ＰＥＧ修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ
本発明は、ポリエチレングリコールで修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、その製造方法及び、アミノ酸レベル、活性酸素種又は／及びアンモニウムの調節に対して応答性である疾病の治療方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
発明の背景
本発明は、ポリエチレングリコールで修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに関する。
【０００２】
発明の背景
数十年間、医薬的に活性のある物質を、天然の生物から回収するため、そして、これらの効果を様々な疾病領域で試験するために多くの努力がなされてきた。
【０００３】
アメフラシ（Aplysia punctata）は、捕食から自身を保護するための紫色のインクを産生する。このインクは、抗腫瘍活性を有することが示されている（Butzke et al., 2004）。その後、研究が、この因子を粗製インクから単離すべく実施され、ＡＰＩＴ、Aplysia Punctataインク毒素（Aplysia Punctata Ink Toxin）の発見を生じた。最近では、この因子がクローニングされ、Ｌ−リシンとＬ−アルギニンの酸化による脱アミノ化を触媒作用し、これにより過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、アンモニウム（ＮＨ4+）及び相応するα−ケト酸を産生する（Butzke et al., 2005）、弱グリコシル化されたＦＡＤ結合Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（）であると特性決定した。
【０００４】
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（LAAOs, EC 1.4.3.2）は、分泌物及び毒物中に見出されることができる。フラビン酵素のこのファミリーのメンバーは、Ｌ−アミノ酸の立体特異的な酸化的脱アミノ反応を触媒作用し、かつこれにより、Ｈ2Ｏ2、アンモニウム及び相応するα−ケト酸を産生する（Du et al., 2002）。この個々のＬＡＡＯｓは、その基質特異性において異なる。蛇毒Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ｓｖ−ＬＡＡＯｓ）は、これは、粗製毒素３０（質量）％までを構成し（Ponnudurai et al., 1994）、疎水性アミノ酸に対する明確な選択性を有する。ＡＩＰ（アポトーシス誘導性タンパク質）と呼称される魚カプセル（fish capsule）ＬＡＡＯは、マサバの幼生の線虫の感染により誘導され、これは、Ｌ−リシンに対して高度に特異的である（Jung et al., 2000）。アクアチン（Achacin）（アフリカヘビ、アフリカマイマイからの粘液ＬＡＡＯ）は、極めて広い範囲の基質を代謝し、これは、疎水性アミノ酸、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパルギン及びＬ−チロシンを含む（Ehara et al., 2002）。
【０００５】
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、任意の経路での哺乳類に対する投与後のその半減期について検査されていない。薬物開発に関して、しかしながらこれは重要な問題であり、かつ、薬理作用を効率的に発揮するためには必要条件である。この観点におけるデータは、基質としてＤ−プロリンを使用するＤ−アミノ酸オキシダーゼに関してのみ入手可能である(Fang et al., 2002)。しかしながら、静脈内注射後に天然のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、循環から迅速に清掃された。ペグ化された誘導体は、顕著に増加した循環半減期を示さず、１時間を優に下回った。このような短い半減期を有する製品は、治療、例えば癌治療のために実質的な治療的利益を有するとは期待されることができない。従って、この先行技術の教示によれば、ペグ化されたアミノ酸オキシダーゼが、治療的効力に欠けることが予期されるものである。
【０００６】
本発明の課題は、改善された特性を有する治療製品を提供すべく、Ｌ−アミノ酸オキシドレダクターゼの治療的効力を増加させることであった。
【０００７】
発明の要約
本発明は、初めて、少なくとも１つのポリエチレングリコール残基で修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ及びこの修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有する医薬組成物、この製造方法及び、血漿アミノ酸レベルの調節に対して応答性の、又は／及び活性酸素種又は／及びアンモニウムに対して応答性の疾病、例えば増殖性疾病、ウィルス感染又は／及び微生物感染を治療するための方法について言及する。
【０００８】
有利な一実施態様において、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ（Aplysia punctataインク毒素（ＡＰＩＴ）と呼ばれる）は、重量平均分子量約１０００〜約１００００を有する少なくとも１つのポリエチレングリコールで修飾される。
【０００９】
本発明の更なる実施態様は、ペグ化されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの製造方法に関する。
【００１０】
更なる実施態様は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼのペグ化を含む、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼの酵素活性及び循環時間を促進する方法に関する。
【００１１】
更なる実施態様は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼのペグ化を含む、体液による不活性化に対してアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを保護する方法に関する。
【００１２】
更なる一観点において、本発明は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼをこの液体に添加することを含む、液体中でのアミノ酸リシン又は／及びアルギニンを欠失させるための方法に関する。
【００１３】
また更なる実施態様は、本発明のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有するキットに関する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の課題は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、特にＬ−アルギニン／リシンオキシダーゼをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で共有的に修飾することにより達成される。本発明は、ポリエチレングリコールで修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼが、マウスの血漿中で４８時間より長く循環し、かつ、その酵素活性を維持するとの意外な発見に基づく。対照的に、修飾されないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼが、約３時間のみ等価な活性に基づく用量で循環中で活性がある。
【００１５】
更に、ＰＥＧ修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの用量が、修飾されていないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに比較して顕著に減少されることができることが意外にも見出された。
【００１６】
更に、ＰＥＧ修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼが、修飾されていないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに比較して肺癌細胞の抑制のためにより少ないＩＣ50値を有することが意外にも見出された。
【００１７】
更に、ポリエチレングリコールで修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、アミノ酸レベル、リシン及びアルギニンを低下させ、これにより活性酸素種及びアンモニウムを産生することにおいて、特定の手段を提供する。これらの効果の全て又はこれらの効果の一部は、疾病の特定の種類を治療するために十分である。天然のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに比較すると、ペグ化されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、大抵の酵素活性を維持し、リシン及びアルギニンを哺乳類中で４８時間以上枯渇させることができ、かつ、アミノ酸レベル及び／又は活性酸素種又はアンモニウムの変更に対して応答性の疾病の治療においてより効果がある。更に、このペグ化されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、修飾されていないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに指向した特異的な抗体の存在下ですら活性がある。
【００１８】
第１の観点において、本発明は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ及び少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を含有するコンジュゲートを提供する。
【００１９】
ここで使用される「コンジュゲート」は、ポリペプチド部分を含有する化合物を指し、有利にはこれは、補酵素、例えばＦＡＤを含み、これに対して少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、共有結合により連結されている。
【００２０】
本発明のコンジュゲートは、任意の公知のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、特にＬ−アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含んでよく、これは、Ｌ−アルギニン又は／及びＬ−リシンのそれぞれのアルファイミノ酸への変換を触媒作用する。この工程において、酵素はＨ2Ｏ2を、化学量論量で産生する。第２の工程において、アルファイミノ酸は、α−ケト酸に、アンモニウムの放出下で変換される。第２の工程は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ活性に依存性でない。アルギニン／リシンオキシドレダクターゼにより触媒されるこの反応の詳細は、WO 2004/065415中に説明され、これは、参照することにより本願に組み込まれる。
【００２１】
本発明の別の有利な実施態様において、コンジュゲートは、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有し、これはＬ−アルギニン／Ｌ−リシンオキシドレダクターゼである。
【００２２】
更なる有利な一実施態様において、このコンジュゲートは、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有し、これは、アルギニン又は／及びリシンに対して特異的である。特に、リシン又は／及びアルギニン、特にＬ−リシン又は／及びＬ−アルギニンを処理するための酵素活性は、他のアミノ酸、特に生物中に天然に存在するアルファＬ−アミノ酸の処理のための酵素活性よりも少なくとも約３倍又は約４倍、より大きい。
【００２３】
有利なアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、アメフラシ種から得られてよく、特にAplysia punctataから得られる。例えば、Aplysia Punctataインク毒素（ＡＰＩＴ）は、これは本発明のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼであるが、アメフラシAplysia Punctataのインク中に見出されることができる。この酵素及びその製造は、WO 2004/065415中に説明され、これは参照により本願に含められる。
【００２４】
更に、適したＬ−リシンα−オキシダーゼは、Lukasheva EV, Berezov TT中に説明されている。L-Lysine alpha-oxidase: physiochemical and biological properties. Biochemistry (Mosc.) 2002 Oct;67(10):1152-8。
【００２５】
アルギニン／リシンオキシダーゼは、天然源から単離された天然の分子又は組み換え体、例えば天然に生じない供給源から得られる組み換え分子であってよい。有利な一実施態様において、このコンジュゲートは、組み換えアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有してもよい。
【００２６】
特に有利な一実施態様において、本発明のコンジュゲートは、
（ａ）配列番号２、４、６又は／及び８の配列
（ｂ）少なくとも７０％配列（ａ）と同一である配列、又は／及び
（ｃ）（ａ）又は／及び（ｂ）の断片
を含有するアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有する。
【００２７】
配列番号２、４、６及び８は、幾つかのアミノ酸位置において異なる。配列番号８は、Aplysia punctataから単離された有利なアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを説明する（本発明の実施例参照のこと）。配列番号２、４及び６は、Aplysia punctataから単離された更なるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを説明する。配列番号２、４及び６は、WO 2004/065415中に説明され、これは、参照により本願中に含まれる。
【００２８】
（ａ）の有利な配列は、配列番号８である。
【００２９】
（ｂ）の配列は、少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％、更により有利には少なくとも９５％、最も有利には少なくとも９９％、（ａ）の配列に対して同一である配列である。この同一性は、最大のオーバーラップの領域中で決定される。当業者は、最大のオーバーラップの領域を、一般的に知られているアルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又は／及びアミノ酸配列に関するその誘導体により決定することができる。
【００３０】
（ｃ）の断片は、（ａ）又は（ｂ）のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの任意の酵素活性のある断片であり、かつ、少なくとも約３０アミノ酸残基、有利には少なくとも約５０アミノ酸残基、より有利には少なくとも約１００アミノ酸残基、最も有利には少なくとも約２００アミノ酸残基の長さを有してよい。
【００３１】
（ｃ）の断片は、配列番号２、４、６又は／及び８の完全長よりも短い長さを有してよく、有利には最大で約５００アミノ酸残基、より有利には最大で約４００アミノ酸残基、最も有利には最大で約３００アミノ酸残基である。
【００３２】
（ｃ）の断片は、配列番号２、４、６又は／及び８に由来する配列から、Ｎ−末端のアミノ酸を除去することにより選択されてよい。このＮ末端は、オキシドレダクターゼ機能に必要とされないシグナル配列を示して良い。有利には、約５までの、約１０までの、約２０までの、又は約５０までのＮ−末端アミノ酸が除去される。より有利には、配列番号２において、１８個のＮ−末端アミノ酸が除去され、又は／及び配列番号４において、１７個のＮ−末端アミノ酸が除去される。
【００３３】
本発明のコンジュゲートは有利には、少なくとも６時間の間循環中で活性があり、即ち、このコンジュゲートは有利には少なくとも６時間の循環時間を有する。本発明の文脈において、「循環時間」とは、本発明のコンジュゲートが、その活性、特に酵素活性を、被験体中の循環の間に維持する時間を指す。本発明において、「循環時間」との用語は、比較目的のための他の化合物にも適用される。例えば、「循環時間」は、修飾されていないＡＰＩＴに適用される。循環時間は、循環半減期により表されても良い。
【００３４】
本発明のコンジュゲートは、より有利には、少なくとも１２時間、更に有利には少なくとも２４時間、最も有利には少なくとも４８時間循環中で活性がある。
【００３５】
本発明のコンジュゲートの用量が、相応する修飾されていないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼと比較して顕著に減少されることができることが意外にも見出された。例えば、０．６ユニット／ｋｇ ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの量は、リシン及びアルギニンレベルをマウス中で血漿中６時間の間欠失させることができる。修飾されていないＡＰＩＴは、同じ作用を達成するために１０００ユニット／ｋｇ必要である。従って、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＴＩの用量は、ペグ化されていないＡＰＩＴと比較して約１６６７倍減少されることができる。言い換えると、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの活性は、修飾されていないＡＰＩＴの活性よりも約１６６７倍より大きい。
【００３６】
従って、有利な実施態様において、本発明のコンジュゲートの活性は、ポリエチレングリコール残基を有しないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの活性と比較して、少なくとも３０、より有利には少なくとも１００、更に有利には少なくとも３００、いっそう有利には少なくとも１０００、最も有利には１５００倍より大きい。この活性は特に酵素活性である。より有利には活性は、被験体、例えば哺乳類、例えば齧歯類又はヒトへの投与後の血漿中の酵素活性である。酵素活性は、予め決められた期間、液体、例えば体液、血漿中でアルギニン又は／及びリシンを欠失させるために必要とさせる用量の決定により決定されてよい。この期間は、約３〜約４８時間、約６〜約２４時間、又は約１２〜約１８時間、又は有利には約３時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、又は約４８時間の範囲内から選択されてよい。アルギニン又は／及びリシンは、予め決められたレベル、例えば０μＭに枯渇されてよい。この予め決められたレベルは、０μＭ〜約１０μＭ、０μＭ〜２０μＭ、又は０μＭ〜約１００μＭの範囲内から選択されてよい。
【００３７】
この活性の改善の倍数は、例えば、ペグ化されていないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの用量を、本発明のコンジュゲートの用量で割ることにより計算されることができ、この用量は、予め決められた期間のアルギン／リシンの枯渇のために必要である。
【００３８】
更なる有利な一実施態様において、本発明のコンジュゲートは、重量平均分子量約１０００ダルトン〜約１００００ダルトン、有利には約３０００ダルトン〜約８０００ダルトン、より有利には約４０００ダルトン〜約６０００ダルトン、更に有利には約４５００〜約５５００ダルトン、最も有利には約５０００ダルトンを有する少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を含有する。
【００３９】
本発明で使用されるポリエチレングリコール残基は、ポリペプチドを連結させるために適した、修飾されていない、及び、修飾されたポリエチレングリコール残基を含む。修飾されたポリエチレングリコール残基は有利には、末端で修飾されたポリエチレングリコール残基を含み、その際この末端のＯＨ基は修飾されていて、例えばアルキル化、アシル化及び／又は酸化により修飾されている。より有利には、ポリエチレングリコール残基は、末端のＯＨ基、又はＯ−Ｃ1〜3アルキル基及びアシル基又はその組み合わせから選択される修飾された末端基を有する。
【００４０】
更なる有利な一実施態様において、このコンジュゲートは、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結基を介して共有結合している少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を含有する。この連結基は、スクシンイミド基、有利にはスクシンイミジルスクシナート基であってよい。
【００４１】
別の有利な一実施態様において、本発明のコンジュゲートは、１〜約３０ポリエチレングリコール残基、有利には１〜約２０ポリエチレングリコール残基、より有利には１〜約１０ポリエチレングリコール残基を含有する。
【００４２】
本発明のコンジュゲート中では、少なくとも１つのポリエチレングリコール基は、反応性官能基、例えばカルボキシラート基、アミノ基、チオール基及び／又はヒドロキシ基を有する側鎖を有する任意のアミノ酸に、連結されていてよく、例えばアミノ酸は、アスパルギン酸、グルタミン酸又は／及びリシンから選択される。 有利な一実施態様は、少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼにリシン残基を介して共有結合しているコンジュゲートに関する。配列番号８は、２３個のリシン残基を含有するので、配列番号８のポリペププチドを含有する本発明のコンジュゲートは、リシン残基を介して連結した、２３個までのポリエチレングリコール残基、有利には約１０個までのポリエチレングリコール残基を含有してよい。
【００４３】
本発明のコンジュゲートにおいては、少なくとも１つのポリエチレン基が、リンカー基、例えばスクシンイミドリンカー基又はアミン基への連結のための他の任意の適したリンカー基を介してリシンに連結していることがより有利である。本発明のコンジュゲートにおいては、少なくとも１つのポリエチレン基が、約４５００〜約５５００ダルトンの重量平均分子量を有し、かつ、リンカー基、例えばスクシンイミドリンカー基を介してリシンに連結していることがより有利である。
【００４４】
最も有利には、配列番号８を有するＬ−アルギニン／Ｌ−リシンオキシドレダクターゼ及び重量平均分子量約４５００〜５５００ダルトンを有する少なくとも１つのポリエチレングリコール基を含有するコンジュゲートである。
【００４５】
更なる別の観点は、
（ａ）アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを組み換えにより発現する、又は／及び、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを天然源から単離する工程、
（ｂ）少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を、（ａ）のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結する工程を含む、本発明のコンジュゲートを製造する方法である。
【００４６】
工程（ａ）で使用されてよいアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの有利な天然供給源は、上に説明されるとおりである。
【００４７】
工程（ａ）は有利には、
（ｉ）配列番号１、３、５又は／及び７の配列、
（ｉｉ）配列（ｉ）に相補的な配列、
（ｉｉｉ）配列（ｉ）又は（ｉｉ）の遺伝暗号の縮重の範囲内の配列、
（ｉｖ）配列（ｉ）、（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）に対して少なくとも７０％同一である配列、
（ｖ）配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は／及び（ｉｖ）の任意の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列、又は／及び
（ｖｉ）配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は／及び（ｖ）の任意の配列の断片
を含む核酸の組み換え発現を含む。
【００４８】
配列番号１、３、５及び７は、それぞれ、アミノ酸配列 配列番号２、４、６及び８を含有するポリペプチドをコードする核酸配列である。配列番号１、３、５及び７は、幾つかのヌクレオチド位置において異なる。配列番号７は、Aplysia punctataから単離されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を説明する（本発明の実施例参照のこと）。配列番号１、３及び５は、Aplysia punctataから単離された更なるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を説明する。配列番号１、３及び５は、WO 2004/065415中に説明され、これは、参照により本願中に含まれる。
【００４９】
（ｉ）の有利な配列は、配列番号７である。
【００５０】
（ｉｖ）のヌクレオチド配列は、少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％、更により有利には少なくとも９５％、最も有利には少なくとも９９％、（ｉ）、（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）の配列に対して同一である配列である。ヌクレオチド配列の同一性は、最大のオーバーラップの領域内で決定される。当業者は、一般的に知られているアルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴにより最大のオーバーラップの領域を容易に決定することができる。
【００５１】
当業者は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を知っている（参照、例えば、Sambrook J. et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y）。工程（ｖ）におけるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは有利には、１時間の１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを用いた５５℃、有利には６２℃、より有利には６８℃での洗浄後、特に１時間の０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを用いた５５℃、有利には６２℃、より有利には６８℃での洗浄後にハイブリダイゼーションシグナルが検出されることを意味する。
【００５２】
（ｖｉ）の断片は、少なくとも約９０ヌクレオチド残基、有利には少なくとも約１５０ヌクレオチド残基、より有利には少なくとも約３００ヌクレオチド残基、最も有利には少なくとも約６００ヌクレオチド残基の長さを有してよい。
【００５３】
（ｖｉ）の断片は、配列番号１、３、５又は／及び７の完全長よりもより短い長さを有してよく、有利には最大で約１５００ヌクレオチド残基、より有利には最大で約１２００ヌクレオチド残基、最も有利には最大で約９００ヌクレオチド残基である。
【００５４】
（ｖｉ）の断片は、Ｎ−末端のアミノ酸をコードする５′ヌクレオチドを除去することにより配列番号１、３、５及び７に由来する配列から選択されてよく、このアミノ酸は、オキシドレダクターゼ機能のためには必要でないシグナル配列を提示してよい。有利には、約１５までの、約３０までの、約６０までの、又は約１５０までの５′ヌクレオチドが除去される。より有利には、配列番号１において、５４の５′ヌクレオチドが除去され、又は／及び配列番号３、５において１の５′ヌクレオチドが除去される。
【００５５】
当業者は、タンパク質の組み換え発現、単離、リフォールディング及び補欠分子族、例えばＦＡＤの導入のための方法を知っている。本発明の実施例において、配列番号７の組み換え発現は、配列番号８を含有するポリペプチドを得るために説明されている。組み換え発現のための有利な宿主細胞は、真核性の又は原核性の宿主細胞であり、例えば酵母細胞又は細菌細胞、特にグラム陰性細菌細胞、例えばＥ．コリである。
【００５６】
本発明のコンジュゲートの調製のための方法は、更に、補酵素、例えばＦＡＤを、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ中に導入することを含んでよい。
【００５７】
本発明のコンジュゲートの調製のための方法の工程（ｂ）は、少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を、工程（ａ）で得られるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼにカップリングすることを指す。工程（ｂ）でのペグ化は、当業者に公知の標準的な手法により実施されてよい。
【００５８】
工程（ｂ）において、重量平均分子量が約１０００ダルトン〜約１００００ダルトン、有利には約３０００ダルトン〜約８０００ダルトン、より有利には約４０００ダルトン〜約６０００ダルトン、更により有利には約４５００ダルトン〜約５５００ダルトン、最も有利には約５０００ダルトンを有するポリエチレングリコールが使用されてよい。
【００５９】
このポリエチレングリコール残基は、連結基（スクシンアミド基、有利にはスクシンイミジルスクシナートであってよい）を介して共有結合されてよい。他の連結基も使用されてよい。当業者は、適した連結基を知っている。
【００６０】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼにリシン残基を介して共有結合していることが有利である。リシンへのカップリングは、スクシンイミド連結基を適用することにより実施されることができる。カップリングは、官能基、例えばカルボキシラーゼ基、アミノ基、チオール基又は／及びヒドロキシ基を有する他のアミノ酸側鎖、例えばアスパルギン酸又はグルタミン酸に対して実施されてもよい。
【００６１】
１〜約３０ポリエチレングリコール残基、有利には１〜約２０ポリエチレングリコール残基、より有利には１〜約１０ポリエチレングリコール残基を含有する本発明のコンジュゲートを供給するためには、工程（ｂ）において過剰量のポリエチレングリコールを使用してよい。ポリエチレングリコールは、カップリングに使用できる遊離の残基の数、例えば遊離のリシン残基に関して約１０〜約５００当量、有利には約１０〜約５０当量の量で、提供されてよい。特に、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約２００、又は約５００当量のポリエチレングリコールが使用されてよい。５０当量を超えると、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ分子につき約１０ＰＥＧ分子のカップリングを生じてよい。
【００６２】
また更なる本発明の観点は、本発明のコンジュゲートを、場合により、医薬的に許容可能な担体、助剤、希釈剤又は／及び添加剤と一緒に含有する医薬組成物である。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、活性酸素種又は／及びアンモニウムに対して応答性の、又は／及び血漿アミノ酸レベル、特に血漿リシン又は／及びアルギニンレベルの調節に対して応答性の疾病の予防、緩和又は／及び治療のために適して良い。本発明の医薬組成物は、また、微生物感染、ウィルス感染、例えばＨＩＶ、Ｂ型又は／及びＣ型肝炎ウィルス感染、及び増殖性疾病、例えば癌から選択される疾病の予防、緩和、又は／及び治療に適していても良い。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、一般的な充実性腫瘍及び白血病、例えばアポトーシス抵抗性及び多剤抵抗性の癌の形態の治療のために適する。
【００６５】
本発明の医薬組成物で治療すべき増殖性疾病は、肺癌、ＭＤＲ肺癌、頭部及び頸部癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、子宮頸部癌、子宮癌、喉頭癌、胃癌、肝臓癌、ユーイング肉腫、急性リンパ性白血病、急性及び慢性の骨髄性白血病、アポトーシス抵抗性白血病、膵癌、腎臓癌、膠腫、メラノーマ、慢性リンパ球白血病、又は／及びリンパ腫であってよい。
【００６６】
本発明のまた更なる観点は、本発明のコンジュゲート又は／及び本発明の医薬組成物の有効量をこれを必要とする被験体に投与することを含む、活性酸素種、アンモニウムに応答性の、又は／及び体液中のアミノ酸レベル、特に血漿リシン又は／及びアルギニンレベルの調節に応答性の疾病の、予防、緩和又は／及び治療のための方法である。この方法により治療されるべき疾病は、特に、微生物感染、ウィルス感染又は／及び増殖性疾病、例えば上記で定義した疾病である。
【００６７】
本発明のまた更なる観点は、本発明のコンジュゲート又は／及び本発明の医薬組成物を含有するキットである。
【００６８】
本発明のまた更なる観点は、少なくとも１つのポリエチレングリコール残基をアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結させることを含む、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼの酵素活性又は／及び循環時間を促進させるための方法を指す。この方法において、このアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、特に、上記で定義したとおりのアルギニン／リシンオキシドレダクターゼであってよい。このポリエチレングリコール残基は、上記で定義したとおりであってよい。
【００６９】
また更なる本発明の観点は、少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結することを含む、体液、例えば血液血漿中で不活性化からアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを保護するための方法である。この方法において、このアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、特に、上記で定義したとおりのアルギニン／リシンオキシドレダクターゼであってよい。このポリエチレングリコール残基は、上記で定義したとおりであってよい。特に、体液中の不活性化は、抗体による不活性化であってよい。
【００７０】
ＰＥＧ基、特に本願明細書で定義したとおりのＰＥＧ基は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、特に本願明細書で定義されるとおりのアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの酵素活性又は／及び循環時間を促進するために使用されてよい。
【００７１】
ＰＥＧ基、特に本願明細書で定義されるとおりのＰＥＧ基は、体液、例えば血液血漿中での不活性化に対して、特に抗体による不活性化に対して、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、特に本願明細書で定義されるとおりのアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの保護のために使用されてよい。
【００７２】
本願明細書で定義されるとおりの本発明のコンジュゲート又は／及び本願明細書で定義されるとおりの本発明の医薬組成物は、液体中でのリシン又は／及びアルギニンの枯渇のために又は／及び過酸化水素、アンモニウム又は／及びリシン又は／及びアルギニンの代謝産物の液体中での産生のために使用されてよい。この液体はとくに哺乳類の体液であってよい。
【００７３】
本発明は、更に、以下の実施例及び図において実証され、これらは説明の目的のためのものであり、かつ、本発明の範囲を限定する意図はない。
図の説明
図１：アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴの１次アミノ酸配列（配列番号８）及びそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）
図２：アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴのＰＥＧ−５０００でのペグ化
図３：抗ＡＰＩＴポリクローナル抗体の存在下でのＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの活性
図４：マウス中での血漿リシンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＡＰＩＴ（１０００Ｕ／ｋｇ）の単一経静脈投与の効果
図５：マウス中での血漿アルギニンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＡＰＩＴ（１０００Ｕ／ｋｇ）の単一経静脈投与の効果
図６：マウス中での血漿リシンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの等価の用量２５０Ｕ／ｋｇの単一経静脈投与の比較
図７：マウス中での血漿アルギニンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの等価の用量２５０Ｕ／ｋｇの単一経静脈投与の比較
図８：マウスに対するＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの単一経静脈投与後の血漿リシンレベルの用量依存性の枯渇
図９：マウスに対するＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの単一経静脈投与後の血漿アルギニンレベルの用量依存性の枯渇
図１０：ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの抗腫瘍効力
図１１：Aplysia punctataのインクから単離されるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１、３及び５）及び得られるアミノ酸配列（配列番号２、４及び６）。このジヌクレオチド結合フォールド（２８アミノ酸残基）及びＧＣモチーフ（８アミノ酸残基）が四角により示される。
【００７４】
実施例
実施例１
Ｅ．コリ中での組み換えアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴの大量製造方法
５０００ｍｌ培地を有するB-Braun Biostat B10発酵槽を、適したプロモーター（例えばＴ７）の制御下の配列番号７を含有するＡＰＩＴｃＤＮＡを含有するワーキングセルスターター培養液（working cell starter culture）で接種する。細胞を、光学密度６〜８（６００ｎｍで）にまで、３７±０．５℃で成長させる。引き続き、この細胞を、ＩＰＴＧの添加により誘導し、更に、更なる３時間３７±０．５℃で発酵させる。この後で、細胞を、遠心分離を介して収穫し、かつ、≦−６０℃で貯蔵する。この再懸濁された細胞を、フレンチプレスを用いて破砕し、かつ、この封入体を遠心分離により上清から分離する。この封入体を、≦−６０℃で更なる処理のために貯蔵する。ＡＰＩＴを、Ｅ．コリバイオマスの封入体から尿素で単離する。この可溶化されたタンパク質を再フォールディングさせ、濃縮し、ＴＦＦ（Tangential Crossflow Filtration）により脱塩する。引き続き、ＡＰＩＴを、アニオン交換クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により精製する。
【００７５】
封入体からのＡＰＩＴの単離：
このペレットを、２回連続して洗浄バッファー中で再懸濁し、ついでＮａＣｌ洗浄緩衝液及び尿素洗浄緩衝液中で再懸濁する。この懸濁液を、引き続きそれぞれの再懸濁工程後に遠心分離し、その一方でこの残りの上清を廃棄する。この後で、このペレットを、最後の遠心分離工程の後に再懸濁緩衝液中で再懸濁する。この上清を、０．２μｍを介して濾過し、かつ、この（ＡＰＩＴ含有）溶液を、＜−１５℃で凍結貯蔵する。
【００７６】
リフォールディング：
この方法工程を、室温（２２〜２５℃）で実施する。Ｅ．コリから単離されたＡＰＩＴ２００ｍｌ（再懸濁緩衝液中）を、２００ｍｌのグアニジン−ＨＣｌと混合する。この混合物を次いで、ポンプを用いて、Ｌ−アルギニン及びＦＡＤを含有する２０Ｌのリフォールディング緩衝液中に注入する。この混合／希釈工程は、（最大の活性のある）マグネットスターターを用いて支持される。この希釈を、４つの注入部位を介して実現する。
【００７７】
ＴＦＦによる精製：
ＲＦ混合物を、ＴＦＦ（０．２μｍ）を用いて濾過し、フォールディングされていないタンパク質を分離する。この後で、この系を、１．６Ｌのトリス緩衝液で洗浄する。ＡＰＩＴを、１０ｋＤａの膜を用いて濃縮する。この後で、ＲＦ緩衝液を、トリス緩衝液に対して透析する。この工程の間に、ＲＦ混合物及びトリス緩衝された混合物の伝導性を測定する。この１０ｋＤａ膜を、緩衝液を変更するため、そして、この濃縮工程を継続するために維持する。濃縮されたＡＰＩＴ溶液中での導電性の減少のレベルは、この手法の継続時間を示す。
【００７８】
アニオン交換クロマトグラフィ：
ＡＰＩＴ含有試料を更に、アニオン交換クロマトグラフィにより更に精製する（SOURCE 30Qカラム）。この生成物のカラムからの溶出を、塩勾配（０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて、ｐＨ８．０で実施する。この溶出物を分画で回収する。
【００７９】
サイズ排除クロマトグラフィ：
ＡＰＩＴ含有試料を、サイズ排除クロマトグラフィ（Sephadex G25）を用いて脱塩する。この精製はＤ−ＰＢＳを用いて生じる。この溶出された生成物を分画で回収する。
【００８０】
充填及び貯蔵：
大量生産物の充填は滅菌したＰＥ容器中で、容積１０００μｌであり、２−８℃で貯蔵する。組み換えＡＰＩＴの１次アミノ酸配列は図１中に示される。
【００８１】
実施例２
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴの、ＰＥＧ−５０００でのペグ化
精製したアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、実施例１からのＡＰＩＴを、HiPrep Desalting 26/10カラムで脱塩し、かつ、５０ｍＭの重炭酸ナトリウムを含有する、ｐＨ９．５のペグ化反応緩衝液中に導入する。このペグ化反応を、線状の多分散性ポリエチレングリコールスクシンイミジルエステル、ＭＷ５０００Ｄａ（PEG-5000-SS）を、１０〜５０当量（ｅｑ）のＰＥＧ５０００−ＳＳ対アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ（ＡＰＩＴ中の遊離のリシン残基に基づき）の異なる比で添加し、１時間８００ｒｐｍで２５℃で撹拌することにより実施する。このＰＥＧコンジュゲートしたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ変形、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（１０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（２０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（４０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（５０ｅｑ）を個々に、ゲル濾過により、反応生成物及びコンジュゲートしていないＰＥＧ剤から精製し、かつ、この緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝化した食塩水（ｐＨ７）に対して交換された。最終産物を、ＳＤＳページ上で、酵素活性について分析した（図２）。５０ｅｑＰＥＧの過剰量は、約１０分子のＰＥＧを１つの分子のＡＰＩＴへのカップリングを生じた。
【００８２】
図２は、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴが、６０ｋｄａ〜＞２１２ｋＤａの範囲内の明らかな分子量を有したことを示す。全てのＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ変形は、コンジュゲートしていないＡＰＩＴに比較して酵素活性があった。ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（１０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（３０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（４０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（５０ｅｑ）の相対的な酵素活性は、５８％〜７２％であった。
【００８３】
実施例３
抗ＡＰＩＴポリクローナル抗体の存在下での活性
ＡＰＩＴに対する高力価（＞１：２０００００）ポリクローナル抗体血清をウサギ中で製造した。ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴが、ＡＰＩＴに対する抗体により不活性化されるかどうかを検査するために、免疫前のウサギ血清及び抗ＡＰＩＴウサギ免疫血清を、１時間３７℃でＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴでインキュべーションし、その後にリシン及びアルギニンに関してアミノ酸レベルを分析する。図３は、リシン及びアルギニンレベルが、ウサギの免疫前のウサギ血清及び抗ＡＰＩＴウサギ免疫血清中で通常であったことを示す（リシン：２３８μＭ及び２６５μＭ、それぞれ；アルギニン２０７μＭ及び１７９μＭ、それぞれ）。ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴでのインキュベーションは、リシン及びアルギニンのレベル０μＭを両者で生じ、免疫前のウサギ血清及び抗ＡＰＩＴウサギ免疫血清は、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴが、抗ＡＰＩＴポリクローナル抗体の存在下で酵素活性があり、かつ、リシン及びアルギニンの液体中での完全な枯渇を可能にすることを実証する。
【００８４】
実施例４
マウスに対する適用
マウスは、コンジュゲートしていないＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ又は１０００Ｕ／ｋｇ）又はＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ、７９Ｕ／ｋｇ、１１Ｕ／ｋｇ、２Ｕ／ｋｇ、０．６Ｕ／ｋｇ）又はＤ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）それぞれの単一の静脈投与を受けた（尾の静脈）。連続的な血液試料を、眼窩静脈叢（orbital sinus）を介してエーテル麻酔下での、−１時間の予備投与、及び、示した時間点で後投与でのそれぞれの動物から回収し、かつ、抗凝集物（ヘパリン）を含有する管中に移した。それぞれの血液試料を、４℃で遠心分離して、血漿アミノ酸レベルの分析のために血漿を準備する。
【００８５】
アミノ酸分析のためには、２５μｌのヘパリン血漿試料を、スルホサリチル酸を含有する４μｌの沈殿緩衝液と混合した。次いで、内部標準ノルロイシン（Ｎｌｅ、ｃ：１ｎｍｏｌ／μｌ）を含有する６μｌの試料希釈緩衝液を添加し、この試料を終容積６０μｌに、試料希釈緩衝液で充填した。この後に、試料を混合し（Vortex）かつ遠心分離した。この上清を、遠心分離により遠心分離フィルターを通過させた。この遠心分離物を試料バイアル中に移し、アミノ酸分析機Ａ２００を用いて、生理的プログラムを用いて分析した。
【００８６】
図４及び図５は、単一静脈用量２５０Ｕ／ｋｇ及び１０００Ｕ／ｋｇでのＡＰＩＴの、それぞれの、血漿アルギニン又は血漿リシンレベルに対する、マウスに対する作用を示す。ＡＰＩＴ用量の２５０Ｕ／ｋｇから１０００Ｕ／ｋｇへの４倍の増加は、３時間から６時間の投与後のリシン又はアルギニンの枯渇の延長化を生じる。
【００８７】
図６及び７は、コンジュゲートしていないＡＰＩＴ及びＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの、２５０Ｕ／ｋｇの単一静脈用量での作用の直接的な比較を示す。コンジュゲートしていないＡＰＩＴが、リシン（図６）及びアルギニン（図７）の枯渇を、投与後３時間だけ媒介する一方で、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴは、投与後少なくとも４８時間両方のアミノ酸を枯渇させた。
【００８８】
異なる用量のＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴのマウスに対する単一の静脈投与後のリシン及びアルギニン血漿レベルは、図８及び９中にそれぞれ示されている。
【００８９】
図８は、１１ユニット／ｋｇ又は２５Ｕ／ｋｇ又は７９Ｕ／ｋｇのＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの単一の静脈用量が、完全にマウス中での血漿リシンレベルを枯渇させることを示す。０．６Ｕ／ｋｇ又は２Ｕ／ｋｇの用量はまだなお、６時間のマウス中でのリシンの完全な枯渇を媒介し、これは、１０００Ｕ／ｋｇのコンジュゲートしていないＡＰＩＴの効果である。図９は、単一の静脈用量７９ユニット／ｋｇのＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴが完全にマウス中で血漿アルギンレベルを枯渇させることを示す。２５Ｕ／ｋｇ又は１１Ｕ／ｋｇの用量は、２４時間のマウス中でのアルギニンの完全な枯渇を媒介する。０．６Ｕ／ｋｇ又は２Ｕ／ｋｇの用量はまだなお、６時間のマウス中でのアルギニンの完全な枯渇を媒介し、これは、コンジュゲートしていないＡＰＩＴの１０００Ｕ／ｋｇの効果である。
【００９０】
これらを一緒に考慮すると、図８及び図９中に示されるこの予期せぬ発見は、コンジュゲートしていないＡＰＩＴ用量に比較して０．１％未満のＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴが、哺乳類中でのリシン及びアルギニンレベルに対する等価の効果を媒介することを示す。
【００９１】
図５：ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの抗腫瘍効力
ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの抗腫瘍効力を、コンジュゲートしていないＡＰＩＴに比較して、ＭＴＴアッセイによりＡ５４９肺癌細胞に対して評価した。このＭＴＴアッセイは、代謝活性のある細胞による、黄色のテトラゾリウム塩のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の、紫色のホルマゾン結晶への分解を基礎とする。腫瘍細胞を９６ウェル培養プレート上に播種し、ＡＰＩＴ又はＰＥＧ−５０００−ＡＰＴＩを更なる９６時間添加する前に、この培養中で２４時間維持した。処置後に、２０μｌのＭＴＴラベル化剤を、それぞれのウェル及びプレートに添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベーシした。ＭＴＴインキュベーション後に、この培養をＤＭＳＯでもってインキュベーションし、かつ、この試料の吸光分析による吸光を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて５５０ｎｍの波長で検出した。この結果を、試験物質濃度に対してプロットし、用量応答曲線を得る。代謝活性の５０％阻害を生じるこの試験物質濃度（ＩＣ５０）を、グラフにより決定し、かつ、図１０中で、コンジュゲートしていないＡＰＩＴ又はＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴに対して示す。意外にも、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴのＩＣ５０は、Ａ５４９細胞に対してコンジュゲートしていないＡＰＩＴ（７１７μＵ／ｍＬ）でのＩＣ５０よりも低く（６３３μＵ／ｍＬ）、コンジュゲートしていないＡＰＩＴに比較してＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴのより高い抗腫瘍作用を示す。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴの１次アミノ酸配列（配列番号８）及びそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図である。
【図２】図２は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴのＰＥＧ−５０００でのペグ化を示す図である。
【図３】図３は、抗ＡＰＩＴポリクローナル抗体の存在下でのＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの活性を示す図である。
【図４】図４は、マウス中での血漿リシンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＡＰＩＴ（１０００Ｕ／ｋｇ）の単一経静脈投与の効果を示す図である。
【図５】図５は、マウス中での血漿アルギニンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＡＰＩＴ（１０００Ｕ／ｋｇ）の単一経静脈投与の効果を示す図である。
【図６】図６は、マウス中での血漿リシンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの等価の用量２５０Ｕ／ｋｇの単一経静脈投与の比較を示す図である。
【図７】図７は、マウス中での血漿アルギニンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの等価の用量２５０Ｕ／ｋｇの単一経静脈投与の比較を示す図である。
【図８】図８は、マウスに対するＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの単一経静脈投与後の血漿リシンレベルの用量依存性の枯渇を示す図である。
【図９】図９は、マウスに対するＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの単一経静脈投与後の血漿アルギニンレベルの用量依存性の枯渇を示す図である。
【図１０】図１０は、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの抗腫瘍効力を示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Aplysia punctataのインクから単離されるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１、３及び５）及び得られるアミノ酸配列（配列番号２、４及び６）を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Aplysia punctataのインクから単離されるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１、３及び５）及び得られるアミノ酸配列（配列番号２、４及び６）を示す図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、Aplysia punctataのインクから単離されるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１、３及び５）及び得られるアミノ酸配列（配列番号２、４及び６）を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
発明の背景
本発明は、ポリエチレングリコールで修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに関する。
【０００２】
発明の背景
数十年間、医薬的に活性のある物質を、天然の生物から回収するため、そして、これらの効果を様々な疾病領域で試験するために多くの努力がなされてきた。
【０００３】
アメフラシ（Aplysia punctata）は、捕食から自身を保護するための紫色のインクを産生する。このインクは、抗腫瘍活性を有することが示されている（Butzke et al., 2004）。その後、研究が、この因子を粗製インクから単離すべく実施され、ＡＰＩＴ、Aplysia Punctataインク毒素（Aplysia Punctata Ink Toxin）の発見を生じた。最近では、この因子がクローニングされ、Ｌ−リシンとＬ−アルギニンの酸化による脱アミノ化を触媒作用し、これにより過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、アンモニウム（ＮＨ4+）及び相応するα−ケト酸を産生する（Butzke et al., 2005）、弱グリコシル化されたＦＡＤ結合Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（）であると特性決定した。
【０００４】
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（LAAOs, EC 1.4.3.2）は、分泌物及び毒物中に見出されることができる。フラビン酵素のこのファミリーのメンバーは、Ｌ−アミノ酸の立体特異的な酸化的脱アミノ反応を触媒作用し、かつこれにより、Ｈ2Ｏ2、アンモニウム及び相応するα−ケト酸を産生する（Du et al., 2002）。この個々のＬＡＡＯｓは、その基質特異性において異なる。蛇毒Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ｓｖ−ＬＡＡＯｓ）は、これは、粗製毒素３０（質量）％までを構成し（Ponnudurai et al., 1994）、疎水性アミノ酸に対する明確な選択性を有する。ＡＩＰ（アポトーシス誘導性タンパク質）と呼称される魚カプセル（fish capsule）ＬＡＡＯは、マサバの幼生の線虫の感染により誘導され、これは、Ｌ−リシンに対して高度に特異的である（Jung et al., 2000）。アクアチン（Achacin）（アフリカヘビ、アフリカマイマイからの粘液ＬＡＡＯ）は、極めて広い範囲の基質を代謝し、これは、疎水性アミノ酸、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパルギン及びＬ−チロシンを含む（Ehara et al., 2002）。
【０００５】
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、任意の経路での哺乳類に対する投与後のその半減期について検査されていない。薬物開発に関して、しかしながらこれは重要な問題であり、かつ、薬理作用を効率的に発揮するためには必要条件である。この観点におけるデータは、基質としてＤ−プロリンを使用するＤ−アミノ酸オキシダーゼに関してのみ入手可能である(Fang et al., 2002)。しかしながら、静脈内注射後に天然のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、循環から迅速に清掃された。ペグ化された誘導体は、顕著に増加した循環半減期を示さず、１時間を優に下回った。このような短い半減期を有する製品は、治療、例えば癌治療のために実質的な治療的利益を有するとは期待されることができない。従って、この先行技術の教示によれば、ペグ化されたアミノ酸オキシダーゼが、治療的効力に欠けることが予期されるものである。
【０００６】
本発明の課題は、改善された特性を有する治療製品を提供すべく、Ｌ−アミノ酸オキシドレダクターゼの治療的効力を増加させることであった。
【０００７】
発明の要約
本発明は、初めて、少なくとも１つのポリエチレングリコール残基で修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ及びこの修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有する医薬組成物、この製造方法及び、血漿アミノ酸レベルの調節に対して応答性の、又は／及び活性酸素種又は／及びアンモニウムに対して応答性の疾病、例えば増殖性疾病、ウィルス感染又は／及び微生物感染を治療するための方法について言及する。
【０００８】
有利な一実施態様において、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ（Aplysia punctataインク毒素（ＡＰＩＴ）と呼ばれる）は、重量平均分子量約１０００〜約１００００を有する少なくとも１つのポリエチレングリコールで修飾される。
【０００９】
本発明の更なる実施態様は、ペグ化されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの製造方法に関する。
【００１０】
更なる実施態様は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼのペグ化を含む、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼの酵素活性及び循環時間を促進する方法に関する。
【００１１】
更なる実施態様は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼのペグ化を含む、体液による不活性化に対してアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを保護する方法に関する。
【００１２】
更なる一観点において、本発明は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼをこの液体に添加することを含む、液体中でのアミノ酸リシン又は／及びアルギニンを欠失させるための方法に関する。
【００１３】
また更なる実施態様は、本発明のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有するキットに関する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の課題は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、特にＬ−アルギニン／リシンオキシダーゼをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で共有的に修飾することにより達成される。本発明は、ポリエチレングリコールで修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼが、マウスの血漿中で４８時間より長く循環し、かつ、その酵素活性を維持するとの意外な発見に基づく。対照的に、修飾されないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼが、約３時間のみ等価な活性に基づく用量で循環中で活性がある。
【００１５】
更に、ＰＥＧ修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの用量が、修飾されていないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに比較して顕著に減少されることができることが意外にも見出された。
【００１６】
更に、ＰＥＧ修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼが、修飾されていないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに比較して肺癌細胞の抑制のためにより少ないＩＣ50値を有することが意外にも見出された。
【００１７】
更に、ポリエチレングリコールで修飾されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、アミノ酸レベル、リシン及びアルギニンを低下させ、これにより活性酸素種及びアンモニウムを産生することにおいて、特定の手段を提供する。これらの効果の全て又はこれらの効果の一部は、疾病の特定の種類を治療するために十分である。天然のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに比較すると、ペグ化されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、大抵の酵素活性を維持し、リシン及びアルギニンを哺乳類中で４８時間以上枯渇させることができ、かつ、アミノ酸レベル及び／又は活性酸素種又はアンモニウムの変更に対して応答性の疾病の治療においてより効果がある。更に、このペグ化されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、修飾されていないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに指向した特異的な抗体の存在下ですら活性がある。
【００１８】
第１の観点において、本発明は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ及び少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を含有するコンジュゲートを提供する。
【００１９】
ここで使用される「コンジュゲート」は、ポリペプチド部分を含有する化合物を指し、有利にはこれは、補酵素、例えばＦＡＤを含み、これに対して少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、共有結合により連結されている。
【００２０】
本発明のコンジュゲートは、任意の公知のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、特にＬ−アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含んでよく、これは、Ｌ−アルギニン又は／及びＬ−リシンのそれぞれのアルファイミノ酸への変換を触媒作用する。この工程において、酵素はＨ2Ｏ2を、化学量論量で産生する。第２の工程において、アルファイミノ酸は、α−ケト酸に、アンモニウムの放出下で変換される。第２の工程は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ活性に依存性でない。アルギニン／リシンオキシドレダクターゼにより触媒されるこの反応の詳細は、WO 2004/065415中に説明され、これは、参照することにより本願に組み込まれる。
【００２１】
本発明の別の有利な実施態様において、コンジュゲートは、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有し、これはＬ−アルギニン／Ｌ−リシンオキシドレダクターゼである。
【００２２】
更なる有利な一実施態様において、このコンジュゲートは、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有し、これは、アルギニン又は／及びリシンに対して特異的である。特に、リシン又は／及びアルギニン、特にＬ−リシン又は／及びＬ−アルギニンを処理するための酵素活性は、他のアミノ酸、特に生物中に天然に存在するアルファＬ−アミノ酸の処理のための酵素活性よりも少なくとも約３倍又は約４倍、より大きい。
【００２３】
有利なアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、アメフラシ種から得られてよく、特にAplysia punctataから得られる。例えば、Aplysia Punctataインク毒素（ＡＰＩＴ）は、これは本発明のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼであるが、アメフラシAplysia Punctataのインク中に見出されることができる。この酵素及びその製造は、WO 2004/065415中に説明され、これは参照により本願に含められる。
【００２４】
更に、適したＬ−リシンα−オキシダーゼは、Lukasheva EV, Berezov TT中に説明されている。L-Lysine alpha-oxidase: physiochemical and biological properties. Biochemistry (Mosc.) 2002 Oct;67(10):1152-8。
【００２５】
アルギニン／リシンオキシダーゼは、天然源から単離された天然の分子又は組み換え体、例えば天然に生じない供給源から得られる組み換え分子であってよい。有利な一実施態様において、このコンジュゲートは、組み換えアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有してもよい。
【００２６】
特に有利な一実施態様において、本発明のコンジュゲートは、
（ａ）配列番号２、４、６又は／及び８の配列
（ｂ）少なくとも７０％配列（ａ）と同一である配列、又は／及び
（ｃ）（ａ）又は／及び（ｂ）の断片
を含有するアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを含有する。
【００２７】
配列番号２、４、６及び８は、幾つかのアミノ酸位置において異なる。配列番号８は、Aplysia punctataから単離された有利なアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを説明する（本発明の実施例参照のこと）。配列番号２、４及び６は、Aplysia punctataから単離された更なるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを説明する。配列番号２、４及び６は、WO 2004/065415中に説明され、これは、参照により本願中に含まれる。
【００２８】
（ａ）の有利な配列は、配列番号８である。
【００２９】
（ｂ）の配列は、少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％、更により有利には少なくとも９５％、最も有利には少なくとも９９％、（ａ）の配列に対して同一である配列である。この同一性は、最大のオーバーラップの領域中で決定される。当業者は、最大のオーバーラップの領域を、一般的に知られているアルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又は／及びアミノ酸配列に関するその誘導体により決定することができる。
【００３０】
（ｃ）の断片は、（ａ）又は（ｂ）のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの任意の酵素活性のある断片であり、かつ、少なくとも約３０アミノ酸残基、有利には少なくとも約５０アミノ酸残基、より有利には少なくとも約１００アミノ酸残基、最も有利には少なくとも約２００アミノ酸残基の長さを有してよい。
【００３１】
（ｃ）の断片は、配列番号２、４、６又は／及び８の完全長よりも短い長さを有してよく、有利には最大で約５００アミノ酸残基、より有利には最大で約４００アミノ酸残基、最も有利には最大で約３００アミノ酸残基である。
【００３２】
（ｃ）の断片は、配列番号２、４、６又は／及び８に由来する配列から、Ｎ−末端のアミノ酸を除去することにより選択されてよい。このＮ末端は、オキシドレダクターゼ機能に必要とされないシグナル配列を示して良い。有利には、約５までの、約１０までの、約２０までの、又は約５０までのＮ−末端アミノ酸が除去される。より有利には、配列番号２において、１８個のＮ−末端アミノ酸が除去され、又は／及び配列番号４において、１７個のＮ−末端アミノ酸が除去される。
【００３３】
本発明のコンジュゲートは有利には、少なくとも６時間の間循環中で活性があり、即ち、このコンジュゲートは有利には少なくとも６時間の循環時間を有する。本発明の文脈において、「循環時間」とは、本発明のコンジュゲートが、その活性、特に酵素活性を、被験体中の循環の間に維持する時間を指す。本発明において、「循環時間」との用語は、比較目的のための他の化合物にも適用される。例えば、「循環時間」は、修飾されていないＡＰＩＴに適用される。循環時間は、循環半減期により表されても良い。
【００３４】
本発明のコンジュゲートは、より有利には、少なくとも１２時間、更に有利には少なくとも２４時間、最も有利には少なくとも４８時間循環中で活性がある。
【００３５】
本発明のコンジュゲートの用量が、相応する修飾されていないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼと比較して顕著に減少されることができることが意外にも見出された。例えば、０．６ユニット／ｋｇ ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの量は、リシン及びアルギニンレベルをマウス中で血漿中６時間の間欠失させることができる。修飾されていないＡＰＩＴは、同じ作用を達成するために１０００ユニット／ｋｇ必要である。従って、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＴＩの用量は、ペグ化されていないＡＰＩＴと比較して約１６６７倍減少されることができる。言い換えると、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの活性は、修飾されていないＡＰＩＴの活性よりも約１６６７倍より大きい。
【００３６】
従って、有利な実施態様において、本発明のコンジュゲートの活性は、ポリエチレングリコール残基を有しないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの活性と比較して、少なくとも３０、より有利には少なくとも１００、更に有利には少なくとも３００、いっそう有利には少なくとも１０００、最も有利には１５００倍より大きい。この活性は特に酵素活性である。より有利には活性は、被験体、例えば哺乳類、例えば齧歯類又はヒトへの投与後の血漿中の酵素活性である。酵素活性は、予め決められた期間、液体、例えば体液、血漿中でアルギニン又は／及びリシンを欠失させるために必要とさせる用量の決定により決定されてよい。この期間は、約３〜約４８時間、約６〜約２４時間、又は約１２〜約１８時間、又は有利には約３時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、又は約４８時間の範囲内から選択されてよい。アルギニン又は／及びリシンは、予め決められたレベル、例えば０μＭに枯渇されてよい。この予め決められたレベルは、０μＭ〜約１０μＭ、０μＭ〜２０μＭ、又は０μＭ〜約１００μＭの範囲内から選択されてよい。
【００３７】
この活性の改善の倍数は、例えば、ペグ化されていないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの用量を、本発明のコンジュゲートの用量で割ることにより計算されることができ、この用量は、予め決められた期間のアルギン／リシンの枯渇のために必要である。
【００３８】
更なる有利な一実施態様において、本発明のコンジュゲートは、重量平均分子量約１０００ダルトン〜約１００００ダルトン、有利には約３０００ダルトン〜約８０００ダルトン、より有利には約４０００ダルトン〜約６０００ダルトン、更に有利には約４５００〜約５５００ダルトン、最も有利には約５０００ダルトンを有する少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を含有する。
【００３９】
本発明で使用されるポリエチレングリコール残基は、ポリペプチドを連結させるために適した、修飾されていない、及び、修飾されたポリエチレングリコール残基を含む。修飾されたポリエチレングリコール残基は有利には、末端で修飾されたポリエチレングリコール残基を含み、その際この末端のＯＨ基は修飾されていて、例えばアルキル化、アシル化及び／又は酸化により修飾されている。より有利には、ポリエチレングリコール残基は、末端のＯＨ基、又はＯ−Ｃ1〜3アルキル基及びアシル基又はその組み合わせから選択される修飾された末端基を有する。
【００４０】
更なる有利な一実施態様において、このコンジュゲートは、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結基を介して共有結合している少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を含有する。この連結基は、スクシンイミド基、有利にはスクシンイミジルスクシナート基であってよい。
【００４１】
別の有利な一実施態様において、本発明のコンジュゲートは、１〜約３０ポリエチレングリコール残基、有利には１〜約２０ポリエチレングリコール残基、より有利には１〜約１０ポリエチレングリコール残基を含有する。
【００４２】
本発明のコンジュゲート中では、少なくとも１つのポリエチレングリコール基は、反応性官能基、例えばカルボキシラート基、アミノ基、チオール基及び／又はヒドロキシ基を有する側鎖を有する任意のアミノ酸に、連結されていてよく、例えばアミノ酸は、アスパルギン酸、グルタミン酸又は／及びリシンから選択される。 有利な一実施態様は、少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼにリシン残基を介して共有結合しているコンジュゲートに関する。配列番号８は、２３個のリシン残基を含有するので、配列番号８のポリペププチドを含有する本発明のコンジュゲートは、リシン残基を介して連結した、２３個までのポリエチレングリコール残基、有利には約１０個までのポリエチレングリコール残基を含有してよい。
【００４３】
本発明のコンジュゲートにおいては、少なくとも１つのポリエチレン基が、リンカー基、例えばスクシンイミドリンカー基又はアミン基への連結のための他の任意の適したリンカー基を介してリシンに連結していることがより有利である。本発明のコンジュゲートにおいては、少なくとも１つのポリエチレン基が、約４５００〜約５５００ダルトンの重量平均分子量を有し、かつ、リンカー基、例えばスクシンイミドリンカー基を介してリシンに連結していることがより有利である。
【００４４】
最も有利には、配列番号８を有するＬ−アルギニン／Ｌ−リシンオキシドレダクターゼ及び重量平均分子量約４５００〜５５００ダルトンを有する少なくとも１つのポリエチレングリコール基を含有するコンジュゲートである。
【００４５】
更なる別の観点は、
（ａ）アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを組み換えにより発現する、又は／及び、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを天然源から単離する工程、
（ｂ）少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を、（ａ）のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結する工程を含む、本発明のコンジュゲートを製造する方法である。
【００４６】
工程（ａ）で使用されてよいアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの有利な天然供給源は、上に説明されるとおりである。
【００４７】
工程（ａ）は有利には、
（ｉ）配列番号１、３、５又は／及び７の配列、
（ｉｉ）配列（ｉ）に相補的な配列、
（ｉｉｉ）配列（ｉ）又は（ｉｉ）の遺伝暗号の縮重の範囲内の配列、
（ｉｖ）配列（ｉ）、（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）に対して少なくとも７０％同一である配列、
（ｖ）配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は／及び（ｉｖ）の任意の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列、又は／及び
（ｖｉ）配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は／及び（ｖ）の任意の配列の断片
を含む核酸の組み換え発現を含む。
【００４８】
配列番号１、３、５及び７は、それぞれ、アミノ酸配列 配列番号２、４、６及び８を含有するポリペプチドをコードする核酸配列である。配列番号１、３、５及び７は、幾つかのヌクレオチド位置において異なる。配列番号７は、Aplysia punctataから単離されたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を説明する（本発明の実施例参照のこと）。配列番号１、３及び５は、Aplysia punctataから単離された更なるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を説明する。配列番号１、３及び５は、WO 2004/065415中に説明され、これは、参照により本願中に含まれる。
【００４９】
（ｉ）の有利な配列は、配列番号７である。
【００５０】
（ｉｖ）のヌクレオチド配列は、少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％、更により有利には少なくとも９５％、最も有利には少なくとも９９％、（ｉ）、（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）の配列に対して同一である配列である。ヌクレオチド配列の同一性は、最大のオーバーラップの領域内で決定される。当業者は、一般的に知られているアルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴにより最大のオーバーラップの領域を容易に決定することができる。
【００５１】
当業者は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を知っている（参照、例えば、Sambrook J. et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y）。工程（ｖ）におけるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは有利には、１時間の１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを用いた５５℃、有利には６２℃、より有利には６８℃での洗浄後、特に１時間の０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを用いた５５℃、有利には６２℃、より有利には６８℃での洗浄後にハイブリダイゼーションシグナルが検出されることを意味する。
【００５２】
（ｖｉ）の断片は、少なくとも約９０ヌクレオチド残基、有利には少なくとも約１５０ヌクレオチド残基、より有利には少なくとも約３００ヌクレオチド残基、最も有利には少なくとも約６００ヌクレオチド残基の長さを有してよい。
【００５３】
（ｖｉ）の断片は、配列番号１、３、５又は／及び７の完全長よりもより短い長さを有してよく、有利には最大で約１５００ヌクレオチド残基、より有利には最大で約１２００ヌクレオチド残基、最も有利には最大で約９００ヌクレオチド残基である。
【００５４】
（ｖｉ）の断片は、Ｎ−末端のアミノ酸をコードする５′ヌクレオチドを除去することにより配列番号１、３、５及び７に由来する配列から選択されてよく、このアミノ酸は、オキシドレダクターゼ機能のためには必要でないシグナル配列を提示してよい。有利には、約１５までの、約３０までの、約６０までの、又は約１５０までの５′ヌクレオチドが除去される。より有利には、配列番号１において、５４の５′ヌクレオチドが除去され、又は／及び配列番号３、５において１の５′ヌクレオチドが除去される。
【００５５】
当業者は、タンパク質の組み換え発現、単離、リフォールディング及び補欠分子族、例えばＦＡＤの導入のための方法を知っている。本発明の実施例において、配列番号７の組み換え発現は、配列番号８を含有するポリペプチドを得るために説明されている。組み換え発現のための有利な宿主細胞は、真核性の又は原核性の宿主細胞であり、例えば酵母細胞又は細菌細胞、特にグラム陰性細菌細胞、例えばＥ．コリである。
【００５６】
本発明のコンジュゲートの調製のための方法は、更に、補酵素、例えばＦＡＤを、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ中に導入することを含んでよい。
【００５７】
本発明のコンジュゲートの調製のための方法の工程（ｂ）は、少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を、工程（ａ）で得られるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼにカップリングすることを指す。工程（ｂ）でのペグ化は、当業者に公知の標準的な手法により実施されてよい。
【００５８】
工程（ｂ）において、重量平均分子量が約１０００ダルトン〜約１００００ダルトン、有利には約３０００ダルトン〜約８０００ダルトン、より有利には約４０００ダルトン〜約６０００ダルトン、更により有利には約４５００ダルトン〜約５５００ダルトン、最も有利には約５０００ダルトンを有するポリエチレングリコールが使用されてよい。
【００５９】
このポリエチレングリコール残基は、連結基（スクシンアミド基、有利にはスクシンイミジルスクシナートであってよい）を介して共有結合されてよい。他の連結基も使用されてよい。当業者は、適した連結基を知っている。
【００６０】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼにリシン残基を介して共有結合していることが有利である。リシンへのカップリングは、スクシンイミド連結基を適用することにより実施されることができる。カップリングは、官能基、例えばカルボキシラーゼ基、アミノ基、チオール基又は／及びヒドロキシ基を有する他のアミノ酸側鎖、例えばアスパルギン酸又はグルタミン酸に対して実施されてもよい。
【００６１】
１〜約３０ポリエチレングリコール残基、有利には１〜約２０ポリエチレングリコール残基、より有利には１〜約１０ポリエチレングリコール残基を含有する本発明のコンジュゲートを供給するためには、工程（ｂ）において過剰量のポリエチレングリコールを使用してよい。ポリエチレングリコールは、カップリングに使用できる遊離の残基の数、例えば遊離のリシン残基に関して約１０〜約５００当量、有利には約１０〜約５０当量の量で、提供されてよい。特に、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約２００、又は約５００当量のポリエチレングリコールが使用されてよい。５０当量を超えると、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ分子につき約１０ＰＥＧ分子のカップリングを生じてよい。
【００６２】
また更なる本発明の観点は、本発明のコンジュゲートを、場合により、医薬的に許容可能な担体、助剤、希釈剤又は／及び添加剤と一緒に含有する医薬組成物である。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、活性酸素種又は／及びアンモニウムに対して応答性の、又は／及び血漿アミノ酸レベル、特に血漿リシン又は／及びアルギニンレベルの調節に対して応答性の疾病の予防、緩和又は／及び治療のために適して良い。本発明の医薬組成物は、また、微生物感染、ウィルス感染、例えばＨＩＶ、Ｂ型又は／及びＣ型肝炎ウィルス感染、及び増殖性疾病、例えば癌から選択される疾病の予防、緩和、又は／及び治療に適していても良い。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、一般的な充実性腫瘍及び白血病、例えばアポトーシス抵抗性及び多剤抵抗性の癌の形態の治療のために適する。
【００６５】
本発明の医薬組成物で治療すべき増殖性疾病は、肺癌、ＭＤＲ肺癌、頭部及び頸部癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、子宮頸部癌、子宮癌、喉頭癌、胃癌、肝臓癌、ユーイング肉腫、急性リンパ性白血病、急性及び慢性の骨髄性白血病、アポトーシス抵抗性白血病、膵癌、腎臓癌、膠腫、メラノーマ、慢性リンパ球白血病、又は／及びリンパ腫であってよい。
【００６６】
本発明のまた更なる観点は、本発明のコンジュゲート又は／及び本発明の医薬組成物の有効量をこれを必要とする被験体に投与することを含む、活性酸素種、アンモニウムに応答性の、又は／及び体液中のアミノ酸レベル、特に血漿リシン又は／及びアルギニンレベルの調節に応答性の疾病の、予防、緩和又は／及び治療のための方法である。この方法により治療されるべき疾病は、特に、微生物感染、ウィルス感染又は／及び増殖性疾病、例えば上記で定義した疾病である。
【００６７】
本発明のまた更なる観点は、本発明のコンジュゲート又は／及び本発明の医薬組成物を含有するキットである。
【００６８】
本発明のまた更なる観点は、少なくとも１つのポリエチレングリコール残基をアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結させることを含む、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼの酵素活性又は／及び循環時間を促進させるための方法を指す。この方法において、このアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、特に、上記で定義したとおりのアルギニン／リシンオキシドレダクターゼであってよい。このポリエチレングリコール残基は、上記で定義したとおりであってよい。
【００６９】
また更なる本発明の観点は、少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結することを含む、体液、例えば血液血漿中で不活性化からアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを保護するための方法である。この方法において、このアルギニン／リシンオキシドレダクターゼは、特に、上記で定義したとおりのアルギニン／リシンオキシドレダクターゼであってよい。このポリエチレングリコール残基は、上記で定義したとおりであってよい。特に、体液中の不活性化は、抗体による不活性化であってよい。
【００７０】
ＰＥＧ基、特に本願明細書で定義したとおりのＰＥＧ基は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、特に本願明細書で定義されるとおりのアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの酵素活性又は／及び循環時間を促進するために使用されてよい。
【００７１】
ＰＥＧ基、特に本願明細書で定義されるとおりのＰＥＧ基は、体液、例えば血液血漿中での不活性化に対して、特に抗体による不活性化に対して、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、特に本願明細書で定義されるとおりのアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの保護のために使用されてよい。
【００７２】
本願明細書で定義されるとおりの本発明のコンジュゲート又は／及び本願明細書で定義されるとおりの本発明の医薬組成物は、液体中でのリシン又は／及びアルギニンの枯渇のために又は／及び過酸化水素、アンモニウム又は／及びリシン又は／及びアルギニンの代謝産物の液体中での産生のために使用されてよい。この液体はとくに哺乳類の体液であってよい。
【００７３】
本発明は、更に、以下の実施例及び図において実証され、これらは説明の目的のためのものであり、かつ、本発明の範囲を限定する意図はない。
図の説明
図１：アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴの１次アミノ酸配列（配列番号８）及びそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）
図２：アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴのＰＥＧ−５０００でのペグ化
図３：抗ＡＰＩＴポリクローナル抗体の存在下でのＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの活性
図４：マウス中での血漿リシンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＡＰＩＴ（１０００Ｕ／ｋｇ）の単一経静脈投与の効果
図５：マウス中での血漿アルギニンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＡＰＩＴ（１０００Ｕ／ｋｇ）の単一経静脈投与の効果
図６：マウス中での血漿リシンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの等価の用量２５０Ｕ／ｋｇの単一経静脈投与の比較
図７：マウス中での血漿アルギニンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの等価の用量２５０Ｕ／ｋｇの単一経静脈投与の比較
図８：マウスに対するＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの単一経静脈投与後の血漿リシンレベルの用量依存性の枯渇
図９：マウスに対するＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの単一経静脈投与後の血漿アルギニンレベルの用量依存性の枯渇
図１０：ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの抗腫瘍効力
図１１：Aplysia punctataのインクから単離されるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１、３及び５）及び得られるアミノ酸配列（配列番号２、４及び６）。このジヌクレオチド結合フォールド（２８アミノ酸残基）及びＧＣモチーフ（８アミノ酸残基）が四角により示される。
【００７４】
実施例
実施例１
Ｅ．コリ中での組み換えアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴの大量製造方法
５０００ｍｌ培地を有するB-Braun Biostat B10発酵槽を、適したプロモーター（例えばＴ７）の制御下の配列番号７を含有するＡＰＩＴｃＤＮＡを含有するワーキングセルスターター培養液（working cell starter culture）で接種する。細胞を、光学密度６〜８（６００ｎｍで）にまで、３７±０．５℃で成長させる。引き続き、この細胞を、ＩＰＴＧの添加により誘導し、更に、更なる３時間３７±０．５℃で発酵させる。この後で、細胞を、遠心分離を介して収穫し、かつ、≦−６０℃で貯蔵する。この再懸濁された細胞を、フレンチプレスを用いて破砕し、かつ、この封入体を遠心分離により上清から分離する。この封入体を、≦−６０℃で更なる処理のために貯蔵する。ＡＰＩＴを、Ｅ．コリバイオマスの封入体から尿素で単離する。この可溶化されたタンパク質を再フォールディングさせ、濃縮し、ＴＦＦ（Tangential Crossflow Filtration）により脱塩する。引き続き、ＡＰＩＴを、アニオン交換クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により精製する。
【００７５】
封入体からのＡＰＩＴの単離：
このペレットを、２回連続して洗浄バッファー中で再懸濁し、ついでＮａＣｌ洗浄緩衝液及び尿素洗浄緩衝液中で再懸濁する。この懸濁液を、引き続きそれぞれの再懸濁工程後に遠心分離し、その一方でこの残りの上清を廃棄する。この後で、このペレットを、最後の遠心分離工程の後に再懸濁緩衝液中で再懸濁する。この上清を、０．２μｍを介して濾過し、かつ、この（ＡＰＩＴ含有）溶液を、＜−１５℃で凍結貯蔵する。
【００７６】
リフォールディング：
この方法工程を、室温（２２〜２５℃）で実施する。Ｅ．コリから単離されたＡＰＩＴ２００ｍｌ（再懸濁緩衝液中）を、２００ｍｌのグアニジン−ＨＣｌと混合する。この混合物を次いで、ポンプを用いて、Ｌ−アルギニン及びＦＡＤを含有する２０Ｌのリフォールディング緩衝液中に注入する。この混合／希釈工程は、（最大の活性のある）マグネットスターターを用いて支持される。この希釈を、４つの注入部位を介して実現する。
【００７７】
ＴＦＦによる精製：
ＲＦ混合物を、ＴＦＦ（０．２μｍ）を用いて濾過し、フォールディングされていないタンパク質を分離する。この後で、この系を、１．６Ｌのトリス緩衝液で洗浄する。ＡＰＩＴを、１０ｋＤａの膜を用いて濃縮する。この後で、ＲＦ緩衝液を、トリス緩衝液に対して透析する。この工程の間に、ＲＦ混合物及びトリス緩衝された混合物の伝導性を測定する。この１０ｋＤａ膜を、緩衝液を変更するため、そして、この濃縮工程を継続するために維持する。濃縮されたＡＰＩＴ溶液中での導電性の減少のレベルは、この手法の継続時間を示す。
【００７８】
アニオン交換クロマトグラフィ：
ＡＰＩＴ含有試料を更に、アニオン交換クロマトグラフィにより更に精製する（SOURCE 30Qカラム）。この生成物のカラムからの溶出を、塩勾配（０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて、ｐＨ８．０で実施する。この溶出物を分画で回収する。
【００７９】
サイズ排除クロマトグラフィ：
ＡＰＩＴ含有試料を、サイズ排除クロマトグラフィ（Sephadex G25）を用いて脱塩する。この精製はＤ−ＰＢＳを用いて生じる。この溶出された生成物を分画で回収する。
【００８０】
充填及び貯蔵：
大量生産物の充填は滅菌したＰＥ容器中で、容積１０００μｌであり、２−８℃で貯蔵する。組み換えＡＰＩＴの１次アミノ酸配列は図１中に示される。
【００８１】
実施例２
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴの、ＰＥＧ−５０００でのペグ化
精製したアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、実施例１からのＡＰＩＴを、HiPrep Desalting 26/10カラムで脱塩し、かつ、５０ｍＭの重炭酸ナトリウムを含有する、ｐＨ９．５のペグ化反応緩衝液中に導入する。このペグ化反応を、線状の多分散性ポリエチレングリコールスクシンイミジルエステル、ＭＷ５０００Ｄａ（PEG-5000-SS）を、１０〜５０当量（ｅｑ）のＰＥＧ５０００−ＳＳ対アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ（ＡＰＩＴ中の遊離のリシン残基に基づき）の異なる比で添加し、１時間８００ｒｐｍで２５℃で撹拌することにより実施する。このＰＥＧコンジュゲートしたアルギニン／リシンオキシドレダクターゼ変形、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（１０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（２０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（４０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（５０ｅｑ）を個々に、ゲル濾過により、反応生成物及びコンジュゲートしていないＰＥＧ剤から精製し、かつ、この緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝化した食塩水（ｐＨ７）に対して交換された。最終産物を、ＳＤＳページ上で、酵素活性について分析した（図２）。５０ｅｑＰＥＧの過剰量は、約１０分子のＰＥＧを１つの分子のＡＰＩＴへのカップリングを生じた。
【００８２】
図２は、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴが、６０ｋｄａ〜＞２１２ｋＤａの範囲内の明らかな分子量を有したことを示す。全てのＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ変形は、コンジュゲートしていないＡＰＩＴに比較して酵素活性があった。ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（１０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（３０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（４０ｅｑ）、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（５０ｅｑ）の相対的な酵素活性は、５８％〜７２％であった。
【００８３】
実施例３
抗ＡＰＩＴポリクローナル抗体の存在下での活性
ＡＰＩＴに対する高力価（＞１：２０００００）ポリクローナル抗体血清をウサギ中で製造した。ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴが、ＡＰＩＴに対する抗体により不活性化されるかどうかを検査するために、免疫前のウサギ血清及び抗ＡＰＩＴウサギ免疫血清を、１時間３７℃でＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴでインキュべーションし、その後にリシン及びアルギニンに関してアミノ酸レベルを分析する。図３は、リシン及びアルギニンレベルが、ウサギの免疫前のウサギ血清及び抗ＡＰＩＴウサギ免疫血清中で通常であったことを示す（リシン：２３８μＭ及び２６５μＭ、それぞれ；アルギニン２０７μＭ及び１７９μＭ、それぞれ）。ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴでのインキュベーションは、リシン及びアルギニンのレベル０μＭを両者で生じ、免疫前のウサギ血清及び抗ＡＰＩＴウサギ免疫血清は、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴが、抗ＡＰＩＴポリクローナル抗体の存在下で酵素活性があり、かつ、リシン及びアルギニンの液体中での完全な枯渇を可能にすることを実証する。
【００８４】
実施例４
マウスに対する適用
マウスは、コンジュゲートしていないＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ又は１０００Ｕ／ｋｇ）又はＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ、７９Ｕ／ｋｇ、１１Ｕ／ｋｇ、２Ｕ／ｋｇ、０．６Ｕ／ｋｇ）又はＤ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）それぞれの単一の静脈投与を受けた（尾の静脈）。連続的な血液試料を、眼窩静脈叢（orbital sinus）を介してエーテル麻酔下での、−１時間の予備投与、及び、示した時間点で後投与でのそれぞれの動物から回収し、かつ、抗凝集物（ヘパリン）を含有する管中に移した。それぞれの血液試料を、４℃で遠心分離して、血漿アミノ酸レベルの分析のために血漿を準備する。
【００８５】
アミノ酸分析のためには、２５μｌのヘパリン血漿試料を、スルホサリチル酸を含有する４μｌの沈殿緩衝液と混合した。次いで、内部標準ノルロイシン（Ｎｌｅ、ｃ：１ｎｍｏｌ／μｌ）を含有する６μｌの試料希釈緩衝液を添加し、この試料を終容積６０μｌに、試料希釈緩衝液で充填した。この後に、試料を混合し（Vortex）かつ遠心分離した。この上清を、遠心分離により遠心分離フィルターを通過させた。この遠心分離物を試料バイアル中に移し、アミノ酸分析機Ａ２００を用いて、生理的プログラムを用いて分析した。
【００８６】
図４及び図５は、単一静脈用量２５０Ｕ／ｋｇ及び１０００Ｕ／ｋｇでのＡＰＩＴの、それぞれの、血漿アルギニン又は血漿リシンレベルに対する、マウスに対する作用を示す。ＡＰＩＴ用量の２５０Ｕ／ｋｇから１０００Ｕ／ｋｇへの４倍の増加は、３時間から６時間の投与後のリシン又はアルギニンの枯渇の延長化を生じる。
【００８７】
図６及び７は、コンジュゲートしていないＡＰＩＴ及びＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの、２５０Ｕ／ｋｇの単一静脈用量での作用の直接的な比較を示す。コンジュゲートしていないＡＰＩＴが、リシン（図６）及びアルギニン（図７）の枯渇を、投与後３時間だけ媒介する一方で、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴは、投与後少なくとも４８時間両方のアミノ酸を枯渇させた。
【００８８】
異なる用量のＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴのマウスに対する単一の静脈投与後のリシン及びアルギニン血漿レベルは、図８及び９中にそれぞれ示されている。
【００８９】
図８は、１１ユニット／ｋｇ又は２５Ｕ／ｋｇ又は７９Ｕ／ｋｇのＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの単一の静脈用量が、完全にマウス中での血漿リシンレベルを枯渇させることを示す。０．６Ｕ／ｋｇ又は２Ｕ／ｋｇの用量はまだなお、６時間のマウス中でのリシンの完全な枯渇を媒介し、これは、１０００Ｕ／ｋｇのコンジュゲートしていないＡＰＩＴの効果である。図９は、単一の静脈用量７９ユニット／ｋｇのＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴが完全にマウス中で血漿アルギンレベルを枯渇させることを示す。２５Ｕ／ｋｇ又は１１Ｕ／ｋｇの用量は、２４時間のマウス中でのアルギニンの完全な枯渇を媒介する。０．６Ｕ／ｋｇ又は２Ｕ／ｋｇの用量はまだなお、６時間のマウス中でのアルギニンの完全な枯渇を媒介し、これは、コンジュゲートしていないＡＰＩＴの１０００Ｕ／ｋｇの効果である。
【００９０】
これらを一緒に考慮すると、図８及び図９中に示されるこの予期せぬ発見は、コンジュゲートしていないＡＰＩＴ用量に比較して０．１％未満のＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴが、哺乳類中でのリシン及びアルギニンレベルに対する等価の効果を媒介することを示す。
【００９１】
図５：ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの抗腫瘍効力
ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの抗腫瘍効力を、コンジュゲートしていないＡＰＩＴに比較して、ＭＴＴアッセイによりＡ５４９肺癌細胞に対して評価した。このＭＴＴアッセイは、代謝活性のある細胞による、黄色のテトラゾリウム塩のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の、紫色のホルマゾン結晶への分解を基礎とする。腫瘍細胞を９６ウェル培養プレート上に播種し、ＡＰＩＴ又はＰＥＧ−５０００−ＡＰＴＩを更なる９６時間添加する前に、この培養中で２４時間維持した。処置後に、２０μｌのＭＴＴラベル化剤を、それぞれのウェル及びプレートに添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベーシした。ＭＴＴインキュベーション後に、この培養をＤＭＳＯでもってインキュベーションし、かつ、この試料の吸光分析による吸光を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて５５０ｎｍの波長で検出した。この結果を、試験物質濃度に対してプロットし、用量応答曲線を得る。代謝活性の５０％阻害を生じるこの試験物質濃度（ＩＣ５０）を、グラフにより決定し、かつ、図１０中で、コンジュゲートしていないＡＰＩＴ又はＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴに対して示す。意外にも、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴのＩＣ５０は、Ａ５４９細胞に対してコンジュゲートしていないＡＰＩＴ（７１７μＵ／ｍＬ）でのＩＣ５０よりも低く（６３３μＵ／ｍＬ）、コンジュゲートしていないＡＰＩＴに比較してＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴのより高い抗腫瘍作用を示す。
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴの１次アミノ酸配列（配列番号８）及びそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図である。
【図２】図２は、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ、ＡＰＩＴのＰＥＧ−５０００でのペグ化を示す図である。
【図３】図３は、抗ＡＰＩＴポリクローナル抗体の存在下でのＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの活性を示す図である。
【図４】図４は、マウス中での血漿リシンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＡＰＩＴ（１０００Ｕ／ｋｇ）の単一経静脈投与の効果を示す図である。
【図５】図５は、マウス中での血漿アルギニンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＡＰＩＴ（１０００Ｕ／ｋｇ）の単一経静脈投与の効果を示す図である。
【図６】図６は、マウス中での血漿リシンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの等価の用量２５０Ｕ／ｋｇの単一経静脈投与の比較を示す図である。
【図７】図７は、マウス中での血漿アルギニンレベルに対するＡＰＩＴ（２５０Ｕ／ｋｇ）及びＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの等価の用量２５０Ｕ／ｋｇの単一経静脈投与の比較を示す図である。
【図８】図８は、マウスに対するＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの単一経静脈投与後の血漿リシンレベルの用量依存性の枯渇を示す図である。
【図９】図９は、マウスに対するＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの単一経静脈投与後の血漿アルギニンレベルの用量依存性の枯渇を示す図である。
【図１０】図１０は、ＰＥＧ−５０００−ＡＰＩＴの抗腫瘍効力を示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Aplysia punctataのインクから単離されるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１、３及び５）及び得られるアミノ酸配列（配列番号２、４及び６）を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Aplysia punctataのインクから単離されるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１、３及び５）及び得られるアミノ酸配列（配列番号２、４及び６）を示す図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、Aplysia punctataのインクから単離されるアルギニン／リシンオキシドレダクターゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１、３及び５）及び得られるアミノ酸配列（配列番号２、４及び６）を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ及び少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を含有するコンジュゲート。
【請求項２】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、約１０００ダルトン〜約１００００ダルトンの重量平均分子量を有する請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結基を介して共有結合している、請求項１又は２記載のコンジュゲート。
【請求項４】
連結基がスクシンイミド基である、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項５】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼにリシン残基を介して連結している、請求項１から４までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項６】
１〜約３０、有利には１〜約１０つのポリエチレングリコール残基を含有する、請求項１から５までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項７】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼがＬ−アルギニン／Ｌ−リシンオキシドレダクターゼである、請求項１から６までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項８】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼが天然源から単離されている、請求項１から７までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項９】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼが、組み換えアルギニン／リシンオキシドレダクターゼである、請求項１から８までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼが、
（ａ）配列番号２、４、６又は／及び８の配列、
（ｂ）少なくとも７０％配列（ａ）と同一である配列、又は／及び
（ｃ）（ａ）又は／及び（ｂ）の断片
を含有する、請求項１から９までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
断片が、少なくとも約３０アミノ酸残基の長さを有する、請求項１０記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
少なくとも６時間の間循環中で活性がある、請求項１から１１までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
ポリエチレングリコール残基を有しないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの活性よりも少なくとも３０倍より高い活性を有する、請求項１から１２までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか１項記載のコンジュゲートを、場合により、医薬的に許容可能な担体、助剤、希釈剤又は／及び添加剤と一緒に含有する、医薬組成物。
【請求項１５】
活性酸素種又は／及びアンモニウムに応答性の、又は／及び血漿アミノ酸レベル、特に血漿リシン又は／及びアルギニンレベルの調節に応答性の疾病の予防、緩和又は／及び治療のための、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
微生物感染、ウィルス感染及び増殖性疾病、例えば癌から選択される疾病の予防、緩和又は／及び治療のための、請求項１４又は１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１から１３までのいずれか１項記載のコンジュゲート又は／及び請求項１４から１６までのいずれか１項記載の医薬組成物の有効量をこれを必要とする被験体に投与することを含む、活性酸素種、アンモニウムに対して応答性の、又は／及び体液中のアミノ酸レベル、特に血漿リシン又は／及びアルギニンレベルの調節に応答性の疾病の、予防、緩和又は／及び治療のための方法。
【請求項１８】
（ａ）アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを組み換えにより発現する、又は／及び、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを天然源から単離する工程、
（ｂ）少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を、（ａ）のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結する工程を含む、請求項１から１３までのいずれか１項記載のコンジュゲートを製造する方法。
【請求項１９】
工程（ａ）が、
（ｉ）配列番号１、３、５又は／及び７の配列、
（ｉｉ）配列（ｉ）に相補的な配列、
（ｉｉｉ）配列（ｉ）又は（ｉｉ）の遺伝暗号の縮重の範囲内の配列、
（ｉｖ）配列（ｉ）、（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）に対して少なくとも７０％同一である配列、
（ｖ）配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は／及び（ｉｖ）のいずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列、又は／及び
（ｖｉ）配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は／及び（ｖ）のいずれかの配列の断片
を含む核酸の組み換え発現を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
断片が、少なくとも約９０ヌクレオチド残基の長さを有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から１３までのいずれか１項記載のコンジュゲート又は／及び請求項１４から１６までのいずれか１項記載の医薬組成物を含有する、キット。
【請求項２２】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基をアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結させることを含む、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼの酵素活性又は／及び循環時間を促進させるための方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基をアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結させることを含む、体液中での不活性化に対してアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを保護するための方法。
【請求項２４】
ポリエチレングリコール残基が、請求項３から７までのいずれか１項記載のとおりである、請求項２２又は２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項１から１３までのいずれか１項記載のコンジュゲート又は／及び請求項１４から１６までのいずれか１項記載の医薬組成物の、リシン又は／及びアルギニンの液体中での枯渇のための又は／及び過酸化水素、アンモニウム又は／及びリシン又は／及びアルギニンの代謝産物の液体中での産生のための使用。
【請求項２６】
液体が哺乳類の体液である、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼの活性又は／及び循環時間の増加のための、少なくとも１つのポリエチレングリコール基の使用。
【請求項２８】
体液中での不活性化に対して、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを保護するための、少なくとも１つのポリエチレングリコール基の使用。
【請求項１】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼ及び少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を含有するコンジュゲート。
【請求項２】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、約１０００ダルトン〜約１００００ダルトンの重量平均分子量を有する請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結基を介して共有結合している、請求項１又は２記載のコンジュゲート。
【請求項４】
連結基がスクシンイミド基である、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項５】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基が、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼにリシン残基を介して連結している、請求項１から４までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項６】
１〜約３０、有利には１〜約１０つのポリエチレングリコール残基を含有する、請求項１から５までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項７】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼがＬ−アルギニン／Ｌ−リシンオキシドレダクターゼである、請求項１から６までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項８】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼが天然源から単離されている、請求項１から７までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項９】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼが、組み換えアルギニン／リシンオキシドレダクターゼである、請求項１から８までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼが、
（ａ）配列番号２、４、６又は／及び８の配列、
（ｂ）少なくとも７０％配列（ａ）と同一である配列、又は／及び
（ｃ）（ａ）又は／及び（ｂ）の断片
を含有する、請求項１から９までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
断片が、少なくとも約３０アミノ酸残基の長さを有する、請求項１０記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
少なくとも６時間の間循環中で活性がある、請求項１から１１までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
ポリエチレングリコール残基を有しないアルギニン／リシンオキシドレダクターゼの活性よりも少なくとも３０倍より高い活性を有する、請求項１から１２までのいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか１項記載のコンジュゲートを、場合により、医薬的に許容可能な担体、助剤、希釈剤又は／及び添加剤と一緒に含有する、医薬組成物。
【請求項１５】
活性酸素種又は／及びアンモニウムに応答性の、又は／及び血漿アミノ酸レベル、特に血漿リシン又は／及びアルギニンレベルの調節に応答性の疾病の予防、緩和又は／及び治療のための、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
微生物感染、ウィルス感染及び増殖性疾病、例えば癌から選択される疾病の予防、緩和又は／及び治療のための、請求項１４又は１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１から１３までのいずれか１項記載のコンジュゲート又は／及び請求項１４から１６までのいずれか１項記載の医薬組成物の有効量をこれを必要とする被験体に投与することを含む、活性酸素種、アンモニウムに対して応答性の、又は／及び体液中のアミノ酸レベル、特に血漿リシン又は／及びアルギニンレベルの調節に応答性の疾病の、予防、緩和又は／及び治療のための方法。
【請求項１８】
（ａ）アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを組み換えにより発現する、又は／及び、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを天然源から単離する工程、
（ｂ）少なくとも１つのポリエチレングリコール残基を、（ａ）のアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結する工程を含む、請求項１から１３までのいずれか１項記載のコンジュゲートを製造する方法。
【請求項１９】
工程（ａ）が、
（ｉ）配列番号１、３、５又は／及び７の配列、
（ｉｉ）配列（ｉ）に相補的な配列、
（ｉｉｉ）配列（ｉ）又は（ｉｉ）の遺伝暗号の縮重の範囲内の配列、
（ｉｖ）配列（ｉ）、（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）に対して少なくとも７０％同一である配列、
（ｖ）配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は／及び（ｉｖ）のいずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列、又は／及び
（ｖｉ）配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は／及び（ｖ）のいずれかの配列の断片
を含む核酸の組み換え発現を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
断片が、少なくとも約９０ヌクレオチド残基の長さを有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から１３までのいずれか１項記載のコンジュゲート又は／及び請求項１４から１６までのいずれか１項記載の医薬組成物を含有する、キット。
【請求項２２】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基をアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結させることを含む、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼの酵素活性又は／及び循環時間を促進させるための方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのポリエチレングリコール残基をアルギニン／リシンオキシドレダクターゼに連結させることを含む、体液中での不活性化に対してアルギニン／リシンオキシドレダクターゼを保護するための方法。
【請求項２４】
ポリエチレングリコール残基が、請求項３から７までのいずれか１項記載のとおりである、請求項２２又は２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項１から１３までのいずれか１項記載のコンジュゲート又は／及び請求項１４から１６までのいずれか１項記載の医薬組成物の、リシン又は／及びアルギニンの液体中での枯渇のための又は／及び過酸化水素、アンモニウム又は／及びリシン又は／及びアルギニンの代謝産物の液体中での産生のための使用。
【請求項２６】
液体が哺乳類の体液である、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
アルギニン／リシンオキシドレダクターゼの活性又は／及び循環時間の増加のための、少なくとも１つのポリエチレングリコール基の使用。
【請求項２８】
体液中での不活性化に対して、アルギニン／リシンオキシドレダクターゼを保護するための、少なくとも１つのポリエチレングリコール基の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【公表番号】特表２００９−５３８１５０（Ｐ２００９−５３８１５０Ａ）
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１２４６４（Ｐ２００９−５１２４６４）
【出願日】平成１９年５月２３日（２００７．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００４５８７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３７７５５
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３４９３８８）アーペーイーテー ラボラトリーズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＩＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｒｍａｎｎｓｗｅｒｄｅｒ １６， Ｄ−１４４７３ Ｐｏｔｓｄａｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２３日（２００７．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００４５８７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３７７５５
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３４９３８８）アーペーイーテー ラボラトリーズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＩＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｒｍａｎｎｓｗｅｒｄｅｒ １６， Ｄ−１４４７３ Ｐｏｔｓｄａｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]