Ｏ−アセチル化糖アミノ酸
【課題】 糖ペプチドライブラリーの構築のための出発物質として有用な化合物を提供する。
【解決手段】 下記式（Ｉ）：
【化１】
(式中、
Ｐは、１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であって、ここで糖残基は該ペプチド鎖中のSer又はThr残基の側鎖とＯ−グリコシド結合し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、互いに独立して、水素、アセチル基、アセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖である。)
で表される化合物。
【解決手段】 下記式（Ｉ）：
【化１】
(式中、
Ｐは、１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であって、ここで糖残基は該ペプチド鎖中のSer又はThr残基の側鎖とＯ−グリコシド結合し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、互いに独立して、水素、アセチル基、アセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖である。)
で表される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖ペプチドのライブラリー合成に有用な糖アミノ酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のゲノム研究の発展により、核酸とタンパク質に関する研究は急速に発展した。タンパク質が実際に機能するためには正しくフォールディングし、特定の部位へ輸送される必要があるが、これに糖鎖が深く関わっていることが近年報告され、その詳細な機構の解明が期待されている。さらに、特定の部位に配置されたタンパク質が様々な相互作用を利用して機能する場面においても、多くの場合、糖鎖との相互作用は避けて通ることのできない重要な情報伝達経路である。
【０００３】
このようにポストゲノム分野において糖鎖はきわめて重要な役割を果たしているにもかかわらず、その詳細な機能の解明はあまり進んでいない。その主な理由として糖鎖はタンパク質などとの複合体として機能していることが多く、さらに特定のタンパク質に特定の糖鎖が修飾されるわけではなく、加齢、病変などに伴いその糖鎖構造は多様に変化することがあげられる。また、特定のタンパク質上の糖鎖構造の変化を測定する技術に関してもまだ有力なものは開発されていない。均一な糖タンパク質を単離することは一般的にきわめて困難であり、これらの諸問題を克服するため糖タンパク質又はその部分構造である糖ペプチドの迅速かつ効率的な調製法の開発が重要である。
【０００４】
この問題に対応し、さらに生体機能の制御の道具として応用するため、これまで糖ペプチド合成法の開発研究が精力的に行われてきた。しかしながら、糖ペプチド合成の原料となる糖アミノ酸の調製が難しいことに加え、これまでに開発された糖アミノ酸はそれぞれ保護基とそれに伴う脱保護条件が異なるため、糖ペプチドライブラリー作成には不向きであった。
【０００５】
近年、Ｋｕｎｚらによりシアル酸を有する糖ペプチド合成法が報告された。しかしながら、この方法ではシアル酸を含有させるので、そのエステル部位の脱保護に比較的強い塩基性を必要とするという問題点がある。
【０００６】
また、中原らよりベンジル系保護基に統一された糖アミノ酸を用いる戦略が報告されているが、糖アミノ酸の調製に必要な操作数が数段階多くなること、脱保護に酸性条件が必要であることなどから、ライブラリー調製の観点からするとより大量に糖アミノ酸が調製可能な実用的な方法が必要であると思われる。
【０００７】
プロテオームの次世代を担うと期待されているグライコプロテオームを強力に推し進めるためには、ペプチド結合形成反応から脱保護まで統一された操作により複数の糖鎖を有する糖ペプチドのライブラリー合成が可能となる合成法及びそのための原料が鍵技術のひとつとなると予想されるが、この目的にかなう技術はいまだ開発されていない。
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−３０６０９９号公報
【特許文献２】特開平１１−１１３５９３号公報
【特許文献３】特開平１１−５０５２２５号公報
【特許文献４】米国特許第５３６９０１７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／８３２３５号明細書
【非特許文献１】Kunz et al., Synlett, 13, 2052-2056 (2003)
【非特許文献２】Y. Nakahara et al.,Tetrahedron, 59, 8415-8427 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまで開発された糖ペプチド合成法では特定の糖ペプチド構造のみにその合成対象を絞っていたため、その保護基戦略は対象構造ごとに最適化されてきた。
【００１０】
本発明では、パターン化された繰り返し操作により様々な糖残基構造を有する糖ペプチドライブラリーの構築のための出発物質として有用な化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、糖水酸基の保護基としてアセチル基のみを用いた糖アミノ酸を出発物質として用いると、均一の反応条件で様々なコア構造の糖ペプチドを容易に調製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）下記式（Ｉ）：
【化１】
(式中、
Ｐは、１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であって、ここで糖残基は該ペプチド鎖中のSer又はThr残基の側鎖とＯ−グリコシド結合し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、互いに独立して、水素、アセチル基、アセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖である。)
で表される化合物。
【００１３】
（２）下記式（II）：
【化２】
(式中、
Ｘ、Ｙ及びＺは、上記定義のとおりであり；
Ｒ１は、水素又はメチルであり；
Ｒ２は、ＯＨ、カルボキシル基の保護基又はカルボキシル基の活性化基であり；
Ｒ３は、アミノ基の保護基である。)
で表される前記（１）記載の化合物。
【００１４】
（３）式（Ｉ）において、Ｘ及びＺは完全にアセチル化された糖残基であり；ＹはＨであり；Ｒ２はＯＨであり；Ｒ３はＦｍｏｃ基である前記（１）又は（２）記載の化合物。
【００１５】
（４）式（Ｉ）において、Ｘ及びＺが、互いに独立して、下記式：
【化３】
からなる群より選択される糖残基である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物。
【００１６】
（５）下記式：
【化４】
からなる群より選択される前記（１）記載の化合物。
【００１７】
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物を用いて糖鎖及び／又はペプチド鎖の伸長反応を行なうことを含む糖ペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
従来の糖ペプチド合成では脱保護の条件が複雑であったため、多検体の並列調製に不向きであったが、本発明の化合物では糖残基の水酸基の保護基がアセチル基に統一されているので、本発明の化合物を出発物質として用いれば脱保護条件を統一することができ、煩雑な保護・脱保護工程は必要がなくなり、糖ペプチド合成を迅速化することができる。また、小さなアセチル基を保護基として使用しているので立体障害が少なく、ペプチドの伸長反応や糖鎖の伸長反応も従来の糖ペプチド合成に比べて反応性が向上する。
【００１９】
本発明の化合物はコア構造と呼ばれる糖残基を有する糖ペプチドであり、この化合物を出発物質として用いることにより、例えば、糖転移酵素を用いて酵素反応的に容易に糖鎖を伸長することが可能であり、糖ペプチドライブラリー合成法のための出発原料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の化合物は、下記式（Ｉ）：
【００２１】
【化５】
(式中、
Ｐは、１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であって、ここで糖残基は該ペプチド鎖中のSer又はThr残基の側鎖とＯ−グリコシド結合し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、互いに独立して、水素、アセチル基、アセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖である。)
で表される化合物である。
【００２２】
式Ｉにおいて「Ｐ」で表されるペプチド鎖(又はアミノ酸残基)は１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であって、ここで糖残基は該ペプチド鎖中のSer又はThr残基の側鎖とＯ−グリコシド結合により結合している。
【００２３】
本発明においては、式Ｉの化合物としてはＰがセリン残基、トレオニン残基又はその誘導体である下記式（II）：
【００２４】
【化６】
(式中、
Ｘ、Ｙ及びＺは、上記定義のとおりであり；
Ｒ１は、水素又はメチルであり；
Ｒ２は、ＯＨ、カルボキシル基の保護基又はカルボキシル基の活性化基であり；
Ｒ３は、アミノ基の保護基である。)
で表される化合物が好ましい。
【００２５】
上記Ｘ、Ｙ及びＺとしては、互いに独立して、水素、アセチル基、アセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖が挙げられる。前記糖残基又は２〜１５糖の糖鎖としては、単糖及びオリゴ糖（２〜１５糖、好ましくは２〜１０糖、さらに好ましくは２〜５糖）のいずれでもよく、また、各構成糖はペントース、ヘキソース及びヘプトース等のいずれであってもよい。３糖以上のオリゴ糖鎖である場合には直鎖状糖鎖及び分岐状糖鎖のいずれでもよい。前記糖残基又は糖鎖は、その水酸基の１つ以上がアセチル基により保護されていてもよく、すべての水酸基が保護されていることが好ましい。なお、本発明において前記糖残基又は糖鎖の水酸基の保護基としてはアセチル基のみを用いることが好ましい。
【００２６】
前記糖残基又は糖鎖の具体例としては、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、Ｎ−アセチルラクトサミン、リボース、ラクトース、マルトース等の単糖類、並びにこれらの構成糖単位を含み直鎖状又は分岐状に結合したオリゴ糖が挙げられる。また、本発明においては、前記糖残基及び糖鎖としてはカルボキシル基を有さないものであることが好ましい。
【００２７】
Ｘ、Ｙ及びＺの組合せとして好ましいのは、Ｘ及びＺがアセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖であり、且つＹが水素又はアセチル基である組合せである。特には、Ｘ及びＺとしては、互いに独立して、下記式：
【００２８】
【化７】
からなる群より選択される基が好ましい。
【００２９】
Ｒ２は、ＯＨ、カルボキシル基の保護基又はカルボキシル基の活性化基であり、通常は遊離の状態で使用されるが、ペプチド合成も行うためには、保護基により保護したり、活性化してもよい。カルボキシル基の活性化基とは、カルボキシル基のカルボニル炭素の反応性を高める目的で導入される官能基である。カルボキシル基の保護基及び活性化基Ｒ２としては、例えば、−ＯＲ（エステル：−ＣＯＯＲとして）、Pfp（ペンタフルオロフェニル基）、フッ素基、Ｓ−アルキル基及びＳ−アリール基（チオエステル：−ＣＯＳＲとして）等が挙げられる。ここで、前記Ｒは低級アルキル又はアリール基である。
【００３０】
Ｒ３は、アミノ基の保護基であり、例えば、９−フルオレニルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基、第３ブチルオキシカルボニル基等が挙げられ、特にＦｍｏｃ基が好ましい。
【００３１】
本発明の化合物において、糖残基とペプチド鎖又はトレオニン残基若しくはセリン残基とはＯ−グリコシド結合により結合されている。
【００３２】
本発明において、もっとも好ましい化合物は以下のコア構造を有するCore１〜Core８等の化合物である：
【００３３】
【化８】
【００３４】
次に、本発明の化合物の製造方法について説明する。
本発明の化合物は、これに限定されるものではないが、以下のような糖誘導体の合成に利用される公知の化学反応を利用して合成することができる。
【００３５】
【化９】
まず、糖供与体としては、例えば、１位がトリクロロアセトイミデート化された２−アジド−Ｄ−ガラクトース誘導体を使用することができる。なお、目的化合物までの製造工程中は、糖水酸基は、１位の水酸基以外は適宜アセチル保護、アセタール保護、シリル保護又はグリコシル化されていてもよい。
【００３６】
もう一方のペプチド鎖については、目的化合物までの製造工程中は上記糖供与体との結合に利用されるセリン又はトレオニン残基の水酸基以外の基は保護しておくことが好ましい。例えば、アミノ基は９−フルオレニルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基、第３ブチルオキシカルボニル基等で保護しておくことが好ましい。カルボキシル基は適宜エステル化して保護したり(例えば、tert−Ｂｕエステル)、その後のペプチド合成のためにペンタフルオロフェニル基、チオエステル基、フッ素基等の基により活性化基としてもよい。
【００３７】
各反応工程は公知の合成反応を利用するものであり、試薬、触媒、溶媒、温度、時間等の反応条件を適宜選択して行う。
【００３８】
上記の合成スキームでは、まず１位がトリクロロアセトイミデート化された３，４，６−Ｏ−トリアセチル−２−アジドガラクトースとペプチド鎖(Ｆｍｏｃセリン又はトレオニンのtert−Ｂｕエステル体)とを反応させる。次いで、一旦アセチル基を除去し、４位及び６位水酸基をイソプロピリデン又はベンジリデン基で保護し、３位のみ遊離水酸基にする。３位の遊離水酸基に、１位がトリクロロアセトイミデート化された２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル−ガラクトースを上記と同様にして導入し、４位及び６位水酸基を脱保護する。次いで、６位の遊離水酸基に１位がトリクロロアセトイミデート化された３，４，６−Ｏ−トリアセチル−グルコサミン（アミノ基はトリクロロエチルオキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ基）で保護）を同様にして導入する。このＴｒｏｃ基とガラクトースの２−アジド基は最後に還元処理を経てアセトアミド基に変換して本発明の化合物を得る。この後、必要に応じて、ペプチド鎖のカルボキシル基を保護していたtert−Ｂｕ基を脱保護してもよい。
【００３９】
上記各反応工程に用いられる溶媒としては、周知の有機溶媒（又は水との混合溶媒）を状況に応じて使用することができる。有機溶媒としては、例えば、エーテル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、酢酸、トルエン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等を挙げることができる。
【００４０】
各反応工程における反応温度は、反応が進行するものである限り特に制限されるものではないが、通常−７８℃〜その溶媒の沸点の温度である。反応時間は反応の進行具合により適宜変更してよい。
【００４１】
反応溶液の濃度としては、例えば、糖及びペプチド鎖のそれぞれが0.01mol/l〜2mol/lの範囲、より好ましくは0.1mol/l〜1mol/lの範囲として行うことが好ましい。
【００４２】
反応終了後、必要に応じて保護基を除去し、そして生成した本発明の化合物を通常の方法に従って精製する。精製手段としては、例えば、抽出、再結晶、シリカゲルクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
【００４３】
上記のようにして得られた本発明の化合物のペプチド鎖を伸長するには公知のペプチド合成反応を利用して行うことができる。例えば、本発明の化合物のペプチド鎖のアミノ基又はカルボキシル基の保護基を脱保護し、公知の縮合剤（例えば、ジフェニルホスホリルアジド(ＤＰＰＡ)、ジエチルホスホリルシアニデート、アジドトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩等の有機リン化合物、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１,２−ジハイドロキノリン(ＥＥＤＱ)、１−イソブチル−２−イソブチル−１,２−ジヒドロキシキノリン等のキノリン系ペプチド縮合剤、２-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(ＨＢＴＵ）、ＤＣＣ等のカルボジイミド類等)を用いて、順次糖アミノ酸（又はアミノ酸）を結合していくことによりペプチド鎖を伸長することができる。また、マイクロ波を照射しながら行ってもよい。本明細書で言う「マイクロ波」とは波長約０．３〜３０ｃｍ程度の電磁波（１〜１００ＧＨｚに相当する）のことをいう。マイクロ波の波長としては、好ましくは２３００〜２６００ＭＨｚであるが、さらに好ましくは２３５０〜２５５０ＭＨｚ、特に好ましくは２４００〜２５００ＭＨｚである。
【００４４】
これは固相反応により行ってもよく、例えば、固相担体に本発明の化合物のＮ末端アミノ基又はＣ末端カルボキシル基を結合して（例えば、Ｃ末端のカルボキシル基をクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合する）、通常の固相合成反応と同様にして行うことができる。
【００４５】
また、糖鎖を伸長するには公知の方法を使用することができ、例えば、１位がトリクロロアセトイミデート化され且つ水酸基が適宜アセチル基で保護された糖誘導体を用いて上記と同様にしてグリコシル化反応を行なうことにより、容易に糖鎖を伸長することができる。あるいは、本発明の化合物を糖転移酵素の基質として用いて酵素反応的に糖鎖を伸長することもできる。
【００４６】
例えば、コア２型糖鎖を有するトレオニン誘導体のアセチル基を脱保護し、これにα２，３−シアル酸転移酵素とその供与体基質であるＣＭＰシアル酸を添加することによりガラクトース残基の３位水酸基上にシアル酸がα結合した化合物を得ることができる。一方、β１,４−ガラクトース転移酵素とＵＤＰガラクトースを添加すると、グルコサミン残基の４位水酸基上にガラクトース残基がβ結合した化合物が得られる。また、これらの二つの酵素を転化する順序に関係なく、もう一方の糖残基を伸長することもできる。また、双方の酵素と供与体基質を同時に添加することにより、それぞれの糖残基を同時に伸長することもできる。このように作用させる糖転移酵素の種類、順番を変えることにより、さまざまな構造の糖アミノ酸及び糖ペプチドを調製することができる。
【００４７】
本発明の化合物を用いて糖ペプチドを合成すれば、保護基がアセチル基に統一されているので、均一の反応条件で様々なコア構造の組み合わせを有する種々の糖ペプチドを容易に調製することが可能となり、糖ペプチド合成の反応工程を大幅に簡素化することができる。
【実施例】
【００４８】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本明細書で用いられる略語は、以下のような意味を有する。
DMF ＝ N,N−ジメチルホルムアミド
DCM ＝ ジクロロメタン
HOBT ＝ N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIEA ＝ ジイソプロピルエチルアミン
HBTU ＝ １− [ビス(ジメチルアミノ)メチレン]−１Ｈ−ベンゾトリアジウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
TFA ＝ トリフルオロ酢酸
TMSOTf ＝ トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルエステル
CSA ＝ １０−カンファースルホン酸
TLC ＝ シリカゲル薄層クロマトグラフ（Merck社製、Silica gel 60 F254）
Fmoc−Ala−OH ＝ N−α−Fmoc−L−アラニン
Fmoc−Gly−OH ＝ N−α−Fmoc−L−グリシン
Fmoc−Pro−OH ＝ N−α−Fmoc−L−プロリン
Fmoc−Arg（Pbf）−OH ＝ N−α−Fmoc−Nγ−（2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル）−L−アルギニン
Fmoc−Asp（OtBu）−OH ＝ N−α−Fmoc−L−アスパラギン酸 β−t−ブチルエステル
Fmoc−Gln（OtBu）−OH ＝ N−α−Fmoc−L−グルタミン酸 β−t−ブチルエステル
Fmoc−Phe−OH ＝ N−α−Fmoc−L−フェニルアラニン
Fmoc−Val−OH ＝ N−α−Fmoc−L−バリン
Fmoc−His（Trt）−OH ＝ N−α−Fmoc−N−im−トリチル−L−ヒスチジン
Fmoc−Thr−OH ＝ N−α−Fmoc−L−トレオニン
Fmoc−Ser−OH ＝ N−α−Fmoc−L−セリン
Fmoc−Thr（Ac3GalNAc）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−(2−アセトアミド−3,4,6−トリ−O−アセチル−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル)−L−トレオニン
Fmoc−Ser（Ac3GalNAc）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−(2−アセトアミド−3,4,6−トリ−O−アセチル−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル)−L−セリン
Fmoc−Thr（Ac7core2）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−{O−(2’,3,’4,’6’−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−（1’→3）−O−[2”−アセトアミド−3”,4”,6”−トリ−O−アセチル−2”−デオキシ−β−D−グルコピラノシル−（1”→6）]−2−アセトアミド−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル}−L−スレオニン
Fmoc−Ser（Ac7core2）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−{O−(2’,3,’4,’6’−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−（1’→3）−O−[2”−アセトアミド−3”,4”,6”−トリ−O−アセチル−2”−デオキシ−β−D−グルコピラノシル−（1”→6）]−2−アセトアミド−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル}−L−セリン
Fmoc−Thr（Ac5core6）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−［O−（2”−アセトアミド−3”,4”,6”−トリ−O−アセチル−2”−デオキシ−β−D−グルコピラノシル）−（1”→6）−2−アセトアミド−4,6−ジ−O−アセチル−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル］−L−スレオニン
Fmoc−Ser（Ac5core6）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−［O−（2”−アセトアミド−3”,4”,6”−トリ−O−アセチル−2”−デオキシ−β−D−グルコピラノシル）−（1”→6）−2−アセトアミド−4,6−ジ−O−アセチル−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル］−L−セリン
【００５０】
（実施例１）コア(Core)２トレオニン誘導体の調製
下記の合成スキームにしたがってコア２トレオニン誘導体(化合物８)を調製した。
【００５１】
【化１０】
【００５２】
化合物（１）の合成
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール（６８．９ｇ）を乾燥アセトニトリル（１０００ｍｌ）に溶かし、−２０℃に冷却した。−２０℃まで冷えたらセリウムアンモニウムナイトレート（２１６ｇ）及びアジ化ナトリウム（１３．０ｇ）を加え、−２０℃で激しく攪拌した。１時間後、さらにセリウムアンモニウムナイトレート（２００ｇ）及びアジ化ナトリウム（１１．７ｇ）を加え、−２０℃で攪拌した。６時間後、反応液にエーテルと水とを加え、分液操作により有機層を集め、水層からエーテルで２回抽出操作を行った。有機層を集め、硫酸マグネシウム乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲル（２００ｇ）を充填したショートカラムに加え、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で溶出した。得られた粗生成物画分を集め、濃縮し、その残渣をアセトン−水（１：１）混合液（１０００ｍｌ）に溶かし、これに炭酸カルシウム（２５ｇ）を加え、室温で３日間攪拌した。反応懸濁液からカルシウム塩を濾別したのち、濾液を半量になるまで濃縮し、酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機層を乾燥、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［トルエン−酢酸エチル（２：１）］により精製し、化合物（１）（４３ｇ、５２％）を得た。化合物（１）：Ｒｆ０．３［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］。
【００５３】
化合物（２）の合成
化合物（１）（４．０５ｇ）とトリクロロアセトニトリル（２．４５ｍｌ）とのジクロロメタン（４０ｍｌ）溶液に無水炭酸カリウム（１．６９ｇ）を加え、室温で７時間激しく攪拌した。炭酸カリウムをセライトろ過により濾別した後、濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［トルエン−酢酸エチル−トリエチルアミン（１５０：５０：１）］により精製し、化合物（２）（４．６ｇ、７９％）を得た。化合物（２）：Ｒｆ０．４［トルエン−酢酸エチル−トリエチルアミン（１５０：５０：１）］。
【００５４】
化合物（３）の合成
化合物（２）（２５．０ｇ）とN−α−Fmoc−L−トレオニン−ｔ−ブチルエステル（１１．４ｇ）をジクロロメタン−エーテル（１：１）の乾燥混合液（２００ｍｌ）に溶かし、−３０℃に冷却した後、ＴＭＳＯＴｆ（５１６μｌ）を滴下した。反応液を−３０℃で３０分間攪拌した後、トリエチルアミン（４００μｌ）で中和し、クロロホルムで希釈した後、０．１Ｍ 塩酸で洗浄、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮を順次行った。残渣を減圧乾燥した後、乾燥メタノールに溶かし、これに、ｐＨ８〜９の範囲に保つように注意しながら０．５Ｍ ナトリウムメトキシドメタノール溶液を滴下した。ＴＬＣで目的物（Ｒｆ０．５；酢酸エチル）の蓄積を確認した後、反応液に酢酸（２．０ｍｌ）を加え、減圧濃縮した。次に、残渣をクロロホルムに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水、水で順次洗浄した後、有機層を硫酸マグネシウム乾燥、濃縮し、減圧乾燥した。続いて、残渣を乾燥アセトニトリルに溶かし、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（８．５ｍｌ）とＣＳＡ（２００ｍｇ）を加え、室温で３時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水を加え、この懸濁液からクロロホルムで３回抽出した。抽出液を硫酸マグネシウム乾燥、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（３：２）］により精製し、化合物（３）（７．２ｇ、３８％）を得た。化合物（３）：Ｒｆ０．６［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］。
【００５５】
化合物（４）の合成
化合物（３）（２００ｍｇ）、２,３,４,６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトーストリクロロアセトイミデート（２００ｍｇ）のジクロロメタン（４ｍｌ）溶液を０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（１１μｌ）を滴下した。０℃で時間攪拌した後、反応液にトリエチルアミン（８μｌ）を加え、反応液に０．１Ｍ塩酸を加えた。有機層の分液及び水層のクロロホルム抽出を行った後、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］により精製し、化合物（４）（２４９ｍｇ、８４％）を得た。化合物（４）：Ｒｆ０．４［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］。
【００５６】
化合物（５）の合成
化合物（４）（２２４ｍｇ）を８０％酢酸水に溶かし、８０℃で２時間攪拌した。反応液の濃縮、トルエン共沸を行い、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：３）］により精製し、化合物（５）（１７６ｍｇ、８６％）を得た。化合物（５）：Ｒｆ０．２［ヘキサン−酢酸エチル（１：３）］。
【００５７】
化合物（６）の合成
化合物（５）（１．７１ｇ）と３,４,６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−（２,２,２−トリクロロエチルオキシカルボニル）−Ｄ−グルコサミントリクロロイミデート（２．２８ｇ）の乾燥ジクロロメタン（５０ｍｌ）溶液を−４０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（４８μｌ）を滴下した。１０分後、反応液にトリエチルアミン（３８μｌ）を加え、反応液に０．１Ｍ塩酸を加えた。有機層の分液及び水層のクロロホルム抽出を行った後、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］により精製し、化合物（６）（３．１５ｇ、９２％）を得た。化合物（６）：Ｒｆ０．６［ヘキサン−酢酸エチル（１：３）］。
【００５８】
化合物（７）の合成
化合物（６）（３．５ｇ）及び酢酸（８．０ｍｌ）の酢酸エチル溶液（６０ｍｌ）に亜鉛粉末（１９ｇ）を加え、激しく攪拌した。３０分後、反応液に無水酢酸（８．０ｍｌ）を加え、さらに３０分間攪拌した。未反応の亜鉛末をセライトろ過により濾別した後、濾液を０．１Ｍ塩酸及び水で順次洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮した。残渣にシリカゲルカラムクロマトグラフィー［アセトン−ヘキサン（２：１）］を行い（７）の粗生成物（３．０ｇ、９４％）を得た。さらにクロロホルム−ヘキサンより３回再結晶することにより化合物（７）の精製物（１．９ｇ、６０％）を得た。化合物（７）：Ｒｆ０．３［アセトン−ヘキサン（２：１）］。
【００５９】
化合物（８）の合成
化合物（７）（１．８ｇ）を９５％ＴＦＡに溶かし、室温で１時間攪拌した。反応液をトルエンで希釈した後濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行い、化合物（８）（１．７ｇ、１００％）を得た。化合物（８）：Ｒｆ０．５［クロロホルム−メタノール（４：１）］。
【００６０】
（実施例２）コア１トレオニン誘導体の調製
下記の合成スキームにしたがってコア１トレオニン誘導体（化合物１０）を調製した。
【００６１】
【化１１】
【００６２】
化合物（９）の合成
化合物（５）（３４９ｍｇ）をピリジン（３ｍｌ）、無水酢酸（２ｍｌ）に溶かし、室温で５時間攪拌した後、トルエンで希釈して濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行った。残渣を酢酸エチル（１０ｍｌ）に溶かし、酢酸（０．８６ｍｌ）及び亜鉛粉末（１．３ｇ）を加え、室温で３０分間攪拌した。続いて、反応液に無水酢酸（１．５ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した後、亜鉛をセライト濾過により濾別した。濾液を０．１Ｍ塩酸及び水で順次洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（３：１）］で精製し、化合物（９）（３２７ｍｇ、８５％）を得た。化合物（９）：Ｒｆ０．３［酢酸エチル−ヘキサン（３：１）］。
【００６３】
化合物（１０）の合成
化合物（９）（３２５ｍｇ）を９５％ＴＦＡに溶かし、室温で１時間攪拌した。反応液をトルエン希釈した後濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（３：１）］で精製し、化合物（１０）（２９７ｍｇ、９７％）を得た。化合物（１０）：Ｒｆ０．４［クロロホルム−メタノール（４：１）］。
【００６４】
（実施例３）コア４セリン誘導体の調製
下記の合成スキームにしたがってコア４セリン誘導体（化合物１６）を合成した。
【００６５】
【化１２】
【００６６】
化合物（１２）の合成
実施例１の方法に基づいて別途調製した化合物（１１）（７５０ｍｇ）と３,４,６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−（２,２,２−トリクロロエチルオキシカルボニル）−Ｄ−グルコサミントリクロロイミデート（８５５ｍｇ）の乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）溶液を−３０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（２５μｌ）を滴下した。１０分後、反応液にトリエチルアミン（２０μｌ）を加え、反応液に０．１Ｍ塩酸を加えた。有機層の分液及び水層のクロロホルム抽出を行った後、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］により精製し、化合物（１２）（１．１６ｇ、９１％）を得た。化合物（１２）：Ｒｆ０．４［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］。
【００６７】
化合物（１３）の合成
化合物（１２）（１．１５ｇ）を８０％酢酸水に溶かし、８０℃で２時間攪拌した。反応液の濃縮、トルエン共沸を行い、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：３）］により精製し、化合物（１３）（９１２ｍｇ、８６％）を得た。化合物（１３）：Ｒｆ０．３［ヘキサン−酢酸エチル（１：３）］。
【００６８】
化合物（１４）の合成
化合物（１３）（６５５ｍｇ）と３,４,６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−（２,２,２−トリクロロエチルオキシカルボニル）−Ｄ−グルコサミントリクロロイミデート（３９６ｍｇ）の乾燥ジクロロメタン（１０ｍｌ）溶液を−４０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（１１μｌ）を滴下した。１０分後、反応液にトリエチルアミン（９μｌ）を加え、反応液に０．１Ｍ塩酸を加えた。有機層の分液及び水層のクロロホルム抽出を行った後、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］により精製し、化合物（１４）（６２４ｍｇ、６６％）を得た。化合物（１４）：Ｒｆ０．２［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］。
【００６９】
化合物（１５）の合成
化合物（１４）（６２４ｍｇ）及び酢酸（２．０ｍｌ）の酢酸エチル溶液（２０ｍｌ）に亜鉛粉末（４．９ｇ）を加え、激しく攪拌した。３０分後、反応液に無水酢酸（４．０ｍｌ）を加え、さらに３０分間攪拌した。未反応の亜鉛末をセライトろ過により濾別した後、濾液を０．１Ｍ塩酸及び水で順次洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮した。残渣にシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］を行い（１５）の粗生成物（４９５ｍｇ、９５％）を得た。さらにクロロホルム−ヘキサンより２回再結晶することにより化合物（１５）の精製物（４２３ｍｇ、８２％）を得た。化合物（１５）：Ｒｆ０．２［クロロホルム−メタノール（１０：１）］。
【００７０】
化合物（１６）の合成
化合物（１５）（４１２ｍｇ）を９５％ＴＦＡに溶かし、室温で１時間攪拌した。反応液をトルエンで希釈した後濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行い、化合物（１６）（３９５ｍｇ、１００％）を得た。化合物（１６）：Ｒｆ０．４［クロロホルム−メタノール（４：１）］。
【００７１】
（実施例４）コア３セリン誘導体の調製
下記の合成スキームにしたがってコア３セリン誘導体（化合物１８）を調製した。
【００７２】
【化１３】
【００７３】
化合物（１７）の合成
化合物（１３）（１．０３ｇ）をピリジン（５ｍｌ）、無水酢酸（３ｍｌ）に溶かし、室温で３時間攪拌した後、トルエン希釈、濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行った。残渣を酢酸エチル（４０ｍｌ）に溶かし、酢酸（４．９ｍｌ）及び亜鉛粉末（７．５ｇ）を加え、室温で２０分間攪拌した。続いて、反応液に無水酢酸（４．０ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した後、亜鉛をセライト濾過により濾別した。濾液を水で洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮した後、残渣をクロロホルム−ヘキサンから再結晶し化合物（１７）（８６２ｍｇ、８７％）を得た。化合物（１７）：Ｒｆ０．５［クロロホルム−メタノール（１０：１）］。
【００７４】
化合物（１８）の合成
化合物（１７）（８５７ｍｇ）を９５％ＴＦＡに溶かし、室温で１時間攪拌した。反応液をトルエン希釈した後濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］で精製し、化合物（１８）（７３１ｍｇ、９０％）を得た。化合物（１８）：Ｒｆ０．３［クロロホルム−メタノール（４：１）］。
【００７５】
（実施例５）糖ペプチド合成
上記のようにして合成した糖アミノ酸を用いて、下記の合成スキームにしたがって糖ペプチド２０を合成した。
【００７６】
【化１４】
【００７７】
化合物（１９）の合成
【化１５】
【００７８】
Tentagel(登録商標)（Hipep Laboratories、０．２５mmol/g）０．１２g（０．０３mmol）を担体として、以下に示すＮ−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸とケト酸とをそれぞれ１０等量とＦｍｏｃ／ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ法試薬とを用いて室温で２時間カップリング反応を行った。糖アミノ酸は試薬１．１等量を用いてマイクロ波照射下５０℃で２０分間カップリング反応を行うことにより、以下の通り順次縮合して目的の糖ペプチド誘導体を合成した。
使用した保護アミノ酸、ケト酸及び糖アミノ酸：
Fmoc−Arg（Pbf）−OH、Fmoc−Thr（Ac5core6）−OH、Fmoc−Asp（OtBu）−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Ser（Ac7core2）−OH、Fmoc−Thr（Ac3GalNAc）−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His（Trt）−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln（OtBu）−OH、Fmoc−Phe−OH、５−ケトヘキサン酸。
【００７９】
ペプチド伸長反応終了後、９０％ＴＦＡ水溶液中、室温で２時間反応させることによってペプチド残基上の保護基を脱離させるとともに、固相担体上から化合物（１９）を遊離させた。樹脂を濾別し、ＴＦＡを揮発留去した後、１０％アセトニトリル水溶液に溶解し固体を逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ−３ ２０×２５０ｍｍカラム、移動層Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液に対するＢ：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルの１０％〜７０％のグラジエント）により精製して化合物（１９）を１７ｍｇ得た（収率１７％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝３３０６．３４０、（理論値：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝３３０５．３２９）。
【００８０】
化合物（２０）の合成
【化１６】
化合物（１９）をメタノール５ｍｌに溶解し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてpHを１２．０に調整した。随時０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でpHを調節しながら、反応終了まで２時間撹拌した。反応終了後、Ｈ＋型陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ８（ダウケミカル社製）を加えて中和した後、樹脂を濾別し、濾液の溶媒を留去して残渣を逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ−３ ２０×２５０ｍｍカラム、移動層Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液に対するＢ：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルの０％〜６０％のグラジエント）により精製して化合物（２０）を５．６ｍｇ得た（収率４０％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝２６７５．５４７、（理論値：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝２６７５．１７１）。
【００８１】
（実施例６）Fmoc−Thr（Ac7core2）−OH（２１）の合成
以下の合成スキームにしたがってFmoc−Thr（Ac7core2）−OH（化合物２１）を調製した。
【００８２】
【化１７】
【００８３】
化合物（２１）の合成
化合物（８）（１２．４ｍｇ）をメタノール−水（１０：１）混合液（５ｍｌ）に溶かし、０．１Ｎナトリウムメトキシドメタノール溶液にてpHをフェノールフタレインピンクに調整し、さらに、随時０．１Ｎナトリウムメトキシドメタノール溶液を追加し、pHを維持した。４時間後、反応液に酢酸（０．２ｍｌ）を加え、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール−水（１０：１０：１→１０：１０：２）］で精製し、化合物（２１）（８．１ｍｇ、８６％）を得た。化合物（２１）：Ｒｆ０．２［クロロホルム−メタノール−水（１０：１０：１）］、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝９３１．５、（理論値：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝９３２．３）、純度９５％以上（逆相ＨＰＬＣ：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ−３ ４．６×２５０ｍｍカラム、移動層Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液に対するＢ：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルの１０％〜９０％のグラジエント）。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の化合物及び製造方法は、コア構造の組み合わせ、ペプチド配列の選択、及び糖転移酵素の選択のそれぞれで多様性の付加ができるため、糖ペプチドライブラリー調製に有用である。
【００８５】
本発明に含まれる糖アミノ酸を用いることにより、これまで実現が困難であった糖ペプチドのライブラリー合成が可能となり、糖タンパク質の機能解析や構造解析が飛躍的に進行するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、実施例６で製造した化合物（２１）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖ペプチドのライブラリー合成に有用な糖アミノ酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のゲノム研究の発展により、核酸とタンパク質に関する研究は急速に発展した。タンパク質が実際に機能するためには正しくフォールディングし、特定の部位へ輸送される必要があるが、これに糖鎖が深く関わっていることが近年報告され、その詳細な機構の解明が期待されている。さらに、特定の部位に配置されたタンパク質が様々な相互作用を利用して機能する場面においても、多くの場合、糖鎖との相互作用は避けて通ることのできない重要な情報伝達経路である。
【０００３】
このようにポストゲノム分野において糖鎖はきわめて重要な役割を果たしているにもかかわらず、その詳細な機能の解明はあまり進んでいない。その主な理由として糖鎖はタンパク質などとの複合体として機能していることが多く、さらに特定のタンパク質に特定の糖鎖が修飾されるわけではなく、加齢、病変などに伴いその糖鎖構造は多様に変化することがあげられる。また、特定のタンパク質上の糖鎖構造の変化を測定する技術に関してもまだ有力なものは開発されていない。均一な糖タンパク質を単離することは一般的にきわめて困難であり、これらの諸問題を克服するため糖タンパク質又はその部分構造である糖ペプチドの迅速かつ効率的な調製法の開発が重要である。
【０００４】
この問題に対応し、さらに生体機能の制御の道具として応用するため、これまで糖ペプチド合成法の開発研究が精力的に行われてきた。しかしながら、糖ペプチド合成の原料となる糖アミノ酸の調製が難しいことに加え、これまでに開発された糖アミノ酸はそれぞれ保護基とそれに伴う脱保護条件が異なるため、糖ペプチドライブラリー作成には不向きであった。
【０００５】
近年、Ｋｕｎｚらによりシアル酸を有する糖ペプチド合成法が報告された。しかしながら、この方法ではシアル酸を含有させるので、そのエステル部位の脱保護に比較的強い塩基性を必要とするという問題点がある。
【０００６】
また、中原らよりベンジル系保護基に統一された糖アミノ酸を用いる戦略が報告されているが、糖アミノ酸の調製に必要な操作数が数段階多くなること、脱保護に酸性条件が必要であることなどから、ライブラリー調製の観点からするとより大量に糖アミノ酸が調製可能な実用的な方法が必要であると思われる。
【０００７】
プロテオームの次世代を担うと期待されているグライコプロテオームを強力に推し進めるためには、ペプチド結合形成反応から脱保護まで統一された操作により複数の糖鎖を有する糖ペプチドのライブラリー合成が可能となる合成法及びそのための原料が鍵技術のひとつとなると予想されるが、この目的にかなう技術はいまだ開発されていない。
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−３０６０９９号公報
【特許文献２】特開平１１−１１３５９３号公報
【特許文献３】特開平１１−５０５２２５号公報
【特許文献４】米国特許第５３６９０１７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／８３２３５号明細書
【非特許文献１】Kunz et al., Synlett, 13, 2052-2056 (2003)
【非特許文献２】Y. Nakahara et al.,Tetrahedron, 59, 8415-8427 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまで開発された糖ペプチド合成法では特定の糖ペプチド構造のみにその合成対象を絞っていたため、その保護基戦略は対象構造ごとに最適化されてきた。
【００１０】
本発明では、パターン化された繰り返し操作により様々な糖残基構造を有する糖ペプチドライブラリーの構築のための出発物質として有用な化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、糖水酸基の保護基としてアセチル基のみを用いた糖アミノ酸を出発物質として用いると、均一の反応条件で様々なコア構造の糖ペプチドを容易に調製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）下記式（Ｉ）：
【化１】
(式中、
Ｐは、１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であって、ここで糖残基は該ペプチド鎖中のSer又はThr残基の側鎖とＯ−グリコシド結合し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、互いに独立して、水素、アセチル基、アセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖である。)
で表される化合物。
【００１３】
（２）下記式（II）：
【化２】
(式中、
Ｘ、Ｙ及びＺは、上記定義のとおりであり；
Ｒ１は、水素又はメチルであり；
Ｒ２は、ＯＨ、カルボキシル基の保護基又はカルボキシル基の活性化基であり；
Ｒ３は、アミノ基の保護基である。)
で表される前記（１）記載の化合物。
【００１４】
（３）式（Ｉ）において、Ｘ及びＺは完全にアセチル化された糖残基であり；ＹはＨであり；Ｒ２はＯＨであり；Ｒ３はＦｍｏｃ基である前記（１）又は（２）記載の化合物。
【００１５】
（４）式（Ｉ）において、Ｘ及びＺが、互いに独立して、下記式：
【化３】
からなる群より選択される糖残基である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物。
【００１６】
（５）下記式：
【化４】
からなる群より選択される前記（１）記載の化合物。
【００１７】
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物を用いて糖鎖及び／又はペプチド鎖の伸長反応を行なうことを含む糖ペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
従来の糖ペプチド合成では脱保護の条件が複雑であったため、多検体の並列調製に不向きであったが、本発明の化合物では糖残基の水酸基の保護基がアセチル基に統一されているので、本発明の化合物を出発物質として用いれば脱保護条件を統一することができ、煩雑な保護・脱保護工程は必要がなくなり、糖ペプチド合成を迅速化することができる。また、小さなアセチル基を保護基として使用しているので立体障害が少なく、ペプチドの伸長反応や糖鎖の伸長反応も従来の糖ペプチド合成に比べて反応性が向上する。
【００１９】
本発明の化合物はコア構造と呼ばれる糖残基を有する糖ペプチドであり、この化合物を出発物質として用いることにより、例えば、糖転移酵素を用いて酵素反応的に容易に糖鎖を伸長することが可能であり、糖ペプチドライブラリー合成法のための出発原料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の化合物は、下記式（Ｉ）：
【００２１】
【化５】
(式中、
Ｐは、１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であって、ここで糖残基は該ペプチド鎖中のSer又はThr残基の側鎖とＯ−グリコシド結合し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、互いに独立して、水素、アセチル基、アセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖である。)
で表される化合物である。
【００２２】
式Ｉにおいて「Ｐ」で表されるペプチド鎖(又はアミノ酸残基)は１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であって、ここで糖残基は該ペプチド鎖中のSer又はThr残基の側鎖とＯ−グリコシド結合により結合している。
【００２３】
本発明においては、式Ｉの化合物としてはＰがセリン残基、トレオニン残基又はその誘導体である下記式（II）：
【００２４】
【化６】
(式中、
Ｘ、Ｙ及びＺは、上記定義のとおりであり；
Ｒ１は、水素又はメチルであり；
Ｒ２は、ＯＨ、カルボキシル基の保護基又はカルボキシル基の活性化基であり；
Ｒ３は、アミノ基の保護基である。)
で表される化合物が好ましい。
【００２５】
上記Ｘ、Ｙ及びＺとしては、互いに独立して、水素、アセチル基、アセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖が挙げられる。前記糖残基又は２〜１５糖の糖鎖としては、単糖及びオリゴ糖（２〜１５糖、好ましくは２〜１０糖、さらに好ましくは２〜５糖）のいずれでもよく、また、各構成糖はペントース、ヘキソース及びヘプトース等のいずれであってもよい。３糖以上のオリゴ糖鎖である場合には直鎖状糖鎖及び分岐状糖鎖のいずれでもよい。前記糖残基又は糖鎖は、その水酸基の１つ以上がアセチル基により保護されていてもよく、すべての水酸基が保護されていることが好ましい。なお、本発明において前記糖残基又は糖鎖の水酸基の保護基としてはアセチル基のみを用いることが好ましい。
【００２６】
前記糖残基又は糖鎖の具体例としては、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、Ｎ−アセチルラクトサミン、リボース、ラクトース、マルトース等の単糖類、並びにこれらの構成糖単位を含み直鎖状又は分岐状に結合したオリゴ糖が挙げられる。また、本発明においては、前記糖残基及び糖鎖としてはカルボキシル基を有さないものであることが好ましい。
【００２７】
Ｘ、Ｙ及びＺの組合せとして好ましいのは、Ｘ及びＺがアセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖であり、且つＹが水素又はアセチル基である組合せである。特には、Ｘ及びＺとしては、互いに独立して、下記式：
【００２８】
【化７】
からなる群より選択される基が好ましい。
【００２９】
Ｒ２は、ＯＨ、カルボキシル基の保護基又はカルボキシル基の活性化基であり、通常は遊離の状態で使用されるが、ペプチド合成も行うためには、保護基により保護したり、活性化してもよい。カルボキシル基の活性化基とは、カルボキシル基のカルボニル炭素の反応性を高める目的で導入される官能基である。カルボキシル基の保護基及び活性化基Ｒ２としては、例えば、−ＯＲ（エステル：−ＣＯＯＲとして）、Pfp（ペンタフルオロフェニル基）、フッ素基、Ｓ−アルキル基及びＳ−アリール基（チオエステル：−ＣＯＳＲとして）等が挙げられる。ここで、前記Ｒは低級アルキル又はアリール基である。
【００３０】
Ｒ３は、アミノ基の保護基であり、例えば、９−フルオレニルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基、第３ブチルオキシカルボニル基等が挙げられ、特にＦｍｏｃ基が好ましい。
【００３１】
本発明の化合物において、糖残基とペプチド鎖又はトレオニン残基若しくはセリン残基とはＯ−グリコシド結合により結合されている。
【００３２】
本発明において、もっとも好ましい化合物は以下のコア構造を有するCore１〜Core８等の化合物である：
【００３３】
【化８】
【００３４】
次に、本発明の化合物の製造方法について説明する。
本発明の化合物は、これに限定されるものではないが、以下のような糖誘導体の合成に利用される公知の化学反応を利用して合成することができる。
【００３５】
【化９】
まず、糖供与体としては、例えば、１位がトリクロロアセトイミデート化された２−アジド−Ｄ−ガラクトース誘導体を使用することができる。なお、目的化合物までの製造工程中は、糖水酸基は、１位の水酸基以外は適宜アセチル保護、アセタール保護、シリル保護又はグリコシル化されていてもよい。
【００３６】
もう一方のペプチド鎖については、目的化合物までの製造工程中は上記糖供与体との結合に利用されるセリン又はトレオニン残基の水酸基以外の基は保護しておくことが好ましい。例えば、アミノ基は９−フルオレニルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基、第３ブチルオキシカルボニル基等で保護しておくことが好ましい。カルボキシル基は適宜エステル化して保護したり(例えば、tert−Ｂｕエステル)、その後のペプチド合成のためにペンタフルオロフェニル基、チオエステル基、フッ素基等の基により活性化基としてもよい。
【００３７】
各反応工程は公知の合成反応を利用するものであり、試薬、触媒、溶媒、温度、時間等の反応条件を適宜選択して行う。
【００３８】
上記の合成スキームでは、まず１位がトリクロロアセトイミデート化された３，４，６−Ｏ−トリアセチル−２−アジドガラクトースとペプチド鎖(Ｆｍｏｃセリン又はトレオニンのtert−Ｂｕエステル体)とを反応させる。次いで、一旦アセチル基を除去し、４位及び６位水酸基をイソプロピリデン又はベンジリデン基で保護し、３位のみ遊離水酸基にする。３位の遊離水酸基に、１位がトリクロロアセトイミデート化された２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル−ガラクトースを上記と同様にして導入し、４位及び６位水酸基を脱保護する。次いで、６位の遊離水酸基に１位がトリクロロアセトイミデート化された３，４，６−Ｏ−トリアセチル−グルコサミン（アミノ基はトリクロロエチルオキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ基）で保護）を同様にして導入する。このＴｒｏｃ基とガラクトースの２−アジド基は最後に還元処理を経てアセトアミド基に変換して本発明の化合物を得る。この後、必要に応じて、ペプチド鎖のカルボキシル基を保護していたtert−Ｂｕ基を脱保護してもよい。
【００３９】
上記各反応工程に用いられる溶媒としては、周知の有機溶媒（又は水との混合溶媒）を状況に応じて使用することができる。有機溶媒としては、例えば、エーテル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、酢酸、トルエン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等を挙げることができる。
【００４０】
各反応工程における反応温度は、反応が進行するものである限り特に制限されるものではないが、通常−７８℃〜その溶媒の沸点の温度である。反応時間は反応の進行具合により適宜変更してよい。
【００４１】
反応溶液の濃度としては、例えば、糖及びペプチド鎖のそれぞれが0.01mol/l〜2mol/lの範囲、より好ましくは0.1mol/l〜1mol/lの範囲として行うことが好ましい。
【００４２】
反応終了後、必要に応じて保護基を除去し、そして生成した本発明の化合物を通常の方法に従って精製する。精製手段としては、例えば、抽出、再結晶、シリカゲルクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
【００４３】
上記のようにして得られた本発明の化合物のペプチド鎖を伸長するには公知のペプチド合成反応を利用して行うことができる。例えば、本発明の化合物のペプチド鎖のアミノ基又はカルボキシル基の保護基を脱保護し、公知の縮合剤（例えば、ジフェニルホスホリルアジド(ＤＰＰＡ)、ジエチルホスホリルシアニデート、アジドトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩等の有機リン化合物、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１,２−ジハイドロキノリン(ＥＥＤＱ)、１−イソブチル−２−イソブチル−１,２−ジヒドロキシキノリン等のキノリン系ペプチド縮合剤、２-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(ＨＢＴＵ）、ＤＣＣ等のカルボジイミド類等)を用いて、順次糖アミノ酸（又はアミノ酸）を結合していくことによりペプチド鎖を伸長することができる。また、マイクロ波を照射しながら行ってもよい。本明細書で言う「マイクロ波」とは波長約０．３〜３０ｃｍ程度の電磁波（１〜１００ＧＨｚに相当する）のことをいう。マイクロ波の波長としては、好ましくは２３００〜２６００ＭＨｚであるが、さらに好ましくは２３５０〜２５５０ＭＨｚ、特に好ましくは２４００〜２５００ＭＨｚである。
【００４４】
これは固相反応により行ってもよく、例えば、固相担体に本発明の化合物のＮ末端アミノ基又はＣ末端カルボキシル基を結合して（例えば、Ｃ末端のカルボキシル基をクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合する）、通常の固相合成反応と同様にして行うことができる。
【００４５】
また、糖鎖を伸長するには公知の方法を使用することができ、例えば、１位がトリクロロアセトイミデート化され且つ水酸基が適宜アセチル基で保護された糖誘導体を用いて上記と同様にしてグリコシル化反応を行なうことにより、容易に糖鎖を伸長することができる。あるいは、本発明の化合物を糖転移酵素の基質として用いて酵素反応的に糖鎖を伸長することもできる。
【００４６】
例えば、コア２型糖鎖を有するトレオニン誘導体のアセチル基を脱保護し、これにα２，３−シアル酸転移酵素とその供与体基質であるＣＭＰシアル酸を添加することによりガラクトース残基の３位水酸基上にシアル酸がα結合した化合物を得ることができる。一方、β１,４−ガラクトース転移酵素とＵＤＰガラクトースを添加すると、グルコサミン残基の４位水酸基上にガラクトース残基がβ結合した化合物が得られる。また、これらの二つの酵素を転化する順序に関係なく、もう一方の糖残基を伸長することもできる。また、双方の酵素と供与体基質を同時に添加することにより、それぞれの糖残基を同時に伸長することもできる。このように作用させる糖転移酵素の種類、順番を変えることにより、さまざまな構造の糖アミノ酸及び糖ペプチドを調製することができる。
【００４７】
本発明の化合物を用いて糖ペプチドを合成すれば、保護基がアセチル基に統一されているので、均一の反応条件で様々なコア構造の組み合わせを有する種々の糖ペプチドを容易に調製することが可能となり、糖ペプチド合成の反応工程を大幅に簡素化することができる。
【実施例】
【００４８】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本明細書で用いられる略語は、以下のような意味を有する。
DMF ＝ N,N−ジメチルホルムアミド
DCM ＝ ジクロロメタン
HOBT ＝ N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIEA ＝ ジイソプロピルエチルアミン
HBTU ＝ １− [ビス(ジメチルアミノ)メチレン]−１Ｈ−ベンゾトリアジウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
TFA ＝ トリフルオロ酢酸
TMSOTf ＝ トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルエステル
CSA ＝ １０−カンファースルホン酸
TLC ＝ シリカゲル薄層クロマトグラフ（Merck社製、Silica gel 60 F254）
Fmoc−Ala−OH ＝ N−α−Fmoc−L−アラニン
Fmoc−Gly−OH ＝ N−α−Fmoc−L−グリシン
Fmoc−Pro−OH ＝ N−α−Fmoc−L−プロリン
Fmoc−Arg（Pbf）−OH ＝ N−α−Fmoc−Nγ−（2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル）−L−アルギニン
Fmoc−Asp（OtBu）−OH ＝ N−α−Fmoc−L−アスパラギン酸 β−t−ブチルエステル
Fmoc−Gln（OtBu）−OH ＝ N−α−Fmoc−L−グルタミン酸 β−t−ブチルエステル
Fmoc−Phe−OH ＝ N−α−Fmoc−L−フェニルアラニン
Fmoc−Val−OH ＝ N−α−Fmoc−L−バリン
Fmoc−His（Trt）−OH ＝ N−α−Fmoc−N−im−トリチル−L−ヒスチジン
Fmoc−Thr−OH ＝ N−α−Fmoc−L−トレオニン
Fmoc−Ser−OH ＝ N−α−Fmoc−L−セリン
Fmoc−Thr（Ac3GalNAc）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−(2−アセトアミド−3,4,6−トリ−O−アセチル−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル)−L−トレオニン
Fmoc−Ser（Ac3GalNAc）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−(2−アセトアミド−3,4,6−トリ−O−アセチル−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル)−L−セリン
Fmoc−Thr（Ac7core2）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−{O−(2’,3,’4,’6’−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−（1’→3）−O−[2”−アセトアミド−3”,4”,6”−トリ−O−アセチル−2”−デオキシ−β−D−グルコピラノシル−（1”→6）]−2−アセトアミド−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル}−L−スレオニン
Fmoc−Ser（Ac7core2）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−{O−(2’,3,’4,’6’−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−（1’→3）−O−[2”−アセトアミド−3”,4”,6”−トリ−O−アセチル−2”−デオキシ−β−D−グルコピラノシル−（1”→6）]−2−アセトアミド−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル}−L−セリン
Fmoc−Thr（Ac5core6）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−［O−（2”−アセトアミド−3”,4”,6”−トリ−O−アセチル−2”−デオキシ−β−D−グルコピラノシル）−（1”→6）−2−アセトアミド−4,6−ジ−O−アセチル−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル］−L−スレオニン
Fmoc−Ser（Ac5core6）−OH ＝ N−α−Fmoc−O−［O−（2”−アセトアミド−3”,4”,6”−トリ−O−アセチル−2”−デオキシ−β−D−グルコピラノシル）−（1”→6）−2−アセトアミド−4,6−ジ−O−アセチル−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシル］−L−セリン
【００５０】
（実施例１）コア(Core)２トレオニン誘導体の調製
下記の合成スキームにしたがってコア２トレオニン誘導体(化合物８)を調製した。
【００５１】
【化１０】
【００５２】
化合物（１）の合成
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール（６８．９ｇ）を乾燥アセトニトリル（１０００ｍｌ）に溶かし、−２０℃に冷却した。−２０℃まで冷えたらセリウムアンモニウムナイトレート（２１６ｇ）及びアジ化ナトリウム（１３．０ｇ）を加え、−２０℃で激しく攪拌した。１時間後、さらにセリウムアンモニウムナイトレート（２００ｇ）及びアジ化ナトリウム（１１．７ｇ）を加え、−２０℃で攪拌した。６時間後、反応液にエーテルと水とを加え、分液操作により有機層を集め、水層からエーテルで２回抽出操作を行った。有機層を集め、硫酸マグネシウム乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲル（２００ｇ）を充填したショートカラムに加え、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で溶出した。得られた粗生成物画分を集め、濃縮し、その残渣をアセトン−水（１：１）混合液（１０００ｍｌ）に溶かし、これに炭酸カルシウム（２５ｇ）を加え、室温で３日間攪拌した。反応懸濁液からカルシウム塩を濾別したのち、濾液を半量になるまで濃縮し、酢酸エチルを用いて３回抽出した。有機層を乾燥、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［トルエン−酢酸エチル（２：１）］により精製し、化合物（１）（４３ｇ、５２％）を得た。化合物（１）：Ｒｆ０．３［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］。
【００５３】
化合物（２）の合成
化合物（１）（４．０５ｇ）とトリクロロアセトニトリル（２．４５ｍｌ）とのジクロロメタン（４０ｍｌ）溶液に無水炭酸カリウム（１．６９ｇ）を加え、室温で７時間激しく攪拌した。炭酸カリウムをセライトろ過により濾別した後、濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［トルエン−酢酸エチル−トリエチルアミン（１５０：５０：１）］により精製し、化合物（２）（４．６ｇ、７９％）を得た。化合物（２）：Ｒｆ０．４［トルエン−酢酸エチル−トリエチルアミン（１５０：５０：１）］。
【００５４】
化合物（３）の合成
化合物（２）（２５．０ｇ）とN−α−Fmoc−L−トレオニン−ｔ−ブチルエステル（１１．４ｇ）をジクロロメタン−エーテル（１：１）の乾燥混合液（２００ｍｌ）に溶かし、−３０℃に冷却した後、ＴＭＳＯＴｆ（５１６μｌ）を滴下した。反応液を−３０℃で３０分間攪拌した後、トリエチルアミン（４００μｌ）で中和し、クロロホルムで希釈した後、０．１Ｍ 塩酸で洗浄、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮を順次行った。残渣を減圧乾燥した後、乾燥メタノールに溶かし、これに、ｐＨ８〜９の範囲に保つように注意しながら０．５Ｍ ナトリウムメトキシドメタノール溶液を滴下した。ＴＬＣで目的物（Ｒｆ０．５；酢酸エチル）の蓄積を確認した後、反応液に酢酸（２．０ｍｌ）を加え、減圧濃縮した。次に、残渣をクロロホルムに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水、水で順次洗浄した後、有機層を硫酸マグネシウム乾燥、濃縮し、減圧乾燥した。続いて、残渣を乾燥アセトニトリルに溶かし、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（８．５ｍｌ）とＣＳＡ（２００ｍｇ）を加え、室温で３時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水を加え、この懸濁液からクロロホルムで３回抽出した。抽出液を硫酸マグネシウム乾燥、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（３：２）］により精製し、化合物（３）（７．２ｇ、３８％）を得た。化合物（３）：Ｒｆ０．６［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］。
【００５５】
化合物（４）の合成
化合物（３）（２００ｍｇ）、２,３,４,６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトーストリクロロアセトイミデート（２００ｍｇ）のジクロロメタン（４ｍｌ）溶液を０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（１１μｌ）を滴下した。０℃で時間攪拌した後、反応液にトリエチルアミン（８μｌ）を加え、反応液に０．１Ｍ塩酸を加えた。有機層の分液及び水層のクロロホルム抽出を行った後、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］により精製し、化合物（４）（２４９ｍｇ、８４％）を得た。化合物（４）：Ｒｆ０．４［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］。
【００５６】
化合物（５）の合成
化合物（４）（２２４ｍｇ）を８０％酢酸水に溶かし、８０℃で２時間攪拌した。反応液の濃縮、トルエン共沸を行い、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：３）］により精製し、化合物（５）（１７６ｍｇ、８６％）を得た。化合物（５）：Ｒｆ０．２［ヘキサン−酢酸エチル（１：３）］。
【００５７】
化合物（６）の合成
化合物（５）（１．７１ｇ）と３,４,６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−（２,２,２−トリクロロエチルオキシカルボニル）−Ｄ−グルコサミントリクロロイミデート（２．２８ｇ）の乾燥ジクロロメタン（５０ｍｌ）溶液を−４０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（４８μｌ）を滴下した。１０分後、反応液にトリエチルアミン（３８μｌ）を加え、反応液に０．１Ｍ塩酸を加えた。有機層の分液及び水層のクロロホルム抽出を行った後、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］により精製し、化合物（６）（３．１５ｇ、９２％）を得た。化合物（６）：Ｒｆ０．６［ヘキサン−酢酸エチル（１：３）］。
【００５８】
化合物（７）の合成
化合物（６）（３．５ｇ）及び酢酸（８．０ｍｌ）の酢酸エチル溶液（６０ｍｌ）に亜鉛粉末（１９ｇ）を加え、激しく攪拌した。３０分後、反応液に無水酢酸（８．０ｍｌ）を加え、さらに３０分間攪拌した。未反応の亜鉛末をセライトろ過により濾別した後、濾液を０．１Ｍ塩酸及び水で順次洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮した。残渣にシリカゲルカラムクロマトグラフィー［アセトン−ヘキサン（２：１）］を行い（７）の粗生成物（３．０ｇ、９４％）を得た。さらにクロロホルム−ヘキサンより３回再結晶することにより化合物（７）の精製物（１．９ｇ、６０％）を得た。化合物（７）：Ｒｆ０．３［アセトン−ヘキサン（２：１）］。
【００５９】
化合物（８）の合成
化合物（７）（１．８ｇ）を９５％ＴＦＡに溶かし、室温で１時間攪拌した。反応液をトルエンで希釈した後濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行い、化合物（８）（１．７ｇ、１００％）を得た。化合物（８）：Ｒｆ０．５［クロロホルム−メタノール（４：１）］。
【００６０】
（実施例２）コア１トレオニン誘導体の調製
下記の合成スキームにしたがってコア１トレオニン誘導体（化合物１０）を調製した。
【００６１】
【化１１】
【００６２】
化合物（９）の合成
化合物（５）（３４９ｍｇ）をピリジン（３ｍｌ）、無水酢酸（２ｍｌ）に溶かし、室温で５時間攪拌した後、トルエンで希釈して濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行った。残渣を酢酸エチル（１０ｍｌ）に溶かし、酢酸（０．８６ｍｌ）及び亜鉛粉末（１．３ｇ）を加え、室温で３０分間攪拌した。続いて、反応液に無水酢酸（１．５ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した後、亜鉛をセライト濾過により濾別した。濾液を０．１Ｍ塩酸及び水で順次洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（３：１）］で精製し、化合物（９）（３２７ｍｇ、８５％）を得た。化合物（９）：Ｒｆ０．３［酢酸エチル−ヘキサン（３：１）］。
【００６３】
化合物（１０）の合成
化合物（９）（３２５ｍｇ）を９５％ＴＦＡに溶かし、室温で１時間攪拌した。反応液をトルエン希釈した後濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［酢酸エチル−ヘキサン（３：１）］で精製し、化合物（１０）（２９７ｍｇ、９７％）を得た。化合物（１０）：Ｒｆ０．４［クロロホルム−メタノール（４：１）］。
【００６４】
（実施例３）コア４セリン誘導体の調製
下記の合成スキームにしたがってコア４セリン誘導体（化合物１６）を合成した。
【００６５】
【化１２】
【００６６】
化合物（１２）の合成
実施例１の方法に基づいて別途調製した化合物（１１）（７５０ｍｇ）と３,４,６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−（２,２,２−トリクロロエチルオキシカルボニル）−Ｄ−グルコサミントリクロロイミデート（８５５ｍｇ）の乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）溶液を−３０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（２５μｌ）を滴下した。１０分後、反応液にトリエチルアミン（２０μｌ）を加え、反応液に０．１Ｍ塩酸を加えた。有機層の分液及び水層のクロロホルム抽出を行った後、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］により精製し、化合物（１２）（１．１６ｇ、９１％）を得た。化合物（１２）：Ｒｆ０．４［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］。
【００６７】
化合物（１３）の合成
化合物（１２）（１．１５ｇ）を８０％酢酸水に溶かし、８０℃で２時間攪拌した。反応液の濃縮、トルエン共沸を行い、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：３）］により精製し、化合物（１３）（９１２ｍｇ、８６％）を得た。化合物（１３）：Ｒｆ０．３［ヘキサン−酢酸エチル（１：３）］。
【００６８】
化合物（１４）の合成
化合物（１３）（６５５ｍｇ）と３,４,６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−（２,２,２−トリクロロエチルオキシカルボニル）−Ｄ−グルコサミントリクロロイミデート（３９６ｍｇ）の乾燥ジクロロメタン（１０ｍｌ）溶液を−４０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（１１μｌ）を滴下した。１０分後、反応液にトリエチルアミン（９μｌ）を加え、反応液に０．１Ｍ塩酸を加えた。有機層の分液及び水層のクロロホルム抽出を行った後、有機層を合わせ、硫酸マグネシウム乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］により精製し、化合物（１４）（６２４ｍｇ、６６％）を得た。化合物（１４）：Ｒｆ０．２［ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］。
【００６９】
化合物（１５）の合成
化合物（１４）（６２４ｍｇ）及び酢酸（２．０ｍｌ）の酢酸エチル溶液（２０ｍｌ）に亜鉛粉末（４．９ｇ）を加え、激しく攪拌した。３０分後、反応液に無水酢酸（４．０ｍｌ）を加え、さらに３０分間攪拌した。未反応の亜鉛末をセライトろ過により濾別した後、濾液を０．１Ｍ塩酸及び水で順次洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮した。残渣にシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］を行い（１５）の粗生成物（４９５ｍｇ、９５％）を得た。さらにクロロホルム−ヘキサンより２回再結晶することにより化合物（１５）の精製物（４２３ｍｇ、８２％）を得た。化合物（１５）：Ｒｆ０．２［クロロホルム−メタノール（１０：１）］。
【００７０】
化合物（１６）の合成
化合物（１５）（４１２ｍｇ）を９５％ＴＦＡに溶かし、室温で１時間攪拌した。反応液をトルエンで希釈した後濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行い、化合物（１６）（３９５ｍｇ、１００％）を得た。化合物（１６）：Ｒｆ０．４［クロロホルム−メタノール（４：１）］。
【００７１】
（実施例４）コア３セリン誘導体の調製
下記の合成スキームにしたがってコア３セリン誘導体（化合物１８）を調製した。
【００７２】
【化１３】
【００７３】
化合物（１７）の合成
化合物（１３）（１．０３ｇ）をピリジン（５ｍｌ）、無水酢酸（３ｍｌ）に溶かし、室温で３時間攪拌した後、トルエン希釈、濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行った。残渣を酢酸エチル（４０ｍｌ）に溶かし、酢酸（４．９ｍｌ）及び亜鉛粉末（７．５ｇ）を加え、室温で２０分間攪拌した。続いて、反応液に無水酢酸（４．０ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した後、亜鉛をセライト濾過により濾別した。濾液を水で洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥、濃縮した後、残渣をクロロホルム−ヘキサンから再結晶し化合物（１７）（８６２ｍｇ、８７％）を得た。化合物（１７）：Ｒｆ０．５［クロロホルム−メタノール（１０：１）］。
【００７４】
化合物（１８）の合成
化合物（１７）（８５７ｍｇ）を９５％ＴＦＡに溶かし、室温で１時間攪拌した。反応液をトルエン希釈した後濃縮し、さらにトルエン共沸を２回行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］で精製し、化合物（１８）（７３１ｍｇ、９０％）を得た。化合物（１８）：Ｒｆ０．３［クロロホルム−メタノール（４：１）］。
【００７５】
（実施例５）糖ペプチド合成
上記のようにして合成した糖アミノ酸を用いて、下記の合成スキームにしたがって糖ペプチド２０を合成した。
【００７６】
【化１４】
【００７７】
化合物（１９）の合成
【化１５】
【００７８】
Tentagel(登録商標)（Hipep Laboratories、０．２５mmol/g）０．１２g（０．０３mmol）を担体として、以下に示すＮ−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸とケト酸とをそれぞれ１０等量とＦｍｏｃ／ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ法試薬とを用いて室温で２時間カップリング反応を行った。糖アミノ酸は試薬１．１等量を用いてマイクロ波照射下５０℃で２０分間カップリング反応を行うことにより、以下の通り順次縮合して目的の糖ペプチド誘導体を合成した。
使用した保護アミノ酸、ケト酸及び糖アミノ酸：
Fmoc−Arg（Pbf）−OH、Fmoc−Thr（Ac5core6）−OH、Fmoc−Asp（OtBu）−OH、Fmoc−Pro−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Ser（Ac7core2）−OH、Fmoc−Thr（Ac3GalNAc）−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−His（Trt）−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln（OtBu）−OH、Fmoc−Phe−OH、５−ケトヘキサン酸。
【００７９】
ペプチド伸長反応終了後、９０％ＴＦＡ水溶液中、室温で２時間反応させることによってペプチド残基上の保護基を脱離させるとともに、固相担体上から化合物（１９）を遊離させた。樹脂を濾別し、ＴＦＡを揮発留去した後、１０％アセトニトリル水溶液に溶解し固体を逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ−３ ２０×２５０ｍｍカラム、移動層Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液に対するＢ：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルの１０％〜７０％のグラジエント）により精製して化合物（１９）を１７ｍｇ得た（収率１７％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝３３０６．３４０、（理論値：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝３３０５．３２９）。
【００８０】
化合物（２０）の合成
【化１６】
化合物（１９）をメタノール５ｍｌに溶解し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてpHを１２．０に調整した。随時０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でpHを調節しながら、反応終了まで２時間撹拌した。反応終了後、Ｈ＋型陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ８（ダウケミカル社製）を加えて中和した後、樹脂を濾別し、濾液の溶媒を留去して残渣を逆相ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ−３ ２０×２５０ｍｍカラム、移動層Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液に対するＢ：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルの０％〜６０％のグラジエント）により精製して化合物（２０）を５．６ｍｇ得た（収率４０％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝２６７５．５４７、（理論値：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝２６７５．１７１）。
【００８１】
（実施例６）Fmoc−Thr（Ac7core2）−OH（２１）の合成
以下の合成スキームにしたがってFmoc−Thr（Ac7core2）−OH（化合物２１）を調製した。
【００８２】
【化１７】
【００８３】
化合物（２１）の合成
化合物（８）（１２．４ｍｇ）をメタノール−水（１０：１）混合液（５ｍｌ）に溶かし、０．１Ｎナトリウムメトキシドメタノール溶液にてpHをフェノールフタレインピンクに調整し、さらに、随時０．１Ｎナトリウムメトキシドメタノール溶液を追加し、pHを維持した。４時間後、反応液に酢酸（０．２ｍｌ）を加え、濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール−水（１０：１０：１→１０：１０：２）］で精製し、化合物（２１）（８．１ｍｇ、８６％）を得た。化合物（２１）：Ｒｆ０．２［クロロホルム−メタノール−水（１０：１０：１）］、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝９３１．５、（理論値：［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋＝９３２．３）、純度９５％以上（逆相ＨＰＬＣ：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ−３ ４．６×２５０ｍｍカラム、移動層Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液に対するＢ：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルの１０％〜９０％のグラジエント）。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の化合物及び製造方法は、コア構造の組み合わせ、ペプチド配列の選択、及び糖転移酵素の選択のそれぞれで多様性の付加ができるため、糖ペプチドライブラリー調製に有用である。
【００８５】
本発明に含まれる糖アミノ酸を用いることにより、これまで実現が困難であった糖ペプチドのライブラリー合成が可能となり、糖タンパク質の機能解析や構造解析が飛躍的に進行するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、実施例６で製造した化合物（２１）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
(式中、
Ｐは、１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であって、ここで糖残基は該ペプチド鎖中のSer又はThr残基の側鎖とＯ−グリコシド結合し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、互いに独立して、水素、アセチル基、アセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖である。)
で表される化合物。
【請求項２】
下記式（II）：
【化２】
(式中、
Ｘ、Ｙ及びＺは、上記定義のとおりであり；
Ｒ１は、水素又はメチルであり；
Ｒ２は、ＯＨ、カルボキシル基の保護基又はカルボキシル基の活性化基であり；
Ｒ３は、アミノ基の保護基である。)
で表される請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式（Ｉ）において、Ｘ及びＺは完全にアセチル化された糖残基であり；ＹはＨであり；Ｒ２はＯＨであり；Ｒ３はＦｍｏｃ基である請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
式（Ｉ）において、Ｘ及びＺが、互いに独立して、下記式：
【化３】
からなる群より選択される糖残基である請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
下記式：
【化４】
からなる群より選択される請求項１記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物を用いて糖鎖及び／又はペプチド鎖の伸長反応を行なうことを含む糖ペプチドの製造方法。
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
(式中、
Ｐは、１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であって、ここで糖残基は該ペプチド鎖中のSer又はThr残基の側鎖とＯ−グリコシド結合し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、互いに独立して、水素、アセチル基、アセチル保護されていてもよい糖残基又はアセチル保護されていてもよい２〜１５糖の糖鎖である。)
で表される化合物。
【請求項２】
下記式（II）：
【化２】
(式中、
Ｘ、Ｙ及びＺは、上記定義のとおりであり；
Ｒ１は、水素又はメチルであり；
Ｒ２は、ＯＨ、カルボキシル基の保護基又はカルボキシル基の活性化基であり；
Ｒ３は、アミノ基の保護基である。)
で表される請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式（Ｉ）において、Ｘ及びＺは完全にアセチル化された糖残基であり；ＹはＨであり；Ｒ２はＯＨであり；Ｒ３はＦｍｏｃ基である請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
式（Ｉ）において、Ｘ及びＺが、互いに独立して、下記式：
【化３】
からなる群より選択される糖残基である請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
下記式：
【化４】
からなる群より選択される請求項１記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物を用いて糖鎖及び／又はペプチド鎖の伸長反応を行なうことを含む糖ペプチドの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−６３０５５（Ｐ２００６−６３０５５Ａ）
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２５０９５４（Ｐ２００４−２５０９５４）
【出願日】平成１６年８月３０日（２００４．８．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「健康維持・増進のためのバイオテクノロジー基盤研究プログラム／糖鎖エンジニアリングプロジェクト／糖鎖構造解析技術開発」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月３０日（２００４．８．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「健康維持・増進のためのバイオテクノロジー基盤研究プログラム／糖鎖エンジニアリングプロジェクト／糖鎖構造解析技術開発」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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