説明

ＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法

【課題】細胞自身のＲＮＡｉ機構を使用してＪＣウイルス中の遺伝子を選択的かつ効果的にサイレンシングする薬剤であって、高い生物活性と生体内安定性の両方を有し、ＪＣウイルス感染によって媒介される病理過程の治療に使用されるＪＣウイルスの複製を効果的に阻害できる薬剤を提供する。
【解決手段】本発明は、ＪＣウイルス遺伝子（ＪＣウイルスゲノム）の発現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）に関し、該ｄｓＲＮＡは、長さが３０ヌクレオチド未満、通常は長さが１９〜２５ヌクレオチドでＪＣウイルス遺伝子の少なくとも一部にほぼ相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む。本発明はまた、該ｄｓＲＮＡを医薬として許容可能な担体とともに含む医薬組成物；該医薬組成物を用いてＪＣウイルス発現を原因とする疾患を治療する方法；ならびに細胞内におけるＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制する方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびに、ＪＣウイルス遺伝子のう
ちの一つの発現を抑制するためのＲＮＡ干渉の仲介における該ｄｓＲＮＡの使用、および
ＪＣウイルス感染により媒介されるＰＭＬ等の病理学的プロセスを治療するための該ｄｓ
ＲＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願
本願は、２００６年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／７９５，９６５号
の利益を主張する。かかる出願の内容は、参照により全体が本願に組み込まれる。
【０００３】
発明の背景
進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）は、人の脳の膠細胞中に存在する潜在ポリオーマウ
イルスＪＣビールス（ＪＣＶ）とその生産複製物の再活性化によって生じる中枢神経系の
致命的な脱髄疾患である（非特許文献１）。ＰＭＬは、かつてはリンパ増殖性および骨髄
増殖性の疾患のために免疫系に障害を受けた患者で主として見られたかなり稀な疾患であ
ったが、ＡＩＤＳ患者の間では主要な神経疾患の１つとなっている（非特許文献２） 。
【０００４】
４〜８％のＡＩＤＳ患者がＰＭＬの徴候を示し、罹患した患者の脳脊髄液でＪＣＶが検
出されることが報告されており、これは脳でのウイルス複製が活発に起こっていることを
示している（（非特許文献１，３）。さらに、ＰＭＬは、インターフェロンと組み合わせ
て抗ＶＬＡ４抗体であるＴｓｙｂａｒｉによる実験的治療を受けた患者で最近観察された
。ＰＭＬの組織学的特徴には、乏枝神経膠細胞に拡大された好酸球のある多病巣性脱髄病
巣と、脳の束に分葉した多染色体核のある拡大された変形した星状細胞とが含まれる（非
特許文献２）が、場合によっては、孤立性パターンの脱髄と灰白質の関与を含む非定型な
特徴が報告されていることもある（非特許文献４）。インビトロでの細胞培養研究および
臨床サンプルでのＪＣＶのインビボ評価からの初期の知見によると、乏枝神経膠細胞と星
状細胞のみがウイルス感染の生成を指示する細胞であると早い時期に仮定された（非特許
文献５）。従って、分子的研究は、中枢神経系由来の細胞でのウイルス初期ゲノムの細胞
種に特異的な転写の証明する証拠を提供していた（非特許文献６）。しかしながら、後の
研究では、Ｂ細胞を含む非神経細胞における低いが検知できるレベルのＣＶ遺伝子発現と
、ヒトのいくつかの神経系および非神経系腫瘍細胞におけるウイルスの初期タンパク質の
高レベルの生産とが示された（非特許文献５，７）。
【０００５】
他のポリオーマウイルスと同様に、ＪＣＶは、そのゲノムが転写制御領域、ウイルス初
期タンパク質であるＴ抗原の発現を担う遺伝子、およびウイルス後期タンパク質であるＶ
Ｐ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする遺伝子、を含む３つの領域に分割可能な小さなＤ
ＮＡウイルスである。さらに、後期ゲノムも、補助ウィルスタンパク質であるアグノプロ
テインの生産を担っている。Ｔ抗原タンパク質は後期遺伝子の転写を刺激すると共にウイ
ルスＤＮＡ複製のプロセスを引き起こすため、Ｔ−抗原の発現はウイルスの溶菌サイクル
の開始にとって極めて重要である。最近の研究によると、アグノプロテインの生産の阻害
がウイルス遺伝子の発現および複製を有意に現象させるため、ＪＣＶの転写および複製に
おいてアグノプロテインが重要な役割を果たすとした（M. Safak et al.、非公表の知見
）。さらに、アグノプロテインは、いくつかのサイクリンおよびそれに関連するキナーゼ
の発現を変更することにより細胞周期を制御不全にする（非特許文献８）。
【０００６】
これまでのところ、ＪＣＶ複製を抑制し、ＰＭＬを治療するための有効な治療法は存在
しない。サイトシンアラビノサイド（ＡｒａＣ）がＰＭＬ患者の治療のために試験された
が、いくつかの例での結果、ＪＣＶに関連する脱髄の寛解が明らかになった（非特許文献
９）。しかしながら、ＡＩＤＳ治験研究班の組織的試験２４３からの報告書によるとヒト
免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に感染したPML患者と、対照集団との生存率に差が
ないことが示された（なお、他の報告書では、このＡＩＤＳ治験研究班の試験でＡｒａＣ
がうまくいかなかったのは静脈内径路および髄腔内径路によったのでＡｒａＣが十分に送
達されなかったためである可能性があることが示唆されている（非特許文献１０））。ト
ポイソメラーゼ阻害剤がＪＣＶ ＤＮＡの複製を抑制できる能力を示すインビトロ研究に
基づいて、トポイソメラーゼ阻害剤のトポテカンをＡＩＤＳ−ＰＭＬ患者の治療に使用し
たが、その結果、トポテカンによる治療が病変サイズの減少と生存期間の延長と関係して
いる可能性があることが示唆された（非特許文献１１）。
【０００７】
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、高度に保存された調節機構で遺伝子発現を妨害す
ることが示されており、これはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている。特許文献１
は、線虫のＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける遺伝子発現を抑制するために長さが少なくとも２
５ヌクレオチドのｄｓＲＮＡを使用することを開示している。ｄｓＲＮＡは、植物（特許
文献２および３）、ショウジョウバエ（非特許文献１２）および哺乳動物（特許文献４お
よび５）を含む他の生物でも標的ＲＮＡを減少させることが示された。この天然の機構は
、今や遺伝子の以上なまたは望ましくない調節によって引き起こされる病気を治療するた
めの新しいクラスの薬剤の開発のための焦点となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO99/32619
【特許文献２】WO99/53050
【特許文献３】WO99/61631
【特許文献４】WO00/44895
【特許文献５】DE101 00 586.5
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Berger, J. R. (1995) J. Neurovirol. 1:5-18
【非特許文献２】Cinque, P., (2003). J. Neurovirol. 9(Suppl. 1):88-92
【非特許文献３】Clifford, D. B., (2001) J. Neurovirol. 4:279
【非特許文献４】Sweeney, B. J., (1994). J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 57:994-997
【非特許文献５】Gordon, J. (1998) Int. J. Mol. Med. 1:647-655
【非特許文献６】Raj, G. V., (1995) Virology 10:283-291
【非特許文献７】Khalili, K., 2003. Oncogene 22:5181-5191
【非特許文献８】Darbinyan, A., (2002) Oncogene 21:5574-5581
【非特許文献９】Aksamit, A. (2001) J. Neurovirol. 7:386-390
【非特許文献１０】Levy, R. M.,(2001) J. Neurovirol. 7:382-385
【非特許文献１１】Royal, W., III, (2003) J. Neurovirol. 9:411-419
【非特許文献１２】Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200
【非特許文献１３】Radhakrishnan, S. (2004) J. Vir. 78:7264-7269
【非特許文献１４】Orba, Y. (2004) J. Vir. 78:7270-7273
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
最近の報告書によると、インビトロでＲＮＡｉがＪＣウイルス複製を減少させる可能性
を示された（非特許文献１３および１４）が、調べられたＲＮＡｉ剤はすべての既知のＪ
Ｃウイルス株に対して設計されたわけではなく、インビボでの治療用のＲＮＡｉ剤に必要
な安定性や他の特性を考慮して選択されたわけではなかった。従って、ＲＮＡｉの分野で
の著しい進歩にもかかわらず、細胞自身のＲＮＡｉ機構を使用してＪＣウイルス中の遺伝
子を選択的かつ効果的にサイレンシングする薬剤であって、高い生物活性と生体内安定性
の両方を有し、ＪＣウイルス感染によって媒介される病理過程の治療に使用されるＪＣウ
イルスの複製を効果的に阻害できる薬剤が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要約
本発明は、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびにそのようなｄｓＲＮＡを使
用して細胞または哺乳動物のＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するための組成物および方
法を提供する。本発明はさらに、ＪＣウイルス感染によるＰＭＬ等の病的状態および疾患
を治療するための、組成物および方法を提供する。本発明のｄｓＲＮＡは、長さ３０ヌク
レオチド未満、通常は長さ１９〜２４ヌクレオチドでＪＣウイルス遺伝子のｍＲＮＡ転写
物の少なくとも一部にほぼ相補的な領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。
【００１２】
１つの実施形態では、本発明はＪＣウイルス遺伝子のうちの一つの発現およびウイルス
複製を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。該ｄｓＲＮ
Ａは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を有する。該ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有
するセンス鎖と第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、ＪＣウ
イルスの遺伝子によりコードされたｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的なヌクレオチ
ド配列を有し、該相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満、通常は長さ１９〜２４ヌクレ
オチドである。該ｄｓＲＮＡは、ＪＣウイルスに感染した細胞と接触させると、ＪＣウイ
ルス遺伝子の発現を少なくとも４０％抑制する。
【００１３】
例えば、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、表１ａおよび１ｂのセンス配列から成る群から選
択されるｄｓＲＮＡの第１の配列を有するものでよく、第２の配列は表１ａおよび１ｂの
アンチセンス配列から成る群から選択される。本発明のｄｓＲＮＡ分子は、天然に存在す
るヌクレオチドからなるものでもよいし、あるいは少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、
例えば２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオ
チド、およびコレステリル誘導体に連結された末端ヌクレオチドなどを含むものでもよい
。あるいは、修飾ヌクレオチドは、次の群、すなわち２’−デオキシ−２’−フルオロ修
飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基
ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モル
ホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、および非天然の塩基を含むヌクレオチド、か
ら選択されうる。通常、そのような修飾配列は、表１ａおよび１ｂのセンス配列から成る
群から選択されたｄｓＲＮＡの第１の配列と、表１ａおよび１ｂのアンチセンス配列から
成る群から選択された第２の配列とに基づいている。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡのうちの１つを含む細胞を提供する
。該細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞であることが好ましい。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、１以上の本発明のｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可能な担
体とを含む、生物体におけるＪＣウイルスの複製を抑制するための医薬組成物を提供する
。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、細胞内のＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するための、
下記工程（ａ）および（ｂ）を含む方法を提供する。
【００１７】
（ａ）細胞内に、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、該ｄ
ｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を有する、工程。該ｄｓＲＮＡは、第
１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含む。アンチセン
ス鎖は、ＪＣウイルスによりコードされるｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的な相補
領域を含み、該相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満、通常は長さ１９〜２４ヌクレオ
チドであり、ｄｓＲＮＡは、ＪＣウイルスに感染した細胞と接触させると、ＪＣウイルス
遺伝子の発現を少なくとも４０％抑制する。
【００１８】
（ｂ）工程（ａ）で生成された細胞を、ＪＣウイルス遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解さ
せるのに十分な時間維持することによって、細胞でのＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制す
る工程。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、ＪＣウイルスにより媒介されるＰＭＬ等の発病過程を治
療、予防、または管理する方法であって、そのような治療、予防または管理を必要とする
患者に、治療上または予防上有効な量の１または複数の本発明のｄｓＲＮＡを投与するこ
とからなる方法を提供する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、細胞でのＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するためのベ
クターであって、本発明のｄｓＲＮＡのうち１つの少なくとも一方の鎖をコードするヌク
レオチド配列に連係して作用する調節配列を有するベクターを提供する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、細胞でのＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するためのベ
クターを含む細胞を提供する。該ベクターは、本発明のｄｓＲＮＡのうち１つの少なくと
も一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に連係して作用する調節配列を有する。
【００２２】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞内のヒトＪＣウイルスゲノムの発現を抑制するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、上記ｄｓＲＮＡは互いに相補的な少なくとも２つの配列を有し、センス鎖は第１の配列を有し、アンチセンス鎖はＪＣウイルスをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含む第２の配列を有し、上記相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満であり、上記ｄｓＲＮＡは、ＪＣウイルスを発現している細胞と接触させると、ＪＣウイルスゲノムの発現を抑制する、ｄｓＲＮＡ。
（項目２）
上記第１の配列は表１ａおよび１ｂからなる群から選択され、上記第２の配列は表１ａおよび１ｂからなる群から選択される、項目１に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目３）
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、項目１に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目４）
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、項目２に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目５）
上記修飾ヌクレオチドは、２’‐Ｏ‐メチル修飾ヌクレオチド、５’‐ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、項目３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目６）
上記修飾ヌクレオチドは、２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ修飾ヌクレオチド、２’‐デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’‐アミノ修飾ヌクレオチド、２’‐Ｏ‐アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、および非天然の塩基を含むヌクレオチド、なる群から選択される、項目３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目７）
上記第１の配列は表１ａおよび１ｂからなる群から選択され、上記第２の配列は表１ａおよび１ｂからなる群から選択される、項目３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目８）
上記第１の配列は表１ａおよび１ｂからなる群から選択され、上記第２の配列は表１ａおよび１ｂからなる群から選択される、項目６または７に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目９）
項目１に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
（項目１０）
ｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含む、生物体におけるＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するための医薬組成物であって、上記ｄｓＲＮＡは互いに相補的な少なくとも２つの配列を有し、センス鎖は第１の配列を有し、アンチセンス鎖はＪＣウイルスをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含む第２の配列を有し、上記相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満であり、上記ｄｓＲＮＡは、ＪＣウイルスを発現している細胞と接触させると、ＪＣウイルスゲノムの発現を抑制する、医薬組成物。
（項目１１）
上記ｄｓＲＮＡの上記第１の配列は表１ａおよび１ｂからなる群から選択され、上記ｄｓＲＮＡの上記第２の配列は表１ａおよび１ｂからなる群から選択される、項目１０に記載の医薬組成物。
（項目１２）
上記ｄｓＲＮＡの上記第１の配列は表１ａおよび１ｂからなる群から選択され、上記ｄｓＲＮＡの上記第２の配列は表１ａおよび１ｂからなる群から選択される、項目１０に記載の医薬組成物。
（項目１３）
細胞内のＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制する方法であって、
（ａ）細胞内に、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を有し、センス鎖は第１の配列を有し、アンチセンス鎖はＪＣウイルスをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含む第２の配列を有し、該相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満であり、上記ｄｓＲＮＡは、ＪＣウイルスを発現している細胞と接触させると、ＪＣウイルスゲノムの発現を抑制する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で生成された細胞を、ＪＣウイルス遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解させるのに十分な時間維持することによって、細胞内のＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制する工程
を含む方法。
（項目１４）
ＪＣウイルスの発現により媒介される病理過程を治療、予防、または管理する方法であって、そのような治療、予防または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量のｄｓＲＮＡを投与する工程からなり、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を有し、センス鎖は第１の配列を有し、アンチセンス鎖はＪＣウイルスをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含む第２の配列を有し、該相補領域の長さは３０ヌクレオチド未満であり、上記ｄｓＲＮＡは、ＪＣウイルスを発現している細胞と接触させると、ＪＣウイルスゲノムの発現を抑制する、方法。
（項目１５）
細胞内のＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するためのベクターであって、上記ベクターは、ｄｓＲＮＡの１つの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に連係して作用する調節配列を有し、上記ｄｓＲＮＡの鎖のうち一方は、ＪＣウイルスをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部にほぼ相補的であり、上記ｄｓＲＮＡの長さは３０塩基対未満であり、上記ｄｓＲＮＡは、ＪＣウイルスを発現している細胞と接触させると、ＪＣウイルスゲノムの発現を抑制する、ベクター。
（項目１６）
項目１５に記載のベクターを含む細胞。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびに該ｄｓＲＮＡを使用して細
胞または哺乳動物のＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法を提供
する。本発明はさらに、ｄｓＲＮＡを使用してＪＣウイルス感染を原因とする哺乳動物の
病的状態および疾患を治療するための組成物および方法を提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮ
Ａ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを通じて、ｍＲＮＡの配列特異的な分解を導
く。
【００２４】
本発明のｄｓＲＮＡは、長さが３０ヌクレオチド未満、通常は長さが１９〜２４ヌクレ
オチドであり、ＪＣウイルス遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部にほぼ相補的な領
域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。これらのｄｓＲＮＡを使用することによ
り、哺乳動物の疼痛応答に関与する遺伝子のｍＲＮＡを標的とした分解が可能である。細
胞アッセイおよび動物アッセイを使用して、本発明者らは、非常に低用量の上記ｄｓＲＮ
Ａが特異的かつ効率的にＲＮＡｉを仲介する結果、ＪＣウイルス遺伝子の発現を顕著に抑
制することができることを実証した。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む本発明の方
法および組成物は、細胞におけるＪＣウイルスの複製および／または維持に関与する遺伝
子を標的とすることにより、がん等のＪＣウイルス感染により媒介される発病過程の治療
に有用である。
【００２５】
以降の詳細な説明は、ＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するためにｄｓＲＮＡおよびｄ
ｓＲＮＡ含有組成物を製造および使用する方法、ならびにＰＭＬ等のＪＣウイルス感染を
原因とする疾患および障害を治療するための組成物および方法を開示する。本発明の医薬
組成物は、長さが３０ヌクレオチド未満、通常は長さ１９〜２４でＪＣウイルス遺伝子の
ＲＮＡ転写物の少なくとも一部にほぼ相補的な相補領域を含むアンチセンス鎖を有するｄ
ｓＲＮＡを、薬学的に許容可能な担体と一緒に含む。
【００２６】
従って、本発明のある態様は、本発明のｄｓＲＮＡを薬学的に許容可能な担体と一緒に
含む医薬組成物、ＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するために該組成物を使用する方法、
およびＪＣウイルス感染を原因とする疾患を治療するために該医薬組成物を使用する方法
を提供する。
【００２７】
Ｉ．定義
便宜のために、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される一
定の用語および語句の意味を以下に示す。本明細書の他の部分におけるある用語の使用法
と、本項に示された該用語の定義との間に明白な矛盾がある場合、本項の定義が優先され
るものとする。
【００２８】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は各々、通常、塩基としてグアニン、シトシン、
アデニン、およびウラシルをそれぞれ含んでいるヌクレオチドを表わす。しかしながら、
当然のことであるが、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、以下にさら
に詳述するような修飾ヌクレオチド、または代用置換部分をも意味しうる。当業者には良
く知られていることであるが、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを他の構成
部分で置換し、そのような置換部分を有するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの
塩基対形成特性を本質的に変化させないでおくことができる。例えば、限定するものでは
ないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシ
ルを含んでいるヌクレオチドと塩基対形成することができる。従って、ウラシル、グアニ
ン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列中において例えば
イノシンを含んでいるヌクレオチドで置換される場合がある。そのような置換部分を含む
配列は本発明の実施形態である。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ＪＣウイルス」は、参照番号ＮＣ＿００１６９９を有す
る潜在ポリオーマウイルスＪＣウイルスを指す。種々のＪＣウイルス配列のさらなるアク
セッション番号に、ＡＢ０３８２４９．１、ＡＢ０３８２５５．１、ＡＢ０４８５４５．
１、ＡＢ０４８５８２．１、ＡＢ０７４５７５．１、ＡＢ０７４５９１．１、ＡＢ０７７
８５５．１、ＡＢ０７７８７９．１、ＡＢ０８１００５．１、ＡＢ０８１０３０．１、Ａ
Ｂ０８１６００．１、ＡＢ０８１６１８．１、ＡＢ０８１６５４．１、ＡＢ０９２５７８
．１、ＡＢ０９２５８７．１、ＡＢ１０３３８７．１、ＡＢ１０３４０２．１、ＡＢ１０
３４２３．１、ＡＢ１０４４８７．１、ＡＢ１１３１１８．１、ＡＢ１１３１４５．１、
ＡＢ１１８６５１．１、ＡＢ１１８６５９．１、ＡＢ１２６９８１．１、ＡＢ１２７０２
７．１、ＡＢ１２７３４２．１、ＡＢ１２７３４４．１、ＡＢ１２７３４６．１、ＡＢ１
２７３４９．１、ＡＢ１２７３５２．１、ＡＢ１２７３５３．１、ＡＢ１９８９４０．１
、ＡＢ１９８９５４．１、ＡＢ２２０９３９．１、ＡＢ２２０９４３．１、ＡＦ００４３
４９．１、ＡＦ００４３５０．１、ＡＦ０１５５２６．１、ＡＦ０１５５３７．１、ＡＦ
０１５６８４．１、ＡＦ０３００８５．１、ＡＦ２８１５９９．１、ＡＦ２８１６２６．
１、ＡＦ２９５７３１．１、ＡＦ２９５７３９．１、ＡＦ３００９４５．１、ＡＦ３００
９６７．１、ＡＦ３６３８３０．１、ＡＦ３６３８３４．１、ＡＦ３９６４２２．１、Ａ
Ｆ３９６４３５．１、ＡＹ１２１９０７．１、ＡＹ１２１９１５．１、ＮＣ＿００１６９
９．１、Ｕ６１７７１．１、Ｕ７３５００．１、Ｕ７３５０２．１．がある。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、ＪＣウイルス遺伝子の転写の際に形成さ
れるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した一部分、例えば一次転写産物のＲＮＡプ
ロセシング生成物であるｍＲＮＡなどを指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「配列を有する鎖」は、標準的なヌクレオチド命名法
を使用して示された配列によって記述されるヌクレオチド鎖を有するオリゴヌクレオチド
を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、かつ別途記載のない限り、用語「相補的」は、第１のヌク
レオチド配列について第２のヌクレオチド配列との関連において記述するために使用され
る場合、第１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが
、第２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとともに
、ある条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を指し、このことは当業者
には当然のことである。そのような条件は、例えばストリンジェントな条件であってよく
、ここでストリンジェントな条件としては：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥ
Ｓ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間の後に洗浄
、が挙げられる。その他の条件、例えば生物体内で遭遇しうるような生理学的に関連のあ
る条件なども当てはまる。当業者であれば、２つの配列の相補性を、ハイブリダイズした
ヌクレオチドの最終的な用途に従って試験するための、最も適した条件一式を決定するこ
とができるであろう。 これは、第１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドま
たはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドまたはポ
リヌクレオチドとの、第１および第２のヌクレオチド配列全長にわたる塩基対形成を含ん
でいる。このような配列は、本明細書においては互いに関して「完全に相補的」というこ
とができる。しかしながら、本明細書において第１の配列が第２の配列に関して「ほぼ相
補的」という場合は、その２つの配列は完全に相補的であってもよいし、あるいはその２
つの配列が、該配列の最終的な用途に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持
しつつ、ハイブリダイゼーション時に１または複数、通常４つ、３つまたは２つ以下のミ
スマッチな塩基対を形成してもよい。ただし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダ
イゼーション時に１以上の一本鎖突出部を形成するように設計されている場合、そのよう
な突出部は相補性の測定に関してミスマッチとは見なされないものとする。例えば、一方
の２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドともう一方の２３ヌクレオチド長のオリゴヌ
クレオチドとからなるｄｓＲＮＡであって、長いほうのオリゴヌクレオチドが短いほうの
オリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を有するものは、本発明の
目的に関してはこの場合も「完全に相補的」とされうる。
【００３３】
「相補的な」配列はまた、本明細書で使用される場合、該配列のハイブリダイズする能
力に関して上記の必要条件が満たされる限り、非ワトソンクリック型の塩基対、または非
天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドから形成された塩基対のうち少なくともいずれ
か一方を含んでもよいし、あるいは完全に前記塩基対から形成されてもよい。
【００３４】
本明細書中の用語「相補的」、「完全に相補的」および「ほぼ相補的」は、該用語の使
用の前後関係から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、あ
るいはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基の対応に関して使用されうる
。
【００３５】
本明細書で使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部に
ほぼ相補的」なポリヌクレオチドとは、対象のｍＲＮＡ（例えばＪＣウイルスをコードす
るもの）の連続した一部分にほぼ相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、配列がＪＣ
ウイルスをコードするｍＲＮＡの連続した一部分にほぼ相補的である場合、そのポリヌク
レオチドはＪＣウイルス ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
【００３６】
用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、リボ核酸
分子の複合体であって、２つの逆平行かつ（上記定義のように）ほぼ相補的な核酸鎖から
なる二重鎖構造を有するものを指す。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つの大きなＲ
ＮＡ分子の異なる部分であってもよいし、個別のＲＮＡ分子であってもよい。２つの鎖が
１つの大きな分子の一部であり、したがって、２つの鎖が、一方の鎖の３’末端と、二重
鎖構造を形成している対応する他方の鎖の５’末端との間の連続したヌクレオチド鎖で接
続されている場合、この接続しているＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。２つの
鎖が、一方の鎖の３’末端と、二重鎖構造を形成している対応する他方の鎖の５’末端と
の間の連続したヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合で接続されている場合、この
接続構造は「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は同数を有してもよいし、異なる数のヌク
レオチドを有してもよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのうち最短の鎖のヌクレオチド
数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１以上のヌクレオチド突出部を含んでもよ
い。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド突出部」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３
’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びるか、あるいはその逆である場合に、該ｄｓＲ
ＮＡの二重鎖構造から突出する非対合ヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」
とは、非対合ヌクレオチドがｄｓＲＮＡの末端に存在しない、すなわちヌクレオチド突出
部がないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡとは、その全長にわたって二本鎖構
造である、すなわち該分子のいずれの末端にもヌクレオチド突出部がないｄｓＲＮＡであ
る。
【００３８】
用語「アンチセンス鎖」は、ｄｓＲＮＡの鎖であって標的配列にほぼ相補的な領域を含
むものを指す。本明細書で使用される場合、用語「相補領域」は、本明細書で定義される
ように、配列（例えば標的配列）にほぼ相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補
領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容さ
れ、かつ、存在する場合は、通常は末端領域に、例えば５’または３’末端のうち少なく
ともいずれかから６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。
【００３９】
用語「センス鎖」は、本明細書で使用される場合、ｄｓＲＮＡの鎖であってアンチセン
ス鎖のある領域にほぼ相補的な領域を含んでいるものを指す。
【００４０】
当業者には理解されるように、「細胞に導入する」とは、ｄｓＲＮＡに関する場合、細
胞内への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込
みは、支援を伴わない拡散プロセスまたは細胞の能動的プロセスを通じて為されてもよい
し、あるいは補助的な薬剤またはデバイスによって為されてもよい。この用語の意味は、
ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に限定されるものではなく；ｄｓＲＮＡは、生体の一部である細
胞について「細胞に導入される」場合もある。そのような場合は、細胞への導入は、生体
への送達を含むことになる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達については、ｄｓＲＮＡが組織
部位に注入されてもよいし、あるいは全身投与されてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞
への導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションのような当分野で既知の
方法が挙げられる。
【００４１】
用語「サイレンシングする」および「発現を抑制する」は、該用語がＪＣウイルス遺伝
子に関するものである限り、本明細書では、ＪＣウイルス遺伝子の発現を少なくとも部分
的に抑制することを指し、該抑制は、ＪＣウイルス遺伝子の転写が行われる第１の細胞ま
たは細胞群であってＪＣウイルス遺伝子の発現が抑制されるように処理されたものから単
離可能な、ＪＣウイルス遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量が、第２の細胞または細胞群
であって第１の細胞または細胞群と本質的に同一であるが上記処理が為されていないもの
（対照細胞）と比較して減少していることによって明らかにされるようなものである。抑
制の程度は通常、
［（対照細胞のｍＲＮＡ）−（処理細胞のｍＲＮＡ）］／（対照細胞のｍＲＮＡ）・
１００％
で表される。
【００４２】
別例として、抑制の程度は、ＪＣウイルスのゲノム転写に機能的関連を有するパラメー
タ、例えば、細胞によって分泌される、ＪＣウイルス遺伝子によってコードされたタンパ
ク質の量、あるいは一定の表現型（例えばアポトーシス）を示す細胞の数など、の減少と
いう観点で与えられる場合もある。原則として、ＪＣウイルスゲノムのサイレンシングは
、構成的にあるいはゲノムの工学操作により標的を発現する任意の細胞において、任意の
適切なアッセイによって測定可能である。しかしながら、所与のｓｉＲＮＡがＪＣウイル
ス遺伝子の発現を一定の度合いで抑制するか、したがって本発明に包含されるかどうかを
判断するために参照が必要な場合、以下の実施例において提供されるアッセイはそのよう
な参照として有用であろう。
【００４３】
例えば、ある例では、ＪＣウイルス遺伝子の発現は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチ
ドの投与によって少なくとも約２０％、２５％、３５％または５０％抑制される。いくつ
かの実施形態では、ＪＣウイルス遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与に
よって少なくとも約６０％、７０％または８０％抑制される。いくつかの実施形態では、
ＪＣウイルス遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約
８５％、９０％または９５％抑制される。
【００４４】
用語「治療する」、「治療」などは、ＪＶウイルス感染により媒介される発病過程の軽
減または緩和を指す。本発明の文脈において本発明が本明細書中以下に示す任意のその他
の（ＪＶウイルス感染により媒介される発病過程以外の）状態に関する限り、用語「治療
する」、「治療」などは、そのような状態に関連する少なくとも１つの症状を軽減または
緩和すること、またはそのような状態の進行を遅延または逆行させることを意味する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、語句「治療上有効な量」および「予防上有効な量」とは、
ＪＶウイルス感染により媒介される発病過程またはＪＶウイルス感染により媒介される発
病過程の明白な症状の治療、予防、または管理に治療上の利点を提供する量を指す。治療
上有効な具体的な量は、普通の医師により容易に決定可能であり、また当分野で周知の要
因、例えばＪＶウイルス感染により媒介される発病過程のタイプ、患者の病歴および年齢
、ＪＶウイルス感染により媒介される発病過程の程度、ならびに他のＪＶウイルス感染に
より媒介される抗発病過程剤の投与などに依存して変化しうる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は薬理学的に有効な量のｄｓＲＮＡと薬学
的に許容可能な担体とを含む。本明細書で使用される場合、「薬理学的に有効な量」、「
治療上有効な量」、または単に「有効な量」とは、意図される薬理学的、治療上、または
予防上の結果を生じるのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、ある臨床治療が、疾患また
は障害に関連した測定可能なパラメータに少なくとも２５％の低下があれば有効であると
考えられる場合、その疾患または障害の治療のために治療上有効な薬の量は、そのパラメ
ータを少なくとも２５％低下させるのに必要な量である。
【００４７】
用語「薬学的に許容可能な担体」は、治療薬を投与するための担体を指す。そのような
担体には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水
、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。該用語は細胞培
養培地を明確に除外している。経口投与される薬物については、薬学的に許容可能な担体
には、限定するものではないが、薬学的に許容可能な添加剤、例えば不活性の賦形剤、崩
壊剤、結着剤、潤滑剤、甘味料、香料、着色剤および保存剤などが挙げられる。適切な不
活性の賦形剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン
酸カルシウム、およびラクトースがあり、またトウモロコシデンプンおよびアルギン酸は
適切な崩壊剤である。結着剤にはデンプンおよびゼラチンを挙げることができ、潤滑剤は
通常、存在する場合にはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであろう
。所望の場合には、胃腸管への吸収を遅らせるために錠剤をモノステアリン酸グリセリン
またはジステアリン酸グリセリンのような材料でコーティングしてもよい。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「形質転換細胞」は、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可
能なベクターが導入された細胞である。
【００４９】
ＩＩ．二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
１つの実施形態では、本発明は、細胞または哺乳動物においてＪＣウイルス遺伝子の発
現を抑制するための二本鎖構造のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、該ｄｓＲＮＡは
ＪＣウイルス遺伝子の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な相補領域を
含むアンチセンス鎖を含み、該相補領域は長さが３０ヌクレオチド未満、通常は１９〜２
４ヌクレオチドであり、前記ｄｓＲＮＡは、前記ＪＣウイルス遺伝子を発現している細胞
と接触すると、前記ＪＣウイルス遺伝子の発現を少なくとも４０％抑制する。該ｄｓＲＮ
Ａは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分相補的な２つのＲＮＡ鎖を含む
。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＪＣウイルス遺伝子の発現の際に形成さ
れるｍＲＮＡの配列に由来する標的配列にほぼ相補的、好ましくは完全に相補的な相補領
域を含み、他方の鎖（センス鎖）は該アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、２つの鎖が
適切な条件の下で組み合わせられた時にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するように
なっている。通常、二重鎖構造は長さが１５〜３０、より一般的には１８〜２５、さらに
より一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１塩基対である。同様に、標的配列
に相補的な領域は、長さが１５〜３０、より一般的には１８〜２５、さらにより一般的に
は１９〜２４、最も好ましくは１９〜２１ヌクレオチドである。本発明のｄｓＲＮＡは、
１または複数の一本鎖ヌクレオチド突出部をさらに含んでもよい。
【００５０】
ｄｓＲＮＡは、以降にさらに議論するように当分野で周知の標準的な方法によって、例
えば、バイオサーチ（Biosearch）、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem
s, Inc.）などから市販されているような自動ＤＮＡ合成装置の使用によって、合成する
ことができる。好ましい実施形態では、ＪＣウイルス遺伝子はヒトＪＣウイルスゲノムで
ある。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１ａおよび１ｂのセンス
配列を有し、第２の配列は、表１ａおよび１ｂのアンチセンス配列から成る群から選択さ
れる。表１ａおよび１ｂに与えられた標的配列を標的とする別のアンチセンス剤が、標的
配列および平滑ＪＣウイルス配列を用いれば容易に決定される。
【００５１】
さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表１ａおよび１ｂに提供された配列群から選択
された少なくとも１つのヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、
この群から選択された少なくとも２つの配列を有し、少なくとも２つの配列のうち一方は
少なくとも２つの配列のもう一方に相補的であり、少なくとも２つの配列のうちの１つは
、ＪＣウイルス遺伝子の発現で生成されるｍＲＮＡの配列にほぼ相補的である。好ましく
は、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、一方のオリゴヌクレオチドは表１ａ
および１ｂに記載されているものであり、もう一方のオリゴヌクレオチドも表１ａおよび
１ｂに記載されている。
【００５２】
当業者には周知のように、２０〜２３塩基対、特に２１塩基対の二重鎖構造を含むｄｓ
ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を引き起こすのに特に有効なものとして評価されている（Elbashir
et al.,EMBO 2001, 20:6877-6888）。しかしながら、より短いｄｓＲＮＡや長いｄｓＲ
ＮＡも同様に有効となりうることが他の研究者によって見出されている。上述の実施形態
では、表１ａおよび１ｂに提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質から、本発明のｄｓ
ＲＮＡは長さが最小２１ヌクレオチドの鎖を少なくとも１つ含むことができる。表１ａお
よび１ｂの配列のうちの１つであって一端または両端からわずか数個のヌクレオチドが差
し引かれたものを含む短いｄｓＲＮＡが、上述のｄｓＲＮＡと比較して同じように有効か
もしれないことを期待するのは合理的と思われる。従って、表１ａおよび１ｂの配列のう
ちの１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上連続
したヌクレオチドである部分配列を有し、かつ、本明細書中以降に記載のようなＦＡＣＳ
分析においてＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制する能力が、完全な配列を有するｄｓＲＮ
Ａと高々５、１０、１５、２０、２５、または３０％（抑制）しか違わないｄｓＲＮＡが
、本発明によって企図されている。表１ａおよび１ｂに与えられた標的配列内で開裂する
さらなるｄｓＲＮＡが、ＪＣウイルス配列および標的配列を用いれば容易に決定される。
【００５３】
さらに、表１ａおよび１ｂに与えられたＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉに基づく開裂を受けや
すいＪＣウイルスｍＲＮＡの部位を同定する。すなわち、本発明は本発明の薬剤の一つに
よって標的とされる配列の中を標的とするＲＮＡｉ剤を含む。本明細書で使用する場合、
第２のＲＮＡｉ剤は、第２のＲＮＡｉ剤が第１のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に相補的な
ｍＲＮＡ内のメッセージを開裂させる場合には、第１のＲＮＡｉ剤の配列内を標的とする
こととなる。そのような第２の薬剤は、ＪＣウイルス遺伝子内の選択配列と連続する領域
から得た追加のヌクレオチド配列に結合された表１ａおよび１ｂに与えられた標的配列の
一つに由来する少なくとも１５の連続するヌクレオチドからなる。例えば、標的ＪＰウイ
ルスゲノム由来の次の６個のヌクレオチドと結合された配列番号１の最後の１５個のヌク
レオチドは、表１ａおよび１ｂに与えられた配列の一つに基づく２１ヌクレオチドの一本
鎖薬剤を提供する。
【００５４】
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対して１または複数のミスマッチを含んでもよい。
好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡが含むミスマッチは３つ以下である。ｄｓＲ
ＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含んでいる場合、ミスマッチ部分
が相補領域の中央に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列
に対するミスマッチを含んでいる場合、該ミスマッチはいずれかの末端から５ヌクレオチ
ド、例えば相補領域の５’または３’末端のいずれかから５、４、３、２、または１ヌク
レオチドに限られることが好ましい。例えば、ＪＣウイルス遺伝子のある領域に相補的な
２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖については、該ｄｓＲＮＡは、中央の１３ヌクレオチド
の範囲内には通常ミスマッチを全く含まない。標的配列に対するミスマッチを含んでいる
ｄｓＲＮＡがＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するのに有効かどうか判断するために、本
発明に記載の方法を使用することができる。特にＪＣウイルス遺伝子中の特定の相補領域
が、集団内で配列多型の変異を有することが知られている場合、ミスマッチを備えたｄｓ
ＲＮＡの、ＪＣウイルス遺伝子の発現抑制における有効性を考慮することは重要である。
【００５５】
１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端には、１〜４ヌクレオチド、
一般的には１〜２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド突出部がある。少なくとも１つのヌ
クレオチド突出部を有するｄｓＲＮＡは、予想外なことに、対応する平滑末端のｄｓＲＮ
Ａよりも優れた抑制特性を有する。さらに、本発明者らは、わずか１つのヌクレオチド突
出部の存在が、ｄｓＲＮＡの全体的な安定性に影響することなくｄｓＲＮＡの干渉活性を
強化することを発見した。突出部を１つだけ有するｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおい
て、ならびに様々な細胞、細胞培養培地、血液および血清において特に安定かつ有効であ
ることが分かった。通常、一本鎖突出部はアンチセンス鎖の３’末端に位置し、あるいは
別例としてセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、平滑末端を有していてもよく
、該平滑末端は通常アンチセンス鎖の５’末端に位置する。そのようなｄｓＲＮＡは安定
性および抑制活性が改善されており、よって、低用量（すなわち１日につき被投与者の体
重１ｋｇあたり５ｍｇ未満）での投与が可能になる。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス
鎖は３’末端にヌクレオチド突出部を有し、５’末端が平滑末端である。別の実施形態で
は、突出部中の１または複数のヌクレオチドがヌクレオシドチオホスフェートで置換され
ている。
【００５６】
さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは安定性増強のために化学修飾される。本発明の
核酸は、参照により本願に組み込まれる"Current protocols in nucleic acid chemistry
",Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley and Sons, Inc., place City New place City York, State NY, USAに記載のような当分野で確立された方法によって合成かつ／または修飾されうる。本発明に有用な好ましいｄＲＮＡ化合物の特定の例には、修飾バックボーンを含むか非天然のヌクレオシド間結合を有するｄｓＲＮＡが含まれる。本明細書で定義されるように、修飾バックボーンを有するｄｓＲＮＡには、バックボーンにリン原子を有するものと、バックボーンにリン原子を有しないものとが含まれる。本発明に関しては、糖の間のバックボーンにリン原子のない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
【００５７】
好ましい修飾ｄｓＲＮＡバックボーンには、例えば、ホスホロチオエート、キラルのホ
スホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホ
トリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホ
スホネートおよびキラルのホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば
３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホス
ホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、な
らびに、正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、その２’−５’結合アナロ
グ、および隣接するヌクレオシドユニット対が３’−５’→５’−３’または２’−５’
→５’−２’に連結されている逆方向のもの、が挙げられる。様々な塩、混合塩および遊
離酸の形のものも含まれる。
【００５８】
上記のリン原子を含む結合の調製に関連する代表的な米国特許文献には、限定するもの
ではないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４
７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８
８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８
，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，
６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２
３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２
６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１
号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号
；および同第５，６２５，０５０号があり、これらは各々参照によって本願に組込まれる
。
【００５９】
好ましい修飾型のｄＮＡバックボーンであってその中にリン原子を含んでいないものに
は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルの糖間結合、ヘテロ原子およびアルキルまたはシ
クロアルキルの糖間結合の混合したもの、あるいは１以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ
環式の糖間結合により形成されるバックボーンが含まれる。これらには、モルホリノ結合
（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）を有するもの；シロキサンのバックボー
ン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンのバックボーン；ホルムアセチルおよびチ
オホルムアセチルのバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびメチレンチオホルムア
セチルのバックボーン；アルケンを含んでいるバックボーン；スルファメートのバックボ
ーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノのバックボーン；スルホネートおよびス
ルホンアミドのバックボーン；アミドのバックボーン；ならびに構成部分Ｎ、Ｏ、Ｓおよ
びＣＨ２が混在するその他のもの、が挙げられる。
【００６０】
上記のオリゴヌクレオシドの調製に関連する代表的な米国特許文献には、限定するもの
ではないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１
８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３
５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５
，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，
９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２
２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８
９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９
号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号
；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３
９号があり、これらは各々参照によって本願に組込まれる。
【００６１】
他の好ましいｄｓＲＮＡミメティックでは、ヌクレオシドユニットの糖およびヌクレオ
シド間結合（つまりバックボーン）の両方が、新しい基で置換される。核酸塩基ユニット
は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのような
オリゴマー化合物であって、優れたハイブリダイゼーション特性を有するｄＲＮＡミメテ
ィックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチド
の糖バックボーンは、アミドを含むバックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボー
ンで置換される。核酸塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接
または間接的に結合されている。ＰＮＡ化合物の調製について教示する代表的な米国特許
文献には、限定するものではないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４
，３３１号；および同第５，７１９，２６２号があり、これらは各々参照によって本願に
組込まれる。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Nielsen et al., Science, 1991,
254,1497-1500に見られる。
【００６２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態は、ホスホロチオエートバックボーンを備えたｄ
ｓＲＮＡおよびヘテロ原子バックボーンを備えたオリゴヌクレオシド、特に、上記に引用
された米国特許第５，４８９，６７７号の‐ＣＨ２‐ＮＨ‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２‐Ｎ（Ｃ
Ｈ３）‐Ｏ‐ＣＨ２‐［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして知ら
れる］、‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｎ（ＣＨ３）‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２‐Ｎ（ＣＨ３）‐Ｎ（ＣＨ３
）‐ＣＨ２‐、および‐Ｎ（ＣＨ３）‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐［天然のホスホジエステルのバ
ックボーンは、‐Ｏ‐Ｐ‐Ｏ‐ＣＨ２‐として表される］、および上記に引用された米国
特許第５，６０２，２４０号のアミドバックボーンを使用する。さらに好ましいのは、上
記に引用された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノバックボーン構造を有する
オリゴヌクレオチドである。
【００６３】
修飾ｄｓＲＮＡは１または複数の置換型糖部分を含んでもよい。好ましいｄｓＲＮＡは
、２’位に、以下のもの、すなわち：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル、Ｏ−
、Ｓ−、またはＮ−アルケニル、あるいはＯ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；＝−アル
キル−Ｏ−アルキル、（該アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換の
Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニル）のうちの１つを
含む。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ
（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ
２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、式中、ｎおよびｍは１から約１０までで
ある。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に、以下のもの、すなわち：Ｃ１
〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカ
リルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣ
Ｆ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアル
キル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリ
ル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物動態学
的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための
基、ならびに同様の特性を有するその他の置換基、のうちの１つを含む。好ましい修飾に
は、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、さらに２’−Ｏ−（２
−メトキシエチル）もしくは２’−ＭＯＥとしても知られている］（Martin et al, Helv
. Chim. Acta,1995, 78, 486）、つまりアルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらな
る好ましい修飾には、以下の実施例で記載される２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、
すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）
および以下の実施例で記載される２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち２’
−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２（２’−ジメチルアミノエトキシエチルまた
は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）がある。
【００６４】
他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキ
シ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）がある。同
様の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の部位に、特に３’末端のヌクレオチド上または
２’−５’結合したｄｓＲＮＡ中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位にな
されてもよい。ｄｓＲＮＡは、糖ミメティック、例えばシクロブチル部分をペントフラノ
シル糖の代わりに有していてもよい。そのような修飾糖の調製に関連した代表的な米国特
許文献には、限定するものではないが、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１
８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３
，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，
７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４
２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３０
０号；同第５，６２７、０５３１号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６
５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号および同第５，７００，９
２０号があり、これらはいずれも参照によって本願に組込まれる。
【００６５】
ｄｓＲＮＡは、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修
飾または置換を含む場合がある。本明細書中で使用されるように、「未修飾の」または「
天然の」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピ
リミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核
酸塩基には、その他の合成および天然の核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ
−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデ
ニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキルの誘導体、アデニンおよ
びグアニンの２−プロピルおよび他のアルキルの誘導体、２−チオウラシル、２−チオチ
ミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニ
ルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび
６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８
−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８−置換
型のアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよ
びその他の５−置換型のウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチル
アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デ
アザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン、が含まれる。
【００６６】
さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley and Sons, 1990に開示されているもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されているもの、およびSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基のうちあるものは、本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるのに特に有用である。それらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されており、（Sanghvi, Y.S., Croke, S.T. and Lebleu, B., Edsl, DsRNA Research and Applications, CRC Press, place City Boca Raton, 1993, ２７６−２７８ページ）、また現時点で好ましい塩基置換であり、２’−メトキシエチル糖修飾と併用した場合はさらに一層好ましい。
【００６７】
上記の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基のうち一部の調製に関連する代表的
な米国特許文献には、限定するものではないが、上述の米国特許第３，６８７，８０８号
、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３
４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２
，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，
９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５
４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９
１号；同第５，６１４，６１７号；および同第５，６８１，９４１号があり、これらはい
ずれも参照によって本願に組込まれ、同第５，７５０，６０２も参照によって本願に組込
まれる。
【００６８】
本発明のｄｓＲＮＡの別の修飾は、ｄｓＲＮＡの活性、細胞内分布または細胞への取り
込みを増強する１または複数の追加の部分すなわちコンジュゲートを、オリゴヌクレオチ
ドに化学結合させることに関する。そのような部分としては、限定するものではないが、
脂質部分、例えばコレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. ,
1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoha
ran et al., Ann. NY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg.
Med. Chem. Let,1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（O berhauser et al., Nu
cl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪鎖、例えばドデカンジオール残基またはウ
ンデシル残基（Saison-Behmoaraset al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et
al., FEBSLett.,1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-5
4）、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモ
ニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Mano
haran et al.,Tetrahedron Lett, 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1
990, 18,3777-3783）、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et a
l., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、あるいはアダマンタン酢酸（
Manoharan etal., Tetrahedron Lett, 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishr
a et al.,Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、あるいはオクタデシルア
ミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J
. Pharmacol.Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）がある。
【００６９】
そのようなｄｓＲＮＡコンジュゲートの調製に関連する代表的な米国特許文献には、限
定するものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；
同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同
第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第
５，５８０，７３１号；；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第
５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５
，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，
６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６
６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２
４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４
，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，
９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９
６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６
９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０
号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号
、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；
同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同
第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第
５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５
，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；および同
第５，６８８，９４１号があり、これらは各々が参照によって本願に組込まれる。
【００７０】
所与の化合物のすべての位置が一様に修飾されている必要はなく、実際、一つの化合物
や、ｄｓＲＮＡ内の一つのヌクレオシドに上述の２つ以上の修飾が組み込まれてもよい。
本発明は、キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も包含する。「キメラ」ｄｓＲＮＡ化合
物すなわち「キメラ」とは、本発明の文脈では、ｄｓＲＮＡ化合物、各領域が少なくとも
一つのモノマーユニットで構成された（すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合ヌクレオチド）
、特に２つ以上の化学的に異なる領域を含むｄｓＲＮＡである。このようなｄｓＲＮＡは
通常、ヌクレアーゼ分解へのｄｓＲＮＡの耐性の増大、細胞内取り込みの増大、および／
または標的核酸への結合親和性の増大を与えるようｄｓＲＮＡが修飾される、少なくとも
１つの領域を有する。ｄｓＲＮＡの追加領域はＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイ
ブリッドを開裂可能な酵素に対する基質として昨日し売る。例として、ＲＮａｓｅＨはＲ
ＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂させる細胞内エンドヌクレアーゼである。ＲＮａｓ
ｅＨの活性化は、それゆえＲＮＡ標的物の開裂を生じさせ、結果として遺伝子発現のｄｓ
ＲＮＡによる抑制効率が高められる。したがって、キメラｄｓＲＮＡが使用された短いｄ
ｓＲＮＡに関しては、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロエチオエートデオキシ
ｄｓＲＮＡと比べて、比較結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的物の開裂はゲル電気泳
動および必要な場合にはそれに伴う当該技術分野で周知の核酸ハイブリダイゼーションに
より、常法で得られる。
【００７１】
ある例では、ｄｓＲＮＡは非リガンド基によって修飾される場合がある。多くの非リガ
ンド分子が、ｄｓＲＮＡの活性、細胞内分布または細胞への取り込みを増強するためにｄ
ｓＲＮＡにコンジュゲートされ、そのようにコンジュゲートするための手法は科学文献か
ら入手可能である。そのような非リガンド部分は、脂質部分、例えばコレステロール（Le
tsinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553）、コール酸（Manoharan
et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. , 1994, 4:1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシ
ル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. NY. Acad. Sci., 1992, 660:306;
Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let, 1993, 3:2765）、チオコレステロール（Ob
erhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533）、脂肪
鎖、例えばドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMB
O J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al
., Biochimie, 1993, 75:49）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ
ールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−
３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea e
t al., Nucl.Acids Res., 1990, 18:3777）、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコー
ル鎖（Manoharanet al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14:969）、あるいはア
ダマンタン酢酸（Manoharanet al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651）、パルミチル
部分（Mishraet al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229）、あるいはオクタデ
シルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et
al., J Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923）である。そのようなｄｓＲＮＡコンジ
ュゲートの調製を教示する代表的な米国特許文献は、上記に列挙されている。ｄＲＮＡ実
施の典型的なプロトコールは、配列の１または複数の部位にアミノリンカーを有するオリ
ゴヌクレオチドの合成を要する。その後、該アミノ基を、適切なカップリング剤または活
性化剤を使用して、コンジュゲートさせる分子と反応させる。コンジュゲート反応は、ま
だ固体支持体に結合しているｄｓＲＮＡを用いて実施してもよいし、溶液相中でｄｓＲＮ
Ａを切断した後に実施してもよい。ＨＰＬＣによりｄｓＲＮＡコンジュゲートを精製する
と、通常純粋なコンジュゲートが得られる。
【００７２】
ベクターによりコードされたＲＮＡｉ剤
本発明のｄｓＲＮＡは、インビボで生体内で組換えウイルスベクターから発現させるこ
とも可能である。本発明の組換えウイルスのベクターは、本発明のｄｓＲＮＡをコードす
る配列と、かかるｄｓＲＮＡ配列を発現する任意のプロモータとを含む。適切なプロモー
タには、例えばＵ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータ配列およびサイトメ
ガロウイルスプロモータが含まれる。他の適切なプロモータの選択は当該技術分野におけ
る技術である。本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織内や特定の細胞内環境中
でｄｓＲＮＡの発現を誘導または調節可能なプロモータであり得る。インビボで本発明の
ｄｓＲＮＡを細胞へ送達するための組換えウイルスベクターの使用については、以下によ
り詳細に説明する。
【００７３】
本発明のｄｓＲＮＡは、２つの別個の相補的ＲＮＡ分子として、あるいは２つの相補的
領域を有する一つのＲＮＡ分子として、組換えウイルスベクターから発現させることがで
きる。
【００７４】
ｄｓＲＮＡ分子のコード領域の発現を許容できるウイルスベクターであればいかなるベ
クターでも使用することが可能であるが、それには例えばアデノウイルス（ＡＶ）；アデ
ノ関連ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えばレンチウイルス、ラブドウイルス、
マウス白血病ウィルス（ＬＶ））；ヘルペスウィルス等のベクターが挙げられる。適切な
ように、ウイルスベクターの指向性は、別のウイルスのエンベロープタンパク質または別
の表面抗原でベクターを偽型にすることにより、あるいは別のウイルスのウイルスキャプ
シドタンパク質に置換することにより、改変することができる。
【００７５】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬
病ウイルス、エボラウイルス、Ｍｏｋｏｌａウイルス等の表面タンパク質で偽型にするこ
とができる。本発明のＡＡＶベクターは、種々のウイルスキャプシドタンパク質の血清型
２を発現するようにベクターを操作することにより、種々の細胞を標的とするようにする
ことができる。例えば、血清型２のゲノム上に血清型２のキャプシドを発現するＡＡＶベ
クターは、ＡＡＶ ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ ２／２ベクター中のこの血清型２キャプ
シド遺伝子は、ＡＡＶ ２／５ベクターを生産するために血清型５キャプシド遺伝子と置
き換えることができる。種々のキャプシドタンパク質の血清型を発現するＡＡＶベクター
を構築するための技術は当該技術分野の慣用技術である。例えば、開示全体が参照により
本願に組み込まれるRabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801を参照されたい
。
【００７６】
本発明で使用するのに適した組換えウイルスベクターの選択、ベクターでｄｓＲＮＡを
発現させるために核酸配列を挿入する方法、および対象の細胞までウイルスベクターを運
ぶ方法は、当該技術分野の慣用技術である。例えば参照によりその全体が本願に組み込ま
れるDornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechnique
s 6: 608-614;Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998),
Nature 392:25-30; およびRubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406を参照され
たい。
【００７７】
好ましいウイルスのベクターはＡＶとＡＡＶに由来するものである。特に好ましい実施
形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、例えばＵ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモータまたは一
本鎖ＲＮＡサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを有する組換えＡＡＶベクターか
ら、２つの別個の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現される。
【００７８】
本発明のｄｓＲＮＡの発現に適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法、お
よび標的細胞内へベクターを運ぶ方法は、Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 100
6-1010に記載されている。
【００７９】
本発明のｄｓＲＮＡの発現に適したＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法、
および標的細胞へベクターを運ぶ方法は、参照によりその全体が本願に組み込まれるSamu
lski R et al.(1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Viro
l, 70: 520-532;Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; 米国特許第5,2
52,479号; 米国特許第5,139,941号;国際特許出願第WO 94/13788号; および国際特許出願
第WO93/24641号に記載されている。
【００８０】
ＩＩＩ．ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物
１つの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、薬学的に許容可
能な担体とを含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、ＰＭＬ等のＪ
Ｃウイルス遺伝子の発現または活性および／またはウイルス感染に関連した疾患または障
害を治療するのに有用である。かかる医薬組成物は送達の様式に従って調製される。一つ
の例は、非経口送達を介して全身投与用に調製された組成物である。
【００８１】
本発明の医薬組成物はＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制するのに十分な用量で投与され
る。本発明者らは、有効性が高められたことにより本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を驚
くほど低用量で投与することができることを見出した。１日に被投与者の体重（キログラ
ム）あたり５ｍｇのｄｓＲＮＡを最大用量とすると、ＪＣウイルス遺伝子の発現を抑制ま
たは完全に抑止するのに十分である。
【００８２】
通常、ｄｓＲＮＡの適切な用量は、１日に被投与者の体重（キログラム）当たり０．０
１〜５．０ミリグラムの範囲、好ましくは１日に体重（キログラム）当たり１マイクログ
ラム〜１ｍｇの範囲になるであろう。医薬組成物は１日に１回投与されてもよいし、ある
いは、ｄｓＲＮＡが、その日を通じて適切な間隔で２、３、４、５または６回以上の分割
用量として、または徐放性製剤の持続注入または送達を使用して投与されてもよい。その
場合、それぞれの分割用量に含まれるｄｓＲＮＡは１日あたりの合計用量を達成するよう
に相応に少なくなるはずである。投薬単位は、数日間にわたって送達されるように、例え
ば、数日間にわたりｄｓＲＮＡを持続的に放出する従来の徐放性剤型を使用して、調合さ
れてもよい。徐放性剤型は当分野においてよく知られている。この実施形態では、投薬単
位は１日の用量の倍数相当を含んでいる。
【００８３】
当業者には当然のことであるが、ある種の要因は対象を有効に治療するために必要な投
薬量およびタイミングに影響を及ぼす可能性があり、該要因は、限定するものではないが
、例えばその疾患または障害の重症度、事前の治療、対象の全体的な健康状態および／ま
たは年齢、ならびにその他の疾患の存在である。さらに、治療上有効な量の組成物を用い
た対象の治療は、単回の治療であってもよいし、一連の複数の治療を含んでもよい。本明
細書中に別記されるように、本発明に包含される個々のｄｓＲＮＡについての有効な投薬
量およびｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の評価は、従来の方法論を用いて為されてもよい
し、あるいは適切な動物モデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて為されてもよい
。
【００８４】
マウス遺伝学の進歩により、ＪＣウイルス発現により媒介される病理過程のような様々
なヒト疾患に関する研究のための多くのマウスモデルが生み出されている。そのようなモ
デルは、ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ試験、ならびに治療上有効な用量の決定に使用され
る。
【００８５】
本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ化合物を含む医薬組成物および製剤も包含する。本発明
の医薬組成物は、局所治療が望まれるかまたは全身治療が望まれるか、および治療部位に
従って、多くの方法で投与することが可能である。投与は、局所、肺（例えば噴霧器等に
よる粉末やエアロゾルの吸入または吹送）、気管内、鼻腔内、上皮、経皮）、口腔内また
は非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内への注射
または注入、もしくは頭蓋内、例えば髄腔内または脳室内への投与が含まれる。
【００８６】
経口投与用の組成物および製剤には、散剤もしくは顆粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、
水中もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ
剤、錠剤または小型錠剤が含まれる。増粘剤、香料、賦形剤、乳化剤、分散助剤または結
合剤が望ましい場合もある。
【００８７】
非経口、髄腔内または脳室内投与のための組成物および製剤は、無菌の水溶液を含みう
るものであり、該水溶液は、バッファー、希釈剤およびその他の適切な添加剤、例えば、
限定するものではないが浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担
体もしくは賦形剤も含みうる。
【００８８】
本発明の医薬組成物としては、限定するものではないが、液剤、乳剤、およびリポソー
ム含有製剤が挙げられる。これらの組成物は、限定するものではないが、予め形成された
液剤、自己乳化型の固体および自己乳化型の半固体を含む様々な構成成分から生成可能で
ある。
【００８９】
本発明の医薬製剤（便利なように単位投与形態で提供されうる）は、医薬品産業におい
てよく知られた従来の技術に従って調製可能である。そのような技術は、有効成分を製薬
用の担体または賦形剤とともに会合させるステップを含んでいる。一般に、製剤は、有効
成分を液体担体もしくは微粉固体担体または両方とともに均一かつ念入りに会合させ、次
いで必要な場合は生成物を成形することにより調製される。
リポソーム
薬物の製剤化用に研究・使用されているものには、マイクロエマルション以外にも、多
くの組織化界面活性剤構造がある。そのような構造には、単分子膜、ミセル、二分子膜、
およびベシクルが含まれる。例えばリポソームなどのベシクルは、薬物送達という観点か
ら、それらが提供する特異性および作用の持続時間のために高い関心を集めている。本発
明において、用語「リポソーム」とは、１つまたは複数の球状二分子膜状に配置された両
親媒性脂質から構成されたベシクルを意味する。
【００９０】
リポソームは、脂溶性物質と水性内部とから構成された膜を有する一枚膜または多重膜
のベシクルである。水性部は、送達する組成物を含有している。カチオン性リポソームは
、細胞壁に融合可能であるという利点を有している。非カチオン性リポソームは、細胞壁
に効率的に融合することはできないが、ｉｎ ｖｉｖｏでマクロファージに貪食される。
【００９１】
脂質ベシクルが哺乳動物の無傷の皮膚を通過するためには、適切な経皮勾配の影響下に
、それぞれ５０ｎｍ未満の径を有する一連の細孔を通過しなければならない。したがって
、高度に変形可能で、上記のような細孔を通過できるリポソームを使用するのが望ましい
。
【００９２】
リポソームのさらなる利点としては、天然のリン脂質から得たリポソームは生体適合性
かつ生分解性であること、リポソームには、多岐にわたる水溶性および脂溶性薬物を組み
込み得ること、リポソームはその内部コンパートメント内に封入した薬物を代謝および分
解から保護できることが挙げられる〔Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieber
man, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume
1, p. 245〕。リポソーム製剤の製造に際して考慮すべき重要な点は、脂質の表面電荷、
ベシクルのサイズおよびリポソームの含水量である。
【００９３】
リポソームは、有効成分を作用部位に移動・送達するのに有用である。リポソーム膜は
、構造的に生体膜に似ているので、リポソームを組織に適用すると、リポソームは細胞膜
と融合し始め、リポソームと細胞の融合が進行するにつれ、リポソームの内容物は、有効
成分が作用し得る細胞内に取り込まれてゆく。
【００９４】
リポソーム製剤は、多くの薬物送達様式として広範な調査の対象となっている。局所投
与の場合、リポソームは他の製剤より優れたいくつかの利点を有するという証拠が増大し
ている。そのような利点としては、投与される薬物の高体内吸収に関連する副作用が減少
すること、投与薬物の所望のターゲットにおける堆積が増加すること、および親水性・疎
水性を問わず多岐にわたる薬物を皮膚に投与できることが挙げられる。
【００９５】
いくつかのレポートに、高分子量ＤＮＡを含めた作用剤を皮膚に送達するリポソームの
能力が詳述されている。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含めた化合物が
皮膚に投与されている。適用のほとんどは、表皮上層をターゲットとするものであった。
【００９６】
リポソームはおおざっぱに２つの種類に分類される。カチオン性リポソームは正帯電性
リポソームであり、負帯電性ＤＮＡ分子と相互作用して安定した複合体を形成する。正帯
電性ＤＮＡ／リポソーム複合体は、負帯電性細胞表面に結合して、エンドソームに取り込
まれる。エンドソーム内のｐＨは酸性であるために、リポソームは破裂して、その内容物
を細胞質中に放出する（Wa ng et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147,
980-985）。
【００９７】
ｐＨ感受性または負帯電性であるリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するのではなくＤＮＡを取り込む。ＤＮＡも脂質も同様に帯電しているので、複合体の形成ではなく反発作用が生じる。しかし、ＤＮＡの中には、これらのリポソームの水性内部内に取り込まれるものがある。ｐＨ感受性リポソームは、培養液中で、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを細胞単層に送達するのに用いられている。ターゲット細胞で外来遺伝子の発現が検出された（Zhouet al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274）。
【００９８】
１つの主要タイプのリポソームは、天然のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含んでいる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性融合性リポソームは、主として、ジオールコイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、ダイズＰＣやタマゴＰＣなどから形成される。ほかのタイプのものは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【００９９】
いくつかの研究では、リポソーム薬物製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームをモルモットの皮膚に投与すると、皮膚のヘルペス痛が軽減されたが、他の手段を介した（例えば、溶液またはエマルションとしての）インターフェロンの送達は効果がなかった（Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410）。さらに、もう１つの研究では、水溶液系を用いたインターフェロン投与に対してリポソーム製剤の一部として投与したインターフェロンの薬効をテストし、リポソーム製剤は水溶液投与より優れているとの結論に達した（du Plessis et al., Antiviral Research, 1992,18, 259-265）。
【０１００】
また、非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含むシステムを、皮膚への薬物送達におけるそれらの実用性を測定するために調べた。マウスの皮膚の真皮にシクロスポリンＡを送達するために、Ｎｏｖａｓｏｍｅ．ＴＭ．Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）とＮｏｖａｓｏｍｅ．ＴＭ．ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を用いた。その結果によると、そのような非イオン性リポソーム系は皮膚のさまざまな層へのシクロスポリンＡの堆積を促進するのに有効であった（Hu et al., S. T. P. Pharma. Sci., 1994, 4,6, 466）。
【０１０１】
リポソームには、さらに、「立体的に安定化させた」（sterically stabilized）リポ
ソームが含まれるが、この用語は、本明細書においては、１または複数種の特殊な脂質を
含むリポソームを指し、こうした脂質は、リポソームに組み込まれると、そのような特殊
な脂質を含まないリポソームに比べて循環血中寿命が高められる。立体的に安定化させた
リポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部の一部が、（Ａ）１または複数種の
糖脂質、例えば、モノシアロガングリオシド Ｇ．ｓｕｂ．Ｍ１を含むか、または（Ｂ）
１または複数種の親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘
導体化されているものである。特定の理論に拘束されることは意図しないが、当該技術分
野においては、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体
化脂質を含有する立体的に安定化させたリポソームの場合、これらの立体的に安定化させ
たリポソームの高い循環血中半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）細胞への取り込み量の低下
に由来すると考えられている（Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al.
, Cancer Research, 1993, 53, 3765）。
【０１０２】
当該技術分野では１または複数種の糖脂質を含むさまざまなリポソームが知られている
。パパハジョプーロスら（Papahadjopoulos et al.）（Ann. N. Y. Acad. Sci., 1987, 5
07, 64）は、リポソームの血中半減期を延ばすモノシアロガングリオシドＧ．ｓｕｂ．Ｍ
１、ガラクトセレブロシド硫酸エステルおよびホスファチジルイノシトールの能力を報告
した。これらの知見については、ガビゾンら（Gabizon et al.）（Proc. Natl. Acad. Sc
i., U.S.A.,1988, 85, 6949）が詳しく説明した。いずれもアレンら（Allen et al.）に
付与された米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４号は、（１）ス
フィンゴミエリンと（２）ガングリオシドＧ．ｓｕｂ．Ｍ１またはガラクトセレブロシド
硫酸エステルとを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号〔ウ
エッブら（Webbet al.）〕は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。
１，２−ｓｎ−ジミリストイルホフファチジルコリンがＷＯ９７／１３４９９号〔リムら
（Lim etla）〕に開示されている。
【０１０３】
当該技術分野では、１または複数種の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多く
のリポソームおよびそれらの製造法が周知である。スナモトら（Sunamoto et al.）（B u
ll. Chem. Soc.Jpn., 1980, 53, 2778）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性
剤、２Ｃ．ｓｕｂ．１２１５Ｇを含むリポソームを記載した。イルムら（Ｉｌｌum et al
.）（FEBS Lett.,1984, 167, 79）は、ポリスチレン粒子をポリマーグリコールで親水性
コーティングすることにより、血中半減期が著しく向上すると指摘した。ポリアルキレン
グリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基を付けて修飾した合成リン脂質がシアーズ
（Sears）（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）により
記載されている。クリバノフら（Klibanov et al.）（FEBS Lett., 1990, 267,235）は、
ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ
）を含むリポソームが循環血中半減期を著しく増大させることを実証する実験を記載した
。ブリュームら（Blumeet al.）（Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91）
は、上記のような観察結果を、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組み合わせから形成されたＤＳ
ＰＥ−ＰＥＧにも適用した。外面に共有結合ＰＥＧ部分を有するリポソームが、フィッシ
ャー（Fisher）に付与された、欧州（ＥＰ）特許第０ ４４５ １３１ Ｂ１号およびＷ
Ｏ９０／０４３８４号に記載されている。１〜２０モル％のＰＥＧ誘導体化ＰＥを含有す
るリポソーム組成物およびその使用法が、ウードルら（Woodle et al.）（米国特許第５
，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）ならびにマーチンら（Martin et
al.）（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州（ＥＰ）特許第０ ４９６ ８１３
Ｂ１号）により記載されている。多くの他の脂質・ポリマーコンジュゲートを含むリポ
ソームが、ＷＯ９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（いずれもマ
ーチンらに付与）ならびにＷＯ９４／２００７３号〔ザリプスキーら（Zalipsky et al.
）〕で開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームがＷＯ９６／１０３９
１号〔チョイら（Choiet al.）〕に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号
〔ミヤザキら（Miyazakiet al.）〕および米国特許第５，５５６，９４８号〔タガワら
（Tagawaet al.）〕は、さらに表面の官能基で誘導体化し得るＢＥＧ含有リポソームを
記載している。
【０１０４】
当該技術分野では、核酸を含むリポソームはわずかしか知られていない。ティエリーら
（Tierryet al.）に付与されたＷＯ９６／４００６２号は、高分子量の核酸をリポソー
ムに封入する方法を開示している。タガワら（Tagawa et al.）に付与された米国特許第
５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示しており、そのようなリポソ
ームの内容物には、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡが含まれると主張している。ラーマンら（Rahman
et al.）に付与された米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチ
ドをリポソームに封入するいくつかの方法を記載している。ラブら（Love et al.）に付
与されたＷＯ９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子をターゲットとするｄｓＲＮＡ ｄｓ
ＲＮＡｓを含むリポソームを開示している。
【０１０５】
トランスフェルソームはさらに別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルの魅
力的な候補である高変形性脂質集合体である。トランスフェルソームは脂質滴と言っても
よく、非常に変形性が高いので、脂質滴より小さい細孔を容易に貫通し得る。トランスフ
ェルソームは使用環境に適応可能であり、例えば、自己最適化性（皮膚の細孔形状に適合
可能）、自己修復性であり、高頻度で砕けずにターゲットに到達し、多くの場合、自動装
填性である。トランスフェルソームを作製するために、標準リポソーム組成物に、表面エ
ッジ活性化剤（surfaceedge-activator）、通常、界面活性剤を添加することができる。
トランスフェルソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するのに用いられている。トラン
スフェルソームを介した血清アルブミンの送達は、血清アルブミン含有溶液の皮下注射と
同じくらい有効であることが証明されている。
【０１０６】
界面活性剤は、（マイクロエマルションを含めた）エマルションやリポソームなどの製
剤に広く用いられている。天然のみならず合成の多くの異なるタイプの界面活性剤を分類
し、ランク付けする最も一般的な方法は、親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を使用する
方法である。（「ヘッド」としても知られている）親水基の性質は、製剤に用いられるさ
まざまな界面活性剤を分類するのに最も有用な手段となる（Rieger, in Pharmaceutical
Dosage Forms,Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p.285）。
【０１０７】
界面活性剤分子は、イオン化されていない場合、非イオン性界面活性剤と分類される。
非イオン性界面活性剤は、医薬品や化粧品に広く適用されており、広範なｐＨ範囲にわた
って使用可能である。一般に、非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値は、それらの構造に応じ
て２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、非イオン性エステル、例えば、
エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリコールエステル、グ
リセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル
、およびエトキシル化エステルが含まれる。非イオン性アルカノールアミドや、例えば、
脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポ
キシル化ブロックポリマーなどもこの分類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は
、非イオン性界面活性剤類のうちで最も良く知られているメンバーである。
【０１０８】
界面活性剤分子が水中に溶解または分散しているとき負に帯電している場合、この界面
活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤には、カルボキシレート、例え
ば、石けん、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、
アルキルスルフェートおよびエトキシル化アルキルスルフェート、スルホネート、例えば
、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスル
ホスクシネート、ならびにホスフェートが含まれる。アニオン性界面活性剤類のうちで最
も重要なメンバーは、アルキルスルホネートおよび石けんである。
【０１０９】
界面活性剤分子が水中に溶解または分散しているときに正に帯電しる場合、この界面活
性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩およ
びエトキシル化アミンが含まれる。第四級アンモニウム塩はこの分類中最も良く使用され
ているメンバーである。
【０１１０】
界面活性剤分子が正または負の電荷を担持する能力を有する場合、この界面活性剤は両
性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−ア
ルキルベタインおよびホフファチドが含まれる。
【０１１１】
医薬品、製剤、およびエマルションにおける界面活性剤の使用が概説されている（Rieg
er, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p
.285）。
【０１１２】
本発明の医薬組成物および他の組成物には、ｄｓＲＮＡの細胞レベルでの取り込みを強
化する作用剤をさらに添加し得る。例えば、リポフェクチン（Junichi et al., U.S. Pat
.No.5,705,188）などのカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体や、ポリリシン
（Lollo et al., PCT Application WO 97/30731）などのポリカチオン分子もｄｓＲＮＡ
の細胞取り込みを強化することが知られている。
【０１１３】
投与する核酸の貫通率を高めるために、エチレングリコールやプロピレングリコールな
どのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、およびリモネンやメントンなど
のテルペンを含めた他の作用剤を利用し得る。
【０１１４】
担体
本発明のいくつかの組成物は、製剤中にさらに担体化合物を組み込む。本明細書におい
て、「担体化合物」または「担体」は、核酸、またはそのアナログに関連し得、不活性で
はあるが（すなわち、それ自体、生物活性を有していないが）、例えば、生物学的に活性
な核酸を分解するか、核酸の循環血液中からの除去を促進することにより、生物活性を有
する核酸のバイオアベイラビリティーを低下させる生体内プロセスによって核酸として認
識される。核酸と、通常過剰量の担体化合物とを同時投与することにより、恐らく担体化
合物と核酸が共通の受容体に対して競合するために、肝臓、腎臓または他の循環外貯蔵器
（extracirculatory reservoirs）に回収される核酸の量を実質的に減少させ得る。例え
ば、部分的ホスホロチオアート ｄｓＲＮＡと、ポリイノシン酸、デキストランスルフェ
ート、ポリシチジン酸または４−アセトアミド−４’イソチオシアノスチルベン−２，２
’−ジスルホン酸とを同時投与すると、肝組織における部分的ホスホロチオアート ｄｓ
ＲＮＡの回収を減少させることができる（Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 11
5-121; Takakuraet al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。
【０１１５】
賦形剤
担体化合物とは違って、「医薬担体」または「賦形剤」は、１または複数種の核酸を動
物に送達するための医薬上許容される溶媒、懸濁剤または任意の他の薬理学的に不活性な
ビヒクルである。賦形剤は、液体でも固体でもよく、考慮された計画的投与法に基づいて
、核酸や所与の医薬組成物の他の成分と組み合わせたときに、所望のバルク、整合性など
が得られるように選択する。典型的な医薬担体としては、結合剤（例えば、プレゼラチン
化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロ
ースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、微晶質セルロース、ペクチン
、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カ
ルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイ
ド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ
、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例え
ば、スターチ、ナトリウムスターチグリコール酸塩など）；および湿潤剤（例えば、ラウ
リル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、それらには限定されない。
【０１１６】
本発明の組成物の製剤化には、核酸と有害な反応をしない、非経口投与に適した、医薬
上許容される有機または無機賦形剤を使用することもできる。適当な医薬上許容される担
体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース
、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、種々のパラフィン、ヒドロ
キシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、それらには限定され
ない。
【０１１７】
適当な医薬上許容される賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリ
コール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ
酸、種々のパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げ
られるが、それらには限定されない。
【０１１８】
他の成分
本発明の組成物は、さらに、医薬組成物中に通常見られる他の補助成分を当該技術分野
で確立された使用量（art-established usage level）で含み得る。したがって、例えば
、本発明の組成物は、追加の相溶性薬理活性物質、例えば、かゆみ止め剤、収斂剤、局所
麻酔剤または抗炎症剤などを含むか、または、本発明組成物のさまざまな剤形を物理的に
製剤化するのに有用な追加物質、例えば、染料、香料、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増
粘剤および安定剤などを含み得る。しかし、そのような物質は、添加する場合、本発明の
組成物成分の生物活性に必要以上に干渉するものであってはならない。本発明の製剤は、
滅菌し、必要に応じて、製剤中の核酸と有害な相互作用をしない助剤、例えば、潤滑剤、
保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を支配する塩、緩衝剤、着色剤、矯味／香味物
質などと混合することができる。
【０１１９】
水性懸濁液は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび
／またはデキストランを含めた、懸濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。懸濁液はさ
らに安定剤を含み得る。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態は、（ａ）１または複数種のアンチセンス化合物と、（ｂ
）非アンチセンス機構によって機能を果たす１または複数種の他の化学療法剤とを含む医
薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例としては、ダウノルビシン、ダウノマイ
シン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン
、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ビス
−クロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、ミトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、
ミスラマイシン、プレドニソン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシ
フェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン
、ミトキサントロン、アムサクリン、クロルアンブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ
ウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプ
トプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオ
キシコフォルマイシン、４−ヒドロキシペロキシシクロホスホールアミド、５−フルオロ
ウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサ
ート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシ
ド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テ
ニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が挙げられるが、
それらには限定されない。概括的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1
5th Ed. 1987,pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N.J.参照。そのような化
学療法剤は、本発明の化合物と共に使用する際には、個別に（例えば、５−ＦＵとオリゴ
ヌクレオチド）、連続的に（例えば、一定時間、５−ＦＵとオリゴヌクレオチド、続いて
、ＭＴＸとオリゴヌクレオチド）、または１または複数種の他のそのような化学療法剤と
組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸとオリゴヌクレオチド、または５−ＦＵ、放射
線治療とオリゴヌクレオチド）用い得る。本発明の組成物では、非ステロイド性抗炎症薬
およびコルチコステロイドを含むがそれらには限定されない抗炎症薬と、リビビリン、ビ
ダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むがそれらには限定されない抗ウイル
ス薬とを組み合わせてもよい。概括的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therap
y, 15th Ed.,Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J.のそれぞれ2499-2506ページお
よび46-49ページ参照。他の非アンチセンス化学療法剤も本発明の範囲内である。2種以上
の組み合わせ化合物を同時にまたは連続して用いてもよい。
【０１２１】
上記化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％致死量）およびＥ
Ｄ５０（集団の５０％治療有効量）を測定するための、細胞培養物または実験動物におけ
る標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は
治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数
を示す化合物が好ましい。
【０１２２】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒトで使用するための用量範囲の
策定に使用することができる。本発明の組成物の用量は、一般に、毒性をほとんどまたは
全く伴わないＥＤ５０を含む循環血中濃度範囲内にある。用量は、この範囲内で、使用す
る剤形および利用する投与経路に応じて異なり得る。本発明の方法で使用するいずれの化
合物の場合も、治療有効量は、先ず、細胞培養アッセイから決定することができる。用量
は、動物モデルにおいては、細胞培養で測定したＩＣ５０（つまり症状の最大抑制の５０
％を達成するのに必要な試験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿中濃度範囲、または
適切な場合にはターゲット配列のポリペプチド生成物の（例えば、ポリペプチドの濃度減
少を達成する）循環血漿中濃度範囲が得られるように策定可能である。そのような情報は
、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中濃
度は、例えば高速液体クロマトグラフィによって測定可能である。
【０１２３】
本発明のｄｓＲＮＡは、上記に説明したような個別投与または複数投与に加えて、ＪＣウイルス発現によって媒介される病理過程の治療に有効な他の既知作用剤と併用投与することができる。いずれの場合にも、投与する医師は、当該技術分野で周知または本明細書に記載の標準的な有効性の尺度を用いて観察した結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節することができる。
【０１２４】
ＪＣウイルス由来遺伝子の発現によって起こる疾患を治療する方法
本発明は、特に、ＪＣウイルス感染、例えば、ＰＭＬに関連する病的状態を治療または
予防するためのｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡから作られた医薬組成物の使用に関する。本
発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡから作られた医薬組成物は、ＪＣウイルス発現に対す
る抑制作用のために、特に、ＭＳの治療の一部として抗ＶＬＡ４抗体で治療を受けている
患者の生活の質を高めることができる。
【０１２５】
本発明はさらに、ＰＭＬを治療するために、ｄｓＲＮＡまたはその医薬組成物を、他の
医薬品および／または他の治療法と併用して、例えば、既知医薬品および／または既知治
療法、例えば、ガンの治療および／または腫瘍転移の予防のために現在用いられているも
のなどと併用することに関する。放射線治療や、化学療法剤、例えば、シスプラチン、シ
クロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンまたはタ
モキシフェンなどと併用するのが好ましい。
【０１２６】
本発明はさらに、特異的ＲＮＡｉ剤と、従来の化学療法剤などの別の抗ガン化学療法剤
とを組み合わせて実施することもできる。特異的結合剤とそのような他の作用剤とを併用
することにより化学療法プロトコルの治療効果を高めることができる。本発明の方法に組
み込み得るものとして多くの化学療法プロトコルが当業者の心に浮かぶであろう。アルキ
ル化剤や、代謝拮抗剤、ホルモンおよびアンタゴニスト、放射線同位元素、ならびに天然
物を含めた任意の化学療法剤を使用することができる。例えば、本発明の化合物は、ドキ
ソルビシンおよび他のアントラサイクリンアナログなどの抗生物質、シクロホスファミド
などのナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシルなどのピリミジンアナログ、シ
スプラチン、ヒドロキシウレア、タキソールおよびその天然および合成誘導体などと併せ
て投与することができる。別の例として、例えば、腫瘍がゴナドトロピン依存性細胞とゴ
ナドトロピン非依存性細胞とを含む乳腺腺癌などの混合腫瘍の場合、本発明の化合物は、
ロイプロリドまたはゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチドアナログ）と併せて投与する
ことができる。他の抗腫瘍プロトコルには、テトラサイクリン化合物と、本明細書では「
付加抗腫瘍モダリティー」とも称される別の治療モダリティー、例えば、外科手術、放射
線などとの併用も含まれる。したがって、本発明の方法は、そのような従来の投薬計画と
併用して、副作用を軽減し、かつ効力を増強するという利点を得ることができる。
【０１２７】
ＪＣウイルス由来遺伝子の発現を抑制する方法
さらに別の態様で、本発明は、哺乳動物におけるＪＣウイルス由来の遺伝子の発現を抑制
する方法を提供する。この方法は、ターゲットＪＣウイルスゲノムの発現がサイレンシン
グされるように、哺乳動物に本発明の組成物を投与するステップを含む。本発明のｄｓＲ
ＮＡは、特異性が高いために、ターゲットＪＣウイルス遺伝子のＲＮＡ（第一次ＲＮＡま
たはプロセシング後ＲＮＡ）を特異的にターゲットとする。ｄｓＲＮＡを用いたこれらの
ＪＣウイルスの発現を抑制する組成物および方法は、本明細書中に別記されるようにして
実施することができる。
【０１２８】
本発明の方法は、１つの実施形態において、治療する哺乳動物に、ＪＣウイルス遺伝子
のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を有するｄｓＲＮＡを含む
組成物を投与するステップを含む。治療する生物がヒトなどの哺乳動物である場合、組成
物は、経口または非経口経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道内（エアロゾ
ール）、鼻腔内投与を含むが、それらには限定されない、当該技術分野では周知の任意の
手段を用いて投与し得る。好ましい実施形態において、組成物は、静脈内注入または注射
により投与される。
【０１２９】
別途定義のないかぎり、本明細書中で使用される技術用語および科学用語はすべて本発
明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書
に記載のものと同様または等価である方法および材料を本発明の実施または試験に用いる
ことも可能であるが、適切な方法および材料については下記に述べる。本明細書で記載の
すべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献はそれらの内容全体が参照により
本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書に従う。さらに
、材料、方法および実施例は一例に過ぎず、限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０１３０】
実施例
ＪＣＶ ｓｉＲＮＡの設計
２００６年４月１０日に利用可能なＪＣウイルスの全長ゲノム配列を得て、３８８個の
配列からなるターゲットプールを調製した（アクセス番号：ＡＢ０３８２３９．１−ＡＢ
０３８２５５．１；ＡＢ０４８５４５．１−ＡＢ０４８５８２．１；ＡＢ０７４５７５．
１−ＡＢ０７４５９１．１；ＡＢ０７７８５５．１−ＡＢ０７７８７９．１；ＡＢ０８１
００５．１−ＡＢ０８１０３０．１；ＡＢ０８１６００．１−ＡＢ０８１６１８．１；Ａ
Ｂ０８１６５４．１；ＡＢ０９２５７８．１−ＡＢ０９２５８７．１；ＡＢ１０３３８７
．１；ＡＢ１０３４０２．１−ＡＢ１０３４２３．１；ＡＢ１０４４８７．１；ＡＢ１１
３１１８．１−ＡＢ１１３１４５．１；ＡＢ１１８６５１．１−ＡＢ１１８６５９．１；
ＡＢ１２６９８１．１−ＡＢ１２７０２７．１；ＡＢ１２７３４２．１；ＡＢ１２７３４
４．１；ＡＢ１２７３４６．１−ＡＢ１２７３４９．１；ＡＢ１２７３５２．１−ＡＢ１
２７３５３．１；ＡＢ１９８９４０．１−ＡＢ１９８９５４．１；ＡＢ２２０９３９．１
−ＡＢ２２０９４３．１；ＡＦ００４３４９．１−ＡＦ００４３５０．１；ＡＦ０１５５
２６．１−ＡＦ０１５５３７．１；ＡＦ０１５６８４．１；ＡＦ０３００８５．１；ＡＦ
２８１５９９．１−ＡＦ２８１６２６．１；ＡＦ２９５７３１．１−ＡＦ２９５７３９．
１；ＡＦ３００９４５．１−ＡＦ３００９６７．１；ＡＦ３６３８３０．１−ＡＦ３６３
８３４．１；ＡＦ３９６４２２．１−ＡＦ３９６４３５．１；ＡＹ１２１９０７．１−Ａ
Ｙ１２１９１５．１；ＮＣ ００１６９９．１；Ｕ６１７７１．１；Ｕ７３５００．１−
Ｕ７３５０２．１）。ＮＣ ００１６９９を参照配列とした。
【０１３１】
ｓｉＲＮＡの選定過程は以下のように実施した：ターゲットプールから全配列のグロー
バルアラインメントを生成するために、ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアラインメントを用
いた。次いで、ＩＵＰＡＣコンセンサス配列を生成した。
【０１３２】
Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ塩基のみを含むストレッチで表され、したがって、ターゲットプールの全配列中に存在するＩＵＰＡＣコンセンサス配列からのすべての保存された１９ｍｅｒターゲット配列を選択した。ＪＣウイルスの転写配列部分をターゲットとするｓｉＲＮＡのみを選択するために、保存された１９ｍｅｒターゲット配列のプールから候補ターゲット配列を選択した。このために、それぞれ後期および初期遺伝子用に、参照配列に関してヌクレオチド１６３〜２５９の領域をカバーする候補ターゲット配列と２５２７〜５１１５の領域をカバーする候補ターゲット配列を抽出した。さらに、初期遺伝子の配列はゲノム配列と比べて逆相補配列方向にあるので、これらの遺伝子の候補ターゲット配列を逆相補配列に移し、前者の候補ターゲット配列プールに代えた。
【０１３３】
候補ターゲット配列とその各ｓｉＲＮＡをランク付けし、適切なものを選択するために
、予測されるそれらの関連ターゲットとの相互作用の可能性（オフターゲットの可能性）
をランク付けパラメータとみなした。オフターゲットの可能性が低いｓｉＲＮＡを好まし
いものと定義し、ｉｎ ｖｉｖｏでより特異的であると推測した。
【０１３４】
ｓｉＲＮＡに特有なオフターゲットの可能性を予測するために、以下の仮設をたてた：
（１） 鎖の（５’−３’方向に数えて）２〜９位（シード領域）では、残りの配列（非
シードおよび切断部位領域）よりオフターゲットの可能性が高くなり得る；
（２） 鎖の（５’−３’方向に数えて）１０及び１１位（切断部位領域）では、非シー
ド領域よりオフターゲットの可能性が高くなり得る；
（３） オフターゲットスコアは、ヒットするたびに、ｓｉＲＮＡ配列に対する同一性お
よびミスマッチの位置に基づいて計算することができる；
（４）導入される内部修飾によってセンス鎖の活性が阻止され得ると仮定すれば、アンチ
センス鎖のオフターゲット可能性のみが関係がある。
【０１３５】
潜在的オフターゲット遺伝子を同定するために、公的に入手可能なヒトｍＲＮＡ配列に
対して１９ｍｅｒ入力配列を相同性検索にかけた。
【０１３６】
この目的のために、ヒトＲｅｆＳｅｑデータベース（２００６年１１月７日にｆｔｐ：
／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑからダウンロードした入手可能な
バージョン）に対して、すべての１９ｍｅｒ候補ターゲット配列に関してｆａｓｔＡ（バ
ージョン３．４）検索を実施した。ｆａｓｔＡ検索は、ギャップを含まない１９ｍｅｒの
全長にわたる相同性を考慮に入れるために、パラメータ値ペア−ｆ５０／ｇ５０を用いて
実行した。ｆａｓｔＡ出力ファイル中のすべての関連オフターゲットヒットを確実にリス
トにするために、さらにパラメータ−Ｅ３００００を用いた。すべてのヌクレオチドマッ
チをスコア１３と評価し、すべてのミスマッチを−７と評価する検索の実行にスコアリン
グマトリックスを適用した。この検索の結果、各候補ｓｉＲＮＡに関する潜在的オフター
ゲットのリストを得た。
【０１３７】
得られた各ｓｉＲＮＡに関する潜在的オフターゲットのリストを分類するために、ｆａ
ｓｔＡ出力ファイルを分析して、最適なオフターゲットとそのオフターゲットスコアを識
別した。各オフターゲットに関して、各１９ｍｅｒ入力配列の以下のオフターゲット特性
を抽出して、オフターゲットスコアを計算した：
非シード領域中のミスマッチ数
シード領域中のミスマッチ数
切断部位領域中のミスマッチ数。
仮説１〜３を検討するためにオフターゲットスコアを以下のように計算した：
オフターゲットスコア ＝ シード領域ミスマッチの数＊ １０
＋ 切断部位領域ミスマッチの数 ＊ １．２
＋ 非シード領域ミスマッチの数 ＊ １
入力された各１９ｍｅｒ入力配列に最も関連性のあるオフターゲット遺伝子を最低のオ
フターゲットスコアを有する遺伝子と定義した。したがって、最低のオフターゲットスコ
アを対応ｓｉＲＮＡに対する関連オフターゲットスコアと定義した。
【０１３８】
ｓｉＲＮＡのランキングを作成するために、計算した関連オフターゲットスコアを結果
表に書き込んだ。すべてのｓｉＲＮＡを、オフターゲットスコアに従って（下降）分類し
た。
【０１３９】
オフターゲットスコア２．２をｓｉＲＮＡ選択に関するカットオフ値（特異性基準）と
定義した。さらに、シード領域中にミスマッチが１つしかない配列はすべてスクリーニン
グ試験から排除した。選択手順の結果、一連の９３ＪＣＶ特異的ｓｉＲＮＡを得た（表１
ａ）。
【０１４０】
新たに利用可能になったヒトＲｅｆＳｅｑデータベース〔ＲｅｆＳｅｑリリースバージ
ョン２１（２００７年１月１２日にダウンロード）のヒトｍＲＮＡ配列〕に基づいて予測
特異性を再計算し、１列に３つ以下のＧしか含んでおらず、アンチセンス鎖に関するオフ
ターゲットスコアが２以上の２０８ｓｉＲＮＡのみを選択して、スクリーニングの拡大を
行った（表１ｂ）。
【０１４１】
ＪＣＶ ｓｉＲＮＡの合成
すべてのｓｉＲＮＡは、標準手順に従って、ＡＢ１３９００ ＤＮＡ合成装置において
、０．２μｍｏｌｅ合成スケールで合成した。
【０１４２】
初期スクリーニングセット（９３個の異なるｓｉＲＮＡ配列）では、４種の異なる化学
修飾法を用いた：
（ａ）外部／内部光（ＥＥＬ） − センス鎖： ２’Ｏ−メチル全ピリミジン、（５
’末端から数えて）ヌクレオチド２０と２１の間のＰＴＯ、３’末端のｄＴｄＴ（ヌクレ
オチド２０と２１）
− アンチセンス鎖： ５’−ＵＡ−３’および５’
−ＣＡ−３’モチーフ中のピリミジンにおける２’−Ｏ−メチル、（５’末端から数えて
）ヌクレオチド２０と２１の間のＰＴＯ、３’末端におけるｄＴｄＴ（ヌクレオチド２０
と２１）
（ｂ）アンチセンス鎖の２位におけるＥＥＬプラス２’−Ｏ−メチル（５’末端に５’−
ＵＡ−３’および５’−ＣＡ−３’がない場合のみで、そうでなければ、すでにＥＥＬで
カバーされている）
（ｃ）センス鎖の２位におけるＥＥＬプラス２’−Ｏ−メチル（２位にピリミジンがない
場合のみで、そうでなければ、すでにＥＥＬでカバーされている）
（ｄ）センス鎖およびアンチセンス鎖の２位におけるＥＥＬプラス２’−Ｏ−メチル（す
でにａ、ｂおよびｃでカバーされていない場合のみ）。
【０１４３】
拡大スクリーニングセット（２０８個の異なるｓｉＲＮＡ配列）の場合、ｓｉＲＮＡは
、ｄＴｄＴオーバーハング〔アンチセンス鎖およびセンス鎖の３’
末端（ヌクレオチド２０と２１）におけるｄＴｄT〕を有する非修飾ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドからなっていた（表１ｂ）。
ＪＣＶ ｓｉＲＮＡのスクリーニング
ＪＣＶ転写物をコードするレポーター系の構築
初期ＪＣＶ転写物（Ｅ）配列をＧＥＮＥＡＲＴ社〔ドイツ、レーゲンスブルク（Regens
burg）所在〕で合成し、ＧＥＮＥＡＲＴ標準ベクターにクローン化した。第１アプローチ
で後期ＪＣＶ転写物の配列を、２つのフラグメント：ＶＰ１タンパク質の転写物配列を含
むＬ１と、ＶＰ２、ＶＰ３およびアグノタンパク質の配列を含むＬＡ２３とに分割した。
フラグメントＬＡ２３に係るクローニング問題のために、第２アプローチで、この配列を
２つのフラグメント（ＬＡ２３ １−７００とＬＡ２３ ７０１−１４３８）に分割した
。すべての配列をＧＥＮＥＡＲＴで合成し、ＧＥＮＥＡＲＴ標準ベクターにクローン化し
た。全フラグメント（Ｅ、Ｌ１、ＬＡ２３ １−７００およびＬＡ２３ ７０１−１４３
８）を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ〔共に、ドイツ、フランクフルト（Frankfurt）所在の
ＮＥＢ社〕を介してｐｓｉＣｈｅｃｋ−２〔ドイツ、マンハイム（Mannheim）所在のプロ
メガ（Promega）社〕にサブクローン化し、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼの終
止コドンとポリＡシグナルとの間にＪＣＶ配列を有する構築物を得た。
Ｌ１
CTCGAGACTTTTAGGGTTGTACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCATATGAAGATGGCCCCAACAAAAAGAAAAGGA
GAAAGGAAGGACCCCGTGCAAGTTCCAAAACTTCTTATAAGAGGAGGAGTAGAAGTTCTAGAAGTTAAAACTGGGGTTGA
CTCAATTACAGAGGTAGAATGCTTTTTAACTCCAGAAATGGGTGACCCAGATGAGCATCTTAGGGGTTTTAGTAAGTCAA
TTTCTATATCAGATACATTTGAAAGTGACTCCCCAAATAAGGACATGCTTCCTTGTTACAGTGTGGCCAGAATTCCACTA
CCCAATCTAAATGAGGATCTAACCTGTGGAAATATACTAATGTGGGAGGCTGTGACCTTAAAAACTGAGGTTCTAGGGG
TGACAACTTTGATGAATGTGCACTCTAATGGTCAAGCAACTCATGACAATGGTGCAGGAAAGCCAGTGCAGGGCACCAGC
TTTCATTTTTTTTCTGTTGGCGGGGAGGCTTTAGAATTACAGGGGGTGGTTTTTAATTACAGAACAAAGTACCCAGATGG
AACAATTTTTCCAAAGAATGCAACAGTGCAATCTCAAGTAATGAACACAGAGCACAAGGCGTACCTAGATAAGAACAAA
GCATATCCTGTTGAATGTTGGGTTCCTGATCCCACCAGAAATGAAAACACAAGATATTTTGGGACACTAACAGGAGGAGA
AAATGTTCCTCCAGTTCTTCATATAACAAACACTGCCACAACAGTGCTGCTTGATGAATTTGGTGTTGGGCCACTTTGCA
AAGGTGACAACTTGTATTTGTCAGCTGTTGATGTTTGTGGAATGTTTACTAACAGATCTGGTTCCCAGCAGTGGAGAGG
ACTGTCCAGATATTTTAAGGTTCAGCTCAGAAAAAGGAGGGTTAAAAACCCCTACCCAATTTCTTTCCTTCTTACTGATT
TGATTAACAGAAGGACCCCTAGAGTTGATGGGCAACCTATGTATGGTATGGATGCTCAGGTAGAGGAGGTTAGAGTTTTT
GAGGGGACAGAGGAACTTCCAGGGGACCCAGACATGATGAGATATGTTGACAGATATGGACAGTTGCAAACAAAGATGC
TGTAATCAAAATCCTTTATTGTAATATGCAGTACATTTTAATAAAGTATAACCAGCTTTACTTTACAGTTGCAGTCATGC
GGCCGC (配列番号９３１)

Ｅ
CTCGAGCCGCCTCCAAGCTTACTCAGAAGTAGTAAGGGCGTGGAGGCTTTTTAGGAGGCCAGGGAAATTCCCTTGTTTTT
CCCTTTTTTGCAGTAATTTTTTGCTGCAAAAAGCTAAAATGGACAAAGTGCTGAATAGGGAGGAATCCATGGAGCTTATG
GATTTATTAGGCCTTGATAGGTCTGCATGGGGGAACATTCCTGTCATGAGAAAAGCTTATCTGAAAAAATGCAAAGAACT
CCACCCTGATAAAGGTGGGGACGAAGACAAGATGAAGAGAATGAATTTTTTATATAAAAAAATGGAACAAGGTGTAAAAG
TTGCTCATCAGCCTGATTTTGGTACATGGAATAGTTCAGAGGTTGGTTGTGATTTTCCTCCTAATTCTGATACCCTTTA
TTGCAAGGAATGGCCTAACTGTGCCACTAATCCTTCAGTGCATTGCCCCTGTTTAATGTGCATGCTAAAATTAAGGCATA
GAAACAGAAAATTTTTAAGAAGCAGCCCACTTGTGTGGATAGATTGCTATTGCTTTGATTGCTTCAGACAATGGTTTGGG
TGTGACTTAACCCAAGAAGCTCTTCATTGCTGGGAGAAAGTTCTTGGAGACACCCCCTACAGGGATCTAAAGCTTTAAG
TGCCAACCTATGGAACAGATGAATGGGAATCCTGGTGGAATACATTTAATGAGAAGTGGGATGAAGACCTGTTTTGCCAT
GAAGAAATGTTTGCCAGTGATGATGAAAACACAGGATCCCAACACTCTACCCCACCTAAAAAGAAAAAAAAGGTAGAAGA
CCCTAAAGACTTTCCTGTAGATCTGCATGCATTCCTCAGTCAAGCTGTGTTTAGTAATAGAACTGTTGCTTCTTTTGCT
GTGTATACCACTAAAGAAAAAGCTCAAATTTTATATAAGAAACTTATGGAAAAATATTCTGTAACTTTTATAAGTAGACA
TGGTTTTGGGGGTCATAATATTTTGTTTTTCTTAACACCACATAGACATAGAGTGTCAGCAATTAATAACTACTGTCAAA
AACTATGTACCTTTAGTTTTTTAATTTGTAAAGGTGTGAATAAGGAATACTTGTTTTATAGTGCCCTGTGTAGACAGCC
ATATGCAGTAGTGGAAGAAAGTATTCAGGGGGGCCTTAAGGAGCATGACTTTAACCCAGAAGAACCAGAAGAAACTAAGC
AGGTTTCATGGAAATTAGTTACACAGTATGCCTTGGAAACCAAGTGTGAGGATGTTTTTTTGCTTATGGGCATGTACTTA
GACTTTCAGGAAAACCCACAGCAATGCAAAAAATGTGAAAAAAAGGATCAGCCAAATCACTTTAACCATCATGAAAAAC
ACTATTATAATGCCCAAATTTTTGCAGATAGCAAAAATCAAAAAAGCATTTGCCAGCAGGCTGTTGATACTGTAGCAGCC
AAACAAAGGGTTGACAGCATCCACATGACCAGAGAAGAAATGTTAGTTGAAAGGTTTAATTTCTTGCTTGATAAAATGGA
CTTAATTTTTGGGGCACATGGCAATGCTGTTTTAGAGCAATATATGGCTGGGGTGGCCTGGATTCATTGCTTGCTGCCTC
AAATGGACACTGTTATTTATGACTTTCTAAAATGCATTGTATTAAACATTCCAAAAAAAAGGTACTGGCTATTCAAGGG
GCCAATAGACAGTGGCAAAACTACTTTAGCTGCAGCTTTACTTGATCTCTGTGGGGGAAAGTCATTAAATGTTAATATGC
CATTAGAAAGATTAAACTTTGAATTAGGAGTGGGTATAGATCAGTTTATGGTTGTATTTGAGGATGTAAAAGGCACTGGT
GCAGAGTCAAGGGATTTACCTTCAGGGCATGGCATAAGCAACCTTGATTGCTTAAGAGATTACTTAGATGGAAGTGTAA
AAGTTAATTTAGAGAGAAAACACCAAAACAAAAGAACACAGGTGTTTCCACCTGGAATTGTAACCATGAATGAATATTCA
GTGCCTAGAACTTTACAGGCCAGATTTGTAAGGCAGATAGATTTTAGACCAAAGGCCTACCTGAGAAAATCACTAAGCTG
CTCTGAGTATTTGCTAGAAAAAAGGATTTTGCAAAGTGGTATGACTTTGCTTTTGCTTTTAATCTGGTTTAGGCCAGTT
GCTGACTTTGCAGCTGCCATTCATGAGAGGATTGTGCAGTGGAAAGAAAGGCTGGATTTAGAAATAAGCATGTATACATT
TTCTACTATGAAAGCTAATGTTGGTATGGGGAGACCCATTCTTGACTTTCCTAGAGAGGAAGATTCTGAAGCAGAAGACT
CTGGACATGGATCAAGCACTGAATCACAATCACAATGCTTTTCCCAGGTCTCAGAAGCCTCTGGTGCAGACACACAGGA
AAACTGCACTTTTCACATCTGTAAAGGCTTTCAATGTTTCAAAAAACCAAAGACCCCTCCCCCAAAATAACTGCAACTGT
GCGGCCGC （配列番号９３２）

ＬＡ２３ １−７００
CTCGAGCAGCTAACAGCCAGTAAACAAAGCACAAGGGGAAGTGGAAAGCAGCCAAGGGAACATGTTTTGCGAGCCAGAGC
TGTTTTGGCTTGTCACCAGCTGGCCATGGTTCTTCGCCAGCTGTCACGTAAGGCTTCTGTGAAAGTTAGTAAAACCTGGA
GTGGAACTAAAAAAAGAGCTCAAAGGATTTTAATTTTTTTGTTAGAATTTTTGCTGGACTTTTGCACAGGTGAAGACAGT
GTAGACGGGAAAAAAAGACAGAGACACAGTGGTTTGACTGAGCAGACATACAGTGCTTTGCCTGAACCAAAAGCTACAT
AGGTAAGTAATGTTTTTTTTTGTGTTTTCAGGTTCATGGGTGCCGCACTTGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCTACTGTT
TCTGAGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTAGCTGAAATTGCTGCTGGAGAGGCTGCTGCTACTATAGAAGTTGAAAT
TGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGGATTACAAGTACCTCTGAGGCTATAGCTGCTATAGGCCTTACTCCTGAAACATATG
CTGTAATAACTGGAGCTCCGGGGGCTGTAGCTGGGTTTGCTGCATTGGTTCAAACTGTAACTGGTGGTAGTGCTATTGC
TCAGTTGGGATATAGATTTTTTGCTGACTGGGATCATAAAGTTTCAACAGTTGGGCTTTTTCGCGGCCGC （配列番
号９３３）

ＬＡ２３ ７０１−１４３８
CTCGAGAGCAGCCAGCTATGGCTTTACAATTATTTAATCCAGAAGACTACTATGATATTTTATTTCCTGGAGTGAATGCC
TTTGTTAACAATATTCACTATTTAGATCCTAGACATTGGGGCCCGTCCTTGTTCTCCACAATCTCCCAGGCTTTTTGGAA
TCTTGTTAGAGATGATTTGCCAGCCTTAACCTCTCAGGAAATTCAGAGAAGAACCCAAAAACTATTTGTTGAAAGTTTAG
CAAGGTTTTTGGAAGAAACTACTTGGGCAATAGTTAATTCACCAGCTAACTTATATAATTATATTTCAGACTATTATTCT
AGATTGTCTCCAGTTAGGCCCTCTATGGTAAGGCAAGTTGCCCAAAGGGAGGGAACCTATATTTCTTTTGGCCACTCATA
CACCCAAAGTATAGATGATGCAGACAGCATTCAAGAAGTTACCCAAAGGCTAGATTTAAAAACCCCAAATGTGCAATCTG
GTGAATTTATAGAAAGAAGTATTGCACCAGGAGGTGCAAATCAAAGATCTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTTTA
GGGTTGTACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCATATGAAGATGGCCCCAACAAAAAGAAAAGGAGAAAGGAAGGACC
CCGTGCAAGTTCCAAAACTTCTTATAAGAGGAGGAGTAGAAGTTCTAGAAGTTAAAACTGGGGTTGACTCAATTACAGAG
GTAGAATGCTGCGGCCGC（配列番号９３４）
トランスフェクト細胞中のＪＣＶ ｓｉＲＮＡのスクリーニング
Ｃｏｓ−７細胞〔ドイツ、ブラウンシュバイク（Braunschweig）所在のＤＳＭＺ社、＃Ａ
ＣＣ−６０〕を、透明な底部を有する白い９６ウエルプレート〔ドイツ、フリッケンハウ
ゼン（Frickenhausen）所在のグライナー・バイオ・ワン社（GreinerBio- One GmbH）〕
の１ウエル当たり１．５×１０４細胞として７５μｌ増殖培地中に播種した。細胞を播種
した後直ぐ、ウエル当たり５０ｎｇの対応レポータープラスミドを、リポフェクタミン（
Lipofectamine）ＴＭ２０００〔ドイツ、カールスルーエ（Karlsruhe）所在のインビトロ
ジェン社（InvitrogenGmbH）〕を用いてトランスフェクトし、このプラスミドを、ウエ
ル当たり１２．５μｌの最終容量となるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈し、プレート全体
用のマスターミックスとして調製した。
【０１４４】
プラスミドトランスフェクションの４時間後に、細胞から増殖培地を除去し、１００μ
ｌ／ウエルの新鮮培地と交換した。製造業者が記載しているように、リポフェクタミンＴ
Ｍ２０００（インビトロジェン社）を用いてｓｉＲＮＡのトランスフェクションを実施し
た。細胞を、加湿インキュベータ〔ドイツ、ハナウ（Hanau）所在のヘラウス社（Heraeus
GmbH）〕中、３７℃、５％ＣＯ２下に、２４時間インキュベートした。一次スクリーニ
ングでは、すべてのｓｉＲＮＡを３０ｎＭの最終濃度でスクリーニングした。選択した配
列を３００ｐＭのｓｉＲＮＡ濃度で再スクリーニングした。各ｓｉＲＮＡを各濃度に関し
て４通りに試験した。
【０１４５】
増殖培地を除去し、培地と、デュアル−グロルシフェラーゼアッセイシステム（Dual-G
lo Luciferase Assay System）（プロメガ社）由来の基質との１：１混合物１５０μｌを
加えて細胞を溶解させた。このルシフェラーゼアッセイは、デュアル−グロルシフェラー
ゼアッセイに関する製造業者のプロトコルに従って実施し、ビクター−ライト１４２０ル
ミネセンスカウンター（Victor-Light 1420 Luminescence Counter）〔ドイツ、ロドガウ
−ユーゲスハイム（Rodgau-Jugesheim）所在のパーキンエルマー（PerkinElmer）社〕で
発光を測定した。トランスフェクション効果を補正するために、レニラルシフェラーゼで
得た値をホタルルシフェラーゼで得たそれぞれの値に対して標準化した。ＪＣＶ遺伝子に
対するｓｉＲＮＡのトランスフェクション後に得たウミシイタケ／ホタルルシフェラーゼ
活性を、１００％に設定した非関連コントロールｓｉＲＮＡのトランスフェクション後に
得たレニラ／ホタルルシフェラーゼ活性に対して標準化した。表１ａおよび１ｂは、配列
を表１ａに示すｓｉＲＮＡを３０ｎＭの単一用量で試験した結果を示している。非関連コ
ントロールｓｉＲＮＡと比較した抑制率±標準偏差は、「残留ルシフェラーゼ活性（コン
トロールの％）」の欄に示されている。いくつかの３０ｎＭ ＪＣＶ ｓｉＲＮＡは、Ｃ
ｏｓ−７細胞におけるターゲットｍＲＮＡの量を７０％以上減少させるのに有効であった
（すなわち、残留ルシフェラーゼ活性は３０％未満であった）。
【０１４６】
単一用量スクリーニングから選択されたＪＣＶ ｓｉＲＮＡをさらに用量応答曲線によ
り特徴解析した。用量応答曲線を生成するためのＪＣＶ ｓｉＲＮＡのトランスフェクシ
ョンは、上記プロトコルに従って以下のｓｉＲＮＡ濃度で実施した：
− ３倍希釈の３３ｎＭから０．００５ｎＭまで（フラグメント１の場合）
− ４倍希釈の２４ｎＭから０．００１ｎＭまで（フラグメントＥと、フラグメントＬ
Ａ２３ １−７００およびＬＡ２３ ７０１−１４３８の場合）。
【０１４７】
プログラムＸＬｆｉｔ〔英国、ギルドフォード（Guildford）所在のＩＤＢＳ社〕を用
いたパラメータ化曲線当てはめによりＩＣ５０値を決定した。表２は、３２個の選択され
たＪＣＶ ｓｉＲＮＡに関する２回の独立した実験の結果を示している。これら２回の独
立実験の平均ＩＣ５０が示されている。この実験パラダイムにおいて、いくつかのＪＣＶ
ｓｉＲＮＡ（ＡＤ−１２６２２、ＡＤ−１２６７７、ＡＤ−１２７０９、ＡＤ−１２７
１０、ＡＤ−１２７２２、ＡＤ−１２７２４、ＡＤ−１２７２８、ＡＤ−１２７６３、Ａ
Ｄ−１２７６７、ＡＤ−１２７６８、ＡＤ−１２７６９、ＡＤ−１２７７１、ＡＤ−１２
７７４、ＡＤ−１２７７５、ＡＤ−１２７７７、ＡＤ−１２７８１、ＡＤ−１２７８４、
ＡＤ−１２７９５、ＡＤ−１２８１３、ＡＤ−１２８２１、ＡＤ−１２８２３、ＡＤ−１
２８２４、ＡＤ−１２８２５、ＡＤ−１２８２７、ＡＤ−１２８２９、ＡＤ−１２８４２
）は特に効力が高く、７０ｐＭ〜１ｎＭのＩＣ５０値を示した。
表２：ＩＣ50
デュプレックス 平均ＩＣ50
の名称 ［ｎＭ］
AD-12599 2.37
AD-12622 0.57
AD-12666 3.7
AD-12677 0.49
AD-12709 0.19
AD-12710 0.47
AD-12712 2.33
AD-12722 0.12
AD-12724 0.26
AD-12728 0.8
AD-12761 1.2
AD-12763 0.95
AD-12767 0.09
AD-12768 0.19
AD-12769 0.35
AD-12771 0.35
AD-12774 0.13
AD-12775 0.18
AD-12777 0.17
AD-12778 12.65
AD-12781 0.18
AD-12784 0.44
AD-12795 0.65
AD-12813 0.2
AD-12818 1.88
AD-12821 0.07
AD-12823 0.46
AD-12824 0.25
AD-12825 0.52
AD-12827 0.15
AD-12829 0.14
AD-12842 0.44
ＳＶＧ−Ａ細胞における生ＪＣウイルスに対するＪＣＶ ｓｉＲＮＡのスクリーニング
細胞およびウイルス
ブラウン大学（Brown University）のウォルター・アトウッド（Walter Atwood）から
得たＳＶＧ-Ａ細胞（ＳＶ４０Ｔ抗原で形質転換したヒト胎児グリア細胞）を、加湿イン
キュベータ〔米国ノースカロライナ州アッシュビル（Ashville）所在のサーモ・エレクト
ロン社（Thermo Electron Corporation）製のＨｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ〕中、
３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）〔米国カリフォルニア州
タルザナ（Tarzana）所在のオメガ・サイエンティフィック（OmegaScientific）社〕、
ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ〔米国カリフォルニア
州カールスバード（Carlsbad）所在のインビトロジェン社〕を加えたイーグルＭＥＭ培地
（Eagle’s Minimum Essential Media）〔米国バージニア州マナサス（Manassas）所在の
ＡＴＣＣ〕中で培養した。ブラウン大学のウォルター・アトウッドから得たＪＣＶのＭａ
ｄ−1−ＳＶＥΔ株を全実験で用い、公開されている標準法（Liuand Atwood, Propagati
on and assay of the JC Virus, Methods Mol Biol. 2001; 165：9-17）に従い、ＳＶＧ
−Ａ細胞を用いてウイルス株を作製した。
【０１４８】
予防アッセイ
抗生物質を除いた上述の培地中でトランスフェクトする２４時間前に、ＳＶＧ−Ａ細胞
を６ウエルディッシュのガラスカバースリップ上に播種した。製造業者（米国カリフォル
ニア州カールスバード所在のインビトロジェン社）の指示に従い、リポフェクタミンＴＭ
２０００を用いて、細胞に指示濃度のｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ、５０ｎＭ、または１００ｎ
Ｍ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、２％ＦＢＳを含む
培地で細胞を洗浄し、次いで、２％ＦＢＳ培地に希釈したＪＣＶウイルス株（Ｍａｄ−１
−ＳＶＥΔ株）の１：２５希釈物に感染させた。カバースリップ全体に等しいウイルス結
合が得られるように１時間にわたって１５分毎に手で数回細胞を揺り動かし、次いで、追
加の１０％ＦＢＳ培地を加え、７２間感染を進行させた。７２時間の感染後に、細胞をア
セトン中で固定し、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体（インビトロ
ジェン社）を含むＪＣＶ ＶＰ１（ブラウン大学のウォルター・アトウッドから取得）を
認識するハイブリドーマ上清ＰＡＢ５９７を用いて、標準免疫蛍光法により、細胞を後期
ウイルスタンパク質（ＶＰ１）染色した。蛍光顕微鏡〔米国ニュージャージー州ソーンウ
ッド（Thornwood）所在のツァイス（Zeiss）社製、Imager:Z1〕を用いてＶＰ１免疫反応
細胞を数えて感染細胞を採点し、データを、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡをトランスフェク
トしたコントロールを播種したカバースリップについて計数した感染細胞の割合として表
した。表３は、異なるｓｉＲＮＡ濃度での予防アッセイの結果を示している。ＶＰ１ ｓ
ｉＲＮＡはグループとして最も効力が高く、Ｔ抗原ｓｉＲＮＡが続き、ＶＰ２／３ｓｉＲ
ＮＡは最も効力が弱かった。ウイルスを減少させるのに最も有効なＶＰ１ ｓｉＲＮＡは
、一貫して、ＡＤ−１２６２２、ＡＤ−１２７２８、ＡＤ−１２７９５、およびＡＤ−１
２８４２であった。最も強力なＴ抗原ｓｉＲＮＡはＡＤ−１２８１３であった。
【０１４９】
【表１】

【０１５０】

【０１５１】
感染後治療アッセイ
１０％ＦＢＳ培地中での感染の２４時間前に、６ウエルディッシュのガラスカバースリ
ップ上にＳＶＧ−Ａ細胞を播種した。２％ＦＢＳを含有する培地で細胞を洗浄し、次いで
、２％ＦＢＳ培地に希釈したＪＣＶウイルス株の１：２５希釈物に感染させた。カバース
リップ全体に等しいウイルス結合が得られるように１時間にわたって１５分毎に手で約８
〜１０回揺り動かし、次いで、追加の１０％ＦＢＳ培地を加えた。感染２４時間後および
４８時間後に、抗生物質を含まない１０％ＦＢＳ培地で細胞を洗浄し、次いで、製造業者
の指示（インビトロジェン社）に従って、リポフェクタミンＴＭ２０００を用いて細胞に
５０ｎＭの指示ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。感染７２時間後に、細胞をアセトン
中で固定し、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体〔米国オレゴン州ユ
ージーン（Eugene）所在のモレキュラー・プローブス（MolecularProbes）社〕を含むＪ
ＣＶ ＶＰ１（ブラウン大学のウォルター・アトウッドから取得）を認識するハイブリド
ーマ上清ＰＡＢ５９７を用いて、標準免疫蛍光法により、ＪＣＶ 後期ウイルスタンパク
質（ＶＰ１）染色した。蛍光顕微鏡（ツァイス、Imager:Z1）を用いてＶＰ１免疫反応細
胞を数えて感染細胞を採点し、データを、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡをトランスフェクト
したコントロールカバースリップについて計数した感染細胞の割合として表した。表４は
、感染後治療実験の結果を示している。治療アッセイで試験したｓｉＲＮＡはいずれも、
残留ウイルスがルシフェラーゼＳｉＲＮＡコントロールにおけるより著しく減少したとい
うように、ＪＣＶに対する有意な抗ウイルス活性を示した。
【０１５２】
【表２】

【０１５３】
ＪＣＶ ｓｉＲＮＡの予防投与は活性子孫ＪＣウイルスの産生を阻害する
抗生物質を除いた上述培地中での感染の２４時間前に、６ウエルディッシュにＳＶＧ−
Ａ細胞を播種した。製造業者の指示（インビトロジェン社）に従い、リポフェクタミンＴ
Ｍ２０００を用いて、細胞に１０ｎＭの指示ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トラン
スフェクション２４時間後に、２％ＦＢＳを含む培地で細胞を洗浄し、次いで、２％ＦＢ
Ｓ培地に希釈したＪＣＶウイルス株（Ｍａｄ−１−ＳＶＥΔ株）の１：２５希釈物を感染
させた。カバースリップ全体に等しいウイルス結合が得られるように、１時間にわたって
１５分毎に細胞を手で数回揺り動かし、次いで、追加の１０％ＦＢＳ培地を加え、６日間
感染を進行させた。感染６日後に、感染細胞からオーバーレイ培地を除去するか、細胞を
こそげ取って子孫ウイルスを回収し、ウイルス作製を行った。ウイルスの作製は、細胞を
残さず上清培地にこそげ入れ、激しく攪拌し、再懸濁した細胞を間に攪拌を入れて２回凍
結融解し、次いで、細胞破片を沈降させて、上清を取るステップからなっていた。次に、
ガラスカバースリップ上に播種した新鮮なＳＶＧ-Ａ細胞を、初期感染の場合と同じ手順
を用いていずれかの方法で回収したウイルスに二次感染させて、さまざまなｓｉＲＮＡを
トランスフェクトした細胞が産生した感染性ウイルスの量を測定した。カバースリップ感
染７２時間後に、細胞をアセトン中で固定し、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４
８８二次抗体（インビトロジェン社）を含むＪＣＶ ＶＰ１（ブラウン大学のウォルター
・アトウッドから取得）を認識するハイブリドーマ上清ＰＡＢ５９７を用いて、標準免疫
蛍光法により後期ウイルスタンパク質（ＶＰ１）染色した。蛍光顕微鏡（ツァイス社製、
Imager:Z1）を用いてＶＰ１免疫反応細胞を数えて感染細胞を採点し、データを、ルシフ
ェラーゼｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたコントロールカバースリップについて計数し
た感染細胞の割合として表した。表５は、選択されたｓｉＲＮＡの結果を示しており、こ
の結果は、いずれかのウイルス回収法により活性子孫ウイルスの産生を阻害する予防ｓｉ
ＲＮＡ治療の能力を証明している。ＶＰ１をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ＡＤ−１２６
２２およびＡＤ−１２８４２）のトランスフェクションは、ウイルスを培地から回収する
か、感染細胞調製物から回収するかに関係なく、活性子孫ウイルス産生の阻害に最も効果
があった。抗原ｓｉＲＮＡ ＡＤ−１２８１３は次に強力な阻害効果を有していたが、Ｖ
Ｐ２／３ｓｉＲＮＡ ＡＤ−１２８２４およびＡＤ−１２７６９も、活性子孫ＪＣＶ産生
の阻害に低いとは言え、いくらかの能力を示した。
【０１５４】
【表３】

【０１５５】
ＪＣＶをターゲットとする選択されたｓｉＲＮＡの脳髄液（ＣＳＦ）中での安定性
１１種の選択されたＪＣＶ ｓｉＲＮＡを、ヒトＣＳＦ中および比較のためにＰＢＳ中
で、５ｕＭ、３７℃で４８時間、安定性について試験した。９６ウエルプレート中で、３
０μｌのヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）と、３μｌの５０μＭ 二本鎖（ｓｉＲＮＡ）溶液とを
混合し、蒸発を避けるためにシールし、３７℃で指示時間インキュベートした。ｓｉＲＮ
Ａを３０ｕｌのＰＢＳ中４８時間インキュベートしたものは、非特異的分解のコントロー
ルとしての機能を果たした。４ｕｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）と２５ｕｌの
プロテイナーゼＫバッファーを加えて反応を停止し、４２℃で２０分（２０’）インキュ
ベートした。次いで、サンプルを０．２μｍの９６ウエルフィルタープレートに３０００
ｒｐｍで２０分間通して回転ろ過した。インキュベーションウエルを５０ｕｌのミリポア
水で２回洗浄し、合わせた洗浄液も回転ろ過した。
【０１５６】
サンプルを変性条件下にイオン交換ＨＰＬＣで分析した。サンプルを単一オートサンプ
ラー用のバイアルに移した。以下の条件下にＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を行った：Ｄｉｏｎｅ
ｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００（４×２５０ｍｍの分析用カラム）、温度 ４５℃（変性
条件 ｐＨ＝１１）、流速 １ｍｌ／分、注入量 ５０ｕｌ、および帯域幅１ｎｍの検出
波長 ２６０ｎｍ（参照波長 ６００ｎｍ）。さらに、ＨＰＬＣ溶出液Ａの勾配条件は以
下の通りであった：１０％ＡＣＮ中２０ｍＭ のＮａ３ＰＯ４：ｐＨ＝１１；ＨＰＬＣ溶
出液Ｂ：ＨＰＬＣ溶出液Ａ中１ＭのＮａＢr：
【０１５７】
【表４】

【０１５８】
上記変性ＩＥＸ−ＨＰＬＣ条件下に、二本鎖を２つの分離した一本鎖として溶出した。
全クロマトグラムをＤｉｏｎｅｘ Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ６．６０ ＨＰＬＣソフトウ
エアで自動積分し、必要に応じて手動調整した。各鎖に関するピーク下面積を計算し、各
時点に関する無傷の各全長生成物（ＦＬＰ）の％値を以下の方程式で計算した：
％−ＦＬＰ（s/as:t=x）＝（ピーク面積（s/as）;t=x／ピーク面積（s/as）;t=0分）＊１００％。
すべての値をｔ＝０分におけるＦＬＰに対し標準化した。表６は、ヒトＣＳＦ中３７℃で
４８時間のインキュベート後の結果を示している。１０種のＪＣＶ ｓｉＲＮＡ（ＡＤ−
１２６２２、ＡＤ−１２７２４、ＡＤ−１２７６７、ＡＤ−１２７６９、ＡＤ−１２７９
５、ＡＤ−１２８１３、ＡＤ−１２８１８、ＡＤ−１２８２３、ＡＤ−１２８２４、ＡＤ
−１２８４２）のアンチセンス鎖とセンス鎖両方の少なくとも７５％が回収されたが、こ
れは、これらのｓｉＲＮＡがヒトＣＳＦ中３７℃で極めて安定であることを証明している
。ＡＤ−１２８２１の場合、ヒトＣＳＦ中３７℃４８時間のインキュベーション後に、ア
ンチセンス鎖の５９％およびセンス鎖の９７％が回収されたが、これは、このｓｉＲＮＡ
がヒトＣＳＦ中３７℃下に４８時間を越える半減期を有することを示している。
【０１５９】
【表５】

【０１６０】
ｄｓＲＮＡ発現ベクター
本発明の別の態様において、ＪＣウイルスゲノムの発現活性を調節するＪＣウイルス特
異的ｄｓＲＮＡ分子は、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニット
から発現される（例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10；Skillern, A.,
et al.,International PCT Publication No. WO 00/22113、Conrad, International PCT
Publication No. WO 00/22114、およびConrad, US Pat. No. 6,054,299参照）。これら
の導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、あるいはウイルスベクターとして導入可
能であり、宿主ゲノムに組み込まれ、一体化された導入遺伝子として受け継がれ得る。ま
た、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれ得るように構築することもでき
る（Gassmann,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２つの別個の発現ベクター上のプロモーターを用いて転写し、
ターゲット細胞内に共トランスフェクトすることができる。あるいは、ｄｓＲＮＡの個々
の鎖それぞれを、いずれも同じ発現プラスミド上にあるプロモーターを用いて転写しても
よい。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ステム・アンド・ループ構造を有するよう
に、リンカーポリヌクレオチド配列を介して連結された逆方向反復配列として発現させる
。
【０１６１】
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、ほとんどの場合、ＤＮＡプラスミドまたはウイルス
ベクターである。ｄｓＲＮＡを発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス〔概説
として、Muzyczka,et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129参照〕；
アデノウイルス〔例えば、Berkner, et al., Bio Techniques (1998) 6:616, Rosenfeld
et al., (1991, Science,252:431-434)およびRosenfeld et al., (1992), Cell 68:143-
155参照〕；またはアルファウイルスや当該技術分野で公知の他のウイルスをベースとし
て構築できるが、それらのウイルスには限定されない。レトロウイルスは、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで、上皮細胞を含めた多くの異なる細胞種にさまざま
な遺伝子を導入するのに用いられている〔例えば、Eglitis, et al., Science (1985) 23
0:1395-1398;Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464;
Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al.,
1990,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al., 1991, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8
377-8381;Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al.,
1992, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therap
y 3:641-647;Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et
al.,1993, J. Immunol. 150:4104-4115; U.S. Patent No. 4,868,116; U.S. Patent No
. 4,980,286;PCT Application WO 89/07136; PCT Appli cation WO 89/02468; PCT Appl
ication WO89/05345; およびPCT Application WO 92/07573参照〕。細胞のゲノムに挿入
された遺伝子を形質導入・発現し得る組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウ
イルスゲノムを、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰなどの適切なパッケージング細胞系
にトランスフェクトすることにより作製することができる（Comette et al., 1991, Huma
n Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349）。
組換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主（例えばラット、ハムスター、イヌおよび
チンパンジー）の多種多様な細胞および組織に感染させるのに使用できる（Hsu et al.,
1992, J.Infectious Disease, 166:769）だけでなく、感染させるのに活発に有系分裂す
る細胞を必要とはしないという利点も有している。
【０１６２】
本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター中でｄｓＲＮＡの発現を駆動するプロモーターは、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター（例えばリボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（例えば、ＣＭＶの初期プロモーターもしくはアクチンプロモーターもしくはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）またはほとんどの場合ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６ ｓｎＲＮＡもしくは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）であるか、あるいは、発現プラスミドがさらにＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをもコードする場合には、原核生物のプロモーター、例えばＴ７プロモーターであり得る。プロモーターは、導入遺伝子の発現を膵臓に方向付けることも可能である〔例えば、膵臓用のインスリン調節配列（Bucchini et al., 1986,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515）参照〕。
【０１６３】
さらに、導入遺伝子の発現は、例えば、ある種の生理的調節因子、例えば循環血中グルコースレベルまたはホルモンに感受性の調節配列などの誘導可能な調節配列や発現系を用いることにより、正確に調節することができる（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞または哺乳動物における導入遺伝子の発現を制御するのに適した上記の誘導可能発現系には、エクジソンによる調節、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化を誘導する化学物質、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者であれば、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の使用目的に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選ぶことができるであろう。
【０１６４】
一般に、ｄｓＲＮＡ分子を発現できる組換えベクターは、下記のようにターゲット細胞
に送達され、そこにとどまる。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子を一過性に発現させるウイルス
ベクターを使用することもできる。そのようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与す
ることができる。ｄｓＲＮＡは、一旦発現されると、ターゲットＲＮＡに結合して、その
機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内または筋
肉内投与などにより全身投与するか、患者から取り出したターゲット細胞に投与した後で
患者に再導入するか、または所望のターゲット細胞内への導入を可能にする任意の他の手
段を用いて投与することができる。
【０１６５】
ｄｓＲＮＡを発現するＤＮＡプラスミドは、通常、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクタミン）または非カチオン性の脂質ベース担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯＴＭ）との複合体として、ターゲット細胞にトランスフェクトされる。本発明では、一週間またはそれ以上の期間にわたる、単一のＪＣウイルスゲノムまたは複数のＪＣウイルスゲノムの異なる領域をターゲットとするｄｓＲＮＡを介したノックダウンのための多重脂質トランスフェクションも企図される。本発明のベクターが宿主細胞内に首尾よく導入されたかどうかは、さまざまな公知方法を用いてモニターすることができる。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を一例とする蛍光マーカーなどのリポーターを用いて示すことができる。ｅｘ ｖｉｖｏ細胞の安定トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞に、ヒグロマイシンＢ耐性などの特定の環境要因（例えば抗生物質および薬物）に対する耐性を付与するマーカーを使用して確認することができる。
【０１６６】
ＪＣウイルス特異的ｄｓＲＮＡ分子をベクターに挿入し、ヒト患者用の遺伝子治療用ベクターとして使用することもできる。遺伝子治療用ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（U.S. Patent5,328,470参照）、または定位注射（例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 91:3054-3057を参照）によって、対象に送達することができる。遺伝子治療用ベクター製剤は、許容される希釈剤中に遺伝子治療用ベクターを含むものであってもよいし、遺伝子導入ビヒクルが埋め込まれた遅延放出マトリックスからなるものであってもよい。あるいは、組換え細胞からそのまま完全な遺伝子導入ベクター、例えばレトロウイルスベクターが得られる場合、製剤は、この遺伝子導入系を産生する１個以上の細胞を含んでいてもよい。
【０１６７】
【数１】

【０１６８】
【数２】

【０１６９】
【数３】

【０１７０】
【数４】

【０１７１】
【数５】

【０１７２】
【数６】

【０１７３】
【数７】

【０１７４】
【数８】

【０１７５】
【数９】

【０１７６】
【数１０】

【０１７７】
【数１１】

【０１７８】
【数１２】

【０１７９】
【数１３】

【０１８０】
【数１４】

【０１８１】
【数１５】

【０１８２】
【数１６】

【０１８３】
【数１７】

【０１８４】
【数１８】

【０１８５】
【数１９】

【０１８６】
【数２０】

【０１８７】
【数２１】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【公開番号】特開２０１１−１３０７７２（Ｐ２０１１−１３０７７２Ａ）
【公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６６８１８（Ｐ２０１１−６６８１８）
【出願日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【分割の表示】特願２００９−５０７９８５（Ｐ２００９−５０７９８５）の分割
【原出願日】平成１９年４月２７日（２００７．４．２７）
【出願人】（５０５３６９１５８）アルナイラム　ファーマシューティカルズ，　インコーポレイテッド (51)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，　ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】

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