ＲＮＡワクチン
本発明は、アレルゲンまたはその誘導体をコードするＲＮＡ分子を含むＲＮＡワクチン、およびその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡワクチンに関する。
【０００２】
この数十年間に、欧米先進国では、Ｉ型アレルギー性疾患が大きな健康問題として浮上してきており、現在では、人口の約２５％が発症している。
【０００３】
遺伝的要因の他、幼児期の感染を含む成長期の環境、食習慣、および、受動喫煙や大気汚染への暴露などの環境要因が、アトピー性疾患の発生に大きく関係する。
【０００４】
現在、何年かに渡ってアレルゲンを徐々に増やして投与するという特定の免疫療法が、唯一有効な治療的介入の例である。しかし、投与量が多いため、アナフィラキシー性副作用の危険性は明白であり、未精製の、殆ど特定されていないアレルゲンの抽出物を使用した場合、未確認の成分に対する患者の感作を生じさせる可能性がある。
【０００５】
さらに、Ｉ型アレルギーに対する予防接種は実現しておらず、アレルギー性疾患を発症する遺伝的リスクが高い幼児においてアレルギー性疾患の発症を予防するのが、最も実現可能な手法であろう。幼い免疫システムを訓練するほうが、既に発症したアレルギー性免疫表現型の均衡を保つよりも簡単である。
【０００６】
Ying et al.（Nature Med (1999) 5:823-827）には、免疫学的過程を研究するためのモデル分子として使用されることが多いβ−ガラクトシダーゼをコードするＲＮＡを含む自己修復ＲＮＡワクチンが開示されている。Ying et al.では、抗腫瘍反応が研究されており、ＣＤ８陽性細胞の誘導が観察されている。しかし、Ying et al.において調査されていないＣＤ４陽性細胞は、ＣＤ８陽性細胞とは対照的に、アレルギーに対する免疫学的防御を媒介し、Ｂ細胞におけるＩｇＥへのクラススイッチを妨げる。
【０００７】
近年、核酸ベースのワクチンは、アレルギー性疾患の根底にある免疫機構にバイアスをかける有効な手法となってきている。数多くの動物実験において、ＤＮＡワクチンがＩ型アレルギー反応の誘導を抑制し、さらには既存のアレルギー性ＴＨ２免疫状態を回復させることが立証されている（Weiss, R. et al. (2006) Int Arch Allergy Immunol 139:332-345）。
【０００８】
それでもなお、ＤＮＡベースのワクチンの安全性に関して懸念の声が挙がっている。注入されたＤＮＡ分子は、宿主ゲノムに統合される可能性があり、また、様々な組織への分散性により、アレルゲンが持続的に放出され、その結果、既存のアレルゲン特異的ＩｇＥ分子を有する患者において制御不可能なアナフィラキシー反応を誘発する慮がある。さらに、健康な子供に対してワクチンを投与する場合、抗アレルギーワクチンにおける最も高水準の安全基準を適用する必要がある。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ＤＮＡワクチンの欠点を克服し、さらにアレルギー治療に有効である、または、アレルゲンに対する感作をうまく抑制できるアレルゲンワクチンを提供することにある。
【００１０】
本発明は、少なくとも１つのアレルゲンまたはそのアレルゲンの誘導体をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含むＲＮＡワクチンに関する。当該ＲＮＡワクチンにおいて、当該アレルゲンは、アルヌス・グルチノーサ（Alnus glutinosa）、アルタナリア・アルタナータ（Alternaria alternata）、アンブローシア・アルテミシーフォリア（Ambrosia artemisiifolia）、アピウム・グラベオレンス（Apium graveolens）、アラキス・ハイポガエア（Arachis hypogaea）、ベツラ・ベルコーサ（Betula verrucosa）、カルピヌス・ベツルス（Carpinus betulus）、カスタネア・サチバ（Castanea sativa）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Cladosporiumherbarum）、コリルス・アベラナ（Corylus avellana）、クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica）、カプリナス・カルピオ（Cyprinus carpio）、ダウクス・カロタ（Daucus carota）、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（Dermatophagoides pteronyssinus）、ファグス・シルバチカ（Fagus sylvatica）、フェリス・ドメスチカス（Felis domesticus）、ヘベア・ブラシリエンシス（Heveabrasiliensis）、ジュニペルス・アシュエイ（Juniperus ashei）、マルス・ドメスチカ（Malus domestica）、ケルクス・アルバ（Quercus alba）、およびフレウム・プラテンス（Phleum pratense）のアレルゲンである。
【００１１】
アレルゲンまたはそのアレルゲンの誘導体をコードするＲＮＡ分子は、ＲＮＡワクチンとしても有効に使用できる可能性があることがわかった。ＲＮＡワクチンは、アレルギー性疾患の治療のためのＤＮＡワクチンによる特徴を示す。すなわち、ＲＮＡワクチンにおいて、アレルゲンは最も純粋な形態、すなわち遺伝情報にて提供され、ＤＮＡワクチンと同様に、ＲＮＡワクチンはＴＨ１−バイアスの免疫反応を誘発する。さらに、低アレルギー性の遺伝子産物を生成するためにＤＮＡワクチン用に作られた方法と同様の方法を、ＲＮＡワクチンにおいても利用することができる。
【００１２】
さらに、ＲＮＡワクチンには、ＤＮＡワクチンより大きな利点がある。
（ｉ）ＲＮＡワクチンは、アレルゲンの純粋な遺伝情報を含んでいるが、ＤＮＡワクチンに使用されるプラスミドの骨格に通常存在するウイルスプロモータ、抗生物質耐性遺伝子、またはウイルス／細菌の調節配列などの外来配列を含まない。
（ｉｉ）ＲＮＡは、宿主ゲノムに統合されないため、悪性腫瘍の危険性を解消できる。
（ｉｉｉ）ＲＮＡは、細胞の細胞質にて翻訳されるので、細胞核の転写機構が必要ではなく、ＲＮＡワクチンは、核内移行または核外移行とは独立しており、核の各ステージからも独立している。
（ｉｖ）ＲＮＡは迅速に分解されるので、外来遺伝子の発現は短期間に行われ、制御不可能な長期に渡る抗原の発現を避けることができる。
【００１３】
本発明に係るＲＮＡワクチンは、アレルゲンをコードする１つ以上のＲＮＡ分子を含んでいてもよく、好適には２、３、５、１０種等のＲＮＡ分子を含んでいてもよい。しかし、１種のＲＮＡ分子が１つ以上のアレルゲンをコードしてもよい。つまり、１種のＲＮＡ分子が少なくとも１、２、３、５、１０個の異なる、または同じアレルゲンをコードする塩基配列を含む構成としてもよい。１種ないし複数種のＲＮＡ分子によってコードされるアレルゲンは、後述の列挙のあらゆる組み合せの中から選択されてもよい。
【００１４】
本明細書において使用するとき、「ＲＮＡワクチン」という用語は、本明細書において規定されたＲＮＡ分子を含むワクチンを指す。しかし当然のことながら、当該ワクチンは、個体に投与する際に必要とされる、または、好適である他の物質および分子（たとえば医薬品賦形剤）を含んでいてもよい。
【００１５】
「〜のアレルゲン」という用語は、「〜由来のアレルゲン」および「〜から得られるアレルゲン」という用語に置き換えることができる。これは、アレルゲンが当該生物において自然発現されるものであり、本発明に係るＲＮＡ分子を生成するために当該アレルゲンをコードするＤＮＡ／ＲＮＡが単離されることを指す。
【００１６】
哺乳類またはヒトに投与したとき、アレルゲンをコードするＲＮＡ分子の全てがアレルゲン特異的抗体の形成を誘発するわけではないことがわかった。例えばアルテミシア・ブルガリス（Artemisiavulgaris）のアレルゲンＡｒｔ Ｖ １、およびオレア・エウロピア（Olea europea）のアレルゲンＯｌｅ ｅ １をコードするＲＮＡ分子は、Ｔｈ１メモリを誘発することができず、アレルゲン特異的ＩｇＥ反応を抑制することができない。しかし、上述したソースに由来するアレルゲンをコードするＲＮＡ分子は上記を行うことができる。
【００１７】
本発明の好適な実施形態によると、アルヌス・グルチノーサのアレルゲンは、Ａｌｎ ｇ １であり、アルタナリア・アルタナータのアレルゲンは、Ａｌｔ ａ １、Ａｌｔ ａ ３、Ａｌｔ ａ ４、Ａｌｔ ａ ５、Ａｌｔ ａ ６、Ａｌｔ ａ ７、Ａｌｔ ａ ８、Ａｌｔ ａ １０、Ａｌｔ ａ １２およびＡｌｔ ａ １３からなる群より選択され、アンブローシア・アルテミシーフォリアのアレルゲンは、Ａｍｂ ａ １、Ａｍｂ ａ ２、Ａｍｂ ａ ３、Ａｍｂ ａ ５、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ７、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ９およびＡｍｂ ａ １０からなる群より選択され、アピウム・グラベオレンスのアレルゲンは、Ａｐｉ ｇ １、Ａｐｉ ｇ ４およびＡｐｉ ｇ ５からなる群より選択され、アラキス・ハイポガエアのアレルゲンは、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ４、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ７およびＡｒａ ｈ ８からなる群より選択され、ベツラ・ベルコーサのアレルゲンは、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ６およびＢｅｔ ｖ ７からなる群より選択され、カルピヌス・ベツルスのアレルゲンは、Ｃａｒ ｂ １であり、カスタネア・サチバのアレルゲンは、Ｃａｓ ｓ １、Ｃａｓ ｓ ５およびＣａｓ ｓ ８からなる群より選択され、クラドスポリウム・ヘルバルムのアレルゲンは、Ｃｌａ ｈ ２、Ｃｌａ ｈ ５、Ｃｌａ ｈ ６、Ｃｌａ ｈ ７、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｌａ ｈ ９、Ｃｌａ ｈ １０およびＣｌａ ｈ １２からなる群より選択され、コリルス・アベラナのアレルゲンは、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ １０およびＣｏｒ ａ １１からなる群より選択され、クリプトメリア・ジャポニカのアレルゲンは、Ｃｒｙ ｊ １およびＣｒｙ ｊ ２からなる群より選択され、カプリナス・カルピオのアレルゲンは、Ｃｙｐ ｃ １であり、ダウクス・カロタのアレルゲンは、Ｄａｕ ｃ １およびＤａｕ ｃ ４からなる群から選択され、デルマトファゴイデス・プテロニシヌスのアレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＣｌｏｎｅ ３０アレルゲンからなる群より選択され、ファグス・シルバチカのアレルゲンは、Ｆａｇ ｓ １であり、フェリス・ドメスチカスのアレルゲンは、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ５ｗ、Ｆｅｌ ｄ ６ｗおよびＦｅｌ ｄ ７ｗからなる群より選択され、ヘベア・ブラシリエンシスのアレルゲンは、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６．０１、Ｈｅｖ ｂ ６．０２、Ｈｅｖ ｂ ６．０３、Ｈｅｖ ｂ ７．０１、Ｈｅｖ ｂ ７．０２、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２およびＨｅｖ ｂ １３からなる群より選択され、ジュニペルス・アシュエイのアレルゲンは、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ ２およびＪｕｎ ａ ３からなる群より選択され、マルス・ドメスチカのアレルゲンは、Ｍａｌ ｄ １、Ｍａｌ ｄ ２、Ｍａｌ ｄ ３およびＭａｌ ｄ ４からなる群より選択され、ケルクス・アルバのアレルゲンは、Ｑｕｅ ａ １であり、ならびに、フレウム・プラテンスのアレルゲンは、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２およびＰｈｌ ｐ １３からなる群より選択される。
【００１８】
本発明の好適な実施形態によると、アレルゲンは、下記からなる群から選択される：
イネ科の花粉：Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 12
イエダニ：Der p 1, Der p 2, Der p 7, Der p 21, Clone 30 allergen （PCT国際出願番号AT2007/000201, オーストリア特許出願番号AT 503530：
MKFNIIIVFI SLAILVHSSY AANDNDDDPT TTVHPTTTEQ PDDKFECPSR FGYFADPKDP HKFYICSNWE AVHKDCPGNT RWNEDEETCT、配列番号１）
カバノキ花粉：Bet v 1 およびその同種の木（Aln g 1, Cor a 1, Fag s 1）または食物アレルゲン（Mal d 1, Api g 1, Pru p 1）
猫：Fel d 1, Fel d 2
草（ブタクサ、ヨモギ）：Amb a 1
イトスギ／ビャクシン／ヒマラヤスギ：Cry j 1, Cry j 2, Jun a 1, Jun a 3,
Cha o 1, Cha o 2, Cup a 1, Cup a 3, Jun a 1, Jun a 3, Pla a 3
ピーナッツ：Ara h 1, Ara h 2, Ara h 4
へーゼルナッツ：Cor a 8, Cor a 9
魚／エビ：Gad c 1, Cyp c 1, Pen a 1。
【００１９】
本発明に係るＲＮＡワクチンに使用される特に好適なアレルゲンは、Ａｌｎ ｇ １、Ａｌｔ ａ １、Ａｍｂ ａ １、Ａｐｉ ｇ １、Ａｒａ ｈ ２、Ｂｅｔ ｖ １、ベータ−カゼイン、Ｃａｒ ｂ １、Ｃａｓ ｓ １、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｙｐ ｃ １、Ｄａｕ ｃ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｆａｇ ｓ １、Ｆｅｌ ｄ １、Ｈｅｖ ｂ ６、Ｊｕｎ ａ １、Ｍａｌ ｄ １、オボアルブミン（ＯＶＡ）、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６およびＰｈｌ ｐ ７からなる群より選択される。
【００２０】
上述したアレルゲンは、ＲＮＡワクチンにおける使用に特に適することがわかった。当然のことながら、Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 8, Amb a 9, Amb a 10, Amb t 5, Hel a 1, Hel a 2, Hel a 3, Mer a 1, Che a 1, Che a 2, Che a 3, Sal k 1, Cat r 1, Pla l 1, Hum j 1, Par j 1, Par j 2, Par j 3, Par o 1, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 5, Fes p 4w, Hol l 1, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 5, Lol p 11, Pha a 1, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13, Poa p 1, Poa p 5, Sor h 1, Pho d 2, Aln g 1, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Car b 1, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Que a 1, Fra e 1, Lig v 1, Syr v 1, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3w, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1, Pla a 1, Pla a 2, Pla a 3, Aca s 13, Blo t 1, Blo t 3, Blo t 4, Blo t 5, Blo t 6, Blo t 10, Blo t 11, Blo t 12, Blo t 13, Blo t 19, Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 7, Der f 10, Der f 11, Der f 14, Der f 15, Der f 16, Der f 17, Der f 18w, Der m 1, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6, Der p 7, Der p 8, Der p 9, Der p 10, Der p 11, Der p 14, Der p 20, Der p 21, Eur m 2, Eur m 14, Gly d 2,Lep d 1, Lep d 2, Lep d 5, Lep d 7, Lep d 10, Lep d 13, Tyr p 2, Tyr p 13, Bos d 2, Bos d 3, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Equ c 4, Equ c 5, Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5w, Fel d 6w, Fel d 7w, Cav p 1, Cav p 2, Mus m 1, Rat n 1, Alt a 1, Alt a 3, Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Alt a 7, Alt a 8, Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13, Cla h 2, Cla h 5, Cla h 6, Cla h 7, Cla h 8, Cla h 9, Cla h 10, Cla h 12, Asp fl 13, Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22w, Asp f 23, Asp f 27, Asp f 28, Asp f 29, Asp n 14, Asp n 18, Asp n 25, Asp o 13, Asp o 21, Pen b 13, Pen b 26, Pen ch 13, Pen ch 18, Pen ch 20, Pen c 3, Pen c 13, Pen c 19, Pen c 22w, Pen c 24, Pen o 18, Fus c 1, Fus c 2, Tri r 2, Tri r 4, Tri t 1, Tri t 4, Cand a 1, Cand a 3, Cand b 2, Psi c 1, Psi c 2, Cop c 1, Cop c 2, Cop c 3, Cop c 5, Cop c 7, Rho m 1, Rho m 2, Mala f 2, Mala f 3, Mala f 4, Mala s 1, Mala s 5, Mala s 6, Mala s 7, Mala s 8, Mala s 9, Mala s 10, Mala s 11, Mala s 12, Mala s 13, Epi p 1, Aed a 1, Aed a 2, Api m 1, Api m 2, Api m 4, Api m 6, Api m 7, Bom p 1,Bom p 4, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g 7, Bla g 8, Per a 1, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Chi k 10, Chi t 1-9, Chi t 1.01, Chi t 1.02, Chi t 2.0101, Chi t 2.0102, Chi t 3, Chi t 4, Chi t 5, Chi t 6.01, Chi t 6.02, Chi t 7, Chi t 8, Chi t 9, Cte f 1, Cte f 2, Cte f 3, Tha p 1, Lep s 1, Dol m 1, Dol m 2, Dol m 5, Dol a 5, Pol a 1, Pol a 2, Pol a 5, Pol d 1, Pol d 4, Pol d 5, Pol e 1, Pol e 5, Pol f 5, Pol g 5, Pol m 5, Vesp c 1, Vesp c 5, Vesp m 1, Vesp m 5, Ves f 5, Ves g 5, Ves m 1, Ves m 2, Ves m 5, Ves p 5, Ves s 5, Ves vi 5, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 5, Myr p 1, Myr p 2, Sol g 2, Sol g 4, Sol i 2, Sol i 3, Sol i 4, Sol s 2, Tria p 1, Gad c 1, Sal s 1, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Gal d 1, Gal d 2, Gal d 3, Gal d 4, Gal d 5, Met e 1, Pen a 1, Pen i 1, Pen m 1, Pen m 2, Tod p 1, Hel as 1, Hal m 1, Ran e 1, Ran e 2, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Sec c 20, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 25, Tri a 26, Zea m 14, Zea m 25, Ory s 1, Api g 1, Api g 4, Api g 5, Dau c 1, Dau c 4, Cor a 1.04, Cor a 2, Cor a 8, Fra a 3, Fra a 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Mal d 4, Pyr c 1, Pyr c 4, Pyr c 5, Pers a 1, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru av 4, Pru d 3, Pru du 4, Pru p 3, Pru p 4, Aspa o 1, Cro s 1, Cro s 2, Lac s 1, Vit v 1, Mus xp 1, Ana c 1, Ana c 2, Cit l 3, Cit s 1, Cit s 2, Cit s 3, Lit c 1, Sin a 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Vig r 1, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Len c 1, Len c 2, Pis s 1, Pis s 2, Act c 1, Act c 2, Cap a 1w, Cap a 2, Lyc e 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola t 4, Ber e 1, Ber e 2, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Ric c 1, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Cuc m 1, Cuc m 2, Cuc m 3, Ziz m 1, Ani s 1, Ani s 2, Ani s 3, Ani s 4, Arg r, Asc s 1, Car p 1, Den n 1, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6.01, Hev b 6.02, Hev b 6.03, Hev b 7.01, Hev b 7.02, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hom s 1, Hom s 2, Hom s 3, Hom s 4, Hom s 5、およびTrip s 1などの他のアレルゲンを本発明に使用することもできる。
【００２１】
本発明に係る好適な実施形態によると、アレルゲン誘導体は低アレルギー性である。
【００２２】
哺乳類、特にヒトの体内において、アレルギー反応を誘発させずに、または、最小限に抑えながら、特定の免疫反応を誘発するためには、本発明のアレルゲンまたはその誘導体が低アレルギー性を示すこと、すなわち、その低アレルギー性の分子が、全くまたは殆どＩｇＥ反応を示さないことが好ましい。
【００２３】
本明細書において使用するとき、「低アレルギー性」という用語は、アレルギー特性をもつアレルゲンに由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、個体に投与されたときに、該アレルゲンに対して特異的なＴ細胞の誘導を誘発し、かつアレルギー反応が少ない、または全く発生させない能力があることを指す。当該アレルゲンに存在するＴ細胞エピトープは保存しつつ、当該アレルゲンからＩｇＥ結合エピトープを除去または破壊することによって、ヒトのアレルギー反応を誘発する能力をアレルゲンの低アレルギー性誘導体において消失または低減させることができる。例えば、ＩｇＥ結合能力が低減された、またはＩｇＥ結合能力が全くないフラグメントに分割することによって達成される。分割した当該フラグメントのうちのいくつか、または全てを、野生型のアレルゲンにおけるフラグメントの順番とは異なる順番に結合させてもよい。（例えば欧州特許出願公開第１４４０９７９号明細書参照）。アレルゲンから低アレルギー性分子を生成する他の方法は、野生型アレルゲンのＣ末端欠失、および／または、Ｎ末端欠失を伴う方法である（例えば欧州特許出願公開第１２２４２１５号明細書参照）。当然のことながら、野生型アレルゲンの１つ以上のアミノ酸残基に対して特異的変異を導入することによって、低アレルギー性分子を生成することもできる。この改変の結果、３次元構造が欠失する。
【００２４】
ＲＮＡワクチンの低アレルギー化は、ＲＮＡワクチンから生ずるタンパク質を細胞のユビキチン化経路の標的とし、ユビキチン化経路において、各タンパク質を低アレルギー性のペプチドに分解することによって為される。上記は、ユビキチンをコードする配列を、アレルゲンをコードするＲＮＡの５’末端に結合させることによって、達成される。７６番目のアミノ酸残基をグリシンからアラニンに変異させる（Ｇ７６→Ａ７６）ことによって、ユビキチン化効率を上げることができる。また、アレルゲンの第１アミノ酸（メチオニン）を不安定化アミノ酸（アルギニン）に変異させる（Ｍ７７→Ｒ７７）ことによって、ユビキチン化効率をさらに上げることができる。また、ＰＥＳＴ配列として知られるカルボキシ末端不安定化配列を加えることによって、ＲＮＡワクチンから生ずる遺伝子産物のユビキチン化を行うこともできる。
【００２５】
本発明の好適な実施形態によると、ワクチンにおけるＲＮＡによってコードされた低アレルギー性のアレルゲン誘導体のＩｇＥ反応性は、野生型アレルゲンのＩｇＥ反応性よりも、１０％以上、好適には２０％以上、より好適には３０％以上、特に５０％以上低い。
【００２６】
ウサギの網状赤血球溶解液システムにおいてインビトロにてＲＮＡを翻訳することによって、ＲＮＡワクチンの低アレルギー性を定期的に検査することができる。適切な患者の血清のプールを用いたＩｇＥウェスタンブロット法によって、ＲＮＡワクチンから生じた遺伝子産物を分析することができる。当該網状赤血球溶解液システムにおいて翻訳された野生型分子のＩｇＥ結合能力と比較して、各低アレルギー性アレルゲンのＩｇＥ結合能力を評価することができる。
【００２７】
本発明に係る特に好適な実施形態によると、本発明のＲＮＡ分子は、１個を越える、好適には２個を越える、より好適には３個を越える、さらに好適には４個を越えるアレルゲンまたはそのアレルゲンの誘導体をコードするものであってもよい。特に、ＲＮＡ分子は、Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5およびPhl p6、またはAln g 1, Cor a 1, Que a 1, Car b 1およびBet v 1をコードする。
【００２８】
アレルゲンまたはその誘導体をコードするＲＮＡ分子は、少なくとも１つのさらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に結合される。
【００２９】
アレルゲンをコードするＲＮＡ配列は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ配列に結合され得る。これらのペプチドは、小胞体にアレルゲンを方向付けることによって細胞からのタンパク質分泌を高める、例えばヒト組織プラスミノーゲン活性化シグナルペプチド（ｈＴＰＡ）などのシグナルペプチドであってもよい。当該ペプチドまたはタンパク質は、リソソームに結合した膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、またはリソソームの膜内在性タンパク−ＩＩ（ＬＩＭＰ−ＩＩ）におけるＣ末の２０−アミノ酸であってもよい。ＬＡＭＰ／ＬＩＭＰ−ＩＩ配列は、抗原タンパク質を、形質転換された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の主要組織適合クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）小胞区画に方向付けるのに使用され、それによって、ワクチンの有効性を向上させるＴヘルパー細胞の活性を高める。当該タンパク質またはポリペプチドは、例えば熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、コレラ毒素などの細菌毒素、または大腸菌（Escherichia coli）の易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）といった、ワクチンのＴＨバイアスを高めるタンパク質であってもよい。
【００３０】
本発明に係る好適な実施形態では、ＲＮＡ分子は、レプリカーゼ、β−グロビンリーダー配列、ｃａｐ０、ｃａｐ１およびポリＡテールからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる要素を含むものである。
【００３１】
本発明のＲＮＡワクチンは、それぞれのアレルゲンをコードするＲＮＡ配列により構成される。当該ＲＮＡ配列は、アレルゲンの野生型配列であってもよいし、そのコドン使用頻度に対して適合されてもよい。コドン使用頻度の適合によって、ＲＮＡの翻訳効率および半減期を増大させることができる。少なくとも３０個のアデノシン残基からなるポリＡテールを、ＲＮＡの３´末端に結合させ、ＲＮＡの半減期を増大させる。ＲＮＡの５’末端は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（ｃａｐ ０構造）構造をもつ変異リボヌクレオチド、またはその誘導体によってキャップされる。当該変異リボヌクレオチドまたはその誘導体は、ＲＮＡ合成の間に組み込まれてもよく、または、ＲＮＡ転写の後に、Vaccinia Virus Capping Enzyme（ＶＣＥ：ｍＲＮＡトリフォスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼおよびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼからなる酵素）を用いて酵素処理してもよい。この酵素が、N7-monomethylated cap 0構造の構成を触媒する。ｃａｐ ０構造は、ＲＮＡワクチンの安定性および翻訳効率を維持するために重要な役割を果たす。ＲＮＡワクチンの５’キャップを２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾させてもよく、これによって、ｃａｐ １構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）が生成され、さらに、翻訳効率が向上する。
【００３２】
ＲＮＡワクチンは、自己複製ワクチンへの変換によって最適化され得る。当該ベクターは、対象の遺伝子とともに、アルファウイルス由来の複製要素と、構造的なウイルスタンパク質の代用物とを含む。レプリカーゼを基本要素とするＲＮＡワクチンは、ウイルス由来の危険シグナルが媒介する免疫活性化が原因で、極めて低量であっても、抗体だけでなく細胞毒性応答をも誘発することが示されている（Ying, H. et al. (1999) Nat Med 5:823-827）。
【００３３】
また、ＲＮＡワクチンは、自己複製ＲＮＡワクチンであってもよい。自己複製ＲＮＡワクチンは、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、またはアルファウイルスファミリーに属する他のウイルスに由来するレプリカーゼＲＮＡ分子によって構成されている。レプリカーゼの下流にはサブゲノムプロモータが存在し、当該サブゲノムプロモータがアレルゲンＲＮＡ、およびこれに続く３０個以上のアデノシン残基からなる人工ポリＡテールの複製を制御する。
【００３４】
本発明の他の好適な実施形態によると、ワクチンはさらにＣｐＧ−ＤＮＡおよびサイトカインを含み、サイトカインは好適にはインターロイキン（ＩＬ）−１２およびＩＬ−１５である。
【００３５】
さらに、ワクチンまたは本発明に係るワクチン製剤はアジュバントを含んでいてもよい。本発明における「アジュバント」は、抗原に対する免疫反応を高める化合物または混合物を指す。アジュバントは、抗原を徐放する組織徐放性製剤として供給されてもよい。アジュバントは、とりわけ、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバンド、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルオロニック多価アルコール、多価陰イオン、ペプチド、レバミゾール、ＣｐＧ−ＤＮＡ、油または炭化水素乳剤、ならびに、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有益なアジュバントを含む。
【００３６】
上記の代わりに、または上記に加えて、免疫刺激タンパク質をアジュバントとして、または、ワクチンに対する免疫の増大のために用いてもよい。免疫刺激サイトカイン、免疫増強サイトカインもしくは炎症性サイトカイン、リンフォカイン、またはケモカインなどの免疫刺激分子を、ワクチン、特にベクターワクチンとともに同時投与することによって、ワクチン接種の効果が高まる可能性がある（Salgaller and Lodge, J. Surg. Oncol. (1988) 68:122）。例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および、他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド（Lyman, Curr. Opin. Hematol., 1998, 5:192）、ＣＤ４０リガンド、などのサイトカインまたはサイトカイン遺伝子、ならびに、いくつかの主要な副刺激分子またはそれらの遺伝子（例えばＢ７．１、Ｂ７．２）を使用することができる。これら免疫刺激性分子は、タンパク質として全身的もしくは局所的に分配されてもよいし、ＲＮＡ分子または本発明に係るＲＮＡワクチンにおけるＲＮＡ分子にコードされていてもよい。また、免疫刺激性分子として、ポリアルギニンなどのポリカチオン性ペプチドを使用してもよい。
【００３７】
本発明に係るさらなる好適な実施形態によると、ワクチンは、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与、局所性投与、または微粒子銃投与に適用される。
【００３８】
様々な方法を用いて、本発明に係るＲＮＡワクチンを投与してもよい。例えば１つの方法では、インビボにおいてＲＮＡワクチンを直接体内に注入する（例：筋内、皮内、静脈内、鼻腔内など）。また、体外においてＲＮＡを細胞（例えば上皮細胞）内に注入することができる。例えば、インビトロにおいてＲＮＡワクチンを上皮細胞に形質移入し、身体に投与する（移殖する）。外因性ＲＮＡまたは異種ＲＮＡを細胞内に注入すれば、細胞は、当該ＲＮＡによって形質移入され得る。パルス法（pulsing）、すなわち、本発明に係るＲＮＡ分子とともに、細胞を培養することによって、細胞内にＲＮＡを導入することができる。また、ネイキッドＲＮＡとして、または他の形質移入促進剤（ペプチド、ポリマーなど）とともに、リポフェクションによってインビボでＲＮＡを導入してもよい。合成陽イオン性脂質は、インビボでの形質移入においてリポソームを生成するために使用される。核酸の形質移入に有益な脂質化合物および組成物は、例えばＤＯＤＣ，ＤＯＰＥ，ＣＨＯＬ，ＤＭＥＤＡ，ＤＤＡＢ，ＤＯＤＡＣ，ＤＯＴＡＰおよびＤＯＴＭＡである。また、他の分子も生体内での核酸の形質移入を促進するのに役立つ。他の分子とは、カチオン性オリゴペプチド（例えば国際公開第９５／２１９３１号パンフレット）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば国際公開第９６／２５５０８号パンフレット）、またはカチオン性ポリマー（例えば国際公開第９５／２１９３１号パンフレット）である。また、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、ポリラクチド−ポリグリコリドならびにキトサンを使用してもよい。また、電気穿孔法、顕微注入法、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、または遺伝子銃を使用する方法などの周知の方法を用いて、ＲＮＡ分子を所望の宿主細胞の中に導入してもよい（微粒子銃形質移入、Tang et al., Nature (1992) 356: 152-154参照）。
【００３９】
本発明の他の形態は、本明細書において規定された、アレルギーの治療用または予防用のワクチンを製造するための、少なくとも１つのＲＮＡ分子の使用に関する。
【００４０】
本発明のさらなる形態は、本明細書において規定された、アレルゲンに対する個体の除感作のためのワクチンを製造するための少なくとも１つのＲＮＡ分子の使用に関する。
【００４１】
本発明に係る他の好適な実施形態によると、ワクチンは、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与または微粒子銃投与に適用される。
【００４２】
本発明に係る他の形態は、少なくとも１つのアレルゲンまたはその誘導体をコードする少なくとも１つのヌクレオチドを含む分離されたＲＮＡ分子に関する。当該ＲＮＡ分子は、好適には、ｃａｐ０、ｃａｐ１、５’β−グロビンリーダー配列、自己複製ＲＮＡ、再コード化されたアレルゲン配列、および人工のポリＡテールからなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列を含む。なかでも、ＲＮＡ分子は、ｃａｐ０‐アレルゲン配列‐ポリＡテールが特に好ましい。ｃａｐ０は、インビボでの抗体の生成のため、ならびにアレルゲン特異的なＴ細胞の誘導およびＩＦＮ−ガンマ分泌のための自己複製ＲＮＡワクチンに関して、有益である。
【００４３】
さらに、下記の図面および例を用いて本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００４４】
図１は、β−ガラクトシダーゼをコードするＲＮＡ（βＧａｌ−ＲＮＡ）または自己複製ＲＮＡ（βＧａｌ−ｒｅｐＲＮＡ）転写産物を用いた、インビトロにおけるＢＨＫ２１細胞の形質移入を示す。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造を付加したＲＮＡ転写産物（キャップ）または当該構造を付加していないＲＮＡ転写産物（キャップなし）について試験した。形質移入していない細胞をバックグラウンド対照として使用した（形質移入されていない）。データは、３つの独立した形質移入実験の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。
【００４５】
図２Ａは、核酸ワクチン接種後のＰｈｌ ｐ ５特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルを示し、図２Ｂは、ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作を示す。血清は、１：１０００（図２Ａ）、１：１０００００（図２Ｂ）に希釈した。棒グラフの頂点上の数値は、各群におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２の平均比を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【００４６】
図３は、ＲＢＬ放出アッセイによって測定されたＰｈｌ ｐ ５特異的ＩｇＥを示す。ＩｇＥレベルは、各核酸ワクチンを用いたワクチン接種後（グレーの棒グラフ）、および、ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作（黒の棒グラフ）後に測定した。数値は、特定のヘキソサミニダーゼ放出の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【００４７】
図４は、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌ Ｐ５によるインビトロでの再刺激後のＩＦＮ−ガンマ（図４Ａ）、ＩＬ−４（図４Ｂ）、およびＩＬ−５（図４Ｃ）の数を示す。データは、１０６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【００４８】
図５は、アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおける全白血球数（図５Ａ）、および好酸球数（図５Ｂ）を示す。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
【００４９】
図６は、アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおけるＩＬ−５（図６Ａ）およびＩＦＮ−γ（図６Ｂ）のレベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【００５０】
図７は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５１】
図８は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５２】
図９は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５３】
図１０は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００５４】
図１１は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５５】
図１２は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｏｒ ａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００５６】
図１３は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｎ ｇ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００５７】
図１４は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５８】
図１５は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５９】
図１６は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ７によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６０】
図１７は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌ ｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６１】
図１８は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｒｙ ｊ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００６２】
図１９は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｊｕｎ ａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００６３】
図２０は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｍｂ ａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００６４】
図２１は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｐｉ ｇ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６５】
図２２は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄａｕ ｃ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００６６】
図２３は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６７】
図２４は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６８】
図２５は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔａ−ＣａｓｅｉｎによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６９】
図２６は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｙｐ ｃ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７０】
図２７は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆｅｌ ｄ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７１】
図２８は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄｅｒ ｐ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００７２】
図２９は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００７３】
図３０は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｌａ ｈ８によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００７４】
図３１は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｈｅｖ ｂ６によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７５】
図３２は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（アレルゲン）によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７６】
図３３は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒａ ｈ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００７７】
図３４は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｑｕｅ ａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７８】
図３５は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒｔ ｖ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７９】
図３６は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｏｌｅ ｅ１によるＴｈ１メモリの誘導がない、またはＩｇＥ反応の抑制がないことを示す。
【００８０】
＜実施例＞
〔実施例１：〕
本実施例では、ＲＮＡおよび臨床的に関連するオオアワガエリの花粉アレルゲンＰｈｌ ｐ５をコードするレプリカーゼベースのＲＮＡワクチンが、アレルギー反応を効果的に抑制することを示す。
【００８１】
（材料および方法）
［ＲＮＡ転写に使用されるプラスミド］
ｐＴＮＴベクターをＰｒｏｍｅｇａ（マンハイム、ドイツ）から購入した。このベクターは、他のベクターより優れた利点をもつ特別な特徴を有する。一方はＳＰ６ポリメラーゼ用、もう一方はＴ７ポリメラーゼ用の２つのプロモータが存在しており、ＳＰ６およびＴ７に基づくインビトロ転写を可能にする。それらプロモータは、タンデムにマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の近傍に配置されている。Ａ５’β−グロビンのリーダー配列は、より迅速に翻訳を開始させることによって複数の遺伝子の翻訳の増加を促進する。当該ベクターは、遺伝子の発現を向上させる他の特徴として、合成ポリ（Ａ）３０テールを有する。
【００８２】
ベクターｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，オーストリア）は、シンドビス・アルファウイルス（sindbis alphavirus）由来であり、これは包まれたポジティブストランドＲＮＡウイルスである。アルファウイルスベースのレプリコンベクターは、ウイルス性構造タンパク質を欠失しているが、細胞質におけるＲＮＡの自己増殖、およびアルファウイルス性プロモータを介する挿入遺伝子の発現に必要な複製エレメント（レプリカーゼ）を保持する。
【００８３】
ベクターｐＣＭＶ−Ｐｈｌｐ５からＮｈｅＩ／ＸｂａＩを介してＰｈｌ ｐ５遺伝子を抽出し（Gabler et al. (2006), J Allergy Clin Immunol 118:734-741）、ｐＴＮＴおよびｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５のＸｂａＩ制限酵素認識部位に連結し、それぞれｐＴＮＴ−Ｐ５およびｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５−Ｐ５を得た。
【００８４】
［ＲＮＡ転写］
対応する制限酵素を用いてプラスミドｐＴＮＴ−Ｐ５およびｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５−Ｐ５を直鎖状にした。フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出、それに続く１回のクロロホルム−イソアミルアルコール抽出によって、テンプレートを精製した。１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２を加えた後、２容量の１００％ＥｔＯＨによってプラスミドを沈殿させ、７０％ＥｔＯＨを用いて３回洗浄した。
【００８５】
全ての転写反応は、製造者のプロトコルに従って、Ｔ７またはＳＰ６ ＲｉｂｏＭＡＸＴＭ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。簡単には、１００μｌの反応液として、２０μｌの転写バッファー、３０μｌのｒＮＴＰ、５〜１０μｇのテンプレート、および１０μｌの酵素混合液を、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏで満たして１００μｌとし、３７℃にて２〜３時間インキュベートした。ＳＰ６ ＲｉｂｏＭａｘキットを使用する場合、３０μｌのｒＮＴＰの代わりに２０μｌのｒＮＴＰを使用した。
【００８６】
ｍＲＮＡのキャップ構造を擬態させるために、ＲＮＡ合成中に５’７−メチルグアノシンヌクレオチド（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）またはキャップアナログ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ，ＵＳＡ）を組み込んだ。ｒＮＴＰ混合物は、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＧＴＰおよびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの２５：２５：２５：２２．５：２．５ｍＭ混合物となるように調製した。
【００８７】
転写の後に、１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、氷上にて１０〜１５分間混合物をインキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温にて１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後、７０％エタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【００８８】
（結果）
［ＲＮＡおよび自己複製ＲＮＡを用いたインビトロ形質移入］
β−ガラクトシダーゼをコードする２つの異なるＲＮＡ転写産物を用いて、ＢＨＫ−２１細胞をインビトロ形質移入した。当該ＲＮＡ転写産物は、ベクターｐＴＮＴ−βＧａｌから転写された従来のＲＮＡワクチン（βＧａｌ−ＲＮＡ）、または、ベクターｐＲｅｐ５−βＧａｌから転写された自己複製ＲＮＡ（βＧａｌ−ｒｅｐＲＮＡ）である。
【００８９】
ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造が付加されたＲＮＡ転写産物、または付加されていないＲＮＡ転写産物について、試験した。図１は、従来のＲＮＡと同量の自己複製ＲＮＡを形質移入した場合、従来のＲＮＡと比べて７．５倍高い遺伝子発現を誘発することを示す。加えて、キャップ構造によるＲＮＡの安定化は、ＲＮＡのインビトロ形質移入／翻訳に不可欠である。
【００９０】
［アレルゲンＰｈｌｐ５をコードするＲＮＡベースのワクチンは、免疫原性であり、ＩｇＥ誘導を抑制する］
ＲＮＡベースのワクチンがアレルギーの誘導を抑制する可能性を検証するために、Ｐｈｌ ｐ ５をコードする従来のＲＮＡ、またはＰｈｌ Ｐ ５をコードする自己複製ＲＮＡを用いて、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫性を付与した。ＲＮＡワクチンの有効性を算出するために、従来のＤＮＡワクチン（ｐＣＭＶ−Ｐ５）およびＰｈｌ ｐ５をコードする自己複製ＤＮＡワクチン（ｐＳｉｎ−Ｐ５）を同量用いて、対応する群に免疫性を付与した。１週間ごとのインターバルをおいて３回マウスに免疫性を付与し、２週間後、ミョウバンとの複合体とした組み換え体Ｐｈｌ ｐ ５を２回注入して、感作させた。これは、アレルギー表現型を誘導するプロトコルとして知られており、高レベルのＩｇＥ、およびＴＨ２にバイアスされたサイトカインプロファイルを特徴とする。
【００９１】
図２Ａは、両方のＲＮＡワクチンが、自己複製ＤＮＡワクチンｐＳｉｎ−Ｐ５と同様の液性免疫反応を誘導することを示す。対照的に、従来のＤＮＡワクチンｐＣＭＶ−Ｐ５によって誘導された液性免疫反応は、他のワクチンよりも約１桁高い大きさであった。全てのワクチンタイプが、低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比によって特徴付けられるＴＨ１バイアスの血清学的プロファイルを示し、かつＲＢＬ放出アッセイによって測定される機能性あるＩｇＥの誘導を示さなかった（図３、グレーの棒グラフ）。
【００９２】
感作後、プレ免疫付与されていない対照群は、アレルギー感作を示す、高いＩｇＧ１レベルおよび高いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を有する完全にＴＨ２にバイアスされた血清を示した。対照的に、ワクチン接種された全群がＴＨ１調和型の免疫表現型を維持した（図２Ｂ）。両タイプのＲＮＡワクチンを用いたプレワクチン接種によって、対応するＤＮＡを用いた対照動物と同じ、またはよりよいＩｇＥ誘導の抑制が生じた（図３、黒棒グラフ）。全体的に見て、両タイプのＲＮＡワクチンを用いたプレワクチン接種によって、アレルギー感作に対するＩｇＥ誘導が９３％抑制された。
【００９３】
［ＲＮＡベースのワクチンがＴＨ１バイアスＴ細胞メモリを誘導］
最終感作の２週間後、組み換え型Ｐｈｌ ｐ ５タンパク質を用いて脾細胞をインビトロにおいて再刺激し、それらのＴＨ１／ＴＨ２プロファイルを評価した。したがって、ＥＬＩＳＰＯＴを用いてＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−５分泌細胞の数を測定した。
【００９４】
核酸ワクチンによってプレワクチン接種された全ての接種群は、対照群に比べてＩＦＮ−γ分泌細胞の誘導が著しいことが示された（図４Ａ）。同時に、ＴＨ２型サイトカインＩＬ−４（図４Ｂ）およびＩＬ−５（図４Ｃ）を分泌する細胞数は抑制され、ＤＮＡワクチンと同様に、ＲＮＡワクチンがＴＨ１バイアス抗原特異的メモリを確立することができ、このＴＨ１バイアス抗原特異的メモリはその後のアレルゲン曝露によって再活性化され得ることが示された。
【００９５】
［ＲＮＡベースのワクチンがアレルゲン誘導性の肺炎症を軽減する］
ＲＮＡ接種が肺病理の誘導に及ぼす影響を検証するために、最終感作の２週間後に、１μｇの組み換え型Ｐｈｌ ｐ ５を１日２回鼻腔内投与して、肺炎症を誘導した。当該プロトコルによって、感作されたマウスにおいて気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）内への白血球の浸潤が強く誘導された（図５Ａ、対照）。浸潤した白血球の約８０％が好酸球であった（図５Ｂ）。対照的に、プレワクチン接種されたマウスにおいて浸潤した白血球の全数は大幅に低減しており、好酸球に関してはさらに低減していた。
【００９６】
炎症性浸潤は、ＢＡＬＦ中のＩＬ−５の抑制の影響をも強く受けて、低減した（図６Ａ）。ＩＬ−５の抑制は、逆にＩＦＮ−γの誘導と相関した（図６Ｂ）。
【００９７】
（結論）
ＤＮＡワクチンは、アレルギー性疾患の予防および治療に有効である可能性が極めて高い。しかし、ＤＮＡワクチンにはリスクがあるのではという仮説があるので、この新型ワクチンを健康な成人または子供に対して臨床使用することは疑問視されている。
【００９８】
本実施例では、臨床的に関連性あるアレルゲンをもつネイキッドＲＮＡを接種することによって、このネイキッドＲＮＡと同量のＤＮＡワクチンが投与された場合と同程度にアレルギー誘導を抑制できることが初めて示された。
【００９９】
より多量のＲＮＡを製造するという問題に取り組むため、従来のＲＮＡをシンドビス・ウイルスのレプリコン由来の自己複製ＲＮＡと比較した。両タイプのＲＮＡを用いたインビトロ形質移入では、抗原の発現は、とりわけ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップのアナロゴン（ａｎａｌｏｇｏｎ）の付加に依存することがわかった。真核ｍＲＮＡの大半が５’末端において当該ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造を有することは周知であり、これは、翻訳開始因子の結合にとって重要であり、ｍＲＮＡ安定性に寄与する。加えて、同様の量の自己複製ＲＮＡから、７倍高いレベルのタンパク質が翻訳された（図１）。この結果は、それぞれの抗原をコードするサブゲノムＲＮＡの自己増殖に寄与する。この結果は、従来のＤＮＡワクチンよりもタンパク質の発現が低い自己複製ＤＮＡワクチンとは対照的に、形質移入された細胞におけるアポトーシスの誘導に寄与したという効果である。しかし、ＲＮＡワクチンの発現は一過性のものに過ぎず、そのため、自己複製ワクチンによって形質移入された直後にアポトーシスを起こす細胞と同等である。実際、自己複製ＲＮＡワクチンは、自己複製ＤＮＡワクチンと同様の液性免疫反応を誘発する（図２Ａ）が、従来のＤＮＡワクチンは、抗原を継続的に発現させるため、最も高い液性免疫反応を示す。
【０１００】
本実施例では従来のＲＮＡ／ＤＮＡワクチンの５分の１量の自己複製核酸ワクチンを使用したが、ミョウバン中における組み換え型アレルゲンを用いた次の感作後のＩｇＧ２ａの増加（図２Ｂ）、および再刺激された脾細胞のＴＨ１サイトカインプロファイル、ならびに高い抑制能力（図３）に示されたように、同様のＴＨ１メモリ誘導が観察された。したがって、ＲＮＡワクチンおよび自己複製ＤＮＡワクチンの両方が従来のＤＮＡワクチンよりも高い抑制能力を示す。ただし、後者は、より高いレベルの正常抗原、およびより高い液性免疫反応を誘導する。これは、長期間のアレルゲン分泌を誘発するワクチンが、ＲＮＡワクチンおよび自己複製ワクチンに見られる短期間のワクチン発現に比べて逆効果を招き得ることを示す。
【０１０１】
また、ＲＮＡワクチン接種は、鼻腔内の誘発後の肺浸潤をＤＮＡワクチンと同程度低減させる（図５Ａ）。これは、ＢＡＬＦ中における好酸球の数の激減が主な原因である（図５Ｂ）。このことは、肺におけるＩＬ−５の低減（図６Ａ）、および中間レベルのＩＦＮ−γの誘導と相関しており（図２Ｂ）、ワクチンにより誘導されたＴＨ１細胞の産生が、肺におけるＴＨ１／ＴＨ２サイトカインバランスに影響を及ぼすことを示している。ウイルスモデルでは、肺におけるＩＦＮ−γは、喘息および肺病理に有害な影響を及ぼすが、これは、ＩＦＮ−γが肺上皮細胞を活性化させ、より多くのＴＨ２細胞を組織内に取り入れることによる間接的影響であると考えられる。実際、アレルギーモデルでは、ＴＨ２免疫を、より調和のとれたＴＨ１環境に再度方向付けることは、主にＩＬ−５およびＩＬ−１３を対抗制御することによって、肺浸潤および気道過敏症に好影響を及ぼす（Ford, J. G. et al. (2001) J Immunol 167:1769-1777）。
【０１０２】
上記をまとめると、ＲＮＡベースワクチンは、アレルギー性感作に対する防御を強く誘発させることができ、自己複製ＲＮＡワクチンを使用することによって、低用量にて当該効果を得ることができる。ＲＮＡワクチンにおけるこの優れた安全なプロファイルを鑑みると、治療環境だけでなく、アレルギー性疾患を発症する可能性が高い健康な個体にもＲＮＡワクチンを使用できる可能性がある。
【０１０３】
〔実施例２〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｂｅｔ ｖ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。３７℃にて１５分間、キャップした転写産物をＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【０１０４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換え体Ｂｅｔ ｖ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１０５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｂｅｔ ｖ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１０６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図７Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図７Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的ＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図７Ｃ）。
【０１０７】
〔実施例３〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃａｒ ｂ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１０８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【０１０９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣａｒ ｂ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１１０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｃａｒ ｂ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１１１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図８Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図８Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図８Ｃ）。
【０１１２】
〔実施例４〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃａｓ ｓ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１１３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【０１１４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣａｓ ｓ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１１５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｃａｓ ｓ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１１６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図９Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図９Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図９Ｃ）。
【０１１７】
〔実施例５〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したように、Ｐｈｌ ｐ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を作製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１１８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【０１１９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌ ｐ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１２０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｐｈｌ ｐ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１２１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１０Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１０Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１２２】
〔実施例６〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｐｈｌ ｐ ６をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１２３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【０１２４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌ ｐ ６を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１２５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定＞］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｐｈｌ ｐ ６を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１２６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１１Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１１Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１１Ｃ）。
【０１２７】
〔実施例７〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｏｒ ａ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１２８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１２９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｏｒ ａ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｏｒ ａ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１３０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的な血清ＩｇＧ２ａを測定した。
【０１３１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｏｒ ａ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１２Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１２Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１２Ｃ）。
【０１３２】
〔実施例８〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したように、Ａｌｎ ｇ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１３３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１３４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｎ ｇ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｌｎ ｇ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１３５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ａｌｎ ｇ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清をアレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１３６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｎ ｇ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１３）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１３７】
〔実施例９〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｆａｇ ｓ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１３８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１３９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＦａｇ ｓ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１４０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｆａｇ ｓ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１４１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１４Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１４Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１４Ｃ）。
【０１４２】
〔実施例１０〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｐｈｌ ｐ ２をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１４３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１４４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ２を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌ ｐ ２を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１４５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｐｈｌ ｐ ２を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１４６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ２（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１５Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１５Ｂ）。
【０１４７】
〔実施１１〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したように、Ｐｈｌ ｐ 7をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１４８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１４９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ７を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌ ｐ ７を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１５０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。
【０１５１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ７（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１６Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１６Ｂ）。
【０１５２】
〔実施例１２〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５、およびＰｈｌ ｐ ６をコードするハイブリッドｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした（Linhart B. and Valenta R., Int Arch Allergy Immunol (2004) 134:324-331）。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１５３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１５４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（Ｐｈｌ ｐ １−２−５−６）を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５、およびＰｈｌ ｐ ６を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１５５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型アレルゲンを用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１５６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（Ｐｈｌ ｐ １−２−５−６）（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１７Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１７Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１７Ｃ）。
【０１５７】
〔実施例１３〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｒｙ ｊ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１５８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１５９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｒｙ ｊ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｒｙ ｊ １を２週間注入して、感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１６０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｃｒｙ ｊ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１６１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｒｙ ｊ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１８Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１８Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１６２】
〔実施例１４〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｊｕｎ ａ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１６３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１６４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｊｕｎ ａ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＪｕｎ ａ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１６５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｊｕｎ ａ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１６６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｊｕｎ ａ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１９）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１６７】
〔実施例１５〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｍｂ ａ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニング。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１６８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間培養し、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１６９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｍｂ ａ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｍｂ ａ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１７０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ａｍｂ ａ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１７１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｍｂ ａ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図２０）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１７２】
〔実施例１６〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｐｉ ｇ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間培養し、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１７３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｐｉ ｇ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｐｉ ｇ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１７４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ａｐｉ ｇ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１７５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２１Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２１Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２１Ｃ）。
【０１７６】
〔実施例１７〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｄａｕ ｃ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１７７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１７８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｄａｕ ｃ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＤａｕ ｃ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１７９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｄａｕ ｃ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１８０】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２２Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２２Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１８１】
〔実施例１８〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｍａｌ ｄ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１８２】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１８３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＭａｌ ｄ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１８４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｍａｌ ｄ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１８５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２３Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２３Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２３Ｃ）。
【０１８６】
〔実施例１９〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、ＯｖａをコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を作製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１８７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１８８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｖａを用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＯｖａを２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１８９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｏｖａを用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１９０】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｖａ（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２４Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２４Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２４Ｃ）。
【０１９１】
〔実施例２０〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、ベータ−カゼインをコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を生成し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１９２】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１９３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ベータ−カゼインを用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えベータ−カゼインを２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１９４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型ベータ−カゼインを用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１９５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ベータ−カゼイン（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図２５Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２５Ｂ）。
【０１９６】
〔実施例２１〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｙｐ ｃ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１９７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１９８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｙｐ ｃ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｙｐ ｃ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１９９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。
【０２００】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｙｐ ｃ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２６）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０２０１】
〔実施例２２〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｆｅｌ ｄ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２０２】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２０３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆｅｌ ｄ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＦｅｌ ｄ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２０４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｆｅｌ ｄ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２０５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆｅｌ ｄ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２７Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２７Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０２０６】
〔実施例２３〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｄｅｒ ｐ ２をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２０７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２０８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｄｅｒ ｐ ２を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＤｅｒ ｐ ２を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２０９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。
【０２１０】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｄｅｒ ｐ ２（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１１Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２８Ｂ）。
【０２１１】
〔実施例２４〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｌｔ ａ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２１２】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２１３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンを用いた１μｇの組み換えＡｌｔ ａ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２１４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ａｌｔ ａ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２１５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２９Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２９Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２９Ｃ）。
【０２１６】
〔実施例２５〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｌａ ｈ ８をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２１７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２１８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｌａ ｈ ８を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｌａ ｈ ８を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２１９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｃｌａ ｈ ８を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清をアレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２２０】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｌａ ｈ ８（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図３０Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図３０Ｂ）。
【０２２１】
〔実施例２６〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｈｅｖ ｂ ６をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２２２】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２２３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｈｅｖ ｂ ６を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＨｅｖ ｂ ６を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２２４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｈｅｖ ｂ ６を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２２５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｈｅｖ ｂ ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図３１Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図３１Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図３１Ｃ）。
【０２２６】
〔実施例２７〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、５つの異なるアレルゲンをコードするハイブリッドｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２２７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２２８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（Ａｌｎ−Ｃｏｒ−Ｑｕｅ−Ｃａｒ−Ｂｅｔ）を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換え型の全アレルゲンを２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２２９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。
【０２３０】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（アレルゲン）（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図３２）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０２３１】
〔実施例２８〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｒａ ｈ ２をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２３２】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒａ ｈ ２を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｒａ ｈ ２を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２３３】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、生体外にて７２時間、組み換え型Ａｒａ ｈ２を用いて脾細胞を再刺激し、ＩＦＮ−γに関して細胞培養上澄み液をアレルゲン特異的Ｔｈ１細胞活性の指標として分析した。
【０２３４】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒａ ｈ ２（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図３３Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図３３Ｂ）。
【０２３５】
〔実施例２９〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｑｕｅ ａ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２３６】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２３７】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｑｕｅ ａ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＱｕｅ ａ １を２週間注入して１週間後に感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２３８】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｐｈｌ ｐ ６を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２３９】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｑｕｅ ａ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図３４Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図３４Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０２４０】
〔実施例３０〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｒｔ ｖ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２４１】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２４２】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒｔ ｖ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｒｔ ｖ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２４３】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ａｒｔ ｖ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２４４】
（結果）
ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒｔ ｖ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大がなく（図３５Ａ）、さらにＩＦＮ−γの分泌の増大がないこと（図３５Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増がなかった。
【０２４５】
〔例３１〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｏｌｅ ｅ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２４６】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２４７】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｌｅ ｅ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＯｌｅ ｅ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２４８】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。
【０２４９】
（結果）
ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｌｅ ｅ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大がなく（図３６Ａ）、さらにＩＦＮ−γの分泌の増大がないこと（図３６Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増がなかった。さらに、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導の抑制を測定することができなかった（図３６Ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】β−ガラクトシダーゼをコードするＲＮＡ（βＧａｌ−ＲＮＡ）または自己複製ＲＮＡ（βＧａｌ−ｒｅｐＲＮＡ）転写産物を用いた、インビトロにおけるＢＨＫ２１細胞の形質移入を示す。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造を付加したＲＮＡ転写産物（キャップ）または当該構造を付加していないＲＮＡ転写産物（キャップなし）について試験した。形質移入していない細胞をバックグラウンド対照として使用した（形質移入されていない）。データは、３つの独立した形質移入実験の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。
【図２Ａ】核酸ワクチン接種後のＰｈｌ ｐ ５特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルを示す。血清は、１：１０００（図２Ａ）に希釈した。棒グラフの頂点上の数値は、各群におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２の平均比を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図２Ｂ】ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作を示す。血清は、１：１０００００（図２Ｂ）に希釈した。棒グラフの頂点上の数値は、各群におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２の平均比を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図３】ＲＢＬ放出アッセイによって測定されたＰｈｌ ｐ ５特異的ＩｇＥを示す。ＩｇＥレベルは、各核酸ワクチンを用いたワクチン接種後（グレーの棒グラフ）、および、ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作（黒の棒グラフ）後に測定した。数値は、特定のヘキソサミニダーゼ放出の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図４Ａ】ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌ ｐ ５によるインビトロでの再刺激後のＩＦＮ−ガンマ（図４Ａ）の数を示す。データは、１０６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図４Ｂ】ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌ ｐ ５によるインビトロでの再刺激後のＩＬ−４（図４Ｂ）の数を示す。データは、１０６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図４Ｃ】ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌ ｐ ５によるインビトロでの再刺激後のＩＬ−５（図４Ｃ）の数を示す。データは、１０６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図５Ａ】アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおける全白血球数（図５Ａ）を示す。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
【図５Ｂ】アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおける好酸球数（図５Ｂ）を示す。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
【図６Ａ】アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおけるＩＬ−５（図６Ａ）のレベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図６Ｂ】アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおけるＩＦＮ−γ（図６Ｂ）のレベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図７Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図７Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図７Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図８Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図８Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図８Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図９Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図９Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図９Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１０Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１０Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１１Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１１Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１１Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１２】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｏｒ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１３】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｎ ｇ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１４Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１４Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１４Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１５Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１５Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１６Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ７によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１６Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ７によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１７Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌ ｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１７Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌ ｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１７Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌ ｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１８Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｒｙ ｊ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１８Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｒｙ ｊ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１９】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｊｕｎ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２０】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｍｂ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２１Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｐｉ ｇ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２１Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｐｉ ｇ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２１Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｐｉ ｇ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２２Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄａｕ ｃ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２２Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄａｕ ｃ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２３Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２３Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２３Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２４Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２４Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２４Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２５Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔａ−ＣａｓｅｉｎによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２５Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔａ−ＣａｓｅｉｎによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２６】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｙｐ ｃ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２７Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆｅｌ ｄ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２７Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆｅｌ ｄ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２８Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄｅｒ ｐ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２８Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄｅｒ ｐ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２９Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２９Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２９Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図３０Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｌａ ｈ ８によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図３０Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｌａ ｈ ８によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図３１Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｈｅｖ ｂ ６によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３１Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｈｅｖ ｂ ６によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３２】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（アレルゲン）によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３３Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒａ ｈ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図３３Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒａ ｈ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図３４Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｑｕｅ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３４Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｑｕｅ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３５Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒｔ ｖ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３５Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒｔ ｖ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３６Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｏｌｅ ｅ １によるＴｈ１メモリの誘導がない、またはＩｇＥ反応の抑制がないことを示す。
【図３６Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｏｌｅ ｅ １によるＴｈ１メモリの誘導がない、またはＩｇＥ反応の抑制がないことを示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡワクチンに関する。
【０００２】
この数十年間に、欧米先進国では、Ｉ型アレルギー性疾患が大きな健康問題として浮上してきており、現在では、人口の約２５％が発症している。
【０００３】
遺伝的要因の他、幼児期の感染を含む成長期の環境、食習慣、および、受動喫煙や大気汚染への暴露などの環境要因が、アトピー性疾患の発生に大きく関係する。
【０００４】
現在、何年かに渡ってアレルゲンを徐々に増やして投与するという特定の免疫療法が、唯一有効な治療的介入の例である。しかし、投与量が多いため、アナフィラキシー性副作用の危険性は明白であり、未精製の、殆ど特定されていないアレルゲンの抽出物を使用した場合、未確認の成分に対する患者の感作を生じさせる可能性がある。
【０００５】
さらに、Ｉ型アレルギーに対する予防接種は実現しておらず、アレルギー性疾患を発症する遺伝的リスクが高い幼児においてアレルギー性疾患の発症を予防するのが、最も実現可能な手法であろう。幼い免疫システムを訓練するほうが、既に発症したアレルギー性免疫表現型の均衡を保つよりも簡単である。
【０００６】
Ying et al.（Nature Med (1999) 5:823-827）には、免疫学的過程を研究するためのモデル分子として使用されることが多いβ−ガラクトシダーゼをコードするＲＮＡを含む自己修復ＲＮＡワクチンが開示されている。Ying et al.では、抗腫瘍反応が研究されており、ＣＤ８陽性細胞の誘導が観察されている。しかし、Ying et al.において調査されていないＣＤ４陽性細胞は、ＣＤ８陽性細胞とは対照的に、アレルギーに対する免疫学的防御を媒介し、Ｂ細胞におけるＩｇＥへのクラススイッチを妨げる。
【０００７】
近年、核酸ベースのワクチンは、アレルギー性疾患の根底にある免疫機構にバイアスをかける有効な手法となってきている。数多くの動物実験において、ＤＮＡワクチンがＩ型アレルギー反応の誘導を抑制し、さらには既存のアレルギー性ＴＨ２免疫状態を回復させることが立証されている（Weiss, R. et al. (2006) Int Arch Allergy Immunol 139:332-345）。
【０００８】
それでもなお、ＤＮＡベースのワクチンの安全性に関して懸念の声が挙がっている。注入されたＤＮＡ分子は、宿主ゲノムに統合される可能性があり、また、様々な組織への分散性により、アレルゲンが持続的に放出され、その結果、既存のアレルゲン特異的ＩｇＥ分子を有する患者において制御不可能なアナフィラキシー反応を誘発する慮がある。さらに、健康な子供に対してワクチンを投与する場合、抗アレルギーワクチンにおける最も高水準の安全基準を適用する必要がある。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ＤＮＡワクチンの欠点を克服し、さらにアレルギー治療に有効である、または、アレルゲンに対する感作をうまく抑制できるアレルゲンワクチンを提供することにある。
【００１０】
本発明は、少なくとも１つのアレルゲンまたはそのアレルゲンの誘導体をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含むＲＮＡワクチンに関する。当該ＲＮＡワクチンにおいて、当該アレルゲンは、アルヌス・グルチノーサ（Alnus glutinosa）、アルタナリア・アルタナータ（Alternaria alternata）、アンブローシア・アルテミシーフォリア（Ambrosia artemisiifolia）、アピウム・グラベオレンス（Apium graveolens）、アラキス・ハイポガエア（Arachis hypogaea）、ベツラ・ベルコーサ（Betula verrucosa）、カルピヌス・ベツルス（Carpinus betulus）、カスタネア・サチバ（Castanea sativa）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Cladosporiumherbarum）、コリルス・アベラナ（Corylus avellana）、クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica）、カプリナス・カルピオ（Cyprinus carpio）、ダウクス・カロタ（Daucus carota）、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（Dermatophagoides pteronyssinus）、ファグス・シルバチカ（Fagus sylvatica）、フェリス・ドメスチカス（Felis domesticus）、ヘベア・ブラシリエンシス（Heveabrasiliensis）、ジュニペルス・アシュエイ（Juniperus ashei）、マルス・ドメスチカ（Malus domestica）、ケルクス・アルバ（Quercus alba）、およびフレウム・プラテンス（Phleum pratense）のアレルゲンである。
【００１１】
アレルゲンまたはそのアレルゲンの誘導体をコードするＲＮＡ分子は、ＲＮＡワクチンとしても有効に使用できる可能性があることがわかった。ＲＮＡワクチンは、アレルギー性疾患の治療のためのＤＮＡワクチンによる特徴を示す。すなわち、ＲＮＡワクチンにおいて、アレルゲンは最も純粋な形態、すなわち遺伝情報にて提供され、ＤＮＡワクチンと同様に、ＲＮＡワクチンはＴＨ１−バイアスの免疫反応を誘発する。さらに、低アレルギー性の遺伝子産物を生成するためにＤＮＡワクチン用に作られた方法と同様の方法を、ＲＮＡワクチンにおいても利用することができる。
【００１２】
さらに、ＲＮＡワクチンには、ＤＮＡワクチンより大きな利点がある。
（ｉ）ＲＮＡワクチンは、アレルゲンの純粋な遺伝情報を含んでいるが、ＤＮＡワクチンに使用されるプラスミドの骨格に通常存在するウイルスプロモータ、抗生物質耐性遺伝子、またはウイルス／細菌の調節配列などの外来配列を含まない。
（ｉｉ）ＲＮＡは、宿主ゲノムに統合されないため、悪性腫瘍の危険性を解消できる。
（ｉｉｉ）ＲＮＡは、細胞の細胞質にて翻訳されるので、細胞核の転写機構が必要ではなく、ＲＮＡワクチンは、核内移行または核外移行とは独立しており、核の各ステージからも独立している。
（ｉｖ）ＲＮＡは迅速に分解されるので、外来遺伝子の発現は短期間に行われ、制御不可能な長期に渡る抗原の発現を避けることができる。
【００１３】
本発明に係るＲＮＡワクチンは、アレルゲンをコードする１つ以上のＲＮＡ分子を含んでいてもよく、好適には２、３、５、１０種等のＲＮＡ分子を含んでいてもよい。しかし、１種のＲＮＡ分子が１つ以上のアレルゲンをコードしてもよい。つまり、１種のＲＮＡ分子が少なくとも１、２、３、５、１０個の異なる、または同じアレルゲンをコードする塩基配列を含む構成としてもよい。１種ないし複数種のＲＮＡ分子によってコードされるアレルゲンは、後述の列挙のあらゆる組み合せの中から選択されてもよい。
【００１４】
本明細書において使用するとき、「ＲＮＡワクチン」という用語は、本明細書において規定されたＲＮＡ分子を含むワクチンを指す。しかし当然のことながら、当該ワクチンは、個体に投与する際に必要とされる、または、好適である他の物質および分子（たとえば医薬品賦形剤）を含んでいてもよい。
【００１５】
「〜のアレルゲン」という用語は、「〜由来のアレルゲン」および「〜から得られるアレルゲン」という用語に置き換えることができる。これは、アレルゲンが当該生物において自然発現されるものであり、本発明に係るＲＮＡ分子を生成するために当該アレルゲンをコードするＤＮＡ／ＲＮＡが単離されることを指す。
【００１６】
哺乳類またはヒトに投与したとき、アレルゲンをコードするＲＮＡ分子の全てがアレルゲン特異的抗体の形成を誘発するわけではないことがわかった。例えばアルテミシア・ブルガリス（Artemisiavulgaris）のアレルゲンＡｒｔ Ｖ １、およびオレア・エウロピア（Olea europea）のアレルゲンＯｌｅ ｅ １をコードするＲＮＡ分子は、Ｔｈ１メモリを誘発することができず、アレルゲン特異的ＩｇＥ反応を抑制することができない。しかし、上述したソースに由来するアレルゲンをコードするＲＮＡ分子は上記を行うことができる。
【００１７】
本発明の好適な実施形態によると、アルヌス・グルチノーサのアレルゲンは、Ａｌｎ ｇ １であり、アルタナリア・アルタナータのアレルゲンは、Ａｌｔ ａ １、Ａｌｔ ａ ３、Ａｌｔ ａ ４、Ａｌｔ ａ ５、Ａｌｔ ａ ６、Ａｌｔ ａ ７、Ａｌｔ ａ ８、Ａｌｔ ａ １０、Ａｌｔ ａ １２およびＡｌｔ ａ １３からなる群より選択され、アンブローシア・アルテミシーフォリアのアレルゲンは、Ａｍｂ ａ １、Ａｍｂ ａ ２、Ａｍｂ ａ ３、Ａｍｂ ａ ５、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ７、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ９およびＡｍｂ ａ １０からなる群より選択され、アピウム・グラベオレンスのアレルゲンは、Ａｐｉ ｇ １、Ａｐｉ ｇ ４およびＡｐｉ ｇ ５からなる群より選択され、アラキス・ハイポガエアのアレルゲンは、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ４、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ７およびＡｒａ ｈ ８からなる群より選択され、ベツラ・ベルコーサのアレルゲンは、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ６およびＢｅｔ ｖ ７からなる群より選択され、カルピヌス・ベツルスのアレルゲンは、Ｃａｒ ｂ １であり、カスタネア・サチバのアレルゲンは、Ｃａｓ ｓ １、Ｃａｓ ｓ ５およびＣａｓ ｓ ８からなる群より選択され、クラドスポリウム・ヘルバルムのアレルゲンは、Ｃｌａ ｈ ２、Ｃｌａ ｈ ５、Ｃｌａ ｈ ６、Ｃｌａ ｈ ７、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｌａ ｈ ９、Ｃｌａ ｈ １０およびＣｌａ ｈ １２からなる群より選択され、コリルス・アベラナのアレルゲンは、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ １０およびＣｏｒ ａ １１からなる群より選択され、クリプトメリア・ジャポニカのアレルゲンは、Ｃｒｙ ｊ １およびＣｒｙ ｊ ２からなる群より選択され、カプリナス・カルピオのアレルゲンは、Ｃｙｐ ｃ １であり、ダウクス・カロタのアレルゲンは、Ｄａｕ ｃ １およびＤａｕ ｃ ４からなる群から選択され、デルマトファゴイデス・プテロニシヌスのアレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＣｌｏｎｅ ３０アレルゲンからなる群より選択され、ファグス・シルバチカのアレルゲンは、Ｆａｇ ｓ １であり、フェリス・ドメスチカスのアレルゲンは、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ５ｗ、Ｆｅｌ ｄ ６ｗおよびＦｅｌ ｄ ７ｗからなる群より選択され、ヘベア・ブラシリエンシスのアレルゲンは、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６．０１、Ｈｅｖ ｂ ６．０２、Ｈｅｖ ｂ ６．０３、Ｈｅｖ ｂ ７．０１、Ｈｅｖ ｂ ７．０２、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２およびＨｅｖ ｂ １３からなる群より選択され、ジュニペルス・アシュエイのアレルゲンは、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ ２およびＪｕｎ ａ ３からなる群より選択され、マルス・ドメスチカのアレルゲンは、Ｍａｌ ｄ １、Ｍａｌ ｄ ２、Ｍａｌ ｄ ３およびＭａｌ ｄ ４からなる群より選択され、ケルクス・アルバのアレルゲンは、Ｑｕｅ ａ １であり、ならびに、フレウム・プラテンスのアレルゲンは、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２およびＰｈｌ ｐ １３からなる群より選択される。
【００１８】
本発明の好適な実施形態によると、アレルゲンは、下記からなる群から選択される：
イネ科の花粉：Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 12
イエダニ：Der p 1, Der p 2, Der p 7, Der p 21, Clone 30 allergen （PCT国際出願番号AT2007/000201, オーストリア特許出願番号AT 503530：
MKFNIIIVFI SLAILVHSSY AANDNDDDPT TTVHPTTTEQ PDDKFECPSR FGYFADPKDP HKFYICSNWE AVHKDCPGNT RWNEDEETCT、配列番号１）
カバノキ花粉：Bet v 1 およびその同種の木（Aln g 1, Cor a 1, Fag s 1）または食物アレルゲン（Mal d 1, Api g 1, Pru p 1）
猫：Fel d 1, Fel d 2
草（ブタクサ、ヨモギ）：Amb a 1
イトスギ／ビャクシン／ヒマラヤスギ：Cry j 1, Cry j 2, Jun a 1, Jun a 3,
Cha o 1, Cha o 2, Cup a 1, Cup a 3, Jun a 1, Jun a 3, Pla a 3
ピーナッツ：Ara h 1, Ara h 2, Ara h 4
へーゼルナッツ：Cor a 8, Cor a 9
魚／エビ：Gad c 1, Cyp c 1, Pen a 1。
【００１９】
本発明に係るＲＮＡワクチンに使用される特に好適なアレルゲンは、Ａｌｎ ｇ １、Ａｌｔ ａ １、Ａｍｂ ａ １、Ａｐｉ ｇ １、Ａｒａ ｈ ２、Ｂｅｔ ｖ １、ベータ−カゼイン、Ｃａｒ ｂ １、Ｃａｓ ｓ １、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｙｐ ｃ １、Ｄａｕ ｃ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｆａｇ ｓ １、Ｆｅｌ ｄ １、Ｈｅｖ ｂ ６、Ｊｕｎ ａ １、Ｍａｌ ｄ １、オボアルブミン（ＯＶＡ）、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６およびＰｈｌ ｐ ７からなる群より選択される。
【００２０】
上述したアレルゲンは、ＲＮＡワクチンにおける使用に特に適することがわかった。当然のことながら、Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 8, Amb a 9, Amb a 10, Amb t 5, Hel a 1, Hel a 2, Hel a 3, Mer a 1, Che a 1, Che a 2, Che a 3, Sal k 1, Cat r 1, Pla l 1, Hum j 1, Par j 1, Par j 2, Par j 3, Par o 1, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 5, Fes p 4w, Hol l 1, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 5, Lol p 11, Pha a 1, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13, Poa p 1, Poa p 5, Sor h 1, Pho d 2, Aln g 1, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Car b 1, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Que a 1, Fra e 1, Lig v 1, Syr v 1, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3w, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1, Pla a 1, Pla a 2, Pla a 3, Aca s 13, Blo t 1, Blo t 3, Blo t 4, Blo t 5, Blo t 6, Blo t 10, Blo t 11, Blo t 12, Blo t 13, Blo t 19, Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 7, Der f 10, Der f 11, Der f 14, Der f 15, Der f 16, Der f 17, Der f 18w, Der m 1, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6, Der p 7, Der p 8, Der p 9, Der p 10, Der p 11, Der p 14, Der p 20, Der p 21, Eur m 2, Eur m 14, Gly d 2,Lep d 1, Lep d 2, Lep d 5, Lep d 7, Lep d 10, Lep d 13, Tyr p 2, Tyr p 13, Bos d 2, Bos d 3, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Equ c 4, Equ c 5, Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5w, Fel d 6w, Fel d 7w, Cav p 1, Cav p 2, Mus m 1, Rat n 1, Alt a 1, Alt a 3, Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Alt a 7, Alt a 8, Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13, Cla h 2, Cla h 5, Cla h 6, Cla h 7, Cla h 8, Cla h 9, Cla h 10, Cla h 12, Asp fl 13, Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22w, Asp f 23, Asp f 27, Asp f 28, Asp f 29, Asp n 14, Asp n 18, Asp n 25, Asp o 13, Asp o 21, Pen b 13, Pen b 26, Pen ch 13, Pen ch 18, Pen ch 20, Pen c 3, Pen c 13, Pen c 19, Pen c 22w, Pen c 24, Pen o 18, Fus c 1, Fus c 2, Tri r 2, Tri r 4, Tri t 1, Tri t 4, Cand a 1, Cand a 3, Cand b 2, Psi c 1, Psi c 2, Cop c 1, Cop c 2, Cop c 3, Cop c 5, Cop c 7, Rho m 1, Rho m 2, Mala f 2, Mala f 3, Mala f 4, Mala s 1, Mala s 5, Mala s 6, Mala s 7, Mala s 8, Mala s 9, Mala s 10, Mala s 11, Mala s 12, Mala s 13, Epi p 1, Aed a 1, Aed a 2, Api m 1, Api m 2, Api m 4, Api m 6, Api m 7, Bom p 1,Bom p 4, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g 7, Bla g 8, Per a 1, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Chi k 10, Chi t 1-9, Chi t 1.01, Chi t 1.02, Chi t 2.0101, Chi t 2.0102, Chi t 3, Chi t 4, Chi t 5, Chi t 6.01, Chi t 6.02, Chi t 7, Chi t 8, Chi t 9, Cte f 1, Cte f 2, Cte f 3, Tha p 1, Lep s 1, Dol m 1, Dol m 2, Dol m 5, Dol a 5, Pol a 1, Pol a 2, Pol a 5, Pol d 1, Pol d 4, Pol d 5, Pol e 1, Pol e 5, Pol f 5, Pol g 5, Pol m 5, Vesp c 1, Vesp c 5, Vesp m 1, Vesp m 5, Ves f 5, Ves g 5, Ves m 1, Ves m 2, Ves m 5, Ves p 5, Ves s 5, Ves vi 5, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 5, Myr p 1, Myr p 2, Sol g 2, Sol g 4, Sol i 2, Sol i 3, Sol i 4, Sol s 2, Tria p 1, Gad c 1, Sal s 1, Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Gal d 1, Gal d 2, Gal d 3, Gal d 4, Gal d 5, Met e 1, Pen a 1, Pen i 1, Pen m 1, Pen m 2, Tod p 1, Hel as 1, Hal m 1, Ran e 1, Ran e 2, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Sec c 20, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 25, Tri a 26, Zea m 14, Zea m 25, Ory s 1, Api g 1, Api g 4, Api g 5, Dau c 1, Dau c 4, Cor a 1.04, Cor a 2, Cor a 8, Fra a 3, Fra a 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Mal d 4, Pyr c 1, Pyr c 4, Pyr c 5, Pers a 1, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru av 4, Pru d 3, Pru du 4, Pru p 3, Pru p 4, Aspa o 1, Cro s 1, Cro s 2, Lac s 1, Vit v 1, Mus xp 1, Ana c 1, Ana c 2, Cit l 3, Cit s 1, Cit s 2, Cit s 3, Lit c 1, Sin a 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Vig r 1, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Len c 1, Len c 2, Pis s 1, Pis s 2, Act c 1, Act c 2, Cap a 1w, Cap a 2, Lyc e 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola t 4, Ber e 1, Ber e 2, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Ric c 1, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Cuc m 1, Cuc m 2, Cuc m 3, Ziz m 1, Ani s 1, Ani s 2, Ani s 3, Ani s 4, Arg r, Asc s 1, Car p 1, Den n 1, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6.01, Hev b 6.02, Hev b 6.03, Hev b 7.01, Hev b 7.02, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hom s 1, Hom s 2, Hom s 3, Hom s 4, Hom s 5、およびTrip s 1などの他のアレルゲンを本発明に使用することもできる。
【００２１】
本発明に係る好適な実施形態によると、アレルゲン誘導体は低アレルギー性である。
【００２２】
哺乳類、特にヒトの体内において、アレルギー反応を誘発させずに、または、最小限に抑えながら、特定の免疫反応を誘発するためには、本発明のアレルゲンまたはその誘導体が低アレルギー性を示すこと、すなわち、その低アレルギー性の分子が、全くまたは殆どＩｇＥ反応を示さないことが好ましい。
【００２３】
本明細書において使用するとき、「低アレルギー性」という用語は、アレルギー特性をもつアレルゲンに由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、個体に投与されたときに、該アレルゲンに対して特異的なＴ細胞の誘導を誘発し、かつアレルギー反応が少ない、または全く発生させない能力があることを指す。当該アレルゲンに存在するＴ細胞エピトープは保存しつつ、当該アレルゲンからＩｇＥ結合エピトープを除去または破壊することによって、ヒトのアレルギー反応を誘発する能力をアレルゲンの低アレルギー性誘導体において消失または低減させることができる。例えば、ＩｇＥ結合能力が低減された、またはＩｇＥ結合能力が全くないフラグメントに分割することによって達成される。分割した当該フラグメントのうちのいくつか、または全てを、野生型のアレルゲンにおけるフラグメントの順番とは異なる順番に結合させてもよい。（例えば欧州特許出願公開第１４４０９７９号明細書参照）。アレルゲンから低アレルギー性分子を生成する他の方法は、野生型アレルゲンのＣ末端欠失、および／または、Ｎ末端欠失を伴う方法である（例えば欧州特許出願公開第１２２４２１５号明細書参照）。当然のことながら、野生型アレルゲンの１つ以上のアミノ酸残基に対して特異的変異を導入することによって、低アレルギー性分子を生成することもできる。この改変の結果、３次元構造が欠失する。
【００２４】
ＲＮＡワクチンの低アレルギー化は、ＲＮＡワクチンから生ずるタンパク質を細胞のユビキチン化経路の標的とし、ユビキチン化経路において、各タンパク質を低アレルギー性のペプチドに分解することによって為される。上記は、ユビキチンをコードする配列を、アレルゲンをコードするＲＮＡの５’末端に結合させることによって、達成される。７６番目のアミノ酸残基をグリシンからアラニンに変異させる（Ｇ７６→Ａ７６）ことによって、ユビキチン化効率を上げることができる。また、アレルゲンの第１アミノ酸（メチオニン）を不安定化アミノ酸（アルギニン）に変異させる（Ｍ７７→Ｒ７７）ことによって、ユビキチン化効率をさらに上げることができる。また、ＰＥＳＴ配列として知られるカルボキシ末端不安定化配列を加えることによって、ＲＮＡワクチンから生ずる遺伝子産物のユビキチン化を行うこともできる。
【００２５】
本発明の好適な実施形態によると、ワクチンにおけるＲＮＡによってコードされた低アレルギー性のアレルゲン誘導体のＩｇＥ反応性は、野生型アレルゲンのＩｇＥ反応性よりも、１０％以上、好適には２０％以上、より好適には３０％以上、特に５０％以上低い。
【００２６】
ウサギの網状赤血球溶解液システムにおいてインビトロにてＲＮＡを翻訳することによって、ＲＮＡワクチンの低アレルギー性を定期的に検査することができる。適切な患者の血清のプールを用いたＩｇＥウェスタンブロット法によって、ＲＮＡワクチンから生じた遺伝子産物を分析することができる。当該網状赤血球溶解液システムにおいて翻訳された野生型分子のＩｇＥ結合能力と比較して、各低アレルギー性アレルゲンのＩｇＥ結合能力を評価することができる。
【００２７】
本発明に係る特に好適な実施形態によると、本発明のＲＮＡ分子は、１個を越える、好適には２個を越える、より好適には３個を越える、さらに好適には４個を越えるアレルゲンまたはそのアレルゲンの誘導体をコードするものであってもよい。特に、ＲＮＡ分子は、Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5およびPhl p6、またはAln g 1, Cor a 1, Que a 1, Car b 1およびBet v 1をコードする。
【００２８】
アレルゲンまたはその誘導体をコードするＲＮＡ分子は、少なくとも１つのさらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に結合される。
【００２９】
アレルゲンをコードするＲＮＡ配列は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ配列に結合され得る。これらのペプチドは、小胞体にアレルゲンを方向付けることによって細胞からのタンパク質分泌を高める、例えばヒト組織プラスミノーゲン活性化シグナルペプチド（ｈＴＰＡ）などのシグナルペプチドであってもよい。当該ペプチドまたはタンパク質は、リソソームに結合した膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、またはリソソームの膜内在性タンパク−ＩＩ（ＬＩＭＰ−ＩＩ）におけるＣ末の２０−アミノ酸であってもよい。ＬＡＭＰ／ＬＩＭＰ−ＩＩ配列は、抗原タンパク質を、形質転換された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の主要組織適合クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）小胞区画に方向付けるのに使用され、それによって、ワクチンの有効性を向上させるＴヘルパー細胞の活性を高める。当該タンパク質またはポリペプチドは、例えば熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、コレラ毒素などの細菌毒素、または大腸菌（Escherichia coli）の易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）といった、ワクチンのＴＨバイアスを高めるタンパク質であってもよい。
【００３０】
本発明に係る好適な実施形態では、ＲＮＡ分子は、レプリカーゼ、β−グロビンリーダー配列、ｃａｐ０、ｃａｐ１およびポリＡテールからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる要素を含むものである。
【００３１】
本発明のＲＮＡワクチンは、それぞれのアレルゲンをコードするＲＮＡ配列により構成される。当該ＲＮＡ配列は、アレルゲンの野生型配列であってもよいし、そのコドン使用頻度に対して適合されてもよい。コドン使用頻度の適合によって、ＲＮＡの翻訳効率および半減期を増大させることができる。少なくとも３０個のアデノシン残基からなるポリＡテールを、ＲＮＡの３´末端に結合させ、ＲＮＡの半減期を増大させる。ＲＮＡの５’末端は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（ｃａｐ ０構造）構造をもつ変異リボヌクレオチド、またはその誘導体によってキャップされる。当該変異リボヌクレオチドまたはその誘導体は、ＲＮＡ合成の間に組み込まれてもよく、または、ＲＮＡ転写の後に、Vaccinia Virus Capping Enzyme（ＶＣＥ：ｍＲＮＡトリフォスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼおよびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼからなる酵素）を用いて酵素処理してもよい。この酵素が、N7-monomethylated cap 0構造の構成を触媒する。ｃａｐ ０構造は、ＲＮＡワクチンの安定性および翻訳効率を維持するために重要な役割を果たす。ＲＮＡワクチンの５’キャップを２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾させてもよく、これによって、ｃａｐ １構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）が生成され、さらに、翻訳効率が向上する。
【００３２】
ＲＮＡワクチンは、自己複製ワクチンへの変換によって最適化され得る。当該ベクターは、対象の遺伝子とともに、アルファウイルス由来の複製要素と、構造的なウイルスタンパク質の代用物とを含む。レプリカーゼを基本要素とするＲＮＡワクチンは、ウイルス由来の危険シグナルが媒介する免疫活性化が原因で、極めて低量であっても、抗体だけでなく細胞毒性応答をも誘発することが示されている（Ying, H. et al. (1999) Nat Med 5:823-827）。
【００３３】
また、ＲＮＡワクチンは、自己複製ＲＮＡワクチンであってもよい。自己複製ＲＮＡワクチンは、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、またはアルファウイルスファミリーに属する他のウイルスに由来するレプリカーゼＲＮＡ分子によって構成されている。レプリカーゼの下流にはサブゲノムプロモータが存在し、当該サブゲノムプロモータがアレルゲンＲＮＡ、およびこれに続く３０個以上のアデノシン残基からなる人工ポリＡテールの複製を制御する。
【００３４】
本発明の他の好適な実施形態によると、ワクチンはさらにＣｐＧ−ＤＮＡおよびサイトカインを含み、サイトカインは好適にはインターロイキン（ＩＬ）−１２およびＩＬ−１５である。
【００３５】
さらに、ワクチンまたは本発明に係るワクチン製剤はアジュバントを含んでいてもよい。本発明における「アジュバント」は、抗原に対する免疫反応を高める化合物または混合物を指す。アジュバントは、抗原を徐放する組織徐放性製剤として供給されてもよい。アジュバントは、とりわけ、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバンド、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルオロニック多価アルコール、多価陰イオン、ペプチド、レバミゾール、ＣｐＧ−ＤＮＡ、油または炭化水素乳剤、ならびに、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有益なアジュバントを含む。
【００３６】
上記の代わりに、または上記に加えて、免疫刺激タンパク質をアジュバントとして、または、ワクチンに対する免疫の増大のために用いてもよい。免疫刺激サイトカイン、免疫増強サイトカインもしくは炎症性サイトカイン、リンフォカイン、またはケモカインなどの免疫刺激分子を、ワクチン、特にベクターワクチンとともに同時投与することによって、ワクチン接種の効果が高まる可能性がある（Salgaller and Lodge, J. Surg. Oncol. (1988) 68:122）。例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および、他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド（Lyman, Curr. Opin. Hematol., 1998, 5:192）、ＣＤ４０リガンド、などのサイトカインまたはサイトカイン遺伝子、ならびに、いくつかの主要な副刺激分子またはそれらの遺伝子（例えばＢ７．１、Ｂ７．２）を使用することができる。これら免疫刺激性分子は、タンパク質として全身的もしくは局所的に分配されてもよいし、ＲＮＡ分子または本発明に係るＲＮＡワクチンにおけるＲＮＡ分子にコードされていてもよい。また、免疫刺激性分子として、ポリアルギニンなどのポリカチオン性ペプチドを使用してもよい。
【００３７】
本発明に係るさらなる好適な実施形態によると、ワクチンは、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与、局所性投与、または微粒子銃投与に適用される。
【００３８】
様々な方法を用いて、本発明に係るＲＮＡワクチンを投与してもよい。例えば１つの方法では、インビボにおいてＲＮＡワクチンを直接体内に注入する（例：筋内、皮内、静脈内、鼻腔内など）。また、体外においてＲＮＡを細胞（例えば上皮細胞）内に注入することができる。例えば、インビトロにおいてＲＮＡワクチンを上皮細胞に形質移入し、身体に投与する（移殖する）。外因性ＲＮＡまたは異種ＲＮＡを細胞内に注入すれば、細胞は、当該ＲＮＡによって形質移入され得る。パルス法（pulsing）、すなわち、本発明に係るＲＮＡ分子とともに、細胞を培養することによって、細胞内にＲＮＡを導入することができる。また、ネイキッドＲＮＡとして、または他の形質移入促進剤（ペプチド、ポリマーなど）とともに、リポフェクションによってインビボでＲＮＡを導入してもよい。合成陽イオン性脂質は、インビボでの形質移入においてリポソームを生成するために使用される。核酸の形質移入に有益な脂質化合物および組成物は、例えばＤＯＤＣ，ＤＯＰＥ，ＣＨＯＬ，ＤＭＥＤＡ，ＤＤＡＢ，ＤＯＤＡＣ，ＤＯＴＡＰおよびＤＯＴＭＡである。また、他の分子も生体内での核酸の形質移入を促進するのに役立つ。他の分子とは、カチオン性オリゴペプチド（例えば国際公開第９５／２１９３１号パンフレット）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば国際公開第９６／２５５０８号パンフレット）、またはカチオン性ポリマー（例えば国際公開第９５／２１９３１号パンフレット）である。また、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、ポリラクチド−ポリグリコリドならびにキトサンを使用してもよい。また、電気穿孔法、顕微注入法、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、または遺伝子銃を使用する方法などの周知の方法を用いて、ＲＮＡ分子を所望の宿主細胞の中に導入してもよい（微粒子銃形質移入、Tang et al., Nature (1992) 356: 152-154参照）。
【００３９】
本発明の他の形態は、本明細書において規定された、アレルギーの治療用または予防用のワクチンを製造するための、少なくとも１つのＲＮＡ分子の使用に関する。
【００４０】
本発明のさらなる形態は、本明細書において規定された、アレルゲンに対する個体の除感作のためのワクチンを製造するための少なくとも１つのＲＮＡ分子の使用に関する。
【００４１】
本発明に係る他の好適な実施形態によると、ワクチンは、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与または微粒子銃投与に適用される。
【００４２】
本発明に係る他の形態は、少なくとも１つのアレルゲンまたはその誘導体をコードする少なくとも１つのヌクレオチドを含む分離されたＲＮＡ分子に関する。当該ＲＮＡ分子は、好適には、ｃａｐ０、ｃａｐ１、５’β−グロビンリーダー配列、自己複製ＲＮＡ、再コード化されたアレルゲン配列、および人工のポリＡテールからなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列を含む。なかでも、ＲＮＡ分子は、ｃａｐ０‐アレルゲン配列‐ポリＡテールが特に好ましい。ｃａｐ０は、インビボでの抗体の生成のため、ならびにアレルゲン特異的なＴ細胞の誘導およびＩＦＮ−ガンマ分泌のための自己複製ＲＮＡワクチンに関して、有益である。
【００４３】
さらに、下記の図面および例を用いて本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００４４】
図１は、β−ガラクトシダーゼをコードするＲＮＡ（βＧａｌ−ＲＮＡ）または自己複製ＲＮＡ（βＧａｌ−ｒｅｐＲＮＡ）転写産物を用いた、インビトロにおけるＢＨＫ２１細胞の形質移入を示す。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造を付加したＲＮＡ転写産物（キャップ）または当該構造を付加していないＲＮＡ転写産物（キャップなし）について試験した。形質移入していない細胞をバックグラウンド対照として使用した（形質移入されていない）。データは、３つの独立した形質移入実験の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。
【００４５】
図２Ａは、核酸ワクチン接種後のＰｈｌ ｐ ５特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルを示し、図２Ｂは、ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作を示す。血清は、１：１０００（図２Ａ）、１：１０００００（図２Ｂ）に希釈した。棒グラフの頂点上の数値は、各群におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２の平均比を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【００４６】
図３は、ＲＢＬ放出アッセイによって測定されたＰｈｌ ｐ ５特異的ＩｇＥを示す。ＩｇＥレベルは、各核酸ワクチンを用いたワクチン接種後（グレーの棒グラフ）、および、ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作（黒の棒グラフ）後に測定した。数値は、特定のヘキソサミニダーゼ放出の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【００４７】
図４は、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌ Ｐ５によるインビトロでの再刺激後のＩＦＮ−ガンマ（図４Ａ）、ＩＬ−４（図４Ｂ）、およびＩＬ−５（図４Ｃ）の数を示す。データは、１０６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【００４８】
図５は、アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおける全白血球数（図５Ａ）、および好酸球数（図５Ｂ）を示す。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
【００４９】
図６は、アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおけるＩＬ−５（図６Ａ）およびＩＦＮ−γ（図６Ｂ）のレベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【００５０】
図７は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５１】
図８は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５２】
図９は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５３】
図１０は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００５４】
図１１は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５５】
図１２は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｏｒ ａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００５６】
図１３は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｎ ｇ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００５７】
図１４は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５８】
図１５は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００５９】
図１６は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ７によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６０】
図１７は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌ ｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６１】
図１８は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｒｙ ｊ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００６２】
図１９は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｊｕｎ ａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００６３】
図２０は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｍｂ ａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００６４】
図２１は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｐｉ ｇ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６５】
図２２は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄａｕ ｃ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００６６】
図２３は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６７】
図２４は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６８】
図２５は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔａ−ＣａｓｅｉｎによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００６９】
図２６は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｙｐ ｃ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７０】
図２７は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆｅｌ ｄ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７１】
図２８は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄｅｒ ｐ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００７２】
図２９は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００７３】
図３０は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｌａ ｈ８によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００７４】
図３１は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｈｅｖ ｂ６によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７５】
図３２は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（アレルゲン）によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７６】
図３３は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒａ ｈ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【００７７】
図３４は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｑｕｅ ａ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７８】
図３５は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒｔ ｖ１によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【００７９】
図３６は、ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｏｌｅ ｅ１によるＴｈ１メモリの誘導がない、またはＩｇＥ反応の抑制がないことを示す。
【００８０】
＜実施例＞
〔実施例１：〕
本実施例では、ＲＮＡおよび臨床的に関連するオオアワガエリの花粉アレルゲンＰｈｌ ｐ５をコードするレプリカーゼベースのＲＮＡワクチンが、アレルギー反応を効果的に抑制することを示す。
【００８１】
（材料および方法）
［ＲＮＡ転写に使用されるプラスミド］
ｐＴＮＴベクターをＰｒｏｍｅｇａ（マンハイム、ドイツ）から購入した。このベクターは、他のベクターより優れた利点をもつ特別な特徴を有する。一方はＳＰ６ポリメラーゼ用、もう一方はＴ７ポリメラーゼ用の２つのプロモータが存在しており、ＳＰ６およびＴ７に基づくインビトロ転写を可能にする。それらプロモータは、タンデムにマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の近傍に配置されている。Ａ５’β−グロビンのリーダー配列は、より迅速に翻訳を開始させることによって複数の遺伝子の翻訳の増加を促進する。当該ベクターは、遺伝子の発現を向上させる他の特徴として、合成ポリ（Ａ）３０テールを有する。
【００８２】
ベクターｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，オーストリア）は、シンドビス・アルファウイルス（sindbis alphavirus）由来であり、これは包まれたポジティブストランドＲＮＡウイルスである。アルファウイルスベースのレプリコンベクターは、ウイルス性構造タンパク質を欠失しているが、細胞質におけるＲＮＡの自己増殖、およびアルファウイルス性プロモータを介する挿入遺伝子の発現に必要な複製エレメント（レプリカーゼ）を保持する。
【００８３】
ベクターｐＣＭＶ−Ｐｈｌｐ５からＮｈｅＩ／ＸｂａＩを介してＰｈｌ ｐ５遺伝子を抽出し（Gabler et al. (2006), J Allergy Clin Immunol 118:734-741）、ｐＴＮＴおよびｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５のＸｂａＩ制限酵素認識部位に連結し、それぞれｐＴＮＴ−Ｐ５およびｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５−Ｐ５を得た。
【００８４】
［ＲＮＡ転写］
対応する制限酵素を用いてプラスミドｐＴＮＴ−Ｐ５およびｐＳｉｎ−Ｒｅｐ５−Ｐ５を直鎖状にした。フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出、それに続く１回のクロロホルム−イソアミルアルコール抽出によって、テンプレートを精製した。１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２を加えた後、２容量の１００％ＥｔＯＨによってプラスミドを沈殿させ、７０％ＥｔＯＨを用いて３回洗浄した。
【００８５】
全ての転写反応は、製造者のプロトコルに従って、Ｔ７またはＳＰ６ ＲｉｂｏＭＡＸＴＭ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。簡単には、１００μｌの反応液として、２０μｌの転写バッファー、３０μｌのｒＮＴＰ、５〜１０μｇのテンプレート、および１０μｌの酵素混合液を、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏで満たして１００μｌとし、３７℃にて２〜３時間インキュベートした。ＳＰ６ ＲｉｂｏＭａｘキットを使用する場合、３０μｌのｒＮＴＰの代わりに２０μｌのｒＮＴＰを使用した。
【００８６】
ｍＲＮＡのキャップ構造を擬態させるために、ＲＮＡ合成中に５’７−メチルグアノシンヌクレオチド（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）またはキャップアナログ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ，ＵＳＡ）を組み込んだ。ｒＮＴＰ混合物は、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＧＴＰおよびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの２５：２５：２５：２２．５：２．５ｍＭ混合物となるように調製した。
【００８７】
転写の後に、１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、氷上にて１０〜１５分間混合物をインキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温にて１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後、７０％エタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【００８８】
（結果）
［ＲＮＡおよび自己複製ＲＮＡを用いたインビトロ形質移入］
β−ガラクトシダーゼをコードする２つの異なるＲＮＡ転写産物を用いて、ＢＨＫ−２１細胞をインビトロ形質移入した。当該ＲＮＡ転写産物は、ベクターｐＴＮＴ−βＧａｌから転写された従来のＲＮＡワクチン（βＧａｌ−ＲＮＡ）、または、ベクターｐＲｅｐ５−βＧａｌから転写された自己複製ＲＮＡ（βＧａｌ−ｒｅｐＲＮＡ）である。
【００８９】
ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造が付加されたＲＮＡ転写産物、または付加されていないＲＮＡ転写産物について、試験した。図１は、従来のＲＮＡと同量の自己複製ＲＮＡを形質移入した場合、従来のＲＮＡと比べて７．５倍高い遺伝子発現を誘発することを示す。加えて、キャップ構造によるＲＮＡの安定化は、ＲＮＡのインビトロ形質移入／翻訳に不可欠である。
【００９０】
［アレルゲンＰｈｌｐ５をコードするＲＮＡベースのワクチンは、免疫原性であり、ＩｇＥ誘導を抑制する］
ＲＮＡベースのワクチンがアレルギーの誘導を抑制する可能性を検証するために、Ｐｈｌ ｐ ５をコードする従来のＲＮＡ、またはＰｈｌ Ｐ ５をコードする自己複製ＲＮＡを用いて、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫性を付与した。ＲＮＡワクチンの有効性を算出するために、従来のＤＮＡワクチン（ｐＣＭＶ−Ｐ５）およびＰｈｌ ｐ５をコードする自己複製ＤＮＡワクチン（ｐＳｉｎ−Ｐ５）を同量用いて、対応する群に免疫性を付与した。１週間ごとのインターバルをおいて３回マウスに免疫性を付与し、２週間後、ミョウバンとの複合体とした組み換え体Ｐｈｌ ｐ ５を２回注入して、感作させた。これは、アレルギー表現型を誘導するプロトコルとして知られており、高レベルのＩｇＥ、およびＴＨ２にバイアスされたサイトカインプロファイルを特徴とする。
【００９１】
図２Ａは、両方のＲＮＡワクチンが、自己複製ＤＮＡワクチンｐＳｉｎ−Ｐ５と同様の液性免疫反応を誘導することを示す。対照的に、従来のＤＮＡワクチンｐＣＭＶ−Ｐ５によって誘導された液性免疫反応は、他のワクチンよりも約１桁高い大きさであった。全てのワクチンタイプが、低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比によって特徴付けられるＴＨ１バイアスの血清学的プロファイルを示し、かつＲＢＬ放出アッセイによって測定される機能性あるＩｇＥの誘導を示さなかった（図３、グレーの棒グラフ）。
【００９２】
感作後、プレ免疫付与されていない対照群は、アレルギー感作を示す、高いＩｇＧ１レベルおよび高いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を有する完全にＴＨ２にバイアスされた血清を示した。対照的に、ワクチン接種された全群がＴＨ１調和型の免疫表現型を維持した（図２Ｂ）。両タイプのＲＮＡワクチンを用いたプレワクチン接種によって、対応するＤＮＡを用いた対照動物と同じ、またはよりよいＩｇＥ誘導の抑制が生じた（図３、黒棒グラフ）。全体的に見て、両タイプのＲＮＡワクチンを用いたプレワクチン接種によって、アレルギー感作に対するＩｇＥ誘導が９３％抑制された。
【００９３】
［ＲＮＡベースのワクチンがＴＨ１バイアスＴ細胞メモリを誘導］
最終感作の２週間後、組み換え型Ｐｈｌ ｐ ５タンパク質を用いて脾細胞をインビトロにおいて再刺激し、それらのＴＨ１／ＴＨ２プロファイルを評価した。したがって、ＥＬＩＳＰＯＴを用いてＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−５分泌細胞の数を測定した。
【００９４】
核酸ワクチンによってプレワクチン接種された全ての接種群は、対照群に比べてＩＦＮ−γ分泌細胞の誘導が著しいことが示された（図４Ａ）。同時に、ＴＨ２型サイトカインＩＬ−４（図４Ｂ）およびＩＬ−５（図４Ｃ）を分泌する細胞数は抑制され、ＤＮＡワクチンと同様に、ＲＮＡワクチンがＴＨ１バイアス抗原特異的メモリを確立することができ、このＴＨ１バイアス抗原特異的メモリはその後のアレルゲン曝露によって再活性化され得ることが示された。
【００９５】
［ＲＮＡベースのワクチンがアレルゲン誘導性の肺炎症を軽減する］
ＲＮＡ接種が肺病理の誘導に及ぼす影響を検証するために、最終感作の２週間後に、１μｇの組み換え型Ｐｈｌ ｐ ５を１日２回鼻腔内投与して、肺炎症を誘導した。当該プロトコルによって、感作されたマウスにおいて気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）内への白血球の浸潤が強く誘導された（図５Ａ、対照）。浸潤した白血球の約８０％が好酸球であった（図５Ｂ）。対照的に、プレワクチン接種されたマウスにおいて浸潤した白血球の全数は大幅に低減しており、好酸球に関してはさらに低減していた。
【００９６】
炎症性浸潤は、ＢＡＬＦ中のＩＬ−５の抑制の影響をも強く受けて、低減した（図６Ａ）。ＩＬ−５の抑制は、逆にＩＦＮ−γの誘導と相関した（図６Ｂ）。
【００９７】
（結論）
ＤＮＡワクチンは、アレルギー性疾患の予防および治療に有効である可能性が極めて高い。しかし、ＤＮＡワクチンにはリスクがあるのではという仮説があるので、この新型ワクチンを健康な成人または子供に対して臨床使用することは疑問視されている。
【００９８】
本実施例では、臨床的に関連性あるアレルゲンをもつネイキッドＲＮＡを接種することによって、このネイキッドＲＮＡと同量のＤＮＡワクチンが投与された場合と同程度にアレルギー誘導を抑制できることが初めて示された。
【００９９】
より多量のＲＮＡを製造するという問題に取り組むため、従来のＲＮＡをシンドビス・ウイルスのレプリコン由来の自己複製ＲＮＡと比較した。両タイプのＲＮＡを用いたインビトロ形質移入では、抗原の発現は、とりわけ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップのアナロゴン（ａｎａｌｏｇｏｎ）の付加に依存することがわかった。真核ｍＲＮＡの大半が５’末端において当該ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造を有することは周知であり、これは、翻訳開始因子の結合にとって重要であり、ｍＲＮＡ安定性に寄与する。加えて、同様の量の自己複製ＲＮＡから、７倍高いレベルのタンパク質が翻訳された（図１）。この結果は、それぞれの抗原をコードするサブゲノムＲＮＡの自己増殖に寄与する。この結果は、従来のＤＮＡワクチンよりもタンパク質の発現が低い自己複製ＤＮＡワクチンとは対照的に、形質移入された細胞におけるアポトーシスの誘導に寄与したという効果である。しかし、ＲＮＡワクチンの発現は一過性のものに過ぎず、そのため、自己複製ワクチンによって形質移入された直後にアポトーシスを起こす細胞と同等である。実際、自己複製ＲＮＡワクチンは、自己複製ＤＮＡワクチンと同様の液性免疫反応を誘発する（図２Ａ）が、従来のＤＮＡワクチンは、抗原を継続的に発現させるため、最も高い液性免疫反応を示す。
【０１００】
本実施例では従来のＲＮＡ／ＤＮＡワクチンの５分の１量の自己複製核酸ワクチンを使用したが、ミョウバン中における組み換え型アレルゲンを用いた次の感作後のＩｇＧ２ａの増加（図２Ｂ）、および再刺激された脾細胞のＴＨ１サイトカインプロファイル、ならびに高い抑制能力（図３）に示されたように、同様のＴＨ１メモリ誘導が観察された。したがって、ＲＮＡワクチンおよび自己複製ＤＮＡワクチンの両方が従来のＤＮＡワクチンよりも高い抑制能力を示す。ただし、後者は、より高いレベルの正常抗原、およびより高い液性免疫反応を誘導する。これは、長期間のアレルゲン分泌を誘発するワクチンが、ＲＮＡワクチンおよび自己複製ワクチンに見られる短期間のワクチン発現に比べて逆効果を招き得ることを示す。
【０１０１】
また、ＲＮＡワクチン接種は、鼻腔内の誘発後の肺浸潤をＤＮＡワクチンと同程度低減させる（図５Ａ）。これは、ＢＡＬＦ中における好酸球の数の激減が主な原因である（図５Ｂ）。このことは、肺におけるＩＬ−５の低減（図６Ａ）、および中間レベルのＩＦＮ−γの誘導と相関しており（図２Ｂ）、ワクチンにより誘導されたＴＨ１細胞の産生が、肺におけるＴＨ１／ＴＨ２サイトカインバランスに影響を及ぼすことを示している。ウイルスモデルでは、肺におけるＩＦＮ−γは、喘息および肺病理に有害な影響を及ぼすが、これは、ＩＦＮ−γが肺上皮細胞を活性化させ、より多くのＴＨ２細胞を組織内に取り入れることによる間接的影響であると考えられる。実際、アレルギーモデルでは、ＴＨ２免疫を、より調和のとれたＴＨ１環境に再度方向付けることは、主にＩＬ−５およびＩＬ−１３を対抗制御することによって、肺浸潤および気道過敏症に好影響を及ぼす（Ford, J. G. et al. (2001) J Immunol 167:1769-1777）。
【０１０２】
上記をまとめると、ＲＮＡベースワクチンは、アレルギー性感作に対する防御を強く誘発させることができ、自己複製ＲＮＡワクチンを使用することによって、低用量にて当該効果を得ることができる。ＲＮＡワクチンにおけるこの優れた安全なプロファイルを鑑みると、治療環境だけでなく、アレルギー性疾患を発症する可能性が高い健康な個体にもＲＮＡワクチンを使用できる可能性がある。
【０１０３】
〔実施例２〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｂｅｔ ｖ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。３７℃にて１５分間、キャップした転写産物をＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【０１０４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換え体Ｂｅｔ ｖ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１０５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｂｅｔ ｖ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１０６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図７Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図７Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的ＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図７Ｃ）。
【０１０７】
〔実施例３〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃａｒ ｂ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１０８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【０１０９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣａｒ ｂ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１１０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｃａｒ ｂ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１１１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図８Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図８Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図８Ｃ）。
【０１１２】
〔実施例４〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃａｓ ｓ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１１３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【０１１４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣａｓ ｓ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１１５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｃａｓ ｓ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１１６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図９Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図９Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図９Ｃ）。
【０１１７】
〔実施例５〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したように、Ｐｈｌ ｐ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を作製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１１８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【０１１９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌ ｐ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１２０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｐｈｌ ｐ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１２１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１０Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１０Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１２２】
〔実施例６〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｐｈｌ ｐ ６をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１２３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温で１５分間遠心分離（１３０００ｒｐｍ）した後に、沈殿物を、７０％のエタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中に再縣濁した。
【０１２４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌ ｐ ６を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１２５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定＞］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｐｈｌ ｐ ６を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養の上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１２６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１１Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１１Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１１Ｃ）。
【０１２７】
〔実施例７〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｏｒ ａ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１２８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１２９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｏｒ ａ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｏｒ ａ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１３０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的な血清ＩｇＧ２ａを測定した。
【０１３１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡｐＴＮＴ−Ｃｏｒ ａ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１２Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１２Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１２Ｃ）。
【０１３２】
〔実施例８〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したように、Ａｌｎ ｇ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１３３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１３４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｎ ｇ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｌｎ ｇ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１３５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ａｌｎ ｇ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清をアレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１３６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｎ ｇ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１３）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１３７】
〔実施例９〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｆａｇ ｓ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１３８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１３９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＦａｇ ｓ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１４０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｆａｇ ｓ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１４１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１４Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１４Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１４Ｃ）。
【０１４２】
〔実施例１０〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｐｈｌ ｐ ２をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１４３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１４４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ２を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌ ｐ ２を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１４５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｐｈｌ ｐ ２を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１４６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ２（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１５Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１５Ｂ）。
【０１４７】
〔実施１１〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したように、Ｐｈｌ ｐ 7をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１４８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に該キャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１４９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ７を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌ ｐ ７を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１５０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。
【０１５１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ７（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１６Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１６Ｂ）。
【０１５２】
〔実施例１２〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５、およびＰｈｌ ｐ ６をコードするハイブリッドｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした（Linhart B. and Valenta R., Int Arch Allergy Immunol (2004) 134:324-331）。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１５３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１５４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（Ｐｈｌ ｐ １−２−５−６）を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＰｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５、およびＰｈｌ ｐ ６を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１５５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型アレルゲンを用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１５６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（Ｐｈｌ ｐ １−２−５−６）（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１７Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１７Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図１７Ｃ）。
【０１５７】
〔実施例１３〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｒｙ ｊ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１５８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１５９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｒｙ ｊ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｒｙ ｊ １を２週間注入して、感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１６０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｃｒｙ ｊ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１６１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｒｙ ｊ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１８Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図１８Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１６２】
〔実施例１４〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｊｕｎ ａ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１６３】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１６４】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｊｕｎ ａ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＪｕｎ ａ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１６５】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ｊｕｎ ａ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１６６】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｊｕｎ ａ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図１９）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１６７】
〔実施例１５〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｍｂ ａ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニング。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１６８】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間培養し、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１６９】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｍｂ ａ１を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｍｂ ａ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１７０】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ａｍｂ ａ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１７１】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｍｂ ａ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図２０）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１７２】
〔実施例１６〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｐｉ ｇ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間培養し、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１７３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｐｉ ｇ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｐｉ ｇ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１７４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え体Ａｐｉ ｇ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１７５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２１Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２１Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２１Ｃ）。
【０１７６】
〔実施例１７〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｄａｕ ｃ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１７７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１７８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｄａｕ ｃ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＤａｕ ｃ１を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１７９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｄａｕ ｃ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１８０】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２２Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２２Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０１８１】
〔実施例１８〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｍａｌ ｄ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１８２】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１８３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＭａｌ ｄ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１８４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｍａｌ ｄ１を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１８５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２３Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２３Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２３Ｃ）。
【０１８６】
〔実施例１９〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、ＯｖａをコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を作製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１８７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１８８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｖａを用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＯｖａを２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１８９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｏｖａを用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１９０】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｖａ（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２４Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２４Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２４Ｃ）。
【０１９１】
〔実施例２０〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、ベータ−カゼインをコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を生成し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１９２】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１９３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ベータ−カゼインを用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えベータ−カゼインを２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１９４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型ベータ−カゼインを用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０１９５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ベータ−カゼイン（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図２５Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２５Ｂ）。
【０１９６】
〔実施例２１〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｙｐ ｃ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０１９７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０１９８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｙｐ ｃ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｙｐ ｃ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０１９９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。
【０２００】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｙｐ ｃ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２６）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０２０１】
〔実施例２２〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｆｅｌ ｄ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２０２】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２０３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆｅｌ ｄ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＦｅｌ ｄ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２０４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｆｅｌ ｄ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２０５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｆｅｌ ｄ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２７Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２７Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０２０６】
〔実施例２３〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｄｅｒ ｐ ２をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２０７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２０８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｄｅｒ ｐ ２を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＤｅｒ ｐ ２を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２０９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。
【０２１０】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｄｅｒ ｐ ２（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図１１Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２８Ｂ）。
【０２１１】
〔実施例２４〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｌｔ ａ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２１２】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２１３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンを用いた１μｇの組み換えＡｌｔ ａ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２１４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ａｌｔ ａ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２１５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図２９Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図２９Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図２９Ｃ）。
【０２１６】
〔実施例２５〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｃｌａ ｈ ８をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２１７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２１８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｌａ ｈ ８を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＣｌａ ｈ ８を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２１９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｃｌａ ｈ ８を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清をアレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２２０】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｃｌａ ｈ ８（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図３０Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図３０Ｂ）。
【０２２１】
〔実施例２６〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｈｅｖ ｂ ６をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２２２】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２２３】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｈｅｖ ｂ ６を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＨｅｖ ｂ ６を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２２４】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｈｅｖ ｂ ６を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２２５】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｈｅｖ ｂ ６（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図３１Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図３１Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図３１Ｃ）。
【０２２６】
〔実施例２７〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、５つの異なるアレルゲンをコードするハイブリッドｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２２７】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２２８】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（Ａｌｎ−Ｃｏｒ−Ｑｕｅ−Ｃａｒ−Ｂｅｔ）を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換え型の全アレルゲンを２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２２９】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。
【０２３０】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（アレルゲン）（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図３２）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０２３１】
〔実施例２８〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｒａ ｈ ２をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２３２】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒａ ｈ ２を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｒａ ｈ ２を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２３３】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。最終感作の１０日後、生体外にて７２時間、組み換え型Ａｒａ ｈ２を用いて脾細胞を再刺激し、ＩＦＮ−γに関して細胞培養上澄み液をアレルゲン特異的Ｔｈ１細胞活性の指標として分析した。
【０２３４】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒａ ｈ ２（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩＦＮ−γの分泌の増大（図３３Ａ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。当該Ｔｈ１の初回刺激によって、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導を抑制することができた（図３３Ｂ）。
【０２３５】
〔実施例２９〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｑｕｅ ａ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２３６】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２３７】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｑｕｅ ａ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＱｕｅ ａ １を２週間注入して１週間後に感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２３８】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したようにＥＬＩＳＡを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ｐｈｌ ｐ ６を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２３９】
（結果）
感作対照（黒の棒グラフ）または未処理のマウス（白の棒グラフ）とは対照的に、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｑｕｅ ａ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大（図３４Ａ）およびＩＦＮ−γの分泌の増大（図３４Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増をもたらした。
【０２４０】
〔実施例３０〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ａｒｔ ｖ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２４１】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２４２】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒｔ ｖ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＡｒｔ ｖ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２４３】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａを測定した。最終感作の１０日後、インビトロにて７２時間、組み換え型Ａｒｔ ｖ １を用いて脾細胞を再刺激し、細胞培養上清を、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の活性化の指標であるＩＦＮ−γに関して分析した。
【０２４４】
（結果）
ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ａｒｔ ｖ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大がなく（図３５Ａ）、さらにＩＦＮ−γの分泌の増大がないこと（図３５Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増がなかった。
【０２４５】
〔例３１〕
（材料および方法）
［プラスミドおよびＲＮＡ転写］
実施例１にて説明したようにして、Ｏｌｅ ｅ １をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＴＮＴにクローニングした。上述したようにＲＮＡ転写産物を調製し、製造者のプロトコルに従ってＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてキャップ状構造を付加した。
【０２４６】
３７℃にて１５分間、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にキャップした転写産物をインキュベートし、テンプレートＤＮＡを除去した。１容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを反応試験管に加え、混合物を氷上にて１０〜１５分間インキュベートし、ＲＮＡを沈殿させた。４℃または室温での１５分間の遠心分離（１３０００ｒｐｍ）後に、７０％のエタノールを用いて沈殿物を洗浄し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏ中にて再縣濁させた。
【０２４７】
［免疫付与および感作］
１週間ごとのインターバルをおいて３回、ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｌｅ ｅ １を用いてマウスに免疫付与した。その１週間後、ミョウバンとの複合体とした１μｇの組み換えＯｌｅ ｅ １を２週間注入して感作させ、アレルギー表現型を誘導した。対照動物には感作のみを行い、ＲＮＡワクチンによるプレワクチン接種を行わなかった。
【０２４８】
［Ｔｈ１メモリ誘導および防御の測定］
最終感作の１週間後、実験１にて説明したように、ＥＬＩＳＡおよびＲＢＬを用いてアレルゲン特異的血清ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥを測定した。
【０２４９】
（結果）
ＲＮＡのｐＴＮＴ−Ｏｌｅ ｅ １（斜線の棒グラフ）を用いたプレワクチン接種は、ＩｇＧ２ａの誘導の増大がなく（図３６Ａ）、さらにＩＦＮ−γの分泌の増大がないこと（図３６Ｂ）によって示されたように、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞の漸増がなかった。さらに、アレルゲン特異的なＩｇＥ反応の誘導の抑制を測定することができなかった（図３６Ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】β−ガラクトシダーゼをコードするＲＮＡ（βＧａｌ−ＲＮＡ）または自己複製ＲＮＡ（βＧａｌ−ｒｅｐＲＮＡ）転写産物を用いた、インビトロにおけるＢＨＫ２１細胞の形質移入を示す。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ構造を付加したＲＮＡ転写産物（キャップ）または当該構造を付加していないＲＮＡ転写産物（キャップなし）について試験した。形質移入していない細胞をバックグラウンド対照として使用した（形質移入されていない）。データは、３つの独立した形質移入実験の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。
【図２Ａ】核酸ワクチン接種後のＰｈｌ ｐ ５特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルを示す。血清は、１：１０００（図２Ａ）に希釈した。棒グラフの頂点上の数値は、各群におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２の平均比を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図２Ｂ】ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作を示す。血清は、１：１０００００（図２Ｂ）に希釈した。棒グラフの頂点上の数値は、各群におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２の平均比を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図３】ＲＢＬ放出アッセイによって測定されたＰｈｌ ｐ ５特異的ＩｇＥを示す。ＩｇＥレベルは、各核酸ワクチンを用いたワクチン接種後（グレーの棒グラフ）、および、ミョウバン中の組み換えアレルゲンを用いたその後の感作（黒の棒グラフ）後に測定した。数値は、特定のヘキソサミニダーゼ放出の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図４Ａ】ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌ ｐ ５によるインビトロでの再刺激後のＩＦＮ−ガンマ（図４Ａ）の数を示す。データは、１０６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図４Ｂ】ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌ ｐ ５によるインビトロでの再刺激後のＩＬ−４（図４Ｂ）の数を示す。データは、１０６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図４Ｃ】ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された、組み換え型Ｐｈｌ ｐ ５によるインビトロでの再刺激後のＩＬ−５（図４Ｃ）の数を示す。データは、１０６個の脾細胞あたりのサイトカイン分泌細胞の数の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図５Ａ】アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおける全白血球数（図５Ａ）を示す。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
【図５Ｂ】アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおける好酸球数（図５Ｂ）を示す。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
【図６Ａ】アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおけるＩＬ−５（図６Ａ）のレベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図６Ｂ】アレルゲンの鼻腔内投与後、感作されたマウスのＢＡＬＦにおけるＩＦＮ−γ（図６Ｂ）のレベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図７Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ１によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図７Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図７Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔ ｖ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図８Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図８Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図８Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｒ ｂ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図９Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図９Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図９Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃａｓ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１０Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１０Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１１Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１１Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１１Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ６によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１２】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｏｒ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１３】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｎ ｇ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１４Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１４Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１４Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆａｇ ｓ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１５Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１５Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１６Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ７によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１６Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｐｈｌ ｐ ７によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１７Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌ ｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１７Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌ ｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１７Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ハイブリッド（Ｐｈｌ ｐ１−２−５−６）によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図１８Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｒｙ ｊ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１８Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｒｙ ｊ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図１９】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｊｕｎ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２０】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｍｂ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２１Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｐｉ ｇ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２１Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｐｉ ｇ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２１Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｐｉ ｇ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２２Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄａｕ ｃ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２２Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄａｕ ｃ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２３Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２３Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２３Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｍａｌ ｄ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２４Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２４Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２４Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ＯｖａによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２５Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔａ−ＣａｓｅｉｎによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２５Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｂｅｔａ−ＣａｓｅｉｎによるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２６】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｙｐ ｃ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２７Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆｅｌ ｄ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２７Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｆｅｌ ｄ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図２８Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄｅｒ ｐ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２８Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｄｅｒ ｐ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２９Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２９Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図２９Ｃ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｌｔ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図３０Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｌａ ｈ ８によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図３０Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｃｌａ ｈ ８によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図３１Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｈｅｖ ｂ ６によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３１Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｈｅｖ ｂ ６によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３２】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−ｈｙｂｒｉｄ（アレルゲン）によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３３Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒａ ｈ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図３３Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒａ ｈ ２によるＴｈ１メモリの誘導、およびＩｇＥ反応の抑制を示す。
【図３４Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｑｕｅ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３４Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｑｕｅ ａ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３５Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒｔ ｖ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３５Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ａｒｔ ｖ １によるＴｈ１メモリの誘導を示す。
【図３６Ａ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｏｌｅ ｅ １によるＴｈ１メモリの誘導がない、またはＩｇＥ反応の抑制がないことを示す。
【図３６Ｂ】ＲＮＡ ｐＴＮＴ−Ｏｌｅ ｅ １によるＴｈ１メモリの誘導がない、またはＩｇＥ反応の抑制がないことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアレルゲンまたはその誘導体をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含むＲＮＡワクチンであって、当該アレルゲンが、アルヌス・グルチノーサ（Alnus glutinosa）、アルタナリア・アルタナータ（Alternaria alternata）、アンブローシア・アルテミシーフォリア（Ambrosia artemisiifolia）、アピウム・グラベオレンス（Apium graveolens）、アラキス・ハイポガエア（Arachis hypogaea）、ベツラ・ベルコーサ（Betula verrucosa）、カルピヌス・ベツルス（Carpinus betulus）、カスタネア・サチバ（Castanea sativa）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Cladosporium herbarum）、コリルス・アベラナ（Corylus avellana）、クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica）、カプリナス・カルピオ（Cyprinus carpio）、ダウクス・カロタ（Daucus carota）、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（Dermatophagoides pteronyssinus）、ファグス・シルバチカ（Fagus sylvatica）、フェリス・ドメスチカス（Felis domesticus）、ヘベア・ブラシリエンシス（Hevea brasiliensis）、ジュニペルス・アシュエイ（Juniperus ashei）、マルス・ドメスチカ（Malus domestica）、ケルクス・アルバ（Quercus alba）、およびフレウム・プラテンス（Phleum pratense）のアレルゲンである、ＲＮＡワクチン。
【請求項２】
アルヌス・グルチノーサの上記アレルゲンは、Ａｌｎ ｇ １であり、アルタナリア・アルタナータの上記アレルゲンは、Ａｌｔ ａ １、Ａｌｔ ａ ３、Ａｌｔ ａ ４、Ａｌｔ ａ ５、Ａｌｔ ａ ６、Ａｌｔ ａ ７、Ａｌｔ ａ ８、Ａｌｔ ａ １０、Ａｌｔ ａ １２およびＡｌｔ ａ １３からなる群より選択され、アンブローシア・アルテミシーフォリアの上記アレルゲンは、Ａｍｂ ａ １、Ａｍｂ ａ ２、Ａｍｂ ａ ３、Ａｍｂ ａ ５、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ７、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ９およびＡｍｂ ａ １０からなる群より選択され、アピウム・グラベオレンスの上記アレルゲンは、Ａｐｉ ｇ １、Ａｐｉ ｇ ４およびＡｐｉ ｇ ５からなる群より選択され、アラキス・ハイポガエアの上記アレルゲンは、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ４、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ７およびＡｒａ ｈ ８からなる群より選択され、ベツラ・ベルコーサの上記アレルゲンは、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ６およびＢｅｔ ｖ ７からなる群より選択され、カルピヌス・ベツルスの上記アレルゲンは、Ｃａｒ ｂ １であり、カスタネア・サチバの上記アレルゲンは、Ｃａｓ ｓ １、Ｃａｓ ｓ ５およびＣａｓ ｓ ８からなる群より選択され、クラドスポリウム・ヘルバルムの上記アレルゲンは、Ｃｌａ ｈ ２、Ｃｌａ ｈ ５、Ｃｌａ ｈ ６、Ｃｌａ ｈ ７、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｌａ ｈ ９、Ｃｌａ ｈ １０およびＣｌａ ｈ １２からなる群より選択され、コリルス・アベラナの上記アレルゲンは、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ １０およびＣｏｒ ａ １１からなる群より選択され、クリプトメリア・ジャポニカの上記アレルゲンは、Ｃｒｙ ｊ １およびＣｒｙ ｊ ２からなる群より選択され、カプリナス・カルピオの上記アレルゲンは、Ｃｙｐ ｃ １であり、ダウクス・カロタの上記アレルゲンは、Ｄａｕ ｃ １およびＤａｕ ｃ ４からなる群から選択され、デルマトファゴイデス・プテロニシヌスの上記アレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＣｌｏｎｅ ３０上記アレルゲンからなる群より選択され、ファグス・シルバチカの上記アレルゲンは、Ｆａｇ ｓ １であり、フェリス・ドメスチカスの上記アレルゲンは、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ５ｗ、Ｆｅｌ ｄ ６ｗおよびＦｅｌ ｄ ７ｗからなる群より選択され、ヘベア・ブラシリエンシスの上記アレルゲンは、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６．０１、Ｈｅｖ ｂ ６．０２、Ｈｅｖ ｂ ６．０３、Ｈｅｖ ｂ ７．０１、Ｈｅｖ ｂ ７．０２、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２およびＨｅｖ ｂ １３からなる群より選択され、ジュニペルス・アシュエイの上記アレルゲンは、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ ２およびＪｕｎ ａ ３からなる群より選択され、マルス・ドメスチカの上記アレルゲンは、Ｍａｌ ｄ １、Ｍａｌ ｄ ２、Ｍａｌ ｄ ３およびＭａｌ ｄ ４からなる群より選択され、ケルクス・アルバの上記アレルゲンは、Ｑｕｅ ａ １であり、ならびに、フレウム・プラテンスの上記アレルゲンは、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２およびＰｈｌ ｐ １３からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
上記アレルゲンは、Ａｌｎ ｇ １、Ａｌｔ ａ １、Ａｍｂ ａ １、Ａｐｉ ｇ １、Ａｒａ ｈ ２、Ｂｅｔ ｖ １、ベータ−カゼイン、Ｃａｒ ｂ １、Ｃａｓ ｓ １、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｙｐ ｃ １、Ｄａｕ ｃ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｆａｇ ｓ １、Ｆｅｌ ｄ １、Ｈｅｖ ｂ ６、Ｊｕｎ ａ １、Ｍａｌ ｄ １、オボアルブミン（ＯＶＡ）、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６およびＰｈｌ ｐ ７からなる群より選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
上記ＲＮＡ分子が、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５およびＰｈｌ ｐ ６、またはＡｌｎ ｇ １、Ｃｏｒ ａ １、Ｑｕｅ ａ １、Ｃａｒ ｂ １およびＢｅｔ ｖ １をコードすることを特徴とする請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項５】
上記アレルゲンの誘導体が低アレルギー性であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項６】
上記低アレルギー性のアレルゲン誘導体のＩｇＥ反応性が、野生型アレルゲンのＩｇＥ反応性よりも、１０％以上、好適には２０％以上、より好適には３０％以上、特に５０％以上低いことを特徴とする請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
上記アレルゲンまたはその誘導体をコードする上記ＲＮＡ分子が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのさらなる分子に結合されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項８】
上記ＲＮＡ分子が、レプリカーゼ、β−グロビンリーダー配列、ｃａｐ０、ｃａｐ１およびポリＡテールからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる要素を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項９】
上記ワクチンが、好適にはＣｐＧ−ＤＮＡおよびサイトカインからなる群より選択されるアジュバントをさらに含み、上記サイトカインは好適にはＩＬ−１２およびＩＬ−１５であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１０】
上記ワクチンが、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与、局所性投与、または微粒子銃投与に適用されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
アレルギーの治療用または予防用のワクチンを製造するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載された少なくとも１つのＲＮＡ分子の、使用。
【請求項１２】
アレルゲンに対する個体の除感作のための予防的かつ治療的なワクチンを製造するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載された少なくとも１つのＲＮＡ分子の、使用。
【請求項１３】
上記ワクチンが、好適にはＣｐＧ−ＤＮＡおよびサイトカインからなる群より選択されるアジュバントをさらに含み、上記サイトカインは好適にはＩＬ−１２およびＩＬ−１５であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
上記ワクチンが、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与、局所性投与または微粒子銃投与に適用されることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載された少なくとも１つのアレルゲンまたはその誘導体をコードする少なくとも１つの塩基配列を含む、単離されたＲＮＡ分子。
【請求項１】
少なくとも１つのアレルゲンまたはその誘導体をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含むＲＮＡワクチンであって、当該アレルゲンが、アルヌス・グルチノーサ（Alnus glutinosa）、アルタナリア・アルタナータ（Alternaria alternata）、アンブローシア・アルテミシーフォリア（Ambrosia artemisiifolia）、アピウム・グラベオレンス（Apium graveolens）、アラキス・ハイポガエア（Arachis hypogaea）、ベツラ・ベルコーサ（Betula verrucosa）、カルピヌス・ベツルス（Carpinus betulus）、カスタネア・サチバ（Castanea sativa）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Cladosporium herbarum）、コリルス・アベラナ（Corylus avellana）、クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica）、カプリナス・カルピオ（Cyprinus carpio）、ダウクス・カロタ（Daucus carota）、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（Dermatophagoides pteronyssinus）、ファグス・シルバチカ（Fagus sylvatica）、フェリス・ドメスチカス（Felis domesticus）、ヘベア・ブラシリエンシス（Hevea brasiliensis）、ジュニペルス・アシュエイ（Juniperus ashei）、マルス・ドメスチカ（Malus domestica）、ケルクス・アルバ（Quercus alba）、およびフレウム・プラテンス（Phleum pratense）のアレルゲンである、ＲＮＡワクチン。
【請求項２】
アルヌス・グルチノーサの上記アレルゲンは、Ａｌｎ ｇ １であり、アルタナリア・アルタナータの上記アレルゲンは、Ａｌｔ ａ １、Ａｌｔ ａ ３、Ａｌｔ ａ ４、Ａｌｔ ａ ５、Ａｌｔ ａ ６、Ａｌｔ ａ ７、Ａｌｔ ａ ８、Ａｌｔ ａ １０、Ａｌｔ ａ １２およびＡｌｔ ａ １３からなる群より選択され、アンブローシア・アルテミシーフォリアの上記アレルゲンは、Ａｍｂ ａ １、Ａｍｂ ａ ２、Ａｍｂ ａ ３、Ａｍｂ ａ ５、Ａｍｂ ａ ６、Ａｍｂ ａ ７、Ａｍｂ ａ ８、Ａｍｂ ａ ９およびＡｍｂ ａ １０からなる群より選択され、アピウム・グラベオレンスの上記アレルゲンは、Ａｐｉ ｇ １、Ａｐｉ ｇ ４およびＡｐｉ ｇ ５からなる群より選択され、アラキス・ハイポガエアの上記アレルゲンは、Ａｒａ ｈ １、Ａｒａ ｈ ２、Ａｒａ ｈ ３、Ａｒａ ｈ ４、Ａｒａ ｈ ５、Ａｒａ ｈ ６、Ａｒａ ｈ ７およびＡｒａ ｈ ８からなる群より選択され、ベツラ・ベルコーサの上記アレルゲンは、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ６およびＢｅｔ ｖ ７からなる群より選択され、カルピヌス・ベツルスの上記アレルゲンは、Ｃａｒ ｂ １であり、カスタネア・サチバの上記アレルゲンは、Ｃａｓ ｓ １、Ｃａｓ ｓ ５およびＣａｓ ｓ ８からなる群より選択され、クラドスポリウム・ヘルバルムの上記アレルゲンは、Ｃｌａ ｈ ２、Ｃｌａ ｈ ５、Ｃｌａ ｈ ６、Ｃｌａ ｈ ７、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｌａ ｈ ９、Ｃｌａ ｈ １０およびＣｌａ ｈ １２からなる群より選択され、コリルス・アベラナの上記アレルゲンは、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｏｒ ａ ２、Ｃｏｒ ａ ８、Ｃｏｒ ａ ９、Ｃｏｒ ａ １０およびＣｏｒ ａ １１からなる群より選択され、クリプトメリア・ジャポニカの上記アレルゲンは、Ｃｒｙ ｊ １およびＣｒｙ ｊ ２からなる群より選択され、カプリナス・カルピオの上記アレルゲンは、Ｃｙｐ ｃ １であり、ダウクス・カロタの上記アレルゲンは、Ｄａｕ ｃ １およびＤａｕ ｃ ４からなる群から選択され、デルマトファゴイデス・プテロニシヌスの上記アレルゲンは、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ３、Ｄｅｒ ｐ ４、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ６、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ８、Ｄｅｒ ｐ ９、Ｄｅｒ ｐ １０、Ｄｅｒ ｐ １１、Ｄｅｒ ｐ １４、Ｄｅｒ ｐ ２０、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＣｌｏｎｅ ３０上記アレルゲンからなる群より選択され、ファグス・シルバチカの上記アレルゲンは、Ｆａｇ ｓ １であり、フェリス・ドメスチカスの上記アレルゲンは、Ｆｅｌ ｄ １、Ｆｅｌ ｄ ２、Ｆｅｌ ｄ ３、Ｆｅｌ ｄ ４、Ｆｅｌ ｄ ５ｗ、Ｆｅｌ ｄ ６ｗおよびＦｅｌ ｄ ７ｗからなる群より選択され、ヘベア・ブラシリエンシスの上記アレルゲンは、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６．０１、Ｈｅｖ ｂ ６．０２、Ｈｅｖ ｂ ６．０３、Ｈｅｖ ｂ ７．０１、Ｈｅｖ ｂ ７．０２、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２およびＨｅｖ ｂ １３からなる群より選択され、ジュニペルス・アシュエイの上記アレルゲンは、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ａ ２およびＪｕｎ ａ ３からなる群より選択され、マルス・ドメスチカの上記アレルゲンは、Ｍａｌ ｄ １、Ｍａｌ ｄ ２、Ｍａｌ ｄ ３およびＭａｌ ｄ ４からなる群より選択され、ケルクス・アルバの上記アレルゲンは、Ｑｕｅ ａ １であり、ならびに、フレウム・プラテンスの上記アレルゲンは、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２およびＰｈｌ ｐ １３からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
上記アレルゲンは、Ａｌｎ ｇ １、Ａｌｔ ａ １、Ａｍｂ ａ １、Ａｐｉ ｇ １、Ａｒａ ｈ ２、Ｂｅｔ ｖ １、ベータ−カゼイン、Ｃａｒ ｂ １、Ｃａｓ ｓ １、Ｃｌａ ｈ ８、Ｃｏｒ ａ １、Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｙｐ ｃ １、Ｄａｕ ｃ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｆａｇ ｓ １、Ｆｅｌ ｄ １、Ｈｅｖ ｂ ６、Ｊｕｎ ａ １、Ｍａｌ ｄ １、オボアルブミン（ＯＶＡ）、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６およびＰｈｌ ｐ ７からなる群より選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
上記ＲＮＡ分子が、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５およびＰｈｌ ｐ ６、またはＡｌｎ ｇ １、Ｃｏｒ ａ １、Ｑｕｅ ａ １、Ｃａｒ ｂ １およびＢｅｔ ｖ １をコードすることを特徴とする請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項５】
上記アレルゲンの誘導体が低アレルギー性であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項６】
上記低アレルギー性のアレルゲン誘導体のＩｇＥ反応性が、野生型アレルゲンのＩｇＥ反応性よりも、１０％以上、好適には２０％以上、より好適には３０％以上、特に５０％以上低いことを特徴とする請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
上記アレルゲンまたはその誘導体をコードする上記ＲＮＡ分子が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのさらなる分子に結合されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項８】
上記ＲＮＡ分子が、レプリカーゼ、β−グロビンリーダー配列、ｃａｐ０、ｃａｐ１およびポリＡテールからなる群より選択される少なくとも１つのさらなる要素を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項９】
上記ワクチンが、好適にはＣｐＧ−ＤＮＡおよびサイトカインからなる群より選択されるアジュバントをさらに含み、上記サイトカインは好適にはＩＬ−１２およびＩＬ−１５であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１０】
上記ワクチンが、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与、局所性投与、または微粒子銃投与に適用されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
アレルギーの治療用または予防用のワクチンを製造するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載された少なくとも１つのＲＮＡ分子の、使用。
【請求項１２】
アレルゲンに対する個体の除感作のための予防的かつ治療的なワクチンを製造するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載された少なくとも１つのＲＮＡ分子の、使用。
【請求項１３】
上記ワクチンが、好適にはＣｐＧ−ＤＮＡおよびサイトカインからなる群より選択されるアジュバントをさらに含み、上記サイトカインは好適にはＩＬ−１２およびＩＬ−１５であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
上記ワクチンが、筋内投与、皮内投与、静脈内投与、経皮投与、局所性投与または微粒子銃投与に適用されることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載された少なくとも１つのアレルゲンまたはその誘導体をコードする少なくとも１つの塩基配列を含む、単離されたＲＮＡ分子。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図２９Ｃ】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３２】
【図３３Ａ】
【図３３Ｂ】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３５Ａ】
【図３５Ｂ】
【図３６Ａ】
【図３６Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２６】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図２９Ｃ】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３２】
【図３３Ａ】
【図３３Ｂ】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３５Ａ】
【図３５Ｂ】
【図３６Ａ】
【図３６Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５４０５００（Ｐ２０１０−５４０５００Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２６３２２（Ｐ２０１０−５２６３２２）
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６３０３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４０４４３
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（５０７１８０４２３）ビオマイ アクチエンゲゼルシャフト (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６３０３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４０４４３
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（５０７１８０４２３）ビオマイ アクチエンゲゼルシャフト (12)
【Ｆターム（参考）】
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