ＰＤ−１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体ならびにその使用
本発明は、ＰＤ−１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体ならびにその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＰＤ−１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体ならびにその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
コレセプターシグナル伝達は、免疫応答を調和しそして密接に調節するための重要な機序である。αβＴ細胞の通常の活性化スキームは、ＨＬＡクラスＩまたはＩＩによって提示されるペプチド抗原によってもたらされるポジティブなシグナルに依拠する。コレセプターシグナルは、この活性化を増加させるかまたは妨げるかのいずれかである。
【０００３】
ネガティブなシグナル伝達分子の中で、ＣＤ２８／Ｂ７ファミリーに属するものが、圧倒的に最も研究されている。このファミリーの３つのメンバーが、記載されている：ＣＴＬ関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム死−１（ＰＤ−１）ならびにＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）。それらは全て、トレランスの制御に役割を果たす。それらは、免疫応答を制限、終結および／または減弱させるネガティブなシグナルを与える。
【０００４】
ＰＤ−１は、アポトーシスを起こしているＴ細胞ハイブリドーマにおいてアップレギュレーションした遺伝子として単離され、そしてプログラム死１と命名された。ＰＤ−１またはＣＤ２７９は、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞、ならびに活性化骨髄系細胞上に発現する。
【０００５】
その発現は、活性化Ｔ細胞上にのみ見られるＣＴＬＡ−４よりも広い。
【０００６】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞レセプター（ＴｃＲ）とコライゲーションされると、阻害シグナルを誘起する。
【０００７】
ＰＤ−１細胞質ドメインは、２つのチロシンを含み、１つは免疫レセプターチロシン抑制性レセプター（ＩＴＩＭ）を構成し、他方は免疫レセプターチロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を構成する。第２のチロシンのリン酸化により、チロシンホスファターゼＳＨＰ２が補充され、そしてある程度ＳＨＰ１が補充される。これらのホスファターゼは、ＺＡＰ７０、ＣＤ３ζおよびＰＫＣθを脱リン酸化し、そして結果的にＴ細胞シグナルを減弱する。
【０００８】
ＰＤ−１は主に、Ｇ０／Ｇ１での細胞停止を引き起こし、そしてＴ細胞におけるサイトカイン産生を阻害することによって、Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖を阻害する。
【０００９】
２つのＰＤ−１リガンド、すなわちＰＤ−Ｌ１／Ｂ７Ｈ１／ＣＤ２７４およびＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ／ＣＤ２７３が、記載されている。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージおよびＴ細胞などの免疫細胞上に低レベルで発現し、そして活性化後にアップレギュレーションされる。ＰＤ−Ｌ１はまた、内皮細胞、心臓、肺、膵臓、筋肉、ケラチノサイトおよび胎盤などの非リンパ器官上にも発現する。非リンパ組織内の発現は、ＰＤ−Ｌ１が、末梢組織における自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞ならびに骨髄系細胞の機能を調節し得るか、または標的器官における炎症応答を調節し得ることを示唆する。ＰＤ−Ｌ１発現は主に、内皮細胞および上皮細胞上でのＰＤ−Ｌ１の主なレギュレーターである１型および２型インターフェロンによって調節される。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍試料中に発現し、そして予後不良に関連する。種々のウイルス感染が、宿主組織上において強力なＰＤ−Ｌ１発現を誘導する。
【００１０】
ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ細胞表面発現は、マクロファージおよび樹状細胞に限定されるが、ＰＤ−Ｌ２転写物は、心臓、肝臓および膵臓などの非造血組織に見られた。その表面発現は、ＩＦＮγおよびＴｈ２サイトカインの産生に依存する。
【００１１】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現はまた、明確に異なる刺激に依存する。マクロファージ上でＰＤ−Ｌ１は、ＩＮＦγによって誘導されるが、ＰＤ−Ｌ２は、ＩＬ−４によって誘導される。類似の調節が、ＤＣ上に見られるが、これらの差異は、絶対的ではない。これらの研究は、ＰＤ−Ｌ１が、優先的にＴｈ１応答を調節し得、一方、ＰＤ−Ｌ２は、Ｔｈ２応答を調節することを示唆する傾向がある。
【００１２】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方が、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生、ならびにβ１およびβ２インテグリンにより媒介される接着を阻害する。しかしながらいくつかの矛盾するデータが、共刺激機能を提案した。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１ではなくＰＤ−Ｌ２が、樹状細胞における逆シグナル伝達をトリガーし、ＩＬ−１２の産生およびＴ細胞の活性化をもたらす。
【００１３】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現パターンは、免疫調節における重複した役割および異なる役割の両方を示唆する。ＰＤ−Ｌ１は、多種多様なヒト癌において豊富である（Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用により、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞レセプター媒介増殖の減少、および癌細胞による免疫回避が起こる（Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって、免疫抑制を逆転させることができ、そしてその効果は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用が同様に遮断されれば相加的である（Iwai et al. (2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66）。
【００１４】
ＰＤ−１欠損動物は、自己免疫性心筋症、ならびに関節炎および腎炎を伴うループス様症候群を含む、種々の自己免疫表現型を発達させる（Nishimura et al. (1999) Immunity H: 141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291:319-22）。さらに、ＰＤ−１は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主疾病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病、および関節リウマチにおいて役割を果たしていることが判明した（Salama et al. (2003) J Exp Med 198:71-78: Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum MoI Genet 13:R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 11:510）。
【００１５】
動物モデルにおいては、遮断ｍＡｂを使用したＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の遮断は、系統特異的な実験的自己免疫性脳炎の感受性および慢性的進行における明確に異なる役割を証明する。ＮＯＤ前糖尿病性マウスにおいては、ＰＤ−Ｌ２ではなくＰＤ−Ｌ１の遮断が、糖尿病を誘発した。自己免疫性糖尿病のＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスモデルを使用して、Martin-Orozco等はＰＤ−Ｌ２ではなくＰＤ−Ｌ１が、糖尿病発症の阻害を媒介したことを見出した（Martin-Orozco et al. (2006) J Immunol. 15;177(12):8291-5）。
【００１６】
現在までに、特に癌患者において、ワクチンに対して強力な免疫応答を誘導することを証明した満足の行くアプローチはなかった。癌患者においてそして慢性感染中に観察された免疫抑制機序を克服するために依然として方法を考案する必要がある。
【００１７】
自己免疫疾病の処置および移植片対宿主疾病（ＧＶＨＤ）における移植拒絶の予防は、免疫抑制剤に依存するが、それらは重篤な副作用を有するかまたは常には効果的ではない。新たな免疫抑制剤が、所望される。
【００１８】
発明の要約
本発明は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできるＰＤ−１抗体（ＰＤ１．３）に関する。
【００１９】
本発明はまた、ＰＤ１．３のＣＤＲを含むＰＤ−１抗体にも関する。
【００２０】
本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用のためのＰＤ１．３またはその誘導体に関する。
【００２１】
本発明は、癌または慢性感染の処置のためのＰＤ１．３またはその誘導体に関する。
【００２２】
本発明は、ＰＤ１．３またはその誘導体を含む、癌または慢性感染の処置のためのワクチンに関する。
【００２３】
本発明は、
ａ）ＰＤ１．３またはその誘導体；および
ｂ）癌または慢性感染の処置のためのワクチン
を含む、癌または慢性感染の処置のためのキットに関する。
【００２４】
本発明はまた、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【００２５】
本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法において使用するためのＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【００２６】
本発明は、自己免疫疾病、移植拒絶または移植片対宿主疾病の処置のための、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【００２７】
発明の詳細な説明
定義
本発明による「抗体」または「免疫グロブリン」は、同じ意味を有し、そして本発明において同等に使用される。本明細書において使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。従って、抗体という用語は、完全な抗体分子だけでなく、抗体フラグメントまたは誘導体も包含する。抗体フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２およびダイアボディを含むがそれらに限定されない。
【００２８】
天然抗体においては、２つの重鎖が、互いにジスルフィド結合によって連結され、そして各々の重鎖は、ジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。軽鎖にはラムダ（λ）およびカッパ（κ）の二種類がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。各々の鎖は、明確に異なる配列ドメインを含む。軽鎖は、２つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメインを含む（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、まとめてＣＨと称する）。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域が、結合認識および抗原に対する特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインが、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、およびＦｃレセプター（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、そして１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原性決定基との間の構造的相補性に存する。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基からなる。時折、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基が、全体的なドメイン構造に影響を及ぼし、従って、結合部位に影響を及ぼす。相補性決定領域すなわちＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の各々は、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３とそれぞれ称される３つのＣＤＲを有する。それ故、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のＶ領域の各々に由来するＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指す。
【００２９】
「キメラ抗体」という用語は、動物の抗体、典型的にはマウス抗体の一部と、ヒト抗体の一部との遺伝子操作した融合物を指す。一般的には、キメラ抗体は、約３３％のマウスタンパク質および６７％のヒトタンパク質を含む。動物抗体によって誘起されるヒト抗動物抗体応答が減少するように開発したため、それらは、動物抗体の特異性と、ヒト抗体の効率的なヒト免疫系相互作用とを兼ね備える。
【００３０】
本発明による「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体に由来する可変領域フレームワークおよび定常領域を有するが動物抗体のＣＤＲを保持する、抗体を指す。
【００３１】
「Ｆａｂ」という用語は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを示し、プロテアーゼのパパインを用いてＩｇＧを処理することによって得られたフラグメントの中で、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分および完全なＬ鎖が、ジスルフィド結合を通して結合している。
【００３２】
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、約１００，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、これは、プロテアーゼのペプシンを用いてＩｇＧを処理することによって得られたフラグメントの中で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合したＦａｂよりも僅かに大きい。
【００３３】
「Ｆａｂ’」という用語は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、これは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる。
【００３４】
単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結した、ＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から通常発現する、共有結合的に連結したＶＨ：ＶＬヘテロダイマーである。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化したＶＨ：ＶＬヘテロダイマーである。二価および多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合によって自発的に形成し得るか、または二価ｓｃ（Ｆｖ）２のように、ペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖをカップリングすることによって生成することができる。
【００３５】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対を形成させ、そして２つの抗原結合部位を作り出す。
【００３６】
「精製された」および「単離された」によって、ポリペプチド（すなわち本発明による抗体）またはヌクレオチド配列を言及する場合、指定した分子が、同じ型の他の生物学的巨大分子の実質的に非存在下において存在することを意味する。本明細書において使用する「精製された」という用語は、好ましくは、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、より好ましくはさらには少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の同じ型の生物学的巨大分子が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指し；しかしながら、分子は、前記組成物の基本的な特徴に有害な影響を及ぼさないいくつかの追加的な塩基または部分を含んでいてもよい。
【００３７】
本発明に関連して、本明細書において使用する「処置する」または「処置」という用語は、このような用語が適用する疾患もしくは容態、またはこのような疾患もしくは容態の１つ以上の症状の進行を逆転、寛解、阻害するか、または前記を予防することを意味する。「治療有効量」は、被験体に治療利点を付与するのに必要とされる活性剤の最小量を意図する。例えば、哺乳動物への「治療有効量」は、病的症状、疾病の進行、または疾患に関連した生理学的容態、または疾患に屈することに対する抵抗性の改善を誘導、回復または別様に引き起こすような量である。
【００３８】
本明細書において使用する「予防」という用語は、疾病または容態に罹患するとまだ診断されていない被験体において前記疾病または容態が起こることを予防することを指す。
【００３９】
本明細書において使用する「被験体」という用語は、哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌおよび霊長類を示す。好ましくは、本発明による被験体は、ヒトである。
【００４０】
本明細書において使用する「癌」、「過増殖」および「新生物」という用語は、自律的増殖能を有する細胞、すなわち、急速に増殖している細胞増殖によって特徴付けられる異常な状態または容態を指す。過増殖および新生物疾病状態は、病的、すなわち疾病状態を特徴付けるまたは構成するとして分類され得るか、あるいは、非病的、すなわち正常からは逸脱しているが疾病状態には関連していないとして分類され得る。この用語は、病理組織学的タイプまたは侵襲性の段階に関係なく、全てのタイプの癌性増殖または発癌過程、転移性組織または悪性に形質転換した細胞、組織もしくは器官を含むことを意味する。「癌」または「新生物」という用語は、罹患している肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸および泌尿生殖器などの種々の器官系の悪性疾患、ならびに、大半の大腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小腸癌および食道癌などの悪性疾患を含む腺癌を含む。
【００４１】
本発明者らは、２００９年２月４日に、ブダペスト条約の規約に従って、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）に、マウスＰＤ−１抗体（ＰＤ１．３）を産生するハイブリドーマを寄託した。寄託したハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２を有する。
【００４２】
「ＰＤ１．３」は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる単離されたＰＤ−１抗体を指す。
【００４３】
「ＰＤ１．３の誘導体」という表現は、ＰＤ１．３の６つのＣＤＲを含むＰＤ−１抗体を指す。
【００４４】
本発明者らは、２００８年１０月１５日に、ブダペスト条約の規約に従って、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）にマウスＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＤＬ１．１）を産生するハイブリドーマを寄託した。寄託したハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８０を有する。
【００４５】
「ＰＤＬ１．１」は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８０の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる単離されたＰＤ−Ｌ１抗体を指す。
【００４６】
「ＰＤＬ１．１の誘導体」という表現は、ＰＤＬ１．１の６つのＣＤＲを含むＰＤ−Ｌ１抗体を指す。
【００４７】
本発明者らは、２００８年１０月１５日に、ブダペスト条約の規約に従って、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）にマウスＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＤＬ１．２）を産生するハイブリドーマを寄託した。寄託したハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８１を有する。
【００４８】
「ＰＤＬ１．２」は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８１の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる単離されたＰＤ−Ｌ１抗体を指す。
【００４９】
「ＰＤＬ１．２の誘導体」という表現は、ＰＤＬ１．２の６つのＣＤＲを含むＰＤ−Ｌ１抗体を指す。
【００５０】
本発明の抗体およびそれらをコードする核酸
本発明は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる単離されたＰＤ−１抗体（ＰＤ１．３）に関する。
【００５１】
本発明は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２の下で入手できるハイブリドーマに関する。
【００５２】
本発明は、ＰＤ１．３の６つのＣＤＲを含む抗体に関する。
【００５３】
別の態様において、本発明は、ＰＤ１．３のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含む、ＰＤ１．３の誘導体に関する。
【００５４】
別の態様において、本発明は、ＰＤ１．３の可変ドメインを含む、キメラ抗体であるＰＤ１．３の誘導体に関する。
【００５５】
本発明はまた、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、単離されたＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【００５６】
典型的には、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合の安定化は、実施例に記載の方法に従って測定され得る。
【００５７】
ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、単離されたＰＤ−Ｌ１抗体の例は、ＰＤＬ１．１、ＰＤＬ１．２またはその誘導体である。
【００５８】
本発明はまた、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８０またはＩ−４０８１の下で入手できるハイブリドーマに関する。
【００５９】
本発明はまた、ＰＤＬ１．１の６つのＣＤＲまたはＰＤＬ１．２の６つのＣＤＲを含む抗体に関する。
【００６０】
別の態様において、本発明は、それぞれＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含む、ＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２の誘導体に関する。
【００６１】
別の態様において、本発明は、ＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２の可変ドメインを含む、キメラ抗体であるＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２の誘導体に関する。
【００６２】
１つの態様において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。
【００６３】
１つの態様において、本発明の抗体は、キメラ抗体である。
【００６４】
１つの態様において、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。
【００６５】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗体をコードする核酸配列に関する。
【００６６】
特定の態様において、本発明は、本発明の抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインをコードする核酸配列に関する。
【００６７】
典型的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの任意の適切なベクターに含まれ得る、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
【００６８】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、ビヒクルを意味し、これによりＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を、宿主細胞に導入することができ、よって宿主を形質転換し、そして導入した配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進することができる。
【００６９】
よって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００７０】
このようなベクターは、調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含み得、被験体への投与時に前記抗体の発現を引き起こすかまたは指令する。動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーターおよびエンハンサーなどが挙げられる。
【００７１】
ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入および発現することができる限り、動物細胞のための任意の発現ベクターを、使用することができる。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４、ｐＫＣＲ、ｐＳＧ１βｄ２−４−などが挙げられる。
【００７２】
プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、または組込みプラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。
【００７３】
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、パッケージング細胞をトランスフェクションすることによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いての一過性トランスフェクションによってなどの、当技術分野において公知の技術によって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠陥組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えばWO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056およびWO 94/19478に見出され得る。
【００７４】
本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターによってトランスフェクション、感染または形質転換した細胞に関する。「形質転換」という用語は、宿主細胞への「外来」（すなわち外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の導入を意味し、よって宿主細胞は、導入した遺伝子または配列を発現して、所望の物質、典型的には導入した遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素を産生する。導入したＤＮＡまたはＲＮＡを受容しそして発現する宿主細胞は、「形質転換」している。
【００７５】
本発明の核酸を使用して、適切な発現系において本発明の抗体を産生し得る。「発現系」という用語は、例えば、ベクターが保有し宿主細胞に導入した外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、適切な条件下の宿主細胞および適合性ベクターを意味する。
【００７６】
一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、以下に制限されるわけではないが、原核細胞（例えば細菌）および真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳動物細胞系（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）ならびに一次または樹立した哺乳動物細胞培養（例えば、リンパ芽球細胞、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生）が挙げられる。例としてはまた、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（本明細書において以後「ＤＨＦＲ遺伝子」と称する）が欠損しているＣＨＯ細胞、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、本明細書においては以後「ＹＢ２／０細胞」と称する）などが挙げられる。
【００７７】
本発明はまた、本発明による抗体を発現している組換え宿主細胞を産生する方法に関し、前記方法は、工程：（ｉ）in vitroまたはex vivoにおいて前記したような組換え核酸またはベクターをコンピテントな宿主細胞に導入すること、（ｉｉ）in vitroまたはex vivoにおいて得られた組換え宿主細胞を培養すること、および（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現および／または分泌する細胞を選択することを含む。このような組換え宿主細胞を、本発明の抗体の産生のために使用することができる。
【００７８】
本発明の抗体を産生する方法
本発明の抗体を、任意の化学的、生物学的、遺伝学的または酵素的技術など、これらに限定されない当技術分野において公知の任意の技術を単独でまたは組み合わせてのいずれかによって産生し得る。
【００７９】
所望の配列のアミノ酸配列を知っていれば、当業者は、ポリペプチドの産生のための標準的な技術によって前記抗体を容易に産生することができる。例えば、それらを、周知の固相法を使用して、好ましくは市販されているペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems, Foster City, Californiaによって製造されたもの）を使用してそして製造業者の指示に従って合成することができる。あるいは、本発明の抗体を、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。例えば、抗体を、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに取り込み、そして所望の抗体を発現するであろう適切な真核生物宿主または原核生物宿主にこのようなベクターを導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得ることができ、前記宿主から周知の技術を使用して後に単離することができる。
【００８０】
特に、本発明はさらに、本発明の抗体を産生する方法に関し、前記方法は、（ｉ）前記抗体の発現を可能とするに適した条件下で、本発明による形質転換した宿主細胞を培養すること；および（ｉｉ）発現した抗体を回収することからなる工程を含む。
【００８１】
別の特定の態様において、前記方法は、工程：
（ｉ）抗体の発現を可能とするに適した条件下でＣＮＣＭ Ｉ−４１２２、ＣＮＣＭ Ｉ−４０８０またはＣＮＣＭ Ｉ−４０８１として寄託したハイブリドーマを培養すること；および
（ｉｉ）発現した抗体を回収することを含む。
【００８２】
本発明の抗体を、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離する。
【００８３】
特定の態様において、本発明のヒトキメラ抗体を、以前に記載したようなＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸配列を得、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターにそれらを挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、そして発現ベクターを動物細胞に導入することによってコード配列を発現させることによって産生し得る。
【００８４】
ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとしては、それはヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であり得るが、ＩｇＧクラスのものが適切であり、そしてまたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などのＩｇＧクラスに属するサブクラスのいずれか１つを使用することができる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとしては、それは、Ｉｇに属する任意の領域であり得、そしてカッパークラスまたはラムダクラスのものを使用することができる。
【００８５】
キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である従来の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション技術を含む（特許文書ＵＳ５，２０２，２３８；およびＵＳ５，２０４，２４４を参照されたい）。
【００８６】
本発明のヒト化抗体を、以前に記載のように、ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得、（ｉ）ヒト抗体のそれと同一である重鎖定常領域および（ｉｉ）ヒト抗体のそれと同一である軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターにそれらを挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構築し、そして該発現ベクターを動物細胞に導入することによって該遺伝子を発現させることによって産生し得る。
【００８７】
ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子および抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上に存在するタイプ、または両方の遺伝子が同じベクター上に存在する（タンデムタイプ）タイプのいずれかであり得る。ヒト化抗体発現ベクターの構築のし易さ、動物細胞への導入のし易さ、および動物細胞における抗体Ｈ鎖の発現レベルとＬ鎖の発現レベルとの間のバランスの点では、タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターが、好ましい。タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。
【００８８】
従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術に基づいたヒト化抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である。抗体を、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０９９６７； 米国特許第５，２２５，５３９；第５，５３０，１０１；および第５，５８５，０８９）、ベニアリングまたは再表面化（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ ５１９，５９６）、およびチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２）を含む、当技術分野において公知の多種多様な技術を使用してヒト化することができる。このような抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３および国際特許出願ＷＯ９６／０２５７６を参照されたい）。
【００８９】
本発明のＦａｂを、ＰＤ−１と特異的に反応する抗体をプロテアーゼのパパインを用いて処理することによって得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現系のためのまたは真核生物発現系のための該ベクターに挿入し、そしてベクターを原核生物または真核生物（適宜）に導入して該Ｆａｂを発現させることによってＦａｂを産生することができる。
【００９０】
本発明のＦ（ａｂ’）２を、ＰＤ１．３と特異的に反応する抗体をプロテアーゼのペプシンで処理することによって得ることができる。また、該Ｆ（ａｂ’）２を、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して以下に記載したＦａｂ’を結合することによっても産生し得る。
【００９１】
本発明のＦａｂ’を、ヒトＰＤ−１と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤のジチオトレイトールで処理することによって得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを、原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現ベクターに挿入し、そして該ベクターを原核生物または真核生物（適宜）に導入して、その発現を行なうことによって該Ｆａｂ’を産生することができる。
【００９２】
本発明のｓｃＦｖを、以前に記載したようなＶＨおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現ベクターに挿入し、そしてその後、該発現ベクターを原核生物または真核生物（適宜）に導入して該ｓｃＦｖを発現させることによって産生することができる。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを生成するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を使用し得、これは、ドナーのｓｃＦｖフラグメントから相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、そしてそれらを公知の３次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワークに移植することを含む（例えば、Ｗ０９８／４５３２２；ＷＯ８７／０２６７１；ＵＳ５，８５９，２０５；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ４，８１６，５６７；ＥＰ０１７３４９４を参照されたい）。
【００９３】
本明細書において記載した抗体のアミノ酸配列の改変を考える。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性が向上することが望ましくあり得る。非ヒト動物由来の抗体のＶＨおよびＶＬにおけるＣＤＲのみを、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに単に移植することによってヒト化抗体を産生する場合、抗原結合活性は、非ヒト動物由来の元の抗体のそれと比較して減少することが知られている。ＣＤＲにおけるだけでなくＦＲにおける、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのいくつかのアミノ酸残基も、抗原結合活性に直接的または間接的に関連していると考えられる。従って、これらのアミノ酸残基を、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基を用いて置換することにより、結合活性が減少するだろう。問題を解決するために、ヒトＣＤＲを用いて移植した抗体においては、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、抗体との結合に直接関連しているか、またはＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するか、または抗体の３次元構造を維持し、そして抗原への結合に直接関連しているアミノ酸残基を同定するために試みを行なわなければならない。減少した抗原結合活性を、同定したアミノ酸を非ヒト動物由来の元の抗体のアミノ酸残基を用いて置換することによって増加させることができた。
【００９４】
改変および変化を、本発明の抗体の構造、およびそれらをコードするＤＮＡ配列に行ない得、そして依然として所望の特徴を有する抗体をコードする機能的分子を得る。
【００９５】
アミノ配列を変化させる際に、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮し得る。タンパク質上に相互作用的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性が、一般的に当技術分野において理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特徴は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次いで、タンパク質と、他の分子、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められる。各アミノ酸は、その疎水性および荷電特徴に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられており、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００９６】
本発明のさらなる態様はまた、本発明の抗体の機能保存的な変異体も包含する。
【００９７】
「機能保存的変異体」は、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基を、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変容（alter）させることなく変化させている（これは、アミノ酸を、類似の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸を用いて置換することを含むがそれらに限定されない）ものである。保存されていると指摘されたもの以外のアミノ酸は、タンパク質中において異なっていてもよく、よって、類似の機能のいずれか２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸の配列類似率は変化し得、そして、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ法によるなどのアラインメントスキームに従って決定したところ７０％〜９９％であり得、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存的変異体」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定したところ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、そして比較する天然タンパク質または親タンパク質と同じまたは実質的に類似した特性または機能を有する、ポリペプチドを含む。
【００９８】
２つのアミノ酸配列は、短い方の配列の全長にかけてアミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一である場合、または約９０％超、好ましくは９５％超が類似（機能的同一）している場合に「実質的に相同」または「実質的に類似」している。好ましくは、類似配列または相同配列を、例えばＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラム、またはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムのいずれかを使用したアラインメントによって同定する。
【００９９】
例えば、認め得る活性の減少を伴うことなく、タンパク質構造中の特定のアミノ酸を、他のアミノ酸によって置換することができる。タンパク質の相互作用能および性質は、タンパク質の生物学的な機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸置換をタンパク質配列中に、およびもちろんそのＤＮＡコーディング配列中に行なって、依然として類似した特性を有するタンパク質を得ることができる。従って、本発明の抗体配列または前記抗体をコードする対応するＤＮＡ配列において種々の変化を、認め得るその生物学的活性の減少を伴うことなく行なうことができると考えられる。
【０１００】
特定のアミノ酸を、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換し得、そして依然として、類似した生物学的活性を有するタンパク質が得られ、すなわち、依然として生物学的に機能的に等価なタンパク質が得られることが当技術分野において知られている。
【０１０１】
前記に概略を示したように、それ故、アミノ酸の置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、荷電、サイズなどに基づく。前記の種々の特徴を考慮に入れた例示的な置換は、当業者には周知であり、そして、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびに、バリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。
【０１０２】
本発明の抗体の別のタイプのアミノ酸改変は、抗体の元のグリコシル化パターンを変容させるのに有用であり得る。
【０１０３】
「変容させる」によって、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１０４】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合である。「Ｎ結合」は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのいずれかのトリペプチド配列の存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。抗体へのグリコシル化部位の付加を、抗体が前記のトリペプチド配列の１つ以上を含むように（Ｎ結合グリコシル化部位のために）、アミノ酸配列を変容させることによって簡便に達成する。
【０１０５】
別のタイプの共有結合的修飾は、抗体にグリコシドを化学的または酵素的にカップリングすることを含む。これらの手順は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないために有利である。使用するカップリング形態に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのそれ、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのそれ、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのそれ、あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させ得る。例えば、このような方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
【０１０６】
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去を、化学的にまたは酵素的に達成し得る。化学的脱グリコシル化は、化合物のトリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理により、連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く殆どまたは全ての糖が切断され、抗体はインタクトのままで残る。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断を、多種多様なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成し得る。
【０１０７】
抗体の別のタイプの共有結合的修飾は、米国特許第４，６４０，８３５；第４，４９６，６８９；第４，３０１，１４４；第４，６７０，４１７；第４，７９１，１９２または第４，１７９，３３７において示された様式での、多種多様な非タンパク質性ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンへの抗体の連結を含む。
【０１０８】
また、例えば抗体の抗原依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましくあり得る。これを、抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成し得る。代替的にまたは追加的に、システイン残基をＦｃ領域に導入し得、これにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能となる。このようにして生成したホモダイマー抗体は、内部移行能および／または増加した補体介在性細胞殺滅および／または抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を改善し得る（Caron PC. et al. J Exp Med. 1992 Oct 1;176(4):1191-5およびShopes B. J Immunol. 1992 May 1;148(9):2918-22）。
【０１０９】
本発明の抗体の治療使用
本発明者らは、ＰＤ１．３が、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合を阻害し、よってこれを癌患者および慢性感染中に観察されるＰＤ−１によって媒介される免疫抑制機序を克服するために使用し得ることを実証した。
【０１１０】
本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用のためのＰＤ１．３またはその誘導体に関する。
【０１１１】
本発明は、癌または慢性感染の処置のためのＰＤ１．３またはその誘導体に関する。
【０１１２】
本発明はまた、癌または慢性感染を処置するための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量のＰＤ１．３またはその誘導体を投与する工程を含む。
【０１１３】
癌の例としては、血液学的悪性疾患、例えばＢ細胞リンパ系新生物、Ｔ細胞リンパ系新生物、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ−ＮＨＬ、Ｔ−ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ＮＫ細胞リンパ系新生物および骨髄系細胞系統新生物が挙げられるがそれらに限定されない。非血液学的癌の例としては、大腸癌、乳癌、肺癌、脳癌、前立腺癌、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸直腸癌、骨癌、子宮頸部癌、肝癌、口腔癌、食道癌、甲状腺癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌および皮膚癌が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１４】
慢性感染の例としては、ウイルス、細菌、寄生虫または真菌の感染、例えば慢性肝炎、肺感染、下気道感染、気管支炎、インフルエンザ、肺炎および性行為感染症が挙げられるがそれらに限定されない。ウイルス感染の例としては、肝炎（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、単純ヘルペス（ＨＳＶ）、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、エイズおよびエイズ関連合併症、水痘（水疱瘡）、感冒、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染、天然痘（痘瘡）、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、口蹄疫、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核球症、ムンプス、ノロウイルス、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル病および黄熱病が挙げられるがそれらに限定されない。細菌感染の例としては、肺炎、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、結核、炭疽病、ボツリヌス症、ブルセラ症、カンピロバクター症、チフス、淋病、リステリア症、ライム病、リウマチ熱、百日咳（pertussis）（百日咳、Whooping Cough）、ペスト、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、野兎病、腸チフス熱、および尿路感染症が挙げられるがそれらに限定されない。寄生虫感染の例としては、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、シャーガス病、クリプトスポリジウム症、肝蛭症、フィラリア症、アメーバ感染、ジアルジア症、蟯虫感染、住血吸虫症、条虫症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、およびトリパノソーマ症が挙げられるがそれらに限定されない。真菌感染の例としては、カンジダ症、アスペルギルス症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症および足白癬が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１５】
ＰＤ１．３またはその誘導体を、癌または慢性感染の処置のためのワクチンアジュバントとして使用し得る。
【０１１６】
本発明は、ＰＤ１．３またはその誘導体を含む、癌または慢性感染の処置のためのワクチンに関する。
【０１１７】
本発明は、
ａ）ＰＤ１．３またはその誘導体；および
ｂ）癌または慢性感染の処置のためのワクチン
を含む、癌または慢性感染の処置のためのキットに関する。
【０１１８】
キットの２つの成分を、時間をかけて同時にまたは連続的に投与し得る。
【０１１９】
癌または慢性感染の処置のためのワクチンの例としては、ＨＩＶおよびＨＢＶなどのウイルス、細菌、寄生虫もしくは真菌の感染に対するワクチン、ならびにウイルス関連癌（例えばＨＰＶまたはＨＢＶ）に対するワクチン、またはメラノーマ、白血病、乳癌、肺癌を有する患者の処置に例えば使用する抗癌ワクチンが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２０】
さらに、本発明者らは、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化し、よってＰＤ−１によって媒介される免疫抑制機序を刺激するのに使用し得る、ＰＤ−Ｌ１抗体を生成した。これらのＰＤ−Ｌ１抗体は、免疫抑制剤として使用され得る。
【０１２１】
さらなる態様において、本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用のためのＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【０１２２】
特に、本発明は、自己免疫疾病、移植拒絶または移植片対宿主疾病の処置のための、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【０１２３】
本発明はまた、自己免疫疾病、移植拒絶または移植片対宿主疾病の処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、治療有効量のＰＤ−Ｌ１抗体を投与する工程を含む。典型的には、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化するＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤＬ１．１、その誘導体、ＰＤＬ１．２またはその誘導体であり得る。
【０１２４】
処置され得る自己免疫疾病の例としては、関節リウマチ（ＲＡ）、インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、アジソン病、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、特発性白血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、男性不妊症、混合性結合組織病、重症筋無力症、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、ライター症候群、全身硬直症候群、甲状腺中毒症、潰瘍性大腸炎およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２５】
典型的には、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化するＰＤ−Ｌ１抗体を、他の免疫抑制剤および化学療法剤（プレドニゾン、アザチオプリン、シクロスポリン、メトトレキセートおよびシクロホスファミドなどであるがそれらに限定されない）と組み合わせて使用し得る。
【０１２６】
本発明はまた、本発明の抗体を含む薬学的組成物に関する。
【０１２７】
それ故、本発明の抗体を、薬学的に許容される賦形剤および場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと合わせて、治療組成物を形成してもよい。
【０１２８】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害な反応、アレルギー反応または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意のタイプの無毒性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、封入材料または製剤助剤を指す。
【０１２９】
薬学的組成物の剤形、投与経路、投与量およびレジメンは、当然ながら、患者の、処置しようとする容態、病気の重篤度、年齢、体重および性別などに依存する。
【０１３０】
本発明の薬学的組成物を、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与などのために製剤化し得る。
【０１３１】
好ましくは、薬学的組成物は、注射することのできる製剤のための薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張性で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなどまたはこのような塩の混合物）、または場合に応じて滅菌水もしくは生理食塩水を添加すると注射溶液の復元が可能となる、乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であり得る。
【０１３２】
投与のために使用する投与量を、種々のパラメーターの関数として、特に使用する投与形態、関連する病態、または代替的には所望の処置期間の関数として適合することができる。
【０１３３】
薬学的組成物を調製するために、有効量の抗体を、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散し得る。
【０１３４】
注射使用に適した剤形は、無菌水性液剤または分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、そして容易にシリンジが扱える程度に流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下において安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。
【０１３５】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中において調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物中、ならびに油中において調製することができる。通常の保存および使用の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含む。
【０１３６】
本発明の抗体を、中性形または塩形の組成物へと製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成）を含み、そしてこれを、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成する。また、遊離カルボキシル基を用いて形成する塩を、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導することもできる。
【０１３７】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止を、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中における、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤の使用によってもたらすことができる。
【０１３８】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を、必要であれば前記に列挙した種々の他の成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製する。一般的には、分散液を、基本分散媒体と、前記に列挙したものに由来する必要とされる他の成分とを含む無菌ビヒクルに、種々の滅菌した活性成分を取り込むことによって調製する。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過したその溶液から、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【０１３９】
直接的な注入のためのより濃縮したまたは高度に濃縮した溶液の調製も考えられ、極めて急速に浸透し、小さな腫瘍領域に高濃度の活性剤を送達する、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が考えられる。
【０１４０】
製剤化した後、溶液を、投与製剤と適合性の様式で、治療的に有効な量で投与する。製剤を、前記した注射用溶液のタイプなどの多種多様な剤形で容易に投与するが、薬物放出カプセルなども、使用することができる。
【０１４１】
水溶液での非経口的な投与のために、例えば、溶液を、必要であれば適切に緩衝化するべきであり、そして十分な食塩水またはグルコースを用いて液体をまず等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適している。これに関して、使用することのできる無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知である。例えば、１投与量を１mlの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し得、そして１０００mlの皮下点滴療法用液体に添加するか、または提案した点滴部位に注入し得る（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 15th Edition, pages 1035-1038および1570-1580参照）。用量のいくらかの変更が、処置される被験体の容態に依存して必然的になされるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験体に対する適切な用量を決定する。
【０１４２】
本発明の抗体を、１用量あたり、約０．０００１〜１．０mg、または約０．００１〜０．１mg、または約０．１〜１．０またはさらには約１０mgなどを含むように、治療混合物内に製剤化し得る。複数の用量を投与してもよい。
【０１４３】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化した化合物に加えて、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、経口投与のための錠剤または他の固形剤；徐放性カプセル；および現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。
【０１４４】
特定の態様において、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が、宿主細胞への抗体の導入のために考えられる。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成および使用は当業者には公知である。
【０１４５】
ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現性のある様式で化合物を封入することができる。細胞内におけるポリマーの過負荷に起因する副作用を回避するために、in vivoにおいて分解され得るポリマーを使用してこのような超微細粒子（約０．１μmのサイズ）を、一般的に設計する。これらの必要条件に合致する生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子を、本発明における使用に考え、そしてこのような粒子を、容易に作製し得る。
【０１４６】
リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして自発的に多層の同心円状の二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５nmから４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、コア中に水溶液を含む、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
【０１４７】
本発明を、以下の図面および実施例を鑑みてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】Ｂｉａｃｏｒｅを使用したＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の競合的結合のＳＰＲ分析。（Ａ）（Ｂ）において使用した表面競合的結合阻害の図解。（Ｂ）ＰＤ−１チップを、漸増量のＰＤ−Ｌ２（０〜１０００ＲＵ）と共にプレインキュベーションし、そしてＰＤ−Ｌ１を１０μg/mlで２分間１０μl/分の流速で、結合したＰＤ−Ｌ２を除去することなく注入した。種々のレベルのＰＤ−Ｌ２占有度で結合したＰＤ−Ｌ１を示すセンサーグラムを重ねる。（Ｃ）（Ｄ）において使用した溶液阻害の図解。（Ｄ）１０μg/mlのＰＤ−１組換えタンパク質を、漸増濃度のＰＤ−Ｌ２（０〜６０μｇ/ml）と共にプレインキュベーションし、そして１０μl/分の流速で２分間ＰＤ−Ｌ１チップ上に注入した。注入の終了から１０秒後にモニタリングしたＲＵ値を、ＰＤ−Ｌ２濃度の関数としてプロットした（ｌｏｇスケール）。
【図２】ＰＤ１．３抗体は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方へのＰＤ−１の結合を遮断し、そしてＴ細胞の活性化を増強する。（Ａ）（Ｂ）および（Ｃ）において使用した表面競合的結合阻害の図解。第１ステップにおいて、固定したＰＤ−１タンパク質を抗体Ｆａｂを使用して飽和させ、そして対応するＰＤ−１リガンドを、第２ステップにおいて可溶性分析物として注入する。（ＢおよびＣ）ＰＤ−Ｌ１Ｉｇ（Ｂ）およびＰＤ−Ｌ２Ｉｇタンパク質（Ｃ）を、１０μg/mlで２分間１０μl/分の流速でＰＤ−１チップ上に注入するか（無し）、または抗ＰＤ−１Ｆａｂ、ＰＤ１．３もしくはＰＤ１．６と共にプレインキュベーションしたＰＤ−１チップ上に注入した。種々の状況におけるＰＤ−１リガンドの結合を示すセンサーグラムを重ねる。示したデータは、２回の別々の実験の代表である。（Ｄ）ＰＤ１．３ｍＡｂは、ＰＤ−１を発現している細胞への、ＰＤ−Ｌ１ ＦｃおよびＰＤ−Ｌ２ Ｆｃの結合を妨げる。（ＥおよびＦ）ＰＤ１．３ｍＡｂは、ＤＣ相互作用時にＣＤ４ Ｔ細胞においてＩＦＮ−γおよびＩＬ１０の産生を誘導することができる。同種異型ｉＤＣを、抗ＰＤ１.３、ＰＤ１．６またはアイソタイプ対照と、ＣＤ４＋ Ｔ細胞と共に共培養した。培養を、５日間インキュベーションし、上清をサイトカイン分析のために取り出した。ＩＦＮ−γ産生（Ｅ）およびＩＬ１０産生（Ｆ）のレベルを、二重にＥＬＩＳＡ検出によって決定した。示したデータは、２回の別々の実験の代表である。
【図３】ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、同じ分子機序でＰＤ−１に結合しない。（Ａ）ＰＤ−１チップへのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合と、ＣＤ８０チップへのＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４の結合を示す、重ね合わせたセンサーグラム。１０μg/mlのタンパク質を３０秒間１０μl/分の流速でＰＤ−１チップ上に注入し、そしてさらに１２０秒間かけて解離させた。（Ｂ）ＰＤ−１チップ上へのそれぞれＰＤ−Ｌ１（上）およびＰＤ−Ｌ２（下）の短い（青色）および長い（赤色）注入を示す重ね合わせたセンサーグラム。１０μg/mlのタンパク質を１分間または７分間１０μl/分の流速でＰＤ−１チップ上に注入した。センサーグラムをＹ軸において正規化し、そして注入の終了時にＸ軸にアラインさせた。
【図４】ＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２ ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する。（Ａ）ＰＤ−１チップ上への、ＰＤ−Ｌ１ Ｉｇ組換えタンパク質の注入（灰色）、またはＰＤ−Ｌ１抗体と共にプレインキュベーションしたＰＤ−Ｌ１ Ｉｇ組換えタンパク質の注入（黒色）を示す、重ね合わせたセンサーグラム。１０μg/mlのＰＤ−Ｌ１ Ｉｇ組換えタンパク質を、１００μg/mlの飽和濃度でＰＤＬ１．１、ＰＤＬ１．２またはＰＤＬ１．３ ＰＤ−Ｌ１抗体Ｆａｂと共にプレインキュベーションし、そして１０分間１０μl/分の流速でＰＤ−１ Ｉｇチップ上に注入した。センサーグラムを、Ｙ軸において正規化し、そして注入の終了時にＸ軸にアラインさせた。（Ｂ）ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＯＳ細胞上でのＦＡＣＳ分析。ＰＤＬ１．１、ＰＤＬ１．２およびＰＤＬ１．３Ｆａｂ ｍＡｂを、ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞と共に５または３０分間インキュベーションした。ＰＤ−１ Ｉｇの結合は、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）にコンジュゲーションしたＰＥにより判明し、ＭＦＩ比をＹ軸に示した。示したデータは、３回の別々の実験の代表である。
【図５】ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の相互作用の可能性ある機序
【図６】表３
【０１４９】
実施例
要約
プログラム死１分子（ＰＤ−１）は、末梢性トレランスおよび持続ウイルス感染の調節、ならびに免疫系からの腫瘍の回避機序に関与する。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２という２つのリガンドが記載されており、これらは、組織分布、発現の調節およびＰＤ−１へのその結合に関与する残基において異なっている。本発明者らは、組換えタンパク質およびｍＡｂを使用して、表面プラズモン共鳴および細胞表面結合によって、ＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用の分子機序をさらに調査した。本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方が、ＰＤ−１への結合に関して交差競合することを実証できた。興味深いことにそして同じように、１つの選択したＰＤ−１ ｍＡｂが、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方の結合に干渉し得る。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、同等な親和性で、しかし会合および解離の特徴のレベルにおいて示される顕著な差異をもってＰＤ−１に結合した。従って、ＰＤ−Ｌ２ではなくＰＤ−Ｌ１は、遅延した相互作用を示し、これはコンフォメーション遷移の現象を連想させる。これらの機序を、ＰＤ−１からのＰＤ−Ｌ１の解離を遅延させ得るＰＤ−Ｌ１ｍＡｂのお陰でさらに確認した。この機序は、ＰＤ−１相互作用に限定されなかった。なぜならＰＤ−Ｌ１は、その第２リガンドのＣＤ８０と類似した様式で挙動するからである。
【０１５０】
最後に、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１は、ＣＤ８０上の明確に異なる重複していない部位に結合した。これらのデータはさらに、ＰＤ−１と両方のリガンドとの相互作用の異なる分子機序を強調し、これにより、ＰＤ−１への両方のリガンドの結合を妨げ得、慢性感染、癌および移植における免疫抑制の最適な遮断を可能とするｍＡｂ療法を考案するための新規な道を同定する。
【０１５１】
材料および方法
構築物
ヒトＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４ ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって、（ＣＤ３＋ＣＤ２８）活性化Ｔ細胞から表１に示すプライマーを使用して生成し、そしてその後、ＤＮＡ４ベクター（Yang WC et al., Int. Immnol. 2000）にサブクローニングした。ヒトＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の細胞外領域（ａａ１〜１５２およびａａ）を、このプラスミドから表１に示すプライマーを使用して増幅し、そしてＣｏｓ Ｆｃリンクベクター（SmithKline Beecham Pharmaceuticals, King of Prussia, PA）を使用してヒトＩｇＧ１配列のＦｃフラグメントと共にインフレームにクローニングした。ヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２ ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって、脳および肺のヒト全ＲＮＡ（Clontech Laboratories, Inc）からそれぞれ表１に示すプライマーを使用して生成した。ＰＤ−１と同じクローニングプロトコールを使用して、Ｉｇ融合タンパク質として完全長ＰＤ−Ｌおよびその細胞外部分を生成した。
【０１５２】
【表１】
【０１５３】
ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８０可溶性ヒトＩｇ融合タンパク質
ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを、Ｃｏｓ Ｆｃリンクベクターを使用して、ヒトＩｇＧ１配列のＦｃフラグメントとライゲーションすることによって、キメラｃＤＮＡを構築した。
【０１５４】
Ｃｏｓ細胞を、２mM Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で培養し、そしてＦＢＳを含まないＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地（Invitrogen製）中において、ＣＦＬベクター中のＤＮＡプラスミド構築物を用いて、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を用いて製造業者のプロトコール（ROCHE）に従ってトランスフェクションした。培養上清を、トランスフェクションから７日後に回収し、ろ過し、そして製造業者のプロトコール（Bio-rad, Hercules, CA）に従って５mlのアフィゲルプロテインＡカラムにのせた。洗浄後、タンパク質を０．１mol/Lクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）を用いて溶出し、濃縮し、そしてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。精製工程を、ＥＬＩＳＡによって、コーティングした抗ヒトＩｇＧ−ＵＮＬＢ抗体および抗ヒトＩｇＧ-ＡＰ抗体（Southern Biotechnology Associates）で構成されるサンドイッチ顕示システムを使用してモニタリングし、そしてｐＮＰＰ基質（Sigma）によって明らかにした。ヒトＩｇ融合タンパク質の純度および品質を、ゲル電気泳動、およびそれぞれヒトＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ−４をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞系上での細胞表面染色によって制御した。ＣＤ８０ＦｃをＲ＆Ｄから購入した。
【０１５５】
抗ヒトＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＤ８０モノクローナル抗体の生成およびＦａｂフラグメンテーション
ヒトＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対するＭＡｂを同じように産生した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、フロイントアジュバントと共に１０μgのヒトＩｇ融合タンパク質を用いての腹腔内注入によって免疫化した。免疫化は２週間間隔で３回繰り返し、４回目の免疫化は、１０μgのＩｇ融合タンパク質を用いての尾への静脈内注入によってなした。３日後、脾臓細胞を、ＰＥＧ１５００（Roche）を用いてＸ６３Ａｇ８骨髄腫細胞と融合し、そしてＨＡＴ選択（Sigma）およびハイブリドーマクローニング因子（OrigenのＨＣＦ）を用いてクローニングした。ハイブリドーマ上清を、それぞれヒトＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞系の細胞表面を染色することによって、トランスフェクションしていないＣＯＳ細胞との反応性の欠如についてスクリーニングした。クローンＰＤ１．３（マウス、ＩｇＧ２ｂ）およびＰＤ１．６（マウス、ＩｇＧ１）、ＰＤＬ１．１、ＰＤＬ１．２およびＰＤＬ１．３（マウス、ＩｇＧ１）およびＰＤ−Ｌ２（マウス、ＩｇＧ１）を、腹水液の産生によって産生し、プロテインＡアフィニティカラムを用いて精製し、そしてＦＡＣＳおよびＢｉａｃｏｒｅ分析ならびに機能的研究のための試薬として選択した。一過性トランスフェクトＣＯＳ細胞を、製造業者のプロトコール（ROCHE）に従ってＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を用いて得た。ＣＤ８０ｍＡｂ ２Ｄ１０．４は以前に報告されている。
【０１５６】
Ｆａｂフラグメンテーションを、製造業者のプロトコール（PIERCE）に従ってイムノピュアＦａｂ調製キットを用いてパパインを使用して実施した。完全なＭＡｂおよびＦａｂを還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてゲルをクーマシーブルーで染色し、コンタミしている完全ｍＡｂはＦａｂ調製物中には全く存在しなかった（データは示さず）。Ｆａｂは、それぞれレセプターに結合するその能力を保持していた。完全なｍＡｂおよびそのＦａｂを用いてのＦＡＣＳ分析により、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞への結合時におけるほぼ同じ平均蛍光強度が判明した。
【０１５７】
ＦＡＣＳ分析
Ｃｏｓ−７細胞系を、２mM Ｌ−グルタミン（Invitrogen）を含むＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で培養した。一過性にトランスフェクションしたＣＯＳ細胞の染色は、基本的な手順に従った。簡潔に言えば、細胞を、最適な希釈度のｍＡｂと共にインキュベーションし、２％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含む冷ＰＢＳ中で洗浄し、そしてＦＩＴＣとコンジュゲーションしたヤギ抗マウス（GAM）（Beckman Coulter）と共にインキュベーションした。洗浄後、細胞を、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯフローサイトメーター（Becton Dickinson）で分析した。
【０１５８】
ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合に対する、ＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２の抗ＰＤ−Ｌ１非遮断抗体の効果を試験するために、４μg/mlのＰＤ−１ Ｉｇタンパク質を、非処理であるか、または７．５μg/mlのＰＤＬ１．１、ＰＤＬ１．２またはＰＤＬ１．３ Ｆａｂ ｍＡｂと共に５または３０分間プレインキュベーションした、ＰＤ−Ｌ１をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上に加えた。ＰＤ−１ Ｉｇの結合は、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）のコンジュゲーションしたＰＥにより判明した。結果を平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表現する。ＭＦＩ比を、Ｆａｂとプレインキュベーションした細胞のＭＦＩ／非処理細胞のＭＦＩによって計算した。
【０１５９】
Ｂｉａｃｏｒｅ実験
表面プラズモン共鳴測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ１０００アップグレード装置（Biacore GE Healthcare）で２５℃において実施した。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験においてＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Biacore GE Healthcare）をランニング緩衝液として用い、そしてセンサーグラムをＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアを用いて分析した。
【０１６０】
タンパク質の固定のために、組換えタンパク質を、センサーチップＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合的に固定した。センサーチップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Biacore GE Healthcare））を用いて活性化した。タンパク質をカップリング緩衝液（１０mMアセテート、ｐＨ５．２）中で１０μg/mlまで希釈し、そして適切な固定レベルに到達するまで（すなわち１０００〜１２００ＲＵ）注入した。
【０１６１】
残りの活性基の脱活性化を、１００mMエタノールアミンｐＨ８（Biacore GE Healthcare）を使用して実施した。
【０１６２】
タンパク質の親和性を決定するために、０．３〜３０nMおよび１．３７〜９０nMの可溶性抗体および組換えタンパク質の連続希釈液をそれぞれ２分間かけて４０μl/分の一定の流速で、固定した組換え標的タンパク質を含むデキストラン層上に注入し、そして３分間かけて解離させ、その後、５００mM ＮａＣｌおよび１０mM ＮａＯＨ緩衝液の８秒間の注入によって再生した。
【０１６３】
得られたセンサーグラムを、適切なモデルを使用したグローバルフィッティングによって分析した。
【０１６４】
表面競合的結合阻害実験のために、可溶性分析物を、適切に固定した組換え標的タンパク質を含むデキストラン層上に１０μg/mlの一定濃度で注入した。各競合サイクルは、１０μl/分の一定の流速での２分間の３回の注入工程からなっていた。最初に、１つの分析物を２回注入する。第２に、第１の分析物を除去することなく、第２の分析物を注入し、そしてセンサーグラムおよびＲＵ値をモニタリングする。第２の分析物のセンサーグラムを、この分析物をヌード組換え標的タンパク質上に直接的に注入した場合に得られたセンサーグラムと比較する。第１分析物による第２の分析物の結合阻害の比率（Ｉ２−１）を、以下の式：Ｉ２−１＝（１−（ＲＵ２−１／ＲＵ２））×１００を使用して、注入から１０秒後に得られたＲＵ値から決定した。ＲＵ２−１およびＲＵ２は、第１分析物の存在下および非存在下においてそれぞれモニタリングした第２分析物のＲＵ値である。各サイクル後、４０μl/分の流速で５００mM ＮａＣｌおよび１０mM ＮａＯＨ緩衝液を８秒間注入することによってセンサーチップを再生した。
【０１６５】
溶液阻害実験のために、１０μg/mlの一定濃度の可溶性組換えタンパク質を、漸増濃度の同族組換えリガンド（０〜６０μg/ml）または抗体（ＰＤ−１ ｍＡｂ、ＰＤ−Ｌ２ ｍＡｂおよびＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂのそれぞれについて、０〜８０μg/mlおよび０〜１２０μg/ml）と共にプレインキュベーションし、そして１０μl/分の流速で２分間かけて適切なチップ上に注入した。注入の終了から１０秒後にＲＵ値をモニタリングした。各サイクル後、４０μl/分の流速で５００mM ＮａＣｌおよび１０mM ＮａＯＨ緩衝液を８秒間注入することによってセンサーチップを再生した。
【０１６６】
ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合に対する、ＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２抗体の安定化効果を測定するために、１０μg/mlの一定濃度の可溶性組換えＰＤ−Ｌ１ Ｉｇタンパク質を、１００μg/mlの飽和濃度のＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２抗体Ｆａｂと共にプレインキュベーションし、そして１０μl/分の流速で１０分間かけてＰＤ−１チップ上に注入した。センサーグラムをモニタリングし、Ｙ軸において１００ＲＵに正規化し、そして抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｆａｂとプレインキュベーションしないで得られたものと比較した。
【０１６７】
未成熟な単球由来ＤＣ（ｉＤＣ）の調製
ｉＤＣを、改変を加えた以前に確立したプロトコール（Charbonnier et al, Eur J Immunol. 1999;29(8):2567-78）に従って単球から調製した。ＰＢＭＣを健康な個体志願者から入手し、そしてｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ（ABCys）勾配遠心分離による分画によって単離した。単球は、製造業者のプロトコール（Miltenyi Biotec）に従って単球単離キットＩＩヒトを用いてのネガティブセレクションによってＰＢＭＣから得た。単球を、６ウェルプレート中の、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０（Invitrogen）培地中で、２．５×１０６細胞/ウェル（Falcon, BD Biosciences）で培養し、そして２０ng/mlの組換えヒトインターロイキン４（ＩＬ−４）および１００ng/mlの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ABCys French society）を用いて５日間分化させた。ｉＤＣは、一貫してＣＤ１４およびＣＤ８３陰性であり、ＣＤ１ａは９２％超、ＣＤ１１ｂは９６％超、ＨＬＡＤＲは８０％超、ＣＤ８０細胞は２０％超であった。
【０１６８】
ｉＤＣを用いてのＣＤ４＋Ｔ細胞の同種異型刺激
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコール（Miltenyi Biotec）に従ってＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩヒトを用いてのネガティブセレクションによりＰＢＭＣから単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、通例的に９５％超の純度であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０５／ウェル）を、種々の濃度のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対するｍＡｂを加えて、３枚の９６ウェル平底プレート（Falcon; BD Biosciences）中で、１０％ＦＢＳを補充した２００μlのＲＰＭＩ １６４０（Invitrogen）中の２×１０４ｉＤＣ／ウェルと共に共培養した。アイソタイプの一致したｍＡｂ（Ｂ９．３、マウスＩｇＧ１およびＢ９．４、マウスＩｇＧ２ｂ）を、陰性対照として使用した。培養を５日間インキュベーションした。
【０１６９】
サイトカイン分析のためのＥＬＩＳＡ
その後、上清を回収し、培養上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の産生をＥＬＩＳＡ検出によってＯｐｔＥＩＡ（商標）ヒトＩＦＮ−γおよびＩＬ１０セットを使用して製造業者のプロトコール（BD Biosciences）に従って検出した。検出限界は、４pg/mlであった。
【０１７０】
結果
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２ｍＡｂおよびＰＤ−１ Ｉｇ、ＰＤ−Ｌ１ ＩｇおよびＰＤ−Ｌ２ Ｉｇ融合タンパク質の特徴付け
本研究を実施するために、本発明者らは、ＰＤ−１およびそのリガンドに対して作られたｍＡｂを作製し、そしてそれらをＦａｂ、ならびにＰＤ−１、ＰＤＬ−１およびＰＤＬ−２の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に対応する可溶性融合タンパク質として使用した。本発明者らは、ｍＡｂのＦａｂフラグメントおよび融合タンパク質の両方の結合特徴を、トランスフェクションした細胞上で、ＳＰＲによって、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００およびフローサイトメトリーを使用して調査した（データは示さず）。
【０１７１】
ＳＰＲを使用した動的分析によって、ｍＡｂのＦａｂフラグメントのＫＤは０．２６〜４１nMの範囲であった。
【０１７２】
２つのＰＤ−１ｍａｂのＰＤ１．３およびＰＤ１．６は交差結合しなかった（データは示さず）。３つのＰＤ−Ｌ１ｍＡｂは、交差結合するＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２を有する一方のグループと、他方方でＰＤＬ１．３エピトープは、他の２つのｍＡｂとは独立しているグループの２つを表わす（データは示さず）。
【０１７３】
本発明者らは次に、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が、ＣＭ５チップにカップリングしたＰＤ−１に相互に結合し得るかどうかを調査した。本発明者らは、共有結合的なカップリングが、ＰＤ−Ｌ２組換えタンパク質を不活性化し、そしてＰＤ−１ＦｃとＰＤ−Ｌ２ｍＡｂとの結合を妨げる（データは示さず）ことを観察し、このことは、結合部位がおそらく遊離ＮＨ２を含むが、それは、固定したＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合に対しては全く影響を及ぼさず（図１および図４Ａ）、また、固定したＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−１の結合にも全く影響を及ぼさなかったこと（図１）を示す。類似の実験を、ＣＤ８０およびＣＴＬＡ−４タンパク質を使用して行なった。
【０１７４】
合わせて考えると、これらの結果は、その同族レセプターに結合した３つの融合タンパク質およびＦａｂフラグメントは、ＣＭ５センサーチップにカップリングしたその標的に特異的に結合したことを実証する。
【０１７５】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１への結合に対して交差競合する
本発明者らは次に、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が一緒にＰＤ−１に結合し得るかどうか、またはＰＤ−１占有に対して交差競合するかどうかを調査した。
【０１７６】
図１に示したように、本発明者らは、ＳＰＲ分析を実施した。ＰＤ−１チップを漸増量のＰＤ−Ｌ２（０〜１０００ＲＵの結合したＰＤ−Ｌ２）と共にプレインキュベーションし、そしてＰＤ−Ｌ１を、結合したＰＤ−Ｌ２を除去することなく注入した。センサーグラムは、ＰＤ−Ｌ１が、ＰＤ−Ｌ２占有度の増加時にＰＤ−Ｌ２に対して打ち負かし得ることを示す。（図１パネルＡ）。別の実験設定においては、本発明者らは、漸増濃度のＰＤ−Ｌ２（０〜６０μg/ml）と共に１０μg/mlのＰＤ−１組換えタンパク質をプレインキュベーションし、そして前記複合体をＰＤ−Ｌ１チップ上に注入した。ＰＤ−Ｌ２プレインキュベーションは、用量依存的にＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１の結合を妨げた（図１、パネルＢ）。
【０１７７】
これらのデータは、両方のリガンドが、他のＰＤ−１リガンドの結合を妨げること、そして結果として、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の事前の結合は、用量依存的に他のリガンドとの相互作用を妨げるであろうことを実証する。同じ結果が、トランスフェクションした細胞上でのフローサイトメトリーによって得られた（データは示さず）。ヒトＰＤ−Ｌ１は、ヒトＣＤ８０と相互作用する（図１Ｃ）。ＰＤ−１の存在下におけるＣＤ８０に対するＰＤ−Ｌ１の結合の干渉の可能性を分析するために、本発明者らは、プレインキュベーション実験を実施し、そしてＰＤ−１と共にＰＤ−Ｌ１をプレインキュベーションすることは、ＰＤ−Ｌ１：ＣＤ８０の相互作用を妨げることを示す（図１Ｃ）。本発明者らは次に、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１とＣＤ８０との相互作用を試験した。すでに報告したように、ＣＴＬＡ４に対してＣＤ８０が強力に結合するが、これはＣＴＬＡ−４ Ｉｇそれ自体によって妨げられるが、またＣＤ８０ ｍＡｂ２Ｄ１０．４によっても妨げられる（図１Ｅ）。最後に、本発明者らは、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１と、ＣＤ８０との相互作用を試験した（図１Ｄ）。ＣＤ８０へのＣＴＬＡ−４の事前の結合は、ＰＤ−Ｌ１の結合を妨げなない。ＣＤ８０ ｍＡｂ ２Ｄ１０．４は、ＣＤ８０へのＰＤ−Ｌ１の結合を妨げなかったが、それは完全にＣＴＬＡ−４−ＣＤ８０の相互作用を消失させた。これらの実験は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１が、両方共に同時にヒトＰＤ−Ｌ１に結合することができることを実証する。
【０１７８】
ＰＤ１．３ｍａｂは、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方の結合を妨げる
追加の１セットの実験において、本発明者らは、ＰＤ−１ｍＡｂが、逆向きに、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方の結合を妨げ得るかどうかを調査した。図２パネルＢおよびＣに示したように、抗ＰＤ１．６ではなく抗ＰＤ１.３が、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１（図２Ｂおよび２Ｃの上のパネル）およびＰＤ−Ｌ２（図２Ｂおよび２Ｃの下のパネル）の両方の結合を完全に阻害した。相互的に、ＰＤ１．３ｍＡｂは用量依存的に、ＰＤ−Ｌ１チップへのＰＤ−１Ｆｃの結合を遮断した（データは示さず）。ＦＡＣＳ分析によって、ＰＤ１．３ｍＡｂは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２発現細胞へのＰＤ−１Ｆｃの結合を阻害することができる（図２Ｃ）。
【０１７９】
ＰＤ−１ｍａｂは、同種異型の未成熟な樹状細胞によるＴ細胞の活性化をモデュレーションすることができる
本発明者らは次に、ＰＤ−１に対して作られたｍＡｂの機能的能力を調査した。本発明者らは、最適以下の活性化に対する同種異型Ｔ細胞の活性化、すなわち未成熟な単球由来樹状細胞の活性化を誘導するその能力を試験した。非阻害性のＰＤ１．６ではなく、ＰＤ−１リガンドとの相互作用を阻害するｍＡｂであるＰＤ１．３が、ＩＦＮγおよびＩＬ１０の産生の増加（図２パネルＤ）およびＴ細胞増殖（データは示さず）によって示されるように、ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化を増強することができた。
【０１８０】
合わせて考えると、これらのデータは、２つのリガンドがＰＤ−１結合に競合し、そして逆に、阻害性抗ＰＤ−１ｍＡｂは容易にＰＤ−１リガンド結合を妨げることができ、結果として、Ｔ細胞活性化を増強することができることを実証する。
【０１８１】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１結合のその分子機序において異なる
本発明者らは次に、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合の機序を調査した。本発明者らは、この相互作用の異なる工程を特定するために、注意深い動態研究を実施した。動的結合アッセイを実施して、ＰＤ−１と、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２融合タンパク質との間の平衡解離定数を決定した。最初に結合データを１：１のラングミュアモデルを使用して分析した。ＰＤ−Ｌ２／ＰＤ−１については、適合は非常に良好であり、そして９．９７nMのＫＤが得られた。両方の組換え分析物は二価であったが、ラングミュアモデルは非常に良好にデータに適合し、このことは各分子の２つの結合部位がおそらく同時に相互作用することを示す。従って、ＫＤ値は結合価を示す可能性が最も高い。
【０１８２】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１ならびにＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０については、ラングミュアモデルを使用した適合は、も非常に悪くかつ不適切であった。
【０１８３】
実際に、図３パネルＡに示したように、２つのリガンドが、明確に異なる特徴でもってＰＤ−１と相互作用した。ＰＤ−Ｌ１は急速に会合し、そしてまた非常に速く解離した。これに対して、ＰＤ−Ｌ２の結合は、異なる勾配を有して遅延し、そしてより頑強であった。残りの数値も強く異なっていた。従って、ＰＤＬ−Ｌ１ ＰＤ−１解離相において２つの明確に異なる現象が観察した。初期の相（この間に、ＰＤ−Ｌ１は解離の開始時にＰＤ−１から急速に解離した）の後に、シグナルがより安定に出現する遅い解離速度によって特徴付けられる後期の相が続き、一方でＰＤ−Ｌ２ ＰＤ−１解離は、より均一であった。適合のために試験した種々のモデルからの、「コンフォメーション修飾モデル」は、最善かつ信頼性のある適合を与え、そしてＰＤ−１チップ上で１０．７nMおよび５６．５nMの見かけの解離定数（ＫＤ＃）が得られた。
【０１８４】
「コンフォメーション修飾モデル」から、注入時間の延長もまた結合の安定性を増加させるであろうことが予測され得る。この仮説を試験するために、その後、本発明者らは、２つの設定に従ってＰＤ−１チップへのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合を比較し、１０μg/mlのＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２融合タンパク質をそれぞれ７分間または１分間の間に注入した。図３Ｂにおいて示したセンサーグラムは、接触時間が、ＰＤ−１チップへのＰＤ−Ｌ１の結合の安定性に影響を及ぼすことを明瞭に実証する。ＰＤ−１チップへのＰＤ−Ｌ１の解離は、注入時間をより長くした場合により遅かった。
【０１８５】
対照として、ＰＤ−Ｌ２についての解離動態は、注入時間を延長することによって影響を受けなかった（図３Ｂ）。
【０１８６】
合わせて考えると、これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と、ＰＤ−１との相互作用の機序における顕著な差異を実証する。ＰＤ−Ｌ１を用いて得られたデータは、、そのレセプターとのその効率的な結合のためにはコンフォメーション変化が必要とされるようなモデルと適合する。
【０１８７】
本発明者らは最後に、このコンフォメーション変化モデルが、ＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−１相互作用に限定され、従って、リガンドに因るか、またはＣＤ８０のような別のＰＤ−Ｌ１リガンドでも観察されるかどうかを分析した。図３Ａに示したように、ＣＤ８０へのＰＤ−Ｌ１の結合もまた、コンフォメーション変化モデルに関連した。合わせて考えると、これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はＰＤ−１へのその結合において異なることを示す。そのリガンドに、すなわちＰＤ−１およびＣＤ８０に類似の会合機序および解離機序で結合する。
【０１８８】
非遮断性ＰＤ−Ｌ１ｍａｂは、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を増加させる
本発明者らはまた、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の相互作用を妨げる、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２ｍａｂの能力を試験した。抗ＰＤ−Ｌ２および抗ＰＤＬ１．３ｍＡｂは、それぞれＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１相互作用を妨げた（データは示さず）。しかしながら、抗ＰＤＬ１．１および抗ＰＤＬ１．２は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を阻害しなかった（データは示さず）。ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合は、ＰＤ−Ｌ１のコンフォメーション修飾を誘導し得るので、本発明者らは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の結合に干渉しない２つのｍＡｂは、リガンド−レセプター相互作用に必須であり得る他のＰＤ−Ｌ１領域に影響を及ぼし得ると判断した。従って、本発明者らはまた、ＰＤ−１への結合を遮断しない抗ＰＤ−Ｌ１抗体がこの現象に影響を及ぼし得るかどうかを調査した。そうするために、ＰＤ−Ｌ１ Ｉｇタンパク質を、飽和濃度のＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２抗体Ｆａｂと共にインキュベーションし、そしてＰＤ−１チップ上に注入した（図４Ａ）。本発明者らは、両方の非遮断性抗ＰＤ−Ｌ１抗体とのプレインキュベーションが、ＰＤ−１チップからのＰＤ−Ｌ１ Ｉｇタンパク質の解離を明瞭に修飾することを観察した。ＰＤ−Ｌ１がＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２Ｆａｂのいずれかに結合している場合にはＰＤ−Ｌ１の解離はより遅い。ＰＤ−Ｌ１へのＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２Ｆａｂの結合は、ＰＤ−Ｌ１ ＰＤ−１の相互作用の安定性を増加させるようであり、これはおそらくＰＤ−Ｌ１のコンフォメーション修飾に影響を及ぼすことによってである。これらのデータは、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合の適合のために本発明者らが選択することを好んだ「コンフォメーション修飾モデル」と一致しているようである。しかしながら、コンフォメーション遷移現象を、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して観察することができるという事実は、ＰＤ−Ｌ１状態の修飾が、急速な現象ではないことを示す。本発明者らは次にこれらの考察を考慮して、細胞表面に発現されるネイティブなＰＤ−Ｌ１分子上にコンフォメーション修飾を観察し得るかどうかを調査した。
【０１８９】
従って、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合に対する、ＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２非遮断性抗体の安定化効果を、細胞レベルで分析した。ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＯＳ細胞を、５または３０分間かけて３つの異なる抗ＰＤ−Ｌ１ Ｆａｂと共にインキュベーションした。その後、ＰＤ−１ Ｉｇタンパク質の結合をＦＡＣＳ分析によって試験した。ＰＤＬ１．１Ｆａｂプレインキュベーションは、ＰＤ−１タンパク質結合に因るＭＦＩの増加を誘導した（図４Ｂ）。Ｆａｂ注入から早くも５分後にこの増加が現れ、そして３０分後にはさらに増強した。この結果は、ＳＰＲ分析のデータと一致した（図４Ａ）。図４Ｂに示したように、非遮断性ＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２の両方が、ＰＤ−１の結合の増加を誘導する。対照においては、遮断性ＰＤＬ１．３Ｆａｂは、このＰＤ−１結合を損なった（図４Ｂ）。ＰＤ−Ｌ１を発現する未成熟なＤＣを使用して同じ結果が得られた（データは示さず）。合わせて考えると、非遮断性ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂは中立ではなく、実際は、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を促進する。
【０１９０】
参考文献
本出願全体を通じて、種々の参考文献が、本発明が属する最先端技術を説明する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によって本明細書に組み入れられる。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＰＤ−１抗体およびＰＤ−Ｌ１抗体ならびにその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
コレセプターシグナル伝達は、免疫応答を調和しそして密接に調節するための重要な機序である。αβＴ細胞の通常の活性化スキームは、ＨＬＡクラスＩまたはＩＩによって提示されるペプチド抗原によってもたらされるポジティブなシグナルに依拠する。コレセプターシグナルは、この活性化を増加させるかまたは妨げるかのいずれかである。
【０００３】
ネガティブなシグナル伝達分子の中で、ＣＤ２８／Ｂ７ファミリーに属するものが、圧倒的に最も研究されている。このファミリーの３つのメンバーが、記載されている：ＣＴＬ関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム死−１（ＰＤ−１）ならびにＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）。それらは全て、トレランスの制御に役割を果たす。それらは、免疫応答を制限、終結および／または減弱させるネガティブなシグナルを与える。
【０００４】
ＰＤ−１は、アポトーシスを起こしているＴ細胞ハイブリドーマにおいてアップレギュレーションした遺伝子として単離され、そしてプログラム死１と命名された。ＰＤ−１またはＣＤ２７９は、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞、ならびに活性化骨髄系細胞上に発現する。
【０００５】
その発現は、活性化Ｔ細胞上にのみ見られるＣＴＬＡ−４よりも広い。
【０００６】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞レセプター（ＴｃＲ）とコライゲーションされると、阻害シグナルを誘起する。
【０００７】
ＰＤ−１細胞質ドメインは、２つのチロシンを含み、１つは免疫レセプターチロシン抑制性レセプター（ＩＴＩＭ）を構成し、他方は免疫レセプターチロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を構成する。第２のチロシンのリン酸化により、チロシンホスファターゼＳＨＰ２が補充され、そしてある程度ＳＨＰ１が補充される。これらのホスファターゼは、ＺＡＰ７０、ＣＤ３ζおよびＰＫＣθを脱リン酸化し、そして結果的にＴ細胞シグナルを減弱する。
【０００８】
ＰＤ−１は主に、Ｇ０／Ｇ１での細胞停止を引き起こし、そしてＴ細胞におけるサイトカイン産生を阻害することによって、Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖を阻害する。
【０００９】
２つのＰＤ−１リガンド、すなわちＰＤ−Ｌ１／Ｂ７Ｈ１／ＣＤ２７４およびＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ／ＣＤ２７３が、記載されている。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージおよびＴ細胞などの免疫細胞上に低レベルで発現し、そして活性化後にアップレギュレーションされる。ＰＤ−Ｌ１はまた、内皮細胞、心臓、肺、膵臓、筋肉、ケラチノサイトおよび胎盤などの非リンパ器官上にも発現する。非リンパ組織内の発現は、ＰＤ−Ｌ１が、末梢組織における自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞ならびに骨髄系細胞の機能を調節し得るか、または標的器官における炎症応答を調節し得ることを示唆する。ＰＤ−Ｌ１発現は主に、内皮細胞および上皮細胞上でのＰＤ−Ｌ１の主なレギュレーターである１型および２型インターフェロンによって調節される。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍試料中に発現し、そして予後不良に関連する。種々のウイルス感染が、宿主組織上において強力なＰＤ−Ｌ１発現を誘導する。
【００１０】
ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ細胞表面発現は、マクロファージおよび樹状細胞に限定されるが、ＰＤ−Ｌ２転写物は、心臓、肝臓および膵臓などの非造血組織に見られた。その表面発現は、ＩＦＮγおよびＴｈ２サイトカインの産生に依存する。
【００１１】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現はまた、明確に異なる刺激に依存する。マクロファージ上でＰＤ−Ｌ１は、ＩＮＦγによって誘導されるが、ＰＤ−Ｌ２は、ＩＬ−４によって誘導される。類似の調節が、ＤＣ上に見られるが、これらの差異は、絶対的ではない。これらの研究は、ＰＤ−Ｌ１が、優先的にＴｈ１応答を調節し得、一方、ＰＤ−Ｌ２は、Ｔｈ２応答を調節することを示唆する傾向がある。
【００１２】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方が、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生、ならびにβ１およびβ２インテグリンにより媒介される接着を阻害する。しかしながらいくつかの矛盾するデータが、共刺激機能を提案した。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１ではなくＰＤ−Ｌ２が、樹状細胞における逆シグナル伝達をトリガーし、ＩＬ−１２の産生およびＴ細胞の活性化をもたらす。
【００１３】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現パターンは、免疫調節における重複した役割および異なる役割の両方を示唆する。ＰＤ−Ｌ１は、多種多様なヒト癌において豊富である（Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用により、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞レセプター媒介増殖の減少、および癌細胞による免疫回避が起こる（Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって、免疫抑制を逆転させることができ、そしてその効果は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用が同様に遮断されれば相加的である（Iwai et al. (2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66）。
【００１４】
ＰＤ−１欠損動物は、自己免疫性心筋症、ならびに関節炎および腎炎を伴うループス様症候群を含む、種々の自己免疫表現型を発達させる（Nishimura et al. (1999) Immunity H: 141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291:319-22）。さらに、ＰＤ−１は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主疾病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病、および関節リウマチにおいて役割を果たしていることが判明した（Salama et al. (2003) J Exp Med 198:71-78: Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum MoI Genet 13:R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 11:510）。
【００１５】
動物モデルにおいては、遮断ｍＡｂを使用したＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の遮断は、系統特異的な実験的自己免疫性脳炎の感受性および慢性的進行における明確に異なる役割を証明する。ＮＯＤ前糖尿病性マウスにおいては、ＰＤ−Ｌ２ではなくＰＤ−Ｌ１の遮断が、糖尿病を誘発した。自己免疫性糖尿病のＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスモデルを使用して、Martin-Orozco等はＰＤ−Ｌ２ではなくＰＤ−Ｌ１が、糖尿病発症の阻害を媒介したことを見出した（Martin-Orozco et al. (2006) J Immunol. 15;177(12):8291-5）。
【００１６】
現在までに、特に癌患者において、ワクチンに対して強力な免疫応答を誘導することを証明した満足の行くアプローチはなかった。癌患者においてそして慢性感染中に観察された免疫抑制機序を克服するために依然として方法を考案する必要がある。
【００１７】
自己免疫疾病の処置および移植片対宿主疾病（ＧＶＨＤ）における移植拒絶の予防は、免疫抑制剤に依存するが、それらは重篤な副作用を有するかまたは常には効果的ではない。新たな免疫抑制剤が、所望される。
【００１８】
発明の要約
本発明は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできるＰＤ−１抗体（ＰＤ１．３）に関する。
【００１９】
本発明はまた、ＰＤ１．３のＣＤＲを含むＰＤ−１抗体にも関する。
【００２０】
本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用のためのＰＤ１．３またはその誘導体に関する。
【００２１】
本発明は、癌または慢性感染の処置のためのＰＤ１．３またはその誘導体に関する。
【００２２】
本発明は、ＰＤ１．３またはその誘導体を含む、癌または慢性感染の処置のためのワクチンに関する。
【００２３】
本発明は、
ａ）ＰＤ１．３またはその誘導体；および
ｂ）癌または慢性感染の処置のためのワクチン
を含む、癌または慢性感染の処置のためのキットに関する。
【００２４】
本発明はまた、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【００２５】
本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法において使用するためのＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【００２６】
本発明は、自己免疫疾病、移植拒絶または移植片対宿主疾病の処置のための、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【００２７】
発明の詳細な説明
定義
本発明による「抗体」または「免疫グロブリン」は、同じ意味を有し、そして本発明において同等に使用される。本明細書において使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。従って、抗体という用語は、完全な抗体分子だけでなく、抗体フラグメントまたは誘導体も包含する。抗体フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２およびダイアボディを含むがそれらに限定されない。
【００２８】
天然抗体においては、２つの重鎖が、互いにジスルフィド結合によって連結され、そして各々の重鎖は、ジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。軽鎖にはラムダ（λ）およびカッパ（κ）の二種類がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。各々の鎖は、明確に異なる配列ドメインを含む。軽鎖は、２つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメインを含む（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、まとめてＣＨと称する）。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域が、結合認識および抗原に対する特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインが、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、およびＦｃレセプター（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、そして１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原性決定基との間の構造的相補性に存する。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基からなる。時折、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基が、全体的なドメイン構造に影響を及ぼし、従って、結合部位に影響を及ぼす。相補性決定領域すなわちＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の各々は、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３とそれぞれ称される３つのＣＤＲを有する。それ故、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のＶ領域の各々に由来するＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指す。
【００２９】
「キメラ抗体」という用語は、動物の抗体、典型的にはマウス抗体の一部と、ヒト抗体の一部との遺伝子操作した融合物を指す。一般的には、キメラ抗体は、約３３％のマウスタンパク質および６７％のヒトタンパク質を含む。動物抗体によって誘起されるヒト抗動物抗体応答が減少するように開発したため、それらは、動物抗体の特異性と、ヒト抗体の効率的なヒト免疫系相互作用とを兼ね備える。
【００３０】
本発明による「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体に由来する可変領域フレームワークおよび定常領域を有するが動物抗体のＣＤＲを保持する、抗体を指す。
【００３１】
「Ｆａｂ」という用語は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを示し、プロテアーゼのパパインを用いてＩｇＧを処理することによって得られたフラグメントの中で、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分および完全なＬ鎖が、ジスルフィド結合を通して結合している。
【００３２】
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、約１００，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、これは、プロテアーゼのペプシンを用いてＩｇＧを処理することによって得られたフラグメントの中で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合したＦａｂよりも僅かに大きい。
【００３３】
「Ｆａｂ’」という用語は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、これは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる。
【００３４】
単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結した、ＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から通常発現する、共有結合的に連結したＶＨ：ＶＬヘテロダイマーである。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化したＶＨ：ＶＬヘテロダイマーである。二価および多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合によって自発的に形成し得るか、または二価ｓｃ（Ｆｖ）２のように、ペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖをカップリングすることによって生成することができる。
【００３５】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対を形成させ、そして２つの抗原結合部位を作り出す。
【００３６】
「精製された」および「単離された」によって、ポリペプチド（すなわち本発明による抗体）またはヌクレオチド配列を言及する場合、指定した分子が、同じ型の他の生物学的巨大分子の実質的に非存在下において存在することを意味する。本明細書において使用する「精製された」という用語は、好ましくは、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、より好ましくはさらには少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の同じ型の生物学的巨大分子が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指し；しかしながら、分子は、前記組成物の基本的な特徴に有害な影響を及ぼさないいくつかの追加的な塩基または部分を含んでいてもよい。
【００３７】
本発明に関連して、本明細書において使用する「処置する」または「処置」という用語は、このような用語が適用する疾患もしくは容態、またはこのような疾患もしくは容態の１つ以上の症状の進行を逆転、寛解、阻害するか、または前記を予防することを意味する。「治療有効量」は、被験体に治療利点を付与するのに必要とされる活性剤の最小量を意図する。例えば、哺乳動物への「治療有効量」は、病的症状、疾病の進行、または疾患に関連した生理学的容態、または疾患に屈することに対する抵抗性の改善を誘導、回復または別様に引き起こすような量である。
【００３８】
本明細書において使用する「予防」という用語は、疾病または容態に罹患するとまだ診断されていない被験体において前記疾病または容態が起こることを予防することを指す。
【００３９】
本明細書において使用する「被験体」という用語は、哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌおよび霊長類を示す。好ましくは、本発明による被験体は、ヒトである。
【００４０】
本明細書において使用する「癌」、「過増殖」および「新生物」という用語は、自律的増殖能を有する細胞、すなわち、急速に増殖している細胞増殖によって特徴付けられる異常な状態または容態を指す。過増殖および新生物疾病状態は、病的、すなわち疾病状態を特徴付けるまたは構成するとして分類され得るか、あるいは、非病的、すなわち正常からは逸脱しているが疾病状態には関連していないとして分類され得る。この用語は、病理組織学的タイプまたは侵襲性の段階に関係なく、全てのタイプの癌性増殖または発癌過程、転移性組織または悪性に形質転換した細胞、組織もしくは器官を含むことを意味する。「癌」または「新生物」という用語は、罹患している肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸および泌尿生殖器などの種々の器官系の悪性疾患、ならびに、大半の大腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小腸癌および食道癌などの悪性疾患を含む腺癌を含む。
【００４１】
本発明者らは、２００９年２月４日に、ブダペスト条約の規約に従って、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）に、マウスＰＤ−１抗体（ＰＤ１．３）を産生するハイブリドーマを寄託した。寄託したハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２を有する。
【００４２】
「ＰＤ１．３」は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる単離されたＰＤ−１抗体を指す。
【００４３】
「ＰＤ１．３の誘導体」という表現は、ＰＤ１．３の６つのＣＤＲを含むＰＤ−１抗体を指す。
【００４４】
本発明者らは、２００８年１０月１５日に、ブダペスト条約の規約に従って、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）にマウスＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＤＬ１．１）を産生するハイブリドーマを寄託した。寄託したハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８０を有する。
【００４５】
「ＰＤＬ１．１」は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８０の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる単離されたＰＤ−Ｌ１抗体を指す。
【００４６】
「ＰＤＬ１．１の誘導体」という表現は、ＰＤＬ１．１の６つのＣＤＲを含むＰＤ−Ｌ１抗体を指す。
【００４７】
本発明者らは、２００８年１０月１５日に、ブダペスト条約の規約に従って、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）にマウスＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＤＬ１．２）を産生するハイブリドーマを寄託した。寄託したハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８１を有する。
【００４８】
「ＰＤＬ１．２」は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８１の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる単離されたＰＤ−Ｌ１抗体を指す。
【００４９】
「ＰＤＬ１．２の誘導体」という表現は、ＰＤＬ１．２の６つのＣＤＲを含むＰＤ−Ｌ１抗体を指す。
【００５０】
本発明の抗体およびそれらをコードする核酸
本発明は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる単離されたＰＤ−１抗体（ＰＤ１．３）に関する。
【００５１】
本発明は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２の下で入手できるハイブリドーマに関する。
【００５２】
本発明は、ＰＤ１．３の６つのＣＤＲを含む抗体に関する。
【００５３】
別の態様において、本発明は、ＰＤ１．３のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含む、ＰＤ１．３の誘導体に関する。
【００５４】
別の態様において、本発明は、ＰＤ１．３の可変ドメインを含む、キメラ抗体であるＰＤ１．３の誘導体に関する。
【００５５】
本発明はまた、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、単離されたＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【００５６】
典型的には、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合の安定化は、実施例に記載の方法に従って測定され得る。
【００５７】
ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、単離されたＰＤ−Ｌ１抗体の例は、ＰＤＬ１．１、ＰＤＬ１．２またはその誘導体である。
【００５８】
本発明はまた、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８０またはＩ−４０８１の下で入手できるハイブリドーマに関する。
【００５９】
本発明はまた、ＰＤＬ１．１の６つのＣＤＲまたはＰＤＬ１．２の６つのＣＤＲを含む抗体に関する。
【００６０】
別の態様において、本発明は、それぞれＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２のＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含む、ＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２の誘導体に関する。
【００６１】
別の態様において、本発明は、ＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２の可変ドメインを含む、キメラ抗体であるＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２の誘導体に関する。
【００６２】
１つの態様において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。
【００６３】
１つの態様において、本発明の抗体は、キメラ抗体である。
【００６４】
１つの態様において、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。
【００６５】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗体をコードする核酸配列に関する。
【００６６】
特定の態様において、本発明は、本発明の抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインをコードする核酸配列に関する。
【００６７】
典型的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの任意の適切なベクターに含まれ得る、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
【００６８】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、ビヒクルを意味し、これによりＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を、宿主細胞に導入することができ、よって宿主を形質転換し、そして導入した配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進することができる。
【００６９】
よって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００７０】
このようなベクターは、調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含み得、被験体への投与時に前記抗体の発現を引き起こすかまたは指令する。動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーターおよびエンハンサーなどが挙げられる。
【００７１】
ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入および発現することができる限り、動物細胞のための任意の発現ベクターを、使用することができる。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４、ｐＫＣＲ、ｐＳＧ１βｄ２−４−などが挙げられる。
【００７２】
プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、または組込みプラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。
【００７３】
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、パッケージング細胞をトランスフェクションすることによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いての一過性トランスフェクションによってなどの、当技術分野において公知の技術によって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠陥組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えばWO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056およびWO 94/19478に見出され得る。
【００７４】
本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターによってトランスフェクション、感染または形質転換した細胞に関する。「形質転換」という用語は、宿主細胞への「外来」（すなわち外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の導入を意味し、よって宿主細胞は、導入した遺伝子または配列を発現して、所望の物質、典型的には導入した遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素を産生する。導入したＤＮＡまたはＲＮＡを受容しそして発現する宿主細胞は、「形質転換」している。
【００７５】
本発明の核酸を使用して、適切な発現系において本発明の抗体を産生し得る。「発現系」という用語は、例えば、ベクターが保有し宿主細胞に導入した外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、適切な条件下の宿主細胞および適合性ベクターを意味する。
【００７６】
一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、以下に制限されるわけではないが、原核細胞（例えば細菌）および真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳動物細胞系（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）ならびに一次または樹立した哺乳動物細胞培養（例えば、リンパ芽球細胞、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生）が挙げられる。例としてはまた、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（本明細書において以後「ＤＨＦＲ遺伝子」と称する）が欠損しているＣＨＯ細胞、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、本明細書においては以後「ＹＢ２／０細胞」と称する）などが挙げられる。
【００７７】
本発明はまた、本発明による抗体を発現している組換え宿主細胞を産生する方法に関し、前記方法は、工程：（ｉ）in vitroまたはex vivoにおいて前記したような組換え核酸またはベクターをコンピテントな宿主細胞に導入すること、（ｉｉ）in vitroまたはex vivoにおいて得られた組換え宿主細胞を培養すること、および（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現および／または分泌する細胞を選択することを含む。このような組換え宿主細胞を、本発明の抗体の産生のために使用することができる。
【００７８】
本発明の抗体を産生する方法
本発明の抗体を、任意の化学的、生物学的、遺伝学的または酵素的技術など、これらに限定されない当技術分野において公知の任意の技術を単独でまたは組み合わせてのいずれかによって産生し得る。
【００７９】
所望の配列のアミノ酸配列を知っていれば、当業者は、ポリペプチドの産生のための標準的な技術によって前記抗体を容易に産生することができる。例えば、それらを、周知の固相法を使用して、好ましくは市販されているペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems, Foster City, Californiaによって製造されたもの）を使用してそして製造業者の指示に従って合成することができる。あるいは、本発明の抗体を、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。例えば、抗体を、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに取り込み、そして所望の抗体を発現するであろう適切な真核生物宿主または原核生物宿主にこのようなベクターを導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得ることができ、前記宿主から周知の技術を使用して後に単離することができる。
【００８０】
特に、本発明はさらに、本発明の抗体を産生する方法に関し、前記方法は、（ｉ）前記抗体の発現を可能とするに適した条件下で、本発明による形質転換した宿主細胞を培養すること；および（ｉｉ）発現した抗体を回収することからなる工程を含む。
【００８１】
別の特定の態様において、前記方法は、工程：
（ｉ）抗体の発現を可能とするに適した条件下でＣＮＣＭ Ｉ−４１２２、ＣＮＣＭ Ｉ−４０８０またはＣＮＣＭ Ｉ−４０８１として寄託したハイブリドーマを培養すること；および
（ｉｉ）発現した抗体を回収することを含む。
【００８２】
本発明の抗体を、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離する。
【００８３】
特定の態様において、本発明のヒトキメラ抗体を、以前に記載したようなＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸配列を得、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターにそれらを挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、そして発現ベクターを動物細胞に導入することによってコード配列を発現させることによって産生し得る。
【００８４】
ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとしては、それはヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であり得るが、ＩｇＧクラスのものが適切であり、そしてまたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などのＩｇＧクラスに属するサブクラスのいずれか１つを使用することができる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとしては、それは、Ｉｇに属する任意の領域であり得、そしてカッパークラスまたはラムダクラスのものを使用することができる。
【００８５】
キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である従来の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション技術を含む（特許文書ＵＳ５，２０２，２３８；およびＵＳ５，２０４，２４４を参照されたい）。
【００８６】
本発明のヒト化抗体を、以前に記載のように、ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得、（ｉ）ヒト抗体のそれと同一である重鎖定常領域および（ｉｉ）ヒト抗体のそれと同一である軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターにそれらを挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構築し、そして該発現ベクターを動物細胞に導入することによって該遺伝子を発現させることによって産生し得る。
【００８７】
ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子および抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上に存在するタイプ、または両方の遺伝子が同じベクター上に存在する（タンデムタイプ）タイプのいずれかであり得る。ヒト化抗体発現ベクターの構築のし易さ、動物細胞への導入のし易さ、および動物細胞における抗体Ｈ鎖の発現レベルとＬ鎖の発現レベルとの間のバランスの点では、タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターが、好ましい。タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。
【００８８】
従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術に基づいたヒト化抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である。抗体を、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０９９６７； 米国特許第５，２２５，５３９；第５，５３０，１０１；および第５，５８５，０８９）、ベニアリングまたは再表面化（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ ５１９，５９６）、およびチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２）を含む、当技術分野において公知の多種多様な技術を使用してヒト化することができる。このような抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３および国際特許出願ＷＯ９６／０２５７６を参照されたい）。
【００８９】
本発明のＦａｂを、ＰＤ−１と特異的に反応する抗体をプロテアーゼのパパインを用いて処理することによって得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現系のためのまたは真核生物発現系のための該ベクターに挿入し、そしてベクターを原核生物または真核生物（適宜）に導入して該Ｆａｂを発現させることによってＦａｂを産生することができる。
【００９０】
本発明のＦ（ａｂ’）２を、ＰＤ１．３と特異的に反応する抗体をプロテアーゼのペプシンで処理することによって得ることができる。また、該Ｆ（ａｂ’）２を、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して以下に記載したＦａｂ’を結合することによっても産生し得る。
【００９１】
本発明のＦａｂ’を、ヒトＰＤ−１と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤のジチオトレイトールで処理することによって得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを、原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現ベクターに挿入し、そして該ベクターを原核生物または真核生物（適宜）に導入して、その発現を行なうことによって該Ｆａｂ’を産生することができる。
【００９２】
本発明のｓｃＦｖを、以前に記載したようなＶＨおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現ベクターに挿入し、そしてその後、該発現ベクターを原核生物または真核生物（適宜）に導入して該ｓｃＦｖを発現させることによって産生することができる。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを生成するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を使用し得、これは、ドナーのｓｃＦｖフラグメントから相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、そしてそれらを公知の３次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワークに移植することを含む（例えば、Ｗ０９８／４５３２２；ＷＯ８７／０２６７１；ＵＳ５，８５９，２０５；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ４，８１６，５６７；ＥＰ０１７３４９４を参照されたい）。
【００９３】
本明細書において記載した抗体のアミノ酸配列の改変を考える。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性が向上することが望ましくあり得る。非ヒト動物由来の抗体のＶＨおよびＶＬにおけるＣＤＲのみを、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに単に移植することによってヒト化抗体を産生する場合、抗原結合活性は、非ヒト動物由来の元の抗体のそれと比較して減少することが知られている。ＣＤＲにおけるだけでなくＦＲにおける、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのいくつかのアミノ酸残基も、抗原結合活性に直接的または間接的に関連していると考えられる。従って、これらのアミノ酸残基を、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基を用いて置換することにより、結合活性が減少するだろう。問題を解決するために、ヒトＣＤＲを用いて移植した抗体においては、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、抗体との結合に直接関連しているか、またはＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するか、または抗体の３次元構造を維持し、そして抗原への結合に直接関連しているアミノ酸残基を同定するために試みを行なわなければならない。減少した抗原結合活性を、同定したアミノ酸を非ヒト動物由来の元の抗体のアミノ酸残基を用いて置換することによって増加させることができた。
【００９４】
改変および変化を、本発明の抗体の構造、およびそれらをコードするＤＮＡ配列に行ない得、そして依然として所望の特徴を有する抗体をコードする機能的分子を得る。
【００９５】
アミノ配列を変化させる際に、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮し得る。タンパク質上に相互作用的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性が、一般的に当技術分野において理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特徴は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次いで、タンパク質と、他の分子、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められる。各アミノ酸は、その疎水性および荷電特徴に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられており、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００９６】
本発明のさらなる態様はまた、本発明の抗体の機能保存的な変異体も包含する。
【００９７】
「機能保存的変異体」は、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基を、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変容（alter）させることなく変化させている（これは、アミノ酸を、類似の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸を用いて置換することを含むがそれらに限定されない）ものである。保存されていると指摘されたもの以外のアミノ酸は、タンパク質中において異なっていてもよく、よって、類似の機能のいずれか２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸の配列類似率は変化し得、そして、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ法によるなどのアラインメントスキームに従って決定したところ７０％〜９９％であり得、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存的変異体」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定したところ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、そして比較する天然タンパク質または親タンパク質と同じまたは実質的に類似した特性または機能を有する、ポリペプチドを含む。
【００９８】
２つのアミノ酸配列は、短い方の配列の全長にかけてアミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一である場合、または約９０％超、好ましくは９５％超が類似（機能的同一）している場合に「実質的に相同」または「実質的に類似」している。好ましくは、類似配列または相同配列を、例えばＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラム、またはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムのいずれかを使用したアラインメントによって同定する。
【００９９】
例えば、認め得る活性の減少を伴うことなく、タンパク質構造中の特定のアミノ酸を、他のアミノ酸によって置換することができる。タンパク質の相互作用能および性質は、タンパク質の生物学的な機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸置換をタンパク質配列中に、およびもちろんそのＤＮＡコーディング配列中に行なって、依然として類似した特性を有するタンパク質を得ることができる。従って、本発明の抗体配列または前記抗体をコードする対応するＤＮＡ配列において種々の変化を、認め得るその生物学的活性の減少を伴うことなく行なうことができると考えられる。
【０１００】
特定のアミノ酸を、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換し得、そして依然として、類似した生物学的活性を有するタンパク質が得られ、すなわち、依然として生物学的に機能的に等価なタンパク質が得られることが当技術分野において知られている。
【０１０１】
前記に概略を示したように、それ故、アミノ酸の置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、荷電、サイズなどに基づく。前記の種々の特徴を考慮に入れた例示的な置換は、当業者には周知であり、そして、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびに、バリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。
【０１０２】
本発明の抗体の別のタイプのアミノ酸改変は、抗体の元のグリコシル化パターンを変容させるのに有用であり得る。
【０１０３】
「変容させる」によって、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１０４】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合である。「Ｎ結合」は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのいずれかのトリペプチド配列の存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。抗体へのグリコシル化部位の付加を、抗体が前記のトリペプチド配列の１つ以上を含むように（Ｎ結合グリコシル化部位のために）、アミノ酸配列を変容させることによって簡便に達成する。
【０１０５】
別のタイプの共有結合的修飾は、抗体にグリコシドを化学的または酵素的にカップリングすることを含む。これらの手順は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないために有利である。使用するカップリング形態に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのそれ、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのそれ、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのそれ、あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させ得る。例えば、このような方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
【０１０６】
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去を、化学的にまたは酵素的に達成し得る。化学的脱グリコシル化は、化合物のトリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理により、連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く殆どまたは全ての糖が切断され、抗体はインタクトのままで残る。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断を、多種多様なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成し得る。
【０１０７】
抗体の別のタイプの共有結合的修飾は、米国特許第４，６４０，８３５；第４，４９６，６８９；第４，３０１，１４４；第４，６７０，４１７；第４，７９１，１９２または第４，１７９，３３７において示された様式での、多種多様な非タンパク質性ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンへの抗体の連結を含む。
【０１０８】
また、例えば抗体の抗原依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましくあり得る。これを、抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成し得る。代替的にまたは追加的に、システイン残基をＦｃ領域に導入し得、これにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能となる。このようにして生成したホモダイマー抗体は、内部移行能および／または増加した補体介在性細胞殺滅および／または抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を改善し得る（Caron PC. et al. J Exp Med. 1992 Oct 1;176(4):1191-5およびShopes B. J Immunol. 1992 May 1;148(9):2918-22）。
【０１０９】
本発明の抗体の治療使用
本発明者らは、ＰＤ１．３が、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合を阻害し、よってこれを癌患者および慢性感染中に観察されるＰＤ−１によって媒介される免疫抑制機序を克服するために使用し得ることを実証した。
【０１１０】
本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用のためのＰＤ１．３またはその誘導体に関する。
【０１１１】
本発明は、癌または慢性感染の処置のためのＰＤ１．３またはその誘導体に関する。
【０１１２】
本発明はまた、癌または慢性感染を処置するための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量のＰＤ１．３またはその誘導体を投与する工程を含む。
【０１１３】
癌の例としては、血液学的悪性疾患、例えばＢ細胞リンパ系新生物、Ｔ細胞リンパ系新生物、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ−ＮＨＬ、Ｔ−ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ＮＫ細胞リンパ系新生物および骨髄系細胞系統新生物が挙げられるがそれらに限定されない。非血液学的癌の例としては、大腸癌、乳癌、肺癌、脳癌、前立腺癌、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸直腸癌、骨癌、子宮頸部癌、肝癌、口腔癌、食道癌、甲状腺癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌および皮膚癌が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１４】
慢性感染の例としては、ウイルス、細菌、寄生虫または真菌の感染、例えば慢性肝炎、肺感染、下気道感染、気管支炎、インフルエンザ、肺炎および性行為感染症が挙げられるがそれらに限定されない。ウイルス感染の例としては、肝炎（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、単純ヘルペス（ＨＳＶ）、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、エイズおよびエイズ関連合併症、水痘（水疱瘡）、感冒、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染、天然痘（痘瘡）、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、口蹄疫、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核球症、ムンプス、ノロウイルス、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル病および黄熱病が挙げられるがそれらに限定されない。細菌感染の例としては、肺炎、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、結核、炭疽病、ボツリヌス症、ブルセラ症、カンピロバクター症、チフス、淋病、リステリア症、ライム病、リウマチ熱、百日咳（pertussis）（百日咳、Whooping Cough）、ペスト、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、野兎病、腸チフス熱、および尿路感染症が挙げられるがそれらに限定されない。寄生虫感染の例としては、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、シャーガス病、クリプトスポリジウム症、肝蛭症、フィラリア症、アメーバ感染、ジアルジア症、蟯虫感染、住血吸虫症、条虫症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、およびトリパノソーマ症が挙げられるがそれらに限定されない。真菌感染の例としては、カンジダ症、アスペルギルス症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症および足白癬が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１５】
ＰＤ１．３またはその誘導体を、癌または慢性感染の処置のためのワクチンアジュバントとして使用し得る。
【０１１６】
本発明は、ＰＤ１．３またはその誘導体を含む、癌または慢性感染の処置のためのワクチンに関する。
【０１１７】
本発明は、
ａ）ＰＤ１．３またはその誘導体；および
ｂ）癌または慢性感染の処置のためのワクチン
を含む、癌または慢性感染の処置のためのキットに関する。
【０１１８】
キットの２つの成分を、時間をかけて同時にまたは連続的に投与し得る。
【０１１９】
癌または慢性感染の処置のためのワクチンの例としては、ＨＩＶおよびＨＢＶなどのウイルス、細菌、寄生虫もしくは真菌の感染に対するワクチン、ならびにウイルス関連癌（例えばＨＰＶまたはＨＢＶ）に対するワクチン、またはメラノーマ、白血病、乳癌、肺癌を有する患者の処置に例えば使用する抗癌ワクチンが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２０】
さらに、本発明者らは、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化し、よってＰＤ−１によって媒介される免疫抑制機序を刺激するのに使用し得る、ＰＤ−Ｌ１抗体を生成した。これらのＰＤ−Ｌ１抗体は、免疫抑制剤として使用され得る。
【０１２１】
さらなる態様において、本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用のためのＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【０１２２】
特に、本発明は、自己免疫疾病、移植拒絶または移植片対宿主疾病の処置のための、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体に関する。
【０１２３】
本発明はまた、自己免疫疾病、移植拒絶または移植片対宿主疾病の処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、治療有効量のＰＤ−Ｌ１抗体を投与する工程を含む。典型的には、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化するＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤＬ１．１、その誘導体、ＰＤＬ１．２またはその誘導体であり得る。
【０１２４】
処置され得る自己免疫疾病の例としては、関節リウマチ（ＲＡ）、インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、アジソン病、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、特発性白血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、男性不妊症、混合性結合組織病、重症筋無力症、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、ライター症候群、全身硬直症候群、甲状腺中毒症、潰瘍性大腸炎およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２５】
典型的には、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化するＰＤ−Ｌ１抗体を、他の免疫抑制剤および化学療法剤（プレドニゾン、アザチオプリン、シクロスポリン、メトトレキセートおよびシクロホスファミドなどであるがそれらに限定されない）と組み合わせて使用し得る。
【０１２６】
本発明はまた、本発明の抗体を含む薬学的組成物に関する。
【０１２７】
それ故、本発明の抗体を、薬学的に許容される賦形剤および場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと合わせて、治療組成物を形成してもよい。
【０１２８】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害な反応、アレルギー反応または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意のタイプの無毒性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、封入材料または製剤助剤を指す。
【０１２９】
薬学的組成物の剤形、投与経路、投与量およびレジメンは、当然ながら、患者の、処置しようとする容態、病気の重篤度、年齢、体重および性別などに依存する。
【０１３０】
本発明の薬学的組成物を、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与などのために製剤化し得る。
【０１３１】
好ましくは、薬学的組成物は、注射することのできる製剤のための薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張性で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなどまたはこのような塩の混合物）、または場合に応じて滅菌水もしくは生理食塩水を添加すると注射溶液の復元が可能となる、乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であり得る。
【０１３２】
投与のために使用する投与量を、種々のパラメーターの関数として、特に使用する投与形態、関連する病態、または代替的には所望の処置期間の関数として適合することができる。
【０１３３】
薬学的組成物を調製するために、有効量の抗体を、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散し得る。
【０１３４】
注射使用に適した剤形は、無菌水性液剤または分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、そして容易にシリンジが扱える程度に流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下において安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。
【０１３５】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中において調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物中、ならびに油中において調製することができる。通常の保存および使用の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含む。
【０１３６】
本発明の抗体を、中性形または塩形の組成物へと製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成）を含み、そしてこれを、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成する。また、遊離カルボキシル基を用いて形成する塩を、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導することもできる。
【０１３７】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止を、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中における、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤の使用によってもたらすことができる。
【０１３８】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を、必要であれば前記に列挙した種々の他の成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製する。一般的には、分散液を、基本分散媒体と、前記に列挙したものに由来する必要とされる他の成分とを含む無菌ビヒクルに、種々の滅菌した活性成分を取り込むことによって調製する。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過したその溶液から、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【０１３９】
直接的な注入のためのより濃縮したまたは高度に濃縮した溶液の調製も考えられ、極めて急速に浸透し、小さな腫瘍領域に高濃度の活性剤を送達する、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が考えられる。
【０１４０】
製剤化した後、溶液を、投与製剤と適合性の様式で、治療的に有効な量で投与する。製剤を、前記した注射用溶液のタイプなどの多種多様な剤形で容易に投与するが、薬物放出カプセルなども、使用することができる。
【０１４１】
水溶液での非経口的な投与のために、例えば、溶液を、必要であれば適切に緩衝化するべきであり、そして十分な食塩水またはグルコースを用いて液体をまず等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適している。これに関して、使用することのできる無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知である。例えば、１投与量を１mlの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し得、そして１０００mlの皮下点滴療法用液体に添加するか、または提案した点滴部位に注入し得る（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 15th Edition, pages 1035-1038および1570-1580参照）。用量のいくらかの変更が、処置される被験体の容態に依存して必然的になされるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験体に対する適切な用量を決定する。
【０１４２】
本発明の抗体を、１用量あたり、約０．０００１〜１．０mg、または約０．００１〜０．１mg、または約０．１〜１．０またはさらには約１０mgなどを含むように、治療混合物内に製剤化し得る。複数の用量を投与してもよい。
【０１４３】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化した化合物に加えて、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、経口投与のための錠剤または他の固形剤；徐放性カプセル；および現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。
【０１４４】
特定の態様において、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が、宿主細胞への抗体の導入のために考えられる。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成および使用は当業者には公知である。
【０１４５】
ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現性のある様式で化合物を封入することができる。細胞内におけるポリマーの過負荷に起因する副作用を回避するために、in vivoにおいて分解され得るポリマーを使用してこのような超微細粒子（約０．１μmのサイズ）を、一般的に設計する。これらの必要条件に合致する生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子を、本発明における使用に考え、そしてこのような粒子を、容易に作製し得る。
【０１４６】
リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして自発的に多層の同心円状の二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５nmから４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、コア中に水溶液を含む、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
【０１４７】
本発明を、以下の図面および実施例を鑑みてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】Ｂｉａｃｏｒｅを使用したＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の競合的結合のＳＰＲ分析。（Ａ）（Ｂ）において使用した表面競合的結合阻害の図解。（Ｂ）ＰＤ−１チップを、漸増量のＰＤ−Ｌ２（０〜１０００ＲＵ）と共にプレインキュベーションし、そしてＰＤ−Ｌ１を１０μg/mlで２分間１０μl/分の流速で、結合したＰＤ−Ｌ２を除去することなく注入した。種々のレベルのＰＤ−Ｌ２占有度で結合したＰＤ−Ｌ１を示すセンサーグラムを重ねる。（Ｃ）（Ｄ）において使用した溶液阻害の図解。（Ｄ）１０μg/mlのＰＤ−１組換えタンパク質を、漸増濃度のＰＤ−Ｌ２（０〜６０μｇ/ml）と共にプレインキュベーションし、そして１０μl/分の流速で２分間ＰＤ−Ｌ１チップ上に注入した。注入の終了から１０秒後にモニタリングしたＲＵ値を、ＰＤ−Ｌ２濃度の関数としてプロットした（ｌｏｇスケール）。
【図２】ＰＤ１．３抗体は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方へのＰＤ−１の結合を遮断し、そしてＴ細胞の活性化を増強する。（Ａ）（Ｂ）および（Ｃ）において使用した表面競合的結合阻害の図解。第１ステップにおいて、固定したＰＤ−１タンパク質を抗体Ｆａｂを使用して飽和させ、そして対応するＰＤ−１リガンドを、第２ステップにおいて可溶性分析物として注入する。（ＢおよびＣ）ＰＤ−Ｌ１Ｉｇ（Ｂ）およびＰＤ−Ｌ２Ｉｇタンパク質（Ｃ）を、１０μg/mlで２分間１０μl/分の流速でＰＤ−１チップ上に注入するか（無し）、または抗ＰＤ−１Ｆａｂ、ＰＤ１．３もしくはＰＤ１．６と共にプレインキュベーションしたＰＤ−１チップ上に注入した。種々の状況におけるＰＤ−１リガンドの結合を示すセンサーグラムを重ねる。示したデータは、２回の別々の実験の代表である。（Ｄ）ＰＤ１．３ｍＡｂは、ＰＤ−１を発現している細胞への、ＰＤ−Ｌ１ ＦｃおよびＰＤ−Ｌ２ Ｆｃの結合を妨げる。（ＥおよびＦ）ＰＤ１．３ｍＡｂは、ＤＣ相互作用時にＣＤ４ Ｔ細胞においてＩＦＮ−γおよびＩＬ１０の産生を誘導することができる。同種異型ｉＤＣを、抗ＰＤ１.３、ＰＤ１．６またはアイソタイプ対照と、ＣＤ４＋ Ｔ細胞と共に共培養した。培養を、５日間インキュベーションし、上清をサイトカイン分析のために取り出した。ＩＦＮ−γ産生（Ｅ）およびＩＬ１０産生（Ｆ）のレベルを、二重にＥＬＩＳＡ検出によって決定した。示したデータは、２回の別々の実験の代表である。
【図３】ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、同じ分子機序でＰＤ−１に結合しない。（Ａ）ＰＤ−１チップへのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合と、ＣＤ８０チップへのＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４の結合を示す、重ね合わせたセンサーグラム。１０μg/mlのタンパク質を３０秒間１０μl/分の流速でＰＤ−１チップ上に注入し、そしてさらに１２０秒間かけて解離させた。（Ｂ）ＰＤ−１チップ上へのそれぞれＰＤ−Ｌ１（上）およびＰＤ−Ｌ２（下）の短い（青色）および長い（赤色）注入を示す重ね合わせたセンサーグラム。１０μg/mlのタンパク質を１分間または７分間１０μl/分の流速でＰＤ−１チップ上に注入した。センサーグラムをＹ軸において正規化し、そして注入の終了時にＸ軸にアラインさせた。
【図４】ＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２ ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する。（Ａ）ＰＤ−１チップ上への、ＰＤ−Ｌ１ Ｉｇ組換えタンパク質の注入（灰色）、またはＰＤ−Ｌ１抗体と共にプレインキュベーションしたＰＤ−Ｌ１ Ｉｇ組換えタンパク質の注入（黒色）を示す、重ね合わせたセンサーグラム。１０μg/mlのＰＤ−Ｌ１ Ｉｇ組換えタンパク質を、１００μg/mlの飽和濃度でＰＤＬ１．１、ＰＤＬ１．２またはＰＤＬ１．３ ＰＤ−Ｌ１抗体Ｆａｂと共にプレインキュベーションし、そして１０分間１０μl/分の流速でＰＤ−１ Ｉｇチップ上に注入した。センサーグラムを、Ｙ軸において正規化し、そして注入の終了時にＸ軸にアラインさせた。（Ｂ）ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＯＳ細胞上でのＦＡＣＳ分析。ＰＤＬ１．１、ＰＤＬ１．２およびＰＤＬ１．３Ｆａｂ ｍＡｂを、ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞と共に５または３０分間インキュベーションした。ＰＤ−１ Ｉｇの結合は、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）にコンジュゲーションしたＰＥにより判明し、ＭＦＩ比をＹ軸に示した。示したデータは、３回の別々の実験の代表である。
【図５】ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の相互作用の可能性ある機序
【図６】表３
【０１４９】
実施例
要約
プログラム死１分子（ＰＤ−１）は、末梢性トレランスおよび持続ウイルス感染の調節、ならびに免疫系からの腫瘍の回避機序に関与する。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２という２つのリガンドが記載されており、これらは、組織分布、発現の調節およびＰＤ−１へのその結合に関与する残基において異なっている。本発明者らは、組換えタンパク質およびｍＡｂを使用して、表面プラズモン共鳴および細胞表面結合によって、ＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用の分子機序をさらに調査した。本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方が、ＰＤ−１への結合に関して交差競合することを実証できた。興味深いことにそして同じように、１つの選択したＰＤ−１ ｍＡｂが、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方の結合に干渉し得る。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、同等な親和性で、しかし会合および解離の特徴のレベルにおいて示される顕著な差異をもってＰＤ−１に結合した。従って、ＰＤ−Ｌ２ではなくＰＤ−Ｌ１は、遅延した相互作用を示し、これはコンフォメーション遷移の現象を連想させる。これらの機序を、ＰＤ−１からのＰＤ−Ｌ１の解離を遅延させ得るＰＤ−Ｌ１ｍＡｂのお陰でさらに確認した。この機序は、ＰＤ−１相互作用に限定されなかった。なぜならＰＤ−Ｌ１は、その第２リガンドのＣＤ８０と類似した様式で挙動するからである。
【０１５０】
最後に、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１は、ＣＤ８０上の明確に異なる重複していない部位に結合した。これらのデータはさらに、ＰＤ−１と両方のリガンドとの相互作用の異なる分子機序を強調し、これにより、ＰＤ−１への両方のリガンドの結合を妨げ得、慢性感染、癌および移植における免疫抑制の最適な遮断を可能とするｍＡｂ療法を考案するための新規な道を同定する。
【０１５１】
材料および方法
構築物
ヒトＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４ ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって、（ＣＤ３＋ＣＤ２８）活性化Ｔ細胞から表１に示すプライマーを使用して生成し、そしてその後、ＤＮＡ４ベクター（Yang WC et al., Int. Immnol. 2000）にサブクローニングした。ヒトＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の細胞外領域（ａａ１〜１５２およびａａ）を、このプラスミドから表１に示すプライマーを使用して増幅し、そしてＣｏｓ Ｆｃリンクベクター（SmithKline Beecham Pharmaceuticals, King of Prussia, PA）を使用してヒトＩｇＧ１配列のＦｃフラグメントと共にインフレームにクローニングした。ヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２ ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって、脳および肺のヒト全ＲＮＡ（Clontech Laboratories, Inc）からそれぞれ表１に示すプライマーを使用して生成した。ＰＤ−１と同じクローニングプロトコールを使用して、Ｉｇ融合タンパク質として完全長ＰＤ−Ｌおよびその細胞外部分を生成した。
【０１５２】
【表１】
【０１５３】
ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８０可溶性ヒトＩｇ融合タンパク質
ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを、Ｃｏｓ Ｆｃリンクベクターを使用して、ヒトＩｇＧ１配列のＦｃフラグメントとライゲーションすることによって、キメラｃＤＮＡを構築した。
【０１５４】
Ｃｏｓ細胞を、２mM Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で培養し、そしてＦＢＳを含まないＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地（Invitrogen製）中において、ＣＦＬベクター中のＤＮＡプラスミド構築物を用いて、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を用いて製造業者のプロトコール（ROCHE）に従ってトランスフェクションした。培養上清を、トランスフェクションから７日後に回収し、ろ過し、そして製造業者のプロトコール（Bio-rad, Hercules, CA）に従って５mlのアフィゲルプロテインＡカラムにのせた。洗浄後、タンパク質を０．１mol/Lクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）を用いて溶出し、濃縮し、そしてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。精製工程を、ＥＬＩＳＡによって、コーティングした抗ヒトＩｇＧ−ＵＮＬＢ抗体および抗ヒトＩｇＧ-ＡＰ抗体（Southern Biotechnology Associates）で構成されるサンドイッチ顕示システムを使用してモニタリングし、そしてｐＮＰＰ基質（Sigma）によって明らかにした。ヒトＩｇ融合タンパク質の純度および品質を、ゲル電気泳動、およびそれぞれヒトＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ−４をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞系上での細胞表面染色によって制御した。ＣＤ８０ＦｃをＲ＆Ｄから購入した。
【０１５５】
抗ヒトＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＤ８０モノクローナル抗体の生成およびＦａｂフラグメンテーション
ヒトＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対するＭＡｂを同じように産生した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、フロイントアジュバントと共に１０μgのヒトＩｇ融合タンパク質を用いての腹腔内注入によって免疫化した。免疫化は２週間間隔で３回繰り返し、４回目の免疫化は、１０μgのＩｇ融合タンパク質を用いての尾への静脈内注入によってなした。３日後、脾臓細胞を、ＰＥＧ１５００（Roche）を用いてＸ６３Ａｇ８骨髄腫細胞と融合し、そしてＨＡＴ選択（Sigma）およびハイブリドーマクローニング因子（OrigenのＨＣＦ）を用いてクローニングした。ハイブリドーマ上清を、それぞれヒトＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞系の細胞表面を染色することによって、トランスフェクションしていないＣＯＳ細胞との反応性の欠如についてスクリーニングした。クローンＰＤ１．３（マウス、ＩｇＧ２ｂ）およびＰＤ１．６（マウス、ＩｇＧ１）、ＰＤＬ１．１、ＰＤＬ１．２およびＰＤＬ１．３（マウス、ＩｇＧ１）およびＰＤ−Ｌ２（マウス、ＩｇＧ１）を、腹水液の産生によって産生し、プロテインＡアフィニティカラムを用いて精製し、そしてＦＡＣＳおよびＢｉａｃｏｒｅ分析ならびに機能的研究のための試薬として選択した。一過性トランスフェクトＣＯＳ細胞を、製造業者のプロトコール（ROCHE）に従ってＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を用いて得た。ＣＤ８０ｍＡｂ ２Ｄ１０．４は以前に報告されている。
【０１５６】
Ｆａｂフラグメンテーションを、製造業者のプロトコール（PIERCE）に従ってイムノピュアＦａｂ調製キットを用いてパパインを使用して実施した。完全なＭＡｂおよびＦａｂを還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてゲルをクーマシーブルーで染色し、コンタミしている完全ｍＡｂはＦａｂ調製物中には全く存在しなかった（データは示さず）。Ｆａｂは、それぞれレセプターに結合するその能力を保持していた。完全なｍＡｂおよびそのＦａｂを用いてのＦＡＣＳ分析により、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞への結合時におけるほぼ同じ平均蛍光強度が判明した。
【０１５７】
ＦＡＣＳ分析
Ｃｏｓ−７細胞系を、２mM Ｌ−グルタミン（Invitrogen）を含むＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で培養した。一過性にトランスフェクションしたＣＯＳ細胞の染色は、基本的な手順に従った。簡潔に言えば、細胞を、最適な希釈度のｍＡｂと共にインキュベーションし、２％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含む冷ＰＢＳ中で洗浄し、そしてＦＩＴＣとコンジュゲーションしたヤギ抗マウス（GAM）（Beckman Coulter）と共にインキュベーションした。洗浄後、細胞を、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯフローサイトメーター（Becton Dickinson）で分析した。
【０１５８】
ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合に対する、ＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２の抗ＰＤ−Ｌ１非遮断抗体の効果を試験するために、４μg/mlのＰＤ−１ Ｉｇタンパク質を、非処理であるか、または７．５μg/mlのＰＤＬ１．１、ＰＤＬ１．２またはＰＤＬ１．３ Ｆａｂ ｍＡｂと共に５または３０分間プレインキュベーションした、ＰＤ−Ｌ１をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上に加えた。ＰＤ−１ Ｉｇの結合は、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）のコンジュゲーションしたＰＥにより判明した。結果を平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表現する。ＭＦＩ比を、Ｆａｂとプレインキュベーションした細胞のＭＦＩ／非処理細胞のＭＦＩによって計算した。
【０１５９】
Ｂｉａｃｏｒｅ実験
表面プラズモン共鳴測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ１０００アップグレード装置（Biacore GE Healthcare）で２５℃において実施した。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験においてＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Biacore GE Healthcare）をランニング緩衝液として用い、そしてセンサーグラムをＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアを用いて分析した。
【０１６０】
タンパク質の固定のために、組換えタンパク質を、センサーチップＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合的に固定した。センサーチップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Biacore GE Healthcare））を用いて活性化した。タンパク質をカップリング緩衝液（１０mMアセテート、ｐＨ５．２）中で１０μg/mlまで希釈し、そして適切な固定レベルに到達するまで（すなわち１０００〜１２００ＲＵ）注入した。
【０１６１】
残りの活性基の脱活性化を、１００mMエタノールアミンｐＨ８（Biacore GE Healthcare）を使用して実施した。
【０１６２】
タンパク質の親和性を決定するために、０．３〜３０nMおよび１．３７〜９０nMの可溶性抗体および組換えタンパク質の連続希釈液をそれぞれ２分間かけて４０μl/分の一定の流速で、固定した組換え標的タンパク質を含むデキストラン層上に注入し、そして３分間かけて解離させ、その後、５００mM ＮａＣｌおよび１０mM ＮａＯＨ緩衝液の８秒間の注入によって再生した。
【０１６３】
得られたセンサーグラムを、適切なモデルを使用したグローバルフィッティングによって分析した。
【０１６４】
表面競合的結合阻害実験のために、可溶性分析物を、適切に固定した組換え標的タンパク質を含むデキストラン層上に１０μg/mlの一定濃度で注入した。各競合サイクルは、１０μl/分の一定の流速での２分間の３回の注入工程からなっていた。最初に、１つの分析物を２回注入する。第２に、第１の分析物を除去することなく、第２の分析物を注入し、そしてセンサーグラムおよびＲＵ値をモニタリングする。第２の分析物のセンサーグラムを、この分析物をヌード組換え標的タンパク質上に直接的に注入した場合に得られたセンサーグラムと比較する。第１分析物による第２の分析物の結合阻害の比率（Ｉ２−１）を、以下の式：Ｉ２−１＝（１−（ＲＵ２−１／ＲＵ２））×１００を使用して、注入から１０秒後に得られたＲＵ値から決定した。ＲＵ２−１およびＲＵ２は、第１分析物の存在下および非存在下においてそれぞれモニタリングした第２分析物のＲＵ値である。各サイクル後、４０μl/分の流速で５００mM ＮａＣｌおよび１０mM ＮａＯＨ緩衝液を８秒間注入することによってセンサーチップを再生した。
【０１６５】
溶液阻害実験のために、１０μg/mlの一定濃度の可溶性組換えタンパク質を、漸増濃度の同族組換えリガンド（０〜６０μg/ml）または抗体（ＰＤ−１ ｍＡｂ、ＰＤ−Ｌ２ ｍＡｂおよびＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂのそれぞれについて、０〜８０μg/mlおよび０〜１２０μg/ml）と共にプレインキュベーションし、そして１０μl/分の流速で２分間かけて適切なチップ上に注入した。注入の終了から１０秒後にＲＵ値をモニタリングした。各サイクル後、４０μl/分の流速で５００mM ＮａＣｌおよび１０mM ＮａＯＨ緩衝液を８秒間注入することによってセンサーチップを再生した。
【０１６６】
ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合に対する、ＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２抗体の安定化効果を測定するために、１０μg/mlの一定濃度の可溶性組換えＰＤ−Ｌ１ Ｉｇタンパク質を、１００μg/mlの飽和濃度のＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２抗体Ｆａｂと共にプレインキュベーションし、そして１０μl/分の流速で１０分間かけてＰＤ−１チップ上に注入した。センサーグラムをモニタリングし、Ｙ軸において１００ＲＵに正規化し、そして抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｆａｂとプレインキュベーションしないで得られたものと比較した。
【０１６７】
未成熟な単球由来ＤＣ（ｉＤＣ）の調製
ｉＤＣを、改変を加えた以前に確立したプロトコール（Charbonnier et al, Eur J Immunol. 1999;29(8):2567-78）に従って単球から調製した。ＰＢＭＣを健康な個体志願者から入手し、そしてｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ（ABCys）勾配遠心分離による分画によって単離した。単球は、製造業者のプロトコール（Miltenyi Biotec）に従って単球単離キットＩＩヒトを用いてのネガティブセレクションによってＰＢＭＣから得た。単球を、６ウェルプレート中の、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０（Invitrogen）培地中で、２．５×１０６細胞/ウェル（Falcon, BD Biosciences）で培養し、そして２０ng/mlの組換えヒトインターロイキン４（ＩＬ−４）および１００ng/mlの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ABCys French society）を用いて５日間分化させた。ｉＤＣは、一貫してＣＤ１４およびＣＤ８３陰性であり、ＣＤ１ａは９２％超、ＣＤ１１ｂは９６％超、ＨＬＡＤＲは８０％超、ＣＤ８０細胞は２０％超であった。
【０１６８】
ｉＤＣを用いてのＣＤ４＋Ｔ細胞の同種異型刺激
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコール（Miltenyi Biotec）に従ってＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩヒトを用いてのネガティブセレクションによりＰＢＭＣから単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、通例的に９５％超の純度であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０５／ウェル）を、種々の濃度のＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対するｍＡｂを加えて、３枚の９６ウェル平底プレート（Falcon; BD Biosciences）中で、１０％ＦＢＳを補充した２００μlのＲＰＭＩ １６４０（Invitrogen）中の２×１０４ｉＤＣ／ウェルと共に共培養した。アイソタイプの一致したｍＡｂ（Ｂ９．３、マウスＩｇＧ１およびＢ９．４、マウスＩｇＧ２ｂ）を、陰性対照として使用した。培養を５日間インキュベーションした。
【０１６９】
サイトカイン分析のためのＥＬＩＳＡ
その後、上清を回収し、培養上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の産生をＥＬＩＳＡ検出によってＯｐｔＥＩＡ（商標）ヒトＩＦＮ−γおよびＩＬ１０セットを使用して製造業者のプロトコール（BD Biosciences）に従って検出した。検出限界は、４pg/mlであった。
【０１７０】
結果
ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２ｍＡｂおよびＰＤ−１ Ｉｇ、ＰＤ−Ｌ１ ＩｇおよびＰＤ−Ｌ２ Ｉｇ融合タンパク質の特徴付け
本研究を実施するために、本発明者らは、ＰＤ−１およびそのリガンドに対して作られたｍＡｂを作製し、そしてそれらをＦａｂ、ならびにＰＤ−１、ＰＤＬ−１およびＰＤＬ−２の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に対応する可溶性融合タンパク質として使用した。本発明者らは、ｍＡｂのＦａｂフラグメントおよび融合タンパク質の両方の結合特徴を、トランスフェクションした細胞上で、ＳＰＲによって、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００およびフローサイトメトリーを使用して調査した（データは示さず）。
【０１７１】
ＳＰＲを使用した動的分析によって、ｍＡｂのＦａｂフラグメントのＫＤは０．２６〜４１nMの範囲であった。
【０１７２】
２つのＰＤ−１ｍａｂのＰＤ１．３およびＰＤ１．６は交差結合しなかった（データは示さず）。３つのＰＤ−Ｌ１ｍＡｂは、交差結合するＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２を有する一方のグループと、他方方でＰＤＬ１．３エピトープは、他の２つのｍＡｂとは独立しているグループの２つを表わす（データは示さず）。
【０１７３】
本発明者らは次に、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が、ＣＭ５チップにカップリングしたＰＤ−１に相互に結合し得るかどうかを調査した。本発明者らは、共有結合的なカップリングが、ＰＤ−Ｌ２組換えタンパク質を不活性化し、そしてＰＤ−１ＦｃとＰＤ−Ｌ２ｍＡｂとの結合を妨げる（データは示さず）ことを観察し、このことは、結合部位がおそらく遊離ＮＨ２を含むが、それは、固定したＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合に対しては全く影響を及ぼさず（図１および図４Ａ）、また、固定したＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−１の結合にも全く影響を及ぼさなかったこと（図１）を示す。類似の実験を、ＣＤ８０およびＣＴＬＡ−４タンパク質を使用して行なった。
【０１７４】
合わせて考えると、これらの結果は、その同族レセプターに結合した３つの融合タンパク質およびＦａｂフラグメントは、ＣＭ５センサーチップにカップリングしたその標的に特異的に結合したことを実証する。
【０１７５】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１への結合に対して交差競合する
本発明者らは次に、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が一緒にＰＤ−１に結合し得るかどうか、またはＰＤ−１占有に対して交差競合するかどうかを調査した。
【０１７６】
図１に示したように、本発明者らは、ＳＰＲ分析を実施した。ＰＤ−１チップを漸増量のＰＤ−Ｌ２（０〜１０００ＲＵの結合したＰＤ−Ｌ２）と共にプレインキュベーションし、そしてＰＤ−Ｌ１を、結合したＰＤ−Ｌ２を除去することなく注入した。センサーグラムは、ＰＤ−Ｌ１が、ＰＤ−Ｌ２占有度の増加時にＰＤ−Ｌ２に対して打ち負かし得ることを示す。（図１パネルＡ）。別の実験設定においては、本発明者らは、漸増濃度のＰＤ−Ｌ２（０〜６０μg/ml）と共に１０μg/mlのＰＤ−１組換えタンパク質をプレインキュベーションし、そして前記複合体をＰＤ−Ｌ１チップ上に注入した。ＰＤ−Ｌ２プレインキュベーションは、用量依存的にＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１の結合を妨げた（図１、パネルＢ）。
【０１７７】
これらのデータは、両方のリガンドが、他のＰＤ−１リガンドの結合を妨げること、そして結果として、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の事前の結合は、用量依存的に他のリガンドとの相互作用を妨げるであろうことを実証する。同じ結果が、トランスフェクションした細胞上でのフローサイトメトリーによって得られた（データは示さず）。ヒトＰＤ−Ｌ１は、ヒトＣＤ８０と相互作用する（図１Ｃ）。ＰＤ−１の存在下におけるＣＤ８０に対するＰＤ−Ｌ１の結合の干渉の可能性を分析するために、本発明者らは、プレインキュベーション実験を実施し、そしてＰＤ−１と共にＰＤ−Ｌ１をプレインキュベーションすることは、ＰＤ−Ｌ１：ＣＤ８０の相互作用を妨げることを示す（図１Ｃ）。本発明者らは次に、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１とＣＤ８０との相互作用を試験した。すでに報告したように、ＣＴＬＡ４に対してＣＤ８０が強力に結合するが、これはＣＴＬＡ−４ Ｉｇそれ自体によって妨げられるが、またＣＤ８０ ｍＡｂ２Ｄ１０．４によっても妨げられる（図１Ｅ）。最後に、本発明者らは、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１と、ＣＤ８０との相互作用を試験した（図１Ｄ）。ＣＤ８０へのＣＴＬＡ−４の事前の結合は、ＰＤ−Ｌ１の結合を妨げなない。ＣＤ８０ ｍＡｂ ２Ｄ１０．４は、ＣＤ８０へのＰＤ−Ｌ１の結合を妨げなかったが、それは完全にＣＴＬＡ−４−ＣＤ８０の相互作用を消失させた。これらの実験は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１が、両方共に同時にヒトＰＤ−Ｌ１に結合することができることを実証する。
【０１７８】
ＰＤ１．３ｍａｂは、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方の結合を妨げる
追加の１セットの実験において、本発明者らは、ＰＤ−１ｍＡｂが、逆向きに、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方の結合を妨げ得るかどうかを調査した。図２パネルＢおよびＣに示したように、抗ＰＤ１．６ではなく抗ＰＤ１.３が、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１（図２Ｂおよび２Ｃの上のパネル）およびＰＤ−Ｌ２（図２Ｂおよび２Ｃの下のパネル）の両方の結合を完全に阻害した。相互的に、ＰＤ１．３ｍＡｂは用量依存的に、ＰＤ−Ｌ１チップへのＰＤ−１Ｆｃの結合を遮断した（データは示さず）。ＦＡＣＳ分析によって、ＰＤ１．３ｍＡｂは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２発現細胞へのＰＤ−１Ｆｃの結合を阻害することができる（図２Ｃ）。
【０１７９】
ＰＤ−１ｍａｂは、同種異型の未成熟な樹状細胞によるＴ細胞の活性化をモデュレーションすることができる
本発明者らは次に、ＰＤ−１に対して作られたｍＡｂの機能的能力を調査した。本発明者らは、最適以下の活性化に対する同種異型Ｔ細胞の活性化、すなわち未成熟な単球由来樹状細胞の活性化を誘導するその能力を試験した。非阻害性のＰＤ１．６ではなく、ＰＤ−１リガンドとの相互作用を阻害するｍＡｂであるＰＤ１．３が、ＩＦＮγおよびＩＬ１０の産生の増加（図２パネルＤ）およびＴ細胞増殖（データは示さず）によって示されるように、ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化を増強することができた。
【０１８０】
合わせて考えると、これらのデータは、２つのリガンドがＰＤ−１結合に競合し、そして逆に、阻害性抗ＰＤ−１ｍＡｂは容易にＰＤ−１リガンド結合を妨げることができ、結果として、Ｔ細胞活性化を増強することができることを実証する。
【０１８１】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１結合のその分子機序において異なる
本発明者らは次に、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合の機序を調査した。本発明者らは、この相互作用の異なる工程を特定するために、注意深い動態研究を実施した。動的結合アッセイを実施して、ＰＤ−１と、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２融合タンパク質との間の平衡解離定数を決定した。最初に結合データを１：１のラングミュアモデルを使用して分析した。ＰＤ−Ｌ２／ＰＤ−１については、適合は非常に良好であり、そして９．９７nMのＫＤが得られた。両方の組換え分析物は二価であったが、ラングミュアモデルは非常に良好にデータに適合し、このことは各分子の２つの結合部位がおそらく同時に相互作用することを示す。従って、ＫＤ値は結合価を示す可能性が最も高い。
【０１８２】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１ならびにＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０については、ラングミュアモデルを使用した適合は、も非常に悪くかつ不適切であった。
【０１８３】
実際に、図３パネルＡに示したように、２つのリガンドが、明確に異なる特徴でもってＰＤ−１と相互作用した。ＰＤ−Ｌ１は急速に会合し、そしてまた非常に速く解離した。これに対して、ＰＤ−Ｌ２の結合は、異なる勾配を有して遅延し、そしてより頑強であった。残りの数値も強く異なっていた。従って、ＰＤＬ−Ｌ１ ＰＤ−１解離相において２つの明確に異なる現象が観察した。初期の相（この間に、ＰＤ−Ｌ１は解離の開始時にＰＤ−１から急速に解離した）の後に、シグナルがより安定に出現する遅い解離速度によって特徴付けられる後期の相が続き、一方でＰＤ−Ｌ２ ＰＤ−１解離は、より均一であった。適合のために試験した種々のモデルからの、「コンフォメーション修飾モデル」は、最善かつ信頼性のある適合を与え、そしてＰＤ−１チップ上で１０．７nMおよび５６．５nMの見かけの解離定数（ＫＤ＃）が得られた。
【０１８４】
「コンフォメーション修飾モデル」から、注入時間の延長もまた結合の安定性を増加させるであろうことが予測され得る。この仮説を試験するために、その後、本発明者らは、２つの設定に従ってＰＤ−１チップへのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合を比較し、１０μg/mlのＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２融合タンパク質をそれぞれ７分間または１分間の間に注入した。図３Ｂにおいて示したセンサーグラムは、接触時間が、ＰＤ−１チップへのＰＤ−Ｌ１の結合の安定性に影響を及ぼすことを明瞭に実証する。ＰＤ−１チップへのＰＤ−Ｌ１の解離は、注入時間をより長くした場合により遅かった。
【０１８５】
対照として、ＰＤ−Ｌ２についての解離動態は、注入時間を延長することによって影響を受けなかった（図３Ｂ）。
【０１８６】
合わせて考えると、これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と、ＰＤ−１との相互作用の機序における顕著な差異を実証する。ＰＤ−Ｌ１を用いて得られたデータは、、そのレセプターとのその効率的な結合のためにはコンフォメーション変化が必要とされるようなモデルと適合する。
【０１８７】
本発明者らは最後に、このコンフォメーション変化モデルが、ＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−１相互作用に限定され、従って、リガンドに因るか、またはＣＤ８０のような別のＰＤ−Ｌ１リガンドでも観察されるかどうかを分析した。図３Ａに示したように、ＣＤ８０へのＰＤ−Ｌ１の結合もまた、コンフォメーション変化モデルに関連した。合わせて考えると、これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はＰＤ−１へのその結合において異なることを示す。そのリガンドに、すなわちＰＤ−１およびＣＤ８０に類似の会合機序および解離機序で結合する。
【０１８８】
非遮断性ＰＤ−Ｌ１ｍａｂは、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を増加させる
本発明者らはまた、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の相互作用を妨げる、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２ｍａｂの能力を試験した。抗ＰＤ−Ｌ２および抗ＰＤＬ１．３ｍＡｂは、それぞれＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１相互作用を妨げた（データは示さず）。しかしながら、抗ＰＤＬ１．１および抗ＰＤＬ１．２は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を阻害しなかった（データは示さず）。ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合は、ＰＤ−Ｌ１のコンフォメーション修飾を誘導し得るので、本発明者らは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の結合に干渉しない２つのｍＡｂは、リガンド−レセプター相互作用に必須であり得る他のＰＤ−Ｌ１領域に影響を及ぼし得ると判断した。従って、本発明者らはまた、ＰＤ−１への結合を遮断しない抗ＰＤ−Ｌ１抗体がこの現象に影響を及ぼし得るかどうかを調査した。そうするために、ＰＤ−Ｌ１ Ｉｇタンパク質を、飽和濃度のＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２抗体Ｆａｂと共にインキュベーションし、そしてＰＤ−１チップ上に注入した（図４Ａ）。本発明者らは、両方の非遮断性抗ＰＤ−Ｌ１抗体とのプレインキュベーションが、ＰＤ−１チップからのＰＤ−Ｌ１ Ｉｇタンパク質の解離を明瞭に修飾することを観察した。ＰＤ−Ｌ１がＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２Ｆａｂのいずれかに結合している場合にはＰＤ−Ｌ１の解離はより遅い。ＰＤ−Ｌ１へのＰＤＬ１．１またはＰＤＬ１．２Ｆａｂの結合は、ＰＤ−Ｌ１ ＰＤ−１の相互作用の安定性を増加させるようであり、これはおそらくＰＤ−Ｌ１のコンフォメーション修飾に影響を及ぼすことによってである。これらのデータは、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合の適合のために本発明者らが選択することを好んだ「コンフォメーション修飾モデル」と一致しているようである。しかしながら、コンフォメーション遷移現象を、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して観察することができるという事実は、ＰＤ−Ｌ１状態の修飾が、急速な現象ではないことを示す。本発明者らは次にこれらの考察を考慮して、細胞表面に発現されるネイティブなＰＤ−Ｌ１分子上にコンフォメーション修飾を観察し得るかどうかを調査した。
【０１８９】
従って、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合に対する、ＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２非遮断性抗体の安定化効果を、細胞レベルで分析した。ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＯＳ細胞を、５または３０分間かけて３つの異なる抗ＰＤ−Ｌ１ Ｆａｂと共にインキュベーションした。その後、ＰＤ−１ Ｉｇタンパク質の結合をＦＡＣＳ分析によって試験した。ＰＤＬ１．１Ｆａｂプレインキュベーションは、ＰＤ−１タンパク質結合に因るＭＦＩの増加を誘導した（図４Ｂ）。Ｆａｂ注入から早くも５分後にこの増加が現れ、そして３０分後にはさらに増強した。この結果は、ＳＰＲ分析のデータと一致した（図４Ａ）。図４Ｂに示したように、非遮断性ＰＤＬ１．１およびＰＤＬ１．２の両方が、ＰＤ−１の結合の増加を誘導する。対照においては、遮断性ＰＤＬ１．３Ｆａｂは、このＰＤ−１結合を損なった（図４Ｂ）。ＰＤ−Ｌ１を発現する未成熟なＤＣを使用して同じ結果が得られた（データは示さず）。合わせて考えると、非遮断性ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂは中立ではなく、実際は、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を促進する。
【０１９０】
参考文献
本出願全体を通じて、種々の参考文献が、本発明が属する最先端技術を説明する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によって本明細書に組み入れられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体。
【請求項２】
ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８０またはＩ−４０８１の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる、ＰＤ−Ｌ１抗体。
【請求項３】
請求項２のＰＤ−Ｌ１抗体のＣＤＲを含む、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体。
【請求項４】
療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用の、請求項１〜３のいずれか１項記載のＰＤ−Ｌ１抗体。
【請求項５】
自己免疫疾病、移植拒絶または移植片対宿主疾病の処置のための、請求項４記載のＰＤ−Ｌ１抗体。
【請求項６】
ＣＮＣＭ Ｉ−４１２２、ＣＮＣＭ Ｉ−４０８０およびＣＮＣＭ Ｉ−４０８１からなる群より選択される、ハイブリドーマ細胞系。
【請求項７】
ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる、ＰＤ−１抗体。
【請求項８】
請求項７のＰＤ−１抗体のＣＤＲを含む、ＰＤ−１抗体。
【請求項９】
療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用の、請求項７または８記載のＰＤ−１抗体。
【請求項１０】
癌または慢性感染の処置のための、請求項９記載のＰＤ−１抗体。
【請求項１１】
請求項７または８記載のＰＤ−１抗体を含む癌または慢性感染の処置のためのワクチン。
【請求項１２】
ａ）請求項７または８記載のＰＤ−１抗体；および
ｂ）癌または慢性感染の処置のためのワクチン
を含む、癌または慢性感染の処置のためのキット。
【請求項１】
ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体。
【請求項２】
ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４０８０またはＩ−４０８１の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる、ＰＤ−Ｌ１抗体。
【請求項３】
請求項２のＰＤ−Ｌ１抗体のＣＤＲを含む、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を安定化する、ＰＤ−Ｌ１抗体。
【請求項４】
療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用の、請求項１〜３のいずれか１項記載のＰＤ−Ｌ１抗体。
【請求項５】
自己免疫疾病、移植拒絶または移植片対宿主疾病の処置のための、請求項４記載のＰＤ−Ｌ１抗体。
【請求項６】
ＣＮＣＭ Ｉ−４１２２、ＣＮＣＭ Ｉ−４０８０およびＣＮＣＭ Ｉ−４０８１からなる群より選択される、ハイブリドーマ細胞系。
【請求項７】
ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２２の下で入手できるハイブリドーマから得ることのできる、ＰＤ−１抗体。
【請求項８】
請求項７のＰＤ−１抗体のＣＤＲを含む、ＰＤ−１抗体。
【請求項９】
療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用の、請求項７または８記載のＰＤ−１抗体。
【請求項１０】
癌または慢性感染の処置のための、請求項９記載のＰＤ−１抗体。
【請求項１１】
請求項７または８記載のＰＤ−１抗体を含む癌または慢性感染の処置のためのワクチン。
【請求項１２】
ａ）請求項７または８記載のＰＤ−１抗体；および
ｂ）癌または慢性感染の処置のためのワクチン
を含む、癌または慢性感染の処置のためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５１７４０６（Ｐ２０１２−５１７４０６Ａ）
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８７２４（Ｐ２０１１−５４８７２４）
【出願日】平成２２年２月９日（２０１０．２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５１５６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８９４１１
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５０３２８５６１２）ユニヴェルシテ・ドゥ・ラ・メディテラネ (15)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＡ ＭＥＤＩＴＥＲＲＡＮＥＥ
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月９日（２０１０．２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５１５６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８９４１１
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５０３２８５６１２）ユニヴェルシテ・ドゥ・ラ・メディテラネ (15)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＡ ＭＥＤＩＴＥＲＲＡＮＥＥ
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【Ｆターム（参考）】
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