ＨＩＶに対するヒトにおける広範なＴ細胞応答の生成
本発明は、ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質、またはその一部、またはその誘導体、あるいは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質、またはその一部、またはその誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、薬剤またはワクチンとして使用するための組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ならびにＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療および／または予防のためのその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質、またはその一部、またはその誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ならびにＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療および／または予防のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子である。すべてのレトロウイルスと同様に、このウイルスのゲノムも、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖタンパク質をコードしている。また、このウイルスゲノムは調節タンパク質、すなわちＴａｔおよびＲｅｖと、アクセサリータンパク質、すなわちＶｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、ＶｉｆおよびＮｅｆもコードしている。
【０００３】
ＡＩＤＳの流行が蔓延するのを抑制しようとする公衆衛生的努力にもかかわらず、新規感染数は依然として増加している。世界保健機関は、この世界的な蔓延を、２００３年末の時点で感染者数３，７８０万人と推定した。包括的な予防機構のさらなる改善がなければ、多数の新たなＨＩＶ感染が起こり、世界的に、この１０年で４，５００万人になると予測される（２００４ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ Ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌ ＡＩＤＳ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ，ＵＮＡＩＤＳ ａｎｄ ＷＨＯ）。
【０００４】
ＨＩＶ感染は、部分的に制御することができるが、未だに治癒されない慢性感染疾患である。合併症を予防し、ＡＩＤＳへの進行を遅延させる有効な手段がある。現状では、ＨＩＶに感染したすべての人が、ＡＩＤＳに進行するとは限らないが、一般に、多数がそうなると考えられている。
【０００５】
高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）と呼ばれる、いくつかの抗レトロウイルス薬の組み合わせは、ウイルス負荷を減少させることにおいて極めて有効であり、Ｔ細胞数を向上させることができる。これはＨＩＶの治癒ではなく、ＨＡＡＲＴ中の抑制レベルのＨＩＶを有する人々は、依然としてウイルスを他者に伝染させる可能性がある。しかしながら、ＨＩＶレベルが依然として抑制され、ＣＤ４数が２００よりも大きい場合、生活の質および寿命が著しく向上し、長くなり得るという十分な証拠がある。新規のベクターまたはアジュバント系など、多数の異なるＨＩＶワクチン送達戦略が、現在既に開発され、異なる前臨床設定および臨床試験で評価されている。第ＩＩＩ相臨床試験に入った最初のワクチン候補は、アルミニウム中のエンベロープｇｐ１２０タンパク質に基づいている（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １９９８；１４（Ｓｕｐｐｌ ３）（５）：Ｓ３２５−３１）。しかしながら、最初の臨床研究の結果は、あまり期待できるものではなかった。
【０００６】
ＨＡＡＲＴレジメンにおいて使用される薬物は、ウイルス力価を減少させることができるが、抗レトロウイルスレジメンに関していくつかの懸念がある。ＨＡＡＲＴに関する１つの主要な問題は、（長期の）副作用およびそれによる患者のコンプライアンスである。患者が服薬を忘れると、薬物耐性が進展し得る。また抗レトロウイルス薬は高価であり、世界の感染者の大多数が、ＨＩＶおよびＡＩＤＳ用の薬剤および治療を利用できない。
【０００７】
過去に有用性が試験されたワクチンは、通常、Ｅｎｖ等の単一ＨＩＶタンパク質に基づいている。しかしながら、そのような単一タンパク質、例えば、Ｅｎｖに対して免疫応答が生成された場合であっても、当該免疫応答が有効でないことが実証された。無効性の１つの理由は、特に、ウイルス中にワクチンによって誘発される免疫応答によって認識されないタンパク質をもたらすＥｎｖタンパク質に関する、ＨＩＶの高い変異率である。
【０００８】
利用できる有効な予防的治療がないため、有効なワクチンを臨床にもたらすことが依然として必要である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、驚くべきことに、ＨＩＶ−１タンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆを含むＭＶＡ系ＨＩＶワクチンが、ヒトにおいて、特にＨＩＶに感染している免疫不全のヒトにおいて、これらのＨＩＶタンパク質の最大６つに対するＴ細胞応答を誘発することができることを発見した。そのようなＭＶＡは、Ｔ細胞応答が所望されるエピトープは、免疫優勢エピトープによって、いわば上書きされるように、免疫優勢エピトープを免疫系に提供することが知られているため、この発見は予測され得なかった。さらに、臨床試験中、ワクチン接種したＨＩＶ感染者の免疫応答が、１回目の免疫付与を受けてから２０週後も依然としてベースラインよりも高いことが認められた。
【００１０】
実際には、本発明とは対照的に、免疫細胞に対するＨＩＶワクチンの効果を調査するために、ヒトにおける臨床試験はないが、マウスモデルにおいて、管内データまたは生体内データのいずれかが生成された。
【００１１】
実際、動物実験は、モデルがヒトの応答率および応答の大きさを予測しない場合が多いため、人体研究ほど良好でない。より多くのマウスおよびウサギのすべてが、ヒトと同様に、免疫応答性が高くなる。したがって、本発明者らによって得られたデータは、高く評価される必要があり、ＭＶＡによる免疫優勢の既知の現象を考慮すると、それらはＨＩＶに感染したヒトから得られたためにそれ程でないことは予測され得なかった。添付の実施例に記載される臨床試験に参加したＨＩＶ感染者は、３５０／μｌ未満のＣＤ４数を有し、この低い数字に基づくと、臨床試験の参加者に投与されるＭＶＡ系ワクチンから成る、８つのＨＩＶ−１タンパク質の６つに対するそのような広域Ｔ細胞応答は予測しなかったであろう。
【００１２】
例えば、第ＵＳ２００６／１８８９６１号および第ＷＯ０３／０９７６７５号は、ＭＶＡ系ＨＩＶワクチンについて説明した。しかしながら、これらの文書は、本明細書に記載されるような組換えＭＶＡにおいて適用されるＨＩＶ−１タンパク質に対する、広域Ｔ細胞応答を明らかにしていない。
【００１３】
第ＥＰ１９２１１４６号および第ＷＯ０１／４７９５５号は、Ｔ細胞応答の誘発のためのＣＴＬエピトープ（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆ、またはＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、およびＶｐｕ）を含むＭＶＡ系ＨＩＶワクチンについて説明する。しかしながら、これらの文書は、ヒトにおいて得られたデータはもちろん、広域Ｔ細胞応答を示すデータを提供していない。
【００１４】
第ＷＯ２００６／１２３２５６号は、第ＷＯ０１／４７９５５号によく似ており、より特異的なＣＴＬエピトープ以外に、第ＷＯ０１／４７９５５号が説明する内容を超えるものを提供しない。
【００１５】
第ＷＯ２００８／１１８９３６号は、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｎｅｆ、ＲＴ、Ｔａｔ、およびＲｅｖから選択されるＨＩＶタンパク質を含むＭＶＡ系ＨＩＶワクチンについて説明する。しかし、本文書は、単に動物モデルデータを有するという欠点があり、ヒトに対して合理的に推定され得ない。
【００１６】
Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈらの（２００８），Ｖａｃｃｉｎｅ．２６：６８８３−６８９３は、ＨＡＡＲＴ中、したがってＨＩＶに感染している若年成人に投与される、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびＲＴを含む、組換え体ポックスウイルスＨＩＶ−１ワクチンの安全性および免疫原性研究について報告している。しかしながら、著者らは、それらのワクチンの開発が容易に進展しそうにないと報告している。
【００１７】
しかしながら、この目的のために、免疫不全の被検体におけるそのような免疫応答はもちろん、８つのＨＩＶタンパク質の６つに対する広域Ｔ細胞応答を予測しなかったであろう。特に、管内データも動物モデルも、特にＨＩＶ治療の分野において、合理的な成功の期待の基礎を形成することができない。これは、ＨＩＶの「実際の」モデル系がヒト、特にＨＩＶに感染したヒトであるからである。
【００１８】
所望のＨＩＶタンパク質に対する免疫応答の生成を必ずしももたらさなかった動物実験および複数のＣＴＬエピトープを並べることによって（例えば、第ＷＯ０１／４７９５５号または第ＷＯ２００８／１１８９３６号）、免疫応答をさらに増殖させる試みに基づいて、免疫不全のヒトにおいて、８つのＨＩＶタンパク質の６つが、免疫系によって認識されることは予測され得なかった。
【００１９】
したがって、本発明は、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも３つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２０】
一実施形態において、当該組換えＭＶＡは、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む。
【００２１】
別の実施形態において、当該組換えＭＶＡは、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも８つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む。
【００２２】
本発明のさらに特定の実施形態において、当該組換えＭＶＡは、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、３、４、５、６、７、もしくは８つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む。
【００２３】
本発明は、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、８つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体、および１つ以上の追加の構造および／または規制ＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）も包含する。
【００２４】
好適な実施形態において、本発明は、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、ＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆ、または当該タンパク質の部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２５】
さらなる好適な実施形態において、本発明は、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、ＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆ、または当該タンパク質の部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２６】
特定の好適な実施形態において、本発明は、ウイルスゲノム中に、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、ＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発する際に使用するための、ＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、または当該タンパク質の部分、またはその誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２７】
別の特定の好適な実施形態において、本発明は、ウイルスゲノム中に、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、ＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発する際に使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または当該タンパク質の誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２８】
さらなる特定の好適な実施形態において、本発明は、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、ＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発する際に使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも８つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または当該タンパク質の誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを、ウイルスゲノム中に含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２９】
本発明は、本明細書に定義される組換えＭＶＡを含む薬学的またはワクチン組成物、特に、ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、その部分または当該タンパク質の誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを含む、組換えＭＶＡも提供する。
【００３０】
より好ましくは、本発明の薬学的またはワクチン組成物は、ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも８つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または当該タンパク質の誘導体を発現するための、１つ以上の発現カセットを含む、組換えＭＶＡを含む。
【００３１】
さらなる好適な実施形態において、組成物は、ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または当該タンパク質の誘導体を発現するための、１つ以上の発現カセットを含む、組換えＭＶＡ。
【００３２】
好適な実施形態において、薬学的またはワクチン組成物に含まれるＭＶＡは、当該薬学的またはワクチン組成物中に約２ｘ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量である。
【００３３】
別の好適な実施形態において、薬学的またはワクチン組成物に含まれるＭＶＡは、３つの時間間隔で投与するために調製される。３つの時間間隔は、好ましくは、０、４、および１２週目である。
【００３４】
本発明に記載の組換えＭＶＡを用いて、ここでは、多数のＨＩＶタンパク質を発現することが可能である。これらの多数のタンパク質は、広範な免疫応答を誘発することができる。したがって、異なるＨＩＶ分離体に対して有効な防御免疫応答が生成される可能性が高まる。
【００３５】
本発明に記載の修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）は、ヒトならびにマウスおよび非ヒト霊長類等のいくつかの動物種において使用するために適している。ＭＶＡは、例外的に安全であることが知られている。
【００３６】
本明細書で使用する「被検体」という用語は、特に、ヒト被検体を表す。本明細書で参照される時、ヒト被検体は、例えば、ＨＩＶ感染に起因して、免疫付与される場合があり、すなわち、ヒト被検体は、ＨＩＶ、例えばＨＩＶ−１に感染している。本明細書で参照されるヒト被検体は、それが３５０／μｌ未満のＣＤ４細胞数を有することを特徴とし得る。
【００３７】
本明細書で使用される時、「免疫不全の」は、免疫系が感染疾患を防御またはそれに対抗する能力が不全であるか、または全く存在しない状態である。
【００３８】
ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）がニワトリ胚線維芽細胞上を長期間、連続して通過することによって生成された（検討する場合は、Ｍａｙｒ，Ａ．，Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ，Ｖ．ａｎｄ Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．［１９７５］Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３，６−１４；Ｓｗｉｓｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５６８，３９２を参照）。ブタペスト条約の要件に準拠して寄託され、本発明に記載の組換え体ウイルスの生成に有用である、ＭＶＡウイルス株の実施例は、欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ、ソールズベリー（ＵＫ））において、１９９４年１月２７日に寄託番号第ＥＣＡＣＣ９４０１２７０７号で寄託された株ＭＶＡ５７２、２０００年１２月７日に第ＥＣＡＣＣ００１２０７０７号で寄託されたＭＶＡ５７５、および２０００年８月３０日に番号第０００８３００８号で、ＥＣＡＣＣにおいて寄託されたＭＶＡ−ＢＮである。
【００３９】
ワクチン開発におけるその使用に関する、ＭＶＡ株のいくつかの優れた特性は、広範な臨床試験において照明された（Ｍａｙｒら、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ １６７，３７５−３９０［１９８７］）。リスクの高い患者を含む、１２０，０００人を超えるヒトにおいて行われたこれらの研究中に、副作用は見られなかった（Ｓｔｉｃｋｌら、Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２［１９７４］）。
【００４０】
ＭＶＡは、哺乳類細胞におけるウイルス複製周期の後期に遮断されることがさらに分かった（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，１０８４７−１０８５１［１９９２］）。したがって、ＭＶＡは、そのＤＮＡを完全に複製し、早期、中期、および後期遺伝子生成物を合成するが、感染細胞から放出され得る成熟感染性ビリオンを組み立てることはできない。この理由で、すなわち、その複製制限された性質のために、ＭＶＡは、遺伝子発現ベクターとして機能する。
【００４１】
したがって、本発明の一実施形態において、組換えＭＶＡは、ＭＶＡ株のＭＶＡ５７５、ＭＶＡ５７２、およびＭＶＡ−ＢＮから選択される。
【００４２】
好適な実施形態において、本発明の組換えＭＶＡウイルスは、ヒトおよび非ヒト霊長類において複製能力がない。ヒトおよび／非ヒト霊長類において「複製能力がない」ＭＶＡウイルスという用語、ならびにヒトおよび／または非ヒト霊長類において「感染子孫ウイルスに対して複製されることができない」ウイルスの同義語は、いずれも好ましくは、当該ウイルスでワクチン接種されたヒトおよび／または非ヒト霊長類の細胞において、全く複製しないＭＶＡウイルスを表す。しかしながら、組換えＭＶＡウイルスが投与される、ヒトおよび／または非ヒト霊長類の免疫系によって制御される、わずかな残留複製活性を示す、それらのウイルスも本出願の範囲内である。
【００４３】
一実施形態において、複製能力がない組換えＭＶＡウイルスは、ウイルスがワクチンとして使用される、ヒトおよび／または非ヒト霊長類の細胞に感染することができるウイルスであってもよい。「細胞に感染することができる」ウイルスは、ウイルスまたは少なくともウイルスゲノムが、宿主細胞に組み込まれる程度に宿主細胞と相互作用することができる、ウイルスである。本発明に従って使用されるウイルスは、ワクチン接種したヒトおよび／または非ヒト霊長類の細胞に感染することができ、それは、ワクチン接種したヒトおよび／または非ヒト霊長類の細胞において、感染子孫ウイルスに対して複製されることができない。
【００４４】
本発明に従って、第１の動物種の細胞に感染することができるが、当該細胞において、感染子孫ウイルスに対して複製されることができないウイルスは、第２の動物種において異なる動作をし得ることが理解される。例えば、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体（以下を参照）は、ヒトの細胞に感染することができるが、ヒト細胞において、感染子孫ウイルスに対して複製されることができないウイルスである。しかしながら、同一のウイルスは、ニワトリにおいて効率的に複製され、すなわち、ニワトリにおいて、ＭＶＡ−ＢＮは、細胞に感染することも、それらの細胞において感染子孫ウイルスに対して複製されることもできるウイルスである。
【００４５】
ヒトにおいて複製されることができるか、または複製されることができないかを予測するのを可能にする適切な試験は、第ＷＯ０２／４２４８０号において開示され（参照により本明細書に組み込まれる）重度に免疫不全のＡＧＲ１２９マウス株を使用する。さらに、ＡＧＲ１２９マウスの代わりに、成熟ＢおよびＴ細胞を生成することができず、そのため重度に免疫不全であり、複製ウイルスに非常に感染しやすい、あらゆる他のマウス株を使用することができる。本マウスモデルにおいて得られる結果は、伝えられるところによると、ヒトを示すため、本出願に従って、当該マウスモデルにおいて複製能力がないウイルスは、「ヒトにおいて複製能力がない」ウイルスであると見なされる。
【００４６】
他の実施形態において、本発明に従うウイルスは、好ましくは、少なくとも１つの動物種の少なくとも１つの細胞型において複製されることができる。したがって、ワクチン接種および／または治療される動物に投与する前に、ウイルスを増殖させることができる。実施例として、ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）細胞中で増殖することができるが、ヒトにおいて、感染子孫ウイルスに対して複製されることができない、ＭＶＡ−ＢＮを参照する。
【００４７】
本発明に記載されるウイルスの「誘導体」または「変異体」という用語は、親ウイルスと同一の特徴的特性を示すが、そのゲノムの１つ以上の部分において差異を示す、子孫ウイルスを表す。「誘導体」、もしくは「ＭＶＡの変異体」または「ＭＶＡ−ＢＮ」という用語は、ＭＶＡと比較して、同一の機能的特徴を有するウイルスを説明する。例えば、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体／変異体は、ＭＶＡ−ＢＮの特徴的特性、好ましくは、寄託番号第０００８３００８号でＥＣＡＣＣにおいて寄託されるようなＭＶＡ−ＢＮを有する。ＭＶＡ−ＢＮ、またはその変異体のこれらの特徴の１つは、その減衰であり、それぞれヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ、ヒト胚腎臓細胞株２９３、ヒト骨骨肉種細胞株１４３Ｂ、およびヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ等のヒト細胞株において、生殖複製の能力を有しない。
【００４８】
追加および代替として、ＭＶＡ−ＢＮおよび誘導体は、成熟ＢおよびＴ細胞を産生することができない、マウスモデルにおいて複製することができないという特性を有し、および／またはＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジームと比較した場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジームにおいて、少なくとも同一レベルの特異的免疫応答を誘発する能力を有する。
【００４９】
第ＷＯ０２／４２４８０号に開示されるように、「アッセイ１」および「アッセイ２」の１つまたは２つにおいて測定されるようなＣＴＬ応答が、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブーストレジームと比較して、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジームにおいて、少なくとも実質的に同一である場合、ワクシニアウイルス、特にＭＶＡ株は、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジームにおいて、少なくとも実質的に同一レベルの免疫性を誘発すると見なされる。
【００５０】
本発明に従って使用されるウイルスは、モノクローナル抗体等のクローン精製ウイルスであり得る。
【００５１】
本発明に従って使用されるウイルスは、血清中に含有される薬剤に感染するリスクを減少させるように、無血清状態で産生／通過されたウイルスであり得る。
【００５２】
本発明に従うＭＶＡは、１０４〜１０９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲内、好ましくは、例えば１０５〜５ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲内、より好ましくは、例えば１０６〜１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌまたは１０７〜１０９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲内、さらにより好ましくは、例えば１０８〜１０９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲内、および最も好ましくは、２ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度で投与される。実際の濃度は、ウイルスおよびワクチン接種される動物種の型に依存する。ＭＶＡ−ＢＮの場合、ヒトに対する典型的なワクチン接種用量は、５ｘ１０７ ＴＣＩＤ５０〜５ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０、例えば、約１または２ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０を含み、皮下的に投与される。
【００５３】
本発明の好適な実施形態において、本明細書に記載される組換えＭＶＡは、本発明の使用および方法に適用される場合、少なくとも３回投与される。
【００５４】
本発明の別の好適な実施形態において、組換えＭＶＡは、本発明の使用および方法において適用される場合、０、４、および１２週目に投与される。
【００５５】
上に定義されるような組換えＭＶＡの単回投与、特に株ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体を用いて、免疫応答を誘発することが可能である。通常、本発明に従うＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮ、およびその誘導体を、同種プライムブーストレジームにおいて使用してもよく、すなわち、組換えＭＶＡを１回目のワクチン接種に使用し、１回目のワクチン接種において使用されるものと同一または関連する組換えＭＶＡの投与によって、１回目のワクチン接種において生成される免疫応答を上昇させることが可能である。本発明に従う組換えＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮ、およびその誘導体は、ワクチン接種の１回以上が、上に定義されるようなＭＶＡを用いて行われ、ワクチン接種の１回以上が、別の型のワクチン、例えば、別のウイルスワクチン、タンパク質または核酸ワクチンで行われる、異種プライムブーストレジームにおいて使用されてもよい。
【００５６】
投与モードは、静脈内、筋肉内、皮膚内、鼻腔内、または皮下であってもよい。静脈内、筋肉内、または特に皮下投与が好ましい。しかしながら、乱切等のいずれかの他の投与モードが使用されてもよい。
【００５７】
本出願の文脈で使用する「ＨＩＶ」という用語は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含むＨＩＶのあらゆる種、およびＨＩＶ−１クレードＡ、Ｂ、またはＣ等の対応するクレードを表す。実施例には、クレードＢの株等のＨＩＶ−１株が挙げられる。
【００５８】
本発明の一実施形態に従って、発現カセットによってコードされるＨＩＶタンパク質は、ＨＩＶ−１タンパク質である。
【００５９】
本出願で使用する「ＨＩＶタンパク質の部分」という用語は、対応する全長ＨＩＶタンパク質の少なくとも１０の連続アミノ酸、例えば、当該全長タンパク質の少なくとも２０、３０、または４０アミノ酸を含む、ペプチドまたはタンパク質を表す。一例として、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに開示されているさまざまなＨＩＶ配列、特にＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０３４５５を持つＨＩＶ−１分離株ＨＸＢ２Ｒの配列が挙げられるが、本発明はこの態様に限定されるわけではない。
【００６０】
本明細書で使用する「ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列の誘導体」という用語は、対応する天然ＨＩＶタンパク質と比較して変化したアミノ酸配列を持つＨＩＶタンパク質を表す。変化したアミノ酸配列は、ＨＩＶタンパク質の配列の１種以上のアミノ酸が置換もしくは挿入されているか、または欠失している、およびしたがって変異している配列であってもよい。より具体的に、「ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列の誘導体」は、タンパク質誘導体のアミノ酸配列が、既知のＨＩＶ分離株のそれぞれのＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列と比較される場合、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、あるいは少なくとも８０％または８５％、もしくは少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を示す、アミノ酸配列である。アミノ酸配列は、その相同性／同一性がたった１つのＨＩＶ分離株の対応するタンパク質について見いだされるに過ぎない場合でも、他の分離株の対応するタンパク質にはそれより低い相同性を示すものがあるかもしれないという事実とは関わりなく、上記の配列相同性または同一性を持つものと見なされる。例えば、融合タンパク質中のＶｐｒ誘導体が、あるＨＩＶ分離株のＶｐｒ配列には９５％の相同性を示すが、他のＨＩＶ分離株（のすべて）には５０〜７０％の相同性しか示さない場合、当該Ｖｐｒ誘導体の相同性は少なくとも９０％であると見なされる。特に、「ＨＩＶタンパク質の誘導体」という用語は、ＨＩＶ−１分離株ＨＸＢ２Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ悪セッション番号Ｋ０３４５５）中のそれぞれのＨＩＶタンパク質に少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の相同性を示すアミノ酸配列を表す。
【００６１】
ＨＩＶタンパク質の誘導体およびＨＩＶタンパク質の部分は、完全活性、低下活性、無活性、またはトランスドミナント活性を持つことができる。例えば、本発明に従う組換えＭＶＡは、ＨＩＶの調節および／またはアクセサリータンパク質を発現する。これらのタンパク質は、望ましくない副作用を持ち得る、生物活性を有する。そのため、組換えＭＶＡから発現された１つ以上のＨＩＶタンパク質が、野生型タンパク質と比較して、低下した活性を有し得ることは、本発明の範囲内である。
【００６２】
あるＨＩＶタンパク質の生物活性が低下しているかどうかを判定するための試験は、当業者に知られている。
【００６３】
生体内でのウイルス複製に不可欠なＶｉｆタンパク質の分子機序はまだ分かっていないが、Ｖｉｆは強い自己会合傾向を持っている。この多量体化は、ウイルスの生活環におけるＶｉｆの機能にとって重要であることが示されている（Ｙａｎｇ Ｓ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１；２７６：４８８９−４８９３）。追加として、ｖｉｆは、ウイルス核タンパク複合体と特異的に関連付けられることが示され、これは機能的に重要であるかもしれない（Ｋｈａｎ Ｍ．Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００１：７５（１６）：７２５２−６５）。したがって、低下した活性を持つｖｉｆタンパク質は、多量体化および／または核タンパク質複合体への会合の減少を示す。
【００６４】
Ｖｐｒタンパク質はウイルスの生活環に重要な役割を果たす。Ｖｐｒはウイルスのプレインテグレーション複合体の核内移行を調節し、マクロファージなどの非分裂細胞の感染を促進する（Ａｇｏｓｔｉｎｉら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２００２；１８（４）：２８３−８）。また、それはＬＴＲとの相互作用によって媒介されるトランス活性化活性も持っている（Ｖａｎｉｔｈａｒａｎｉ Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００１；２８９（２）：３３４−４２）。したがって、低下した活性を持つＶｐｒは、トランス活性化および／またはウイルスプレインテグレーション複合体との相互作用の減少を示すか、またはトランス活性化および／またはウイルスプレインテグレーション複合体との相互作用を全く示さない。
【００６５】
Ｖｐｒに対して高い相同性を持つＶｐｘも、非分裂細胞における効率のよいウイルスの複製にとって重要である。Ｖｐｘは、ｇａｇ前駆体ポリタンパク質のｐ６ドメインとの相互作用によって、ウイルス粒子にパッケージングされる。Ｖｐｒと同様に、Ｖｐｘも核内へのプレインテグレーション複合体の輸送に関与する（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ２００１；７５（１）：３６２−７４）。したがって、低下した活性を持つＶｐｘは、ｇａｇ前駆体を介してプレインテグレーション複合体に会合する能力が減少している。
【００６６】
Ｖｐｕタンパク質はＣＤ４の細胞質尾部と相互作用することが知られており、ＣＤ４分解を引き起こす（Ｂｏｕｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５；６９（３）：１５１０−２０）。したがって、低下した活性を持つＶｐｕは、ＣＤ４分解を誘発する能力が低下している。
【００６７】
詳しく特徴づけられているＴａｔタンパク質の関連する生物活性は、トランス活性化応答要素（ＴＡＲ）との相互作用を介した転写のトランス活性化である。ＴａｔはＴＡＲ以外のＨＩＶ配列を欠く異種プロモーターをトランス活性化できることが実証されている（Ｈａｎ Ｐ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９９１；１９（２５）：７２２５−９）。したがって、低下した活性を持つＴａｔタンパク質は、ＴＡＲ要素を介したプロモーターのトランス活性化の減少を示す。本発明に従って、トランスドミナントＴａｔを使用することも可能である。トランスドミナントＴａｔは、以下の置換を行うことによって得られ得る：２２（Ｃｙｓ＞Ｇｌｙ）および３７（Ｃｙｓ＞Ｓｅｒ）。
【００６８】
Ｎｅｆタンパク質は、ＣＤ４の細胞表面ダウンレギュレーションを誘発することから、疾患進行の原因となるウイルス複製にとって不可欠である（Ｌｏｕ Ｔら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ １９９７；４（４）：１３２）。このダウンレギュレーションは、ＣＤ４とＮｅｆの間の直接的相互作用によって開始される（Ｐｒｅｕｓｓｅｒ Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００２；２９２（３）：７３４−４０）。したがって、低下した機能を持つＮｅｆタンパク質は、ＣＤ４との相互作用の減少を示す。実施例には、アミノ末端で切断されるＮｅｆタンパク質、例えば、１９Ｎ末端アミノ酸が欠失しているタンパク質が挙げられる。本発明に従って、特に１９Ｎ末端アミノ酸が欠失している、切断Ｎｅｆを使用することも可能である。
【００６９】
Ｒｅｖの関連する機能は、ウイルスＲＮＡのＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）との相互作用によって開始される転写後トランス活性化である（Ｉｗａｉら、１９９２；Ｎｕｃｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９２；２０（２４）：６４６５−７２）。したがって、低下した活性を持つＲｅｖは、ＲＲＥとの相互作用の減少を示す。
【００７０】
本発明の一実施形態に従って、ＨＩＶタンパク質の１つ以上は、個々のタンパク質として発現される。
【００７１】
さらなる実施形態に従って、ＨＩＶタンパク質の２つ以上が、融合タンパク質として発現される。好ましくは、ＨＩＶアクセサリー／調節タンパク質の２つ以上が、融合タンパク質として発現される。
【００７２】
本文脈において、第ＷＯ０３／０９７６７５号が参照され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
例として、本発明に従う組換えＭＶＡ、例えば、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、（ｉ）Ｖｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを、融合タンパク質として、この順序または異なる順序で発現する場合があり、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、およびＲｅｖは、全長タンパク質、あるいは全長タンパク質の部分または誘導体を代表し（上の定義を参照）、（ｉｉ）Ｎｅｆあるいはその部分または誘導体、特にＮ末端アミノ酸が欠失しているＮｅｆタンパク質（すなわち、Ｎ−末端切断Ｎｅｆ）、例えば、最初の１９アミノ酸、（ｉｉｉ）Ｔａｔあるいはその部分または誘導体、特にトランスドミナントＴａｔ、および（ｉｖ）ＧａｇおよびＰｏｌは、全長タンパク質、あるいは全長タンパク質の部分または誘導体を代表し、例示される順序または逆順序（Ｐｏｌ−Ｇａｇ）で配置される、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質が挙げられる。
【００７４】
そこからＨＩＶタンパク質が発現される発現カセットの数は、重要ではない。実施例として、ＨＩＶタンパク質は、２〜５つの発現カセットから発現され得る。第１の発現カセットは、Ｖｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを、融合タンパク質として、この順序または異なる順序で発現する場合があり、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、およびＲｅｖは、全長タンパク質、あるいは全長タンパク質の部分または誘導体を代表し（上の定義を参照）、第２の発現カセットは、Ｎｅｆあるいはその部分または誘導体、特にＮ−末端アミノ酸が欠失しているＮｅｆタンパク質、例えば、最初の１９アミノ酸を発現する場合があり、第３の発現カセットは、Ｔａｔあるいはその部分または誘導体、特にトランスドミナントＴａｔを発現する場合があり、第４の発現カセットは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質を発現する場合があり、ＧａｇおよびＰｏｌは、全長タンパク質、もしくは全長タンパク質の部分または誘導体を代表し、例示される順序または逆順序（Ｐｏｌ−Ｇａｇ）で配置される。好ましくは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする発現カセット、およびＴａｔをコードする発現カセットは、同一の挿入部位に挿入される。
【００７５】
異種核酸配列の発現は、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターの転写制御下であるが、この限りではない。適切なポックスウイルスプロモーターの例は、牛痘ＡＴＩプロモーターである（第ＷＯ０３／０９７８４４号を参照）。各発現カセットの発現が異なるプロモーターによって制御されることは可能である。代替として、すべての発現カセットが、同一のプロモーターの複製によって制御されることも可能である。例として、本発明は、すべてのＨＩＶ発現カセット、例えば、上に例示される４つの発現カセットが、第ＷＯ０３／０９７８４４号に定義されるような牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体によって制御される、組換え体ウイルスに関する。
【００７６】
ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体等の本発明に従う組換えＭＶＡにおいて、発現カセットは、ウイルスゲノムの１〜１０の挿入部位に挿入されてもよい。
【００７７】
ＨＩＶタンパク質もしくはその部分または誘導体を発現するための組換えＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮおよびその変異体は、すべての発現カセットが同一の挿入部位に挿入されない場合に容易に得ることができることが予期せず分かった。したがって、異なる発現カセットは、ウイルスゲノムの１〜５、２〜８、３〜５、または３つの挿入部位に挿入されてもよい。
【００７８】
異種核酸配列の挿入は、ウイルスゲノムの必須でない領域に行われてもよい。本発明の別の実施形態に従って、異種核酸配列は、ＭＶＡゲノムの自然発生する欠失部位に挿入される（第ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６号に開示される）。さらなる代替に従って、異種配列は、ポックスウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入されてもよい（第ＷＯ０３／０９７８４５号を参照）。異種配列をポックスウイルスゲノムに挿入する方法は、当業者に知られている。例として、発現カセットは、ＭＶＡゲノム、特にＭＶＡ−ＢＮのゲノムおよびその誘導体の遺伝子間領域ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ Ｉ４Ｌ／Ｉ５Ｌ、およびＩＧＲ１３６／１３７の１つ以上に挿入されてもよい。
【００７９】
本発明の好適な実施形態に従って、組換えＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体であり、以下の発現カセットは、以下の挿入部位に挿入される。（ｉ）Ｖｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを、融合タンパク質として、この順序または異なる順序で発現する発現カセットであって、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、およびＲｅｖは、全長タンパク質、もしくは全長タンパク質の部分または誘導体を代表する（上の定義を参照）発現カセットは、遺伝子間領域ＩＧＲ０７／０８に挿入され、（ｉｉ）Ｎｅｆもしくはその部分または誘導体を発現する第２の発現カセット、特にＮ−末端アミノ酸が欠失しているＮｅｆタンパク質、例えば最初の１９アミノ酸は、ＩＧＲＩ４Ｌ／Ｉ５Ｌに挿入され、（ｉｉｉ）Ｔａｔもしくはその部分または誘導体、特にトランスドミナントＴａｔを発現する第３の発現カセット、ならびにＧａｇおよびＰｏｌが全長タンパク質を代表する、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質を発現する第４の発現カセットは、ＩＧＲ１３６／１３７に挿入される。この例において、第３および第４の発現カセットは、同一の統合部位に挿入され、２つの発現カセットは、両方の可能な順序で配置され得る。ＩＧＲの付番については、第ＷＯ０３／０９７８４５号を参照する。一方のＩＧＲ Ｉ４Ｌ／Ｉ５Ｌおよび他方のＩＧＲ １３６／１３７、ＩＧＲ ０７／０８は、２つの異なる付番方式に属することを考慮すべきであり、これらは第ＷＯ０３／０９７８４５号に説明される。
【００８０】
最も好ましくは、本発明の組換えＭＶＡは、ウイルスゲノム中に、
（ｉ）融合タンパク質としてＶｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを発現し、遺伝子間領域ＩＧＲ０７／０８に挿入される、第１の発現カセットと、
（ｉｉ）最初の１９Ｎ末端アミノ酸が欠失しているＮｅｆタンパク質を発現し、ＩＧＲＩ４Ｌ／Ｉ５Ｌに挿入される、第２の発現カセットと、
（ｉｉｉ）いずれもＩＧＲ１３６／１３７に挿入される、トランスドミナントＴａｔを発現する第３の発現カセットおよびＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質を発現する第４の発現カセット、
を含む、組換えＭＶＡである。
【００８１】
本発明に従う組換え体ウイルスは、防御免疫応答を誘発し得る。「防御免疫応答」という用語は、ワクチン接種した被検体が、それに対してワクチン接種が行われた病原体による感染を、何らかの方法で制御することができることを意味する。通常、「防御免疫応答」を生じた動物は、ワクチン接種を受けていない被検体よりも軽度の臨床症状を生じ、疾患の進行は減速する。
【００８２】
本発明は、上に定義されるような組換えＭＶＡを含む、さらに薬学的組成物またはワクチン、および随意に薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、および／または添加剤に関する。
【００８３】
ポックスウイルス製剤を調製するための多数の方法、ならびに保管モードは、熟練者に知られている。本文脈において、第ＷＯ０３０５３４６３号が参照される。
【００８４】
補助物質の非限定例は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤、または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、保存剤、安定剤等である。適切な担体は、通常、大きく代謝の遅い分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、脂質会合体等から成る群から選択される。
【００８５】
ワクチンを調製する場合、本発明に従う組換えＭＶＡウイルスは、生理学的に許容される形態に変換される。これは、天然痘の予防接種に用いられるポックスウイルスワクチン（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら［１９７４］Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２に記載されているもの）を調製する際の経験に基づいて行うことができる。例えば、精製ウイルスは、５×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で１０ｍＭトリス、１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に製剤化して、−８０℃で保存する。
【００８６】
一実施形態において、ワクチン注射剤を精製するために、本発明に記載のＭＶＡウイルスを使用する。例えば、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００ｍＬ中のウイルス粒子約１０２〜約１０８個を、アンプル（好ましくはガラスアンプル）中で凍結乾燥する。別の非限定例において、ワクチン注射剤は、製剤中のウイルスの段階的な凍結乾燥によって生成する。ある実施形態において、この製剤は、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドンなどの追加の添加剤、または、生体内投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などの他の酸を含むことができる。その場合、このガラスアンプルを封印して、４℃〜室温で数ヶ月間保存することができる。しかしながら、即時の必要がない限り、アンプルは−２０℃未満の温度で保存することが好ましい。
【００８７】
ワクチン接種または治療を行うには、凍結乾燥物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解し、それを全身的または局所的に、すなわち非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、または当業者に知られる他の任意の投与経路のいずれかによって、投与されてもよい。当業者であれば、投与様式、投与量および投与回数を、既知の方法で最適化することができる。しかしながら、最も一般的に、患者は、１回目のワクチン接種から約１ヶ月〜６週間後に２回目のワクチン接種を受ける。３回目およびそれ以降の接種は、前回の接種から好ましくは４〜１２週間後に行うことができる。
【００８８】
驚くべきことに、本発明の組換えＭＶＡを用いて、強力な抗原特異的Ｔ細胞応答は、組換え技術によって発現されたＨＩＶタンパク質の１つ以上に対して、誘発され得ることが分かった。既に前述のとおり、認められた免疫優勢と呼ばれる現象を考慮すると、これは予期せぬ結果であり、それによって宿主免疫系は、指定の免疫原中の多数の可能なエピトープのいくつかに対してのみに応答する。ＭＶＡベクターに関して、以前の研究は、非組換えベクターエピトープの免疫優勢が、組換え抗原に対する強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答の誘発を阻止することを示した（Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｐｏｘｖｉｒａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：８４３１−８４３７，２００５．）。ワクチン駆動型Ｔ細胞応答は、主にポックスウイルスエピトープに対して配向されることを立証した。対照的に、本発明の組換えＭＶＡの使用は、強力かつ広域のＴ細胞応答をもたらし、組換えＨＩＶタンパク質を増殖させた。さらに、免疫応答は、応答を誘発したすべてのＨＩＶタンパク質に対して１回目の免疫付与を受けてから２０週間後も、依然としてベースラインよりも高かった。これは、天然痘に対する早期ワクチン接種および抗体中和の進行に起因する、骨格ウイルスベクターに対する潜在的な既存の免疫を考慮すると、さらに予期せぬ結果である。
【００８９】
したがって、本発明は、さらに、ヒト患者において、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つのＨＩＶタンパク質に対するＴ細胞応答を誘発するために、上に定義されるような組換えＭＶＡ、または上に定義されるような組換えＭＶＡを含む薬学的組成物もしくはワクチンに関し、タンパク質は、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される。
【００９０】
本発明は、ヒト患者において、１つ以上のＨＩＶタンパク質に対して、特に３、４、５、６つ、またはそれ以上のＨＩＶタンパク質に対して、好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのＨＩＶタンパク質に対して、Ｔ細胞応答を誘発するための薬剤を調製するために、上に定義されるような組換えＭＶＡ、または上に定義されるような組換えＭＶＡを含む薬学的組成物またはワクチンの使用にも関し、タンパク質は、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される。
【００９１】
同様に、本発明は、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発するための方法にも関し、上に定義されるような組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を投与することを含む。
【００９２】
投与される組換えＭＶＡは、好ましくは、それが所望の効果、すなわち、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質の少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つ、さらにより好ましくは少なくとも６つに対するＴ細胞応答を誘発するために有効な量である。
【００９３】
特定の好適な実施形態において、本発明は、上に定義されるような組換えＭＶＡに関し、ＭＶＡは、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも４つに対してＴ細胞応答を誘発する。
【００９４】
より特定の好適な実施形態において、本発明は、上に定義されるような組換えＭＶＡに関し、ＭＶＡは、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも５つに対するＴ細胞応答を誘発する。
【００９５】
さらにより特定の好適な実施形態において、本発明は、上に定義されるような組換えＭＶＡに関し、ＭＶＡは、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも６つに対するＴ細胞応答を誘発する。
【００９６】
好適な実施形態において、本明細書において定義されるようなＭＶＡが、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるタンパク質に対してＴ細胞応答を誘発するＨＩＶ−１タンパク質には、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆが含まれる。
【００９７】
好適な実施形態において、当該少なくとも３つのＨＩＶタンパク質は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆである。別の好適な実施形態において、当該３つのＨＩＶタンパク質の１つは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、切断されたＮｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、およびＲｅｆから成る群から選択されるものである。
【００９８】
本発明は、さらに、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための、上に定義されるような組換えＭＶＡ、もしくは上に定義されるような組換えＭＶＡを含む薬学的組成物またはワクチンに関する。
【００９９】
本発明は、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための薬剤を調製するための、上に定義されるような組換えＭＶＡ、もしくは上に定義されるような組換えＭＶＡを含む薬学的組成物またはワクチンの使用にも関する。
【０１００】
「ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの予防」という用語は、組換えＭＶＡが、あらゆる条件下、あらゆる被検体においてＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳを予防することを意味しないことが指摘される。反対に、本用語は、この予防効果がむしろ低い場合であっても、あらゆる統計的に有意な予防効果を網羅する。
【０１０１】
さらに好適な実施形態において、組換えＭＶＡは、１０５〜５ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量、好ましくは２ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量で投与される。
【０１０２】
別の好適な実施形態において、組換えＭＶＡは、静脈内、筋肉内、または皮下的に投与される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】８つのＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆを発現する、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＭＡＧ構成物（ＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂ）。
【図２】ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答率。ｎ（応答者である被検体の数）から計算され、群サイズＮ＝１５に基づく応答率。ＲＴ＝逆転写酵素、ＣＴＬ＝細胞毒性Ｔリンパ球、ＨＴＬ＝ヘルパーＴリンパ球。
【図３Ａ】指示されるＨＩＶ−１タンパク質の中央ＳＦＵ／１ｘ１０６ＰＢＭＣ。矢印はワクチン接種を示す。
【図３Ｂ】指示されるＨＩＶ−１タンパク質の中央ＳＦＵ／１ｘ１０６ＰＢＭＣ。矢印はワクチン接種を示す。
【図３Ｃ】指示されるＨＩＶ−１タンパク質の中央ＳＦＵ／１ｘ１０６ＰＢＭＣ。矢印はワクチン接種を示す。
【図３Ｄ】指示されるＨＩＶ−１タンパク質の中央ＳＦＵ／１ｘ１０６ＰＢＭＣ。矢印はワクチン接種を示す。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例は、本発明をさらに説明する。提供される実施例は、いかなる方法においても、本発明によって提供される技術の適用性を本実施例に限定する方法で解釈され得ないことは、当業者によって十分に理解されるであろう。
【実施例１】
【０１０５】
ウイルスゲノム中に、切断されたｎｅｆ遺伝子、ｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子、トランスドミナントＴａｔ遺伝子、およびＶｉｆ−Ｖｐｒ−Ｖｐｕ−Ｒｅｖ遺伝子を含む、組換えＭＶＡ−ＢＮの、それぞれＡＴＩプロモーターの制御下での生成
【０１０６】
ＭＶＡベクター、ｍＢＮ８７は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５０１，１２７号に記載されるように生成した。つまり、ｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子は、ＨＸＢ２感染細胞のＤＮＡからのＰＣＲによって得た。ｎｅｆ遺伝子をＭＶＡ−ｎｅｆ（ＬＡＩ）のＤＮＡからのＰＣＲによって増殖させて、切断バージョンを得た。最初の１９アミノ酸を欠失させてＮｅｆ切断をもたらした。ｖｉｆおよびｖｐｕ遺伝子は、一次分離体ＭｖＰ−８９９のＨＩＶ ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによって生成したが、ｖｐｒ、ｒｅｖ、およびｔａｔ遺伝子は、ＨＸＢ２の配列に基づくオリゴアニーリングによって合成した。タンパク質Ｔａｔ変異は、Ｔａｔにおいて、重要なエピトープには局在しないが、トランス活性化能の喪失をもたらす、２つの変異を誘発することによって形成した。変異は、以下の置換基：２２（Ｃｙｓ＞Ｇｌｙ）および３７（Ｃｙｓ＞Ｓｅｒ）である。ＤＮＡ構成体は、組換えベクターにクローン化した。
【０１０７】
５回のプラーク精製後、外来ＤＮＡ（切断ｎｅｆ遺伝子、ｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子、トランスドミナントｔａｔ遺伝子、およびｖｉｆ−ｖｐｒ−ｖｐｕ−ｒｅｖ融合遺伝子）の挿入および野生型ウイルスの非存在は、ＰＣＲによって確認した。得られる組換えウイルスクローンは、ｍＢＮ８７Ａと命名した。非選択的条件下で５回プラーク精製した後、選択カセットを欠いている組換えウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ８７Ｂを分離することができた。組換えベクターの識別は、標準方法によって確認した。
【０１０８】
ＭＶＡ−ｍＢＮ８７Ｂにおいて、ｖｉｆ−ｖｐｒ−ｖｐｕ−ｒｅｖ遺伝子は、末端に終止コドンを持たず、３１の非特異的アミノ酸の追加をもたらす。したがって、新しい組換えウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂをクローン化することによって、終止コドンを融合遺伝子に追加した。本構成体（図１も参照）は、マウスの前臨床研究およびヒトの臨床研究で使用した。
【実施例２】
【０１０９】
マウスの前臨床研究
ＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂが、成体非遺伝子導入マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）において、ＨＩＶ特異的細胞免疫応答を付載することができるか否かを調査した。最も有望なエピトープを選択し、各タンパク質に対して、２つのＣＤ４および２つのＣＤ８ Ｔ細胞エピトープを合成した。
【０１１０】
０日目および２１日目に、５００μｌのＴＢＳ（１群）を対照項目として、または約４ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０ ＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂ（２群）のいずれかをマウスに皮下投与（ｓ．ｃ．）した。３５日目に、眼窩後穿孔によって、すべての動物から血液試料を採取し、可能性のある今後の分析のために、血清に処理した。血液試料の採取に続いて、頸椎脱臼によって動物を犠牲死させ、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、ワクチン挿入物中でコードされるＨＩＶ特異的ペプチドを用いて脾臓細胞を再刺激することによって、細胞免疫応答を後に分析するために脾臓を壊死させた。
【０１１１】
ＨＩＶタンパク質特異的細胞免疫応答は、特異的ペプチドを用いる脾臓細胞の再刺激、およびＥＬＩＳｐｏｔアッセイによる脾臓細胞からのＩＦＮγ放出の後次検出によって決定した。ペプチドは、以下のように、ペプチド名、Ｔ細胞制限、およびペプチド配列を示す。
Ｎｅｆ−１ ＣＤ４ ＦＨＨＶＡＲＥＬＨＰＥＹＦＫＮＣ（配列番号１）
Ｎｅｆ−２ ＣＤ４ ＤＰＥＲＥＶＬＥＷＲＦＤＳＲＬＡ（配列番号２）
Ｎｅｆ−３ ＣＤ８ ＨＴＱＧＹＦＤＰ（配列番号３）
Ｎｅｆ−４ ＣＤ８ ＲＹＰＬＴＦＧＷＣ（配列番号４）
Ｇａｇ−１ ＣＤ４ ＩＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫ（配列番号５）
Ｇａｇ−２ ＣＤ４ ＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳＰＴ（配列番号６）
Ｇａｇ−３ ＣＤ８ ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（配列番号７）
Ｇａｇ−４ ＣＤ８ ＥＩＹＫＲＷＩＩＬ（配列番号８）
Ｐｏｌ−１ ＣＤ４ ＶＱＮＡＮＰＤＣＫ（配列番号９）
Ｐｏｌ−２ ＣＤ４ ＴＩＫＩＧＧＱＬＫ（配列番号１０）
Ｐｏｌ−３ ＣＤ８ ＩＦＱＳＳＭＴＫＩ（配列番号１１）
Ｐｏｌ−４ ＣＤ８ ＱＰＤＫＳＥＳＥＬ（配列番号１２）
Ｔａｔ−１ ＣＤ４ ＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫ（配列番号１３）
Ｔａｔ−２ ＣＤ４ ＲＱＲＲＲＡＨＱＮ（配列番号１４）
Ｔａｔ−３ ＣＤ８ ＱＰＫＴＡＧＴＮＣ（配列番号１５）
Ｔａｔ−４ ＣＤ８ ＳＦＩＴＫＡＬＧＩ（配列番号１６）
Ｖｉｆ−１ ＣＤ４ ＫＫＡＫＧＷＭＹＫ（配列番号１７）
Ｖｉｆ−２ ＣＤ４ ＲＣＥＹＱＡＧＨＮ（配列番号１８）
Ｖｉｆ−３ ＣＤ８ ＱＹＬＡＬＡＡＬＩ（配列番号１９）
Ｖｉｆ−４ ＣＤ８ ＡＧＨＮＫＶＧＳＬ（配列番号２０）
Ｖｐｕ−１ ＣＤ４ ＫＰＱＫＴＫＧＨＲ（配列番号２１）
Ｖｐｕ−２ ＣＤ４ ＷＡＧＶＥＡＩＩＲ（配列番号２２）
Ｖｐｕ−３ ＣＤ８ ＴＹＧＤＴＷＡＧＶ（配列番号２３）
Ｖｐｕ−４ ＣＤ８ ＡＧＶＥＡＩＩＲＩ（配列番号２４）
Ｖｐｒ−１ ＣＤ４ ＩＶＬＩＥＹＲＫＩ（配列番号２５）
Ｖｐｒ−２ ＣＤ４ ＥＥＡＬＡＡＬＶＤ（配列番号２６）
Ｖｐｒ−３ ＣＤ８ ＴＱＰＩＰＩＶＡＩ（配列番号２７）
Ｖｐｒ−４ ＣＤ８ ＶＬＩＥＹＲＫＩＬ（配列番号２８）
Ｒｅｖ−１ ＣＤ４ ＲＱＡＲＲＮＲＲＲ（配列番号２９）
Ｒｅｖ−２ ＣＤ４ ＳＰＱＩＬＶＥＳＰ（配列番号３０）
Ｒｅｖ−３ ＣＤ８ ＳＧＤＳＤＥＥＬＩ（配列番号３１）
Ｒｅｖ−４ ＣＤ８ ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ（配列番号３２）
【０１１２】
つまり、５００μｇの各ペプチドを含有するアリコートは、最初に少量のジメチルスルホキシド中に溶解し、続いてＲＰＭＩ媒体でさらに希釈することによって、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液を得た（ペプチド＃４、１４、２０、および２１の完全再構成を保証するには、追加で容量５〜２５μｌの酢酸が必要であり、ペプチド＃２０、２２、２３、および２４の完全再構成を保証するには、追加で５〜２５μｌが必要であった）。
【０１１３】
脾臓均質化は、「Ｓａｍ０３」プログラムを使用して、ディスポミック管内で行った。均質化に続いて、細胞懸濁液を５０ｍｌ管に写し、遠心分離して、赤血球を赤血球溶解緩衝液で５分間溶解した。２回の洗浄ステップに続いて、小アリコートの細胞懸濁液をトリパンブルーと混合し、血球計算盤（Ｍａｄａｕｓ製）を用いて手動計数することによって細胞濃度を計算した。細胞密度は、個々の脾臓細胞懸濁液に対して調整した。細胞をＥＬＩＳｐｏｔプレート（抗ＩＦＮ−γ抗体でプレコートされた）に載せた後、ペプチドを最終濃度２．５μｇ／ｍｌで添加した。水平に配向されたＥＬＩＳｐｏｔプレート上で、水平に載置される異なるマウスからの脾臓細胞、および垂直に開始される異なる刺激を用いて、脾臓細胞２．５ｘ１０５個／ウェルの重複培養を行った（すなわち、それぞれペプチド＃１−８、９−１６、１７−２４、２５−３２を用いるプレート１＋５、２＋６、３＋７、４＋８被膜刺激）。プレート５および１０上で、最終濃度０．５μｇのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）および０．５μｇ／ｍｌブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）を陽性対照として、または培地対照を陰性対照として用いるインキュベーションは、それぞれ列番号Ｂ、Ｅ、またはＨにおいて行った。１９時間の一晩のインキュベーションに続いて、サプライヤーによって推奨されるように、ＥＬＩＳｐｏｔプレートを開発した。
【０１１４】
【表１】
ｎ．ａ． ＝ 該当なし
【０１１５】
ＨＩＶ特異的細胞応答を開始することができる、３つのペプチドを識別した。これらのペプチドから、Ｈ２−Ｋｄ制限されるＣＤ８ Ｔ細胞特異的ペプチド「Ｇａｇ−ＣＤ８−１」を用いる刺激に続いて、最高のＩＦＮ１応答を決定した。このペプチドは、頻繁に文献に引用されているため、これは驚くことではない（例えば、Ｌｉｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６，２４，ページ３３３２）。第２のＧａｇ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞制限されるペプチド「Ｇａｇ−ＣＤ８−２」は、すべてのマウスにおいて、良好な特異的ＩＦＮ１放出を誘発することもできた。このペプチドは、今のところＳｈｉｎｏｄａらによって、長いペプチドの文脈において、特異的なＣＴＬ応答を誘発することが説明されているに過ぎない（Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４，２２，ページ３６７６）。しかしながら、文献に記載されている長いペプチドは、ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープのみならず、追加の予測可能な（およびしたがって潜在的な）ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞エピトープを含有する。したがって、最初に、「Ｇａｇ−ＣＤ８−２」が、特異的ＩＦＮ１放出を誘発することができることを示す。エピトープ予測に基づいて、「Ｇａｇ−ＣＤ８−２」は、Ｈ２−Ｄｄ制限されるＣＤ８ Ｔ細胞エピトープである。第３の応答性ペプチド「Ｎｅｆ−ＣＤ４−２」は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの大部分において、特異的なＩＦＮ１の放出を誘発することができた。このペプチドは、Ｍｉｔｃｈｅｌらによって（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９２，８，ページ４６９）、それに対する増殖応答および細胞溶解活性を決定することができるペプチドとして説明されている。エピトープの予測から、このペプチドは、主にＣＤ４ Ｔ細胞に制限されるとして識別された（ＰｒｅｄＢＡＬＢ／Ｃデータベースにおいて、Ｉ−Ｅｄ分子の場合スコア９．６、およびＩＡｄ分子の場合９．１が識別されたが、ＣＤ８ Ｔ細胞制限されるＨ２ｄ分子のスコアは、７．９未満であった）。驚くべきことに、公開済みの文献に基づいて選択された３つの応答性ペプチド以外のペプチド、例えば、「Ｎｅｆ−ＣＤ４−１」または「Ｔａｔ−ＣＤ８−１」は、特異的なＩＦＮ１放出を誘発できることが認められなかった。この矛盾の理由は不明である。
【０１１６】
要するに、ＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂを用いるＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫原性研究は、ＨＩＶ−多抗原ＭＶＡ構成体が免疫原性であることが立証されただけでなく、免疫応答が、組換えＭＶＡ生成物においてコードされる少なくとも２つのタンパク質に対して配向されること（すなわち、ＮｅｆおよびＧａｇ特異的応答が検出された）、ＣＤ８ Ｔ細胞制限される免疫応答が、単一のＣＤ８ Ｔ細胞分子に限定されないこと（Ｈ２−ＫｄおよびＨ２−Ｄｄ応答の両方が誘発されるため）、およびＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞制限される応答の両方が、ＭＶＡ−構成体によって誘発されたことも明らかとなった。さらに、これらの結果は、少なくともＮｅｆ−遺伝子およびＧａｇ−遺伝子が、生体内でベクターから発現されることを示す。
【実施例３】
【０１１７】
ヒトの臨床研究
第Ｉ相研究において、ＨＩＶ−１クレードＢサブグループ（ｇａｇ−ｐｏｌ融合、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、ｔａｔ、およびｎｅｆを含む）から９つの遺伝子の８つを発現する、組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ワクチンの安全性、応答原性、および免疫原性を、１５名のＨＩＶ−１感染被検体において評価した。この安全性試験は、応答型および非応答型の局所性および全身性の譜作用応答の分析を包含した。さらに、ベクターに対する細胞性および血液性免疫応答を評価した。また収集した標本を使用して、異なるＨＩＶ抗原に対する広域細胞媒介応答を誘発するように、そのような相同性プライムブーストワクチンアプローチの可能性を確立するために、研究ワクチンＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂによって誘発される、ＨＩＶ特異的免疫応答を特異的に分析するアッセイも開発した。
【０１１８】
この第Ｉ相試験において、ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法）において安定している、ＣＤ４数が３５０／μｌを超える１５名のＨＩＶ−１感染患者は、０、４、および１２週目に２ｘ１０８ ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＭＡＧのワクチン接種を３回受けた。応答型副作用（ＡＥ）は日誌カードに記録し、非応答型ＡＥと心臓兆候および症状は、２０週目のフォローアップ訪問まで、研究を通して記録した。患者の血清ＨＩウイルス負荷およびＣＤ４数等の疾患特異的パラメータを決定した。ワクシニア特異的血液免疫応答は、ＥＬＩＳＡにより測定され、ＨＩＶ−１挿入ならびにワクシニアに対する細胞免疫応答は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、（ＨＩＶ応答を誘発するための）刺激剤として、１１個のアミノ酸重複を有する１５−ｍｅｒペプチド、およびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）を、バッチ分析においてそれぞれ１（ワクシニア応答を誘発するための）の感染の多重度で使用して評価した。
【０１１９】
研究は、ＣＤ４数が３５０細胞／μｌを超えるＨＩＶ感染被検体において、組換えＭＶＡ ＨＩＶ多抗原ワクチンの安全性および応答原性を評価するために行われる、単一中心、非盲検の第Ｉ相研究であった。
【０１２０】
被検体は、０日目、ならびに４週間および１２週間後に、２ｘ１０８ 組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）ＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂの用量で、免疫付与を受けた。ワクチンは、皮下投与された。
【０１２１】
研究は、最長３週間のスクリーニング期間と、最長２０週間の活動研究期間（１２週間のプライム相および８週間のブースト相）とで構成される。被検体当たりの研究の総期間は、最長２３週間であった。
【０１２２】
適格な被検体は、訪問１で開始する活動研究相に入った。訪問１において、すべての被検体は、皮下投与される１回目のＭＶＡ−ＢＮ１２０Ｂワクチン接種を受けた。４週間後の訪問３において、すべての被検体は、２回目のワクチン接種を受け、（訪問１から）１２週間後の訪問５において、３回目のワクチン接種を受けた。各免疫付与は、それぞれ１回の投与当たり１ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０の用量で、２回のＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂの投与で構成された。ワクチンは、０．５ｍｌのＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂを、各腕の三角筋領域に注入することによって、皮下投与された。被検体は、１回目は０週目、４週間後に１回、および１２週間後に１回の３回の免疫付与を受けた。ワクチン接種中または後に起こったあらゆる副作用（ＡＥ）を記録した。
【０１２３】
以下の手順および調査は、それぞれの予定された訪問時に行った。凍結保存末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）生成細胞の定量的管内決定に使用される、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイは、生きたワクシニアウイルス（ＶＶ）：修飾ワクシニアウイルスアンカラ−Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ（ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標））またはワクシニアウイルス−ウエスタンリザーブ（ＶＶ−ＷＲ）を用いる刺激後に行った。
【０１２４】
つまり、９６ウェルフィルタープレート（ＨＴＳプレート、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、捕捉抗体（製造者の指示に従って、ＩＦＮ−γに対する（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ対）を用いて、４℃で一晩コーティングした。続いて、蘇生したＰＢＭＣを、１のＭＯＩにおいて、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）と組み合わせて、２００，０００細胞／２００μｌ最終用量の濃度でウェルに添加した。インキュベーション期間後（３７℃／５％ ＣＯ２で一晩）、ウェルを洗浄し、ＰＢＳ／９％ＦＣＳ中のビオチン標識された検出抗体を添加した。ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ストレプトアビジン結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をウェルに添加し、続いて洗浄ステップおよび沈殿物質（ＡＥＣ、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加を行った。サイトカイン生成細胞の数は、ＣＴＬ Ｓ５マイクロアナライザーを使用して、スポットを計数することにより決定した。報告される値は、バックグラウンド補正され、１ｘ１０６ ＰＢＭＣに標準化した。
【０１２５】
ワクシニア特異的細胞応答を評価するために、１のＭＯＩにおいて、細胞を生きたＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）で刺激した。
【０１２６】
ＨＩＶ特異的細胞応答を評価するために、細胞をペプチドプール（１１アミノ酸重複を持つ１５−ｍｅｒ）を用いて、ペプチド当たり５μｇ／ｍｌの最終濃度で刺激した。
【０１２７】
１５のペプチドプールが刺激に使用され、表２に表される。
【表２】
【０１２８】
高性能液体クロマトグラフィによって確認されるように、ペプチドを９０％を超える純度で合成した（Ｍｅｔａｂｉｏｎ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ，ＵＫ）。
【０１２９】
ベクターまたはＨＩＶ−ＭＡＧ特異的シグナルは、バックグラウンド補正後、１ｘ１０６細胞当たり少なくとも５０ＳＦＵの頻度で定義した（ＳＦＵ／１ｘ１０６非刺激細胞の控除／バックグラウンドの２倍以上）。バックグラウンド補正後のＳＦＵ／１ｘ１０６細胞の数を報告した。
【０１３０】
ベクターまたはＨＩＶ−ＭＡＧ特異的Ｔ細胞応答は、ベースラインにおいてシグナルを持たない被検体におけるシグナルの発生、またはベースラインにおいてシグナルを持つ被検体における、ベースライン値を超える少なくとも１．７倍の相対増加のいずれかとして定義された。
【０１３１】
１回以上のポストベースライン訪問において応答を示した被検体は、応答者として分類した。
【０１３２】
特異的なシグナルは、バックグラウンド（非刺激）ウェルにおけるスポット形成細胞の数を、対応する実験（刺激）ウェルにおいて出現するものから控除することによって定義した（各被検体、訪問、および刺激条件に対して）。５０個未満のスポット形成単位（ＳＦＵ）の特異的シグナルは、応答を計算するためにゼロに戻した。
【０１３３】
陽性の特異的応答は、ベースライン（Ｖ１）において、以前はアッセイカットオフ未満であった被検体において、１ｘ１０６ＰＢＭＣ当たり５０ＳＦＵのアッセイカットオフに等しいか、またはそれを超える陽性の特異的シグナルの出現がある場合、またはアッセイカットオフ値に等しいか、またはそれを超えるベースライン（Ｖ１）シグナルを持つ被検体のベースライン（Ｖ１）シグナルから、少なくとも１．７倍のＳＦＵ数の上昇がある場合のいずれかに定義した。そうでなければ、それぞれのポストベースラインまたはベースライン値のいずれかが欠失していた場合を除いて、応答を負として定義し、次に応答状態を欠失として定義した。
【０１３４】
被検体は、複数のポストベースライン訪問に渡って、複数の応答を持ち得たが、１つの応答のみが、特異的な応答者として考慮される必要があった。
【０１３５】
ＨＩＶペプチド刺激は、すべての被検体に対して３つのレベルで、ならびに応答者のみに別個の分析で、刺激プール別（１−１５）、タンパク質／ポリタンパク質別（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｉｆ、混合）、およびワクチン別（すなわち、すべてのＨＩＶタンパク質を含む）に分析した。
【０１３６】
記述統計は、刺激状態（ＨＩＶ−ＭＡＧペプチドおよび生きたＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）による刺激を含む）によって、すべての試料採取時に得られ、観察回数、算術平均、および標準偏差（ＳＤ）、ＳＦＵの数の中間値および範囲を含む。これは、すべての被検体に行い、分析の３つのレベルすべてにおいて、応答者のみに別個の分析を行った（すなわち、プールレベルの応答者、タンパク質／ポリタンパク質レベルの応答者、およびワクチンレベルの応答者に対して）。
【０１３７】
９５％クロッパー−ピアソン信頼区間に沿って、陽性の特異的応答者（応答者率）の数およびパーセンテージを、各プール、各タンパク質／ポリタンパク質、および全体ＨＩＶ−ＭＡＧワクチン、ならびにＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に対して一覧にした。パーセンテージは、特定の分析に含まれる被検体の数に基づいて計算した。被検体は、応答者と見なされるには、タンパク質／ポリタンパク質およびワクチンレベルにおいて、１つのポールに応答すればよい。１つのみに刺激条件（ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）による刺激）を使用して試験した、ベクター特異的応答者率に対しても同様であった。
【０１３８】
ＨＩＶ特異的応答の幅は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、および６つのタンパク質／ポリタンパク質に対して応答を持つ被検体の数、以下のカテゴリーを使用して、被検体のタンパク質／ポリタンパク質応答の累積描写によって表した。
【０１３９】
ＥＬＩＳＰＯＴによって決定されるようなワクチン接種に先立って、被検体の８７％が、ｇａｇに対して、６０％がｎｅｆに対して、５３％がＣＴＬエピトープに対して、４０％が混合タンパク質およびＨＴＬエピトープに対して、３３％がｐｏｌに対して、７％のみがｔａｔおよびｖｉｆに対して細胞免疫応答を生じた。
【０１４０】
各ペプチドプール、タンパク質／ポリタンパク質、およびＨＩＶワクチン（ＨＩＶ−ＭＡＧ）の応答者率は、表３に要約され、応答が検出された時点も明らかにする。応答者を定義するための単一の応答の使用は、ＳＡＰにおいて定義され、応答を審査するための高感度方法であるが、この方法は、より高い偽陽性率の傾向があり得る。この理由で、より厳密性の高い応答者の定義を使用して補足分析を行ったところ、２つの応答を応答者として定義する必要がある。
【０１４１】
図２にも示されるように、新しい応答またはベースライン値よりも増加した応答が、ワクチン−ベクター内でコードされるＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）、ＨＩＶタンパク質に対して高く、被検体の８７％（１３／１５）が応答したことを暗示する。より厳密性の高い応答者の定義を使用する場合でも、被検体の８０％が、ＨＩＶ成分に対する応答者であった。最高比率の被検体がｇａｇに応答した（７３％、１１／１５、図２を参照）。ｇａｇ内で、ｐ２４は、ｐ１７（２０％）よりも高い応答者率をもたらした（２つのｇａｇ−ｐプール２４に対してそれぞれ４０％および４７％）。より厳密性の高い応答者の定義を使用する場合でも、被検体の６０％がｇａｇに応答した。ｐｏｌおよび混合タンパク質プールに対する応答者率は類似し（５３％、８／１５、図２も参照）、ｐｏｌ内で、プロテアーゼおよびＲＴは、最高かつ等しい応答者率（２７％）を有し、２０％の応答者率を持つインテグラーゼが続いた。混合プールは、複数のタンパク質からのペプチドを含有するため、最も免疫原性の高いペプチドを決定することができなかった。より厳密性の高い応答者率の定義を使用する場合でも、依然として、ｐｏｌ（３３％）および混合（４０％）の両方に対して高い応答者率をもたらした。Ｎｅｆ応答者率は、４０％であり（６／１５、図２を参照）、プール４に対する応答は最高であった（２７％）。より厳密性の高い応答者率の定義を使用すると、Ｎｅｆ応答は、２７％であった。計７名の被検体（４６．７％）および１名の被検体（６．７％）が、ＨＴＬおよびＣＴＬポリトープペプチドに対して応答し、ＴａｔおよびＶｉｆの両方に対する応答者は検出されなかった。
【０１４２】
【表３】
【０１４３】
ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答の幅は、被検体が新規または増加したＴ細胞応答を生じたタンパク質／ポリタンパク質の数を表す。表４は、ＨＩＶタンパク質に対する応答の幅を示す。ワクチン付与は、大部分の被検体において、いくつかのタンパク質に対する応答の生成をもたらした。ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、および混合（ｐ２ｐ７、ｖｐｒ、ｅｒｖ）を含む、最大４つの異なるタンパク質／ポリタンパク質に対する応答は、表４に示される。すべての被検体の６６．７％が、少なくとも２つのタンパク質／ポリタンパク質に対して、４６．７％ が少なくとも３つのタンパク質／ポリタンパク質に対して応答した。
【０１４４】
【表４】
Ｎ＝指定群の被検体数、Ｒ＋＝上述されるいずれかのタンパク質に対して応答した被検体の数、％＝Ｎに基づくパーセンテージ、９５％ ＣＩ＝クロッパー−ピアソン信頼区間、下限および上限
【０１４５】
１５名の被検体すべてが３回のワクチン接種を受け、研究の終了までフォローアップされた。重篤なＡＥは報告されず、関連ＡＥのために離脱した研究被検体はいなかった。すべての被検体は、あるグレード３の事象（注入部位の疼痛）を伴う、全身応答（主に吐き気）および局所応答（主に硬化）を報告した。したがって、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＭＡＧの投与は、ＨＩＶ−１に感染した被検体において良好な耐容性を示した。
【０１４６】
すべての被検体がワクシニアに応答した。図４Ａ〜Ｄは、指定のＨＩＶ−１タンパク質の中央値ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣを立証した。結果は、以下のように要約され得る。
【０１４７】
Ｇａｇ応答者（１１／１５被検体）：４３７ ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣの中央値ピークは、３回目の免疫付与から１週間後の１３週目。
【０１４８】
Ｐｏｌ応答者（８／１５被検体）：８０ ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣの中央値ピークは、３回目の免疫付与から１週間後の１３週目。
【０１４９】
Ｎｅｆ応答者（６／１５被検体）：２７６ ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣの中央値ピークは、２回目の免疫付与から８週間後の１２週目。
【０１５０】
混合プール（ｐ２ｐ７、ｖｐｒ、ｒｅｖ）応答者（８／１５被検体）：６５ ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣの中央値ピークは、２回目の免疫付与から８週間後の１２週目。
【０１５１】
Ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、および混合応答性ＩＦＮ−γ分泌ＰＢＭＣは、１回目の免疫付与から２０週後も、ベースラインより高いままであった。
【０１５２】
ワクシニア特異的応答者の中央ＳＦＵ値は、２回目の免疫付与から８週間後の１２週目にピークの３５０ ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣに到達し、３回目のワクチン接種後にさらに増加しなかった。ＨＩＶ応答に関して観察されるように、ワクシニア応答性ＩＦＮ−γ分泌ＰＢＭＣの数は、１回目の免疫付与から２０週後も、ベースラインより高いままであった。抗ワクシニア抗体血清変換率は、５週目（２回目のワクチン付与から１週間後）に１００．０％に到達し、研究期間中は１００％のままであった。ＥＬＩＳＡ ＧＭＴは、１回目のワクチン接種から１週間後にわずかな増加および強力なブースター応答を呈した。ワクシニア特異的抗体の力価は、３回目の免疫付与から１週間後にピークの８７６に到達し、１回目の免疫付与から２０週後も、ベースラインよりはるかに高いままであった。
【０１５３】
ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＭＡＧ ＨＩＶワクチン候補は、ＨＩＶ−１に感染した被検体において良好な耐容性を示した。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答率は、８６．７％であり、ワクシニア特異的応答率は、１００％であった。プール中の４つのＨＩＶタンパク質／ポリタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、および混合［ｐ２ｐ７−ｖｐｒ−ｒｅｖ］）に対する広域細胞免疫応答が認められ、全被検体の６６．７％が少なくとも２つ、４６．７％が少なくとも３つのＨＩＶ−１タンパク質／ポリタンパク質に応答した。Ｔ細胞応答の中央値は、応答を誘発したすべてのＨＩＶタンパク質に対して、第１回の免疫付与から２０週間後も、依然としてベースラインより高かった。これは、ワクシニア特異的Ｔ細胞応答についても当てはまる。したがって、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＭＡＧワクチンは、複数のＨＩＶ−１タンパク質、およびワクシニアに対する広域免疫応答を誘発することができ、応答は、第１回の免疫付与を受けてから２０週間後も、依然としてベースラインよりも高かった。
【０１５４】
本発明は、以下の項目も含む。
【０１５５】
１．ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも３つのＨＩＶタンパク質、および当該タンパク質の部分または誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【０１５６】
２．ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、および当該タンパク質の部分または誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを含む、項目１に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【０１５７】
３．ＨＩＶタンパク質の部分が、対応する全長タンパク質の少なくとも１０個の連続アミノ酸を含むタンパク質である、項目１または２に記載の組換えＭＶＡ。
【０１５８】
４．ＨＩＶタンパク質の誘導体が、前記ＨＩＶ−１分離体ＨＸＢ２Ｒ（ＧｅｎｅＢａｎｋ悪セッション番号Ｋ０３４５５）において、前記それぞれのＨＩＶタンパク質に対して少なくとも５０％の相同性を示す、アミノ酸配列である、前記項目のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
【０１５９】
５．前記ＭＶＡゲノムは、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、およびＲｅｖを含む融合タンパク質をコードする発現カセット、Ｎｅｆをコードする発現カセット、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする発現カセット、およびＴａｔをコードする発現カセットを含む、前記項目のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
【０１６０】
６．Ｎｅｆが、Ｎ末端切断Ｎｅｆであり、かつ／またはＴａｔがトランスドミナントＴａｔである、前記項目のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
【０１６１】
７．ウイルスゲノム中に、
（ｉ）遺伝子間領域ＩＧＲ０７／０８に挿入される融合タンパク質として、Ｖｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを発現する、第１の発現カセットと、
（ｉｉ）最初の１９Ｎ−末端アミノ酸が欠失され、遺伝子間領域ＩＧＲＩ４Ｌ／Ｉ５Ｌに挿入されるＮｅｆタンパク質を発現する、第２の発現カセットと、
（ｉｉｉ）ＩＧＲ１３６／１３７に挿入される、トランスドミナントＴａｔを発現する第３の発現カセットと、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質を発現する第４の発現カセット、
を含む、前記項目のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
【０１６２】
８．項目１〜７のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、および薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、および／または添加剤を任意に含む、薬学的組成物またはワクチン。
【０１６３】
９．ヒト患者において、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも３つのＨＩＶタンパク質に対してＴ細胞応答を誘発するための、項目１〜７のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、もしくは項目８に記載の薬学的組成物またはワクチン。
【０１６４】
１０．ヒト患者において、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも３つのＨＩＶタンパク質に対してＴ細胞応答を誘発するために、薬剤を調製するための、項目１〜７のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、もしくは項目８に記載の薬学的組成物またはワクチンの使用。
【０１６５】
１１．項目９に記載の組換えＭＶＡ、薬学的組成物、またはワクチン、もしくは前記ＨＩＶタンパク質がＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆである、項目１０に記載の使用。
【０１６６】
１２．項目９に記載の組換えＭＶＡ、薬学的組成物、またはワクチン、もしくはＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される前記ＨＩＶタンパク質の少なくとも４つに対するＴ細胞応答を誘発するための、項目１０に記載の使用。
【０１６７】
１３．項目９〜１２のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、薬学的組成物、またはワクチン、もしくは前記ＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆに対するＴ細胞応答を誘発するための、項目１０または１２に記載の使用。
【０１６８】
１４．ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための項目１〜７のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、もしくは項目８に記載の薬学的組成物またはワクチンの使用。
【０１６９】
１５．ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための薬剤を調製するための、項目１〜７のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、もしくは項目８に記載の薬学的組成物またはワクチンの使用。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質、またはその一部、またはその誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ならびにＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療および／または予防のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子である。すべてのレトロウイルスと同様に、このウイルスのゲノムも、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖタンパク質をコードしている。また、このウイルスゲノムは調節タンパク質、すなわちＴａｔおよびＲｅｖと、アクセサリータンパク質、すなわちＶｐｒ、Ｖｐｘ、Ｖｐｕ、ＶｉｆおよびＮｅｆもコードしている。
【０００３】
ＡＩＤＳの流行が蔓延するのを抑制しようとする公衆衛生的努力にもかかわらず、新規感染数は依然として増加している。世界保健機関は、この世界的な蔓延を、２００３年末の時点で感染者数３，７８０万人と推定した。包括的な予防機構のさらなる改善がなければ、多数の新たなＨＩＶ感染が起こり、世界的に、この１０年で４，５００万人になると予測される（２００４ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ Ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌ ＡＩＤＳ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ，ＵＮＡＩＤＳ ａｎｄ ＷＨＯ）。
【０００４】
ＨＩＶ感染は、部分的に制御することができるが、未だに治癒されない慢性感染疾患である。合併症を予防し、ＡＩＤＳへの進行を遅延させる有効な手段がある。現状では、ＨＩＶに感染したすべての人が、ＡＩＤＳに進行するとは限らないが、一般に、多数がそうなると考えられている。
【０００５】
高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）と呼ばれる、いくつかの抗レトロウイルス薬の組み合わせは、ウイルス負荷を減少させることにおいて極めて有効であり、Ｔ細胞数を向上させることができる。これはＨＩＶの治癒ではなく、ＨＡＡＲＴ中の抑制レベルのＨＩＶを有する人々は、依然としてウイルスを他者に伝染させる可能性がある。しかしながら、ＨＩＶレベルが依然として抑制され、ＣＤ４数が２００よりも大きい場合、生活の質および寿命が著しく向上し、長くなり得るという十分な証拠がある。新規のベクターまたはアジュバント系など、多数の異なるＨＩＶワクチン送達戦略が、現在既に開発され、異なる前臨床設定および臨床試験で評価されている。第ＩＩＩ相臨床試験に入った最初のワクチン候補は、アルミニウム中のエンベロープｇｐ１２０タンパク質に基づいている（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １９９８；１４（Ｓｕｐｐｌ ３）（５）：Ｓ３２５−３１）。しかしながら、最初の臨床研究の結果は、あまり期待できるものではなかった。
【０００６】
ＨＡＡＲＴレジメンにおいて使用される薬物は、ウイルス力価を減少させることができるが、抗レトロウイルスレジメンに関していくつかの懸念がある。ＨＡＡＲＴに関する１つの主要な問題は、（長期の）副作用およびそれによる患者のコンプライアンスである。患者が服薬を忘れると、薬物耐性が進展し得る。また抗レトロウイルス薬は高価であり、世界の感染者の大多数が、ＨＩＶおよびＡＩＤＳ用の薬剤および治療を利用できない。
【０００７】
過去に有用性が試験されたワクチンは、通常、Ｅｎｖ等の単一ＨＩＶタンパク質に基づいている。しかしながら、そのような単一タンパク質、例えば、Ｅｎｖに対して免疫応答が生成された場合であっても、当該免疫応答が有効でないことが実証された。無効性の１つの理由は、特に、ウイルス中にワクチンによって誘発される免疫応答によって認識されないタンパク質をもたらすＥｎｖタンパク質に関する、ＨＩＶの高い変異率である。
【０００８】
利用できる有効な予防的治療がないため、有効なワクチンを臨床にもたらすことが依然として必要である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、驚くべきことに、ＨＩＶ−１タンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆを含むＭＶＡ系ＨＩＶワクチンが、ヒトにおいて、特にＨＩＶに感染している免疫不全のヒトにおいて、これらのＨＩＶタンパク質の最大６つに対するＴ細胞応答を誘発することができることを発見した。そのようなＭＶＡは、Ｔ細胞応答が所望されるエピトープは、免疫優勢エピトープによって、いわば上書きされるように、免疫優勢エピトープを免疫系に提供することが知られているため、この発見は予測され得なかった。さらに、臨床試験中、ワクチン接種したＨＩＶ感染者の免疫応答が、１回目の免疫付与を受けてから２０週後も依然としてベースラインよりも高いことが認められた。
【００１０】
実際には、本発明とは対照的に、免疫細胞に対するＨＩＶワクチンの効果を調査するために、ヒトにおける臨床試験はないが、マウスモデルにおいて、管内データまたは生体内データのいずれかが生成された。
【００１１】
実際、動物実験は、モデルがヒトの応答率および応答の大きさを予測しない場合が多いため、人体研究ほど良好でない。より多くのマウスおよびウサギのすべてが、ヒトと同様に、免疫応答性が高くなる。したがって、本発明者らによって得られたデータは、高く評価される必要があり、ＭＶＡによる免疫優勢の既知の現象を考慮すると、それらはＨＩＶに感染したヒトから得られたためにそれ程でないことは予測され得なかった。添付の実施例に記載される臨床試験に参加したＨＩＶ感染者は、３５０／μｌ未満のＣＤ４数を有し、この低い数字に基づくと、臨床試験の参加者に投与されるＭＶＡ系ワクチンから成る、８つのＨＩＶ−１タンパク質の６つに対するそのような広域Ｔ細胞応答は予測しなかったであろう。
【００１２】
例えば、第ＵＳ２００６／１８８９６１号および第ＷＯ０３／０９７６７５号は、ＭＶＡ系ＨＩＶワクチンについて説明した。しかしながら、これらの文書は、本明細書に記載されるような組換えＭＶＡにおいて適用されるＨＩＶ−１タンパク質に対する、広域Ｔ細胞応答を明らかにしていない。
【００１３】
第ＥＰ１９２１１４６号および第ＷＯ０１／４７９５５号は、Ｔ細胞応答の誘発のためのＣＴＬエピトープ（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆ、またはＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、およびＶｐｕ）を含むＭＶＡ系ＨＩＶワクチンについて説明する。しかしながら、これらの文書は、ヒトにおいて得られたデータはもちろん、広域Ｔ細胞応答を示すデータを提供していない。
【００１４】
第ＷＯ２００６／１２３２５６号は、第ＷＯ０１／４７９５５号によく似ており、より特異的なＣＴＬエピトープ以外に、第ＷＯ０１／４７９５５号が説明する内容を超えるものを提供しない。
【００１５】
第ＷＯ２００８／１１８９３６号は、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｎｅｆ、ＲＴ、Ｔａｔ、およびＲｅｖから選択されるＨＩＶタンパク質を含むＭＶＡ系ＨＩＶワクチンについて説明する。しかし、本文書は、単に動物モデルデータを有するという欠点があり、ヒトに対して合理的に推定され得ない。
【００１６】
Ｇｒｅｅｎｏｕｇｈらの（２００８），Ｖａｃｃｉｎｅ．２６：６８８３−６８９３は、ＨＡＡＲＴ中、したがってＨＩＶに感染している若年成人に投与される、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびＲＴを含む、組換え体ポックスウイルスＨＩＶ−１ワクチンの安全性および免疫原性研究について報告している。しかしながら、著者らは、それらのワクチンの開発が容易に進展しそうにないと報告している。
【００１７】
しかしながら、この目的のために、免疫不全の被検体におけるそのような免疫応答はもちろん、８つのＨＩＶタンパク質の６つに対する広域Ｔ細胞応答を予測しなかったであろう。特に、管内データも動物モデルも、特にＨＩＶ治療の分野において、合理的な成功の期待の基礎を形成することができない。これは、ＨＩＶの「実際の」モデル系がヒト、特にＨＩＶに感染したヒトであるからである。
【００１８】
所望のＨＩＶタンパク質に対する免疫応答の生成を必ずしももたらさなかった動物実験および複数のＣＴＬエピトープを並べることによって（例えば、第ＷＯ０１／４７９５５号または第ＷＯ２００８／１１８９３６号）、免疫応答をさらに増殖させる試みに基づいて、免疫不全のヒトにおいて、８つのＨＩＶタンパク質の６つが、免疫系によって認識されることは予測され得なかった。
【００１９】
したがって、本発明は、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも３つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２０】
一実施形態において、当該組換えＭＶＡは、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む。
【００２１】
別の実施形態において、当該組換えＭＶＡは、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも８つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む。
【００２２】
本発明のさらに特定の実施形態において、当該組換えＭＶＡは、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、３、４、５、６、７、もしくは８つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む。
【００２３】
本発明は、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、８つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体、および１つ以上の追加の構造および／または規制ＨＩＶタンパク質、またはその部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）も包含する。
【００２４】
好適な実施形態において、本発明は、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、ＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆ、または当該タンパク質の部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２５】
さらなる好適な実施形態において、本発明は、ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、ＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆ、または当該タンパク質の部分、または誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２６】
特定の好適な実施形態において、本発明は、ウイルスゲノム中に、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、ＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発する際に使用するための、ＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、または当該タンパク質の部分、またはその誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２７】
別の特定の好適な実施形態において、本発明は、ウイルスゲノム中に、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、ＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発する際に使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または当該タンパク質の誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２８】
さらなる特定の好適な実施形態において、本発明は、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、ＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発する際に使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも８つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または当該タンパク質の誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを、ウイルスゲノム中に含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関する。
【００２９】
本発明は、本明細書に定義される組換えＭＶＡを含む薬学的またはワクチン組成物、特に、ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、その部分または当該タンパク質の誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを含む、組換えＭＶＡも提供する。
【００３０】
より好ましくは、本発明の薬学的またはワクチン組成物は、ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも８つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または当該タンパク質の誘導体を発現するための、１つ以上の発現カセットを含む、組換えＭＶＡを含む。
【００３１】
さらなる好適な実施形態において、組成物は、ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、またはその部分、または当該タンパク質の誘導体を発現するための、１つ以上の発現カセットを含む、組換えＭＶＡ。
【００３２】
好適な実施形態において、薬学的またはワクチン組成物に含まれるＭＶＡは、当該薬学的またはワクチン組成物中に約２ｘ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量である。
【００３３】
別の好適な実施形態において、薬学的またはワクチン組成物に含まれるＭＶＡは、３つの時間間隔で投与するために調製される。３つの時間間隔は、好ましくは、０、４、および１２週目である。
【００３４】
本発明に記載の組換えＭＶＡを用いて、ここでは、多数のＨＩＶタンパク質を発現することが可能である。これらの多数のタンパク質は、広範な免疫応答を誘発することができる。したがって、異なるＨＩＶ分離体に対して有効な防御免疫応答が生成される可能性が高まる。
【００３５】
本発明に記載の修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）は、ヒトならびにマウスおよび非ヒト霊長類等のいくつかの動物種において使用するために適している。ＭＶＡは、例外的に安全であることが知られている。
【００３６】
本明細書で使用する「被検体」という用語は、特に、ヒト被検体を表す。本明細書で参照される時、ヒト被検体は、例えば、ＨＩＶ感染に起因して、免疫付与される場合があり、すなわち、ヒト被検体は、ＨＩＶ、例えばＨＩＶ−１に感染している。本明細書で参照されるヒト被検体は、それが３５０／μｌ未満のＣＤ４細胞数を有することを特徴とし得る。
【００３７】
本明細書で使用される時、「免疫不全の」は、免疫系が感染疾患を防御またはそれに対抗する能力が不全であるか、または全く存在しない状態である。
【００３８】
ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）がニワトリ胚線維芽細胞上を長期間、連続して通過することによって生成された（検討する場合は、Ｍａｙｒ，Ａ．，Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ，Ｖ．ａｎｄ Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．［１９７５］Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３，６−１４；Ｓｗｉｓｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５６８，３９２を参照）。ブタペスト条約の要件に準拠して寄託され、本発明に記載の組換え体ウイルスの生成に有用である、ＭＶＡウイルス株の実施例は、欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ、ソールズベリー（ＵＫ））において、１９９４年１月２７日に寄託番号第ＥＣＡＣＣ９４０１２７０７号で寄託された株ＭＶＡ５７２、２０００年１２月７日に第ＥＣＡＣＣ００１２０７０７号で寄託されたＭＶＡ５７５、および２０００年８月３０日に番号第０００８３００８号で、ＥＣＡＣＣにおいて寄託されたＭＶＡ−ＢＮである。
【００３９】
ワクチン開発におけるその使用に関する、ＭＶＡ株のいくつかの優れた特性は、広範な臨床試験において照明された（Ｍａｙｒら、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ １６７，３７５−３９０［１９８７］）。リスクの高い患者を含む、１２０，０００人を超えるヒトにおいて行われたこれらの研究中に、副作用は見られなかった（Ｓｔｉｃｋｌら、Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２［１９７４］）。
【００４０】
ＭＶＡは、哺乳類細胞におけるウイルス複製周期の後期に遮断されることがさらに分かった（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，１０８４７−１０８５１［１９９２］）。したがって、ＭＶＡは、そのＤＮＡを完全に複製し、早期、中期、および後期遺伝子生成物を合成するが、感染細胞から放出され得る成熟感染性ビリオンを組み立てることはできない。この理由で、すなわち、その複製制限された性質のために、ＭＶＡは、遺伝子発現ベクターとして機能する。
【００４１】
したがって、本発明の一実施形態において、組換えＭＶＡは、ＭＶＡ株のＭＶＡ５７５、ＭＶＡ５７２、およびＭＶＡ−ＢＮから選択される。
【００４２】
好適な実施形態において、本発明の組換えＭＶＡウイルスは、ヒトおよび非ヒト霊長類において複製能力がない。ヒトおよび／非ヒト霊長類において「複製能力がない」ＭＶＡウイルスという用語、ならびにヒトおよび／または非ヒト霊長類において「感染子孫ウイルスに対して複製されることができない」ウイルスの同義語は、いずれも好ましくは、当該ウイルスでワクチン接種されたヒトおよび／または非ヒト霊長類の細胞において、全く複製しないＭＶＡウイルスを表す。しかしながら、組換えＭＶＡウイルスが投与される、ヒトおよび／または非ヒト霊長類の免疫系によって制御される、わずかな残留複製活性を示す、それらのウイルスも本出願の範囲内である。
【００４３】
一実施形態において、複製能力がない組換えＭＶＡウイルスは、ウイルスがワクチンとして使用される、ヒトおよび／または非ヒト霊長類の細胞に感染することができるウイルスであってもよい。「細胞に感染することができる」ウイルスは、ウイルスまたは少なくともウイルスゲノムが、宿主細胞に組み込まれる程度に宿主細胞と相互作用することができる、ウイルスである。本発明に従って使用されるウイルスは、ワクチン接種したヒトおよび／または非ヒト霊長類の細胞に感染することができ、それは、ワクチン接種したヒトおよび／または非ヒト霊長類の細胞において、感染子孫ウイルスに対して複製されることができない。
【００４４】
本発明に従って、第１の動物種の細胞に感染することができるが、当該細胞において、感染子孫ウイルスに対して複製されることができないウイルスは、第２の動物種において異なる動作をし得ることが理解される。例えば、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体（以下を参照）は、ヒトの細胞に感染することができるが、ヒト細胞において、感染子孫ウイルスに対して複製されることができないウイルスである。しかしながら、同一のウイルスは、ニワトリにおいて効率的に複製され、すなわち、ニワトリにおいて、ＭＶＡ−ＢＮは、細胞に感染することも、それらの細胞において感染子孫ウイルスに対して複製されることもできるウイルスである。
【００４５】
ヒトにおいて複製されることができるか、または複製されることができないかを予測するのを可能にする適切な試験は、第ＷＯ０２／４２４８０号において開示され（参照により本明細書に組み込まれる）重度に免疫不全のＡＧＲ１２９マウス株を使用する。さらに、ＡＧＲ１２９マウスの代わりに、成熟ＢおよびＴ細胞を生成することができず、そのため重度に免疫不全であり、複製ウイルスに非常に感染しやすい、あらゆる他のマウス株を使用することができる。本マウスモデルにおいて得られる結果は、伝えられるところによると、ヒトを示すため、本出願に従って、当該マウスモデルにおいて複製能力がないウイルスは、「ヒトにおいて複製能力がない」ウイルスであると見なされる。
【００４６】
他の実施形態において、本発明に従うウイルスは、好ましくは、少なくとも１つの動物種の少なくとも１つの細胞型において複製されることができる。したがって、ワクチン接種および／または治療される動物に投与する前に、ウイルスを増殖させることができる。実施例として、ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）細胞中で増殖することができるが、ヒトにおいて、感染子孫ウイルスに対して複製されることができない、ＭＶＡ−ＢＮを参照する。
【００４７】
本発明に記載されるウイルスの「誘導体」または「変異体」という用語は、親ウイルスと同一の特徴的特性を示すが、そのゲノムの１つ以上の部分において差異を示す、子孫ウイルスを表す。「誘導体」、もしくは「ＭＶＡの変異体」または「ＭＶＡ−ＢＮ」という用語は、ＭＶＡと比較して、同一の機能的特徴を有するウイルスを説明する。例えば、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体／変異体は、ＭＶＡ−ＢＮの特徴的特性、好ましくは、寄託番号第０００８３００８号でＥＣＡＣＣにおいて寄託されるようなＭＶＡ−ＢＮを有する。ＭＶＡ−ＢＮ、またはその変異体のこれらの特徴の１つは、その減衰であり、それぞれヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ、ヒト胚腎臓細胞株２９３、ヒト骨骨肉種細胞株１４３Ｂ、およびヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ等のヒト細胞株において、生殖複製の能力を有しない。
【００４８】
追加および代替として、ＭＶＡ−ＢＮおよび誘導体は、成熟ＢおよびＴ細胞を産生することができない、マウスモデルにおいて複製することができないという特性を有し、および／またはＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジームと比較した場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジームにおいて、少なくとも同一レベルの特異的免疫応答を誘発する能力を有する。
【００４９】
第ＷＯ０２／４２４８０号に開示されるように、「アッセイ１」および「アッセイ２」の１つまたは２つにおいて測定されるようなＣＴＬ応答が、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブーストレジームと比較して、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジームにおいて、少なくとも実質的に同一である場合、ワクシニアウイルス、特にＭＶＡ株は、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジームにおいて、少なくとも実質的に同一レベルの免疫性を誘発すると見なされる。
【００５０】
本発明に従って使用されるウイルスは、モノクローナル抗体等のクローン精製ウイルスであり得る。
【００５１】
本発明に従って使用されるウイルスは、血清中に含有される薬剤に感染するリスクを減少させるように、無血清状態で産生／通過されたウイルスであり得る。
【００５２】
本発明に従うＭＶＡは、１０４〜１０９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲内、好ましくは、例えば１０５〜５ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲内、より好ましくは、例えば１０６〜１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌまたは１０７〜１０９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲内、さらにより好ましくは、例えば１０８〜１０９ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲内、および最も好ましくは、２ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度で投与される。実際の濃度は、ウイルスおよびワクチン接種される動物種の型に依存する。ＭＶＡ−ＢＮの場合、ヒトに対する典型的なワクチン接種用量は、５ｘ１０７ ＴＣＩＤ５０〜５ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０、例えば、約１または２ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０を含み、皮下的に投与される。
【００５３】
本発明の好適な実施形態において、本明細書に記載される組換えＭＶＡは、本発明の使用および方法に適用される場合、少なくとも３回投与される。
【００５４】
本発明の別の好適な実施形態において、組換えＭＶＡは、本発明の使用および方法において適用される場合、０、４、および１２週目に投与される。
【００５５】
上に定義されるような組換えＭＶＡの単回投与、特に株ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体を用いて、免疫応答を誘発することが可能である。通常、本発明に従うＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮ、およびその誘導体を、同種プライムブーストレジームにおいて使用してもよく、すなわち、組換えＭＶＡを１回目のワクチン接種に使用し、１回目のワクチン接種において使用されるものと同一または関連する組換えＭＶＡの投与によって、１回目のワクチン接種において生成される免疫応答を上昇させることが可能である。本発明に従う組換えＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮ、およびその誘導体は、ワクチン接種の１回以上が、上に定義されるようなＭＶＡを用いて行われ、ワクチン接種の１回以上が、別の型のワクチン、例えば、別のウイルスワクチン、タンパク質または核酸ワクチンで行われる、異種プライムブーストレジームにおいて使用されてもよい。
【００５６】
投与モードは、静脈内、筋肉内、皮膚内、鼻腔内、または皮下であってもよい。静脈内、筋肉内、または特に皮下投与が好ましい。しかしながら、乱切等のいずれかの他の投与モードが使用されてもよい。
【００５７】
本出願の文脈で使用する「ＨＩＶ」という用語は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含むＨＩＶのあらゆる種、およびＨＩＶ−１クレードＡ、Ｂ、またはＣ等の対応するクレードを表す。実施例には、クレードＢの株等のＨＩＶ−１株が挙げられる。
【００５８】
本発明の一実施形態に従って、発現カセットによってコードされるＨＩＶタンパク質は、ＨＩＶ−１タンパク質である。
【００５９】
本出願で使用する「ＨＩＶタンパク質の部分」という用語は、対応する全長ＨＩＶタンパク質の少なくとも１０の連続アミノ酸、例えば、当該全長タンパク質の少なくとも２０、３０、または４０アミノ酸を含む、ペプチドまたはタンパク質を表す。一例として、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに開示されているさまざまなＨＩＶ配列、特にＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０３４５５を持つＨＩＶ−１分離株ＨＸＢ２Ｒの配列が挙げられるが、本発明はこの態様に限定されるわけではない。
【００６０】
本明細書で使用する「ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列の誘導体」という用語は、対応する天然ＨＩＶタンパク質と比較して変化したアミノ酸配列を持つＨＩＶタンパク質を表す。変化したアミノ酸配列は、ＨＩＶタンパク質の配列の１種以上のアミノ酸が置換もしくは挿入されているか、または欠失している、およびしたがって変異している配列であってもよい。より具体的に、「ＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列の誘導体」は、タンパク質誘導体のアミノ酸配列が、既知のＨＩＶ分離株のそれぞれのＨＩＶタンパク質のアミノ酸配列と比較される場合、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、あるいは少なくとも８０％または８５％、もしくは少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を示す、アミノ酸配列である。アミノ酸配列は、その相同性／同一性がたった１つのＨＩＶ分離株の対応するタンパク質について見いだされるに過ぎない場合でも、他の分離株の対応するタンパク質にはそれより低い相同性を示すものがあるかもしれないという事実とは関わりなく、上記の配列相同性または同一性を持つものと見なされる。例えば、融合タンパク質中のＶｐｒ誘導体が、あるＨＩＶ分離株のＶｐｒ配列には９５％の相同性を示すが、他のＨＩＶ分離株（のすべて）には５０〜７０％の相同性しか示さない場合、当該Ｖｐｒ誘導体の相同性は少なくとも９０％であると見なされる。特に、「ＨＩＶタンパク質の誘導体」という用語は、ＨＩＶ−１分離株ＨＸＢ２Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ悪セッション番号Ｋ０３４５５）中のそれぞれのＨＩＶタンパク質に少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の相同性を示すアミノ酸配列を表す。
【００６１】
ＨＩＶタンパク質の誘導体およびＨＩＶタンパク質の部分は、完全活性、低下活性、無活性、またはトランスドミナント活性を持つことができる。例えば、本発明に従う組換えＭＶＡは、ＨＩＶの調節および／またはアクセサリータンパク質を発現する。これらのタンパク質は、望ましくない副作用を持ち得る、生物活性を有する。そのため、組換えＭＶＡから発現された１つ以上のＨＩＶタンパク質が、野生型タンパク質と比較して、低下した活性を有し得ることは、本発明の範囲内である。
【００６２】
あるＨＩＶタンパク質の生物活性が低下しているかどうかを判定するための試験は、当業者に知られている。
【００６３】
生体内でのウイルス複製に不可欠なＶｉｆタンパク質の分子機序はまだ分かっていないが、Ｖｉｆは強い自己会合傾向を持っている。この多量体化は、ウイルスの生活環におけるＶｉｆの機能にとって重要であることが示されている（Ｙａｎｇ Ｓ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１；２７６：４８８９−４８９３）。追加として、ｖｉｆは、ウイルス核タンパク複合体と特異的に関連付けられることが示され、これは機能的に重要であるかもしれない（Ｋｈａｎ Ｍ．Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００１：７５（１６）：７２５２−６５）。したがって、低下した活性を持つｖｉｆタンパク質は、多量体化および／または核タンパク質複合体への会合の減少を示す。
【００６４】
Ｖｐｒタンパク質はウイルスの生活環に重要な役割を果たす。Ｖｐｒはウイルスのプレインテグレーション複合体の核内移行を調節し、マクロファージなどの非分裂細胞の感染を促進する（Ａｇｏｓｔｉｎｉら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２００２；１８（４）：２８３−８）。また、それはＬＴＲとの相互作用によって媒介されるトランス活性化活性も持っている（Ｖａｎｉｔｈａｒａｎｉ Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００１；２８９（２）：３３４−４２）。したがって、低下した活性を持つＶｐｒは、トランス活性化および／またはウイルスプレインテグレーション複合体との相互作用の減少を示すか、またはトランス活性化および／またはウイルスプレインテグレーション複合体との相互作用を全く示さない。
【００６５】
Ｖｐｒに対して高い相同性を持つＶｐｘも、非分裂細胞における効率のよいウイルスの複製にとって重要である。Ｖｐｘは、ｇａｇ前駆体ポリタンパク質のｐ６ドメインとの相互作用によって、ウイルス粒子にパッケージングされる。Ｖｐｒと同様に、Ｖｐｘも核内へのプレインテグレーション複合体の輸送に関与する（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ２００１；７５（１）：３６２−７４）。したがって、低下した活性を持つＶｐｘは、ｇａｇ前駆体を介してプレインテグレーション複合体に会合する能力が減少している。
【００６６】
Ｖｐｕタンパク質はＣＤ４の細胞質尾部と相互作用することが知られており、ＣＤ４分解を引き起こす（Ｂｏｕｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５；６９（３）：１５１０−２０）。したがって、低下した活性を持つＶｐｕは、ＣＤ４分解を誘発する能力が低下している。
【００６７】
詳しく特徴づけられているＴａｔタンパク質の関連する生物活性は、トランス活性化応答要素（ＴＡＲ）との相互作用を介した転写のトランス活性化である。ＴａｔはＴＡＲ以外のＨＩＶ配列を欠く異種プロモーターをトランス活性化できることが実証されている（Ｈａｎ Ｐ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９９１；１９（２５）：７２２５−９）。したがって、低下した活性を持つＴａｔタンパク質は、ＴＡＲ要素を介したプロモーターのトランス活性化の減少を示す。本発明に従って、トランスドミナントＴａｔを使用することも可能である。トランスドミナントＴａｔは、以下の置換を行うことによって得られ得る：２２（Ｃｙｓ＞Ｇｌｙ）および３７（Ｃｙｓ＞Ｓｅｒ）。
【００６８】
Ｎｅｆタンパク質は、ＣＤ４の細胞表面ダウンレギュレーションを誘発することから、疾患進行の原因となるウイルス複製にとって不可欠である（Ｌｏｕ Ｔら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ １９９７；４（４）：１３２）。このダウンレギュレーションは、ＣＤ４とＮｅｆの間の直接的相互作用によって開始される（Ｐｒｅｕｓｓｅｒ Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００２；２９２（３）：７３４−４０）。したがって、低下した機能を持つＮｅｆタンパク質は、ＣＤ４との相互作用の減少を示す。実施例には、アミノ末端で切断されるＮｅｆタンパク質、例えば、１９Ｎ末端アミノ酸が欠失しているタンパク質が挙げられる。本発明に従って、特に１９Ｎ末端アミノ酸が欠失している、切断Ｎｅｆを使用することも可能である。
【００６９】
Ｒｅｖの関連する機能は、ウイルスＲＮＡのＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）との相互作用によって開始される転写後トランス活性化である（Ｉｗａｉら、１９９２；Ｎｕｃｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９２；２０（２４）：６４６５−７２）。したがって、低下した活性を持つＲｅｖは、ＲＲＥとの相互作用の減少を示す。
【００７０】
本発明の一実施形態に従って、ＨＩＶタンパク質の１つ以上は、個々のタンパク質として発現される。
【００７１】
さらなる実施形態に従って、ＨＩＶタンパク質の２つ以上が、融合タンパク質として発現される。好ましくは、ＨＩＶアクセサリー／調節タンパク質の２つ以上が、融合タンパク質として発現される。
【００７２】
本文脈において、第ＷＯ０３／０９７６７５号が参照され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
例として、本発明に従う組換えＭＶＡ、例えば、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、（ｉ）Ｖｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを、融合タンパク質として、この順序または異なる順序で発現する場合があり、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、およびＲｅｖは、全長タンパク質、あるいは全長タンパク質の部分または誘導体を代表し（上の定義を参照）、（ｉｉ）Ｎｅｆあるいはその部分または誘導体、特にＮ末端アミノ酸が欠失しているＮｅｆタンパク質（すなわち、Ｎ−末端切断Ｎｅｆ）、例えば、最初の１９アミノ酸、（ｉｉｉ）Ｔａｔあるいはその部分または誘導体、特にトランスドミナントＴａｔ、および（ｉｖ）ＧａｇおよびＰｏｌは、全長タンパク質、あるいは全長タンパク質の部分または誘導体を代表し、例示される順序または逆順序（Ｐｏｌ−Ｇａｇ）で配置される、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質が挙げられる。
【００７４】
そこからＨＩＶタンパク質が発現される発現カセットの数は、重要ではない。実施例として、ＨＩＶタンパク質は、２〜５つの発現カセットから発現され得る。第１の発現カセットは、Ｖｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを、融合タンパク質として、この順序または異なる順序で発現する場合があり、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、およびＲｅｖは、全長タンパク質、あるいは全長タンパク質の部分または誘導体を代表し（上の定義を参照）、第２の発現カセットは、Ｎｅｆあるいはその部分または誘導体、特にＮ−末端アミノ酸が欠失しているＮｅｆタンパク質、例えば、最初の１９アミノ酸を発現する場合があり、第３の発現カセットは、Ｔａｔあるいはその部分または誘導体、特にトランスドミナントＴａｔを発現する場合があり、第４の発現カセットは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質を発現する場合があり、ＧａｇおよびＰｏｌは、全長タンパク質、もしくは全長タンパク質の部分または誘導体を代表し、例示される順序または逆順序（Ｐｏｌ−Ｇａｇ）で配置される。好ましくは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする発現カセット、およびＴａｔをコードする発現カセットは、同一の挿入部位に挿入される。
【００７５】
異種核酸配列の発現は、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターの転写制御下であるが、この限りではない。適切なポックスウイルスプロモーターの例は、牛痘ＡＴＩプロモーターである（第ＷＯ０３／０９７８４４号を参照）。各発現カセットの発現が異なるプロモーターによって制御されることは可能である。代替として、すべての発現カセットが、同一のプロモーターの複製によって制御されることも可能である。例として、本発明は、すべてのＨＩＶ発現カセット、例えば、上に例示される４つの発現カセットが、第ＷＯ０３／０９７８４４号に定義されるような牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体によって制御される、組換え体ウイルスに関する。
【００７６】
ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体等の本発明に従う組換えＭＶＡにおいて、発現カセットは、ウイルスゲノムの１〜１０の挿入部位に挿入されてもよい。
【００７７】
ＨＩＶタンパク質もしくはその部分または誘導体を発現するための組換えＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮおよびその変異体は、すべての発現カセットが同一の挿入部位に挿入されない場合に容易に得ることができることが予期せず分かった。したがって、異なる発現カセットは、ウイルスゲノムの１〜５、２〜８、３〜５、または３つの挿入部位に挿入されてもよい。
【００７８】
異種核酸配列の挿入は、ウイルスゲノムの必須でない領域に行われてもよい。本発明の別の実施形態に従って、異種核酸配列は、ＭＶＡゲノムの自然発生する欠失部位に挿入される（第ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６号に開示される）。さらなる代替に従って、異種配列は、ポックスウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入されてもよい（第ＷＯ０３／０９７８４５号を参照）。異種配列をポックスウイルスゲノムに挿入する方法は、当業者に知られている。例として、発現カセットは、ＭＶＡゲノム、特にＭＶＡ−ＢＮのゲノムおよびその誘導体の遺伝子間領域ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ Ｉ４Ｌ／Ｉ５Ｌ、およびＩＧＲ１３６／１３７の１つ以上に挿入されてもよい。
【００７９】
本発明の好適な実施形態に従って、組換えＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体であり、以下の発現カセットは、以下の挿入部位に挿入される。（ｉ）Ｖｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを、融合タンパク質として、この順序または異なる順序で発現する発現カセットであって、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、およびＲｅｖは、全長タンパク質、もしくは全長タンパク質の部分または誘導体を代表する（上の定義を参照）発現カセットは、遺伝子間領域ＩＧＲ０７／０８に挿入され、（ｉｉ）Ｎｅｆもしくはその部分または誘導体を発現する第２の発現カセット、特にＮ−末端アミノ酸が欠失しているＮｅｆタンパク質、例えば最初の１９アミノ酸は、ＩＧＲＩ４Ｌ／Ｉ５Ｌに挿入され、（ｉｉｉ）Ｔａｔもしくはその部分または誘導体、特にトランスドミナントＴａｔを発現する第３の発現カセット、ならびにＧａｇおよびＰｏｌが全長タンパク質を代表する、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質を発現する第４の発現カセットは、ＩＧＲ１３６／１３７に挿入される。この例において、第３および第４の発現カセットは、同一の統合部位に挿入され、２つの発現カセットは、両方の可能な順序で配置され得る。ＩＧＲの付番については、第ＷＯ０３／０９７８４５号を参照する。一方のＩＧＲ Ｉ４Ｌ／Ｉ５Ｌおよび他方のＩＧＲ １３６／１３７、ＩＧＲ ０７／０８は、２つの異なる付番方式に属することを考慮すべきであり、これらは第ＷＯ０３／０９７８４５号に説明される。
【００８０】
最も好ましくは、本発明の組換えＭＶＡは、ウイルスゲノム中に、
（ｉ）融合タンパク質としてＶｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを発現し、遺伝子間領域ＩＧＲ０７／０８に挿入される、第１の発現カセットと、
（ｉｉ）最初の１９Ｎ末端アミノ酸が欠失しているＮｅｆタンパク質を発現し、ＩＧＲＩ４Ｌ／Ｉ５Ｌに挿入される、第２の発現カセットと、
（ｉｉｉ）いずれもＩＧＲ１３６／１３７に挿入される、トランスドミナントＴａｔを発現する第３の発現カセットおよびＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質を発現する第４の発現カセット、
を含む、組換えＭＶＡである。
【００８１】
本発明に従う組換え体ウイルスは、防御免疫応答を誘発し得る。「防御免疫応答」という用語は、ワクチン接種した被検体が、それに対してワクチン接種が行われた病原体による感染を、何らかの方法で制御することができることを意味する。通常、「防御免疫応答」を生じた動物は、ワクチン接種を受けていない被検体よりも軽度の臨床症状を生じ、疾患の進行は減速する。
【００８２】
本発明は、上に定義されるような組換えＭＶＡを含む、さらに薬学的組成物またはワクチン、および随意に薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、および／または添加剤に関する。
【００８３】
ポックスウイルス製剤を調製するための多数の方法、ならびに保管モードは、熟練者に知られている。本文脈において、第ＷＯ０３０５３４６３号が参照される。
【００８４】
補助物質の非限定例は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤、または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、保存剤、安定剤等である。適切な担体は、通常、大きく代謝の遅い分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、脂質会合体等から成る群から選択される。
【００８５】
ワクチンを調製する場合、本発明に従う組換えＭＶＡウイルスは、生理学的に許容される形態に変換される。これは、天然痘の予防接種に用いられるポックスウイルスワクチン（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら［１９７４］Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２に記載されているもの）を調製する際の経験に基づいて行うことができる。例えば、精製ウイルスは、５×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で１０ｍＭトリス、１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に製剤化して、−８０℃で保存する。
【００８６】
一実施形態において、ワクチン注射剤を精製するために、本発明に記載のＭＶＡウイルスを使用する。例えば、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００ｍＬ中のウイルス粒子約１０２〜約１０８個を、アンプル（好ましくはガラスアンプル）中で凍結乾燥する。別の非限定例において、ワクチン注射剤は、製剤中のウイルスの段階的な凍結乾燥によって生成する。ある実施形態において、この製剤は、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドンなどの追加の添加剤、または、生体内投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などの他の酸を含むことができる。その場合、このガラスアンプルを封印して、４℃〜室温で数ヶ月間保存することができる。しかしながら、即時の必要がない限り、アンプルは−２０℃未満の温度で保存することが好ましい。
【００８７】
ワクチン接種または治療を行うには、凍結乾燥物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解し、それを全身的または局所的に、すなわち非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、または当業者に知られる他の任意の投与経路のいずれかによって、投与されてもよい。当業者であれば、投与様式、投与量および投与回数を、既知の方法で最適化することができる。しかしながら、最も一般的に、患者は、１回目のワクチン接種から約１ヶ月〜６週間後に２回目のワクチン接種を受ける。３回目およびそれ以降の接種は、前回の接種から好ましくは４〜１２週間後に行うことができる。
【００８８】
驚くべきことに、本発明の組換えＭＶＡを用いて、強力な抗原特異的Ｔ細胞応答は、組換え技術によって発現されたＨＩＶタンパク質の１つ以上に対して、誘発され得ることが分かった。既に前述のとおり、認められた免疫優勢と呼ばれる現象を考慮すると、これは予期せぬ結果であり、それによって宿主免疫系は、指定の免疫原中の多数の可能なエピトープのいくつかに対してのみに応答する。ＭＶＡベクターに関して、以前の研究は、非組換えベクターエピトープの免疫優勢が、組換え抗原に対する強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答の誘発を阻止することを示した（Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｐｏｘｖｉｒａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：８４３１−８４３７，２００５．）。ワクチン駆動型Ｔ細胞応答は、主にポックスウイルスエピトープに対して配向されることを立証した。対照的に、本発明の組換えＭＶＡの使用は、強力かつ広域のＴ細胞応答をもたらし、組換えＨＩＶタンパク質を増殖させた。さらに、免疫応答は、応答を誘発したすべてのＨＩＶタンパク質に対して１回目の免疫付与を受けてから２０週間後も、依然としてベースラインよりも高かった。これは、天然痘に対する早期ワクチン接種および抗体中和の進行に起因する、骨格ウイルスベクターに対する潜在的な既存の免疫を考慮すると、さらに予期せぬ結果である。
【００８９】
したがって、本発明は、さらに、ヒト患者において、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つのＨＩＶタンパク質に対するＴ細胞応答を誘発するために、上に定義されるような組換えＭＶＡ、または上に定義されるような組換えＭＶＡを含む薬学的組成物もしくはワクチンに関し、タンパク質は、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される。
【００９０】
本発明は、ヒト患者において、１つ以上のＨＩＶタンパク質に対して、特に３、４、５、６つ、またはそれ以上のＨＩＶタンパク質に対して、好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのＨＩＶタンパク質に対して、Ｔ細胞応答を誘発するための薬剤を調製するために、上に定義されるような組換えＭＶＡ、または上に定義されるような組換えＭＶＡを含む薬学的組成物またはワクチンの使用にも関し、タンパク質は、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される。
【００９１】
同様に、本発明は、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発するための方法にも関し、上に定義されるような組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を投与することを含む。
【００９２】
投与される組換えＭＶＡは、好ましくは、それが所望の効果、すなわち、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質の少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つ、さらにより好ましくは少なくとも６つに対するＴ細胞応答を誘発するために有効な量である。
【００９３】
特定の好適な実施形態において、本発明は、上に定義されるような組換えＭＶＡに関し、ＭＶＡは、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも４つに対してＴ細胞応答を誘発する。
【００９４】
より特定の好適な実施形態において、本発明は、上に定義されるような組換えＭＶＡに関し、ＭＶＡは、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも５つに対するＴ細胞応答を誘発する。
【００９５】
さらにより特定の好適な実施形態において、本発明は、上に定義されるような組換えＭＶＡに関し、ＭＶＡは、ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも６つに対するＴ細胞応答を誘発する。
【００９６】
好適な実施形態において、本明細書において定義されるようなＭＶＡが、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるタンパク質に対してＴ細胞応答を誘発するＨＩＶ−１タンパク質には、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆが含まれる。
【００９７】
好適な実施形態において、当該少なくとも３つのＨＩＶタンパク質は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆである。別の好適な実施形態において、当該３つのＨＩＶタンパク質の１つは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、切断されたＮｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、およびＲｅｆから成る群から選択されるものである。
【００９８】
本発明は、さらに、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための、上に定義されるような組換えＭＶＡ、もしくは上に定義されるような組換えＭＶＡを含む薬学的組成物またはワクチンに関する。
【００９９】
本発明は、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための薬剤を調製するための、上に定義されるような組換えＭＶＡ、もしくは上に定義されるような組換えＭＶＡを含む薬学的組成物またはワクチンの使用にも関する。
【０１００】
「ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの予防」という用語は、組換えＭＶＡが、あらゆる条件下、あらゆる被検体においてＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳを予防することを意味しないことが指摘される。反対に、本用語は、この予防効果がむしろ低い場合であっても、あらゆる統計的に有意な予防効果を網羅する。
【０１０１】
さらに好適な実施形態において、組換えＭＶＡは、１０５〜５ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量、好ましくは２ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量で投与される。
【０１０２】
別の好適な実施形態において、組換えＭＶＡは、静脈内、筋肉内、または皮下的に投与される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】８つのＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆを発現する、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＭＡＧ構成物（ＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂ）。
【図２】ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答率。ｎ（応答者である被検体の数）から計算され、群サイズＮ＝１５に基づく応答率。ＲＴ＝逆転写酵素、ＣＴＬ＝細胞毒性Ｔリンパ球、ＨＴＬ＝ヘルパーＴリンパ球。
【図３Ａ】指示されるＨＩＶ−１タンパク質の中央ＳＦＵ／１ｘ１０６ＰＢＭＣ。矢印はワクチン接種を示す。
【図３Ｂ】指示されるＨＩＶ−１タンパク質の中央ＳＦＵ／１ｘ１０６ＰＢＭＣ。矢印はワクチン接種を示す。
【図３Ｃ】指示されるＨＩＶ−１タンパク質の中央ＳＦＵ／１ｘ１０６ＰＢＭＣ。矢印はワクチン接種を示す。
【図３Ｄ】指示されるＨＩＶ−１タンパク質の中央ＳＦＵ／１ｘ１０６ＰＢＭＣ。矢印はワクチン接種を示す。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例は、本発明をさらに説明する。提供される実施例は、いかなる方法においても、本発明によって提供される技術の適用性を本実施例に限定する方法で解釈され得ないことは、当業者によって十分に理解されるであろう。
【実施例１】
【０１０５】
ウイルスゲノム中に、切断されたｎｅｆ遺伝子、ｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子、トランスドミナントＴａｔ遺伝子、およびＶｉｆ−Ｖｐｒ−Ｖｐｕ−Ｒｅｖ遺伝子を含む、組換えＭＶＡ−ＢＮの、それぞれＡＴＩプロモーターの制御下での生成
【０１０６】
ＭＶＡベクター、ｍＢＮ８７は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５０１，１２７号に記載されるように生成した。つまり、ｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子は、ＨＸＢ２感染細胞のＤＮＡからのＰＣＲによって得た。ｎｅｆ遺伝子をＭＶＡ−ｎｅｆ（ＬＡＩ）のＤＮＡからのＰＣＲによって増殖させて、切断バージョンを得た。最初の１９アミノ酸を欠失させてＮｅｆ切断をもたらした。ｖｉｆおよびｖｐｕ遺伝子は、一次分離体ＭｖＰ−８９９のＨＩＶ ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによって生成したが、ｖｐｒ、ｒｅｖ、およびｔａｔ遺伝子は、ＨＸＢ２の配列に基づくオリゴアニーリングによって合成した。タンパク質Ｔａｔ変異は、Ｔａｔにおいて、重要なエピトープには局在しないが、トランス活性化能の喪失をもたらす、２つの変異を誘発することによって形成した。変異は、以下の置換基：２２（Ｃｙｓ＞Ｇｌｙ）および３７（Ｃｙｓ＞Ｓｅｒ）である。ＤＮＡ構成体は、組換えベクターにクローン化した。
【０１０７】
５回のプラーク精製後、外来ＤＮＡ（切断ｎｅｆ遺伝子、ｇａｇ−ｐｏｌ融合遺伝子、トランスドミナントｔａｔ遺伝子、およびｖｉｆ−ｖｐｒ−ｖｐｕ−ｒｅｖ融合遺伝子）の挿入および野生型ウイルスの非存在は、ＰＣＲによって確認した。得られる組換えウイルスクローンは、ｍＢＮ８７Ａと命名した。非選択的条件下で５回プラーク精製した後、選択カセットを欠いている組換えウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ８７Ｂを分離することができた。組換えベクターの識別は、標準方法によって確認した。
【０１０８】
ＭＶＡ−ｍＢＮ８７Ｂにおいて、ｖｉｆ−ｖｐｒ−ｖｐｕ−ｒｅｖ遺伝子は、末端に終止コドンを持たず、３１の非特異的アミノ酸の追加をもたらす。したがって、新しい組換えウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂをクローン化することによって、終止コドンを融合遺伝子に追加した。本構成体（図１も参照）は、マウスの前臨床研究およびヒトの臨床研究で使用した。
【実施例２】
【０１０９】
マウスの前臨床研究
ＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂが、成体非遺伝子導入マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）において、ＨＩＶ特異的細胞免疫応答を付載することができるか否かを調査した。最も有望なエピトープを選択し、各タンパク質に対して、２つのＣＤ４および２つのＣＤ８ Ｔ細胞エピトープを合成した。
【０１１０】
０日目および２１日目に、５００μｌのＴＢＳ（１群）を対照項目として、または約４ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０ ＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂ（２群）のいずれかをマウスに皮下投与（ｓ．ｃ．）した。３５日目に、眼窩後穿孔によって、すべての動物から血液試料を採取し、可能性のある今後の分析のために、血清に処理した。血液試料の採取に続いて、頸椎脱臼によって動物を犠牲死させ、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、ワクチン挿入物中でコードされるＨＩＶ特異的ペプチドを用いて脾臓細胞を再刺激することによって、細胞免疫応答を後に分析するために脾臓を壊死させた。
【０１１１】
ＨＩＶタンパク質特異的細胞免疫応答は、特異的ペプチドを用いる脾臓細胞の再刺激、およびＥＬＩＳｐｏｔアッセイによる脾臓細胞からのＩＦＮγ放出の後次検出によって決定した。ペプチドは、以下のように、ペプチド名、Ｔ細胞制限、およびペプチド配列を示す。
Ｎｅｆ−１ ＣＤ４ ＦＨＨＶＡＲＥＬＨＰＥＹＦＫＮＣ（配列番号１）
Ｎｅｆ−２ ＣＤ４ ＤＰＥＲＥＶＬＥＷＲＦＤＳＲＬＡ（配列番号２）
Ｎｅｆ−３ ＣＤ８ ＨＴＱＧＹＦＤＰ（配列番号３）
Ｎｅｆ−４ ＣＤ８ ＲＹＰＬＴＦＧＷＣ（配列番号４）
Ｇａｇ−１ ＣＤ４ ＩＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫ（配列番号５）
Ｇａｇ−２ ＣＤ４ ＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳＰＴ（配列番号６）
Ｇａｇ−３ ＣＤ８ ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（配列番号７）
Ｇａｇ−４ ＣＤ８ ＥＩＹＫＲＷＩＩＬ（配列番号８）
Ｐｏｌ−１ ＣＤ４ ＶＱＮＡＮＰＤＣＫ（配列番号９）
Ｐｏｌ−２ ＣＤ４ ＴＩＫＩＧＧＱＬＫ（配列番号１０）
Ｐｏｌ−３ ＣＤ８ ＩＦＱＳＳＭＴＫＩ（配列番号１１）
Ｐｏｌ−４ ＣＤ８ ＱＰＤＫＳＥＳＥＬ（配列番号１２）
Ｔａｔ−１ ＣＤ４ ＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫ（配列番号１３）
Ｔａｔ−２ ＣＤ４ ＲＱＲＲＲＡＨＱＮ（配列番号１４）
Ｔａｔ−３ ＣＤ８ ＱＰＫＴＡＧＴＮＣ（配列番号１５）
Ｔａｔ−４ ＣＤ８ ＳＦＩＴＫＡＬＧＩ（配列番号１６）
Ｖｉｆ−１ ＣＤ４ ＫＫＡＫＧＷＭＹＫ（配列番号１７）
Ｖｉｆ−２ ＣＤ４ ＲＣＥＹＱＡＧＨＮ（配列番号１８）
Ｖｉｆ−３ ＣＤ８ ＱＹＬＡＬＡＡＬＩ（配列番号１９）
Ｖｉｆ−４ ＣＤ８ ＡＧＨＮＫＶＧＳＬ（配列番号２０）
Ｖｐｕ−１ ＣＤ４ ＫＰＱＫＴＫＧＨＲ（配列番号２１）
Ｖｐｕ−２ ＣＤ４ ＷＡＧＶＥＡＩＩＲ（配列番号２２）
Ｖｐｕ−３ ＣＤ８ ＴＹＧＤＴＷＡＧＶ（配列番号２３）
Ｖｐｕ−４ ＣＤ８ ＡＧＶＥＡＩＩＲＩ（配列番号２４）
Ｖｐｒ−１ ＣＤ４ ＩＶＬＩＥＹＲＫＩ（配列番号２５）
Ｖｐｒ−２ ＣＤ４ ＥＥＡＬＡＡＬＶＤ（配列番号２６）
Ｖｐｒ−３ ＣＤ８ ＴＱＰＩＰＩＶＡＩ（配列番号２７）
Ｖｐｒ−４ ＣＤ８ ＶＬＩＥＹＲＫＩＬ（配列番号２８）
Ｒｅｖ−１ ＣＤ４ ＲＱＡＲＲＮＲＲＲ（配列番号２９）
Ｒｅｖ−２ ＣＤ４ ＳＰＱＩＬＶＥＳＰ（配列番号３０）
Ｒｅｖ−３ ＣＤ８ ＳＧＤＳＤＥＥＬＩ（配列番号３１）
Ｒｅｖ−４ ＣＤ８ ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ（配列番号３２）
【０１１２】
つまり、５００μｇの各ペプチドを含有するアリコートは、最初に少量のジメチルスルホキシド中に溶解し、続いてＲＰＭＩ媒体でさらに希釈することによって、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液を得た（ペプチド＃４、１４、２０、および２１の完全再構成を保証するには、追加で容量５〜２５μｌの酢酸が必要であり、ペプチド＃２０、２２、２３、および２４の完全再構成を保証するには、追加で５〜２５μｌが必要であった）。
【０１１３】
脾臓均質化は、「Ｓａｍ０３」プログラムを使用して、ディスポミック管内で行った。均質化に続いて、細胞懸濁液を５０ｍｌ管に写し、遠心分離して、赤血球を赤血球溶解緩衝液で５分間溶解した。２回の洗浄ステップに続いて、小アリコートの細胞懸濁液をトリパンブルーと混合し、血球計算盤（Ｍａｄａｕｓ製）を用いて手動計数することによって細胞濃度を計算した。細胞密度は、個々の脾臓細胞懸濁液に対して調整した。細胞をＥＬＩＳｐｏｔプレート（抗ＩＦＮ−γ抗体でプレコートされた）に載せた後、ペプチドを最終濃度２．５μｇ／ｍｌで添加した。水平に配向されたＥＬＩＳｐｏｔプレート上で、水平に載置される異なるマウスからの脾臓細胞、および垂直に開始される異なる刺激を用いて、脾臓細胞２．５ｘ１０５個／ウェルの重複培養を行った（すなわち、それぞれペプチド＃１−８、９−１６、１７−２４、２５−３２を用いるプレート１＋５、２＋６、３＋７、４＋８被膜刺激）。プレート５および１０上で、最終濃度０．５μｇのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）および０．５μｇ／ｍｌブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）を陽性対照として、または培地対照を陰性対照として用いるインキュベーションは、それぞれ列番号Ｂ、Ｅ、またはＨにおいて行った。１９時間の一晩のインキュベーションに続いて、サプライヤーによって推奨されるように、ＥＬＩＳｐｏｔプレートを開発した。
【０１１４】
【表１】
ｎ．ａ． ＝ 該当なし
【０１１５】
ＨＩＶ特異的細胞応答を開始することができる、３つのペプチドを識別した。これらのペプチドから、Ｈ２−Ｋｄ制限されるＣＤ８ Ｔ細胞特異的ペプチド「Ｇａｇ−ＣＤ８−１」を用いる刺激に続いて、最高のＩＦＮ１応答を決定した。このペプチドは、頻繁に文献に引用されているため、これは驚くことではない（例えば、Ｌｉｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６，２４，ページ３３３２）。第２のＧａｇ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞制限されるペプチド「Ｇａｇ−ＣＤ８−２」は、すべてのマウスにおいて、良好な特異的ＩＦＮ１放出を誘発することもできた。このペプチドは、今のところＳｈｉｎｏｄａらによって、長いペプチドの文脈において、特異的なＣＴＬ応答を誘発することが説明されているに過ぎない（Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４，２２，ページ３６７６）。しかしながら、文献に記載されている長いペプチドは、ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープのみならず、追加の予測可能な（およびしたがって潜在的な）ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞エピトープを含有する。したがって、最初に、「Ｇａｇ−ＣＤ８−２」が、特異的ＩＦＮ１放出を誘発することができることを示す。エピトープ予測に基づいて、「Ｇａｇ−ＣＤ８−２」は、Ｈ２−Ｄｄ制限されるＣＤ８ Ｔ細胞エピトープである。第３の応答性ペプチド「Ｎｅｆ−ＣＤ４−２」は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの大部分において、特異的なＩＦＮ１の放出を誘発することができた。このペプチドは、Ｍｉｔｃｈｅｌらによって（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１９９２，８，ページ４６９）、それに対する増殖応答および細胞溶解活性を決定することができるペプチドとして説明されている。エピトープの予測から、このペプチドは、主にＣＤ４ Ｔ細胞に制限されるとして識別された（ＰｒｅｄＢＡＬＢ／Ｃデータベースにおいて、Ｉ−Ｅｄ分子の場合スコア９．６、およびＩＡｄ分子の場合９．１が識別されたが、ＣＤ８ Ｔ細胞制限されるＨ２ｄ分子のスコアは、７．９未満であった）。驚くべきことに、公開済みの文献に基づいて選択された３つの応答性ペプチド以外のペプチド、例えば、「Ｎｅｆ−ＣＤ４−１」または「Ｔａｔ−ＣＤ８−１」は、特異的なＩＦＮ１放出を誘発できることが認められなかった。この矛盾の理由は不明である。
【０１１６】
要するに、ＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂを用いるＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫原性研究は、ＨＩＶ−多抗原ＭＶＡ構成体が免疫原性であることが立証されただけでなく、免疫応答が、組換えＭＶＡ生成物においてコードされる少なくとも２つのタンパク質に対して配向されること（すなわち、ＮｅｆおよびＧａｇ特異的応答が検出された）、ＣＤ８ Ｔ細胞制限される免疫応答が、単一のＣＤ８ Ｔ細胞分子に限定されないこと（Ｈ２−ＫｄおよびＨ２−Ｄｄ応答の両方が誘発されるため）、およびＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞制限される応答の両方が、ＭＶＡ−構成体によって誘発されたことも明らかとなった。さらに、これらの結果は、少なくともＮｅｆ−遺伝子およびＧａｇ−遺伝子が、生体内でベクターから発現されることを示す。
【実施例３】
【０１１７】
ヒトの臨床研究
第Ｉ相研究において、ＨＩＶ−１クレードＢサブグループ（ｇａｇ−ｐｏｌ融合、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、ｔａｔ、およびｎｅｆを含む）から９つの遺伝子の８つを発現する、組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）ワクチンの安全性、応答原性、および免疫原性を、１５名のＨＩＶ−１感染被検体において評価した。この安全性試験は、応答型および非応答型の局所性および全身性の譜作用応答の分析を包含した。さらに、ベクターに対する細胞性および血液性免疫応答を評価した。また収集した標本を使用して、異なるＨＩＶ抗原に対する広域細胞媒介応答を誘発するように、そのような相同性プライムブーストワクチンアプローチの可能性を確立するために、研究ワクチンＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂによって誘発される、ＨＩＶ特異的免疫応答を特異的に分析するアッセイも開発した。
【０１１８】
この第Ｉ相試験において、ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法）において安定している、ＣＤ４数が３５０／μｌを超える１５名のＨＩＶ−１感染患者は、０、４、および１２週目に２ｘ１０８ ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＭＡＧのワクチン接種を３回受けた。応答型副作用（ＡＥ）は日誌カードに記録し、非応答型ＡＥと心臓兆候および症状は、２０週目のフォローアップ訪問まで、研究を通して記録した。患者の血清ＨＩウイルス負荷およびＣＤ４数等の疾患特異的パラメータを決定した。ワクシニア特異的血液免疫応答は、ＥＬＩＳＡにより測定され、ＨＩＶ−１挿入ならびにワクシニアに対する細胞免疫応答は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、（ＨＩＶ応答を誘発するための）刺激剤として、１１個のアミノ酸重複を有する１５−ｍｅｒペプチド、およびＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）を、バッチ分析においてそれぞれ１（ワクシニア応答を誘発するための）の感染の多重度で使用して評価した。
【０１１９】
研究は、ＣＤ４数が３５０細胞／μｌを超えるＨＩＶ感染被検体において、組換えＭＶＡ ＨＩＶ多抗原ワクチンの安全性および応答原性を評価するために行われる、単一中心、非盲検の第Ｉ相研究であった。
【０１２０】
被検体は、０日目、ならびに４週間および１２週間後に、２ｘ１０８ 組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）ＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂの用量で、免疫付与を受けた。ワクチンは、皮下投与された。
【０１２１】
研究は、最長３週間のスクリーニング期間と、最長２０週間の活動研究期間（１２週間のプライム相および８週間のブースト相）とで構成される。被検体当たりの研究の総期間は、最長２３週間であった。
【０１２２】
適格な被検体は、訪問１で開始する活動研究相に入った。訪問１において、すべての被検体は、皮下投与される１回目のＭＶＡ−ＢＮ１２０Ｂワクチン接種を受けた。４週間後の訪問３において、すべての被検体は、２回目のワクチン接種を受け、（訪問１から）１２週間後の訪問５において、３回目のワクチン接種を受けた。各免疫付与は、それぞれ１回の投与当たり１ｘ１０８ ＴＣＩＤ５０の用量で、２回のＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂの投与で構成された。ワクチンは、０．５ｍｌのＭＶＡ−ｍＢＮ１２０Ｂを、各腕の三角筋領域に注入することによって、皮下投与された。被検体は、１回目は０週目、４週間後に１回、および１２週間後に１回の３回の免疫付与を受けた。ワクチン接種中または後に起こったあらゆる副作用（ＡＥ）を記録した。
【０１２３】
以下の手順および調査は、それぞれの予定された訪問時に行った。凍結保存末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）生成細胞の定量的管内決定に使用される、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイは、生きたワクシニアウイルス（ＶＶ）：修飾ワクシニアウイルスアンカラ−Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ（ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標））またはワクシニアウイルス−ウエスタンリザーブ（ＶＶ−ＷＲ）を用いる刺激後に行った。
【０１２４】
つまり、９６ウェルフィルタープレート（ＨＴＳプレート、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、捕捉抗体（製造者の指示に従って、ＩＦＮ−γに対する（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ対）を用いて、４℃で一晩コーティングした。続いて、蘇生したＰＢＭＣを、１のＭＯＩにおいて、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）と組み合わせて、２００，０００細胞／２００μｌ最終用量の濃度でウェルに添加した。インキュベーション期間後（３７℃／５％ ＣＯ２で一晩）、ウェルを洗浄し、ＰＢＳ／９％ＦＣＳ中のビオチン標識された検出抗体を添加した。ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ストレプトアビジン結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をウェルに添加し、続いて洗浄ステップおよび沈殿物質（ＡＥＣ、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加を行った。サイトカイン生成細胞の数は、ＣＴＬ Ｓ５マイクロアナライザーを使用して、スポットを計数することにより決定した。報告される値は、バックグラウンド補正され、１ｘ１０６ ＰＢＭＣに標準化した。
【０１２５】
ワクシニア特異的細胞応答を評価するために、１のＭＯＩにおいて、細胞を生きたＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）で刺激した。
【０１２６】
ＨＩＶ特異的細胞応答を評価するために、細胞をペプチドプール（１１アミノ酸重複を持つ１５−ｍｅｒ）を用いて、ペプチド当たり５μｇ／ｍｌの最終濃度で刺激した。
【０１２７】
１５のペプチドプールが刺激に使用され、表２に表される。
【表２】
【０１２８】
高性能液体クロマトグラフィによって確認されるように、ペプチドを９０％を超える純度で合成した（Ｍｅｔａｂｉｏｎ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ，ＵＫ）。
【０１２９】
ベクターまたはＨＩＶ−ＭＡＧ特異的シグナルは、バックグラウンド補正後、１ｘ１０６細胞当たり少なくとも５０ＳＦＵの頻度で定義した（ＳＦＵ／１ｘ１０６非刺激細胞の控除／バックグラウンドの２倍以上）。バックグラウンド補正後のＳＦＵ／１ｘ１０６細胞の数を報告した。
【０１３０】
ベクターまたはＨＩＶ−ＭＡＧ特異的Ｔ細胞応答は、ベースラインにおいてシグナルを持たない被検体におけるシグナルの発生、またはベースラインにおいてシグナルを持つ被検体における、ベースライン値を超える少なくとも１．７倍の相対増加のいずれかとして定義された。
【０１３１】
１回以上のポストベースライン訪問において応答を示した被検体は、応答者として分類した。
【０１３２】
特異的なシグナルは、バックグラウンド（非刺激）ウェルにおけるスポット形成細胞の数を、対応する実験（刺激）ウェルにおいて出現するものから控除することによって定義した（各被検体、訪問、および刺激条件に対して）。５０個未満のスポット形成単位（ＳＦＵ）の特異的シグナルは、応答を計算するためにゼロに戻した。
【０１３３】
陽性の特異的応答は、ベースライン（Ｖ１）において、以前はアッセイカットオフ未満であった被検体において、１ｘ１０６ＰＢＭＣ当たり５０ＳＦＵのアッセイカットオフに等しいか、またはそれを超える陽性の特異的シグナルの出現がある場合、またはアッセイカットオフ値に等しいか、またはそれを超えるベースライン（Ｖ１）シグナルを持つ被検体のベースライン（Ｖ１）シグナルから、少なくとも１．７倍のＳＦＵ数の上昇がある場合のいずれかに定義した。そうでなければ、それぞれのポストベースラインまたはベースライン値のいずれかが欠失していた場合を除いて、応答を負として定義し、次に応答状態を欠失として定義した。
【０１３４】
被検体は、複数のポストベースライン訪問に渡って、複数の応答を持ち得たが、１つの応答のみが、特異的な応答者として考慮される必要があった。
【０１３５】
ＨＩＶペプチド刺激は、すべての被検体に対して３つのレベルで、ならびに応答者のみに別個の分析で、刺激プール別（１−１５）、タンパク質／ポリタンパク質別（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｉｆ、混合）、およびワクチン別（すなわち、すべてのＨＩＶタンパク質を含む）に分析した。
【０１３６】
記述統計は、刺激状態（ＨＩＶ−ＭＡＧペプチドおよび生きたＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）による刺激を含む）によって、すべての試料採取時に得られ、観察回数、算術平均、および標準偏差（ＳＤ）、ＳＦＵの数の中間値および範囲を含む。これは、すべての被検体に行い、分析の３つのレベルすべてにおいて、応答者のみに別個の分析を行った（すなわち、プールレベルの応答者、タンパク質／ポリタンパク質レベルの応答者、およびワクチンレベルの応答者に対して）。
【０１３７】
９５％クロッパー−ピアソン信頼区間に沿って、陽性の特異的応答者（応答者率）の数およびパーセンテージを、各プール、各タンパク質／ポリタンパク質、および全体ＨＩＶ−ＭＡＧワクチン、ならびにＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）に対して一覧にした。パーセンテージは、特定の分析に含まれる被検体の数に基づいて計算した。被検体は、応答者と見なされるには、タンパク質／ポリタンパク質およびワクチンレベルにおいて、１つのポールに応答すればよい。１つのみに刺激条件（ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）による刺激）を使用して試験した、ベクター特異的応答者率に対しても同様であった。
【０１３８】
ＨＩＶ特異的応答の幅は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、および６つのタンパク質／ポリタンパク質に対して応答を持つ被検体の数、以下のカテゴリーを使用して、被検体のタンパク質／ポリタンパク質応答の累積描写によって表した。
【０１３９】
ＥＬＩＳＰＯＴによって決定されるようなワクチン接種に先立って、被検体の８７％が、ｇａｇに対して、６０％がｎｅｆに対して、５３％がＣＴＬエピトープに対して、４０％が混合タンパク質およびＨＴＬエピトープに対して、３３％がｐｏｌに対して、７％のみがｔａｔおよびｖｉｆに対して細胞免疫応答を生じた。
【０１４０】
各ペプチドプール、タンパク質／ポリタンパク質、およびＨＩＶワクチン（ＨＩＶ−ＭＡＧ）の応答者率は、表３に要約され、応答が検出された時点も明らかにする。応答者を定義するための単一の応答の使用は、ＳＡＰにおいて定義され、応答を審査するための高感度方法であるが、この方法は、より高い偽陽性率の傾向があり得る。この理由で、より厳密性の高い応答者の定義を使用して補足分析を行ったところ、２つの応答を応答者として定義する必要がある。
【０１４１】
図２にも示されるように、新しい応答またはベースライン値よりも増加した応答が、ワクチン−ベクター内でコードされるＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）、ＨＩＶタンパク質に対して高く、被検体の８７％（１３／１５）が応答したことを暗示する。より厳密性の高い応答者の定義を使用する場合でも、被検体の８０％が、ＨＩＶ成分に対する応答者であった。最高比率の被検体がｇａｇに応答した（７３％、１１／１５、図２を参照）。ｇａｇ内で、ｐ２４は、ｐ１７（２０％）よりも高い応答者率をもたらした（２つのｇａｇ−ｐプール２４に対してそれぞれ４０％および４７％）。より厳密性の高い応答者の定義を使用する場合でも、被検体の６０％がｇａｇに応答した。ｐｏｌおよび混合タンパク質プールに対する応答者率は類似し（５３％、８／１５、図２も参照）、ｐｏｌ内で、プロテアーゼおよびＲＴは、最高かつ等しい応答者率（２７％）を有し、２０％の応答者率を持つインテグラーゼが続いた。混合プールは、複数のタンパク質からのペプチドを含有するため、最も免疫原性の高いペプチドを決定することができなかった。より厳密性の高い応答者率の定義を使用する場合でも、依然として、ｐｏｌ（３３％）および混合（４０％）の両方に対して高い応答者率をもたらした。Ｎｅｆ応答者率は、４０％であり（６／１５、図２を参照）、プール４に対する応答は最高であった（２７％）。より厳密性の高い応答者率の定義を使用すると、Ｎｅｆ応答は、２７％であった。計７名の被検体（４６．７％）および１名の被検体（６．７％）が、ＨＴＬおよびＣＴＬポリトープペプチドに対して応答し、ＴａｔおよびＶｉｆの両方に対する応答者は検出されなかった。
【０１４２】
【表３】
【０１４３】
ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答の幅は、被検体が新規または増加したＴ細胞応答を生じたタンパク質／ポリタンパク質の数を表す。表４は、ＨＩＶタンパク質に対する応答の幅を示す。ワクチン付与は、大部分の被検体において、いくつかのタンパク質に対する応答の生成をもたらした。ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、および混合（ｐ２ｐ７、ｖｐｒ、ｅｒｖ）を含む、最大４つの異なるタンパク質／ポリタンパク質に対する応答は、表４に示される。すべての被検体の６６．７％が、少なくとも２つのタンパク質／ポリタンパク質に対して、４６．７％ が少なくとも３つのタンパク質／ポリタンパク質に対して応答した。
【０１４４】
【表４】
Ｎ＝指定群の被検体数、Ｒ＋＝上述されるいずれかのタンパク質に対して応答した被検体の数、％＝Ｎに基づくパーセンテージ、９５％ ＣＩ＝クロッパー−ピアソン信頼区間、下限および上限
【０１４５】
１５名の被検体すべてが３回のワクチン接種を受け、研究の終了までフォローアップされた。重篤なＡＥは報告されず、関連ＡＥのために離脱した研究被検体はいなかった。すべての被検体は、あるグレード３の事象（注入部位の疼痛）を伴う、全身応答（主に吐き気）および局所応答（主に硬化）を報告した。したがって、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＭＡＧの投与は、ＨＩＶ−１に感染した被検体において良好な耐容性を示した。
【０１４６】
すべての被検体がワクシニアに応答した。図４Ａ〜Ｄは、指定のＨＩＶ−１タンパク質の中央値ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣを立証した。結果は、以下のように要約され得る。
【０１４７】
Ｇａｇ応答者（１１／１５被検体）：４３７ ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣの中央値ピークは、３回目の免疫付与から１週間後の１３週目。
【０１４８】
Ｐｏｌ応答者（８／１５被検体）：８０ ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣの中央値ピークは、３回目の免疫付与から１週間後の１３週目。
【０１４９】
Ｎｅｆ応答者（６／１５被検体）：２７６ ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣの中央値ピークは、２回目の免疫付与から８週間後の１２週目。
【０１５０】
混合プール（ｐ２ｐ７、ｖｐｒ、ｒｅｖ）応答者（８／１５被検体）：６５ ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣの中央値ピークは、２回目の免疫付与から８週間後の１２週目。
【０１５１】
Ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、および混合応答性ＩＦＮ−γ分泌ＰＢＭＣは、１回目の免疫付与から２０週後も、ベースラインより高いままであった。
【０１５２】
ワクシニア特異的応答者の中央ＳＦＵ値は、２回目の免疫付与から８週間後の１２週目にピークの３５０ ＳＦＵ／１ｘ１０６ ＰＢＭＣに到達し、３回目のワクチン接種後にさらに増加しなかった。ＨＩＶ応答に関して観察されるように、ワクシニア応答性ＩＦＮ−γ分泌ＰＢＭＣの数は、１回目の免疫付与から２０週後も、ベースラインより高いままであった。抗ワクシニア抗体血清変換率は、５週目（２回目のワクチン付与から１週間後）に１００．０％に到達し、研究期間中は１００％のままであった。ＥＬＩＳＡ ＧＭＴは、１回目のワクチン接種から１週間後にわずかな増加および強力なブースター応答を呈した。ワクシニア特異的抗体の力価は、３回目の免疫付与から１週間後にピークの８７６に到達し、１回目の免疫付与から２０週後も、ベースラインよりはるかに高いままであった。
【０１５３】
ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＭＡＧ ＨＩＶワクチン候補は、ＨＩＶ−１に感染した被検体において良好な耐容性を示した。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答率は、８６．７％であり、ワクシニア特異的応答率は、１００％であった。プール中の４つのＨＩＶタンパク質／ポリタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、および混合［ｐ２ｐ７−ｖｐｒ−ｒｅｖ］）に対する広域細胞免疫応答が認められ、全被検体の６６．７％が少なくとも２つ、４６．７％が少なくとも３つのＨＩＶ−１タンパク質／ポリタンパク質に応答した。Ｔ細胞応答の中央値は、応答を誘発したすべてのＨＩＶタンパク質に対して、第１回の免疫付与から２０週間後も、依然としてベースラインより高かった。これは、ワクシニア特異的Ｔ細胞応答についても当てはまる。したがって、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＭＡＧワクチンは、複数のＨＩＶ−１タンパク質、およびワクシニアに対する広域免疫応答を誘発することができ、応答は、第１回の免疫付与を受けてから２０週間後も、依然としてベースラインよりも高かった。
【０１５４】
本発明は、以下の項目も含む。
【０１５５】
１．ウイルスゲノム中に、薬剤またはワクチンとして使用するための、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも３つのＨＩＶタンパク質、および当該タンパク質の部分または誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを含む、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【０１５６】
２．ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、および当該タンパク質の部分または誘導体を発現するための１つ以上の発現カセットを含む、項目１に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【０１５７】
３．ＨＩＶタンパク質の部分が、対応する全長タンパク質の少なくとも１０個の連続アミノ酸を含むタンパク質である、項目１または２に記載の組換えＭＶＡ。
【０１５８】
４．ＨＩＶタンパク質の誘導体が、前記ＨＩＶ−１分離体ＨＸＢ２Ｒ（ＧｅｎｅＢａｎｋ悪セッション番号Ｋ０３４５５）において、前記それぞれのＨＩＶタンパク質に対して少なくとも５０％の相同性を示す、アミノ酸配列である、前記項目のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
【０１５９】
５．前記ＭＶＡゲノムは、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、およびＲｅｖを含む融合タンパク質をコードする発現カセット、Ｎｅｆをコードする発現カセット、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする発現カセット、およびＴａｔをコードする発現カセットを含む、前記項目のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
【０１６０】
６．Ｎｅｆが、Ｎ末端切断Ｎｅｆであり、かつ／またはＴａｔがトランスドミナントＴａｔである、前記項目のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
【０１６１】
７．ウイルスゲノム中に、
（ｉ）遺伝子間領域ＩＧＲ０７／０８に挿入される融合タンパク質として、Ｖｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを発現する、第１の発現カセットと、
（ｉｉ）最初の１９Ｎ−末端アミノ酸が欠失され、遺伝子間領域ＩＧＲＩ４Ｌ／Ｉ５Ｌに挿入されるＮｅｆタンパク質を発現する、第２の発現カセットと、
（ｉｉｉ）ＩＧＲ１３６／１３７に挿入される、トランスドミナントＴａｔを発現する第３の発現カセットと、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質を発現する第４の発現カセット、
を含む、前記項目のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
【０１６２】
８．項目１〜７のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、および薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、および／または添加剤を任意に含む、薬学的組成物またはワクチン。
【０１６３】
９．ヒト患者において、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも３つのＨＩＶタンパク質に対してＴ細胞応答を誘発するための、項目１〜７のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、もしくは項目８に記載の薬学的組成物またはワクチン。
【０１６４】
１０．ヒト患者において、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも３つのＨＩＶタンパク質に対してＴ細胞応答を誘発するために、薬剤を調製するための、項目１〜７のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、もしくは項目８に記載の薬学的組成物またはワクチンの使用。
【０１６５】
１１．項目９に記載の組換えＭＶＡ、薬学的組成物、またはワクチン、もしくは前記ＨＩＶタンパク質がＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆである、項目１０に記載の使用。
【０１６６】
１２．項目９に記載の組換えＭＶＡ、薬学的組成物、またはワクチン、もしくはＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される前記ＨＩＶタンパク質の少なくとも４つに対するＴ細胞応答を誘発するための、項目１０に記載の使用。
【０１６７】
１３．項目９〜１２のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、薬学的組成物、またはワクチン、もしくは前記ＨＩＶタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆに対するＴ細胞応答を誘発するための、項目１０または１２に記載の使用。
【０１６８】
１４．ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための項目１〜７のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、もしくは項目８に記載の薬学的組成物またはワクチンの使用。
【０１６９】
１５．ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための薬剤を調製するための、項目１〜７のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、もしくは項目８に記載の薬学的組成物またはワクチンの使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被検体においてＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対するＴ細胞応答を誘発する際に使用するために、ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、または対応する全長タンパク質の少なくとも１０個の連続アミノ酸を含むその一部、または前記タンパク質の誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含み、ＨＩＶタンパク質の前記アミノ酸配列の誘導体は、既知のＨＩＶ分離株中の前記それぞれのＨＩＶタンパク質の前記アミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の相同性を示すアミノ酸配列である、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項２】
前記ウイルスゲノムが、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、またはその一部、または前記タンパク質の誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、請求項１に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項３】
前記ウイルスゲノムは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される少なくとも８つのＨＩＶタンパク質、またはその一部、または前記タンパク質の誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、請求項１または２に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項４】
ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される前記ＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発するための薬剤またはワクチンの調製のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）の使用。
【請求項５】
ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される前記ＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発するための方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を投与することを含む、方法。
【請求項６】
前記ＭＶＡが、前記ヒト被検体において、前記ＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも４つに対してＴ細胞応答を誘発する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、請求項４に記載の使用、または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＶＡが、前記ヒト被検体において、前記ＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも５つに対するＴ細胞応答を誘発する、請求項１〜３および６のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、請求項４もしくは６に記載の使用、または請求項５もしくは６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＶＡが、前記ヒト被検体において、前記ＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも６つに対するＴ細胞応答を誘発する、請求項１〜３、６および７のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、請求項４、６および７のいずれか１項に記載の使用、または請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト被検体において、ＭＶＡがＴ細胞応答を誘発する前記ＨＩＶ−１タンパク質が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆを含む、請求項１〜３および６〜８のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、請求項４および６〜８のいずれか１項に記載の使用、または請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記被検体が、免疫不全である、請求項１〜３および６〜９のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、請求項４および６〜９のいずれか１項に記載の使用、または請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被検体が、ＨＩＶ−１に感染している、請求項１〜３および６〜１０のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、請求項４および６〜１０のいずれか１項に記載の使用、または請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記被検体が、３５０／μｌ未満のＣＤ４細胞数を有する、請求項１〜３および６〜１１のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、請求項４および６〜１１のいずれか１項に記載の使用、または請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＶＡゲノムは、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、およびＲｅｖを含む融合タンパク質をコードする発現カセットと、Ｎｅｆをコードする発現カセットと、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする発現カセットと、Ｔａｔをコードする発現カセット、を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項１４】
Ｎｅｆは、Ｎ末端が切断されたＮｅｆであり、かつ／または、Ｔａｔは、トランスドミナントＴａｔである、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項１５】
ウイルスゲノム中に、
（ｉ）融合タンパク質としてＶｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを発現し、遺伝子間領域ＩＧＲ０７／０８に挿入される、第１の発現カセットと、
（ｉｉ）最初の１９Ｎ末端アミノ酸が欠失しているＮｅｆタンパク質を発現し、ＩＧＲＩ４Ｌ／Ｉ５Ｌに挿入される、第２の発現カセットと、
（ｉｉｉ）ＩＧＲ１３６／１３７に挿入される、トランスドミナントＴａｔを発現する第３の発現カセットおよびＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質を発現する第４の発現カセット、
を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項１６】
任意に、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、および／または添加剤と一緒に投与される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項１７】
ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防において使用するための、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項１８】
ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための薬剤を調製するための、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡの使用、使用、または方法。
【請求項１９】
用量１０７〜１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌの前記組換えＭＶＡが、前記ヒト被検体に投与される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２０】
用量１０８〜１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌの前記組換えＭＶＡが、前記ヒト被検体に投与される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２１】
用量２ｘ１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの前記組換えＭＶＡが、前記ヒト被検体に投与される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２２】
前記組換えＭＶＡが、少なくとも３回投与される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２３】
前記組換え体ＭＶＡが、０、４、および１２週目に投与される、組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２４】
前記組換え体ＭＶＡが、ＭＶＡ−ＢＮである、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２５】
前記の請求項のいずれか１項に定義される組換えＭＶＡを含む薬学的組成物またはワクチン組成物。
【請求項１】
ヒト被検体においてＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択されるＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対するＴ細胞応答を誘発する際に使用するために、ウイルスゲノム中に、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される、少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、または対応する全長タンパク質の少なくとも１０個の連続アミノ酸を含むその一部、または前記タンパク質の誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含み、ＨＩＶタンパク質の前記アミノ酸配列の誘導体は、既知のＨＩＶ分離株中の前記それぞれのＨＩＶタンパク質の前記アミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の相同性を示すアミノ酸配列である、組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項２】
前記ウイルスゲノムが、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される少なくとも６つのＨＩＶタンパク質、またはその一部、または前記タンパク質の誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、請求項１に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項３】
前記ウイルスゲノムは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される少なくとも８つのＨＩＶタンパク質、またはその一部、または前記タンパク質の誘導体の発現のための１つ以上の発現カセットを含む、請求項１または２に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項４】
ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される前記ＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発するための薬剤またはワクチンの調製のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）の使用。
【請求項５】
ヒト被検体において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆから選択される前記ＨＩＶタンパク質の少なくとも３つに対してＴ細胞応答を誘発するための方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を投与することを含む、方法。
【請求項６】
前記ＭＶＡが、前記ヒト被検体において、前記ＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも４つに対してＴ細胞応答を誘発する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、請求項４に記載の使用、または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＶＡが、前記ヒト被検体において、前記ＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも５つに対するＴ細胞応答を誘発する、請求項１〜３および６のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、請求項４もしくは６に記載の使用、または請求項５もしくは６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＶＡが、前記ヒト被検体において、前記ＨＩＶ−１タンパク質の少なくとも６つに対するＴ細胞応答を誘発する、請求項１〜３、６および７のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、請求項４、６および７のいずれか１項に記載の使用、または請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト被検体において、ＭＶＡがＴ細胞応答を誘発する前記ＨＩＶ−１タンパク質が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆを含む、請求項１〜３および６〜８のいずれか１項に記載の組換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、請求項４および６〜８のいずれか１項に記載の使用、または請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記被検体が、免疫不全である、請求項１〜３および６〜９のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、請求項４および６〜９のいずれか１項に記載の使用、または請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被検体が、ＨＩＶ−１に感染している、請求項１〜３および６〜１０のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、請求項４および６〜１０のいずれか１項に記載の使用、または請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記被検体が、３５０／μｌ未満のＣＤ４細胞数を有する、請求項１〜３および６〜１１のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、請求項４および６〜１１のいずれか１項に記載の使用、または請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＶＡゲノムは、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、およびＲｅｖを含む融合タンパク質をコードする発現カセットと、Ｎｅｆをコードする発現カセットと、Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする発現カセットと、Ｔａｔをコードする発現カセット、を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項１４】
Ｎｅｆは、Ｎ末端が切断されたＮｅｆであり、かつ／または、Ｔａｔは、トランスドミナントＴａｔである、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項１５】
ウイルスゲノム中に、
（ｉ）融合タンパク質としてＶｉｆ−Ｖｐｕ−Ｖｐｒ−Ｒｅｖを発現し、遺伝子間領域ＩＧＲ０７／０８に挿入される、第１の発現カセットと、
（ｉｉ）最初の１９Ｎ末端アミノ酸が欠失しているＮｅｆタンパク質を発現し、ＩＧＲＩ４Ｌ／Ｉ５Ｌに挿入される、第２の発現カセットと、
（ｉｉｉ）ＩＧＲ１３６／１３７に挿入される、トランスドミナントＴａｔを発現する第３の発現カセットおよびＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質を発現する第４の発現カセット、
を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項１６】
任意に、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、および／または添加剤と一緒に投与される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ。
【請求項１７】
ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防において使用するための、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項１８】
ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療および／または予防のための薬剤を調製するための、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡの使用、使用、または方法。
【請求項１９】
用量１０７〜１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌの前記組換えＭＶＡが、前記ヒト被検体に投与される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２０】
用量１０８〜１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌの前記組換えＭＶＡが、前記ヒト被検体に投与される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２１】
用量２ｘ１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの前記組換えＭＶＡが、前記ヒト被検体に投与される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２２】
前記組換えＭＶＡが、少なくとも３回投与される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２３】
前記組換え体ＭＶＡが、０、４、および１２週目に投与される、組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２４】
前記組換え体ＭＶＡが、ＭＶＡ−ＢＮである、前記の請求項のいずれか１項に記載の組換えＭＶＡ、使用、または方法。
【請求項２５】
前記の請求項のいずれか１項に定義される組換えＭＶＡを含む薬学的組成物またはワクチン組成物。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【公表番号】特表２０１３−５０７１０７（Ｐ２０１３−５０７１０７Ａ）
【公表日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３２４８９（Ｐ２０１２−５３２４８９）
【出願日】平成２２年１０月６日（２０１０．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００６１１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４２１８０
【国際公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【出願人】（５０９２９６４４３）バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月６日（２０１０．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００６１１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４２１８０
【国際公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【出願人】（５０９２９６４４３）バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ (9)
【Ｆターム（参考）】
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