ＨＩＶ−１感染症のためのペプチド及び治療法
次式：Ｘ1−Ｍ−配列番号１又はその誘導体（式中、は、配列番号１のアミノ酸のＮ末端に結合するタンパク質導入ドメインを有する随意の基を表す。）を提供する。また、当該化合物を含む医薬組成物及び当該化合物を使用した治療方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）による感染症及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療のための化合物、組成物及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトレンチウイルスであるＨＩＶ−１は、ＡＩＤＳの主要原因病原体であり、現在のところ、全世界でおよそ４２００万人の人々がこれに感染し、北アメリカでは１００万人の人々が感染している。
【０００３】
有効な治療計画にかなりの努力が注がれてはいるものの、今のところ入手可能な薬剤は、ＡＩＤＳを治癒させるのには有効でない。このような薬剤を開発するにあたって、ＨＩＶ−１生活環のいくつかの段階が治療介入のためのターゲットとして考慮されてきた（Ｈ．Ｍｉｔｓｕｙａ外，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１９９１，５，２３６９−８１）。ＨＩＶ−１生活環による治療介入のために多くのウイルス標的が提案されている。ＨＩＶ−１感染及びＡＩＤＳの治療に見込みのある薬剤標的の一部を示すＨＩＶ−１生活環の略図を図１に示す。現在のところ利用可能な治療のほとんどは、逆転写酵素又はＨＩＶ−１タンパク質分解酵素を阻害する。近年、新たな作用機序を持つ薬剤であるエンフビルチドが認可された。エンフビルチドは、ＨＩＶ−１とＣＤ４陽性宿主細胞の膜との融合に関与する当該ウイルスのエンベロープ糖蛋白質４１の所定領域に結合し、それによってＨＩＶ−１とＣＤ４陽性細胞の膜との融合を阻害するペプチドである（Ｊ．Ｐ．Ｌａｌｅｚａｒｉ外，「Ｅｎｆｕｒｖｉｒｔｉｄｅ，ａｎ ＨＩＶ−１ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｆｏｒ ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｒｔｈ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ」，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００３，３４８，２１７５−８５）。
【０００４】
ＨＩＶ−１に対する新たな治療計画から、逆転写酵素（ＲＴ）を標的にするアジドチミジン（ＡＺＴ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）といった抗ＨＩＶ化合物の組合せとＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤とを併用することで、ウイルス量について、ＡＺＴ単独（約１ログ減少）と比較して極めて大きな効果が得られる（２〜３ログの減少）ことが示されている。その一例は、ＡＺＴと、ｄｄＩと、３ＴＣと、リトナビルとの組合せである（Ａ．Ｓ．Ｐｅｒｅｌｓｏｎ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，１５：１５８２−８６）。
【０００５】
表１は、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの治療のために米国食品医薬品局が現在認可している薬剤を列挙している。
【表１】
【０００６】
これらの進展にも拘わらず、依然としてＨＩＶ−１感染及びＡＩＤＳに対して有効な新規薬剤に対する要望がある。現在利用可能な治療剤を含むこれらの化学物質の組合せを長期間使用すると、特に骨髄に対して毒性となる可能性がある。また、長期にわたる細胞傷害性療法は、キラー細胞活性によって（Ｖ．Ｂｌａｚｅｖｉｃ外，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９５，１１，１３３５−４２）及び抑制性因子、特にケモカインのランテス、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βの放出によって（Ｆ．Ｃｏｃｃｈｉ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０，１８１１−１８１５）、ＨＩＶの制御に不可欠なＣＤ８陽性Ｔ細胞の抑圧に至る可能性もある。長期にわたる抗レトロウイルス化学療法における別の大きな問題は、部分的な又は完全な抵抗性を持ったＨＩＶ突然変異体の発生である（Ｊ．Ｍ．Ｌａｎｇｅ，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９５，１０，Ｓ７７−８２）。このような変異は、抗ウイルス療法の必然的な結果であると考えられる。治療による野生型ウイルスの消失と変異体ウイルスの出現のパターンは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数の同時減少と相まって、少なくともいくつかの化合物によるウイルス変異体の出現がＡＩＤＳ治療の失敗の主な基礎的要素であることを強く示唆するものである。
【０００７】
ＨＩＶ−１ウイルスは、（ｉ）Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖといった構造タンパク質；（ii）必須トランス作用タンパク質（Ｔａｔ、Ｒｅｖ）；及び（iii）少なくともいくつかの細胞培養系における効率的なウイルス複製にとって必要ではない「補助」タンパク質（Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ）を含む、遺伝子産物の３つの主要なクラスをコードする１０ｋｂの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを含む。
【０００８】
ＨＩＶ−１に感染した個人を治療するアプローチの一つは、このような個人に、ヒト細胞内でＨＩＶ−１自身が複製する機構に直接的に干渉し、そしてそれを阻害する化合物を投与することである。
【０００９】
そのようなタンパク質の１種であるＶｉｆ（viral infectivity factor：ウイルス感染因子）は、ウマ伝染性貧血ウイルスを除く既知のレンチウイルスの全てで発現している。ＨＩＶ−１のＶｉｆタンパク質は、１９２個のアミノ酸から構成される２３ｋＤａの高塩基性タンパク質である。ＨＩＶ−１に感染した個人からのウイルスＤＮＡの配列分析から、Ｖｉｆの翻訳領域は損なわれていないことが明らかになった（Ｐ．Ｓｏｖａ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５，６９，２５５７−６４；Ｕ．Ｗｉｅｌａｎｄ外，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４，２０３，４３−５１；Ｕ．Ｗｉｅｌａｎｄ外，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７，７８，３９３−４００）。Ｖｉｆは、細胞の抗ウイルス系の作用を克服することができる能力のため、生体内だけでなく、所定の宿主細胞型においては試験管内においてもウイルスが効率的に複製するのために必要なものである。Ｖｉｆ遺伝子が欠失すると、マカクにおいてサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の複製が劇的に減少し、しかも、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスにおいてＨＩＶ−１の複製が劇的に減少する（Ｇ．Ｍ．Ａｌｄｒｏｖａｎｄｉ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９６，７０，１５０５−１１；Ｒ．Ｃ．Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８，７２，１４３１−３７）が、これは、Ｖｉｆ遺伝子が生体内におけるレンチウイルスの病因的複製にとって不可欠であることを示している。
【００１０】
近年の研究から、生体内におけるＨＩＶ−１ウイルスの複製にＶｉｆが重要であることの根拠となる機構が解明された（この重要性は、ｈＡ３Ｇ（ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）（ＣＥＭ１５）と呼ばれる宿主タンパク質の抗ウイルス効果と関連がある）。ｈＡ３Ｇはシチジンデアミナーゼファミリーに属し、新たに合成されたウイルスｃＤＮＡにおいてＧからＡへの高頻度変異を誘導する。ｈＡ３Ｇがウイルス粒子にパッケージングされると、逆転写中に当該ウイルスのマイナス鎖ｃＤＮＡの高頻度変異が生じ、それによって当該ウイルスの複製が阻害され得る。Ｒ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓ外，Ｃｅｌｌ，２００３，１１３，８０３−０９；Ｂ．Ｍａｎｇｅａｔ外，Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２４，９９−１０３。ｈＡ３Ｇの抗ウイルス効果と同じく、ｈＡ３ＧのｍＲＮＡレベルとＨＩＶウイルス量とＣＤ４細胞数との間には相関関係が認められており、これらは、いずれも、抗レトロウイルス薬その他の治療介入を受けていない患者におけるＨＩＶ疾患の進行の予測因子である。さらに、抗ウイルス治療をしていなくても疾患の進行速度が低いＨＩＶ感染患者（「長期未発症者」）は、ｈＡ３ＧのｍＲＮＡレベルが、ＨＩＶ未感染の対照者や、ｈＡ３ＴＧのｍＲＮＡレベルがＨＩＶ未感染の対照者よりも有意に低い疾患進行患者よりも有意に高いことが分かった。Ｘ．Ｊｉｎ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００５，７９（１７），１１５１３−１６。
【００１１】
ＨＩＶ−１複製に対するＶｉｆの重要性は、ｈＡ３Ｇによって与えられる宿主防御機構を克服するその役割によるものであると考えられる。Ｖｉｆは、ｈＡ３Ｇの抗ウイルス活性をユビキチン−プロテアソーム経路による破壊の標的にすることによって当該抗ウイルス活性に対抗する。Ｖｉｆは、ｈＡ３Ｇと複合体を形成し、ｈＡ３Ｇのユビキチン化を促進し、それによってｈＡ３Ｇをユビキチン−プロテアソーム経路による分解の標的にする。Ａ．Ｍｅｈｌｅ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９（９），７７９２−９８。Ｂ．Ｒ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６，８０，１０６７−７６。
【００１２】
ＨＩＶ−１に対する宿主細胞防御を逃れる際のＶｉｆの効果に関する詳細な分子機構は依然として不明であるが、マルチマーを形成するためのＶｉｆの自己会合が重要な役割を果たしている可能性があるとの仮説が立てられており、また、Ｖｉｆのマルチマー化が当該ウイルスの生活環におけるＶｉｆの機能に必要であることが分かっている。Ｓ．Ｙａｎｇ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６（７），４８８９−９３。Ｖｉｆ集合は単に偶然の集合によるものではなく、Ｖｉｆの自己会合に作用する特定のドメインがこのタンパク質のＣ末端、特に、プロリンが豊富な１５１−１６４領域に位置し、Ｖｉｆのマルチマー化に関与していることが実証されている。
【００１３】
細胞培養系では、Ｖｉｆ欠損（Ｖｉｆ-）ＨＩＶ−１は、所定の細胞、例えば、Ｈ９Ｔ細胞、末梢血単核球細胞及び単球由来マクロファージにおいて感染を確立することができない。そのため、これらの細胞は非許容であると分類されるに至っている。他の細胞では、Ｖｉｆ遺伝子は必要とされない；これらの細胞は、許容と分類されている。この現象を利用して、Ｙａｎｇ外は、Ｖｉｆ集合（マルチマー化）が、ウイルス感染力の増進に果たすＶｉｆの役割に不可欠であることを実証した。Ｙａｎｇ外は、変更１ラウンドウイルス感染力アッセイで様々なＶｉｆ変異体を試験した。野生型Ｖｉｆ又はその変異体は、非許容Ｈ９Ｔ−細胞内で発現した。同時に、偽型（ＶＳＶ外被を有する）ＨＩＶ−１ウイルスは、それらのゲノム中にＶｉｆ及びｅｎｖがなくても、これらの細胞から生産された。これらの組換えウイルスは、ＨＩＶ−１末端反復配列のプロモーター駆動ＣＡＴ遺伝子を含有する発現カセットを内部に持つ標的細胞に感染することができた。そのウイルス感染力が標的細胞内におけるＣＡＴ遺伝子発現のレベルによって測定された。野生型Ｖｉｆ遺伝子がＶｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルス生産性非許容Ｈ９Ｔ細胞内で発現したときに、高レベルのウイルス感染力が観察された。しかしながら、その結合領域を欠失したＶｉｆ変異体（ＶｉｆΔ１５１−１６４）がＶｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルス生産性非許容Ｈ９Ｔ細胞内で発現した場合には、そのウイルス感染力は、Ｖｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルスと比較してもほとんど変わらなかったが、これは、その欠失がＶｉｆタンパク質の機能を大幅に低下させ、非許容Ｔ細胞から生じたＶｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルスの感染力を奪回できなくしたことを示唆する。この実験は、Ｖｉｆタンパク質のマルチマー化がＶｉｆ機能に必要であることを実証した。Ｓ．Ｙａｎｇ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６（７），４８８９−９３。また、Ｖｉｆの走査突然変異解析から、感染力に対する結合領域の重要性、特に１６１−１６３の３つの残基（ＰＰＬ）の重要性も実証された。これらのものは、機能を失うことなく個々に置換できたが、３つの残基全てを置換すると機能が大幅に抑制された。Ｊ．Ｈ．Ｍ．Ｓｉｍｏｎ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３（４），２６７５−８１。
【００１４】
Ｖｉｆタンパク質のマルチマー化がウイルスの生活環におけるＶｉｆ機能に必要であるという発見により、これが抗ＨＩＶ−１療法のための見込まれる新規な標的として提案されるに至った。この仮説を図２Ａ及び２Ｂに示す。上記研究で示されたように、Ｖｉｆのマルチマー化は、ＨＩＶ−１感染細胞におけるＶｉｆの作用に必須であると思われる。Ｖｉｆが細胞質において正常に機能すると、Ｖｉｆは二量体化し、生じたＶｉｆダイマーは、ｈＡ３Ｇをユビキチン化による修飾の標的にする；そして、結果として、ｈＡ３Ｇはプロテオソームによって破壊され、ＨＩＶの生活環は中断すると考えられる。つまり、Ｖｉｆが正常に機能している場合には、そのウイルスは、ｈＡ３Ｇの抗感染機能に打ち勝つ。これに対し、Ｖｉｆ機能が損なわれると（例えば、Ｖｉｆの二量体化を阻害する薬剤の作用により）、ＨＩＶ−１は、依然としてＣＤ４に結合してＴ細胞に侵入することができると考えられるものの、ｈＡ３Ｇは逆転写中にウイルスＤＮＡを過剰変異させ、変異ウイルスＤＮＡを生じさせる。この変異ウイルスＤＮＡは破壊されるか又は染色体ＤＮＡに不完全な形態で組み込まれるかのいずれかであろう。この変異ＤＮＡが転写された場合には、生じたＲＮＡは機能タンパク質をほとんど又は全くコードしておらず、しかもその細胞によって生産されるＨＩＶ−１ウイルスのほとんどは、不完全でかつ非感染性であろう。
【００１５】
Ｙａｎｇ外は、ＨＩＶ−１のＶｉｆタンパク質に結合するＰＸＰモチーフを含むペプチドを同定した。これらの高プロリンペプチドは、試験管内でＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を阻害することが分かった。さらに、ＨＩＶ−１のＶｉｆタンパク質配列の全アミノ酸をカバーするペプチドが調製され、そして161ＰＰＬＰ164ドメインを含有する高プロリンペプチドがＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を阻害できることが分かった。この研究から、高プロリンペプチドは、161ＰＰＬＰ164ドメインによって形成されるＶｉｆのポリプロリン界面に干渉することを通してＶｉｆのマルチマー化をブロックすると結論付けられた。さらに、試験管内でＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を阻害するこれらのペプチドは、「非許容」Ｔ細胞内でＨＩＶ−１の複製を阻害することが分かった。Ｂ．Ｙａｎｇ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８（８），６５９６−６０２。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】J.P.Lalezari外,「Enfurvirtide,an HIV-1 fusion inhibitor,for drug-resistant HIV infection in North and South America」,N.Engl.J.Med.,2003,348,2175-85
【非特許文献２】A.S.Perelson外,Science,1996,15:1582-86
【非特許文献３】V.Blazevic外,AIDS Res.Hum.Retroviruses,1995,11,1335-42
【非特許文献４】F.Cocchi外,Science,1995,270,1811-1815
【非特許文献５】J.M.Lange,AIDS Res.Hum.Retroviruses,1995,10,S77-82
【非特許文献６】P.Sova外,J.Virol.1995,69,2557-64
【非特許文献７】U.Wieland外,Virology,1994,203,43-51
【非特許文献８】U.Wieland外,J.Gen.Virol.,1997,78,393-400
【非特許文献９】G.M.Aldrovandi外,J.Virol.,1996,70,1505-11
【非特許文献１０】R.C.Desrosiers外,J.Virol.,1998,72,1431-37
【非特許文献１１】R.S.Harris外,Cell,2003,113,803-09
【非特許文献１２】B.Mangeat外,Nature,2003,424,99-103
【非特許文献１３】X.Jin外,J.Virol.,2005,79(17),11513-16
【非特許文献１４】A.Mehle外,J.Biol.Chem.,2004,279(9),7792-98
【非特許文献１５】B.R.Cullen,J.Virol.2006,80,1067-76
【非特許文献１６】S.Yang外,J.Biol.Chem.,2001,276(7),4889-93
【非特許文献１７】J.H.M.Simon外,J.Virol.,1999,73(4),2675-81
【非特許文献１８】B.Yang外,J.Biol.Chem.,2003,278(8),6596-602
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の概要
本発明によれば、Ｖｉｆのマルチマー化を阻害し、かつ、ＨＩＶ−１に対して有効な化合物及び組成物であって、ＨＩＶ−１感染及びＡＩＤＳなどの、Ｖｉｆのマルチマー化がウイルスの複製に必要な疾患又は状態を治療するのに有用な化合物及び組成物が提供される。
【００１８】
本発明の一態様としては、次式Ｉの化合物：
Ｘ1−Ｍ−配列番号１ （Ｉ）
又はその誘導体
（式中、
Ｘ1−Ｍ−は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に結合したタンパク質導入ドメインを有する随意の基を表し、ここで、
Ｘ1はタンパク質導入ドメインを表し；
−Ｍ−は、単結合又は該タンパク質導入ドメインと該配列番号１のアミノ酸配列との間に共有結合を形成する随意の結合基を表し；
ただし、該化合物が配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に直接結合するアミノ酸を含む場合には、該Ｎ末端に直接結合するアミノ酸はアスパラギン以外であるものとする。）
を提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施形態は、式Ｉに従う化合物が配列番号１のアミノ酸配列のペプチド又は配列番号２のアミノ酸配列のペプチドであるものである。
【００２０】
本発明の他の特定の実施形態は、式Ｉに従う化合物が配列番号３のアミノ酸配列を含むものである。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、タンパク質導入ドメインが配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を含む（随意に当該アミノ酸配列からなる）ものである。
【００２２】
本発明の別の態様としては、製薬上許容できるキャリヤー及び式Ｉに従う化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
本発明の別の態様としては、ある個体でのウイルスの複製にＶｉｆタンパク質のマルチマー化を必要とする疾患又は状態の治療方法であって、そのような治療が必要な個体に、本発明に従う化合物又はその実施形態のいずれかの治療上有効な量を投与することを含むものを提供する。
【００２４】
ＨＩＶ−１感染の治療又は予防方法であって、そのような治療が必要な個体に、本発明に従う化合物又はその実施形態のいずれかの治療上有効な量を投与することを含むものを提供する。
【００２５】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療又は予防方法であって、そのような治療が必要な個体に、本発明に従う化合物又はその実施形態のいずれかの治療上有効な量を投与することを含むものを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
図面の簡単な説明
【図１】治療介入のための薬剤標的を表すＨＩＶの生活環を示す概略図である。（１）ＨＩＶが免疫系細胞に融合し、そのＲＮＡを放出する；（２）ＨＩＶのＲＮＡが逆転写酵素の作用によりＤＮＡに変換される；（３）このウイルスＤＮＡが宿主細胞の核に入り、ＨＩＶインテグラーゼの作用により宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる；ウイルスＲＮＡが作られ、タンパク質が生産され、そしてウイルス構築のためにＨＩＶプロテアーゼがタンパク質をプロセシングする；（５）細胞からＨＩＶウイルスが出芽し、続けて他の細胞に感染する。
【図２】図２Ａ及び２Ｂ：提案されたＶｉｆアンタゴニスト作用機序を示す概略図である。Ｖｉｆが細胞質において正常に機能する場合（図２Ａ）：（１）細胞質中でＶｉｆが二量体化する（この二量体化はＶｉｆ機能に不可欠である）；（２）ＶｉｆダイマーがｈＡ３Ｇをユビキチン化による修飾の標的にする；（３）ｈＡ３Ｇがプロテオソームにより破壊されるので、ＨＩＶ生活環は中断しない。Ｖｉｆ機能が損なわれている場合（例えば二量体化の阻害により）（図２Ｂ）：（１）ＨＩＶ−１がＴ細胞に結合する；（２）ＨＩＶがそのＲＮＡをＤＮＡに変換するときに、ｈＡ３ＧがウイルスＤＮＡを高頻度変異させる；（３）変異ウイルスＤＮＡは破壊され、また、染色体ＤＮＡに組み込まれる変異ウイルスＤＮＡは不完全である；（４）変異ウイルスＲＮＡのコピーが作られたときには、高頻度変異のため、生じたＲＮＡは機能タンパク質をほとんど又は全くコードしない；（５）その結果として、生産されたＨＩＶ−１ウイルスのほとんどは不完全であり、かつ、非感染性であろう。
【図３】次のアミノ酸配列のペプチド：配列番号３６（ペプチドＡ）、配列番号３７（ペプチドＢ）若しくは配列番号２（ペプチドＣ）又は未処理対照群の存在下で培養したヒトＴリンパ芽球様Ｈ９株細胞ペプチド感染ＨＩＶ−１NL4-3ウイルスの細胞培養上澄中におけるＨＩＶ−１ｐ２４抗原レベル（ＥＬＩＳＡにより測定）のグラフ図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ２ ５０μＭ」）、５０μＭの配列番号３５のアミノ酸配列のペプチド（「Ｐ１ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図４Ａ）、０．０３の感染効率（図４Ｂ）、０．０１の感染効率（図４Ｃ）及び０．００３の感染効率（図４Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ２ ５０μＭ」）、５０μＭの配列番号３５のアミノ酸配列のペプチド（「Ｐ１ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図４Ａ）、０．０３の感染効率（図４Ｂ）、０．０１の感染効率（図４Ｃ）及び０．００３の感染効率（図４Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ２ ５０μＭ」）、５０μＭの配列番号３５のアミノ酸配列のペプチド（「Ｐ１ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図４Ａ）、０．０３の感染効率（図４Ｂ）、０．０１の感染効率（図４Ｃ）及び０．００３の感染効率（図４Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ２ ５０μＭ」）、５０μＭの配列番号３５のアミノ酸配列のペプチド（「Ｐ１ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図４Ａ）、０．０３の感染効率（図４Ｂ）、０．０１の感染効率（図４Ｃ）及び０．００３の感染効率（図４Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図５Ａ】図５Ａは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号２のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号２のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ３ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図５Ａ）、０．０３の感染効率（図５Ｂ）、０．０１の感染効率（図５Ｃ）及び０．００３の感染効率（図５Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号２のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号２のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ３ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図５Ａ）、０．０３の感染効率（図５Ｂ）、０．０１の感染効率（図５Ｃ）及び０．００３の感染効率（図５Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号２のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号２のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ３ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図５Ａ）、０．０３の感染効率（図５Ｂ）、０．０１の感染効率（図５Ｃ）及び０．００３の感染効率（図５Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号２のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号２のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ３ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図５Ａ）、０．０３の感染効率（図５Ｂ）、０．０１の感染効率（図５Ｃ）及び０．００３の感染効率（図５Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図６】ＦＴＩＣタグを付けた配列番号２のアミノ酸配列のペプチドで処理し、次いで２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．４％トリトンＸ−１００で透過処理し、そしてＤＮＡ選択的染料の４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色したＨ９及びＭＴ−２細胞の取得画像である。細胞核及び配列番号２のアミノ酸配列のタグ付きペプチドに対するＤＡＰＩ染色及びＦＩＴＣタグ染色の個々の画像及び画像オーバーレイ（重ね合わせ）は、それぞれ、５０μＭのＯＹＡ−００５−ＦＩＴＣで１回処理した後２４時間目に撮影した。２つの別個の細胞は、Ｈ９細胞及びＭＴ−２細胞の両方を示している。
【図７】ｈＡ３Ｇ遺伝子をトランスフェクトし、かつ、ＶＳＶ−Ｇ偽型ＨＩＶウイルス（「＋Ｖｉｆ、＋ｈＡ３Ｇ」）を感染させたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞及びＶｉｆ陰性ＶＳＶ−Ｇ偽型ＨＩＶウイルス（「−Ｖｉｆ，−ｈＡ３Ｇ」）を感染させたＨＥＫ ２９３Ｔ（非ｈＡ３Ｇ発現）細胞であって、配列番号２のアミノ酸配列のペプチドによる処理を受けたもの（「ペプチドμＭ」）又はそのような処理を受けていないもの（「ペプチドなし」）から生じたウイルスの培養によるＪＣ５３ＢＬレポーター細胞感染性アッセイの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
明細書及び添付した請求の範囲において使用するときに、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに示さない限り、複数の対象が含まれる。
【００２８】
表現「治療する」及び「治療」とは、疾患の発症の遅延及び／又は発症する若しくは発症が見込まれる症状の重症度の低減を生じさせること又はその行為を意味する。これらの用語は、これまでの症状を改善させること、さらなる症状を抑えること及び症状の基礎的代謝原因を改善させること又は同原因を抑えることをさらに包含する。
【００２９】
ある個体に対する治療を説明するために使用するときの「有効な量」という表現とは、治療上有用な効果を生じさせる化合物の量をいう。
【００３０】
ここで使用するときに、「個体」（治療の対象と同様）とは、ほ乳類、特に非ヒト霊長類、例えば類人猿及びサル、とりわけヒトを意味する。
【００３１】
本明細書において、ペプチドは、ペプチド結合で共有結合した２個以上のアミノ酸の鎖を有する有機化合物であると定義される。ペプチドは、構成アミノ酸の数を基準にして言及される場合がある（すなわち、ジペプチドは２個のアミノ酸残基を含み、トリペプチドは３個のアミノ酸残基を含むなど。）。請求項に係る発明で使用するときに、「ペプチド」とは、１０，０００ダルトン未満、好ましくは５，０００ダルトン未満、より好ましくは２，５００ダルトン未満の分子量を有する部分をいうものとする。
【００３２】
ここで使用するときに、用語「アミノ酸」とは、塩基性アミノ基と酸性カルボキシル基との両方を有する有機化合物を意味する。この用語には、天然アミノ酸（例えば、Ｌ−アミノ酸）、修飾アミノ酸及異常アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）だけでなく、遊離型又は混合型で生物学的に生じるが通常タンパク質には生じないことが知られているアミノ酸も包含される。この用語には、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＶｅｌｌａｃｃｉｏ（１９８３）「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，５：３４２−４２９に開示されたような修飾アミノ酸及異常アミノ酸も含まれる。その教示を参照により援用するものとする。天然タンパク質型のアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、チロシン、トリプトファン、プロリン及びバリンが挙げられるが、これらに限定されない。天然非タンパク質アミノ酸としては、アルギノコハク酸、シトルリン、システインスルフィン酸、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチン、３−モノヨードチロシン、３，５−ジヨードチロシン、３，５，５'−トリヨードチロニン及び３，３’，５，５’−テトラヨードチロニンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明を実施するために使用できる修飾アミノ酸又は異常アミノ酸としては、Ｄ−アミノ酸、ヒドロキシリシン、４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−Ｃｂｚ保護アミノ酸、２，４−ジアミノ酪酸、ホモアルギニン、ノルロイシン、Ｎ−メチルアミノ酪酸、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、β−フェニルプロリン、ｔ−ロイシン、４−アミノシクロヘキシルアラニン、Ｎ−メチルノルロイシン、３，４−デヒドロプロリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノグリシン、Ｎ−メチルアミノグリシン、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸、６−アミノカプロン酸、トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸、２−、３−及び４−（アミノメチル）安息香酸、１−アミノシクロペンタンカルボン酸、１−アミノシクロプロパンカルボン酸及び２−ベンジル−５−アミノペンタン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
用語「ペプチド結合」とは、第１のアミノ酸のカルボキシル基と第２のアミノ酸のアミノ基との間で水分子が失われることによって形成されたアミド共有結合を意味する。
【００３４】
用語「ペプチド骨格」とは、アミノ酸のカルボキシル基とアミノ基とを結合するアミノ酸の原子（通常はα−アミノ酸のα−炭素）と共に、ペプチド結合であるカルボキシアミド基を有するペプチドの原子鎖を意味する。
【００３５】
用語「側鎖」とは、ペプチド骨格に結合する基を意味し、典型的にはα−アミノ酸のα−炭素に結合する基をいう。例えば、タンパク新生アミノ酸の側鎖については、メチル（アラニン）、ヒドロキシメチル（セリン）、ベンジル（フェニルアラニン）、メルカプトメチル（システイン）及びカルボキシメチル（アスパラギン酸）が挙げられる。
【００３６】
ペプチド鎖を有する化合物に適用されるときの用語「誘導体」とは、ペプチドの側鎖におけるアミノ基、ヒドロキシル基若しくはカルボキシル基又は末端アミノ基若しくは末端カルボキシル基の１個以上が誘導体官能基に変更された化合物を意味する。アミノ基は、アミド（例えばアルキルカルボキシアミド、アセトアミド）、カルバメート（例えば、カルバミン酸アルキル、例えばカルバミン酸メチル又はカルバミン酸ｔ−ブチル）又は尿素として誘導体化できる。ヒドロキシル基は、エステル（例えばアルカノエート、例えばアセテート、プロピオネート又はアレンカルボキシレート、例えばベンゾエート）、カルバメート（例えばカルバミン酸アルキル、例えばカルバミン酸メチル）、カーボネート（例えば炭酸アルキル、例えば炭酸エチル）として誘導体化できる。カルボキシル基は、エステル（例えばアルキルエステル、例えばエチルエステル）又はアミド（例えば第一カルボキシアミド、Ｎ−アルキル第二カルボキシアミド又はＮ，Ｎ−ジアルキルカルボキシアミド）として誘導体化できる。当業者であれば、ペプチドの誘導体が親ペプチドの特性を維持することが予想されることが分かるであろう。誘導体基の導入はペプチドの特性を変化させないか、又は誘導体基は生体内で除去される（例えば代謝により）かのいずれかだからである。本発明の好ましい実施形態は、アミノ基、カルボキシル基及びヒドロキシル基の３個以下、好ましくは２個以下、又は１個が誘導体官能基に修飾されているか、或いは全く修飾されていない。また、用語「誘導体」には塩も含まれ、誘導体の塩も含まれる。
【００３７】
ペプチドに関連して使用される用語である「末端誘導体」とは、Ｃ末端カルボキシレート基若しくはＮ末端アミノ基又はその両方が誘導体官能基に修飾されたペプチドを意味する。Ｃ末端カルボキシル基は、エステル（例えばアルキルエステル、例えばエチルエステル）又はアミド（例えば第一カルボキシアミド、Ｎ−アルキル第二カルボキシアミド又はＮ，Ｎ−ジアルキルカルボキシアミド）として誘導体化できる。Ｎ末端アミノ基は、エステル（例えばアルキルエステル、例えばエチルエステル）又はアミド（例えば第一カルボキシアミド、Ｎ−アルキル第二カルボキシアミド又はＮ，Ｎ−ジアルキルカルボキシアミド）として誘導体化できる。また、Ｃ末端カルボキシル基及び／又はＮ末端アミノ基は、塩の状態であることもできる。
【００３８】
用語「単離化合物」とは、所定の化合物であって、混入物、又は当該化合物が自然に分泌される細胞成分、又はその合成に使用された試薬、又はその合成の副産物、を実質的に有しないものを意味する。「単離」及び「混入物を実質的に有しない」は、その調製が技術的に純粋（均質）であることを意味するものではなく、治療に使用できる状態のペプチド又はポリペプチドを準備するのに十分に純粋であることを意味する。
【００３９】
用語「タンパク質導入ドメイン」（「細胞透過性ペプチド」ともいう）は、所定のペプチド又はその誘導体であって、細胞膜を横断することができ、かつ、タンパク質導入ドメインと関連のあるペプチド、タンパク質又は分子を細胞の外部から当該細胞の細胞質に当該細胞の細胞質膜を介して輸送する方向に誘導することができるものを示すために使用する。
【００４０】
２個のペプチドの連結を指す用語である「結合」とは、２個のペプチドが互いに共有結合することを意味する。この結合は、一方のペプチドのカルボキシル基と他方のペプチドのアミノ基との間のアミド結合の形成により直接、又はこれらのペプチドのそれぞれに対して共有結合を有する結合基を介して達成される。例えば、結合基は、ペプチド鎖、アミノ酸又は少なくとも２個の官能基を有し、かつ、２個のペプチド鎖のそれぞれに共有結合を形成させることのできる任意の基であることができる。
【００４１】
用語「ＨＩＶ−１治療用化合物」とは、ＨＩＶ感染症の治療や予防のために現在使用されている化合物、ＨＩＶ感染症の治療又は予防に使用するための治験化合物及び当業者がＨＩＶ感染症の治療又は予防に有用であると考える化合物など、ＨＩＶ感染症の治療又は予防に有用な任意の化合物を意味する。
【００４２】
用語「後天性免疫不全症候群の治療用化合物」とは、後天性免疫不全症候群の治療又は予防のために現在使用されている化合物、後天性免疫不全症候群の治療又は予防に使用するための治験化合物及び当業者が後天性免疫不全症候群の治療又は予防に有用であると考える化合物など、後天性免疫不全症候群の治療又は予防に有用な任意の化合物を意味する。
【００４３】
２個の化学基のを指す用語である「直接結合」とは、これらの基が共有結合により結合することを意味する（それそれが結合基に結合することにより結合するのではない）。
【００４４】
用語「Ｖｉｆアンタゴニスト」とは、Ｖｉｆタンパク質、好ましくはＶｉｆタンパク質内のマルチマー化ドメインに結合し、それによってＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用及びＶｉｆタンパク質のマルチマー化を阻害する分子を意味する。
【００４５】
用語「組織培養感染量５０」（又は「ＴＣＩＤ50」）とは、多数の感受性組織培養液に接種されたときに、それぞれの培養液の５０％を感染させる感染性因子（例えばウイルス）の量を意味する。
【００４６】
II．本発明の化合物
本発明の一態様としては、次式Ｉの化合物：
Ｘ1−Ｍ−配列番号１ （Ｉ）
又はその誘導体
（式中、
Ｘ1−Ｍ−は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に結合したタンパク質導入ドメインを有する随意の基を表し、ここで、
Ｘ1はタンパク質導入ドメインを表し；
−Ｍ−は、単結合又は該タンパク質導入ドメインと配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドとの間に共有結合を形成する随意の結合基を表し；
ただし、該化合物が配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に直接結合するアミノ酸を有する場合には、該Ｎ末端に直接結合する該アミノ酸はアスパラギン以外のものであるものとする。）
を提供する。
【００４７】
「Ｘ1−Ｍ−は、随意の基を表す」というときには、式Ｉは、配列番号１のアミノ酸配列がタンパク質導入ドメインに結合した式Ｘ1−Ｍ−配列番号１の化合物又はその誘導体だけでなく、タンパク質導入ドメインには結合していない配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド又はその誘導体をも包含するものとする。
【００４８】
ａ．結合基
配列番号１のアミノ酸配列のペプチドがタンパク質導入ドメインに結合する場合には、配列番号１のアミノ酸配列のペプチドとタンパク質導入ドメインとの結合は、単結合又は随意の結合基により形成される。この結合基の目的は、単にタンパク質導入ドメインと配列番号１のアミノ酸配列のペプチドとを共有結合させることに過ぎないので、当業者であれば、様々な方法でこのような結合を達成することができるであろう。基本的に、この結合基は、少なくとも２官能性の任意の部分であることができるが、ただしタンパク質導入ドメインと配列番号１のアミノ酸配列との間で生じた結合は安定であることを条件とする。好適な結合部分としては、２官能性又は多官能性のアルキル、アリール、アラルキル又はペプチド部分、アルキル、アリール又はアラルキルアルデヒドの酸エステル及び無水物、スルフヒドリル又はカルボキシル基、例えばマレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体及びスクシンイミド誘導体が挙げられ、或いは、当該部分は、臭化シアヌル又は塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステル又はスルホン酸ハロゲン化物などから誘導できる（Ｆｉｓｃｈｅｒ外，米国特許第６，４７２，５０７号。その開示の全体を参照によって援用するものとする）。リンカー部分上にある官能基としては、アミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニル及びカルボキシル基を挙げることができる。随意に、当該リンカー基は、十分に不安定であるように選択される（例えば、標的組織中に存在する酵素による酵素分解に対して）ので、配列番号１のアミノ酸配列のペプチドの運搬後に切断され、それによってペプチドが遊離する。代表的な不安定結合は、Ｌｏｗ外，米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。その開示の全体を参照によって援用するものとする。また、このペプチド−活性剤デリバリーシステムは、活性剤と本発明のペプチドとの間の化学的切断によっても分離し得る。リンカー部分がアミノ酸残基を含む実施形態においては、このような切断は、リンカー部分自体の内部で生じ得る。
【００４９】
以下で提供する例は例示を目的とするものであって、包括的であることを目的とするものではない。したがって、以下の例は、−Ｍ−基とペプチドとの間の結合がアミド結合である場合を例示するものであるが、当業者であれば、配列番号１のアミノ酸配列の末端ＮＨ基と末端（又は他の）カルボキシル基（又はタンパク質導入ドメインの末端若しくは他の−ＮＨ−基若しくは任意の他の官能基）の−Ｃ（＝Ｏ）−基との間に結合を形成させることのできる任意の官能基によって形成できることが分かるであろう。
【００５０】
結合基によって形成される結合が配列番号１のアミノ酸配列のペプチドのアミノ酸末端とタンパク質導入ドメインのカルボキシル基（例えば末端カルボキシル基）との間にある場合には、任意のアミノ酸（タンパク新生アミノ酸（これに限定されない）を含めたα−アミノ酸（これに限定されない）を含む）又はペプチド鎖が配列番号１のアミノ酸配列のペプチドとタンパク質導入ドメインとの間の結合となることができる。
【００５１】
配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端とタンパク質導入ドメインのカルボキシル基とを結合させるための安定な結合基−Ｍ−の例としては、
−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−Ｃ（＝Ｏ）−（式中、Ｒはタンパク質新生アミノ酸の側鎖である）；
ペプチド鎖；及び
−ＮＨ−Ｘm−Ｃ（＝Ｏ）−
（式中、
ｍは１以上、好ましくは１〜３であり、
それぞれの−Ｘ−は、直鎖、分岐又は環状の脂肪族炭化水素であって、１個以上のメチレン基が−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されていてよく、かつ、１個以上のメチン基がＮで置換されていてよいもの；−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−（式中、ｎは１以上である）；及び芳香族環又は複素環式芳香族環よりなる群から選択される。）
が挙げられる。
【００５２】
結合基によって形成される結合が配列番号１のアミノ酸配列のペプチドのアミノ酸末端とタンパク質導入ドメインのアミノ基（例えば末端アミノ基）との間にある場合には、当該２個のペプチド基間の結合は、例えば尿素（この場合、−Ｍ−は−Ｃ（＝Ｏ）−である）又は任意のジカルボン酸残基（例えば−Ｍ−は−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）−である）であることができる。
【００５３】
配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端とタンパク質導入ドメインのアミノ基とを結合させるための安定な結合基−Ｍ−の例としては、
−Ｃ（＝Ｏ）−（すなわち尿素）；
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐｅｐ1−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｐｅｐ2−Ｃ（＝Ｏ）−（式中、−ＮＨ−Ｐｅｐ1−Ｃ（＝Ｏ）−及び−ＮＨ−Ｐｅｐ2−Ｃ（＝Ｏ）−は、それぞれ、アミノ酸又はペプチド鎖のいずれかであって、それらのアミノ末端（又はアミノ酸の場合にはα−アミノ基）を介して尿素結合−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−により結合したものを表す。）；及び
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘm−Ｃ（＝Ｏ）−
（式中、
ｍは１以上、好ましくは１〜３であり、
それぞれの−Ｘ−は、直鎖、分岐又は環状の脂肪族炭化水素であって、１個以上のメチレン基が−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されていてよく、かつ、１個以上のメチン基がＮで置換されていてよいもの；−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−（式中、ｎは１以上である）；及び芳香族環又は複素環式芳香族環よりなる群から選択される。）
が挙げられる。
【００５４】
−Ｍ−基は、タンパク質導入ドメインと配列番号１のアミノ酸配列とを「結合させる」ものであるが、この用語の使用は、式Ｉの化合物を合成する方法に関していかなる限定も暗示するものではない。つまり、タンパク質導入ドメインと配列番号１のアミノ酸配列のペプチドとを別々に合成し、次いで互いに連結させる必要はない。むしろ、この用語は、単に、式Ｉの化合物におけるタンパク質導入ドメインと、配列番号１のアミノ酸配列と、結合基−Ｍ−との間の構造的な結合部分を説明するものに過ぎない。
【００５５】
ｂ．タンパク質導入ドメイン
タンパク質導入ドメインは、細胞膜を横断することができ、かつ、タンパク質導入ドメインと関連のあるペプチド、タンパク質又は分子の、所定の細胞の外部から該細胞の細胞質への該細胞の細胞質膜を介した輸送を誘導することのできるペプチドである。
【００５６】
ＨＩＶのＴＡＴタンパク質、ショウジョウバエ由来のアンテナペディアタンパク質及び単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ２２タンパク質などのいくつかの天然型タンパク質は、容易に細胞に入ることができた。このようなタンパク質の細胞侵入の機構は完全には理解されていないものの、このようなタンパク質中の比較的短い配列（タンパク質導入配列又は膜融合配列）が細胞侵入を容易にする役割を果たすことが分かっている。容易な細胞侵入を促進させる特性は、上記ペプチド配列が別の分子に結合する場合であっても保持される。結果として、このような配列への結合を使用して他の分子が細胞に送達されるのを容易にすることができる。
【００５７】
タンパク質導入ドメインは、かなり興味深い研究対象である。というのは、当該ドメインは、他の化合物への結合により、当該結合化合物を細胞に輸送するのを容易にするからである。そのため、かなりの刊行物が発行されている。例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｕｌｏ Ｌａｎｇｅｌ（編集者）（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，第２版，２００６）、「Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｕｌｏ Ｌａｎｇｅｌ（編集者）（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，第１版，２００２）；Ｅ．Ｌ．Ｓｎｙｄｅｒ外，「Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２００４，２１（３），３８９−９３、Ａ．Ｊ．Ｍ．Ｂｅｅｒｅｎｓ外，「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｔｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００３，３（５），４８６−９４；Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚ外，「Ｍｅｄｉｕｍ−ｓｉｚｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｂｕｉｌｔ ｉｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，２００５，２５（６），６７９−７３６。
【００５８】
タンパク質導入ドメインに導入できる又は当該ドメインとして使用できるアミノ酸配列の例は表２に示すものである。
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【００５９】
ｃ．本発明の化合物の特定の実施形態及び好ましい実施形態
本発明の化合物の好ましい実施形態は、−Ｍ−が単結合、アミノ酸又はペプチドからなるものである。−Ｍ−がアミノ酸からなる場合には、当該アミノ酸は、好ましくはグリシンである。−Ｍ−がペプチドからなる場合には、当該ペプチドは、好ましくはそのＣ末端を介して配列番号１のアミノ酸配列のペプチドのアミノ末端に結合し、かつ、そのＮ末端を介してタンパク質導入ドメインのＣ末端に結合する。また、当該ペプチドは、好ましくは１０個以下のアミノ酸残基からなる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、タンパク質導入ドメインは、そのＣ末端で−Ｍ−に直接結合する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、タンパク質導入ドメインは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を含む（随意に当該アミノ酸配列からなる）。
【００６３】
特定の実施形態では、式Ｉの化合物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００６４】
特定の実施形態では、式Ｉの化合物は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、式Ｉの化合物は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００６６】
他の好ましい実施形態では、式Ｉの化合物又はその実施形態いずれかは単離化合物である。他の好ましい実施形態では、式Ｉの化合物及び当該化合物を含有する組成物（医薬組成物を含む）は、製薬上許容できない混入物を実質的に有しない。製薬上許容できない混入物とは、所定の化合物であって、ごくわずかの量を超えて存在すると、当該化合物をヒトへの治療投与のための医薬品として使用するのを不適当なものにするであろう化合物のことである。
【００６７】
III．本発明の化合物の調製
本発明の化合物は、ペプチド及び有機合成の当業者に周知の方法によって調製できる。
【００６８】
本発明のペプチドは、組換えペプチド又は合成ペプチドであることができる。また、これらのものは、例えば、固相合成法を使用して化学的に合成することもできる。タンパク質導入ドメインは、天然ペプチド又は合成ペプチドであることができ、天然源からの単離による製造又は合成が可能である。
【００６９】
本発明のペプチドは、ペプチド合成法を使用して新規合成できる。このような方法では、当該ペプチド鎖は、成長しつつあるペプチド鎖に構成アミノ酸を所望の配列で付加する一連のカップリング反応により調製される。様々なＮ保護基、例えば、カルボベンジルオキシ基又はｔ−ブチルオキシカルボニル基；様々なカップリング試薬、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド又はカルボニルジイミダゾール；様々な活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドのエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル；及び様々な切断試薬、例えば、トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）、ジオキサン中ＨＣｌ、硼素トリス（トリフルオルアセテート）及び臭化シアンの使用；並びに、中間体の単離及び精製を伴う溶液状態での反応は、当業者に周知の方法である。この反応は、溶液の状態のペプチド又は固相担体に結合したペプチドのいずれかで実施できる。固相方法では、ペプチドは、合成の完了後に固相担体から遊離される。
【００７０】
好ましいペプチド合成法は、メリフィールド固相手順に従う。メリフィールド，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６３，８５，２１４９−５４及びＳｃｉｅｎｃｅ，１９６５，５０，１７８−８５を参照されたい。固相合成手順に関する追加の情報は、次の学術論文を参照することにより得ることができる：Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ及びＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ（第２版，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１９８４）、及びＲ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２：２２１−２９６のレビューの章，Ｆ．Ｆ．Ｎｏｌｄ著（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６９）及びＢ．Ｗ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ及びＲ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第２巻，ｐｐ．２５５以下参照，Ｎｅｕｒａｔｈ及びＨｉｌｌ著（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）。
【００７１】
溶液法によるペプチドの合成は、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，第１１巻，Ｎｅｕｒａｔｈ外著（第３版，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９７６）に記載されている。ペプチド合成に関する他の一般参照としては、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ及びＢｅｎ Ｍ．Ｄｕｎｎ著（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９４）、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｉｋｌｏｓ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３）及びＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐａｕｌ Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ、Ｅ．Ｇｉｒａｌｔ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９７）及びＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｇ．Ｇｒａｎｔ著（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２００２）が挙げられる。
【００７２】
リンカーの−Ｍ−がペプチド鎖以外のものである式Ｉの化合物は、例えば、タンパク質導入ドメインと好適な結合分子とを、当該化合物の正確な性質によって変わってくる方法（ただし、これは当業者には明らかであろう）を使用してカップリングさせることによって調製できる。例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（第３版，Ｗｉｌｅｙ１９９９）に記載されるように、好適な保護基方法を採用してカップリング部位の所望の選択を実現することができる。
【００７３】
或いは、ペプチドは、そのペプチドをコードする核酸を好適なベクターに結合させ、得られたベクターを好適な宿主細胞に挿入し、得られた宿主細胞により生成されたペプチドを回収し、そして回収されたポリペプチドを精製することを含む組換えＤＮＡ技術を使用して調製できる。組換えＤＮＡ技術は、当業者には周知である。組換え分子をクローニングし及び発現させる一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，第２版，１９８９）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９８７）に記載されている。
【００７４】
所望のペプチドをコードする核酸は、１個以上の調節領域に機能的に連結されていてよい。調節領域としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、翻訳開始シグナル（コザック領域）、終止コドン、ペプチド切断部位及びエンハンサーが挙げられる。使用される調節配列は、これらが投与される脊椎動物の細胞内において機能的でなければならない。好適な１つの調節領域又は複数の調節領域を選択することは日常的な事項であり、当業者の技術常識である。
【００７５】
本発明の化合物の合成に使用できるプロモーターとしては、構成的プロモーターと調節（誘導）プロモーターの両方が挙げられる。これらのプロモーターは、宿主に応じて原核生物型又は真核生物型であることができる。本発明の実施に有用な原核生物型（バクテリオファージを含む）プロモーターには、ｌａｃ、Ｔ３、Ｔ７、ラムダＰｒ’Ｐｌ’及びｔｒｐプロモーターがある。本発明の実施に有用な真核生物型（ウイルスを含む）プロモーターには、遍在性プロモーター（例えばＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間径フィラメントプロモーター（例えばデスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療遺伝子プロモーター（例えばＭＤＲ型、ＣＦＴＲ、第VIII因子）、組織特異的プロモーター（例えば平滑筋細胞におけるアクチンプロモーター）、刺激に応答するプロモーター（例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン制御転写調節物質、サイトメガロウイルス前初期、レトロウイルスＬＴＲ、メタロチオネイン、ＳＶ−４０、Ｅ１ａ及びＭＬＰプロモーターがある。テトラサイクリン制御転写調節物質プロモーター及びＣＭＶプロモーターは、ＷＯ９６／０１３１３号、米国特許第５，１６８，０６２号及び米国特許第５，３８５，８３９号に記載されている。これらの特許文献の全開示を参照によりここに含めるものとする。
【００７６】
本発明で使用できるポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明の化合物は、化学合成によって調製されるか組換えＤＮＡ技術によって調製されるかを問わず、既知の技術、例えば分取ＨＰＬＣを使用して精製できる。次いで、当該化合物について、ここで説明するアッセイ法に従って生物活性をアッセイすることができるだけでなく、当業者に周知の方法によってアッセイすることもできる。
【００７８】
IV．本発明の化合物の生物学的評価
Ｖｉｆ又はＶｉｆ結合体に結合し、かつ、Ｖｉｆタンパク質のマルチマー化を阻害する分子は、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合アッセイを使用して検定できる。具体的に言うと、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合アッセイは、（１）Ｖｉｆ又はＶｉｆ含有ペプチドをカラム又はビーズに結合させ；（２）該Ｖｉｆ又はＶｉｆ含有ペプチドが結合したカラム又はビーズ上に、試験分子とマルチマー化ドメインを含有する標識Ｖｉｆ又はその断片とをアプライし；（３）該カラム又はビーズを洗浄し、そして該カラム又はビーズから該標識Ｖｉｆ又はその断片を分離させ；そして、（４）該カラム又はビーズに結合した標識Ｖｉｆ又はその断片の量を測定し、比較して該試験分子の拮抗作用活性を決定する段階を含む。「標識Ｖｉｆ又はその断片」とは、放射標識Ｖｉｆ、化学標識Ｖｉｆ又は蛍光標識Ｖｉｆをいうが、これらに限定されない。スクリーニングは、好ましくは35Ｓ標識Ｖｉｆを使用して行われる。
【００７９】
化合物のＶｉｆ機能阻害有効性は、細胞ｈＡ３ＧレベルのＶｉｆ仲介低下を阻害することに該化合物が有効かどうかを検定することによって決定できる。好適な細胞、例えばＨ９細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞又はＭＴ−２細胞に、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を結合したｈＡ３Ｇを含む遺伝子構築物をトランスフェクトし、ウイルスを感染させ、そして、ＥＧＦＰ−ｈＡ３Ｇ蛍光の存在を、蛍光顕微鏡又はＥＬＩＳＡプレート読み取り装置による蛍光検出を使用して監視する。それによって、化合物がウイルス感染によるｈＡ３ＧレベルのＶｉｆ仲介低下を減ずることの有効性を測定できる。
【００８０】
また、化合物のＶｉｆ機能阻害有効性は、ウイルス粒子中のｈＡ３Ｇを定量することで決定することもできる。ｈＡ３Ｇを発現するウイルス感染細胞から放出されたウイルス粒子は、Ｖｉｆ機能が阻害されている場合には高レベルのｈＡ３Ｇを有する一方で、機能を有するＶｉｆは、ｈＡ３Ｇの破壊をもたらし、また、Ｖｉｆがウイルス粒子に取り込まれるのをブロックする。そのため、Ｖｉｆ機能をブロックする効果のある薬剤は、ウイルス粒子中におけるｈＡ３Ｇレベルを高くするであろう。細胞から放出されたウイルス粒子について、ウイルス粒子のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、得られたゲルをウエスタンブロットし、そして該ブロットをｈＡ３Ｇ抗体で探索することによりそれらのｈＡ３Ｇ含有量を定量できる。これらのブロットをｐ２４のような別のウイルスタンパク質に対する抗体でも探索する場合には、ｈＡ３Ｇの測定存在量を正規化してウイルス量の変動を明らかにすることができる（すなわち単位ウイルス量により表される）。
【００８１】
Ｖｉｆに結合するものとして同定された化合物について、例えばここで説明するような当業者に周知の試験管内及び生体内抗ウイルスアッセイで活性を試験することができる。次の例は、所定の化合物についてＨＩＶ−１に対する有効性を評価するための例示の手順を説明するものである。
【００８２】
まず、治療化合物が培養細胞中におけるＨＩＶ−１複製に及ぼす影響を決定することができる。これは、造血細胞（例えば、ＭＴ−２Ｔ細胞リンパ腫細胞、第一末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、単離マクロファージ、単離ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は培養Ｈ９ヒトＴ細胞）に、ＨＩＶ−１を、細胞に試験管内で急性感染させるための当該技術分野において周知の力価（例えば１０4.5ＴＣＩＤ50／ｍＬ）を使用して急性感染させることにより実施できる。次いで、これらの細胞を様々な量の１種の試験化合物の存在下で培養する。次いで、培養液を、ＨＩＶ−１生産についてアッセイする（例えば、逆転写酵素アッセイを使用して逆転写酵素のレベルを測定することにより又は市販のＥＬＩＳＡアッセイを使用してｐ２４抗原を測定することにより）。未処理対照群で観察されたウイルスレベルと比較したレベルの低下は、その試験化合物がＨＩＶ−１感染の治療に試験管内で有効であることを示す。
【００８３】
ヒトで試験する前に、好ましくは、試験化合物をＨＩＶ−１感染の動物モデルで試験する。このようなモデルの一つにおいては、本発明の化合物をＨＩＶ−１のための遺伝子導入マウス、例えば、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子欠失ＨＩＶ−１プロウイルスゲノムの７．４ｋｂを含む分子クローンｐＮＬ４−３を組み込んだマウスに投与する（Ｐ．Ｄｉｃｋｉｅ外，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９１，１８５，１０９−１１９）。このマウスから得られた皮膚生検について、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）によってＨＩＶ−１遺伝子の発現を試験し又は免疫染色法によってＨＩＶ−１抗原の発現、例えばｇｐ１２０若しくはＮＥＦの発現を試験する。さらに、当該マウスについて、ＨＩＶ−１遺伝子導入マウスにおいて通常観察される悪液質及び成長遅延が低減するかどうか試験する（Ｒ．Ｒ．Ｆｒａｎｋｓ外，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓ．，１９９５，３７，５６−６３）。
【００８４】
また、本発明の化合物の有効性は、ＳＩＶ感染アカゲザル（Ｎ．Ｌ．Ｌｅｔｒｉｎ外，Ｊ．ＡＩＤＳ，１９９０，３，１０２３−４０）、特に、実験的に感染したサルにおいてヒトＡＩＤＳに非常に類似する症候群を引き起こすＳＩＶmac251に感染したアカゲザルで決定することもできる（Ｈ．Ｋｅｓｔｌｅｒ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４８，１１０９−１２）。特に、サルに、無細胞ＳＩＶmac251、例えば１０4.5ＴＣＩＤ50／ｍＬの力価のウイルスを感染させることができる。感染を、ＰＢＭＣにおけるＳＩＶのｐ２７抗原の出現により監視する。本発明の化合物の有用性は、正常の体重増加、ＰＢＭＣにおけるＳＩＶ力価の減少及びＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加によって特徴付けられる。
【００８５】
ＨＩＶ感染ヒト細胞について生体内での化合物の有効性を決定するために、中空繊維アッセイを使用することもできる。ＨＩＶ感染ヒト細胞を、ＳＣＩＤマウスのような実験動物に移植された中空繊維内で成長させ、そして当該細胞からの感染の広がりを、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、ｐ２４又は逆転写酵素といったエンドポイントを使用して監視する。例えば、Ｂ．Ｔａｇｇａｒｔ外，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，２００４，６３（１），１−６を参照されたい。
【００８６】
ヒト患者では、化合物による治療の有効性は、ＨＩＶ−１感染症及びＨＩＶ−１関連疾患の様々なパラメーターを測定することによって決定できる。特に、ウイルス量の変化は、定量ＲＴ−ＰＣＲを使用した血漿のＨＩＶ−１ＲＮＡの定量分析によって（Ｂ．Ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９４，４９，１５７−６８；Ｙ．Ｈ．Ｃｈｅｎ外，ＡＩＤＳ，１９９２，６，５３３−３９）又は単離ＰＢＭＣからのウイルス生産についてのアッセイによって決定できる。ＰＢＭＣからのウイルス生産は、患者からのＰＢＭＣとＨ９細胞とを同時に培養し、その後ｐ２４抗原レベルについてＥＬＩＳＡアッセイを使用してＨＩＶ−１の力価を測定することによって決定できる（Ｍ．Ｐｏｐｏｖｉｃ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８４，２０４，４９７−５００）。血漿ＨＩＶ−１レベル及びエイズの進行の別の指標は、炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＴＮＦαの生産である；したがって、本発明の化合物の有効性は、これらのサイトカインのいずれか又は全ての血清レベルの減少についてのＥＬＩＳＡ試験により評価できる。また、治療の効果は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞レベルの変化、体重の変化又はＨＩＶ感染若しくはＡＩＤＳ若しくはエイズ関連症候群（ＡＲＣ）に関連のある任意の他の身体状態の変化を評価することによって実証することもできる。
【００８７】
Ｖ．本発明の化合物の塩
ペプチド鎖は、典型的には酸性基又は塩基性基（例えばアミン基又はカルボキシル基）を含有するが、このような基は、必ずしも遊離塩基の形態である必要はない。ペプチドである化合物やペプチド鎖を含有する化合物に言及する場合には、当該言及には、ペプチドの塩の形態が含まれるものとする。したがって、式Ｉの化合物の塩及びその誘導体は、本発明の範囲内にある。好ましい塩は製薬上許容できる塩である。
【００８８】
用語「塩」は、本発明の化合物である遊離酸又は遊離塩基の付加塩を包含する。用語「製薬上許容できる塩」とは、薬学的応用において有用性を与える範囲内で毒性プロフィールを有する塩をいう。製薬上許容できない塩は、例えば、本発明の化合物の合成、精製又は調合過程における有用性のような、本発明の実施の際に有用性を有する、高い結晶化度といった特性を有することができる。
【００８９】
好適な製薬上許容できる酸付加塩は、無機酸又は有機酸から調製できる。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸及び燐酸が挙げられる。好適な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族、複素環式、カルボン酸及びスルホン酸類の有機酸から選択でき、その例としては、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボニン酸（パモン酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオルメタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β−ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸及びガラクツロン酸が挙げられる。製薬上許容できない酸付加塩の例としては、例えば、過塩素酸塩及びテトラフルオロホウ酸塩が挙げられる。
【００９０】
本発明の化合物の好適な製薬上許容できる塩基付加塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及び遷移金属塩などの金属塩、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩及び亜鉛塩などが挙げられる。また、製薬上許容できる塩基付加塩としては、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、クロルプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）及びプロカインなどの塩基性アミンから作られた有機塩も挙げられる。製薬上許容できない塩基付加塩の例としては、リチウム塩及びシアン酸塩が挙げられる。これらの塩の全ては、好適な酸又は塩基と式Ｉに従う化合物とを反応させることによって式Ｉに従う対応化合物から製造できる。
【００９１】
VI．医薬組成物
本発明の化合物は、製薬上許容できるキャリヤーと共に医薬組成物の形態で投与できる。このような処方物中における有効成分は、０．１〜９９．９９重量％を占めることができる。「製薬上許容できるキャリヤー」とは、処方物の他の成分と相溶性があり、かつ、受容者にとって有害ではない任意のキャリヤー、希釈剤又は賦形剤を意味する。
【００９２】
活性剤は、好ましくは、選択した投与経路及び標準的な薬務を基準にして選択された製薬上許容できるキャリヤーと共に投与される。この活性剤は、医薬品の分野における標準的な方法に従って所定の剤形に処方できる。Ａｌｐｈｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ著，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，米国ペンシルバニア州イーストンを参照されたい。好適な剤形は、例えば、錠剤、カプセル剤、溶液、点滴製剤、トローチ、坐剤又は懸濁液を含むことができる。
【００９３】
非経口投与については、活性剤は、好適なキャリヤー又は希釈剤、例えば、水、オイル（特に植物油）、エタノール、食塩水、水性デキストロース（グルコース）及び同類の糖溶液、グリセリン又はプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールと混合できる。非経口投与用の溶液は、好ましくは活性剤の水溶性塩を含有する。また、分解防止剤、酸化防止剤及び防腐剤を添加することもできる。好適な酸化防止剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、クエン酸及びその塩並びにナトリウムＥＤＴＡが挙げられる。好適な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベン又はプロピルパラベン及びクロルブタノールが挙げられる。非経口投与用の組成物は、水溶液又は非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョンの形態をとることができる。
【００９４】
経口投与にあたって、活性剤は、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、顆粒剤その他の好適な経口剤形を製造するための１種以上の固形不活性成分と混合できる。例えば、活性剤は、少なくとも１種の賦形剤、例えば、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、浸潤剤、吸収剤又は潤滑剤と混合できる。錠剤の一具体例によれば、活性剤をカルボキシメチルセルロースカルシウム、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール及びデンプンと混合させ、続いて、従来の打錠方法によって錠剤に成形することができる。
【００９５】
当該組成物は、好ましくは、単位剤形であってそれぞれの剤形が剤形１単位当たり約１〜約５００ｍｇ、さらに典型的には、約１０〜約１００ｍｇの活性剤を含有するもので処方される。用語「単位剤形」とは、ヒト患者及び他のほ乳類のために一単位の投与量として好適な物理的に分離した複数の単位であって、それぞれの単位が、所望の治療効果を生じさせるように算出された所定量の活性材料を好適な製剤賦形剤と共に含有するものをいう。
【００９６】
また、本発明の医薬組成物は、その中の有効成分の持続放出又は制御放出を与えるように、例えば、所望の放出特性を与えるために様々な割合のヒドロプロピルメチルセルロース、他の重合体マトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系、多層被覆、微小粒子、リポソーム及び／又はミクロスフェアを使用して処方することもできる。
【００９７】
一般に、放出制御製剤とは、所望期間にわたって一定の薬理活性を維持するのに必要な速度で有効成分を放出することができる医薬組成物のことである。このような剤形は、所定の期間中身体に薬剤を供給し、それによって従来の非放出制御製剤よりも長い期間にわたって薬剤レベルを治療範囲内に維持する。
【００９８】
米国特許第５，６７４，５３３号には、モギステイン（強力な末梢性鎮咳薬）を投与するための液体剤形としての放出制御医薬組成物が開示されている。米国特許第５，０５９，５９５号には、器質性精神障害の治療のために胃耐性錠剤を使用することにより活性剤を制御放出させることが記載されている。米国特許第５，５９１，７６７号には、ケトロラック（強力な鎮痛作用を有する非ステロイド系抗炎症剤）の制御投与用の液体貯留経皮貼布が記載されている。米国特許第５，１２０，５４８号には、膨潤性重合体から構成される制御放出薬剤送達装置が開示されている。米国特許第５，０７３，５４３号には、ガングリオシド−リポソームビヒクルによって封入された栄養素を含有する放出制御製剤が記載されている。米国特許第５，６３９，４７６号には、親水性アクリル系重合体の水性分散液から得られる被覆を有する安定な固形物制御放出製剤が開示されている。生分解性微小粒子は、放出制御製剤に使用するためのものとして知られている。米国特許第５，３５４，５６６号には、有効成分を含有する放出制御粉末が開示されている。米国特許第５，７３３，５６６号には、抗寄生虫組成物を放出する高分子微小粒子を使用することが記載されている。
【００９９】
有効成分の制御放出は、様々な誘導因子、例えばｐＨ、温度、酵素、水若しくは他の生理的条件又は化合物によって刺激できる。様々な薬剤放出機構が存在する。例えば、一実施形態では、患者への投与後に制御放出成分が膨張し、有効成分を放出する程度に十分に大きな多孔質の間隙を形成することができる。本発明において、用語「制御放出成分」は、医薬組成物中の有効成分の制御放出を容易にする１種以上の化合物、例えば、重合体、重合体マトリックス、ゲル、透過性膜、リポソーム及び／又はミクロスフェアであると定義される。別の実施形態では、制御放出成分は生分解性であり、これは、体内の水性環境、ｐＨ、温度又は酵素にさらされることによって誘導される。別の実施形態では、室温では固体のゾルゲルマトリックスに有効成分を取り込んだゾルゲルが使用できる。このマトリックスをゾルゲルマトリックスのゲル形成を誘導するのに十分に高い体温を有する患者、好ましくは哺乳動物に埋め込み、それによって有効成分が該患者に放出される。
【０１００】
鼻腔内投与や吸入による投与に好適な本発明の化合物の組成物が特に興味深い。
【０１０１】
本発明の化合物は、概して乾燥粉末として（そのもの又は混合物のいずれか、例えば、無水物又は一水和物、好ましくは一水和物としてのラクトース、マンニトール、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロース若しくはトレハロースとの乾燥ブレンドで又は混合成分粒子、例えばリン脂質と混合された混合成分粒子として）乾燥粉末吸入器から、或いはエアゾールスプレーとして、加圧された容器、ポンプ、スプレー、噴霧器（好ましくは電気流体力学を使用して霧状ミストを生じさせる噴霧器）から、或いはジクロロフルオロメタンなどの好適な推進剤を使用して若しくはそれを使用しないで噴霧剤として、鼻腔内投与又は吸入による投与をすることができる。
【０１０２】
加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器又は噴霧剤は、例えば、エタノール（随意に、水性エタノール）やそれに代わる活性化合物の分散、溶解若しくは延長放出用の好適な試剤、溶媒としての推進剤及びソルビタントレオレエートやオリゴ乳酸などの随意の界面活性剤を含む活性化合物の溶液又は懸濁液を含有する。
【０１０３】
乾燥粉末又は懸濁液処方物に使用する前に、薬剤生成物を吸入による送達に好適なサイズにまで微粉化する（典型的には５ミクロン未満）。これは、好適な粉末化方法、例えばスパイラルジェット磨砕、流動床ジェット磨砕、ナノ粒子を形成させるための超臨界流体処理、高圧ホモジナイズ法又は噴霧乾燥などにより達成できる。
【０１０４】
電気流体力学を使用して霧状ミストを生じさせる噴霧器に使用するのに好適な溶液処方物は、１回の作動当たり本発明の化合物を１μｇ〜２０ｍｇ含有し、作動容量は１μＬ〜１００μＬまで変更できる。典型的な処方物は、本発明の化合物、プロピレングリコール、滅菌水、エタノール及び塩化ナトリウムを含むことができる。プロピレングリコールの代わりに使用できる別の溶媒としては、グリセリン及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１０５】
吸入器又は注入器に使用するためのカプセル剤、ブリスター及び薬包（例えば、ゼラチン又はＨＰＭＣから作られたもの）は、式（Ｉ）のニコチンアミド誘導体と、ラクトースやデンプンなどの好適な粉末原料と、Ｌ−ロイシン、マンニトール又はステアリン酸マグネシウムといった性能調節剤との粉末混合物を含有するように処方できる。
【０１０６】
吸入／鼻腔内投与のための処方物は、即時放出型及び／又は放出調節型となるように処方できる。放出調節性処方物としては、遅延放出型、持続放出型、パルス放出型、制御二段階放出型、標的放出型及びプログラム放出型が挙げられる。持続放出型又は制御放出型は、例えばポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）を使用することによって得ることができる。
【０１０７】
VII．本発明の化合物を使用した治療方法
本発明の化合物はＶｉｆのマルチマー化を阻害するので、レンチウイルス感染を伴う病気及び疾患だけでなく、Ｖｉｆのマルチマー化に関連する他の疾患の治療や予防に使用できる。その方法は、ここで説明した化合物又は該化合物を含む医薬組成物の有効量を、そのような治療又は予防が必要な個体に投与することを含む。そのような治療が必要な個体とは、レンチウイルスに感染している個体又はＶｉｆのマルチマー化に関連する疾患に罹患している個体のことである。そのような予防が必要な個体とは、当該ウイルスに実際にさらされている又はさらされるおそれがあるため、ウイルスに感染するリスクのある個体のことである。
【０１０８】
特定の実施形態では、当該化合物は、（１）レンチウイルス、特にＨＩＶ−１に関連する病気、疾患若しくは状態；又は（２）試験管内（若しくは生体内）アッセイによりＶｉｆアンタゴニスト投与の効用が示された病気、疾患又は状態において、治療のために（予防を含む）投与される。ＨＩＶ−１の存在は、当該技術分野において標準的な任意の手段によって、例えば患者の血液試料を得て、そして当該試料についてＨＩＶ−１の存在を検定することによって容易に検出できる。
【０１０９】
予防は、ＨＩＶウイルスに短期間さらされたことが分かった又はそれが疑われた後の、以前には未感染の個体に必要である。このようなペプチドの予防的使用の例としては、母親から乳幼児へのウイルス感染の予防及びＨＩＶ感染の可能性がある他の状況、例えば労働者がＨＩＶを含む血液製剤にさらされる医療現場での事故の予防が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
特定の疾患又は状態の治療に有効な本発明の治療剤の量は、当該疾患又は状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定される。さらに、試験管内アッセイを適宜使用して最適な投与量の範囲を特定するのに役立ててもよい。また、処方物に使用されるべき正確な投与量も投与経路及び病気、疾患又は状態の重症度に依存し、医師の判断及び各患者の事情に従って決定される。
【０１１１】
また、薬剤の組合せを投与することによるＨＩＶ−１感染症及び／又はＡＩＤＳの治療方法又は予防方法も提供する。この方法は、そのような治療又は予防が必要な個体に、ここで説明した化合物又は該化合物を含む医薬組成物の有効量を逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤又は融合阻害剤（以下、まとめて「従来のＨＩＶ薬剤」という。）よりなる群から選択される１種以上の化合物と共に投与することを含む。
【０１１２】
販売されている従来のＨＩＶ−１薬剤について、好適な投与量及び投与手順は、製造業者が推奨するものであり、例えばＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，第６０版（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２００６）に公開されている。その開示の全体を参照によって援用する。販売されている薬剤及び治験用化学療法剤の両方について、好適な投与量は、この文献において、当該化合物の臨床試験の報告として言及され、公開されている。当業者であれば、任意の特定の兆候にとって好適な投与量及び投与手順を決定するに際してこのような情報源を参照するであろう。このような確立したプロコールは、従来のＨＩＶ薬剤を式Ｉの化合物とは別の組成物で投与している場合には特に好ましい。したがって、特定の実施形態では、従来のＨＩＶ薬剤の投与の投与量、処方、投与経路及び投与計画は、当該薬剤に関する既知のプロトコールに従って実施される。しかしながら、ＨＩＶ−１薬剤と本発明の化合物とを併用することの見込まれる利点は、これらの化合物を別々に使用した場合に見込まれるよりも少ない投与量でこれらの化合物のいずれか又は両方を使用することが可能になる場合があることである。
【０１１３】
VIII．本発明の化合物の投与
当該化合物は、経口投与、直腸内投与、肺内投与、舌下投与及び非経口投与を含めた任意の経路で投与できる。非経口投与としては、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、膣内投与、嚢内投与（例えば、膀胱に）、皮内投与、経皮投与、局所投与又は皮下投与が挙げられる。典型的には、１日当たり少なくとも１回、典型的には１日当たり１回、２回、３回又は４回、薬剤の一定の存在を維持してウイルスを抑制し、かつ、耐性発現の機会を減らすために昼夜を通して等間隔で所定の投与量を与えて治療を施す。
【０１１４】
本発明の１種以上の化合物は、同一の若しくは異なる経路で又は治療中の様々な時点で同時に投与できる。また、本発明の化合物は、従来のＨＩＶ薬剤と組み合わせて処方することもできる。このような組合せで使用する場合に、本発明の化合物及び従来のＨＩＶ薬剤は、同一の若しくは異なる経路で又は治療中の様々な時点で同時に投与できる。選択した従来のＨＩＶ薬剤の投与量は、使用される特定の化合物と、投与の経路及び頻度に依存するであろう。典型的には、従来のＨＩＶ薬剤による治療も１日当たり少なくとも１回、典型的には１日当たり１回、２回、３回又は４回行われ、この場合、必ずしも本発明の化合物と同じスケジュールに従う必要はないが、昼夜を通して等間隔で所定の投与量が与えられるであろう。
【０１１５】
治療は、必要に応じてある程度長い期間にわたり実施できる。典型的には、感染を繰り返す間には治療が無期限に続行されるものと考えられるが、ただし、例えばウイルスによる耐性の発現のため当該化合物がもはや薬効を生じない場合には、中断を指示することができるであろうと考えられる。治療にあたる医師であれば、患者の反応に基づいて治療を増やし、減らし又は中断する方法が分かるであろう。
【０１１６】
細胞増殖性疾患の治療について治療効果を得るための本発明に従う化合物の具体的な投与量は、勿論、患者の身長、体重、年齢及び性別、病気の性質及び段階、病気の攻撃性並びに化合物の投与経路を含めた個々の患者の特定の状況によって決定されるであろう。
【０１１７】
例えば、約０．０２〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の１日投与量を使用できる。また、これよりも多い又は少ない投与量も想定される。場合によっては、これらの範囲外の投与量を使用する必要があるかもしれないからである。この１日投与量は分割できる。例えば、１日の投与につき２〜４回に等しく分割できる。静脈内投与について好適な投与量の範囲は、概して体重１ｋｇ当たり約２０〜５００マイクログラムである。
【０１１８】
鼻腔内又は吸入投与にとって好適な投与量範囲は、概して、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。乾燥粉末吸入器及び噴霧器の場合には、投与単位は、定量を供給するバルブにより決定される。単位は、本発明に従い、典型的には定量又は適当量を供給する「ひと吹き」を投与するようにアレンジされる。１日投与量は、その日を通して単回投与で又は分割投与として投与できる。
【０１１９】
坐剤は、一般に、０．５重量％〜１０重量％の範囲の有効成分を含有する；経口処方物は、好ましくは１０％〜９５％の有効成分を含有する。
【０１２０】
有効量は、試験管内モデル試験系又は動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定できる。
【０１２１】
また、本発明は、本発明の医薬組成物の成分のうち１種以上が充填された１個以上の容器を含む医薬パック又は医薬キットも提供する。随意に、このような容器には、医薬品又は生物製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知が添付され、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売に関する機関による認可を示す。
【実施例】
【０１２２】
例
次の例は本発明を例示するために提供するものであり、本発明を限定するものではない。
【０１２３】
例１〜３９．本発明の例示化合物
表３に示すペプチドは、本発明の範囲内にある化合物の例示である。
【表３−１】
【表３−２】
【０１２４】
例４０．タンパク質発現及び試験管内結合アッセイ
Ｖｉｆに結合する化合物は、例えば、試験管内結合アッセイを使用して同定できる。このアッセイは、米国特許第６，６５３，４４３号に記載されたとおりに実施できる。基本的に次のとおりである。
Ｖｉｆ遺伝子を有する又は有しないベクターｐＧＥＸでＢＬ２１コンピテント細胞（ノバゲン社，米国ウィスコンシン州マジソン）を形質転換させる。３７℃でおよそ０．６のＯＤまで増殖させた後に、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆタンパク質の発現を０．４ｍＭのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導する。これらの細菌細胞を、溶解緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２μｇ／ｍＬのロイペプチン及び１μｇ／ｍＬのアプロチニン）を添加し、その後超音波処理により溶解させる。この試料を１２０００ｇで１０分間にわたり４℃でペレット化させ、その上澄みをグルタチオン結合アガロースビーズ（シグマ社，米国ミズーリ州セントルイス）カラムに加える。バッチ結合後に、そのマトリックスを３回、各回毎に１０ベッド容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加することによって洗浄する。次いで、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆが結合したアガロースビーズを分注し、そして−２０℃で保存した。
逆に、35Ｓ−標識Ｖｉｆは、ＳＰＴ３キット（ノバゲン社，米国ウィスコンシン州マジソン）を利用して合成する。製造業者が提供するプロトコールに従う。試験管内で翻訳した後に、ＲＮアーゼＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を添加して反応を停止させ、ｔＲＮＡと試験管内で翻訳したｍＲＮＡとを除去する。トリクロル酢酸（ＴＣＡ）不溶性放射活性アミノ酸をシンチレーションカクテルの存在下で定量した。
ＧＳＴプルダウンアッセイについては、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆ結合ビーズスラリーと35Ｓ−標識Ｖｉｆとを結合用緩衝液［１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００］中で混合させる。４℃で１時間の結合後に、この混合物を３０００ｇで１分間遠心分離し、そしてビーズを結合用緩衝液で３回洗浄する。この35Ｓ−標識Ｖｉｆタンパク質を、ＳＤＳ含有添加液を添加し、そして９５℃で５分間加熱することによってビーズから分離させる。次いで、これらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（米国カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオ・ラド社が製造する１５％のトリス−ＨＣｌ既製ゲル）で電気泳動する。固定用緩衝液（１０％酢酸、１０％メタノール）で処理し、次いで増幅（アマシャム・ファルマシア社，米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）した後、これらのゲルを乾燥させ、そしてＸ線フィルムに暴露し又は蛍光体画像を使用して定量分析した（モレキュラー・ダイナミクス社，米国カリフォルニア州サニービュー）。
Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合アッセイをＧＳＴプルダウンアッセイと同様に実施したが、ただし、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆ結合ビーズスラリーと35Ｓ−標識Ｖｉｆ及び試験ペプチド又は試験分子とを結合用緩衝液中で混合させた。これらの結果をＧＳＴプルダウンアッセイからの結果（これを１００％と表す）と比較する。
【０１２５】
例４１．配列番号１のアミノ酸配列のペプチドがウイルス感染を阻害するのに必要な最低限の配列を有することの実証
配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドの様々な切断型アナログを調製してウイルス感染を阻害するのに必要な最低限のペプチドを決定した。これらの化合物を、ＰＢＭＣにＨＩＶ−１NL4-3ウイルスを感染させた（ＭＯＩ：０．１）ウイルス感染力アッセイで試験した。ウイルス生産量をｐ２４ＧａｇＥＬＩＳＡ（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して細胞培養液中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原レベルを検出することによって監視した。これらの実験の結果を表４にまとめる。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、２５９６のＭ．Ｗ．と、１２．３９という塩基性の等電点（ｐＩ）と、約１ｍｇ／ｍＬの溶解度とを有していた。
【０１２８】
例４２．配列番号２のアミノ酸配列のペプチドがヒトＴリンパ芽球様Ｈ９株細胞においてＨＩＶ−１NL4-3ウイルスを阻害することの実証
ウイルス感染力アッセイを、配列番号２及び配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド並びに配列番号３５のアミノ酸配列の対照ペプチドの存在下又は非存在下で、Ｈ９細胞内でＨＩＶ−１NL4-3ウイルスを使用し、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原を検量することにより実行した。この手順は、基本的に、次の方法について記載されているＢ．Ｙａｎｇ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８（８），６５９６−６０２に記載されたとおりに実行した。Ｈ９細胞（１×１０6）とＨＩＶ−１NL4-3ウイルスとを０．０１の感染効率で混合させた。３７℃で５時間インキュベートした後に、過剰のウイルスを除去し、そして細胞を、５０μＭ濃度のペプチドを有する又は有しないＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎仔血清の存在下で培養した。３〜４日毎に、上澄みを集め、補給した。これらのペプチドがウイルス感染力に及ぼす影響を、細胞培養液の上澄み中におけるＨＩＶ−１ｐ２４抗原レベルをＥＬＩＳＡにより検出することによって監視した。
これらの実験の結果を図３に示す。配列番号２のアミノ酸配列のペプチド及び配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドは、両方とも、未処理細胞又は配列番号３５のアミノ酸配列の対照ペプチドで処理した細胞と比較して、ウイルスの複製を阻害した。
【０１２９】
例４４．ＭＴ−２細胞での低感染効率急性感染（ＭＯＩ）アッセイにおける本発明の化合物の評価手順
ＭＴ−２細胞及び研究室適応ＨＩＶ−１IIIB株を、米国メリーランド州ロックビルのＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから得た。
９６ウェルマイクロタイタープレート中で次の標準的なプロトコールを使用してＭＴ−２細胞に感染させた。既知濃度の試験化合物又はコントロール（ネガティブコントロールとして水又はポジティブコントロールとしてＡＺＴ ）の溶液（５０μＬ）を１ウェル当たり２．５×１０3個細胞の密度で蒔かれたＭＴ−２細胞（５０μＬ）に三通り添加した。これらウェルにＨＩＶ−１IIIBウイルスを１００μＬの容量で０．１０、０．０３２、０．０１及び０．００３２μＬ／ウェルのＭＯＩで添加した。感染したＭＴ−２細胞でのウイルス複製を逆転写酵素アッセイによって毎日監視した。試験化合物（又はコントロール化合物）を、一日おきに、除去した上澄みの容量に相当する容量で同じ既知濃度で補充して逆転写酵素アッセイを行った。これは、この試験を通してウェル内の化合物濃度を合理的に一定に維持することを目的とするものである。培養液を、培養液の１：５分割を実施することによって８日目及び１４日目に継代培養して細胞を対数増殖期に維持する。この継代培養は、ウェルの容量の２０％（細胞及び培地）を、新鮮な組織培養培地を試験化合物（又はコントロール）の新たな試料と共に含有するウェルに移すことを伴うものであった。
ウイルス複製を評価するための逆転写酵素活性アッセイを、放射活性取り込み重合アッセイを使用して、基本的に次のとおりに実施した。トリチウム化チミジンホスフェートをパーキンエルマー社から１Ｃｉ／ｍＬで購入し、酵素反応につき１μＬを使用した。ポリ（ｒＡ）及びオリゴ（ｄＴ）を、−２０℃で維持された原液から、それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬ及び１．７単位／ｍＬの濃度で調製した。逆転写酵素反応緩衝液を毎日新たに調製した。これは、１ＭのＥＧＴＡ（１２５μＬ）、脱イオン水（１２５μＬ）、２０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１２５μＬ）、トリス（ｐＨ７．４）（５０μＬ）、ＤＴＴ（５０μＬ）及びＭｇＣｌ2（１Ｍ，４０μＬ）からなる。それぞれの反応のために、トリチウム化チミジンホスフェート（１μＬ）と、脱イオン水（４μＬ）と、ポリ（ｒＡ）及び オリゴ（ｄＴ）溶液（２．５μＬ）と、反応緩衝液（２．５μＬ）とを混合した。得られた反応混合物（１０μＬ）を丸底マイクロタイタープレートに置き、そしてウイルスを含有する上澄み（１５μＬ）を添加し、混合した。このプレートを加湿インキュベーター内において３７℃で９０分間インキュベートし、次いで反応体積の１０μＬを適当なプレートフォーマット内のＤＥＡＥろ過マット上にスポットし、５％リン酸ナトリウム緩衝液中で５分間にわたり５回洗浄し、蒸留水中で１分間にわたり２回洗浄し、７０％エタノール中で１分間にわたり２回洗浄し、次いで風乾させた。乾燥したろ過マットをプラスチック製のスリーブ内に置き、Ｏｐｔｉ−Ｆｌｕｏｒ（商標）Ｏ（液体シンチレーションカクテル，パーキンエルマー社）を各スリーブに添加した。取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ（商標）Ｔｒｉｌｕｘ）で測定した。
【０１３０】
上記実験を次のペプチドを使用して行った：
（１）Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu（配列番号３５）。
（２）Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Asn Gln Gly Gly Ser Pro Leu Pro Arg Ser Val（配列番号３６）。
（３）Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gln Gly Gly Ser Pro Leu Pro Arg Ser Val（配列番号２）。
【０１３１】
これらの実験の結果を、図４Ａ〜４Ｄ（配列番号３５のアミノ酸配列のペプチドと配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドとの比較）及び図５Ａ〜５Ｄ（配列番号２のアミノ酸配列のペプチドについての結果を示す）に示している。示したデータの他に、溶媒のコントロール（試験化合物の溶液ではなく水による細胞の偽処理）及び細胞コントロール（ウイルス感染していないＭＴ−２細胞）を他の実験と平行して実施した。
【０１３２】
高いＭＯＩ（０．１）（図４Ａ及び５Ａ）では、コントロールペプチド（配列番号３５の配列）はウイルス生産を阻害しなかったのに対し、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドは、およそ４〜５日間ウイルス生産の開始を遅延させた。配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドと同様の効果を有し、約５〜６日間ウイルス生産の開始を遅延させることが分かった。
【０１３３】
中程度に高いＭＯＩ（０．０３）（図４Ｂ及び５Ｂ）では、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドでＭＯＩ（０．１）の場合と同様の効果が見られ、約２〜３日間ウイルス生産の開始を遅延させた。配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、約３〜４日間ウイルス生産の開始を遅延させたが、およそ１１日目でピークに達した後１５日まで抑制が回復しなかった。コントロールペプチド（配列番号３５の配列）は、ウイルス生産を阻害しなかった。
【０１３４】
中程度に低いＭＯＩ（０．０１）（図４Ｃ及び５Ｃ）では、結果は、ＭＯＩ（０．０３）で観察された結果と同様であった。配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドは、およそ３〜４日間ウイルス生産の開始を遅延させたのに対し、配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、およそ５〜６日間ウイルス生産の開始を遅延させ、かつ、約１１日目でピークに達した後１５〜１６日で抑制を回復した。コントロールペプチド（配列番号３５の配列）は、ウイルス生産を阻害しなかった。
【０１３５】
試験した最も低いＭＯＩ（０．００３）（図４Ｄ及び５Ｄ）では、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドは、ウイルス生産に何らかの影響を及ぼすようには思われなかった：このペプチドに関する結果は、ウイルスコントロール及び溶媒コントロールについての結果をたどるように思われた（データは示さない）。コントロールペプチド（配列番号３５の配列）は、未処理細胞に対してウイルス生産をいくらか向上させるように思われた。配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、ウイルスコントロール試料と比較して有意な保護を与え、およそ７〜８日間ウイルス生産の開始を遅延させた。
【０１３６】
これらの結果から、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドはウイルス生産の阻害の点で活性であり、配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、試験した最も高いＭＯＩ（この場合、配列番号２のアミノ酸配列のペプチドと配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドの活性は匹敵していた）を除けば、それよりも際だって効果的であったことが示された。
【０１３７】
また、これらの結果は、特に０．０３及び０．０１のＭＯＩでの配列番号２のアミノ酸配列ペプチドの曲線間で、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドと比較して定性的な差異が観察された点でも注目に値する。上記のように、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドは、逆転写酵素レベルで判断したときに、ウイルス複製の発現を遅延させる点では効果的であったが、ウイルス複製の発現後には、実験期間にわたり逆転写酵素レベルの上昇が観察された。これに対し、配列番号２のアミノ酸配列のペプチドも、初期にウイルスレベルの上昇の遅延を示したが、その後ウイルスレベルはピークに達し、そして抑制が回復した。この結果は、配列番号１のアミノ酸配列を含む化合物（例えば配列番号２のアミノ酸配列のペプチド）においてＶｉｆ結合配列を切り詰めると、配列番号７６のアミノ酸配列を含む化合物（例えば配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド）よりもウイルスの複製を抑制する点でさらに効果的であることを示唆するものである。特に、これらの結果は、配列番号１のアミノ酸配列を含む化合物、例えば配列番号２のアミノ酸配列のペプチドが、配列番号７６のアミノ酸配列を含む化合物、例えば配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドよりもウイルス耐性の発現に対する感受性が少ないという点で、特に有利であることを示している。
【０１３８】
例４５．配列番号２のアミノ酸配列のペプチドが細胞に入ることの実証
配列番号２のアミノ酸配列のペプチドをＣ末端フルオレセインイソチオシアネート（ＦＴＩＣ）タグと共に合成した。このＦＩＴＣタグは、生細胞の蛍光顕微鏡観察により当該ペプチドの細胞取り込み及び細胞内局在を評価することを可能にする。Ｈ９細胞及びＭＴ−２細胞の培養細胞をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）が推奨する培地中で増殖させ、そしてそれぞれの培養液を培養液中で配列番号２のアミノ酸配列のＦＴＩＣタグ付きペプチドにより１回処理した。次いで、これらの細胞を培養皿中で倒立蛍光顕微鏡により様々な時点で写真撮影した。それらの画像は、細胞内の蛍光がＦＩＴＣタグ付きペプチド処理の５分後に検出され、また、ＦＩＴＣタグ付きペプチドの細胞内局在が全ての細胞で３０分以内に明確になったように、ＦＩＴＣタグ付きペプチドの細胞への迅速な取り込みを示した。細胞内での分布は、細胞質において点状及び拡散した状態であったが、細胞核内ではＦＩＴＣタグ付きペプチドは、ほとんど又は全く観察されなかった。この分布は２４〜２８時間継続したが、処理後７２時間で５０％以上減少した。
【０１３９】
核の位置を強調するために、Ｈ９細胞及びＭＴ−２細胞を、上記のとおり、配列番号２のアミノ酸配列のＦＩＴＣタグ付きペプチドで処理し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．４％トリトンＸ−１００で透過処理し、そしてＤＮＡ選択的染料の４'、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。この実験の結果を図６に示す。図６は、ＦＩＴＣタグ付きペプチドによる１回の処理の２４時間後にそれぞれ撮影した、細胞核及び配列番号２のアミノ酸配列のタグ付きペプチドに対するＤＡＰＩ及びＦＩＴＣタグ染色の個々の画像及び画像オーバーレイ（組合せ）を示す。これらの結果は、配列番号２のアミノ酸配列のＦＩＴＣタグ付きペプチドが細胞に入り、細胞質に局在しているものの、核には存在していなかったことを示す。
【０１４０】
例４６．配列番号２のアミノ酸配列のペプチドがＶｉｆ／ｈＡＧ３仮定機構により特異的に作用することの実証
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｈＡ３Ｇを発現しない）及びｈＡ３ＧのｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プロウイルスＤＮＡ又はＶＳＶ−ＧのｃＤＮＡで偽型化されたΔＶｉｆウイルスＤＮＡ（ｅｎｖを欠失）のいずれかをトランスフェクトし、そしてウイルス粒子を生産させた。この方法では、Ｖｉｆを有するウイルスとＶｉｆを有しないウイルスとの両方が生産できた。これは、ΔＶｉｆウイルスがＶｉｆコード配列内に終止コドンを有し、Ｖｉｆ発現が阻害されるからである。
これらの細胞を、感染前の２時間、感染後の１０時間及び感染後の２４時間、未処理のまま放置するか又は配列番号２のアミノ酸配列のペプチドで処理した。同時感染後４８時間で細胞培養液の上澄みを集め、そしてろ過してウイルス粒子を得た。各ウイルスストックのｐ２４（Ｇａｇ）含有量をＥＬＩＳＡ（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ）で評価し、そして、これらのウイルスストックを１０ｎｇのｐ２４に基準化してから次の段階、すなわち、９６ウェルプレート内でのＪＣ５３ＢＬレポーター細胞の感染を行った。
ＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５（ＪＣ５３）株細胞は、ＣＤ４及びＣＣＲ５の両方の表面レベルを比較的高く発現し、Ｒ５ＨＩＶ−１単離体及びＸ４ＨＩＶ−１単離体の両方による感染に対して感受性がある。ＨＩＶ−１プロモーターの調節下でβ−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼを発現するＪＣ５３ＢＬ細胞を使用する、ＨＩＶ−１による感染についてのレポーター遺伝子アッセイが開発されている。Ｘ．Ｗｅｉ外，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２００２，４６（６），１８９６−１９０５。
そのため、ＪＣ５３ＢＬレポーターアッセイを使用して当該細胞のそれぞれが生産したウイルスの感染力を測定することができる。感染を細胞溶解及びルシフェラーゼ基質（プロメガ社）添加前の４８時間に開始させた。生じた発光をビクター３プレートリーダー（パーキンエルマー社）で測定した。発光レベルは、各条件下で生産されたウイルスの感染力と相互に関連があった。
【０１４１】
図７は、ｈＡ３Ｇ遺伝子をトランスフェクトし、かつ、Ｖｉｆ陽性ウイルスを感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（「＋Ｖｉｆ，＋ｈＡ３Ｇ」）及びＶｉｆ陰性ウイルスを感染させたＨＥＫ２９３Ｔ（非ｈＡ３Ｇ発現）細胞（「−Ｖｉｆ，−ｈＡ３Ｇ」）から生成されたウイルスの培養液によるＪＣ５３ＢＬレポーター細胞感染性アッセイの結果を示している。配列番号２のアミノ酸配列のペプチドによる処理を行わない場合には、ｈＡ３Ｇ遺伝子をトランスフェクトし、かつ、Ｖｉｆ陽性ウイルスを感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（「＋Ｖｉｆ，＋ｈＡ３Ｇ」）から生成されたウイルスは、感染性のウイルスを生産した。これは、ｈＡ３ＧのＶｉｆ−仲介破壊がｈＡ３Ｇの保護効果に打ち勝つためである。同様に、Ｖｉｆ陰性ウイルス（「−Ｖｉｆ，−ｈＡ３Ｇ」）を感染させた非ｈＡ３Ｇ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生成されたウイルスも感染性ウイルスを生産する。これは、ｈＡ３Ｇの保護効果が存在しないためである。配列番号２のアミノ酸配列のペプチドによる処理の場合には、Ｖｉｆ陽性ウイルスを感染させたｈＡ３Ｇ発現細胞が生産するウイルスについて感染性が生じた。Ｖｉｆ陰性ウイルスを感染させた非ｈＡ３Ｇ発現細胞によって生産されたウイルスの感染性については、何の影響も観察されなかった。これは、Ｖｉｆの抑制によって仲介される配列番号２のアミノ酸配列のペプチドの抗ウイルス効果と一致する。Ｖｉｆの抑制によってｈＡ３Ｇの保護効果が回復するからである。ｈＡ３Ｇは、ウイルスＤＮＡを過剰変異させ、それによってウイルス生産が少なくなり及び／又は不完全な（すなわち感染力の低い）ウイルスが生産される。感染力の低下は、Ｖｉｆ陰性ウイルスを感染させた非ｈＡ３Ｇ発現細胞では観察されないが、これは、このペプチドが、Ｖｉｆ及び／又はｈＡ３Ｇを必要としないウイルス生活環におけるいずれのプロセスも妨害しないことを示唆する。
【０１４２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び公開された特許出願などの全ての文献は、参照により援用される。本発明は、本発明の精神又は本質的属性から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化できるため、本発明の範囲の基準としては、本明細書ではなく添付した請求の範囲を参照すべきである。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）による感染症及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療のための化合物、組成物及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトレンチウイルスであるＨＩＶ−１は、ＡＩＤＳの主要原因病原体であり、現在のところ、全世界でおよそ４２００万人の人々がこれに感染し、北アメリカでは１００万人の人々が感染している。
【０００３】
有効な治療計画にかなりの努力が注がれてはいるものの、今のところ入手可能な薬剤は、ＡＩＤＳを治癒させるのには有効でない。このような薬剤を開発するにあたって、ＨＩＶ−１生活環のいくつかの段階が治療介入のためのターゲットとして考慮されてきた（Ｈ．Ｍｉｔｓｕｙａ外，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１９９１，５，２３６９−８１）。ＨＩＶ−１生活環による治療介入のために多くのウイルス標的が提案されている。ＨＩＶ−１感染及びＡＩＤＳの治療に見込みのある薬剤標的の一部を示すＨＩＶ−１生活環の略図を図１に示す。現在のところ利用可能な治療のほとんどは、逆転写酵素又はＨＩＶ−１タンパク質分解酵素を阻害する。近年、新たな作用機序を持つ薬剤であるエンフビルチドが認可された。エンフビルチドは、ＨＩＶ−１とＣＤ４陽性宿主細胞の膜との融合に関与する当該ウイルスのエンベロープ糖蛋白質４１の所定領域に結合し、それによってＨＩＶ−１とＣＤ４陽性細胞の膜との融合を阻害するペプチドである（Ｊ．Ｐ．Ｌａｌｅｚａｒｉ外，「Ｅｎｆｕｒｖｉｒｔｉｄｅ，ａｎ ＨＩＶ−１ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｆｏｒ ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｒｔｈ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ」，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００３，３４８，２１７５−８５）。
【０００４】
ＨＩＶ−１に対する新たな治療計画から、逆転写酵素（ＲＴ）を標的にするアジドチミジン（ＡＺＴ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）といった抗ＨＩＶ化合物の組合せとＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤とを併用することで、ウイルス量について、ＡＺＴ単独（約１ログ減少）と比較して極めて大きな効果が得られる（２〜３ログの減少）ことが示されている。その一例は、ＡＺＴと、ｄｄＩと、３ＴＣと、リトナビルとの組合せである（Ａ．Ｓ．Ｐｅｒｅｌｓｏｎ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，１５：１５８２−８６）。
【０００５】
表１は、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの治療のために米国食品医薬品局が現在認可している薬剤を列挙している。
【表１】
【０００６】
これらの進展にも拘わらず、依然としてＨＩＶ−１感染及びＡＩＤＳに対して有効な新規薬剤に対する要望がある。現在利用可能な治療剤を含むこれらの化学物質の組合せを長期間使用すると、特に骨髄に対して毒性となる可能性がある。また、長期にわたる細胞傷害性療法は、キラー細胞活性によって（Ｖ．Ｂｌａｚｅｖｉｃ外，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９５，１１，１３３５−４２）及び抑制性因子、特にケモカインのランテス、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βの放出によって（Ｆ．Ｃｏｃｃｈｉ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０，１８１１−１８１５）、ＨＩＶの制御に不可欠なＣＤ８陽性Ｔ細胞の抑圧に至る可能性もある。長期にわたる抗レトロウイルス化学療法における別の大きな問題は、部分的な又は完全な抵抗性を持ったＨＩＶ突然変異体の発生である（Ｊ．Ｍ．Ｌａｎｇｅ，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９５，１０，Ｓ７７−８２）。このような変異は、抗ウイルス療法の必然的な結果であると考えられる。治療による野生型ウイルスの消失と変異体ウイルスの出現のパターンは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数の同時減少と相まって、少なくともいくつかの化合物によるウイルス変異体の出現がＡＩＤＳ治療の失敗の主な基礎的要素であることを強く示唆するものである。
【０００７】
ＨＩＶ−１ウイルスは、（ｉ）Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖといった構造タンパク質；（ii）必須トランス作用タンパク質（Ｔａｔ、Ｒｅｖ）；及び（iii）少なくともいくつかの細胞培養系における効率的なウイルス複製にとって必要ではない「補助」タンパク質（Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ）を含む、遺伝子産物の３つの主要なクラスをコードする１０ｋｂの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを含む。
【０００８】
ＨＩＶ−１に感染した個人を治療するアプローチの一つは、このような個人に、ヒト細胞内でＨＩＶ−１自身が複製する機構に直接的に干渉し、そしてそれを阻害する化合物を投与することである。
【０００９】
そのようなタンパク質の１種であるＶｉｆ（viral infectivity factor：ウイルス感染因子）は、ウマ伝染性貧血ウイルスを除く既知のレンチウイルスの全てで発現している。ＨＩＶ−１のＶｉｆタンパク質は、１９２個のアミノ酸から構成される２３ｋＤａの高塩基性タンパク質である。ＨＩＶ−１に感染した個人からのウイルスＤＮＡの配列分析から、Ｖｉｆの翻訳領域は損なわれていないことが明らかになった（Ｐ．Ｓｏｖａ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５，６９，２５５７−６４；Ｕ．Ｗｉｅｌａｎｄ外，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４，２０３，４３−５１；Ｕ．Ｗｉｅｌａｎｄ外，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７，７８，３９３−４００）。Ｖｉｆは、細胞の抗ウイルス系の作用を克服することができる能力のため、生体内だけでなく、所定の宿主細胞型においては試験管内においてもウイルスが効率的に複製するのために必要なものである。Ｖｉｆ遺伝子が欠失すると、マカクにおいてサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の複製が劇的に減少し、しかも、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスにおいてＨＩＶ−１の複製が劇的に減少する（Ｇ．Ｍ．Ａｌｄｒｏｖａｎｄｉ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９６，７０，１５０５−１１；Ｒ．Ｃ．Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８，７２，１４３１−３７）が、これは、Ｖｉｆ遺伝子が生体内におけるレンチウイルスの病因的複製にとって不可欠であることを示している。
【００１０】
近年の研究から、生体内におけるＨＩＶ−１ウイルスの複製にＶｉｆが重要であることの根拠となる機構が解明された（この重要性は、ｈＡ３Ｇ（ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）（ＣＥＭ１５）と呼ばれる宿主タンパク質の抗ウイルス効果と関連がある）。ｈＡ３Ｇはシチジンデアミナーゼファミリーに属し、新たに合成されたウイルスｃＤＮＡにおいてＧからＡへの高頻度変異を誘導する。ｈＡ３Ｇがウイルス粒子にパッケージングされると、逆転写中に当該ウイルスのマイナス鎖ｃＤＮＡの高頻度変異が生じ、それによって当該ウイルスの複製が阻害され得る。Ｒ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓ外，Ｃｅｌｌ，２００３，１１３，８０３−０９；Ｂ．Ｍａｎｇｅａｔ外，Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２４，９９−１０３。ｈＡ３Ｇの抗ウイルス効果と同じく、ｈＡ３ＧのｍＲＮＡレベルとＨＩＶウイルス量とＣＤ４細胞数との間には相関関係が認められており、これらは、いずれも、抗レトロウイルス薬その他の治療介入を受けていない患者におけるＨＩＶ疾患の進行の予測因子である。さらに、抗ウイルス治療をしていなくても疾患の進行速度が低いＨＩＶ感染患者（「長期未発症者」）は、ｈＡ３ＧのｍＲＮＡレベルが、ＨＩＶ未感染の対照者や、ｈＡ３ＴＧのｍＲＮＡレベルがＨＩＶ未感染の対照者よりも有意に低い疾患進行患者よりも有意に高いことが分かった。Ｘ．Ｊｉｎ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００５，７９（１７），１１５１３−１６。
【００１１】
ＨＩＶ−１複製に対するＶｉｆの重要性は、ｈＡ３Ｇによって与えられる宿主防御機構を克服するその役割によるものであると考えられる。Ｖｉｆは、ｈＡ３Ｇの抗ウイルス活性をユビキチン−プロテアソーム経路による破壊の標的にすることによって当該抗ウイルス活性に対抗する。Ｖｉｆは、ｈＡ３Ｇと複合体を形成し、ｈＡ３Ｇのユビキチン化を促進し、それによってｈＡ３Ｇをユビキチン−プロテアソーム経路による分解の標的にする。Ａ．Ｍｅｈｌｅ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９（９），７７９２−９８。Ｂ．Ｒ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６，８０，１０６７−７６。
【００１２】
ＨＩＶ−１に対する宿主細胞防御を逃れる際のＶｉｆの効果に関する詳細な分子機構は依然として不明であるが、マルチマーを形成するためのＶｉｆの自己会合が重要な役割を果たしている可能性があるとの仮説が立てられており、また、Ｖｉｆのマルチマー化が当該ウイルスの生活環におけるＶｉｆの機能に必要であることが分かっている。Ｓ．Ｙａｎｇ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６（７），４８８９−９３。Ｖｉｆ集合は単に偶然の集合によるものではなく、Ｖｉｆの自己会合に作用する特定のドメインがこのタンパク質のＣ末端、特に、プロリンが豊富な１５１−１６４領域に位置し、Ｖｉｆのマルチマー化に関与していることが実証されている。
【００１３】
細胞培養系では、Ｖｉｆ欠損（Ｖｉｆ-）ＨＩＶ−１は、所定の細胞、例えば、Ｈ９Ｔ細胞、末梢血単核球細胞及び単球由来マクロファージにおいて感染を確立することができない。そのため、これらの細胞は非許容であると分類されるに至っている。他の細胞では、Ｖｉｆ遺伝子は必要とされない；これらの細胞は、許容と分類されている。この現象を利用して、Ｙａｎｇ外は、Ｖｉｆ集合（マルチマー化）が、ウイルス感染力の増進に果たすＶｉｆの役割に不可欠であることを実証した。Ｙａｎｇ外は、変更１ラウンドウイルス感染力アッセイで様々なＶｉｆ変異体を試験した。野生型Ｖｉｆ又はその変異体は、非許容Ｈ９Ｔ−細胞内で発現した。同時に、偽型（ＶＳＶ外被を有する）ＨＩＶ−１ウイルスは、それらのゲノム中にＶｉｆ及びｅｎｖがなくても、これらの細胞から生産された。これらの組換えウイルスは、ＨＩＶ−１末端反復配列のプロモーター駆動ＣＡＴ遺伝子を含有する発現カセットを内部に持つ標的細胞に感染することができた。そのウイルス感染力が標的細胞内におけるＣＡＴ遺伝子発現のレベルによって測定された。野生型Ｖｉｆ遺伝子がＶｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルス生産性非許容Ｈ９Ｔ細胞内で発現したときに、高レベルのウイルス感染力が観察された。しかしながら、その結合領域を欠失したＶｉｆ変異体（ＶｉｆΔ１５１−１６４）がＶｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルス生産性非許容Ｈ９Ｔ細胞内で発現した場合には、そのウイルス感染力は、Ｖｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルスと比較してもほとんど変わらなかったが、これは、その欠失がＶｉｆタンパク質の機能を大幅に低下させ、非許容Ｔ細胞から生じたＶｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルスの感染力を奪回できなくしたことを示唆する。この実験は、Ｖｉｆタンパク質のマルチマー化がＶｉｆ機能に必要であることを実証した。Ｓ．Ｙａｎｇ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６（７），４８８９−９３。また、Ｖｉｆの走査突然変異解析から、感染力に対する結合領域の重要性、特に１６１−１６３の３つの残基（ＰＰＬ）の重要性も実証された。これらのものは、機能を失うことなく個々に置換できたが、３つの残基全てを置換すると機能が大幅に抑制された。Ｊ．Ｈ．Ｍ．Ｓｉｍｏｎ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３（４），２６７５−８１。
【００１４】
Ｖｉｆタンパク質のマルチマー化がウイルスの生活環におけるＶｉｆ機能に必要であるという発見により、これが抗ＨＩＶ−１療法のための見込まれる新規な標的として提案されるに至った。この仮説を図２Ａ及び２Ｂに示す。上記研究で示されたように、Ｖｉｆのマルチマー化は、ＨＩＶ−１感染細胞におけるＶｉｆの作用に必須であると思われる。Ｖｉｆが細胞質において正常に機能すると、Ｖｉｆは二量体化し、生じたＶｉｆダイマーは、ｈＡ３Ｇをユビキチン化による修飾の標的にする；そして、結果として、ｈＡ３Ｇはプロテオソームによって破壊され、ＨＩＶの生活環は中断すると考えられる。つまり、Ｖｉｆが正常に機能している場合には、そのウイルスは、ｈＡ３Ｇの抗感染機能に打ち勝つ。これに対し、Ｖｉｆ機能が損なわれると（例えば、Ｖｉｆの二量体化を阻害する薬剤の作用により）、ＨＩＶ−１は、依然としてＣＤ４に結合してＴ細胞に侵入することができると考えられるものの、ｈＡ３Ｇは逆転写中にウイルスＤＮＡを過剰変異させ、変異ウイルスＤＮＡを生じさせる。この変異ウイルスＤＮＡは破壊されるか又は染色体ＤＮＡに不完全な形態で組み込まれるかのいずれかであろう。この変異ＤＮＡが転写された場合には、生じたＲＮＡは機能タンパク質をほとんど又は全くコードしておらず、しかもその細胞によって生産されるＨＩＶ−１ウイルスのほとんどは、不完全でかつ非感染性であろう。
【００１５】
Ｙａｎｇ外は、ＨＩＶ−１のＶｉｆタンパク質に結合するＰＸＰモチーフを含むペプチドを同定した。これらの高プロリンペプチドは、試験管内でＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を阻害することが分かった。さらに、ＨＩＶ−１のＶｉｆタンパク質配列の全アミノ酸をカバーするペプチドが調製され、そして161ＰＰＬＰ164ドメインを含有する高プロリンペプチドがＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を阻害できることが分かった。この研究から、高プロリンペプチドは、161ＰＰＬＰ164ドメインによって形成されるＶｉｆのポリプロリン界面に干渉することを通してＶｉｆのマルチマー化をブロックすると結論付けられた。さらに、試験管内でＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を阻害するこれらのペプチドは、「非許容」Ｔ細胞内でＨＩＶ−１の複製を阻害することが分かった。Ｂ．Ｙａｎｇ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８（８），６５９６−６０２。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】J.P.Lalezari外,「Enfurvirtide,an HIV-1 fusion inhibitor,for drug-resistant HIV infection in North and South America」,N.Engl.J.Med.,2003,348,2175-85
【非特許文献２】A.S.Perelson外,Science,1996,15:1582-86
【非特許文献３】V.Blazevic外,AIDS Res.Hum.Retroviruses,1995,11,1335-42
【非特許文献４】F.Cocchi外,Science,1995,270,1811-1815
【非特許文献５】J.M.Lange,AIDS Res.Hum.Retroviruses,1995,10,S77-82
【非特許文献６】P.Sova外,J.Virol.1995,69,2557-64
【非特許文献７】U.Wieland外,Virology,1994,203,43-51
【非特許文献８】U.Wieland外,J.Gen.Virol.,1997,78,393-400
【非特許文献９】G.M.Aldrovandi外,J.Virol.,1996,70,1505-11
【非特許文献１０】R.C.Desrosiers外,J.Virol.,1998,72,1431-37
【非特許文献１１】R.S.Harris外,Cell,2003,113,803-09
【非特許文献１２】B.Mangeat外,Nature,2003,424,99-103
【非特許文献１３】X.Jin外,J.Virol.,2005,79(17),11513-16
【非特許文献１４】A.Mehle外,J.Biol.Chem.,2004,279(9),7792-98
【非特許文献１５】B.R.Cullen,J.Virol.2006,80,1067-76
【非特許文献１６】S.Yang外,J.Biol.Chem.,2001,276(7),4889-93
【非特許文献１７】J.H.M.Simon外,J.Virol.,1999,73(4),2675-81
【非特許文献１８】B.Yang外,J.Biol.Chem.,2003,278(8),6596-602
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の概要
本発明によれば、Ｖｉｆのマルチマー化を阻害し、かつ、ＨＩＶ−１に対して有効な化合物及び組成物であって、ＨＩＶ−１感染及びＡＩＤＳなどの、Ｖｉｆのマルチマー化がウイルスの複製に必要な疾患又は状態を治療するのに有用な化合物及び組成物が提供される。
【００１８】
本発明の一態様としては、次式Ｉの化合物：
Ｘ1−Ｍ−配列番号１ （Ｉ）
又はその誘導体
（式中、
Ｘ1−Ｍ−は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に結合したタンパク質導入ドメインを有する随意の基を表し、ここで、
Ｘ1はタンパク質導入ドメインを表し；
−Ｍ−は、単結合又は該タンパク質導入ドメインと該配列番号１のアミノ酸配列との間に共有結合を形成する随意の結合基を表し；
ただし、該化合物が配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に直接結合するアミノ酸を含む場合には、該Ｎ末端に直接結合するアミノ酸はアスパラギン以外であるものとする。）
を提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施形態は、式Ｉに従う化合物が配列番号１のアミノ酸配列のペプチド又は配列番号２のアミノ酸配列のペプチドであるものである。
【００２０】
本発明の他の特定の実施形態は、式Ｉに従う化合物が配列番号３のアミノ酸配列を含むものである。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、タンパク質導入ドメインが配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を含む（随意に当該アミノ酸配列からなる）ものである。
【００２２】
本発明の別の態様としては、製薬上許容できるキャリヤー及び式Ｉに従う化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
本発明の別の態様としては、ある個体でのウイルスの複製にＶｉｆタンパク質のマルチマー化を必要とする疾患又は状態の治療方法であって、そのような治療が必要な個体に、本発明に従う化合物又はその実施形態のいずれかの治療上有効な量を投与することを含むものを提供する。
【００２４】
ＨＩＶ−１感染の治療又は予防方法であって、そのような治療が必要な個体に、本発明に従う化合物又はその実施形態のいずれかの治療上有効な量を投与することを含むものを提供する。
【００２５】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療又は予防方法であって、そのような治療が必要な個体に、本発明に従う化合物又はその実施形態のいずれかの治療上有効な量を投与することを含むものを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
図面の簡単な説明
【図１】治療介入のための薬剤標的を表すＨＩＶの生活環を示す概略図である。（１）ＨＩＶが免疫系細胞に融合し、そのＲＮＡを放出する；（２）ＨＩＶのＲＮＡが逆転写酵素の作用によりＤＮＡに変換される；（３）このウイルスＤＮＡが宿主細胞の核に入り、ＨＩＶインテグラーゼの作用により宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる；ウイルスＲＮＡが作られ、タンパク質が生産され、そしてウイルス構築のためにＨＩＶプロテアーゼがタンパク質をプロセシングする；（５）細胞からＨＩＶウイルスが出芽し、続けて他の細胞に感染する。
【図２】図２Ａ及び２Ｂ：提案されたＶｉｆアンタゴニスト作用機序を示す概略図である。Ｖｉｆが細胞質において正常に機能する場合（図２Ａ）：（１）細胞質中でＶｉｆが二量体化する（この二量体化はＶｉｆ機能に不可欠である）；（２）ＶｉｆダイマーがｈＡ３Ｇをユビキチン化による修飾の標的にする；（３）ｈＡ３Ｇがプロテオソームにより破壊されるので、ＨＩＶ生活環は中断しない。Ｖｉｆ機能が損なわれている場合（例えば二量体化の阻害により）（図２Ｂ）：（１）ＨＩＶ−１がＴ細胞に結合する；（２）ＨＩＶがそのＲＮＡをＤＮＡに変換するときに、ｈＡ３ＧがウイルスＤＮＡを高頻度変異させる；（３）変異ウイルスＤＮＡは破壊され、また、染色体ＤＮＡに組み込まれる変異ウイルスＤＮＡは不完全である；（４）変異ウイルスＲＮＡのコピーが作られたときには、高頻度変異のため、生じたＲＮＡは機能タンパク質をほとんど又は全くコードしない；（５）その結果として、生産されたＨＩＶ−１ウイルスのほとんどは不完全であり、かつ、非感染性であろう。
【図３】次のアミノ酸配列のペプチド：配列番号３６（ペプチドＡ）、配列番号３７（ペプチドＢ）若しくは配列番号２（ペプチドＣ）又は未処理対照群の存在下で培養したヒトＴリンパ芽球様Ｈ９株細胞ペプチド感染ＨＩＶ−１NL4-3ウイルスの細胞培養上澄中におけるＨＩＶ−１ｐ２４抗原レベル（ＥＬＩＳＡにより測定）のグラフ図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ２ ５０μＭ」）、５０μＭの配列番号３５のアミノ酸配列のペプチド（「Ｐ１ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図４Ａ）、０．０３の感染効率（図４Ｂ）、０．０１の感染効率（図４Ｃ）及び０．００３の感染効率（図４Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ２ ５０μＭ」）、５０μＭの配列番号３５のアミノ酸配列のペプチド（「Ｐ１ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図４Ａ）、０．０３の感染効率（図４Ｂ）、０．０１の感染効率（図４Ｃ）及び０．００３の感染効率（図４Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ２ ５０μＭ」）、５０μＭの配列番号３５のアミノ酸配列のペプチド（「Ｐ１ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図４Ａ）、０．０３の感染効率（図４Ｂ）、０．０１の感染効率（図４Ｃ）及び０．００３の感染効率（図４Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ２ ５０μＭ」）、５０μＭの配列番号３５のアミノ酸配列のペプチド（「Ｐ１ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図４Ａ）、０．０３の感染効率（図４Ｂ）、０．０１の感染効率（図４Ｃ）及び０．００３の感染効率（図４Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図５Ａ】図５Ａは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号２のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号２のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ３ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図５Ａ）、０．０３の感染効率（図５Ｂ）、０．０１の感染効率（図５Ｃ）及び０．００３の感染効率（図５Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号２のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号２のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ３ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図５Ａ）、０．０３の感染効率（図５Ｂ）、０．０１の感染効率（図５Ｃ）及び０．００３の感染効率（図５Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号２のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号２のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ３ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図５Ａ）、０．０３の感染効率（図５Ｂ）、０．０１の感染効率（図５Ｃ）及び０．００３の感染効率（図５Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＨＩＶ−１IIIBウイルスを様々な感染効率（ＭＯＩ）で有するＭＴ−２細胞中における配列番号２のアミノ酸配列のペプチド（５０μＭ）の抗ウイルス活性。ウイルス生産は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを使用して定量した。５０μＭの配列番号２のアミノ酸配列のペプチド （「Ｐ３ ５０μＭ」）、１μＭのアジドチミジン（「ＡＺＴ １μＭ」）及び未処理対照群（「ウイルスコントロール」）で処理した感染細胞の培養液についての逆転写酵素アッセイの経時グラフを示している。これらの結果は、０．１の感染効率（図５Ａ）、０．０３の感染効率（図５Ｂ）、０．０１の感染効率（図５Ｃ）及び０．００３の感染効率（図５Ｄ）で実施された細胞感染により行われた実験について示したものである。
【図６】ＦＴＩＣタグを付けた配列番号２のアミノ酸配列のペプチドで処理し、次いで２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．４％トリトンＸ−１００で透過処理し、そしてＤＮＡ選択的染料の４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色したＨ９及びＭＴ−２細胞の取得画像である。細胞核及び配列番号２のアミノ酸配列のタグ付きペプチドに対するＤＡＰＩ染色及びＦＩＴＣタグ染色の個々の画像及び画像オーバーレイ（重ね合わせ）は、それぞれ、５０μＭのＯＹＡ−００５−ＦＩＴＣで１回処理した後２４時間目に撮影した。２つの別個の細胞は、Ｈ９細胞及びＭＴ−２細胞の両方を示している。
【図７】ｈＡ３Ｇ遺伝子をトランスフェクトし、かつ、ＶＳＶ−Ｇ偽型ＨＩＶウイルス（「＋Ｖｉｆ、＋ｈＡ３Ｇ」）を感染させたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞及びＶｉｆ陰性ＶＳＶ−Ｇ偽型ＨＩＶウイルス（「−Ｖｉｆ，−ｈＡ３Ｇ」）を感染させたＨＥＫ ２９３Ｔ（非ｈＡ３Ｇ発現）細胞であって、配列番号２のアミノ酸配列のペプチドによる処理を受けたもの（「ペプチドμＭ」）又はそのような処理を受けていないもの（「ペプチドなし」）から生じたウイルスの培養によるＪＣ５３ＢＬレポーター細胞感染性アッセイの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
明細書及び添付した請求の範囲において使用するときに、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに示さない限り、複数の対象が含まれる。
【００２８】
表現「治療する」及び「治療」とは、疾患の発症の遅延及び／又は発症する若しくは発症が見込まれる症状の重症度の低減を生じさせること又はその行為を意味する。これらの用語は、これまでの症状を改善させること、さらなる症状を抑えること及び症状の基礎的代謝原因を改善させること又は同原因を抑えることをさらに包含する。
【００２９】
ある個体に対する治療を説明するために使用するときの「有効な量」という表現とは、治療上有用な効果を生じさせる化合物の量をいう。
【００３０】
ここで使用するときに、「個体」（治療の対象と同様）とは、ほ乳類、特に非ヒト霊長類、例えば類人猿及びサル、とりわけヒトを意味する。
【００３１】
本明細書において、ペプチドは、ペプチド結合で共有結合した２個以上のアミノ酸の鎖を有する有機化合物であると定義される。ペプチドは、構成アミノ酸の数を基準にして言及される場合がある（すなわち、ジペプチドは２個のアミノ酸残基を含み、トリペプチドは３個のアミノ酸残基を含むなど。）。請求項に係る発明で使用するときに、「ペプチド」とは、１０，０００ダルトン未満、好ましくは５，０００ダルトン未満、より好ましくは２，５００ダルトン未満の分子量を有する部分をいうものとする。
【００３２】
ここで使用するときに、用語「アミノ酸」とは、塩基性アミノ基と酸性カルボキシル基との両方を有する有機化合物を意味する。この用語には、天然アミノ酸（例えば、Ｌ−アミノ酸）、修飾アミノ酸及異常アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）だけでなく、遊離型又は混合型で生物学的に生じるが通常タンパク質には生じないことが知られているアミノ酸も包含される。この用語には、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＶｅｌｌａｃｃｉｏ（１９８３）「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，５：３４２−４２９に開示されたような修飾アミノ酸及異常アミノ酸も含まれる。その教示を参照により援用するものとする。天然タンパク質型のアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、チロシン、トリプトファン、プロリン及びバリンが挙げられるが、これらに限定されない。天然非タンパク質アミノ酸としては、アルギノコハク酸、シトルリン、システインスルフィン酸、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチン、３−モノヨードチロシン、３，５−ジヨードチロシン、３，５，５'−トリヨードチロニン及び３，３’，５，５’−テトラヨードチロニンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明を実施するために使用できる修飾アミノ酸又は異常アミノ酸としては、Ｄ−アミノ酸、ヒドロキシリシン、４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−Ｃｂｚ保護アミノ酸、２，４−ジアミノ酪酸、ホモアルギニン、ノルロイシン、Ｎ−メチルアミノ酪酸、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、β−フェニルプロリン、ｔ−ロイシン、４−アミノシクロヘキシルアラニン、Ｎ−メチルノルロイシン、３，４−デヒドロプロリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノグリシン、Ｎ−メチルアミノグリシン、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸、６−アミノカプロン酸、トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸、２−、３−及び４−（アミノメチル）安息香酸、１−アミノシクロペンタンカルボン酸、１−アミノシクロプロパンカルボン酸及び２−ベンジル−５−アミノペンタン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
用語「ペプチド結合」とは、第１のアミノ酸のカルボキシル基と第２のアミノ酸のアミノ基との間で水分子が失われることによって形成されたアミド共有結合を意味する。
【００３４】
用語「ペプチド骨格」とは、アミノ酸のカルボキシル基とアミノ基とを結合するアミノ酸の原子（通常はα−アミノ酸のα−炭素）と共に、ペプチド結合であるカルボキシアミド基を有するペプチドの原子鎖を意味する。
【００３５】
用語「側鎖」とは、ペプチド骨格に結合する基を意味し、典型的にはα−アミノ酸のα−炭素に結合する基をいう。例えば、タンパク新生アミノ酸の側鎖については、メチル（アラニン）、ヒドロキシメチル（セリン）、ベンジル（フェニルアラニン）、メルカプトメチル（システイン）及びカルボキシメチル（アスパラギン酸）が挙げられる。
【００３６】
ペプチド鎖を有する化合物に適用されるときの用語「誘導体」とは、ペプチドの側鎖におけるアミノ基、ヒドロキシル基若しくはカルボキシル基又は末端アミノ基若しくは末端カルボキシル基の１個以上が誘導体官能基に変更された化合物を意味する。アミノ基は、アミド（例えばアルキルカルボキシアミド、アセトアミド）、カルバメート（例えば、カルバミン酸アルキル、例えばカルバミン酸メチル又はカルバミン酸ｔ−ブチル）又は尿素として誘導体化できる。ヒドロキシル基は、エステル（例えばアルカノエート、例えばアセテート、プロピオネート又はアレンカルボキシレート、例えばベンゾエート）、カルバメート（例えばカルバミン酸アルキル、例えばカルバミン酸メチル）、カーボネート（例えば炭酸アルキル、例えば炭酸エチル）として誘導体化できる。カルボキシル基は、エステル（例えばアルキルエステル、例えばエチルエステル）又はアミド（例えば第一カルボキシアミド、Ｎ−アルキル第二カルボキシアミド又はＮ，Ｎ−ジアルキルカルボキシアミド）として誘導体化できる。当業者であれば、ペプチドの誘導体が親ペプチドの特性を維持することが予想されることが分かるであろう。誘導体基の導入はペプチドの特性を変化させないか、又は誘導体基は生体内で除去される（例えば代謝により）かのいずれかだからである。本発明の好ましい実施形態は、アミノ基、カルボキシル基及びヒドロキシル基の３個以下、好ましくは２個以下、又は１個が誘導体官能基に修飾されているか、或いは全く修飾されていない。また、用語「誘導体」には塩も含まれ、誘導体の塩も含まれる。
【００３７】
ペプチドに関連して使用される用語である「末端誘導体」とは、Ｃ末端カルボキシレート基若しくはＮ末端アミノ基又はその両方が誘導体官能基に修飾されたペプチドを意味する。Ｃ末端カルボキシル基は、エステル（例えばアルキルエステル、例えばエチルエステル）又はアミド（例えば第一カルボキシアミド、Ｎ−アルキル第二カルボキシアミド又はＮ，Ｎ−ジアルキルカルボキシアミド）として誘導体化できる。Ｎ末端アミノ基は、エステル（例えばアルキルエステル、例えばエチルエステル）又はアミド（例えば第一カルボキシアミド、Ｎ−アルキル第二カルボキシアミド又はＮ，Ｎ−ジアルキルカルボキシアミド）として誘導体化できる。また、Ｃ末端カルボキシル基及び／又はＮ末端アミノ基は、塩の状態であることもできる。
【００３８】
用語「単離化合物」とは、所定の化合物であって、混入物、又は当該化合物が自然に分泌される細胞成分、又はその合成に使用された試薬、又はその合成の副産物、を実質的に有しないものを意味する。「単離」及び「混入物を実質的に有しない」は、その調製が技術的に純粋（均質）であることを意味するものではなく、治療に使用できる状態のペプチド又はポリペプチドを準備するのに十分に純粋であることを意味する。
【００３９】
用語「タンパク質導入ドメイン」（「細胞透過性ペプチド」ともいう）は、所定のペプチド又はその誘導体であって、細胞膜を横断することができ、かつ、タンパク質導入ドメインと関連のあるペプチド、タンパク質又は分子を細胞の外部から当該細胞の細胞質に当該細胞の細胞質膜を介して輸送する方向に誘導することができるものを示すために使用する。
【００４０】
２個のペプチドの連結を指す用語である「結合」とは、２個のペプチドが互いに共有結合することを意味する。この結合は、一方のペプチドのカルボキシル基と他方のペプチドのアミノ基との間のアミド結合の形成により直接、又はこれらのペプチドのそれぞれに対して共有結合を有する結合基を介して達成される。例えば、結合基は、ペプチド鎖、アミノ酸又は少なくとも２個の官能基を有し、かつ、２個のペプチド鎖のそれぞれに共有結合を形成させることのできる任意の基であることができる。
【００４１】
用語「ＨＩＶ−１治療用化合物」とは、ＨＩＶ感染症の治療や予防のために現在使用されている化合物、ＨＩＶ感染症の治療又は予防に使用するための治験化合物及び当業者がＨＩＶ感染症の治療又は予防に有用であると考える化合物など、ＨＩＶ感染症の治療又は予防に有用な任意の化合物を意味する。
【００４２】
用語「後天性免疫不全症候群の治療用化合物」とは、後天性免疫不全症候群の治療又は予防のために現在使用されている化合物、後天性免疫不全症候群の治療又は予防に使用するための治験化合物及び当業者が後天性免疫不全症候群の治療又は予防に有用であると考える化合物など、後天性免疫不全症候群の治療又は予防に有用な任意の化合物を意味する。
【００４３】
２個の化学基のを指す用語である「直接結合」とは、これらの基が共有結合により結合することを意味する（それそれが結合基に結合することにより結合するのではない）。
【００４４】
用語「Ｖｉｆアンタゴニスト」とは、Ｖｉｆタンパク質、好ましくはＶｉｆタンパク質内のマルチマー化ドメインに結合し、それによってＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用及びＶｉｆタンパク質のマルチマー化を阻害する分子を意味する。
【００４５】
用語「組織培養感染量５０」（又は「ＴＣＩＤ50」）とは、多数の感受性組織培養液に接種されたときに、それぞれの培養液の５０％を感染させる感染性因子（例えばウイルス）の量を意味する。
【００４６】
II．本発明の化合物
本発明の一態様としては、次式Ｉの化合物：
Ｘ1−Ｍ−配列番号１ （Ｉ）
又はその誘導体
（式中、
Ｘ1−Ｍ−は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に結合したタンパク質導入ドメインを有する随意の基を表し、ここで、
Ｘ1はタンパク質導入ドメインを表し；
−Ｍ−は、単結合又は該タンパク質導入ドメインと配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドとの間に共有結合を形成する随意の結合基を表し；
ただし、該化合物が配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に直接結合するアミノ酸を有する場合には、該Ｎ末端に直接結合する該アミノ酸はアスパラギン以外のものであるものとする。）
を提供する。
【００４７】
「Ｘ1−Ｍ−は、随意の基を表す」というときには、式Ｉは、配列番号１のアミノ酸配列がタンパク質導入ドメインに結合した式Ｘ1−Ｍ−配列番号１の化合物又はその誘導体だけでなく、タンパク質導入ドメインには結合していない配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド又はその誘導体をも包含するものとする。
【００４８】
ａ．結合基
配列番号１のアミノ酸配列のペプチドがタンパク質導入ドメインに結合する場合には、配列番号１のアミノ酸配列のペプチドとタンパク質導入ドメインとの結合は、単結合又は随意の結合基により形成される。この結合基の目的は、単にタンパク質導入ドメインと配列番号１のアミノ酸配列のペプチドとを共有結合させることに過ぎないので、当業者であれば、様々な方法でこのような結合を達成することができるであろう。基本的に、この結合基は、少なくとも２官能性の任意の部分であることができるが、ただしタンパク質導入ドメインと配列番号１のアミノ酸配列との間で生じた結合は安定であることを条件とする。好適な結合部分としては、２官能性又は多官能性のアルキル、アリール、アラルキル又はペプチド部分、アルキル、アリール又はアラルキルアルデヒドの酸エステル及び無水物、スルフヒドリル又はカルボキシル基、例えばマレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体及びスクシンイミド誘導体が挙げられ、或いは、当該部分は、臭化シアヌル又は塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステル又はスルホン酸ハロゲン化物などから誘導できる（Ｆｉｓｃｈｅｒ外，米国特許第６，４７２，５０７号。その開示の全体を参照によって援用するものとする）。リンカー部分上にある官能基としては、アミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニル及びカルボキシル基を挙げることができる。随意に、当該リンカー基は、十分に不安定であるように選択される（例えば、標的組織中に存在する酵素による酵素分解に対して）ので、配列番号１のアミノ酸配列のペプチドの運搬後に切断され、それによってペプチドが遊離する。代表的な不安定結合は、Ｌｏｗ外，米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。その開示の全体を参照によって援用するものとする。また、このペプチド−活性剤デリバリーシステムは、活性剤と本発明のペプチドとの間の化学的切断によっても分離し得る。リンカー部分がアミノ酸残基を含む実施形態においては、このような切断は、リンカー部分自体の内部で生じ得る。
【００４９】
以下で提供する例は例示を目的とするものであって、包括的であることを目的とするものではない。したがって、以下の例は、−Ｍ−基とペプチドとの間の結合がアミド結合である場合を例示するものであるが、当業者であれば、配列番号１のアミノ酸配列の末端ＮＨ基と末端（又は他の）カルボキシル基（又はタンパク質導入ドメインの末端若しくは他の−ＮＨ−基若しくは任意の他の官能基）の−Ｃ（＝Ｏ）−基との間に結合を形成させることのできる任意の官能基によって形成できることが分かるであろう。
【００５０】
結合基によって形成される結合が配列番号１のアミノ酸配列のペプチドのアミノ酸末端とタンパク質導入ドメインのカルボキシル基（例えば末端カルボキシル基）との間にある場合には、任意のアミノ酸（タンパク新生アミノ酸（これに限定されない）を含めたα−アミノ酸（これに限定されない）を含む）又はペプチド鎖が配列番号１のアミノ酸配列のペプチドとタンパク質導入ドメインとの間の結合となることができる。
【００５１】
配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端とタンパク質導入ドメインのカルボキシル基とを結合させるための安定な結合基−Ｍ−の例としては、
−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−Ｃ（＝Ｏ）−（式中、Ｒはタンパク質新生アミノ酸の側鎖である）；
ペプチド鎖；及び
−ＮＨ−Ｘm−Ｃ（＝Ｏ）−
（式中、
ｍは１以上、好ましくは１〜３であり、
それぞれの−Ｘ−は、直鎖、分岐又は環状の脂肪族炭化水素であって、１個以上のメチレン基が−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されていてよく、かつ、１個以上のメチン基がＮで置換されていてよいもの；−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−（式中、ｎは１以上である）；及び芳香族環又は複素環式芳香族環よりなる群から選択される。）
が挙げられる。
【００５２】
結合基によって形成される結合が配列番号１のアミノ酸配列のペプチドのアミノ酸末端とタンパク質導入ドメインのアミノ基（例えば末端アミノ基）との間にある場合には、当該２個のペプチド基間の結合は、例えば尿素（この場合、−Ｍ−は−Ｃ（＝Ｏ）−である）又は任意のジカルボン酸残基（例えば−Ｍ−は−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）−である）であることができる。
【００５３】
配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端とタンパク質導入ドメインのアミノ基とを結合させるための安定な結合基−Ｍ−の例としては、
−Ｃ（＝Ｏ）−（すなわち尿素）；
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐｅｐ1−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｐｅｐ2−Ｃ（＝Ｏ）−（式中、−ＮＨ−Ｐｅｐ1−Ｃ（＝Ｏ）−及び−ＮＨ−Ｐｅｐ2−Ｃ（＝Ｏ）−は、それぞれ、アミノ酸又はペプチド鎖のいずれかであって、それらのアミノ末端（又はアミノ酸の場合にはα−アミノ基）を介して尿素結合−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−により結合したものを表す。）；及び
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘm−Ｃ（＝Ｏ）−
（式中、
ｍは１以上、好ましくは１〜３であり、
それぞれの−Ｘ−は、直鎖、分岐又は環状の脂肪族炭化水素であって、１個以上のメチレン基が−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されていてよく、かつ、１個以上のメチン基がＮで置換されていてよいもの；−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−（式中、ｎは１以上である）；及び芳香族環又は複素環式芳香族環よりなる群から選択される。）
が挙げられる。
【００５４】
−Ｍ−基は、タンパク質導入ドメインと配列番号１のアミノ酸配列とを「結合させる」ものであるが、この用語の使用は、式Ｉの化合物を合成する方法に関していかなる限定も暗示するものではない。つまり、タンパク質導入ドメインと配列番号１のアミノ酸配列のペプチドとを別々に合成し、次いで互いに連結させる必要はない。むしろ、この用語は、単に、式Ｉの化合物におけるタンパク質導入ドメインと、配列番号１のアミノ酸配列と、結合基−Ｍ−との間の構造的な結合部分を説明するものに過ぎない。
【００５５】
ｂ．タンパク質導入ドメイン
タンパク質導入ドメインは、細胞膜を横断することができ、かつ、タンパク質導入ドメインと関連のあるペプチド、タンパク質又は分子の、所定の細胞の外部から該細胞の細胞質への該細胞の細胞質膜を介した輸送を誘導することのできるペプチドである。
【００５６】
ＨＩＶのＴＡＴタンパク質、ショウジョウバエ由来のアンテナペディアタンパク質及び単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ２２タンパク質などのいくつかの天然型タンパク質は、容易に細胞に入ることができた。このようなタンパク質の細胞侵入の機構は完全には理解されていないものの、このようなタンパク質中の比較的短い配列（タンパク質導入配列又は膜融合配列）が細胞侵入を容易にする役割を果たすことが分かっている。容易な細胞侵入を促進させる特性は、上記ペプチド配列が別の分子に結合する場合であっても保持される。結果として、このような配列への結合を使用して他の分子が細胞に送達されるのを容易にすることができる。
【００５７】
タンパク質導入ドメインは、かなり興味深い研究対象である。というのは、当該ドメインは、他の化合物への結合により、当該結合化合物を細胞に輸送するのを容易にするからである。そのため、かなりの刊行物が発行されている。例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｕｌｏ Ｌａｎｇｅｌ（編集者）（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，第２版，２００６）、「Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｕｌｏ Ｌａｎｇｅｌ（編集者）（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，第１版，２００２）；Ｅ．Ｌ．Ｓｎｙｄｅｒ外，「Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２００４，２１（３），３８９−９３、Ａ．Ｊ．Ｍ．Ｂｅｅｒｅｎｓ外，「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｔｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００３，３（５），４８６−９４；Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚ外，「Ｍｅｄｉｕｍ−ｓｉｚｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｂｕｉｌｔ ｉｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，２００５，２５（６），６７９−７３６。
【００５８】
タンパク質導入ドメインに導入できる又は当該ドメインとして使用できるアミノ酸配列の例は表２に示すものである。
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【００５９】
ｃ．本発明の化合物の特定の実施形態及び好ましい実施形態
本発明の化合物の好ましい実施形態は、−Ｍ−が単結合、アミノ酸又はペプチドからなるものである。−Ｍ−がアミノ酸からなる場合には、当該アミノ酸は、好ましくはグリシンである。−Ｍ−がペプチドからなる場合には、当該ペプチドは、好ましくはそのＣ末端を介して配列番号１のアミノ酸配列のペプチドのアミノ末端に結合し、かつ、そのＮ末端を介してタンパク質導入ドメインのＣ末端に結合する。また、当該ペプチドは、好ましくは１０個以下のアミノ酸残基からなる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、タンパク質導入ドメインは、そのＣ末端で−Ｍ−に直接結合する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、タンパク質導入ドメインは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を含む（随意に当該アミノ酸配列からなる）。
【００６３】
特定の実施形態では、式Ｉの化合物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００６４】
特定の実施形態では、式Ｉの化合物は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、式Ｉの化合物は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００６６】
他の好ましい実施形態では、式Ｉの化合物又はその実施形態いずれかは単離化合物である。他の好ましい実施形態では、式Ｉの化合物及び当該化合物を含有する組成物（医薬組成物を含む）は、製薬上許容できない混入物を実質的に有しない。製薬上許容できない混入物とは、所定の化合物であって、ごくわずかの量を超えて存在すると、当該化合物をヒトへの治療投与のための医薬品として使用するのを不適当なものにするであろう化合物のことである。
【００６７】
III．本発明の化合物の調製
本発明の化合物は、ペプチド及び有機合成の当業者に周知の方法によって調製できる。
【００６８】
本発明のペプチドは、組換えペプチド又は合成ペプチドであることができる。また、これらのものは、例えば、固相合成法を使用して化学的に合成することもできる。タンパク質導入ドメインは、天然ペプチド又は合成ペプチドであることができ、天然源からの単離による製造又は合成が可能である。
【００６９】
本発明のペプチドは、ペプチド合成法を使用して新規合成できる。このような方法では、当該ペプチド鎖は、成長しつつあるペプチド鎖に構成アミノ酸を所望の配列で付加する一連のカップリング反応により調製される。様々なＮ保護基、例えば、カルボベンジルオキシ基又はｔ−ブチルオキシカルボニル基；様々なカップリング試薬、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド又はカルボニルジイミダゾール；様々な活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドのエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル；及び様々な切断試薬、例えば、トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）、ジオキサン中ＨＣｌ、硼素トリス（トリフルオルアセテート）及び臭化シアンの使用；並びに、中間体の単離及び精製を伴う溶液状態での反応は、当業者に周知の方法である。この反応は、溶液の状態のペプチド又は固相担体に結合したペプチドのいずれかで実施できる。固相方法では、ペプチドは、合成の完了後に固相担体から遊離される。
【００７０】
好ましいペプチド合成法は、メリフィールド固相手順に従う。メリフィールド，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６３，８５，２１４９−５４及びＳｃｉｅｎｃｅ，１９６５，５０，１７８−８５を参照されたい。固相合成手順に関する追加の情報は、次の学術論文を参照することにより得ることができる：Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ及びＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ（第２版，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１９８４）、及びＲ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２：２２１−２９６のレビューの章，Ｆ．Ｆ．Ｎｏｌｄ著（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６９）及びＢ．Ｗ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ及びＲ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第２巻，ｐｐ．２５５以下参照，Ｎｅｕｒａｔｈ及びＨｉｌｌ著（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）。
【００７１】
溶液法によるペプチドの合成は、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，第１１巻，Ｎｅｕｒａｔｈ外著（第３版，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９７６）に記載されている。ペプチド合成に関する他の一般参照としては、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ及びＢｅｎ Ｍ．Ｄｕｎｎ著（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９４）、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｉｋｌｏｓ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３）及びＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐａｕｌ Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ、Ｅ．Ｇｉｒａｌｔ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９７）及びＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｇ．Ｇｒａｎｔ著（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２００２）が挙げられる。
【００７２】
リンカーの−Ｍ−がペプチド鎖以外のものである式Ｉの化合物は、例えば、タンパク質導入ドメインと好適な結合分子とを、当該化合物の正確な性質によって変わってくる方法（ただし、これは当業者には明らかであろう）を使用してカップリングさせることによって調製できる。例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（第３版，Ｗｉｌｅｙ１９９９）に記載されるように、好適な保護基方法を採用してカップリング部位の所望の選択を実現することができる。
【００７３】
或いは、ペプチドは、そのペプチドをコードする核酸を好適なベクターに結合させ、得られたベクターを好適な宿主細胞に挿入し、得られた宿主細胞により生成されたペプチドを回収し、そして回収されたポリペプチドを精製することを含む組換えＤＮＡ技術を使用して調製できる。組換えＤＮＡ技術は、当業者には周知である。組換え分子をクローニングし及び発現させる一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，第２版，１９８９）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９８７）に記載されている。
【００７４】
所望のペプチドをコードする核酸は、１個以上の調節領域に機能的に連結されていてよい。調節領域としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、翻訳開始シグナル（コザック領域）、終止コドン、ペプチド切断部位及びエンハンサーが挙げられる。使用される調節配列は、これらが投与される脊椎動物の細胞内において機能的でなければならない。好適な１つの調節領域又は複数の調節領域を選択することは日常的な事項であり、当業者の技術常識である。
【００７５】
本発明の化合物の合成に使用できるプロモーターとしては、構成的プロモーターと調節（誘導）プロモーターの両方が挙げられる。これらのプロモーターは、宿主に応じて原核生物型又は真核生物型であることができる。本発明の実施に有用な原核生物型（バクテリオファージを含む）プロモーターには、ｌａｃ、Ｔ３、Ｔ７、ラムダＰｒ’Ｐｌ’及びｔｒｐプロモーターがある。本発明の実施に有用な真核生物型（ウイルスを含む）プロモーターには、遍在性プロモーター（例えばＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間径フィラメントプロモーター（例えばデスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療遺伝子プロモーター（例えばＭＤＲ型、ＣＦＴＲ、第VIII因子）、組織特異的プロモーター（例えば平滑筋細胞におけるアクチンプロモーター）、刺激に応答するプロモーター（例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン制御転写調節物質、サイトメガロウイルス前初期、レトロウイルスＬＴＲ、メタロチオネイン、ＳＶ−４０、Ｅ１ａ及びＭＬＰプロモーターがある。テトラサイクリン制御転写調節物質プロモーター及びＣＭＶプロモーターは、ＷＯ９６／０１３１３号、米国特許第５，１６８，０６２号及び米国特許第５，３８５，８３９号に記載されている。これらの特許文献の全開示を参照によりここに含めるものとする。
【００７６】
本発明で使用できるポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明の化合物は、化学合成によって調製されるか組換えＤＮＡ技術によって調製されるかを問わず、既知の技術、例えば分取ＨＰＬＣを使用して精製できる。次いで、当該化合物について、ここで説明するアッセイ法に従って生物活性をアッセイすることができるだけでなく、当業者に周知の方法によってアッセイすることもできる。
【００７８】
IV．本発明の化合物の生物学的評価
Ｖｉｆ又はＶｉｆ結合体に結合し、かつ、Ｖｉｆタンパク質のマルチマー化を阻害する分子は、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合アッセイを使用して検定できる。具体的に言うと、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合アッセイは、（１）Ｖｉｆ又はＶｉｆ含有ペプチドをカラム又はビーズに結合させ；（２）該Ｖｉｆ又はＶｉｆ含有ペプチドが結合したカラム又はビーズ上に、試験分子とマルチマー化ドメインを含有する標識Ｖｉｆ又はその断片とをアプライし；（３）該カラム又はビーズを洗浄し、そして該カラム又はビーズから該標識Ｖｉｆ又はその断片を分離させ；そして、（４）該カラム又はビーズに結合した標識Ｖｉｆ又はその断片の量を測定し、比較して該試験分子の拮抗作用活性を決定する段階を含む。「標識Ｖｉｆ又はその断片」とは、放射標識Ｖｉｆ、化学標識Ｖｉｆ又は蛍光標識Ｖｉｆをいうが、これらに限定されない。スクリーニングは、好ましくは35Ｓ標識Ｖｉｆを使用して行われる。
【００７９】
化合物のＶｉｆ機能阻害有効性は、細胞ｈＡ３ＧレベルのＶｉｆ仲介低下を阻害することに該化合物が有効かどうかを検定することによって決定できる。好適な細胞、例えばＨ９細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞又はＭＴ−２細胞に、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を結合したｈＡ３Ｇを含む遺伝子構築物をトランスフェクトし、ウイルスを感染させ、そして、ＥＧＦＰ−ｈＡ３Ｇ蛍光の存在を、蛍光顕微鏡又はＥＬＩＳＡプレート読み取り装置による蛍光検出を使用して監視する。それによって、化合物がウイルス感染によるｈＡ３ＧレベルのＶｉｆ仲介低下を減ずることの有効性を測定できる。
【００８０】
また、化合物のＶｉｆ機能阻害有効性は、ウイルス粒子中のｈＡ３Ｇを定量することで決定することもできる。ｈＡ３Ｇを発現するウイルス感染細胞から放出されたウイルス粒子は、Ｖｉｆ機能が阻害されている場合には高レベルのｈＡ３Ｇを有する一方で、機能を有するＶｉｆは、ｈＡ３Ｇの破壊をもたらし、また、Ｖｉｆがウイルス粒子に取り込まれるのをブロックする。そのため、Ｖｉｆ機能をブロックする効果のある薬剤は、ウイルス粒子中におけるｈＡ３Ｇレベルを高くするであろう。細胞から放出されたウイルス粒子について、ウイルス粒子のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、得られたゲルをウエスタンブロットし、そして該ブロットをｈＡ３Ｇ抗体で探索することによりそれらのｈＡ３Ｇ含有量を定量できる。これらのブロットをｐ２４のような別のウイルスタンパク質に対する抗体でも探索する場合には、ｈＡ３Ｇの測定存在量を正規化してウイルス量の変動を明らかにすることができる（すなわち単位ウイルス量により表される）。
【００８１】
Ｖｉｆに結合するものとして同定された化合物について、例えばここで説明するような当業者に周知の試験管内及び生体内抗ウイルスアッセイで活性を試験することができる。次の例は、所定の化合物についてＨＩＶ−１に対する有効性を評価するための例示の手順を説明するものである。
【００８２】
まず、治療化合物が培養細胞中におけるＨＩＶ−１複製に及ぼす影響を決定することができる。これは、造血細胞（例えば、ＭＴ−２Ｔ細胞リンパ腫細胞、第一末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、単離マクロファージ、単離ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は培養Ｈ９ヒトＴ細胞）に、ＨＩＶ−１を、細胞に試験管内で急性感染させるための当該技術分野において周知の力価（例えば１０4.5ＴＣＩＤ50／ｍＬ）を使用して急性感染させることにより実施できる。次いで、これらの細胞を様々な量の１種の試験化合物の存在下で培養する。次いで、培養液を、ＨＩＶ−１生産についてアッセイする（例えば、逆転写酵素アッセイを使用して逆転写酵素のレベルを測定することにより又は市販のＥＬＩＳＡアッセイを使用してｐ２４抗原を測定することにより）。未処理対照群で観察されたウイルスレベルと比較したレベルの低下は、その試験化合物がＨＩＶ−１感染の治療に試験管内で有効であることを示す。
【００８３】
ヒトで試験する前に、好ましくは、試験化合物をＨＩＶ−１感染の動物モデルで試験する。このようなモデルの一つにおいては、本発明の化合物をＨＩＶ−１のための遺伝子導入マウス、例えば、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子欠失ＨＩＶ−１プロウイルスゲノムの７．４ｋｂを含む分子クローンｐＮＬ４−３を組み込んだマウスに投与する（Ｐ．Ｄｉｃｋｉｅ外，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９１，１８５，１０９−１１９）。このマウスから得られた皮膚生検について、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）によってＨＩＶ−１遺伝子の発現を試験し又は免疫染色法によってＨＩＶ−１抗原の発現、例えばｇｐ１２０若しくはＮＥＦの発現を試験する。さらに、当該マウスについて、ＨＩＶ−１遺伝子導入マウスにおいて通常観察される悪液質及び成長遅延が低減するかどうか試験する（Ｒ．Ｒ．Ｆｒａｎｋｓ外，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓ．，１９９５，３７，５６−６３）。
【００８４】
また、本発明の化合物の有効性は、ＳＩＶ感染アカゲザル（Ｎ．Ｌ．Ｌｅｔｒｉｎ外，Ｊ．ＡＩＤＳ，１９９０，３，１０２３−４０）、特に、実験的に感染したサルにおいてヒトＡＩＤＳに非常に類似する症候群を引き起こすＳＩＶmac251に感染したアカゲザルで決定することもできる（Ｈ．Ｋｅｓｔｌｅｒ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４８，１１０９−１２）。特に、サルに、無細胞ＳＩＶmac251、例えば１０4.5ＴＣＩＤ50／ｍＬの力価のウイルスを感染させることができる。感染を、ＰＢＭＣにおけるＳＩＶのｐ２７抗原の出現により監視する。本発明の化合物の有用性は、正常の体重増加、ＰＢＭＣにおけるＳＩＶ力価の減少及びＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加によって特徴付けられる。
【００８５】
ＨＩＶ感染ヒト細胞について生体内での化合物の有効性を決定するために、中空繊維アッセイを使用することもできる。ＨＩＶ感染ヒト細胞を、ＳＣＩＤマウスのような実験動物に移植された中空繊維内で成長させ、そして当該細胞からの感染の広がりを、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、ｐ２４又は逆転写酵素といったエンドポイントを使用して監視する。例えば、Ｂ．Ｔａｇｇａｒｔ外，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，２００４，６３（１），１−６を参照されたい。
【００８６】
ヒト患者では、化合物による治療の有効性は、ＨＩＶ−１感染症及びＨＩＶ−１関連疾患の様々なパラメーターを測定することによって決定できる。特に、ウイルス量の変化は、定量ＲＴ−ＰＣＲを使用した血漿のＨＩＶ−１ＲＮＡの定量分析によって（Ｂ．Ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ外，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９４，４９，１５７−６８；Ｙ．Ｈ．Ｃｈｅｎ外，ＡＩＤＳ，１９９２，６，５３３−３９）又は単離ＰＢＭＣからのウイルス生産についてのアッセイによって決定できる。ＰＢＭＣからのウイルス生産は、患者からのＰＢＭＣとＨ９細胞とを同時に培養し、その後ｐ２４抗原レベルについてＥＬＩＳＡアッセイを使用してＨＩＶ−１の力価を測定することによって決定できる（Ｍ．Ｐｏｐｏｖｉｃ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８４，２０４，４９７−５００）。血漿ＨＩＶ−１レベル及びエイズの進行の別の指標は、炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＴＮＦαの生産である；したがって、本発明の化合物の有効性は、これらのサイトカインのいずれか又は全ての血清レベルの減少についてのＥＬＩＳＡ試験により評価できる。また、治療の効果は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞レベルの変化、体重の変化又はＨＩＶ感染若しくはＡＩＤＳ若しくはエイズ関連症候群（ＡＲＣ）に関連のある任意の他の身体状態の変化を評価することによって実証することもできる。
【００８７】
Ｖ．本発明の化合物の塩
ペプチド鎖は、典型的には酸性基又は塩基性基（例えばアミン基又はカルボキシル基）を含有するが、このような基は、必ずしも遊離塩基の形態である必要はない。ペプチドである化合物やペプチド鎖を含有する化合物に言及する場合には、当該言及には、ペプチドの塩の形態が含まれるものとする。したがって、式Ｉの化合物の塩及びその誘導体は、本発明の範囲内にある。好ましい塩は製薬上許容できる塩である。
【００８８】
用語「塩」は、本発明の化合物である遊離酸又は遊離塩基の付加塩を包含する。用語「製薬上許容できる塩」とは、薬学的応用において有用性を与える範囲内で毒性プロフィールを有する塩をいう。製薬上許容できない塩は、例えば、本発明の化合物の合成、精製又は調合過程における有用性のような、本発明の実施の際に有用性を有する、高い結晶化度といった特性を有することができる。
【００８９】
好適な製薬上許容できる酸付加塩は、無機酸又は有機酸から調製できる。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸及び燐酸が挙げられる。好適な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族、複素環式、カルボン酸及びスルホン酸類の有機酸から選択でき、その例としては、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボニン酸（パモン酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオルメタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β−ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸及びガラクツロン酸が挙げられる。製薬上許容できない酸付加塩の例としては、例えば、過塩素酸塩及びテトラフルオロホウ酸塩が挙げられる。
【００９０】
本発明の化合物の好適な製薬上許容できる塩基付加塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及び遷移金属塩などの金属塩、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩及び亜鉛塩などが挙げられる。また、製薬上許容できる塩基付加塩としては、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、クロルプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）及びプロカインなどの塩基性アミンから作られた有機塩も挙げられる。製薬上許容できない塩基付加塩の例としては、リチウム塩及びシアン酸塩が挙げられる。これらの塩の全ては、好適な酸又は塩基と式Ｉに従う化合物とを反応させることによって式Ｉに従う対応化合物から製造できる。
【００９１】
VI．医薬組成物
本発明の化合物は、製薬上許容できるキャリヤーと共に医薬組成物の形態で投与できる。このような処方物中における有効成分は、０．１〜９９．９９重量％を占めることができる。「製薬上許容できるキャリヤー」とは、処方物の他の成分と相溶性があり、かつ、受容者にとって有害ではない任意のキャリヤー、希釈剤又は賦形剤を意味する。
【００９２】
活性剤は、好ましくは、選択した投与経路及び標準的な薬務を基準にして選択された製薬上許容できるキャリヤーと共に投与される。この活性剤は、医薬品の分野における標準的な方法に従って所定の剤形に処方できる。Ａｌｐｈｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ著，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，米国ペンシルバニア州イーストンを参照されたい。好適な剤形は、例えば、錠剤、カプセル剤、溶液、点滴製剤、トローチ、坐剤又は懸濁液を含むことができる。
【００９３】
非経口投与については、活性剤は、好適なキャリヤー又は希釈剤、例えば、水、オイル（特に植物油）、エタノール、食塩水、水性デキストロース（グルコース）及び同類の糖溶液、グリセリン又はプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールと混合できる。非経口投与用の溶液は、好ましくは活性剤の水溶性塩を含有する。また、分解防止剤、酸化防止剤及び防腐剤を添加することもできる。好適な酸化防止剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、クエン酸及びその塩並びにナトリウムＥＤＴＡが挙げられる。好適な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベン又はプロピルパラベン及びクロルブタノールが挙げられる。非経口投与用の組成物は、水溶液又は非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョンの形態をとることができる。
【００９４】
経口投与にあたって、活性剤は、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、顆粒剤その他の好適な経口剤形を製造するための１種以上の固形不活性成分と混合できる。例えば、活性剤は、少なくとも１種の賦形剤、例えば、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、浸潤剤、吸収剤又は潤滑剤と混合できる。錠剤の一具体例によれば、活性剤をカルボキシメチルセルロースカルシウム、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール及びデンプンと混合させ、続いて、従来の打錠方法によって錠剤に成形することができる。
【００９５】
当該組成物は、好ましくは、単位剤形であってそれぞれの剤形が剤形１単位当たり約１〜約５００ｍｇ、さらに典型的には、約１０〜約１００ｍｇの活性剤を含有するもので処方される。用語「単位剤形」とは、ヒト患者及び他のほ乳類のために一単位の投与量として好適な物理的に分離した複数の単位であって、それぞれの単位が、所望の治療効果を生じさせるように算出された所定量の活性材料を好適な製剤賦形剤と共に含有するものをいう。
【００９６】
また、本発明の医薬組成物は、その中の有効成分の持続放出又は制御放出を与えるように、例えば、所望の放出特性を与えるために様々な割合のヒドロプロピルメチルセルロース、他の重合体マトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系、多層被覆、微小粒子、リポソーム及び／又はミクロスフェアを使用して処方することもできる。
【００９７】
一般に、放出制御製剤とは、所望期間にわたって一定の薬理活性を維持するのに必要な速度で有効成分を放出することができる医薬組成物のことである。このような剤形は、所定の期間中身体に薬剤を供給し、それによって従来の非放出制御製剤よりも長い期間にわたって薬剤レベルを治療範囲内に維持する。
【００９８】
米国特許第５，６７４，５３３号には、モギステイン（強力な末梢性鎮咳薬）を投与するための液体剤形としての放出制御医薬組成物が開示されている。米国特許第５，０５９，５９５号には、器質性精神障害の治療のために胃耐性錠剤を使用することにより活性剤を制御放出させることが記載されている。米国特許第５，５９１，７６７号には、ケトロラック（強力な鎮痛作用を有する非ステロイド系抗炎症剤）の制御投与用の液体貯留経皮貼布が記載されている。米国特許第５，１２０，５４８号には、膨潤性重合体から構成される制御放出薬剤送達装置が開示されている。米国特許第５，０７３，５４３号には、ガングリオシド−リポソームビヒクルによって封入された栄養素を含有する放出制御製剤が記載されている。米国特許第５，６３９，４７６号には、親水性アクリル系重合体の水性分散液から得られる被覆を有する安定な固形物制御放出製剤が開示されている。生分解性微小粒子は、放出制御製剤に使用するためのものとして知られている。米国特許第５，３５４，５６６号には、有効成分を含有する放出制御粉末が開示されている。米国特許第５，７３３，５６６号には、抗寄生虫組成物を放出する高分子微小粒子を使用することが記載されている。
【００９９】
有効成分の制御放出は、様々な誘導因子、例えばｐＨ、温度、酵素、水若しくは他の生理的条件又は化合物によって刺激できる。様々な薬剤放出機構が存在する。例えば、一実施形態では、患者への投与後に制御放出成分が膨張し、有効成分を放出する程度に十分に大きな多孔質の間隙を形成することができる。本発明において、用語「制御放出成分」は、医薬組成物中の有効成分の制御放出を容易にする１種以上の化合物、例えば、重合体、重合体マトリックス、ゲル、透過性膜、リポソーム及び／又はミクロスフェアであると定義される。別の実施形態では、制御放出成分は生分解性であり、これは、体内の水性環境、ｐＨ、温度又は酵素にさらされることによって誘導される。別の実施形態では、室温では固体のゾルゲルマトリックスに有効成分を取り込んだゾルゲルが使用できる。このマトリックスをゾルゲルマトリックスのゲル形成を誘導するのに十分に高い体温を有する患者、好ましくは哺乳動物に埋め込み、それによって有効成分が該患者に放出される。
【０１００】
鼻腔内投与や吸入による投与に好適な本発明の化合物の組成物が特に興味深い。
【０１０１】
本発明の化合物は、概して乾燥粉末として（そのもの又は混合物のいずれか、例えば、無水物又は一水和物、好ましくは一水和物としてのラクトース、マンニトール、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロース若しくはトレハロースとの乾燥ブレンドで又は混合成分粒子、例えばリン脂質と混合された混合成分粒子として）乾燥粉末吸入器から、或いはエアゾールスプレーとして、加圧された容器、ポンプ、スプレー、噴霧器（好ましくは電気流体力学を使用して霧状ミストを生じさせる噴霧器）から、或いはジクロロフルオロメタンなどの好適な推進剤を使用して若しくはそれを使用しないで噴霧剤として、鼻腔内投与又は吸入による投与をすることができる。
【０１０２】
加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器又は噴霧剤は、例えば、エタノール（随意に、水性エタノール）やそれに代わる活性化合物の分散、溶解若しくは延長放出用の好適な試剤、溶媒としての推進剤及びソルビタントレオレエートやオリゴ乳酸などの随意の界面活性剤を含む活性化合物の溶液又は懸濁液を含有する。
【０１０３】
乾燥粉末又は懸濁液処方物に使用する前に、薬剤生成物を吸入による送達に好適なサイズにまで微粉化する（典型的には５ミクロン未満）。これは、好適な粉末化方法、例えばスパイラルジェット磨砕、流動床ジェット磨砕、ナノ粒子を形成させるための超臨界流体処理、高圧ホモジナイズ法又は噴霧乾燥などにより達成できる。
【０１０４】
電気流体力学を使用して霧状ミストを生じさせる噴霧器に使用するのに好適な溶液処方物は、１回の作動当たり本発明の化合物を１μｇ〜２０ｍｇ含有し、作動容量は１μＬ〜１００μＬまで変更できる。典型的な処方物は、本発明の化合物、プロピレングリコール、滅菌水、エタノール及び塩化ナトリウムを含むことができる。プロピレングリコールの代わりに使用できる別の溶媒としては、グリセリン及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１０５】
吸入器又は注入器に使用するためのカプセル剤、ブリスター及び薬包（例えば、ゼラチン又はＨＰＭＣから作られたもの）は、式（Ｉ）のニコチンアミド誘導体と、ラクトースやデンプンなどの好適な粉末原料と、Ｌ−ロイシン、マンニトール又はステアリン酸マグネシウムといった性能調節剤との粉末混合物を含有するように処方できる。
【０１０６】
吸入／鼻腔内投与のための処方物は、即時放出型及び／又は放出調節型となるように処方できる。放出調節性処方物としては、遅延放出型、持続放出型、パルス放出型、制御二段階放出型、標的放出型及びプログラム放出型が挙げられる。持続放出型又は制御放出型は、例えばポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）を使用することによって得ることができる。
【０１０７】
VII．本発明の化合物を使用した治療方法
本発明の化合物はＶｉｆのマルチマー化を阻害するので、レンチウイルス感染を伴う病気及び疾患だけでなく、Ｖｉｆのマルチマー化に関連する他の疾患の治療や予防に使用できる。その方法は、ここで説明した化合物又は該化合物を含む医薬組成物の有効量を、そのような治療又は予防が必要な個体に投与することを含む。そのような治療が必要な個体とは、レンチウイルスに感染している個体又はＶｉｆのマルチマー化に関連する疾患に罹患している個体のことである。そのような予防が必要な個体とは、当該ウイルスに実際にさらされている又はさらされるおそれがあるため、ウイルスに感染するリスクのある個体のことである。
【０１０８】
特定の実施形態では、当該化合物は、（１）レンチウイルス、特にＨＩＶ−１に関連する病気、疾患若しくは状態；又は（２）試験管内（若しくは生体内）アッセイによりＶｉｆアンタゴニスト投与の効用が示された病気、疾患又は状態において、治療のために（予防を含む）投与される。ＨＩＶ−１の存在は、当該技術分野において標準的な任意の手段によって、例えば患者の血液試料を得て、そして当該試料についてＨＩＶ−１の存在を検定することによって容易に検出できる。
【０１０９】
予防は、ＨＩＶウイルスに短期間さらされたことが分かった又はそれが疑われた後の、以前には未感染の個体に必要である。このようなペプチドの予防的使用の例としては、母親から乳幼児へのウイルス感染の予防及びＨＩＶ感染の可能性がある他の状況、例えば労働者がＨＩＶを含む血液製剤にさらされる医療現場での事故の予防が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
特定の疾患又は状態の治療に有効な本発明の治療剤の量は、当該疾患又は状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定される。さらに、試験管内アッセイを適宜使用して最適な投与量の範囲を特定するのに役立ててもよい。また、処方物に使用されるべき正確な投与量も投与経路及び病気、疾患又は状態の重症度に依存し、医師の判断及び各患者の事情に従って決定される。
【０１１１】
また、薬剤の組合せを投与することによるＨＩＶ−１感染症及び／又はＡＩＤＳの治療方法又は予防方法も提供する。この方法は、そのような治療又は予防が必要な個体に、ここで説明した化合物又は該化合物を含む医薬組成物の有効量を逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤又は融合阻害剤（以下、まとめて「従来のＨＩＶ薬剤」という。）よりなる群から選択される１種以上の化合物と共に投与することを含む。
【０１１２】
販売されている従来のＨＩＶ−１薬剤について、好適な投与量及び投与手順は、製造業者が推奨するものであり、例えばＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，第６０版（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２００６）に公開されている。その開示の全体を参照によって援用する。販売されている薬剤及び治験用化学療法剤の両方について、好適な投与量は、この文献において、当該化合物の臨床試験の報告として言及され、公開されている。当業者であれば、任意の特定の兆候にとって好適な投与量及び投与手順を決定するに際してこのような情報源を参照するであろう。このような確立したプロコールは、従来のＨＩＶ薬剤を式Ｉの化合物とは別の組成物で投与している場合には特に好ましい。したがって、特定の実施形態では、従来のＨＩＶ薬剤の投与の投与量、処方、投与経路及び投与計画は、当該薬剤に関する既知のプロトコールに従って実施される。しかしながら、ＨＩＶ−１薬剤と本発明の化合物とを併用することの見込まれる利点は、これらの化合物を別々に使用した場合に見込まれるよりも少ない投与量でこれらの化合物のいずれか又は両方を使用することが可能になる場合があることである。
【０１１３】
VIII．本発明の化合物の投与
当該化合物は、経口投与、直腸内投与、肺内投与、舌下投与及び非経口投与を含めた任意の経路で投与できる。非経口投与としては、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、膣内投与、嚢内投与（例えば、膀胱に）、皮内投与、経皮投与、局所投与又は皮下投与が挙げられる。典型的には、１日当たり少なくとも１回、典型的には１日当たり１回、２回、３回又は４回、薬剤の一定の存在を維持してウイルスを抑制し、かつ、耐性発現の機会を減らすために昼夜を通して等間隔で所定の投与量を与えて治療を施す。
【０１１４】
本発明の１種以上の化合物は、同一の若しくは異なる経路で又は治療中の様々な時点で同時に投与できる。また、本発明の化合物は、従来のＨＩＶ薬剤と組み合わせて処方することもできる。このような組合せで使用する場合に、本発明の化合物及び従来のＨＩＶ薬剤は、同一の若しくは異なる経路で又は治療中の様々な時点で同時に投与できる。選択した従来のＨＩＶ薬剤の投与量は、使用される特定の化合物と、投与の経路及び頻度に依存するであろう。典型的には、従来のＨＩＶ薬剤による治療も１日当たり少なくとも１回、典型的には１日当たり１回、２回、３回又は４回行われ、この場合、必ずしも本発明の化合物と同じスケジュールに従う必要はないが、昼夜を通して等間隔で所定の投与量が与えられるであろう。
【０１１５】
治療は、必要に応じてある程度長い期間にわたり実施できる。典型的には、感染を繰り返す間には治療が無期限に続行されるものと考えられるが、ただし、例えばウイルスによる耐性の発現のため当該化合物がもはや薬効を生じない場合には、中断を指示することができるであろうと考えられる。治療にあたる医師であれば、患者の反応に基づいて治療を増やし、減らし又は中断する方法が分かるであろう。
【０１１６】
細胞増殖性疾患の治療について治療効果を得るための本発明に従う化合物の具体的な投与量は、勿論、患者の身長、体重、年齢及び性別、病気の性質及び段階、病気の攻撃性並びに化合物の投与経路を含めた個々の患者の特定の状況によって決定されるであろう。
【０１１７】
例えば、約０．０２〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の１日投与量を使用できる。また、これよりも多い又は少ない投与量も想定される。場合によっては、これらの範囲外の投与量を使用する必要があるかもしれないからである。この１日投与量は分割できる。例えば、１日の投与につき２〜４回に等しく分割できる。静脈内投与について好適な投与量の範囲は、概して体重１ｋｇ当たり約２０〜５００マイクログラムである。
【０１１８】
鼻腔内又は吸入投与にとって好適な投与量範囲は、概して、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。乾燥粉末吸入器及び噴霧器の場合には、投与単位は、定量を供給するバルブにより決定される。単位は、本発明に従い、典型的には定量又は適当量を供給する「ひと吹き」を投与するようにアレンジされる。１日投与量は、その日を通して単回投与で又は分割投与として投与できる。
【０１１９】
坐剤は、一般に、０．５重量％〜１０重量％の範囲の有効成分を含有する；経口処方物は、好ましくは１０％〜９５％の有効成分を含有する。
【０１２０】
有効量は、試験管内モデル試験系又は動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定できる。
【０１２１】
また、本発明は、本発明の医薬組成物の成分のうち１種以上が充填された１個以上の容器を含む医薬パック又は医薬キットも提供する。随意に、このような容器には、医薬品又は生物製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知が添付され、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売に関する機関による認可を示す。
【実施例】
【０１２２】
例
次の例は本発明を例示するために提供するものであり、本発明を限定するものではない。
【０１２３】
例１〜３９．本発明の例示化合物
表３に示すペプチドは、本発明の範囲内にある化合物の例示である。
【表３−１】
【表３−２】
【０１２４】
例４０．タンパク質発現及び試験管内結合アッセイ
Ｖｉｆに結合する化合物は、例えば、試験管内結合アッセイを使用して同定できる。このアッセイは、米国特許第６，６５３，４４３号に記載されたとおりに実施できる。基本的に次のとおりである。
Ｖｉｆ遺伝子を有する又は有しないベクターｐＧＥＸでＢＬ２１コンピテント細胞（ノバゲン社，米国ウィスコンシン州マジソン）を形質転換させる。３７℃でおよそ０．６のＯＤまで増殖させた後に、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆタンパク質の発現を０．４ｍＭのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導する。これらの細菌細胞を、溶解緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２μｇ／ｍＬのロイペプチン及び１μｇ／ｍＬのアプロチニン）を添加し、その後超音波処理により溶解させる。この試料を１２０００ｇで１０分間にわたり４℃でペレット化させ、その上澄みをグルタチオン結合アガロースビーズ（シグマ社，米国ミズーリ州セントルイス）カラムに加える。バッチ結合後に、そのマトリックスを３回、各回毎に１０ベッド容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加することによって洗浄する。次いで、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆが結合したアガロースビーズを分注し、そして−２０℃で保存した。
逆に、35Ｓ−標識Ｖｉｆは、ＳＰＴ３キット（ノバゲン社，米国ウィスコンシン州マジソン）を利用して合成する。製造業者が提供するプロトコールに従う。試験管内で翻訳した後に、ＲＮアーゼＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を添加して反応を停止させ、ｔＲＮＡと試験管内で翻訳したｍＲＮＡとを除去する。トリクロル酢酸（ＴＣＡ）不溶性放射活性アミノ酸をシンチレーションカクテルの存在下で定量した。
ＧＳＴプルダウンアッセイについては、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆ結合ビーズスラリーと35Ｓ−標識Ｖｉｆとを結合用緩衝液［１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００］中で混合させる。４℃で１時間の結合後に、この混合物を３０００ｇで１分間遠心分離し、そしてビーズを結合用緩衝液で３回洗浄する。この35Ｓ−標識Ｖｉｆタンパク質を、ＳＤＳ含有添加液を添加し、そして９５℃で５分間加熱することによってビーズから分離させる。次いで、これらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（米国カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオ・ラド社が製造する１５％のトリス−ＨＣｌ既製ゲル）で電気泳動する。固定用緩衝液（１０％酢酸、１０％メタノール）で処理し、次いで増幅（アマシャム・ファルマシア社，米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）した後、これらのゲルを乾燥させ、そしてＸ線フィルムに暴露し又は蛍光体画像を使用して定量分析した（モレキュラー・ダイナミクス社，米国カリフォルニア州サニービュー）。
Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合アッセイをＧＳＴプルダウンアッセイと同様に実施したが、ただし、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆ結合ビーズスラリーと35Ｓ−標識Ｖｉｆ及び試験ペプチド又は試験分子とを結合用緩衝液中で混合させた。これらの結果をＧＳＴプルダウンアッセイからの結果（これを１００％と表す）と比較する。
【０１２５】
例４１．配列番号１のアミノ酸配列のペプチドがウイルス感染を阻害するのに必要な最低限の配列を有することの実証
配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドの様々な切断型アナログを調製してウイルス感染を阻害するのに必要な最低限のペプチドを決定した。これらの化合物を、ＰＢＭＣにＨＩＶ−１NL4-3ウイルスを感染させた（ＭＯＩ：０．１）ウイルス感染力アッセイで試験した。ウイルス生産量をｐ２４ＧａｇＥＬＩＳＡ（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して細胞培養液中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原レベルを検出することによって監視した。これらの実験の結果を表４にまとめる。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、２５９６のＭ．Ｗ．と、１２．３９という塩基性の等電点（ｐＩ）と、約１ｍｇ／ｍＬの溶解度とを有していた。
【０１２８】
例４２．配列番号２のアミノ酸配列のペプチドがヒトＴリンパ芽球様Ｈ９株細胞においてＨＩＶ−１NL4-3ウイルスを阻害することの実証
ウイルス感染力アッセイを、配列番号２及び配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド並びに配列番号３５のアミノ酸配列の対照ペプチドの存在下又は非存在下で、Ｈ９細胞内でＨＩＶ−１NL4-3ウイルスを使用し、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原を検量することにより実行した。この手順は、基本的に、次の方法について記載されているＢ．Ｙａｎｇ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８（８），６５９６−６０２に記載されたとおりに実行した。Ｈ９細胞（１×１０6）とＨＩＶ−１NL4-3ウイルスとを０．０１の感染効率で混合させた。３７℃で５時間インキュベートした後に、過剰のウイルスを除去し、そして細胞を、５０μＭ濃度のペプチドを有する又は有しないＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎仔血清の存在下で培養した。３〜４日毎に、上澄みを集め、補給した。これらのペプチドがウイルス感染力に及ぼす影響を、細胞培養液の上澄み中におけるＨＩＶ−１ｐ２４抗原レベルをＥＬＩＳＡにより検出することによって監視した。
これらの実験の結果を図３に示す。配列番号２のアミノ酸配列のペプチド及び配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドは、両方とも、未処理細胞又は配列番号３５のアミノ酸配列の対照ペプチドで処理した細胞と比較して、ウイルスの複製を阻害した。
【０１２９】
例４４．ＭＴ−２細胞での低感染効率急性感染（ＭＯＩ）アッセイにおける本発明の化合物の評価手順
ＭＴ−２細胞及び研究室適応ＨＩＶ−１IIIB株を、米国メリーランド州ロックビルのＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから得た。
９６ウェルマイクロタイタープレート中で次の標準的なプロトコールを使用してＭＴ−２細胞に感染させた。既知濃度の試験化合物又はコントロール（ネガティブコントロールとして水又はポジティブコントロールとしてＡＺＴ ）の溶液（５０μＬ）を１ウェル当たり２．５×１０3個細胞の密度で蒔かれたＭＴ−２細胞（５０μＬ）に三通り添加した。これらウェルにＨＩＶ−１IIIBウイルスを１００μＬの容量で０．１０、０．０３２、０．０１及び０．００３２μＬ／ウェルのＭＯＩで添加した。感染したＭＴ−２細胞でのウイルス複製を逆転写酵素アッセイによって毎日監視した。試験化合物（又はコントロール化合物）を、一日おきに、除去した上澄みの容量に相当する容量で同じ既知濃度で補充して逆転写酵素アッセイを行った。これは、この試験を通してウェル内の化合物濃度を合理的に一定に維持することを目的とするものである。培養液を、培養液の１：５分割を実施することによって８日目及び１４日目に継代培養して細胞を対数増殖期に維持する。この継代培養は、ウェルの容量の２０％（細胞及び培地）を、新鮮な組織培養培地を試験化合物（又はコントロール）の新たな試料と共に含有するウェルに移すことを伴うものであった。
ウイルス複製を評価するための逆転写酵素活性アッセイを、放射活性取り込み重合アッセイを使用して、基本的に次のとおりに実施した。トリチウム化チミジンホスフェートをパーキンエルマー社から１Ｃｉ／ｍＬで購入し、酵素反応につき１μＬを使用した。ポリ（ｒＡ）及びオリゴ（ｄＴ）を、−２０℃で維持された原液から、それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬ及び１．７単位／ｍＬの濃度で調製した。逆転写酵素反応緩衝液を毎日新たに調製した。これは、１ＭのＥＧＴＡ（１２５μＬ）、脱イオン水（１２５μＬ）、２０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１２５μＬ）、トリス（ｐＨ７．４）（５０μＬ）、ＤＴＴ（５０μＬ）及びＭｇＣｌ2（１Ｍ，４０μＬ）からなる。それぞれの反応のために、トリチウム化チミジンホスフェート（１μＬ）と、脱イオン水（４μＬ）と、ポリ（ｒＡ）及び オリゴ（ｄＴ）溶液（２．５μＬ）と、反応緩衝液（２．５μＬ）とを混合した。得られた反応混合物（１０μＬ）を丸底マイクロタイタープレートに置き、そしてウイルスを含有する上澄み（１５μＬ）を添加し、混合した。このプレートを加湿インキュベーター内において３７℃で９０分間インキュベートし、次いで反応体積の１０μＬを適当なプレートフォーマット内のＤＥＡＥろ過マット上にスポットし、５％リン酸ナトリウム緩衝液中で５分間にわたり５回洗浄し、蒸留水中で１分間にわたり２回洗浄し、７０％エタノール中で１分間にわたり２回洗浄し、次いで風乾させた。乾燥したろ過マットをプラスチック製のスリーブ内に置き、Ｏｐｔｉ−Ｆｌｕｏｒ（商標）Ｏ（液体シンチレーションカクテル，パーキンエルマー社）を各スリーブに添加した。取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ（商標）Ｔｒｉｌｕｘ）で測定した。
【０１３０】
上記実験を次のペプチドを使用して行った：
（１）Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu（配列番号３５）。
（２）Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Asn Gln Gly Gly Ser Pro Leu Pro Arg Ser Val（配列番号３６）。
（３）Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gln Gly Gly Ser Pro Leu Pro Arg Ser Val（配列番号２）。
【０１３１】
これらの実験の結果を、図４Ａ〜４Ｄ（配列番号３５のアミノ酸配列のペプチドと配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドとの比較）及び図５Ａ〜５Ｄ（配列番号２のアミノ酸配列のペプチドについての結果を示す）に示している。示したデータの他に、溶媒のコントロール（試験化合物の溶液ではなく水による細胞の偽処理）及び細胞コントロール（ウイルス感染していないＭＴ−２細胞）を他の実験と平行して実施した。
【０１３２】
高いＭＯＩ（０．１）（図４Ａ及び５Ａ）では、コントロールペプチド（配列番号３５の配列）はウイルス生産を阻害しなかったのに対し、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドは、およそ４〜５日間ウイルス生産の開始を遅延させた。配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドと同様の効果を有し、約５〜６日間ウイルス生産の開始を遅延させることが分かった。
【０１３３】
中程度に高いＭＯＩ（０．０３）（図４Ｂ及び５Ｂ）では、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドでＭＯＩ（０．１）の場合と同様の効果が見られ、約２〜３日間ウイルス生産の開始を遅延させた。配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、約３〜４日間ウイルス生産の開始を遅延させたが、およそ１１日目でピークに達した後１５日まで抑制が回復しなかった。コントロールペプチド（配列番号３５の配列）は、ウイルス生産を阻害しなかった。
【０１３４】
中程度に低いＭＯＩ（０．０１）（図４Ｃ及び５Ｃ）では、結果は、ＭＯＩ（０．０３）で観察された結果と同様であった。配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドは、およそ３〜４日間ウイルス生産の開始を遅延させたのに対し、配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、およそ５〜６日間ウイルス生産の開始を遅延させ、かつ、約１１日目でピークに達した後１５〜１６日で抑制を回復した。コントロールペプチド（配列番号３５の配列）は、ウイルス生産を阻害しなかった。
【０１３５】
試験した最も低いＭＯＩ（０．００３）（図４Ｄ及び５Ｄ）では、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドは、ウイルス生産に何らかの影響を及ぼすようには思われなかった：このペプチドに関する結果は、ウイルスコントロール及び溶媒コントロールについての結果をたどるように思われた（データは示さない）。コントロールペプチド（配列番号３５の配列）は、未処理細胞に対してウイルス生産をいくらか向上させるように思われた。配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、ウイルスコントロール試料と比較して有意な保護を与え、およそ７〜８日間ウイルス生産の開始を遅延させた。
【０１３６】
これらの結果から、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドはウイルス生産の阻害の点で活性であり、配列番号２のアミノ酸配列のペプチドは、試験した最も高いＭＯＩ（この場合、配列番号２のアミノ酸配列のペプチドと配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドの活性は匹敵していた）を除けば、それよりも際だって効果的であったことが示された。
【０１３７】
また、これらの結果は、特に０．０３及び０．０１のＭＯＩでの配列番号２のアミノ酸配列ペプチドの曲線間で、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドと比較して定性的な差異が観察された点でも注目に値する。上記のように、配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドは、逆転写酵素レベルで判断したときに、ウイルス複製の発現を遅延させる点では効果的であったが、ウイルス複製の発現後には、実験期間にわたり逆転写酵素レベルの上昇が観察された。これに対し、配列番号２のアミノ酸配列のペプチドも、初期にウイルスレベルの上昇の遅延を示したが、その後ウイルスレベルはピークに達し、そして抑制が回復した。この結果は、配列番号１のアミノ酸配列を含む化合物（例えば配列番号２のアミノ酸配列のペプチド）においてＶｉｆ結合配列を切り詰めると、配列番号７６のアミノ酸配列を含む化合物（例えば配列番号３６のアミノ酸配列のペプチド）よりもウイルスの複製を抑制する点でさらに効果的であることを示唆するものである。特に、これらの結果は、配列番号１のアミノ酸配列を含む化合物、例えば配列番号２のアミノ酸配列のペプチドが、配列番号７６のアミノ酸配列を含む化合物、例えば配列番号３６のアミノ酸配列のペプチドよりもウイルス耐性の発現に対する感受性が少ないという点で、特に有利であることを示している。
【０１３８】
例４５．配列番号２のアミノ酸配列のペプチドが細胞に入ることの実証
配列番号２のアミノ酸配列のペプチドをＣ末端フルオレセインイソチオシアネート（ＦＴＩＣ）タグと共に合成した。このＦＩＴＣタグは、生細胞の蛍光顕微鏡観察により当該ペプチドの細胞取り込み及び細胞内局在を評価することを可能にする。Ｈ９細胞及びＭＴ−２細胞の培養細胞をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）が推奨する培地中で増殖させ、そしてそれぞれの培養液を培養液中で配列番号２のアミノ酸配列のＦＴＩＣタグ付きペプチドにより１回処理した。次いで、これらの細胞を培養皿中で倒立蛍光顕微鏡により様々な時点で写真撮影した。それらの画像は、細胞内の蛍光がＦＩＴＣタグ付きペプチド処理の５分後に検出され、また、ＦＩＴＣタグ付きペプチドの細胞内局在が全ての細胞で３０分以内に明確になったように、ＦＩＴＣタグ付きペプチドの細胞への迅速な取り込みを示した。細胞内での分布は、細胞質において点状及び拡散した状態であったが、細胞核内ではＦＩＴＣタグ付きペプチドは、ほとんど又は全く観察されなかった。この分布は２４〜２８時間継続したが、処理後７２時間で５０％以上減少した。
【０１３９】
核の位置を強調するために、Ｈ９細胞及びＭＴ−２細胞を、上記のとおり、配列番号２のアミノ酸配列のＦＩＴＣタグ付きペプチドで処理し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．４％トリトンＸ−１００で透過処理し、そしてＤＮＡ選択的染料の４'、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。この実験の結果を図６に示す。図６は、ＦＩＴＣタグ付きペプチドによる１回の処理の２４時間後にそれぞれ撮影した、細胞核及び配列番号２のアミノ酸配列のタグ付きペプチドに対するＤＡＰＩ及びＦＩＴＣタグ染色の個々の画像及び画像オーバーレイ（組合せ）を示す。これらの結果は、配列番号２のアミノ酸配列のＦＩＴＣタグ付きペプチドが細胞に入り、細胞質に局在しているものの、核には存在していなかったことを示す。
【０１４０】
例４６．配列番号２のアミノ酸配列のペプチドがＶｉｆ／ｈＡＧ３仮定機構により特異的に作用することの実証
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｈＡ３Ｇを発現しない）及びｈＡ３ＧのｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プロウイルスＤＮＡ又はＶＳＶ−ＧのｃＤＮＡで偽型化されたΔＶｉｆウイルスＤＮＡ（ｅｎｖを欠失）のいずれかをトランスフェクトし、そしてウイルス粒子を生産させた。この方法では、Ｖｉｆを有するウイルスとＶｉｆを有しないウイルスとの両方が生産できた。これは、ΔＶｉｆウイルスがＶｉｆコード配列内に終止コドンを有し、Ｖｉｆ発現が阻害されるからである。
これらの細胞を、感染前の２時間、感染後の１０時間及び感染後の２４時間、未処理のまま放置するか又は配列番号２のアミノ酸配列のペプチドで処理した。同時感染後４８時間で細胞培養液の上澄みを集め、そしてろ過してウイルス粒子を得た。各ウイルスストックのｐ２４（Ｇａｇ）含有量をＥＬＩＳＡ（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ）で評価し、そして、これらのウイルスストックを１０ｎｇのｐ２４に基準化してから次の段階、すなわち、９６ウェルプレート内でのＪＣ５３ＢＬレポーター細胞の感染を行った。
ＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５（ＪＣ５３）株細胞は、ＣＤ４及びＣＣＲ５の両方の表面レベルを比較的高く発現し、Ｒ５ＨＩＶ−１単離体及びＸ４ＨＩＶ−１単離体の両方による感染に対して感受性がある。ＨＩＶ−１プロモーターの調節下でβ−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼを発現するＪＣ５３ＢＬ細胞を使用する、ＨＩＶ−１による感染についてのレポーター遺伝子アッセイが開発されている。Ｘ．Ｗｅｉ外，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２００２，４６（６），１８９６−１９０５。
そのため、ＪＣ５３ＢＬレポーターアッセイを使用して当該細胞のそれぞれが生産したウイルスの感染力を測定することができる。感染を細胞溶解及びルシフェラーゼ基質（プロメガ社）添加前の４８時間に開始させた。生じた発光をビクター３プレートリーダー（パーキンエルマー社）で測定した。発光レベルは、各条件下で生産されたウイルスの感染力と相互に関連があった。
【０１４１】
図７は、ｈＡ３Ｇ遺伝子をトランスフェクトし、かつ、Ｖｉｆ陽性ウイルスを感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（「＋Ｖｉｆ，＋ｈＡ３Ｇ」）及びＶｉｆ陰性ウイルスを感染させたＨＥＫ２９３Ｔ（非ｈＡ３Ｇ発現）細胞（「−Ｖｉｆ，−ｈＡ３Ｇ」）から生成されたウイルスの培養液によるＪＣ５３ＢＬレポーター細胞感染性アッセイの結果を示している。配列番号２のアミノ酸配列のペプチドによる処理を行わない場合には、ｈＡ３Ｇ遺伝子をトランスフェクトし、かつ、Ｖｉｆ陽性ウイルスを感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（「＋Ｖｉｆ，＋ｈＡ３Ｇ」）から生成されたウイルスは、感染性のウイルスを生産した。これは、ｈＡ３ＧのＶｉｆ−仲介破壊がｈＡ３Ｇの保護効果に打ち勝つためである。同様に、Ｖｉｆ陰性ウイルス（「−Ｖｉｆ，−ｈＡ３Ｇ」）を感染させた非ｈＡ３Ｇ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生成されたウイルスも感染性ウイルスを生産する。これは、ｈＡ３Ｇの保護効果が存在しないためである。配列番号２のアミノ酸配列のペプチドによる処理の場合には、Ｖｉｆ陽性ウイルスを感染させたｈＡ３Ｇ発現細胞が生産するウイルスについて感染性が生じた。Ｖｉｆ陰性ウイルスを感染させた非ｈＡ３Ｇ発現細胞によって生産されたウイルスの感染性については、何の影響も観察されなかった。これは、Ｖｉｆの抑制によって仲介される配列番号２のアミノ酸配列のペプチドの抗ウイルス効果と一致する。Ｖｉｆの抑制によってｈＡ３Ｇの保護効果が回復するからである。ｈＡ３Ｇは、ウイルスＤＮＡを過剰変異させ、それによってウイルス生産が少なくなり及び／又は不完全な（すなわち感染力の低い）ウイルスが生産される。感染力の低下は、Ｖｉｆ陰性ウイルスを感染させた非ｈＡ３Ｇ発現細胞では観察されないが、これは、このペプチドが、Ｖｉｆ及び／又はｈＡ３Ｇを必要としないウイルス生活環におけるいずれのプロセスも妨害しないことを示唆する。
【０１４２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び公開された特許出願などの全ての文献は、参照により援用される。本発明は、本発明の精神又は本質的属性から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化できるため、本発明の範囲の基準としては、本明細書ではなく添付した請求の範囲を参照すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式Ｉの化合物：
Ｘ1−Ｍ−配列番号１ （Ｉ）
又はその誘導体
（式中、
Ｘ1−Ｍ−は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に結合したタンパク質導入ドメインを有する随意の基を表し、ここで、
Ｘ1はタンパク質導入ドメインを表し；
−Ｍ−は、単結合又は該タンパク質導入ドメインと該配列番号１のアミノ酸配列との間に共有結合を形成する随意の結合基を表し；
ただし、該化合物が配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に直接結合するアミノ酸を含む場合には、該Ｎ末端に直接結合する該アミノ酸はアスパラギン以外のものであるものとする。）。
【請求項２】
−Ｍ−が単結合、アミノ酸又はペプチドからなる、請求項１に記載の化合物又は誘導体。
【請求項３】
式Ｉの化合物が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の化合物又は誘導体。
【請求項４】
前記タンパク質導入ドメインがそのＣ末端で−Ｍ−に直接結合している、請求項１に記載の化合物又は誘導体。
【請求項５】
前記タンパク質導入ドメインが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の化合物又は誘導体。
【請求項６】
−Ｍ−がアミノ酸又はペプチドからなる、請求項５に記載の化合物又は誘導体。
【請求項７】
−Ｍ−が単結合からなる、請求項５に記載の化合物又は誘導体。
【請求項８】
前記タンパク質導入ドメインが配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の化合物又は誘導体。
【請求項９】
−Ｍ−がアミノ酸又はペプチドからなる、請求項８に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１０】
−Ｍ−が単結合からなる、請求項８に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１１】
前記タンパク質導入ドメインが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１２】
−Ｍ−がアミノ酸又はペプチドからなる、請求項１０に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１３】
式Ｉの化合物が、配列番号１、配列番号２、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１４】
式Ｉの化合物が配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１３に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１５】
式Ｉの化合物が配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１６】
製薬上許容できるキャリヤー及び請求項１に記載の化合物又は誘導体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
ある個体においてウイルス複製にＶｉｆタンパク質のマルチマー化が必要な疾患又は状態を治療する方法であって、当該治療が必要な個体に、請求項１に記載の化合物又は誘導体の治療上有効な量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
ＨＩＶ−１感染の治療又は予防方法であって、当該治療が必要な個体に、請求項１に記載の化合物又は誘導体の治療上有効な量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の化合物又は誘導体の他に、少なくとも１種の他のＨＩＶ−１治療用化合物を投与することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１種の他のＨＩＶ−１治療用化合物がプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び融合阻害剤よりなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の化合物又は誘導体が配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド又はその誘導体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
後天性免疫不全症候群の治療方法であって、当該治療が必要な個体に、請求項１に記載の化合物又は誘導体の治療上有効な量を投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の化合物又は誘導体の他に、少なくとも１種の他の後天性免疫不全症候群の治療用化合物を投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１種の他の後天性免疫不全症候群の治療用化合物がプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び融合阻害剤よりなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の化合物又は誘導体が配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド又はその誘導体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
次式Ｉの化合物：
Ｘ1−Ｍ−配列番号１ （Ｉ）
又はその誘導体
（式中、
Ｘ1−Ｍ−は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に結合したタンパク質導入ドメインを有する随意の基を表し、ここで、
Ｘ1はタンパク質導入ドメインを表し；
−Ｍ−は、単結合又は該タンパク質導入ドメインと該配列番号１のアミノ酸配列との間に共有結合を形成する随意の結合基を表し；
ただし、該化合物が配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端に直接結合するアミノ酸を含む場合には、該Ｎ末端に直接結合する該アミノ酸はアスパラギン以外のものであるものとする。）。
【請求項２】
−Ｍ−が単結合、アミノ酸又はペプチドからなる、請求項１に記載の化合物又は誘導体。
【請求項３】
式Ｉの化合物が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の化合物又は誘導体。
【請求項４】
前記タンパク質導入ドメインがそのＣ末端で−Ｍ−に直接結合している、請求項１に記載の化合物又は誘導体。
【請求項５】
前記タンパク質導入ドメインが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の化合物又は誘導体。
【請求項６】
−Ｍ−がアミノ酸又はペプチドからなる、請求項５に記載の化合物又は誘導体。
【請求項７】
−Ｍ−が単結合からなる、請求項５に記載の化合物又は誘導体。
【請求項８】
前記タンパク質導入ドメインが配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の化合物又は誘導体。
【請求項９】
−Ｍ−がアミノ酸又はペプチドからなる、請求項８に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１０】
−Ｍ−が単結合からなる、請求項８に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１１】
前記タンパク質導入ドメインが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１２】
−Ｍ−がアミノ酸又はペプチドからなる、請求項１０に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１３】
式Ｉの化合物が、配列番号１、配列番号２、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３よりなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１４】
式Ｉの化合物が配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１３に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１５】
式Ｉの化合物が配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の化合物又は誘導体。
【請求項１６】
製薬上許容できるキャリヤー及び請求項１に記載の化合物又は誘導体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
ある個体においてウイルス複製にＶｉｆタンパク質のマルチマー化が必要な疾患又は状態を治療する方法であって、当該治療が必要な個体に、請求項１に記載の化合物又は誘導体の治療上有効な量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
ＨＩＶ−１感染の治療又は予防方法であって、当該治療が必要な個体に、請求項１に記載の化合物又は誘導体の治療上有効な量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の化合物又は誘導体の他に、少なくとも１種の他のＨＩＶ−１治療用化合物を投与することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１種の他のＨＩＶ−１治療用化合物がプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び融合阻害剤よりなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の化合物又は誘導体が配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド又はその誘導体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
後天性免疫不全症候群の治療方法であって、当該治療が必要な個体に、請求項１に記載の化合物又は誘導体の治療上有効な量を投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の化合物又は誘導体の他に、少なくとも１種の他の後天性免疫不全症候群の治療用化合物を投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１種の他の後天性免疫不全症候群の治療用化合物がプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤及び融合阻害剤よりなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の化合物又は誘導体が配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド又はその誘導体である、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図７】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図７】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５１１７０６（Ｐ２０１０−５１１７０６Ａ）
【公表日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４０２４９（Ｐ２００９−５４０２４９）
【出願日】平成１９年１２月４日（２００７．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２４７９０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７００４９
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（５９７１７７２４２）トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ (12)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【出願人】（５０９１６０５３５）オヤジェン・インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＯＹＡＧＥＮ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】６０１ Ｅｌｍｗｏｏｄ Ａｖｅｎｕｅ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ １４６２５ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月４日（２００７．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２４７９０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７００４９
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（５９７１７７２４２）トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ (12)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【出願人】（５０９１６０５３５）オヤジェン・インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＯＹＡＧＥＮ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】６０１ Ｅｌｍｗｏｏｄ Ａｖｅｎｕｅ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ １４６２５ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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