ＳＮＰｓ解析装置、およびＳＮＰｓ解析方法
【課題】電気泳動を行った結果からＳＮＰｓ判定を行う際に、ノイズによるピークと、ＤＮＡによるピークとを区別することが困難であった。
【解決手段】泳動中に複数回測定したデータを２値化し、同じ場所に現れるピークをノイズと認識する。また、電気泳動によりＤＮＡによるピークが移動する位置を想定し、任意の１サイクルの走査データと該サイクルの次の１サイクルでの走査データのピーク位置が、所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定する。これにより、ノイズを減らし、正確なＳＮＰｓ判定を行うことが出来る。
【解決手段】泳動中に複数回測定したデータを２値化し、同じ場所に現れるピークをノイズと認識する。また、電気泳動によりＤＮＡによるピークが移動する位置を想定し、任意の１サイクルの走査データと該サイクルの次の１サイクルでの走査データのピーク位置が、所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定する。これにより、ノイズを減らし、正確なＳＮＰｓ判定を行うことが出来る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖類その他のあらゆる生体試料を導電性媒体中で電気泳動により分離・分析する場合において、目的とする生体試料の泳動状態および泳動位置を正確に判別することのできるＳＮＰｓ解析装置、およびＳＮＰｓ解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な生体試料を考えた場合、代表的なものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質が存在する。近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきた。ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（ＳＩＮＧＬＥ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭＳの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や副作用をあらかじめ予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００３】
現在ＳＮＰｓを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定方法）が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケンス法（ＳＡＮＧＥＲ法）である。
【０００４】
なお、このシーケンシングは、このＳＡＮＧＥＲ法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。そして、このようなシーケンシングによるＳＮＰｓの解析は、ターゲットとする遺伝子を単離した後、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定法（装置）を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行うものであるため、実験に膨大な作業量と時間、さらには多大のランニングコストを要し、またその際に使用する塩基配列決定のための自動化装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、高価な試薬を大量に必要とする、という問題を有している。
【０００５】
こうした問題点は、アフィニティキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法を用いればほぼ解決できる。アフィニティキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（ＤＮＡとそれを相補するＤＮＡ、ＤＮＡとそのＤＮＡから転写されたＲＮＡ、酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、相互作用する二成分のうちの一方を添加しておき、他方の成分を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（特許文献１参照）。
【０００６】
ここで、従来のアフィニティキャピラリー電気泳動では、塩基配列を特異的に認識するアフィニティ物質として、被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係にある１本鎖ＤＮＡを使うが、ポリヌクレオチドを成分とするＤＮＡは負電荷を有しているため、電圧を印加すると、このアフィニティ物質として用いているＤＮＡがキャピラリー外に流出してしまう。これを防ぐため、従来では、アフィニティのために用いるＤＮＡである、前記被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係の１本鎖ＤＮＡを、キャピラリー内に固定化している。そして、固定化の方法としては、ビニル化ＤＮＡをリニアポリマー化したポリアクリルアミドと共重合し、それをキャピラリー内壁に共有結合的に固定化するものが提案されている。これにより、前記被検体ＤＮＡは、アフィニティ物質である固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）と強く相互作用してキャピラリー内に吸着され、一方ノイズＤＮＡは該固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）に吸着されずキャピラリー外に流出され、この結果、前記被検体ＤＮＡを検出することが可能となる（特許文献１参照）。
【０００７】
しかしながら、この方法では、アフィニティのために用いるＤＮＡ（以下：アフィニティＤＮＡ）がキャピラリー内壁にしか固定化できないので、アフィニティＤＮＡと試料ＤＮＡとの相互作用が壁面近傍に限られ、測定が難しく、且つ測定精度が悪くなるという問題がある。
【０００８】
そこで、本件出願人は、アフィニティＤＮＡと試料との相互作用が壁面近傍に限られないように、該アフィニティＤＮＡをキャピラリー内で擬似的に固定する方法を開発し、それぞれ電極を配置した第１容器と第２容器間を、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管で連絡し、次いで、このキャピラリー管の緩衝液の中に、該ＤＮＡ試料に含まれる異常ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を結合したリニアポリマーからなる分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填した後、続いて被検体であるＤＮＡ試料を充填し、その後、両電極間に電圧を印加して、キャピラリー管内の被検体ＤＮＡ試料を電気泳動させることで、該ＤＮＡ試料を分離する遺伝子診断装置および遺伝子診断方法を提案している（特許文献２参照）。
【０００９】
以下、アフィニティＤＮＡをキャピラリー内で擬似的に固定する方法について説明すると、ＤＮＡは二本鎖を形成するものと、一本鎖を形成するものとが存在するが、ＤＮＡのもつＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣが結合し、ペアを形成する性質を有しており、ＤＮＡの二本鎖においてもＡＴ，ＧＣで対をなしている。従って、一方のＤＮＡがＡＴＣＧＣＧＴと配列されている場合、他方のＤＮＡはＴＡＧＣＧＣＡという塩基配列をもっている。
【００１０】
ＤＮＡ試料を分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートは、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用するために、該分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分に、ＤＮＡ試料の異常ＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えている。例えば、ＤＮＡ試料の異常ＤＮＡのＤＮＡ配列がＡＴＣＧＣＧＴを含み、正常ＤＮＡがＡＴＣＡＣＧＴを含む場合、下線で示した部分で、異常ＤＮＡと正常ＤＮＡの塩基が異なっている。
【００１１】
このとき、分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分の配列をＴＡＧＣＧＣＡとすると、正常ＤＮＡは下線部においてＤＮＡコンジュゲートと相補的ではなくなる。これにより、全体の結合力は異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより１塩基分大きくなり、電気泳動時に異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより遅延して泳動される。ＤＮＡ試料は血液などから、細胞を破壊してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによって目的のＤＮＡ配列を含む部分を増幅する。このとき、所定の塩基数にして増幅すると、相補的配列を持つＤＮＡコンジュゲートの塩基数も決定できる。
【００１２】
前述した方法によれば、負に帯電した分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを、電気泳動させる際に、アフィニティＤＮＡと被ＤＮＡ検体との相互作用が壁面近傍に限られないように擬似的に固定し、そのＤＮＡ試料の移動速度差から、該正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとを分離することができ、この結果、ＳＮＰｓの遺伝子異常を、短時間、且つ簡単、正確に判別することが可能になる。
【００１３】
しかし、前述した特許文献２の遺伝子診断装置および診断方法においては、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを充填する必要がある。このように、キャピラリー管１本１本に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料を充填するのは面倒な作業であるが、この問題に対しては、特許文献３に記載されているように、プラットホームであるプレートに微細な流路を形成し、該プレートの回転速度を変化させることで、該回転から生じる向心力を変化させて試料を移動させるという方法が提案されている。
【００１４】
以上で説明した方法により、ＤＮＡ試料を分離し、流路と相対的に移動するようにした光学検出部により前記ＤＮＡ試料の蛍光度を検出することで、ＳＮＰｓの有無を判定することができる装置を構成することができる。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特開２００２−３４０８５９号公報
【特許文献３】特開２００３−２８８８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、上記した従来の方法では、測定されたデータにノイズが含まれており、ＤＮＡ試料によるピークと、その他の原因によるノイズとを区別することができず、正確な判定が行えない場合がある、という課題を有していた。
【００１６】
また、実際の測定においては、上記のノイズに加えて、プライマーと呼ばれるＰＣＲの残物が加わり、さらにＤＮＡ試料によるピークの特定が困難になる、という課題を有していた。
【００１７】
この発明は、上記のような従来の問題点に鑑みてなされたもので、ノイズを減らし、正確なＳＮＰｓ判定を行うことのできるＳＮＰｓ解析装置、およびＳＮＰｓ解析方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記課題を解決するために、本発明の請求項１にかかるＳＮＰｓ解析装置は、微細流路と、前記微細流路に電圧を印加する電極と、前記微細流路よりの光を検知する光検出器と、前記微細流路に対して前記光検出器を前記微細流路上で走査させる走査機構と、前記検出したデータを表示する表示部とを備えたＳＮＰｓ解析装置において、前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行い、前記保存したデータを所定の閾値で２値化し、前記各サイクルの連続したデータのピークの位置を比較し、所定回数の走査データにおいて同じ位置にピークがある場合に該ピークをノイズと判定する、ことを特徴とする。
【００１９】
これにより、流路の形状による検出信号のノイズや、流路に付着した付着物によるノイズを除去し、ＳＮＰｓの正確な判定を行うことができる。
【００２０】
本発明の請求項２にかかるＳＮＰｓ解析装置は、微細流路と、前記微細流路に電圧を印加する電極と、前記微細流路よりの光を検知する光検出器と、前記微細流路に対して前記光検出器を前記微細流路上で走査させる走査機構と、前記検出したデータを表示する表示部とを備えたＳＮＰｓ解析装置において、前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行い、前記保存したデータを所定の閾値で２値化したデータにおいて、任意の１サイクル時の走査データと該サイクルの次の１サイクル時での走査データのピーク位置が所定の移動距離に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定する、ことを特徴とする。
【００２１】
これにより、ＤＮＡ試料が電気泳動する際に移動する速度を想定できることを利用して、光検出器の位置のズレ等によるノイズを除去し、ＳＮＰｓの正確な判定を行うことができる。
【００２２】
本発明の請求項３にかかるＳＮＰｓ解析方法は、請求項１に記載のＳＮＰｓ解析装置における解析方法において、前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行う工程と、前記保存したデータを所定の閾値で２値化する工程と、前記各サイクルの連続したデータのピークの位置を比較し、所定回数の走査データにおいて同じ位置にピークがある場合に該ピークをノイズと判定する工程とを含む、ことを特徴とする。
【００２３】
これにより、流路の形状による検出信号のノイズや、流路に付着した付着物によるノイズを除去し、ＳＮＰｓの正確な判定を行うことができる。
【００２４】
さらに、本発明の請求項４にかかるＳＮＰｓ解析方法は、請求項２に記載のＳＮＰｓ解析装置における解析方法において、前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行う工程と、前記保存したデータを所定の閾値で２値化する工程と、前記保存したデータを所定の閾値で２値化したデータにおいて、任意の１サイクル時の走査データと該サイクルの次の１サイクル時での走査データのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定する工程とを含む、ことを特徴とするＳＮＰｓ解析方法。
【００２５】
これにより、ＤＮＡ試料が電気泳動する際に移動する速度を想定できることを利用して、光検出器の位置ズレ等によるノイズを除去し、ＳＮＰｓの正確な判定を行うことができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のＳＮＰｓ解析装置、及び解析方法によれば、電気泳動で得られた波形データから、泳動時間に係らず、同じ位置にあるピークをノイズと判定するため、従来では、流路の形状によるノイズや、流路に付着した付着物によるノイズが原因で、ＳＮＰｓの判定が困難であったものを、該ノイズを除去することにより、ＳＮＰｓを容易かつ正確に判定することができる。また、電気泳動する際に、ＤＮＡ試料の移動速度を想定できることを利用して、任意の１サイクルの走査データと該サイクルの次の１サイクルでの走査データのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定するため、従来では、試料内に含まれるプライマーなどによるノイズや、光検出部の位置のズレによるノイズが原因で、ＳＮＰｓの判定が困難であったものを、該ノイズを除去することにより、ＳＮＰｓを容易かつ正確に判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（実施の形態１）
以下に、本発明の実施の形態を、図面とともに詳細に説明する。
図１は、本発明の実施の形態１によるＳＮＰｓ解析装置を構成する電気泳動装置１００の概略構成を示した図である。
【００２８】
本実施の形態１のＳＮＰｓ解析装置を構成する電気泳動装置１００は、本体１、上蓋２、及び検査プレート３により構成され、検査プレート３は、２本の嵌合ピン４で回転体３５と固定される。固定された検査プレート３は、ステッピングモータ５を動力源とする回転機構６によって、検査プレート３を回転制御することが可能である。該回転機構６の動力としては、ＤＣモータ、あるいは他の駆動機構を使用することができる。検査プレート３の下には、光検出部７が備えられており、検査プレート３に対する光源の照射と、検査プレート３からの蛍光とを検出する。検査プレート３を測定する方法としては、発光、蛍光、吸光度などを測定することができる。
【００２９】
また、検査プレート３が装着された空間８は、上蓋２を閉めた状態で気密性が高くなる構成となっており、該空間８は、温度制御機能を有するペルチェ素子やヒーター等の加熱冷却デバイス９とサーミスタ１０とを用いて温度制御が可能となっている。それらを制御することによって、該空間８を検査プレート３に対して一定温度に制御することができる。
【００３０】
また、上蓋２には、電圧印加手段１１を備えている。電圧印加手段１１は、電極基板ユニット１２に装着されたプラスと、マイナスの電極プローブ１３からなり、ＤＣモータ１４と、圧縮バネ１５とを用いて昇降する。マイナス電極プローブ１３は、電流検出機構１６を備えており、電気泳動中の電流値を測定することが可能である。電極プローブ１３は、１微細流路につきプラスとマイナスの電極プローブ１３を１セットとして、微細流路の数に対応した数を装着しており、各電極プローブ１３において印加電圧を変更することが可能な構成となっている。
【００３１】
図２は、図１の構成において上蓋２を開けた状態を示し、この状態で検査プレート３を脱着する。検査プレート３の脱着は、上蓋２と本体１を一体型の装置とし、光ディスク装置に代表されるような、トレイにプレートを乗せて脱着する方式とすることができ、あるいは、スロットインの方式にしてもよい。
【００３２】
次に、図３は、検査プレート３を上から見た概略構成を示した図である。
検査プレート３は、２本の嵌合ピンを接続するための接続穴２６が開いており、その接続穴２６と、プレートの角を落とした位置あわせ部１７とで、本体との取り付け方向を固定し、表裏が逆にならない構造にしている。検査プレート３には、複数の検査部１８が設けられており、本実施の形態では、４個の場合の例を示している。
【００３３】
検査部１８は、液体を注入するための注入口１９、微細流路である検査流路２０、余分な液体を溜めるバッファ２１、検査流路２０と、バッファ２１へ液体を移動するための微細移動用流路２２、及び検査流路２０へ電圧を印加するための２箇所の電極部２３で構成される。
【００３４】
検査流路２０は、断面積が直径５０〜３００μｍの円形と同等とし、断面形状は変化してはならない。また、各検査部１８の検査流路２０は、検査プレート３の中心に位置する接続穴２６を中心とした同一円周２５上に位置している。
【００３５】
同一円周２５は、本体１に検査プレート３を装着して回転機構６で回転させた際に光検出部７上を通過する。また、バッファ２１は、液体が漏れないほどの空気穴２４を開けている。
【００３６】
以上のように構成された本実施の形態１のＳＮＰｓ解析装置を構成する電気泳動装置について、以下にその動作、作用を説明する。
まず、トリスとホウ酸によってｐＨ調整された水溶液に、塩化マグネシウムなどの結合制御剤を混合して緩衝液とする。この緩衝液は、ｐＨ調整ができ、かつ緩衝作用を有し、サンプルに影響を与えない物質であれば他の緩衝液でもよい。
【００３７】
次に、最低でも６０塩基以上の塩基配列で構成されたサンプル溶液であるサンプルＤＮＡの配列の一部と相補的に配列する６〜１０塩基の配列を持つＤＮＡをアミノ化して、ＭＯＳＵ（メタクリロイル・オキシ・スクシンイミド）を使用してビニル化する。（ここで、詳細な方法は、本発明に直接関係しないので省略する。） ビニル化したＤＮＡと、モノマーのアクリルアミド、および、重合開始剤であるＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）とＴＥＭＤ（テトラメチルエチレンジアミン）とを混合して、嫌気性の中で反応させると、リニアーのポリアクリルアミドの一部に、サンプルＤＮＡの配列の一部と相補的に配列する６〜１０塩基の配列を持つＤＮＡが混入される。この特殊なＤＮＡを含むアクリルアミドポリマーと、前記緩衝液を混合してコンジュゲートとする（特許文献２参照）。
【００３８】
次に、検査プレート３における検査部１８に、コンジュゲートを注入口１９から注入して検査流路２０の全体を満たす。ここで、コンジュゲートを検査流路２０の全体に移動させるために、回転機能６を用いた遠心力を使用することもできる。また、ポンプなどを用いて吸引または圧入することも可能である。
【００３９】
このとき、コンジュゲートを検査流路２０に満たす時に気泡が混入すると、後で電気泳動した際に電気が流れない、という現象が発生して、電気泳動をさせることができなくなるため、これには注意をする必要がある。
【００４０】
次に、サンプル溶液を、一定量注入する。サンプル溶液であるＤＮＡには、ターゲットの塩基配列を、血液や細胞などから抽出した全ＤＮＡよりも、ＰＣＲ法などの方法により取り出してくるほうが良い。ここで、目的のＤＮＡと同じ配列がないようにするためにＤＮＡの塩基数は４０塩基以上が望ましい。
【００４１】
また、コンジュゲートと、サンプル溶液が注入された検査プレート３とを、本体１に装着した後、所定の温度に温度制御する。これにより、空間８の温度を制御することができ、検査プレート３を一定温度下におくことで、サンプル溶液が電気泳動する速度に対する温度による影響を抑えることができる。
【００４２】
そして、所定の温度に制御された後、各電極プローブ１３を降ろして、電極部２３と接触させる。接触後、コンジュゲートと、サンプル溶液が注入された検査部１８に、それぞれ一定の電圧を所定時間印加する。この際の印加電圧と、印加時間は、使用する検体によって異なるが、本実施の形態１では、印加電圧４００Ｖ、印加時間３０秒とする。この印加時間は、電気泳動によって泳動物質を測定可能な位置に移動させる時間である。
【００４３】
３０秒後、検査プレート３の検査流路２０の状態、即ち、電気泳動結果を確認するため、電極プローブ１３を上げて、回転機構６を用いて検査プレート３を、図３においては反時計回りに、回転させながら、光検出部７から励起光を照射して、ＤＮＡに結合した蛍光物質が発する光の強度を検出する。この時の測定結果を示したのが、図４である。
【００４４】
図４の横軸は、電気泳動により泳動物質が移動した距離を示している。これは、検査流路２０上の位置に相当する。また、図４の縦軸は、検出された光の強度を示している。
【００４５】
図４中では、波形が右に移動するほど電気泳動が進んでいることを示す。即ち、図４において、ある時点での測定結果では、ピークの位置がピーク位置４１であり、次の測定では、ピーク位置４２に移動していることを示している。このように、電気泳動と、測定を繰り返すことで、泳動の経過を測定することが出来る。
【００４６】
このような電気泳動の経過を測定することで、ＳＮＰｓの判別を行うことができる。サンプル溶液に、ワイルドタイプＤＮＡ（正常型）と、ＳＮＰｓタイプＤＮＡ（異常型）の両方が含まれる場合に、それぞれのＤＮＡとコンジュゲートとの結合力の差から、電気泳動速度に違いが発生し、ＤＮＡによるピークが分離する。この分離を判定することで、ＳＮＰｓの判別を行うことができる。
【００４７】
図５（ａ）は、測定開始時点での測定結果を示しており、ピークは１つ（ｐ）であり、ＤＮＡによるピークは分離していない。次に、３０秒間電気泳動した後に測定した結果を、図５（ｂ）に、さらに次の測定結果を図５（ｃ）に示す。電気泳動が進むにつれて、ＤＮＡによるピーク（ｐ１、ｐ２）が分離して泳動されている。
【００４８】
しかし、実際には、検査プレート３上に付着物などがあり、その付着物により光の測定が影響されて、ノイズが波形として表出することがある。また、検査プレートの形状により、光が反射・散乱し、特定の位置にノイズが現れることがある。これを、図６（ａ）、図６（ｂ）、図６（ｃ）に示す。図６（ａ）において、測定開始時点でピークは１つ（ｐ）で、ＤＮＡによるピークは分離していないが、図６（ｂ）の３０秒間電気泳動した後の測定結果、および、図６（ｃ）のさらに次の測定結果では、図５と同様に、電気泳動が進むにつれてＤＮＡによるピーク（ｐ１、ｐ２）が分離して泳動されているが、ノイズ６４は、時間に関係なく、同じ位置に現れている。このノイズ６４をノイズによるピークであると認識する方法を、以下に説明する。
【００４９】
まず、図６（ａ）、図６（ｂ）、図６（ｃ）のデータを、所定の閾値、例えば最大値の半分の値、により２値化する。２値化する方法は、データを微分して２値化する方法、あるいは他の方法を用いることも可能である。この結果を、図７（ａ）、図７（ｂ）、図７（ｃ）に示す。
【００５０】
次に、付着物等の検査プレートの場所に依存するノイズは、測定のたびに同じ場所にピークが現れることを利用して、ノイズと認識する。
即ち、２回以上の複数回（図６の場合、図６（ａ），図６（ｂ），図６（ｃ）の３回）にわたって、同じ位置６４（２値化した後は、図７の７４）にピークが検出されると、そのピークを流路の形状による検出信号のノイズや、流路に付着した付着物によるノイズであると認識する。
【００５１】
また、印加電圧など、条件にもよるが、サンプル溶液中のＤＮＡが電気泳動する速度は、ある程度想定できる（５ｍｍ〜２０ｍｍ／分）。それを利用して、一定時間電気泳動した後にピークが移動する位置を想定して、任意の１サイクルの走査データと該サイクルの次の１サイクルでの走査データとのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に該ピーク位置をノイズによるピークである、と正確に認識する。
【００５２】
即ち、測定したデータを２値化した後に、任意のサイクル時における測定値の全てのピークに対して、一定時間経過後のサイクル時の測定データにおいて、所定の移動距離の範囲内にピークがない場合に、そのピーク位置をノイズと判断する工程を繰り返す。これにより、２値化したデータから、ノイズを減らすことができる。
【００５３】
また、測定した波形データと、ノイズと判定されなかった２値化データとを、重ねて表示することで、測定者に対して測定データを見やすくすることができる。そのため、測定者がデータから、より正確にＳＮＰｓを判定することの手助けとなることができる。
【００５４】
以上のように、本実施の形態１によるＳＮＰｓ解析装置によれば、微細流路と、前記微細流路に電圧を印加する電極と、前記微細流路よりの光を検知する光検出器と、前記微細流路に対して前記光検出器を前記微細流路上で走査させる走査機構と、前記検出したデータを表示する表示部とを備えたＳＮＰｓ解析装置において、前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行い、前記保存したデータを所定の閾値で２値化し、前記各サイクルの連続したデータのピークの位置を比較し、所定回数の走査データにおいて同じ位置にピークがある場合に、該ピークをノイズと判定するようにしたので、流路の形状による検出信号のノイズや流路に付着した付着物によるノイズを除去し、正確なＳＮＰｓ判定を行うことができる。
【００５５】
また、前記保存したデータを所定の閾値で２値化したデータにおいて、任意の１サイクル時の走査データと、該サイクルの次のサイクル時での走査データのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定するようにしたので、ＤＮＡ試料が電気泳動する際に移動する速度を想定できることを利用して、光検出器などの位置のズレによるノイズを除去し、正確なＳＮＰｓ判定を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明にかかる、ＳＮＰｓ解析装置及びＳＮＰｓ解析方法は、すなわち、電気泳動により目的生体試料を解析、検出する装置および方法であり、これにより、サンプル溶液中に目的の試料が存在するかを正確に判定することができるものであり、電気泳動を使用する技術分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の実施の形態１によるＳＮＰｓ解析装置を構成する電気泳動装置１００を示す概略構成図
【図２】本発明の実施の形態１の電気泳動装置１００の上蓋２を開けた状態を示す概略構成図
【図３】本発明の実施の形態１の電気泳動装置１００における検査プレート３の概略構成図
【図４】従来の電気泳動装置における電気泳動によるピークの移動を示す図
【図５】（ａ）は本発明の実施の形態１における１回目電気泳動結果を示す図、（ｂ）は本発明の実施の形態１における２回目電気泳動結果を示す図、（ｃ）は本発明の実施の形態１における３回目電気泳動結果を示す図
【図６】（ａ）は本発明の実施の形態１における１回目電気泳動結果（ノイズを含む）を示す図、（ｂ）は本発明の実施の形態１における２回目電気泳動結果（ノイズを含む）を示す図、（ｃ）は本発明の実施の形態１における３回目電気泳動結果（ノイズを含む）を示す図
【図７】（ａ）は本発明の実施の形態１における１回目電気泳動結果（２値化）を示す図、（ｂ）は本発明の実施の形態１における２回目電気泳動結果（２値化）を示す図、（ｃ）は本発明の実施の形態１における３回目電気泳動結果（２値化）を示す図
【符号の説明】
【００５８】
１００ 電気泳動装置
１ 電気泳動装置の本体
２ 電気泳動装置の上蓋
３ 検査プレート
４ 嵌合ピン
５ ステッピングモータ
６ 回転機構
７ 光検出部
８ 温度制御される空間
９ 加熱冷却デバイス
１０ サーミスタ
１１ 電圧印加手段
１２ 電極基板ユニット
１３ 電極プローブ
１４ ＤＣモータ
１５ 圧縮バネ
１６ 電流検出機構
１７ 位置あわせ部
１８ 検査部
１９ 注入口
２０ 検査流路
２１ バッファ
２２ 微細移動用流路
２３ 電極部
２４ 空気穴
２５ 同一円周
２６ 接続穴
３５ 回転体
４１ ピーク位置
４２ 一定時間後のピーク位置
６４ ノイズ
７４ 場所に依存するノイズ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖類その他のあらゆる生体試料を導電性媒体中で電気泳動により分離・分析する場合において、目的とする生体試料の泳動状態および泳動位置を正確に判別することのできるＳＮＰｓ解析装置、およびＳＮＰｓ解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な生体試料を考えた場合、代表的なものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質が存在する。近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきた。ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（ＳＩＮＧＬＥ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭＳの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や副作用をあらかじめ予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００３】
現在ＳＮＰｓを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定方法）が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケンス法（ＳＡＮＧＥＲ法）である。
【０００４】
なお、このシーケンシングは、このＳＡＮＧＥＲ法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。そして、このようなシーケンシングによるＳＮＰｓの解析は、ターゲットとする遺伝子を単離した後、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定法（装置）を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行うものであるため、実験に膨大な作業量と時間、さらには多大のランニングコストを要し、またその際に使用する塩基配列決定のための自動化装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、高価な試薬を大量に必要とする、という問題を有している。
【０００５】
こうした問題点は、アフィニティキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法を用いればほぼ解決できる。アフィニティキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（ＤＮＡとそれを相補するＤＮＡ、ＤＮＡとそのＤＮＡから転写されたＲＮＡ、酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、相互作用する二成分のうちの一方を添加しておき、他方の成分を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（特許文献１参照）。
【０００６】
ここで、従来のアフィニティキャピラリー電気泳動では、塩基配列を特異的に認識するアフィニティ物質として、被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係にある１本鎖ＤＮＡを使うが、ポリヌクレオチドを成分とするＤＮＡは負電荷を有しているため、電圧を印加すると、このアフィニティ物質として用いているＤＮＡがキャピラリー外に流出してしまう。これを防ぐため、従来では、アフィニティのために用いるＤＮＡである、前記被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係の１本鎖ＤＮＡを、キャピラリー内に固定化している。そして、固定化の方法としては、ビニル化ＤＮＡをリニアポリマー化したポリアクリルアミドと共重合し、それをキャピラリー内壁に共有結合的に固定化するものが提案されている。これにより、前記被検体ＤＮＡは、アフィニティ物質である固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）と強く相互作用してキャピラリー内に吸着され、一方ノイズＤＮＡは該固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）に吸着されずキャピラリー外に流出され、この結果、前記被検体ＤＮＡを検出することが可能となる（特許文献１参照）。
【０００７】
しかしながら、この方法では、アフィニティのために用いるＤＮＡ（以下：アフィニティＤＮＡ）がキャピラリー内壁にしか固定化できないので、アフィニティＤＮＡと試料ＤＮＡとの相互作用が壁面近傍に限られ、測定が難しく、且つ測定精度が悪くなるという問題がある。
【０００８】
そこで、本件出願人は、アフィニティＤＮＡと試料との相互作用が壁面近傍に限られないように、該アフィニティＤＮＡをキャピラリー内で擬似的に固定する方法を開発し、それぞれ電極を配置した第１容器と第２容器間を、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管で連絡し、次いで、このキャピラリー管の緩衝液の中に、該ＤＮＡ試料に含まれる異常ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を結合したリニアポリマーからなる分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填した後、続いて被検体であるＤＮＡ試料を充填し、その後、両電極間に電圧を印加して、キャピラリー管内の被検体ＤＮＡ試料を電気泳動させることで、該ＤＮＡ試料を分離する遺伝子診断装置および遺伝子診断方法を提案している（特許文献２参照）。
【０００９】
以下、アフィニティＤＮＡをキャピラリー内で擬似的に固定する方法について説明すると、ＤＮＡは二本鎖を形成するものと、一本鎖を形成するものとが存在するが、ＤＮＡのもつＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣが結合し、ペアを形成する性質を有しており、ＤＮＡの二本鎖においてもＡＴ，ＧＣで対をなしている。従って、一方のＤＮＡがＡＴＣＧＣＧＴと配列されている場合、他方のＤＮＡはＴＡＧＣＧＣＡという塩基配列をもっている。
【００１０】
ＤＮＡ試料を分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートは、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用するために、該分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分に、ＤＮＡ試料の異常ＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えている。例えば、ＤＮＡ試料の異常ＤＮＡのＤＮＡ配列がＡＴＣＧＣＧＴを含み、正常ＤＮＡがＡＴＣＡＣＧＴを含む場合、下線で示した部分で、異常ＤＮＡと正常ＤＮＡの塩基が異なっている。
【００１１】
このとき、分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分の配列をＴＡＧＣＧＣＡとすると、正常ＤＮＡは下線部においてＤＮＡコンジュゲートと相補的ではなくなる。これにより、全体の結合力は異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより１塩基分大きくなり、電気泳動時に異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより遅延して泳動される。ＤＮＡ試料は血液などから、細胞を破壊してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによって目的のＤＮＡ配列を含む部分を増幅する。このとき、所定の塩基数にして増幅すると、相補的配列を持つＤＮＡコンジュゲートの塩基数も決定できる。
【００１２】
前述した方法によれば、負に帯電した分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを、電気泳動させる際に、アフィニティＤＮＡと被ＤＮＡ検体との相互作用が壁面近傍に限られないように擬似的に固定し、そのＤＮＡ試料の移動速度差から、該正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとを分離することができ、この結果、ＳＮＰｓの遺伝子異常を、短時間、且つ簡単、正確に判別することが可能になる。
【００１３】
しかし、前述した特許文献２の遺伝子診断装置および診断方法においては、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを充填する必要がある。このように、キャピラリー管１本１本に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料を充填するのは面倒な作業であるが、この問題に対しては、特許文献３に記載されているように、プラットホームであるプレートに微細な流路を形成し、該プレートの回転速度を変化させることで、該回転から生じる向心力を変化させて試料を移動させるという方法が提案されている。
【００１４】
以上で説明した方法により、ＤＮＡ試料を分離し、流路と相対的に移動するようにした光学検出部により前記ＤＮＡ試料の蛍光度を検出することで、ＳＮＰｓの有無を判定することができる装置を構成することができる。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特開２００２−３４０８５９号公報
【特許文献３】特開２００３−２８８８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、上記した従来の方法では、測定されたデータにノイズが含まれており、ＤＮＡ試料によるピークと、その他の原因によるノイズとを区別することができず、正確な判定が行えない場合がある、という課題を有していた。
【００１６】
また、実際の測定においては、上記のノイズに加えて、プライマーと呼ばれるＰＣＲの残物が加わり、さらにＤＮＡ試料によるピークの特定が困難になる、という課題を有していた。
【００１７】
この発明は、上記のような従来の問題点に鑑みてなされたもので、ノイズを減らし、正確なＳＮＰｓ判定を行うことのできるＳＮＰｓ解析装置、およびＳＮＰｓ解析方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記課題を解決するために、本発明の請求項１にかかるＳＮＰｓ解析装置は、微細流路と、前記微細流路に電圧を印加する電極と、前記微細流路よりの光を検知する光検出器と、前記微細流路に対して前記光検出器を前記微細流路上で走査させる走査機構と、前記検出したデータを表示する表示部とを備えたＳＮＰｓ解析装置において、前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行い、前記保存したデータを所定の閾値で２値化し、前記各サイクルの連続したデータのピークの位置を比較し、所定回数の走査データにおいて同じ位置にピークがある場合に該ピークをノイズと判定する、ことを特徴とする。
【００１９】
これにより、流路の形状による検出信号のノイズや、流路に付着した付着物によるノイズを除去し、ＳＮＰｓの正確な判定を行うことができる。
【００２０】
本発明の請求項２にかかるＳＮＰｓ解析装置は、微細流路と、前記微細流路に電圧を印加する電極と、前記微細流路よりの光を検知する光検出器と、前記微細流路に対して前記光検出器を前記微細流路上で走査させる走査機構と、前記検出したデータを表示する表示部とを備えたＳＮＰｓ解析装置において、前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行い、前記保存したデータを所定の閾値で２値化したデータにおいて、任意の１サイクル時の走査データと該サイクルの次の１サイクル時での走査データのピーク位置が所定の移動距離に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定する、ことを特徴とする。
【００２１】
これにより、ＤＮＡ試料が電気泳動する際に移動する速度を想定できることを利用して、光検出器の位置のズレ等によるノイズを除去し、ＳＮＰｓの正確な判定を行うことができる。
【００２２】
本発明の請求項３にかかるＳＮＰｓ解析方法は、請求項１に記載のＳＮＰｓ解析装置における解析方法において、前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行う工程と、前記保存したデータを所定の閾値で２値化する工程と、前記各サイクルの連続したデータのピークの位置を比較し、所定回数の走査データにおいて同じ位置にピークがある場合に該ピークをノイズと判定する工程とを含む、ことを特徴とする。
【００２３】
これにより、流路の形状による検出信号のノイズや、流路に付着した付着物によるノイズを除去し、ＳＮＰｓの正確な判定を行うことができる。
【００２４】
さらに、本発明の請求項４にかかるＳＮＰｓ解析方法は、請求項２に記載のＳＮＰｓ解析装置における解析方法において、前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行う工程と、前記保存したデータを所定の閾値で２値化する工程と、前記保存したデータを所定の閾値で２値化したデータにおいて、任意の１サイクル時の走査データと該サイクルの次の１サイクル時での走査データのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定する工程とを含む、ことを特徴とするＳＮＰｓ解析方法。
【００２５】
これにより、ＤＮＡ試料が電気泳動する際に移動する速度を想定できることを利用して、光検出器の位置ズレ等によるノイズを除去し、ＳＮＰｓの正確な判定を行うことができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のＳＮＰｓ解析装置、及び解析方法によれば、電気泳動で得られた波形データから、泳動時間に係らず、同じ位置にあるピークをノイズと判定するため、従来では、流路の形状によるノイズや、流路に付着した付着物によるノイズが原因で、ＳＮＰｓの判定が困難であったものを、該ノイズを除去することにより、ＳＮＰｓを容易かつ正確に判定することができる。また、電気泳動する際に、ＤＮＡ試料の移動速度を想定できることを利用して、任意の１サイクルの走査データと該サイクルの次の１サイクルでの走査データのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定するため、従来では、試料内に含まれるプライマーなどによるノイズや、光検出部の位置のズレによるノイズが原因で、ＳＮＰｓの判定が困難であったものを、該ノイズを除去することにより、ＳＮＰｓを容易かつ正確に判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（実施の形態１）
以下に、本発明の実施の形態を、図面とともに詳細に説明する。
図１は、本発明の実施の形態１によるＳＮＰｓ解析装置を構成する電気泳動装置１００の概略構成を示した図である。
【００２８】
本実施の形態１のＳＮＰｓ解析装置を構成する電気泳動装置１００は、本体１、上蓋２、及び検査プレート３により構成され、検査プレート３は、２本の嵌合ピン４で回転体３５と固定される。固定された検査プレート３は、ステッピングモータ５を動力源とする回転機構６によって、検査プレート３を回転制御することが可能である。該回転機構６の動力としては、ＤＣモータ、あるいは他の駆動機構を使用することができる。検査プレート３の下には、光検出部７が備えられており、検査プレート３に対する光源の照射と、検査プレート３からの蛍光とを検出する。検査プレート３を測定する方法としては、発光、蛍光、吸光度などを測定することができる。
【００２９】
また、検査プレート３が装着された空間８は、上蓋２を閉めた状態で気密性が高くなる構成となっており、該空間８は、温度制御機能を有するペルチェ素子やヒーター等の加熱冷却デバイス９とサーミスタ１０とを用いて温度制御が可能となっている。それらを制御することによって、該空間８を検査プレート３に対して一定温度に制御することができる。
【００３０】
また、上蓋２には、電圧印加手段１１を備えている。電圧印加手段１１は、電極基板ユニット１２に装着されたプラスと、マイナスの電極プローブ１３からなり、ＤＣモータ１４と、圧縮バネ１５とを用いて昇降する。マイナス電極プローブ１３は、電流検出機構１６を備えており、電気泳動中の電流値を測定することが可能である。電極プローブ１３は、１微細流路につきプラスとマイナスの電極プローブ１３を１セットとして、微細流路の数に対応した数を装着しており、各電極プローブ１３において印加電圧を変更することが可能な構成となっている。
【００３１】
図２は、図１の構成において上蓋２を開けた状態を示し、この状態で検査プレート３を脱着する。検査プレート３の脱着は、上蓋２と本体１を一体型の装置とし、光ディスク装置に代表されるような、トレイにプレートを乗せて脱着する方式とすることができ、あるいは、スロットインの方式にしてもよい。
【００３２】
次に、図３は、検査プレート３を上から見た概略構成を示した図である。
検査プレート３は、２本の嵌合ピンを接続するための接続穴２６が開いており、その接続穴２６と、プレートの角を落とした位置あわせ部１７とで、本体との取り付け方向を固定し、表裏が逆にならない構造にしている。検査プレート３には、複数の検査部１８が設けられており、本実施の形態では、４個の場合の例を示している。
【００３３】
検査部１８は、液体を注入するための注入口１９、微細流路である検査流路２０、余分な液体を溜めるバッファ２１、検査流路２０と、バッファ２１へ液体を移動するための微細移動用流路２２、及び検査流路２０へ電圧を印加するための２箇所の電極部２３で構成される。
【００３４】
検査流路２０は、断面積が直径５０〜３００μｍの円形と同等とし、断面形状は変化してはならない。また、各検査部１８の検査流路２０は、検査プレート３の中心に位置する接続穴２６を中心とした同一円周２５上に位置している。
【００３５】
同一円周２５は、本体１に検査プレート３を装着して回転機構６で回転させた際に光検出部７上を通過する。また、バッファ２１は、液体が漏れないほどの空気穴２４を開けている。
【００３６】
以上のように構成された本実施の形態１のＳＮＰｓ解析装置を構成する電気泳動装置について、以下にその動作、作用を説明する。
まず、トリスとホウ酸によってｐＨ調整された水溶液に、塩化マグネシウムなどの結合制御剤を混合して緩衝液とする。この緩衝液は、ｐＨ調整ができ、かつ緩衝作用を有し、サンプルに影響を与えない物質であれば他の緩衝液でもよい。
【００３７】
次に、最低でも６０塩基以上の塩基配列で構成されたサンプル溶液であるサンプルＤＮＡの配列の一部と相補的に配列する６〜１０塩基の配列を持つＤＮＡをアミノ化して、ＭＯＳＵ（メタクリロイル・オキシ・スクシンイミド）を使用してビニル化する。（ここで、詳細な方法は、本発明に直接関係しないので省略する。） ビニル化したＤＮＡと、モノマーのアクリルアミド、および、重合開始剤であるＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）とＴＥＭＤ（テトラメチルエチレンジアミン）とを混合して、嫌気性の中で反応させると、リニアーのポリアクリルアミドの一部に、サンプルＤＮＡの配列の一部と相補的に配列する６〜１０塩基の配列を持つＤＮＡが混入される。この特殊なＤＮＡを含むアクリルアミドポリマーと、前記緩衝液を混合してコンジュゲートとする（特許文献２参照）。
【００３８】
次に、検査プレート３における検査部１８に、コンジュゲートを注入口１９から注入して検査流路２０の全体を満たす。ここで、コンジュゲートを検査流路２０の全体に移動させるために、回転機能６を用いた遠心力を使用することもできる。また、ポンプなどを用いて吸引または圧入することも可能である。
【００３９】
このとき、コンジュゲートを検査流路２０に満たす時に気泡が混入すると、後で電気泳動した際に電気が流れない、という現象が発生して、電気泳動をさせることができなくなるため、これには注意をする必要がある。
【００４０】
次に、サンプル溶液を、一定量注入する。サンプル溶液であるＤＮＡには、ターゲットの塩基配列を、血液や細胞などから抽出した全ＤＮＡよりも、ＰＣＲ法などの方法により取り出してくるほうが良い。ここで、目的のＤＮＡと同じ配列がないようにするためにＤＮＡの塩基数は４０塩基以上が望ましい。
【００４１】
また、コンジュゲートと、サンプル溶液が注入された検査プレート３とを、本体１に装着した後、所定の温度に温度制御する。これにより、空間８の温度を制御することができ、検査プレート３を一定温度下におくことで、サンプル溶液が電気泳動する速度に対する温度による影響を抑えることができる。
【００４２】
そして、所定の温度に制御された後、各電極プローブ１３を降ろして、電極部２３と接触させる。接触後、コンジュゲートと、サンプル溶液が注入された検査部１８に、それぞれ一定の電圧を所定時間印加する。この際の印加電圧と、印加時間は、使用する検体によって異なるが、本実施の形態１では、印加電圧４００Ｖ、印加時間３０秒とする。この印加時間は、電気泳動によって泳動物質を測定可能な位置に移動させる時間である。
【００４３】
３０秒後、検査プレート３の検査流路２０の状態、即ち、電気泳動結果を確認するため、電極プローブ１３を上げて、回転機構６を用いて検査プレート３を、図３においては反時計回りに、回転させながら、光検出部７から励起光を照射して、ＤＮＡに結合した蛍光物質が発する光の強度を検出する。この時の測定結果を示したのが、図４である。
【００４４】
図４の横軸は、電気泳動により泳動物質が移動した距離を示している。これは、検査流路２０上の位置に相当する。また、図４の縦軸は、検出された光の強度を示している。
【００４５】
図４中では、波形が右に移動するほど電気泳動が進んでいることを示す。即ち、図４において、ある時点での測定結果では、ピークの位置がピーク位置４１であり、次の測定では、ピーク位置４２に移動していることを示している。このように、電気泳動と、測定を繰り返すことで、泳動の経過を測定することが出来る。
【００４６】
このような電気泳動の経過を測定することで、ＳＮＰｓの判別を行うことができる。サンプル溶液に、ワイルドタイプＤＮＡ（正常型）と、ＳＮＰｓタイプＤＮＡ（異常型）の両方が含まれる場合に、それぞれのＤＮＡとコンジュゲートとの結合力の差から、電気泳動速度に違いが発生し、ＤＮＡによるピークが分離する。この分離を判定することで、ＳＮＰｓの判別を行うことができる。
【００４７】
図５（ａ）は、測定開始時点での測定結果を示しており、ピークは１つ（ｐ）であり、ＤＮＡによるピークは分離していない。次に、３０秒間電気泳動した後に測定した結果を、図５（ｂ）に、さらに次の測定結果を図５（ｃ）に示す。電気泳動が進むにつれて、ＤＮＡによるピーク（ｐ１、ｐ２）が分離して泳動されている。
【００４８】
しかし、実際には、検査プレート３上に付着物などがあり、その付着物により光の測定が影響されて、ノイズが波形として表出することがある。また、検査プレートの形状により、光が反射・散乱し、特定の位置にノイズが現れることがある。これを、図６（ａ）、図６（ｂ）、図６（ｃ）に示す。図６（ａ）において、測定開始時点でピークは１つ（ｐ）で、ＤＮＡによるピークは分離していないが、図６（ｂ）の３０秒間電気泳動した後の測定結果、および、図６（ｃ）のさらに次の測定結果では、図５と同様に、電気泳動が進むにつれてＤＮＡによるピーク（ｐ１、ｐ２）が分離して泳動されているが、ノイズ６４は、時間に関係なく、同じ位置に現れている。このノイズ６４をノイズによるピークであると認識する方法を、以下に説明する。
【００４９】
まず、図６（ａ）、図６（ｂ）、図６（ｃ）のデータを、所定の閾値、例えば最大値の半分の値、により２値化する。２値化する方法は、データを微分して２値化する方法、あるいは他の方法を用いることも可能である。この結果を、図７（ａ）、図７（ｂ）、図７（ｃ）に示す。
【００５０】
次に、付着物等の検査プレートの場所に依存するノイズは、測定のたびに同じ場所にピークが現れることを利用して、ノイズと認識する。
即ち、２回以上の複数回（図６の場合、図６（ａ），図６（ｂ），図６（ｃ）の３回）にわたって、同じ位置６４（２値化した後は、図７の７４）にピークが検出されると、そのピークを流路の形状による検出信号のノイズや、流路に付着した付着物によるノイズであると認識する。
【００５１】
また、印加電圧など、条件にもよるが、サンプル溶液中のＤＮＡが電気泳動する速度は、ある程度想定できる（５ｍｍ〜２０ｍｍ／分）。それを利用して、一定時間電気泳動した後にピークが移動する位置を想定して、任意の１サイクルの走査データと該サイクルの次の１サイクルでの走査データとのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に該ピーク位置をノイズによるピークである、と正確に認識する。
【００５２】
即ち、測定したデータを２値化した後に、任意のサイクル時における測定値の全てのピークに対して、一定時間経過後のサイクル時の測定データにおいて、所定の移動距離の範囲内にピークがない場合に、そのピーク位置をノイズと判断する工程を繰り返す。これにより、２値化したデータから、ノイズを減らすことができる。
【００５３】
また、測定した波形データと、ノイズと判定されなかった２値化データとを、重ねて表示することで、測定者に対して測定データを見やすくすることができる。そのため、測定者がデータから、より正確にＳＮＰｓを判定することの手助けとなることができる。
【００５４】
以上のように、本実施の形態１によるＳＮＰｓ解析装置によれば、微細流路と、前記微細流路に電圧を印加する電極と、前記微細流路よりの光を検知する光検出器と、前記微細流路に対して前記光検出器を前記微細流路上で走査させる走査機構と、前記検出したデータを表示する表示部とを備えたＳＮＰｓ解析装置において、前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行い、前記保存したデータを所定の閾値で２値化し、前記各サイクルの連続したデータのピークの位置を比較し、所定回数の走査データにおいて同じ位置にピークがある場合に、該ピークをノイズと判定するようにしたので、流路の形状による検出信号のノイズや流路に付着した付着物によるノイズを除去し、正確なＳＮＰｓ判定を行うことができる。
【００５５】
また、前記保存したデータを所定の閾値で２値化したデータにおいて、任意の１サイクル時の走査データと、該サイクルの次のサイクル時での走査データのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定するようにしたので、ＤＮＡ試料が電気泳動する際に移動する速度を想定できることを利用して、光検出器などの位置のズレによるノイズを除去し、正確なＳＮＰｓ判定を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明にかかる、ＳＮＰｓ解析装置及びＳＮＰｓ解析方法は、すなわち、電気泳動により目的生体試料を解析、検出する装置および方法であり、これにより、サンプル溶液中に目的の試料が存在するかを正確に判定することができるものであり、電気泳動を使用する技術分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の実施の形態１によるＳＮＰｓ解析装置を構成する電気泳動装置１００を示す概略構成図
【図２】本発明の実施の形態１の電気泳動装置１００の上蓋２を開けた状態を示す概略構成図
【図３】本発明の実施の形態１の電気泳動装置１００における検査プレート３の概略構成図
【図４】従来の電気泳動装置における電気泳動によるピークの移動を示す図
【図５】（ａ）は本発明の実施の形態１における１回目電気泳動結果を示す図、（ｂ）は本発明の実施の形態１における２回目電気泳動結果を示す図、（ｃ）は本発明の実施の形態１における３回目電気泳動結果を示す図
【図６】（ａ）は本発明の実施の形態１における１回目電気泳動結果（ノイズを含む）を示す図、（ｂ）は本発明の実施の形態１における２回目電気泳動結果（ノイズを含む）を示す図、（ｃ）は本発明の実施の形態１における３回目電気泳動結果（ノイズを含む）を示す図
【図７】（ａ）は本発明の実施の形態１における１回目電気泳動結果（２値化）を示す図、（ｂ）は本発明の実施の形態１における２回目電気泳動結果（２値化）を示す図、（ｃ）は本発明の実施の形態１における３回目電気泳動結果（２値化）を示す図
【符号の説明】
【００５８】
１００ 電気泳動装置
１ 電気泳動装置の本体
２ 電気泳動装置の上蓋
３ 検査プレート
４ 嵌合ピン
５ ステッピングモータ
６ 回転機構
７ 光検出部
８ 温度制御される空間
９ 加熱冷却デバイス
１０ サーミスタ
１１ 電圧印加手段
１２ 電極基板ユニット
１３ 電極プローブ
１４ ＤＣモータ
１５ 圧縮バネ
１６ 電流検出機構
１７ 位置あわせ部
１８ 検査部
１９ 注入口
２０ 検査流路
２１ バッファ
２２ 微細移動用流路
２３ 電極部
２４ 空気穴
２５ 同一円周
２６ 接続穴
３５ 回転体
４１ ピーク位置
４２ 一定時間後のピーク位置
６４ ノイズ
７４ 場所に依存するノイズ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細流路と、前記微細流路に電圧を印加する電極と、前記微細流路よりの光を検知する光検出器と、前記微細流路に対して前記光検出器を該微細流路上で走査させる走査機構と、前記検出したデータを表示する表示部と、を備えたＳＮＰｓ解析装置において、
前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行い、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化し、
前記各サイクルの連続したデータのピークの位置を比較し、所定回数の走査データにおいて同じ位置にピークがある場合に、該ピークをノイズと判定する、
ことを特徴とするＳＮＰｓ解析装置。
【請求項２】
微細流路と、前記微細流路に電圧を印加する電極と、前記微細流路よりの光を検知する光検出器と、前記微細流路に対して前記光検出器を該微細流路上で走査させる走査機構と、前記検出したデータを表示する表示部と、を備えたＳＮＰｓ解析装置において、
前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行い、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化し、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化したデータにおいて、任意の１サイクルの走査データと該サイクルの次の１サイクルでの走査データのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定する、
ことを特徴とするＳＮＰｓ解析装置。
【請求項３】
請求項１に記載のＳＮＰｓ解析装置における解析方法において、
前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行う工程と、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化する工程と、
前記各サイクルの連続したデータのピークの位置を比較し、所定回数の走査データにおいて同じ位置にピークがある場合に該ピークをノイズと判定する工程と、を含む、
ことを特徴とするＳＮＰｓ解析方法。
【請求項４】
請求項２に記載のＳＮＰｓ解析装置における解析方法において、
前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行う工程と、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化する工程と、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化したデータにおいて、任意の１サイクルの走査データと該サイクルの次の１サイクルでの走査データのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定する工程と、を含む、
ことを特徴とするＳＮＰｓ解析方法。
【請求項１】
微細流路と、前記微細流路に電圧を印加する電極と、前記微細流路よりの光を検知する光検出器と、前記微細流路に対して前記光検出器を該微細流路上で走査させる走査機構と、前記検出したデータを表示する表示部と、を備えたＳＮＰｓ解析装置において、
前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行い、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化し、
前記各サイクルの連続したデータのピークの位置を比較し、所定回数の走査データにおいて同じ位置にピークがある場合に、該ピークをノイズと判定する、
ことを特徴とするＳＮＰｓ解析装置。
【請求項２】
微細流路と、前記微細流路に電圧を印加する電極と、前記微細流路よりの光を検知する光検出器と、前記微細流路に対して前記光検出器を該微細流路上で走査させる走査機構と、前記検出したデータを表示する表示部と、を備えたＳＮＰｓ解析装置において、
前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行い、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化し、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化したデータにおいて、任意の１サイクルの走査データと該サイクルの次の１サイクルでの走査データのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定する、
ことを特徴とするＳＮＰｓ解析装置。
【請求項３】
請求項１に記載のＳＮＰｓ解析装置における解析方法において、
前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行う工程と、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化する工程と、
前記各サイクルの連続したデータのピークの位置を比較し、所定回数の走査データにおいて同じ位置にピークがある場合に該ピークをノイズと判定する工程と、を含む、
ことを特徴とするＳＮＰｓ解析方法。
【請求項４】
請求項２に記載のＳＮＰｓ解析装置における解析方法において、
前記光検出器を走査しながら該光検出器で連続的に検出して得られたデータを保存する１サイクルの工程を一定時間間隔で行う工程と、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化する工程と、
前記保存したデータを所定の閾値で２値化したデータにおいて、任意の１サイクルの走査データと該サイクルの次の１サイクルでの走査データのピーク位置が所定の移動距離の範囲に入っていない場合に、該ピーク位置をノイズと判定する工程と、を含む、
ことを特徴とするＳＮＰｓ解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−２３２６６３（Ｐ２００８−２３２６６３Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６９０９６（Ｐ２００７−６９０９６）
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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