ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法及び検出用キット、ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法及び調製用キット、ならびに目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＰＮＡチップ。
【課題】本発明は、より簡便、正確かつ短時間に検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できるＰＮＡプローブを利用した検出方法及び検出用キットを提供することを目的とする。
【解決手段】検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡとこれとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、ＤＭＳＯを含有させたハイブリダイゼーション液中でインキュベートすることによりハイブリダイズさせ、得られたハイブリダイズ産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄する。
【解決手段】検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡとこれとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、ＤＭＳＯを含有させたハイブリダイゼーション液中でインキュベートすることによりハイブリダイズさせ、得られたハイブリダイズ産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法及び検出用キット、ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法及び調製用キット、ならびに目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＰＮＡチップに関するものであり、より簡便、正確、短時間に目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出すること可能にするものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、目的の遺伝子を検出する方法として、ダイレクト・ハイブリダイゼーション法や遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）を用いた方法などが利用されている。また、近年、多数のプローブを貼り付けたＤＮＡチップが発明され、研究および医療の診断などの分野で用いられ始めている。一般的なＤＮＡチップの大きさは１〜１０ｃｍ２で、この領域に数千〜数十万種のＤＮＡを整列させるように固定化する。一般的に、蛍光標識ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより発現遺伝子や多型を検出する。検出には１〜１０μｍの解像度をもつ高性能蛍光スキャナーが用いられている。ＤＮＡチップ技術は、ポストゲノムの研究課題としてゲノム構造解析プロジェクトの成果を飛躍的に発展させる新しい技術として開発され、創薬研究・疾病の診断や予防法の開発などの研究開発に新しい手段を提供するものと期待されている。この手法は、その原理がシンプルなこと、大量の遺伝子の発現情報等を一括して収集できること、蛍光ラベルを用いて視覚に訴えることなどその分かりやすさから広まりつつある。
【０００３】
しかし、ＤＮＡチップには核酸同士の結合力によりハイブリダイゼーションさせる原理が採用されているため、インキュベーション時間を長くとる必要があるという欠点を有する。元来ＤＮＡチップは６０−８０塩基の長さを有するＤＮＡプローブをチップ基板上に貼り付けたものが多く、これを競合ハイブリダイゼーションによって解析する方法が一般的である。しかし、当該ＤＮＡプローブは塩基数が多いため、１塩基のミスマッチを認識する必要がある一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphisms、以下ＳＮＰｓ）解析には不向きであり、そのため２０−３０塩基程度のショートオリゴＤＮＡを用いたチップも考案されている。しかしながら、ＤＮＡプローブの塩基数を少なくした場合にはハイブリダイゼーションの効率が低下するので、ハイブリ時間を長くする必要があり、短時間で結果を得ることができない。このため、ＤＮＡチップは精度や感度の面で技術的にはまだまだ開発段階にある。また、ＤＮＡチップの精度を評価するためには多検体解析後、分布図を作成しなければならないなどの手間や時間を要する。
【０００４】
ＥＣＡ（Electronic Chemical Array）チップは合成オリゴＤＮＡ（８０塩基）を金の微小電極上に共有結合させたセラミック・チップである。このチップのアレイが微小電極と相同しており、標的遺伝子を捕捉した電極にだけ電流が流れるので、電気信号として標的遺伝子を検出できることを特徴とする。従来のＤＮＡチップが標識されたＤＮＡを試料として使用するのに対し、無標識で測定にかけられるＥＣＡチップは高感度でＰＣＲが不要になる。また、ＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance）はＤＮＡチップ・ＥＣＡチップと比べると集積化がよくないが、生態環境に一番近い状態で速度論的な解析ができるという点で非常に興味深い。
【０００５】
一方、１９９１年頃から、擬似核酸の一種であるペプチド核酸（Peptide nucleic acid、以下ＰＮＡ）が開発され、注目されている（非特許文献１）。例えばＰＮＡ／ＤＮＡやＰＮＡ／ＲＮＡの熱に対する安定性は、ＤＮＡ／ＤＮＡやＤＮＡ／ＲＮＡよりも極めて高いことが証明されているため、ＰＮＡを用いた場合、ハイブリダイゼーション温度を従来に比べて高くすることが可能であり、ＰＮＡと目的の核酸以外の非特異的結合をより抑えることができると推測される。また、ＤＮＡ／ＤＮＡの場合は、リン酸基のもつ負電荷をできるだけ抑えるために塩濃度を一定値以上に設定する必要があるが、ＰＮＡ／ＤＮＡの場合はＰＮＡ自体が負電荷をもたない中性高分子であるので塩濃度の影響をほとんど受けない。従って、ハイブリダイゼーションは酸性、塩基性、低イオン強度下でも可能であり、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブで用いられるハイブリダイゼーションバッファーなどにおける規則が必要なくなると推測され、ＰＮＡプローブでは蒸留水で希釈するだけでよく、作業上の手間を軽減可能であると期待される。さらに、ＤＮＡやＲＮＡの糖リン酸バックボーンは負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、ＰＮＡの場合はもともと電荷を持たないので静電的な反発が無い。
【０００６】
このように、ＰＮＡは従来の核酸と比較して、（１）高い二重鎖形成能、（２）高い塩基配列認識能を持ち、（３）生体内ヌクレアーゼ・プロテアーゼに対し非常に安定で分解されないので、ＰＮＡはアンチセンス分子として、ＤＮＡに代わる分子生物学や遺伝子工学に利用価値の高いツールとして非常に注目を集めるようになった。
【０００７】
しかし、ＰＮＡには、合成が困難であることやＰＮＡオリゴマーが細胞膜を透過しにくいという欠点がある。また、ＰＮＡプローブをチップに固定させてＤＮＡチップと同様に使用しようとしても、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に検出することは困難であり、ＰＮＡのより効果的な利用方法の模索が続いている。
【非特許文献１】Perry-O’Keefe, H. et al., J. Microbiol. Method., Vol.47, pp. 281-292 (2000).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記従来技術を背景として、本発明者らは簡便なＰＮＡの高度処理技術の構築を試みた。すなわち、本発明は、より簡便、正確かつ短時間に検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できるＰＮＡプローブを利用した検出方法及び検出用キットを提供することを目的とする。また、本発明は、ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法及び調製用キットを提供することを目的とする。さらに本発明は、競合ハイブリダイゼーションを要することなく、より正確かつ容易に目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無を判断することができるＰＮＡチップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑み研究を行ったところ、本発明者は、検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡとこれとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide、ＤＭＳＯ）を含有させたハイブリダイゼーション液中でインキュベートすることによりハイブリダイズさせ、得られたハイブリダイズ産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄することにより、ＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとを短時間でハイブリダイズさせることが可能であることを見出した。また、本発明者は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅させた後に得られた増幅産物をＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる際、１：４〜１００のモル比でセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて目的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を得た場合に、より効率良く目的ＤＮＡまたはＲＮＡとＰＮＡプローブとをハイブリダイズできることを見出した。また、本発明者は、ＰＮＡチップを、少なくとも目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つだけ有するＰＮＡプローブ、及び目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズしないＰＮＡプローブを備えたものとすることにより、より正確かつ容易に目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できることを見出した。本発明は上記知見に基づきさらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。
項１．ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、以下の工程、
（１）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液中で検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡと、該目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、ハイブリダイズできる条件下でインキュベートする工程、
（２）前記工程（１）の産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄する工程、及び
（３）前記工程（２）の後にＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物の有無を検出する工程、
を含むことを特徴とする、検出方法。
項２．前記ハイブリダイゼーション液のＤＭＳＯの濃度が約５〜６０重量％である、項１に記載の検出方法。
項３．前記洗浄溶液の炭素数１〜４の低級アルコール濃度が５０〜１００重量％である、項１に記載の検出方法。
項４．目的ＤＮＡまたはＲＮＡが、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜１００の比で用いて得られた増幅産物である、項１に記載の検出方法。
項５．前記ＰＮＡプローブがチップ上に配置されたＰＮＡチップを用いて目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する、項１に記載の検出方法。
項６．前記ＰＮＡチップが、少なくとも、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを備えるものである、項５に記載の検出方法。
項７．ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出用キットであって、以下、
（i）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液、及び
（ii）炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液、
を含むことを特徴とする、キット。
項８．さらに、１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含む、項７に記載のキット。
項９．さらに、前記ＰＮＡプローブがチップ上に配置されたＰＮＡチップを含む、項７に記載のキット。
項１０．ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法であって、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜１００の比で用いてＰＣＲを行うことにより得ることを特徴とする、調製方法。
項１１．ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製用キットであって、１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする、キット。
項１２．目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＰＮＡチップであって、少なくとも、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを備えることを特徴とする、ＰＮＡチップ。
項１３．前記目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブと、前記目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブと、前記ネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブが隣接して配置されているものである、項１２に記載のＰＮＡチップ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法及び検出用キット
本発明の検出方法は、（１）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液中で検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡと、該目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、ハイブリダイズできる条件下でインキュベートする工程、（２）前記工程（１）の産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄する工程、及び（３）前記工程（２）の後にＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物の有無を検出する工程、を含むことを特徴とする。また、本発明の検出用キットは、（i）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液、及び（ii）炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明においてハイブリダイズできるとは、ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液と炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液を用いるハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせた場合に、目的ＤＮＡまたはＲＮＡと該目的ＤＮＡまたはＲＮＡを標的とするＰＮＡプローブとのハイブリダイズ産物が得られることをいう。以下、本発明の検出方法及び検出用キットを詳細に説明する。
【００１２】
本発明の検出方法
本発明の検出方法は、上述の通り、ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液中で検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡと、該目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、これらがハイブリダイズできる条件下でインキュベートする工程（１）を含む。具体的には該工程は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを含む検体を、ハイブリダイゼーション液に混和し、この混和液を、目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズできるＰＮＡプローブ存在下で適切な時間・温度でインキュベートするものである。該ＰＮＡプローブはあらかじめ加温しておくことが好ましい。
【００１３】
この場合、インキュベーション温度は目的ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡプローブの塩基配列、ＰＮＡプローブの長さなどに応じて適宜調節でき、好ましくは３６〜５０℃の範囲であり、さらに好ましくは５０℃である。また、インキュベーション時間も、目的ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡプローブの塩基配列、ＰＮＡプローブの長さなどに応じて適宜調節でき、好ましくは５〜６０分であり、さらに好ましくは６０分である。ＰＮＡプローブの加温温度は制限されないが、好ましくは上記インキュベーション温度と同じ温度である。
【００１４】
なお、本発明において使用するハイブリダイゼーション液は次のように説明できる。ハイブリダイゼーション液は、通常使用されているハイブリダイゼーション液にＤＭＳＯを加えることにより作成されたものであればよい。ハイブリダイゼーション液のＤＭＳＯ濃度は、好ましくは約５〜６０重量％、さらに好ましくは２０〜２５重量％である。一例として、ハイブリダイゼーション液として、ＤＭＳＯを加えた、１重量％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＰＥが使用できる。
【００１５】
また、本発明の検出方法は、上述の通り、工程（１）の産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄する工程（２）を含む。具体的には該工程は、工程（１）で得られた検体中のＤＮＡまたはＲＮＡとプローブとのハイブリダイズ産物を、炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液に接触させることにより、ＰＮＡプローブと付着しているだけのＤＮＡまたはＲＮＡなど、ＰＮＡプローブとハイブリダイズしていないＤＮＡまたはＲＮＡを除去するものである。
【００１６】
ここで、洗浄は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡプローブの塩基配列、ＰＮＡプローブの長さなどに応じて適宜調節された温度で行うことができるが、好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下であり、さらに温度管理の手間を要しない点から室温がより好ましい。また、洗浄は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡプローブの塩基配列、ＰＮＡプローブの長さなどに応じて適宜調節された時間行うことができるが、短時間で検出できる点から好ましくは１〜３０分、さらに好ましくは１〜１５分である。
【００１７】
本発明において使用する洗浄液は次のように説明できる。洗浄液は通常使用されている洗浄液に炭素数１〜４の低級アルコールを加えることにより作成されたものであればよいが、好ましくは蒸留水などの水に低級アルコールを加えることにより作成されたものである。洗浄液中の低級アルコール濃度は５０〜１００重量％とすることができ、好ましくは８０〜１００重量％、さらに好ましくは１００重量％である。炭素数１〜４の低級アルコールの例としてはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられ、好ましくはエタノールである。
【００１８】
上記ハイブリダイゼーション液及び洗浄液を使用することにより、目的ＤＮＡまたはＲＮＡと、目的ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズできるＰＮＡプローブとのハイブリダイズ産物を高い精度で得ることができる。また、上記ハイブリダイゼーション液及び洗浄液を使用することにより、ＰＮＡプローブに単に付着しているだけでハイブリダイズしていないＤＮＡまたはＲＮＡを効果的に除去することができる。
【００１９】
このため、上記ハイブリダイゼーション液及び洗浄液を使用することにより、目的ＤＮＡまたはＲＮＡとＰＮＡプローブを短時間でハイブリダイズさせることができ、かくして得られるハイブリダイズ産物の蛍光発光等のシグナルを、以下説明する工程（３）において鮮明に観察することができる。
【００２０】
なお、上記工程（２）の後、必要に応じてさらに洗浄することができ、例えば０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥにより洗浄することができる。
【００２１】
本発明の検出方法は、上述の通り、ＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物の有無を検出する工程（３）を含む。具体的には該工程は、ＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物の有無を、該ハイブリダイズ産物由来のシグナルの有無またはシグナル強度により判別するものである。該シグナルは、例えばあらかじめプローブに標識しておいた標識剤や蛍光色素に基づいて得ることができ、当該シグナル、シグナル強度は蛍光顕微鏡やスキャナー等の従来公知の装置を用いて観察、測定することができる。そして例えば、ＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物由来のシグナルが観察されれば検体中に目的ＤＮＡまたはＲＮＡが存在すると判定され、観察されなければ存在しないと判定される。
【００２２】
本発明において使用する上記検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡは次のように説明できる。検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルス由来、細菌由来、ニワトリ由来、ブタ由来、ヒト由来など、その由来は制限されない。また、該検体は目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無を判断できるように調製されたものであればよく、例えば検体として、何らかの細胞膜透過処理を施した細胞を含むものでもよく、抽出された目的ＤＮＡまたはＲＮＡそのものを含むものでもよく、またＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲ等による目的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を含むものであってもよい。
【００２３】
検体として目的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を使用する場合、当該増幅産物は通常の方法に従い得ることができる。目的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を得る場合には、上述するように例えばＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ法が使用できるが、温度、時間、サイクル数などの各ＰＣＲ条件、また逆転写反応条件は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはプライマーの塩基配列、長さなど応じて適宜調整される。当該調整は、当業者であれば予備的実験等を経ることにより容易成し得る。使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーについては、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜１００のモル比で用いて増幅産物を得ることが好ましく、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜５０のモル比で用いることがより好ましく、これらを１：１０のモル比で用いることがさらに好ましい。
【００２４】
センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：１のモル比で用いて得た増幅産物を使用した場合と、これらのモル比を１：１０で用いて得た増幅産物を使用した場合を比較すると、前者より後者のほうが、目的ＤＮＡまたはＲＮＡとＰＮＡプローブとをより効率良くハイブリダイズさせることができ、ハイブリダイズ産物をより明瞭に検出することができる。
【００２５】
本発明において使用するＰＮＡプローブは次のように説明できる。ＰＮＡプローブは目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できるものであれば限定されず、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的なものでもよく、完全相補的でないものでもよく、プローブの塩基配列および長さ、ハイブリダイゼーションの条件などに応じて適宜決定できる。好ましくは、ＰＮＡプローブは目的ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部の領域の塩基配列と完全相補的なもの（以下、ＰＮＡプローブ１と称することもある）、前記領域と１塩基のミスマッチを有するものであり（以下、ＰＮＡプローブ２と称することもある）、さらに好ましくはＰＮＡプローブ１である。また、本発明のＰＮＡチップには、さらにネガティブコントロールとなるプローブを固定させることが好ましい。ここでネガティブコントロールとなるプローブとは、目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズしないプローブを意味する。
【００２６】
なお、本発明において「目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ」とは、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部分の領域と完全相補的であるプローブを指し、これは目的ＤＮＡまたはＲＮＡの全塩基配列のうち一部分の領域と完全相補的なプローブだけでなく、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの全塩基配列と完全相補的なプローブも含む。また、本発明において「目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ」は、好ましくは前記「目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ」の塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブである。
【００２７】
また、本発明において使用するＰＮＡプローブは、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できるだけの長さを有しているものであれば限定されず、好ましくはＰＮＡプローブとしてのＰＮＡオリゴマーを約１２〜２０ｍｅｒとすることができる。また、ＰＮＡプローブはビオチンなどの各種標識剤で標識することができ、またＣｙ３、Ｃｙ５などの各種蛍光色素で標識することもできる。また、ＰＮＡプローブは、チップ上に固定されたものでもよく、またチップ上に固定されていないものでもよい。
【００２８】
チップ上に固定されたＰＮＡプローブを使用する場合、すなわちＰＮＡチップを使用する場合、当該ＰＮＡチップはガラス、プラスチック、セラミックなどのチップ材料として一般的に用いられている基板上に、既に合成したＰＮＡプローブを貼り付けることにより作製されたものでもよく、また当該基板上でＰＮＡプローブを合成することにより作製されたものでもよい。ＰＮＡチップには当然のことながら複数のＰＮＡプローブを固定させることができるが、推定Ｔｍ値を統一したプローブを固定することが好ましい。また、この場合、ＰＮＡプローブは、目的ＤＮＡまたはＲＮＡまたは増幅産物の任意の部分をターゲットとするものであればよく、好ましくは目的ＤＮＡまたはＲＮＡまたは増幅産物の末端部分をターゲットとするものである。また、ＰＮＡチップに配置される複数のＰＮＡプローブは、検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できる組み合わせであれば制限されない。
【００２９】
例えば、目的ＤＮＡまたはＲＮＡと他のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて１塩基の違いを判別したい場合には、チップには少なくとも前記ＰＮＡプローブ１と、前記ＰＮＡプローブ２がともに固定される。この場合、ＰＮＡプローブ１と目的ＤＮＡまたはＲＮＡとは効率良くハイブリダイズできるが、ＰＮＡプローブ２と目的ＤＮＡまたはＲＮＡとは全くハイブリダイズしないハイブリダイゼーション条件に適宜調整する、すなわち上記工程（１）及び工程（２）の条件を適宜調整することにより、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に検出することができる。このため、本発明の方法によれば例えばＳＮＰｓを判断することが可能であり、また同一疾患の各種遺伝子表現亜型を診断することも可能である。
【００３０】
また、ほかの例は、ＰＮＡチップには、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部の領域の塩基配列と完全相補的なＰＮＡプローブ１と、当該領域の塩基配列と１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブ２と、当該領域と２塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブ（以下、ＰＮＡプローブ３と称することもある）をともに固定させることができる。この場合には、ハイブリダイゼーション条件、すなわち上記工程（１）及び工程（２）の条件を適宜調整することにより、ＰＮＡプローブ１と目的ＤＮＡまたはＲＮＡとは効率良くハイブリダイズさせ、ＰＮＡプローブ２と目的ＤＮＡまたはＲＮＡとは前者ほど効率良くハイブリダイズさせず、さらにＰＮＡプローブ３と目的ＤＮＡまたはＲＮＡとでは全くハイブリダイズさせないようにすることができる。この場合、例えばハイブリダイゼーション後の洗浄過程において、ＰＮＡプローブ２を固定したスポットに若干蛍光発光が残る程度に洗浄を制御することで、擬陽性の問題をクリアできる。すなわち、例えばＰＮＡプローブ１、ＰＮＡプローブ２、ＰＮＡプローブ３において、蛍光発光等のシグナル強度に差がなければ擬陽性反応と判定される。また、例えばＰＮＡプローブ１、ＰＮＡプローブ２、ＰＮＡプローブ３の順にシグナル強度が低下している場合には、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを正確に検出できていると判定される。
【００３１】
上述したいずれのＰＮＡチップにおいても、さらにネガティブコントロールとなるプローブを配置させることが好ましい。また、上記工程（１）及び工程（２）の条件は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびにプローブの塩基配列及び長さなどに応じて、当業者であれば予備的実験を経ることにより容易に調整できる。
【００３２】
さらに、例えば、ＰＮＡチップには上記ＰＮＡプローブ１、ＰＮＡプローブ２を、さらにネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを、チップ上に縦列、横列、円形状など様々な配置形態で隣接乃至近接して配置させることができる。これら各プローブの間には、別の配列を有するＰＮＡプローブを配置させることもできる。隣接とは、あるＰＮＡプローブが少なくとも別の１つのＰＮＡプローブと隣りあっていればよく、例えば横方向に一列で配置させること、縦方向に一列で配置させることなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、少なくともＰＮＡプローブ１とＰＮＡプローブ２が隣り合って配置させることであり、さらに好ましくはＰＮＡプローブ１、ＰＮＡプローブ２、ネガティブコントロールとなるプローブを縦または横方向に順に並んで配置させることが好ましい。
【００３３】
上述のように、少なくともＰＮＡプローブ１とＰＮＡプローブ２とをチップ上に隣接乃至近接して配置させることにより、プローブを配置させた各スポット間における蛍光強度を比較することがより容易になる。すなわち、各プローブをこのように配置させることによって、擬陽性の有無の判断が一層容易かつ正確となる。従って、本発明は、チップ上に、少なくとも目的ＤＮＡまたはＲＮＡと完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブと、当該目的ＤＮＡまたはＲＮＡと１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブとをともに配置させることにより、擬陽性反応の有無を判断する方法をも提供すものでもある。
【００３４】
また、本発明ではさらに、目的ＤＮＡまたはＲＮＡと２塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブ３も、ＰＮＡプローブ１、ＰＮＡプローブ２、ネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブなどと隣接乃至近接して配置させることが好ましい。いずれのＰＮＡプローブを組合わせて配置させるかについては、当業者が研究目的、診断目的などにあわせて適宜選択すればよい。
【００３５】
本発明の検出用キット
本発明の検出用キットは、上述の通り、ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液と、炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液を含むものである。該キットに含まれるハイブリダイゼーション液及び低級アルコールは前述する通りである。また、当該キットを使用した場合のハイブリダイゼーション条件及び目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無の判断、検出手段に関しても、前述と同様に行うことができる。
【００３６】
また、本発明における検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡについても前述する通りであり、増幅産物も上記と同様にして得ることができる。また、利用するＰＮＡプローブも前述する通りである。
【００３７】
また、当該キットにはさらに１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含むことができるが、この場合、本発明のキットをさらに簡便に使用できるようにするためには、当該キットに１：４〜１００の比でセンスプライマーとアンチセンスプライマーが含まれていることが望ましい。また、本発明にはさらにＰＮＡチップを含むこともできるが、当該ＰＮＡチップは前述のものを含むことができる。また、本発明のキットには、当該キットを使用するプロトコールが記載された説明書なども含むことができる。
【００３８】
以上のことから、本発明の検出方法及び検出用キットによれば、短時間で効率よく目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無を判断することが可能となる。また、検体として、１：４〜１００のモル比のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用することにより得た増幅産物を含むものを用いた場合には、さらに効率良く目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出することが可能となる。さらに、上記のようなＰＮＡチップを用いることにより、競合ハイブリダイゼーションを必要することなく、より容易に目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出することが可能となる。
【００３９】
例えば、ＡＩＤＳ、ＳＡＲＳをはじめとする重篤な症状を示す感染症は、その治療が困難なことから、早期発見システムの確立が世界的に求められている。早期診断法を医療機関やベッドサイドへ導入することが予防方法として効果的であるが、従来の診断法は「時間がかかる・コストが高い・取り扱いが難しい」など問題点がある。
【００４０】
また、例えば、各種ウイルス疾患の診断においては、臨床徴候から疑われるウイルスの抗原（蛋白質）に対する抗体の検出により診断することが多い。しかしながら、ウイルス由来の抗原の発生には、ウイルス感染後数日を要し、従って、発病後でないと治療に結びつかない時間的な課題を解決する必要性がある。
【００４１】
また、近年、他の感染症と同様にウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡをＰＣＲ法を用いて検出する方法やハイブリダイゼーション法を用いて検出する方法が用いられている。しかしながら、例えばＤＮＡまたはＲＮＡチップを使用した方法では、上述するように結果を得るまでに時間や手間を要する。
【００４２】
本発明はこのような抗原抗体反応によってのみ正確な診断が可能であった感染症を早期に発見し、予防や治療に利用することも可能なものであり、また、ＤＮＡまたはＲＮＡチップを使用した場合より迅速、簡便かつ正確に診断することも可能なものである。
【００４３】
また、上記本発明は、ゲノム構造解析プロジェクトの成果をさらに発展させることを可能にするものであり、また、創薬研究・疾病の診断や予防法の開発などの研究開発をさらに効果的に行うことを可能にするものである。
【００４４】
２．ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法及び調製用キット
本発明の調製方法は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を、１：４〜１００の比でセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ることを特徴とする。また、本発明の検出用キットは、１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする。
【００４５】
ここで、該目的ＤＮＡまたはＲＮＡは前述する通りであり、本発明の調製方法及び調整用キットによれば、増幅産物もセンスプライマーとアンチセンスプライマーのモル比を１：４〜１００とする以外は前述と同様にして得ることができる。好ましくは、センスプライマーとアンチセンスプライマーのモル比を１：４〜５０、さらに好ましくは１：１０とするものである。また、当該調製方法及び／または調製用キットにより得られた増幅産物は、前述と同様してＰＮＡプローブとハイブリダイズさせることができ、また前述と同様して目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無を判断することができる。
【００４６】
また、当該キットにはさらに１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含むことができるが、この場合、本発明のキットをさらに簡便に使用できるようにするためには、当該キットに１：４〜１００の比でセンスプライマーとアンチセンスプライマーが含まれていることが望ましい。また、本発明にはさらにＰＮＡチップを含むこともできるが、当該ＰＮＡチップは前述のものを含むことができる。本発明の調整用キットにおいても、当該キットを使用するプロトコールが記載された説明書などを含むことができる。
【００４７】
前述するように、センスプライマーとアンチセンスプライマーのモル比を上記の比率にして増幅産物を得た場合には、増幅産物である目的ＤＮＡまたはＲＮＡとＰＮＡプローブとを一層効率良くハイブリダイズさせることが可能となる。
【００４８】
３．目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＰＮＡチップ
本発明のＰＮＡチップは、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを少なくとも備えることを特徴とし、該特徴を有するよう作製する以外は前述と同様にして得ることができる。
【００４９】
また、目的ＤＮＡまたはＲＮＡとしては前述と同様のものを使用することができ、また、増幅産物についても同様にして得ることができる。また、本発明のＰＮＡチップを用いた場合にも、前述と同様にしてＰＮＡプローブとハイブリダイズさせることができ、また前述と同様にして目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無を判断することができる。また、本発明のＰＮＡチップにはさらに、前述と同様にして、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を２つ有するＰＮＡプローブを備えることもできる。
【００５０】
従って、本発明のＰＮＡチップによれば、上述と同様に、例えばＳＮＰｓを判断することが可能であり、また同一疾患の各種遺伝子表現亜型を診断することも可能である。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄過程において、例えば１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブを配置したスポットに若干蛍光発光が残る程度に洗浄を制御することで、擬陽性の問題をクリアできる。
【００５１】
また、本発明のＰＮＡチップにおけるプローブの配置形態に関しても前述の記載を援用する。従って、このように配置させた場合には、前述と同様に各スポット間における蛍光強度を比較することがより容易になり、擬陽性の有無の判断が一層容易かつ正確となる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明の内容を以下の実施例及び比較例を用いて具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００５３】
（i）チップ上に貼り付けるＰＮＡオリゴマーの設計
実施例１：ＰＮＡチップ１
ヒトＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）ゲノムの塩基配列データは米国国立衛生研究所のゲノムデータベースから入手し、ＰＣＲのプライマーおよびＰＮＡプローブの配列を検討した。プライマー配列選択には、市販の遺伝子解析ソフトを用いた。ＰＣＲ用プライマーの塩基配列は次の通りである。
５’センスプライマー：ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴ（primer 1）（配列番号１）
３’センスプライマー：ＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧ（primer 2）（配列番号２）
このプライマーにより増幅される領域に相補的配列を有するＰＮＡオリゴマーを検出用ＰＮＡプローブとして選択し、常法によりＰＮＡオリゴマーを合成した。選択した塩基配列は次の通りである。
スポット１（ＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧ（probe 1）（配列番号３）
スポット２（ＨＣＶの塩基配列と２塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＡＡＧＣＣＴＣＴＡＧＧＣＡＴＧ（probe 2）（配列番号４）
スポット３（５’側上流に位置するＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡ（probe 3）（配列番号５）
スポット４（３’側下流に位置するＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ）：ＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣ（probe 4）（配列番号６）
スポット５（ＳＡＲＳコロナウイルス検出用プローブ、ネガティブコントロールとして使用）：ＡＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣ（probe 5）（配列番号７）
即ち、検出用ＰＮＡプローブとして、標的であるＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマー、当該ＰＮＡオリゴマーと２塩基のミスマッチを有するＰＮＡオリゴマー、前記ＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマーの５’末端側上流に位置するＰＮＡオリゴマー、前記ＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマーの３’側下流に位置するＰＮＡオリゴマー、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを順にデュプリケートで並べたＰＮＡチップ（以下、ＰＮＡチップ１）を作成した。当該ＰＮＡチップ１のスペックを図１に示す。なお、上記スポット１〜５はそれぞれ、図１の丸１〜丸５に相当する。
【００５４】
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate、ＳＤＳ）および２０％ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）を含む１ｘＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を用いた。ＰＮＡチップを、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温しておく。次に、ＨＣＶの一部の配列をターゲットとして作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物４μｌを、１６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップの上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置にいれて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ１の洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した。マイクロアレイ解析は、GeneTAC LSIV装置（Genomic Solution製）を用いて行った。
【００５５】
その結果、スポット１のみならず、スポット３及びスポット４において蛍光発光が観察されたが、スポット２及びスポット５では蛍光発光は観察されなかった。結果を図２に示す。これより、目的遺伝子の塩基配列と完全相補的な配列を有するプローブのみならず、その上流側の配列を有するプローブ、及びその下流側の配列を有するプローブによっても、目的遺伝子を認識できることがわかった。また、目的遺伝子の塩基配列と２塩基のミスマッチを有するプローブは、当該実験条件では目的遺伝子を認識しないことがわかった。
【００５６】
実施例２：ＰＮＡチップ２
実施例１で作成したＰＮＡチップ１を用いて機能評価を行った結果、「設計するＰＮＡオリゴマーの相補的ＤＮＡオリゴマーとのハイブリダイゼーション形成時における推定Ｔｍ値を統一すること」、「ＰＣＲ増幅産物の末端部分をターゲットとすること」、「当然のことながらハイブリダイズの条件を適宜調整することにより１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブにはハイブリダイズさせないようにできると予想されるので、２塩基ミスマッチＰＮＡオリゴマーのみではなく１塩基ミスマッチＰＮＡオリゴマーも採用すること」などの改良すべき点が浮き彫りになった。
【００５７】
そこで、実施例１で選択したプライマー領域に相補的配列を有するＰＮＡオリゴマーを検出用ＰＮＡプローブとして選択し、常法によりＰＮＡオリゴマーを合成した。選択した塩基配列は次の通りである。
スポット１（ＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ、Ｔｍ値が５５℃付近となるように設計した）：ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡ（probe 6）（配列番号８）
スポット２（ＨＣＶの塩基配列と１塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡ（probe 7）（配列番号９）
スポット３（ＨＣＶの塩基配列と２塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＣＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＣＣＣＡ（probe 8）（配列番号１０）
スポット４（１６塩基分５’側上流に位置するＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴ（probe 9）（配列番号１１）
スポット５（ネガティブコントロールとして使用）：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ（probe 10）（配列番号１２）
即ち、検出用ＰＮＡプローブとして、標的であるＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマー、当該ＰＮＡオリゴマーと１塩基のミスマッチを有するＰＮＡオリゴマー、前記ＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマーと２塩基のミスマッチを有するＰＮＡオリゴマー、前記ＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマーの配列の１６塩基分５’末端側上流に位置するＰＮＡオリゴマー、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを順にデュプリケートで並べたＰＮＡチップ（以下、ＰＮＡチップ２）を作成した。当該ＰＮＡチップ２のスペックを図３に示す。なお、上記スポット１〜５はそれぞれ、図３の丸１〜丸５に相当する。
【００５８】
実施例１と同様に各スポットの蛍光輝度を測定した。なお、ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ２の洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した場合、１分間攪拌した場合及び３分間攪拌した場合を比較した。
【００５９】
その結果、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した場合には、スポット１のみならず、スポット２及びスポット４においても蛍光発光がみられた（図４）。また、スポット２とスポット３は、スポット１と比較して徐々に蛍光発光強度が減少することが観察された。
【００６０】
また、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間攪拌した場合及び３分間攪拌した場合には、ＨＣＶの塩基配列と１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブを固定したスポット２及び３では蛍光発光はほとんど観察されなかった。
【００６１】
（ii）ＰＣＲ条件の検討
実施例３：ＰＣＲ条件の検討１
サンプルとして、ＨＣＶ感染血液を用いた。ＰＣＲはキット製造業者のマニュアル通りに行った。まず、Rneasy Mini Kit (QIAGEN製)を用いて、血清１４０μｌからＲＮＡ分画を精製した。次に、Sensiscript RT Kit (QIAGEN製)を用いて、上記のＲＮＡ溶液１０μｌから、２０μｌのＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を得た。インキュベーション条件は、３７℃、６０分間で逆転写反応を行い、９３℃、５分間で反応を停止させた。ＨＣＶのコア領域を増幅するプライマーのペア（Roche株式会社のAmpliCore Kitにあるプライマーと同等のＤＮＡオリゴヌクレオチド）を準備した。５’末端側のセンスプライマー（ＨＣＶ００１）（配列番号１３）と３’末端側のアンチセンスプライマーの５’末端を蛍光色素Ｃｙ５で標識したもの（ＨＣＶ００２）（配列番号１４）を用いた（表１）。ＨＣＶ００１とＨＣＶ００２のモル比は１：１０となるように調整した。５μｌのＲＴ−ＰＣＲ増幅産物をＰＣＲ用ミックスで１００μｌとし、Gene Amp PCR System 9600-R（Perkin Elmer社製）を使って、４０回増幅した。このときＰＣＲ増幅条件として、９４℃で３分間、６６℃で１分間、７２℃で１分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、６６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３８サイクル、９４℃で３０秒間、６６℃で３０秒間、７２℃で５分間を１サイクル、を採用した。この条件は、Roche株式会社のプロトコールに従った。
【００６２】
【表１】
【００６３】
ＰＴ−ＰＣＲ増幅産物の出来状況は標準的電気泳動方法によって確認した。即ち、電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド液中に１５分間浸し、その後２０分間蒸留水中で洗浄して染色した。紫外線照射により発色したバンドを、デジタルカメラにて撮影することにより観察した。その結果、長さの異なったバンドの存在もなく、目的とする分子量を有するバンドのみ存在することがわかった。
【００６４】
得られたＰＣＲ増幅産物を用いて、ＰＮＡチップ２によるハイブリダイゼーション実験を実施した。その結果、スポット１、スポット２及びスポット４において蛍光発光が観察され、スポット２ではスポット１及び４より低い輝度で蛍光発光が観察された。また、スポット３及びスポット５では蛍光発光は観察されなかった。これより、センスプライマーとアンチセンスプライマーのモル比を１：１０として調製した増幅産物を検体として使用した場合には、ＰＮＡプローブを使用して目的遺伝子を良好に検出できることがわかった。
【００６５】
比較例１：ＰＣＲ条件の検討２
実施例３に記載の５’末端側のセンスプライマー（ＨＣＶ００１）と３’末端側のアンチセンスプライマーの５’末端を蛍光色素Ｃｙ５で標識したもの（ＨＣＶ００２）の比が１：１となるように調整し、実施例３の条件に従いＰＴ−ＰＣＲを実施した。その結果、長さの異なったバンドの存在もなく、目的とする分子量を有するバンドのみ存在することがわかった。
【００６６】
このＰＴ−ＰＣＲ増幅産物を用いて、ＰＮＡチップ２によるハイブリダイゼーション実験を実施したが、実施例３ほど効率良く明瞭なスポットは観察できなかった。これは、上記プライマー比１：１のＰＴ−ＰＣＲ増幅産物は、そのほとんどが２本鎖を形成しているために、ＰＮＡとのハイブリ形成が両区に起こりにくいことが示唆された。
【００６７】
（iii）ハイブリダイゼーション条件の検討
実施例４：ハイブリダイゼーション液の検討１
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ２を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップ２の上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ２の洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間または５分間静置した。その結果、いずれの条件においても鮮明なスポットを確認することが出来た（図５）。また、上記０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間または５分間攪拌洗浄を行った場合も、鮮明なスポットを確認することが出来た（図５）。
【００６８】
比較例２：ハイブリダイゼーション液の検討２
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＦ（dimethylformamide）を含む５ｘＳＳＰＥを用いた。しかし、ＤＭＦを加えた時点で、ハイブリダイゼーション液が白濁した。ＤＭＦの量を１０％〜５０％まで変化させたが、白濁したままであった。ハイブリダイゼーションをそのまま続行してマイクロアレイ解析を行ったが、全くスポットを確認できなかった。
【００６９】
比較例３：ハイブリダイゼーション液の検討３
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＮＭＰ（N-methylpyroridon）を含む５ｘＳＳＰＥを用いた。しかし、ＮＭＰを加えた時点で、ハイブリダイゼーション液が白濁した。ＮＭＰの量を１０％〜５０％まで変化させたが、白濁したままであった。ハイブリダイゼーションをそのまま続行してマイクロアレイ解析を行ったが、全くスポットを確認できなかった。
【００７０】
比較例４：ハイブリダイゼーション液の検討４
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび５０％ホルムアルデヒド含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ１を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌのハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップ１の上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ１の洗浄は、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずしただけのものと、さらに０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で５または１０分間攪拌洗浄を行ったものを用いて、洗浄方法及び時間について検討した。
【００７１】
その結果、いずれの場合もスポット１においては蛍光発光の確認が出来ず、上流側のスポット３においてのみ蛍光発光が確認された（図６）。また、洗浄を行うことによって、スポットの蛍光発光が薄くなり、ＰＴ−ＰＣＲ増幅産物がはがれていくことが観察された（図６）。このことから、本ハイブリダイゼーション液は不適切であることが分かった。
【００７２】
実施例５：洗浄液の検討１
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ２を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、３６℃或いは５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップの上に丁寧に載せて３６℃或いは５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、５、１５、３０、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップの洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した。また、一部のサンプルではさらに３または５分間、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中での攪拌洗浄を行った。
【００７３】
その結果、５分間攪拌することにより洗浄した場合、ハイブリダイゼーション温度が５０℃の時のほうが３６℃の時よりも蛍光発光強度が強かったことから（図７及び図８）、３６℃でのハイブリダイゼーションは予想以上の量のＰＴ−ＰＣＲ増幅産物がハイブリダイズしていることが予想された。即ち、このことは、ハイブリ時間３０分で５分間攪拌まで洗浄した場合、３６℃でのスポットの蛍光発光強度は顕著に減少しているのに対して、５０℃の場合にはその傾向が少なく標的をしっかりと認識していることからも推測できた。従って、ハイブリ温度は３６℃より５０℃のほうが有効であると判明した。また、ハイブリ時間は５分間から６０分間へと時間を長くするほど、蛍光強度が強くなった。ただし、ハイブリ時間が５分間であっても、ハイブリ温度５０℃であって、１分間静置または攪拌により洗浄した場合に、良好な結果を得ることができた。
【００７４】
実施例６
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ２を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップの上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップの洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した。また、一部のサンプルではさらに３または６分間の０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中での攪拌洗浄を行い、洗浄方法及び時間について検討した。
【００７５】
その結果、３または６分間の攪拌洗浄のいずれの場合も、スポット１及びスポット４の蛍光発光が明瞭に確認できた。結果を図９に示す。しかし、３分間の攪拌洗浄の場合、スポット２において蛍光発光が観察されたのに対し、６分間の場合にはスポット２の蛍光発光はほとんど消滅していることが判明した。これは６分間の攪拌洗浄が不適切であるということを示すものではないが、スポット２が消滅する直前で攪拌洗浄を止めても、スポット１及び４の蛍光発光に影響を与えないことから、洗浄方法をスポット２の蛍光発光の有無で制御可能であることを示すものである。
【００７６】
比較例５
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２５％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ１を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップ１の上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ１の洗浄は、７０％イソプロパノール水溶液中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置した。場合によっては、５、１０分間の０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ溶液中での攪拌洗浄を行い、洗浄方法及び時間について検討した。
【００７７】
その結果、洗浄内容に関わらず、チップ表面の汚れが取れておらず、イソプロパノールの使用は不適切であることがわかった（図１０）。
【００７８】
比較例６
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび１０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ１を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップ１の上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、１２０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ１の洗浄は、１０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥ溶液中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後、５分間攪拌した。場合によっては、さらに５分間の１０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥ溶液中での攪拌洗浄を行い、洗浄方法及び時間について検討した。
【００７９】
その結果、スポットの蛍光発光の検出は可能であったが、スポット１よりもスポット２及びスポット３の蛍光強度が強く、判定する上で不適切であることが判明した。また、洗浄条件の違いに関わらず、同一の洗浄条件においても、スポットの蛍光強度のばらつきがあった。また、１０分洗浄後のスポットは明瞭に確認することが困難であり、５分洗浄との時間的な微妙な差が、スポット強度に与える影響がこれだけ鮮明になることから、操作性の厳密さが要求されることが分かった。
【００８０】
（iv）ＤＮＡチップを用いた目的遺伝子の検出（比較例７）
従来のＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションの条件で実験を開始したところ、ハイブリダイゼーションは２時間で認められることが判明した。しかし、さらなる洗浄条件の検討から、より少ない塩濃度でのハイブリダイゼーション液で反応を行う方が、より結合する力が強いと考えられた。さらに、ハイブリダイゼーション液中のＳＤＳ濃度を０．０１％から１．０％まで変化させたところ、影響は少ないことが確認できた。ただし、ＳＤＳを添加しない場合には、バックグラウンドが汚れてくることが確認できたので、従来通り、１％ＳＤＳをハイブリダイゼーション液に用いた。
【００８１】
（v）本願発明のＰＮＡチップとＤＮＡチップとの比較（実施例７）
下記に示す検出用ＰＮＡプローブに対応した検出用ＤＮＡプローブを合成し、同一チップ基板上に貼り付けたＰＮＡチップ３を作製した（図１１）。選択した塩基配列は次の通りである。
スポット１（ＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ（probe 11）（配列番号１５）
スポット２（ＨＣＶの塩基配列と中心付近で１塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＴＣＧＣＡＡＧＧＡＣＣＣＴＡＴＣＡ（probe 12）（配列番号１６）
スポット３（ＨＣＶの塩基配列と末端で１塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＧＡ（probe 13）（配列番号１７）
スポット４（１６塩基分５’側上流に位置する、ＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡ（probe 14）（配列番号１８）
スポット５（ネガティブコントロールとして使用）：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ（probe 15）（配列番号１９）
スポット６：ＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ（probe 16）（配列番号２０）
スポット７（スポット６として配置したプローブの塩基配列と中心付近で１塩基のミスマッチを有するＤＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＴＣＧＣＡＡＧＧＡＣＣＣＴＡＴＣＡ（probe 17）（配列番号２１）
スポット８（スポット６として配置したプローブの塩基配列と末端で１塩基のミスマッチを有するＤＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＧＡ（probe 18）（配列番号２２）
スポット９（１６塩基分５’側上流に位置する、スポット６として配置したプローブの塩基配列と完全相補的な配列を有するＤＮＡプローブ）：ＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡ（probe 19）（配列番号２３）
スポット１０（ネガティブコントロールとして使用）：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ（probe 20）（配列番号２４）
当該ＰＮＡチップ３のスペックを図１１に示す。なお、上記スポット１〜１０はそれぞれ、図１１の丸１〜丸１０に相当する。また、各ＰＮＡプローブは順にデュプリケートで並べた。
【００８２】
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。上記ＰＮＡチップ３を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップの上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、５〜６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップの洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後１分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置、さらに３分間の０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中での攪拌洗浄を行った。
【００８３】
その結果を図１２に示す。ＰＮＡプローブを配置させたスポットのほうが、ＤＮＡプローブを配置させたスポットより、良好な蛍光発光結果が得られた。これより、ＰＮＡプローブのほうがＤＮＡプローブよりもハイブリ能力が高いことが判明した。また、ハイブリ時間を変化させた場合も、その傾向は同様であった。
【００８４】
（vi）ＰＮＡプローブの長さの検討（実施例８）
下記に示す検出用ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーション時における長さの影響を調べるために、Ｔｍ値が５５度付近となる１７ｍｅｒのＰＮＡプローブ（スポット１〜５に対応）とＴｍ値が３５度付近となる１２ｍｅｒのＰＮＡプローブ（スポット６〜１０に対応）を合成し、同一チップ基板上に貼り付けたＰＮＡチップ４を作製した（図１３）。選択した塩基配列は次の通りである。
スポット１：ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡ（probe 21）（配列番号２５）
スポット２（スポット１として配置したプローブの塩基配列と中心付近で１塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡ（probe 22）（配列番号２６）
スポット３（スポット１として配置したプローブの塩基配列と末端で２塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＣＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＣＣＣＡ（probe 23）（配列番号２７）
スポット４（１６塩基分５’側上流に位置する、スポット１として配置したプローブの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴ（probe 24）（配列番号２８）
スポット５（ネガティブコントロールとして使用）：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ（probe 25）（配列番号２９）
スポット６：ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴ（probe 26）（配列番号３０）
スポット７（スポット６として配置したプローブの塩基配列と中心付近で１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＣＴ（probe 27）（配列番号３１）
スポット８（スポット６として配置したプローブの塩基配列と末端で２塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＧＴＡＡＧＣＣＴＣＴ（probe 28）（配列番号３２）
スポット９（１６塩基分５’側上流に位置する、スポット６として配置したプローブの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ）：ＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧ（probe 29）（配列番号３３）
スポット１０（ネガティブコントロールとして使用）：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ（probe 30）（配列番号３４）
当該ＰＮＡチップ４のスペックを図１３に示す。なお、上記スポット１〜１０はそれぞれ、図１３の丸１〜丸１０に相当する。また、各ＰＮＡプローブは順にデュプリケートで並べた。
【００８５】
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。上記ＰＮＡチップを、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップの上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップの洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した。一部のサンプルではさらに３分間の０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中での攪拌洗浄を行った。
【００８６】
その結果を図１４に示す。ＰＮＡプローブの長さが１７ｍｅｒと１２ｍｅｒでは、プローブの長さにより各スポットの輝度は異なるものの、いずれの場合も目的遺伝子を検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、ＰＮＡチップ１のスペックを示す。
【図２】図２は、ＰＮＡチップ１を使用したハイブリダイゼーション結果を示す。
【図３】図３は、ＰＮＡチップ２のスペックを示す。
【図４】図４は、ＰＮＡチップ２を使用したハイブリダイゼーション結果を示す。
【図５】図５は、２０重量％のＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液を使用したハイブリダイゼーション結果を示す。
【図６】図６は、５０重量％のホルムアルデヒドを含むハイブリダイゼーション液を使用したハイブリダイゼーション結果を示す。
【図７】図７は、５０℃でハイブリダイズさせたハイブリダイゼーション結果を示す。
【図８】図８は、３６℃でハイブリダイズさせたハイブリダイゼーション結果を示す。
【図９】図９は、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＰＥを使用した洗浄条件の検討結果を示す。
【図１０】図１０は、７０重量％のイソプロパノールを洗浄液として使用したハイブリダイゼーション結果を示す。
【図１１】図１１は、ＰＮＡチップ３のスペックを示す。
【図１２】図１２は、ＰＮＡチップとＤＮＡチップの比較結果を示す。
【図１３】図１３は、ＰＮＡチップ４のスペックを示す。
【図１４】図１４は、ＰＮＡチップにおけるＰＮＡプローブの長さの検討結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号１はprimer 1の塩基配列を示す。
配列番号２はprimer 2の塩基配列を示す。
配列番号３はprobe 1の塩基配列を示す。
配列番号４はprobe 2の塩基配列を示す。
配列番号５はprobe 3の塩基配列を示す。
配列番号６はprobe 4の塩基配列を示す。
配列番号７はprobe 5の塩基配列を示す。
配列番号８はprobe 6の塩基配列を示す。
配列番号９はprobe 7の塩基配列を示す。
配列番号１０はprobe 8の塩基配列を示す。
配列番号１１はprobe 9の塩基配列を示す。
配列番号１２はprobe 10の塩基配列を示す。
配列番号１３はHCV001 primerの塩基配列を示す。
配列番号１４はHCV001 primerの塩基配列を示す。
配列番号１５はprobe 11の塩基配列を示す。
配列番号１６はprobe 12の塩基配列を示す。
配列番号１７はprobe 13の塩基配列を示す。
配列番号１８はprobe 14の塩基配列を示す。
配列番号１９はprobe 15の塩基配列を示す。
配列番号２０はprobe 16の塩基配列を示す。
配列番号２１はprobe 17の塩基配列を示す。
配列番号２２はprobe 18の塩基配列を示す。
配列番号２３はprobe 19の塩基配列を示す。
配列番号２４はprobe 20の塩基配列を示す。
配列番号２５はprobe 21の塩基配列を示す。
配列番号２６はprobe 22の塩基配列を示す。
配列番号２７はprobe 23の塩基配列を示す。
配列番号２８はprobe 24の塩基配列を示す。
配列番号２９はprobe 25の塩基配列を示す。
配列番号３０はprobe 26の塩基配列を示す。
配列番号３１はprobe 27の塩基配列を示す。
配列番号３２はprobe 28の塩基配列を示す。
配列番号３３はprobe 29の塩基配列を示す。
配列番号３４はprobe 30の塩基配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法及び検出用キット、ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法及び調製用キット、ならびに目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＰＮＡチップに関するものであり、より簡便、正確、短時間に目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出すること可能にするものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、目的の遺伝子を検出する方法として、ダイレクト・ハイブリダイゼーション法や遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）を用いた方法などが利用されている。また、近年、多数のプローブを貼り付けたＤＮＡチップが発明され、研究および医療の診断などの分野で用いられ始めている。一般的なＤＮＡチップの大きさは１〜１０ｃｍ２で、この領域に数千〜数十万種のＤＮＡを整列させるように固定化する。一般的に、蛍光標識ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより発現遺伝子や多型を検出する。検出には１〜１０μｍの解像度をもつ高性能蛍光スキャナーが用いられている。ＤＮＡチップ技術は、ポストゲノムの研究課題としてゲノム構造解析プロジェクトの成果を飛躍的に発展させる新しい技術として開発され、創薬研究・疾病の診断や予防法の開発などの研究開発に新しい手段を提供するものと期待されている。この手法は、その原理がシンプルなこと、大量の遺伝子の発現情報等を一括して収集できること、蛍光ラベルを用いて視覚に訴えることなどその分かりやすさから広まりつつある。
【０００３】
しかし、ＤＮＡチップには核酸同士の結合力によりハイブリダイゼーションさせる原理が採用されているため、インキュベーション時間を長くとる必要があるという欠点を有する。元来ＤＮＡチップは６０−８０塩基の長さを有するＤＮＡプローブをチップ基板上に貼り付けたものが多く、これを競合ハイブリダイゼーションによって解析する方法が一般的である。しかし、当該ＤＮＡプローブは塩基数が多いため、１塩基のミスマッチを認識する必要がある一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphisms、以下ＳＮＰｓ）解析には不向きであり、そのため２０−３０塩基程度のショートオリゴＤＮＡを用いたチップも考案されている。しかしながら、ＤＮＡプローブの塩基数を少なくした場合にはハイブリダイゼーションの効率が低下するので、ハイブリ時間を長くする必要があり、短時間で結果を得ることができない。このため、ＤＮＡチップは精度や感度の面で技術的にはまだまだ開発段階にある。また、ＤＮＡチップの精度を評価するためには多検体解析後、分布図を作成しなければならないなどの手間や時間を要する。
【０００４】
ＥＣＡ（Electronic Chemical Array）チップは合成オリゴＤＮＡ（８０塩基）を金の微小電極上に共有結合させたセラミック・チップである。このチップのアレイが微小電極と相同しており、標的遺伝子を捕捉した電極にだけ電流が流れるので、電気信号として標的遺伝子を検出できることを特徴とする。従来のＤＮＡチップが標識されたＤＮＡを試料として使用するのに対し、無標識で測定にかけられるＥＣＡチップは高感度でＰＣＲが不要になる。また、ＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance）はＤＮＡチップ・ＥＣＡチップと比べると集積化がよくないが、生態環境に一番近い状態で速度論的な解析ができるという点で非常に興味深い。
【０００５】
一方、１９９１年頃から、擬似核酸の一種であるペプチド核酸（Peptide nucleic acid、以下ＰＮＡ）が開発され、注目されている（非特許文献１）。例えばＰＮＡ／ＤＮＡやＰＮＡ／ＲＮＡの熱に対する安定性は、ＤＮＡ／ＤＮＡやＤＮＡ／ＲＮＡよりも極めて高いことが証明されているため、ＰＮＡを用いた場合、ハイブリダイゼーション温度を従来に比べて高くすることが可能であり、ＰＮＡと目的の核酸以外の非特異的結合をより抑えることができると推測される。また、ＤＮＡ／ＤＮＡの場合は、リン酸基のもつ負電荷をできるだけ抑えるために塩濃度を一定値以上に設定する必要があるが、ＰＮＡ／ＤＮＡの場合はＰＮＡ自体が負電荷をもたない中性高分子であるので塩濃度の影響をほとんど受けない。従って、ハイブリダイゼーションは酸性、塩基性、低イオン強度下でも可能であり、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブで用いられるハイブリダイゼーションバッファーなどにおける規則が必要なくなると推測され、ＰＮＡプローブでは蒸留水で希釈するだけでよく、作業上の手間を軽減可能であると期待される。さらに、ＤＮＡやＲＮＡの糖リン酸バックボーンは負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、ＰＮＡの場合はもともと電荷を持たないので静電的な反発が無い。
【０００６】
このように、ＰＮＡは従来の核酸と比較して、（１）高い二重鎖形成能、（２）高い塩基配列認識能を持ち、（３）生体内ヌクレアーゼ・プロテアーゼに対し非常に安定で分解されないので、ＰＮＡはアンチセンス分子として、ＤＮＡに代わる分子生物学や遺伝子工学に利用価値の高いツールとして非常に注目を集めるようになった。
【０００７】
しかし、ＰＮＡには、合成が困難であることやＰＮＡオリゴマーが細胞膜を透過しにくいという欠点がある。また、ＰＮＡプローブをチップに固定させてＤＮＡチップと同様に使用しようとしても、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に検出することは困難であり、ＰＮＡのより効果的な利用方法の模索が続いている。
【非特許文献１】Perry-O’Keefe, H. et al., J. Microbiol. Method., Vol.47, pp. 281-292 (2000).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記従来技術を背景として、本発明者らは簡便なＰＮＡの高度処理技術の構築を試みた。すなわち、本発明は、より簡便、正確かつ短時間に検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できるＰＮＡプローブを利用した検出方法及び検出用キットを提供することを目的とする。また、本発明は、ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法及び調製用キットを提供することを目的とする。さらに本発明は、競合ハイブリダイゼーションを要することなく、より正確かつ容易に目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無を判断することができるＰＮＡチップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑み研究を行ったところ、本発明者は、検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡとこれとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide、ＤＭＳＯ）を含有させたハイブリダイゼーション液中でインキュベートすることによりハイブリダイズさせ、得られたハイブリダイズ産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄することにより、ＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとを短時間でハイブリダイズさせることが可能であることを見出した。また、本発明者は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅させた後に得られた増幅産物をＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる際、１：４〜１００のモル比でセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて目的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を得た場合に、より効率良く目的ＤＮＡまたはＲＮＡとＰＮＡプローブとをハイブリダイズできることを見出した。また、本発明者は、ＰＮＡチップを、少なくとも目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つだけ有するＰＮＡプローブ、及び目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズしないＰＮＡプローブを備えたものとすることにより、より正確かつ容易に目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できることを見出した。本発明は上記知見に基づきさらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。
項１．ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、以下の工程、
（１）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液中で検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡと、該目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、ハイブリダイズできる条件下でインキュベートする工程、
（２）前記工程（１）の産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄する工程、及び
（３）前記工程（２）の後にＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物の有無を検出する工程、
を含むことを特徴とする、検出方法。
項２．前記ハイブリダイゼーション液のＤＭＳＯの濃度が約５〜６０重量％である、項１に記載の検出方法。
項３．前記洗浄溶液の炭素数１〜４の低級アルコール濃度が５０〜１００重量％である、項１に記載の検出方法。
項４．目的ＤＮＡまたはＲＮＡが、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜１００の比で用いて得られた増幅産物である、項１に記載の検出方法。
項５．前記ＰＮＡプローブがチップ上に配置されたＰＮＡチップを用いて目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する、項１に記載の検出方法。
項６．前記ＰＮＡチップが、少なくとも、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを備えるものである、項５に記載の検出方法。
項７．ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出用キットであって、以下、
（i）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液、及び
（ii）炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液、
を含むことを特徴とする、キット。
項８．さらに、１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含む、項７に記載のキット。
項９．さらに、前記ＰＮＡプローブがチップ上に配置されたＰＮＡチップを含む、項７に記載のキット。
項１０．ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法であって、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜１００の比で用いてＰＣＲを行うことにより得ることを特徴とする、調製方法。
項１１．ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製用キットであって、１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする、キット。
項１２．目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＰＮＡチップであって、少なくとも、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを備えることを特徴とする、ＰＮＡチップ。
項１３．前記目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブと、前記目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブと、前記ネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブが隣接して配置されているものである、項１２に記載のＰＮＡチップ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法及び検出用キット
本発明の検出方法は、（１）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液中で検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡと、該目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、ハイブリダイズできる条件下でインキュベートする工程、（２）前記工程（１）の産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄する工程、及び（３）前記工程（２）の後にＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物の有無を検出する工程、を含むことを特徴とする。また、本発明の検出用キットは、（i）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液、及び（ii）炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明においてハイブリダイズできるとは、ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液と炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液を用いるハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせた場合に、目的ＤＮＡまたはＲＮＡと該目的ＤＮＡまたはＲＮＡを標的とするＰＮＡプローブとのハイブリダイズ産物が得られることをいう。以下、本発明の検出方法及び検出用キットを詳細に説明する。
【００１２】
本発明の検出方法
本発明の検出方法は、上述の通り、ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液中で検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡと、該目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、これらがハイブリダイズできる条件下でインキュベートする工程（１）を含む。具体的には該工程は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを含む検体を、ハイブリダイゼーション液に混和し、この混和液を、目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズできるＰＮＡプローブ存在下で適切な時間・温度でインキュベートするものである。該ＰＮＡプローブはあらかじめ加温しておくことが好ましい。
【００１３】
この場合、インキュベーション温度は目的ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡプローブの塩基配列、ＰＮＡプローブの長さなどに応じて適宜調節でき、好ましくは３６〜５０℃の範囲であり、さらに好ましくは５０℃である。また、インキュベーション時間も、目的ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡプローブの塩基配列、ＰＮＡプローブの長さなどに応じて適宜調節でき、好ましくは５〜６０分であり、さらに好ましくは６０分である。ＰＮＡプローブの加温温度は制限されないが、好ましくは上記インキュベーション温度と同じ温度である。
【００１４】
なお、本発明において使用するハイブリダイゼーション液は次のように説明できる。ハイブリダイゼーション液は、通常使用されているハイブリダイゼーション液にＤＭＳＯを加えることにより作成されたものであればよい。ハイブリダイゼーション液のＤＭＳＯ濃度は、好ましくは約５〜６０重量％、さらに好ましくは２０〜２５重量％である。一例として、ハイブリダイゼーション液として、ＤＭＳＯを加えた、１重量％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＰＥが使用できる。
【００１５】
また、本発明の検出方法は、上述の通り、工程（１）の産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄する工程（２）を含む。具体的には該工程は、工程（１）で得られた検体中のＤＮＡまたはＲＮＡとプローブとのハイブリダイズ産物を、炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液に接触させることにより、ＰＮＡプローブと付着しているだけのＤＮＡまたはＲＮＡなど、ＰＮＡプローブとハイブリダイズしていないＤＮＡまたはＲＮＡを除去するものである。
【００１６】
ここで、洗浄は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡプローブの塩基配列、ＰＮＡプローブの長さなどに応じて適宜調節された温度で行うことができるが、好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下であり、さらに温度管理の手間を要しない点から室温がより好ましい。また、洗浄は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡプローブの塩基配列、ＰＮＡプローブの長さなどに応じて適宜調節された時間行うことができるが、短時間で検出できる点から好ましくは１〜３０分、さらに好ましくは１〜１５分である。
【００１７】
本発明において使用する洗浄液は次のように説明できる。洗浄液は通常使用されている洗浄液に炭素数１〜４の低級アルコールを加えることにより作成されたものであればよいが、好ましくは蒸留水などの水に低級アルコールを加えることにより作成されたものである。洗浄液中の低級アルコール濃度は５０〜１００重量％とすることができ、好ましくは８０〜１００重量％、さらに好ましくは１００重量％である。炭素数１〜４の低級アルコールの例としてはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられ、好ましくはエタノールである。
【００１８】
上記ハイブリダイゼーション液及び洗浄液を使用することにより、目的ＤＮＡまたはＲＮＡと、目的ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズできるＰＮＡプローブとのハイブリダイズ産物を高い精度で得ることができる。また、上記ハイブリダイゼーション液及び洗浄液を使用することにより、ＰＮＡプローブに単に付着しているだけでハイブリダイズしていないＤＮＡまたはＲＮＡを効果的に除去することができる。
【００１９】
このため、上記ハイブリダイゼーション液及び洗浄液を使用することにより、目的ＤＮＡまたはＲＮＡとＰＮＡプローブを短時間でハイブリダイズさせることができ、かくして得られるハイブリダイズ産物の蛍光発光等のシグナルを、以下説明する工程（３）において鮮明に観察することができる。
【００２０】
なお、上記工程（２）の後、必要に応じてさらに洗浄することができ、例えば０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥにより洗浄することができる。
【００２１】
本発明の検出方法は、上述の通り、ＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物の有無を検出する工程（３）を含む。具体的には該工程は、ＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物の有無を、該ハイブリダイズ産物由来のシグナルの有無またはシグナル強度により判別するものである。該シグナルは、例えばあらかじめプローブに標識しておいた標識剤や蛍光色素に基づいて得ることができ、当該シグナル、シグナル強度は蛍光顕微鏡やスキャナー等の従来公知の装置を用いて観察、測定することができる。そして例えば、ＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物由来のシグナルが観察されれば検体中に目的ＤＮＡまたはＲＮＡが存在すると判定され、観察されなければ存在しないと判定される。
【００２２】
本発明において使用する上記検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡは次のように説明できる。検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルス由来、細菌由来、ニワトリ由来、ブタ由来、ヒト由来など、その由来は制限されない。また、該検体は目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無を判断できるように調製されたものであればよく、例えば検体として、何らかの細胞膜透過処理を施した細胞を含むものでもよく、抽出された目的ＤＮＡまたはＲＮＡそのものを含むものでもよく、またＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲ等による目的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を含むものであってもよい。
【００２３】
検体として目的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を使用する場合、当該増幅産物は通常の方法に従い得ることができる。目的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を得る場合には、上述するように例えばＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ法が使用できるが、温度、時間、サイクル数などの各ＰＣＲ条件、また逆転写反応条件は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはプライマーの塩基配列、長さなど応じて適宜調整される。当該調整は、当業者であれば予備的実験等を経ることにより容易成し得る。使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーについては、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜１００のモル比で用いて増幅産物を得ることが好ましく、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜５０のモル比で用いることがより好ましく、これらを１：１０のモル比で用いることがさらに好ましい。
【００２４】
センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：１のモル比で用いて得た増幅産物を使用した場合と、これらのモル比を１：１０で用いて得た増幅産物を使用した場合を比較すると、前者より後者のほうが、目的ＤＮＡまたはＲＮＡとＰＮＡプローブとをより効率良くハイブリダイズさせることができ、ハイブリダイズ産物をより明瞭に検出することができる。
【００２５】
本発明において使用するＰＮＡプローブは次のように説明できる。ＰＮＡプローブは目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できるものであれば限定されず、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的なものでもよく、完全相補的でないものでもよく、プローブの塩基配列および長さ、ハイブリダイゼーションの条件などに応じて適宜決定できる。好ましくは、ＰＮＡプローブは目的ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部の領域の塩基配列と完全相補的なもの（以下、ＰＮＡプローブ１と称することもある）、前記領域と１塩基のミスマッチを有するものであり（以下、ＰＮＡプローブ２と称することもある）、さらに好ましくはＰＮＡプローブ１である。また、本発明のＰＮＡチップには、さらにネガティブコントロールとなるプローブを固定させることが好ましい。ここでネガティブコントロールとなるプローブとは、目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズしないプローブを意味する。
【００２６】
なお、本発明において「目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ」とは、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部分の領域と完全相補的であるプローブを指し、これは目的ＤＮＡまたはＲＮＡの全塩基配列のうち一部分の領域と完全相補的なプローブだけでなく、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの全塩基配列と完全相補的なプローブも含む。また、本発明において「目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ」は、好ましくは前記「目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ」の塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブである。
【００２７】
また、本発明において使用するＰＮＡプローブは、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できるだけの長さを有しているものであれば限定されず、好ましくはＰＮＡプローブとしてのＰＮＡオリゴマーを約１２〜２０ｍｅｒとすることができる。また、ＰＮＡプローブはビオチンなどの各種標識剤で標識することができ、またＣｙ３、Ｃｙ５などの各種蛍光色素で標識することもできる。また、ＰＮＡプローブは、チップ上に固定されたものでもよく、またチップ上に固定されていないものでもよい。
【００２８】
チップ上に固定されたＰＮＡプローブを使用する場合、すなわちＰＮＡチップを使用する場合、当該ＰＮＡチップはガラス、プラスチック、セラミックなどのチップ材料として一般的に用いられている基板上に、既に合成したＰＮＡプローブを貼り付けることにより作製されたものでもよく、また当該基板上でＰＮＡプローブを合成することにより作製されたものでもよい。ＰＮＡチップには当然のことながら複数のＰＮＡプローブを固定させることができるが、推定Ｔｍ値を統一したプローブを固定することが好ましい。また、この場合、ＰＮＡプローブは、目的ＤＮＡまたはＲＮＡまたは増幅産物の任意の部分をターゲットとするものであればよく、好ましくは目的ＤＮＡまたはＲＮＡまたは増幅産物の末端部分をターゲットとするものである。また、ＰＮＡチップに配置される複数のＰＮＡプローブは、検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出できる組み合わせであれば制限されない。
【００２９】
例えば、目的ＤＮＡまたはＲＮＡと他のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて１塩基の違いを判別したい場合には、チップには少なくとも前記ＰＮＡプローブ１と、前記ＰＮＡプローブ２がともに固定される。この場合、ＰＮＡプローブ１と目的ＤＮＡまたはＲＮＡとは効率良くハイブリダイズできるが、ＰＮＡプローブ２と目的ＤＮＡまたはＲＮＡとは全くハイブリダイズしないハイブリダイゼーション条件に適宜調整する、すなわち上記工程（１）及び工程（２）の条件を適宜調整することにより、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に検出することができる。このため、本発明の方法によれば例えばＳＮＰｓを判断することが可能であり、また同一疾患の各種遺伝子表現亜型を診断することも可能である。
【００３０】
また、ほかの例は、ＰＮＡチップには、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部の領域の塩基配列と完全相補的なＰＮＡプローブ１と、当該領域の塩基配列と１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブ２と、当該領域と２塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブ（以下、ＰＮＡプローブ３と称することもある）をともに固定させることができる。この場合には、ハイブリダイゼーション条件、すなわち上記工程（１）及び工程（２）の条件を適宜調整することにより、ＰＮＡプローブ１と目的ＤＮＡまたはＲＮＡとは効率良くハイブリダイズさせ、ＰＮＡプローブ２と目的ＤＮＡまたはＲＮＡとは前者ほど効率良くハイブリダイズさせず、さらにＰＮＡプローブ３と目的ＤＮＡまたはＲＮＡとでは全くハイブリダイズさせないようにすることができる。この場合、例えばハイブリダイゼーション後の洗浄過程において、ＰＮＡプローブ２を固定したスポットに若干蛍光発光が残る程度に洗浄を制御することで、擬陽性の問題をクリアできる。すなわち、例えばＰＮＡプローブ１、ＰＮＡプローブ２、ＰＮＡプローブ３において、蛍光発光等のシグナル強度に差がなければ擬陽性反応と判定される。また、例えばＰＮＡプローブ１、ＰＮＡプローブ２、ＰＮＡプローブ３の順にシグナル強度が低下している場合には、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを正確に検出できていると判定される。
【００３１】
上述したいずれのＰＮＡチップにおいても、さらにネガティブコントロールとなるプローブを配置させることが好ましい。また、上記工程（１）及び工程（２）の条件は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびにプローブの塩基配列及び長さなどに応じて、当業者であれば予備的実験を経ることにより容易に調整できる。
【００３２】
さらに、例えば、ＰＮＡチップには上記ＰＮＡプローブ１、ＰＮＡプローブ２を、さらにネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを、チップ上に縦列、横列、円形状など様々な配置形態で隣接乃至近接して配置させることができる。これら各プローブの間には、別の配列を有するＰＮＡプローブを配置させることもできる。隣接とは、あるＰＮＡプローブが少なくとも別の１つのＰＮＡプローブと隣りあっていればよく、例えば横方向に一列で配置させること、縦方向に一列で配置させることなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、少なくともＰＮＡプローブ１とＰＮＡプローブ２が隣り合って配置させることであり、さらに好ましくはＰＮＡプローブ１、ＰＮＡプローブ２、ネガティブコントロールとなるプローブを縦または横方向に順に並んで配置させることが好ましい。
【００３３】
上述のように、少なくともＰＮＡプローブ１とＰＮＡプローブ２とをチップ上に隣接乃至近接して配置させることにより、プローブを配置させた各スポット間における蛍光強度を比較することがより容易になる。すなわち、各プローブをこのように配置させることによって、擬陽性の有無の判断が一層容易かつ正確となる。従って、本発明は、チップ上に、少なくとも目的ＤＮＡまたはＲＮＡと完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブと、当該目的ＤＮＡまたはＲＮＡと１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブとをともに配置させることにより、擬陽性反応の有無を判断する方法をも提供すものでもある。
【００３４】
また、本発明ではさらに、目的ＤＮＡまたはＲＮＡと２塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブ３も、ＰＮＡプローブ１、ＰＮＡプローブ２、ネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブなどと隣接乃至近接して配置させることが好ましい。いずれのＰＮＡプローブを組合わせて配置させるかについては、当業者が研究目的、診断目的などにあわせて適宜選択すればよい。
【００３５】
本発明の検出用キット
本発明の検出用キットは、上述の通り、ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液と、炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液を含むものである。該キットに含まれるハイブリダイゼーション液及び低級アルコールは前述する通りである。また、当該キットを使用した場合のハイブリダイゼーション条件及び目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無の判断、検出手段に関しても、前述と同様に行うことができる。
【００３６】
また、本発明における検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡについても前述する通りであり、増幅産物も上記と同様にして得ることができる。また、利用するＰＮＡプローブも前述する通りである。
【００３７】
また、当該キットにはさらに１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含むことができるが、この場合、本発明のキットをさらに簡便に使用できるようにするためには、当該キットに１：４〜１００の比でセンスプライマーとアンチセンスプライマーが含まれていることが望ましい。また、本発明にはさらにＰＮＡチップを含むこともできるが、当該ＰＮＡチップは前述のものを含むことができる。また、本発明のキットには、当該キットを使用するプロトコールが記載された説明書なども含むことができる。
【００３８】
以上のことから、本発明の検出方法及び検出用キットによれば、短時間で効率よく目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無を判断することが可能となる。また、検体として、１：４〜１００のモル比のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用することにより得た増幅産物を含むものを用いた場合には、さらに効率良く目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出することが可能となる。さらに、上記のようなＰＮＡチップを用いることにより、競合ハイブリダイゼーションを必要することなく、より容易に目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出することが可能となる。
【００３９】
例えば、ＡＩＤＳ、ＳＡＲＳをはじめとする重篤な症状を示す感染症は、その治療が困難なことから、早期発見システムの確立が世界的に求められている。早期診断法を医療機関やベッドサイドへ導入することが予防方法として効果的であるが、従来の診断法は「時間がかかる・コストが高い・取り扱いが難しい」など問題点がある。
【００４０】
また、例えば、各種ウイルス疾患の診断においては、臨床徴候から疑われるウイルスの抗原（蛋白質）に対する抗体の検出により診断することが多い。しかしながら、ウイルス由来の抗原の発生には、ウイルス感染後数日を要し、従って、発病後でないと治療に結びつかない時間的な課題を解決する必要性がある。
【００４１】
また、近年、他の感染症と同様にウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡをＰＣＲ法を用いて検出する方法やハイブリダイゼーション法を用いて検出する方法が用いられている。しかしながら、例えばＤＮＡまたはＲＮＡチップを使用した方法では、上述するように結果を得るまでに時間や手間を要する。
【００４２】
本発明はこのような抗原抗体反応によってのみ正確な診断が可能であった感染症を早期に発見し、予防や治療に利用することも可能なものであり、また、ＤＮＡまたはＲＮＡチップを使用した場合より迅速、簡便かつ正確に診断することも可能なものである。
【００４３】
また、上記本発明は、ゲノム構造解析プロジェクトの成果をさらに発展させることを可能にするものであり、また、創薬研究・疾病の診断や予防法の開発などの研究開発をさらに効果的に行うことを可能にするものである。
【００４４】
２．ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法及び調製用キット
本発明の調製方法は、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を、１：４〜１００の比でセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ることを特徴とする。また、本発明の検出用キットは、１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする。
【００４５】
ここで、該目的ＤＮＡまたはＲＮＡは前述する通りであり、本発明の調製方法及び調整用キットによれば、増幅産物もセンスプライマーとアンチセンスプライマーのモル比を１：４〜１００とする以外は前述と同様にして得ることができる。好ましくは、センスプライマーとアンチセンスプライマーのモル比を１：４〜５０、さらに好ましくは１：１０とするものである。また、当該調製方法及び／または調製用キットにより得られた増幅産物は、前述と同様してＰＮＡプローブとハイブリダイズさせることができ、また前述と同様して目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無を判断することができる。
【００４６】
また、当該キットにはさらに１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含むことができるが、この場合、本発明のキットをさらに簡便に使用できるようにするためには、当該キットに１：４〜１００の比でセンスプライマーとアンチセンスプライマーが含まれていることが望ましい。また、本発明にはさらにＰＮＡチップを含むこともできるが、当該ＰＮＡチップは前述のものを含むことができる。本発明の調整用キットにおいても、当該キットを使用するプロトコールが記載された説明書などを含むことができる。
【００４７】
前述するように、センスプライマーとアンチセンスプライマーのモル比を上記の比率にして増幅産物を得た場合には、増幅産物である目的ＤＮＡまたはＲＮＡとＰＮＡプローブとを一層効率良くハイブリダイズさせることが可能となる。
【００４８】
３．目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＰＮＡチップ
本発明のＰＮＡチップは、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを少なくとも備えることを特徴とし、該特徴を有するよう作製する以外は前述と同様にして得ることができる。
【００４９】
また、目的ＤＮＡまたはＲＮＡとしては前述と同様のものを使用することができ、また、増幅産物についても同様にして得ることができる。また、本発明のＰＮＡチップを用いた場合にも、前述と同様にしてＰＮＡプローブとハイブリダイズさせることができ、また前述と同様にして目的ＤＮＡまたはＲＮＡの有無を判断することができる。また、本発明のＰＮＡチップにはさらに、前述と同様にして、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を２つ有するＰＮＡプローブを備えることもできる。
【００５０】
従って、本発明のＰＮＡチップによれば、上述と同様に、例えばＳＮＰｓを判断することが可能であり、また同一疾患の各種遺伝子表現亜型を診断することも可能である。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄過程において、例えば１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブを配置したスポットに若干蛍光発光が残る程度に洗浄を制御することで、擬陽性の問題をクリアできる。
【００５１】
また、本発明のＰＮＡチップにおけるプローブの配置形態に関しても前述の記載を援用する。従って、このように配置させた場合には、前述と同様に各スポット間における蛍光強度を比較することがより容易になり、擬陽性の有無の判断が一層容易かつ正確となる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明の内容を以下の実施例及び比較例を用いて具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００５３】
（i）チップ上に貼り付けるＰＮＡオリゴマーの設計
実施例１：ＰＮＡチップ１
ヒトＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）ゲノムの塩基配列データは米国国立衛生研究所のゲノムデータベースから入手し、ＰＣＲのプライマーおよびＰＮＡプローブの配列を検討した。プライマー配列選択には、市販の遺伝子解析ソフトを用いた。ＰＣＲ用プライマーの塩基配列は次の通りである。
５’センスプライマー：ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴ（primer 1）（配列番号１）
３’センスプライマー：ＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧ（primer 2）（配列番号２）
このプライマーにより増幅される領域に相補的配列を有するＰＮＡオリゴマーを検出用ＰＮＡプローブとして選択し、常法によりＰＮＡオリゴマーを合成した。選択した塩基配列は次の通りである。
スポット１（ＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧ（probe 1）（配列番号３）
スポット２（ＨＣＶの塩基配列と２塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＡＡＧＣＣＴＣＴＡＧＧＣＡＴＧ（probe 2）（配列番号４）
スポット３（５’側上流に位置するＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡ（probe 3）（配列番号５）
スポット４（３’側下流に位置するＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ）：ＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣ（probe 4）（配列番号６）
スポット５（ＳＡＲＳコロナウイルス検出用プローブ、ネガティブコントロールとして使用）：ＡＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣ（probe 5）（配列番号７）
即ち、検出用ＰＮＡプローブとして、標的であるＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマー、当該ＰＮＡオリゴマーと２塩基のミスマッチを有するＰＮＡオリゴマー、前記ＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマーの５’末端側上流に位置するＰＮＡオリゴマー、前記ＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマーの３’側下流に位置するＰＮＡオリゴマー、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを順にデュプリケートで並べたＰＮＡチップ（以下、ＰＮＡチップ１）を作成した。当該ＰＮＡチップ１のスペックを図１に示す。なお、上記スポット１〜５はそれぞれ、図１の丸１〜丸５に相当する。
【００５４】
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate、ＳＤＳ）および２０％ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）を含む１ｘＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を用いた。ＰＮＡチップを、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温しておく。次に、ＨＣＶの一部の配列をターゲットとして作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物４μｌを、１６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップの上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置にいれて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ１の洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した。マイクロアレイ解析は、GeneTAC LSIV装置（Genomic Solution製）を用いて行った。
【００５５】
その結果、スポット１のみならず、スポット３及びスポット４において蛍光発光が観察されたが、スポット２及びスポット５では蛍光発光は観察されなかった。結果を図２に示す。これより、目的遺伝子の塩基配列と完全相補的な配列を有するプローブのみならず、その上流側の配列を有するプローブ、及びその下流側の配列を有するプローブによっても、目的遺伝子を認識できることがわかった。また、目的遺伝子の塩基配列と２塩基のミスマッチを有するプローブは、当該実験条件では目的遺伝子を認識しないことがわかった。
【００５６】
実施例２：ＰＮＡチップ２
実施例１で作成したＰＮＡチップ１を用いて機能評価を行った結果、「設計するＰＮＡオリゴマーの相補的ＤＮＡオリゴマーとのハイブリダイゼーション形成時における推定Ｔｍ値を統一すること」、「ＰＣＲ増幅産物の末端部分をターゲットとすること」、「当然のことながらハイブリダイズの条件を適宜調整することにより１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブにはハイブリダイズさせないようにできると予想されるので、２塩基ミスマッチＰＮＡオリゴマーのみではなく１塩基ミスマッチＰＮＡオリゴマーも採用すること」などの改良すべき点が浮き彫りになった。
【００５７】
そこで、実施例１で選択したプライマー領域に相補的配列を有するＰＮＡオリゴマーを検出用ＰＮＡプローブとして選択し、常法によりＰＮＡオリゴマーを合成した。選択した塩基配列は次の通りである。
スポット１（ＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ、Ｔｍ値が５５℃付近となるように設計した）：ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡ（probe 6）（配列番号８）
スポット２（ＨＣＶの塩基配列と１塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡ（probe 7）（配列番号９）
スポット３（ＨＣＶの塩基配列と２塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＣＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＣＣＣＡ（probe 8）（配列番号１０）
スポット４（１６塩基分５’側上流に位置するＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴ（probe 9）（配列番号１１）
スポット５（ネガティブコントロールとして使用）：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ（probe 10）（配列番号１２）
即ち、検出用ＰＮＡプローブとして、標的であるＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマー、当該ＰＮＡオリゴマーと１塩基のミスマッチを有するＰＮＡオリゴマー、前記ＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマーと２塩基のミスマッチを有するＰＮＡオリゴマー、前記ＨＣＶを特異的に検出できるＰＮＡオリゴマーの配列の１６塩基分５’末端側上流に位置するＰＮＡオリゴマー、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを順にデュプリケートで並べたＰＮＡチップ（以下、ＰＮＡチップ２）を作成した。当該ＰＮＡチップ２のスペックを図３に示す。なお、上記スポット１〜５はそれぞれ、図３の丸１〜丸５に相当する。
【００５８】
実施例１と同様に各スポットの蛍光輝度を測定した。なお、ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ２の洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した場合、１分間攪拌した場合及び３分間攪拌した場合を比較した。
【００５９】
その結果、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した場合には、スポット１のみならず、スポット２及びスポット４においても蛍光発光がみられた（図４）。また、スポット２とスポット３は、スポット１と比較して徐々に蛍光発光強度が減少することが観察された。
【００６０】
また、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間攪拌した場合及び３分間攪拌した場合には、ＨＣＶの塩基配列と１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブを固定したスポット２及び３では蛍光発光はほとんど観察されなかった。
【００６１】
（ii）ＰＣＲ条件の検討
実施例３：ＰＣＲ条件の検討１
サンプルとして、ＨＣＶ感染血液を用いた。ＰＣＲはキット製造業者のマニュアル通りに行った。まず、Rneasy Mini Kit (QIAGEN製)を用いて、血清１４０μｌからＲＮＡ分画を精製した。次に、Sensiscript RT Kit (QIAGEN製)を用いて、上記のＲＮＡ溶液１０μｌから、２０μｌのＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を得た。インキュベーション条件は、３７℃、６０分間で逆転写反応を行い、９３℃、５分間で反応を停止させた。ＨＣＶのコア領域を増幅するプライマーのペア（Roche株式会社のAmpliCore Kitにあるプライマーと同等のＤＮＡオリゴヌクレオチド）を準備した。５’末端側のセンスプライマー（ＨＣＶ００１）（配列番号１３）と３’末端側のアンチセンスプライマーの５’末端を蛍光色素Ｃｙ５で標識したもの（ＨＣＶ００２）（配列番号１４）を用いた（表１）。ＨＣＶ００１とＨＣＶ００２のモル比は１：１０となるように調整した。５μｌのＲＴ−ＰＣＲ増幅産物をＰＣＲ用ミックスで１００μｌとし、Gene Amp PCR System 9600-R（Perkin Elmer社製）を使って、４０回増幅した。このときＰＣＲ増幅条件として、９４℃で３分間、６６℃で１分間、７２℃で１分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、６６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３８サイクル、９４℃で３０秒間、６６℃で３０秒間、７２℃で５分間を１サイクル、を採用した。この条件は、Roche株式会社のプロトコールに従った。
【００６２】
【表１】
【００６３】
ＰＴ−ＰＣＲ増幅産物の出来状況は標準的電気泳動方法によって確認した。即ち、電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド液中に１５分間浸し、その後２０分間蒸留水中で洗浄して染色した。紫外線照射により発色したバンドを、デジタルカメラにて撮影することにより観察した。その結果、長さの異なったバンドの存在もなく、目的とする分子量を有するバンドのみ存在することがわかった。
【００６４】
得られたＰＣＲ増幅産物を用いて、ＰＮＡチップ２によるハイブリダイゼーション実験を実施した。その結果、スポット１、スポット２及びスポット４において蛍光発光が観察され、スポット２ではスポット１及び４より低い輝度で蛍光発光が観察された。また、スポット３及びスポット５では蛍光発光は観察されなかった。これより、センスプライマーとアンチセンスプライマーのモル比を１：１０として調製した増幅産物を検体として使用した場合には、ＰＮＡプローブを使用して目的遺伝子を良好に検出できることがわかった。
【００６５】
比較例１：ＰＣＲ条件の検討２
実施例３に記載の５’末端側のセンスプライマー（ＨＣＶ００１）と３’末端側のアンチセンスプライマーの５’末端を蛍光色素Ｃｙ５で標識したもの（ＨＣＶ００２）の比が１：１となるように調整し、実施例３の条件に従いＰＴ−ＰＣＲを実施した。その結果、長さの異なったバンドの存在もなく、目的とする分子量を有するバンドのみ存在することがわかった。
【００６６】
このＰＴ−ＰＣＲ増幅産物を用いて、ＰＮＡチップ２によるハイブリダイゼーション実験を実施したが、実施例３ほど効率良く明瞭なスポットは観察できなかった。これは、上記プライマー比１：１のＰＴ−ＰＣＲ増幅産物は、そのほとんどが２本鎖を形成しているために、ＰＮＡとのハイブリ形成が両区に起こりにくいことが示唆された。
【００６７】
（iii）ハイブリダイゼーション条件の検討
実施例４：ハイブリダイゼーション液の検討１
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ２を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップ２の上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ２の洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間または５分間静置した。その結果、いずれの条件においても鮮明なスポットを確認することが出来た（図５）。また、上記０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間または５分間攪拌洗浄を行った場合も、鮮明なスポットを確認することが出来た（図５）。
【００６８】
比較例２：ハイブリダイゼーション液の検討２
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＦ（dimethylformamide）を含む５ｘＳＳＰＥを用いた。しかし、ＤＭＦを加えた時点で、ハイブリダイゼーション液が白濁した。ＤＭＦの量を１０％〜５０％まで変化させたが、白濁したままであった。ハイブリダイゼーションをそのまま続行してマイクロアレイ解析を行ったが、全くスポットを確認できなかった。
【００６９】
比較例３：ハイブリダイゼーション液の検討３
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＮＭＰ（N-methylpyroridon）を含む５ｘＳＳＰＥを用いた。しかし、ＮＭＰを加えた時点で、ハイブリダイゼーション液が白濁した。ＮＭＰの量を１０％〜５０％まで変化させたが、白濁したままであった。ハイブリダイゼーションをそのまま続行してマイクロアレイ解析を行ったが、全くスポットを確認できなかった。
【００７０】
比較例４：ハイブリダイゼーション液の検討４
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび５０％ホルムアルデヒド含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ１を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌのハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップ１の上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ１の洗浄は、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずしただけのものと、さらに０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で５または１０分間攪拌洗浄を行ったものを用いて、洗浄方法及び時間について検討した。
【００７１】
その結果、いずれの場合もスポット１においては蛍光発光の確認が出来ず、上流側のスポット３においてのみ蛍光発光が確認された（図６）。また、洗浄を行うことによって、スポットの蛍光発光が薄くなり、ＰＴ−ＰＣＲ増幅産物がはがれていくことが観察された（図６）。このことから、本ハイブリダイゼーション液は不適切であることが分かった。
【００７２】
実施例５：洗浄液の検討１
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ２を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、３６℃或いは５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップの上に丁寧に載せて３６℃或いは５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、５、１５、３０、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップの洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した。また、一部のサンプルではさらに３または５分間、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中での攪拌洗浄を行った。
【００７３】
その結果、５分間攪拌することにより洗浄した場合、ハイブリダイゼーション温度が５０℃の時のほうが３６℃の時よりも蛍光発光強度が強かったことから（図７及び図８）、３６℃でのハイブリダイゼーションは予想以上の量のＰＴ−ＰＣＲ増幅産物がハイブリダイズしていることが予想された。即ち、このことは、ハイブリ時間３０分で５分間攪拌まで洗浄した場合、３６℃でのスポットの蛍光発光強度は顕著に減少しているのに対して、５０℃の場合にはその傾向が少なく標的をしっかりと認識していることからも推測できた。従って、ハイブリ温度は３６℃より５０℃のほうが有効であると判明した。また、ハイブリ時間は５分間から６０分間へと時間を長くするほど、蛍光強度が強くなった。ただし、ハイブリ時間が５分間であっても、ハイブリ温度５０℃であって、１分間静置または攪拌により洗浄した場合に、良好な結果を得ることができた。
【００７４】
実施例６
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ２を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップの上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップの洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した。また、一部のサンプルではさらに３または６分間の０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中での攪拌洗浄を行い、洗浄方法及び時間について検討した。
【００７５】
その結果、３または６分間の攪拌洗浄のいずれの場合も、スポット１及びスポット４の蛍光発光が明瞭に確認できた。結果を図９に示す。しかし、３分間の攪拌洗浄の場合、スポット２において蛍光発光が観察されたのに対し、６分間の場合にはスポット２の蛍光発光はほとんど消滅していることが判明した。これは６分間の攪拌洗浄が不適切であるということを示すものではないが、スポット２が消滅する直前で攪拌洗浄を止めても、スポット１及び４の蛍光発光に影響を与えないことから、洗浄方法をスポット２の蛍光発光の有無で制御可能であることを示すものである。
【００７６】
比較例５
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２５％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ１を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップ１の上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ１の洗浄は、７０％イソプロパノール水溶液中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置した。場合によっては、５、１０分間の０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ溶液中での攪拌洗浄を行い、洗浄方法及び時間について検討した。
【００７７】
その結果、洗浄内容に関わらず、チップ表面の汚れが取れておらず、イソプロパノールの使用は不適切であることがわかった（図１０）。
【００７８】
比較例６
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび１０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。ＰＮＡチップ１を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップ１の上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、１２０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップ１の洗浄は、１０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥ溶液中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後、５分間攪拌した。場合によっては、さらに５分間の１０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥ溶液中での攪拌洗浄を行い、洗浄方法及び時間について検討した。
【００７９】
その結果、スポットの蛍光発光の検出は可能であったが、スポット１よりもスポット２及びスポット３の蛍光強度が強く、判定する上で不適切であることが判明した。また、洗浄条件の違いに関わらず、同一の洗浄条件においても、スポットの蛍光強度のばらつきがあった。また、１０分洗浄後のスポットは明瞭に確認することが困難であり、５分洗浄との時間的な微妙な差が、スポット強度に与える影響がこれだけ鮮明になることから、操作性の厳密さが要求されることが分かった。
【００８０】
（iv）ＤＮＡチップを用いた目的遺伝子の検出（比較例７）
従来のＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションの条件で実験を開始したところ、ハイブリダイゼーションは２時間で認められることが判明した。しかし、さらなる洗浄条件の検討から、より少ない塩濃度でのハイブリダイゼーション液で反応を行う方が、より結合する力が強いと考えられた。さらに、ハイブリダイゼーション液中のＳＤＳ濃度を０．０１％から１．０％まで変化させたところ、影響は少ないことが確認できた。ただし、ＳＤＳを添加しない場合には、バックグラウンドが汚れてくることが確認できたので、従来通り、１％ＳＤＳをハイブリダイゼーション液に用いた。
【００８１】
（v）本願発明のＰＮＡチップとＤＮＡチップとの比較（実施例７）
下記に示す検出用ＰＮＡプローブに対応した検出用ＤＮＡプローブを合成し、同一チップ基板上に貼り付けたＰＮＡチップ３を作製した（図１１）。選択した塩基配列は次の通りである。
スポット１（ＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ（probe 11）（配列番号１５）
スポット２（ＨＣＶの塩基配列と中心付近で１塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＴＣＧＣＡＡＧＧＡＣＣＣＴＡＴＣＡ（probe 12）（配列番号１６）
スポット３（ＨＣＶの塩基配列と末端で１塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＧＡ（probe 13）（配列番号１７）
スポット４（１６塩基分５’側上流に位置する、ＨＣＶの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡ（probe 14）（配列番号１８）
スポット５（ネガティブコントロールとして使用）：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ（probe 15）（配列番号１９）
スポット６：ＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ（probe 16）（配列番号２０）
スポット７（スポット６として配置したプローブの塩基配列と中心付近で１塩基のミスマッチを有するＤＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＴＣＧＣＡＡＧＧＡＣＣＣＴＡＴＣＡ（probe 17）（配列番号２１）
スポット８（スポット６として配置したプローブの塩基配列と末端で１塩基のミスマッチを有するＤＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＧＡ（probe 18）（配列番号２２）
スポット９（１６塩基分５’側上流に位置する、スポット６として配置したプローブの塩基配列と完全相補的な配列を有するＤＮＡプローブ）：ＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡ（probe 19）（配列番号２３）
スポット１０（ネガティブコントロールとして使用）：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ（probe 20）（配列番号２４）
当該ＰＮＡチップ３のスペックを図１１に示す。なお、上記スポット１〜１０はそれぞれ、図１１の丸１〜丸１０に相当する。また、各ＰＮＡプローブは順にデュプリケートで並べた。
【００８２】
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。上記ＰＮＡチップ３を、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップの上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、５〜６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップの洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後１分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置、さらに３分間の０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中での攪拌洗浄を行った。
【００８３】
その結果を図１２に示す。ＰＮＡプローブを配置させたスポットのほうが、ＤＮＡプローブを配置させたスポットより、良好な蛍光発光結果が得られた。これより、ＰＮＡプローブのほうがＤＮＡプローブよりもハイブリ能力が高いことが判明した。また、ハイブリ時間を変化させた場合も、その傾向は同様であった。
【００８４】
（vi）ＰＮＡプローブの長さの検討（実施例８）
下記に示す検出用ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーション時における長さの影響を調べるために、Ｔｍ値が５５度付近となる１７ｍｅｒのＰＮＡプローブ（スポット１〜５に対応）とＴｍ値が３５度付近となる１２ｍｅｒのＰＮＡプローブ（スポット６〜１０に対応）を合成し、同一チップ基板上に貼り付けたＰＮＡチップ４を作製した（図１３）。選択した塩基配列は次の通りである。
スポット１：ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡ（probe 21）（配列番号２５）
スポット２（スポット１として配置したプローブの塩基配列と中心付近で１塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡ（probe 22）（配列番号２６）
スポット３（スポット１として配置したプローブの塩基配列と末端で２塩基のミスマッチを有する検出用ＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＣＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＣＣＣＡ（probe 23）（配列番号２７）
スポット４（１６塩基分５’側上流に位置する、スポット１として配置したプローブの塩基配列と完全相補的な配列を有する検出用ＰＮＡプローブ）：ＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴ（probe 24）（配列番号２８）
スポット５（ネガティブコントロールとして使用）：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ（probe 25）（配列番号２９）
スポット６：ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴ（probe 26）（配列番号３０）
スポット７（スポット６として配置したプローブの塩基配列と中心付近で１塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＣＴ（probe 27）（配列番号３１）
スポット８（スポット６として配置したプローブの塩基配列と末端で２塩基のミスマッチを有するＰＮＡプローブ、下線部がミスマッチ部位）：ＣＡＧＴＡＡＧＣＣＴＣＴ（probe 28）（配列番号３２）
スポット９（１６塩基分５’側上流に位置する、スポット６として配置したプローブの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ）：ＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧ（probe 29）（配列番号３３）
スポット１０（ネガティブコントロールとして使用）：ＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ（probe 30）（配列番号３４）
当該ＰＮＡチップ４のスペックを図１３に示す。なお、上記スポット１〜１０はそれぞれ、図１３の丸１〜丸１０に相当する。また、各ＰＮＡプローブは順にデュプリケートで並べた。
【００８５】
ハイブリダイゼーション液は、１％ＳＤＳおよび２０％ＤＭＳＯを含む５ｘＳＳＰＥを用いた。上記ＰＮＡチップを、ハイブリダイゼーション用チャンバーに固定し、５０℃にあらかじめ加温した。次に、実施例３に従い作成されたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の４μｌを、３６μｌハイブリダイゼーション液に混和し、このＰＮＡチップの上に丁寧に載せて５０℃のハイブリダイゼーション専用恒温装置に入れて加温した。加温時間は、６０分間で行った。ハイブリダイゼーション後のＰＮＡチップの洗浄は、ＥｔＯＨ中でハイブリダイゼーション用カバーをはずした後５分間静置し、次いで０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中で１分間静置した。一部のサンプルではさらに３分間の０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＰＥ中での攪拌洗浄を行った。
【００８６】
その結果を図１４に示す。ＰＮＡプローブの長さが１７ｍｅｒと１２ｍｅｒでは、プローブの長さにより各スポットの輝度は異なるものの、いずれの場合も目的遺伝子を検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、ＰＮＡチップ１のスペックを示す。
【図２】図２は、ＰＮＡチップ１を使用したハイブリダイゼーション結果を示す。
【図３】図３は、ＰＮＡチップ２のスペックを示す。
【図４】図４は、ＰＮＡチップ２を使用したハイブリダイゼーション結果を示す。
【図５】図５は、２０重量％のＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液を使用したハイブリダイゼーション結果を示す。
【図６】図６は、５０重量％のホルムアルデヒドを含むハイブリダイゼーション液を使用したハイブリダイゼーション結果を示す。
【図７】図７は、５０℃でハイブリダイズさせたハイブリダイゼーション結果を示す。
【図８】図８は、３６℃でハイブリダイズさせたハイブリダイゼーション結果を示す。
【図９】図９は、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＰＥを使用した洗浄条件の検討結果を示す。
【図１０】図１０は、７０重量％のイソプロパノールを洗浄液として使用したハイブリダイゼーション結果を示す。
【図１１】図１１は、ＰＮＡチップ３のスペックを示す。
【図１２】図１２は、ＰＮＡチップとＤＮＡチップの比較結果を示す。
【図１３】図１３は、ＰＮＡチップ４のスペックを示す。
【図１４】図１４は、ＰＮＡチップにおけるＰＮＡプローブの長さの検討結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号１はprimer 1の塩基配列を示す。
配列番号２はprimer 2の塩基配列を示す。
配列番号３はprobe 1の塩基配列を示す。
配列番号４はprobe 2の塩基配列を示す。
配列番号５はprobe 3の塩基配列を示す。
配列番号６はprobe 4の塩基配列を示す。
配列番号７はprobe 5の塩基配列を示す。
配列番号８はprobe 6の塩基配列を示す。
配列番号９はprobe 7の塩基配列を示す。
配列番号１０はprobe 8の塩基配列を示す。
配列番号１１はprobe 9の塩基配列を示す。
配列番号１２はprobe 10の塩基配列を示す。
配列番号１３はHCV001 primerの塩基配列を示す。
配列番号１４はHCV001 primerの塩基配列を示す。
配列番号１５はprobe 11の塩基配列を示す。
配列番号１６はprobe 12の塩基配列を示す。
配列番号１７はprobe 13の塩基配列を示す。
配列番号１８はprobe 14の塩基配列を示す。
配列番号１９はprobe 15の塩基配列を示す。
配列番号２０はprobe 16の塩基配列を示す。
配列番号２１はprobe 17の塩基配列を示す。
配列番号２２はprobe 18の塩基配列を示す。
配列番号２３はprobe 19の塩基配列を示す。
配列番号２４はprobe 20の塩基配列を示す。
配列番号２５はprobe 21の塩基配列を示す。
配列番号２６はprobe 22の塩基配列を示す。
配列番号２７はprobe 23の塩基配列を示す。
配列番号２８はprobe 24の塩基配列を示す。
配列番号２９はprobe 25の塩基配列を示す。
配列番号３０はprobe 26の塩基配列を示す。
配列番号３１はprobe 27の塩基配列を示す。
配列番号３２はprobe 28の塩基配列を示す。
配列番号３３はprobe 29の塩基配列を示す。
配列番号３４はprobe 30の塩基配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、以下の工程、
（１）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液中で検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡと、該目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、ハイブリダイズできる条件下でインキュベートする工程、
（２）前記工程（１）の産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄する工程、及び
（３）前記工程（２）の後にＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物の有無を検出する工程、
を含むことを特徴とする、検出方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイゼーション液のＤＭＳＯの濃度が約５〜６０重量％である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記洗浄溶液の炭素数１〜４の低級アルコール濃度が５０〜１００重量％である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
目的ＤＮＡまたはＲＮＡが、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜１００の比で用いて得られた増幅産物である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
前記ＰＮＡプローブがチップ上に配置されたＰＮＡチップを用いて目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する、請求項１に記載の検出方法。
【請求項６】
前記ＰＮＡチップが、少なくとも、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを備えるものである、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出用キットであって、以下、
（i）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液、及び
（ii）炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液、
を含むことを特徴とする、キット。
【請求項８】
さらに、１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
さらに、前記ＰＮＡプローブがチップ上に配置されたＰＮＡチップを含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法であって、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜１００の比で用いてＰＣＲを行うことにより得ることを特徴とする、調製方法。
【請求項１１】
ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製用キットであって、１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする、キット。
【請求項１２】
目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＰＮＡチップであって、少なくとも、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを備えることを特徴とする、ＰＮＡチップ。
【請求項１３】
前記目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブと、前記目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブと、前記ネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブが隣接して配置されているものである、請求項１２に記載のＰＮＡチップ。
【請求項１】
ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法であって、以下の工程、
（１）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液中で検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡと、該目的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズできるＰＮＡプローブとを、ハイブリダイズできる条件下でインキュベートする工程、
（２）前記工程（１）の産物を炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液で洗浄する工程、及び
（３）前記工程（２）の後にＰＮＡプローブと目的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイズ産物の有無を検出する工程、
を含むことを特徴とする、検出方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイゼーション液のＤＭＳＯの濃度が約５〜６０重量％である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記洗浄溶液の炭素数１〜４の低級アルコール濃度が５０〜１００重量％である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
目的ＤＮＡまたはＲＮＡが、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜１００の比で用いて得られた増幅産物である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
前記ＰＮＡプローブがチップ上に配置されたＰＮＡチップを用いて目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する、請求項１に記載の検出方法。
【請求項６】
前記ＰＮＡチップが、少なくとも、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを備えるものである、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
ＰＮＡプローブを利用した検体中の目的ＤＮＡまたはＲＮＡの検出用キットであって、以下、
（i）ＤＭＳＯを含むハイブリダイゼーション液、及び
（ii）炭素数１〜４の低級アルコールを含む洗浄液、
を含むことを特徴とする、キット。
【請求項８】
さらに、１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
さらに、前記ＰＮＡプローブがチップ上に配置されたＰＮＡチップを含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製方法であって、目的ＤＮＡまたはＲＮＡを、センスプライマーとアンチセンスプライマーを１：４〜１００の比で用いてＰＣＲを行うことにより得ることを特徴とする、調製方法。
【請求項１１】
ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせる目的ＤＮＡまたはＲＮＡの調製用キットであって、１：４〜１００の比で使用されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする、キット。
【請求項１２】
目的ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのＰＮＡチップであって、少なくとも、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブ、目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブ、及びネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブを備えることを特徴とする、ＰＮＡチップ。
【請求項１３】
前記目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列と完全相補的な配列を有するＰＮＡプローブと、前記目的ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列とミスマッチな塩基を１つ有するＰＮＡプローブと、前記ネガティブコントロールとなるＰＮＡプローブが隣接して配置されているものである、請求項１２に記載のＰＮＡチップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００８−１４２００９（Ｐ２００８−１４２００９Ａ）
【公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３２６６２（Ｐ２００６−３３２６６２）
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【出願人】（５０３２８０９６１）株式会社クレディアジャパン (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【出願人】（５０３２８０９６１）株式会社クレディアジャパン (10)
【Ｆターム（参考）】
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