Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ株を特徴付けするためのマーカー遺伝子の組み合わせ
本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を特徴付けるためのマーカー遺伝子の新しい組み合わせに関する。特に、本発明は、特徴付けすべき株を分類し同定する目的での、この株のゲノム内のマーカー遺伝子の存在または不在のパターンの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を特徴付けするためのマーカー遺伝子の組み合わせに関するものである。特に、本発明は、特徴付けすべき株を分類および同定するための、この株のゲノム内におけるマーカー遺伝子の存在または不在のパターンの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
新鮮な肉および魚は、栄養価は高いもののきわめて腐りやすい食品である。生産および貯蔵中、これらの食品は、加工環境からの不可避的な微生物汚染に曝露されている。このような汚染には、腐敗性生物および病原体が含まれ得る。したがって、食品加工業者にとっては、汚染物質が潜在的に危険なレベルまで発達しないように、その成長を制限することが優先事項である。利用される方法の一つは、腐敗性および病原性の微生物の成長を食い止めるために安全な細菌を用いることである。この観点から見て、肉媒介性の乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉは、優れた特性を示す。
【０００３】
Ｌ．ｓａｋｅｉは、新鮮な肉上で生存および成長して、選択技術が適用された場合に優勢な個体群を形成する能力を有する。一部の株は、欧州において、その有用な防腐特性のため、発酵ソーセージの手工業的製造および大規模製造のために広く用いられている。しかし、これらを、望ましくない細菌の成長を防ぐことにより、肉の生物防腐剤として使用することも考えられ得る（Ｖｅｒｍｅｉｒｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９６：１４９−１６４）。
【０００４】
Ｌ．ｓａｋｅｉの株は、表現型形質において大幅な可変性を示し得、長い間分類するのが困難であると考えられてきた。これまでの研究では、Ｌ．ｓａｋｅｉ株を分類するためのアプローチが開示されている。ＲＡＰＤパターン（Ｂｅｒｔｈｉｅｒ ａｎｄ Ｅｈｒｌｉｃｈ １９９９ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４９：９９７−１００７）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ可溶性タンパク質の含有量パターンの数値的解析を用いた研究では、株を二つの下位群に分割することが示唆されたが、これは定義が軟弱であり研究に従った比較が不可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、これらのアプローチを通して得られたＬ．ｓａｋｅｉ株の分類はなお、満足のいくものではない。本発明の一つの目的は、特に食品上または生物防腐剤として使用される細菌カクテル中に存在するＬ．ｓａｋｅｉ株を同定するために使用できる、Ｌ．ｓａｋｅｉ株を分類、特徴付け、および同定する、より優れた方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者らは、本明細書において、Ｌ．ｓａｋｅｉゲノムのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの研究、およびＬ．ｓａｋｅｉ株の大きなコレクションについての実験的検証に基づいて、これらの株を特徴付けおよび検出するためのマーカーの組み合わせを同定した。特に、組み合わせることでＬ．ｓａｋｅｉ株の最適な特徴付け法を提供する、２９個のマーカー遺伝子が単離された。
【０００７】
本発明は、したがって、ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも二つのマーカー遺伝子を含むＬ．ｓａｋｅｉ株の特徴付けを可能にするマーカーの組み合わせに関する。
【０００８】
好ましい実施形態において、前記組み合わせは、配列番号１〜配列番号２９のマーカー遺伝子の全てを含む。
【０００９】
本発明はまた、前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株中のＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定することからなるステップを含む、Ｌ．ｓａｋｅｉ株を特徴付けするための方法にも関する。
【００１０】
好ましい実施形態において、前記配列番号１〜配列番号２９のマーカー遺伝子の全ての存在または不在が決定される。
【００１１】
好ましくは、前記一つまたは複数のマーカー遺伝子の存在または不在は、増幅によって、または前記一つもしくは複数のマーカー遺伝子に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションによって決定される。
【００１２】
好ましい実施形態において、前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株の分類は、上述の一つまたは複数のマーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析すること、および、基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株のセットに関してＪａｃｑｕａｒｄ指数またはダイス係数または任意の２値距離行列を計算することによって実施される。
【００１３】
本発明はまた、以上で定義されたマーカーの組み合わせを含むＤＮＡアレイにも関する。
【００１４】
本発明の別の態様は、少なくとも二つのＬ．ｓａｋｅｉ株を比較する方法であって、
ａ）第一のＬ．ｓａｋｅｉ株中のＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定すること、および
ｂ）第二のＬ．ｓａｋｅｉ株中の前記少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定すること、
からなるステップを含み、前記少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在のパターンが前記第一および第二のＬ．ｓａｋｅｉ株間で異なっている場合にはこれらのＬ．ｓａｋｅｉ株は異なっているとされる方法に関する。
【００１５】
好ましい実施形態において、前記配列番号１〜配列番号２９のマーカー遺伝子の全ての存在または不在が決定される。
【００１６】
特定の実施形態において、少なくとも二つのＬ．ｓａｋｅｉ株を比較する上述の方法は、Ｊａｃｑｕａｒｄ指数またはダイス係数または任意の２値距離行列を計算することにより前記マーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析するステップをさらに含む。
【００１７】
本発明の別の態様は、試料中の特定のＬ．ｓａｋｅｉ株を定量化する方法であって、
ａ）以上で定義した方法により前記試料中に存在するＬ．ｓａｋｅｉ株を同定および／または特徴付けすること、
ｂ）前記試料中に存在するその他の株に関して前記特定のラクトバチルス株内に差次的に存在する一つまたは複数のマーカー遺伝子を決定すること、ならびに
ｃ）定量ＰＣＲにより一つまたは複数の前記遺伝子を増幅すること、
からなるステップを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｌ．ｓａｋｅｉのゲノム多様性を示す図である。７３個のＬ．ｓａｋｅｉ単離株および外集団の基準として考慮された二つのＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ単離株の間の６０個の遺伝子マーカーの分布。遺伝子は、２３Ｋの染色体、すなわちＬＳＡ００８８、ＬＳＡ０１１８、ＬＳＡ０１５７、ＬＳＡ０１６５、ＬＳＡ０１７２、ＬＳＡ０１７８、ＬＳＡ０２１２、ＬＳＡ０２１６、ＬＳＡ０２１７、ＬＳＡ０２１８、ＬＳＡ０２１９＿ｂ、ＬＳＡ０３０６、ＬＳＡ０４３９、ＬＳＡ５０９、ＬＳＡ５１０、ＬＳＡ０５３０、ＬＳＡ０５６４＿ａｃ、ＬＳＡ０５６５、ＬＳＡ０５６７、ＬＳＡ０５７２、ＬＳＡ７２４、ＬＳＡ７２７、ＬＳＡ１００６、ＬＳＡ１１８２／３、ＬＳＡ１２２０、ＬＳＡ１２２２、ＬＳＡ１２２７、ＬＳＡ１２３２、ＬＳＡ１２８３、ＬＳＡ１５０９、ＬＳＡ１５１０、ＬＳＡ１５１２、ＬＳＡ１５１０＿ａ、ＬＳＡ１５１０＿ｇ、ＬＳＡ１５７２、ＬＳＡ１５７９／８０、ＬＳＡ１５８１、ＬＳＡ１５８４、ＬＳＡ１６４１、ＬＳＡ１６４０、ＬＳＡ１６４０、ＬＳＡ１７２０、ＬＳＡ１７２４、ＬＳＡ１７３０、ＬＳＡ１７３１、ＬＳＡ１８０６、ＬＳＡ１８０９、ＬＳＡ１８７４、ｓｓｐＴ、ｓｓｐＡ、ＦＧＰ２１−０００１、ＤｒｓＡ、ＦＧＰ３３２−０００１、ＦＧＰ３３２−０００２、ＦＧＰ３３２−０００３、ＦＧＰ３３２−０００６、ＦＧＰ３３２−０００５、ｌａｃＣ、ｌａｃＧ内のその位置によって表の左側に順序付けされている。色：白色は不在、黒色は存在。株のゲノム関係の推定値を示すデンドログラムは、完全連結階層分析によって作成した。スケールは、各ノードにおける距離を表す。１という係数は完全な独立性を表し、ゼロは絶対的な同一性を示す。ノードにおけるＰ値は、ＰＶＣＬＵＳＴプログラムを用いたマルチスケール・ブートストラップ・リサンプリングによるクラスタ化の信頼性を示す。株は、信頼性が９０％超であり単離株間の最大距離が０．５であるクラスタ分岐に基づいてグループ化した。主要な株群は、全個体群中のそのそれぞれの百分率と共に示されている。亜種型株および基準株であるＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋは、垂直な長方形で示されている。
【図２Ａ】Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株間のゲノムサイズのヒストグラム分布を示す図である。株は、ゲノムサイズ軸の上のラグ状のバーにより表されている。ヒストグラムのバーは、３０ｋｂのゲノムサイズ枠内の株の数を表す（ＰＦＧＥ測定の平均標準偏差）。個体群中のゲノムサイズのガウス確率分布（右側の軸上の推定された密度）は、灰色の平滑な線で示されている。亜種型株および株２３Ｋは、アスタリスクで示されている。
【図２Ｂ】Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株の遺伝子型クラスタ化に従った、前記Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株のゲノムサイズの分布を示すボックスプロットを示す図である。水平の黒い線は、２０２０ｋｂの平均ゲノムサイズを示している。互いの間でほとんど変動を示していないクラスタＥおよびＦを、分析のために共にプールした。明確さを期して、未分類の株３３２、ＬＴＨ２０７０、および２１をクラスタＨにグループ化した。
【図３】株のゲノム関係の推定値を示すデンドログラムを、完全連結階層分析によって作成した。スケールは、各ノードにおける距離を表す。株は、信頼性が９０％超であり単離株間の最大距離が０．５であるクラスタ分岐に基づいてグループ化した。遺伝子含量のマトリクスにおいては、黒色が遺伝子の存在（１）を示し、白色が遺伝子の不在（０）を表す。左側の遺伝子は、表１におけるように順序付けされている。より詳細には、マトリクスの異なる線は、以下の遺伝子マーカーに対応する：１）ＬＳＡ１６４１、２）ＬＳＡ１１８２およびＬＳＡ１１８３＿ｃ、３）ＬＳＡ０１７２、４）ＬＳＡ１７３１、５）ＬＳＡ０２１１およびＬＳＡ０２１２、６）ＬＳＡ１５７９およびＬＳＡ１５８０、７）ＬＳＡ０１１８、８）ＬＳＡ０５２９、９）ＬＳＡ０４３９、１０）ＬＳＡ０５７２、１１）ＬＳＡ０２１９ｂ、１２）ＬＳＡ０５６４＿ａ、ＬＳＡ０５６４＿ｂおよびＬＳＡ０５６４＿ｃ、１３）ＦＧＰ２１−０００１、１４）ｓｓｐＡおよびｓｐｉＡ、１５）ＦＧＰ３３２−０００１、１６）ＦＧＰ３３２−０００２、１７）ＦＧＰ３３２−００７、１８）ＦＧＰ３３２−０００８、１８）ＦＧＰ３３２−０００９、１９）ＦＧＰ３３２−００１０、２０）ＦＧＰ３３２−００１１、２１）ＦＧＰ３３２−００１１、２２）ＦＧＰ３３２−００１２、２３）ＦＧＰ３３２−００１３。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
その他のＬ．ｓａｋｅｉ株と比較して一つのＬ．ｓａｋｅｉ株を具体的に特徴付けするために用い得るマーカー遺伝子を同定するために、発明者らは、種に応じて高い多様性を示す可変的遺伝子を含むと考えられるＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋのゲノム内の可変的ゲノムアイランドをまず同定した（実施例１に記載されているステップ）。次に発明者らは、先に同定されたゲノムアイランド由来の遺伝子の存在または不在に従ってＬ．ｓａｋｅｉ株の分類を実施し、そうして得た分類を、その他の複数のタイプ決定技術を用いて得た分類と比較した（実施例２に記載のステップ）。最終的に、発明者らは、多数の可変的遺伝子を用いて得られる分類と比較されるＬ．ｓａｋｅｉ株の信頼性のある分類を得るために使用可能である、ゲノムアイランド由来の最小数の遺伝子の最適な組み合わせを同定した（実施例３に記載のステップ）。
【００２０】
したがって、本発明によると、Ｌ．ｓａｋｅｉ株の特徴付けを可能にするマーカーの組み合わせは、ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも二つのマーカー遺伝子を含む。
【００２１】
本明細書で使用される「マーカー」という用語は、細菌株内の標的遺伝子の存在を同定できるようにし、かつ場合によってその発現を定量化できるようにする、あらゆる生物学的、化学的、または物理的手段を意味する。かかるマーカーは、当業者にとっては周知のものである。有利には、本発明に従ったマーカーは遺伝子マーカーである。
【００２２】
表１は、マーカー遺伝子の上記の遺伝子座タグおよび配列ならびに遺伝子の名称の間の対応を示している。
【００２３】
表１：遺伝子マーカーの遺伝子座タグおよび名称の対応
【表１−１】
【表１−２】
【００２４】
これらの遺伝子の一つまたはいくつかの組み合わせの存在または不在を用いて、特定のＬ．ｓａｋｅｉ株を別の密に関係する株と区別することができる。
【００２５】
実施例３に記載されているように、発明者らは、これらの２９個のマーカー遺伝子がその他のＬ．ｓａｋｅｉ株の中で一つのＬ．ｓａｋｅｉ株を特徴付けるために最適であることを実証した。したがって、好ましい実施形態において、前記組み合わせは、配列番号１〜配列番号２９のマーカー遺伝子で構成される。
【００２６】
より詳細には、図３に例示されているとおり、以上で定義付けした２９個のマーカー遺伝子の存在または不在のパターンと７５個のＬ．ｓａｋｅｉ株との間の以下の対応が得られた。
− 株ＤＳＭ２００１９中には、配列番号２１のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ４９４中には、配列番号２１のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＡＧＲ４６中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１５６中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＡＧＲ５１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ１０４８中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２４、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ２０９２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２４、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１９５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２１、および配列番号２５のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＩＰ１０５４２２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ４２９中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ６７３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１８中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ５２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２６、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ５９中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ９２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＲＬ１４６７中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ３３５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＳＦ８４２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＳＦ７７０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＳＦ７７１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ２８７中には、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ０４１中には、配列番号１、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ４２７中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＹＭＥ３４４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株Ｖ５５３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ３４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株２３Ｋ中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株７２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株５０４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＴＩＳＴＲ９１１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＹＭＷ５４０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株３００中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２３のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２３のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ２０７０中には、配列番号１、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＪＧ３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ１７６４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ６６２６中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＳＦ８４１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＳＦ８４３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ１６３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ５５９０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ０１４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１６０Ｋ中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＡＧＲ４８中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ５５８９中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１１２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＹＭＨ２４３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１３４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＹＭＷ５５７中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株Ｌ１１０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ５５８８中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ２０９１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ２０８９中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ２０９０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株７４５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株７１０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株２０５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ２０８８中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ４９４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株３３１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＡＧＲ５３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株４９５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株Ｌｂ７０６中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ２１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ６７７中には、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株３３２中には、配列番号１、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株３３中には、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株６４中には、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ６４６９中には、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ５７２８中には、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株２１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＴＩＳＴＲ８９０中には、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＡＴＣＣ１５５２１中には、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ６７５中には、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、および配列番号２３のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
【００２７】
本発明はまた、Ｌ．ｓａｋｅｉ株を特徴付けするための方法であって、前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株中の、ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定することからなるステップを含む方法にも関する。
【００２８】
細菌株内の遺伝子の存在または不在を決定できる数多くの方法が当業者にとって周知である。これらの方法には、一つまたは複数の前記マーカー遺伝子の発現産物によって構成される、抗原に特異的に結合する抗体の使用、一つまたは複数の前記マーカー遺伝子由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはポリペプチド、またはその断片の検出が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、一つまたは複数の前記マーカー遺伝子の存在または不在は、本発明によると、増幅によって、または一つもしくは複数の前記マーカー遺伝子に特異的なＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによって決定される。
【００２９】
より好ましくは、配列番号１〜配列番号２９の前記マーカー遺伝子の全ての存在または不在が決定される。
【００３０】
特定の実施形態において、これらのマーカー遺伝子のプローブの組み合わせは、同じ支持体、好ましくは標準化された支持体上に集められる。これらの支持体は、当業者にとって公知である。そのサイズは、一つまたは複数の前記マーカー遺伝子の存在または不在を検出するために用いられる装置に応じて変動し得る。
【００３１】
有利には、本発明に従ったマーカー遺伝子の組み合わせは、標的遺伝子にハイブリダイズすると考えられる核酸断片が好ましくは標準化された要領で被着している支持体を含む、ＤＮＡマトリクスの形をしている。このような支持体のサイズは、用いられる調製方法および検出方法に応じて変動する。このような小さい支持体は、ＤＮＡアレイとも呼ばれる。
【００３２】
したがって、本発明の別の態様は、以上で定義されたマーカーの組み合わせを含むＤＮＡアレイに関する。
【００３３】
本明細書で使用される「ＤＮＡアレイ」という用語は、高密度で支持体（スライドガラス、ナイロン膜など）に被着された遺伝子、遺伝子断片、オリゴヌクレオチドのセットを意味する。ＤＮＡアレイの調製および使用に関する数多くの科学文献が入手可能である。
【００３４】
本発明の別の態様において、前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株の分類は、上述の一つまたは複数のマーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析すること、および基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株のセットに関してＪａｃｑｕａｒｄ指数またはダイス係数または任意の２値距離行列を計算することによって実施される。Ｊａｃｑｕａｒｄ指数は、ＪａｃｑｕａｒｄおよびＦｅｉｎｇｏｌｄ、１９７４年（Ｊａｃｑｕａｒｄ ａｎｄ Ｆｅｉｎｇｏｌｄ、１９７４ Ｔｈｅｏｒ．Ｐｏｐｕｌ．Ｂｉｏｌ．６：２１−３４）に記載されているように計算することができる。ダイス係数は、Ｖａｎ Ｒｉｊｓｂｅｒｇｅｎ、１９７９年（Ｖａｎ Ｒｉｊｓｂｅｒｇｅｎ、１９７９、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ、Ｌｏｎｄｏｎ： Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）が記載したように計算することができる。
【００３５】
本明細書で使用される「分類」という用語は、株をその遺伝子パターンに従って複数の異なるサブファミリーにまとめることを意味する。特に、同じ遺伝子パターンを示す株は同じサブファミリーに属する。
【００３６】
本明細書で使用される「基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株」という用語は、一つまたは複数の前記マーカー遺伝子の存在または不在が本発明に従ってすでに決定されており、分類すべき前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株を比較する対象である、Ｌ．ｓａｋｅｉ株のセットまたはコレクションを意味する。すなわち、前記基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株は、分類すべき前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株をその中に位置付けることが意図されたＬ．ｓａｋｅｉ株のサブファミリーまたはクラスタを構成するために使用されたものである。
【００３７】
好ましくは、本発明に従った基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株のセットは、表２に開示される株を含む。とは言え、その他の公知のＬ．ｓａｋｅｉ株を基準株として使用することもでき、それらは当業者にとって周知である。
【００３８】
好ましくは、前記基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株により構成されたＬ．ｓａｋｅｉ株の前記サブファミリーは、実施例３で定義されているとおりである。しかしながら、当業者であれば、クラスタ化が新しい株の同定に従って進化し得るものであることが分かっている。したがって、本明細書中に具体的に記述されていないクラスタにＬ．ｓａｋｅｉ株を分類するための、本発明に従った方法の使用は、本発明の範囲内である。
【００３９】
本明細書で使用される「Ｊａｃｑｕａｒｄ指数」という用語は、試料セットの類似性および多様性を比較するために用いられる統計値である。Ｊａｃｑｕａｒｄ指数は、Ｊ（Ａ，Ｂ）＝｜Ａ∩Ｂ｜／｜Ａ∪Ｂ｜という公式に従って共通集合のサイズを試料セットの和集合のサイズで除したものとして定義される。
【００４０】
好ましくは、本発明に従ったＪａｃｑｕａｒｄ指数の計算は、基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株の異なるサブファミリー中の前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株の場所を表示するクラスタリングツリーを最終的に提供するソフトウェアＲ（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２００６ Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ．Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を介して実施される。
【００４１】
本明細書で使用される「ダイス係数」という用語は、Ｊａｃｑｕａｒｄ指数に関連する類似性の尺度である。ダイス係数は、Ｊａｃｑｕａｒｄ指数と類似であるが、ｓ＝２｜Ａ∩Ｂ｜／（｜Ａ｜＋｜Ｂ｜）という公式に従って、一致に二倍の重みを付与するものである。
【００４２】
本発明の別の態様は、少なくとも二つのＬ．ｓａｋｅｉ株を比較する方法であって、
ａ） 第一のＬ．ｓａｋｅｉ株中のＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定すること、および
ｂ） 以上で定義されたように、第二のＬ．ｓａｋｅｉ株中の前記少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定すること、
からなるステップを含み、前記少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在のパターンが前記第一および第二のＬ．ｓａｋｅｉ株の間で異なっている場合にはこれらのＬ．ｓａｋｅｉ株は異なっているとされる方法に関する。
【００４３】
好ましくは、少なくとも二つのＬ．ｓａｋｅｉ株を比較する上述の方法において、前記配列番号１〜配列番号２９のマーカー遺伝子の全ての存在または不在が決定される。
【００４４】
特に、少なくとも二つのＬ．ｓａｋｅｉ株を比較する上述の方法は、以上で定義されたＪａｃｑｕａｒｄ指数、ダイス係数、または任意の２値距離行列を計算することにより前記マーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析するステップをさらに含む。
【００４５】
本発明に従った以上で定義された方法は、肉および／または魚に対する生物防腐剤として使用できる株カクテル内でＬ．ｓａｋｅｉ株を同定するために特に有利である。このような株カクテルを特徴付けする別の論点は、前記カクテル内に存在する各々の株の定量化にある。
【００４６】
したがって本発明の別の態様は、試料中の特定のＬ．ｓａｋｅｉ株を定量化する方法であって、
ａ）以上で定義されている方法により前記試料中に存在するＬ．ｓａｋｅｉ株を同定および／または特徴付けること、
ｂ）前記試料中に存在するその他の株に関して前記特定のＬ．ｓａｋｅｉ株内に差次的に存在する、一つまたは複数のマーカー遺伝子を決定すること、ならびに
ｃ）定量ＰＣＲにより一つまたは複数の前記遺伝子を増幅すること、
からなるステップを含む方法に関する。
【００４７】
定量ＰＣＲ法は、当技術分野において周知であり、リアルタイムＰＣＲ、競合ＰＣＲ、および放射性ＰＣＲを含む。
【００４８】
本明細書で使用される「試料」という用語は、一つまたは複数のＬ．ｓａｋｅｉ株が場合によっては他の細菌種と組み合わされた状態で中に存在する試料を包含する。
【００４９】
したがって、試料中の特定のＬ．ｓａｋｅｉ株を定量化する上述の方法には、試料中に存在する他の株から前記株を区別する先行ステップが含まれ得る。
【００５０】
以下の実施例は、本発明者らが前記マーカー遺伝子を同定した方法をさらに説明するものである。これらの実施例は、以上で定義した方法を例示するものであるが、限定するものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ２３Ｋ染色体におけるゲノムアイランドの検出および分析
この実施例は、本発明においてマーカーとして使用される遺伝子を有するＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ染色体におけるゲノムアイランドの、本発明者らによる同定について記載する。
【００５２】
細菌染色体は、株間での維持を示すのに充分長い間にわたり種内に存続している遺伝子を含むコア遺伝子プールと、一般的にはアイランドにクラスタ化され遺伝子水平移動（ＨＧＴ）により獲得されることの多い、可変的かつ補助的な遺伝子を含む、柔軟な遺伝子プールという、二つの遺伝子セットに分けられることが認められている。
【００５３】
したがって、本研究の目的は、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋのゲノム内の推定上の可変的ゲノムアイランドを同定し、ＨＧＴに原因があると考えられる、生態学的に重要であると推定される細胞機能を特徴付けすることにある。
【００５４】
実験手順
コドン使用頻度の分析
発現度の高い遺伝子のコドン使用頻度の痕跡を、ＳｈａｒｐおよびＷｅｎｇ−Ｈｓｉｕｎｇ（Ｓｈａｒｐ ａｎｄ Ｗｅｎｇ−Ｈｓｉｕｎｇ １９８７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：１２８１−１２９５）により紹介されたＣＡＩを使用して調べた。ＣＡＩの計算のために基準として用いたコドン頻度は、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋゲノム内で見られるリボソームタンパク質およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子に基づいて推定した。第二に、コード配列（ＣＤＳ）の非監視のクラスタ化を、本発明者らによって設計されたアルゴリズムを用いて、それらの同義語コドンの使用頻度に基づいて実施した。このアプローチは、異なる遺伝子クラスにおける同義語コドンの選択を説明する混合モデルの使用に基づくものである。簡単に言うと、ユーザーによって遺伝子クラスの数が定義づけされると、モデルは、反復アルゴリズムを用いて配列に適合され、最終的なクラスタ化によって、各ＣＤＳが、その最も確率の高いクラスに関連付けされる。
【００５５】
以下では、混合モデルおよびクラスタ化手順をより形式的に記載する。すなわち、混合モデルのコドン使用頻度のクラス、または構成要素の数をｎで表す。各クラスｕは、混合物中のその発生率ｑｕとセット確率（ｆｕ，ｉ，ｊ）（１≦ｉ≦２０、１≦ｊ≦ｓｉ）により特徴付けされ、ここでｆｕ，ｉ，ｊは、アミノ酸ｉについてのｊ番目の同義語コドンを使用する確率に対応し、ｓｉはアミノ酸ｉについての同義語コドンの数を表す。モデルパラメータｑｕおよびｆｕ，ｉ，ｊの最大尤度推定値は、期待値最大化アルゴリズムを用いて得られる。最後に、最終的なクラスタ化は、ベイズ式を用いて各々のＣＤＳｋについて各クラスｕの確率を計算した後に得られる。すなわち、ｐｋ（ｕ）は、ｑｕΠｆｕ，ｉ，ｊｃ（ｋ，ｉ，ｊ）（式中、ｐｋ（ｕ）はＣＤＳｋがクラスｕに属する確率を表し、ｃ（ｋ，ｉ，ｊ）はＣＤＳｋにおけるアミノ酸ｉについてのｊ番目の同義語コドンの出現を計数する）に正比例する。混合モデルの枠組みの具体的な提示は、ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＰｅｅｌ（ＭｃＬａｃｈｌａｎ ａｎｄ Ｐｅｅｌ ２０００ Ｉｎ Ｆｉｎｉｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）において見ることができる。最後に、Ｍｅｄｉｇｕｅら、１９９１年（Ｍｅｄｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．、１９９１ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：８５１−８５６）において記載されているものと類似の要領でＣＤＳの集団のグラフ表示を可能にするよう、対応分析を実施した。短いＣＤＳ（３００ｂｐから１００アミノ酸長未満）および二つのシステインコドンは、関連する相対的コドン頻度の正確な推定を可能にしないことから、対応分析から削除した。さらに、全ての計数に疑似計数１を加えることによって、コドン頻度の推定値を平滑化した。
【００５６】
全ての分析は、Ａ＋Ｔ含有量およびＣＡＩを計算するため、また上述の新たなクラスタ分析を実施するＣ＋＋プログラムとＭＵＬＴＩＶパッケージのＣＡ機能を用いて対応分析を実施するＲスクリプトとの両方を呼び出すために機能する、ＣＯＤＯＮＵＳＡＧＥ．ＰＬという名称のアドホックＰｅｒｌスクリプトで実施した（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２００６ Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｖｉｅｎｎｅ、Ａｕｓｔｒｉａ：Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）。全てのプログラムは、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｏｕｙ．ｉｎｒａ．ｆｒ／〜ｐｎｉｃｏｌａｓ／ｃｏｄｏｎｍｉｘｔｕｒｅ／にてダウンロードすることができる。
【００５７】
結果
Ｌ．ｓａｋｅｉのコドン使用頻度は、染色体の複製および翻訳の効率によって決定される。
考えられるＨＧＴ事象を検出する目的で、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ遺伝子プールの組成傾向を特徴付けするために、Ｇ＋Ｃ含量分析、コドン適合指数（ＣＡＩ）の計算、同義語コドン使用頻度の対応分析、および上述の同義語コドンの使用頻度の混合モデリングに基づく新たな方法を用いた遺伝子プールの非監視のクラスタ化を含む、統計学的測定値のアレイを用いた。
【００５８】
完全な遺伝子プールの非監視のクラスタ化により、四つの遺伝子群の同定が可能となった。第一および第二の群の遺伝子は、遺伝子プール全体の７４．５％を占める。これらの遺伝子は極めて選択的に染色体複製のリーディング鎖上に位置し（９３％）、ＣＡＩで測定されるその発現レベルによって区別される（タンパク質の発現レベルを反映する）。すなわち、群１の遺伝子は低いまたは平均的なＣＡＩ値を有し、一方、群２の遺伝子は高いＣＡＩ値を示す。この第２の群は、典型的な発現度の高い遺伝子、例えばＳ層様タンパク質、Ｃｐｌ様シャペロン、および発現度の高い代謝的に重要な酵素、例えば解糖経路の酵素を含む。群３は、遺伝子プール全体の１８．５％を包含し、ラギング鎖上に位置する遺伝子を主に含む（８７％）。
【００５９】
したがって、染色体の複製に対するその配向およびその推定翻訳効率レベルによってそのコドンの使用頻度が強く決定される三つの遺伝子群を明らかにすることができた。
【００６０】
より重要なことに、このモデルにより、非定型のＡ＋Ｔに富んだ含有量および低いＣＡＩ値を有する第四の遺伝子群（遺伝子プール全体の７％）の区別が可能となった。この第四群の組成パターンは、低いＧ＋Ｃ含有量を有する遺伝子が多くの細菌内でＨＧＴと関連することが記載されているため（Ｍｅｄｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．、１９９１ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：８５１−８５６）、ＨＧＴによって決定されている可能性がある。
【００６１】
非定型のＡ＋Ｔに富んだＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ遺伝子は、ゲノムアイランド内にクラスタ化される。
この第四の遺伝子群のＨＧＴ関連の由来源を確認するため、染色体におけるそれらの対応する遺伝学的状況をさらに、より詳細に考察した。現在のところ、これらの非定型のＣＤＳの大部分が集合して、機能的に関連性のある遺伝子の大きなアイランドを形成することが第一に指摘され、前記アイランドは多くの場合に可動要素の近くに位置し、これは、水平移動される遺伝的クラスタの古典的な特徴である（Ｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．、２０００ Ｎａｔｕｒｅ ４０５：２９９−３０４）。
【００６２】
さらに、非定型のコドン使用頻度を有する遺伝子は、多くの場合、系統発生的に遠い細菌属においてのみ見られるタンパク質に相同なコード産物であった。
【００６３】
これらのデータから、本発明者らは、推定ＨＧＴ遺伝子プールがこのようにして、２７個のゲノムアイランド（７．３ｋｂの平均サイズで１．６から２８ｋｂ）および４９個の単一遺伝子で構成され、全体で２３５ｋｂ（１２．５％）のＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ染色体をカバーするものであったことを実証した。また、２７個のゲノムアイランドが、重要でないＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋのゲノムに関係する可能性があることが推測された。
【００６４】
実施例２：肉媒介性の乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉの種内のゲノム多様性および天然の個体群構造
この実施例は、本発明者らによる、マーカー遺伝子を用いたＬ．ｓａｋｅｉ株の分類について記載する。
【００６５】
本研究において、本発明者らは、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）ゲノムマッピング、株の階層クラスタ化のための、本発明者らにより同定された（実施例１参照）可変的遺伝子プールから得た遺伝子マーカーのＰＣＲに基づいた検出、そして最後に、それらのそれぞれの表現型多様性を評価するためのプロテオーム比較を含む、複数のタイプ決定技術の組み合わせを実施した。さまざまな地理的場所および肉または魚関連製品の様々な供給源に対応する、さまざまな研究所コレクションからの単離株が、これらの培養化されていない株が天然のＬ．ｓａｋｅｉ個体群の多様性を代表するという期待に基づいて、特定的に選択された。
【００６６】
これらの結果は、Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株の分子サブタイプのレパートリーを分類するための、ゲノムに基づいた統合的な枠組みを提供する。
【００６７】
実験手順
細菌株および培養条件
この研究において使用される全てのＬ．ｓａｋｅｉおよびＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ株は表２に記載されている。細菌株をＭＲＳ肉汁培地（Ｄｉｆｃｏ）内において３０℃で中期の対数増殖期まで成長させた（Ｄｅ ｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９６０ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２３：１３３−１３５）。プロテオーム研究のために、細菌株を、０．５％グルコースを補った化学合成培地ＣＤＭ（Ｌａｕｒｅｔ ｅｔ ａｌ．、１９９６ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１９２２−１９２７）内において３０℃で成長させた。
【００６８】
分子生物学的技術
Ｌ．ｓａｋｅｉ ３３２Ｆのサブトラクティブ抑制ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を以下のように実施した。すなわち、その内因性プラスミドｐＲＶ５００（Ａｌｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、２００３ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：５５７４−５５８４）から保存処理したテスター株３３２Ｆを調製するために、エリスロマイシン耐性を有し、ｐＲＶ５００レプリコンから誘導したｐＲＶ５６６プラスミド（Ａｌｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、２００３ Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：５５７４−５５８４）を用いて、Ｂｅｒｔｈｉｅｒらの方法（Ｂｅｒｔｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９６ Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：３０３７−３０４１）により、親Ｌ．ｓａｋｅｉ ３３２をエレクトロポレーションした。
【００６９】
さらに、抗生物質を含まないＭＲＳブロスにおいて３０℃で、一つのエリスロマイシン耐性クローンを２００世代にわたり培養した。最終培養物から得た複数の希釈物をＭＲＳ寒天上に置いた。エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含むかまたは含まないＭＲＳ寒天上に２００個のクローンをレプリカ平板固定することによって、一つのエリスロマイシン感受性クローンを選択することができた。ｒｅｐＡ遺伝子に特異的なプローブを用いて、サザンブロッティング法（ＥＣＬ（商標）ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、ｐＲ５６６プラスミドの喪失を確認した。対応する株を３３２Ｆと名付けた。
【００７０】
メーカーの推奨事項に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ ＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ（商標）細菌ゲノムサブトラクションキットを用いて、かつドライバーとしてＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋを用いて、ＳＳＨ実験を実施した。この技術により、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋには不在である８個の新たな遺伝子が同定された。Ｌ．ｓａｋｅｉ ２１由来のＦＧＰ２１−０００１遺伝子を、ＰＣＲ産物（ＬＳＡ０５６５からＬＳＡ５６６）の配列決定後に同定し、その結果、予想外のサイズが得られ、新型のバクテリオシン免疫様のタンパク質をコードする遺伝子が明らかになった。
【００７１】
表２：本研究において用いられるＬ．ｓａｋｅｉおよびＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ株
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【００７２】
ＰＣＲに基づいた遺伝子の検出
本発明者らが同定した柔軟な遺伝子プールの存在または不在を、以下の、株のクラスタ化のためのゲノムアイランドの従来のＰＣＲに基づいた検出および検証を用いて調査した。
ＰＣＲ鋳型は７３個のＬ．ｓａｋｅｉ株および２個のＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ株から抽出した１００ｎｇの染色体ＤＮＡであった。実験を二回行い、否定的な結果を確認した。増幅が微弱であるかまたは擬似である場合、ＰＣＲ産物を配列決定して、株間のヌクレオチド多型を検査した。必要な場合には、プライマーを設計し直した。
【００７３】
Ｌ．ｓａｋｅｉおよびＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ由来の染色体ＤＮＡの抽出をＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＭｃＫａｙの方法（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ ＭｃＫａｙ，１９８３ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：５４９−５５２）により実施した。各々のＰＣＲ増幅のために、プライマー対を、産物の予想された長さが２ｋｂ未満となるように設計した。
【００７４】
ＰＣＲサイクリング条件は、９４℃で４分間と、それに続く、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で３分間の３０サイクルであった。全てのＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルを用いて検査し、エチジウムブロマイドで染色した。一部の遺伝子の切断または予想外のサイズの産物を確認するために、１０μｌの単位複製配列を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＣｌ２緩衝液中の０．１単位のエビアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および１ＵのエキソヌクレアーゼＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｂｉｏｌａｂｓ）で、３７℃で１時間にわたり処理し、それに続いて、９４℃で１０分間不活性化した。その後、生成物を、標準的な技術を用いて配列決定した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅ−ｍｗｇ．ｃｏｍ）。
【００７５】
ＰＦＧＥ実験およびＩ−ＣｅｕＩパターン分析
Ｄｕｄｅｚら、２００２年（Ｄｕｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４８：４２１−３１）により記載されているように、パルスフィールドゲル電気泳動法およびＩ−ＣｅｕＩ消化パターン分析を実施した。平均４個のゲルを各株について実施した。そのゲノムサイズにしたがった株の分布を、Ｒ統計パッケージのＨＩＳＴ関数および確率密度関数を用いて検査した（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２００６ Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ：Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）。分析のために、ガウス確率分布および３０（ゲノムサイズ推定の平均標準偏差）という平滑化帯域幅を選択した。
【００７６】
株のクラスタ化
試験した株の遺伝子含有量は、遺伝子の不在の場合は０、そして存在の場合は１という、２文字のマトリクス（遺伝子×単離株）を使用することにより記述された。ＩＳエレメントにより切断された遺伝子は、それらの野生型対応物とは異なる遺伝子同一性とみなした。株間の類似性を、Ｊａｃｑｕａｒｄの相関係数を用いて決定した（Ｊａｃｑｕａｒｄ ａｎｄ Ｆｅｉｎｇｏｌｄ、１９７４ Ｔｈｅｏｒ Ｐｏｐｕｌ Ｂｉｏｌ．６：２１−３４）。非監視の階層クラスタ化を、類似性マトリクス上の完全な連結を用いて実施した。クラスタ化のデンドログラムを作成するために、Ｒ統計パッケージ（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２００６ Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ：Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）のＤＩＳＴ、ＨＣＬＵＳＴ、およびＤＥＮＤＲＯＧＲＡＭという関数を使用した。各ノードの統計的安定性を評価する目的でのマルチスケール・ブートストラップ・リサンプリングのために、ＲパッケージのＰＶＣＬＵＳＴ（ＳＵＺＵＫＩ ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｄｅｉｒａ、２００６ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２２：１５４０−１５４２）を使用した。ブートストラップ複製の数は１０００であった。考えられる株クラスタを区別するために、９０％以上の近似的に不偏なＰ値および５０％以上のＪａｃｑｕａｒｄ類似性係数を使用した。
【００７７】
２Ｄゲル電気泳動およびペプチドマスフィンガープリンティングによるタンパク質の同定
標準的な方法により、細菌抽出物の調製および電気泳動を実施した（Ｊｏｆｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５８：５１２−５２０）。Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってゲルを分析した。Ｍａｒｃｅａｕら（Ｍａｒｃｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：７２６０−７２６８）により記載されているように、クマシー染色したゲルからスポットを切除し、Ｇｕｉｌｌｏｔら（Ｇｕｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００ ｌｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５５：４７−５１）によって以前に記載されたように、質量分析を実施した。ローカルサーバー上にインストールしたＭＳ−Ｆｉｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ）およびＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｓｅａｒｃｈ＿ｆｏｒｍ＿ｓｅｌｅｃｔ．ｈｔｍｌ）を用いて、ペプチドマスフィンガープリントからのタンパク質を同定した。全てのサーチを、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｇａｌｅ．ｊｏｕｙ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｓａｋｅｉ）に対して実施した。
【００７８】
結果
Ｌ．ｓａｋｅｉ株の選択
天然のＬ．ｓａｋｅｉ個体群の生物学的多様性を入念に推定するため、発明者らは、さまざまな肉もしくは魚関連食品（生もしくは発酵）またはザウアークラウトおよびヒトの便を含むその他の供給源から単離した株を注意深く分析した。さらに、使用した単離手順または分析した食品原料のタイプが原因で、単一の研究所の細菌コレクション中にサンプリングバイアスが存在する可能性があるため、Ｌ．ｓａｋｅｉ株は、欧州、アジア、およびニュージーランド内に地理的に散在する、１４個の異なる研究所のコレクションから選択した。合計７３個のＬ．ｓａｋｅｉ株を、外部種基準（外集団基準）と考えられるＬ．ｓａｋｅｉ種に近い類縁である二つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ株と同様に選択し、分析した（表２）。
【００７９】
柔軟な遺伝子プールのＰＣＲベースの検出による主要なＬ．ｓａｋｅｉ分子サブタイプの同定
Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ染色体のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析について記載する実施例１において、発明者らは、２７個のゲノムアイランドおよび４９個の独立した遺伝子を含むその推定柔軟遺伝子プールを同定した。発明者らは、Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株のクラスタ化分析のために、従来のＰＣＲを使用することにより、この遺伝子プールの存在または不在（株間で可変的であると仮定されている）を検査することを決定した。
【００８０】
この戦略を、これらの遺伝子の種内変動を実証するために、２０株のセットに対する予備的ＰＣＲ実験で最初に試験した。５つのアイランドだけが良く保存されていることが明らかとなり、したがって分析からこれらを除外した。横方向移動の可能性が高い可動エレメント（挿入配列、ファージ、および制限／修飾系）に起因したクラスタ化の妨害を回避するために、これらの遺伝子も分析から外した。さらに、発明者らは、各ゲノムアイランド内部の大部分の遺伝子が類似の変動パターンを通常は示している（アイランド全体が通常は存在するかまたは不在である）ことを示した。したがって、大きなゲノムクラスタ（より小さなゲノムクラスタに比べてより多くの遺伝子を含むもの）からの偏向を避けるため、最大４個の遺伝子（異なる変動パターンを最終的に示すもの）を各クラスタについて選択した。
【００８１】
さらに、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ染色体には不在であったその他のＬ．ｓａｋｅｉ株から得られる染色体にコードされた１１個の遺伝子を分析に組み込んだ。これらの遺伝子は、以前に公表されたクラスタから一部選択し、その他のＬ．ｓａｋｅｉ株の部分的なゲノム配列決定から一部得た。したがって、この選抜の結果として、約８０％の遺伝子がＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ（２１個のゲノムアイランドおよび４個の独立した遺伝子を表す）に由来し、約２０％の遺伝子がその他の株に由来した。これらの６０個の遺伝子の特徴は、表３および表４にまとめられている。
【００８２】
６０個の遺伝子のＰＣＲ分析に基づいて、発明者らは、非監視完全連結階層クラスタ化アルゴリズムを使用することおよびマルチスケール・ブートストラップ・リサンプリングを介してＰ値を推定してクラスタ化分析の不確実性を評価することによる、Ｌ．ｓａｋｅｉ天然単離株の分類を試みた（図１）。得られたデンドログラムから、発明者らは、三つの主要な群に分割される少なくとも１１個のブートストラップ支持型の株クラスタを明確に同定した。
【００８３】
クラスタＡは基準株２３Ｋを含み、クラスタＢからＤは、共に群１を形成している、このクラスタＡに密に関係する株を含む。その他の群は、群１との関係性が階層的に低く、Ｌ．サケイ亜種ｃａｒｎｏｓｕｓ型株ＣＩＰ １０５４２２Ｔ（クラスタＧ、群２）およびＬ．ｓａｋｅｉ亜種ｓａｋｅｉ型株ＡＴＣＣ １５５２１Ｔ（クラスタＫ、群３）を含む株クラスタであり、後者は、群１との関係が最も遠い。群３からの三つの株（３３２、２１、およびＬＴＨ２０７０）は、クラスタＨとクラスタＩの間で確実にクラスタ化することができなかった。
【００８４】
Ｌ．ｓａｋｅｉの遺伝子型クラスタ間の染色体サイズおよび幾何形状の変動
発明者らは次に、Ｉ−ＣｅｕＩで消化された断片のＰＦＧＥ分析による、Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株間のゲノムサイズ変動の程度を調査した。Ｌ．ｓａｋｅｉ染色体のＩ−ＣｅｕＩマッピングは、結果として、さまざまなサイズの七つのＤＮＡ断片をもたらし（Ｄｕｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４８：４２１−３１）、Ｌ．ｓａｋｅｉ株間で全体的なゲノムサイズおよび幾何形状を決定する上での効率の良い手段である。
【００８５】
この分析により、Ｌ．ｓａｋｅｉ株間のゲノムサイズの大きな差異が明らかとなった。平均染色体サイズは、種では２０２０±３０ｋｂであるが、サイズ範囲は、１８１４±３０ｋｂ（株ＣＴＣ４２７）から２３０９±７９ｋｂ（株ＬＴＨ６７７）までにわたっており、したがってこれは約２５％のゲノム変動（約５００ｋｂ）を表している。さらに特筆すべきは、Ｌ．ｓａｋｅｉ株の染色体サイズがこの範囲に沿って均質に分布しておらず（図２Ａ）、ゲノムサイズデータのガウス確率分布が、株が亜個体群へ分割される可能性を示唆していたという観察結果である。
【００８６】
ＰＧＦＥ亜個体群をさまざまな遺伝子型クラスタ内での株の分布により説明できるか否かを評価するために、発明者らは、１１個のクラスタにわたるゲノムサイズ分布を分析した（図２Ｂ）。発明者らは、ゲノムサイズが株クラスタ間で比較的均一であることを実証した。発明者らは同様に、群１（クラスタＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）由来のＬ．ｓａｋｅｉ単離株が小さなゲノム（平均サイズ１９１５ｋｂ±７９ｋｂ）を通常は含み、一方、群２（クラスタＥ、Ｆ、およびＧ）ならびに群３（クラスタＨ、Ｉ、Ｊ、およびＫ）がより大きなゲノム（それぞれ平均サイズ２０５５ｋｂ±８０ｋｂおよび２０８０ｋｂ±８０ｋｂ）を有する単離株の大部分を含むことも示した。
【００８７】
遺伝子型クラスタとＰＧＦＥ亜個体群との間で見られたこの優れた一致に促されて、発明者らは、染色体全体のゲノムサイズと７３個のＬ．ｓａｋｅｉ単離株内のＩ−ＣｅｕＩで消化された各断片のゲノムサイズとの間の相関関係を分析するに至った。これら二つのパラメータは最小のＬ．ｓａｋｅｉゲノムから最大のＬ．ｓａｋｅｉゲノムまでの比例的な増加を示していたため、優れた相関関係が観察された。
【００８８】
表３：クラスタ化分析のために用いられるＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ株の柔軟な遺伝子プール由来の遺伝子の説明
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【００８９】
表４：クラスタ化分析のために用いられる２３Ｋ以外の株に由来する遺伝子の説明
【表４】
【００９０】
異なるクラスタに由来するＬ．ｓａｋｅｉ単離株間の包括的なプロテオーム可変性
発明者らは次に、二次元電気泳動を用いて、クラスタ化の最終的な確認として、さまざまな遺伝子型クラスタＡ〜Ｋから選択された１２個の選抜株のプロテオームを比較した。４〜７のＰｉ範囲内で平均約４００個のスポットが一般に観察されたが、発明者らは、株間で検出されたこのスポット数の２０％超の著しい変動を認識した。
【００９１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用することにより、主要な差異を表すスポットを同定した。大部分の差異は、中程度もしくは低度に発現するタンパク質またはこの基準ゲノムからのタンパク質データベース中では同定できなかったことからＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ内に存在しない遺伝子によりコードされると考えられるタンパク質の株特異的なスポットであることが明らかになった。２Ｄタンパク質パターンにおける幾分かの変動も同様に、高度に発現されるタンパク質の一部の株特異的なアイソフォームの泳動差の結果であることが発見された。Ｌ．ｓａｋｅｉの亜種を定義するためにその他の研究において用いられた技術であるＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質プロフィールの分析が主として高度に発現されるタンパク質の検出に基づいていることから、この情報は特に興味深いものであった。これらのデータは、図１に示されている階層クラスタ化をさらに確認するものであった。
【００９２】
結論として、発明者らは、Ｌ．ｓａｋｅｉ種において考えられる分子サブタイプ数についての初めての洞察を提供した。以上の結果から、この天然個体群を三つの主要な株群として観察することができ、その各々は３から４個のクラスタにさらに分けられる。群１の単離株間のゲノムサイズ（平均１９１５ｋｂ）と群２および群３の単離株間のゲノムサイズ（両方について平均約２０７５ｋｂ）との間には、実質的な差が存在する。
【００９３】
発明者らは、Ｌ．ｓａｋｅｉ種の種間のゲノム変動の程度を評価し、初めて、天然単離株の包括的な分類を生成した。
【００９４】
実施例３
この実施例において、発明者らは、株の階層クラスタ化のために、可変遺伝子のプールから得られた２９個の遺伝子マーカーのＰＣＲベースの検出を実施した。
【００９５】
この研究で使用したＬ．ｓａｋｅｉおよびＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ株の全ては、表２に記載されている。
【００９６】
試験した株の遺伝子含有量は、遺伝子の不在を０、存在を１とした、２文字のマトリクス（遺伝子×単離株）を使用することにより記述された。株間の類似性を、以上で定義されたようにＪａｃｑｕａｒｄ相関係数（またはＪａｃｑｕａｒｄ指数）を用いて決定した。
【００９７】
発明者らは、実施例２に記載したものと類似したスクリーニングを実施し、その結果、表１にまとめた２９個のマーカー遺伝子のみを選抜した。
【００９８】
これらのわずか２９個の遺伝子のＰＣＲ分析に基づいて、発明者らは、非監視完全連結階層クラスタ化アルゴリズムを使用すること、およびマルチスケール・ブートストラップ・リサンプリングを介してＰ値を推定してクラスタ化分析の不確実性を評価することによって、Ｌ．ｓａｋｅｉの天然単離株を分類した。得られたデンドログラムから、Ａ〜Ｋと呼ばれる１１個のブートストラップ支持型の株クラスタを明らかに同定した（図３）。これらの株クラスタは、約６０個のマーカー遺伝子を用いて得られた、実施例２に記載したものときわめて類似している。
【００９９】
したがって、本発明者らは、Ｌ．ｓａｋｅｉの天然単離株を正しく分類するために充分な２９個の遺伝子を同定することができた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１００】
【非特許文献１】Ｖｅｒｍｅｉｒｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９６：１４９−１６４
【非特許文献２】Ｂｅｒｔｈｉｅｒ ａｎｄ Ｅｈｒｌｉｃｈ １９９９ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４９：９９７−１００７
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を特徴付けするためのマーカー遺伝子の組み合わせに関するものである。特に、本発明は、特徴付けすべき株を分類および同定するための、この株のゲノム内におけるマーカー遺伝子の存在または不在のパターンの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
新鮮な肉および魚は、栄養価は高いもののきわめて腐りやすい食品である。生産および貯蔵中、これらの食品は、加工環境からの不可避的な微生物汚染に曝露されている。このような汚染には、腐敗性生物および病原体が含まれ得る。したがって、食品加工業者にとっては、汚染物質が潜在的に危険なレベルまで発達しないように、その成長を制限することが優先事項である。利用される方法の一つは、腐敗性および病原性の微生物の成長を食い止めるために安全な細菌を用いることである。この観点から見て、肉媒介性の乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉは、優れた特性を示す。
【０００３】
Ｌ．ｓａｋｅｉは、新鮮な肉上で生存および成長して、選択技術が適用された場合に優勢な個体群を形成する能力を有する。一部の株は、欧州において、その有用な防腐特性のため、発酵ソーセージの手工業的製造および大規模製造のために広く用いられている。しかし、これらを、望ましくない細菌の成長を防ぐことにより、肉の生物防腐剤として使用することも考えられ得る（Ｖｅｒｍｅｉｒｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９６：１４９−１６４）。
【０００４】
Ｌ．ｓａｋｅｉの株は、表現型形質において大幅な可変性を示し得、長い間分類するのが困難であると考えられてきた。これまでの研究では、Ｌ．ｓａｋｅｉ株を分類するためのアプローチが開示されている。ＲＡＰＤパターン（Ｂｅｒｔｈｉｅｒ ａｎｄ Ｅｈｒｌｉｃｈ １９９９ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４９：９９７−１００７）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ可溶性タンパク質の含有量パターンの数値的解析を用いた研究では、株を二つの下位群に分割することが示唆されたが、これは定義が軟弱であり研究に従った比較が不可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、これらのアプローチを通して得られたＬ．ｓａｋｅｉ株の分類はなお、満足のいくものではない。本発明の一つの目的は、特に食品上または生物防腐剤として使用される細菌カクテル中に存在するＬ．ｓａｋｅｉ株を同定するために使用できる、Ｌ．ｓａｋｅｉ株を分類、特徴付け、および同定する、より優れた方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者らは、本明細書において、Ｌ．ｓａｋｅｉゲノムのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの研究、およびＬ．ｓａｋｅｉ株の大きなコレクションについての実験的検証に基づいて、これらの株を特徴付けおよび検出するためのマーカーの組み合わせを同定した。特に、組み合わせることでＬ．ｓａｋｅｉ株の最適な特徴付け法を提供する、２９個のマーカー遺伝子が単離された。
【０００７】
本発明は、したがって、ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも二つのマーカー遺伝子を含むＬ．ｓａｋｅｉ株の特徴付けを可能にするマーカーの組み合わせに関する。
【０００８】
好ましい実施形態において、前記組み合わせは、配列番号１〜配列番号２９のマーカー遺伝子の全てを含む。
【０００９】
本発明はまた、前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株中のＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定することからなるステップを含む、Ｌ．ｓａｋｅｉ株を特徴付けするための方法にも関する。
【００１０】
好ましい実施形態において、前記配列番号１〜配列番号２９のマーカー遺伝子の全ての存在または不在が決定される。
【００１１】
好ましくは、前記一つまたは複数のマーカー遺伝子の存在または不在は、増幅によって、または前記一つもしくは複数のマーカー遺伝子に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションによって決定される。
【００１２】
好ましい実施形態において、前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株の分類は、上述の一つまたは複数のマーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析すること、および、基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株のセットに関してＪａｃｑｕａｒｄ指数またはダイス係数または任意の２値距離行列を計算することによって実施される。
【００１３】
本発明はまた、以上で定義されたマーカーの組み合わせを含むＤＮＡアレイにも関する。
【００１４】
本発明の別の態様は、少なくとも二つのＬ．ｓａｋｅｉ株を比較する方法であって、
ａ）第一のＬ．ｓａｋｅｉ株中のＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定すること、および
ｂ）第二のＬ．ｓａｋｅｉ株中の前記少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定すること、
からなるステップを含み、前記少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在のパターンが前記第一および第二のＬ．ｓａｋｅｉ株間で異なっている場合にはこれらのＬ．ｓａｋｅｉ株は異なっているとされる方法に関する。
【００１５】
好ましい実施形態において、前記配列番号１〜配列番号２９のマーカー遺伝子の全ての存在または不在が決定される。
【００１６】
特定の実施形態において、少なくとも二つのＬ．ｓａｋｅｉ株を比較する上述の方法は、Ｊａｃｑｕａｒｄ指数またはダイス係数または任意の２値距離行列を計算することにより前記マーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析するステップをさらに含む。
【００１７】
本発明の別の態様は、試料中の特定のＬ．ｓａｋｅｉ株を定量化する方法であって、
ａ）以上で定義した方法により前記試料中に存在するＬ．ｓａｋｅｉ株を同定および／または特徴付けすること、
ｂ）前記試料中に存在するその他の株に関して前記特定のラクトバチルス株内に差次的に存在する一つまたは複数のマーカー遺伝子を決定すること、ならびに
ｃ）定量ＰＣＲにより一つまたは複数の前記遺伝子を増幅すること、
からなるステップを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｌ．ｓａｋｅｉのゲノム多様性を示す図である。７３個のＬ．ｓａｋｅｉ単離株および外集団の基準として考慮された二つのＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ単離株の間の６０個の遺伝子マーカーの分布。遺伝子は、２３Ｋの染色体、すなわちＬＳＡ００８８、ＬＳＡ０１１８、ＬＳＡ０１５７、ＬＳＡ０１６５、ＬＳＡ０１７２、ＬＳＡ０１７８、ＬＳＡ０２１２、ＬＳＡ０２１６、ＬＳＡ０２１７、ＬＳＡ０２１８、ＬＳＡ０２１９＿ｂ、ＬＳＡ０３０６、ＬＳＡ０４３９、ＬＳＡ５０９、ＬＳＡ５１０、ＬＳＡ０５３０、ＬＳＡ０５６４＿ａｃ、ＬＳＡ０５６５、ＬＳＡ０５６７、ＬＳＡ０５７２、ＬＳＡ７２４、ＬＳＡ７２７、ＬＳＡ１００６、ＬＳＡ１１８２／３、ＬＳＡ１２２０、ＬＳＡ１２２２、ＬＳＡ１２２７、ＬＳＡ１２３２、ＬＳＡ１２８３、ＬＳＡ１５０９、ＬＳＡ１５１０、ＬＳＡ１５１２、ＬＳＡ１５１０＿ａ、ＬＳＡ１５１０＿ｇ、ＬＳＡ１５７２、ＬＳＡ１５７９／８０、ＬＳＡ１５８１、ＬＳＡ１５８４、ＬＳＡ１６４１、ＬＳＡ１６４０、ＬＳＡ１６４０、ＬＳＡ１７２０、ＬＳＡ１７２４、ＬＳＡ１７３０、ＬＳＡ１７３１、ＬＳＡ１８０６、ＬＳＡ１８０９、ＬＳＡ１８７４、ｓｓｐＴ、ｓｓｐＡ、ＦＧＰ２１−０００１、ＤｒｓＡ、ＦＧＰ３３２−０００１、ＦＧＰ３３２−０００２、ＦＧＰ３３２−０００３、ＦＧＰ３３２−０００６、ＦＧＰ３３２−０００５、ｌａｃＣ、ｌａｃＧ内のその位置によって表の左側に順序付けされている。色：白色は不在、黒色は存在。株のゲノム関係の推定値を示すデンドログラムは、完全連結階層分析によって作成した。スケールは、各ノードにおける距離を表す。１という係数は完全な独立性を表し、ゼロは絶対的な同一性を示す。ノードにおけるＰ値は、ＰＶＣＬＵＳＴプログラムを用いたマルチスケール・ブートストラップ・リサンプリングによるクラスタ化の信頼性を示す。株は、信頼性が９０％超であり単離株間の最大距離が０．５であるクラスタ分岐に基づいてグループ化した。主要な株群は、全個体群中のそのそれぞれの百分率と共に示されている。亜種型株および基準株であるＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋは、垂直な長方形で示されている。
【図２Ａ】Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株間のゲノムサイズのヒストグラム分布を示す図である。株は、ゲノムサイズ軸の上のラグ状のバーにより表されている。ヒストグラムのバーは、３０ｋｂのゲノムサイズ枠内の株の数を表す（ＰＦＧＥ測定の平均標準偏差）。個体群中のゲノムサイズのガウス確率分布（右側の軸上の推定された密度）は、灰色の平滑な線で示されている。亜種型株および株２３Ｋは、アスタリスクで示されている。
【図２Ｂ】Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株の遺伝子型クラスタ化に従った、前記Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株のゲノムサイズの分布を示すボックスプロットを示す図である。水平の黒い線は、２０２０ｋｂの平均ゲノムサイズを示している。互いの間でほとんど変動を示していないクラスタＥおよびＦを、分析のために共にプールした。明確さを期して、未分類の株３３２、ＬＴＨ２０７０、および２１をクラスタＨにグループ化した。
【図３】株のゲノム関係の推定値を示すデンドログラムを、完全連結階層分析によって作成した。スケールは、各ノードにおける距離を表す。株は、信頼性が９０％超であり単離株間の最大距離が０．５であるクラスタ分岐に基づいてグループ化した。遺伝子含量のマトリクスにおいては、黒色が遺伝子の存在（１）を示し、白色が遺伝子の不在（０）を表す。左側の遺伝子は、表１におけるように順序付けされている。より詳細には、マトリクスの異なる線は、以下の遺伝子マーカーに対応する：１）ＬＳＡ１６４１、２）ＬＳＡ１１８２およびＬＳＡ１１８３＿ｃ、３）ＬＳＡ０１７２、４）ＬＳＡ１７３１、５）ＬＳＡ０２１１およびＬＳＡ０２１２、６）ＬＳＡ１５７９およびＬＳＡ１５８０、７）ＬＳＡ０１１８、８）ＬＳＡ０５２９、９）ＬＳＡ０４３９、１０）ＬＳＡ０５７２、１１）ＬＳＡ０２１９ｂ、１２）ＬＳＡ０５６４＿ａ、ＬＳＡ０５６４＿ｂおよびＬＳＡ０５６４＿ｃ、１３）ＦＧＰ２１−０００１、１４）ｓｓｐＡおよびｓｐｉＡ、１５）ＦＧＰ３３２−０００１、１６）ＦＧＰ３３２−０００２、１７）ＦＧＰ３３２−００７、１８）ＦＧＰ３３２−０００８、１８）ＦＧＰ３３２−０００９、１９）ＦＧＰ３３２−００１０、２０）ＦＧＰ３３２−００１１、２１）ＦＧＰ３３２−００１１、２２）ＦＧＰ３３２−００１２、２３）ＦＧＰ３３２−００１３。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
その他のＬ．ｓａｋｅｉ株と比較して一つのＬ．ｓａｋｅｉ株を具体的に特徴付けするために用い得るマーカー遺伝子を同定するために、発明者らは、種に応じて高い多様性を示す可変的遺伝子を含むと考えられるＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋのゲノム内の可変的ゲノムアイランドをまず同定した（実施例１に記載されているステップ）。次に発明者らは、先に同定されたゲノムアイランド由来の遺伝子の存在または不在に従ってＬ．ｓａｋｅｉ株の分類を実施し、そうして得た分類を、その他の複数のタイプ決定技術を用いて得た分類と比較した（実施例２に記載のステップ）。最終的に、発明者らは、多数の可変的遺伝子を用いて得られる分類と比較されるＬ．ｓａｋｅｉ株の信頼性のある分類を得るために使用可能である、ゲノムアイランド由来の最小数の遺伝子の最適な組み合わせを同定した（実施例３に記載のステップ）。
【００２０】
したがって、本発明によると、Ｌ．ｓａｋｅｉ株の特徴付けを可能にするマーカーの組み合わせは、ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも二つのマーカー遺伝子を含む。
【００２１】
本明細書で使用される「マーカー」という用語は、細菌株内の標的遺伝子の存在を同定できるようにし、かつ場合によってその発現を定量化できるようにする、あらゆる生物学的、化学的、または物理的手段を意味する。かかるマーカーは、当業者にとっては周知のものである。有利には、本発明に従ったマーカーは遺伝子マーカーである。
【００２２】
表１は、マーカー遺伝子の上記の遺伝子座タグおよび配列ならびに遺伝子の名称の間の対応を示している。
【００２３】
表１：遺伝子マーカーの遺伝子座タグおよび名称の対応
【表１−１】
【表１−２】
【００２４】
これらの遺伝子の一つまたはいくつかの組み合わせの存在または不在を用いて、特定のＬ．ｓａｋｅｉ株を別の密に関係する株と区別することができる。
【００２５】
実施例３に記載されているように、発明者らは、これらの２９個のマーカー遺伝子がその他のＬ．ｓａｋｅｉ株の中で一つのＬ．ｓａｋｅｉ株を特徴付けるために最適であることを実証した。したがって、好ましい実施形態において、前記組み合わせは、配列番号１〜配列番号２９のマーカー遺伝子で構成される。
【００２６】
より詳細には、図３に例示されているとおり、以上で定義付けした２９個のマーカー遺伝子の存在または不在のパターンと７５個のＬ．ｓａｋｅｉ株との間の以下の対応が得られた。
− 株ＤＳＭ２００１９中には、配列番号２１のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ４９４中には、配列番号２１のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＡＧＲ４６中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１５６中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＡＧＲ５１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ１０４８中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２４、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ２０９２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２４、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１９５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２１、および配列番号２５のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＩＰ１０５４２２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ４２９中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ６７３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１８中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ５２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２６、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ５９中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ９２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＲＬ１４６７中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ３３５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＳＦ８４２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＳＦ７７０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＳＦ７７１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ２８７中には、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ０４１中には、配列番号１、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ４２７中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＹＭＥ３４４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株Ｖ５５３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ３４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株２３Ｋ中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株７２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株５０４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＴＩＳＴＲ９１１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＹＭＷ５４０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株３００中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２３のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２３のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ２０７０中には、配列番号１、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＪＧ３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ１７６４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ６６２６中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＳＦ８４１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＳＦ８４３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ１６３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ５５９０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ０１４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１６０Ｋ中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＡＧＲ４８中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ５５８９中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１１２中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＹＭＨ２４３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株１３４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＹＭＷ５５７中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株Ｌ１１０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ５５８８中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ２０９１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ２０８９中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ２０９０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株７４５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株７１０中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株２０５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＭＦ２０８８中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ４９４中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株３３１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＡＧＲ５３中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株４９５中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株Ｌｂ７０６中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＶ２１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ６７７中には、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株３３２中には、配列番号１、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株３３中には、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株６４中には、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＣＴＣ６４６９中には、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ５７２８中には、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２７のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株２１中には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＴＩＳＴＲ８９０中には、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、および配列番号２８のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＡＴＣＣ１５５２１中には、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、および配列番号２４のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
− 株ＬＴＨ６７５中には、配列番号６、配列番号７、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、および配列番号２３のマーカー遺伝子が存在し、その他のマーカー遺伝子は不在である。
【００２７】
本発明はまた、Ｌ．ｓａｋｅｉ株を特徴付けするための方法であって、前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株中の、ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定することからなるステップを含む方法にも関する。
【００２８】
細菌株内の遺伝子の存在または不在を決定できる数多くの方法が当業者にとって周知である。これらの方法には、一つまたは複数の前記マーカー遺伝子の発現産物によって構成される、抗原に特異的に結合する抗体の使用、一つまたは複数の前記マーカー遺伝子由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはポリペプチド、またはその断片の検出が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、一つまたは複数の前記マーカー遺伝子の存在または不在は、本発明によると、増幅によって、または一つもしくは複数の前記マーカー遺伝子に特異的なＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによって決定される。
【００２９】
より好ましくは、配列番号１〜配列番号２９の前記マーカー遺伝子の全ての存在または不在が決定される。
【００３０】
特定の実施形態において、これらのマーカー遺伝子のプローブの組み合わせは、同じ支持体、好ましくは標準化された支持体上に集められる。これらの支持体は、当業者にとって公知である。そのサイズは、一つまたは複数の前記マーカー遺伝子の存在または不在を検出するために用いられる装置に応じて変動し得る。
【００３１】
有利には、本発明に従ったマーカー遺伝子の組み合わせは、標的遺伝子にハイブリダイズすると考えられる核酸断片が好ましくは標準化された要領で被着している支持体を含む、ＤＮＡマトリクスの形をしている。このような支持体のサイズは、用いられる調製方法および検出方法に応じて変動する。このような小さい支持体は、ＤＮＡアレイとも呼ばれる。
【００３２】
したがって、本発明の別の態様は、以上で定義されたマーカーの組み合わせを含むＤＮＡアレイに関する。
【００３３】
本明細書で使用される「ＤＮＡアレイ」という用語は、高密度で支持体（スライドガラス、ナイロン膜など）に被着された遺伝子、遺伝子断片、オリゴヌクレオチドのセットを意味する。ＤＮＡアレイの調製および使用に関する数多くの科学文献が入手可能である。
【００３４】
本発明の別の態様において、前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株の分類は、上述の一つまたは複数のマーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析すること、および基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株のセットに関してＪａｃｑｕａｒｄ指数またはダイス係数または任意の２値距離行列を計算することによって実施される。Ｊａｃｑｕａｒｄ指数は、ＪａｃｑｕａｒｄおよびＦｅｉｎｇｏｌｄ、１９７４年（Ｊａｃｑｕａｒｄ ａｎｄ Ｆｅｉｎｇｏｌｄ、１９７４ Ｔｈｅｏｒ．Ｐｏｐｕｌ．Ｂｉｏｌ．６：２１−３４）に記載されているように計算することができる。ダイス係数は、Ｖａｎ Ｒｉｊｓｂｅｒｇｅｎ、１９７９年（Ｖａｎ Ｒｉｊｓｂｅｒｇｅｎ、１９７９、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ、Ｌｏｎｄｏｎ： Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）が記載したように計算することができる。
【００３５】
本明細書で使用される「分類」という用語は、株をその遺伝子パターンに従って複数の異なるサブファミリーにまとめることを意味する。特に、同じ遺伝子パターンを示す株は同じサブファミリーに属する。
【００３６】
本明細書で使用される「基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株」という用語は、一つまたは複数の前記マーカー遺伝子の存在または不在が本発明に従ってすでに決定されており、分類すべき前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株を比較する対象である、Ｌ．ｓａｋｅｉ株のセットまたはコレクションを意味する。すなわち、前記基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株は、分類すべき前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株をその中に位置付けることが意図されたＬ．ｓａｋｅｉ株のサブファミリーまたはクラスタを構成するために使用されたものである。
【００３７】
好ましくは、本発明に従った基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株のセットは、表２に開示される株を含む。とは言え、その他の公知のＬ．ｓａｋｅｉ株を基準株として使用することもでき、それらは当業者にとって周知である。
【００３８】
好ましくは、前記基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株により構成されたＬ．ｓａｋｅｉ株の前記サブファミリーは、実施例３で定義されているとおりである。しかしながら、当業者であれば、クラスタ化が新しい株の同定に従って進化し得るものであることが分かっている。したがって、本明細書中に具体的に記述されていないクラスタにＬ．ｓａｋｅｉ株を分類するための、本発明に従った方法の使用は、本発明の範囲内である。
【００３９】
本明細書で使用される「Ｊａｃｑｕａｒｄ指数」という用語は、試料セットの類似性および多様性を比較するために用いられる統計値である。Ｊａｃｑｕａｒｄ指数は、Ｊ（Ａ，Ｂ）＝｜Ａ∩Ｂ｜／｜Ａ∪Ｂ｜という公式に従って共通集合のサイズを試料セットの和集合のサイズで除したものとして定義される。
【００４０】
好ましくは、本発明に従ったＪａｃｑｕａｒｄ指数の計算は、基準Ｌ．ｓａｋｅｉ株の異なるサブファミリー中の前記Ｌ．ｓａｋｅｉ株の場所を表示するクラスタリングツリーを最終的に提供するソフトウェアＲ（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２００６ Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ．Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を介して実施される。
【００４１】
本明細書で使用される「ダイス係数」という用語は、Ｊａｃｑｕａｒｄ指数に関連する類似性の尺度である。ダイス係数は、Ｊａｃｑｕａｒｄ指数と類似であるが、ｓ＝２｜Ａ∩Ｂ｜／（｜Ａ｜＋｜Ｂ｜）という公式に従って、一致に二倍の重みを付与するものである。
【００４２】
本発明の別の態様は、少なくとも二つのＬ．ｓａｋｅｉ株を比較する方法であって、
ａ） 第一のＬ．ｓａｋｅｉ株中のＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定すること、および
ｂ） 以上で定義されたように、第二のＬ．ｓａｋｅｉ株中の前記少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在を決定すること、
からなるステップを含み、前記少なくとも一つのマーカー遺伝子の存在または不在のパターンが前記第一および第二のＬ．ｓａｋｅｉ株の間で異なっている場合にはこれらのＬ．ｓａｋｅｉ株は異なっているとされる方法に関する。
【００４３】
好ましくは、少なくとも二つのＬ．ｓａｋｅｉ株を比較する上述の方法において、前記配列番号１〜配列番号２９のマーカー遺伝子の全ての存在または不在が決定される。
【００４４】
特に、少なくとも二つのＬ．ｓａｋｅｉ株を比較する上述の方法は、以上で定義されたＪａｃｑｕａｒｄ指数、ダイス係数、または任意の２値距離行列を計算することにより前記マーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析するステップをさらに含む。
【００４５】
本発明に従った以上で定義された方法は、肉および／または魚に対する生物防腐剤として使用できる株カクテル内でＬ．ｓａｋｅｉ株を同定するために特に有利である。このような株カクテルを特徴付けする別の論点は、前記カクテル内に存在する各々の株の定量化にある。
【００４６】
したがって本発明の別の態様は、試料中の特定のＬ．ｓａｋｅｉ株を定量化する方法であって、
ａ）以上で定義されている方法により前記試料中に存在するＬ．ｓａｋｅｉ株を同定および／または特徴付けること、
ｂ）前記試料中に存在するその他の株に関して前記特定のＬ．ｓａｋｅｉ株内に差次的に存在する、一つまたは複数のマーカー遺伝子を決定すること、ならびに
ｃ）定量ＰＣＲにより一つまたは複数の前記遺伝子を増幅すること、
からなるステップを含む方法に関する。
【００４７】
定量ＰＣＲ法は、当技術分野において周知であり、リアルタイムＰＣＲ、競合ＰＣＲ、および放射性ＰＣＲを含む。
【００４８】
本明細書で使用される「試料」という用語は、一つまたは複数のＬ．ｓａｋｅｉ株が場合によっては他の細菌種と組み合わされた状態で中に存在する試料を包含する。
【００４９】
したがって、試料中の特定のＬ．ｓａｋｅｉ株を定量化する上述の方法には、試料中に存在する他の株から前記株を区別する先行ステップが含まれ得る。
【００５０】
以下の実施例は、本発明者らが前記マーカー遺伝子を同定した方法をさらに説明するものである。これらの実施例は、以上で定義した方法を例示するものであるが、限定するものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ２３Ｋ染色体におけるゲノムアイランドの検出および分析
この実施例は、本発明においてマーカーとして使用される遺伝子を有するＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ染色体におけるゲノムアイランドの、本発明者らによる同定について記載する。
【００５２】
細菌染色体は、株間での維持を示すのに充分長い間にわたり種内に存続している遺伝子を含むコア遺伝子プールと、一般的にはアイランドにクラスタ化され遺伝子水平移動（ＨＧＴ）により獲得されることの多い、可変的かつ補助的な遺伝子を含む、柔軟な遺伝子プールという、二つの遺伝子セットに分けられることが認められている。
【００５３】
したがって、本研究の目的は、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋのゲノム内の推定上の可変的ゲノムアイランドを同定し、ＨＧＴに原因があると考えられる、生態学的に重要であると推定される細胞機能を特徴付けすることにある。
【００５４】
実験手順
コドン使用頻度の分析
発現度の高い遺伝子のコドン使用頻度の痕跡を、ＳｈａｒｐおよびＷｅｎｇ−Ｈｓｉｕｎｇ（Ｓｈａｒｐ ａｎｄ Ｗｅｎｇ−Ｈｓｉｕｎｇ １９８７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：１２８１−１２９５）により紹介されたＣＡＩを使用して調べた。ＣＡＩの計算のために基準として用いたコドン頻度は、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋゲノム内で見られるリボソームタンパク質およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子に基づいて推定した。第二に、コード配列（ＣＤＳ）の非監視のクラスタ化を、本発明者らによって設計されたアルゴリズムを用いて、それらの同義語コドンの使用頻度に基づいて実施した。このアプローチは、異なる遺伝子クラスにおける同義語コドンの選択を説明する混合モデルの使用に基づくものである。簡単に言うと、ユーザーによって遺伝子クラスの数が定義づけされると、モデルは、反復アルゴリズムを用いて配列に適合され、最終的なクラスタ化によって、各ＣＤＳが、その最も確率の高いクラスに関連付けされる。
【００５５】
以下では、混合モデルおよびクラスタ化手順をより形式的に記載する。すなわち、混合モデルのコドン使用頻度のクラス、または構成要素の数をｎで表す。各クラスｕは、混合物中のその発生率ｑｕとセット確率（ｆｕ，ｉ，ｊ）（１≦ｉ≦２０、１≦ｊ≦ｓｉ）により特徴付けされ、ここでｆｕ，ｉ，ｊは、アミノ酸ｉについてのｊ番目の同義語コドンを使用する確率に対応し、ｓｉはアミノ酸ｉについての同義語コドンの数を表す。モデルパラメータｑｕおよびｆｕ，ｉ，ｊの最大尤度推定値は、期待値最大化アルゴリズムを用いて得られる。最後に、最終的なクラスタ化は、ベイズ式を用いて各々のＣＤＳｋについて各クラスｕの確率を計算した後に得られる。すなわち、ｐｋ（ｕ）は、ｑｕΠｆｕ，ｉ，ｊｃ（ｋ，ｉ，ｊ）（式中、ｐｋ（ｕ）はＣＤＳｋがクラスｕに属する確率を表し、ｃ（ｋ，ｉ，ｊ）はＣＤＳｋにおけるアミノ酸ｉについてのｊ番目の同義語コドンの出現を計数する）に正比例する。混合モデルの枠組みの具体的な提示は、ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＰｅｅｌ（ＭｃＬａｃｈｌａｎ ａｎｄ Ｐｅｅｌ ２０００ Ｉｎ Ｆｉｎｉｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）において見ることができる。最後に、Ｍｅｄｉｇｕｅら、１９９１年（Ｍｅｄｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．、１９９１ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：８５１−８５６）において記載されているものと類似の要領でＣＤＳの集団のグラフ表示を可能にするよう、対応分析を実施した。短いＣＤＳ（３００ｂｐから１００アミノ酸長未満）および二つのシステインコドンは、関連する相対的コドン頻度の正確な推定を可能にしないことから、対応分析から削除した。さらに、全ての計数に疑似計数１を加えることによって、コドン頻度の推定値を平滑化した。
【００５６】
全ての分析は、Ａ＋Ｔ含有量およびＣＡＩを計算するため、また上述の新たなクラスタ分析を実施するＣ＋＋プログラムとＭＵＬＴＩＶパッケージのＣＡ機能を用いて対応分析を実施するＲスクリプトとの両方を呼び出すために機能する、ＣＯＤＯＮＵＳＡＧＥ．ＰＬという名称のアドホックＰｅｒｌスクリプトで実施した（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２００６ Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｖｉｅｎｎｅ、Ａｕｓｔｒｉａ：Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）。全てのプログラムは、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｏｕｙ．ｉｎｒａ．ｆｒ／〜ｐｎｉｃｏｌａｓ／ｃｏｄｏｎｍｉｘｔｕｒｅ／にてダウンロードすることができる。
【００５７】
結果
Ｌ．ｓａｋｅｉのコドン使用頻度は、染色体の複製および翻訳の効率によって決定される。
考えられるＨＧＴ事象を検出する目的で、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ遺伝子プールの組成傾向を特徴付けするために、Ｇ＋Ｃ含量分析、コドン適合指数（ＣＡＩ）の計算、同義語コドン使用頻度の対応分析、および上述の同義語コドンの使用頻度の混合モデリングに基づく新たな方法を用いた遺伝子プールの非監視のクラスタ化を含む、統計学的測定値のアレイを用いた。
【００５８】
完全な遺伝子プールの非監視のクラスタ化により、四つの遺伝子群の同定が可能となった。第一および第二の群の遺伝子は、遺伝子プール全体の７４．５％を占める。これらの遺伝子は極めて選択的に染色体複製のリーディング鎖上に位置し（９３％）、ＣＡＩで測定されるその発現レベルによって区別される（タンパク質の発現レベルを反映する）。すなわち、群１の遺伝子は低いまたは平均的なＣＡＩ値を有し、一方、群２の遺伝子は高いＣＡＩ値を示す。この第２の群は、典型的な発現度の高い遺伝子、例えばＳ層様タンパク質、Ｃｐｌ様シャペロン、および発現度の高い代謝的に重要な酵素、例えば解糖経路の酵素を含む。群３は、遺伝子プール全体の１８．５％を包含し、ラギング鎖上に位置する遺伝子を主に含む（８７％）。
【００５９】
したがって、染色体の複製に対するその配向およびその推定翻訳効率レベルによってそのコドンの使用頻度が強く決定される三つの遺伝子群を明らかにすることができた。
【００６０】
より重要なことに、このモデルにより、非定型のＡ＋Ｔに富んだ含有量および低いＣＡＩ値を有する第四の遺伝子群（遺伝子プール全体の７％）の区別が可能となった。この第四群の組成パターンは、低いＧ＋Ｃ含有量を有する遺伝子が多くの細菌内でＨＧＴと関連することが記載されているため（Ｍｅｄｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．、１９９１ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：８５１−８５６）、ＨＧＴによって決定されている可能性がある。
【００６１】
非定型のＡ＋Ｔに富んだＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ遺伝子は、ゲノムアイランド内にクラスタ化される。
この第四の遺伝子群のＨＧＴ関連の由来源を確認するため、染色体におけるそれらの対応する遺伝学的状況をさらに、より詳細に考察した。現在のところ、これらの非定型のＣＤＳの大部分が集合して、機能的に関連性のある遺伝子の大きなアイランドを形成することが第一に指摘され、前記アイランドは多くの場合に可動要素の近くに位置し、これは、水平移動される遺伝的クラスタの古典的な特徴である（Ｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．、２０００ Ｎａｔｕｒｅ ４０５：２９９−３０４）。
【００６２】
さらに、非定型のコドン使用頻度を有する遺伝子は、多くの場合、系統発生的に遠い細菌属においてのみ見られるタンパク質に相同なコード産物であった。
【００６３】
これらのデータから、本発明者らは、推定ＨＧＴ遺伝子プールがこのようにして、２７個のゲノムアイランド（７．３ｋｂの平均サイズで１．６から２８ｋｂ）および４９個の単一遺伝子で構成され、全体で２３５ｋｂ（１２．５％）のＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ染色体をカバーするものであったことを実証した。また、２７個のゲノムアイランドが、重要でないＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋのゲノムに関係する可能性があることが推測された。
【００６４】
実施例２：肉媒介性の乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉの種内のゲノム多様性および天然の個体群構造
この実施例は、本発明者らによる、マーカー遺伝子を用いたＬ．ｓａｋｅｉ株の分類について記載する。
【００６５】
本研究において、本発明者らは、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）ゲノムマッピング、株の階層クラスタ化のための、本発明者らにより同定された（実施例１参照）可変的遺伝子プールから得た遺伝子マーカーのＰＣＲに基づいた検出、そして最後に、それらのそれぞれの表現型多様性を評価するためのプロテオーム比較を含む、複数のタイプ決定技術の組み合わせを実施した。さまざまな地理的場所および肉または魚関連製品の様々な供給源に対応する、さまざまな研究所コレクションからの単離株が、これらの培養化されていない株が天然のＬ．ｓａｋｅｉ個体群の多様性を代表するという期待に基づいて、特定的に選択された。
【００６６】
これらの結果は、Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株の分子サブタイプのレパートリーを分類するための、ゲノムに基づいた統合的な枠組みを提供する。
【００６７】
実験手順
細菌株および培養条件
この研究において使用される全てのＬ．ｓａｋｅｉおよびＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ株は表２に記載されている。細菌株をＭＲＳ肉汁培地（Ｄｉｆｃｏ）内において３０℃で中期の対数増殖期まで成長させた（Ｄｅ ｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９６０ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２３：１３３−１３５）。プロテオーム研究のために、細菌株を、０．５％グルコースを補った化学合成培地ＣＤＭ（Ｌａｕｒｅｔ ｅｔ ａｌ．、１９９６ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１９２２−１９２７）内において３０℃で成長させた。
【００６８】
分子生物学的技術
Ｌ．ｓａｋｅｉ ３３２Ｆのサブトラクティブ抑制ハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を以下のように実施した。すなわち、その内因性プラスミドｐＲＶ５００（Ａｌｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、２００３ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：５５７４−５５８４）から保存処理したテスター株３３２Ｆを調製するために、エリスロマイシン耐性を有し、ｐＲＶ５００レプリコンから誘導したｐＲＶ５６６プラスミド（Ａｌｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、２００３ Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：５５７４−５５８４）を用いて、Ｂｅｒｔｈｉｅｒらの方法（Ｂｅｒｔｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９６ Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：３０３７−３０４１）により、親Ｌ．ｓａｋｅｉ ３３２をエレクトロポレーションした。
【００６９】
さらに、抗生物質を含まないＭＲＳブロスにおいて３０℃で、一つのエリスロマイシン耐性クローンを２００世代にわたり培養した。最終培養物から得た複数の希釈物をＭＲＳ寒天上に置いた。エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含むかまたは含まないＭＲＳ寒天上に２００個のクローンをレプリカ平板固定することによって、一つのエリスロマイシン感受性クローンを選択することができた。ｒｅｐＡ遺伝子に特異的なプローブを用いて、サザンブロッティング法（ＥＣＬ（商標）ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、ｐＲ５６６プラスミドの喪失を確認した。対応する株を３３２Ｆと名付けた。
【００７０】
メーカーの推奨事項に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ ＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ（商標）細菌ゲノムサブトラクションキットを用いて、かつドライバーとしてＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋを用いて、ＳＳＨ実験を実施した。この技術により、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋには不在である８個の新たな遺伝子が同定された。Ｌ．ｓａｋｅｉ ２１由来のＦＧＰ２１−０００１遺伝子を、ＰＣＲ産物（ＬＳＡ０５６５からＬＳＡ５６６）の配列決定後に同定し、その結果、予想外のサイズが得られ、新型のバクテリオシン免疫様のタンパク質をコードする遺伝子が明らかになった。
【００７１】
表２：本研究において用いられるＬ．ｓａｋｅｉおよびＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ株
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【００７２】
ＰＣＲに基づいた遺伝子の検出
本発明者らが同定した柔軟な遺伝子プールの存在または不在を、以下の、株のクラスタ化のためのゲノムアイランドの従来のＰＣＲに基づいた検出および検証を用いて調査した。
ＰＣＲ鋳型は７３個のＬ．ｓａｋｅｉ株および２個のＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ株から抽出した１００ｎｇの染色体ＤＮＡであった。実験を二回行い、否定的な結果を確認した。増幅が微弱であるかまたは擬似である場合、ＰＣＲ産物を配列決定して、株間のヌクレオチド多型を検査した。必要な場合には、プライマーを設計し直した。
【００７３】
Ｌ．ｓａｋｅｉおよびＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ由来の染色体ＤＮＡの抽出をＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＭｃＫａｙの方法（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ ＭｃＫａｙ，１９８３ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：５４９−５５２）により実施した。各々のＰＣＲ増幅のために、プライマー対を、産物の予想された長さが２ｋｂ未満となるように設計した。
【００７４】
ＰＣＲサイクリング条件は、９４℃で４分間と、それに続く、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で３分間の３０サイクルであった。全てのＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルを用いて検査し、エチジウムブロマイドで染色した。一部の遺伝子の切断または予想外のサイズの産物を確認するために、１０μｌの単位複製配列を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＣｌ２緩衝液中の０．１単位のエビアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および１ＵのエキソヌクレアーゼＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｂｉｏｌａｂｓ）で、３７℃で１時間にわたり処理し、それに続いて、９４℃で１０分間不活性化した。その後、生成物を、標準的な技術を用いて配列決定した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅ−ｍｗｇ．ｃｏｍ）。
【００７５】
ＰＦＧＥ実験およびＩ−ＣｅｕＩパターン分析
Ｄｕｄｅｚら、２００２年（Ｄｕｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４８：４２１−３１）により記載されているように、パルスフィールドゲル電気泳動法およびＩ−ＣｅｕＩ消化パターン分析を実施した。平均４個のゲルを各株について実施した。そのゲノムサイズにしたがった株の分布を、Ｒ統計パッケージのＨＩＳＴ関数および確率密度関数を用いて検査した（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２００６ Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ：Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）。分析のために、ガウス確率分布および３０（ゲノムサイズ推定の平均標準偏差）という平滑化帯域幅を選択した。
【００７６】
株のクラスタ化
試験した株の遺伝子含有量は、遺伝子の不在の場合は０、そして存在の場合は１という、２文字のマトリクス（遺伝子×単離株）を使用することにより記述された。ＩＳエレメントにより切断された遺伝子は、それらの野生型対応物とは異なる遺伝子同一性とみなした。株間の類似性を、Ｊａｃｑｕａｒｄの相関係数を用いて決定した（Ｊａｃｑｕａｒｄ ａｎｄ Ｆｅｉｎｇｏｌｄ、１９７４ Ｔｈｅｏｒ Ｐｏｐｕｌ Ｂｉｏｌ．６：２１−３４）。非監視の階層クラスタ化を、類似性マトリクス上の完全な連結を用いて実施した。クラスタ化のデンドログラムを作成するために、Ｒ統計パッケージ（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２００６ Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ：Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）のＤＩＳＴ、ＨＣＬＵＳＴ、およびＤＥＮＤＲＯＧＲＡＭという関数を使用した。各ノードの統計的安定性を評価する目的でのマルチスケール・ブートストラップ・リサンプリングのために、ＲパッケージのＰＶＣＬＵＳＴ（ＳＵＺＵＫＩ ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｄｅｉｒａ、２００６ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２２：１５４０−１５４２）を使用した。ブートストラップ複製の数は１０００であった。考えられる株クラスタを区別するために、９０％以上の近似的に不偏なＰ値および５０％以上のＪａｃｑｕａｒｄ類似性係数を使用した。
【００７７】
２Ｄゲル電気泳動およびペプチドマスフィンガープリンティングによるタンパク質の同定
標準的な方法により、細菌抽出物の調製および電気泳動を実施した（Ｊｏｆｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５８：５１２−５２０）。Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってゲルを分析した。Ｍａｒｃｅａｕら（Ｍａｒｃｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：７２６０−７２６８）により記載されているように、クマシー染色したゲルからスポットを切除し、Ｇｕｉｌｌｏｔら（Ｇｕｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００ ｌｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５５：４７−５１）によって以前に記載されたように、質量分析を実施した。ローカルサーバー上にインストールしたＭＳ−Ｆｉｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ）およびＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｓｅａｒｃｈ＿ｆｏｒｍ＿ｓｅｌｅｃｔ．ｈｔｍｌ）を用いて、ペプチドマスフィンガープリントからのタンパク質を同定した。全てのサーチを、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｇａｌｅ．ｊｏｕｙ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｓａｋｅｉ）に対して実施した。
【００７８】
結果
Ｌ．ｓａｋｅｉ株の選択
天然のＬ．ｓａｋｅｉ個体群の生物学的多様性を入念に推定するため、発明者らは、さまざまな肉もしくは魚関連食品（生もしくは発酵）またはザウアークラウトおよびヒトの便を含むその他の供給源から単離した株を注意深く分析した。さらに、使用した単離手順または分析した食品原料のタイプが原因で、単一の研究所の細菌コレクション中にサンプリングバイアスが存在する可能性があるため、Ｌ．ｓａｋｅｉ株は、欧州、アジア、およびニュージーランド内に地理的に散在する、１４個の異なる研究所のコレクションから選択した。合計７３個のＬ．ｓａｋｅｉ株を、外部種基準（外集団基準）と考えられるＬ．ｓａｋｅｉ種に近い類縁である二つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ株と同様に選択し、分析した（表２）。
【００７９】
柔軟な遺伝子プールのＰＣＲベースの検出による主要なＬ．ｓａｋｅｉ分子サブタイプの同定
Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ染色体のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析について記載する実施例１において、発明者らは、２７個のゲノムアイランドおよび４９個の独立した遺伝子を含むその推定柔軟遺伝子プールを同定した。発明者らは、Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株のクラスタ化分析のために、従来のＰＣＲを使用することにより、この遺伝子プールの存在または不在（株間で可変的であると仮定されている）を検査することを決定した。
【００８０】
この戦略を、これらの遺伝子の種内変動を実証するために、２０株のセットに対する予備的ＰＣＲ実験で最初に試験した。５つのアイランドだけが良く保存されていることが明らかとなり、したがって分析からこれらを除外した。横方向移動の可能性が高い可動エレメント（挿入配列、ファージ、および制限／修飾系）に起因したクラスタ化の妨害を回避するために、これらの遺伝子も分析から外した。さらに、発明者らは、各ゲノムアイランド内部の大部分の遺伝子が類似の変動パターンを通常は示している（アイランド全体が通常は存在するかまたは不在である）ことを示した。したがって、大きなゲノムクラスタ（より小さなゲノムクラスタに比べてより多くの遺伝子を含むもの）からの偏向を避けるため、最大４個の遺伝子（異なる変動パターンを最終的に示すもの）を各クラスタについて選択した。
【００８１】
さらに、Ｌ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ染色体には不在であったその他のＬ．ｓａｋｅｉ株から得られる染色体にコードされた１１個の遺伝子を分析に組み込んだ。これらの遺伝子は、以前に公表されたクラスタから一部選択し、その他のＬ．ｓａｋｅｉ株の部分的なゲノム配列決定から一部得た。したがって、この選抜の結果として、約８０％の遺伝子がＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ（２１個のゲノムアイランドおよび４個の独立した遺伝子を表す）に由来し、約２０％の遺伝子がその他の株に由来した。これらの６０個の遺伝子の特徴は、表３および表４にまとめられている。
【００８２】
６０個の遺伝子のＰＣＲ分析に基づいて、発明者らは、非監視完全連結階層クラスタ化アルゴリズムを使用することおよびマルチスケール・ブートストラップ・リサンプリングを介してＰ値を推定してクラスタ化分析の不確実性を評価することによる、Ｌ．ｓａｋｅｉ天然単離株の分類を試みた（図１）。得られたデンドログラムから、発明者らは、三つの主要な群に分割される少なくとも１１個のブートストラップ支持型の株クラスタを明確に同定した。
【００８３】
クラスタＡは基準株２３Ｋを含み、クラスタＢからＤは、共に群１を形成している、このクラスタＡに密に関係する株を含む。その他の群は、群１との関係性が階層的に低く、Ｌ．サケイ亜種ｃａｒｎｏｓｕｓ型株ＣＩＰ １０５４２２Ｔ（クラスタＧ、群２）およびＬ．ｓａｋｅｉ亜種ｓａｋｅｉ型株ＡＴＣＣ １５５２１Ｔ（クラスタＫ、群３）を含む株クラスタであり、後者は、群１との関係が最も遠い。群３からの三つの株（３３２、２１、およびＬＴＨ２０７０）は、クラスタＨとクラスタＩの間で確実にクラスタ化することができなかった。
【００８４】
Ｌ．ｓａｋｅｉの遺伝子型クラスタ間の染色体サイズおよび幾何形状の変動
発明者らは次に、Ｉ−ＣｅｕＩで消化された断片のＰＦＧＥ分析による、Ｌ．ｓａｋｅｉ単離株間のゲノムサイズ変動の程度を調査した。Ｌ．ｓａｋｅｉ染色体のＩ−ＣｅｕＩマッピングは、結果として、さまざまなサイズの七つのＤＮＡ断片をもたらし（Ｄｕｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４８：４２１−３１）、Ｌ．ｓａｋｅｉ株間で全体的なゲノムサイズおよび幾何形状を決定する上での効率の良い手段である。
【００８５】
この分析により、Ｌ．ｓａｋｅｉ株間のゲノムサイズの大きな差異が明らかとなった。平均染色体サイズは、種では２０２０±３０ｋｂであるが、サイズ範囲は、１８１４±３０ｋｂ（株ＣＴＣ４２７）から２３０９±７９ｋｂ（株ＬＴＨ６７７）までにわたっており、したがってこれは約２５％のゲノム変動（約５００ｋｂ）を表している。さらに特筆すべきは、Ｌ．ｓａｋｅｉ株の染色体サイズがこの範囲に沿って均質に分布しておらず（図２Ａ）、ゲノムサイズデータのガウス確率分布が、株が亜個体群へ分割される可能性を示唆していたという観察結果である。
【００８６】
ＰＧＦＥ亜個体群をさまざまな遺伝子型クラスタ内での株の分布により説明できるか否かを評価するために、発明者らは、１１個のクラスタにわたるゲノムサイズ分布を分析した（図２Ｂ）。発明者らは、ゲノムサイズが株クラスタ間で比較的均一であることを実証した。発明者らは同様に、群１（クラスタＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）由来のＬ．ｓａｋｅｉ単離株が小さなゲノム（平均サイズ１９１５ｋｂ±７９ｋｂ）を通常は含み、一方、群２（クラスタＥ、Ｆ、およびＧ）ならびに群３（クラスタＨ、Ｉ、Ｊ、およびＫ）がより大きなゲノム（それぞれ平均サイズ２０５５ｋｂ±８０ｋｂおよび２０８０ｋｂ±８０ｋｂ）を有する単離株の大部分を含むことも示した。
【００８７】
遺伝子型クラスタとＰＧＦＥ亜個体群との間で見られたこの優れた一致に促されて、発明者らは、染色体全体のゲノムサイズと７３個のＬ．ｓａｋｅｉ単離株内のＩ−ＣｅｕＩで消化された各断片のゲノムサイズとの間の相関関係を分析するに至った。これら二つのパラメータは最小のＬ．ｓａｋｅｉゲノムから最大のＬ．ｓａｋｅｉゲノムまでの比例的な増加を示していたため、優れた相関関係が観察された。
【００８８】
表３：クラスタ化分析のために用いられるＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ株の柔軟な遺伝子プール由来の遺伝子の説明
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【００８９】
表４：クラスタ化分析のために用いられる２３Ｋ以外の株に由来する遺伝子の説明
【表４】
【００９０】
異なるクラスタに由来するＬ．ｓａｋｅｉ単離株間の包括的なプロテオーム可変性
発明者らは次に、二次元電気泳動を用いて、クラスタ化の最終的な確認として、さまざまな遺伝子型クラスタＡ〜Ｋから選択された１２個の選抜株のプロテオームを比較した。４〜７のＰｉ範囲内で平均約４００個のスポットが一般に観察されたが、発明者らは、株間で検出されたこのスポット数の２０％超の著しい変動を認識した。
【００９１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用することにより、主要な差異を表すスポットを同定した。大部分の差異は、中程度もしくは低度に発現するタンパク質またはこの基準ゲノムからのタンパク質データベース中では同定できなかったことからＬ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ内に存在しない遺伝子によりコードされると考えられるタンパク質の株特異的なスポットであることが明らかになった。２Ｄタンパク質パターンにおける幾分かの変動も同様に、高度に発現されるタンパク質の一部の株特異的なアイソフォームの泳動差の結果であることが発見された。Ｌ．ｓａｋｅｉの亜種を定義するためにその他の研究において用いられた技術であるＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質プロフィールの分析が主として高度に発現されるタンパク質の検出に基づいていることから、この情報は特に興味深いものであった。これらのデータは、図１に示されている階層クラスタ化をさらに確認するものであった。
【００９２】
結論として、発明者らは、Ｌ．ｓａｋｅｉ種において考えられる分子サブタイプ数についての初めての洞察を提供した。以上の結果から、この天然個体群を三つの主要な株群として観察することができ、その各々は３から４個のクラスタにさらに分けられる。群１の単離株間のゲノムサイズ（平均１９１５ｋｂ）と群２および群３の単離株間のゲノムサイズ（両方について平均約２０７５ｋｂ）との間には、実質的な差が存在する。
【００９３】
発明者らは、Ｌ．ｓａｋｅｉ種の種間のゲノム変動の程度を評価し、初めて、天然単離株の包括的な分類を生成した。
【００９４】
実施例３
この実施例において、発明者らは、株の階層クラスタ化のために、可変遺伝子のプールから得られた２９個の遺伝子マーカーのＰＣＲベースの検出を実施した。
【００９５】
この研究で使用したＬ．ｓａｋｅｉおよびＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ株の全ては、表２に記載されている。
【００９６】
試験した株の遺伝子含有量は、遺伝子の不在を０、存在を１とした、２文字のマトリクス（遺伝子×単離株）を使用することにより記述された。株間の類似性を、以上で定義されたようにＪａｃｑｕａｒｄ相関係数（またはＪａｃｑｕａｒｄ指数）を用いて決定した。
【００９７】
発明者らは、実施例２に記載したものと類似したスクリーニングを実施し、その結果、表１にまとめた２９個のマーカー遺伝子のみを選抜した。
【００９８】
これらのわずか２９個の遺伝子のＰＣＲ分析に基づいて、発明者らは、非監視完全連結階層クラスタ化アルゴリズムを使用すること、およびマルチスケール・ブートストラップ・リサンプリングを介してＰ値を推定してクラスタ化分析の不確実性を評価することによって、Ｌ．ｓａｋｅｉの天然単離株を分類した。得られたデンドログラムから、Ａ〜Ｋと呼ばれる１１個のブートストラップ支持型の株クラスタを明らかに同定した（図３）。これらの株クラスタは、約６０個のマーカー遺伝子を用いて得られた、実施例２に記載したものときわめて類似している。
【００９９】
したがって、本発明者らは、Ｌ．ｓａｋｅｉの天然単離株を正しく分類するために充分な２９個の遺伝子を同定することができた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１００】
【非特許文献１】Ｖｅｒｍｅｉｒｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９６：１４９−１６４
【非特許文献２】Ｂｅｒｔｈｉｅｒ ａｎｄ Ｅｈｒｌｉｃｈ １９９９ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４９：９９７−１００７
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を特徴付けするための方法であって、前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株内のマーカー遺伝子ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）の存在または不在を決定することからなるステップを含む方法。
【請求項２】
前記マーカー遺伝子の存在または不在が増幅により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マーカー遺伝子の存在または不在が前記マーカー遺伝子に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株の分類が、前記マーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析すること、および基準Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株のセットに関してＪａｃｑｕａｒｄ指数またはダイス係数または任意の２値距離行列を計算することによって実施される、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
試料中の特定のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を定量化する方法であって、
ａ）請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法により前記試料中に存在するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を同定および／または特徴付けすること、
ｂ）前記試料中に存在するその他の株に関して前記特定のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株内に差次的に存在する一つまたは複数のマーカー遺伝子を決定すること、ならびに
ｃ）定量ＰＣＲにより一つまたは複数の前記遺伝子を増幅すること、
からなるステップを含む方法。
【請求項６】
試料中に存在するその他の株から前記株を区別する先行ステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
マーカー遺伝子ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）を含む、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株の特徴付けを可能にするマーカーの組み合わせ。
【請求項８】
請求項７に記載のマーカーの組み合わせを含むＤＮＡアレイ。
【請求項９】
少なくとも二つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を比較する方法であって、
ａ）第一のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株中のマーカー遺伝子ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）の存在または不在を決定すること、および
ｂ）第二のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株中の前記マーカー遺伝子の存在または不在を決定すること、
からなるステップを含み、前記マーカー遺伝子の存在または不在のパターンが前記第一および第二のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株間で異なっている場合にはこれらのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株は異なっているとされる方法。
【請求項１０】
Ｊａｃｑｕａｒｄ指数またはダイス係数または任意の２値距離を計算することにより前記マーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を特徴付けするための方法であって、前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株内のマーカー遺伝子ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）の存在または不在を決定することからなるステップを含む方法。
【請求項２】
前記マーカー遺伝子の存在または不在が増幅により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マーカー遺伝子の存在または不在が前記マーカー遺伝子に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株の分類が、前記マーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析すること、および基準Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株のセットに関してＪａｃｑｕａｒｄ指数またはダイス係数または任意の２値距離行列を計算することによって実施される、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
試料中の特定のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を定量化する方法であって、
ａ）請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法により前記試料中に存在するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を同定および／または特徴付けすること、
ｂ）前記試料中に存在するその他の株に関して前記特定のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株内に差次的に存在する一つまたは複数のマーカー遺伝子を決定すること、ならびに
ｃ）定量ＰＣＲにより一つまたは複数の前記遺伝子を増幅すること、
からなるステップを含む方法。
【請求項６】
試料中に存在するその他の株から前記株を区別する先行ステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
マーカー遺伝子ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）、およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）を含む、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株の特徴付けを可能にするマーカーの組み合わせ。
【請求項８】
請求項７に記載のマーカーの組み合わせを含むＤＮＡアレイ。
【請求項９】
少なくとも二つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株を比較する方法であって、
ａ）第一のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株中のマーカー遺伝子ＬＳＡ１６４１（配列番号１）、ＬＳＡ１１８２（配列番号２）、ＬＳＡ１１８３＿ｃ（配列番号３）、ＬＳＡ０１７２（配列番号４）、ＬＳＡ１７３１（配列番号５）、ＬＳＡ０２１１（配列番号６）、ＬＳＡ０２１２（配列番号７）、ＬＳＡ１５７９（配列番号８）、ＬＳＡ１５８０（配列番号９）、ＬＳＡ０１１８（配列番号１０）、ＬＳＡ０５２９（配列番号１１）、ＬＳＡ０４３９（配列番号１２）、ＬＳＡ０５７２（配列番号１３）、ＬＳＡ０２１９ｂ（配列番号１４）、ＬＳＡ０５６４＿ａ（配列番号１５）、ＬＳＡ０５６４＿ｂ（配列番号１６）、ＬＳＡ０５６４＿ｃ（配列番号１７）、ＦＧＰ２１−０００１（配列番号１８）、ｓｓｐＡ（配列番号１９）、ｓｐｉＡ（配列番号２０）、ＦＧＰ３３２−０００１（配列番号２１）、ＦＧＰ３３２−０００２（配列番号２２）、ＦＧＰ３３２−０００７（配列番号２３）、ＦＧＰ３３２−０００８（配列番号２４）、ＦＧＰ３３２−０００９（配列番号２５）、ＦＧＰ３３２−００１０（配列番号２６）、ＦＧＰ３３２−００１１（配列番号２７）、ＦＧＰ３３２−００１２（配列番号２８）およびＦＧＰ３３２−００１３（配列番号２９）の存在または不在を決定すること、および
ｂ）第二のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株中の前記マーカー遺伝子の存在または不在を決定すること、
からなるステップを含み、前記マーカー遺伝子の存在または不在のパターンが前記第一および第二のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株間で異なっている場合にはこれらのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ株は異なっているとされる方法。
【請求項１０】
Ｊａｃｑｕａｒｄ指数またはダイス係数または任意の２値距離を計算することにより前記マーカー遺伝子の存在または不在のパターンを分析するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５２４１５８（Ｐ２０１１−５２４１５８Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４８０８３（Ｐ２０１０−５４８０８３）
【出願日】平成２１年２月２０日（２００９．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２０７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０６４９１
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【出願人】（５０７３５６３０５）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミック （インラ） (3)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＡＧＲＯＮＯＭＩＱＵＥ （ＩＮＲＡ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２０日（２００９．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２０７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０６４９１
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【出願人】（５０７３５６３０５）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミック （インラ） (3)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＡＧＲＯＮＯＭＩＱＵＥ （ＩＮＲＡ）
【Ｆターム（参考）】
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