Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａのｆｕｒ細胞およびその外膜タンパク質の抽出物によるＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａに対する異種性の防御
本発明は、毒性のP. multocidaによる感染症に対して異種性の防御を付与することができるPasteurella multocidaの変異体に関する。上記変異体は、ｆｕｒ ｏｍｐＨ遺伝子およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ遺伝子に欠損を有する。本発明は、P. multocidaから得られたｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体、およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体、または上記変異体から得られる鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）の抽出物を含むPasteurella multocida細菌ワクチン、および賦形剤および／または薬学的に許容可能なアジュバントに関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、毒性のP. multocidaによる感染症に対する異種性の防御(heterologous protection)を実現できるPasteurella multocidaの変異体に関する。これらの変異体は、ｆｕｒ ｏｍｐＨ遺伝子およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ遺伝子に欠損を有する。本発明は、P. multocidaから得られる、ｆｕｒとｏｍｐＨとの二重変異体およびｆｕｒとｏｍｐＨとｇａｌＥとの三重変異体、または、これらの変異体から得られる鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）の抽出物と、賦形剤と、および／または、薬学的に許容可能なアジュバントと、を含む、パスツレラ属細菌（特に、Pasteurella multocida）に対するワクチン組成物に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
世界的に、動物およびヒト（特に子供）が罹る病気の主な原因は、細菌の感染である。パスツレラ属細菌は病原菌であり、現在、Pasteurella multocidaを含む２０の種が存在している。Pasteurella multocidaは、豚やその他の家畜において、家禽コレラ、ウシの肺炎、出血性敗血症、萎縮性鼻炎などの様々な感染症を引き起こす病原菌であり、この感染症の制御は、上記家畜を飼育する畜産農家にとって極めて重要である。
【０００３】
それ故に、家畜を感染症から守るワクチンを開発する必要がある。ワクチンを開発する目的は、できる限り長期間に渡る十分な防御を提供することにある。
【０００４】
従来から、大別して３つのタイプのワクチンが開発されてきた。
ａ）生きた病原菌の毒性を生育にとって低減、除去、または無毒化して生成する「弱毒化生ワクチン（live attenuated vaccines）」、
ｂ）病原菌の精製された成分を使用するワクチン、
ｃ）死んだ病原菌を直接使用する「死菌ワクチン（killed vaccines）」、
これらの３種類のワクチンは、それぞれ利点および欠点をもつ。弱毒化生ワクチンは、自然の疾病と同様の条件下において防御を生み出す。しかし、ｂ）およびｃ）のタイプのワクチンの方が、安全性の観点からは好ましい。
【０００５】
獣医学では、主にP. multocidaのワクチン接種は、「バクテリン」として知られる不活性化されたP. multocidaの使用、または弱毒化された生細菌の使用に基づいている。バクテリンは、同種性の防御（homologous protection）のみを付与する。生ワクチンは、同種性の防御および異種性の防御を付与するが、不明な弱毒マーカーを含み、場合によっては集団感染（epidemic outbreaks）を招くこともあった。
【０００６】
米国特許３，８５５，４０８、米国特許４，１６９，８８６、および米国特許４，６２６，４３０は、P. multocidaの「生ワクチン」について記載している。
【０００７】
ＷＯ９８／５６９０１ Ａ２（発明の名称：弱毒化生ワクチン）は、弱毒化された細菌について開示している。この弱毒化された細菌では、ｆｕｒ遺伝子またはｆｕｒ遺伝子の同種遺伝子（homolog）の発現が、細菌が生育している培地中に存在する鉄の濃度と関係なく制御されるように、ｆｕｒ遺伝子またはｆｕｒ遺伝子の同種遺伝子が改変されている。上記細菌を「生ワクチン」として使用することができる。上記文献は、特にNeisseria meningitidisに焦点を当てているが、あらゆるグラム陰性菌に関するものである。
【０００８】
ヒトまたは動物が生産しない代謝産物（metabolite）または異化生成物（catabolite）を生産するために必要な遺伝子の変異によって、細菌が弱毒化される。好適には、細菌を弱毒化するための変異は、ａｒｏ遺伝子、またはプリンまたはピリミジン経路に関与する遺伝子の変異である。本発明の他の形態では、細菌は、ｒｅｃＡに変異を有する。
【０００９】
また、本発明は、ワクチン、および本発明に基づいた細菌を産生するための方法を提供する。当該方法は、ｆｕｒ遺伝子またはその同種遺伝子の発現が、細菌をとりまく環境中に存在する鉄の濃度に関係なく制御されるように、弱毒化細菌の野生型ｆｕｒ遺伝子またはその同種遺伝子を改変することを含む。
【００１０】
上記文献によれば、弱毒化生ワクチンを産生しようとする過去の試みでは、交叉防御（cross protection）にとって重要な特定のタンパク質を、バルク培養中の生物が産生しなかった。これらのタンパク質には、鉄によって制御されるタンパク質が含まれており、その産生がｆｕｒ遺伝子によって調整される。さらに、一旦これらの細菌が宿主に投与されると、制限されたコロニー形成の間では、ワクチン株は、上記タンパク質を発現させるための時間または代謝資源を有していなかった。
【００１１】
ｆｕｒの発現が改変された弱毒化細菌株の作製は、一般的に用いられている技術である。したがって、ｆｕｒ遺伝子またはその同種遺伝子を有する病原菌を、当該病原菌が病原として働く宿主内における成長にとって不可欠な遺伝子を抑制または改変することによって弱毒化させ、上述したように、細菌の環境下に存在する鉄の濃度とは関係なく細菌がｆｕｒ遺伝子またはその同種遺伝子の産物を生成するように、上記弱毒化された病原菌を改変することができる。ｆｕｒ遺伝子の同種遺伝子は、例えば、E. coliやN. meningitidisなどの、他のｆｕｒ遺伝子の配列との比較によって同定され得る。好適には、これらの同種遺伝子は、他の周知のｆｕｒ遺伝子と実質的に同種（homologous）であり、少なくとも１００アミノ酸の長さにおいて６０〜７０％が同一（identity）である。したがって、転写因子をコードし、鉄の存在に対して反応性を有する遺伝子であれば、他の細菌において同定された遺伝子を使用してもよい。
【００１２】
また、本発明は、ワクチンに使用する細菌に安定性を与えるために、ｒｅｃＡ遺伝子およびｃｏｍＡ遺伝子における変異を提案している。これらの変異は、記載されている残りの改変の後に、最終的な遺伝子改変として導入される必要がある。
【００１３】
欧州特許出願２ ０５９ ５０３Ｔ３（発明の名称：パスツレラ症のワクチン“Vacuna contra la pasteurelosis”）は、パスツレラ遺伝子を有する細菌（特にPasteurella multocida）に対する症例について記載している。
【００１４】
上記文献によると、鉄が制限された条件下にてパスツレラ生体を培養する場合、鉄、外膜抽出物、または全細胞溶解液は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの通常条件下において得られるものとは異なるタンパク質プロフィールを形成する。この異なるタンパク質プロフィールは、通常の成長条件下において培養された同じ生体によって形成されたタンパク質プロフィールよりも免疫原性が高い。本発明は、ワクチンの調製を目的として、鉄が制限された条件下において培養された、「バクテリン」を含む不活性化パスツレラ全細胞溶解液を含む。
【００１５】
本発明は、ホモ血清型（homologous serotype）を使用したワクチン製剤について提案しているが、病理学的に重要な全てのパスツレラ血清型（Pasteurella serotypes）の、鉄によって制御されるタンパク質を含む多価ワクチンをも含む。したがって、上記特許文献は、鉄調節タンパク質、当該タンパク質のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、およびワクチン製剤に焦点を当てている。ワクチン製剤では、動物用ワクチン中にて、タンパク質材料が代表的なコアジュバント(coadjuvant)の何れかと混合される。上記文献では、使用するキレート試薬の濃度が高すぎると細菌の培養が阻害されることから、その濃度を慎重に制御する必要がある。
【００１６】
米国特許６，７９０，９５０ Ｂ２（発明の名称：抗菌ワクチン組成物）は、グラム陰性細菌の毒性の遺伝子を特定している（具体的には、Pasteurella multocidaに焦点を当てている）。この文献により、これらの毒性の遺伝子およびその産物に対する新たな抗菌剤（antibacterial agents）を特定することができる。
【００１７】
上記特許は、従来用いられてきた、血清に対して特異的な防御のみを提供する死菌（不活性化細菌）の全細胞を使用したワクチン組成物を作製する試みに関するものであるが、異なる血清の存在を鑑みると、ワクチン接種に関する問題を含む。発明者らは、不活性化されたＡｐｘＩＩ毒素を産生する弱毒化細菌ワクチンが交叉防御を示すと述べている。
【００１８】
不明確な自然突然変異を有する細菌株を含むワクチン製剤に関する問題を考慮して、上記文献の著者らは、弱毒化細菌の同定、および細菌の毒性に必須である、抗菌剤を特定するための方法の進歩に役立つ遺伝子の同定だけでなく、安全で、パスツレラ血清型に対する同種性の防御および異種性の防御を提供するワクチンとして使用できる弱毒化細菌の構築に焦点を当てている。したがって、上記文献は、特定の遺伝子配列中の機能突然変異（functional mutations）を含むグラム陰性細菌性生物（とりわけ、Pasteurella multocida）を提供する。この突然変異は、遺伝子によってコードされた産物の発現または生物活性を抑制または阻害し、この突然変異によって、細菌株の毒性が弱くなる。
【００１９】
細菌感染またはそれに伴う症状を予防するワクチンを構築するという観点から、突然変異を起こした弱毒化されたグラム陰性細菌、および、任意の薬学的に許容可能なアジュバントおよび／または賦形剤もしくは希釈剤を含む組成物について説明されている。
【００２０】
本発明者らは、本発明の改変された菌株が有効な製剤になるためには、感染症による臨床症状を抑えるには十分であって、しかも、宿主における細菌の複製および限定的な成長を可能にする程度に弱毒化を行う必要があると指摘している。
【００２１】
本発明は、弱毒化されたP. multocida株、（ヒトおよび動物に投与可能な）ワクチン、グラム陰性細菌の毒性に必要な遺伝子産物をコードしているポリヌクレオチド、感染したポリヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞、本発明に係るポリペプチドの生成方法、本発明の抗菌剤の投与による、グラム陰性細菌に感染した被験者の治療方法などを提供する。
【００２２】
しかし、本出願は、与えられた配列によってコードされたポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、および、当該ベクターによって形質転換された宿主細胞を請求している。本願に記載された弱毒化Pasteurella細菌は、弱毒化されて使用される。
【００２３】
本発明のｆｕｒ変異の目的は、細菌の毒性の低減を意図するものではないので、上記グループの変異には含まれない。米国特許６，７９０，９５０Ｂ２には、死菌の全細胞のワクチン接種によって異種性の防御を付与するのは難しいと記載されているが、本出願に係る発明は、その達成を目的としている。
【００２４】
ＷＯ９９／２９７２４Ａ２（発明の名称：Pasteurella multocidaの外膜タンパク質をコードするＤＮＡ）は、鳥類のPasteurella multocidaの膜タンパク質またはＯｍｐＨポリペプチド、および、生物活性サブユニットまたは変異体をコードする予め選択された核酸配列を含む、単離および精製された核酸分子を請求している。これを達成するために、（７３％は同一である）16 P. multocida血清型のＯｍｐＨｓの配列を決めて複製している。
【００２５】
上記特許文献は、単離されかつ精製された外膜Ｘ−７３ポリペプチドを介した、鶏の同種性の防御の研究を示している。また、上記発明に係る免疫原性組成物が、バクテリンと組み合わせて使用され得ることも記載されている。これらの免疫原性組成物は、有効量の単離精製されたP. multocida外膜ポリペプチド、サブユニット、ペプチド、変異体またはそれらの混合物、ならびに組成物を脊椎に投与した後でP. multocida外膜のポーリンに特異的な抗体の産生を促す薬学的に許容可能な賦形剤を含む。また、上記発明は、鶏のP. multocidaに特異的な抗体の存在を検出または測定する方法をも提供する。
【００２６】
非特許文献「深海の細菌Photobacterium sp. SS9における高圧信号伝達を追跡するレポータ遺伝子の使用」[Ellen Chi and Douglas H. Bartlett, (American Society for Microbiology, pp. 7533-7540 (1993))では、好圧菌であるPhotobacterium spl SS9の第一遺伝子システムが開発されている。上記システムを、静水圧の変化に応答するｏｍｐＨ遺伝子の発現を制御する調節機構の初期特性に使用することについて記載されている。
【００２７】
ｏｍｐＨ遺伝子と圧力との関係を研究するために、ompHLac Photobacterium spl株が得られる。また、１アトムの圧力条件下において選択された変異ｏｍｐＨ株が得られる。その結果、４つの変異体が得られる。そのうち３つの変異体は、発現について培地の圧力の影響を受けない。しかし、４つ目の変異体（ＥＣ１００２）は、圧力に対して極めて高い感受性をもつことが実証されている。したがって、ＥＣ１００２のような圧力に対して感受性がある変異体の特性を将来調べることにより、高圧へ適合するために必要な機能を同定する機会が得られるであろう。
【００２８】
上記非特許文献に記載された研究では、グラム陰性細菌のｏｍｐＨ変異体が作製されてはいるが、これらの変異体は上記細菌に対する免疫研究を目的としておらず、この特定の場合では、ｏｍｐＨ欠損変異体は、高圧における成長にとって重要な機能の特定を目的としている。
【００２９】
最後に、本願の著者らは、文献「Expression of the Pasteurella multocida ompHgene is negatively regulated by the Fur protein」[Montserrat Bosch, Raul Tarrago, Ma Elena Garrido, Susana Campoy, Antonio R. Fernandez de Henestrosa, Ana M. Perez de Rozas, Ignacio Badiola and Jordi Barbe; FEMS Microbiology Letters 203, 35-40 (2001)]において、P. multocidaにおける鉄の取り込みに関する機構および調整について研究している。P. multocidaのｆｕｒ変異体を構築することによって、（高い抗原性を有する）主要な構造膜タンパク質（main structural membrane protein）をコードするｏｍｐＨ遺伝子が、ｆｕｒタンパク質、鉄およびグルコースによって負に調節されることを実証した。同様に、野生型およびｆｕｒ欠損型のP. multocida細胞が、同レベルの毒性をもつことも実証された。
【００３０】
上記文献は、生成物、つまり、Ｆｅ２＋依存性のＤＮＡ結合活性を有する１７ＫＤａのタンパク質を介した、細菌の鉄の取り込みシステムにおけるｆｕｒ遺伝子の役割について説明している。ｆｕｒタンパク質は、正（positive）の調節因子または負（negative）の調節因子として機能し得る。
【００３１】
鉄が欠乏した条件下における培養により、毒性のP. multocida株によって起こる感染症に対する異種性の防御が誘発されることが周知であることを考慮して、著者らは、当該細菌のｆｕｒ欠損変異体を採取し単離して、特徴付けることを提案している。上記遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号AF027154として登録されている。
【００３２】
上記文献は、P. multocidaのｆｕｒ変異体のクローン化および作製について記載している。この目的のために、ｆｕｒ遺伝子の内部領域を含む自殺プラスミド（suicide plasmid）の単一の組み換え（simple recombination）によって、P. multocidaのｆｕｒ遺伝子を不活性化させる。Ｆｕｒ１プライマーおよびＦｕｒ２プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、ｆｕｒ遺伝子の１８−４１２ヌクレオチドを含む３９４塩基対の断片が得られる。この断片を自殺プラスミドｐＵＡ８２６にクローン化してプラスミドｐＵＡ８９１を作製し、プラスミドｐＵＡ８９１が、「トリペアレンタルメイティング（triparental mating）」によってP. multocidaに導入される。ストレプトマイシン抵抗性のトランス接合体が選択される。
【００３３】
本特許出願の目的である、二重変異体および三重変異体を得るための開始点として、ｆｕｒ遺伝子、増幅領域、使用するプライマー、およびプラスミドを不活性化する方法が用いられる。
【００３４】
上記文献において実施された研究は、（上述した３６ＫＤａであるポーリンをコードする）野生型のP. multocidaのｏｍｐＨ遺伝子の発現分析、およびｆｕｒ変異体における分析へと続いている。ｏｍｐＨの発現は、野生型の株よりもｆｕｒ変異体において多いことが観察されている。このことから、ｏｍｐＨの発現がｆｕｒによって負に調節されていることがわかる。上記文献では、ｆｕｒ変異体の毒性の研究も行っており、野生型のP. multocidaおよびｆｕｒ変異体の毒性は、同じレベルであると結論づけられている。
【００３５】
上記文献は、「バクテリン」を得ることを目的とした、P. multocidaによる感染症に対する防御を行う抗原としてｏｍｐＨタンパク質が機能することが実証された事実を鑑みて、グルコースがｏｍｐＨ遺伝子の発現に対して阻害作用を及ぼすことから、グルコースを除去した条件下において、使用する株を培養する必要があると結論付けている。
【００３６】
〔発明の要約〕
本発明の目的は、Pasteurella multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体から調製される外膜タンパク抽出物が毒性Pasteurella multocidaに対して完全な異種性の防御を行うことから、Pasteurella multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体を含むワクチンを生成するための材料および方法を提供することにある。
【００３７】
本発明は、熱によって不活性化されたP. multocidaのＦｕｒ ｏｍｐＨ変異体およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体の使用が、毒性のP. multocidaに対する６０％の交叉防御を付与することについても言及している。同様に、本発明は、超音波処理を用いて細胞を不活性化させた場合、熱処理のみの場合よりも高いレベルの防御が得られることも指摘している。
【００３８】
したがって、本発明の目的は、毒性のP. multocidaに対する防御のために免疫原として使用される二重変異体および三重変異体を含む組成物を提供することにある。
【００３９】
同様に、例えば家禽コレラだけでなく、豚、ウシおよび小動物の肺炎などのP. multocidaによる感染症に対するワクチンの提供も本発明の目的である。
【００４０】
さらに、本発明は、P. multocidaによって発病する危険がある動物に上記ワクチンを投与するためのキットを提供する。上記ワクチンは、ｆｕｒ、ｆｕｒ ｏｍｐＨ（二重変異体）、および／または、ｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ（三重変異体）が欠損したP. multocidaから得られる外膜タンパク質の抽出物と、投与に適したアジュバントを任意で含む薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む。
【００４１】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、Pasteurella multocidaのｆｕｒ変異体のＰＣＲ分析を示す。
【００４２】
図１Ａは、P. multocidaのｆｕｒ変異体の構成を示す。Ｆｕｒ３およびＡａｄ３は、Ｆｕｒ変異の存在を確認するために使用するプライマーの位置を示している。
【００４３】
図１Ｂは、Ａａｄ３プライマーおよびＦｕｒ３プライマーを用いてＰＣＲ分析を行った、野生型の菌株（ＰＭ１０１１（レーン２）、Ｆｕｒ変異体（ＰＭ １０９５）（レーン３）、およびＦｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン４）の染色体ＤＮＡを示している（表２）。対照であるＤＮＡを含まないＰＣＲを、レーン５に示している。ＨｉｎｆＩによって消化したファージΦＸ１７４のＤＮＡを、分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【００４４】
図２は、P. multocidaのｏｍｐＨ１遺伝子およびｏｍｐＨ２遺伝子の構造を示している。ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ１ｒｐ、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐおよびＲＴｏｍｐＨ２ｒｐは、転写解析に使用されるプライマーの位置を示している。
【００４５】
図２Ａは、ｐｍｐＨ１遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。
【００４６】
図２Ｂは、ｏｍｐＨ２遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。
【００４７】
図２Ｃは、想定されるｏｍｐＨ１−ｏｍｐＨ２オペロン遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。
【００４８】
図２Ｄは、野生型株（ＰＭ１０１１）（レーン２）およびｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン３）における遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。上記各菌株の全ＲＮＡ、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐとＲＴｏｍｐＨ１ｒｐとのプライマー対、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐとＲＴｏｍｐＨ２ｒｐとのプライマー対、および、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐとＲＴｏｍｐＨ２ｒｐとのプライマー対を使用した。野生型株のＤＮＡのＰＣＲ（レーン４）、および、ＲＮＡまたはＤＮＡを用いないネガティブな対照（レーン５）のＰＣＲについても示す。ＨｉｎｆＩによって消化されたファージΦＸ１７４のＤＮＡ(ＢおよびＣ)、およびＢｓｔＥＩＩによって消化されたファージλのＤＮＡ（Ｄ）を分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【００４９】
図３は、P. multocidaのｇａｌＥ変異体のＰＣＲ分析を示している。
【００５０】
図３Ａは、P. multocidaのｇａｌＥ変異体の構成を示している。ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐおよびｐＫＯ３−Ｒは、ｇａｌＥ変異体の存在を確認するために使用するプライマーの位置を示している。
【００５１】
図３Ｂは、ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐプライマーおよびｐＫＯ３−Ｒプライマーを用いたＰＣＲ分析を行った、野生型株（ＰＭ１０１１）（レーン２）、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン３）、およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体（ＰＭ１０９６）（レーン４）の染色体ＤＮＡを示している（表２）。ＤＮＡを用いない対照のＰＣＲを、レーン５に示す。ＢｓｔＥＩＩによって消化されたファージλのＤＮＡを分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【００５２】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、P. multocidaによる感染症に対する異種性の防御を促進することができるPasteurella multocida由来の変異体、およびワクチンにおけるその利用に関する。これらの変異体は、ｆｕｒ遺伝子に異常を有している。この変異体については、以前、本発明の発明者らと同一の著者らが説明しているが、ワクチンにおけるその利用については説明していない。P. multocidaのｆｕｒ変異体に加えて、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体などの二重変異体、および、ｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体などの三重変異体が得られる。これらをワクチンに加えることによって、P. multocidaによる感染症に対する異種性の防御を実現する。
【００５３】
殆ど全ての生細胞にとって、鉄は必須の元素である。Haemophilus influenzaeやNeisseria meningitidisなどの多くのグラム陰性の病原菌は、当該病原菌の外膜に、宿主生物の粘膜に存在する、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、ヘミン、フェリチンなどの鉄結合性分子に結合するタンパク質を有している（Ratledge, C. and L.G. Dover. Annu. Rev. Microbiol. 54: 881-941. 2000）。これらの外膜タンパク質の略全ての発現は、Ｆｕｒ（鉄取り込み調節）タンパク質によって制御されている（Stojiljkovic, I., et al. A.J. Baumler and K. Hantke. J. Mol. Biol. 236: 531-545. J. Mol. Biol. 240: 271. 1994）。Ｆｕｒタンパク質は、細菌の細胞質に存在する鉄に結合する。この反応において、Ｆｕｒタンパク質は、Ｆｅ（ＩＩ）と複合体を形成する。次いで、当該複合体は、鉄調節遺伝子のプロモータ領域において、「ｆｕｒ ｂｏｘ」（２，１２，１４）として知られる特定のＤＮＡ配列に結合し、その結果、それらの転写を阻害する。鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）の多くは、強力な抗原であり、病原体の感染過程における毒性にとって、必須の因子である（Ratledge, C., and L.G. Dover. Annu. Rev. Microbiol. 54: 881-941. 2000）。このことから、上記鉄によって制御される外膜タンパク質は、精製された受容体に基づくワクチン（Chibber, S., and S.B. Bhardwaj J. Med. Microbiol. 53: 705-706. 2004）、または抗ＩＲＯＭＰ抵血清を用いたワクチン（Sood, S., P. Rishi, V. Dahwan, S. Sharma, and N.K. Ganguly. Mol. Cell. Biochem. 273:69-78. 2005）の候補として提案されてきた。
【００５４】
Pasteurella multocidaは、家禽コレラや、ウシの肺炎、出血性敗血症、および豚や家畜の萎縮性鼻炎などの様々な感染症を引き起こす病原菌である。獣医学では、P. multocidaのワクチン接種は、主に、「バクテリン」として知られる不活性されたP. multocida細胞の使用に基づくか、または弱毒化された生細菌の使用に基づいている。しかしながら、バクテリンは同種性の防御しか与えず、一方、生ワクチンは、同種性の防御および異種性の防御を付与するが、不明確な弱毒マーカーを含んでおり、場合によっては、集団感染を招くこともあった。鉄を除去せずに成長させたP. multocidaの外膜タンパク質を用いることによって、異種性の防御を得た（Basagoudanavar, S.H., D.K. Singh and B.C. Varshney. J. Vet. Med. 53: 524-530. 2006）。さらに、最近、ワクチン候補となり得る明確に定義された複数の弱毒化された生株が記載されている（１０，１７）。
【００５５】
鉄が欠乏した培地にて成長したP. multocidaから得られるバクテリンによる交叉防御（Glisson, J.R., M.D. Contreras, I.H. Cheng, and C. Wang. Avian. Dis. 37:1074-1079. 1993）、および外膜タンパク質の抽出物による交叉防御（Adler B. et al. J. Biotechnol., Vol. 44, pp. 139-144. 1996; Ruffolo, C.G., et al. B.H. Jose, and B. Adler. Vet. Microbiol. 59:123-137. 1998）は、公知である。この異種性の防御は、培地における鉄の欠乏、ひいては細胞内における鉄の欠乏によって誘発される、P. multocidaの鉄によって制御される外膜タンパク質の過剰発現に基づくと考えられる。２，２’−ジピリジル（ＤＰＤ）などの二価陽イオンに対するキレート剤の存在下では、細菌の成長率が極めて低いということから、上記手法には限界がある。この限界は、大量のワクチンを得ることにとって、大きな限界である。
【００５６】
２つのヘモグロビン結合性受容体はP. multocidaにおいて最初に見出され（Bosch, M. et al., M.E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas. I. Badiola, and J. Barbe. Infect. Immun. 70: 5955-5964. 2002; Cox, A.J., M.L. Hunt, J.D. Boyce, and B. Adler. Microb. Pathog. 34: 287-296, 2003）、次に、上記細菌が、免疫原性をもつ少なくとも６つのヘミンおよび／またはヘモグロビン結合性タンパク質を有することが実証された（Bosch, M. et al., M.E. Garrido, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, J. Barbe, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 99: 103-112. 2004）。しかしながら、それらを別々にワクチン接種した場合には、その何れも異種攻撃（heterologous attack）に対する防御を行わない（Bosch, M., M.E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. Infect. Immun. 70: 5955-5964. 2002; Bosch, M., M.E. Garrido, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, J. Barbe, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 99: 103-112. 2004; B. Adler, personal communication）。
【００５７】
本発明の発明者らは、近年のP. multocidaにおけるｆｕｒ遺伝子の単離により、上記細菌種のｆｕｒ変異体を作製することに成功した（Bosch, M., R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernandez de Henestrosa, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol. Lett. 203:35-40. 2001）。Ｆｕｒが多くの細菌の鉄取り込みタンパク質を制御することを鑑みて、本発明の発明者らはP. multocidaのｆｕｒ細胞による異種性の防御について研究してきた。
【００５８】
P. multocidaのｆｕｒ変異体における、鉄によって制御される外膜タンパク質の過剰発現が、鉄が欠乏した培地中で成長する野生型のP. multocida細胞と同じであることから、ｆｕｒ変異体を用いる手法は、鉄キレート剤が存在する培養液中における細菌の低い成長性に関する問題を解決し、これらの条件下において細胞が示す低成長性を抑制する。
【００５９】
鉄によって制御される外膜タンパク質に基づくワクチンの開発、特に複数の異なる鉄受容体を有する病原菌（例えば、P. multocida）に対するワクチンの開発は、その用途の中でもとりわけ顕著である。
【００６０】
ｆｕｒ遺伝子に欠損を有するP. multocida変異体を本発明の結果として記載している。ｆｕｒ遺伝子は、細菌中で、鉄によって調節される多くのタンパク質の発現を制御している。したがって、P. multocidaのｆｕｒ変異体における鉄によって制御される外膜タンパク質の過剰発現は、鉄が欠乏した培地において野生型のP. multocidaを成長させて生じる過剰発現と同じである。
【００６１】
ｆｕｒ変異体に加えて、ｏｍｐＨタンパク質（高い免疫原性を有する）を発現しないｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体、ならびに、ｆｕｒおよびｏｍｐＨの欠損に加えてｇａｌＥの欠損をも有するｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体についても記載されている。
【００６２】
本発明に係る変異体に加えて、対応する変異体を作製するためのオリゴ、当該オリゴを内包するプラスミド、および変異体から作製されるワクチンについても記載されている。ワクチンは、熱によって不活性化された、または超音波処理によって不活性化された変異細菌（上述した変異体を含む）、または、P. multocidaの変異体が発現する上記鉄によって制御される外膜タンパク質に基づいていてもよい。
【００６３】
したがって、本願は下記について説明している。
【００６４】
ａ）変異が生じたP. multocidaのｆｕｒ遺伝子。この変異では、１８番目〜４１２番目である、３９４塩基対のｆｕｒ遺伝子の内部領域の断片を含むプラスミドを細菌内へ導入することによって、ｆｕｒ遺伝子が分断される。
【００６５】
ｂ）Ｆｕｒ１プライマー、Ｆｕｒ２プライマーおよびＦｕｒ３プライマー。Ｆｕｒ１プライマーおよびＦｕｒ２プライマーを用いたＰＣＲによって、P. multocidaのｆｕｒ遺伝子の３９４塩基対の内部断片をクローニングすることができ、次に、当該内部断片をプラスミドに挿入する。Ｆｕｒ３プライマーを用いて、P. multocidaからクローニングされた３９４塩基対の断片を含むプラスミドがP. multocidaに挿入されることによって野生型遺伝子が阻害されたことを確認することができる。
【００６６】
Ｆｕｒ１、Ｆｕｒ２およびＦｕｒ３のオリゴの配列を表２に示す。
【００６７】
ｃ）自殺プラスミドｐＵＡ８２６を介して得られるとともに、P. multocidaのｆｕｒ遺伝子の３９４塩基対の断片をクローニングすることができる、ストレプトマイシン抵抗性遺伝子を内包するプラスミドｐＵＡ８９１。このプラスミドを、トリペアレンタルメイティング（triparental mating）によってP. multocidaに導入し、次に、ｆｕｒ変異体の候補を選択して単離する。
【００６８】
ｄ）ｏｍｐＨ１およびｏｍｐＨ２遺伝子におけるナンセンス変異。P. multocidaでは、１５４塩基対にて分離されるｏｍｐＨ遺伝子の２つのコピーが存在し、それらが個々に転写されることを鑑みて、２つの変異体を説明する。
【００６９】
ｏｍｐＨ１における変異は、グルタミンコドンの代わりに終止コドンを生じさせる、７６位のナンセンス変異であり、２４アミノ酸を有する短縮されたタンパク質（truncated protein）を発現させる。ＯｍｐＨ２における変異は、６７０位のナンセンス変異を含む複数のヌクレオチドの変化を伴い、６７０位のナンセンス変異は、天然タンパク質が有する３５０アミノ酸の代わりに２２３アミノ酸を有する短縮されたタンパク質を生じさせる。ｏｍｐＨ１およびｏｍｐＨ２におけるナンセンス変異によってもたらされる効果は、３５ＫＤａのＯＭＰタンパク質が発現しないことである。
【００７０】
ｅ）ＯｍｐＨ１ｓｅｑｕｐ、ＯｍｐＨ２ｓｅｑｄｗ、Ｏｍｐ２１０００、Ｏｍｐ２２０００、ｏｍｐＨ１−２ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ１ｒｐ、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐおよびＲＴｏｍｐＨ２ｄｗプライマー。
【００７１】
ＯｍｐＨ１ｓｅｑｕｐプライマーおよびＯｍｐＨ２ｓｅｑｄｗプライマーは、次のベクターへのクローニングのためにP. multocidaのｏｍｐＨ１遺伝子およびｏｍｐＨ２遺伝子（ompH1遺伝子の受託番号: EF102481、およびompH2遺伝子の受託番号: EF102482, GenBank）を含むバンド（bands）を増幅させる。P. multocidaのｏｍｐＨ１遺伝子およびｏｍｐＨ２遺伝子の配列を解析するために、Ｏｍｐ２１０００およびＯｍｐ２２０００を使用する。P. multocidaのｏｍｐＨ１の配列を解析するために、ＯｍｐＨ１−２ｕｐを使用する。そして、P. multocidaにおけるｏｍｐＨ遺伝子（ＯｍｐＨ１およびＯｍｐＨ２）の転写物を解析するために、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ１ｒｐ、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ２ｄｗを使用する。上記オリゴの配列を表２に示す。
【００７２】
ｆ）プライマーを用いてクローン化されたP. multocidaの断片が組み込まれ、P. multocidaへ挿入されることによってP. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体を生じさせるベクター。
【００７３】
ｇ）ＧａｌＥｉｎｔｕｐ、ＧａｌＥｉｎｔｒｐ、ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐおよびｐＫＯ３−Ｒプライマー：ＧａｌＥｉｎｔｕｐおよびＧａｌＥｉｎｔｒｐプライマーは、P. multocidaのｇａｌＥ遺伝子の４９５ｂｐの内部断片を得るために使用されるプライマーであり、ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐは、P. multocidaのｇａｌＥ遺伝子の分断を確認するために使用される順方向プライマーであり、ｐＫＯ３−Ｒは、プラスミドｐＵＡ８９１（４９５ｂｐ断片がクローン化されたプラスミド）がP. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨへ挿入されてP. multocidaのｇａｌＥ遺伝子が分断されたことを確認するためのプライマーである。これらのプライマーの配列を表２に示す。
【００７４】
ｈ）P. multocidaの変異体：これらの細菌は、本来の遺伝子に欠陥をもつ。P. multocidaのｆｕｒ変異体は、ｆｕｒ遺伝子に欠損を有し、ｆｕｒ−Ｆｅ（ＩＩ）複合体の形成を妨げ、鉄によって制御される遺伝子の転写の阻害を起こさせない。これらの変異体、またはこれらの変異体が発現する鉄によって制御される外膜タンパク質を用いて、毒性のP. multocidaに対する異種性の防御を付与することができるP. multocidaワクチンを製造することができる。鉄が欠乏した培地における培養を必要としないので、細菌の培養においてより高い収量が達成される（細菌の成長率は、キレート剤の存在下においては極めて低い）。P. multocidaのｆｕｒ遺伝子の３９４塩基対の断片を組み込むプラスミドを挿入することによって得られる変異体を単離した後で、P. multocidaのｆｕｒ細菌を得る。上記変異体については既に説明されている（Bosch, M., R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernandez de Henestrosa, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol. Lett. 203:35-40. 2001）。
【００７５】
本発明の他の目的は、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体である。上記細菌は、ｆｕｒおよびｏｍｐＨ遺伝子に欠損を有する。したがって、これらの細菌では、ｏｍｐＨ１およびｏｍｐＨ２が発現しない。このことは、上記変異体をワクチンに使用する上で、ｆｕｒ変異体よりも高い防御がもたらされることを意味している（これは、ｏｍｐＨが高い免疫原性をもつ３６ＫｄａのＯｍｐＨタンパク質をコードするからという予期せぬ結果である）。
【００７６】
最後に、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体をも得た。ｇａｌＥを変異させる目的は、P. multocidaに対する防御を高めるために、P. multocida のｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体における鉄によって制御される外膜タンパク質の表面への露出を最適化することにある。このことを達成するために、ｇａｌＥの４９５塩基対の断片を増幅させるのに使用されるプライマーの配列を提供し、次に、ｇａｌＥの４９５塩基対の断片がプラスミドｐＵＡ１０８９にクローン化される。トリペアレンタルメイティングを用いて、上記プラスミドをP. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ ＰＭ１０９４変異体に導入し、次に、三重変異体を選択する。それでもなお、マウスの生体内にて実施したこれらのワクチンの効果についての実験では、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体による防御と同じレベルの防御が示されている。
【００７７】
ｉ）毒性のP. multocidaに感染しやすい動物に異種性の防御を付与することを目的としたワクチンの調製における、原則として抽出物の形態である、不活性化されたP. multocidaのｆｕｒ変異体細菌、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体細菌、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体細菌、および／または、その鉄によって制御される外膜タンパク質の使用。上記不活性化は、熱処理、または超音波処理によるものである。
【００７８】
ｊ）熱処理または超音波処理によって不活性化されたP. multocidaのｆｕｒ変異体細菌、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体細菌、またはｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体細菌、および／または、これら変異体の鉄によって制御される外膜タンパク質の抽出物を含み、１つ以上のアジュバントおよび／または１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含むワクチン。ワクチンを得るという本発明の用途は、本発明の産業上の利用要件を満たす。
【００７９】
マウスを用いて、本願に係る二重変異体および三重変異体を用いたP. multocidaに対する防御の研究を行った。しかし、発症する豚および牛の肺炎、ウサギやハムスターなどの小動物の家禽コレラ、および肺炎など、P. multocidaにより発症するあらゆる病気を制御するために上記ワクチンを用いることができる。
【００８０】
ワクチンを製剤するために、P. multocidaのｆｕｒ ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体またはｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体を、リポ多糖体や、完全フロインドアジュバントまたは不完全フロインドアジュバント、モノホスホリピッドＡなどのモノホスホリピッド、硫酸、リン酸アルミニウムなどのリン酸塩、水酸化アルミニウムヒドロキシリン酸や水酸化アルミニウムなどの水酸化物、などの上記タイプの家畜ワクチンにおける代表的なコアジュバントのいずれかと混合してもよい。
【００８１】
ワクチンの用量は、抗原成分の濃度によって異なる。活性物質の濃度は、通常、賦形剤および任意に０．７％水酸化アルミニウムなどのアジュバント１ｍｌの溶液中において７×ｌ０８〜ｌ×ｌ０９ｃｆｕ／ｍｌであるが、例えば、不活性化された細胞に基づくワクチンであれば、用量は０．１ｍｌであり、賦形剤として用いる１ｍｌの生理食塩水中において１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度のｆｕｒ変異体、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体またはｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体を用いる。活性物質の濃度は、通常、賦形剤および任意に０．７％水酸化アルミニウムなどのアジュバントの１ｍｌ溶液中において１００〜４００μｇであるが、外膜タンパクの抽出物に基づくワクチンであれば、用量は０．１ｍｌであり、１ｍｌの生理食塩水において４００μｇの濃度の抽出物を使用する。
【００８２】
【表１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
【００８５】
【表３】
【００８６】
【表４】
【００８７】
〔材料および方法〕
〔細菌株および成長条件〕
使用した細菌株の一覧を表１に示す。全てのP. multocida株を液体培地、緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）またはＢＨＩ、ＳＢＡ寒天プレートにて培養した。必要に応じて、上記濃縮液に抗菌剤を加えた（Cardenas, M. et al. A.R. Fernandez de Henestrosa, S. Campoy, A.M. Perez de Rozas, J. Barbe, I. Badiola, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 80:53-61. 2001）。野生型株の培養では、使用した二価陽イオンキレート剤、２−２’−ジピリジルＤＰＤ（シグマ）の濃度は１５０μＭであった（表３）。
【００８８】
〔遺伝子法〕
プラスミドｐＵＡ８９１から、P. multocidaのｆｕｒ変異体を得た（図１Ａ）。このプラスミドは、３９４ｂｐのPasteurella multocidaのｆｕｒ遺伝子の内部断片とともに、ｐＵＡ８２６遺伝子の内部断片を挿入した結果得られる（Bosch, M., R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernandez de Henestrosa, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol. Lett. 203: 35-40. 2001）。ｐＵＡ８２６は、ｐＧＹ２（２６−）に由来する。ｐＧＹ２（２６−）から、ＳａｌＩ制限酵素によってｃａｔ遺伝子が抽出された。プラスミドｐＧＹ２は、Ｒ６Ｋの複製起点を有している。Ｒ６Ｋの複製はλpirタンパク質に依存しているので、プラスミドｐＧＹ２は、Pasteurella multocidaにおいて自己不活性化（suicidal）しているとともに、ＲＰ４のｍｏｂ可動化領域（mobilization region）、並びに、アンピシリン（ｂｌａ）、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン（ａａｄＡ）およびクロラムフェニコール（ｃａｔ）に対する抵抗性を付与する遺伝子を含む。後者の遺伝子は、すでに述べたように、ｐＵＡ８２６およびｐＵＡ８９１には存在しない。
【００８９】
ｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体を作製するために、プラスミドｐＵＡ１０９０（図３Ａ）を使用した。このプラスミドは、プラスミドｐＵＡ１０８９（ｐＵＡ８２６のｍｏｂサイトを有するｐＫＯ３）内にPasteurella multocidaのｇａｌＥ遺伝子の４９５ｂｐの内部断片を挿入することによって得られる。トリペアレンタルメイティングによって、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体にプラスミドｐＵＡ１０９０を導入した。選択培地において、トランス接合体を選択した。
【００９０】
ｆｕｒ変異の安定性を測定するために、抗菌剤を加えずに、ＳＢＡ培地において２０回連続してｆｕｒ変異体を二次培養した。ストレプトマイシン有り、および無しのＳＢＡ培地において、適した希釈の細胞縣濁液（１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を用いて、５、１５および２０継代における生菌の濃度を測定した。というのも、ｐＵＡ８９１が、上記抗菌剤に対する抵抗性を示す遺伝子をコードするからである。抗菌剤を加えた培地にて得られたコロニーの数と、抗菌剤を含まない培地にて得られたコロニーの数とを比較して、安定率を算出した。
【００９１】
ｆｕｒ変異は、選択圧がない２０継代後の細胞においても１００％の安定性をもって維持されることがわかった。
【００９２】
〔生化学的方法、ＤＮＡおよびＲＮＡ技術〕
上述したように、コンピュータを用いて、配列を分析した（8- Cardenas, M., A.R. Fernandez de Henestrosa, S. Campoy, A.M. Perez de Rozas, J. Barbo, I. Badiola, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 80: 53-61. 2001）。使用したプライマーを表２に示す。ＡＬＦシーケンサー（Pharmacia Biotech）においてジデオキシ法を実施し、ヌクレオチド配列を測定した。上述したように、ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した（Bosch, M., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol Lett. 210: 201-208. 2002）。上述したように、P. multocidaの外膜タンパク質の抽出物を得て、分析した（Bosch, M., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol Lett. 210: 201-208. 2002）。上述したように、タンパク質の濃度を測定した（Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr, and R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275. 1951）。
【００９３】
〔P. multocidaに対する防御の研究〕
生後３週間のメスのスイスマウス（Harlan Iberica; Barcelona, Spain）５匹の群に、腹腔内注射によって１０または４０μｇ／匹の外膜タンパク質（ＯＭＰ）の抽出物を注入した。異なる培養条件下にて培養した、異なるP. multocida株から抽出物を調製した。全ての場合において、投与した抽出物の量は、１００μlであった。この１００μlを、２週間の間隔を空けて２服にわけて投与した。対照マウスには１００μlの生理食塩水を投与した。３週間後、０．１ｍｌの毒性のP. multocida株（ＰＭ１００２）を腹腔内投与することによって、異種抗原投与（heterologous challenge）を行った。この毒性のP. multocida株(PM1002)は、１００または５００倍のLD50を含んでいた。
【００９４】
熱処理または超音波処理によって不活性化されたP. multocida PM1094株（ｆｕｒおよびｏｍｐＨにおける欠損）およびPM1096株(ｆｕｒ、ｏｍｐＨおよびｇａｌＥにおける欠損)によって与えられた防御を試験するために、同じ方法論を使用した。３０℃の温度下のＢＦｎにおいて７×１０８ｃｆｕ／ｍｌの密度にまで予め培養した培養液を４５℃にて一晩培養することによって、熱による不活性化を行った。超音波処理によって不活性化させた細胞は、７×１０８ｃｆｕ／ｍｌの細胞を超音波処理することによって調製し、ＢＰＷに再縣濁させて、−４０℃の氷浴を用いて５分間ずつ５回処置し、収率８０％を得た。ＳＢＡプレート上で、生菌が存在しないことを試験した。全ての場合において、投与された不活性化された細胞の抽出物の量は１００μｌであり、２週間の間隔を空けて２回投与した。上述したように、ネガティブな対照試験および異種抗原投与を行った。
【００９５】
〔結果：P. multocida変異体の構築〕
Ｆｕｒ１プライマーおよびＦｕｒ２プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、P. multocidaのｆｕｒ遺伝子の３９４−ｂｐの内部断片を得た（表２）。得られた断片を自殺プラスミドｐＵＡ８２６にクローン化し、プラスミドｐＵＡ８９１を得た（図１Ａ）。
【００９６】
トリペアレンタルメイティングによってP. multocidaにプラスミドｐＵＡ８９１を導入した後で、適した選択培地にて細菌を生育させ、複数のｆｕｒ変異体の候補を単離した。ＰＣＲ技術による染色体ＤＮＡの分析によって、プラスミドｐＵＡ８９１の挿入による野生型ｆｕｒ遺伝子の分断が確認された（図１B）。
【００９７】
図１Ｂは、Ａａｄ３プライマーおよびＦｕｒ３プライマーを用いてＰＣＲ分析にかけられた、野生型株（ＰＭ１０１１）（レーン２）、ｆｕｒ変異体（ＰＭ１０９５）（レーン３）およびｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン４）の染色体ＤＮＡを示している。ＤＮＡを用いない対照ＰＣＲを、レーン５に示す。ＨｉｎｆＩによって消化されたファージΦＸ１７４のＤＮＡを、分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【００９８】
同様に、幾つかのｆｕｒ変異体の外膜画分（outer-membrane fractions）の電気泳動像を分析して、既に記載したように（４）、ｆｕｒ変異によって、鉄によって制御される大きな分子量の外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）の誘導が生じることを確認した。２つの異なるｆｕｒ変異体のプロフィールが得られた。驚くべきことに、第一の変異体は、P. multocidaの３６−Ｋｄａの主要な外膜タンパク質（ＯＭＰ）、ＯｍｐΗを発現させ、第二の変異体は発現させなかった。
【００９９】
P. multocidaの全ゲノム塩基配列において、ＯｍｐΗｌタンパク質およびＯｍｐΗ２タンパク質をコードする、Ｐｍ７０（２１）、（１５４ｂｐによって単離された）ｏｍｐＨ遺伝子の２つのコピーが同定された。ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４株）において見られる表現型に関連する変異を決定するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施し、ｏｍｐＨ遺伝子が転写されたか否かを測定した。その結果、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体のｏｍｐＨｌおよびｏｍｐＨ２が個別に転写されたことが実証された。しかしながら、これらの遺伝子（GenBank 受託番号EF102481およびEF102482）のＤＮＡ配列は、ＰＭ１０１１およびＰｍ７０株における対応する配列とは大きく異なることが明らかになった。ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体のｏｍｐＨ遺伝子では、７６位にナンセンス変異が見出され、グルタミンをコードするかわりに終止コドンが生じていた。これにより、２４アミノ酸を有する極めて短い短縮タンパク質が生じる。同様に、この変異体のｏｍｐＨ２の配列は、３５０アミノ酸の代わりに２２３アミノ酸を有する短縮タンパク質を発生させる、６７０位のナンセンス変異を含む多くのヌクレオチド変化を有していた。これらの結果は、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体では３６−Ｋｄａの主要な外膜タンパク質（ＯＭＰ）が無い原因が、ｏｍｐＨ１およびｏｍｐＨ２におけるナンセンス変異であることを明確に示している。図２は、P. multocidaのｏｍｐＨ１遺伝子およびｏｍｐＨ２遺伝子の構造を示している。ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ１ｒｐ、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐおよびＲＴｏｍｐＨ２ｒｐは、転写解析に使用するプライマーの位置を示す（Ａ）。図２（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、野生型株（ＰＭ１０１１）（レーン２）およびｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン３）におけるｏｍｐＨ１、ｏｍｐＨ２遺伝子の転写、および想定されるｏｍｐＨ１−ｏｍｐＨ１オペロンの転写のＲＴ−ＰＣＲによる分析を示している。上記各株の全ＲＮＡ、および、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐとＲＴｏｍｐＨ１ｒｐとのプライマー対、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐとＲＴｏｍｐＨ２ｒｐとのプライマー対、または、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐとＲＴｏｍｐＨ２ｒｐとのプライマー対を、各々使用した。野生型株のＤＮＡのＰＣＲ（レーン４）、およびＲＮＡまたはＤＮＡを用いないネガチティブ対照のＰＣＲ（レーン５）についても示している。ＨｉｎｆＩによって消化されたファージΦＸ１７４のＤＮＡ(ＢおよびＣ)、およびＢｓｔＥＩＩによって消化されたファージλのＤＮＡ（Ｄ）を、分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【０１００】
〔P. multocida fur変異体による防御の研究〕
P. multocidaのｆｕｒ変異体の推定される防御効果を分析するために、ＤＰＤの非存在下または存在下にて培養した野生型のP. multocida ＰＭ１０１１株、ｆｕｒ変異体およびｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体から調製された外膜タンパク質（ＯＭＰ）の抽出物を１０μｇ／匹および４０μｇ／匹にて、５匹のマウス群に免疫した。そして、用量５００ＸＬＤ５０の毒性ＰＭ１００２株（ＬＤ５０＝３ｃｆｕ／匹）によって、マウスに異種抗原投与を行った。ＤＰＤ欠乏下において培養された野生型の細胞から得られた外膜タンパク質（ＯＭＰ）の抽出物を免疫した全てのマウスが、抗原投与の２日後に死んだ（表３）。しかし、鉄が欠乏した培地にて培養された野生型株由来の外膜タンパク質（ＯＭＰ）の抽出物４０μｇを免疫したマウス、およびｆｕｒ変異体を免疫したマウスは、２０％の防御を示した（表３）。抽出物におけるP. multocida主要な外膜タンパク質（ＯＭＰ）が無いことにより、完全防御（complete protection）が飛躍的に達成された（表３）。
【０１０１】
最も高い防御を示したのは、ｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体から調製された外膜タンパク質（ＯＭＰ）の抽出物であったことから、以下の実験は、当該株を熱によって不活性化させた細胞による防御の分析に焦点を当てて行った。熱によって不活性化された、用量７×１０７ｃｆｕ／ｍｌのｆｕｒ ｏｍｐＨ細胞を投与されたマウスを、続いて、用量ｌ００ＸＬＤ５０のＰＭ１００２株を用いて異種抗原投与した。これらのマウスの防御率は６０％であった（表４）。これらの結果は、一度熱によって不活性化したP. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ細胞を用いて、異種性の防御を付与するワクチンを作製することができることを示している。
【０１０２】
〔P. multocida株の防御能におけるｇａｌＥ変異の効果〕
鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）の表面への露出の最適化が、不活性化されたｆｕｒ ｏｍｐＨ細胞から得られる防御を高めるか否かを測定するために、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体のリポ多糖体（ＬＰＳ）に変異を導入して、派生株を作製した。ｇａｌＥ遺伝子の産物は、ＵＤＰ−ガラクトースのＵＤＰ−グルコースへのエピ化を触媒するものであって、リポ多糖体の中心の正確な合成に必要である。このために、グルコースの存在下において培養できるが、野生型の細胞の表面ＬＰＳを合成することができないｇａｌＥ変異体を作製した。ＧａｌＥｉｎｔｕｐオリゴヌクレオチドおよびＧａｌＥｉｎｔｒｐオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅によって、４９５ｂｐのｇａｌＥ遺伝子の内部断片を得た。この断片をｐＵＡ１０８９にクローン化し、その結果生じたプラスミドを、トリペアレンタルメイティングによってｆｕｒ ｏｍｐＨ株（ＰＭ１０９４）に導入した。適した選択培地によって培養した後で、複数のｇａｌＥ変異体を得た。
【０１０３】
図３は、P. multocidaのｇａｌＥ変異体のＰＣＲ分析を示す。図３（Ａ）は、P. multocidaのｇａｌＥ変異体の構築を示す。ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐおよびｐＫＯ３−Ｒは、ｇａｌＥ変異の存在を確認するために使用するプライマーの位置を示し、図３（Ｂ）は、ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐおよびｐＫＯ３−Ｒプライマーを用いたＰＣＲ分析にかけられた野生型株（ＰＭ１０１１）（レーン２）、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン３）およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体（ＰＭ１０９６）（レーン４）の染色体ＤＮＡを示している（表２）。ＤＮＡを用いない対照のＰＣＲを、レーン５に示す。ＢｓｔＥＩＩによって消化されたファージλのＤＮＡを、分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【０１０４】
トランス接合体の４つの染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析によって、ｐＵＡ１０９０の挿入が野生型ｇａｌＥ遺伝子を分断することが確認された。そして、これらのクローンのうちの１つ、つまりＰＭ１０９６（図３）が、次の試験のために選択され、その外膜タンパク質プロフィールの分析により、ＰＭ１０９６が前駆株（progenitor strain）と同じプロフィールを有することが確認された。
【０１０５】
５匹のマウス群に、熱によって不活性化（４５℃にて１２時間）されたｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ細胞を７×１０７ｃｆｕ／匹投与し、次に、用量１００および５００ｘＬＤ５ＯのＰＭ１００２の異種抗原投与を行った。表４から明らかなように、熱によって不活性化された株によって免疫された動物が、最小用量にて６０％の防御率を示した。つまり、細菌細胞がより短い細胞表面ＬＰＳを発現させたとしても、それが鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）によって媒介される防御を高めることはなかった。というのも、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体は、上記熱によって不活性化された変異体のいずれかの株によって免疫されたマウスにおいて、同じレベルの防御を生じさせたからである。
【０１０６】
さらに、超音波処理による細胞の分断に基づいた別の不活性化方法についても試験した。超音波処理によって不活性化されたｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ細胞によって免疫されたマウスは、最高用量（５００ｘＬＤ５０）の病原菌に対して６０％の防御を示した（表Ａ）。これらの結果は、上記方法による細胞の不活性化が、熱処理よりも強い免疫反応を生じさせることを示している。したがって、超音波処理によって不活性化させる方法は、P. multocidaによる感染症に対するワクチンの開発により適していると言える。
【０１０７】
最後に、新たに提示された結果は、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体の鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）は免疫原性を有し、異種性の防御を付与するものであることを示している。したがって、上記結果は、特にP. multocidaのように複数の異なる鉄受容体を有する病原体に対して、鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）に基づくワクチンの開発にｆｕｒ変異体を用いることができることを示している。さらに、ｆｕｒ変異体を用いる方法は、二価陽イオンキレート剤の存在下において細菌性細胞が示す低い成長率などの、他の方法において見られる問題を解決する。
【０１０８】
〔非特許文献〕
1. Adler B., R. Chancellor, P. Homchampa, M. Hunt, C. Ruffolo, R. Strugnell, and D. Wapling. 1996. Immunity and vaccine development in Pasteurella multocida infections. J. Biotechnol. 44:139-144.
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、Pasteurella multocidaのｆｕｒ変異体のＰＣＲ分析を示している。
【図２】図２は、P. multocidaのｏｍｐＨ１遺伝子およびｏｍｐＨ２遺伝子の構造を示している。
【図３】図３は、P. multocidaのｇａｌＥ変異体のＰＣＲ分析を示している。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、毒性のP. multocidaによる感染症に対する異種性の防御(heterologous protection)を実現できるPasteurella multocidaの変異体に関する。これらの変異体は、ｆｕｒ ｏｍｐＨ遺伝子およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ遺伝子に欠損を有する。本発明は、P. multocidaから得られる、ｆｕｒとｏｍｐＨとの二重変異体およびｆｕｒとｏｍｐＨとｇａｌＥとの三重変異体、または、これらの変異体から得られる鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）の抽出物と、賦形剤と、および／または、薬学的に許容可能なアジュバントと、を含む、パスツレラ属細菌（特に、Pasteurella multocida）に対するワクチン組成物に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
世界的に、動物およびヒト（特に子供）が罹る病気の主な原因は、細菌の感染である。パスツレラ属細菌は病原菌であり、現在、Pasteurella multocidaを含む２０の種が存在している。Pasteurella multocidaは、豚やその他の家畜において、家禽コレラ、ウシの肺炎、出血性敗血症、萎縮性鼻炎などの様々な感染症を引き起こす病原菌であり、この感染症の制御は、上記家畜を飼育する畜産農家にとって極めて重要である。
【０００３】
それ故に、家畜を感染症から守るワクチンを開発する必要がある。ワクチンを開発する目的は、できる限り長期間に渡る十分な防御を提供することにある。
【０００４】
従来から、大別して３つのタイプのワクチンが開発されてきた。
ａ）生きた病原菌の毒性を生育にとって低減、除去、または無毒化して生成する「弱毒化生ワクチン（live attenuated vaccines）」、
ｂ）病原菌の精製された成分を使用するワクチン、
ｃ）死んだ病原菌を直接使用する「死菌ワクチン（killed vaccines）」、
これらの３種類のワクチンは、それぞれ利点および欠点をもつ。弱毒化生ワクチンは、自然の疾病と同様の条件下において防御を生み出す。しかし、ｂ）およびｃ）のタイプのワクチンの方が、安全性の観点からは好ましい。
【０００５】
獣医学では、主にP. multocidaのワクチン接種は、「バクテリン」として知られる不活性化されたP. multocidaの使用、または弱毒化された生細菌の使用に基づいている。バクテリンは、同種性の防御（homologous protection）のみを付与する。生ワクチンは、同種性の防御および異種性の防御を付与するが、不明な弱毒マーカーを含み、場合によっては集団感染（epidemic outbreaks）を招くこともあった。
【０００６】
米国特許３，８５５，４０８、米国特許４，１６９，８８６、および米国特許４，６２６，４３０は、P. multocidaの「生ワクチン」について記載している。
【０００７】
ＷＯ９８／５６９０１ Ａ２（発明の名称：弱毒化生ワクチン）は、弱毒化された細菌について開示している。この弱毒化された細菌では、ｆｕｒ遺伝子またはｆｕｒ遺伝子の同種遺伝子（homolog）の発現が、細菌が生育している培地中に存在する鉄の濃度と関係なく制御されるように、ｆｕｒ遺伝子またはｆｕｒ遺伝子の同種遺伝子が改変されている。上記細菌を「生ワクチン」として使用することができる。上記文献は、特にNeisseria meningitidisに焦点を当てているが、あらゆるグラム陰性菌に関するものである。
【０００８】
ヒトまたは動物が生産しない代謝産物（metabolite）または異化生成物（catabolite）を生産するために必要な遺伝子の変異によって、細菌が弱毒化される。好適には、細菌を弱毒化するための変異は、ａｒｏ遺伝子、またはプリンまたはピリミジン経路に関与する遺伝子の変異である。本発明の他の形態では、細菌は、ｒｅｃＡに変異を有する。
【０００９】
また、本発明は、ワクチン、および本発明に基づいた細菌を産生するための方法を提供する。当該方法は、ｆｕｒ遺伝子またはその同種遺伝子の発現が、細菌をとりまく環境中に存在する鉄の濃度に関係なく制御されるように、弱毒化細菌の野生型ｆｕｒ遺伝子またはその同種遺伝子を改変することを含む。
【００１０】
上記文献によれば、弱毒化生ワクチンを産生しようとする過去の試みでは、交叉防御（cross protection）にとって重要な特定のタンパク質を、バルク培養中の生物が産生しなかった。これらのタンパク質には、鉄によって制御されるタンパク質が含まれており、その産生がｆｕｒ遺伝子によって調整される。さらに、一旦これらの細菌が宿主に投与されると、制限されたコロニー形成の間では、ワクチン株は、上記タンパク質を発現させるための時間または代謝資源を有していなかった。
【００１１】
ｆｕｒの発現が改変された弱毒化細菌株の作製は、一般的に用いられている技術である。したがって、ｆｕｒ遺伝子またはその同種遺伝子を有する病原菌を、当該病原菌が病原として働く宿主内における成長にとって不可欠な遺伝子を抑制または改変することによって弱毒化させ、上述したように、細菌の環境下に存在する鉄の濃度とは関係なく細菌がｆｕｒ遺伝子またはその同種遺伝子の産物を生成するように、上記弱毒化された病原菌を改変することができる。ｆｕｒ遺伝子の同種遺伝子は、例えば、E. coliやN. meningitidisなどの、他のｆｕｒ遺伝子の配列との比較によって同定され得る。好適には、これらの同種遺伝子は、他の周知のｆｕｒ遺伝子と実質的に同種（homologous）であり、少なくとも１００アミノ酸の長さにおいて６０〜７０％が同一（identity）である。したがって、転写因子をコードし、鉄の存在に対して反応性を有する遺伝子であれば、他の細菌において同定された遺伝子を使用してもよい。
【００１２】
また、本発明は、ワクチンに使用する細菌に安定性を与えるために、ｒｅｃＡ遺伝子およびｃｏｍＡ遺伝子における変異を提案している。これらの変異は、記載されている残りの改変の後に、最終的な遺伝子改変として導入される必要がある。
【００１３】
欧州特許出願２ ０５９ ５０３Ｔ３（発明の名称：パスツレラ症のワクチン“Vacuna contra la pasteurelosis”）は、パスツレラ遺伝子を有する細菌（特にPasteurella multocida）に対する症例について記載している。
【００１４】
上記文献によると、鉄が制限された条件下にてパスツレラ生体を培養する場合、鉄、外膜抽出物、または全細胞溶解液は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの通常条件下において得られるものとは異なるタンパク質プロフィールを形成する。この異なるタンパク質プロフィールは、通常の成長条件下において培養された同じ生体によって形成されたタンパク質プロフィールよりも免疫原性が高い。本発明は、ワクチンの調製を目的として、鉄が制限された条件下において培養された、「バクテリン」を含む不活性化パスツレラ全細胞溶解液を含む。
【００１５】
本発明は、ホモ血清型（homologous serotype）を使用したワクチン製剤について提案しているが、病理学的に重要な全てのパスツレラ血清型（Pasteurella serotypes）の、鉄によって制御されるタンパク質を含む多価ワクチンをも含む。したがって、上記特許文献は、鉄調節タンパク質、当該タンパク質のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、およびワクチン製剤に焦点を当てている。ワクチン製剤では、動物用ワクチン中にて、タンパク質材料が代表的なコアジュバント(coadjuvant)の何れかと混合される。上記文献では、使用するキレート試薬の濃度が高すぎると細菌の培養が阻害されることから、その濃度を慎重に制御する必要がある。
【００１６】
米国特許６，７９０，９５０ Ｂ２（発明の名称：抗菌ワクチン組成物）は、グラム陰性細菌の毒性の遺伝子を特定している（具体的には、Pasteurella multocidaに焦点を当てている）。この文献により、これらの毒性の遺伝子およびその産物に対する新たな抗菌剤（antibacterial agents）を特定することができる。
【００１７】
上記特許は、従来用いられてきた、血清に対して特異的な防御のみを提供する死菌（不活性化細菌）の全細胞を使用したワクチン組成物を作製する試みに関するものであるが、異なる血清の存在を鑑みると、ワクチン接種に関する問題を含む。発明者らは、不活性化されたＡｐｘＩＩ毒素を産生する弱毒化細菌ワクチンが交叉防御を示すと述べている。
【００１８】
不明確な自然突然変異を有する細菌株を含むワクチン製剤に関する問題を考慮して、上記文献の著者らは、弱毒化細菌の同定、および細菌の毒性に必須である、抗菌剤を特定するための方法の進歩に役立つ遺伝子の同定だけでなく、安全で、パスツレラ血清型に対する同種性の防御および異種性の防御を提供するワクチンとして使用できる弱毒化細菌の構築に焦点を当てている。したがって、上記文献は、特定の遺伝子配列中の機能突然変異（functional mutations）を含むグラム陰性細菌性生物（とりわけ、Pasteurella multocida）を提供する。この突然変異は、遺伝子によってコードされた産物の発現または生物活性を抑制または阻害し、この突然変異によって、細菌株の毒性が弱くなる。
【００１９】
細菌感染またはそれに伴う症状を予防するワクチンを構築するという観点から、突然変異を起こした弱毒化されたグラム陰性細菌、および、任意の薬学的に許容可能なアジュバントおよび／または賦形剤もしくは希釈剤を含む組成物について説明されている。
【００２０】
本発明者らは、本発明の改変された菌株が有効な製剤になるためには、感染症による臨床症状を抑えるには十分であって、しかも、宿主における細菌の複製および限定的な成長を可能にする程度に弱毒化を行う必要があると指摘している。
【００２１】
本発明は、弱毒化されたP. multocida株、（ヒトおよび動物に投与可能な）ワクチン、グラム陰性細菌の毒性に必要な遺伝子産物をコードしているポリヌクレオチド、感染したポリヌクレオチドによって形質転換された宿主細胞、本発明に係るポリペプチドの生成方法、本発明の抗菌剤の投与による、グラム陰性細菌に感染した被験者の治療方法などを提供する。
【００２２】
しかし、本出願は、与えられた配列によってコードされたポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、および、当該ベクターによって形質転換された宿主細胞を請求している。本願に記載された弱毒化Pasteurella細菌は、弱毒化されて使用される。
【００２３】
本発明のｆｕｒ変異の目的は、細菌の毒性の低減を意図するものではないので、上記グループの変異には含まれない。米国特許６，７９０，９５０Ｂ２には、死菌の全細胞のワクチン接種によって異種性の防御を付与するのは難しいと記載されているが、本出願に係る発明は、その達成を目的としている。
【００２４】
ＷＯ９９／２９７２４Ａ２（発明の名称：Pasteurella multocidaの外膜タンパク質をコードするＤＮＡ）は、鳥類のPasteurella multocidaの膜タンパク質またはＯｍｐＨポリペプチド、および、生物活性サブユニットまたは変異体をコードする予め選択された核酸配列を含む、単離および精製された核酸分子を請求している。これを達成するために、（７３％は同一である）16 P. multocida血清型のＯｍｐＨｓの配列を決めて複製している。
【００２５】
上記特許文献は、単離されかつ精製された外膜Ｘ−７３ポリペプチドを介した、鶏の同種性の防御の研究を示している。また、上記発明に係る免疫原性組成物が、バクテリンと組み合わせて使用され得ることも記載されている。これらの免疫原性組成物は、有効量の単離精製されたP. multocida外膜ポリペプチド、サブユニット、ペプチド、変異体またはそれらの混合物、ならびに組成物を脊椎に投与した後でP. multocida外膜のポーリンに特異的な抗体の産生を促す薬学的に許容可能な賦形剤を含む。また、上記発明は、鶏のP. multocidaに特異的な抗体の存在を検出または測定する方法をも提供する。
【００２６】
非特許文献「深海の細菌Photobacterium sp. SS9における高圧信号伝達を追跡するレポータ遺伝子の使用」[Ellen Chi and Douglas H. Bartlett, (American Society for Microbiology, pp. 7533-7540 (1993))では、好圧菌であるPhotobacterium spl SS9の第一遺伝子システムが開発されている。上記システムを、静水圧の変化に応答するｏｍｐＨ遺伝子の発現を制御する調節機構の初期特性に使用することについて記載されている。
【００２７】
ｏｍｐＨ遺伝子と圧力との関係を研究するために、ompHLac Photobacterium spl株が得られる。また、１アトムの圧力条件下において選択された変異ｏｍｐＨ株が得られる。その結果、４つの変異体が得られる。そのうち３つの変異体は、発現について培地の圧力の影響を受けない。しかし、４つ目の変異体（ＥＣ１００２）は、圧力に対して極めて高い感受性をもつことが実証されている。したがって、ＥＣ１００２のような圧力に対して感受性がある変異体の特性を将来調べることにより、高圧へ適合するために必要な機能を同定する機会が得られるであろう。
【００２８】
上記非特許文献に記載された研究では、グラム陰性細菌のｏｍｐＨ変異体が作製されてはいるが、これらの変異体は上記細菌に対する免疫研究を目的としておらず、この特定の場合では、ｏｍｐＨ欠損変異体は、高圧における成長にとって重要な機能の特定を目的としている。
【００２９】
最後に、本願の著者らは、文献「Expression of the Pasteurella multocida ompHgene is negatively regulated by the Fur protein」[Montserrat Bosch, Raul Tarrago, Ma Elena Garrido, Susana Campoy, Antonio R. Fernandez de Henestrosa, Ana M. Perez de Rozas, Ignacio Badiola and Jordi Barbe; FEMS Microbiology Letters 203, 35-40 (2001)]において、P. multocidaにおける鉄の取り込みに関する機構および調整について研究している。P. multocidaのｆｕｒ変異体を構築することによって、（高い抗原性を有する）主要な構造膜タンパク質（main structural membrane protein）をコードするｏｍｐＨ遺伝子が、ｆｕｒタンパク質、鉄およびグルコースによって負に調節されることを実証した。同様に、野生型およびｆｕｒ欠損型のP. multocida細胞が、同レベルの毒性をもつことも実証された。
【００３０】
上記文献は、生成物、つまり、Ｆｅ２＋依存性のＤＮＡ結合活性を有する１７ＫＤａのタンパク質を介した、細菌の鉄の取り込みシステムにおけるｆｕｒ遺伝子の役割について説明している。ｆｕｒタンパク質は、正（positive）の調節因子または負（negative）の調節因子として機能し得る。
【００３１】
鉄が欠乏した条件下における培養により、毒性のP. multocida株によって起こる感染症に対する異種性の防御が誘発されることが周知であることを考慮して、著者らは、当該細菌のｆｕｒ欠損変異体を採取し単離して、特徴付けることを提案している。上記遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号AF027154として登録されている。
【００３２】
上記文献は、P. multocidaのｆｕｒ変異体のクローン化および作製について記載している。この目的のために、ｆｕｒ遺伝子の内部領域を含む自殺プラスミド（suicide plasmid）の単一の組み換え（simple recombination）によって、P. multocidaのｆｕｒ遺伝子を不活性化させる。Ｆｕｒ１プライマーおよびＦｕｒ２プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、ｆｕｒ遺伝子の１８−４１２ヌクレオチドを含む３９４塩基対の断片が得られる。この断片を自殺プラスミドｐＵＡ８２６にクローン化してプラスミドｐＵＡ８９１を作製し、プラスミドｐＵＡ８９１が、「トリペアレンタルメイティング（triparental mating）」によってP. multocidaに導入される。ストレプトマイシン抵抗性のトランス接合体が選択される。
【００３３】
本特許出願の目的である、二重変異体および三重変異体を得るための開始点として、ｆｕｒ遺伝子、増幅領域、使用するプライマー、およびプラスミドを不活性化する方法が用いられる。
【００３４】
上記文献において実施された研究は、（上述した３６ＫＤａであるポーリンをコードする）野生型のP. multocidaのｏｍｐＨ遺伝子の発現分析、およびｆｕｒ変異体における分析へと続いている。ｏｍｐＨの発現は、野生型の株よりもｆｕｒ変異体において多いことが観察されている。このことから、ｏｍｐＨの発現がｆｕｒによって負に調節されていることがわかる。上記文献では、ｆｕｒ変異体の毒性の研究も行っており、野生型のP. multocidaおよびｆｕｒ変異体の毒性は、同じレベルであると結論づけられている。
【００３５】
上記文献は、「バクテリン」を得ることを目的とした、P. multocidaによる感染症に対する防御を行う抗原としてｏｍｐＨタンパク質が機能することが実証された事実を鑑みて、グルコースがｏｍｐＨ遺伝子の発現に対して阻害作用を及ぼすことから、グルコースを除去した条件下において、使用する株を培養する必要があると結論付けている。
【００３６】
〔発明の要約〕
本発明の目的は、Pasteurella multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体から調製される外膜タンパク抽出物が毒性Pasteurella multocidaに対して完全な異種性の防御を行うことから、Pasteurella multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体を含むワクチンを生成するための材料および方法を提供することにある。
【００３７】
本発明は、熱によって不活性化されたP. multocidaのＦｕｒ ｏｍｐＨ変異体およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体の使用が、毒性のP. multocidaに対する６０％の交叉防御を付与することについても言及している。同様に、本発明は、超音波処理を用いて細胞を不活性化させた場合、熱処理のみの場合よりも高いレベルの防御が得られることも指摘している。
【００３８】
したがって、本発明の目的は、毒性のP. multocidaに対する防御のために免疫原として使用される二重変異体および三重変異体を含む組成物を提供することにある。
【００３９】
同様に、例えば家禽コレラだけでなく、豚、ウシおよび小動物の肺炎などのP. multocidaによる感染症に対するワクチンの提供も本発明の目的である。
【００４０】
さらに、本発明は、P. multocidaによって発病する危険がある動物に上記ワクチンを投与するためのキットを提供する。上記ワクチンは、ｆｕｒ、ｆｕｒ ｏｍｐＨ（二重変異体）、および／または、ｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ（三重変異体）が欠損したP. multocidaから得られる外膜タンパク質の抽出物と、投与に適したアジュバントを任意で含む薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む。
【００４１】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、Pasteurella multocidaのｆｕｒ変異体のＰＣＲ分析を示す。
【００４２】
図１Ａは、P. multocidaのｆｕｒ変異体の構成を示す。Ｆｕｒ３およびＡａｄ３は、Ｆｕｒ変異の存在を確認するために使用するプライマーの位置を示している。
【００４３】
図１Ｂは、Ａａｄ３プライマーおよびＦｕｒ３プライマーを用いてＰＣＲ分析を行った、野生型の菌株（ＰＭ１０１１（レーン２）、Ｆｕｒ変異体（ＰＭ １０９５）（レーン３）、およびＦｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン４）の染色体ＤＮＡを示している（表２）。対照であるＤＮＡを含まないＰＣＲを、レーン５に示している。ＨｉｎｆＩによって消化したファージΦＸ１７４のＤＮＡを、分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【００４４】
図２は、P. multocidaのｏｍｐＨ１遺伝子およびｏｍｐＨ２遺伝子の構造を示している。ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ１ｒｐ、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐおよびＲＴｏｍｐＨ２ｒｐは、転写解析に使用されるプライマーの位置を示している。
【００４５】
図２Ａは、ｐｍｐＨ１遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。
【００４６】
図２Ｂは、ｏｍｐＨ２遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。
【００４７】
図２Ｃは、想定されるｏｍｐＨ１−ｏｍｐＨ２オペロン遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。
【００４８】
図２Ｄは、野生型株（ＰＭ１０１１）（レーン２）およびｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン３）における遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。上記各菌株の全ＲＮＡ、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐとＲＴｏｍｐＨ１ｒｐとのプライマー対、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐとＲＴｏｍｐＨ２ｒｐとのプライマー対、および、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐとＲＴｏｍｐＨ２ｒｐとのプライマー対を使用した。野生型株のＤＮＡのＰＣＲ（レーン４）、および、ＲＮＡまたはＤＮＡを用いないネガティブな対照（レーン５）のＰＣＲについても示す。ＨｉｎｆＩによって消化されたファージΦＸ１７４のＤＮＡ(ＢおよびＣ)、およびＢｓｔＥＩＩによって消化されたファージλのＤＮＡ（Ｄ）を分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【００４９】
図３は、P. multocidaのｇａｌＥ変異体のＰＣＲ分析を示している。
【００５０】
図３Ａは、P. multocidaのｇａｌＥ変異体の構成を示している。ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐおよびｐＫＯ３−Ｒは、ｇａｌＥ変異体の存在を確認するために使用するプライマーの位置を示している。
【００５１】
図３Ｂは、ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐプライマーおよびｐＫＯ３−Ｒプライマーを用いたＰＣＲ分析を行った、野生型株（ＰＭ１０１１）（レーン２）、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン３）、およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体（ＰＭ１０９６）（レーン４）の染色体ＤＮＡを示している（表２）。ＤＮＡを用いない対照のＰＣＲを、レーン５に示す。ＢｓｔＥＩＩによって消化されたファージλのＤＮＡを分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【００５２】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、P. multocidaによる感染症に対する異種性の防御を促進することができるPasteurella multocida由来の変異体、およびワクチンにおけるその利用に関する。これらの変異体は、ｆｕｒ遺伝子に異常を有している。この変異体については、以前、本発明の発明者らと同一の著者らが説明しているが、ワクチンにおけるその利用については説明していない。P. multocidaのｆｕｒ変異体に加えて、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体などの二重変異体、および、ｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体などの三重変異体が得られる。これらをワクチンに加えることによって、P. multocidaによる感染症に対する異種性の防御を実現する。
【００５３】
殆ど全ての生細胞にとって、鉄は必須の元素である。Haemophilus influenzaeやNeisseria meningitidisなどの多くのグラム陰性の病原菌は、当該病原菌の外膜に、宿主生物の粘膜に存在する、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、ヘミン、フェリチンなどの鉄結合性分子に結合するタンパク質を有している（Ratledge, C. and L.G. Dover. Annu. Rev. Microbiol. 54: 881-941. 2000）。これらの外膜タンパク質の略全ての発現は、Ｆｕｒ（鉄取り込み調節）タンパク質によって制御されている（Stojiljkovic, I., et al. A.J. Baumler and K. Hantke. J. Mol. Biol. 236: 531-545. J. Mol. Biol. 240: 271. 1994）。Ｆｕｒタンパク質は、細菌の細胞質に存在する鉄に結合する。この反応において、Ｆｕｒタンパク質は、Ｆｅ（ＩＩ）と複合体を形成する。次いで、当該複合体は、鉄調節遺伝子のプロモータ領域において、「ｆｕｒ ｂｏｘ」（２，１２，１４）として知られる特定のＤＮＡ配列に結合し、その結果、それらの転写を阻害する。鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）の多くは、強力な抗原であり、病原体の感染過程における毒性にとって、必須の因子である（Ratledge, C., and L.G. Dover. Annu. Rev. Microbiol. 54: 881-941. 2000）。このことから、上記鉄によって制御される外膜タンパク質は、精製された受容体に基づくワクチン（Chibber, S., and S.B. Bhardwaj J. Med. Microbiol. 53: 705-706. 2004）、または抗ＩＲＯＭＰ抵血清を用いたワクチン（Sood, S., P. Rishi, V. Dahwan, S. Sharma, and N.K. Ganguly. Mol. Cell. Biochem. 273:69-78. 2005）の候補として提案されてきた。
【００５４】
Pasteurella multocidaは、家禽コレラや、ウシの肺炎、出血性敗血症、および豚や家畜の萎縮性鼻炎などの様々な感染症を引き起こす病原菌である。獣医学では、P. multocidaのワクチン接種は、主に、「バクテリン」として知られる不活性されたP. multocida細胞の使用に基づくか、または弱毒化された生細菌の使用に基づいている。しかしながら、バクテリンは同種性の防御しか与えず、一方、生ワクチンは、同種性の防御および異種性の防御を付与するが、不明確な弱毒マーカーを含んでおり、場合によっては、集団感染を招くこともあった。鉄を除去せずに成長させたP. multocidaの外膜タンパク質を用いることによって、異種性の防御を得た（Basagoudanavar, S.H., D.K. Singh and B.C. Varshney. J. Vet. Med. 53: 524-530. 2006）。さらに、最近、ワクチン候補となり得る明確に定義された複数の弱毒化された生株が記載されている（１０，１７）。
【００５５】
鉄が欠乏した培地にて成長したP. multocidaから得られるバクテリンによる交叉防御（Glisson, J.R., M.D. Contreras, I.H. Cheng, and C. Wang. Avian. Dis. 37:1074-1079. 1993）、および外膜タンパク質の抽出物による交叉防御（Adler B. et al. J. Biotechnol., Vol. 44, pp. 139-144. 1996; Ruffolo, C.G., et al. B.H. Jose, and B. Adler. Vet. Microbiol. 59:123-137. 1998）は、公知である。この異種性の防御は、培地における鉄の欠乏、ひいては細胞内における鉄の欠乏によって誘発される、P. multocidaの鉄によって制御される外膜タンパク質の過剰発現に基づくと考えられる。２，２’−ジピリジル（ＤＰＤ）などの二価陽イオンに対するキレート剤の存在下では、細菌の成長率が極めて低いということから、上記手法には限界がある。この限界は、大量のワクチンを得ることにとって、大きな限界である。
【００５６】
２つのヘモグロビン結合性受容体はP. multocidaにおいて最初に見出され（Bosch, M. et al., M.E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas. I. Badiola, and J. Barbe. Infect. Immun. 70: 5955-5964. 2002; Cox, A.J., M.L. Hunt, J.D. Boyce, and B. Adler. Microb. Pathog. 34: 287-296, 2003）、次に、上記細菌が、免疫原性をもつ少なくとも６つのヘミンおよび／またはヘモグロビン結合性タンパク質を有することが実証された（Bosch, M. et al., M.E. Garrido, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, J. Barbe, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 99: 103-112. 2004）。しかしながら、それらを別々にワクチン接種した場合には、その何れも異種攻撃（heterologous attack）に対する防御を行わない（Bosch, M., M.E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. Infect. Immun. 70: 5955-5964. 2002; Bosch, M., M.E. Garrido, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, J. Barbe, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 99: 103-112. 2004; B. Adler, personal communication）。
【００５７】
本発明の発明者らは、近年のP. multocidaにおけるｆｕｒ遺伝子の単離により、上記細菌種のｆｕｒ変異体を作製することに成功した（Bosch, M., R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernandez de Henestrosa, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol. Lett. 203:35-40. 2001）。Ｆｕｒが多くの細菌の鉄取り込みタンパク質を制御することを鑑みて、本発明の発明者らはP. multocidaのｆｕｒ細胞による異種性の防御について研究してきた。
【００５８】
P. multocidaのｆｕｒ変異体における、鉄によって制御される外膜タンパク質の過剰発現が、鉄が欠乏した培地中で成長する野生型のP. multocida細胞と同じであることから、ｆｕｒ変異体を用いる手法は、鉄キレート剤が存在する培養液中における細菌の低い成長性に関する問題を解決し、これらの条件下において細胞が示す低成長性を抑制する。
【００５９】
鉄によって制御される外膜タンパク質に基づくワクチンの開発、特に複数の異なる鉄受容体を有する病原菌（例えば、P. multocida）に対するワクチンの開発は、その用途の中でもとりわけ顕著である。
【００６０】
ｆｕｒ遺伝子に欠損を有するP. multocida変異体を本発明の結果として記載している。ｆｕｒ遺伝子は、細菌中で、鉄によって調節される多くのタンパク質の発現を制御している。したがって、P. multocidaのｆｕｒ変異体における鉄によって制御される外膜タンパク質の過剰発現は、鉄が欠乏した培地において野生型のP. multocidaを成長させて生じる過剰発現と同じである。
【００６１】
ｆｕｒ変異体に加えて、ｏｍｐＨタンパク質（高い免疫原性を有する）を発現しないｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体、ならびに、ｆｕｒおよびｏｍｐＨの欠損に加えてｇａｌＥの欠損をも有するｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体についても記載されている。
【００６２】
本発明に係る変異体に加えて、対応する変異体を作製するためのオリゴ、当該オリゴを内包するプラスミド、および変異体から作製されるワクチンについても記載されている。ワクチンは、熱によって不活性化された、または超音波処理によって不活性化された変異細菌（上述した変異体を含む）、または、P. multocidaの変異体が発現する上記鉄によって制御される外膜タンパク質に基づいていてもよい。
【００６３】
したがって、本願は下記について説明している。
【００６４】
ａ）変異が生じたP. multocidaのｆｕｒ遺伝子。この変異では、１８番目〜４１２番目である、３９４塩基対のｆｕｒ遺伝子の内部領域の断片を含むプラスミドを細菌内へ導入することによって、ｆｕｒ遺伝子が分断される。
【００６５】
ｂ）Ｆｕｒ１プライマー、Ｆｕｒ２プライマーおよびＦｕｒ３プライマー。Ｆｕｒ１プライマーおよびＦｕｒ２プライマーを用いたＰＣＲによって、P. multocidaのｆｕｒ遺伝子の３９４塩基対の内部断片をクローニングすることができ、次に、当該内部断片をプラスミドに挿入する。Ｆｕｒ３プライマーを用いて、P. multocidaからクローニングされた３９４塩基対の断片を含むプラスミドがP. multocidaに挿入されることによって野生型遺伝子が阻害されたことを確認することができる。
【００６６】
Ｆｕｒ１、Ｆｕｒ２およびＦｕｒ３のオリゴの配列を表２に示す。
【００６７】
ｃ）自殺プラスミドｐＵＡ８２６を介して得られるとともに、P. multocidaのｆｕｒ遺伝子の３９４塩基対の断片をクローニングすることができる、ストレプトマイシン抵抗性遺伝子を内包するプラスミドｐＵＡ８９１。このプラスミドを、トリペアレンタルメイティング（triparental mating）によってP. multocidaに導入し、次に、ｆｕｒ変異体の候補を選択して単離する。
【００６８】
ｄ）ｏｍｐＨ１およびｏｍｐＨ２遺伝子におけるナンセンス変異。P. multocidaでは、１５４塩基対にて分離されるｏｍｐＨ遺伝子の２つのコピーが存在し、それらが個々に転写されることを鑑みて、２つの変異体を説明する。
【００６９】
ｏｍｐＨ１における変異は、グルタミンコドンの代わりに終止コドンを生じさせる、７６位のナンセンス変異であり、２４アミノ酸を有する短縮されたタンパク質（truncated protein）を発現させる。ＯｍｐＨ２における変異は、６７０位のナンセンス変異を含む複数のヌクレオチドの変化を伴い、６７０位のナンセンス変異は、天然タンパク質が有する３５０アミノ酸の代わりに２２３アミノ酸を有する短縮されたタンパク質を生じさせる。ｏｍｐＨ１およびｏｍｐＨ２におけるナンセンス変異によってもたらされる効果は、３５ＫＤａのＯＭＰタンパク質が発現しないことである。
【００７０】
ｅ）ＯｍｐＨ１ｓｅｑｕｐ、ＯｍｐＨ２ｓｅｑｄｗ、Ｏｍｐ２１０００、Ｏｍｐ２２０００、ｏｍｐＨ１−２ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ１ｒｐ、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐおよびＲＴｏｍｐＨ２ｄｗプライマー。
【００７１】
ＯｍｐＨ１ｓｅｑｕｐプライマーおよびＯｍｐＨ２ｓｅｑｄｗプライマーは、次のベクターへのクローニングのためにP. multocidaのｏｍｐＨ１遺伝子およびｏｍｐＨ２遺伝子（ompH1遺伝子の受託番号: EF102481、およびompH2遺伝子の受託番号: EF102482, GenBank）を含むバンド（bands）を増幅させる。P. multocidaのｏｍｐＨ１遺伝子およびｏｍｐＨ２遺伝子の配列を解析するために、Ｏｍｐ２１０００およびＯｍｐ２２０００を使用する。P. multocidaのｏｍｐＨ１の配列を解析するために、ＯｍｐＨ１−２ｕｐを使用する。そして、P. multocidaにおけるｏｍｐＨ遺伝子（ＯｍｐＨ１およびＯｍｐＨ２）の転写物を解析するために、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ１ｒｐ、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ２ｄｗを使用する。上記オリゴの配列を表２に示す。
【００７２】
ｆ）プライマーを用いてクローン化されたP. multocidaの断片が組み込まれ、P. multocidaへ挿入されることによってP. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体を生じさせるベクター。
【００７３】
ｇ）ＧａｌＥｉｎｔｕｐ、ＧａｌＥｉｎｔｒｐ、ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐおよびｐＫＯ３−Ｒプライマー：ＧａｌＥｉｎｔｕｐおよびＧａｌＥｉｎｔｒｐプライマーは、P. multocidaのｇａｌＥ遺伝子の４９５ｂｐの内部断片を得るために使用されるプライマーであり、ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐは、P. multocidaのｇａｌＥ遺伝子の分断を確認するために使用される順方向プライマーであり、ｐＫＯ３−Ｒは、プラスミドｐＵＡ８９１（４９５ｂｐ断片がクローン化されたプラスミド）がP. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨへ挿入されてP. multocidaのｇａｌＥ遺伝子が分断されたことを確認するためのプライマーである。これらのプライマーの配列を表２に示す。
【００７４】
ｈ）P. multocidaの変異体：これらの細菌は、本来の遺伝子に欠陥をもつ。P. multocidaのｆｕｒ変異体は、ｆｕｒ遺伝子に欠損を有し、ｆｕｒ−Ｆｅ（ＩＩ）複合体の形成を妨げ、鉄によって制御される遺伝子の転写の阻害を起こさせない。これらの変異体、またはこれらの変異体が発現する鉄によって制御される外膜タンパク質を用いて、毒性のP. multocidaに対する異種性の防御を付与することができるP. multocidaワクチンを製造することができる。鉄が欠乏した培地における培養を必要としないので、細菌の培養においてより高い収量が達成される（細菌の成長率は、キレート剤の存在下においては極めて低い）。P. multocidaのｆｕｒ遺伝子の３９４塩基対の断片を組み込むプラスミドを挿入することによって得られる変異体を単離した後で、P. multocidaのｆｕｒ細菌を得る。上記変異体については既に説明されている（Bosch, M., R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernandez de Henestrosa, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol. Lett. 203:35-40. 2001）。
【００７５】
本発明の他の目的は、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体である。上記細菌は、ｆｕｒおよびｏｍｐＨ遺伝子に欠損を有する。したがって、これらの細菌では、ｏｍｐＨ１およびｏｍｐＨ２が発現しない。このことは、上記変異体をワクチンに使用する上で、ｆｕｒ変異体よりも高い防御がもたらされることを意味している（これは、ｏｍｐＨが高い免疫原性をもつ３６ＫｄａのＯｍｐＨタンパク質をコードするからという予期せぬ結果である）。
【００７６】
最後に、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体をも得た。ｇａｌＥを変異させる目的は、P. multocidaに対する防御を高めるために、P. multocida のｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体における鉄によって制御される外膜タンパク質の表面への露出を最適化することにある。このことを達成するために、ｇａｌＥの４９５塩基対の断片を増幅させるのに使用されるプライマーの配列を提供し、次に、ｇａｌＥの４９５塩基対の断片がプラスミドｐＵＡ１０８９にクローン化される。トリペアレンタルメイティングを用いて、上記プラスミドをP. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ ＰＭ１０９４変異体に導入し、次に、三重変異体を選択する。それでもなお、マウスの生体内にて実施したこれらのワクチンの効果についての実験では、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体による防御と同じレベルの防御が示されている。
【００７７】
ｉ）毒性のP. multocidaに感染しやすい動物に異種性の防御を付与することを目的としたワクチンの調製における、原則として抽出物の形態である、不活性化されたP. multocidaのｆｕｒ変異体細菌、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体細菌、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体細菌、および／または、その鉄によって制御される外膜タンパク質の使用。上記不活性化は、熱処理、または超音波処理によるものである。
【００７８】
ｊ）熱処理または超音波処理によって不活性化されたP. multocidaのｆｕｒ変異体細菌、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体細菌、またはｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体細菌、および／または、これら変異体の鉄によって制御される外膜タンパク質の抽出物を含み、１つ以上のアジュバントおよび／または１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含むワクチン。ワクチンを得るという本発明の用途は、本発明の産業上の利用要件を満たす。
【００７９】
マウスを用いて、本願に係る二重変異体および三重変異体を用いたP. multocidaに対する防御の研究を行った。しかし、発症する豚および牛の肺炎、ウサギやハムスターなどの小動物の家禽コレラ、および肺炎など、P. multocidaにより発症するあらゆる病気を制御するために上記ワクチンを用いることができる。
【００８０】
ワクチンを製剤するために、P. multocidaのｆｕｒ ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体またはｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体を、リポ多糖体や、完全フロインドアジュバントまたは不完全フロインドアジュバント、モノホスホリピッドＡなどのモノホスホリピッド、硫酸、リン酸アルミニウムなどのリン酸塩、水酸化アルミニウムヒドロキシリン酸や水酸化アルミニウムなどの水酸化物、などの上記タイプの家畜ワクチンにおける代表的なコアジュバントのいずれかと混合してもよい。
【００８１】
ワクチンの用量は、抗原成分の濃度によって異なる。活性物質の濃度は、通常、賦形剤および任意に０．７％水酸化アルミニウムなどのアジュバント１ｍｌの溶液中において７×ｌ０８〜ｌ×ｌ０９ｃｆｕ／ｍｌであるが、例えば、不活性化された細胞に基づくワクチンであれば、用量は０．１ｍｌであり、賦形剤として用いる１ｍｌの生理食塩水中において１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度のｆｕｒ変異体、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体またはｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体を用いる。活性物質の濃度は、通常、賦形剤および任意に０．７％水酸化アルミニウムなどのアジュバントの１ｍｌ溶液中において１００〜４００μｇであるが、外膜タンパクの抽出物に基づくワクチンであれば、用量は０．１ｍｌであり、１ｍｌの生理食塩水において４００μｇの濃度の抽出物を使用する。
【００８２】
【表１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
【００８５】
【表３】
【００８６】
【表４】
【００８７】
〔材料および方法〕
〔細菌株および成長条件〕
使用した細菌株の一覧を表１に示す。全てのP. multocida株を液体培地、緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）またはＢＨＩ、ＳＢＡ寒天プレートにて培養した。必要に応じて、上記濃縮液に抗菌剤を加えた（Cardenas, M. et al. A.R. Fernandez de Henestrosa, S. Campoy, A.M. Perez de Rozas, J. Barbe, I. Badiola, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 80:53-61. 2001）。野生型株の培養では、使用した二価陽イオンキレート剤、２−２’−ジピリジルＤＰＤ（シグマ）の濃度は１５０μＭであった（表３）。
【００８８】
〔遺伝子法〕
プラスミドｐＵＡ８９１から、P. multocidaのｆｕｒ変異体を得た（図１Ａ）。このプラスミドは、３９４ｂｐのPasteurella multocidaのｆｕｒ遺伝子の内部断片とともに、ｐＵＡ８２６遺伝子の内部断片を挿入した結果得られる（Bosch, M., R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernandez de Henestrosa, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol. Lett. 203: 35-40. 2001）。ｐＵＡ８２６は、ｐＧＹ２（２６−）に由来する。ｐＧＹ２（２６−）から、ＳａｌＩ制限酵素によってｃａｔ遺伝子が抽出された。プラスミドｐＧＹ２は、Ｒ６Ｋの複製起点を有している。Ｒ６Ｋの複製はλpirタンパク質に依存しているので、プラスミドｐＧＹ２は、Pasteurella multocidaにおいて自己不活性化（suicidal）しているとともに、ＲＰ４のｍｏｂ可動化領域（mobilization region）、並びに、アンピシリン（ｂｌａ）、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン（ａａｄＡ）およびクロラムフェニコール（ｃａｔ）に対する抵抗性を付与する遺伝子を含む。後者の遺伝子は、すでに述べたように、ｐＵＡ８２６およびｐＵＡ８９１には存在しない。
【００８９】
ｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体を作製するために、プラスミドｐＵＡ１０９０（図３Ａ）を使用した。このプラスミドは、プラスミドｐＵＡ１０８９（ｐＵＡ８２６のｍｏｂサイトを有するｐＫＯ３）内にPasteurella multocidaのｇａｌＥ遺伝子の４９５ｂｐの内部断片を挿入することによって得られる。トリペアレンタルメイティングによって、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体にプラスミドｐＵＡ１０９０を導入した。選択培地において、トランス接合体を選択した。
【００９０】
ｆｕｒ変異の安定性を測定するために、抗菌剤を加えずに、ＳＢＡ培地において２０回連続してｆｕｒ変異体を二次培養した。ストレプトマイシン有り、および無しのＳＢＡ培地において、適した希釈の細胞縣濁液（１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を用いて、５、１５および２０継代における生菌の濃度を測定した。というのも、ｐＵＡ８９１が、上記抗菌剤に対する抵抗性を示す遺伝子をコードするからである。抗菌剤を加えた培地にて得られたコロニーの数と、抗菌剤を含まない培地にて得られたコロニーの数とを比較して、安定率を算出した。
【００９１】
ｆｕｒ変異は、選択圧がない２０継代後の細胞においても１００％の安定性をもって維持されることがわかった。
【００９２】
〔生化学的方法、ＤＮＡおよびＲＮＡ技術〕
上述したように、コンピュータを用いて、配列を分析した（8- Cardenas, M., A.R. Fernandez de Henestrosa, S. Campoy, A.M. Perez de Rozas, J. Barbo, I. Badiola, and M. Llagostera. Vet. Microbiol. 80: 53-61. 2001）。使用したプライマーを表２に示す。ＡＬＦシーケンサー（Pharmacia Biotech）においてジデオキシ法を実施し、ヌクレオチド配列を測定した。上述したように、ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した（Bosch, M., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol Lett. 210: 201-208. 2002）。上述したように、P. multocidaの外膜タンパク質の抽出物を得て、分析した（Bosch, M., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. FEMS Microbiol Lett. 210: 201-208. 2002）。上述したように、タンパク質の濃度を測定した（Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr, and R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275. 1951）。
【００９３】
〔P. multocidaに対する防御の研究〕
生後３週間のメスのスイスマウス（Harlan Iberica; Barcelona, Spain）５匹の群に、腹腔内注射によって１０または４０μｇ／匹の外膜タンパク質（ＯＭＰ）の抽出物を注入した。異なる培養条件下にて培養した、異なるP. multocida株から抽出物を調製した。全ての場合において、投与した抽出物の量は、１００μlであった。この１００μlを、２週間の間隔を空けて２服にわけて投与した。対照マウスには１００μlの生理食塩水を投与した。３週間後、０．１ｍｌの毒性のP. multocida株（ＰＭ１００２）を腹腔内投与することによって、異種抗原投与（heterologous challenge）を行った。この毒性のP. multocida株(PM1002)は、１００または５００倍のLD50を含んでいた。
【００９４】
熱処理または超音波処理によって不活性化されたP. multocida PM1094株（ｆｕｒおよびｏｍｐＨにおける欠損）およびPM1096株(ｆｕｒ、ｏｍｐＨおよびｇａｌＥにおける欠損)によって与えられた防御を試験するために、同じ方法論を使用した。３０℃の温度下のＢＦｎにおいて７×１０８ｃｆｕ／ｍｌの密度にまで予め培養した培養液を４５℃にて一晩培養することによって、熱による不活性化を行った。超音波処理によって不活性化させた細胞は、７×１０８ｃｆｕ／ｍｌの細胞を超音波処理することによって調製し、ＢＰＷに再縣濁させて、−４０℃の氷浴を用いて５分間ずつ５回処置し、収率８０％を得た。ＳＢＡプレート上で、生菌が存在しないことを試験した。全ての場合において、投与された不活性化された細胞の抽出物の量は１００μｌであり、２週間の間隔を空けて２回投与した。上述したように、ネガティブな対照試験および異種抗原投与を行った。
【００９５】
〔結果：P. multocida変異体の構築〕
Ｆｕｒ１プライマーおよびＦｕｒ２プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、P. multocidaのｆｕｒ遺伝子の３９４−ｂｐの内部断片を得た（表２）。得られた断片を自殺プラスミドｐＵＡ８２６にクローン化し、プラスミドｐＵＡ８９１を得た（図１Ａ）。
【００９６】
トリペアレンタルメイティングによってP. multocidaにプラスミドｐＵＡ８９１を導入した後で、適した選択培地にて細菌を生育させ、複数のｆｕｒ変異体の候補を単離した。ＰＣＲ技術による染色体ＤＮＡの分析によって、プラスミドｐＵＡ８９１の挿入による野生型ｆｕｒ遺伝子の分断が確認された（図１B）。
【００９７】
図１Ｂは、Ａａｄ３プライマーおよびＦｕｒ３プライマーを用いてＰＣＲ分析にかけられた、野生型株（ＰＭ１０１１）（レーン２）、ｆｕｒ変異体（ＰＭ１０９５）（レーン３）およびｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン４）の染色体ＤＮＡを示している。ＤＮＡを用いない対照ＰＣＲを、レーン５に示す。ＨｉｎｆＩによって消化されたファージΦＸ１７４のＤＮＡを、分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【００９８】
同様に、幾つかのｆｕｒ変異体の外膜画分（outer-membrane fractions）の電気泳動像を分析して、既に記載したように（４）、ｆｕｒ変異によって、鉄によって制御される大きな分子量の外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）の誘導が生じることを確認した。２つの異なるｆｕｒ変異体のプロフィールが得られた。驚くべきことに、第一の変異体は、P. multocidaの３６−Ｋｄａの主要な外膜タンパク質（ＯＭＰ）、ＯｍｐΗを発現させ、第二の変異体は発現させなかった。
【００９９】
P. multocidaの全ゲノム塩基配列において、ＯｍｐΗｌタンパク質およびＯｍｐΗ２タンパク質をコードする、Ｐｍ７０（２１）、（１５４ｂｐによって単離された）ｏｍｐＨ遺伝子の２つのコピーが同定された。ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４株）において見られる表現型に関連する変異を決定するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施し、ｏｍｐＨ遺伝子が転写されたか否かを測定した。その結果、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体のｏｍｐＨｌおよびｏｍｐＨ２が個別に転写されたことが実証された。しかしながら、これらの遺伝子（GenBank 受託番号EF102481およびEF102482）のＤＮＡ配列は、ＰＭ１０１１およびＰｍ７０株における対応する配列とは大きく異なることが明らかになった。ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体のｏｍｐＨ遺伝子では、７６位にナンセンス変異が見出され、グルタミンをコードするかわりに終止コドンが生じていた。これにより、２４アミノ酸を有する極めて短い短縮タンパク質が生じる。同様に、この変異体のｏｍｐＨ２の配列は、３５０アミノ酸の代わりに２２３アミノ酸を有する短縮タンパク質を発生させる、６７０位のナンセンス変異を含む多くのヌクレオチド変化を有していた。これらの結果は、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体では３６−Ｋｄａの主要な外膜タンパク質（ＯＭＰ）が無い原因が、ｏｍｐＨ１およびｏｍｐＨ２におけるナンセンス変異であることを明確に示している。図２は、P. multocidaのｏｍｐＨ１遺伝子およびｏｍｐＨ２遺伝子の構造を示している。ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐ、ＲＴｏｍｐＨ１ｒｐ、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐおよびＲＴｏｍｐＨ２ｒｐは、転写解析に使用するプライマーの位置を示す（Ａ）。図２（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、野生型株（ＰＭ１０１１）（レーン２）およびｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン３）におけるｏｍｐＨ１、ｏｍｐＨ２遺伝子の転写、および想定されるｏｍｐＨ１−ｏｍｐＨ１オペロンの転写のＲＴ−ＰＣＲによる分析を示している。上記各株の全ＲＮＡ、および、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐとＲＴｏｍｐＨ１ｒｐとのプライマー対、ＲＴｏｍｐＨ２ｕｐとＲＴｏｍｐＨ２ｒｐとのプライマー対、または、ＲＴｏｍｐＨ１ｕｐとＲＴｏｍｐＨ２ｒｐとのプライマー対を、各々使用した。野生型株のＤＮＡのＰＣＲ（レーン４）、およびＲＮＡまたはＤＮＡを用いないネガチティブ対照のＰＣＲ（レーン５）についても示している。ＨｉｎｆＩによって消化されたファージΦＸ１７４のＤＮＡ(ＢおよびＣ)、およびＢｓｔＥＩＩによって消化されたファージλのＤＮＡ（Ｄ）を、分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【０１００】
〔P. multocida fur変異体による防御の研究〕
P. multocidaのｆｕｒ変異体の推定される防御効果を分析するために、ＤＰＤの非存在下または存在下にて培養した野生型のP. multocida ＰＭ１０１１株、ｆｕｒ変異体およびｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体から調製された外膜タンパク質（ＯＭＰ）の抽出物を１０μｇ／匹および４０μｇ／匹にて、５匹のマウス群に免疫した。そして、用量５００ＸＬＤ５０の毒性ＰＭ１００２株（ＬＤ５０＝３ｃｆｕ／匹）によって、マウスに異種抗原投与を行った。ＤＰＤ欠乏下において培養された野生型の細胞から得られた外膜タンパク質（ＯＭＰ）の抽出物を免疫した全てのマウスが、抗原投与の２日後に死んだ（表３）。しかし、鉄が欠乏した培地にて培養された野生型株由来の外膜タンパク質（ＯＭＰ）の抽出物４０μｇを免疫したマウス、およびｆｕｒ変異体を免疫したマウスは、２０％の防御を示した（表３）。抽出物におけるP. multocida主要な外膜タンパク質（ＯＭＰ）が無いことにより、完全防御（complete protection）が飛躍的に達成された（表３）。
【０１０１】
最も高い防御を示したのは、ｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体から調製された外膜タンパク質（ＯＭＰ）の抽出物であったことから、以下の実験は、当該株を熱によって不活性化させた細胞による防御の分析に焦点を当てて行った。熱によって不活性化された、用量７×１０７ｃｆｕ／ｍｌのｆｕｒ ｏｍｐＨ細胞を投与されたマウスを、続いて、用量ｌ００ＸＬＤ５０のＰＭ１００２株を用いて異種抗原投与した。これらのマウスの防御率は６０％であった（表４）。これらの結果は、一度熱によって不活性化したP. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ細胞を用いて、異種性の防御を付与するワクチンを作製することができることを示している。
【０１０２】
〔P. multocida株の防御能におけるｇａｌＥ変異の効果〕
鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）の表面への露出の最適化が、不活性化されたｆｕｒ ｏｍｐＨ細胞から得られる防御を高めるか否かを測定するために、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体のリポ多糖体（ＬＰＳ）に変異を導入して、派生株を作製した。ｇａｌＥ遺伝子の産物は、ＵＤＰ−ガラクトースのＵＤＰ−グルコースへのエピ化を触媒するものであって、リポ多糖体の中心の正確な合成に必要である。このために、グルコースの存在下において培養できるが、野生型の細胞の表面ＬＰＳを合成することができないｇａｌＥ変異体を作製した。ＧａｌＥｉｎｔｕｐオリゴヌクレオチドおよびＧａｌＥｉｎｔｒｐオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅によって、４９５ｂｐのｇａｌＥ遺伝子の内部断片を得た。この断片をｐＵＡ１０８９にクローン化し、その結果生じたプラスミドを、トリペアレンタルメイティングによってｆｕｒ ｏｍｐＨ株（ＰＭ１０９４）に導入した。適した選択培地によって培養した後で、複数のｇａｌＥ変異体を得た。
【０１０３】
図３は、P. multocidaのｇａｌＥ変異体のＰＣＲ分析を示す。図３（Ａ）は、P. multocidaのｇａｌＥ変異体の構築を示す。ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐおよびｐＫＯ３−Ｒは、ｇａｌＥ変異の存在を確認するために使用するプライマーの位置を示し、図３（Ｂ）は、ＧａｌＥｉｎｔ２ｕｐおよびｐＫＯ３−Ｒプライマーを用いたＰＣＲ分析にかけられた野生型株（ＰＭ１０１１）（レーン２）、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体（ＰＭ１０９４）（レーン３）およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体（ＰＭ１０９６）（レーン４）の染色体ＤＮＡを示している（表２）。ＤＮＡを用いない対照のＰＣＲを、レーン５に示す。ＢｓｔＥＩＩによって消化されたファージλのＤＮＡを、分子量マーカーとして使用した（レーン１およびレーン６）。
【０１０４】
トランス接合体の４つの染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析によって、ｐＵＡ１０９０の挿入が野生型ｇａｌＥ遺伝子を分断することが確認された。そして、これらのクローンのうちの１つ、つまりＰＭ１０９６（図３）が、次の試験のために選択され、その外膜タンパク質プロフィールの分析により、ＰＭ１０９６が前駆株（progenitor strain）と同じプロフィールを有することが確認された。
【０１０５】
５匹のマウス群に、熱によって不活性化（４５℃にて１２時間）されたｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ細胞を７×１０７ｃｆｕ／匹投与し、次に、用量１００および５００ｘＬＤ５ＯのＰＭ１００２の異種抗原投与を行った。表４から明らかなように、熱によって不活性化された株によって免疫された動物が、最小用量にて６０％の防御率を示した。つまり、細菌細胞がより短い細胞表面ＬＰＳを発現させたとしても、それが鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）によって媒介される防御を高めることはなかった。というのも、ｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体およびｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体は、上記熱によって不活性化された変異体のいずれかの株によって免疫されたマウスにおいて、同じレベルの防御を生じさせたからである。
【０１０６】
さらに、超音波処理による細胞の分断に基づいた別の不活性化方法についても試験した。超音波処理によって不活性化されたｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ細胞によって免疫されたマウスは、最高用量（５００ｘＬＤ５０）の病原菌に対して６０％の防御を示した（表Ａ）。これらの結果は、上記方法による細胞の不活性化が、熱処理よりも強い免疫反応を生じさせることを示している。したがって、超音波処理によって不活性化させる方法は、P. multocidaによる感染症に対するワクチンの開発により適していると言える。
【０１０７】
最後に、新たに提示された結果は、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体の鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）は免疫原性を有し、異種性の防御を付与するものであることを示している。したがって、上記結果は、特にP. multocidaのように複数の異なる鉄受容体を有する病原体に対して、鉄によって制御される外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰｓ）に基づくワクチンの開発にｆｕｒ変異体を用いることができることを示している。さらに、ｆｕｒ変異体を用いる方法は、二価陽イオンキレート剤の存在下において細菌性細胞が示す低い成長率などの、他の方法において見られる問題を解決する。
【０１０８】
〔非特許文献〕
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3. Basagoudanavar, S.H., D.K. Singh and B. C. Varshney. 2006. Immunization with outer membrane proteins of Pasteurella multocida (6:B) provides protection in mice. J. Vet. Med. 53:524-530.
4. Bosch, M., R. Tarrago, M.E. Garrido, S. Campoy, A.R. Fernandez de Henestrosa, A.M. Perez de Rozas, L Badiola, and J. Barbe. 2001. Expression of the Pasteurella multocida ompH gene is negatively regulated by the Fur protein. FEMS Microbiol. Lett. 203:35-40.
5. Bosch, M., E. Garrido, M. Llagostera, A.M. Perez de Rozas, I. Badiola, and J. Barbe. 2002. Pasteurella multocida exbB, exbD and tonB genes are physically linked but independently transcribed. FEMS Microbiol Lett. 210:201-208.
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、Pasteurella multocidaのｆｕｒ変異体のＰＣＲ分析を示している。
【図２】図２は、P. multocidaのｏｍｐＨ１遺伝子およびｏｍｐＨ２遺伝子の構造を示している。
【図３】図３は、P. multocidaのｇａｌＥ変異体のＰＣＲ分析を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｆｕｒの発現、または、ｏｍｐＨ１およびｏｍｐＨ２の発現が生じないように、ｆｕｒ遺伝子およびｏｍｐＨ遺伝子に欠損を有することを特徴とする、Pasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項２】
ｆｕｒ遺伝子およびｏｍｐＨ遺伝子に欠損を有することに加えて、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ細胞における鉄によって制御される外膜タンパク質の表面への露出が最適化されるようにｇａｌＥ遺伝子にも欠損を有することを特徴とする、請求項１に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項３】
Ｆｕｒ１プライマーおよびＦｕｒ２プライマーによって増幅される３９４ｂｐのｆｕｒ遺伝子の内部断片をｆｕｒ遺伝子内に挿入することによって野生型遺伝子が分断され、これによって、ｆｕｒ遺伝子に欠損を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項４】
ｏｍｐＨ１における７６位のナンセンス変異、並びに、ｏｍｐＨ２における６７０位のナンセンス変異および複数のヌクレオチドの変化を有する、ＯｍｐＨに欠損を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項５】
ｏｍｐＨ１における上記変異が、グルタミンのかわりに終止コドンを生じさせることによって、２４個のアミノ酸からなる短縮されたタンパク質を発生させ、
ｏｍｐＨ２における上記変異が、３５０個のアミノ酸の代わりに２２３個のアミノ酸からなる短縮されたタンパク質を発生させることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項６】
請求項４または５に記載の上記ナンセンス変異によって、３６−Ｋｄａの主要な外膜タンパク質が無いことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項７】
ＧａｌＥｉｎｔｕｐプライマーおよびＧａｌＥｉｎｔｐプライマーによる増幅によって得られる４９５ｂｐのｇａｌＥの内部断片をｇａｌＥ遺伝子内に挿入することによって野生型遺伝子が分断され、これによって、ｇａｌＥに欠損を有することを特徴とする、請求項２に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項８】
不活性化されていることを特徴とする、請求項１〜７の何れか１項に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項９】
熱によって不活性化されていることを特徴とする、請求項８に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項１０】
超音波処理によって不活性化されていることを特徴とする、請求項８に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のPasteurella multocida細菌の変異体の外膜タンパク質の製剤。
【請求項１２】
P. multocidaの感染に対する異種性の防御を動物へ付与するためのワクチンの製造方法であって、以下のａ）およびｂ）の工程を含む製造方法。
ａ）ｆｕｒ遺伝子およびｏｍｐＨ遺伝子、または、fur遺伝子、ｏｍｐＨ遺伝子およびｇａｌＥ遺伝子に欠損を有する請求項１〜１０の何れか１項に記載のP. multocida細菌の変異体を得る、および／または、上記P. multocida細菌の変異体の細胞から作製される請求項１１に記載の外膜タンパク質の製剤を得る、工程。
ｂ）有効量のｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体またはｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体および／または当該変異体の外膜タンパク質と、賦形剤と、および／または、薬学的に許容可能なアジュバントとを含む、上記ａ）において得られる細胞の抽出物を含む上記ワクチンの選択された投与方法に適した準備を行う工程。
【請求項１３】
P. multocidaの感染症に対して異種性の防御を動物へ付与する、請求項１２に記載のワクチンの製造方法であって、
上記ｆｕｒ変異体の上記細胞、上記ｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体の上記細胞、または上記ｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体の上記細胞が、熱によって不活性化されていることを特徴とする製造方法。
【請求項１４】
P. multocidaの感染症に対して異種性の防御を動物へ付与する、請求項１２に記載のワクチンの製造方法であって、
上記ｆｕｒ変異体の上記細胞、上記ｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体の上記細胞、または上記ｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体の上記細胞が、超音波処理によって不活性化されていることを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
Pasteurella multocidaの感染症に対して異種性の防御を動物へ付与するワクチン組成物であって、
請求項１２〜１４に記載の方法により得られた、免疫原性量のｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体、免疫原性量のｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体、および／または当該変異体の上記外膜タンパク質と、賦形剤と、および／または薬学的に許容可能なアジュバントとを含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１６】
豚および牛の肺炎、ウサギやハムスターなどの小動物の家禽コレラ、および肺炎などのP. multocidaの感染によって発症する病気に対する異種性の防御のための、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
Pasteurella multocidaによる感染症に対して動物に異種性の防御を付与する請求項１２〜１６の何れか１項に記載の製造方法またはワクチン組成物のための、Pasteurella multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体またはｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体、および／または、当該変異体の外膜タンパク質の抽出物の使用。
【請求項１８】
Pasteurella multocidaによる感染症に対して動物に異種性の防御を付与する請求項１２〜１６に記載の製造方法またはワクチン組成物のための、Pasteurella multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ 二重変異体、および／または、当該変異体の外膜タンパク質の抽出物の使用。
【請求項１９】
Pasteurella multocidaによる感染症に対して動物に異種性の防御を付与する請求項１２〜１６に記載の製造方法またはワクチン組成物のための、Pasteurella multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体、および／または、当該変異体の外膜タンパク質の抽出物の使用。
【請求項１】
ｆｕｒの発現、または、ｏｍｐＨ１およびｏｍｐＨ２の発現が生じないように、ｆｕｒ遺伝子およびｏｍｐＨ遺伝子に欠損を有することを特徴とする、Pasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項２】
ｆｕｒ遺伝子およびｏｍｐＨ遺伝子に欠損を有することに加えて、P. multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ細胞における鉄によって制御される外膜タンパク質の表面への露出が最適化されるようにｇａｌＥ遺伝子にも欠損を有することを特徴とする、請求項１に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項３】
Ｆｕｒ１プライマーおよびＦｕｒ２プライマーによって増幅される３９４ｂｐのｆｕｒ遺伝子の内部断片をｆｕｒ遺伝子内に挿入することによって野生型遺伝子が分断され、これによって、ｆｕｒ遺伝子に欠損を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項４】
ｏｍｐＨ１における７６位のナンセンス変異、並びに、ｏｍｐＨ２における６７０位のナンセンス変異および複数のヌクレオチドの変化を有する、ＯｍｐＨに欠損を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項５】
ｏｍｐＨ１における上記変異が、グルタミンのかわりに終止コドンを生じさせることによって、２４個のアミノ酸からなる短縮されたタンパク質を発生させ、
ｏｍｐＨ２における上記変異が、３５０個のアミノ酸の代わりに２２３個のアミノ酸からなる短縮されたタンパク質を発生させることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項６】
請求項４または５に記載の上記ナンセンス変異によって、３６−Ｋｄａの主要な外膜タンパク質が無いことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項７】
ＧａｌＥｉｎｔｕｐプライマーおよびＧａｌＥｉｎｔｐプライマーによる増幅によって得られる４９５ｂｐのｇａｌＥの内部断片をｇａｌＥ遺伝子内に挿入することによって野生型遺伝子が分断され、これによって、ｇａｌＥに欠損を有することを特徴とする、請求項２に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項８】
不活性化されていることを特徴とする、請求項１〜７の何れか１項に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項９】
熱によって不活性化されていることを特徴とする、請求項８に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項１０】
超音波処理によって不活性化されていることを特徴とする、請求項８に記載のPasteurella multocida細菌の変異体。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のPasteurella multocida細菌の変異体の外膜タンパク質の製剤。
【請求項１２】
P. multocidaの感染に対する異種性の防御を動物へ付与するためのワクチンの製造方法であって、以下のａ）およびｂ）の工程を含む製造方法。
ａ）ｆｕｒ遺伝子およびｏｍｐＨ遺伝子、または、fur遺伝子、ｏｍｐＨ遺伝子およびｇａｌＥ遺伝子に欠損を有する請求項１〜１０の何れか１項に記載のP. multocida細菌の変異体を得る、および／または、上記P. multocida細菌の変異体の細胞から作製される請求項１１に記載の外膜タンパク質の製剤を得る、工程。
ｂ）有効量のｆｕｒ ｏｍｐＨ変異体またはｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ変異体および／または当該変異体の外膜タンパク質と、賦形剤と、および／または、薬学的に許容可能なアジュバントとを含む、上記ａ）において得られる細胞の抽出物を含む上記ワクチンの選択された投与方法に適した準備を行う工程。
【請求項１３】
P. multocidaの感染症に対して異種性の防御を動物へ付与する、請求項１２に記載のワクチンの製造方法であって、
上記ｆｕｒ変異体の上記細胞、上記ｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体の上記細胞、または上記ｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体の上記細胞が、熱によって不活性化されていることを特徴とする製造方法。
【請求項１４】
P. multocidaの感染症に対して異種性の防御を動物へ付与する、請求項１２に記載のワクチンの製造方法であって、
上記ｆｕｒ変異体の上記細胞、上記ｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体の上記細胞、または上記ｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体の上記細胞が、超音波処理によって不活性化されていることを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
Pasteurella multocidaの感染症に対して異種性の防御を動物へ付与するワクチン組成物であって、
請求項１２〜１４に記載の方法により得られた、免疫原性量のｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体、免疫原性量のｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体、および／または当該変異体の上記外膜タンパク質と、賦形剤と、および／または薬学的に許容可能なアジュバントとを含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１６】
豚および牛の肺炎、ウサギやハムスターなどの小動物の家禽コレラ、および肺炎などのP. multocidaの感染によって発症する病気に対する異種性の防御のための、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
Pasteurella multocidaによる感染症に対して動物に異種性の防御を付与する請求項１２〜１６の何れか１項に記載の製造方法またはワクチン組成物のための、Pasteurella multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ二重変異体またはｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体、および／または、当該変異体の外膜タンパク質の抽出物の使用。
【請求項１８】
Pasteurella multocidaによる感染症に対して動物に異種性の防御を付与する請求項１２〜１６に記載の製造方法またはワクチン組成物のための、Pasteurella multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ 二重変異体、および／または、当該変異体の外膜タンパク質の抽出物の使用。
【請求項１９】
Pasteurella multocidaによる感染症に対して動物に異種性の防御を付与する請求項１２〜１６に記載の製造方法またはワクチン組成物のための、Pasteurella multocidaのｆｕｒ ｏｍｐＨ ｇａｌＥ三重変異体、および／または、当該変異体の外膜タンパク質の抽出物の使用。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５１１６３０（Ｐ２０１１−５１１６３０Ａ）
【公表日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４４７４０（Ｐ２０１０−５４４７４０）
【出願日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００９／００００４６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９５５１８
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５１０２０７３１３）ウニベルシタット アウトノマ デ バルセロナ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴ ＡＵＴＯＮＯＭＡ ＤＥ ＢＡＲＣＥＬＯＮＡ
【住所又は居所原語表記】Ｅｄｉｆｉｃｉ Ａ−Ｃａｍｐｕｓ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉ ｓ／ｎ，Ｅ−０８１９３ Ｂｅｌｌａｔｅｒｒａ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）Ｓｐａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００９／００００４６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９５５１８
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５１０２０７３１３）ウニベルシタット アウトノマ デ バルセロナ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴ ＡＵＴＯＮＯＭＡ ＤＥ ＢＡＲＣＥＬＯＮＡ
【住所又は居所原語表記】Ｅｄｉｆｉｃｉ Ａ−Ｃａｍｐｕｓ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉ ｓ／ｎ，Ｅ−０８１９３ Ｂｅｌｌａｔｅｒｒａ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）Ｓｐａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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