ＰＧＨＳ−２のトランスアクチベーター活性のインヒビター
プロスタグランジン−エンドペルオキシドＨシンターゼ（ＰＧＨＳ−２）は、アラキドン酸をプロスタグランジンＨ２に変換する。ＰＧＨＳ−２は、殆どの正常ヒト組織内では検出されないが、癌細胞内には豊富に存在する誘導可能な遺伝子産物である。本発明は、その確立した酵素的役割とは異なる、ＰＧＨＳ−２の未だに開示されていない転写機能を利用して、癌の処置に有用な潜在的治療薬を同定する。本方法は、試験化合物の存在下及び非存在下で、ＰＧＨＳ−２プロモーターのＣ／ＥＢＰ、ＣＲＥ及びＮＦ−κＢ領域に結合するＰＧＨＳ−２タンパク質を評価して、ＰＧＨＳ−２トランス活性化活性のインヒビターを同定する、ＤＮＡ結合アッセイからなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＰＧＨＳ−２のトランス活性化機能のインヒビターに関し、より詳細には、ＰＧＨＳ−２トランス活性化のインヒビターをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロスタグランジン−エンドペルオキシドＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）は、プロスタグランジンの産生における律速酵素である（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＰＧＨＳは、アラキドン酸のプロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）への環状酸化と、ＰＧＧ２のプロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）への還元を触媒する。次に、ＰＧＨ２は、種々のシンターゼによって、プロスタグランジンＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α及びＰＧＩ２、並びにトロンボキサン（ＴＸＡ２）をはじめとする種々の機能的プロスタノイドに代謝される（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ ＤｅＷｉｔｔ，１９９６）。ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２は、それぞれヒト第９染色体及び第１染色体にマッピングされている単一のコピー遺伝子である（Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｆｕｎｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＰＧＨＳ−１は、殆どの組織内で構成的に発現されている（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，２０００）。対照的に、ＰＧＨＳ−２は、非悪性の細胞内で、サイトカイン及び炎症刺激により高度に誘導可能な即時型初期応答遺伝子である（Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９９；Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＰＧＨＳ−２は、ＤＮＡ配列、そのｍＲＮＡの安定性、及び種々の刺激に対する応答の点で、ＰＧＨＳ−１とは区別される。
【０００３】
しかしながら、多数の癌細胞株及び癌組織内で、ＰＧＨＳ−２は構成的に発現されている（Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。腫瘍細胞生物学におけるＰＧＨＳ−２の重要性は、腫瘍成長を支持するＰＧＥ２及びＰＧＩ２の、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に依存した血管新生活性によるところもあった（Ｇａｔｅｌｙ ａｎｄ Ｌｉ，２００４）。小胞体及び核エンベロープ内の通常のプロスタグランジン合成工場から隔離された、ＰＧＨＳ−２のカベオリン−１との共局在化及び相互作用は、腫瘍形成及び炎症に寄与する場合がある（Ｌｉｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＰＧＥ２は、アポトーシス及び免疫監視を阻害することもでき（Ｈｏｓｈｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｉｓｈａｑｕｅ，ｅｔ ａｌ．，２００３）、又ＰＧＥ２は、その発現がヒト胃癌細胞増殖及び発癌に関連する場合がある特定のＤＮＡ修復タンパク質（Ｋｕ７０及びＫｕ８０）を誘導する（Ｌｉｍ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【０００４】
ＰＧＨＳ−２の発現は、比較的低分化且つ高悪性度の乳癌に関連することから、有用な予後の組織指標であり、且つ薬物療法のための標的となる場合がある（Ｗｕｌｆｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＰＧＨＳ−２の過剰発現は、４０％を超えるヒト浸潤性乳癌及び６０％を超える非浸潤性乳管癌内で生じることが報告されている（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｄｕｂｏｉｓ，２００４）。ＰＧＨＳ−２を実験的に過剰発現させると多剤耐性遺伝子１の発現が増大することから、ＰＧＨＳ−２が腫瘍内の多剤耐性に寄与することが示唆されている（Ｐａｔｅｌ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。更に、Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈ，ｅｔ ａｌ． （２００２）には、ＰＧＨＳ−２の高発現が、Ｒａｓシグナルの増強を介した乳癌内におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現に関連していることが示されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明者等は、腫瘍細胞の細胞核内にＰＧＨＳ−２タンパク質は存在するものの、ＰＧＨＳ−１は存在しないことを報告し、ＰＧＨＳ−２は、それ自体の遺伝子のプロモーター領域に結合して、トランス活性化因子として機能し得ることを本明細書に示す。又、本発明者等は、この直接的な正のフィードバック機序が、癌細胞内におけるＰＧＨＳ−２の構成的な発現に寄与することを提案する。従って、本発明は、ＰＧＨＳ−１のインヒビターに関連した有害な副作用を有さない、癌の処置において治療薬として使用し得る、ＰＧＨＳ−２のトランス活性化因子機能の選択的インヒビターをスクリーニングする方法を提供する。
【０００６】
従って、一態様において、本発明は、そのトランス活性化活性の阻害による、構成的なＰＧＨＳ−２発現のインヒビターを同定するための方法であって、ＰＧＨＳ−２又はＭＤＭ２プロモーターの少なくとも１つの領域に対応する核酸プローブと、ＰＧＨＳ−２タンパク質とを試験化合物の存在下又は非存在下で接触させる工程、ＰＧＨＳ−２タンパク質と該プロモーターの結合レベルを測定する工程を包含する方法に関する。前記試験化合物の非存在下で結合したタンパク質の量に比べて、前記試験化合物の存在下で結合したタンパク質の量の減少が、該化合物がＰＧＨＳ−２トランス活性化活性の潜在的インヒビターであることを示す。
【０００７】
一実施形態において、結合レベルは、ＤＮＡ−タンパク質結合アッセイ、例えばクロマチン免疫沈降アッセイ又は電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）により測定される。
【０００８】
一実施形態において、核酸プローブは、ＰＧＨＳ−２プロモーターの一領域：即ち、ｃ／ＥＢＰ部位、ＣＲＥ部位、又はＮＦ−κＢ部位に対応しており、このプローブは標識されている。
【０００９】
一実施形態において、核酸プローブはビオチン化され、ストレプトアビジン被覆ビーズと共にインキュベートされることによって、該プローブに結合した核抽出物タンパク質を単離した後、ビーズから溶離することができる。
【００１０】
関連する態様において、本発明は、ＰＧＨＳ−２インヒビターをスクリーニングする方法であって、ＰＧＨＳ−２を構成的に生成する細胞（該細胞は、ＰＧＨＳ−２プロモーターの一領域に対応する第一の核酸、及びレポーター分子をコードする第二の核酸でトランスフェクトされている）を得る工程；該細胞を試験化合物に曝露する工程；該細胞から核抽出物を単離する工程；前記抽出物中のレポーター分子のレベルを、曝露していない細胞に由来する前記抽出物中のレポーター分子のレベルと比較する工程を包含し、レポーター分子のレベルの低下が、ＰＧＨＳ−２のトランス活性化の阻害を示す、方法に関する。レポーター分子は、例えばルシフェラーゼ又は緑色蛍光タンパク質である場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
癌細胞株内におけるＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の細胞内位置
ＰＧＨＳアイソフォームの細胞内局在化に関して行われた以前の試験では、ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２が何れも線維芽細胞及びマクロファージの小胞体及び核エンベロープ内に見出され、これらの２つのアイソザイムの細胞内分布に実質的な違いがないことが示されている（Ｍｏｒｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８１；Ｒｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｋｕｊｕｂｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９３）。目下の試験において、本発明者等は、ヒト前立腺（ＤＵＩ４５）及び頭頸部（ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ）癌細胞内におけるＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の分布を比較した。図１は、ＰＧＨＳ−１又はＰＧＨＳ−２に特異的な一次抗体を使用して間接免疫蛍光にて染色した癌細胞の共焦点顕微鏡写真である。ＰＧＨＳ−１の免疫反応性は、細胞質の周辺部に均一に分布していた。ＰＧＨＳ−１は、多くの細胞の小胞体に存在することが知られてことから、本発明者等が認めたＰＧＨＳ−１の蛍光染色は、小胞体内における酵素の局在化を大きく反映するものであると考えられる。
【００１２】
ＰＧＨＳ−１とは対照的に、癌細胞内のＰＧＨＳ−２は、核エンベロープに集中しており、細胞核内に豊富に存在していた（図１）。癌細胞株の結果を内皮細胞（ＥＣＹ３０４）の結果と比べたところ、ＥＣＹ３０４細胞の細胞質内には免疫反応性が僅かしか見られず、これらの細胞の核エンベロープにも核内にもＰＧＨＳ−２染色は存在しなかった。図１Ｂに示す通り、ＰＧＨＳ−２の蛍光染色（緑色）は、核染色（赤色）と重なっている。一方、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−１の染色は、核染色と重ならなかった。
【００１３】
癌細胞株内における高レベルのＰＧＨＳ−２タンパク質及びｍＲＮＡと、ＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１Ｉ２）及びｐ３８活性の上昇との関係
ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞の分画により得た核タンパク質のウェスタンブロットでは、これらの細胞の核画分中でＰＧＨＳ−２タンパク質が回収されたが、それはＤＵ１４５細胞よりもＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞の方が顕著であることが示されている（図２Ａ）。ＰＧＨＳ−２のｍＲＮＡのレベルも又、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ癌細胞内で容易に検出できることが見出されている（図２Ｂ）。未処理のＥＣＹ３０４細胞内ではＰＧＨＳ−２タンパク質及びｍＲＮＡのレベルを検出できなかった。これらの所見は、細胞内のＰＧＨＳ−２レベルに影響を与え、酵素の核移行を起こす可能性があるサイトカイン又は増殖因子に露出されていない細胞内で見出されたものであることに留意する必要がある（Ｌｉｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＰＧＨＳ−１タンパク質は、頭頸部癌細胞（ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ）、並びにＤＵ１４５前立腺癌及びＥＣＹ３０４内皮細胞内に豊富に存在した（図２Ａ）。
【００１４】
短時間の試験において、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）はタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化し、ＰＧＨＳ−２遺伝子転写を迅速に誘導する（Ｐａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。本明細書で考察する３つの細胞株では、細胞をＰＭＡで処理することで、核内におけるＰＧＨＳ−２ ｍＲＮＡ及びＰＧＨＳ−２タンパク質の存在量が増大し（図２Ａ及び図２Ｂ）、中でもＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内で最も顕著な変化が見られた。ＰＭＡの処理により、細胞質内のＰＧＨＳ−２も上昇した（図２Ａ）。予想通り、癌細胞株をＰＭＡ（１００ｎＭ）で１２時間インキュベートしても、ＰＧＨＳ−１の存在量に影響は見られなかった。
【００１５】
他で明らかになった証拠により、正常な細胞内では、サイトカイン及び増殖因子に応答したＰＧＨＳ−２の上方調節に、ＭＡＰＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢが重要な役割を果たすことが示されている（Ｇｏｐｐｅｌｔ−Ｓｔｒｕｅｂｅ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｔａｉ，１９９８）。従って、本発明者等は、ＭＡＰＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢが、癌細胞内でＰＧＨＳ−２の構成的な発現に関与するか否かを試験した。先ず、コンフルエントなＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞を、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＥＫ）のＭＡＰＫカスケードインヒビターであるＰＤ９８０５９（１０μＭ）により１２時間かけて処理すると、ＰＧＨＳ−２タンパク質が極めて低いレベルに低下した。ｐ３８キナーゼ経路インヒビターであるＳＢ２３０５８、及びＮＦ−κＢのインヒビターであるピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）は、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２の発現を僅かに阻害した（図３Ａ）。ＰＫＣは、本明細書で考察する腫瘍細胞株内におけるＰＧＨＳ−２の構成的な発現に不可欠であり、ＰＭＡがＰＧＨＳ−２のレベルを上昇させることがこの図で示されているが、これらの結果は、ＵＭ ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２の構成的な発現に関与する細胞内シグナリング経路が幾つか存在することを示している。
【００１６】
本発明者等は、ドミナントネガティブなＥＲＫ１及び／又はＥＲＫ２発現プラスミドでＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞をトランスフェクトした。個別では、ｄｎＥＲＫ１もｄｎＥＲＫ２も、ＰＧＨＳ−２の発現に殆ど影響を与えなかった（図３Ｂ）。予想通り、ｄｎＥＲＫ１及びｄｎＥＲＫ２は一緒になると、両アイソフォームのキナーゼ活性を阻害して、ＰＧＨＳ−２の発現を低下させたものの、突然変異ＥＲＫのリン酸化が認められた（図３Ｂ）。この後者の応答は、既にＲｏｂｂｉｎｓ，ｅｔ ａｌ． （１９９２）に記載されている。これらの結果は、前立腺癌細胞内におけるＰＧＨＳ−２の構成的な発現が、ＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢシグナル伝達経路に一部依存することを示唆している。
【００１７】
癌細胞及びＥＣＶ３０４細胞によるＰＧＥ２の生成
前立腺及び頭頸部癌細胞は、非癌性の内皮細胞（ＥＣＶ３０４、１０．１±１．２ｎｇ／ｍＬ）と同様のＰＧＥ２レベル（それぞれ、１２．７±１．３ｎｇ／ｍＬ及び１４．３±１．５ｎｇ／ｍＬ［平均±ＳＤ］）を生成した（図４）。ＰＭＡ（１００ｎＭ）は、幾つかの細胞株内におけるＰＧＥ２の産生を向上させることが他の文献に示されている（Ｈａｂｉｂ，ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｍｏｌｉｎａ−Ｈｏｌｇａｄｏ，ｅｔ ａｌ．，２０００）。しかしながら、目下の試験において、ＰＭＡは、ＤＵ１４５又はＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＥ２の産生を有意に上昇させることはなかった（図４）。ＰＤ９８０５９は、癌細胞内におけるＰＧＥ２の産生を基底レベルにまで低下させ、ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の非特異的インヒビターであるインドメタシンと、ＰＧＨＳ−２の選択的インヒビターであるＮＳ３９８も同様であった。ＰＭＡにより誘導されたＰＧＨＳ−２の発現の上昇により、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＥ２の産生レベルが有意に上昇することはなかったが、ＰＧＥ２の産生は、ＰＧＨＳ−２酵素活性の従来のインヒビターにより下方調節を受けた。
【００１８】
癌細胞株内における核ＰＧＨＳ−２と他の転写活性化因子との関連性
ＰＧＨＳ−２が転写活性を有する核タンパク質と関連することを調べるために、静止状態のＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞で抗体二重染色実験を行い、ｃ−Ｆｏｓ及びＰＧＨＳ−２が細胞核内で共局在化していることを実証した（図５）。又、共免疫沈降アッセイでは、核ＰＧＨＳ−２がＭＤＭ２及び核共活性化因子タンパク質ｐ３００と関連することも示された。ＭＤＭ２は、ｐ５３の代謝回転の決定因子であり、ｐ５３に結合すると、癌遺伝子抑制因子タンパク質の核輸送を促進する（Ｍｏｍａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞をＰＭＡ（１００ｎＭ）で処理すると、核内におけるＰＧＨＳ−２とｃ−Ｆｏｓとの関連性が顕著に増大したが（図５）、ＭＤＭ２又はｐ３００との関連性は殆ど増大しなかった。
【００１９】
ＰＧＨＳ−２プロモーターに結合する、並びに細胞分割を調節する他の遺伝子に結合するＰＧＨＳ−２
ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２プロモーターの活性を評価するため、ヒトＰＧＨＳ−２プロモーターの遠位（−８３１／＋１２３）塩基対をルシフェラーゼレポーター（ｐＧＨＳ−２ＬＵＣ）に融合した（Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）。このＰＧＨＳ−２レポーター又はＳＶ４０ ＬＵＣ（ｐＧＬ２プロモーター）を、ほぼコンフルエントなＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ腫瘍細胞内にトランスフェクトした。図６に示す通り、ＰＧＨＳ−２プロモーターの活性は、静止状態のＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内で容易に検出され、ＳＶ４０プロモーター及びルシフェラーゼレポーターのトランスフェクトにより得られた結果と類似していた。この結果は、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２の構成的な発現と一致する。ＰＭＡ（１００ｎＭ）はＰＧＨＳ−２プロモーターの活性をごく僅かしか増大させなかったのに対し、ＰＤ９８０５９、ＰＤＴＣ又はＳＢ２０３５８０で細胞を処理した場合には、ＰＧＨＳ−２プロモーターの活性が阻害された。これらの結果は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路及びＮＦ−κＢがＰＧＨＳ−２の構成的な発現に関与することを示唆している。
【００２０】
モノクローナル抗ＰＧＨＳ−２を使用した前立腺癌細胞のＣｈＩＰ実験では、本発明者等は、各試料について、免疫沈降可能なＰＧＨＳ−２プロモーター配列の量をインプットＤＮＡの量と比較した。ＰＧＨＳ−２ ＯＲＦプライマーは、陰性対照の役割を果たした。本発明者等は、ＰＧＨＳ−２がＰＧＨＳ−２プロモーターに構成的に結合し、細胞をＰＭＡで処理することで、ＰＧＨＳ−２とプロモーターとの結合が僅かしか上昇しないことを見出した（図７Ａ）。ＰＧＨＳ−２は又、ＭＤＭ２のプロモーター領域にも結合する。ＰＧＨＳ−２と両プロモーターとの結合は、ＰＤＴＣ及びＰＤ９８０５９によって阻害されており、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰＫ活性化に対するこれらの作用の依存性が示唆されている。
【００２１】
次に、本発明者等は、ＰＧＨＳ−２プロモーターのどのドメインが、ＰＧＨＳ−２タンパク質と結合可能であるかを明確にした。本発明者等は、ＤＮＡ−タンパク質結合アッセイを行い、ビオチン化された短いＰＧＨＳ−２プロモーターオリゴヌクレオチドプローブを、予め核抽出物タンパク質と相互作用させたストレプトアビジン被覆ビーズと共にインキュベートした。図７Ｂに示す通り、ＰＧＨＳ−２は、ＰＧＨＳ−２プロモーター上のｃ／ＥＢＰ部位、ＣＲＥ部位、及び２つのＮＦ−ΚＢ部位に結合した。ＰＧＨＳ−２プロモーター領域内における２つのＮＦ−κＢ部位間では、ＤＮＡ配列に対する弱い結合しか見られなかった。
【００２２】
本発明者等は又、ＰＧＨＳ−２とそれ自体のプロモーターとの結合が、プロモーターの転写活性に対して影響を与えるかどうかも判定した。ＰＧＨＳ−２プロモーター駆動ルシフェラーゼプラスミドを、ＰＧＨＳ−２発現プラスミドと共に、２９３Ｔ細胞へ共トランスフェクトさせた。これらの細胞は、ＰＧＨＳ−２の内因性含有量が少ないことから使用したが、というのも該遺伝子が構成的に発現される細胞株内ではＰＧＨＳ−２の転写活性の変化が評価できないためである。ＰＧＨＳ−２発現プラスミドのトランスフェクトから２４時間後に、２９３Ｔ細胞内でＰＧＨＳ−２タンパク質の量が増大すると、ルシフェラーゼ活性も増大した（図８）。従って、ＰＧＨＳ−２とそのプロモーターとの結合は、ＰＧＨＳ−２遺伝子の転写に正の影響を与えたのに対し、空の発現ベクターのトランスフェクトは、ＰＧＨＳ−２プロモーターの活性に影響を与えなかった。
【００２３】
考察
最近、癌細胞内のＰＧＨＳ酵素に多くの注目が集まっている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｘｉｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。これらの酵素は、細胞質、特に核周囲領域及び小胞体内に位置し、幾つかの機序によって腫瘍成長を支持し得るプロスタノイドの産生に関与している（Ｇａｔｅｌｙ，２０００；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｘ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｐａｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。構成的に発現されるＰＧＨＳ−１は、この点において特に関連性があると仮定されているが、というのもＰＧＨＳ−２が、非癌細胞の関与する炎症応答に重要な役割を有する誘導酵素であると考えられるためである（Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９９；Ｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。しかしながら、幾つかの研究室で得られた証拠では、ＰＧＨＳ−２が構成的に発現される場合があることが示されている（Ｈｏｗｅ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｈａｎａｈａｎ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２０００）。事実、ＰＧＨＳ−２は、ヒト前立腺及び頭頸部癌細胞株内で構成的に発現されるが、非癌性の不死化内皮細胞株（ＥＣＶ３０４）内では発現されないことが目下の試験で見出されている。このような発見において見込まれる意義は、ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の両方の酵素活性を阻害する非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が、幾つかの腫瘍の発症に対する保護機能の役割を果たし得るという所見によって示唆される（Ａｒｂｅｒ ａｎｄ ＤｕＢｏｉｓ，１９９９；Ｍｏｒａｎ ＥＭ，２００２；Ｏｓｈｉｍａ，ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｄａｖｉｅｓ ＧＬ，２００３；Ｐｉａｚｕｅｌｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｐａｒｆｅｎｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００２４】
本試験で使用した共焦点顕微鏡法により、ＰＧＨＳ−２タンパク質は、核周囲位置に存在するだけでなく、これらの癌細胞株の核内にも豊富に存在することが明らかになった。ＰＧＨＳ−２タンパク質は、非癌細胞の核内に存在することが報告されているが、このＰＧＨＳ−２の転位は、サイトカインの処理又はその他の操作によるものであり、構成的なものではない（Ｐａｒｆｅｎｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｍａｒｖｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２０００）。本発明者等による核ＰＧＨＳ−２の発見は、２つの手法（共焦点顕微鏡法、細胞分画法）により確認されており、その結果、本発明者等は、詳述した酵素的役割とは異なる転写機能をＰＧＨＳ−２が有する可能性について調査した。
【００２５】
クロマチン免疫沈降アッセイでは、ＰＧＨＳ−２がヒト前立腺及び頭頸部癌細胞株内においてＰＧＨＳ−２のプロモーター領域に結合することが明らかになった。本発明者等は、ＤＮＡとＰＧＨＳ−２タンパク質の相互作用が生じるＰＧＨＳ−２プロモーター領域の特異的なドメインを幾つか同定した。又、関連するコンストラクトをトランスフェクトさせた２９３Ｔ細胞による転写試験では、ＰＧＨＳ−２タンパク質がそれ自体の遺伝子の転写を直接調節できることを、本発明者等は示した。本発明者等は、これらの結果を癌細胞に当てはめ、癌細胞内におけるＰＧＨＳ−２遺伝子の「構成的な」発現機序は、それ自体の遺伝子産物のトランス活性化因子の機能となる場合があることを提案する。
【００２６】
一連の証拠により、ＮＦ−κＢ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、Ｃ／ＥＢＰ及びＣＲＥが、ＰＧＨＳ−２タンパク質の上方調節に関与することが示唆されている（Ｚｈｕ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。本発明者等は、タンパク質−ＤＮＡ結合アッセイを行い、実際にＰＧＨＳ−２が、２つのＮＦ−κＢ部位、並びにＰＧＨＳ−２プロモーター領域のＣ／ＥＢＰ及びＣＲＥ部位に強力に結合することを見出した。しかし、ＰＧＨＳ−２プロモーターの２つのＮＦ−κＢ部位間では、ＰＧＨＳ−２は対照配列に弱く結合しただけであった。又、本発明者等は、ＰＧＨＳ−２がそれ自体のプロモーターに直接結合するか、或いはその他の活性化因子と関連して結合するかについては判定していない。
【００２７】
更なる発見としては、ＰＧＨＳ−２タンパク質がＭＤＭ２プロモーターに結合することも見出された。ＰＧＨＳ−２がＭＤＭ２のトランス活性化因子として機能する場合、これは、ＰＧＨＳ−２を構成的に発現する癌細胞が癌遺伝子抑制因子タンパク質ｐ５３の細胞内レベルを調節する機序となる。ＭＤＭ２は、核内のｐ５３の転写活性化ドメインに結合し、タンパク質を細胞質へ移動させ、この細胞質でｐ５３が急速に分解される（Ｍｏｍａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【００２８】
目下の試験では又、ＰＧＨＳ−２が幾つかの核タンパク質と複合したことも明らかになった。これらのタンパク質には、ｃ−Ｊｕｎに結合するとトランス活性化因子（ＡＰ−１）となるｃ−Ｆｏｓが含まれる（Ｊａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＡＰ−１は、ＰＧＨＳ−２遺伝子の誘導に関与するものの（Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．，２００１）、ＡＰ−１とＰＧＨＳ−２との直接的な相互作用は、以前に記載されていない。この相互作用により、ＰＧＨＳ−２がｃ−Ｆｏｓとのヘテロ二量体としての転写活性を有する可能性が提起されているが、このことは未だ研究されていない。共活性化因子タンパク質ｐ３００も又、ＰＧＨＳ−２と複合することが見出されている。このことは、ｐ３００がＰＧＨＳ−２遺伝子の転写に関与することが証明されている固有のアセチル基転移酵素活性を有することからすれば、驚くべきことではない（Ｄｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。最後に、核ＰＧＨＳ−２は、ＭＤＭ２タンパク質だけでなく、ＭＤＭ２プロモーターにも結合した。この発見の意義は今のところ明らかではないが、ｐ５３と同様にＰＧＨＳ−２が、ＭＤＭ２により誘導される核輸送及び代謝回転に供されるという可能性が見られる。
【実施例】
【００２９】
細胞株
ヒト頭頸部癌細胞株ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂを、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中に維持した。ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞を、１０％のＦＢＳを補充したＥａｇｌｅの最小必須培地中で培養した。ＥＣＶ３０４内皮細胞を、１０％のＦＢＳを含有するＭ１９９培地中で増殖させた。２９３Ｔ細胞を、５％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、６０％コンフルエンスまで増殖させた。細胞培地は全て、３７℃の５％ＣＯ２／９５％Ｏ２インキュベーター中に維持した。細胞処理に使用したシグナル伝達試薬には、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米国カリフォルニア州ラホイヤ）から入手したＰＤ９８０５９及びＳＢ２０３５８０、並びにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手したＰＤＴＣ及びＰＭＡが含まれていた。
【００３０】
細胞分画
微量遠心管内における細胞の分画、及び核タンパク質の調製は、既に報告されている方法により行った（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。核抽出物は、１時間振とうさせながら粗核画分を高塩緩衝液（４２０ｍＮ ＮａＣｌ、２０％グリセロール）中で４℃にて再縣濁させることにより調製した。次に、４℃、１３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離させた後、上清を収集した。
【００３１】
免疫沈降及び免疫ブロッティング
これらの技法は、本発明者等の研究室で以前に記載した技法ものを使用した（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）。即ち、核タンパク質を不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（９％ゲル）上で分離させた後、電気ブロッティングによりイモビロン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ［米国マサチューセッツ州ベッドフォード］）に転写した。０．１％のＴｗｅｅｎを含有するトリス緩衝生理食塩水中において５％のミルクでブロッキングした後、膜を種々の抗体と共に一晩インキュベートした。二次抗体は、一次抗体の起源に応じて、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０００）又はウサギ抗マウスＩｇＧ（１：１０００）（Ｄａｋｏ［米国カリフォルニア州カーペンテリア］）とした。免疫反応性タンパク質は化学発光により検出した。
【００３２】
プラスミドトランスフェクト及びルシフェラーゼ試験
２９３Ｔ細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を供給業者の説明書に従って使用して、ドミナントネガティブなプラスミド、又はベクター単独でトランスフェクトさせた。次に、各処理群の細胞のアリコートを実験的な変量に曝露した後、核タンパク質の調製のために回収した。全ての実験において、内部対照プラスミドであるｐ−ガラクトシダーゼを共トランスフェクトして、結果を正規化した。
【００３３】
共焦点顕微鏡法
ＥＣＶ３０４、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ及びＤＵ１４５細胞をスライドチャンバー内で培養し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、ＰＢＳ中の２％のホルムアルデヒド中で１０分間インキュベートして固定した後、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＧＨＳ−１、ＰＧＨＳ−２（Ｃａｙｍａｎ［米国ミシガン州アンアーバー］）又はｃ−Ｆｏｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ［米国カリフォルニア州サンタクルス］）に対するモノクローナル抗体をＰＢＳ中で１：２００に希釈した後、チャンバーに加えて、試料を４５分間インキュベートした。これらの試料を、ＰＢＳ中で洗浄した後、ＰＢＳ中のＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスＩｇＧの１：１００希釈物と共に３０分間インキュベートした。顕微鏡法には、励起源としてアルゴンイオンレーザーを備えたＺｅｉｓｓ走査共焦点顕微鏡（５１０ＬＳ）を使用した。ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の細胞内局在化には、２５倍及び６０倍の対物レンズ及び５０％のレーザー電源を使用した。
【００３４】
ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）及びｐ３８キナーゼのドミナントネガティブなプラスミドのトランスフェクション
ユタ大学（米国ユタ州ソルトレークシティ）のＤｒ． Ｓ． Ｍ． Ｐｒｅｓｃｏｔｔ（Ｍｅａｄｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）の好意により、ヒトＰＧＨＳ−２プロモーターの断片を含むプラスミドの提供を受けた。プラスミド１８００ｐＧＬ２は−１８４０／＋１２３を含み、プラスミド＋８００ｐＧＬ２は配列−８３１／＋１２３を含んでいた。トランスフェクト効率の対照には、ｐＳＶ−ｆ３−ガラクトシダーゼを使用した。ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）のドミナントネガティブなプラスミドは、Ｄｒ． Ｍｅｌａｎｉｅ Ｃｏｂｂ （テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンター［米国テキサス州ダラス］）から贈与された。リポフェクタミンプラスを使用して、１０ｃｍプレート内の６０％コンフルエントなＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞を、ドミナントネガティブなＥＲＫＩ及びＥＲＫ２のプラスミド約６μｇでトランスフェクトさせた。培養物を３７℃で５時間インキュベートした。培地を、１０％のウシ胎児血清を含有する培地に２４時間かけて置き換えた後、血清フリー培地に２４時間かけて置き換えた。トランスフェクトさせた細胞を１００ｎＭホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸塩（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ［米国ミズーリ州セントルイス］）と共に１２時間インキュベートした後、ＰＧＨＳ−２タンパク質レベルのウェスタンブロット分析を行うために回収した。
【００３５】
クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）
クロマチン免疫沈降は、Ｌｕｏ，ｅｔ ａｌ． （１９９８）及びＢｒａｕｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ． （１９９６）に記載の通り実施した。単層の細胞（６×１０６）のアリコートを、１％のホルムアルデヒドにより室温にて１５分間かけて処理して、架橋させた。次に、単層をＰＢＳで２回洗浄した。抽出物は、プロテアーゼインヒビターロイペプチン（１０μｇ／ｍＬ）及びペプスタチンＡ（１０μｇ／ｍＬ）、ホスファターゼインヒビター（５０ｍＭ ＮａＦ及び０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム）、並びに脱アセチル化インヒビターであるトリコスタチンＡ、５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ［米国カリフォルニア州サンディエゴ］）を含有する緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、０．１％ ＳＤＳ、５０ｍＭトリス［ｐＨ８．０］、５ｍＭ ＥＤＴＡ）１ｍＬに細胞を擦り入れることにより調製した。細胞溶解物を超音波処理し、アガロースゲル電気泳動の評価で約６００ｂｐのクロマチン断片を得た。抗ｐ５３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ［米国カリフォルニア州サンタクルス］）、免疫沈降は、抗リン酸Ｓｅｒ３９２−ｐ５３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［米国マサチューセッツ州ビバリー］）、又は抗アセチル化ｐ５３（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［米国ニューヨーク州レイクプラシッド］）を使用して行った。ＰＧＨＳ−２プロモーターの試験には、抗ＰＧＨＳ−２（Ｃａｙｍａｎ）を使用した。ＰＣＲで使用したプライマーは、ＭＤＭ２のプロモーターのものであった［５’−ＧＧＡ ＴＴＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧ−３’（順方向）及び５’−ＧＧＴＣＴ ＡＣＣＣＴＣＣＡＡ− ＴＣＧＣＣＡＣ−３’（逆方向）］；ＰＧＨＳ−２［５’−ＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＡＧＣＴ−３’（順方向）及び３’−ＡＧＡＣＴＧＡＡＡ ＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴ−３’（逆方向）］。ＰＣＲの結果を１％アガロースゲル電気泳動で分離させ、ゲルを臭化インジウムで染色した。ＤＮＡの相対レベルは、ＱｕａｎｔｉｆｙＯｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．［米国カリフォルニア州ハーキュリーズ］）を使用して測定した。
【００３６】
ＤＮＡ結合アッセイ
ビオチン化されたＰＧＨＳ−２に特異的なＮＦ−κＢ、Ｃ／ＥＢＰ、又はＣＲＥ配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｇ及び４％のストレプトアビジン被覆ビーズ６０μｌを含有する核抽出物タンパク質のアリコート（２００μｇ）を、１時間振とうさせながらインキュベートした。ビオチン化プローブに結合した核抽出物タンパク質と関連したストレプトアビジン被覆ビーズをペレット化し、冷ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズに結合したタンパク質を沸騰させて溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させた。そして、上述の通り、抗ヒトＰＧＨＳ−２抗体を使用してウェスタンブロット分析を行った。
【００３７】
参考文献
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
【表４】
【００４２】
【表５】
【００４３】
【表６】
【００４４】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）癌細胞株並びにＥＣＶ３０４内皮細胞内におけるＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の局在化。（図１Ａ）ＥＣＶ３０４、前立腺（ＤＵ１４５）及び頭頸部（ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ）細胞株内におけるＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の免疫蛍光染色。ＥＣＶ３０４、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞を、ヒトＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２に対するモノクローナル抗体の後にＡｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗マウス抗体を使用して、間接免疫蛍光染色に供する。上部３枚の画像：ＰＧＨＳ−１に対する抗体；下部３枚の画像：ＰＧＨＳ−２に対する抗体。（図１Ｂ）ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の免疫蛍光染色の細胞内局在化。ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の両方を構成的に発現するこれらの細胞を、間接免疫蛍光染色（緑色）、及びＴＯ−ＰＲＯ−３ヨージドによる核染色（赤色）に供した。核のＰＧＨＳ−２は、核染色にＰＧＨＳ−２染色を重ね合わせて黄橙色を形成することにより示されるが、ＰＧＨＳ−１は示されていない。
【図２】ＥＣＶ３０４、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞内におけるＰＧＨＳ−２の発現。（図２Ａ）ＥＣＶ３０４、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２タンパク質の構成的な発現。細胞を１０ｃｍの皿内でコンフルエンスまで増殖させた。ＰＭＡ（１００ｎＭ）を使用して、又は使用せずに単層を１２時間かけて処理した後、核タンパク質を回収し、抗ヒトＰＧＨＳ−２（上部画像）又はＰＧＨＳ−１（下部画像）使用して免疫ブロッティングに供した。棒グラフは、３つの実験結果を基に、各処理による核又は細胞質のバンド強度（平均：１：ＳＤ）における対照からの変化を示す。（図２Ｂ）ＥＣＶ３０４、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２のｍＲＮＡレベル。コンフルエントな細胞を、ＰＭＡ（１００ｎＭ）を使用して、又は使用せずに８時間かけて処理した。全てのＲＮＡ試料を回収し、ＰＧＨＳ−２又はＧＡＰＤＨプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲに供した（それぞれ上部及び下部画像）。棒グラフは、対照試料と比較したＰＧＨＳ−２のｍＲＮＡレベルの増大を示しており（平均±ＳＤ）、これは、同一試料内におけるＧＡＰＤＨの変化に合わせて補正され、３つの実験結果から纏められている。
【図３】ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞内におけるＰＧＨＳ−２発現は、ＭＡＰＫ、ｐ３８又はＮＦ−κＢの阻害剤により減衰される。（図３Ａ）ＰＫＣ活性化又はシグナリング経路阻害剤のＰＧＨＳ−２発現に対する効果。ＵＭ−ＳＣＣ２２Ｂ細胞を１０ｃｍの培養皿内でコンフルエンスまで増殖させた後、対照培地（１列目画像）、又はＰＭＡ（２列目画像、１００ｎＭ）、ＰＤ９８０５９（ＰＤ、３列目画像、１０μＭ）、ＳＢ２０３５８０（ＳＢ、４列目画像、１０μＭ）若しくはＰＤＴＣ（５列目画像、１００μＭ）を含有する培地に１６時間曝露した。細胞単層を回収し、核タンパク質４０μｇを、抗ヒトＰＧＨＳ−２（上部画像）又は抗ｐＭＡＰＫ（ｐＥＲＫ１／２、下部画像）を使用して免疫ブロッティングに供した。下の棒グラフは、対照試料及び上記の薬剤で処理した細胞のバンド強度を示す。グラフの結果は、３つの類似する実験からの平均±ＳＤである。（図３Ｂ）ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内における、ドミナントネガティブなＥＲＫ１／２トランスフェクトのＰＧＨＳ−２発現に対する効果。ドミナントネガティブな突然変異ＥＲＫ１（ｄｎＥＲＫ１）、ＥＲＫ２（ｄｎＥＲＫ２）、又は両突然変異、又は空ベクター（ｐＣＥＰ４０）で、細胞をトランスフェクトした。ＰＧＨＳ−２及びｐＭＡＰＫ（リン酸化ＥＲＫ１及びＥＲＫ２）の核標本をウェスタンブロッティングにより分析した。
【図４】ＥＣＶ３０４、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）及びＤＵ１４５細胞内におけるＰＧＥ２の産生。細胞を４８ウェル培養皿内に入れ、ＰＭＡ（１００ｎＭ）、ＮＳ３９８（１０μＭ）、インドメタシン（１０μＭ）又はＰＤ９８０５９（１０μＭ）を使用して、又はこれらを使用せずに、１２時間かけて処理した。最後の３０分間は、細胞を２００μｌのＰＢＳに移した。次に、試料を回収し、ＥＬＩＳＡによるＰＧＥ２の定量的分析に供した。結果は、３つの代表的試験の結果の平均±ＳＤとして示す。
【図５】ＰＧＨＳ−２はｃ−Ｆｏｓ、ＭＤＭ２及びｐ３００と関連する。コンフルエントなＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞を、ＰＭＡ、１００ｎＭ、又は溶媒単独で１２時間かけて処理した。細胞核を調製し（Ｌｉｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９９）、ＰＧＨＳ−２に対する抗体を使用して免疫沈降させた。免疫沈降タンパク質をゲル電気泳動により分離させ、ｃ−Ｆｏｓ、ＭＤＭ２又はｐ３００に対する抗体を使用して免疫ブロットした。３つの類似する実験の代表的な免疫ブロットを示す。ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞の核内には、ＰＧＨＳ−２を伴うｃ−Ｆｏｓの共局在化が見られる。
【図６】培養物中の静止ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞は、実質的なＰＧＨＳ−２プロモーター活性を示す。ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞を、ルシフェラーゼレポーターに融合した−８３１／＋１２３ＰＧＨＳ−２プロモーターコンストラクト、又はＳＶ４０プロモーター（ｐＧＬ２プロモーター）を伴うルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトした。細胞のアリコートを、ＰＭＡ（１００ｎＭ）、ＰＤ９８０５９（１０μＭ）、ＰＤＴＣ（１００μＭ）、又はＳＢ２０３５８０（１０μＭ）で１２時間かけて処理した。培養物をβ−ガラクトシダーゼレポータープラスミドで共トランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性に合わせて補正して、測定し、３つの実験の３つの培養物測定値の平均±ＳＤとして表した。
【図７】ＰＧＨＳ−２プロモーターに結合したＰＧＨＳ−２のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析。（図７Ａ）ＰＧＨＳ−２を構成的に発現するＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞を使用して、ＰＭＡ（１００ｎＭ）、ＰＤＴＣ（１００μＭ）又はＰＤ９８０５９（ＰＤ、１０μＭ）の存在下又は非存在下（Ｃｏｎ）で、ＰＧＨＳ−２抗体によりＣｈＩＰを１２時間実施した。インプット及び免疫沈降（ＩＰ）ＤＮＡを、ＭＤＭ２、ＰＧＨＳ−２プロモーター及びＰＧＨＳ−２ ＯＲＦのプライマーを使用して増幅させた後、これらの増幅させたＤＮＡを電気泳動により分離させ、ＶｅｒｓａＤＯＣＴＭ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで走査した。（図７Ｂ）ＰＧＨＳ−２と、ＰＧＨＳ−２に特異的なＮＦ−κＢ（−２１３／−２２２；−４３８／−４４７）、Ｃ／ＥＢＰ（−１３２／−１２４）及びＣＲＥ（−５９／５３）配列との結合。コンフルエントなＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞を、ＰＭＡ（１００ｎＭ）を使用して、又は使用せずに６時間かけて処理し、核抽出物を調製した。ビオチン化ＰＧＨＳ−２プロモーターＤＮＡプローブを、ストレプトアビジン被覆ビーズと共に１時間インキュベートし；ペレット化したビーズを収集して洗浄し、タンパク質を溶離して、抗ＰＧＨＳ−２抗体を使用したウェスタンブロット分析に供した。
【図８】ＰＧＨＳ−２タンパク質は、２９３Ｔ細胞内におけるＰＧＨＳ−２プロモーター活性を増大させる。８０パーセントコンフルエントな２９３Ｔ細胞を、濃度を増大させたＰＣＭＶ内のＰＧＨＳ−２発現ベクター、又は対照ベクター、及びルシフェラーゼレポーターに融合したＰＧＨＳ−２プロモーター（−８３１／＋１２３）で過渡的にトランスフェクトした。トランスフェクト効率の対照として、ＰＣＭＶ β−Ｇａｌをトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−ｌｉｇｈｔシステムにより測定した。グラフは、３つの実験のデータから得られた、対照値１に対するルシフェラーゼ活性の変化を示す。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＰＧＨＳ−２のトランス活性化機能のインヒビターに関し、より詳細には、ＰＧＨＳ−２トランス活性化のインヒビターをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロスタグランジン−エンドペルオキシドＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）は、プロスタグランジンの産生における律速酵素である（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＰＧＨＳは、アラキドン酸のプロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）への環状酸化と、ＰＧＧ２のプロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）への還元を触媒する。次に、ＰＧＨ２は、種々のシンターゼによって、プロスタグランジンＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α及びＰＧＩ２、並びにトロンボキサン（ＴＸＡ２）をはじめとする種々の機能的プロスタノイドに代謝される（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ ＤｅＷｉｔｔ，１９９６）。ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２は、それぞれヒト第９染色体及び第１染色体にマッピングされている単一のコピー遺伝子である（Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｆｕｎｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＰＧＨＳ−１は、殆どの組織内で構成的に発現されている（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，２０００）。対照的に、ＰＧＨＳ−２は、非悪性の細胞内で、サイトカイン及び炎症刺激により高度に誘導可能な即時型初期応答遺伝子である（Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９９；Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＰＧＨＳ−２は、ＤＮＡ配列、そのｍＲＮＡの安定性、及び種々の刺激に対する応答の点で、ＰＧＨＳ−１とは区別される。
【０００３】
しかしながら、多数の癌細胞株及び癌組織内で、ＰＧＨＳ−２は構成的に発現されている（Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。腫瘍細胞生物学におけるＰＧＨＳ−２の重要性は、腫瘍成長を支持するＰＧＥ２及びＰＧＩ２の、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に依存した血管新生活性によるところもあった（Ｇａｔｅｌｙ ａｎｄ Ｌｉ，２００４）。小胞体及び核エンベロープ内の通常のプロスタグランジン合成工場から隔離された、ＰＧＨＳ−２のカベオリン−１との共局在化及び相互作用は、腫瘍形成及び炎症に寄与する場合がある（Ｌｉｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＰＧＥ２は、アポトーシス及び免疫監視を阻害することもでき（Ｈｏｓｈｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｉｓｈａｑｕｅ，ｅｔ ａｌ．，２００３）、又ＰＧＥ２は、その発現がヒト胃癌細胞増殖及び発癌に関連する場合がある特定のＤＮＡ修復タンパク質（Ｋｕ７０及びＫｕ８０）を誘導する（Ｌｉｍ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【０００４】
ＰＧＨＳ−２の発現は、比較的低分化且つ高悪性度の乳癌に関連することから、有用な予後の組織指標であり、且つ薬物療法のための標的となる場合がある（Ｗｕｌｆｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＰＧＨＳ−２の過剰発現は、４０％を超えるヒト浸潤性乳癌及び６０％を超える非浸潤性乳管癌内で生じることが報告されている（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｄｕｂｏｉｓ，２００４）。ＰＧＨＳ−２を実験的に過剰発現させると多剤耐性遺伝子１の発現が増大することから、ＰＧＨＳ−２が腫瘍内の多剤耐性に寄与することが示唆されている（Ｐａｔｅｌ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。更に、Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈ，ｅｔ ａｌ． （２００２）には、ＰＧＨＳ−２の高発現が、Ｒａｓシグナルの増強を介した乳癌内におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現に関連していることが示されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明者等は、腫瘍細胞の細胞核内にＰＧＨＳ−２タンパク質は存在するものの、ＰＧＨＳ−１は存在しないことを報告し、ＰＧＨＳ−２は、それ自体の遺伝子のプロモーター領域に結合して、トランス活性化因子として機能し得ることを本明細書に示す。又、本発明者等は、この直接的な正のフィードバック機序が、癌細胞内におけるＰＧＨＳ−２の構成的な発現に寄与することを提案する。従って、本発明は、ＰＧＨＳ−１のインヒビターに関連した有害な副作用を有さない、癌の処置において治療薬として使用し得る、ＰＧＨＳ−２のトランス活性化因子機能の選択的インヒビターをスクリーニングする方法を提供する。
【０００６】
従って、一態様において、本発明は、そのトランス活性化活性の阻害による、構成的なＰＧＨＳ−２発現のインヒビターを同定するための方法であって、ＰＧＨＳ−２又はＭＤＭ２プロモーターの少なくとも１つの領域に対応する核酸プローブと、ＰＧＨＳ−２タンパク質とを試験化合物の存在下又は非存在下で接触させる工程、ＰＧＨＳ−２タンパク質と該プロモーターの結合レベルを測定する工程を包含する方法に関する。前記試験化合物の非存在下で結合したタンパク質の量に比べて、前記試験化合物の存在下で結合したタンパク質の量の減少が、該化合物がＰＧＨＳ−２トランス活性化活性の潜在的インヒビターであることを示す。
【０００７】
一実施形態において、結合レベルは、ＤＮＡ−タンパク質結合アッセイ、例えばクロマチン免疫沈降アッセイ又は電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）により測定される。
【０００８】
一実施形態において、核酸プローブは、ＰＧＨＳ−２プロモーターの一領域：即ち、ｃ／ＥＢＰ部位、ＣＲＥ部位、又はＮＦ−κＢ部位に対応しており、このプローブは標識されている。
【０００９】
一実施形態において、核酸プローブはビオチン化され、ストレプトアビジン被覆ビーズと共にインキュベートされることによって、該プローブに結合した核抽出物タンパク質を単離した後、ビーズから溶離することができる。
【００１０】
関連する態様において、本発明は、ＰＧＨＳ−２インヒビターをスクリーニングする方法であって、ＰＧＨＳ−２を構成的に生成する細胞（該細胞は、ＰＧＨＳ−２プロモーターの一領域に対応する第一の核酸、及びレポーター分子をコードする第二の核酸でトランスフェクトされている）を得る工程；該細胞を試験化合物に曝露する工程；該細胞から核抽出物を単離する工程；前記抽出物中のレポーター分子のレベルを、曝露していない細胞に由来する前記抽出物中のレポーター分子のレベルと比較する工程を包含し、レポーター分子のレベルの低下が、ＰＧＨＳ−２のトランス活性化の阻害を示す、方法に関する。レポーター分子は、例えばルシフェラーゼ又は緑色蛍光タンパク質である場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
癌細胞株内におけるＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の細胞内位置
ＰＧＨＳアイソフォームの細胞内局在化に関して行われた以前の試験では、ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２が何れも線維芽細胞及びマクロファージの小胞体及び核エンベロープ内に見出され、これらの２つのアイソザイムの細胞内分布に実質的な違いがないことが示されている（Ｍｏｒｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８１；Ｒｏｌｌｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｋｕｊｕｂｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９３）。目下の試験において、本発明者等は、ヒト前立腺（ＤＵＩ４５）及び頭頸部（ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ）癌細胞内におけるＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の分布を比較した。図１は、ＰＧＨＳ−１又はＰＧＨＳ−２に特異的な一次抗体を使用して間接免疫蛍光にて染色した癌細胞の共焦点顕微鏡写真である。ＰＧＨＳ−１の免疫反応性は、細胞質の周辺部に均一に分布していた。ＰＧＨＳ−１は、多くの細胞の小胞体に存在することが知られてことから、本発明者等が認めたＰＧＨＳ−１の蛍光染色は、小胞体内における酵素の局在化を大きく反映するものであると考えられる。
【００１２】
ＰＧＨＳ−１とは対照的に、癌細胞内のＰＧＨＳ−２は、核エンベロープに集中しており、細胞核内に豊富に存在していた（図１）。癌細胞株の結果を内皮細胞（ＥＣＹ３０４）の結果と比べたところ、ＥＣＹ３０４細胞の細胞質内には免疫反応性が僅かしか見られず、これらの細胞の核エンベロープにも核内にもＰＧＨＳ−２染色は存在しなかった。図１Ｂに示す通り、ＰＧＨＳ−２の蛍光染色（緑色）は、核染色（赤色）と重なっている。一方、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−１の染色は、核染色と重ならなかった。
【００１３】
癌細胞株内における高レベルのＰＧＨＳ−２タンパク質及びｍＲＮＡと、ＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１Ｉ２）及びｐ３８活性の上昇との関係
ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞の分画により得た核タンパク質のウェスタンブロットでは、これらの細胞の核画分中でＰＧＨＳ−２タンパク質が回収されたが、それはＤＵ１４５細胞よりもＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞の方が顕著であることが示されている（図２Ａ）。ＰＧＨＳ−２のｍＲＮＡのレベルも又、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ癌細胞内で容易に検出できることが見出されている（図２Ｂ）。未処理のＥＣＹ３０４細胞内ではＰＧＨＳ−２タンパク質及びｍＲＮＡのレベルを検出できなかった。これらの所見は、細胞内のＰＧＨＳ−２レベルに影響を与え、酵素の核移行を起こす可能性があるサイトカイン又は増殖因子に露出されていない細胞内で見出されたものであることに留意する必要がある（Ｌｉｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＰＧＨＳ−１タンパク質は、頭頸部癌細胞（ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ）、並びにＤＵ１４５前立腺癌及びＥＣＹ３０４内皮細胞内に豊富に存在した（図２Ａ）。
【００１４】
短時間の試験において、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）はタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化し、ＰＧＨＳ−２遺伝子転写を迅速に誘導する（Ｐａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。本明細書で考察する３つの細胞株では、細胞をＰＭＡで処理することで、核内におけるＰＧＨＳ−２ ｍＲＮＡ及びＰＧＨＳ−２タンパク質の存在量が増大し（図２Ａ及び図２Ｂ）、中でもＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内で最も顕著な変化が見られた。ＰＭＡの処理により、細胞質内のＰＧＨＳ−２も上昇した（図２Ａ）。予想通り、癌細胞株をＰＭＡ（１００ｎＭ）で１２時間インキュベートしても、ＰＧＨＳ−１の存在量に影響は見られなかった。
【００１５】
他で明らかになった証拠により、正常な細胞内では、サイトカイン及び増殖因子に応答したＰＧＨＳ−２の上方調節に、ＭＡＰＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢが重要な役割を果たすことが示されている（Ｇｏｐｐｅｌｔ−Ｓｔｒｕｅｂｅ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｔａｉ，１９９８）。従って、本発明者等は、ＭＡＰＫ、ｐ３８及びＮＦ−κＢが、癌細胞内でＰＧＨＳ−２の構成的な発現に関与するか否かを試験した。先ず、コンフルエントなＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞を、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＥＫ）のＭＡＰＫカスケードインヒビターであるＰＤ９８０５９（１０μＭ）により１２時間かけて処理すると、ＰＧＨＳ−２タンパク質が極めて低いレベルに低下した。ｐ３８キナーゼ経路インヒビターであるＳＢ２３０５８、及びＮＦ−κＢのインヒビターであるピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）は、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２の発現を僅かに阻害した（図３Ａ）。ＰＫＣは、本明細書で考察する腫瘍細胞株内におけるＰＧＨＳ−２の構成的な発現に不可欠であり、ＰＭＡがＰＧＨＳ−２のレベルを上昇させることがこの図で示されているが、これらの結果は、ＵＭ ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２の構成的な発現に関与する細胞内シグナリング経路が幾つか存在することを示している。
【００１６】
本発明者等は、ドミナントネガティブなＥＲＫ１及び／又はＥＲＫ２発現プラスミドでＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞をトランスフェクトした。個別では、ｄｎＥＲＫ１もｄｎＥＲＫ２も、ＰＧＨＳ−２の発現に殆ど影響を与えなかった（図３Ｂ）。予想通り、ｄｎＥＲＫ１及びｄｎＥＲＫ２は一緒になると、両アイソフォームのキナーゼ活性を阻害して、ＰＧＨＳ−２の発現を低下させたものの、突然変異ＥＲＫのリン酸化が認められた（図３Ｂ）。この後者の応答は、既にＲｏｂｂｉｎｓ，ｅｔ ａｌ． （１９９２）に記載されている。これらの結果は、前立腺癌細胞内におけるＰＧＨＳ−２の構成的な発現が、ＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢシグナル伝達経路に一部依存することを示唆している。
【００１７】
癌細胞及びＥＣＶ３０４細胞によるＰＧＥ２の生成
前立腺及び頭頸部癌細胞は、非癌性の内皮細胞（ＥＣＶ３０４、１０．１±１．２ｎｇ／ｍＬ）と同様のＰＧＥ２レベル（それぞれ、１２．７±１．３ｎｇ／ｍＬ及び１４．３±１．５ｎｇ／ｍＬ［平均±ＳＤ］）を生成した（図４）。ＰＭＡ（１００ｎＭ）は、幾つかの細胞株内におけるＰＧＥ２の産生を向上させることが他の文献に示されている（Ｈａｂｉｂ，ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｍｏｌｉｎａ−Ｈｏｌｇａｄｏ，ｅｔ ａｌ．，２０００）。しかしながら、目下の試験において、ＰＭＡは、ＤＵ１４５又はＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＥ２の産生を有意に上昇させることはなかった（図４）。ＰＤ９８０５９は、癌細胞内におけるＰＧＥ２の産生を基底レベルにまで低下させ、ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の非特異的インヒビターであるインドメタシンと、ＰＧＨＳ−２の選択的インヒビターであるＮＳ３９８も同様であった。ＰＭＡにより誘導されたＰＧＨＳ−２の発現の上昇により、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＥ２の産生レベルが有意に上昇することはなかったが、ＰＧＥ２の産生は、ＰＧＨＳ−２酵素活性の従来のインヒビターにより下方調節を受けた。
【００１８】
癌細胞株内における核ＰＧＨＳ−２と他の転写活性化因子との関連性
ＰＧＨＳ−２が転写活性を有する核タンパク質と関連することを調べるために、静止状態のＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞で抗体二重染色実験を行い、ｃ−Ｆｏｓ及びＰＧＨＳ−２が細胞核内で共局在化していることを実証した（図５）。又、共免疫沈降アッセイでは、核ＰＧＨＳ−２がＭＤＭ２及び核共活性化因子タンパク質ｐ３００と関連することも示された。ＭＤＭ２は、ｐ５３の代謝回転の決定因子であり、ｐ５３に結合すると、癌遺伝子抑制因子タンパク質の核輸送を促進する（Ｍｏｍａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞をＰＭＡ（１００ｎＭ）で処理すると、核内におけるＰＧＨＳ−２とｃ−Ｆｏｓとの関連性が顕著に増大したが（図５）、ＭＤＭ２又はｐ３００との関連性は殆ど増大しなかった。
【００１９】
ＰＧＨＳ−２プロモーターに結合する、並びに細胞分割を調節する他の遺伝子に結合するＰＧＨＳ−２
ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２プロモーターの活性を評価するため、ヒトＰＧＨＳ−２プロモーターの遠位（−８３１／＋１２３）塩基対をルシフェラーゼレポーター（ｐＧＨＳ−２ＬＵＣ）に融合した（Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）。このＰＧＨＳ−２レポーター又はＳＶ４０ ＬＵＣ（ｐＧＬ２プロモーター）を、ほぼコンフルエントなＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ腫瘍細胞内にトランスフェクトした。図６に示す通り、ＰＧＨＳ−２プロモーターの活性は、静止状態のＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内で容易に検出され、ＳＶ４０プロモーター及びルシフェラーゼレポーターのトランスフェクトにより得られた結果と類似していた。この結果は、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２の構成的な発現と一致する。ＰＭＡ（１００ｎＭ）はＰＧＨＳ−２プロモーターの活性をごく僅かしか増大させなかったのに対し、ＰＤ９８０５９、ＰＤＴＣ又はＳＢ２０３５８０で細胞を処理した場合には、ＰＧＨＳ−２プロモーターの活性が阻害された。これらの結果は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路及びＮＦ−κＢがＰＧＨＳ−２の構成的な発現に関与することを示唆している。
【００２０】
モノクローナル抗ＰＧＨＳ−２を使用した前立腺癌細胞のＣｈＩＰ実験では、本発明者等は、各試料について、免疫沈降可能なＰＧＨＳ−２プロモーター配列の量をインプットＤＮＡの量と比較した。ＰＧＨＳ−２ ＯＲＦプライマーは、陰性対照の役割を果たした。本発明者等は、ＰＧＨＳ−２がＰＧＨＳ−２プロモーターに構成的に結合し、細胞をＰＭＡで処理することで、ＰＧＨＳ−２とプロモーターとの結合が僅かしか上昇しないことを見出した（図７Ａ）。ＰＧＨＳ−２は又、ＭＤＭ２のプロモーター領域にも結合する。ＰＧＨＳ−２と両プロモーターとの結合は、ＰＤＴＣ及びＰＤ９８０５９によって阻害されており、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰＫ活性化に対するこれらの作用の依存性が示唆されている。
【００２１】
次に、本発明者等は、ＰＧＨＳ−２プロモーターのどのドメインが、ＰＧＨＳ−２タンパク質と結合可能であるかを明確にした。本発明者等は、ＤＮＡ−タンパク質結合アッセイを行い、ビオチン化された短いＰＧＨＳ−２プロモーターオリゴヌクレオチドプローブを、予め核抽出物タンパク質と相互作用させたストレプトアビジン被覆ビーズと共にインキュベートした。図７Ｂに示す通り、ＰＧＨＳ−２は、ＰＧＨＳ−２プロモーター上のｃ／ＥＢＰ部位、ＣＲＥ部位、及び２つのＮＦ−ΚＢ部位に結合した。ＰＧＨＳ−２プロモーター領域内における２つのＮＦ−κＢ部位間では、ＤＮＡ配列に対する弱い結合しか見られなかった。
【００２２】
本発明者等は又、ＰＧＨＳ−２とそれ自体のプロモーターとの結合が、プロモーターの転写活性に対して影響を与えるかどうかも判定した。ＰＧＨＳ−２プロモーター駆動ルシフェラーゼプラスミドを、ＰＧＨＳ−２発現プラスミドと共に、２９３Ｔ細胞へ共トランスフェクトさせた。これらの細胞は、ＰＧＨＳ−２の内因性含有量が少ないことから使用したが、というのも該遺伝子が構成的に発現される細胞株内ではＰＧＨＳ−２の転写活性の変化が評価できないためである。ＰＧＨＳ−２発現プラスミドのトランスフェクトから２４時間後に、２９３Ｔ細胞内でＰＧＨＳ−２タンパク質の量が増大すると、ルシフェラーゼ活性も増大した（図８）。従って、ＰＧＨＳ−２とそのプロモーターとの結合は、ＰＧＨＳ−２遺伝子の転写に正の影響を与えたのに対し、空の発現ベクターのトランスフェクトは、ＰＧＨＳ−２プロモーターの活性に影響を与えなかった。
【００２３】
考察
最近、癌細胞内のＰＧＨＳ酵素に多くの注目が集まっている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｘｉｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。これらの酵素は、細胞質、特に核周囲領域及び小胞体内に位置し、幾つかの機序によって腫瘍成長を支持し得るプロスタノイドの産生に関与している（Ｇａｔｅｌｙ，２０００；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｘ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｐａｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。構成的に発現されるＰＧＨＳ−１は、この点において特に関連性があると仮定されているが、というのもＰＧＨＳ−２が、非癌細胞の関与する炎症応答に重要な役割を有する誘導酵素であると考えられるためである（Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９９；Ｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。しかしながら、幾つかの研究室で得られた証拠では、ＰＧＨＳ−２が構成的に発現される場合があることが示されている（Ｈｏｗｅ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｈａｎａｈａｎ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２０００）。事実、ＰＧＨＳ−２は、ヒト前立腺及び頭頸部癌細胞株内で構成的に発現されるが、非癌性の不死化内皮細胞株（ＥＣＶ３０４）内では発現されないことが目下の試験で見出されている。このような発見において見込まれる意義は、ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の両方の酵素活性を阻害する非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が、幾つかの腫瘍の発症に対する保護機能の役割を果たし得るという所見によって示唆される（Ａｒｂｅｒ ａｎｄ ＤｕＢｏｉｓ，１９９９；Ｍｏｒａｎ ＥＭ，２００２；Ｏｓｈｉｍａ，ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｄａｖｉｅｓ ＧＬ，２００３；Ｐｉａｚｕｅｌｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｐａｒｆｅｎｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００２４】
本試験で使用した共焦点顕微鏡法により、ＰＧＨＳ−２タンパク質は、核周囲位置に存在するだけでなく、これらの癌細胞株の核内にも豊富に存在することが明らかになった。ＰＧＨＳ−２タンパク質は、非癌細胞の核内に存在することが報告されているが、このＰＧＨＳ−２の転位は、サイトカインの処理又はその他の操作によるものであり、構成的なものではない（Ｐａｒｆｅｎｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｍａｒｖｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２０００）。本発明者等による核ＰＧＨＳ−２の発見は、２つの手法（共焦点顕微鏡法、細胞分画法）により確認されており、その結果、本発明者等は、詳述した酵素的役割とは異なる転写機能をＰＧＨＳ−２が有する可能性について調査した。
【００２５】
クロマチン免疫沈降アッセイでは、ＰＧＨＳ−２がヒト前立腺及び頭頸部癌細胞株内においてＰＧＨＳ−２のプロモーター領域に結合することが明らかになった。本発明者等は、ＤＮＡとＰＧＨＳ−２タンパク質の相互作用が生じるＰＧＨＳ−２プロモーター領域の特異的なドメインを幾つか同定した。又、関連するコンストラクトをトランスフェクトさせた２９３Ｔ細胞による転写試験では、ＰＧＨＳ−２タンパク質がそれ自体の遺伝子の転写を直接調節できることを、本発明者等は示した。本発明者等は、これらの結果を癌細胞に当てはめ、癌細胞内におけるＰＧＨＳ−２遺伝子の「構成的な」発現機序は、それ自体の遺伝子産物のトランス活性化因子の機能となる場合があることを提案する。
【００２６】
一連の証拠により、ＮＦ−κＢ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、Ｃ／ＥＢＰ及びＣＲＥが、ＰＧＨＳ−２タンパク質の上方調節に関与することが示唆されている（Ｚｈｕ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。本発明者等は、タンパク質−ＤＮＡ結合アッセイを行い、実際にＰＧＨＳ−２が、２つのＮＦ−κＢ部位、並びにＰＧＨＳ−２プロモーター領域のＣ／ＥＢＰ及びＣＲＥ部位に強力に結合することを見出した。しかし、ＰＧＨＳ−２プロモーターの２つのＮＦ−κＢ部位間では、ＰＧＨＳ−２は対照配列に弱く結合しただけであった。又、本発明者等は、ＰＧＨＳ−２がそれ自体のプロモーターに直接結合するか、或いはその他の活性化因子と関連して結合するかについては判定していない。
【００２７】
更なる発見としては、ＰＧＨＳ−２タンパク質がＭＤＭ２プロモーターに結合することも見出された。ＰＧＨＳ−２がＭＤＭ２のトランス活性化因子として機能する場合、これは、ＰＧＨＳ−２を構成的に発現する癌細胞が癌遺伝子抑制因子タンパク質ｐ５３の細胞内レベルを調節する機序となる。ＭＤＭ２は、核内のｐ５３の転写活性化ドメインに結合し、タンパク質を細胞質へ移動させ、この細胞質でｐ５３が急速に分解される（Ｍｏｍａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【００２８】
目下の試験では又、ＰＧＨＳ−２が幾つかの核タンパク質と複合したことも明らかになった。これらのタンパク質には、ｃ−Ｊｕｎに結合するとトランス活性化因子（ＡＰ−１）となるｃ−Ｆｏｓが含まれる（Ｊａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＡＰ−１は、ＰＧＨＳ−２遺伝子の誘導に関与するものの（Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．，２００１）、ＡＰ−１とＰＧＨＳ−２との直接的な相互作用は、以前に記載されていない。この相互作用により、ＰＧＨＳ−２がｃ−Ｆｏｓとのヘテロ二量体としての転写活性を有する可能性が提起されているが、このことは未だ研究されていない。共活性化因子タンパク質ｐ３００も又、ＰＧＨＳ−２と複合することが見出されている。このことは、ｐ３００がＰＧＨＳ−２遺伝子の転写に関与することが証明されている固有のアセチル基転移酵素活性を有することからすれば、驚くべきことではない（Ｄｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。最後に、核ＰＧＨＳ−２は、ＭＤＭ２タンパク質だけでなく、ＭＤＭ２プロモーターにも結合した。この発見の意義は今のところ明らかではないが、ｐ５３と同様にＰＧＨＳ−２が、ＭＤＭ２により誘導される核輸送及び代謝回転に供されるという可能性が見られる。
【実施例】
【００２９】
細胞株
ヒト頭頸部癌細胞株ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂを、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中に維持した。ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞を、１０％のＦＢＳを補充したＥａｇｌｅの最小必須培地中で培養した。ＥＣＶ３０４内皮細胞を、１０％のＦＢＳを含有するＭ１９９培地中で増殖させた。２９３Ｔ細胞を、５％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、６０％コンフルエンスまで増殖させた。細胞培地は全て、３７℃の５％ＣＯ２／９５％Ｏ２インキュベーター中に維持した。細胞処理に使用したシグナル伝達試薬には、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米国カリフォルニア州ラホイヤ）から入手したＰＤ９８０５９及びＳＢ２０３５８０、並びにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手したＰＤＴＣ及びＰＭＡが含まれていた。
【００３０】
細胞分画
微量遠心管内における細胞の分画、及び核タンパク質の調製は、既に報告されている方法により行った（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。核抽出物は、１時間振とうさせながら粗核画分を高塩緩衝液（４２０ｍＮ ＮａＣｌ、２０％グリセロール）中で４℃にて再縣濁させることにより調製した。次に、４℃、１３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離させた後、上清を収集した。
【００３１】
免疫沈降及び免疫ブロッティング
これらの技法は、本発明者等の研究室で以前に記載した技法ものを使用した（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）。即ち、核タンパク質を不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（９％ゲル）上で分離させた後、電気ブロッティングによりイモビロン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ［米国マサチューセッツ州ベッドフォード］）に転写した。０．１％のＴｗｅｅｎを含有するトリス緩衝生理食塩水中において５％のミルクでブロッキングした後、膜を種々の抗体と共に一晩インキュベートした。二次抗体は、一次抗体の起源に応じて、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０００）又はウサギ抗マウスＩｇＧ（１：１０００）（Ｄａｋｏ［米国カリフォルニア州カーペンテリア］）とした。免疫反応性タンパク質は化学発光により検出した。
【００３２】
プラスミドトランスフェクト及びルシフェラーゼ試験
２９３Ｔ細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を供給業者の説明書に従って使用して、ドミナントネガティブなプラスミド、又はベクター単独でトランスフェクトさせた。次に、各処理群の細胞のアリコートを実験的な変量に曝露した後、核タンパク質の調製のために回収した。全ての実験において、内部対照プラスミドであるｐ−ガラクトシダーゼを共トランスフェクトして、結果を正規化した。
【００３３】
共焦点顕微鏡法
ＥＣＶ３０４、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ及びＤＵ１４５細胞をスライドチャンバー内で培養し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、ＰＢＳ中の２％のホルムアルデヒド中で１０分間インキュベートして固定した後、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＧＨＳ−１、ＰＧＨＳ−２（Ｃａｙｍａｎ［米国ミシガン州アンアーバー］）又はｃ−Ｆｏｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ［米国カリフォルニア州サンタクルス］）に対するモノクローナル抗体をＰＢＳ中で１：２００に希釈した後、チャンバーに加えて、試料を４５分間インキュベートした。これらの試料を、ＰＢＳ中で洗浄した後、ＰＢＳ中のＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスＩｇＧの１：１００希釈物と共に３０分間インキュベートした。顕微鏡法には、励起源としてアルゴンイオンレーザーを備えたＺｅｉｓｓ走査共焦点顕微鏡（５１０ＬＳ）を使用した。ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の細胞内局在化には、２５倍及び６０倍の対物レンズ及び５０％のレーザー電源を使用した。
【００３４】
ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）及びｐ３８キナーゼのドミナントネガティブなプラスミドのトランスフェクション
ユタ大学（米国ユタ州ソルトレークシティ）のＤｒ． Ｓ． Ｍ． Ｐｒｅｓｃｏｔｔ（Ｍｅａｄｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）の好意により、ヒトＰＧＨＳ−２プロモーターの断片を含むプラスミドの提供を受けた。プラスミド１８００ｐＧＬ２は−１８４０／＋１２３を含み、プラスミド＋８００ｐＧＬ２は配列−８３１／＋１２３を含んでいた。トランスフェクト効率の対照には、ｐＳＶ−ｆ３−ガラクトシダーゼを使用した。ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）のドミナントネガティブなプラスミドは、Ｄｒ． Ｍｅｌａｎｉｅ Ｃｏｂｂ （テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンター［米国テキサス州ダラス］）から贈与された。リポフェクタミンプラスを使用して、１０ｃｍプレート内の６０％コンフルエントなＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞を、ドミナントネガティブなＥＲＫＩ及びＥＲＫ２のプラスミド約６μｇでトランスフェクトさせた。培養物を３７℃で５時間インキュベートした。培地を、１０％のウシ胎児血清を含有する培地に２４時間かけて置き換えた後、血清フリー培地に２４時間かけて置き換えた。トランスフェクトさせた細胞を１００ｎＭホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸塩（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ［米国ミズーリ州セントルイス］）と共に１２時間インキュベートした後、ＰＧＨＳ−２タンパク質レベルのウェスタンブロット分析を行うために回収した。
【００３５】
クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）
クロマチン免疫沈降は、Ｌｕｏ，ｅｔ ａｌ． （１９９８）及びＢｒａｕｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ． （１９９６）に記載の通り実施した。単層の細胞（６×１０６）のアリコートを、１％のホルムアルデヒドにより室温にて１５分間かけて処理して、架橋させた。次に、単層をＰＢＳで２回洗浄した。抽出物は、プロテアーゼインヒビターロイペプチン（１０μｇ／ｍＬ）及びペプスタチンＡ（１０μｇ／ｍＬ）、ホスファターゼインヒビター（５０ｍＭ ＮａＦ及び０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム）、並びに脱アセチル化インヒビターであるトリコスタチンＡ、５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ［米国カリフォルニア州サンディエゴ］）を含有する緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、０．１％ ＳＤＳ、５０ｍＭトリス［ｐＨ８．０］、５ｍＭ ＥＤＴＡ）１ｍＬに細胞を擦り入れることにより調製した。細胞溶解物を超音波処理し、アガロースゲル電気泳動の評価で約６００ｂｐのクロマチン断片を得た。抗ｐ５３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ［米国カリフォルニア州サンタクルス］）、免疫沈降は、抗リン酸Ｓｅｒ３９２−ｐ５３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［米国マサチューセッツ州ビバリー］）、又は抗アセチル化ｐ５３（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［米国ニューヨーク州レイクプラシッド］）を使用して行った。ＰＧＨＳ−２プロモーターの試験には、抗ＰＧＨＳ−２（Ｃａｙｍａｎ）を使用した。ＰＣＲで使用したプライマーは、ＭＤＭ２のプロモーターのものであった［５’−ＧＧＡ ＴＴＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧ−３’（順方向）及び５’−ＧＧＴＣＴ ＡＣＣＣＴＣＣＡＡ− ＴＣＧＣＣＡＣ−３’（逆方向）］；ＰＧＨＳ−２［５’−ＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＡＧＣＴ−３’（順方向）及び３’−ＡＧＡＣＴＧＡＡＡ ＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴ−３’（逆方向）］。ＰＣＲの結果を１％アガロースゲル電気泳動で分離させ、ゲルを臭化インジウムで染色した。ＤＮＡの相対レベルは、ＱｕａｎｔｉｆｙＯｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．［米国カリフォルニア州ハーキュリーズ］）を使用して測定した。
【００３６】
ＤＮＡ結合アッセイ
ビオチン化されたＰＧＨＳ−２に特異的なＮＦ−κＢ、Ｃ／ＥＢＰ、又はＣＲＥ配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６μｇ及び４％のストレプトアビジン被覆ビーズ６０μｌを含有する核抽出物タンパク質のアリコート（２００μｇ）を、１時間振とうさせながらインキュベートした。ビオチン化プローブに結合した核抽出物タンパク質と関連したストレプトアビジン被覆ビーズをペレット化し、冷ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズに結合したタンパク質を沸騰させて溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させた。そして、上述の通り、抗ヒトＰＧＨＳ−２抗体を使用してウェスタンブロット分析を行った。
【００３７】
参考文献
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
【表４】
【００４２】
【表５】
【００４３】
【表６】
【００４４】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）癌細胞株並びにＥＣＶ３０４内皮細胞内におけるＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の局在化。（図１Ａ）ＥＣＶ３０４、前立腺（ＤＵ１４５）及び頭頸部（ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ）細胞株内におけるＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の免疫蛍光染色。ＥＣＶ３０４、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞を、ヒトＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２に対するモノクローナル抗体の後にＡｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗マウス抗体を使用して、間接免疫蛍光染色に供する。上部３枚の画像：ＰＧＨＳ−１に対する抗体；下部３枚の画像：ＰＧＨＳ−２に対する抗体。（図１Ｂ）ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の免疫蛍光染色の細胞内局在化。ＰＧＨＳ−１及びＰＧＨＳ−２の両方を構成的に発現するこれらの細胞を、間接免疫蛍光染色（緑色）、及びＴＯ−ＰＲＯ−３ヨージドによる核染色（赤色）に供した。核のＰＧＨＳ−２は、核染色にＰＧＨＳ−２染色を重ね合わせて黄橙色を形成することにより示されるが、ＰＧＨＳ−１は示されていない。
【図２】ＥＣＶ３０４、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞内におけるＰＧＨＳ−２の発現。（図２Ａ）ＥＣＶ３０４、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２タンパク質の構成的な発現。細胞を１０ｃｍの皿内でコンフルエンスまで増殖させた。ＰＭＡ（１００ｎＭ）を使用して、又は使用せずに単層を１２時間かけて処理した後、核タンパク質を回収し、抗ヒトＰＧＨＳ−２（上部画像）又はＰＧＨＳ−１（下部画像）使用して免疫ブロッティングに供した。棒グラフは、３つの実験結果を基に、各処理による核又は細胞質のバンド強度（平均：１：ＳＤ）における対照からの変化を示す。（図２Ｂ）ＥＣＶ３０４、ＤＵ１４５及びＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内におけるＰＧＨＳ−２のｍＲＮＡレベル。コンフルエントな細胞を、ＰＭＡ（１００ｎＭ）を使用して、又は使用せずに８時間かけて処理した。全てのＲＮＡ試料を回収し、ＰＧＨＳ−２又はＧＡＰＤＨプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲに供した（それぞれ上部及び下部画像）。棒グラフは、対照試料と比較したＰＧＨＳ−２のｍＲＮＡレベルの増大を示しており（平均±ＳＤ）、これは、同一試料内におけるＧＡＰＤＨの変化に合わせて補正され、３つの実験結果から纏められている。
【図３】ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞内におけるＰＧＨＳ−２発現は、ＭＡＰＫ、ｐ３８又はＮＦ−κＢの阻害剤により減衰される。（図３Ａ）ＰＫＣ活性化又はシグナリング経路阻害剤のＰＧＨＳ−２発現に対する効果。ＵＭ−ＳＣＣ２２Ｂ細胞を１０ｃｍの培養皿内でコンフルエンスまで増殖させた後、対照培地（１列目画像）、又はＰＭＡ（２列目画像、１００ｎＭ）、ＰＤ９８０５９（ＰＤ、３列目画像、１０μＭ）、ＳＢ２０３５８０（ＳＢ、４列目画像、１０μＭ）若しくはＰＤＴＣ（５列目画像、１００μＭ）を含有する培地に１６時間曝露した。細胞単層を回収し、核タンパク質４０μｇを、抗ヒトＰＧＨＳ−２（上部画像）又は抗ｐＭＡＰＫ（ｐＥＲＫ１／２、下部画像）を使用して免疫ブロッティングに供した。下の棒グラフは、対照試料及び上記の薬剤で処理した細胞のバンド強度を示す。グラフの結果は、３つの類似する実験からの平均±ＳＤである。（図３Ｂ）ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞内における、ドミナントネガティブなＥＲＫ１／２トランスフェクトのＰＧＨＳ−２発現に対する効果。ドミナントネガティブな突然変異ＥＲＫ１（ｄｎＥＲＫ１）、ＥＲＫ２（ｄｎＥＲＫ２）、又は両突然変異、又は空ベクター（ｐＣＥＰ４０）で、細胞をトランスフェクトした。ＰＧＨＳ−２及びｐＭＡＰＫ（リン酸化ＥＲＫ１及びＥＲＫ２）の核標本をウェスタンブロッティングにより分析した。
【図４】ＥＣＶ３０４、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）及びＤＵ１４５細胞内におけるＰＧＥ２の産生。細胞を４８ウェル培養皿内に入れ、ＰＭＡ（１００ｎＭ）、ＮＳ３９８（１０μＭ）、インドメタシン（１０μＭ）又はＰＤ９８０５９（１０μＭ）を使用して、又はこれらを使用せずに、１２時間かけて処理した。最後の３０分間は、細胞を２００μｌのＰＢＳに移した。次に、試料を回収し、ＥＬＩＳＡによるＰＧＥ２の定量的分析に供した。結果は、３つの代表的試験の結果の平均±ＳＤとして示す。
【図５】ＰＧＨＳ−２はｃ−Ｆｏｓ、ＭＤＭ２及びｐ３００と関連する。コンフルエントなＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞を、ＰＭＡ、１００ｎＭ、又は溶媒単独で１２時間かけて処理した。細胞核を調製し（Ｌｉｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９９）、ＰＧＨＳ−２に対する抗体を使用して免疫沈降させた。免疫沈降タンパク質をゲル電気泳動により分離させ、ｃ−Ｆｏｓ、ＭＤＭ２又はｐ３００に対する抗体を使用して免疫ブロットした。３つの類似する実験の代表的な免疫ブロットを示す。ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞の核内には、ＰＧＨＳ−２を伴うｃ−Ｆｏｓの共局在化が見られる。
【図６】培養物中の静止ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞は、実質的なＰＧＨＳ−２プロモーター活性を示す。ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞を、ルシフェラーゼレポーターに融合した−８３１／＋１２３ＰＧＨＳ−２プロモーターコンストラクト、又はＳＶ４０プロモーター（ｐＧＬ２プロモーター）を伴うルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトした。細胞のアリコートを、ＰＭＡ（１００ｎＭ）、ＰＤ９８０５９（１０μＭ）、ＰＤＴＣ（１００μＭ）、又はＳＢ２０３５８０（１０μＭ）で１２時間かけて処理した。培養物をβ−ガラクトシダーゼレポータープラスミドで共トランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性に合わせて補正して、測定し、３つの実験の３つの培養物測定値の平均±ＳＤとして表した。
【図７】ＰＧＨＳ−２プロモーターに結合したＰＧＨＳ−２のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析。（図７Ａ）ＰＧＨＳ−２を構成的に発現するＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞を使用して、ＰＭＡ（１００ｎＭ）、ＰＤＴＣ（１００μＭ）又はＰＤ９８０５９（ＰＤ、１０μＭ）の存在下又は非存在下（Ｃｏｎ）で、ＰＧＨＳ−２抗体によりＣｈＩＰを１２時間実施した。インプット及び免疫沈降（ＩＰ）ＤＮＡを、ＭＤＭ２、ＰＧＨＳ−２プロモーター及びＰＧＨＳ−２ ＯＲＦのプライマーを使用して増幅させた後、これらの増幅させたＤＮＡを電気泳動により分離させ、ＶｅｒｓａＤＯＣＴＭ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで走査した。（図７Ｂ）ＰＧＨＳ−２と、ＰＧＨＳ−２に特異的なＮＦ−κＢ（−２１３／−２２２；−４３８／−４４７）、Ｃ／ＥＢＰ（−１３２／−１２４）及びＣＲＥ（−５９／５３）配列との結合。コンフルエントなＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ（２２Ｂ）細胞を、ＰＭＡ（１００ｎＭ）を使用して、又は使用せずに６時間かけて処理し、核抽出物を調製した。ビオチン化ＰＧＨＳ−２プロモーターＤＮＡプローブを、ストレプトアビジン被覆ビーズと共に１時間インキュベートし；ペレット化したビーズを収集して洗浄し、タンパク質を溶離して、抗ＰＧＨＳ−２抗体を使用したウェスタンブロット分析に供した。
【図８】ＰＧＨＳ−２タンパク質は、２９３Ｔ細胞内におけるＰＧＨＳ−２プロモーター活性を増大させる。８０パーセントコンフルエントな２９３Ｔ細胞を、濃度を増大させたＰＣＭＶ内のＰＧＨＳ−２発現ベクター、又は対照ベクター、及びルシフェラーゼレポーターに融合したＰＧＨＳ−２プロモーター（−８３１／＋１２３）で過渡的にトランスフェクトした。トランスフェクト効率の対照として、ＰＣＭＶ β−Ｇａｌをトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−ｌｉｇｈｔシステムにより測定した。グラフは、３つの実験のデータから得られた、対照値１に対するルシフェラーゼ活性の変化を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＧＨＳ−２トランス活性化活性のインヒビターを同定するための方法であって、該方法は、以下の工程
ａ）ＰＧＨＳ−２又はＭＤＭ２プロモーターの少なくとも１つの領域に対応する核酸プローブと、ＰＧＨＳ−２タンパク質とを試験化合物の存在又は非存在下で接触させる工程；
ｂ）ＰＧＨＳ−２タンパク質とプローブとの結合レベルを測定する工程
を包含し、
前記試験化合物の非存在下で結合したタンパク質の量に比べて、前記試験化合物の存在下で結合したタンパク質量の減少が、該化合物がＰＧＨＳ−２トランス活性化活性のインヒビターであることを示す、方法。
【請求項２】
該結合レベルが、ＤＮＡ−タンパク質結合アッセイにより測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ−タンパク質結合アッセイがクロマチン免疫沈降アッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合アッセイが電気泳動移動度シフト解析である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該ＰＧＨＳ−２プロモーターの少なくとも１つの領域が、ｃ／ＥＢＰ部位、ＣＲＥ部位及びＮＦ−κＢ部位からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブが標識されている、請求項６に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブがビオチン化されている、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
ＰＧＨＳ−２トランス活性化のインヒビターを同定するために試験化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）ＰＧＨＳ−２を構成的に生成する細胞を提供する工程であって、前記細胞は、該ＰＧＨＳ−２プロモーターの領域に対応する第一の核酸、及びレポーター分子をコードする第二の核酸でトランスフェクトされている、工程；
ｂ）前記細胞を前記試験化合物に曝露する工程；
ｃ）前記細胞から核抽出物を単離する工程；
ｄ）前記抽出物中のレポーター分子のレベルを、曝露していない細胞に由来する核抽出物中のレポーター分子のレベルと比較する工程を包含し、
該レポーター分子のレベルの低下が、ＰＧＨＳ−２のトランス活性化の阻害を示す、方法。
【請求項１】
ＰＧＨＳ−２トランス活性化活性のインヒビターを同定するための方法であって、該方法は、以下の工程
ａ）ＰＧＨＳ−２又はＭＤＭ２プロモーターの少なくとも１つの領域に対応する核酸プローブと、ＰＧＨＳ−２タンパク質とを試験化合物の存在又は非存在下で接触させる工程；
ｂ）ＰＧＨＳ−２タンパク質とプローブとの結合レベルを測定する工程
を包含し、
前記試験化合物の非存在下で結合したタンパク質の量に比べて、前記試験化合物の存在下で結合したタンパク質量の減少が、該化合物がＰＧＨＳ−２トランス活性化活性のインヒビターであることを示す、方法。
【請求項２】
該結合レベルが、ＤＮＡ−タンパク質結合アッセイにより測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ−タンパク質結合アッセイがクロマチン免疫沈降アッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合アッセイが電気泳動移動度シフト解析である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該ＰＧＨＳ−２プロモーターの少なくとも１つの領域が、ｃ／ＥＢＰ部位、ＣＲＥ部位及びＮＦ−κＢ部位からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブが標識されている、請求項６に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブがビオチン化されている、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
ＰＧＨＳ−２トランス活性化のインヒビターを同定するために試験化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）ＰＧＨＳ−２を構成的に生成する細胞を提供する工程であって、前記細胞は、該ＰＧＨＳ−２プロモーターの領域に対応する第一の核酸、及びレポーター分子をコードする第二の核酸でトランスフェクトされている、工程；
ｂ）前記細胞を前記試験化合物に曝露する工程；
ｃ）前記細胞から核抽出物を単離する工程；
ｄ）前記抽出物中のレポーター分子のレベルを、曝露していない細胞に由来する核抽出物中のレポーター分子のレベルと比較する工程を包含し、
該レポーター分子のレベルの低下が、ＰＧＨＳ−２のトランス活性化の阻害を示す、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５０６７５４（Ｐ２００９−５０６７５４Ａ）
【公表日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１３６３６（Ｐ２００８−５１３６３６）
【出願日】平成１８年５月２３日（２００６．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９９６５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２７７３１
【国際公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（５０７３８６９９９）オードウェイ リサーチ インスティテュート， インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５０７３８６９５５）
【出願人】（５０７３８７０００）
【出願人】（５０７３８６９６６）
【出願人】（５０７３８６９７７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２３日（２００６．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９９６５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２７７３１
【国際公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（５０７３８６９９９）オードウェイ リサーチ インスティテュート， インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５０７３８６９５５）
【出願人】（５０７３８７０００）
【出願人】（５０７３８６９６６）
【出願人】（５０７３８６９７７）
【Ｆターム（参考）】
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