Ｔ細胞の活性化を増強および／または延長するため（すなわち、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を増大させるため、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強するため、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激するため、および／またはＴ細胞の生存を促進するため）またはＴ細胞の消耗および／または無応答を克服するために使用するための組成物および方法が提供される。好適な組成物は、ＰＤ−１から阻害シグナルを誘発することなく内因性ＰＤ−１受容体と結合してそれを遮断するか、またはＰＤ−１受容体リガンドと結合してそれを遮断し、それらをＰＤ−１受容体と相互作用しないようにするＰＤ−１受容体アンタゴニストが含まれる。それを必要とする被験体において免疫応答を増強するためにＰＤ−１受容体アンタゴニストを使用する方法が提供される。

【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願第６１／０９１，５０２号、同第６１／０９１，６９４号、同第６１／０９１，７０９号、および同第６１／０９１，７０５号（総て２００８年８月２５日に出願）、２００９年１月５日に出願された米国仮出願第６１／１４２，５４８号、および２００９年４月１日に出願された米国仮出願第６１／１６５，６５２号の優先権と利益を主張するものであり、許容される場合には、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞の活性化を調節するための組成物および方法、特に、Ｔ細胞の活性化を増強するための組成物および方法に関する。
【０００３】
背景技術
抗原特異的Ｔ細胞応答は、１）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、ＭＨＣ（シグナル１）に関して提示される抗原ペプチドの結合、および２）種々の受容体／リガンド対の間の接触により送達される第二の抗原非依存性シグナル（シグナル２）の二つのシグナルにより媒介される。この「第二のシグナル」は、Ｔ細胞応答の種類（活性化か阻害か）ならびにその応答の強度および持続時間の決定に極めて重要であり、Ｂ７ファミリータンパク質などの共刺激分子からの正および負のシグナルの双方によって調節される。最も詳細に特性決定されているＴ細胞共刺激経路はＢ７−ＣＤ２８であり、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）はそれぞれ活性化ＣＤ２８受容体および阻害性ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）受容体と結合することができる。
【０００４】
Ｔ細胞受容体を介したシグナル伝達に関して、ＣＤ２８の結合はＴ細胞の抗原特異的増殖を増大させ、サイトカインの産生を増強し、分化およびエフェクター機能を活性化し、Ｔ細胞の生存を促進する(Lenshow, et al., Annu. Rev. Immunol., 14:233-258 (1996)、 Chambers and Allison, Curr. Opin. Immunol., 9:396-404 (1997)、およびRathmell and Thompson, Annu. Rev. Immunol., 17:781-828 (1999))。これに対して、ＣＴＬＡ−４を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２の産生および細胞周期の進行を阻害する負のシグナルを送達すると思われる(Krummel and Allison, J. Exp. Med., 183:2533-2540 (1996)、およびWalunas, et al., J. Exp. Med., 183:2541-2550 (1996))。Ｂ７ファミリーの他のメンバーとしては、ＰＤ−Ｌ１(Dong, et al., Nature Med., 5:1365-1369 (1999)、およびFreeman, et al., J. Exp. Med., 192:1-9 (2000))、ＰＤ−Ｌ２(Tseng, et al., J. Exp. Med., 193:839-846 (2001)、およびLatchman, et al., Nature Immunol., 2:261-268 (2001))、Ｂ７−Ｈ２(Wang, et al., Blood, 96:2808-2813 (2000)、 Swallow, et al., Immunity, 11:423-432 (1999)、およびYoshinaga, et al., Nature, 402:827-832 (l999))、Ｂ７−Ｈ３(Chapoval, et al., Nature Immunol., 2:269-274 (2001))およびＢ７−Ｈ４(Choi, et al., J. Immunol., 171:4650-4654 (2003)、 Sica, et al., Immunity, 18:849-861 (2003)、 Prasad, et al., Immunity, 18:863-873 (2003)、およびZang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100:10388-10392 (2003))。Ｂ７−Ｈ５はは比較的新しく見出されたＢ７ファミリーメンバーである。Ｂ７−Ｈ５はＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０１２２３２号公報に記載されている。機能的研究は、Ｂ７−Ｈ５がＴ細胞を活性化する働きをするＴ細胞活性の正のレギュレーターであることを示す。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１（programmed cell death-1）のリガンドであり、Ｂ７−Ｈ２はＩＣＯＳのリガンドであり、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４およびＢ７−Ｈ５は、当初はまだオーファンリガンドである(Dong, et al., Immunol. Res., 28:39-48 (2003))。
【０００６】
ほとんどのＢ７ファミリー分子は、膜近位定常ＩｇＣドメインと、膜遠位ＩｇＶドメインとを有する細胞表面で発現される。これらのリガンドの受容体は共通の細胞外ＩｇＶ様ドメインを有する。受容体−リガンド対の相互作用は、主としてリガンドと受容体のＩｇＶドメインの残基により媒介される(Schwartz, et al., Nature Immunol., 3:427-434 (2002))。一般に、ＩｇＶドメインは、それぞれβ鎖の層を含む２枚のシートを有することが記載されている(Williams and Barclay, Annu. Rev. Immunol., 6:381-405 (1988))。ＣＴＬＡ−４の表および裏のシートはそれぞれＡ’ＧＦＣ’Ｃ鎖およびＡＢＥＤＣ”鎖を含む(Ostrov, et al., Science, 290:816-819 (2000))が、Ｂ７ ＩｇＶドメインの表および裏のシートはそれぞれＡＧＦＣＣ’Ｃ”鎖およびＢＥＤ鎖からなる(Schwartz, et al., Nature, 410:604-608 (2001)、 Stamper, et al., Nature, 410:608-611 (2001)、およびIkemizu, et al., Immunity, 12:51-60 (2000))。結晶学的分析から、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７結合境界は、ＭＹＰＰＰＹモチーフからなる、ＣＴＬＡ−４由来のＣＤＲ３類似ループと、主としてＧ、Ｆ、Ｃ、Ｃ’およびＣ”鎖によって形成されるＢ７上の表面との相互作用により支配されることが明らかになった(Schwartz, et al., Nature, 410:604-608 (2001)、 およびStamper, et al., Nature, 410:608-611 (2001))。アミノ酸(ammo acid)ホモロジー、突然変異およびコンピューターモデリングからのデータは、このモチーフもＣＤ２８の主要なＢ７結合部位であるという概念に裏付けを与える(Bajorath, et al., J. Mol. Graph. Model., 15:135-139 (1997))。ＩＣＯＳではＭＹＰＰＰＹモチーフは保存されていないが、研究では、配列ＦＤＰＰＰＦを有し、同様の位置に存在する関連モチーフがＩＣＯＳと、Ｂ７−Ｈ２との結合に主要な決定因子であることが示されている(Wand, et al., J. Exp. Med., 195:1033-1041 (2002))。
【０００７】
ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣとも呼ばれる）は比較的新しいＢ７ファミリーメンバーであり、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１とも呼ばれる）と約３４％同一のアミノ酸配列を有する。ヒトおよびマウスＰＤ−Ｌ２相同分子種は約７０％のアミノ酸同一性を有する。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２転写物は種々の組織で見られ(Dong, et al., Nature Med., 5:1365-1369 (1999)、 Latchman, et al., Nature Immunol., 2:261-268 (2001)、およびTamura, Blood, 97:1809-1816 (2001))が、タンパク質の発現特性は全く異なっている。ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現は、マクロファージ様細胞以外の通常の組織には本質的に見られないが、種々の組織および細胞種で誘導することができる(Dong, et al., Nature Med., 5:1365-1369 (1999)、およびIshida, et al., Immunol. Lett., 84:57-62 (2000))。これに対して、ＰＤ−Ｌ２は樹状細胞および単球でのみ発現される。
【０００８】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は双方とも、細胞質ドメインに免疫受容抑制性チロシンモチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）(ITIM)を有するＣＤ２８ファミリーの遠位メンバーである(Ishida, et al., EMBO J., 11:3887-3895 (1992))ＰＤ−１と結合する(Freeman, et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000))ことが示されている。ＰＤ−１は胸腺細胞の一部で発現され、活性化後のＴ、Ｂおよび骨髄細胞でアップレギュレートされる(Agata, et al., Int. Immunol., 8:765-772 (1996)）。ＰＤ−１は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）により提示されるペプチド抗原と結合した後にＴＣＲの下流でシグナル伝達に拮抗する働きをする。ＰＤ−１のシグナル伝達には、ＴＣＲ：ＭＨＣ複合体と近接したリガンドとの結合を必要とすると思われ、これはＴ細胞と抗原提示細胞の間の免疫シナプスで生じる(Freeman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 105:10275-10276 (2008))。そのリガンドによるＰＤ−１結合の主要な結果は、ＴＣＲの下流でシグナル伝達を阻害することである。よって、ＰＤ−１を介したシグナル伝達は通常、Ｔ細胞に対して、Ｔ細胞増殖の低下またはＴ細胞活性におけるその他の低下をもたらす抑制または阻害シグナルを与える。
【０００９】
ＰＤ−１^−／−マウスの表現型は、ＰＤ−１がインビボにおける免疫応答の負のレギュレーターであるという直接的な証拠となる。ＰＤ−１の非存在下では、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドを持つマウスは狼瘡様糸球体腎炎および進行性関節炎をゆっくり発症する(Nishimura, et al., Immunity, 11:141-151 (1999))。ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドを持つＰＤ−１^−／−マウスは致死性の自己免疫拡張型心筋症を急速に発症する(Nishimura, et al., Science. 291:319-322 (2001))。しかしながら、実質的証拠は、ＰＤ−Ｌ２がＴ細胞応答を活性化させる働きをし得ることを示唆している。最適に満たないＴＣＲシグナルの存在下では、ＰＤ−Ｌ２はインビトロにおいて増殖およびサイトカイン産生の増大を刺激する(Tseng, et al., J. Exp. Med. 193:839-846 (2001))。他方、インビトロ研究では、Ｔ細胞応答におけるＰＤ−Ｌ２の負の調節的役割が示唆されている。これらの矛盾したように見えるデータは、ＰＤ−１以外の、Ｔ細胞上のＰＤ−Ｌ２に対するさらなる受容体の発現により最も良く説明される。
【００１０】
ＰＤ−Ｌ１はＴ細胞において阻害的シグナル伝達を生じる主要なＰＤ−１リガンドである。ＰＤ−１のシグナル伝達はＴＣＲ：ＭＨＣ複合体と近接したＰＤ−１リガンド（一般にＰＤ−Ｌ１）との結合を必要とすると思われ、受容体を遮断するか、またはそのリガンドを阻害することによって、その内因性リガンドとの相互作用からＰＤ−１受容体を遮断し、従って、Ｔ細胞膜上でのＰＤ−１およびＴＣＲの同時結合を妨げるタンパク質、抗体、または小分子が意図される有用なＰＤ−１アンタゴニストである。
【００１１】
よって、本発明の一つの目的は、Ｔ細胞上のＰＤ−１を介したシグナル伝達を阻害するための組成物および方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、ＰＤ−１と結合するが、ＰＤ−１のシグナル伝達を活性化しないＰＤ−１アンタゴニストを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、ＰＤ−１リガンドと結合し、該リガンドとＰＤ−１の相互作用を阻害または低減するＰＤ−１アンタゴニストを提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達に結びつくことなくＰＤ−１受容体と結合し、ＰＤ−１のリガンドと結合し、かつ該リガンドと、ＰＤ−１受容体との相互作用を阻害または低減し、かつ場合により別の受容体経路を介してＴ細胞を活性化するＰＤ−１アンタゴニストを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、ＰＤ−１のアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸分子を発現するベクターを含む細胞を提供することである。
【００１６】
なお、さらに本発明の目的は、Ｔ細胞の活性化を増強および／または延長する、あるいはＴ細胞の消耗および／またはＴ細胞の無応答を克服するための方法であって、それらを、ＰＤ−１を活性化させることなくＰＤ−１と結合するか、またはＰＤ−１のリガンドと結合し、そのリガンドとＰＤ−１受容体の相互作用を阻害または低減するポリペプチドと接触させることによる方法を提供することである。
【００１７】
なお、さらなる本発明の目的は、ＰＤ−１のアンタゴニストポリペプチド、それをコードする核酸、またはＰＤ−１のアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトもしくは形質導入された細胞を、それを必要とする哺乳類に投与するための方法を提供することである。
【００１８】
なお、さらなる本発明の目的は、抗原またはワクチンに対する免疫応答を増強するための方法であって、ＰＤ−１のアンタゴニストポリペプチドを抗原またはワクチンと組み合わせて投与することによる方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１９】
Ｔ細胞の活性化を増強および／または延長する（すなわち、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を増大させる、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強する、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激する、かつ／またはＴ細胞の生存率を高める）、またはＴ細胞の消耗および／または無応答を克服するための組成物および方法が提供される。代表的な組成物としては、ＰＤ−１から阻害シグナルを誘発することなく、免疫細胞上の内因性ＰＤ−１と結合してそれを遮断するＰＤ−１アンタゴニストが含まれる。他の実施形態においては、該組成物としては、ＰＤ−１リガンドと結合してそれを遮断し、それによりそれがＰＤ−１と相互作用しないようにするＰＤ−１アンタゴニストが含まれる。ＰＤ−１アンタゴニストを用いて、それを必要とする被験体において免疫応答を増強する方法が提供される。
【００２０】
免疫細胞、好ましくは、Ｔ細胞上の内因性ＰＤ−１と結合してそれを遮断するＰＤ−１アンタゴニストとしては、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、そのＰＤ−１結合断片、ＰＤ−１抗体、融合タンパク質、ならびにその変異体が含まれる。これらのＰＤ−１アンタゴニストは生理学的条件下でＰＤ−１と結合し、Ｔ細胞の阻害を遮断する。
【００２１】
天然ＰＤ−１リガンドと結合するＰＤ−１アンタゴニストとしては、ＰＤ−１およびＢ７．１ポリペプチド、その断片、抗体、および融合タンパク質が含まれる。これらのＰＤ−１アンタゴニストはＢ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣと結合し、免疫細胞上でＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発しないようにする。
【００２２】
好ましい実施形態においては、Ｂ７−ＤＣおよびＢ７−Ｈ１ポリペプチド、またはその変異体は他のポリペプチドと組み合わされて、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を生じることなくＰＤ−１受容体と結合することによってＰＤ−１受容体と拮抗する融合タンパク質を形成する。一般に、該融合ポリペプチドは、（ｉ）第二のポリペプチドと直接融合された、または（ｉｉ）場合により、第二のポリペプチドと融合されたリンカーペプチド配列と融合された、Ｂ７−ＤＣもしくはＢ７−Ｈ１の全部もしくは一部、またはその変異体を有する第一の融合相手を有する。この融合相手の存在は、ポリペプチドの溶解度、親和性、および／または価数を変化させ得る。ある特定の実施形態においては、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、またはその変異体は、好ましくは、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域に相当するアミノ酸配列を有するＩｇ重鎖定常領域の１以上のドメインと融合される。Ｂ７．１とＰＤ−１を用いた同様の融合タンパク質も提供される。
【００２３】
また、ＰＤ−１受容体アンタゴニストポリペプチドおよび融合タンパク質をコードする核酸、ならびにこのような核酸をベクター内に含む宿主細胞も提供される。
【００２４】
また、開示されているＰＤ−１受容体アンタゴニストを含む免疫原組成物も提供される。免疫原組成物は、抗原、ＰＤ−１受容体アンタゴニストの供給源、および場合によりアジュバントを含む。好適な抗原としては、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、環境抗原、および腫瘍抗原が含まれる。
【００２５】
ＰＤ−１受容体アンタゴニストを用いて、Ｔ細胞の阻害を低減する、および／またはＴ細胞の活性化を延長する、またはＴ細胞の消耗および／または無応答を克服する方法が提供される。ＰＤ−１受容体アンタゴニストおよびそれをコードする核酸の治療的使用が提供される。ＰＤ−１受容体アンタゴニスト組成物は癌に対する免疫応答を増強するために使用可能である。ＰＤ−１受容体アンタゴニスト組成物はまた、免疫抑制被験体の免疫応答を刺激するために使用可能である。ある特定の実施形態においては、ＰＤ−１受容体アンタゴニスト組成物はワクチンとともに投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａ−Ｂは、実施例１に記載されているように、ＰＤ−１結合ＥＬＩＳＡにおける、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇのＰＤ−１への結合を示すグラフである。
【図２】図２は、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇがＣＨＯ細胞を発現するＰＤ−１と結合することを示すグラフである。
【図３】図３は、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇがＰＤ−１との結合に関してＰＤ−Ｌ１と競合することを示すグラフである。
【図４】図４は、Ｐ８１５腫瘍モデルに関する例示的投与計画の図である。
【図５】図５Ａ−Ｃは、時間および処理の関数としてプロットされた腫瘍体積の線グラフである：Ａ）ビヒクル対照、Ｂ）マウスＩｇＧ対照、およびＣ）ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ。
【図６】図６Ａ−Ｃは、シクロホスファミド（ＣＴＸ）と、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇとの組合せがマウスにおける確立されたＣＴ２６腫瘍（結腸癌腫）の根絶をもたらしたことを示す線グラフである。
【図７】図７は、ＣＴＸとＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せがマウスにおける確立されたＣＴ２６腫瘍（結腸癌腫）を根絶し、ＣＴ２６の再負荷から保護したことを示す。
【図８】図８は、ＣＴＸおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置が腫瘍特異的メモリーＣＴＬの生成をもたらしたことを示す。
【発明の具体的説明】
【００２７】
Ｉ．定義
本明細書において「単離された」とは、その化合物が天然に存在する場合と異なる環境にある、例えば、ペプチドをそれが天然には見られない濃度まで濃縮することなどによってその天然の環境から分離された目的化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれか）を表すことを意味する。「単離された」とは、目的化合物が実質的に富化された、かつ／または目的化合物が部分的または実質的に精製されたサンプル内にある化合物を含むことを意味する。
【００２８】
本明細書において、「ポリペプチド」とは、修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）とは無関係に任意の長さのアミノ酸鎖を意味する。
【００２９】
本明細書において、「変異体」ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列に比べて少なくとも一つのアミノ酸配列の変更を含む。
【００３０】
本明細書において、「アミノ酸配列の変更」とは、例えば、１以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり得る。
【００３１】
本明細書において、「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントが、その挿入されたセグメントの複製を生じるように挿入することができるプラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。本明細書に記載のベクターは発現ベクターであり得る。
【００３２】
本明細書において、「発現ベクター」とは、１以上の発現制御配列を含むベクターである。
【００３３】
本明細書において、「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
【００３４】
本明細書において、「機能的に連結される」とは、発現制御配列が目的のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝構築物に組み込まれることを意味する。
【００３５】
本明細書において、ポリペプチドの「断片」とは、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。一般に、断片はアミノ酸５個以上の長さである。
【００３６】
本明細書において、「価数」とは、分子当たりに利用可能な結合部位の数を意味する。
【００３７】
本明細書において、「保存的」アミノ酸置換とは、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する置換である。
【００３８】
本明細書において、「非保存的」アミノ酸置換とは、置換されたアミノ酸の電荷、疎水性、または嵩が有意に変化するものである。
【００３９】
本明細書において、「単離された核酸」とは、哺乳類ゲノムにおいてその核酸の一端または両端に通常隣接している核酸を含み、哺乳類ゲノムに存在する他の核酸分子から分離された核酸を意味する。
【００４０】
本明細書において、核酸に関して「単離された」は任意の非天然核酸配列を含む（このような非天然配列は天然には見られず、天然ゲノムには直接連続する配列を持たないため）。
【００４１】
本明細書において、「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターが導入できる原核細胞および真核細胞を意味する。
【００４２】
本明細書において、「形質転換させる」および「トランスフェクトする」とは、当該技術分野で知られているいくつかの技術によって核酸（例えばベクター）を細胞に導入することを包含する。
【００４３】
本明細書において、「抗体」とは、完全分子ならびに抗原−結合部位を含むその断片の双方を含むことを意味する。これらには完全抗体のＦｃ断片を欠いたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片が含まれる。
【００４４】
「個体」、「宿主」、「被験体」、および「患者」は、本明細書では互換的に用いられ、限定されるものではないが、ヒト、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、および他の実験動物を含む哺乳類を意味する。
【００４５】
本明細書において、「有効量」または「治療上有効な量」とは、処置される病態の１以上の症状を処置、阻害、もしくは緩和するのに、またはそうでなければ、所望の薬理学的および／または生理学的効果を提供するのに十分な用量を意味する。厳密な用量は、被験体に依存する変数（例えば、齢、免疫系の健全性）、および投じられる処置などの様々な因子によって異なる。
【００４６】
ＩＩ．ＰＤ−１アンタゴニスト
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用に干渉するのに好ましいＰＤ−１アンタゴニスト化合物は、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣとしても知られる）、ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメイン、ＰＤ−Ｌ２の融合タンパク質、およびＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合してそれを遮断し、ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１との結合を妨げるその変異体である。さらなるＰＤ−１アンタゴニストとしては、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合するＰＤ−Ｌ１の断片、ＰＤ−１のリガンドと結合し、Ｔ細胞上の内因性ＰＤ−１受容体と結合するのを妨げるＰＤ−１または可溶性その断片、ならびにＰＤ−Ｌ１と結合し、ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１との結合を妨げることができるＢ７．１または可溶性その断片が含まれる。ある特定の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストは被験体におけるＴ細胞傷害性を高める。この多機能性ＰＤ−１アンタゴニストは被験体において強力な免疫応答を誘導し、Ｔ細胞の消耗およびＴ細胞の無応答を克服する助けをする。
【００４７】
ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１のリガンドと結合し、それと相互作用するか、またはリガンドとＰＤ−１受容体の結合を阻害するか、またはＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達に結びつくことなくＰＤ−１受容体と直接結合する。好ましい実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１と直接結合し、ＰＤ−１阻害的シグナル伝達を遮断する。他の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはＰＤ−１のリガンドと結合し、リガンドがＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発するのを低減または阻害する。さらに別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１受容体以外の受容体と結合することによりＴ細胞を活性化することができる。
【００４８】
ＰＤ−１アンタゴニストは小分子アンタゴニストであり得る。「小分子」とは、１００ダルトンを超え、約２，５００ダルトン未満、好ましくは１００〜２０００ダルトン、より好ましくは約１００〜約１２５０ダルトン、より好ましくは約１００〜約１０００ダルトン、より好ましくは約１００〜約７５０ダルトン、より好ましくは約２００〜約５００ダルトンの分子量を有する小有機化合物を意味する。これらの小分子は多くの場合、環状炭素または複素環式構造および／または１以上の官能基で置換された芳香族または多環芳香族構造を含む。これらの小分子アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２などのＰＤ−１のリガンドと結合し、そのリガンドがＰＤ−１と相互作用しないようにすることにより、またはＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を誘発することなく、ＰＤ−１受容体と直接結合することにより、ＰＤ−１受容体シグナル伝達を低減するか、またはそれと干渉する。
【００４９】
例示的ＰＤ−１アンタゴニストとしては、限定されるものではないが、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、またはＢ７−１ポリペプチド、およびその変異体、断片または融合タンパク質が挙げられる。さらなる実施形態としては、これらのタンパク質のいずれかと結合する抗体が挙げられる。
【００５０】
Ａ．ＰＤ−Ｌ２に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
１．ＰＤ−１と結合する、ＰＤ−Ｌ２に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
ＰＤ−１アンタゴニストは免疫細胞上のＰＤ−１と結合し、阻害的ＰＤ−１のシグナル伝達を遮断する。ＰＤ−１のシグナル伝達は、ＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１、一般に、ＰＤ−Ｌ１）が免疫シナプス内でＴＣＲ：ＭＨＣ複合体と近接してＰＤ−１と結合する必要があると思われる。よって、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を遮断し、場合により、Ｔ細胞膜上でのＰＤ−１とＴＣＲの同時結合を妨げるタンパク質、抗体または小分子は有用なＰＤ−１アンタゴニストである。
【００５１】
代表的なポリペプチドアンタゴニストとしては、限定されるものではないが、ＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、その断片、その融合タンパク質、およびその変異体が挙げられる。ＰＤ−１と結合し、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を遮断するＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは好ましい実施形態の一つである。他の実施形態としては、ＰＤ−１の天然リガンドが結合しないように、かつシグナル伝達を誘発しないようにするＰＤ−１アンタゴニストが含まれる。ある特定の実施形態においては、開示されたＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、免疫シナプスに関してペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの同時結合が存在しないので、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達が低減されているか、またはそれを誘発する能力がないと考えられる。ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化およびＴ細胞の増殖を減衰する負のシグナルを伝達するので、ＰＤ−１のシグナル伝達経路を阻害すれば、そうでなければ減衰される細胞を活性化させることができる。
【００５２】
２．例示的ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドＰＤ−１アンタゴニスト
ネズミＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、
【化１】

（配列番号１）または
【化２】

（配列番号２）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００５３】
ヒトＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、
【化３】

（配列番号３）または
【化４】

（配列番号４）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００５４】
非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、
【化５】

（配列番号５）または
【化６】

（配列番号６）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
配列番号１、３および５はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００５５】
Ｂ．ＰＤ−Ｌ１に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
１．ＰＤ−１受容体と結合するＰＤ−Ｌ１に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
ＰＤ−１受容体と結合する他のＰＤ−１アンタゴニストとしては、限定されるものではないが、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、その断片、その融合タンパク質およびその変異体が挙げられる。これらのＰＤ−１ポリペプチドアンタゴニストはＰＤ−１受容体と結合してそれを遮断し、ＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達が低減されているか、またはそれを誘発する能力がない。一つの実施形態においては、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、免疫シナプスに関してペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの同時結合が存在しないので、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達が低減されているか、またはそれを誘発する能力がないと考えられる。ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化およびＴ細胞の増殖を減衰する負のシグナルを伝達するので、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを用いてＰＤ−１のシグナル伝達を阻害すれば、そうでなければ減衰される細胞を活性化することができる。
【００５６】
２．例示的ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドＰＤ−１アンタゴニスト
ネズミＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、
【化７】

（配列番号７）または
【化８】

（配列番号８）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００５７】
ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、
【化９】

（配列番号９）
【化１０】

（配列番号１０）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
配列番号７および９はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００５８】
Ｃ．Ｂ７．１およびＰＤ−１に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
１．ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と結合するＢ７．１およびＰＤ−１に基づくＰＤ−１アンタゴニスト
他の有用なポリペプチドとしては、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２などのＰＤ−１リガンドと結合し、内因性ＰＤ−１受容体との結合を妨げ、それにより阻害的シグナル伝達を妨げることができるＰＤ−１受容体タンパク質、またはその可溶性断片が含まれる。このような断片はまた、場合により天然リガンドとの結合を増大させるＡ９９Ｌ突然変異などの突然変異を含む、ＰＤ−１タンパク質の可溶性ＥＣＤ部分も含む。ＰＤ−Ｌ１はまた、タンパク質Ｂ７．１と結合することも示されている(Butte, et al., Immunity, 27(1): 111-122 (2007))。よって、ＰＤ−Ｌ１リガンドと結合し、内因性ＰＤ−１受容体との結合を妨げ、それにより阻害的シグナル伝達を妨げることができるＢ７．１またはその可溶性断片もまた有用である。
【００５９】
２．例示的Ｂ７．１ポリペプチドＰＤ−１アンタゴニスト
ネズミＢ７．１ポリペプチドは、
【化１１】

（配列番号１１）または
【化１２】

（配列番号１２）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００６０】
ヒトＢ７．１ポリペプチドは、
【化１３】

（配列番号１３）または
【化１４】

（配列番号１４）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
配列番号１１および１３はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００６１】
３．例示的ＰＤ−１ポリペプチドＰＤ−１アンタゴニスト
ヒトＰＤ−１ポリペプチドは、
【化１５】

（配列番号１５）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００６２】
非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−１ポリペプチドは、
【化１６】

（配列番号１６）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
配列番号１５および１６はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００６３】
Ｄ．ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの断片
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、全長ポリペプチドであってもよいし、あるいは全長ポリペプチドの断片であってもよい。本明細書において、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの断片とは、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。
【００６４】
有用な断片は、それらの天然リガンドと結合する能力を保持するものである。全長ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの断片であるＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは一般に、全長ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドに比べてその天然リガンドと結合する能力の少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントを有する、またはさらには１００パーセントを超える。
【００６５】
例えば、ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１の有用な断片は、ＰＤ−１と結合する能力を保持するものである。ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１断片は一般に、全長ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１に比べてＰＤ−１と結合する能力の少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントを有する、またはさらには１００パーセントを超えるものである。
【００６６】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの断片は可溶性断片を含む。可溶性ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチド断片は、産生細胞から放出、分泌またはそうでなければ抽出され得るＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの断片である。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの可溶性断片は、該ポリペプチドの細胞外ドメインの一部または全部を含み、細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインの一部または全部を欠く。一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチド断片はＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの全細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは膜貫通ドメイン由来の１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含み得ると考えられる。あるいは、細胞外ドメインはＣ末端、Ｎ末端または双方から除去された１、２、３、４、または５個のアミノ酸を有し得る。
【００６７】
一般に、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドまたはその断片は、シグナル配列をコードする配列を含む核酸から発現される。このシグナル配列が一般に未熟なポリペプチドから切断されて、シグナル配列を欠く成熟ポリペプチドが生じる。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドのこのシグナル配列は、そのポリペプチドの発現レベル、分泌、溶解度、または他の特性に影響を与えるために標準的な分子生物学的技術を用いて別のポリペプチドのシグナル配列で置換することができる。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドシグナル配列を置換するために用いられるシグナル配列は、当該技術分野で知られているいずれのものであってもよい。
【００６８】
１．ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
ａ．ヒトＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはヒトＰＤ−Ｌ２またはその断片の細胞外ドメインを含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、
【化１７】

（配列番号１７）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００６９】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化１８】

（配列番号１８）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７０】
このシグナル配列は成熟タンパク質では除去されると考えられる。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができると考えられる。配列番号１９は、シグナル配列を含まない配列番号１８のヒトアミノ酸配列を示す。
【化１９】

（配列番号１９）
【００７１】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはヒトＰＤ−Ｌ２のＩｇＶドメインを含む。第一の融合相手は、
【化２０】

（配列番号２０）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００７２】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化２１】

（配列番号２１）（ＰＤ−Ｌ２Ｖとも呼ばれる）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７３】
ｂ．非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインまたはその断片を含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、
【化２２】

（配列番号２２）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００７４】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、非ヒト霊長類アミノ酸配列：
【化２３】

（配列番号２３）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７５】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からの融合タンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号２４は、シグナル配列を含まない配列番号２３の非ヒト霊長類アミノ酸配列を示す。
【化２４】

（配列番号２４）
【００７６】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２のＩｇＶドメインを含む。第一の融合相手は、
【化２５】

（配列番号２５）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００７７】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、非ヒト霊長類アミノ酸配列：
【化２６】

（配列番号２６）（ＰＤ−Ｌ２Ｖとも呼ばれる）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７８】
ｄ．ネズミＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはネズミＰＤ−Ｌ２またはその断片の細胞外ドメインを含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、
【化２７】

（配列番号２７）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００７９】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化２８】

（配列番号２８）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００８０】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号２９は、シグナル配列を含まない配列番号２８のネズミアミノ酸配列を示す。
【化２９】

（配列番号２９）
【００８１】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはネズミＰＤ−Ｌ２のＩｇＶドメインを含む。第一の融合相手は、
【化３０】

（配列番号３０）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００８２】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化３１】

（配列番号３１）（ＰＤ−Ｌ２Ｖとも呼ばれる）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００８３】
ｄ．ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン断片
ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメインは、シグナルペプチドまたはＰＤ−Ｌ２の推定膜貫通ドメイン由来の１以上のアミノ酸を含み得る。分泌の際に切断されるシグナルペプチドのアミノ酸の数は発現系および宿主によって異なり得る。さらに、ＰＤ−１と結合する能力を保持するＣ末端またはＮ末端から１以上のアミノ酸を欠くＰＤ−Ｌ２細胞外ドメインの断片を使用することもできる。
【００８４】
第一の融合相手として使用することができるネズミＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号５３の
【化３２】

が挙げられる。
【００８５】
ネズミＰＤ−Ｌ２のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号１の
【化３３】

が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号１内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されているいずれのものであってもよく、または当該技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【００８６】
第一の融合相手として使用することができるヒトＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号５６の
【化３４】

が挙げられる。
【００８７】
ヒトＰＤ−Ｌ２のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号３の
【化３５】

が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号３内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されているいずれのものであってもよく、または当該技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【００８８】
第一の融合相手として使用することができる非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号５の
【化３６】

が挙げられる。
【００８９】
非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号５の
【化３７】

が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号５内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されているいずれのものであってもよく、または当該技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【００９０】
ＰＤ−Ｌ２タンパク質は、また、配列番号３（ヒト全長）のアミノ酸２０−１２１または配列番号２３（細胞外ドメインまたはＥＣＤ）のアミノ酸１−１０２のＰＤ−１結合断片も含む。その特定の実施形態においては、ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドまたはＰＤ−１結合断片はまた、配列番号３の残基１１０−１１４にアミノ酸ＷＤＹＫＹを、または配列番号２３の残基９１−９５にＷＤＹＫＹを組み込んでいる。限定されない例としてが、このようなＰＤ−１結合断片は、配列番号３のアミノ酸２０−１２１の配列の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含んでなり、このようなＰＤ−１結合断片のそれぞれの好ましい実施形態は、部分断片として配列番号３の残基１１０−１１４に見られるアミノ酸ＷＤＹＫＹ、または配列番号２３の残基９１−９５に見られるＷＤＹＫＹを含んでなる。
【００９１】
２．ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン
一つの実施形態においては、変異体ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは細胞外ドメインの全部または一部を含む。ＰＤ−Ｌ１の代表的な細胞外ドメインのアミノ酸配列は、
【化３８】

（配列番号３２）
と８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有し得る。
【００９２】
ＰＤ−Ｌ１の膜貫通ドメインは配列番号９の２３９番のアミノ酸で始まる。ＰＤ−Ｌ１の好適な断片は、シグナルペプチド配列、例えば、配列番号９またはその変異体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続するアミノ酸、膜貫通ドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸、またはその組合せを含み得る。
【００９３】
ネズミＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは以下のアミノ酸配列：
【化３９】

（配列番号３３）
を有する。
【００９４】
ネズミＰＤ−Ｌ１の膜貫通ドメインは配列番号７の２４０番のアミノ酸で始まる。ある特定の実施形態においては、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、シグナルペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続するアミノ酸、膜貫通ドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続するアミノ酸、またはその組合せを有するネズミＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを含む。
【００９５】
３．Ｂ７．１細胞外ドメイン
ａ．ネズミＢ７．１細胞外ドメイン
一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ネズミＢ７．１またはその断片の細胞外ドメインを含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、
【化４０】

（配列番号３４）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００９６】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化４１】

（配列番号３５）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【００９７】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号３６は、シグナル配列を含まない配列番号３５のネズミアミノ酸配列を示す。
【化４２】

（配列番号３６）
【００９８】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはネズミＢ７．１のＩｇＶドメインを含む。第一の融合相手は、
【化４３】

（配列番号３７）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００９９】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化４４】

（配列番号３８）（Ｂ７．１Ｖとも呼ばれる）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１００】
ｂ．ヒトＢ７．１細胞外ドメイン
一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはヒトＢ７．１またはその断片の細胞外ドメインを含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、
【化４５】

（配列番号３９）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１０１】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化４６】

（配列番号４０）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１０２】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号４１は、シグナル配列を含まない配列番号４０のヒトアミノ酸配列を示す。
【化４７】

（配列番号４１）
【０１０３】
別の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはヒトＢ７．１のＩｇＶドメインを含む。第一の融合相手は、
【化４８】

（配列番号４２）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１０４】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化４９】

（配列番号４３）（Ｂ７．１Ｖとも呼ばれる）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１０５】
３．Ｂ７．１細胞外ドメイン断片
共刺激ポリペプチドドメインとして使用することができるネズミＢ７．１の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号１１の
【化５０】

が挙げられる。
【０１０６】
ネズミＢ７．１のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号１１の
【化５１】

が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号１１内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されているいずれのものであってもよく、または当該技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【０１０７】
共刺激ポリペプチドドメインとして使用することができるヒトＢ７．１の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号１３の
【化５２】

が挙げられる。
【０１０８】
ヒトＢ７．１のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号１３の
【化５３】

が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号１３内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されているいずれのものであってもよく、または当該技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【０１０９】
Ｅ．変異体
１．変異体ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ ＰＤ−１アンタゴニスト
さらなるＰＤ−１アンタゴニストとしては、生理学的条件下でＰＤ−１と結合する能力保持し、非突然変異ＰＤ−１に比べてＰＤ−１に対する結合が増強されているか、またはＰＤ−１に対する結合が低下されているが、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を促進することができないように突然変異誘発されたＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１、ポリペプチドおよびその断片が含まれる。一実施形態は、ＰＤ−１を活性化し、Ｔ細胞へ阻害シグナルを伝達するポリペプチドの能力を非突然変異ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１に比べて阻害または低減する１以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む単離されたＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを提供する。該ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはいずれの起源種のものであってもよい。一つの実施形態においては、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは哺乳類種に由来する。好ましい実施形態においては、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはヒトまたは非ヒト霊長類起源のものである。
【０１１０】
別の実施形態においては、変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、ＰＤ−１に対して野生型または非変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１と同じ結合活性を有するが、非突然変異ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドに比べてＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を刺激する能力を持たないか、または１０％未満である。他の実施形態においては、該変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは野生型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１よりもＰＤ−１に対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれを超える結合活性を有し、非突然変異ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドに比べてＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を刺激する能力が５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満である。
【０１１１】
変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失または挿入の任意の組合せを有し得る。一つの実施形態においては、単離されたＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１変異型ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列が野生型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５、または１００％の同一性を有するように、ある整数のアミノ酸変化を有する。好ましい実施形態においては、Ｂ７−Ｈ１変異型ポリペプチドは、野生型ネズミ、非ヒト霊長類またはヒトＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１１２】
配列同一性％は、コンピュータープログラムまたは直接的配列比較を用いて計算することができる。二つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、限定されるものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられる（例えば、D. W. Mount, 2001, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 参照）。ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラムはＮＣＢＩおよび他のソースから公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用可能である。
【０１１３】
アミノ酸配列比較のためのパラメーター例としては以下のものが挙げられる：１）Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970))からのアルゴリズム、２）Hentikoff and Hentikoff (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:10915-10919 (1992))からのＢＬＯＳＳＵＭ６２比較マトリックス、３）ギャップペナルティー＝１２、および４）ギャップレングスペナルティー＝４。これらのパラメーターを用いる有用なプログラムは、「ギャップ」プログラム(Genetics Computer Group, Madison, Wis.)として公的に入手可能である。上述のパラメーターはポリペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（エンドギャップに対するペナルティーは無い）。
【０１１４】
あるいは、ポリペプチド配列同一性は、下式：同一性％＝（同一の残基の数）／（アミノ酸残基のアライメント長）＊１００を用いて計算することができる。この計算では、アライメント長は内部ギャップを含むが、末端ギャップは含まない。
【０１１５】
ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸置換は「保存的」または「非保存的」であり得る。本明細書において、「保存的」アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する置換であり、「非保存的」アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の電荷、疎水性または嵩が有意に変更されるものである。非保存的置換は、（ａ）例えば、シートまたはらせんコンフォメーションのような置換領域におけるペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの効果がより有意に異なる。
【０１１６】
保存的アミノ酸置換の例としては、置換が以下の５群のうち一つの中でのものが挙げられる：１）小さな脂肪族、非極性またはやや極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、２）極性、負電荷を有する残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）、極性、正電荷を有する残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、大きな脂肪族、非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）、および大きな芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。非保存的アミノ酸置換の例としては、１）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）から（またはにより）置換される場合、２）システインまたはプロリンが他の残基から（またはにより）置換される場合、３）電気的に陽性の側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニルまたはヒスチジル）が電気的に陰性の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）から（またはにより）置換される場合、または４）嵩高の側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が側鎖を持たない残基（例えば、グリシン）から（またはにより）置換される場合が挙げられる。
【０１１７】
しかしながら、挙げられたアミノ酸位置における置換は、任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体を用いて行うことができると理解される。例えば、挙げられた位置における置換は、任意の天然アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、バリン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、トレオニン、セリン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシン）を用いて行うことができる。
【０１１８】
本明細書に記載される置換はマウス、非ヒト霊長類およびヒトＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１に関するものであるが、当業者ならば他種（例えば、ラット、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、またはウシ）由来の相当するポリペプチドにおいても等価の変更を容易に行うことができることを注記しておく。しかしながら、結合は種特異的な成分であることから、ＰＤ−１アンタゴニストをヒト投与する場合にはヒトを使用するのが好ましい。
【０１１９】
一つの実施形態においては、開示されている単離された変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはＰＤ−１のアンタゴニストであり、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合してそれを遮断する。ＰＤ−１シグナル伝達によるＴ細胞の減衰を妨げることにより、より多くのＴ細胞の活性化に利用可能とする。Ｔ細胞阻害を妨げると、ＰＤ−１アンタゴニストと接触していないＴ細胞に比べて、Ｔ細胞応答が高まるか、Ｔ細胞の増殖が増大し、Ｔ細胞によるサイトカインの産生および／または分泌が高まるか、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能が刺激されるか、またはＴ細胞の生存が促進される。この相互作用から生じるＴ細胞応答は一般に、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの非存在下での応答よりも大きい。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの非存在下でのＴ細胞の応答は応答性がないか、またはＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの存在下よりも有意に低いものであり得る。このＴ細胞の応答は、エフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答、１以上のエフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答を助けるヘルパー応答または抑制的応答であり得る。
【０１２０】
２分子間の結合親和性を測定する方法は技術分野でよく知られている。ＰＤ−１に対する変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの結合親和性を測定する方法としては、限定されるものではないが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、表面プラズモン共鳴、蛍光異方性、アフィニティークロマトグラフィー、および親和性選択−質量分析が挙げられる。
【０１２１】
本明細書に開示される変異型ポリペプチドは全長ポリペプチドであってもよいし、あるいは全長ポリペプチドの断片であってもよい。好ましい断片は、ＰＤ−１と結合するのに有効な細胞外ドメインの全部または一部を含む。本明細書において、断片とは、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。
【０１２２】
２．変異型Ｂ７．１およびＰＤ−１アンタゴニスト
さらなるＰＤ−１アンタゴニストとしては、生理学的条件下でＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１と結合する能力を保持し、ＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１対する結合が増強されるか、または低下されるように改変されているＢ７．１およびＰＤ−１ポリペプチドおよびその断片が含まれる。Ｂ７．１およびＰＤ−１ポリペプチドはいずれの起源種のものであってもよい。一つの実施形態においては、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドは哺乳類種に由来する。好ましい実施形態においては、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドはヒトまたは非ヒト霊長類起源のものである。
【０１２３】
変異型Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドはアミノ酸置換、欠失または挿入の任意の組合せを有し得る。一つの実施形態においては、単離されたＢ７．１またはＰＤ−１変異型ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列が野生型Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５、または１００％の同一性を有するように、ある整数のアミノ酸変化を有する。好ましい実施形態においては、Ｂ７．１またはＰＤ−１変異型ポリペプチドは、野生型ネズミ、非ヒト霊長類またはヒトＢ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２４】
Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドにおけるアミノ酸置換は「保存的」または「非保存的」であり得る。保存的および非保存的置換は上記に定義されている。
【０１２５】
一つの実施形態においては、開示されている単離された変異型Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドは、ＰＤ−１のアンタゴニストであり、ＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１と結合し、それによりそれらの内因性ＰＤ−１との結合を遮断する。ＰＤ−１シグナル伝達によるＴ細胞の減衰を妨げることにより、より多くのＴ細胞を活性化に利用可能とする。Ｔ細胞阻害を妨げると、ＰＤ−１アンタゴニストと接触していないＴ細胞に比べて、Ｔ細胞応答が高まるか、Ｔ細胞の増殖が増大するか、Ｔ細胞によるサイトカインの産生および／または分泌が高まるか、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能が刺激されるか、またはＴ細胞の生存が促進される。この相互作用から生じるＴ細胞応答は一般に、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの非存在下での応答よりも大きい。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの非存在下でのＴ細胞の応答は応答性がないか、またはＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの存在下よりも有意に低いものであり得る。このＴ細胞の応答は、エフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答、１以上のエフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答を助けるヘルパー応答または抑制的応答であり得る。
【０１２６】
変異体ポリペプチドは全長ポリペプチドであってもよいし、あるいは全長ポリペプチドの断片であってもよい。好ましい断片は、ＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１と結合するのに有効な細胞外ドメインの全部または一部を含む。本明細書において、断片とは、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。
【０１２７】
Ｆ．融合タンパク質
いくつかの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストは、第一のポリペプチドドメインと、その融合タンパク質を腫瘍細胞または腫瘍細胞関連新生血管系に標的化する抗原結合ドメインである第二の標的化ドメインとを含む融合タンパク質である。この融合タンパク質はＴ細胞受容体に結合することができるか、またはＴ細胞応答を増強することができ、あるいは好ましくはこの融合タンパク質は、例えばＰＤ−１と競合的に結合することによって、Ｔ細胞と結合して、Ｔ細胞への阻害的シグナル伝達を遮断することができる。開示されている組成物は、天然阻害リガンドとＰＤ−１との結合に干渉することにより、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を有効に遮断する。好適な共刺激ポリペプチドとしては、阻害性Ｔ細胞シグナル伝達受容体に対する結合親和性が増強または低下されたＰＤ−１などの変異型ポリペプチドおよび／またはその断片が含まれる。
【０１２８】
融合タンパク質はまた場合により、第一のポリペプチドドメインを抗原結合ドメインから分離するペプチドまたはポリペプチドリンカードメインを含んでもよい。
【０１２９】
本明細書に開示される融合タンパク質は式Ｉ：
Ｎ−Ｒ_１−Ｒ_２−Ｒ_３−Ｃ
（式中、「Ｎ」は融合タンパク質のＮ末端を表し、「Ｃ」は融合タンパク質のＣ末端を表し、「Ｒ_１」はＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドまたは抗原結合標的化ドメインであり、「Ｒ_２」はペプチド／ポリペプチドリンカードメインであり、「Ｒ_３」は標的化ドメインまたは抗原結合標的化ドメインであり、ここで、「Ｒ_１」が抗原結合標的化ドメインである場合には、「Ｒ_３」はポリペプチドドメインであり、「Ｒ_１」がＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドドメインである場合には、「Ｒ３」は抗原結合標的化ドメインである）
で表されるものである。好ましい実施形態においては、「Ｒ_１」はＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１、またはＰＤ−１ポリペプチドドメインであり、「Ｒ_３」は抗原結合標的化ドメインである。
【０１３０】
場合により、融合タンパク質はさらに、２以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをするドメインを含む。該融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをするドメインは別個のドメインであってもよいし、あるいはまたその融合タンパク質の他のドメイン（ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１もしくはＰＤ−１ポリペプチドドメイン、抗原結合標的化ドメインまたはペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）の一つに含まれていてもよい。
【０１３１】
融合タンパク質は二量体化または多量体化されていてもよい。二量体化または多量体化は二量体化または多量体化ドメインを介して２以上の融合タンパク質間で生じ得る。あるいは、融合タンパク質の二量体化または多量体化は化学的架橋によっても生じる。形成される二量体または多量体は、ホモ二量体／ホモ多量体またはヘテロ二量体／ヘテロ多量体であり得る。
【０１３２】
融合タンパク質のモジュール性およびそれらの種々の組合せでの二量体化または多量体化能は、腫瘍細胞の微小環境に対する免疫応答を増強する働きをする標的化分子に豊富な選択肢を与える。
【０１３３】
１．抗原結合標的化ドメイン
融合タンパク質はまた抗原結合標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態においては、標的化ドメインは腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管系に特異的であるか、または正常組織に比べて腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管系でアップレギュレートされている抗原、リガンドまたは受容体と結合する。いくつかの実施形態においては、標的化ドメインは、感染性疾患を引き起こす病原体に応答したＴ細胞の活性化の調節に関与する免疫組織に特異的な抗原、リガンド、または受容体と結合する。
【０１３４】
腫瘍／腫瘍関連血管系標的化ドメイン
腫瘍特異的および腫瘍関連抗原を標的化するための抗原、リガンド、および受容体
一つの実施形態においては、融合タンパク質は、腫瘍細胞により発現される抗原と特異的に結合するドメインを含む。腫瘍により発現される抗原は腫瘍に特異的なものであっても、非腫瘍細胞に比べて腫瘍細胞でより高いレベルで発現されるものでもよい。腫瘍関連抗原として知られる血清学的に定義されたマーカーなど、癌細胞によって独自に発現されるか、または適当な対照に比べて悪性症状を有する被験体において著しく高いレベルで存在する（例えば、統計学的に有意に上昇している）抗原マーカーがある特定の実施形態での使用に意図される。
【０１３５】
腫瘍関連抗原としては、例えば、細胞癌遺伝子によりコードされている産物または発現の異常な原癌遺伝子によりコードされている産物（例えば、ｎｅｕ、ｒａｓ、ｔｒｋ、およびｋｉｔ遺伝子によりコードされている産物）または増殖因子受容体もしくは受容体様細胞表面分子（例えば、ｃ−ｅｒｂ Ｂ遺伝子によりコードされている表面受容体）の突然変異型を含み得る。他の腫瘍関連抗原としては、形質転換事象に直接関与すると思われる分子または発癌性形質転換事象に直接関与するとは思われないが腫瘍細胞により発現される分子（例えば、癌胎児性抗原、ＣＡ−１２５、黒色腫(melonoma)関連抗原など）が含まれる（例えば、米国特許第６，６９９，４７５号公報、Jager, et al., Int. J. Cancer, 106:817-20 (2003)、 Kennedy, et al., Int. Rev. Immunol., 22:141-72 (2003)、 Scanlan, et al. Cancer Immun., 4:1 (2004)参照）。
【０１３６】
細胞腫瘍関連抗原をコードする遺伝子としては、細胞癌遺伝子および発現の異常な原癌遺伝子が含まれる。一般に、細胞癌遺伝子は細胞の形質転換に直接関連のある産物をコードし、このためこれらの抗原は免疫療法にとって特に好ましい標的である。例として、発癌性形質転換に関与する細胞表面分子をコードする腫瘍形成ｎｅｕ遺伝子がある。他の例としては、ｒａｓ、ｋｉｔ、およびｔｒｋ遺伝子が挙げられる。これらの原癌遺伝子（突然変異誘発されて癌遺伝子を形成する正常な遺伝子）の産物は異常な発現を示す（例えば、過剰発現する）ことがあり、この異常な発現は細胞の形質転換に関連する可能性がある。よって、原癌遺伝子によりコードされている産物は標的化可能である。いくつかの癌遺伝子は腫瘍細胞表面で発現される増殖因子受容体分子または増殖因子受容体様分子をコードする。例として、ｃ−ｅｒｂＢ遺伝子によりコードされている細胞表面受容体がある。他の腫瘍関連抗原は悪性形質転換に直接関与するかもしれないし、関与しないかもしれない。しかしながら、これらの抗原はある特定の腫瘍細胞で発現され、従って、有効な標的となる。いくつかの例として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５（卵巣癌に関連）、および黒色腫特異的抗原がある。
【０１３７】
卵巣癌および他の癌腫においては、例えば、腫瘍関連抗原は、血清または粘膜分泌物などの容易に得られる体液のサンプル中で検出可能である。このようなマーカーの一つが、血流中にも放出され、血清中で検出可能な癌腫関連抗原であるＣＡ１２５である（例えば、Bast, et al., N. Eng. J. Med., 309:883 (1983)、 Lloyd, et al., Int. J. Canc., 71:842 (1997)）。卵巣癌および他の癌腫の診断および／または予後プロファイルを得る努力において、血清および他の体液中のＣＡ１２５レベルが、他のマーカー、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、扁平上皮癌抗原（ＳＣＣ）、組織ポリペプチド特異的抗原（ＴＰＳ）、シアリルＴＮムチン（ＳＴＮ）、および胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）のレベルとともに測定されている（例えば、Sarandakou, et al., Acta Oncol., 36:755 (1997)、 Sarandakou, et al., Eur. J. Gynaecol. Oncol., 19:73 (1998)、 Meier, et al., Anticancer Res., 17(4B):2945 (1997)、 Kudoh, et al., Gynecol. Obstet. Invest., 47:52 (1999))。また神経芽腫にも高い血清ＣＡ１２５が伴っている場合があり（例えば、Hirokawa, et al., Surg. Today, 28:349 (1998)）、中でも高いＣＥＡおよびＳＣＣが直腸直腸癌に伴っている場合がある(Gebauer, et al., Anticancer Res., 17(4B):2939 (1997))。
【０１３８】
モノクローナル抗体Ｋ−１との反応性によって定義される腫瘍関連抗原メソテリンは、上皮卵巣腫瘍、子宮頸腫瘍、および食道腫瘍を含む扁平上皮癌の大多数ならびに中皮腫に存在する(Chang, et al., Cancer Res., 52:181 (1992)、 Chang, et al., Int. J. Cancer, 50:373 (1992)、 Chang, et al., Int. J. Cancer, 51:548 (1992)、 Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:136 (1996)、 Chowdhury, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:669 (1998))。ＭＡｂ Ｋ−１を用いた場合、メソテリンは細胞関連腫瘍マーカーとして唯一検出可能であり、卵巣癌患者由来の血清またはＯＶＣＡＲ−３細胞により馴化された培地中には可溶性形態で見られたことはない(Chang, et al., Int. J. Cancer, 50:373 (1992))。しかしながら、構造的に関連のあるヒトメソテリンポリペプチドにはまた、悪性腫瘍を有する患者由来の体液で天然可溶性抗原として検出可能な明瞭に異なるメソテリン関連抗原（ＭＲＡ）ポリペプチドなどの腫瘍関連抗原ポリペプチドも含む（ＷＯ００／５０９００号公報参照）。
【０１３９】
腫瘍抗原は細胞表面分子を含み得る。既知の構造が既知で、既知のまたは記載された機能を有する腫瘍抗原としては、以下の細胞表面受容体：ＨＥＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４８７２２）、ＨＥＲ２(Yoshino, et al., J. Immunol., 152:2393 (1994)、 Disis, et al., Canc. Res., 54:16 (1994)、 ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３３６３およびＭ１７７３０)、ＨＥＲ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２９３３９およびＭ３４３０９）、ＨＥＲ４(Plowman, et al., Nature, 366:473 (1993)、 ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０７８６８およびＴ６４１０５)、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４８７２２およびＫＯ３１９３）、血管内皮細胞増殖因子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ３２９７７）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２２３７５、１６８０１４３、Ｕ４８８０１およびＸ６２５６８）、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ００１７３、Ｘ５６７７４、Ｘ５６７７３、Ｘ０６０４３、欧州特許第ＧＢ２２４１７０３号公報）、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３５６２、Ｘ００９１０、Ｍ１７８６３およびＭ１７８６２）、トランスフェリン受容体（Trowbridge and Omary, Proc. Nat. Acad. USA, 78:3039 (1981)、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０１０６０およびＭ１１５０７）、エストロゲン受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３８６５１、Ｘ０３６３５、Ｘ９９１０１、Ｕ４７６７８およびＭ１２６７４）、プロゲステロン受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５１７３０、Ｘ６９０６８およびＭ１５７１６）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨ−Ｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ３４２６０およびＭ６５０８５）、レチノイン酸受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１２０６０、Ｍ６０９０９、Ｘ７７６６４、Ｘ５７２８０、Ｘ０７２８２およびＸ０６５３８）、ＭＵＣ−１（Barnes, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:7159 (1989)、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６５１３２およびＭ６４９２８）ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００３１４９およびＵ８７４５９）、ＮＡ１７−Ａ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４００３９号公報）、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１（Kawakami, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:3515 (1994)、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０６６５４およびＵ０６４５２）、チロシナーゼ（Topalian, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:9461 (1994)、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２６７２９、Weber, et al., J. Clin. Invest, 102:1258 (1998)）、Ｇｐ−１００（Kawakami, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:3515 (1994)、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７３００３、Adema, et al., J. Biol. Chem., 269:20126 (1994)）、ＭＡＧＥ(van den Bruggen, et al., Science, 254:1643 (1991))、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ９３１６３、ＡＦ０６４５８９、Ｕ６６０８３、Ｄ３２０７７、Ｄ３２０７６、Ｄ３２０７５、Ｕ１０６９４、Ｕ１０６９３、Ｕ１０６９１、Ｕ１０６９０、Ｕ１０６８９、Ｕ１０６８８、Ｕ１０６８７、Ｕ１０６８６、Ｕ１０６８５、Ｌ１８８７７、Ｕ１０３４０、Ｕ１０３３９、Ｌ１８９２０、Ｕ０３７３５およびＭ７７４８１）、ＢＡＧＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１９１８０、米国特許第５，６８３，８８６号公報および同第５，５７１，７１１号公報）、ＧＡＧＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５５４７５、ＡＦ０５５４７４、ＡＦ０５５４７３、Ｕ１９１４７、Ｕ１９１４６、Ｕ１９１４５、Ｕ１９１４４、Ｕ１９１４３およびＵ１９１４２）、特に、ＳＳＸ２遺伝子によりコードされているＨＯＭ−ＭＥＬ−４０抗原（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ８６１７５、Ｕ９０８４２、Ｕ９０８４１およびＸ８６１７４）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ、Gold and Freedman, J. Exp. Med., 121:439 (1985)、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５９７１０、Ｍ５９２５５およびＭ２９５４０）およびＰｙＬＴ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２２８９およびＪ０２０３８）を含む任意のＣＴＡクラス受容体、ｐ９７（メラノトランスフェリン）(Brown, et al., J. Immunol., 127:539-46 (1981)、 Rose, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1261-61 (1986))が含まれる。
【０１４０】
さらなる腫瘍関連抗原としては、前立腺表面抗原（ＰＳＡ）（米国特許第６，６７７，１５７号公報、同第６，６７３，５４５号公報）、β−ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβ−ＨＣＧ）(McManus, et al., Cancer Res., 36:3476-81 (1976)、 Yoshimura, et al., Cancer, 73:2745-52 (1994)、 Yamaguchi, et al., Br. J. Cancer, 60:382-84 (1989): Alfthan, et al., Cancer Res., 52:4628-33 (1992))、グリコシルトランスフェラーゼβ−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ）(Hoon, et al., Int. J. Cancer, 43:857-62 (1989)、 Ando, et al., Int. J. Cancer, 40:12-17 (1987)、 Tsuchida, et al., J. Natl. Cancer, 78:45-54 (1987)、 Tsuchida, et al., J. Natl. Cancer, 78:55-60 (1987))、ＮＵＣ１８(Lehmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9891-95 (1989)、 Lehmann, et al., Cancer Res., 47:841-45 (1987))、黒色腫抗原ｇｐ７５(Vijayasardahi, et al., J. Exp. Med., 171:1375-80 (1990)、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５１４５５）、ヒトサイトケラチン８、高分子量黒色腫抗原(Natali, et al., Cancer, 59:55-63 (1987)、 ケラチン１９(Datta, et al., J. Clin. Oncol., 12:475-82 (1994))が含まれる。
【０１４１】
注目される腫瘍抗原としては、悪性症状を有する被験体において免疫原性である、当該技術分野で「癌／精巣」（ＣＴ）抗原としてみなされている抗原が含まれる(Scanlan, et al., Cancer Immun., 4:1 (2004))。ＣＴ抗原としては、１以上のメンバーを含み、免疫応答を誘導し得る、限定されるものではないが、ＭＡＧＥＡ（ＣＴ１）、ＢＡＧＥ（ＣＴ２）、ＭＡＧＥＢ（ＣＴ３）、ＧＡＧＥ（ＣＴ４）、ＳＳＸ（ＣＴ５）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＣＴ６）、ＭＡＧＥＣ（ＣＴ７）、ＳＹＣＰ１（Ｃ８）、ＳＰＡＮＸＢ１（ＣＴ１１．２）、ＮＡ８８（ＣＴ１８）、ＣＴＡＧＥ（ＣＴ２１）、ＳＰＡ１７（ＣＴ２２）、ＯＹ−ＴＥＳ−１（ＣＴ２３）、ＣＡＧＥ（ＣＴ２６）、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５（ＣＴ２８）、ＨＣＡ６６１（ＣＴ３０）、ＮＹ−ＳＡＲ−３５（ＣＴ３８）、ＦＡＴＥ（ＣＴ４３）、およびＴＰＴＥ（ＣＴ４４）を含む、少なくとも１９の異なるファミリーの抗原が含まれる。
【０１４２】
腫瘍関連または腫瘍特異的抗原を含む標的化され得るさらなる腫瘍抗原としては、限定されるものではないが、α−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、β−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−１、２および３、ネオ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、Ｂａｇｅ−１、Ｇａｇｅ ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、Ｌａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−Ａ１、２、３、４、６、１０、１２、Ｍａｇｅ−Ｃ２、ＮＡ−８８、ＮＹ−Ｅｓｏ−１／Ｌａｇｅ−２、ＳＰ１７、ＳＳＸ−２およびＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ １９−９、ＣＡ ７２−４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトタンパク質、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５−３（ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが挙げられる。他の腫瘍関連および腫瘍特異的抗原は当業者に知られており、開示されている融合タンパク質による標的化に好適である。
【０１４３】
腫瘍新生血管系に関連する抗原
タンパク質治療薬は腫瘍浸透において有効でないため、腫瘍の処置に有効でない可能性がある。腫瘍関連新生血管系は、タンパク質治療薬が腫瘍へ接近し得る容易に接近可能な経路を提供する。別の実施形態においては、融合タンパク質は、腫瘍に関連する新生血管系により発現される抗原と特異的に結合するドメインを含む。
【０１４４】
該抗原は腫瘍の新生血管系に特異性があり得るか、または正常な血管系に比べて腫瘍の新生血管系で高いレベルで発現され得る。正常な血管に比べて腫瘍関連新生血管系により過剰発現される抗原の例としては、限定されるものではないが、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ、Ｔｉｅ２、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、エンドグリンおよびα５β３インテグリン／ビトロネクチンが挙げられる。正常な血管系に比べて腫瘍関連新生血管系により過剰発現される他の抗原は当業者に知られており、開示されている融合タンパク質による標的化に好適である。
【０１４５】
ケモカイン／ケモカイン受容体
別の実施形態においては、融合タンパク質はケモカインまたはケモカイン受容体と特異的に結合するドメインを含む。ケモカインは、それらのコグネイトＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と結合して細胞応答、通常には指向性移動または走化性を惹起する可溶性で小分子量（８〜１４ｋＤａ）のタンパク質である。腫瘍細胞はケモカインを分泌し、ケモカインに応答し、これにより内皮細胞の補充および脈管形成により達成される増殖、免疫監視の破壊ならびにケモカイン放出が腫瘍増殖および遠位部位への転移を可能とするようにそれを歪曲する腫瘍白血球特性の策略を助長する。よって、ケモカインは腫瘍の進行に極めて重要である。
【０１４６】
ケモカインの二つのＮ末端システイン残基を保存している位置に基づき、それらは４つの群、すなわち、ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３Ｃ、およびＣケモカインに分類される。ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣ配列に先行するモチーフ「ｇｌｕ−ｌｅｕ−ａｒｇ（ＥＬＲモチーフ）」の有無に基づいてさらにＥＬＲ＋およびＥＬＲ−ケモカインに分類することができる。ＣＸＣケモカインは、好中球、リンパ球、内皮細胞、および上皮細胞上のそれらのコグネイトケモカイン受容体と結合してそれらを活性化する。ＣＣケモカインは樹状細胞、リンパ球、マクロファージ、好酸球、ナチュラルキラー細胞のいくつかのサブセットに働くが、それらはネズミ好中球以外のＣＣケモカイン受容体を欠いているので好中球は刺激しない。およそ５０のケモカインとわずか２０のケモカイン受容体が存在するので、このリガンド／受容体相互作用系にはかなりの重複が存在する。
【０１４７】
腫瘍および間質細胞から合成されたケモカインは腫瘍および間質細胞上に存在するケモカイン受容体と結合する。腫瘍細胞の自己分泌ループおよび腫瘍と間質細胞の間のパラ分泌刺激ループは腫瘍の進行を助長する。特に、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、およびＣＣＲ７は腫瘍形成および転移に主要な役割を果たす。ＣＸＣＲ２は脈管形成に極めて重要な役割を果たし、ＣＣＲ２はマクロファージの腫瘍微小環境への動員に役割を果たす。リンパ節はＣＣＲ７に対するリガンドＣＣＬ２１を有するので、ＣＣＲ７は腫瘍細胞の前哨リンパ節への転移に関与する。ＣＸＣＲ４は主として多様な腫瘍の転移拡散に関与する。
【０１４８】
標的化ドメインの分子種
リガンドおよび受容体
一つの実施形態においては、腫瘍または腫瘍関連新生血管系標的化ドメインは、腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管系で特異的に発現される細胞表面抗原もしくは受容体と結合するか、または正常組織に比べて腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管系で過剰発現されるリガンドである。腫瘍はまた、腫瘍の増殖および発達に影響を及ぼす腫瘍微小環境中に多数のリガンドを分泌する。限定されるものではないが、増殖因子、サイトカイン、およびケモカイン（上記に示されるケモカインを含む）をはじめとする、腫瘍により分泌されるリガンドと結合する受容体は、開示されている融合タンパク質に用いるのに好適である。腫瘍により分泌されるリガンドは、分泌されたリガンドと結合する受容体の可溶性断片を用いて標的化され得る。可溶性受容体断片は産生細胞から放出、分泌またはそうでなければ抽出され得る断片ポリペプチドであり、全細胞外ドメインまたはその断片を含む。
【０１４９】
単鎖ポリペプチド抗体
別の実施形態においては、腫瘍または腫瘍関連新生血管系標的化ドメインは、腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生血管系で特異的に発現されるか、または正常組織に比べて腫瘍細胞もしくは腫瘍関連新生ポリペプチド血管系で過剰発現される細胞表面抗原または受容体と結合する単鎖抗体である。単鎖ドメイン抗体は共阻害性受容体アンタゴニストドメインに関して上記されている。
【０１５０】
Ｆｃドメイン
別の実施形態においては、腫瘍または腫瘍関連新生血管系標的化ドメインは、腫瘍細胞または腫瘍関連新生血管系で発現されるＦｃ受容体と結合する免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインである。本明細書においてＦｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、ＦｃはＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の二つの定常領域免疫グロブリンドメインとＩｇＥおよびＩｇＭの最後の三つの定常領域免疫グロブリンドメインを意味する。好ましい実施形態においては、Ｆｃドメインはヒトまたはネズミ免疫グロブリンに由来する。より好ましい実施形態においては、Ｆｃドメインは、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域を含むヒトＩｇＧ１またはネズミＩｇＧ２ａに由来する。
【０１５１】
一つの実施形態においては、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３域は、
【化５４】

（配列番号４４）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１５２】
配列番号４４によりコードされるヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域は以下のアミノ酸配列：
【化５５】

（配列番号４５）
を有する。
【０１５３】
別の実施形態においては、ネズミ免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３領域は、
【化５６】

（配列番号４６）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１５４】
配列番号４６によりコードされるネズミ免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３領域は以下のアミノ酸配列：
【化５７】

（配列番号４７）
を有する。
【０１５５】
一実施形態においては、Ｆｃドメインは、腫瘍もしくは腫瘍関連新生血管系で特異的に発現されるか、または正常組織に比べて腫瘍もしくは腫瘍関連新生ポリペプチド血管系で過剰発現される特異的Ｆｃ受容体との結合を増強する１以上のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含み得る。好適なアミノ酸置換は上記のように保存的および非保存的置換を含む。
【０１５６】
非ホジキンリンパ腫またはワルデンストロームマクログロブリン血症に対してリツキシマブ（キメラマウス／ＣＤ２０に対するヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体）で処置された患者における治療転帰は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対して明瞭な内因的親和性を有するＦｃγ受容体の対立遺伝子変異体の個々の発現と相関していた。特に、Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）を活性化する低親和性の高親和性対立遺伝子を有する患者はより高い奏功率を示し、非ホジキンリンパ腫の場合には、無進行生存を改善した。別の実施形態においては、Ｆｃドメインは、低親和性阻害Ｆｃ受容体ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）との結合を低減し、かつ、低親和性活性化Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）との野生型レベルの結合を保持するか、またはそれとの結合を増強する以上のアミノ酸挿入、欠失または置換を含み得る。
【０１５７】
好ましい実施形態においては、Ｆｃドメインは、ＣＤ１６Ａとの結合を増強するアミノ酸挿入、欠失または置換を含む。ＣＤ１６Ａとの結合を増強し、ＣＤ３２Ｂとの結合を低減するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの多数の置換が当該技術分野に知られており、Stavenhagen, et al., Cancer Res., 57(18):8882-90 (2007)に記載されている。ＣＤ３２Ｂとの結合が低減され、かつ／またはＣＤ１６Ａとの結合が増強されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの変異体の例は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩまたはＰ２９６Ｌ置換を含む。これらのアミノ酸置換はヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインにいずれの組合せで存在してもよい。一つの実施形態においては、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、およびＹ３００Ｌ置換を含む。別の実施形態においては、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン変異体はＦ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ２９６Ｌ置換を含む。
【０１５８】
グリコホスファチジルイノシトールアンカードメイン
別の実施形態においては、腫瘍または腫瘍関連新生血管系標的化ドメインは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの翻訳後付加のためのシグナルを与えるポリペプチドである。ＧＰＩアンカーは、多くの真核生物のタンパク質のＣ末端に翻訳後に付加される糖脂質構造である。この修飾は細胞膜の外片に付着タンパク質をしっかり固定する。ＧＰＩアンカーは、Ｔ細胞に対する提示のために細胞表面にＴ細胞受容体結合ドメインを付着させるのに使用することができる。この実施形態においては、ＧＰＩアンカードメインはＴ細胞受容体結合ドメインに対してＣ末端にある。
【０１５９】
一つの実施形態においては、ＧＰＩアンカードメインは、ポリペプチドが真核生物系で発現される場合にＧＰＩアンカーの翻訳後付加のためにシグナルを伝達するポリペプチドである。アンカーの付加はＧＰＩアンカーシグナル配列により決定され、アンカー付加の部位における小アミノ酸のセット（ω部位）とそれに続く親水性スペーサーからなり、疎水性ストレッチ(hydrophobic stretch)で終わる(Low, FASEB J., 3:1600-1608 (1989))。このシグナル配列の切断は、保存された中央成分(Low, FASEB J., 3:1600-1608 (1989))を有するが、可変の末梢部分(Homans et al., Nature, 333:269-272 (1988))を有するアンカーを付加する前にＥＲで起こる。ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端は、ホスホエタノールアミン橋を介して保存性の高いコアグリカン、マンノース（α１−２）マンノース（α１−６）マンノース（α１−４）グルコサミン（α１−６）ミオイノシトールに連結されている。リン脂質テールはＧＰＩアンカーを細胞膜に付着させる。このグリカンコアは、ホスホエタノールアミン基、マンノース、ガラクトース、シアル酸、または他の糖などの側鎖で様々に修飾することができる。第一のマンノース残基に付着されている最も一般的な側鎖は別のマンノースである。グリカンコアの第三のマンノースに付着されているＮ−アセチルガラクトサミン含有多糖などの複合側鎖が哺乳類アンカー構造に見られる。コアグルコサミンの修飾はまれである。タンパク質および起源種によって、ホスホイノシトール環の脂質アンカーは、ジアシルグリセロール、アルキルアシルグリセロール、またはセラミドである。これらの脂質種は炭素１４〜２８個の範囲で長さが異なり、飽和であっても不飽和であってもよい。多くのＧＰＩアンカーはまた、イノシトール環の２−ヒドロキシルにパルミチン酸などの付加的脂肪酸を含む。この余分な脂肪酸により、ＧＰＩアンカーはＰＩ−ＰＬＣによる切断に耐性となる。
【０１６０】
ＧＰＩアンカーは、ＧＰＩ翻訳後修飾を行うことができる真核生物系でＧＰＩアンカードメインを含む融合タンパク質を発現させることよって達成することができる。ＧＰＩアンカードメインは腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインとして使用することもできるし、あるいはすでに別個の腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインを含む融合タンパク質に追加することもできる。
【０１６１】
別の実施形態においては、ＧＰＩアンカー部分は、インビトロ酵素的または化学的工程を介して、単離されたＴ細胞受容体結合ドメインに直接付加される。この実施形態においては、ＧＰＩアンカーは、ＧＰＩアンカードメインを必要とすることなくポリペプチドに付加することができる。よって、ＧＰＩアンカー部分は、Ｔ細胞受容体結合ドメインおよび腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインを有する、本明細書に記載の融合タンパク質に付加することができる。あるいは、ＧＰＩアンカーは、腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインをコードする融合相手を必要とすることなく、Ｔ細胞受容体結合ドメインポリペプチドに直接付加することができる。
【０１６２】
２．ペプチドまたはポリペプチドリンカードメイン
本明細書に開示される融合タンパク質は場合により、共刺激ポリペプチドドメインを抗原結合標的化ドメインから分離するペプチドまたはポリペプチドリンカードメインを含む。
【０１６３】
抗体のヒンジ領域
一つの実施形態においては、リンカードメインは免疫グロブリンのヒンジ領域を含む。好ましい実施形態においては、ヒンジ領域はヒト免疫グロブリンに由来する。ヒンジが由来し得る好適なヒト免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＡが挙げられる。好ましい実施形態においては、ヒンジ領域はヒトＩｇＧに由来する。
【０１６４】
別の実施形態においては、リンカードメインは、上記のような免疫グロブリンのヒンジ領域を含み、さらに１以上の付加的な免疫グロブリンドメインを含む。一実施形態においては、付加的ドメインは免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。本明細書においてＦｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、ＦｃＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の二つの定常領域免疫グロブリンドメインとＩｇＥおよびＩｇＭの最後の三つの定常領域免疫グロブリンドメインを意味する。好ましい実施形態においては、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。より好ましい実施形態においては、ＦｃドメインはＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域を含むヒトＩｇＧに由来する。
【０１６５】
別の実施形態においては、リンカードメインは免疫グロブリンのヒンジ領域と、免疫グロブリン重鎖のＣ_Ｈ１ドメインまたは免疫グロブリン軽鎖のＣ_Ｌドメインのいずれかを含む。好ましい実施形態においては、Ｃ_Ｈ１またはＣ_Ｌドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。Ｃ_Ｌドメインはκ軽鎖またはl軽鎖のいずれかに由来するものであり得る。より好ましい実施形態においては、Ｃ_Ｈ１またはＣ_ＬドメインはヒトＩｇＧに由来する。
【０１６６】
免疫グロブリンヒンジ領域および他のドメインのアミノ酸配列は当該技術分野でよく知られている。
【０１６７】
他のペプチド／ポリペプチドリンカードメイン
他の好適なペプチド／ポリペプチドリンカードメインは、天然または非天然ペプチドまたはポリペプチドを含む。ペプチドリンカー配列は少なくともアミノ酸２個の長さである。好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドドメインは柔軟なペプチドまたはポリペプチドである。本明細書において「柔軟なリンカー」とは、柔軟なリンカーの非存在下で二つの連結されたポリペプチドが持つものよりも、それにより連結された二つのポリペプチドの回転自由度を高めるペプチド結合により連結された２以上のアミノ酸残基を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。このような回転自由度は、柔軟なリンカーによって各接近標的抗原に連結された２以上の抗原結合部位をより有効とする。柔軟なペプチド／ポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４８）、Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４９）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号５０）、および（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）４（配列番号５１）が挙げられる。さらなる柔軟なペプチド／ポリペプチド配列も当該技術分野でよく知られている。
【０１６８】
３．二量体化および多量体化ドメイン
本明細書に開示される融合タンパク質は場合により、２以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをする二量体化または多量体化ドメインを含む。融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをするドメインは分離ドメインであってもよいし、あるいはまた融合タンパク質の他のドメイン（Ｔ細胞共刺激／共阻害受容体結合ドメイン、腫瘍／腫瘍新生血管系抗原結合ドメインまたはペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）の一つの中に含まれてもよい。
【０１６９】
二量体化ドメイン
「二量体化ドメイン」とは、少なくとも二つのアミノ酸残基または少なくとも二つのペプチドもしくはポリペプチド（同じまたは異なるアミノ酸配列を持ち得る）の会合によって形成される。これらのペプチドまたはポリペプチドは共有結合的会合および／または非共有結合的会合によって互いに相互作用し得る。好ましい二量体化ドメインは、融合タンパク質相手上のシステインと分子間ジスルフィド結合を形成することができる少なくとも一つのシステインを含む。二量体化ドメインは、融合タンパク質相手の間でジスルフィド結合が形成できるように１以上のシステイン残基を含み得る。一つの実施形態においては、二量体化ドメインは一つ、二つ、または３つ〜約１０のシステイン残基を含む。好ましい実施形態においては、二量体化ドメインは免疫グロブリンのヒンジ領域である。この特定の実施形態においては、二量体化ドメインは融合タンパク質のリンカーペプチド／ポリペプチド内に含まれる。
【０１７０】
さらなる二量体化ドメインの例も当該技術分野で知られており、限定されるものではないが、コイルドコイル、アシッドパッチ(acid patches)、ジンクフィンガー、カルシウムハンド、Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｌ対、米国特許第５，８２１，３３３号公報に記載されている操作された「こぶ(knob)」および／または「突起(protruberance)」を有する「境界」、ロイシンジッパー（例えば、ｊｕｎおよび／またはｆｏｓ由来）（米国特許第５，９３２，４４８号公報）、ＳＨ２（ｓｒｃホモロジー２）、ＳＨ３（ｓｒｃホモロジー３）(Vidal, et al., Biochemistry, 43, 7336-44 ((2004))、ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）(Zhou, et al., Nature, 378:584-592 (1995))、ＷＷ(Sudol, Prog. Biochys. Mol. Bio., 65:113-132 (1996))、ＰＤＺ(Kim, et al., Nature, 378: 85-88 (1995)、 Komau, et al., Science, 269:1737-1740 (1995))１４−３−３、ＷＤ４０(Hu, et al., J Biol Chem., 273, 33489-33494 (1998))ＥＨ、Ｌｉｍ、イソロイシンジッパー、受容体二量体対（例えば、インターロイキン−８受容体（ＩＬ−８Ｒ）、ならびにインテグリンヘテロ二量体、例えば、ＬＦＡ−１およびＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａまたはその二量体化領域、二量体リガンドポリペプチド（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦメンバー、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）(Arakawa, et al., J. Biol. Chem., 269(45): 27833-27839 (1994)およびRadziejewski, et al., Biochem., 32(48): 1350 (1993))が挙げられ、親和性が変更されたこれらのドメインの変異体であってもよい。これらのポリペプチド対は、酵母二つのハイブリッドスクリーンを含む当該技術分野で知られている方法によって同定することができる。酵母ツーハイブリッドスクリーンは米国特許第５，２８３，１７３号公報および同第６，５６２，５７６号公報に記載されており、ともに引用することにより本明細書の開示の一部とされる。相互作用ドメイン対の間の親和性はKatahira, et al., J. Biol. Chem., 277, 9242-9246 (2002)の記載を含む、当該技術分野で知られている方法を用いて決定することができる。あるいは、ペプチド配列のライブラリーを、例えばＷＯ０１／００８１４号公報に記載されている方法を用いてヘテロ二量体形成に関してスクリーニングすることもできる。タンパク質−タンパク質相互作用に関する有用な方法はまた米国特許第６，７９０，６２４号公報にも記載されている。
【０１７１】
多量体化ドメイン
「多量体化ドメイン」とは、三つ以上のペプチドまたはポリペプチドを共有結合的会合および／または非共有結合的会合によって互いに相互作用させるドメインである。好適な多量体化ドメインとしては、限定されるものではないが、コイルドコイルドメインが挙げられる。コイルドコイルは、通常、７つのアミノ酸（ヘプタッドリピート）または１１のアミノ酸（ウンデカドリピート）の配列に、３および４残基の間隔を置いた主として疎水性の残基の連続パターンを有し、組み立てられて（折りたたまれて）多量性のらせん束を形成するペプチド配列を意味する。３および４残基おきのいくつかの不規則な分布を含む配列を有するコイルドコイルも意図される。疎水性残基は特に、疎水性アミノ酸Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、およびＴｒｐである。主として疎水性とは、残基の少なくとも５０％が記載の疎水性アミノ酸から選択されるべきであることを意味する。
【０１７２】
コイルドコイルドメインはラミニンに由来してもよい。細胞外間隙で、ヘテロ三量体コイルドコイルタンパク質ラミニンは基底膜の形成に重要な役割を果たす。明らかに、多機能オリゴマー構造はラミニン機能に必要である。コイルドコイルドメインはまた、三つ（ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２）または五つ（ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４、およびＴＳＰ−５）の鎖が接続されたトロンボスポンジンまたは平行５鎖コイルドコイル(Malashkevich ,et al., Science, 274: 761-765 (1996))へと折りたたまれるＣＯＭＰ（ＣＯＭＰｃｃ）(Guo, et at., EMBO J., 1998, 17: 5265-5272)に由来してもよい。
【０１７３】
他のタンパク質に由来するさらなるコイルドコイルドメインおよびポリペプチドの多量体化を媒介する他のドメインも当該技術分野で知られており、開示されている融合タンパク質で用いるのに好適である。
【０１７４】
４．融合タンパク質例
Ｂ７−ＤＣ
代表的なネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、
【化５８】

（配列番号５２）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１７５】
配列番号５２によりコードされているネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は以下のアミノ酸配列：
【化５９】

（配列番号５３）
を有する。
【０１７６】
シグナル配列を含まない配列番号５３のネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【化６０】

（配列番号５４）
である。
【０１７７】
代表的なヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、
【化６１】

（配列番号５５）
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１７８】
配列番号５５によりコードされているヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は以下のアミノ酸配列：
【化６２】

（配列番号５６）
を有する。
【０１７９】
シグナル配列を含まない配列番号５６のヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質のアミノ酸配列は
【化６３】

（配列番号５７）
である。
【０１８０】
Ｇ．ＰＤ−１受容体アンタゴニストをコードする単離された核酸分子
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチド、その変異体およびその融合タンパク質をコードする単離された核酸配列が開示される。本明細書において「単離された核酸」とは、哺乳類ゲノムにおいてその核酸の一端または両端に通常隣接している核酸をはじめ、哺乳類ゲノムに存在する他の核酸分子から分離された核酸を意味する。
【０１８１】
単離された核酸は、例えば、天然ゲノムにおいてそのＤＮＡ分子にすぐ隣接して通常見られる核酸配列の一つが除去されているか、または存在しない限り、ＤＮＡ分子であってもよい。よって、単離された核酸としては、限定されるものではないが、他の配列とは独立した分離分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学的に合成された核酸またはｃＤＮＡまたはＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるゲノムＤＮＡ断片）ならびにベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）に、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡが挙げられる。さらに、単離された核酸としては、ハイブリッドまたは融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子などの操作核酸が挙げられる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーの中の数百から数百万の他の核酸に存在する核酸、またはゲノムＤＮＡ制限消化を含むゲルスライスは単離された核酸とはみなさない。
【０１８２】
核酸はセンス配向であってもアンチセンス配向であってもよく、あるいはＢ７−ＤＣ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、またはＢ７．１ポリペプチドまたはその変異体をコードする参照配列と相補的であってもよい。参照配列としては、例えば、当該技術分野で知られており、上記に述べられているヒトＢ７−ＤＣ、ヒトＰＤ−Ｌ１、またはネズミＰＤ−Ｌ２およびネズミＰＤ−Ｌ１のヌクレオチド配列が含まれる。
【０１８３】
核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体であり得る。核酸類似体は塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖において修飾することができる。このような修飾は例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善することができる。塩基部分における修飾としては、デオキシチミジンをデオキシウリジン、デオキシシチジンを５−メチル−２’−デオキシシチジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシシチジンにいうものが挙げられる。糖部分の修飾としては、リボース糖の２’ヒドロキシルの修飾による２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖の形成が挙げられる。デオキシリボースリン酸主鎖は、各塩基部分が６員のモルホリノ環に連結されているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸主鎖がシュードペプチド主鎖で置換され、４つの塩基が保持されているペプチド核酸を生成するように修飾することができる。例えば、Summerton and Weller (1997) Antisence Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195、およびHyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5-23参照。さらに、デオキシリン酸主鎖は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート主鎖、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステル主鎖で置換することができる。
【０１８４】
Ｈ．ＰＤ−１受容体アンタゴニストを発現するベクターおよび宿主細胞
上記のものなどの核酸は、細胞で発現させるためにベクターに挿入することができる。本明細書において「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントが、挿入されたセグメントの複製が起こるように挿入され得る、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは発現ベクターであり得る。「発現ベクター」とは、１以上の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
【０１８５】
ベクター中の核酸は１以上の発現制御配列に機能的に連結させることができる。本明細書において「機能的に連結される」とは、発現制御配列が目的のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、および転写終結領域が挙げられる。プロモーターは、一般に、転写が開始する点の上流１００ヌクレオチド以内（一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位付近）のＤＮＡ分子の領域からなる発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、そのポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位ををプロモーターの下流１〜約１５ヌクレオチドの間に置く必要がある。エンハンサーは、時間、場所、およびレベルに関して発現特異性を与える。プロモーターとは異なり、エンハンサーは転写部位から様々な距離に位置する場合にも機能し得る。エンハンサーはまた、転写開始部位から下流に位置してもよい。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡへ転写することができ、それがコード配列によりコードされているタンパク質へ翻訳され得る場合に、「機能的に連結され」かつ細胞内の発現制御配列の「制御下」にある。
【０１８６】
好適な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。多くのベクターおよび発現系がNovagen (Madison, WI)、Clontech (Palo Alto, CA)、Stratagene (La Jolla, CA)およびInvitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)などの会社から市販されている。
【０１８７】
発現ベクターはタグ配列を含み得る。タグ配列は一般に、コードされているポリペプチドとの融合物として発現される。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端を含むポリペプチド内のいずれの位置にでも挿入することができる。有用なタグの例としては、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、血球凝集素、Ｆｌａｇ（商標）タグ(Kodak, New Haven, CT)、マルトースＥ結合タンパク質、およびタンパク質Ａが挙げられる。一つの実施形態においては、変異体ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、Ｉｇ重鎖定常領域の１以上のドメインをコードする、好ましくは、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域に相当するアミノ酸配列を有する核酸を含むベクター内に存在する。
【０１８８】
発現される核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することができる。「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターが導入可能な原核生物のおよび真核細胞を含むものとする。本明細書において、「形質転換される」および「トランスフェクトされる」は、多くの技術の一つによって核酸分子（例えばベクター）を細胞に導入することを包含する。特定の技術に限定されるものではないが、これらの技術の多くは当該技術分野で十分に確立されている。
【０１８９】
原核細胞は、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム媒介形質転換により核酸で形質転換させることができる。核酸は、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションを含む技術によって哺乳類細胞へトランスフェクトすることができる。宿主細胞（例えば、原核細胞または真核細胞、例えばＣＨＯ細胞）を用いて、例えば、本明細書に記載のＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドを生産することができる。
【０１９０】
Ｉ．抗体ＰＤ−１アンタゴニスト
ＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−１のエピトープと反応性のあるモノクローナルおよびポリクローナル抗体が開示されている。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）およびそれらの製造および使用方法は、Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)、米国特許第４，３７６，１１０号公報、Hartlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、 Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, N.Y. (1980)、 H. Zola et al., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, 1982に記載されている。
【０１９１】
ＰＤ−１と結合し、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を遮断し、かつ、現行使用されているものよりも親和性が低く、投与後３か月、２か月、１か月、３週間、２週間、１週間、または数日未満の期間で抗体を解離させる抗体が免疫応答の増強、増進または刺激に好ましい。
【０１９２】
イムノアッセイ法は、Coligan, J. E. et al., eds., Current Protocols in Immunology, Wiley-Interscience, New York 1991 (または最新版)、 Butt, W. R. (ed.) Practical Immunoassay: The State of the Art, Dekker, N.Y., 1984、 Bizollon, Ch. A., ed., Monoclonal Antibodies and New Trends in Immunoassays, Elsevier, N.Y., 1984、 Butler, J. E., ELISA (Chapter 29), In: van Oss, C. J. et al., (eds), Immunochemistry, Marcel Dekker, Inc., New York, 1994, pp. 759-803、 Butler, J. E. (ed.), Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1991、 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986、 Work, T. S. et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY, (1978) (Chapter by Chard, T., "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques")に記載されている。
【０１９３】
抗イディオタイプ抗体は、例えば、Idiotypy in Biology and Medicine, Academic Press, New York, 1984、 Immunological Reviews Volume 79, 1984、 Immunological Reviews Volume 90, 1986、 Curr. Top. Microbiol., Immunol. Volume 119, 1985、 Bona, C. et al., CRC Crit. Rev. Immunol., pp. 33-81 (1981)、 Jerme, N K, Ann. Immunol. 125C:373-389 (1974)、 Jerne, N K, In: Idiotypes--Antigens on the Inside, Westen-Schnurr, I., ed., Editiones Roche, Basel, 1982, Urbain, J. et al., Ann. Immunol. 133D:179-(1982)、 Rajewsky, K. et al., Ann. Rev. Immunol. 1:569-607 (1983)に記載されている。
【０１９４】
これらの抗体は、異種、同種異系、同系、またはその改変形態（ヒト化またはキメラ抗体など）であり得る。特定の抗体、例えば、抗ＰＤ−Ｌ２抗体のイディオタイプに特異的な抗イディオタイプ抗体も含まれる。「抗体」との用語は、完全分子ならびに抗原結合部位を含み、かつ、およびＰＤ−１アンタゴニストエピトープと結合することができるその断片の双方を含むことを意味する。これらには、完全抗体のＦｃ断片を欠き、循環からより迅速に排除され、完全抗体よりも低い非特異的組織結合性を持ち得るＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる(Wahl et al., J. Nuc. Med. 24:316-325 (1983))。また、Ｆｖ断片も含まれる(Hochman, J. et al. (1973) Biochemistry 12:1130-1135、 Sharon, J. et al.(1976) Biochemistry 15:1591-1594)。これらの種々の断片は、プロテアーゼ切断または化学的切断などの常法を用いて作製される（例えば、Rousseaux et al., Meth. Enzymol., 121:663-69 (1986)参照）。
【０１９５】
ポリクローナル抗体は、ウサギ、ヤギ、齧歯類などの免疫動物から血清として得られ、それ以上処理することなくそのまま用いてもよく、あるいは硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーなどの慣例の富化または精製方法を施してもよい。
【０１９６】
免疫原は、完全なＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−１もしくは断片またはその誘導体を含む。好ましい免疫原は、ＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の全部または一部を含み、ここで、これらの残基はグリコシル化などの翻訳後調節を含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、例えば、慣例の組換え法を用いたクローン化遺伝子の発現または起源細胞からの単離などの当該技術分野で知られている種々の方法で生産される。
【０１９７】
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975）により紹介された手順およびその改変法（上記の参照を参照）などの慣例のハイブリドーマ技術を用いて生産され得る。動物、好ましくはマウスを上記のような免疫原に感作させることにより初回刺激し、刺激動物に所望の抗体応答を惹起させる。初回刺激動物のリンパ節、脾臓または末梢血からのＢリンパ球を、一般にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの誘導促進剤の存在下で骨髄腫細胞と融合させる。多くのネズミ骨髄腫細胞系統はいずれもがこのような使用に利用できる：Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−ｋ０Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、またはＨＬ１−６５３骨髄腫系統（ATCC, Rockville, Md.から入手可能）。その後の工程は、融合されてない親骨髄腫細胞と、ドナーリンパ球細胞とがやがて死に至り、ハイブリドーマ細胞だけが生き残るような選択培地で増殖させることを含む。これらをクローニングし、増殖させ、それらの上清を、例えば、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を用いたイムノアッセイ技術によって所望の特異性の抗体が存在するか否かをスクリーニングする。例えば、制限希釈によって陽性クローンをサブクローニングし、モノクローナル抗体を単離する。
【０１９８】
これらの方法に従って生産されたハイブリドーマは、当該技術分野で知られている技術（一般に、Fink et al., Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)参照）を用いて、インビトロまたはインビボ（腹水中）で増殖させることができる。一般に、個々の細胞系統を培養で増殖させ、高濃度の単一モノクローナル抗体を含む培養培地を、デカンテーション、濾過または遠心分離によって採取することができる。
【０１９９】
抗体は、正常な多量体構造の代わりに単鎖抗体またはｓｃＦｖとして生産してもよい。単鎖抗体は、着目するＩｇに由来する超可変領域を含み、完全なＩｇのサイズの一部でありつつ、天然Ｉｇの抗原結合部位を再形成する(Skerra, A. et al. Science, 240: 1038-1041 (1988)、 Pluckthun, A. et al. Methods Enzymol. 178: 497-515 (1989)、 Winter, G. et al. Nature, 349: 293-299 (1991))。好ましい実施形態においては、抗体は慣例の分子生物学的技術を用いて生産される。
【０２００】
ＩＩＩ．製造方法
ＰＤ−１アンタゴニストの生産方法
ポリペプチドおよびその変異体
単離されたＰＤ−１アンタゴニストポリペプチド、その変異体およびその融合タンパク質は、例えば、化学的合成または宿主細胞での組換え生産によって得ることができる。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドを組換え生産するためには、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を用いて、細菌または真核生物宿主細胞（例えば、昆虫、酵母、または哺乳類細胞）に形質転換、形質導入またはトランスフェクションを行うことができる。一般に、核酸構築物は、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された調節配列を含む。調節配列（本明細書では発現制御配列とも呼ばれる）は一般に遺伝子産物をコードしないが、それらが機能的に連結されている核酸配列の発現に影響を与える。
【０２０１】
ポリペプチドを発現および生産するのに有用な原核生物系および真核生物系は当該技術分野でよく知られており、例えば、ＢＬ−２１などの大腸菌(Escherichia coli)株、およびＣＨＯ細胞などの培養哺乳類細胞が挙げられる。
【０２０２】
真核生物宿主細胞では、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドを発現させるために多くのウイルスに基づく発現系が利用可能である。ウイルスに基づく発現系は当該技術分野でよく知られており、限定されるものではないが、バキュロウイルス、ＳＶ４０、レトロウイルス、またはワクシニアに基づくウイルスベクターが挙げられる。
【０２０３】
変異体共刺激ポリペプチドを安定発現する哺乳類細胞系統は、適当な制御エレメントと、選択マーカーとを備えた発現ベクターを用いて作出することができる。例えば、真核生物発現ベクターｐＣＲ３．１(Invitrogen Life Technologies) およびｐ９１０２３（Ｂ）（Wong et al. (1985) Science 228:810-815参照）は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＭＤＣＫ細胞およびヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）での変異体共刺激ポリペプチドの発現に好適である。エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストランまたは他の好適なトランスフェクション方法による発現ベクターの導入の後、安定な細胞系統を選択することができる（例えば、Ｇ４１８、カナマイシンまたはハイグロマイシンに対する抗生物質耐性による）。トランスフェクト細胞は、目的のポリペプチドが発現されるように培養することができ、このポリペプチドを例えば、細胞培養上清または溶解細胞から回収することができる。あるいは、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、（ａ）増幅された配列をｐｃＤＮＡ３(Invitrogen Life Technologies)などの哺乳類発現ベクターに連結し、（ｂ）インビトロにおいてコムギ胚芽抽出液またはウサギ網状赤血球溶解液を用いて転写および翻訳することによって生産することもできる。
【０２０４】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、例えば、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過およびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を用いて単離することができる。例えば、細胞培養上清または細胞質抽出液中の共刺激ポリペプチドは、Ｇタンパク質カラムを用いて単離することができる。いくつかの実施形態においては、変異体共刺激ポリペプチドは、ポリペプチドを親和性マトリックスに捕捉させるアミノ酸配列を含むように「操作」することができる。ポリペプチドの精製を助けるために、例えば、ｃ−ｍｙｃ、血球凝集素、ポリヒスチジン、またはＦｌａｇ（商標）(Kodak)などのタグを使用することができる。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端を含むポリペプチド内のいずれの位置にも挿入することができる。有用であり得る他の融合物としては、アルカリ性ホスファターゼなど、ポリペプチドの検出を助ける酵素を含むことができる。共刺激ポリペプチドを精製するのに、イムノアフィニティークロマトグラフィーを使用することもできる。
【０２０５】
変異体ポリペプチドを作出するためにランダム突然変異を導入する方法は当該技術分野で知られている。ＰＤ−１受容体またはリガンドと相互作用するペプチドをスクリーニングするためにランダムペプチドディスプレーライブラリーを使用することができる。このようなランダムペプチドディスプレーライブラリーを作出およびスクリーニングするための技術は当該技術分野で知られており（Ladnerら、米国特許第５，２２３，４０９号号公報、Ladnerら、米国特許第４，９４６，７７８号、Ladnerら、米国特許第５，４０３，４８４号およびLadnerら、米国特許第５，５７１，６９８号）、ランダムペプチドディスプレーライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットが市販されている。
【０２０６】
Ｂ．ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドをコードする単離された核酸分子の生産方法
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、限定されるものではないが、一般的分子クローニングおよび化学的核酸合成技術を含む標準的技術によって生産することができる。例えば、変異体共刺激ポリペプチドをコードする単離された核酸を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。ＰＣＲは、標的核酸が酵素的に増幅される技術である。一般に、着目する領域の末端から、またはそれを超える配列情報を用いれば、増幅される鋳型の反対側の鎖と配列が同一であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲを用いて、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ由来の配列を含め、ＤＮＡならびにＲＮＡから特定の配列を増幅させることができる。プライマーは一般に１４〜４０ヌクレオチドの長さであるが、１０ヌクレオチド〜数百ヌクレオチドの範囲の長さであってもよい。一般的なＰＣＲ技術は、例えば、PCR Primaer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。鋳型の供給源としてＲＮＡを用いる場合には、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することができる。単離された核酸を得るために、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己持続配列複製または核酸配列に基づく増幅を使用することもできる。例えば、Lewis (1992) Genetic Engineering News 12:1、 Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878、およびWeiss (1991) Science 254:1292-1293参照。
【０２０７】
単離された核酸は、単一の核酸分子としてか、またはオリゴヌクレオチド系列としてのいずれかで化学的に合成することができる（例えば、３’から５’方向への自動ＤＮＡ合成のためのホスホルアミダイト技術を使用）。例えば、所望の配列を含み、各対が短い相補的セグメント（例えば約１５ヌクレオチド）を含み、その結果、オリゴヌクレオチド対がアニーリングされる際に二重らせんが形成される、長いオリゴヌクレオチド（例えば＞１００ヌクレオチド）の１以上の対を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼオリゴヌクレオチドを延長するのにも使用することができ、その結果、オリゴヌクレオチド対につき一つの一本鎖、二本鎖核酸分子が得られ、次にこれをベクターに連結することができる。また、単離された核酸は突然変異誘発により得ることもできる。ＰＤ−１アンタゴニストをコードする核酸は、ＰＣＲを介したオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発および／または部位特異的突然変異誘発を含む標準的技術を用いて変異させることができる。Short Protocols in Molecular Biology. Chapter 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, edited by Ausubel et al, 1992参照。修飾可能なアミノ酸位置の例としては、本明細書に記載されているものが含まれる。
【０２０８】
ＩＶ．処方物
Ａ．ＰＤ−１アンタゴニスト処方物
Ａ．ＰＤ−１アンタゴニスト処方物
ＰＤ−１アンタゴニストを含有する医薬組成物が提供される。ペプチドまたはポリペプチドを含有する医薬組成物は、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、または皮下注射）、経皮（受動的またはイオン泳動もしくはエレクトロポレーションを使用）または経粘膜（鼻腔、膣、直腸、または舌下）投与経路による投与用であり得る。また、組成物は生浸食性インサートを用いて投与してもよいし、適当なリンパ系組織（例えば、脾臓、リンパ節もしくは粘膜に関連するリンパ系組織）に直接送達、または器官もしくは腫瘍に直接送達してもよい。これらの組成物は各投与経路に適当な剤形で処方することができる。ペプチドまたはポリペプチドでないＰＤ−１受容体のアンタゴニストを含有する組成物はさらに腸内投与用に処方することもできる。
【０２０９】
本明細書において「有効量」または「治療上有効な量」とは、処置される障害の１以上の症状を処置、阻害または緩和するのに、またはそうでなければされる所望の薬理学的および／または生理学的作用を提供するのに十分な用量を意味する。厳密な用量は、被験体に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健全性など）、疾患および行われる処置などの種々の要因によって異なる。ＰＤ−１アンタゴニストの治療上有効な量は、免疫応答を活性化、増強、増大または持続させ、かつ／またはＴ細胞の消耗および／またはＴ細胞の無応答を克服または緩和し、かつ／または単球、マクロファージ、樹状細胞および他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化する。
【０２１０】
好ましい実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストは、腫瘍モデリングおよびバイオアベイラビリティからの外挿に基づき、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与される。最も好ましい範囲は５〜２０ｍｇＰＤ−１アンタゴニスト／ｋｇである。一般に、静脈注射または注入では、別の経路によって投与する場合よりも用量は低くなり得る。
【０２１１】
１．非経口投与用処方物
好ましい実施形態においては、ペプチドおよびポリペプチドを含有するものを含む開示されている組成物は、非経口注射により水溶液として投与される。処方物はまた懸濁液またはエマルションの形態であってもよい。一般に、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含み、場合により薬学上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または担体を含む医薬組成物が提供される。このような組成物は無菌水、緩衝生理食塩水（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨ、およびイオン強度、ならびに場合により、洗剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０、ＴＷＥＥＮ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、および保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含む。非水性溶媒またはビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびコーン油などの植物油、ゼラチン、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。処方物は凍結乾燥させ、使用直前に再溶解／再懸濁させてもよい。処方物は例えば、細菌保持フィルターによる濾過、除菌剤の組成物への配合、組成物の照射または組成物の加熱によって除菌してもよい。
【０２１２】
２．制御送達ポリマーマトリックス
１以上のＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−１アンタゴニストをコードする核酸を含有する組成物は徐放性処方物として投与することができる。徐放性ポリマーデバイスはポリマーデバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）の移植または注射（微粒子）後に長時間全身への放出を行うことができる。マトリックスは、ペプチドが固体ポリマーマトリックス内に分散されているマイクロスフェア、またはコアがポリマー剤皮とは異なる材料のものであり、そのコア（本質的に液体であっても固体であってもよい）内にペプチドが分散もしくは懸濁されているマイクロカプセルなどの微粒子の形態であってもよい。本明細書で特に定義されない限り、微粒子、マイクロスフェアおよびマイクロカプセルは互換的に用いられる。あるいは、ポリマーは数ナノメートルから４センチメートルの範囲の薄スラブもしくはフィルムとしての鋳物、摩砕、もしくは他の標準的な技術によって製造された粉末、またはさらにはヒドロゲルなどのゲルであってもよい。マトリックスはまた、免疫応答を調節するため、免疫不全患者（カテーテルが挿入されている高齢者または未熟児など）における感染予防のため、またはただれ、床ずれ潰瘍などの治癒を促進するために用いられるマトリックスの場合と同様に治癒における補助とするために医療機器の内外に組み込むことができる。
【０２１３】
非生分解性マトリックスでも生分解性マトリックスでもＰＤ−１アンタゴニストまたはそれらをコードする核酸の送達に使用することができるが、生分解性マトリックスが好ましい。これらは天然ポリマーであっても合成ポリマーであってもよいが、分解および放出特性の特徴付けがより良いため、合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が望まれる期間に基づいて選択される。直線的放出が最も有用である場合もあるが、パルス放出または「バルク放出」がより有効な結果をもたらす場合もある。ポリマーはヒドロゲル（一般に最大約９０重量％の水を吸収する）の形態であってもよく、場合により多価イオンまたはポリマーで架橋されていてもよい。
【０２１４】
マトリックスは溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出および当業者に知られている他の方法によって形成させることができる。生浸食性マイクロスフェアは、例えば、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987)、 Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987)、およびMathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988)に記載されているような、薬物送達用のマイクロスフェアを作製するために開発されたいずれかの方法を用いて製造することができる。
【０２１５】
徐放性経口処方物が望ましい場合がある。ＰＤ−１阻害的シグナル伝達のアンタゴニストは、拡散または溶脱機構のいずれかによる放出を可能とする不活性マトリックス、例えば、フィルムまたはガム中に配合することができる。また、緩徐崩壊マトリックスを処方物に配合してもよい。別の徐放性形態としては、水を入り込ませて浸透圧作用により単一の小開口部から薬剤を押し出す半透膜に薬剤が封入されるものがある。経口処方物では、放出の場所は胃、小腸（十二指腸、空腸もしくは回腸）、または大腸であり得る。好ましくは、この放出は有効剤（もしくは誘導体）の保護によるか、または腸などの胃環境を超えた有効剤の放出によるかのいずれかで、胃環境の有害な影響を回避する完全な胃耐性を確保するためには、腸溶コーティング（すなわち、少なくともｐＨ５．０までは不透性）が不可欠である。これらのコーティングは混合フィルム、またはBanner Pharmacapsから市販されているものなどのカプセル剤として使用可能である。
これらのデバイスは移植または注射領域を処置するために局所放出用に処方することができ、一般に、全身処置用の用量よりもはるかに低い用量を送達する。これらのデバイスはまた、全身送達用に処方することもできる。これらは埋植または皮下注射することができる。
【０２１６】
３．腸内投与用処方物
ＰＤ−１のアンタゴニストはまた、経口送達用にも処方することができる。経口固体剤形は当業者に知られている。固体剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ剤、カシェ剤、ペレット、粉末もしくは顆粒、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の特定の調製物、もしくはリポソームへの材料の組み込みが挙げられる。このような組成物は本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Ed. (2005, Lippincott, Williams & Wilins, Baltimore, Md. 21201) pages 889-964参照。組成物は液体形態で調製してもよいし、あるいは乾燥粉末（例えば、凍結乾燥）形態であってもよい。リポソームまたはポリマーカプセル封入を組成物の処方に用いてよい。Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics, G. S. Banker and C. T. Rhodes編 Chapter 10, 1979も参照。一般に、処方物は有効剤と、胃環境でＰＤ−１アンタゴニストを保護し、腸で生活性材料を放出する不活性成分を含む。
【０２１７】
薬学上許容されるエマルション、溶液、懸濁液、およびシロップを含む経口投与用の液体剤形は、不活性希釈剤、湿潤剤、乳化剤、および沈殿防止剤などのアジュバント、ならびに甘味剤、香味剤、および芳香剤を含む他の成分を含み得る。
【０２１８】
Ｂ．ＰＤ−１受容体アンタゴニストを含むワクチン
ワクチンは癌細胞を排除するために強いＴ細胞応答を必要とする。本明細書に記載されているＰＤ−１アンタゴニストは、Ｔ細胞に対する阻害シグナルを妨げるためにワクチンの成分として投与することができる。本明細書に開示されるワクチンは抗原、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの供給源、ならびに場合によりアジュバントおよび標的化分子を含む。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの供給源は、開示されているＢ７−ＤＣ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、またはＢ７．１ポリペプチドのいずれか、その融合タンパク質、その変異体、これらのポリペプチドおよび融合タンパク質もしくはその変異体をコードする核酸、またはＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドを発現するベクターを含む宿主細胞を含む。
【０２１９】
１．抗原
抗原は、ペプチド、タンパク質、多糖類、糖類、脂質、核酸、またはその組合せであり得る。抗原は癌または白血病細胞などの形質転換細胞に由来するものであり得、全細胞またはその免疫原成分であり得る。好適な抗原は当該技術分野で知られており、商業的官業および科学ソースから入手可能である。抗原は腫瘍由来の精製または部分精製ポリペプチドであってもよいし、あるいは異種発現系においてポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを発現させることにより生成される組換えポリペプチドであってもよい。抗原は抗原タンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡであってもよい。ＤＮＡはプラスミドＤＮＡなどのベクターＤＮＡの形態であってもよい。
【０２２０】
抗原は単一の抗原として提供されてもよいし、あるいは組合せで提供されてもよい。抗原はまた、ポリペプチドまたは核酸の複合体混合物として提供されてもよい。
【０２２１】
抗原は、限定されるものではないが、α−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、β−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−１、２、および３、ネオ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、Ｂａｇｅ−１、Ｇａｇｅ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、Ｌａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−Ａ１、２、３、４、６、１０、１２、Ｍａｇｅ−Ｃ２、ＮＡ−８８、ＮＹ−Ｅｓｏ−１／Ｌａｇｅ−２、ＳＰ１７、ＳＳＸ−２、およびＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトタンパク質、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳなどの腫瘍関連高原または腫瘍特異的抗原を含む腫瘍抗原であり得る。
【０２２２】
２．アジュバント
場合により、本明細書に記載されるワクチンはアジュバントを含み得る。アジュバントは、限定されるものではないが、以下の１以上であり得る：オイルエマルション（例えば、フロイントのアジュバント）、サポニン処方物、ウィロソーム(virosomes)およびウイルス様粒子、細菌および細菌誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化毒素および解毒誘導体、ミョウバン、ＢＣＧ、無機物含有組成物（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩）、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩など）、生体接着剤および／または粘膜接着剤、微粒子、リポソーム、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物、ポリホスファゼン、ムラミルペプチド、イミダゾキノロン化合物、および界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）。
【０２２３】
アジュバントはまたサイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロンγ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などの免疫調節剤を含み得る。ＰＤ−１アンタゴニストの他、Ｂ７ファミリーの他のポリペプチドを含む他の共刺激分子を投与してもよい。このようなタンパク質性アジュバントは全長ポリペプチドもしくはその活性断片として、またはプラスミドＤＮＡなどのＤＮＡの形態で提供されてよい。
【０２２４】
ＩＶ．使用方法
Ａ．Ｔ細胞の活性化
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドおよび小分子、その変異体、その融合タンパク質、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドおよび融合タンパク質をコードする核酸、またはＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドおよび融合タンパク質を発現する細胞は、Ｔ細胞の不活性化を回避するため、および／またはＴ細胞の活性化を延長するため（すなわち、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を増強するため、Ｔ細胞によるサイトカイン生産を増強するため、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激するため、および／またはＴ細胞の生存を促進するため）、またはＴ細胞の消耗および／または無応答を克服するために使用することができる。
【０２２５】
好ましいＰＤ−１アンタゴニストとしては、ＰＤ−１またはＢ７−１ポリペプチドなど、内因性ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と結合し、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１受容体との相互作用を低減または阻害するポリペプチドが含まれる。これらのリガンドのＰＤ−１との相互作用を低減することにより、ＰＤ−１により伝達される負のシグナルが回避または低減される。最適に満たないＴＣＲシグナルの存在下では、外因性ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはインビトロにおいてサイトカインの増殖および産生の増大を刺激することができる。よって、ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１以外のＴ細胞受容体とも結合することが明らかである。ＰＤ−１を介して負のシグナルを伝達することなくＰＤ−１受容体と結合してそれを遮断するＰＤ−１アンタゴニストもまた好ましい。これらのアンタゴニストの例としては、ＰＤ−１と結合するがシグナル伝達を誘発しないＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１などのＰＤ−１の組換えリガンドが挙げられる。
【０２２６】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドを用いる方法は、Ｔ細胞とＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドをＴ細胞においてＰＤ−１シグナル伝達を阻害または低減するのに有効な量で接触させることを含む。接触はインビトロ、エクスビボまたはインビボ（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウシ、ブタ、非ヒト霊長類、またはヒトなどの哺乳類で）行うことができる。
【０２２７】
接触はＴ細胞の活性化の前、活性化の間、または活性化の後に行うことができる。一般に、Ｔ細胞と、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドとの接触は活性化と実質的に同時であり得る。活性化は、例えば、Ｔ細胞を、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＴＣＲと物理的に会合しているＣＤ３複合体のポリペプチドの一つと結合する抗体に曝すことによるものであり得る。あるいは、Ｔ細胞は例えば、ＡＰＣ［例えば、鉗合(interdigitating)樹状細胞（本明細書では樹状細胞とも呼ばれる）、マクロファージ、単球またはＢ細胞］上の同種異系抗原（例えば、ＭＨＣ同種異系抗原）または上記のＡＰＣのいずれかによるタンパク質抗原のプロセシングにより生成され、ＡＰＣの表面上のＭＨＣ分子によりＴ細胞に提示される抗原ペプチドのいずれかに曝すこともできる。Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
【０２２８】
いくつかの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドはＴ細胞に直接投与することができる。あるいは、マクロファージ、単球、鉗合樹状細胞（本明細書では樹状細胞とも呼ばれる）またはＢ細胞などのＡＰＣを、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換、形質導入またはトランスフェクトすることができ、Ｔ細胞を形質転換、形質導入、またはトランスフェクトされたＡＰＣと接触させることができる。この形質転換、形質導入またはトランスフェクト細胞は、形質転換、形質導入、またはトランスフェクトされる前は、それが投与される被験体、または別の被験体（例えば、同種の別の被験体）から得ることができる細胞または細胞の後代であり得る。
【０２２９】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、開示されているアミノ酸変更、ポリペプチド断片、融合タンパク質およびその組合せのいずれかを含む、本明細書に記載されているいずれかのＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドであり得る。
【０２３０】
活性化がインビトロであれば、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは適切な培養容器またはビーズまたは他の固相支持体の底面、例えば、プラスチックマイクロタイタープレートのウェルに結合させることができる。
【０２３１】
ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドのインビトロ適用は、例えば、免疫機構の基礎的科学研究において、またはＴ細胞機能の研究もしくは例えば受動免疫療法に用いる活性化Ｔ細胞の生産のために有用であり得る。さらに、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドは、Ｔ細胞が得られた被験体において着目する抗原に対する免疫性を試験すべく設計されたインビトロアッセイ（例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ）に加えることができる。このようなアッセイへのＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの付加は、より強力な、従ってより検出の容易なインビトロ応答をもたらすと考えられる。さらに、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードする核酸で形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入されたＡＰＣは、（ａ）Ｔ細胞が他の分子によって活性を増強するか否かを調べるアッセイにおける陽性対照として、または（ｂ）Ｔ共刺激を阻害するのに有用な化合物（例えば、自己免疫疾患または器官移植片拒絶の処置に有用な可能性のある化合物）のスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
【０２３２】
Ｂ．ＰＤ−１アンタゴニストの治療的使用
１．癌処置
本明細書で提供されるＰＤ−１アンタゴニストは一般にインビボおよびエクスビボにおいて免疫応答刺激治療薬として有用である。一般に、開示されているアンタゴニスト組成物は、被験体の免疫系が免疫応答を惹起する疾患または障害を有する、またはそれに対して疾病素因を有する被験体の処置に有用である。ＰＤ−１アンタゴニストの、Ｄ−１シグナル相互作用を阻害または低減する能力はより強力な免疫応答を可能とする。開示されている組成物は、Ｔ細胞を伴う免疫応答を刺激または増強するのに有用である。
【０２３３】
開示されているＰＤ−１アンタゴニストは、被験体においてＴ細胞を共刺激するのに有効な量のＰＤ−１アンタゴニストを被験体に投与することにより癌を処置するために、宿主の免疫応答を刺激または増強するのに有用である。提供される組成物および方法で処置可能な癌の種類としては、限定されるものではないが、以下のもの：膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、および血液性癌が挙げられる。
【０２３４】
本明細書では処置可能な悪性腫瘍は腫瘍が由来する組織の胚起源に応じて分類される。癌腫は、皮膚または内部器官および腺の上皮下層などの内肺葉または外胚葉組織に起源する腫瘍である。発生頻度は低い肉腫は、骨、脂肪、および軟骨などの中胚葉結合組織に由来する。白血病およびリンパ腫は、骨髄の造血細胞の悪性腫瘍である。白血病は単細胞として増殖するが、リンパ腫は腫瘍塊として増殖する傾向がある。悪性腫瘍は身体の多くの器官または組織で増殖し、癌を形成し得る。
【０２３５】
２．ワクチンにおけるＰＤ−１アンタゴニストの使用
開示されているＰＤ−１アンタゴニストまたはそれをコードする核酸は単独で投与してもよいし、あるいは他の好適な処置と組み合わせて投与してもよい。一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはワクチン組成物とともに、またはワクチン阻害剤の一成分として投与することができる。ワクチン組成物の好適な成分は上記されている。開示されているＰＤ−１アンタゴニストはワクチン投与の前、ワクチン投与と同時、またはワクチン投与の後に投与することができる。一つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニスト組成物はワクチン投与と同時に投与される。
【０２３６】
開示されているＰＤ−１アンタゴニスト組成物は、被験体の免疫応答を誘発する、または癌を有する被験体における腫瘍抗原などの既存の抗原に対する免疫応答を増強するために使用することができる予防ワクチンまたは治療ワクチンとともに投与してもよい。
【０２３７】
予防的、治療的または脱感作免疫応答の所望の結果は、当該技術分野でよく知られている原理に従い、疾患によって異なり得る。同様に、癌、アレルゲン、または病原体に対する免疫応答は疾患を完全に治療する場合、症状を緩和する場合、または疾患に対する全体的な治療的介入の一つの態様である場合がある。例えば、癌に対する免疫応答の刺激は、処置に影響を与えるための外科術、化学療法薬、放射線、ホルモン、および他の免疫学的アプローチと組み合わせることができる。
【０２３８】
３．補助療法
開示されているＰＤ−１アンタゴニストまたはそれをコードする核酸は、抗原に対する耐性を克服し、それにより癌を治療するために使用することができる。共シグナル伝達経路を適切に標的化することにより、Ｔ細胞の活性化および腫瘍抗原に対する耐性の克服をもたらすことができる。一つの実施形態は、抗原耐性を克服するために有効量のＰＤ−１アンタゴニストまたはそれをコードする核酸を投与することを提供する。ＰＤ−１の負のシグナル伝達を阻害または低減すれば、第一の治療薬を投与した後のＴ細胞応答および全体的な免疫性または腫瘍関連抗原などの免疫原性の不十分な抗原に対する応答を増幅することもできる。一つの実施形態は、一次治療、ワクチン接種または腫瘍の死滅化の（抗体により媒介されるもの化学療法または放射線によるものまたはそのいずれかの組合せ）後にＤ−１アンタゴニストまたはそれをコードする核酸の受動投与を提供する。ＰＤ−１アンタゴニストは、腫瘍に対して強力かつ長期の防御応答をもたらす一次応答を増強／追加刺激すると考えられている。
【０２３９】
腫瘍を根絶するために第一治療薬に加えて投じられる処置はアジュバント療法と呼ばれる。補助治療は外科術または放射線などの一次治療を強化するため、癌が再発する機会を低減するために行われる。この付加的な処置は、より強力かつ／または長期の応答を根拠として一次応答の増幅をもたらし得る。
【０２４０】
補助療法には５つの主要な種類がある（これらのうちのいくつかは一次／単独療法としても使用されることを注記しておく）：１）増殖を妨げるか、細胞を自己破壊させることにより癌細胞を死滅させる薬剤を用いる化学療法、２）ホルモン生産を低減し、癌を増殖させないためのホルモン療法、３）癌細胞を死滅させるために強力な線を用いる放射線療法、４）残っている癌細胞を攻撃し、根絶するために身体固有の免疫系に影響を与えることを試みる免疫療法（免疫療法は身体固有の防御を刺激する（癌ワクチン）か、またはそれらを補充する（抗体または免疫細胞の受動的投与）ことができる）、または５）正常、健康細胞だけを残し、癌細胞内に存在する特定の分子を標的化する標的化療法。例えば、乳癌の多くの症例はＨＥＲ２と呼ばれるタンパク質の生産が過剰な腫瘍によって引き起こされる。トラスツズマブ（ヘルセプチン）は、ＨＥＲ２陽性腫瘍を標的とする補助療法として用いられる。
【０２４１】
一般に、補助治療は、複数の機構を誘導し、腫瘍の根絶の機会を増やすため、一次治療と同時に投与するか、または一緒に与える。免疫療法、特にワクチンは、繊細な特異性および既存の免疫寛容を回避する能力を有する持続的抗腫瘍作用を誘導するという独自の利点を与える。「補助療法」を遅延させると、応答を最大化させ、腫瘍を根絶する機会を増大させることが見出された。
【０２４２】
好ましい実施形態においては、本明細書に記載されているように、ＰＤ−１アンタゴニストまたはそれをコードする核酸は、癌治療薬などの第一の治療薬の投与後に投与される。アジュバントの投与のタイミングは一次治療後０〜１４日の範囲であり得、単一または複数の処置を含み得る。ある特定の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストは一次治療の投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日に投与される。アジュバントは好ましくは、患者に全身投与される（ＩＶ、ＩＭ、またはＳＱ）。
【０２４３】
免疫応答を増強するために用いられるＰＤ−１アンタゴニストの選択は、元の一次治療の様式によって異なる。例えば、化学療法とともに用いられる同じＰＤ−１アンタゴニストは放射線治療とは十分働かない場合がある。よって、治療薬とＰＤ−１アンタゴニスト分子の特定の組合せは最適な有効性に必要であり得る。ＰＤ−１アンタゴニストは、癌の種類に関して、例えば親和性成熟を用いて例えば固体腫瘍と液体腫瘍に関して最適化することができる。
【０２４４】
ＰＤ−１アンタゴニストおよびそれをコードする核酸は、腫瘍に対する免疫応答の誘導または増強に有用であり得る。例えば、細胞を、本明細書に記載されているＰＤ−１アンタゴニストをコードする核酸を担持するように操作し、その後、被験体における腫瘍特異的耐性を妨害するために被験体に投与することができる。特に、Ｂ７陰性ネズミ腫瘍細胞におけるＢ７−１の異所発現は、マウスにおいて腫瘍の排除と、腫瘍付加に対する長期保護とを伴う、Ｔ細胞により媒介される特異的免疫性を誘導することが示されている。Ｂ７関連因子を用いた細胞遺伝子療法処置は、遺伝子導入療法にＢ７−１またはＢ７−２を用いる動物実験（K. Dunussi-Joannopoulos et al., J. Pediatr. Hematol. Oncol. 19:356-340 (1997)、 K. Hiroishi et al., Gene Ther. 6:1988-1994 (1999)、 B. K. Martin et al., J. Immunol. 162:6663-6670 (1999)、 M. Kuiper et al., Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-390(2000)参照）またはヒト第Ｉ相臨床試験(H. L. Kaufman et al. Hum. Gene Ther. 11:1065-1082 (2000)) でモデル化することができる。
【０２４５】
投与は既存の腫瘍または感染性疾患の処置に限定されず、個体においてこのような疾患の発症を予防するまたはそのリスクを軽減するため、すなわち、予防的使用のために使用することもできる。予防用ワクチンの可能性のある候補としては、癌を発症する高いリスクを有する、すなわち、ある種の癌の個人病歴または家族病歴を有する個体が含まれる。
【０２４６】
別の実施形態は、被験体のＴ細胞の活性化を増強するために、被験体に有効量のＰＤ−１アンタゴニストまたはそれをコードする核酸を投与することにより、腫瘍浸潤白血球集団を増加させる方法を提供する。
【０２４７】
Ｃ．組合せ療法
開示されているＰＤ−１アンタゴニスト組成物は、それを必要とする被験体に単独で、または１以上の付加的治療薬または挙げられているＰＤ−１アンタゴニストの組合せと組み合わせて投与することができる。付加的治療薬は処置される症状、障害、または疾患に基づいて選択される。例えば、ＰＤ−１アンタゴニストは免疫応答を増強または促進する働きをする１以上の付加的薬剤と同時に投与することができる。
【０２４８】
１．化学療法薬
ＰＤ−１アンタゴニストは１以上の付加的治療薬と組み合わせることもできる。代表的な治療薬としては、限定されるものではないが、化学療法薬およびアポトーシス誘導薬が挙げられる。代表的な化学療法薬としては、限定されるものではないが、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン，カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンパスターゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロマイド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンまたはその組合せが挙げられる。代表的なアポトーシス誘導薬としては、限定されるものではないが、フルダラビンタウロスポリン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ラクトシルセラミド、１５ｄ−ＰＧＪ（２）、およびその組合せが挙げられる。
【０２４９】
ある特定の実施形態においては、被験体において免疫応答を増大または増強するために二種以上のＰＤ−１アンタゴニストを併用することができる。
【０２５０】
２．免疫応答を増強する融合タンパク質
他の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストは、免疫応答を増強する他のＢ７ファミリー共刺激分子を含有する組成物と同時投与することができる。他のＢ７共刺激ポリペプチドはいずれの起源種のものであってもよい。一実施形態においては、共刺激ポリペプチドは哺乳類種に由来する。好ましい実施形態においては、共刺激ポリペプチドはネズミまたはヒト起源である。一つの実施形態においては、ポリペプチドはＢ７．１である。有用なさらなるヒトＢ７ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０４３４３を有する核酸によりコードされているＢ７−２ポリペプチドまたはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７１４３６を有する核酸によりコードされているＢ７−Ｈ５ポリペプチドと少なくとも約８０、８５、９０、９５、または１００％の配列同一性を有する。Ｂ７−Ｈ５はまた、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０１２２３２号公報にも開示されている。
【０２５１】
好ましい実施形態においては、さらなるＢ７ファミリー分子が、本明細書に記載されているように、可溶性融合タンパク質として提供される。二量体または多量体を形成するＢ７分子の可溶性融合タンパク質は、それらのコグネイト受容体を架橋する能力を有し、それにより受容体アゴニストとして働く。
【０２５２】
一つの実施形態においては、第一の融合相手は、限定されるものではないが、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＢ７−Ｈ５を含む、Ｂ７ファミリー分子の断片である。本明細書において、Ｂ７分子の断片は、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。有用な断片はそれらの天然リガンドと結合する能力を保持するものである。全長Ｂ７分子の断片であるＢ７ポリペプチドは一般に、その天然リガンドに結合する能力が全長Ｂ７分子の少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントであるか、またはさらには１００パーセントを超える。
【０２５３】
Ｂ７ポリペプチドの断片は、可溶性断片を含む。可溶性Ｂ７ポリペプチド断片は、産生細胞から放出、分泌またはそうでなければ抽出され得るＢ７ポリペプチドの断片である。Ｂ７ポリペプチドの可溶性断片は受容体ポリペプチドの細胞外ドメインの一部または全部を含み、細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインの一部または全部を欠く。一実施形態においては、Ｂ７ポリペプチド断片はＢ７ポリペプチドの全細胞外ドメインを含む。他の実施形態においては、Ｂ７ポリペプチドの可溶性断片はＢ７生物活性を保持する細胞外ドメインの断片を含む。細胞外ドメインは膜貫通ドメイン由来の１、２、３、４または５個のアミノ酸を含み得ると考えられる。あるいは、細胞外ドメインはＣ末端、Ｎ末端またはその双方から１、２、３、４、または５個のアミノ酸が除去されていてもよい。
【０２５４】
一般に、Ｂ７ポリペプチドまたはその断片は、シグナル配列をコードする配列を含む核酸から発現される。一般に、未熟なポリペプチドからシグナル配列が切断されて、シグナル配列を欠く成熟ポリペプチドが生じる。Ｂ７ポリペプチドのシグナル配列は、ポリペプチドの発現レベル、分泌、溶解度または他の特性に影響を与えるために、標準的な分子生物学的技術を用いて別のポリペプチドのシグナル配列で置換することができる。シグナル配列を置換するために用いられるシグナル配列は当該技術分野で知られているいずれのものであってもよい。
【０２５５】
Ｂ７分子融合ポリペプチドは、野生型ポリペプチド配列に対して１以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入または再配列を含むように変異誘発された変異型ポリペプチドを含む。有用な変異型Ｂ７融合タンパク質は、受容体ポリペプチドと結合する能力を保持するものである。変異型Ｂ７融合ポリペプチドは一般に、Ｂ７受容体ポリペプチドと結合する能力が全長Ｂ７分子の少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントであるか、またはさらには１００パーセントを超える。
【０２５６】
変異型Ｂ７−Ｈ５融合ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、または挿入のいずれかの組合せを有し得る。変異型ポリペプチドは、第一の融合相手、第二のポリペプチド、および／または任意のリンカーペプチド配列のいずれかまたは全ての中での１以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または再配列を含み得る。
【０２５７】
Ｄ．組合せ療法
ＰＤ−１アンタゴニスト組成物はそれを必要とする被験体に単独で、または１以上の付加的治療薬と組み合わせて投与することができる。付加的治療薬は処置される症状、障害または疾患に基づいて選択される。例えば、ＰＤ−１アンタゴニストは免疫応答を増強または促進する働きをする１以上の付加的薬剤と同時に投与することができる。
【０２５８】
Ｅ．養子免疫伝達(adoptive transfer)
養子免疫Ｔ細胞療法は、確立された腫瘍を有する患者の処置にために有望な戦略であり、多くの場合、エクスビボ培養のＴ細胞の供給源である腫瘍浸潤リンパ球が得られる特定の癌に限定される。一つの実施形態は、腫瘍細胞においてＰＤ−１受容体により媒介されるシグナル伝達を阻害または低減するのに有効な量のＰＤ−１のアンタゴニストを、抗原特異的Ｔ細胞の養子免疫Ｔ細胞療法と組み合わせて投与することにより癌を処置する方法を提供する。養子免疫Ｔ細胞伝達は、ＰＤ−１のアンタゴニストを投与する前、または投与した後に投与することができるか、またはエクス・ビボで細胞に加えることができる。
【０２５９】
抗原特異的Ｔ細胞系統は、インビトロにおける抗原刺激と、その後のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの非特異的拡大により生成することができる。抗原特異的Ｔ細胞を拡大する能力は、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢ酵素結合免疫吸着スポットを用いてアッセイすることができる。結果として得られるＴ細胞系統の表現型は、ＦＯＸＰ３発現ＣＤ４（＋）Ｔ細胞の存在を含め、フローサイトメトリーにより評価することができる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの抗原特異的Ｔ細胞集団の増幅は通常、ＩＬ−２の存在下で最適な長さの抗原ペプチドでインビトロ刺激を繰り返すことで行われる。特定のＴ細胞の拡大をモニタリングするために一般に用いられるクロミウム放出アッセイで明らかにしたところ、リンホカイン活性化キラー細胞の活性化／拡大を回避するには通常、低用量のＩＬ−２（１０〜５０Ｕ／ｍｌの間）が用いられてきた。抗原ペプチドの濃度は０．１〜１０μＭであり得る。
【０２６０】
１．腫瘍特異的および腫瘍関連抗原
Ｔ細胞の拡大に有用な抗原は処置される被験体からの腫瘍の生検により得ることができる。抗原は腫瘍生検から生化学的に精製することができる。あるいは、抗原は組換えポリペプチドであってもよい。腫瘍により発現される抗原は腫瘍に特異的であり得るか、または非腫瘍細胞に比べて腫瘍細胞で高いレベルで発現され得る。癌細胞により独自に発現されるか、または適当な被験体に比べて悪性症状を有する被験体で著しく高い（例えば、統計学的に有意に上昇した）レベルで存在する、腫瘍関連抗原として知られる血清学的に定義されたマーカーなどの抗原マーカーがある特定の実施形態での使用に意図される。
【０２６１】
腫瘍関連抗原としては、例えば、細胞癌遺伝子によりコードされている産物または発現の異常な原癌遺伝子によりコードされている産物（例えば、ｎｅｕ、ｒａｓ、ｔｒｋおよびｋｉｔ遺伝子によりコードされている産物）または突然変異型の増殖因子受容体または受容体様細胞表面分子（例えば、ｃ−ｅｒｂ Ｂ遺伝子によりコードされている表面受容体）が挙げられる。他の腫瘍関連抗原としては、形質転換事象に直接関与すると思われる分子または発癌性形質転換事象に直接関与するとは思われないが腫瘍細胞により発現される分子（例えば、癌胎児性抗原、ＣＡ−１２５、黒色腫(melonoma)関連抗原など）が含まれる（例えば、米国特許第６，６９９，４７５号公報、Jager, et al., Int. J. Cancer, 106:817-20 (2003)、 Kennedy, et al., Int. Rev. Immunol., 22:141-72 (2003)、 Scanlan, et al. Cancer Immun., 4:1 (2004)参照）。
【０２６２】
細胞腫瘍関連抗原をコードする遺伝子としては、細胞癌遺伝子および発現の異常な原癌遺伝子が含まれる。一般に、細胞癌遺伝子は細胞の形質転換に直接関連のある産物をコードし、このためにこれらの抗原は免疫療法に特に好ましい標的である。一つの例として、発癌性形質転換に関与する細胞表面子をコードする腫瘍形成ｎｅｕ遺伝子がある。他の例としては、ｒａｓ、ｋｉｔ、およびｔｒｋ遺伝子が挙げられる。これらの原癌遺伝子（癌遺伝子を形するように突然変異された正常な遺伝子）の産物は、異常な発現（例えば、過剰発現）を示すことがあり、この異常な発現は細胞の形質転換に関連している可能性がある。よって、原癌遺伝子によりコードされている産物を標的化することができる。いくつかの癌遺伝子は腫瘍細胞表面で発現される増殖因子受容体分子または増殖因子受容体様分子をコードする。一例として、ｃ−ｅｒｂＢ遺伝子によりコードされている細胞表面受容体がある。他の腫瘍関連抗原は悪性形質転換に直接関与する場合またはしない場合がある。しかしながら、これらの抗原はある特定の腫瘍細胞により発現されるので、有効な標的となる。いくつかの例として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５（卵巣癌と関連）および黒色腫特異的抗原がある。
【０２６３】
卵巣癌およびその他の癌腫では、例えば、腫瘍関連抗原は、血清または粘膜分泌物などの容易に得られる体液のサンプル中で検出可能である。このようなマーカーの一つが、血流中にも放出され、血清中で検出可能な癌腫関連抗原であるＣＡ１２５である（例えば、Bast, et al., N. Eng. J. Med., 309:883 (1983)、 Lloyd, et al., Int. J. Canc., 71:842 (1997)。卵巣癌および他の癌腫の診断および／または予後プロフィールを得る努力において、血清および他の体液中のＣＡ１２５レベルが、他のマーカー、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、扁平上皮癌抗原（ＳＣＣ）、組織ポリペプチド特異的抗原（ＴＰＳ）、シアリルＴＮムチン（ＳＴＮ）、および胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）のレベルとともに測定されている（例えば、Sarandakou, et al., Acta Oncol., 36:755 (1997)、 Sarandakou, et al., Eur. J. Gynaecol. Oncol., 19:73 (1998)、 Meier, et al., Anticancer Res., 17(4B):2945 (1997)、 Kudoh, et al., Gynecol. Obstet. Invest., 47:52 (1999))。また神経芽腫にも高い血清ＣＡ１２５が伴っている場合があり（例えば、Hirokawa, et al., Surg. Today, 28:349 (1998)）、中でも高いＣＥＡおよびＳＣＣが直腸直腸癌に伴っている場合がある(Gebauer, et al., Anticancer Res., 17(4B):2939 (1997))。
【０２６４】
モノクローナル抗体Ｋ−１との反応性によって定義される腫瘍関連抗原メソテリンは、上皮卵巣腫瘍、子宮頸腫瘍、および食道腫瘍を含む扁平上皮癌の大多数ならびに中皮腫に存在する(Chang, et al., Cancer Res., 52:181 (1992)、 Chang, et al., Int. J. Cancer, 50:373 (1992)、 Chang, et al., Int. J. Cancer, 51:548 (1992)、 Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:136 (1996)、 Chowdhury, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:669 (1998))。ＭＡｂ Ｋ−１を用いた場合、メソテリンは細胞関連腫瘍マーカーとして唯一検出可能であり、卵巣癌患者由来の血清またはＯＶＣＡＲ−３細胞により馴化された培地中には可溶性形態で見られたことはない(Chang, et al., Int. J. Cancer, 50:373 (1992))。しかしながら、構造的に関連のあるヒトメソテリンポリペプチドにはまた、悪性腫瘍を有する患者由来の体液で天然可溶性抗原として検出可能な明瞭に異なるメソテリン関連抗原（ＭＲＡ）ポリペプチドなどの腫瘍関連抗原ポリペプチドも含む。
【０２６５】
腫瘍抗原は細胞表面分子を含み得る。構造が既知で、既知または記載されている機能（上記参照）を有する腫瘍抗原。
【０２６６】
２．腫瘍新生血管系に関連する抗原
タンパク質治療薬は腫瘍浸透において有効でないので、腫瘍の処置に有効でない可能性がある。腫瘍関連新生血管系は、タンパク質治療薬が腫瘍へ接近し得る容易に接近可能な経路を提供する。別の実施形態においては、融合タンパク質は、腫瘍に関連する新生血管系により発現される抗原と特異的に結合するドメインを含む。
【０２６７】
該抗原は腫瘍の新生血管系に特異性があり得るか、または正常な血管系に比べて腫瘍の新生血管系で高いレベルで発現され得る。正常な血管に比べて腫瘍関連新生血管系により過剰発現される抗原の例としては、限定されるものではないが、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ、Ｔｉｅ２、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、エンドグリンおよびα５β３インテグリン／ビトロネクチンが挙げられる。正常な血管系に比べて腫瘍関連新生血管系により過剰発現される他の抗原は当業者に知られており、開示されている融合タンパク質による標的化に好適である。
【実施例】
【０２６８】
本発明は、以下の実施例に限定されるものではないが、以下の実施例を参照すれば本発明をさらに理解できる。
【０２６９】
実施例１：Ｂ７−ＤＣのＰＤ−１への結合
ヒトＢ７−ＤＣ−ＩｇのＰＤ−１結合活性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＢｕｐＨ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ／Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｐＨ９．４バッファー(Pierce)で希釈した０．７５μｇ／ｍＬの組換えヒトＰＤ−１／Ｆｃ(R&D Systems)１００μＬで２時間コーティングした後、ＢＳＡ溶液(Jackson ImmunoResearch)を用いて９０〜１２０分間ブロックした。連続誘導体希釈したヒトＢ７−ＤＣ−ＩｇならびにヒトＩｇＧ１イソ型対照を９０分間結合させた。結合したＢ７−ＤＣ−Ｉｇは、１００μＬの０．５μｇ／ｍＬビオチン結合抗ヒトＢ７−ＤＣクローンＭＩＨ１８(eBioscience)、次いで１：１０００希釈ＨＲＰ−ストレプトアビジン(BD Bioscience)およびＴＭＢ基質(BioFX)を用いて検出した。プレートリーダー(Molecular Devices)を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取り、データを、ＳｏｆｔＭａｘで４パラメーターロジスティック適合を用いて解析した。
【０２７０】
ネズミＢ７−ＤＣ−ＩｇのＰＤ−１結合活性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、ＢｕｐＨ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ／Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｐＨ９．４バッファー(Pierce)で希釈した０．７５μｇ／ｍＬの組換えマウスＰＤ−１／Ｆｃ(R&D Systems) １００μＬを用いて２時間コーティングし、次いでＢＳＡ溶液(Candor-Bioscience)を用いて９０分間ブロックした。連続希釈したネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（野生型、ならびにＰＤ−１への低減された結合のために選択されたＤ１１１ＳおよびＫ１１３Ｓ変異株）、ならびにネズミＩｇＧ２ａイソ型対照を９０分間結合させた。結合したＢ７−ＤＣ−Ｉｇは、１００μＬの０．２５μｇ／ｍＬビオチン結合抗マウスＢ７−ＤＣクローン１１２(eBioscience)、次いで１：２０００希釈ＨＲＰ−ストレプトアビジン(BD Bioscience)およびＴＭＢ基質(BioFX)を用いて検出した。プレートリーダー(Molecular Devices)を用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取り、データを、ＳｏｆｔＭａｘで４−パラメーターロジスティック適合を用いて解析した。
【０２７１】
図１Ａおよび１Ｂは、ＰＤ−１結合ＥＬＩＳＡにおける、ＯＤ４５０対Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ（μｇ／ｍｌ）の量の線グラフを示す。図４Ａ １Ａは、４つの異なるロットのヒトＢ７−ＤＣ−Ｉｇの結合を示す。図４Ｂ １Ｂは、野生型ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（円）、ＤＳ変異株（Ｄ１１１Ｓを置換したＢ７−ＤＣ−Ｉｇ、三角）、およびＫＳ変異株（Ｋ１１３Ｓを置換したＢ７−ＤＣ−Ｉｇ、四角）、およびネズミＩｇＧ２ａイソ型対照（ひし形）の結合を示す。
【０２７２】
実施例２：Ｂ７−ＤＣのＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞への結合
Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを、最初にアロフィコシアニン（ＡＰＣ）と結合させ、次いでＰＤ−１を構成的に発現するＣＨＯ細胞系統またはＰＤ−１を発現しない親ＣＨＯ細胞とともに種々な濃度でインキュベートした。結合は、フローサイトメトリーにより分析した。図２は、プローブ濃度（ｘ軸）の関数としての、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ−ＡＰＣの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）（ｙ軸）を示す。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ−ＡＰＣはＣＨＯ．ＰＤ−１細胞（黒円）に結合するが、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞には結合しない（灰色三角）。
【０２７３】
実施例３：ＰＤ−１への結合に関するＢ７−ＤＣ−ＩｇのＢ７−Ｈ１との競合
Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇを、最初にアロフィコシアニン（ＡＰＣ）と結合させた。Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣを、プローブおよび細胞混合物に添加する前に、種々の濃度の非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを、最初に、ＰＤ−１を構成的に発現するＣＨＯ細胞系統とインキュベートした。図３は、加えた非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇコンペティターの濃度（ｘ軸）の関数としての、Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）（ｙ軸）を示す。非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ濃度が増加するにつれて、ＣＨＯ細胞に結合するＢ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣ量は減少し、このことは、ＰＤ−１への結合に関してＢ７−ＤＣ−ＩｇがＢ７−Ｈ１と競合することを実証している。
【０２７４】
実施例４：Ｐ８１５肥満細胞腫モデル
ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇのインビボ活性を、Ｐ８１５肥満細胞腫腫瘍モデルにおいて試験した。Ｐ８１５肥満細胞腫細胞は、メチルコラントレン（ＭＣＡ）処置後のＤＢＡ／２マウス由来である。５×１０^４細胞の皮下注射は、腫瘍接種後およそ３５日に死亡を引き起こす可能性がある。
【０２７５】
ＤＢＡ／２マウス（６〜１０週齢、メス）に、最初に５×１０^４個の生きているＰ８１５細胞を側腹部に皮下注射して誘発した。６日後、前記マウスを、ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇの腹腔内注射により処置した。図４に示した投与計画は、ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ１００μｇ／注射（およそ５ｍｇ／ｋｇ）、２回／週、最大６用量までであった。対照群は、ビヒクルのみ、またはネズミＩｇＧにより処置した。腫瘍サイズは、デジタルキャリパーを用いて２〜３日毎に測定した。マウスの腫瘍サイズが１０００ｍｍ^３に達するか、または超えた場合には、米国赤十字社（ＡＲＣ、Amplimmune社の動物飼育施設）の所内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコールに従ってマウスを安楽死させ、死亡と定義した。生存している腫瘍のないマウスは、５２日目にＰ８１５腫瘍細胞を再負荷した。
【０２７６】
表１および図４に示されるように、ビヒクルまたは対照マウスＩｇＧを用いて処置されたすべてのマウスは、３８日目までにそれらの腫瘍容量がＩＡＣＵＣの許容限界に達したため、安楽死させる必要があった。ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置マウスの５匹中４匹が、処置に反応した：２匹のマウスにおいて腫瘍は根絶され、さらに２匹のマウスはネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置期間中における腫瘍増殖の遅延を示した。
【０２７７】
【表１】

【０２７８】
図５Ａ−Ｃは、ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇを用いるマウスにおける腫瘍根絶を示す。腫瘍のないマウスは、次に、５２日目に最初の接種部位の反対側の側腹部に５×１０^４個のＰ８１５細胞を再負荷した。最初の接種後７４日を経過しても依然としてマウスは腫瘍のないままであったが、Ｐ８１５細胞で誘発を行ったナイーブマウスはすべて、腫瘍を発現した。このことは、Ｐ８１５細胞を接種され、ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇで処置されたマウスは、Ｐ８１５肥満細胞腫に対して長期にわたり免疫性を発現することを示唆している。
【０２７９】
ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ投与計画の合理性
ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ単独は、比較的免疫原性が高いと考えられているＰ８１５モデルにおいて効果的であったが、より急速に進行し、免疫原性のより低い腫瘍タイプに対しては最小限の活性を示す。ヒト癌患者において効果的な抗腫瘍免疫応答を促進することもまた、困難であると発明者らによれば予想される。
【０２８０】
Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇおよびそのネズミ類似体の活性を促進するために、低用量のＣＴＸが安全かつ効果的に癌免疫療法の活性を高め得ることが実証された試験に基づき、ＣＴＸが処置投与計画に組み入れられた。一般に、ヒトでは１００〜３００ｍｇ／ｍ２、マウスでは２０〜２００ｍｇ／ｋｇの用量が用いられる。これらの用量は治療量以下であり、直接的な抗腫瘍活性は持たない。
【０２８１】
癌患者およびネズミにおける癌の同系および遺伝的モデルでは、低用量のＣＴＸはＴｒｅｇの選択的枯渇を引き起こす。Ｔｒｅｇは腫瘍微小環境に比較的豊富に存在し、抗腫瘍免疫応答の抑制において主要な役割を果たしている。抗原刺激、ワクチン、またはサイトカインによる処置に先立つＣＴＸ投与は、より機能的な抗腫瘍免疫応答を促進し、腫瘍根絶の強化をもたらす。単独薬剤として、または癌ワクチンもしくはサイトカインと組み合わせて低用量ＣＴＸを投与する多くの臨床試験では、耐容性が非常に良好であり、免疫増強および臨床的有効性の証拠が示された。
【０２８２】
低用量ＣＴＸ使用の多数の経験および安全性、その免疫増強物質としての特性評価、ならびにＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅ社で作成されたデータに基づき、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇはＣＴＸ投与に続いてＢ７−ＤＣ−Ｉｇ投与を行う標準的な投与計画により投与されるべきである。１００ｍｇ／ｋｇの用量が動物試験において用いられた。ＣＴＸは、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇまたはネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置が開始される２４時間前に投与される。別の投薬計画、例えばＣＴＸのメトロノーム療法(metronomic)も用いることができる。
【０２８３】
実施例６：ＣＴ２６腫瘍モデル
マウス結腸直腸腫瘍細胞系統、ＣＴ２６をＡＴＣＣから入手した。ＡＴＣＣのガイドラインに従って、４代継代でマスターセルバンクを作製した。細胞を試験し、マイコプラズマおよび他の病原体が混入していないことを確認した。腫瘍細胞の一つのバイアルが低温保存株から解凍されており、接種前に２代継代増殖していた。
【０２８４】
ＣＴ２６細胞は、３０ｍＬの完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕ、および１×Ｐ／Ｓ）を用いて１：５希釈して分割し２日間培養、または３０ｍＬの完全培地を用いて１：１０希釈し３日間培養した。
【０２８５】
培地を吸引してＣＴ２６細胞を採取し、フラスコを５ｍＬのＰＢＳですすぎ、５ｍＬのトリプシンを加えて３７℃にて２分間インキュベートし、次いで１０ｍＬの完全培地で中和した。６００×ｇ（〜１０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した後、培地を吸引して(sspirated)細胞ペレット１０ｍｌのプレーンＲＰＭＩを用いてピペット操作により再懸濁させた。この洗浄ステップを３回繰り返した。
【０２８６】
接種された細胞の細胞数および生存力は、適切な希釈溶液（例えば、１：５希釈、１０μＬ細胞＋４０μＬトリパンプルー）を用いるトリパンプルー色素染色により分析し、最終洗浄工程の時にＮＯＶＡ細胞計数により確認した。
【０２８７】
細胞生存力は、一般に接種に対し９５％より大きかった。
【０２８８】
ＣＴ２６細胞は、最初の接種のためにプレーンＲＰＭＩを用いて６．７×１０５細胞／ｍＬに希釈し、氷上で保存した。通常、各マウスには、１５０□Ｌ（１×１０５細胞）を接種した。
【０２８９】
９日目に、すべての担癌マウスを最初にラット用ケージにまとめ、それらのマウスを実験群に無作為に分けた。ＣＴＸ溶液を１×ＰＢＳにより再構成して４ｍｇ／ｍＬとした。マウス腹腔内に（ＩＰ）０．５ｍＬのＣＴＸ溶液を注射し、結果として２０グラムのマウスに対して２ｍｇ、すなわち１００ｍｇ／ｋｇとなった。
【０２９０】
１０日目に、マウスに０．５ｍＬのＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内注射し、結果として２０グラムのマウスに対して０．１ｍｇ、すなわち５ｍｇ／ｋｇとなった。同じ用量を１週間に２回、４週間にわたり合計８用量を投与した。腫瘍増殖は、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを投与した日から開始し腫瘍を週に２回、デジタルキャリパーを用いて計測することによりモニターした。腫瘍容量は、以下に示すように計算した：
腫瘍容量＝π（Ｄｓｈｏｒｔ）２×（Ｄｌｏｎｇ）／６＝〜０．５２×（Ｄｓｈｏｒｔ）２×（Ｄｌｏｎｇ）
【０２９１】
腫瘍容量が２０００ｍｍ^３であるか、または腫瘍接種部位に皮膚潰瘍および感染がある場合には、マウスを安楽死させ、試験から除外した。
【０２９２】
実施例５：シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せが定着腫瘍を根絶し得る
９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下に、上記のように１．０×１０５のＣＴ２６結腸直腸腫瘍細胞を移植した。腫瘍移植後１０日目に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを投与した。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置は１日後である１１日目に開始した。マウスを、１００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇを用いて、１週間に２用量、４週間にわたり合計８用量で処置した。ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置投与計画を受けたマウスの７５％において４４日までに定着腫瘍が根絶され、一方、対照ＣＴＸ単独群のマウスは全例が、腫瘍増殖の結果死亡したか、または腫瘍がＩＡＣＵＣにより承認されたサイズを超えたため安楽死させた（結果は図６に示す）。これらの結果は、定着腫瘍に対する処置投与計画が単なる予防ではなく有効であることを実証している。
【０２９３】
実施例６：シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せが定着腫瘍を根絶し、腫瘍再負荷から保護し得る
上記実験でＣＴ２６結腸直腸定着腫瘍を根絶したマウスに、４４日目および７０日目に１×１０５個のＣＴ２６細胞を再負荷した。再負荷により腫瘍が増殖しなかったことは、シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せ処置が、長期にわたる抗腫瘍免疫を発展させたことを示唆している。ビヒクル対照群のマウスは全例が腫瘍を発現した（結果は図７に示す）。これらの結果は、処置投与計画の定着腫瘍に対する有効性、ならびにシクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣＩｇの組合せ処置が腫瘍抗原に対する記憶応答をもたらしたことを示している。
【０２９４】
実施例７：シクロホスファミドおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せが腫瘍特異的、記憶細胞傷害性Ｔリンパ球を生じさせ得る
上記実験でＣＴ２６結腸直腸定着腫瘍を根絶したマウスに、４４日目に２．５×１０５個のＣＴ２６細胞を再負荷した。７日後、マウスの脾臓を単離した。マウス脾細胞を、Ｇｏｌｇｉ遮断薬(BD BioScience)の存在下、５または５０μｇ／ｍＬのオボアルブミン（ＯＶＡ）またはＡＨ１ペプチドとともに６時間パルス処理し、ＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞を評価することにより記憶Ｔエフェクター細胞を分析した。図８の結果は、ＣＴ２６腫瘍根絶マウスにおいて多量のＣＴ２６特異的Ｔエフェクター細胞が存在することを示している。
【０２９５】
特に定義しない限り、本明細書において用いられたすべての技術的および科学的用語は、開示された発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【０２９６】
当業者ならば、通常の実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識あるいは確認することができる。このような等価物も以下の特許請求の範囲内である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を調節する方法であって、腫瘍に対する免疫応答を誘導する、増大させる、または増強するために有効な量のＰＤ−１アンタゴニストを投与することを含んでなり、その分子の用量、その分子の投与時期、および／またはその分子の親和性によりリガンドのＰＤ−１受容体への間欠的接近を可能にする、方法。
【請求項２】
ＰＤ−１アンタゴニストが、内因性ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１との結合を阻害または低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＤ−１アンタゴニストが、内因性ＰＤ−Ｌ２と、ＰＤ−１との結合を阻害または低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＰＤ−１アンタゴニストがＰＤ−１と結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＰＤ−１アンタゴニストがＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７．１、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
インビボ投与後に、前記分子がＰＤ−１またはそのリガンドと、３か月以内の期間結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
二種以上のＰＤ−１アンタゴニストが投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍が、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌および血液性癌からなる群から選択される癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍に対する免疫応答を増強するために、ＰＤ−１アンタゴニストと組み合わせて腫瘍抗原を投与することさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＤ−１アンタゴニストがＰＤ−１リガンドの融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
融合タンパク質が、ＰＤ−１と結合し得るＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインまたはその断片を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
融合タンパク質が配列番号５７のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＤ−１アンタゴニストとともに、免疫調節剤、Ｔｒｅｇの機能を枯渇させる、または阻害する薬剤、および共刺激分子からなる群から選択される付加的な有効薬剤を投与することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
付加的な有効薬剤がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの機能を枯渇させる、または阻害する薬剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの機能を枯渇させる、または阻害する薬剤がシクロホスファミドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１６】
抗原提示細胞機能を増強させるための請求項１に記載の方法であり、ＡＰＣにおけるＰＤ−１のシグナル伝達を阻害、低減もしくは遮断する、または疾病の除去を増強するための有効な量のＰＤ−１アンタゴニストをＡＰＣと接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１７】
インビボにおいてＰＤ−１受容体のリガンドと結合し、ＰＤ−１受容体シグナル伝達を低減または阻害するのに有効な量のＰＤ−１受容体アンタゴニストを含んでなる、組成物。
【請求項１８】
ＰＤ−１アンタゴニストが、Ｂ７−Ｈ１ポリペプチドと結合し、Ｂ７−Ｈ１ポリペプチドと、ＰＤ−１受容体との結合を阻害または低減するＢ７−ＤＣポリペプチドまたはその断片を含んでなる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記断片が、Ｂ７−Ｈ１と結合するＢ７−ＤＣの細胞外ドメインもしくはその断片、またはＢ７−ＤＣと結合するＢ７−Ｈ１の細胞外ドメインもしくはその断片を含んでなる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ＰＤ−１アンタゴニストが融合タンパク質を含んでなる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を誘発せずにＰＤ−１受容体と結合する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ＰＤ−１受容体アンタゴニストが、Ｂ７−ＤＣポリペプチドと結合し、Ｂ７−ＤＣポリペプチドと、ＰＤ−１受容体との結合を阻害または低減するＢ７−Ｈ１ポリペプチドを含んでなる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２３】
ＰＤ−１受容体アンタゴニストが融合タンパク質を含んでなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ＰＤ−１を介したシグナル伝達を誘発することなく、インビボにおいてＰＤ−１と結合するのに有効な量のポリペプチドを含んでなる、組成物。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合するように改変されたＢ７−ＤＣまたはＢ７−Ｈ１ポリペプチドを含んでなる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、そのポリペプチドがＰＤ−１を介したシグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合するように改変されたＢ７−ＤＣまたはＢ７−Ｈ１の変異体細胞外ドメインを含んでなる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
ａ）第一の融合相手と、
ｂ）第二の融合相手と
を含んでなり、
第一の融合相手が、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合するように改変されたＰＤ−１のリガンドの変異体細胞外ドメインまたはその断片を含んでなり、かつ該第一の融合相手が第二の融合相手と直接融合されているか、または場合により、第二の融合相手と融合されているリンカー配列と融合されている、融合ポリペプチド。
【請求項２８】
第二の融合相手がＩｇ重鎖定常領域の１以上のドメインを含んでなる、請求項２７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
第二のポリペプチドがヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３領域に相当するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
第一のポリペプチドが、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合するように改変されたＢ７−ＤＣまたはＢ７−Ｈ１の細胞外ドメインを含んでなる、請求項２７に記載の融合ポリペプチド。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【公表番号】特表２０１２−５１０４２９（Ｐ２０１２−５１０４２９Ａ）
【公表日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２５１５９（Ｐ２０１１−５２５１５９）
【出願日】平成２１年８月２５日（２００９．８．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５４９７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２７８２８
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５１１０４９４３９）アンプリミューン、インコーポレーテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＰＬＩＭＭＵＮＥ，　ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】