ＲＮＡ干渉のための方法及び組成物

【課題】宿主細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法の提供。
【解決手段】二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を宿主細胞に、標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含み、該ｄｓＲＮＡが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む方法、およびその組成物、さらに医薬製剤。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、該方法は、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を宿主細胞に、標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含み、該ｄｓＲＮＡが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする当該方法。
【請求項２】
宿主細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、該方法は、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を宿主細胞に、標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含み、該ｄｓＲＮＡが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする当該方法。
【請求項３】
標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を含む当該組成物。
【請求項４】
標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を、発現時に生成する発現ベクターを含む当該組成物。
【請求項５】
標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を含む当該組成物。
【請求項６】
標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を、発現時に生成する発現ベクターを含む当該組成物。
【請求項７】
ｄｓＲＮＡがハイブリダイズする標的遺伝子の非翻訳配列を、プロモーター配列及びエンハンサー配列よりなる群から選択する、請求項１に記載の方法又は請求項３若しくは４に記載の組成物。
【請求項８】
宿主細胞を培養に懸濁させる、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が一動物個体内にある、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
標的遺伝子が、宿主細胞のゲノムに組み込まれた遺伝子である、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
標的遺伝子が、異種遺伝子である、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
標的遺伝子が、ウイルス遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、霊長類細胞である、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞が、ヒトの細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｄｓＲＮＡが、短い干渉性の二本鎖ＲＮＡであって、該ＲＮＡが宿主細胞において、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で有意のＰＫＲ依存性応答を生じないことを特徴とする、請求項１及び２の何れかに記載の方法又は請求項３若しくは５に記載の組成物。
【請求項１６】
ｄｓＲＮＡが、１５〜４５塩基対長である、請求項１５に記載の方法又は組成物。
【請求項１７】
ｄｓＲＮＡが、１９〜３０塩基対長である、請求項１５に記載の方法又は組成物。
【請求項１８】
ｄｓＲＮＡが、少なくとも一の転写産物を生成するコード配列を有する発現ベクターによって細胞内で生成され、該転写産物が宿主細胞によりプロセッシングを受けてｓｉＲＮＡになることを特徴とする、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
ｄｓＲＮＡが、ヘアピンＲＮＡであって、該ＲＮＡが宿主細胞によりプロセッシングを受けてｓｉＲＮＡ種になることを特徴とする、請求項１及び２の何れかに記載の方法又は請求項３若しくは５に記載の組成物。
【請求項２０】
標的遺伝子の発現が、少なくとも１０倍減衰される、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
下記：
哺乳動物細胞内の短い干渉性二本鎖ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)であり又は該ＲＮＡを生じさせて標的遺伝子の発現を減衰させる二本鎖ＲＮＡ(ＤＳＲＮＡ)の医薬製剤；及び
該製剤を患者に投与するためのラベル又は使用説明書(書面及び／又は図解)
を含む医薬パッケージであって、このｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞において、標的遺伝子の発現を減衰させるのに効果的な濃度で有意のＰＫＲ依存性応答を生じない当該医薬パッケージ。
【請求項２２】
ｓｉＲＮＡが、標的遺伝子の非転写配列又は非コード配列にハイブリダイズする、請求項２１に記載の医薬パッケージ。
【請求項２３】
請求項３〜６の何れかに記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の細胞内の標的遺伝子の発現を減衰させる方法。
【請求項２４】
標的遺伝子の発現を減衰させることが、細胞の望ましくない増殖又は分化を減少させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
短い干渉性二本鎖ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)を生成する方法であって、下記を含む当該方法：
(ｉ)下記：
相補的なセンス及びアンチセンス標的配列を含む二本鎖核酸
ＲＮＡポリメラーゼ
を含むイン・ビトロ転写系を用意し、
該標的配列は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターと隣接し、センス及びアンチセンス標的配列は転写されてアニールしてｓｉＲＮＡを形成することができ；そして
(ｉｉ)該ｓｉＲＮＡを該イン・ビトロ転写系から単離する。
【請求項２６】
ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＮＡポリメラーゼを、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ及びＳＰ６ポリメラーゼよりなる群から選択する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
イン・ビトロ転写系が、ｓｉＲＮＡ種の多彩なライブラリーを生成する標的配列の多彩なライブラリーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
短い干渉性二本鎖ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の送達事業を行なう方法であって、下記を含む当該方法：
(ｉ)ユーザーにより指名された配列を有するｓｉＲＮＡ種の注文を受理し；
(ｉｉ)下記：
該ユーザーが指名したｓｉＲＮＡ種についての相補的なセンス及びアンチセンス配列の標的配列を有する二本鎖核酸、及び
ＲＮＡポリメラーゼ
を含むイン・ビトロ転写系を用意し、該標的配列は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターと隣接し、センス及びアンチセンス標的配列は転写され、アニールしてｓｉＲＮＡを形成することができ；
(ｉｉｉ)該ｓｉＲＮＡを該イン・ビトロ転写系から単離し；そして
(ｉｖ)該ｓｉＲＮＡを梱包して該ユーザーに送付する。
【請求項３０】
ドナー幹細胞又はその子孫のＭＨＣ表現型を変える方法であって、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を幹細胞に、該ＲＮＡを導入しなければ該幹細胞又はその子孫によって発現されたＭＨＣ遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含む当該方法。
【請求項３１】
ｄｓＲＮＡが、少なくとも一つのヒト白血球抗原(ＨＬＡ)の発現を減少させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも一つのＭＨＣ遺伝子の発現の、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)のドナー幹細胞への導入による安定な減衰から生じる変化したＭＨＣ表現型を有するドナー幹細胞又はその子孫の培養物。
【請求項３３】
患者の移植の方法であって、下記を含む当該方法：
(ｉ)少なくとも一つのＭＨＣ遺伝子の発現の、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)のドナー幹細胞への導入による安定な減衰から生じた変化したＭＨＣ表現型を有するドナー幹細胞又はその子孫のエキス・ビボ細胞又は組織培養を生成し
(ｉｉ)該患者に、該細胞又は組織培養物を移植する。
【請求項３４】
患者への移植のための細胞性医薬の製造における幹細胞の利用であって、該細胞性医薬が、幹細胞又はその子孫を含み、それらが、少なくとも一つのＭＨＣ遺伝子の発現の、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)の幹細胞への導入による安定な減衰から生じた変化したＭＨＣ表現型を有する当該利用。
【請求項３５】
請求項３〜６の何れかに記載の組成物の、少なくとも一つの遺伝子の発現をイン・ビボで減衰させる医薬の製造における利用。
【請求項３６】
宿主細胞の病原体の感染に対する罹病性を低下させる方法であって、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を該宿主細胞に、該病原体の発現に必要な少なくとも一つの遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含む当該方法。
【請求項３７】
病原体がウイルスであり、ｄｓＲＮＡが、該ウイルスの宿主細胞への感染に必要な細胞表面タンパク質の発現を減衰させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
二本鎖ＲＮＡ転写産物をコードする導入遺伝子を含む生殖細胞系列及び／又は体細胞を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、該転写産物は、プロセッシングを受けて短い干渉性の二本鎖ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)種になり、該導入遺伝子の転写が、該動物の少なくとも一つの細胞型において、内因性標的遺伝子の発現を減衰させることを特徴とする当該トランスジェニック動物。
【請求項３９】
前記の導入遺伝子についてキメラである、請求項３８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４０】
前記の導入遺伝子が、染色体に組み込まれている、請求項３８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４１】
導入遺伝子が、別個の相補的転写物を転写し、該転写物はアニールして前記のｓｉＲＮＡを形成し、該ｓｉＲＮＡが、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で、有意のＰＫＲ依存性応答を生じないことを特徴とする、請求項３８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４２】
導入遺伝子が、ヘアピンＲＮＡを転写し、該ＲＮＡがプロセッシングを受けて前記のｓｉＲＮＡになる、請求項３８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４３】
ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第一のヌクレオチド配列、及び該第一のヌクレオチド配列の相補的逆向き反復であって該第一のヌクレオチド配列とハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第二のヌクレオチド配列を含むヘアピンＲＮＡであって、このヘアピンＲＮＡは、該標的遺伝子の発現を減衰させて、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で有意のＰＫＲ依存性応答を生じないことを特徴とする当該ヘアピンＲＮＡ。
【請求項４４】
ヘアピンＲＮＡが、化学合成されたものである、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項４５】
ヘアピンＲＮＡが、イン・ビトロで酵素により合成されたものである、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項４６】
ヘアピンＲＮＡが、イン・ビトロでＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成されたものである、請求項４５に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項４７】
ヘアピンＲＮＡが、イン・ビボで酵素により合成されたものである、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項４８】
ヘアピンＲＮＡが、イン・ビボでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより合成されたものである、請求項４７に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項４９】
ヘアピンＲＮＡが、ベクターにより生成されたものである、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項５０】
ヘアピンＲＮＡが、約２０〜５０ヌクレオチドのサイズを有する、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項５１】
ヘアピンＲＮＡが、約５０〜１００ヌクレオチドのサイズを有する、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項５２】
ヘアピンＲＮＡが、約１００〜５００ヌクレオチドのサイズを有する、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項５３】
ヘアピンのループ内に制限酵素部位を含む、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。

【図１】