ＨＩＶ−１ＴＡＴ及び／又はＮＥＦタンパク質を含んで成る融合タンパク質
【課題】新規のＨＩＶタンパク質構築体、それを含む医薬の提供。
【解決手段】本発明は、（ａ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体；又は（ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｔタンパク質もしくはその誘導体；又は（ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体；を提供する。本発明は更にかかるタンパク質をコードする核酸、及びかかる核酸で形質転換された宿主細胞、例えばピチア・パストリスを提供する。
【解決手段】本発明は、（ａ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体；又は（ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｔタンパク質もしくはその誘導体；又は（ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体；を提供する。本発明は更にかかるタンパク質をコードする核酸、及びかかる核酸で形質転換された宿主細胞、例えばピチア・パストリスを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規のＨＩＶタンパク質構築体、医薬におけるその利用、それを含む医薬組成物、及びその製造の方法に関する。
【０００２】
詳しくは、本発明はＨＩＶ−１ Ｔａｔ及び／又はＮｅｆタンパク質を含んで成る融合タンパク質に関する。
【０００３】
ＨＩＶ−１は世界中の大きな健康問題の一つとして認識されている後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の主たる原因である。世界中で多大な研究がワクチンの製造に費やされているが、かかる努力は今のところ成功を収めていない。
【背景技術】
【０００４】
ＨＩＶ−１の非エンベロープタンパク質が発表されており、それには例えば内部構造タンパク質、例えばｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子、並びにその他の非構造タンパク質、例えばＲｅｖ，Ｎｅｆ，Ｖｉｆ及びＴａｔが挙げられる（Greeneら、New England J.Med, 324, 5, 308以降、及びBryantら（Ed. Pizzo), Pediatr.Infect.Dis.J., 11, 5, 390 以降（1992）。
【０００５】
ＨＩＶ Ｎｅｆ及びＴａｔタンパク質は早期タンパク質であり、即ち、それらは感染の早期において、且つ構造タンパク質の非存在下で発現される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明に従うと、以下を含んで成るタンパク質が提供される：
（ａ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体；又は
（ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体；又は
（ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体。
【０００７】
融合パートナーとは、Ｔａｔ又はＮｅｆではない任意のタンパク質配列を意味する。好ましくは、融合パートナーはヘモフィルス・インフレンザＢに由来するタンパク質Ｄ又はその脂質付加誘導体リポタンパク質Ｄである。特に、Ｎ末端側の１／３、即ち、およそ最初の１００〜１３０個のアミノ酸が利用される。ここではそれをＬｉｐｏ Ｄ １／３と称する。本発明の好適な態様において、Ｎｅｆタンパク質又はその誘導体はＴａｔタンパク質又はその誘導体に連結されていてよい。かかるＮｅｆ−Ｔａｔ融合体は任意的に融合パートナー、例えばタンパク質Ｄにも連結されていてよい。
【０００８】
融合パートナーは通常Ｎｅｆ又はＴａｔタンパク質のＮ末端に連結されている。
【０００９】
本発明に包含される誘導体には、５〜１０個のヒスチジン残基を好適に含むＣ末端ヒスチジンテールを有する分子が含まれる。一般に、ｎ個の残基を含むヒスチジンテールをここではＨｉｓ（ｎ）と呼ぶ。ヒスチジン（又は「Ｈｉｓ」）テールの存在は精製に役に立つ。より詳しくは、本発明は下記の構造を有するタンパク質を提供する：
Ｌｉｐｏ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ − Ｈｉｓ（6 ）
Ｌｉｐｏ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ）
Ｐｒｏｔ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ − Ｈｉｓ（6 ）
Ｐｒｏｔ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ）
Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ）
【００１０】
図１はかかる構築体のための融合パートナーのアミノ酸（Seq. ID. No.7 ）及びＤＮＡ配列（Seq. ID. No.6 ）を示す。
【００１１】
好適な態様において、当該タンパク質は５〜１０個、そして好ましくは６個のヒスチジン残基を含んで成るヒスチジンテールを伴って発現される。酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）における、Ｎｅｆ（Macreadie I.G.ら、1993, Yeast 9 (6) 565-573 ）及びＴａｔ（Braddock Mら、1989, Cell 58 (2) 269-79）の個別の発現は既に報告されている。Ｎｅｆタンパク質のみがミリスチル化されている。本発明ははじめてピチア発現系においてＮｅｆ及びＴａｔの個別の発現（Ｎｅｆ−Ｈｉｓ及びＴａｔ−Ｈｉｓ構築体）、並びに融合構築体Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓの有効な発現を提供する。代表的なＮｅｆ−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.8 及び９）、Ｔａｔ−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.10及び11）、並びにＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質（Seq. ID. No.12及び13）のＤＮＡ及びアミノ酸配列を図１２に示す。
【００１２】
本発明に包含される誘導体には突然変異タンパク質も含まれる。「突然変異」なる語は、部位特異的突然変異誘発のための周知の技術又は任意のその他の慣用の方法を利用して１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加又は置換の施された分子を意味する。
【００１３】
突然変異Ｔａｔを図２（Seq. ID. No.22及び23）に、Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.24及び25）と一緒に示す。
【００１４】
本発明は更に、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。かかる配列は適当な発現ベクターに挿入でき、そして適当な宿主内で発現されうる。
【００１５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は標準のＤＮＡ合成技術、例えばD.M.Roberts ら、Biochemistry 1985, 24, 5090-5098に記載の酵素ライゲーションにより、化学合成により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素重合により、又は熱安定ポリメラーゼの如きを利用するＰＣＲ技術により、又はこれらの技術の組合せを利用して合成できる。
【００１６】
ＤＮＡの酵素重合はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を利用し、ヌクレオシド三リン酸、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを適宜含む適当なバッファーの中で１０〜３７℃の温度において、一般に５０μｌ以下の容量で実施できうる。ＤＮＡフラグメントの酵素的ライゲーションはＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼを利用し、適当なバッファー、例えば０．０５ＭのＴｒｉｓ（pH７．４）、０．０１ＭのＭｇＣｌ2 、０．０１Ｍのジチオスレイトール、１mMのスペルミジン、１mMのＡＴＰ及び０．１mg／mlの牛血清アルブミンの中で、４℃乃至室温の温度で、一般に５０ml以下の容量で実施できうる。このＤＮＡポリマー又はフラグメントの化学合成は慣用のホスホトリエステル、ホスフィット、又はホスホラミジットにより、固相技術、例えば「Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual」（ed. H.G.Gassen and A.Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982)）又はその他の科学文献、例えばM.J.Gait, H.W.D.Matthes, M.Singh, B.S.Sproat, and R.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S.Sproat, and W.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P.Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus, and H.Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; 及びH.W.D.Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801に記載の固相技術を利用して実施できうる。
【００１７】
本発明は、本発明のタンパク質を調製するための方法も提供し、この方法は：
ｉ）宿主細胞内で、前記タンパク質又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡポリマーを発現できる複製可能な又は組込み式発現ベクターを用意する；
ii）宿主細胞を前記ベクターで形質転換する；
iii ）前記形質転換宿主細胞を前記タンパク質が産生されるよう前記ＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下で培養する；そして
iv）前記タンパク質を回収する；
工程を含んで成る。
【００１８】
本発明の方法は慣用の組換技術、例えばManiatisらMolecular Cloning-A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989に記載の技術により実施してよい。
【００１９】
本明細書において用いる語「形質転換」とは、外来ＤＮＡの宿主細胞への導入を意味する。これは例えばGenetic Engineering; Eds.S.M.Kingsman and A.J.Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988に記載の慣用の技術を利用しての適当なプラスミド又はウィルスによる形質転換、トランスフェクション又は感染により達成できうる。「形質転換」は以降、注目の外来遺伝子を含み、且つ発現する宿主細胞結果物に適用する。
【００２０】
当該発現ベクターは新規であり、そして本発明の一部を構成する。
【００２１】
複製可能な発現ベクターは本発明に従い、前記宿主細胞に適合するベクターを切断してインタクトなレプリコンを有する線形ＤＮＡセグメントを供し、そしてこの線形セグメントを、それと一緒になって所望の生成物をコードする１又は複数のＤＮＡ分子、例えば本発明のタンパク質又はその誘導体をコードするＤＮＡポリマーとライゲーション条件下で結合させることにより調製できうる。
【００２２】
かくして、当該ＤＮＡポリマーは適宜、予め形成しておく、又は当該ベクターの構築中に形成してよい。
【００２３】
ベクターの選択はある程度宿主細胞により決定される。かかる細胞は原核系でも真核系でもよいが、好ましくはＥ．コリ又は酵母とする。適当なベクターにはプラスミド、バクテリオファージ、コスミド及び組換ウィルスが挙げられる。
【００２４】
複製可能な発現ベクターの調製は、例えばManiatisら、前掲に記載のＤＮＡの制限処理、重合及びライゲーション用の適当な酵素により慣用的に実施されうる。
【００２５】
組換宿主細胞は、本発明に従い、宿主細胞を本発明の複製可能ベクターで形質転換条件下で形質転換させることにより調製する。適当な形質転換条件は慣用であり、そして例えばManiatisら、前掲又は「DNA Cloning 」Vol.II, D.M.Glover ed., IRL Press Ltd., 1985に記載されている。
【００２６】
形質転換条件の選定は宿主細胞により決定される。即ち、細菌宿主、例えばＥ．コリをＣａＣｌ2 の溶液（Cohen ら、Proc.Natl.Acad.Sci., 1973, 69, 2110 ）又はＲｂＣｌ，ＭｎＣｌ2 、酢酸カリウム及びグリセロールの混合物を含んで成る溶液、次いで３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ及びグリセロールで処理してよい。培養物中の哺乳動物細胞はこの細胞上へのベクターＤＮＡのカルシウム共沈殿により形質転換されうる。本発明は更に本発明の複製発現ベクターで形質転換された宿主細胞にまで及ぶ。
【００２７】
当該ＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下での形質転換宿主細胞の培養は、例えば上記のManiatisらの「DNA Cloning 」に記載の通りにして慣用的に実施する。かくして、好ましくは細胞に栄養分を供給し、そして５０℃以下の温度で培養する。
【００２８】
当該生成物は宿主細胞に従って慣用の方法により回収される。かくして、宿主細胞が細菌、例えばＥ．コリ又は酵母、例えばピチアのとき、それを物理的、化学的又は酵素的に溶解し、そして得られるリゼートからタンパク質生成物を単離してよい。宿主細胞が哺乳類系の場合、その生成物は一般に栄養培地から、又は細胞フリーエキスから単離されうる。慣用のタンパク質単離技術には選択的沈殿、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカラムを含むアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００２９】
ヒスチジンテールの施された本発明のタンパク質にとって、精製は金属イオンアフィニティーカラムの利用により容易に達成されうる。好適な態様において、このタンパク質はそれを陽イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲル濾過クロマトグラフィーにかけることにより更に精製する。次いでこのタンパク質を０．２２μｍの膜に通すことにより滅菌する。
【００３０】
本発明のタンパク質はワクチンとして調剤でき、又はヒスチジン残基を酵素的に浄化してよい。
【００３１】
本発明のタンパク質はＳＤＳ ＰＡＧＥによる可視化に従い、好ましくは純度８０％以上、より好ましくは純度９０％以上で提供される。好ましくは、このタンパク質はＳＤＳ ＰＡＧＥにより単一バンドとして出現する。
【００３２】
本発明は医薬的に許容される賦形剤中の本発明のタンパク質を含んで成る医薬組成物を提供する。
【００３３】
ワクチン製剤はNew Trends and Developments in Vaccines, Voller ら (eds.), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978 に一般に記載してある。リポソーム内での封入はFullerton 、米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。
【００３４】
本発明のタンパク質は好ましくは本発明のワクチン製剤の中でアジュバント付加されている。適当なアジュバントにはアルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（みょうばん）又はリン酸アルミニウムが挙げられるが、カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、又はアシル化チロシンの不溶性懸濁物、又はアシル化糖、陽イオンもしくは陰イオン誘導多糖類、又はポリホスファゼン類が挙げられる。
【００３５】
本発明の製剤において、当該アジュバント組成物が優先的なＴＨ１応答を誘導することが好ましい。適当なアジュバント製剤には、例えばモノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組合せが挙げられる。
【００３６】
増強システムはモノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体との組合せ、特にＷＯ９４／００１５３に開示のＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、又はＷＯ９６／３３７３９に開示の如きＱＳ２１がコレステロールでクエンチングされた反応性の弱い組成物を包含する。
【００３７】
ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを水中油エマルションの中で包含する極めて有効なアジュバント製剤がＷＯ９５／１７２１０に記載され、そして好適な製剤である。
【００３８】
従って、本発明の一の態様において、モノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体、特に３Ｄ−ＭＰＬで強化された本発明に係るタンパク質を含んで成るワクチンを提供する。
【００３９】
好ましくは、このワクチンは更にサポニン、より好ましくはＱＳ２１を含んで成る。
【００４０】
好ましくは、この製剤は更に水中油エマルション及びトコフェロールを含んで成る。本発明は更に、本発明のタンパク質を医薬的に許容される賦形剤、例えば３Ｄ−ＭＰＬと混合することを含んで成るワクチン製剤の製造のための方法を提供する。
【００４１】
本発明のワクチンは更にＨＩＶタンパク質、例えばエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０又はその誘導体ｇｐ１２０を含んで成る。
【００４２】
別の観点において、本発明はピチア・パストリスにおいて発現されたＨＩＶ Ｎｅｆ又はＨＩＶ Ｔａｔタンパク質、又はそれらの誘導体に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
（原文記載なし）
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明を以下の実施例を参考に更に説明する。
【００４５】
実施例
一般事項
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）によりコードされる２種類の調節タンパク質、Ｎｅｆ及びＴａｔタンパク質をＥ．コリ及びメチロール向性酵母ピチア・パストリスの中で生産した。
【００４６】
Ｂｒｕ／Ｌａｉ単離体由来のｎｅｆ遺伝子（Cell 40: 9-17, 1985 ）をこれらの構築体のために選定し、なぜならこの遺伝子はとりわけ共通Ｎｅｆに最も似しているからである。
【００４７】
Ｂｒｕ／Ｌａｉ ｎｅｆ遺伝子のための出発材料は哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３上にクローニングされた１１７０bp ＤＮＡのフラグメントとした（ｐｃＤＮＡ３／ｎｅｆ）。
【００４８】
ｔａｔ遺伝子はＢＨ１０分子クローンに由来する。この遺伝子にはＨＴＬＶIII ｃＤＮＡクローン名ｐＣＶ１が付与され、そしてScience, 229, p-69-73, 1985 に記載されている。
【００４９】
１．ＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びｔａｔ配列のＥ．コリ内での発現
Ｎｅｆタンパク質をコードする配列並びにｎｅｆ及びｔａｔ配列の融合体をプラスミドベクターｐＲＩＴ１４５８６及びｐＲＩＴ１４５８９に設置した（図１参照）。
【００５０】
Ｎｅｆ及びＮｅｆ−Ｔａｔ融合体を、融合パートナーとしてタンパク質Ｄの一部を利用して製造した。タンパク質Ｄはグラム陰性菌、ヘモフィルス・インフレンザの表層に露出したイムノグロブリンＤ結合タンパク質である。
【００５１】
ｐＲＩＴ１４５８６は、λＰＬプロモーターのコントロール下で、タンパク質Ｄの最初の１２７個のアミノ酸をコードするヘモフィルス・インフレンザ菌に由来するＤＮＡ配列（Infect.Immun. 60: 1336-1342, 1992 ）、その直後に後続する多重クローニング部位領域、並びに１個のグリシン、６個のヒスチジン残基及び停止コドンをコードするＤＮＡ配列を含む（図１Ａ）。
【００５２】
このベクターはプロセシングされた脂質化Ｈｉｓテール付き融合タンパク質（Ｌｉｐｏ Ｄ融合タンパク質）を発現するようにデザインされている。この融合タンパク質は長さ１８個のアミノ酸残基のシグナル配列を有する前駆体として合成し、そしてプロセシングの後、この前駆体分子内の１９位のシステインはアミノ末端残基となり、その後共有結合した脂肪酸により修飾される（図１Ｂ）。
【００５３】
ｐＲＩＴ１４５８９はｐＲＩＴ１４５８６とほぼ同一であるが、ｐｒｏｔ Ｄ誘導配列がシステイン１９コドンの直後で始まる。
【００５４】
このベクターからの発現はＨｉｓテール付き、脂質無しの融合タンパク質（Ｐｒｏｔ Ｄ融合タンパク質）をもたらす。
【００５５】
ＬｉｐＯＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ，ＬｉｐｏＤ−ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓ，ＰｒｏｔＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ及びＰｒｏｔＤ−ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓの４つの構築体を作った。
【００５６】
最初の２つの構築体は発現ベクターｐＲＩＴ１４５８６を利用して作り、最後の２つの構築体はｐＲＩＴ１４５８９を利用して作った。
【００５７】
１．１ ＬＩＰＯＤ−Ｎｅｆ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株ＥＣＬＤ
−Ｎ１の構築
１．１．１ ｌｉｐｏＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ発現プラスミドｐＲＩＴ１４５９５の
構築
ｎｅｆ遺伝子（Ｂｒｕ／Ｌａｉ単離体）をＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆプラスミドから、プライマー０１及び０２を用いて増幅した。
【００５８】
ＮｃｏＩ
プライマー０１（Seq ID NO 1 ）：５′ATCGT CCATG.G GT.GGC.AAG.TGG.T３′
ＳｐｅＩ
プライマー０２（Seq ID NO 2 ）：５′CGGCT ACTAGTGCAGTTCTTGAA３′
【００５９】
ｎｅｆＤＮＡ領域の増幅はヌクレオチド８３５７で開始し、そしてヌクレオチド８９７１で終結する（Cell, 40: 9-17, 1985）。
【００６０】
ＮｃｏＩ制限部位（ｎｅｆ遺伝子のＡＴＧコドンを担持する）をＰＣＲフラグメントの５′末端に導入し、そしてＳｐｅＩ部位は３′末端に導入した。
【００６１】
得られるＰＣＲフラグメント及び発現プラスミドｐＲＩＴ１４５８６を共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限処理し、アガロースゲルで精製し、ライゲーションし、そして適当なＥ．コリ宿主、株ＡＲ５８に形質転換させた。この株はｇａｌＥ：：Ｔｎ１０，Δ−８（ｃｈｌＤ−ｐｇｌ），Δ−Ｈ１（ｃｒｏ−ｃｈｌＡ），Ｎ+ 及びｃＩ８５７であるＮ９９に由来するクリプチックλリソゲンである。
【００６２】
得られる組換プラスミドを、自動配列決定によりｎｅｆ増幅した領域の確認後（下記１．１．２章参照のこと）、ｐＲＩＴ１４５９５と命名した。
【００６３】
１．１．２ ｐＲＩＴ１４５９５を有するＥ．コリ株ＡＲ５８の形質転換体の選
定
ＡＲ５８Ｅ．コリ宿主株で形質転換を行うと、組換プラスミドは異種タンパク質の熱誘導性生産を指令する。
【００６４】
いくつかの組換ｌｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｈｉｓ形質転換体の熱誘導性タンパク質生産をクマジーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。形質転換体は全て熱誘導性異種タンパク質生産を示した。組換ＬｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質の量は総タンパク質の１０％と推定された。
【００６５】
形質転換体の一つを選定し、そして実験室承認番号ＥＣＬＤ−Ｎ１を付与した。
【００６６】
組換プラスミドを株ＥＣＬＤ−Ｎ１から再単離し、そしてｎｅｆ−Ｈｉｓコード領域の配列を自動配列決定により確認した。このプラスミドに公共名ｐＲＩＴ１４５９５を付与した。
【００６７】
株ＥＣＬＤ−Ｎ１により生産された完全にプロセシングされ、且つアシル化された組換ＬｉｐｏＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質は
・脂肪酸
・１０９ａ．ａ．のタンパク質Ｄ（ａ．ａ．１９で始まり、ａ．ａ．１２７に至る）
・ｐＲＩＴ１４５８６のＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン（図１）
・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６に至る）
・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン（ｐＲＩＴ１４５８６のＳｐｅＩ部位においてクローニング）
・１個のグリシン及び６個のヒスチジン
から成る。
【００６８】
１．２ ＰＲＯＴＤ−Ｎｅｆ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株ＥＣＤ−
Ｎ１の構築
ＰｒｏｔＤ−Ｎｅｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＲＩＴ１４６００の構築は実施例１に記載のプラスミドの構築と同じであるが、ＰＣＲ増幅ｎｅｆフラグメントのためのレセプタープラスミドとしてｐＲＴ１４５８９を使用した。
【００６９】
Ｅ．コリＡＲ５８株をｐＲＩＴ１４６００で形質転換し、そしてその形質転換体を実施例１．１．２に記載の通りにして分析した。選定した形質転換体に実験室承認番号ＥＣＤ−Ｎ１を付与した。
【００７０】
１．３ ＬＩＰＯＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株
ＥＣＬＤ−ＮＴ６の構築
１．３．１ ｌｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ発現プラスミドｐＲＩＴ１４
５９６の構築
ｔａｔ遺伝子（ＢＨ１０単離体）をＰＣＲにより、ｐＣＶ１プラスミドの誘導体から、プライマー０３及び０４を用いて増幅させた。ＳｐｅＩ制限部位をＰＣＲフラグメントの両端に導入した。
【００７１】
ＳｐｅＩ
プライマー０３（Seq ID NO 3 ）：５′ATCGT ACTAGT. GAG.CCA.GTA.GAT.C ３′
ＳｐｅＩ
プライマー０４（Seq ID NO 4 ）：５′CGGCT ACTAGTTTCCTTCGGGCCT ３′
【００７２】
増幅ｔａｔ遺伝子のヌクレオチド配列はｐＣＶ１クローンにおいて示され（Science 229: 69-73, 1985）、そしてヌクレオチド５４１４乃至ヌクレオチド７９９８をカバーする。
【００７３】
得られるＰＣＲフラグメント及びプラスミドｐＲＩＴ１４５９５（ｌｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を発現する）を共にＳｐｅＩ制限酵素により消化し、アガロースゲルで精製し、ライゲーションし、そしてコンピテントＡＲ５８細胞に形質転換させた。得られる組換プラスミドに、自動配列決定によるｔａｔ増幅配列の確認後（以下の１．３．２章参照のこと）、名称ｐＲＩＴ１４５９６を付与した。
【００７４】
１．３．２ ｐＲＩＴ１４５９６を有する株ＡＲ５８の形質転換体の選定
形質転換体を増殖させ、熱誘導し、そしてそのタンパク質をクマジーブルー染色したゲルにより分析した。組換タンパク質の生産レベルは総タンパク質の１％と推定された。一の組換株を選定し、そして実験室名ＥＣＬＤ−ＮＴ６を付与した。
【００７５】
ｌｉｐｏＤ−ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓ組換プラスミドをＥＣＬＤ−ＮＴ６株から再単離し、配列決定し、そして公共名ｐＲＩＴ１４５９６を付与した。
【００７６】
株ＥＣＬＤ−Ｎ６により産生された完全にプロセシングされ、且つアシル化された組換ＬｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質は
・脂肪酸
・１０９ａ．ａ．のタンパク質Ｄ（ａ．ａ．１９で始まり、ａ．ａ．１２７に至る）
・ｐＲＩＴ１４５８６のＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン
・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６に至る）
・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン
・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至る）
・クローニング手順により導入されたスレオニン及びセリン
・１個のグリシン及び６個のヒスチジン
から成る。
【００７７】
１．４ ＰＲＯＴＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株
ＥＣＤ−ＮＴ１の構築
ＰｒｏｔＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＲＩＴ１４６０１の構築は実施例１．３．１に記載のプラスミド構築と同じであるが、ＰＣＲ増幅ｎｅｆフラグメントのためのレセプタープラスミドとしてｐＲＩＴ１４６００を使用した。
【００７８】
Ｅ．コリＡＲ５８株をｐＲＩＴ１４６０１で形質転換し、そして形質転換体を前述の通りに分析した。選定した形質転換体に実験室承認番号ＥＣＤ−ＮＴ１を付与した。
【００７９】
２．ピチア・パストリス内でのＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びｔａｔ配列の発現
Ｎｅｔタンパク質、Ｔａｔタンパク質及び融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔをメチロール向性酵母ピチア・パストリス内で誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターのコントロール下で発現させた。
【００８０】
これらのＨＩＶ−１遺伝子を発現させるため、組込み式ベクターＰＨＩＬ−Ｄ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）の改良バージョンを利用した。このベクターは異種タンパク質の発現がＡＯＸ１遺伝子の天然ＡＴＧコドンの直後で開始し、そして１個のグリシン及び６個のヒスチジン残基のテールを有する組換タンパク質が産生できるように改良されている。このＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、ＰＨＩＬ−Ｄ２ベクターの隣接ＡｓｕII及びＥｃｏＲＩ部位の間にオリゴヌクレオチドリンカーをクローニングすることにより構築した（図３参照）。Ｈｉｓテールの他に、このリンカーはＮｃｏＩ，ＳｐｅＩ及びＸｂａＩ制限部位を担持し、その間にｎｅｆ，ｔａｔ及びｎｅｆ−ｔａｔ融合体が挿入されている。
【００８１】
２．１ 組込み式ベクターｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質をコ
ード）、ｐＲＩＴ１４５９８（Ｔａｔ−Ｈｉｓタンパク質をコード）及
びｐＲＩＴ１４５９９（融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓをコード）の構
築
ｎｅｆ遺伝子をＰＣＲにより、ｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆプラスミドから、プライマー０１及び０２を用いて増幅させた（１．１．１章、ｐＲＩＴ１４５９５の構築参照）。得られるＰＣＲフラグメント及び組込み式ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処理し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４５９７を構築した（図３参照）。
【００８２】
ｔａｔ遺伝子をＰＣＲにより、ｐＣＶ１プラスミドの誘導体から、プライマー０５及び０４を利用して増幅させた（１．３．１章、ｐＲＩＴ１４５９６の構築参照）：
ＮｃｏＩ
プライマー０５（Seq ID NO 5 ）：５′ATCGT CCATGGAGCCAGTAGATC３′
【００８３】
ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲフラグメントの５′末端に導入し、一方でＳｐｅＩ部位をプライマー０４により３′末端に導入した。得られるＰＣＲフラグメント及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処理し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４５９８で構築した。
【００８４】
ｐＲＩＴ１４５９９を構築するため、ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓコード配列に対応する９１０bpのＤＮＡフラグメントをＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＥｃｏＲＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）とＮｃｏＩ部位との間にライゲーションした。このｎｅｆ−ｔａｔ−ＨｉｓコードフラグメントはｐＲＩＴ１４５９６のＸｂａＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）及びＮｃｏＩ消化物により得た。
【００８５】
２．２ ピチア・パストリス株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）の形質転換
Ｎｅｆ−Ｈｉｓ，Ｔａｔ−Ｈｉｓ及び融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓを発現するピチア・パストリス株を得るため、株ＧＳ１１５を、対応の発現カセットと、宿主ゲノム内のｈｉｓ４を相補するＨＩＳ４遺伝子とを担持する線形ＮｏｔＩフラグメントで形質転換した。ＧＳ１１５のＮｏｔＩ−線形フラグメントによる形質転換はＡＯＸＩ座での組換を優先する。
【００８６】
マルチコピー組込み式クローンを定量ドットブロット分析により選定し、そして組込み、挿入（Ｍｕｔ+ 表現型）又は転位（Ｍｕｔ5 表現型）のタイプを決定した。
【００８７】
各形質転換体から、組換タンパク質について高い生産レベルを示す一の形質転換体を選定した：
ミリスチル化された２１５個のアミノ酸のタンパク質である組換Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を産生する株Ｙ１７３８（Ｍｕｔ+ 表現型）は：
・ミリスチン酸
・ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン
・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６に至る）
・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン（ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＳｐｅＩ部位でクローニング）
・１個のグリシン及び６個のヒスチジン
から成る。
【００８８】
９５個のアミノ酸のタンパク質であるＴａｔ−Ｈｉｓタンパク質を産生する株Ｙ１７３９（Ｍｕｔ+ 表現型）は：
・ＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン
・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至る）
・クローニング手順により導入したスレオニン及びセリン
・１個のグリシン及び６個のヒスチジン
から成る。
【００８９】
ミリスチル化された３０２個のアミノ酸タンパク質である組換Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質を産生する株Ｙ１７３７（Ｍｕｔs 表現型）は：
・ミリスチン酸
・ＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン
・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６に至る）
・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン
・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至る）
・クローニング手順により導入されたスレオニン及びセリン
・１個のグリシン及び６個のヒスチジン
から成る。
【００９０】
３．ピチア・パストリス内でのＨＩＶ−１ Ｔａｔ−突然変異体の発現
Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異融合タンパク質と同様に、突然変異組換Ｔａｔタンパク質も発現させた。この突然変異Ｔａｔタンパク質は生物学的に不活性であり、一方でその免疫原エピトープは維持している。
【００９１】
D.Clements（Tulane University ）により構築された二重突然変異ｔａｔ遺伝子をこれらの構築体のために選定した。
【００９２】
このｔａｔ遺伝子（ＢＨ１０分子クローンを起源とする）は突然変異を活性部位領域（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ７８→Ｌｙｓ及びＡｓｐ８０→Ｇｌｕ）において保有する（Virology 235: 48-64, 1997 ）。
【００９３】
突然変異ｔａｔ遺伝子に、ＣＭＶ発現プラスミド（ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥ）内のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 部位の間にサブクローニングしたｃＤＮＡフラグメントを付与した。
【００９４】
３．１ 組込み式ベクターの構築
ｐＲＩＴ１４９１２（Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓタンパク質をコード）及びｐＲＩＴ１４９１３（融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓをコード）
ｔａｔ突然変異遺伝子をＰＣＲにより、ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドから、プライマー０５及び０４を利用して増幅させた（２．１章、ｐＲＩＴ１４５９８の構築参照）。
【００９５】
ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲフラグメントの５′末端に導入し、ＳｐｅＩ部位はプライマー０４で３′末端に導入した。得られるＰＣＲフラグメント及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処理し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４９１２を構築した。
【００９６】
ｐＲＩＴ１４９１３を構築するため、ｔａｔ突然変異遺伝子をＰＣＲにより、ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドから、プライマー０３及び０４を利用して増幅した（１．３．１章、ｐＲＩＴ１４５９６の構築参照）。
【００９７】
得られるＰＣＲフラグメント及びプラスミドｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を発現）を共にＳｐｅＩ制限酵素により消化し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４９１３を構築した。
【００９８】
３．２ ピチア・パストリス株ＧＳ１１５の形質転換
Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓタンパク質及び融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓを発現するピチア・パストリスを、２．２章に前述した組込み及び組換株選定戦略を適用することにより、得た。
【００９９】
９５個のアミノ酸のタンパク質であるＴａｔ突然変異−Ｈｉｓタンパク質を産生する２種類の組換株、Ｙ１７７５（Ｍｕｔ+ 表現型）及びＹ１７７６（Ｍｕｔs 表現型）を選別した。
【０１００】
３０２個のアミノ酸のタンパク質であるＮｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現する一の組換株、Ｙ１７７４（Ｍｕｔ+ 表現型）を選定した。
【０１０１】
４．Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質（ピチア・パストリス）の精製
精製スキームを１４６ｇの組換ピチア・パストリス細胞（湿潤重量）又は２ＬのＤｙｎｏ−ｍｉｌｌホモジネートＯＤ５５から展開した。クロマトグラフィー手順は室温で実施した。工程の間、Ｎｅｆ−Ｔａｔ陽性画分を低温室（＋４℃）に夜間保存しておいた。長期間のためには、サンプルを−２０℃で冷凍した。
【０１０２】
１４６ｇのピチア・パストリス細胞
↓
ホモジナイゼーション バッファー：２Ｌ ５０mMのＰＯ4 pH７．０
最終ＯＤ：５０
↓
Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ破砕（４回）
↓
遠心分離 ＪＡ１０ローター／９５００rpm ／３０min ／室温
↓
Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌペレット
↓
洗浄 バッファー：＋２Ｌ １０mMのＰＯ4 pH７．５−１５
（１ｈ−４℃） ０mMのＮａＣｌ−０．５％のエンピジェン
↓
遠心分離 ＪＡ１０ローター／９５００rpm ／３０min ／室温
↓
ペレット
【０１０３】
↓
可溶化 バッファー：＋６６０mlの１０mMのＰＯ4 pH７．５−
（Ｏ／Ｎ−４℃） １５０mMのＮａＣｌ−４．０ＭのＧｕＨＣｌ
↓
還元 ＋０．２Ｍの２−メルカプトエタンスルホン酸、ナト （４Ｈ−室温−暗所） リウム塩（粉末添加）／pHインキュベーション前に７
．５に調整（０．５ＭのＮａＯＨ溶液で）
↓
カルボキシメチル化 ＋０．２５Ｍのヨードアセトアミド（粉末添加）／pH（１／２ｈ−室温−暗所）インキュベーション前に７．５に調整（０．５ＭのＮ
ａＯＨ溶液で）
↓
Ｎｉ++−ＮＴＡ−アガ 平衡バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mMロース（Qiagen−３０ のＮａＣｌ−４．０ＭのＧｕＨＣｌ
mlの樹脂）上での固定 洗浄バッファー：１）平衡バッファー
化金属イオンアフィニ ２）１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５ティークロマトグラフ ０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素
ィー ３）１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５
０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素−２５mMのイミダゾール
溶出バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mM
のＮａＣｌ−６Ｍの尿素−０．５Ｍのイミダゾール
【０１０４】
↓
希釈 １８mS／cm2 のイオン強度にまで下げる
希釈バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−６Ｍの尿
素
↓
SP Sepharose FF 上で 平衡バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mMの陽イオン交換クロマ のＮａＣｌ−６．０Ｍの尿素
トグラフィー 洗浄バッファー：１）平衡バッファー
（Pharmacia −３０ml ２）１０mMのＰＯ4 pH７．５−２５の樹脂） ０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素
溶出バッファー：１０mMの硼酸塩pH９．０−２ＭのＮ
ａＣｌ−６Ｍの尿素
↓
濃縮 ５mg／mlに至る
１０kDa Ｏｍｅｇａ膜（Filtron ）
↓
Superdex200 XK上での 溶出バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mMゲル濾過クロマトグラ のＮａＣｌ−６Ｍの尿素
フィー１６／６０ ５mlのサンプル／インジェクション→５回インジェク（Pharmacia −１２０ ション
mlの樹脂）
↓
透析 バッファー：１０mMのＰＯ4 pH６．８−１５０mMのＮ
（Ｏ／Ｎ−４℃） ａＣｌ−０．５Ｍのアルギニン*
↓
無菌濾過 Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ ０．２２μｍ
* 比：１６００μｇ／mlのタンパク質濃度に対して０．５Ｍのアルギニン
【０１０５】
純度
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定する純度のレベルを図４でダイイチ銀染色により、そして図５でクマジーブルーＧ２５０により示す。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００工程の後：＞９５％
透析及び無菌濾過工程の後：＞９５％
【０１０６】
回収率
５１mgのＮｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質が１４６ｇの組換ピチア・パストリス細胞（＝２ＬのＤｙｎｏ−ｍｉｌｌホモジネートＯＤ５５）から精製された。
【０１０７】
５．ワクチン製剤
本発明に従って調製したワクチンは実施例１及び２に例示する抗原をコードするＤＮＡ組換体の発現生成物、並びにアジュバントとして、油／水エマルション中の３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ ３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の混合物を含んで成る配合物を含んで成る。
【０１０８】
３Ｄ−ＭＰＬはグラム陰性菌サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）のリポ多糖（ＬＰＳ）の化学的に解毒した形態である。
【０１０９】
Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、様々なビヒクルと組合せた３Ｄ−ＭＰＬが体液及びＴＨ１型細胞免疫の双方を非常に高めることを示した。
【０１１０】
ＱＳ２１はキラジャ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina ）樹木の樹皮の粗エキスから精製した一種のサポニンであり、これは強力なアジュバント活性を有する：これは抗原特異的リンパ増殖及びいくつかの抗原に対するＣＴＬの双方を活性化する。Smith Kline Beecham Biologicals で実施した実験は体液及びＴＨ１型細胞免疫応答の双方の誘導における３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せの明確な相乗効果を示した。
【０１１１】
油／水エマルションは２種類の油（トコフェロール及びスクワレン）並びに乳化剤としてＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳから成る。このエマルションは５％のスクワレン、５％のトコフェロール、０．４％のＴｗｅｅｎ８０を含んで成り、そして１８０nmの平均粒径を有する（ＷＯ９５／１７２１０参照）。
【０１１２】
Smith Kline Beecham Biologicals で実施した実験は、３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１に対するこのＯ／Ｗエマルションの付加がその免疫刺激特性を更に強めることを実証した。
【０１１３】
油／水エマルションの調製（２倍濃縮物）
Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶かし、ＰＢＳ中の２％の溶液にした。１００mlの２倍濃縮エマルションを供するため、５ｇのＤＬアルファトコフェロール及び５mlのスクワレンをボルテックスにかけてよく混合する。９０mlのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を加え、そしてよく混合する。得られるエマルションをシリンジに通し、そして最後にＭ１１０Ｓマイクロ流動装置を用いてマイクロ流動化した。得られる油滴は約１８０nmのサイズを有していた。
【０１１４】
水中油製剤の調製
実施例１又は２に従って調製した抗原（５μｇ）を１０倍濃縮ＰＢＳ pH６．８及びＨ2 Ｏに希釈し、そしてＳＢ６２，３Ｄ−ＭＰＬ（５μｇ），ＱＳ２１（５μｇ）及び保存剤としての５０μｇ／mlのチオメルサールを５分間隔で順々に添加した。エマルションの容量は総容量の５０％に相当させた（１００μｌの用量のために５０μｌ）。
【０１１５】
インキュベーションは全て撹拌しながら室温で実施した。
【０１１６】
げっ歯動物でのＴａｔ及びＮｅｆ−Ｔａｔの免疫原性
Ｔａｔ及びＮｅｆＴａｔによる免疫を経て誘導される免疫応答の特性決定を実施した。アイソタイププロフィール及び細胞媒介免疫（ＣＭ１）についての情報を得るため、マウスで２通りの免疫実験を実施した。第一の実験では、マウスに２回、２週間あけて酸化又は還元型のＴａｔ又はＮｅｆＴａｔそれぞれで肉趾に免疫を施した。抗原をスクワレン、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びα−トコフェロールを含んで成る水中油エマルションに配合し、そしてコントロールグループにアジュバントのみを与えた。最後の免疫の２週間後、血清を獲得し、そして抗体力価及びアイソタイプの決定のためにＴａｔ特異的ＥＬＩＳＡ（コーティングのために還元Ｔａｔ使用）にかけた（図６ａ）。抗体力価は酸化型Ｔａｔを受容したマウスにおいて最高であった。一般に、酸化型分子は還元型よりも高い抗体力価を誘導し、そしてＴａｔ単独はＮｅｆＴａｔよりも高い抗体力価を誘導した。この観察は第二の実験で確認された。最も興味深いことには、Ｔａｔ特異的抗体のアイソタイププロフィールが免疫のために利用した抗原に依存して相違した。ＴａｔのみはバランスのとれたＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａプロフィールを誘引し、ＮｅｆＴａｔははるかに強いＴH2片寄りを誘導した（図６ｂ）。これも第二の実験で確認された。
【０１１７】
第二のマウス実験では、動物に還元型の分子のみ、又はアジュバントのみを与えた。血清学分析の他（上記参照）、リンパ節細胞からのリンパ増殖応答を評価した。Ｔａｔ又はＮｅｆＴａｔによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのかかる細胞の再刺激の後、3 Ｈ−チミジン組込みを４日間の培養の後に測定した。刺激指数としての結果の紹介は、抗体を受容したマウスの双方のグループにおいて非常に強い応答が誘導されたことを示す（図７）。
【０１１８】
まとめると、マウス研究はＴａｔ及びＮｅｆ−Ｔａｔが極めて免疫原性の候補ワクチン抗原であることを示唆する。２種類の分子に対して特異的な応答は５０％以上のＩｇＧ１を有する高い抗体応答を特徴とする。更に、強力なＣＭＩ応答（リンパ増殖により測定）が観察された。
【０１１９】
７．Ｔａｔ及びＮｅｆ−Ｔａｔタンパク質の機能特性
酸化型又は還元型のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔ分子をヒトＴ細胞系に結合するその能力について調べた。更に、かかる細胞系の増殖に対する作用を評価した。ＥＬＩＳＡプレートに一夜、様々な濃度のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔタンパク質、II型ヘルペス単純ウィルス由来の無関係ｇＤ、又はバッファーコントロールのみをコーティングした。コーティング溶液の除去の後、ＨＵＴ−７８細胞をウェルに加えた。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、そしてウェルの底に対する細胞の結合を顕微鏡で評価した。定量手段として、細胞をトルイジンブルーで染色し、ＳＤＳにより溶解し、そして上清液中のトルイジンブルー濃度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。それらの結果は、４種類のタンパク質全て、即ち、酸化型又は還元型のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔが細胞のＥＬＩＳＡプレートに対する結合を媒介することを示唆した（図８）。無関係タンパク質（データーは示さず）及びバッファーは細胞を固定しなかった。このことは、組換発現Ｔａｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系に特異的に結合することを示唆した。
【０１２０】
第二の実験において、ＨＵＴ−７８細胞をタンパク質と１６時間接触させたままにした。インキュベーション期間の終了時に、細胞を〔3 Ｈ〕−チミジンでラベルし、そして組込み速度を細胞増殖の尺度として測定した。このアッセイに含ませた４種のタンパク質全てが放射活性組込みの消失の判定に従い、細胞増殖を阻害した（図９）。バッファーコントロールはこの効果を媒介しなかった。これらの結果は、組換Ｔａｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系の増殖を阻害できることを示した。
【０１２１】
まとめると、Ｔａｔ及びＮｅｆＴａｔタンパク質の機能特性決定は、これらのタンパク質がヒトＴ細胞系に結合できることを示した。更に、これらのタンパク質はかかる細胞系の増殖を阻害できる。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図２−６】
【図２−７】
【図２−８】
【図３】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図４】
【図５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規のＨＩＶタンパク質構築体、医薬におけるその利用、それを含む医薬組成物、及びその製造の方法に関する。
【０００２】
詳しくは、本発明はＨＩＶ−１ Ｔａｔ及び／又はＮｅｆタンパク質を含んで成る融合タンパク質に関する。
【０００３】
ＨＩＶ−１は世界中の大きな健康問題の一つとして認識されている後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の主たる原因である。世界中で多大な研究がワクチンの製造に費やされているが、かかる努力は今のところ成功を収めていない。
【背景技術】
【０００４】
ＨＩＶ−１の非エンベロープタンパク質が発表されており、それには例えば内部構造タンパク質、例えばｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子、並びにその他の非構造タンパク質、例えばＲｅｖ，Ｎｅｆ，Ｖｉｆ及びＴａｔが挙げられる（Greeneら、New England J.Med, 324, 5, 308以降、及びBryantら（Ed. Pizzo), Pediatr.Infect.Dis.J., 11, 5, 390 以降（1992）。
【０００５】
ＨＩＶ Ｎｅｆ及びＴａｔタンパク質は早期タンパク質であり、即ち、それらは感染の早期において、且つ構造タンパク質の非存在下で発現される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明に従うと、以下を含んで成るタンパク質が提供される：
（ａ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体；又は
（ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体；又は
（ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体。
【０００７】
融合パートナーとは、Ｔａｔ又はＮｅｆではない任意のタンパク質配列を意味する。好ましくは、融合パートナーはヘモフィルス・インフレンザＢに由来するタンパク質Ｄ又はその脂質付加誘導体リポタンパク質Ｄである。特に、Ｎ末端側の１／３、即ち、およそ最初の１００〜１３０個のアミノ酸が利用される。ここではそれをＬｉｐｏ Ｄ １／３と称する。本発明の好適な態様において、Ｎｅｆタンパク質又はその誘導体はＴａｔタンパク質又はその誘導体に連結されていてよい。かかるＮｅｆ−Ｔａｔ融合体は任意的に融合パートナー、例えばタンパク質Ｄにも連結されていてよい。
【０００８】
融合パートナーは通常Ｎｅｆ又はＴａｔタンパク質のＮ末端に連結されている。
【０００９】
本発明に包含される誘導体には、５〜１０個のヒスチジン残基を好適に含むＣ末端ヒスチジンテールを有する分子が含まれる。一般に、ｎ個の残基を含むヒスチジンテールをここではＨｉｓ（ｎ）と呼ぶ。ヒスチジン（又は「Ｈｉｓ」）テールの存在は精製に役に立つ。より詳しくは、本発明は下記の構造を有するタンパク質を提供する：
Ｌｉｐｏ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ − Ｈｉｓ（6 ）
Ｌｉｐｏ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ）
Ｐｒｏｔ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ − Ｈｉｓ（6 ）
Ｐｒｏｔ Ｄ １／３ − Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ）
Ｎｅｆ−Ｔａｔ − Ｈｉｓ（6 ）
【００１０】
図１はかかる構築体のための融合パートナーのアミノ酸（Seq. ID. No.7 ）及びＤＮＡ配列（Seq. ID. No.6 ）を示す。
【００１１】
好適な態様において、当該タンパク質は５〜１０個、そして好ましくは６個のヒスチジン残基を含んで成るヒスチジンテールを伴って発現される。酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）における、Ｎｅｆ（Macreadie I.G.ら、1993, Yeast 9 (6) 565-573 ）及びＴａｔ（Braddock Mら、1989, Cell 58 (2) 269-79）の個別の発現は既に報告されている。Ｎｅｆタンパク質のみがミリスチル化されている。本発明ははじめてピチア発現系においてＮｅｆ及びＴａｔの個別の発現（Ｎｅｆ−Ｈｉｓ及びＴａｔ−Ｈｉｓ構築体）、並びに融合構築体Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓの有効な発現を提供する。代表的なＮｅｆ−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.8 及び９）、Ｔａｔ−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.10及び11）、並びにＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質（Seq. ID. No.12及び13）のＤＮＡ及びアミノ酸配列を図１２に示す。
【００１２】
本発明に包含される誘導体には突然変異タンパク質も含まれる。「突然変異」なる語は、部位特異的突然変異誘発のための周知の技術又は任意のその他の慣用の方法を利用して１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加又は置換の施された分子を意味する。
【００１３】
突然変異Ｔａｔを図２（Seq. ID. No.22及び23）に、Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓ（Seq. ID. No.24及び25）と一緒に示す。
【００１４】
本発明は更に、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。かかる配列は適当な発現ベクターに挿入でき、そして適当な宿主内で発現されうる。
【００１５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は標準のＤＮＡ合成技術、例えばD.M.Roberts ら、Biochemistry 1985, 24, 5090-5098に記載の酵素ライゲーションにより、化学合成により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素重合により、又は熱安定ポリメラーゼの如きを利用するＰＣＲ技術により、又はこれらの技術の組合せを利用して合成できる。
【００１６】
ＤＮＡの酵素重合はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を利用し、ヌクレオシド三リン酸、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを適宜含む適当なバッファーの中で１０〜３７℃の温度において、一般に５０μｌ以下の容量で実施できうる。ＤＮＡフラグメントの酵素的ライゲーションはＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼを利用し、適当なバッファー、例えば０．０５ＭのＴｒｉｓ（pH７．４）、０．０１ＭのＭｇＣｌ2 、０．０１Ｍのジチオスレイトール、１mMのスペルミジン、１mMのＡＴＰ及び０．１mg／mlの牛血清アルブミンの中で、４℃乃至室温の温度で、一般に５０ml以下の容量で実施できうる。このＤＮＡポリマー又はフラグメントの化学合成は慣用のホスホトリエステル、ホスフィット、又はホスホラミジットにより、固相技術、例えば「Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual」（ed. H.G.Gassen and A.Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982)）又はその他の科学文献、例えばM.J.Gait, H.W.D.Matthes, M.Singh, B.S.Sproat, and R.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S.Sproat, and W.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P.Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus, and H.Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; 及びH.W.D.Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801に記載の固相技術を利用して実施できうる。
【００１７】
本発明は、本発明のタンパク質を調製するための方法も提供し、この方法は：
ｉ）宿主細胞内で、前記タンパク質又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡポリマーを発現できる複製可能な又は組込み式発現ベクターを用意する；
ii）宿主細胞を前記ベクターで形質転換する；
iii ）前記形質転換宿主細胞を前記タンパク質が産生されるよう前記ＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下で培養する；そして
iv）前記タンパク質を回収する；
工程を含んで成る。
【００１８】
本発明の方法は慣用の組換技術、例えばManiatisらMolecular Cloning-A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989に記載の技術により実施してよい。
【００１９】
本明細書において用いる語「形質転換」とは、外来ＤＮＡの宿主細胞への導入を意味する。これは例えばGenetic Engineering; Eds.S.M.Kingsman and A.J.Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988に記載の慣用の技術を利用しての適当なプラスミド又はウィルスによる形質転換、トランスフェクション又は感染により達成できうる。「形質転換」は以降、注目の外来遺伝子を含み、且つ発現する宿主細胞結果物に適用する。
【００２０】
当該発現ベクターは新規であり、そして本発明の一部を構成する。
【００２１】
複製可能な発現ベクターは本発明に従い、前記宿主細胞に適合するベクターを切断してインタクトなレプリコンを有する線形ＤＮＡセグメントを供し、そしてこの線形セグメントを、それと一緒になって所望の生成物をコードする１又は複数のＤＮＡ分子、例えば本発明のタンパク質又はその誘導体をコードするＤＮＡポリマーとライゲーション条件下で結合させることにより調製できうる。
【００２２】
かくして、当該ＤＮＡポリマーは適宜、予め形成しておく、又は当該ベクターの構築中に形成してよい。
【００２３】
ベクターの選択はある程度宿主細胞により決定される。かかる細胞は原核系でも真核系でもよいが、好ましくはＥ．コリ又は酵母とする。適当なベクターにはプラスミド、バクテリオファージ、コスミド及び組換ウィルスが挙げられる。
【００２４】
複製可能な発現ベクターの調製は、例えばManiatisら、前掲に記載のＤＮＡの制限処理、重合及びライゲーション用の適当な酵素により慣用的に実施されうる。
【００２５】
組換宿主細胞は、本発明に従い、宿主細胞を本発明の複製可能ベクターで形質転換条件下で形質転換させることにより調製する。適当な形質転換条件は慣用であり、そして例えばManiatisら、前掲又は「DNA Cloning 」Vol.II, D.M.Glover ed., IRL Press Ltd., 1985に記載されている。
【００２６】
形質転換条件の選定は宿主細胞により決定される。即ち、細菌宿主、例えばＥ．コリをＣａＣｌ2 の溶液（Cohen ら、Proc.Natl.Acad.Sci., 1973, 69, 2110 ）又はＲｂＣｌ，ＭｎＣｌ2 、酢酸カリウム及びグリセロールの混合物を含んで成る溶液、次いで３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ及びグリセロールで処理してよい。培養物中の哺乳動物細胞はこの細胞上へのベクターＤＮＡのカルシウム共沈殿により形質転換されうる。本発明は更に本発明の複製発現ベクターで形質転換された宿主細胞にまで及ぶ。
【００２７】
当該ＤＮＡポリマーの発現を可能にする条件下での形質転換宿主細胞の培養は、例えば上記のManiatisらの「DNA Cloning 」に記載の通りにして慣用的に実施する。かくして、好ましくは細胞に栄養分を供給し、そして５０℃以下の温度で培養する。
【００２８】
当該生成物は宿主細胞に従って慣用の方法により回収される。かくして、宿主細胞が細菌、例えばＥ．コリ又は酵母、例えばピチアのとき、それを物理的、化学的又は酵素的に溶解し、そして得られるリゼートからタンパク質生成物を単離してよい。宿主細胞が哺乳類系の場合、その生成物は一般に栄養培地から、又は細胞フリーエキスから単離されうる。慣用のタンパク質単離技術には選択的沈殿、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカラムを含むアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００２９】
ヒスチジンテールの施された本発明のタンパク質にとって、精製は金属イオンアフィニティーカラムの利用により容易に達成されうる。好適な態様において、このタンパク質はそれを陽イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲル濾過クロマトグラフィーにかけることにより更に精製する。次いでこのタンパク質を０．２２μｍの膜に通すことにより滅菌する。
【００３０】
本発明のタンパク質はワクチンとして調剤でき、又はヒスチジン残基を酵素的に浄化してよい。
【００３１】
本発明のタンパク質はＳＤＳ ＰＡＧＥによる可視化に従い、好ましくは純度８０％以上、より好ましくは純度９０％以上で提供される。好ましくは、このタンパク質はＳＤＳ ＰＡＧＥにより単一バンドとして出現する。
【００３２】
本発明は医薬的に許容される賦形剤中の本発明のタンパク質を含んで成る医薬組成物を提供する。
【００３３】
ワクチン製剤はNew Trends and Developments in Vaccines, Voller ら (eds.), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978 に一般に記載してある。リポソーム内での封入はFullerton 、米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。
【００３４】
本発明のタンパク質は好ましくは本発明のワクチン製剤の中でアジュバント付加されている。適当なアジュバントにはアルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（みょうばん）又はリン酸アルミニウムが挙げられるが、カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、又はアシル化チロシンの不溶性懸濁物、又はアシル化糖、陽イオンもしくは陰イオン誘導多糖類、又はポリホスファゼン類が挙げられる。
【００３５】
本発明の製剤において、当該アジュバント組成物が優先的なＴＨ１応答を誘導することが好ましい。適当なアジュバント製剤には、例えばモノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組合せが挙げられる。
【００３６】
増強システムはモノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体との組合せ、特にＷＯ９４／００１５３に開示のＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、又はＷＯ９６／３３７３９に開示の如きＱＳ２１がコレステロールでクエンチングされた反応性の弱い組成物を包含する。
【００３７】
ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを水中油エマルションの中で包含する極めて有効なアジュバント製剤がＷＯ９５／１７２１０に記載され、そして好適な製剤である。
【００３８】
従って、本発明の一の態様において、モノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体、特に３Ｄ−ＭＰＬで強化された本発明に係るタンパク質を含んで成るワクチンを提供する。
【００３９】
好ましくは、このワクチンは更にサポニン、より好ましくはＱＳ２１を含んで成る。
【００４０】
好ましくは、この製剤は更に水中油エマルション及びトコフェロールを含んで成る。本発明は更に、本発明のタンパク質を医薬的に許容される賦形剤、例えば３Ｄ−ＭＰＬと混合することを含んで成るワクチン製剤の製造のための方法を提供する。
【００４１】
本発明のワクチンは更にＨＩＶタンパク質、例えばエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０又はその誘導体ｇｐ１２０を含んで成る。
【００４２】
別の観点において、本発明はピチア・パストリスにおいて発現されたＨＩＶ Ｎｅｆ又はＨＩＶ Ｔａｔタンパク質、又はそれらの誘導体に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
（原文記載なし）
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明を以下の実施例を参考に更に説明する。
【００４５】
実施例
一般事項
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）によりコードされる２種類の調節タンパク質、Ｎｅｆ及びＴａｔタンパク質をＥ．コリ及びメチロール向性酵母ピチア・パストリスの中で生産した。
【００４６】
Ｂｒｕ／Ｌａｉ単離体由来のｎｅｆ遺伝子（Cell 40: 9-17, 1985 ）をこれらの構築体のために選定し、なぜならこの遺伝子はとりわけ共通Ｎｅｆに最も似しているからである。
【００４７】
Ｂｒｕ／Ｌａｉ ｎｅｆ遺伝子のための出発材料は哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３上にクローニングされた１１７０bp ＤＮＡのフラグメントとした（ｐｃＤＮＡ３／ｎｅｆ）。
【００４８】
ｔａｔ遺伝子はＢＨ１０分子クローンに由来する。この遺伝子にはＨＴＬＶIII ｃＤＮＡクローン名ｐＣＶ１が付与され、そしてScience, 229, p-69-73, 1985 に記載されている。
【００４９】
１．ＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びｔａｔ配列のＥ．コリ内での発現
Ｎｅｆタンパク質をコードする配列並びにｎｅｆ及びｔａｔ配列の融合体をプラスミドベクターｐＲＩＴ１４５８６及びｐＲＩＴ１４５８９に設置した（図１参照）。
【００５０】
Ｎｅｆ及びＮｅｆ−Ｔａｔ融合体を、融合パートナーとしてタンパク質Ｄの一部を利用して製造した。タンパク質Ｄはグラム陰性菌、ヘモフィルス・インフレンザの表層に露出したイムノグロブリンＤ結合タンパク質である。
【００５１】
ｐＲＩＴ１４５８６は、λＰＬプロモーターのコントロール下で、タンパク質Ｄの最初の１２７個のアミノ酸をコードするヘモフィルス・インフレンザ菌に由来するＤＮＡ配列（Infect.Immun. 60: 1336-1342, 1992 ）、その直後に後続する多重クローニング部位領域、並びに１個のグリシン、６個のヒスチジン残基及び停止コドンをコードするＤＮＡ配列を含む（図１Ａ）。
【００５２】
このベクターはプロセシングされた脂質化Ｈｉｓテール付き融合タンパク質（Ｌｉｐｏ Ｄ融合タンパク質）を発現するようにデザインされている。この融合タンパク質は長さ１８個のアミノ酸残基のシグナル配列を有する前駆体として合成し、そしてプロセシングの後、この前駆体分子内の１９位のシステインはアミノ末端残基となり、その後共有結合した脂肪酸により修飾される（図１Ｂ）。
【００５３】
ｐＲＩＴ１４５８９はｐＲＩＴ１４５８６とほぼ同一であるが、ｐｒｏｔ Ｄ誘導配列がシステイン１９コドンの直後で始まる。
【００５４】
このベクターからの発現はＨｉｓテール付き、脂質無しの融合タンパク質（Ｐｒｏｔ Ｄ融合タンパク質）をもたらす。
【００５５】
ＬｉｐＯＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ，ＬｉｐｏＤ−ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓ，ＰｒｏｔＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ及びＰｒｏｔＤ−ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓの４つの構築体を作った。
【００５６】
最初の２つの構築体は発現ベクターｐＲＩＴ１４５８６を利用して作り、最後の２つの構築体はｐＲＩＴ１４５８９を利用して作った。
【００５７】
１．１ ＬＩＰＯＤ−Ｎｅｆ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株ＥＣＬＤ
−Ｎ１の構築
１．１．１ ｌｉｐｏＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ発現プラスミドｐＲＩＴ１４５９５の
構築
ｎｅｆ遺伝子（Ｂｒｕ／Ｌａｉ単離体）をＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆプラスミドから、プライマー０１及び０２を用いて増幅した。
【００５８】
ＮｃｏＩ
プライマー０１（Seq ID NO 1 ）：５′ATCGT CCATG.G GT.GGC.AAG.TGG.T３′
ＳｐｅＩ
プライマー０２（Seq ID NO 2 ）：５′CGGCT ACTAGTGCAGTTCTTGAA３′
【００５９】
ｎｅｆＤＮＡ領域の増幅はヌクレオチド８３５７で開始し、そしてヌクレオチド８９７１で終結する（Cell, 40: 9-17, 1985）。
【００６０】
ＮｃｏＩ制限部位（ｎｅｆ遺伝子のＡＴＧコドンを担持する）をＰＣＲフラグメントの５′末端に導入し、そしてＳｐｅＩ部位は３′末端に導入した。
【００６１】
得られるＰＣＲフラグメント及び発現プラスミドｐＲＩＴ１４５８６を共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで制限処理し、アガロースゲルで精製し、ライゲーションし、そして適当なＥ．コリ宿主、株ＡＲ５８に形質転換させた。この株はｇａｌＥ：：Ｔｎ１０，Δ−８（ｃｈｌＤ−ｐｇｌ），Δ−Ｈ１（ｃｒｏ−ｃｈｌＡ），Ｎ+ 及びｃＩ８５７であるＮ９９に由来するクリプチックλリソゲンである。
【００６２】
得られる組換プラスミドを、自動配列決定によりｎｅｆ増幅した領域の確認後（下記１．１．２章参照のこと）、ｐＲＩＴ１４５９５と命名した。
【００６３】
１．１．２ ｐＲＩＴ１４５９５を有するＥ．コリ株ＡＲ５８の形質転換体の選
定
ＡＲ５８Ｅ．コリ宿主株で形質転換を行うと、組換プラスミドは異種タンパク質の熱誘導性生産を指令する。
【００６４】
いくつかの組換ｌｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｈｉｓ形質転換体の熱誘導性タンパク質生産をクマジーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。形質転換体は全て熱誘導性異種タンパク質生産を示した。組換ＬｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質の量は総タンパク質の１０％と推定された。
【００６５】
形質転換体の一つを選定し、そして実験室承認番号ＥＣＬＤ−Ｎ１を付与した。
【００６６】
組換プラスミドを株ＥＣＬＤ−Ｎ１から再単離し、そしてｎｅｆ−Ｈｉｓコード領域の配列を自動配列決定により確認した。このプラスミドに公共名ｐＲＩＴ１４５９５を付与した。
【００６７】
株ＥＣＬＤ−Ｎ１により生産された完全にプロセシングされ、且つアシル化された組換ＬｉｐｏＤ−ｎｅｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質は
・脂肪酸
・１０９ａ．ａ．のタンパク質Ｄ（ａ．ａ．１９で始まり、ａ．ａ．１２７に至る）
・ｐＲＩＴ１４５８６のＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン（図１）
・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６に至る）
・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン（ｐＲＩＴ１４５８６のＳｐｅＩ部位においてクローニング）
・１個のグリシン及び６個のヒスチジン
から成る。
【００６８】
１．２ ＰＲＯＴＤ−Ｎｅｆ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株ＥＣＤ−
Ｎ１の構築
ＰｒｏｔＤ−Ｎｅｆ−Ｈｉｓ融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＲＩＴ１４６００の構築は実施例１に記載のプラスミドの構築と同じであるが、ＰＣＲ増幅ｎｅｆフラグメントのためのレセプタープラスミドとしてｐＲＴ１４５８９を使用した。
【００６９】
Ｅ．コリＡＲ５８株をｐＲＩＴ１４６００で形質転換し、そしてその形質転換体を実施例１．１．２に記載の通りにして分析した。選定した形質転換体に実験室承認番号ＥＣＤ−Ｎ１を付与した。
【００７０】
１．３ ＬＩＰＯＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株
ＥＣＬＤ−ＮＴ６の構築
１．３．１ ｌｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ発現プラスミドｐＲＩＴ１４
５９６の構築
ｔａｔ遺伝子（ＢＨ１０単離体）をＰＣＲにより、ｐＣＶ１プラスミドの誘導体から、プライマー０３及び０４を用いて増幅させた。ＳｐｅＩ制限部位をＰＣＲフラグメントの両端に導入した。
【００７１】
ＳｐｅＩ
プライマー０３（Seq ID NO 3 ）：５′ATCGT ACTAGT. GAG.CCA.GTA.GAT.C ３′
ＳｐｅＩ
プライマー０４（Seq ID NO 4 ）：５′CGGCT ACTAGTTTCCTTCGGGCCT ３′
【００７２】
増幅ｔａｔ遺伝子のヌクレオチド配列はｐＣＶ１クローンにおいて示され（Science 229: 69-73, 1985）、そしてヌクレオチド５４１４乃至ヌクレオチド７９９８をカバーする。
【００７３】
得られるＰＣＲフラグメント及びプラスミドｐＲＩＴ１４５９５（ｌｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を発現する）を共にＳｐｅＩ制限酵素により消化し、アガロースゲルで精製し、ライゲーションし、そしてコンピテントＡＲ５８細胞に形質転換させた。得られる組換プラスミドに、自動配列決定によるｔａｔ増幅配列の確認後（以下の１．３．２章参照のこと）、名称ｐＲＩＴ１４５９６を付与した。
【００７４】
１．３．２ ｐＲＩＴ１４５９６を有する株ＡＲ５８の形質転換体の選定
形質転換体を増殖させ、熱誘導し、そしてそのタンパク質をクマジーブルー染色したゲルにより分析した。組換タンパク質の生産レベルは総タンパク質の１％と推定された。一の組換株を選定し、そして実験室名ＥＣＬＤ−ＮＴ６を付与した。
【００７５】
ｌｉｐｏＤ−ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓ組換プラスミドをＥＣＬＤ−ＮＴ６株から再単離し、配列決定し、そして公共名ｐＲＩＴ１４５９６を付与した。
【００７６】
株ＥＣＬＤ−Ｎ６により産生された完全にプロセシングされ、且つアシル化された組換ＬｉｐｏＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質は
・脂肪酸
・１０９ａ．ａ．のタンパク質Ｄ（ａ．ａ．１９で始まり、ａ．ａ．１２７に至る）
・ｐＲＩＴ１４５８６のＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン
・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６に至る）
・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン
・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至る）
・クローニング手順により導入されたスレオニン及びセリン
・１個のグリシン及び６個のヒスチジン
から成る。
【００７７】
１．４ ＰＲＯＴＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−ＨＩＳ融合タンパク質を産生する組換株
ＥＣＤ−ＮＴ１の構築
ＰｒｏｔＤ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＲＩＴ１４６０１の構築は実施例１．３．１に記載のプラスミド構築と同じであるが、ＰＣＲ増幅ｎｅｆフラグメントのためのレセプタープラスミドとしてｐＲＩＴ１４６００を使用した。
【００７８】
Ｅ．コリＡＲ５８株をｐＲＩＴ１４６０１で形質転換し、そして形質転換体を前述の通りに分析した。選定した形質転換体に実験室承認番号ＥＣＤ−ＮＴ１を付与した。
【００７９】
２．ピチア・パストリス内でのＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びｔａｔ配列の発現
Ｎｅｔタンパク質、Ｔａｔタンパク質及び融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔをメチロール向性酵母ピチア・パストリス内で誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターのコントロール下で発現させた。
【００８０】
これらのＨＩＶ−１遺伝子を発現させるため、組込み式ベクターＰＨＩＬ−Ｄ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）の改良バージョンを利用した。このベクターは異種タンパク質の発現がＡＯＸ１遺伝子の天然ＡＴＧコドンの直後で開始し、そして１個のグリシン及び６個のヒスチジン残基のテールを有する組換タンパク質が産生できるように改良されている。このＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを、ＰＨＩＬ−Ｄ２ベクターの隣接ＡｓｕII及びＥｃｏＲＩ部位の間にオリゴヌクレオチドリンカーをクローニングすることにより構築した（図３参照）。Ｈｉｓテールの他に、このリンカーはＮｃｏＩ，ＳｐｅＩ及びＸｂａＩ制限部位を担持し、その間にｎｅｆ，ｔａｔ及びｎｅｆ−ｔａｔ融合体が挿入されている。
【００８１】
２．１ 組込み式ベクターｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質をコ
ード）、ｐＲＩＴ１４５９８（Ｔａｔ−Ｈｉｓタンパク質をコード）及
びｐＲＩＴ１４５９９（融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓをコード）の構
築
ｎｅｆ遺伝子をＰＣＲにより、ｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆプラスミドから、プライマー０１及び０２を用いて増幅させた（１．１．１章、ｐＲＩＴ１４５９５の構築参照）。得られるＰＣＲフラグメント及び組込み式ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処理し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４５９７を構築した（図３参照）。
【００８２】
ｔａｔ遺伝子をＰＣＲにより、ｐＣＶ１プラスミドの誘導体から、プライマー０５及び０４を利用して増幅させた（１．３．１章、ｐＲＩＴ１４５９６の構築参照）：
ＮｃｏＩ
プライマー０５（Seq ID NO 5 ）：５′ATCGT CCATGGAGCCAGTAGATC３′
【００８３】
ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲフラグメントの５′末端に導入し、一方でＳｐｅＩ部位をプライマー０４により３′末端に導入した。得られるＰＣＲフラグメント及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処理し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４５９８で構築した。
【００８４】
ｐＲＩＴ１４５９９を構築するため、ｎｅｆ−ｔａｔ−Ｈｉｓコード配列に対応する９１０bpのＤＮＡフラグメントをＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＥｃｏＲＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）とＮｃｏＩ部位との間にライゲーションした。このｎｅｆ−ｔａｔ−ＨｉｓコードフラグメントはｐＲＩＴ１４５９６のＸｂａＩ平滑末端化（Ｔ４ポリメラーゼ）及びＮｃｏＩ消化物により得た。
【００８５】
２．２ ピチア・パストリス株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）の形質転換
Ｎｅｆ−Ｈｉｓ，Ｔａｔ−Ｈｉｓ及び融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓを発現するピチア・パストリス株を得るため、株ＧＳ１１５を、対応の発現カセットと、宿主ゲノム内のｈｉｓ４を相補するＨＩＳ４遺伝子とを担持する線形ＮｏｔＩフラグメントで形質転換した。ＧＳ１１５のＮｏｔＩ−線形フラグメントによる形質転換はＡＯＸＩ座での組換を優先する。
【００８６】
マルチコピー組込み式クローンを定量ドットブロット分析により選定し、そして組込み、挿入（Ｍｕｔ+ 表現型）又は転位（Ｍｕｔ5 表現型）のタイプを決定した。
【００８７】
各形質転換体から、組換タンパク質について高い生産レベルを示す一の形質転換体を選定した：
ミリスチル化された２１５個のアミノ酸のタンパク質である組換Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を産生する株Ｙ１７３８（Ｍｕｔ+ 表現型）は：
・ミリスチン酸
・ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン
・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６に至る）
・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン（ＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターのＳｐｅＩ部位でクローニング）
・１個のグリシン及び６個のヒスチジン
から成る。
【００８８】
９５個のアミノ酸のタンパク質であるＴａｔ−Ｈｉｓタンパク質を産生する株Ｙ１７３９（Ｍｕｔ+ 表現型）は：
・ＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン
・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至る）
・クローニング手順により導入したスレオニン及びセリン
・１個のグリシン及び６個のヒスチジン
から成る。
【００８９】
ミリスチル化された３０２個のアミノ酸タンパク質である組換Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質を産生する株Ｙ１７３７（Ｍｕｔs 表現型）は：
・ミリスチン酸
・ＮｃｏＩクローニング部位を利用して構築したメチオニン
・２０５ａ．ａ．のＮｅｆタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．２０６に至る）
・クローニング手順により構築したスレオニン及びセリン
・８５ａ．ａ．のＴａｔタンパク質（ａ．ａ．２で始まり、ａ．ａ．８６に至る）
・クローニング手順により導入されたスレオニン及びセリン
・１個のグリシン及び６個のヒスチジン
から成る。
【００９０】
３．ピチア・パストリス内でのＨＩＶ−１ Ｔａｔ−突然変異体の発現
Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異融合タンパク質と同様に、突然変異組換Ｔａｔタンパク質も発現させた。この突然変異Ｔａｔタンパク質は生物学的に不活性であり、一方でその免疫原エピトープは維持している。
【００９１】
D.Clements（Tulane University ）により構築された二重突然変異ｔａｔ遺伝子をこれらの構築体のために選定した。
【００９２】
このｔａｔ遺伝子（ＢＨ１０分子クローンを起源とする）は突然変異を活性部位領域（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ７８→Ｌｙｓ及びＡｓｐ８０→Ｇｌｕ）において保有する（Virology 235: 48-64, 1997 ）。
【００９３】
突然変異ｔａｔ遺伝子に、ＣＭＶ発現プラスミド（ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥ）内のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 部位の間にサブクローニングしたｃＤＮＡフラグメントを付与した。
【００９４】
３．１ 組込み式ベクターの構築
ｐＲＩＴ１４９１２（Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓタンパク質をコード）及びｐＲＩＴ１４９１３（融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓをコード）
ｔａｔ突然変異遺伝子をＰＣＲにより、ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドから、プライマー０５及び０４を利用して増幅させた（２．１章、ｐＲＩＴ１４５９８の構築参照）。
【００９５】
ＮｃｏＩ制限部位をＰＣＲフラグメントの５′末端に導入し、ＳｐｅＩ部位はプライマー０４で３′末端に導入した。得られるＰＣＲフラグメント及びＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを共にＮｃｏＩ及びＳｐｅＩにより制限処理し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４９１２を構築した。
【００９６】
ｐＲＩＴ１４９１３を構築するため、ｔａｔ突然変異遺伝子をＰＣＲにより、ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドから、プライマー０３及び０４を利用して増幅した（１．３．１章、ｐＲＩＴ１４５９６の構築参照）。
【００９７】
得られるＰＣＲフラグメント及びプラスミドｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を発現）を共にＳｐｅＩ制限酵素により消化し、アガロースゲルで精製し、そしてライゲーションして組込み式プラスミドｐＲＩＴ１４９１３を構築した。
【００９８】
３．２ ピチア・パストリス株ＧＳ１１５の形質転換
Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓタンパク質及び融合体Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓを発現するピチア・パストリスを、２．２章に前述した組込み及び組換株選定戦略を適用することにより、得た。
【００９９】
９５個のアミノ酸のタンパク質であるＴａｔ突然変異−Ｈｉｓタンパク質を産生する２種類の組換株、Ｙ１７７５（Ｍｕｔ+ 表現型）及びＹ１７７６（Ｍｕｔs 表現型）を選別した。
【０１００】
３０２個のアミノ酸のタンパク質であるＮｅｆ−Ｔａｔ突然変異−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現する一の組換株、Ｙ１７７４（Ｍｕｔ+ 表現型）を選定した。
【０１０１】
４．Ｎｅｆ−Ｔａｔ−Ｈｉｓ融合タンパク質（ピチア・パストリス）の精製
精製スキームを１４６ｇの組換ピチア・パストリス細胞（湿潤重量）又は２ＬのＤｙｎｏ−ｍｉｌｌホモジネートＯＤ５５から展開した。クロマトグラフィー手順は室温で実施した。工程の間、Ｎｅｆ−Ｔａｔ陽性画分を低温室（＋４℃）に夜間保存しておいた。長期間のためには、サンプルを−２０℃で冷凍した。
【０１０２】
１４６ｇのピチア・パストリス細胞
↓
ホモジナイゼーション バッファー：２Ｌ ５０mMのＰＯ4 pH７．０
最終ＯＤ：５０
↓
Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ破砕（４回）
↓
遠心分離 ＪＡ１０ローター／９５００rpm ／３０min ／室温
↓
Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌペレット
↓
洗浄 バッファー：＋２Ｌ １０mMのＰＯ4 pH７．５−１５
（１ｈ−４℃） ０mMのＮａＣｌ−０．５％のエンピジェン
↓
遠心分離 ＪＡ１０ローター／９５００rpm ／３０min ／室温
↓
ペレット
【０１０３】
↓
可溶化 バッファー：＋６６０mlの１０mMのＰＯ4 pH７．５−
（Ｏ／Ｎ−４℃） １５０mMのＮａＣｌ−４．０ＭのＧｕＨＣｌ
↓
還元 ＋０．２Ｍの２−メルカプトエタンスルホン酸、ナト （４Ｈ−室温−暗所） リウム塩（粉末添加）／pHインキュベーション前に７
．５に調整（０．５ＭのＮａＯＨ溶液で）
↓
カルボキシメチル化 ＋０．２５Ｍのヨードアセトアミド（粉末添加）／pH（１／２ｈ−室温−暗所）インキュベーション前に７．５に調整（０．５ＭのＮ
ａＯＨ溶液で）
↓
Ｎｉ++−ＮＴＡ−アガ 平衡バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mMロース（Qiagen−３０ のＮａＣｌ−４．０ＭのＧｕＨＣｌ
mlの樹脂）上での固定 洗浄バッファー：１）平衡バッファー
化金属イオンアフィニ ２）１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５ティークロマトグラフ ０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素
ィー ３）１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５
０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素−２５mMのイミダゾール
溶出バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mM
のＮａＣｌ−６Ｍの尿素−０．５Ｍのイミダゾール
【０１０４】
↓
希釈 １８mS／cm2 のイオン強度にまで下げる
希釈バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−６Ｍの尿
素
↓
SP Sepharose FF 上で 平衡バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mMの陽イオン交換クロマ のＮａＣｌ−６．０Ｍの尿素
トグラフィー 洗浄バッファー：１）平衡バッファー
（Pharmacia −３０ml ２）１０mMのＰＯ4 pH７．５−２５の樹脂） ０mMのＮａＣｌ−６Ｍの尿素
溶出バッファー：１０mMの硼酸塩pH９．０−２ＭのＮ
ａＣｌ−６Ｍの尿素
↓
濃縮 ５mg／mlに至る
１０kDa Ｏｍｅｇａ膜（Filtron ）
↓
Superdex200 XK上での 溶出バッファー：１０mMのＰＯ4 pH７．５−１５０mMゲル濾過クロマトグラ のＮａＣｌ−６Ｍの尿素
フィー１６／６０ ５mlのサンプル／インジェクション→５回インジェク（Pharmacia −１２０ ション
mlの樹脂）
↓
透析 バッファー：１０mMのＰＯ4 pH６．８−１５０mMのＮ
（Ｏ／Ｎ−４℃） ａＣｌ−０．５Ｍのアルギニン*
↓
無菌濾過 Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ ０．２２μｍ
* 比：１６００μｇ／mlのタンパク質濃度に対して０．５Ｍのアルギニン
【０１０５】
純度
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定する純度のレベルを図４でダイイチ銀染色により、そして図５でクマジーブルーＧ２５０により示す。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００工程の後：＞９５％
透析及び無菌濾過工程の後：＞９５％
【０１０６】
回収率
５１mgのＮｅｆ−Ｔａｔ−ｈｉｓタンパク質が１４６ｇの組換ピチア・パストリス細胞（＝２ＬのＤｙｎｏ−ｍｉｌｌホモジネートＯＤ５５）から精製された。
【０１０７】
５．ワクチン製剤
本発明に従って調製したワクチンは実施例１及び２に例示する抗原をコードするＤＮＡ組換体の発現生成物、並びにアジュバントとして、油／水エマルション中の３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ ３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の混合物を含んで成る配合物を含んで成る。
【０１０８】
３Ｄ−ＭＰＬはグラム陰性菌サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）のリポ多糖（ＬＰＳ）の化学的に解毒した形態である。
【０１０９】
Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、様々なビヒクルと組合せた３Ｄ−ＭＰＬが体液及びＴＨ１型細胞免疫の双方を非常に高めることを示した。
【０１１０】
ＱＳ２１はキラジャ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina ）樹木の樹皮の粗エキスから精製した一種のサポニンであり、これは強力なアジュバント活性を有する：これは抗原特異的リンパ増殖及びいくつかの抗原に対するＣＴＬの双方を活性化する。Smith Kline Beecham Biologicals で実施した実験は体液及びＴＨ１型細胞免疫応答の双方の誘導における３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せの明確な相乗効果を示した。
【０１１１】
油／水エマルションは２種類の油（トコフェロール及びスクワレン）並びに乳化剤としてＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳから成る。このエマルションは５％のスクワレン、５％のトコフェロール、０．４％のＴｗｅｅｎ８０を含んで成り、そして１８０nmの平均粒径を有する（ＷＯ９５／１７２１０参照）。
【０１１２】
Smith Kline Beecham Biologicals で実施した実験は、３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１に対するこのＯ／Ｗエマルションの付加がその免疫刺激特性を更に強めることを実証した。
【０１１３】
油／水エマルションの調製（２倍濃縮物）
Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶かし、ＰＢＳ中の２％の溶液にした。１００mlの２倍濃縮エマルションを供するため、５ｇのＤＬアルファトコフェロール及び５mlのスクワレンをボルテックスにかけてよく混合する。９０mlのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を加え、そしてよく混合する。得られるエマルションをシリンジに通し、そして最後にＭ１１０Ｓマイクロ流動装置を用いてマイクロ流動化した。得られる油滴は約１８０nmのサイズを有していた。
【０１１４】
水中油製剤の調製
実施例１又は２に従って調製した抗原（５μｇ）を１０倍濃縮ＰＢＳ pH６．８及びＨ2 Ｏに希釈し、そしてＳＢ６２，３Ｄ−ＭＰＬ（５μｇ），ＱＳ２１（５μｇ）及び保存剤としての５０μｇ／mlのチオメルサールを５分間隔で順々に添加した。エマルションの容量は総容量の５０％に相当させた（１００μｌの用量のために５０μｌ）。
【０１１５】
インキュベーションは全て撹拌しながら室温で実施した。
【０１１６】
げっ歯動物でのＴａｔ及びＮｅｆ−Ｔａｔの免疫原性
Ｔａｔ及びＮｅｆＴａｔによる免疫を経て誘導される免疫応答の特性決定を実施した。アイソタイププロフィール及び細胞媒介免疫（ＣＭ１）についての情報を得るため、マウスで２通りの免疫実験を実施した。第一の実験では、マウスに２回、２週間あけて酸化又は還元型のＴａｔ又はＮｅｆＴａｔそれぞれで肉趾に免疫を施した。抗原をスクワレン、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びα−トコフェロールを含んで成る水中油エマルションに配合し、そしてコントロールグループにアジュバントのみを与えた。最後の免疫の２週間後、血清を獲得し、そして抗体力価及びアイソタイプの決定のためにＴａｔ特異的ＥＬＩＳＡ（コーティングのために還元Ｔａｔ使用）にかけた（図６ａ）。抗体力価は酸化型Ｔａｔを受容したマウスにおいて最高であった。一般に、酸化型分子は還元型よりも高い抗体力価を誘導し、そしてＴａｔ単独はＮｅｆＴａｔよりも高い抗体力価を誘導した。この観察は第二の実験で確認された。最も興味深いことには、Ｔａｔ特異的抗体のアイソタイププロフィールが免疫のために利用した抗原に依存して相違した。ＴａｔのみはバランスのとれたＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａプロフィールを誘引し、ＮｅｆＴａｔははるかに強いＴH2片寄りを誘導した（図６ｂ）。これも第二の実験で確認された。
【０１１７】
第二のマウス実験では、動物に還元型の分子のみ、又はアジュバントのみを与えた。血清学分析の他（上記参照）、リンパ節細胞からのリンパ増殖応答を評価した。Ｔａｔ又はＮｅｆＴａｔによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのかかる細胞の再刺激の後、3 Ｈ−チミジン組込みを４日間の培養の後に測定した。刺激指数としての結果の紹介は、抗体を受容したマウスの双方のグループにおいて非常に強い応答が誘導されたことを示す（図７）。
【０１１８】
まとめると、マウス研究はＴａｔ及びＮｅｆ−Ｔａｔが極めて免疫原性の候補ワクチン抗原であることを示唆する。２種類の分子に対して特異的な応答は５０％以上のＩｇＧ１を有する高い抗体応答を特徴とする。更に、強力なＣＭＩ応答（リンパ増殖により測定）が観察された。
【０１１９】
７．Ｔａｔ及びＮｅｆ−Ｔａｔタンパク質の機能特性
酸化型又は還元型のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔ分子をヒトＴ細胞系に結合するその能力について調べた。更に、かかる細胞系の増殖に対する作用を評価した。ＥＬＩＳＡプレートに一夜、様々な濃度のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔタンパク質、II型ヘルペス単純ウィルス由来の無関係ｇＤ、又はバッファーコントロールのみをコーティングした。コーティング溶液の除去の後、ＨＵＴ−７８細胞をウェルに加えた。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、そしてウェルの底に対する細胞の結合を顕微鏡で評価した。定量手段として、細胞をトルイジンブルーで染色し、ＳＤＳにより溶解し、そして上清液中のトルイジンブルー濃度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。それらの結果は、４種類のタンパク質全て、即ち、酸化型又は還元型のＴａｔ及びＮｅｆＴａｔが細胞のＥＬＩＳＡプレートに対する結合を媒介することを示唆した（図８）。無関係タンパク質（データーは示さず）及びバッファーは細胞を固定しなかった。このことは、組換発現Ｔａｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系に特異的に結合することを示唆した。
【０１２０】
第二の実験において、ＨＵＴ−７８細胞をタンパク質と１６時間接触させたままにした。インキュベーション期間の終了時に、細胞を〔3 Ｈ〕−チミジンでラベルし、そして組込み速度を細胞増殖の尺度として測定した。このアッセイに含ませた４種のタンパク質全てが放射活性組込みの消失の判定に従い、細胞増殖を阻害した（図９）。バッファーコントロールはこの効果を媒介しなかった。これらの結果は、組換Ｔａｔ含有タンパク質がヒトＴ細胞系の増殖を阻害できることを示した。
【０１２１】
まとめると、Ｔａｔ及びＮｅｆＴａｔタンパク質の機能特性決定は、これらのタンパク質がヒトＴ細胞系に結合できることを示した。更に、これらのタンパク質はかかる細胞系の増殖を阻害できる。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図２−６】
【図２−７】
【図２−８】
【図３】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質であって
（ａ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体；又は
（ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体；又は
（ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体；
を含んで成るタンパク質。
【請求項２】
Ｔａｔ−Ｎｅｆ融合タンパク質又はその誘導体である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合タンパク質又はその誘導体である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
前記Ｔａｔタンパク質の誘導体が突然変異Ｔａｔタンパク質である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
前記Ｎｅｆタンパク質の誘導体が突然変異Ｎｅｆタンパク質である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項６】
前記融合パートナーがリポタンパク質又はその誘導体である、請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項７】
前記リポタンパク質がヘモフィルス・インフレンザ（Haemophilus Influenza ）Ｂのタンパク質Ｄ又はその誘導体である、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
前記融合パートナーがヘモフィルス・インフレンザＢのタンパク質ＤのＮ末端由来の１００〜１３０個のアミノ酸を含んで成る、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
前記Ｔａｔタンパク質が全長Ｔａｔタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記Ｎｅｆタンパク質が全長Ｎｅｆタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記Ｔａｔタンパク質がＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質及び融合パートナーに融合されている、請求項１〜１０のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記タンパク質がヒスチジンテールを有する、請求項１〜１１のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３記載の核酸で形質転換された宿主。
【請求項１５】
前記宿主がピチア・パストリス（Pichia pastoris ）又はＥ．コリ（E. coli ）のいずれかである、請求項１４記載の宿主。
【請求項１６】
医薬的に許容される賦形剤との混合における、請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質を含んで成るワクチン。
【請求項１７】
アジュバントを更に含んで成る、請求項１６記載のワクチン。
【請求項１８】
前記アジュバントがＴＨ１誘導アジュバントである、請求項１７記載のワクチン。
【請求項１９】
アジュバントがモノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体、例えば３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａを含んで成る、請求項１７又は１８記載のワクチン。
【請求項２０】
サポニンアジュバントを更に含んで成る、請求項１６〜１９のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質を製造する方法であって、宿主を前記タンパク質をコードする核酸で形質転換し、前記タンパク質を発現させ、そして当該タンパク質を回収する工程を含んで成る方法。
【請求項２２】
前記宿主がＥ．コリ又はピチア・パストリスである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質を医薬的に許容される希釈剤と混合することを含んで成る、請求項１６〜２０のいずれか１項記載のワクチンの製造方法。
【請求項２４】
（ｉ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体、又は（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体をピチア・パストリス内で製造する方法であって、ピチア・パストリスを前記ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体又はＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体をコードするＤＮＡで形質転換し、前記タンパク質を発現させ、そしてこのタンパク質を回収する工程を含んで成る方法。
【請求項１】
タンパク質であって
（ａ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体；又は
（ｂ）（ｉ）融合パートナーもしくは（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体のいずれかに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体；又は
（ｃ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体及び融合パートナーに連結されたＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体；
を含んで成るタンパク質。
【請求項２】
Ｔａｔ−Ｎｅｆ融合タンパク質又はその誘導体である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合タンパク質又はその誘導体である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
前記Ｔａｔタンパク質の誘導体が突然変異Ｔａｔタンパク質である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
前記Ｎｅｆタンパク質の誘導体が突然変異Ｎｅｆタンパク質である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項６】
前記融合パートナーがリポタンパク質又はその誘導体である、請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項７】
前記リポタンパク質がヘモフィルス・インフレンザ（Haemophilus Influenza ）Ｂのタンパク質Ｄ又はその誘導体である、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
前記融合パートナーがヘモフィルス・インフレンザＢのタンパク質ＤのＮ末端由来の１００〜１３０個のアミノ酸を含んで成る、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
前記Ｔａｔタンパク質が全長Ｔａｔタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記Ｎｅｆタンパク質が全長Ｎｅｆタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記Ｔａｔタンパク質がＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質及び融合パートナーに融合されている、請求項１〜１０のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記タンパク質がヒスチジンテールを有する、請求項１〜１１のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３記載の核酸で形質転換された宿主。
【請求項１５】
前記宿主がピチア・パストリス（Pichia pastoris ）又はＥ．コリ（E. coli ）のいずれかである、請求項１４記載の宿主。
【請求項１６】
医薬的に許容される賦形剤との混合における、請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質を含んで成るワクチン。
【請求項１７】
アジュバントを更に含んで成る、請求項１６記載のワクチン。
【請求項１８】
前記アジュバントがＴＨ１誘導アジュバントである、請求項１７記載のワクチン。
【請求項１９】
アジュバントがモノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体、例えば３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａを含んで成る、請求項１７又は１８記載のワクチン。
【請求項２０】
サポニンアジュバントを更に含んで成る、請求項１６〜１９のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質を製造する方法であって、宿主を前記タンパク質をコードする核酸で形質転換し、前記タンパク質を発現させ、そして当該タンパク質を回収する工程を含んで成る方法。
【請求項２２】
前記宿主がＥ．コリ又はピチア・パストリスである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質を医薬的に許容される希釈剤と混合することを含んで成る、請求項１６〜２０のいずれか１項記載のワクチンの製造方法。
【請求項２４】
（ｉ）ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体、又は（ii）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体をピチア・パストリス内で製造する方法であって、ピチア・パストリスを前記ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質もしくはその誘導体又はＨＩＶ Ｔａｔタンパク質もしくはその誘導体をコードするＤＮＡで形質転換し、前記タンパク質を発現させ、そしてこのタンパク質を回収する工程を含んで成る方法。
【公開番号】特開２００９−２１３４９２（Ｐ２００９−２１３４９２Ａ）
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５５９１６（Ｐ２００９−１５５９１６）
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【分割の表示】特願２０００−５１３９５３（Ｐ２０００−５１３９５３）の分割
【原出願日】平成１０年９月１７日（１９９８．９．１７）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【分割の表示】特願２０００−５１３９５３（Ｐ２０００−５１３９５３）の分割
【原出願日】平成１０年９月１７日（１９９８．９．１７）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]