ＳｐｏｎｄｉａｓｍｏｍｂｉｎＬ．の抽出物および抽出方法およびその抽出物の使用
【課題】本発明は、ＣＯＸ−２の阻害方法、ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化の阻害方法、炎症の処置方法、癌の処置方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明により、治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、ＣＯＸ−２の阻害方法が提供される。
【解決手段】本発明により、治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、ＣＯＸ−２の阻害方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年８月１日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／９５３，３２２、および２００８年２月１８日に出願された米国特許出願Ｎｏ．１２／０３２，９８７の優先権を主張し、これらの出願の開示は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願は概して、炎症および癌の処置のための植物抽出物に関する。
【背景技術】
【０００３】
関節リュウマチは慢性炎症性疾患であり、複数の組織に影響を及ぼすが、典型的には関節において最も顕著な症状を生じさせる。当該疾患は進行性であり、変形性であり、最終的には衰弱性である。関節での慢性炎症により、軟組織、滑膜および軟骨の破壊、ならびに骨の関節面の浸食が引き起こされる。当該疾患には、米国、欧州および日本において３２０万人以上の人々が罹患しているものと算定されている。当該疾患は女性に多く、疾患者の過半数を占めると見積もられている。
【０００４】
炎症は、外部の物質やけがに対して生体を防御するための自然防御であるが、特定の疾患において問題を生じさせる場合がある。不適切な炎症は、グルココルチコイドであるコルチゾールのような従来のステロイド、組み換えＤＮＡ技術により製造される治療用タンパク質、および／または非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）により処置されうる。
【０００５】
プロスタグランジンは、生体の細胞により生産され、疼痛、炎症および発熱の促進を含む多くの主要な機能に関与している。さらに、いくつかのプロスタグランジンは、血液凝固に必要な血小板の機能をサポートし、酸のダメージ効果から胃の内面を保護している。プロスタグランジンは酵素シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）により生体の細胞内で生産される。
【０００６】
ＣＯＸ−２は、限定はされないが例えば疼痛を含む多くの機能に関与する酵素である。ＣＯＸ−２は具体的には、炎症に応答する生体領域に特異的に存在するが、胃には存在しない。ＣＯＸ−２は我々の生体内で、理想的には限られた理由により活性となるが、食習慣、ストレスおよび怪我などの要因によりＣＯＸ−２活性は増加しうる。継続的な理由によりＣＯＸ−２が活性であるとき、継続的な疼痛が生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
具体的な作用機作は完全には理解されていないが、ＣＯＸ−２の阻害が癌細胞のアポトーシスを生じさせることが見出されている。Ｊｏｈｎｓｅｎら、「Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ Ｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ， ａｎｄ Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；６４巻、７２１０〜７２１５頁（２００４年１０月１５日）；およびＬａｕら、「Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｐ５３／ｈｄｍ２ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６巻、１９２０−１９３１頁（２００７年）を参照されたい。
【０００８】
したがって、ＣＯＸ−２を阻害する植物抽出物は、限定はされないが例えば炎症、関節炎、筋肉痛および癌などの種々の疾患を処置しうる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＣＯＸ−２を阻害する方法、ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を阻害する方法、炎症の処置方法、または癌の処置方法は、患者への、治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．（スポンディアス モンビンＬ．）の抽出物の投与を含みうる。本明細書に記載する医薬は、医薬として許容な賦形剤、および賦形剤中に懸濁させた治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を含んでいてもよい。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物の製造方法は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．材料をエクストラクターおよび溶媒で処理することにより成分溶液（成分ソリューション、ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を作ること、および成分溶液から少なくとも一部の液体を除去することにより抽出物を製造することを含みうる。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、種々の溶媒を使用して抽出される成分を含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、９μｇ／ｍｌの濃度における、４つの異なる溶媒を使用して抽出したＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物による、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＸ−２の阻害を試験する実験結果を示すグラフである。図１のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料由来成分の抽出に使用した溶媒をｘ軸に示す。
【００１１】
【図２】図２は、図１の実験の反復の結果を示すグラフである。図２のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料由来成分の抽出に使用した溶媒をｘ軸に示す。
【００１２】
【図３】図３は、図１の実験の別の反復の結果を示すグラフである。図３のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料由来成分の抽出に使用した溶媒をｘ軸に示す。
【００１３】
【図４】図４は、図１の実験のさらに別の反復の結果を示すグラフである。図４のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料由来成分の抽出に使用した溶媒をｘ軸に示す。
【００１４】
【図５】図５は、種々の濃度における、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物による、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＸ−２の阻害を試験する実験結果を示すグラフである。図５のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に示す。
【００１５】
【図６】図６は、図５の実験の反復の結果を示すグラフである。図６のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に示す。
【００１６】
【図７】図７は、種々の濃度における、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物により生じる血清を含む培地中で培養されたＳＫ−Ｍｅｌ２８ヒトメラノーマ細胞の細胞増殖の抑制を試験する実験結果を示すグラフである。図７のグラフは、細胞増殖の抑制のパーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に示す。
【００１７】
【図８】図８は、ＳＫ−Ｍｅｌ２８ヒトメラノーマ細胞を血清を含まない培地にて培養したこと以外は、図７の実験と同様の実験の結果を示すグラフである。図８のグラフは、細胞増殖の抑制のパーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に示す。
【００１８】
【図９】図９は、１０μｇ／ｍｌの濃度における、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物のフラクションによる、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＸ−２の阻害を試験する実験結果を示すグラフであり、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、溶出時間（分）により特定されるフラクションをｘ軸に示す。
【００１９】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の図９におけるフラクション１および２に関係する液体クロマトグラフィー−質量分析と質量検出に基づく高速液体クロマトグラフィープロファイルである。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の図９におけるフラクション１および２に関係する液体クロマトグラフィー−質量分析と質量検出に基づく高速液体クロマトグラフィープロファイルである。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の図９におけるフラクション１および２に関係する液体クロマトグラフィー−質量分析と質量検出に基づく高速液体クロマトグラフィープロファイルである。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の図９におけるフラクション１および２に関係する液体クロマトグラフィー−質量分析と質量検出に基づく高速液体クロマトグラフィープロファイルである。
【００２０】
【図１１】図１１は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物により処理した３つの乳癌細胞系の細胞コロニー数を試験する実験結果の示すグラフである。図１１のグラフは、細胞系をｘ軸に、対照を１００％として標準化した細胞コロニー数パーセントをｙ軸に示す。
【００２１】
【図１２】図１２は、８ｍｇ／ｍｌの濃度で腹腔内投与したＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物による、ヌードマウスでの腫瘍増殖（ＭＣＦ−７細胞）の抑制を試験する実験結果を示すグラフである。図１２のグラフは、標準化した腫瘍体積をｙ軸に、ＭＣＦ−７細胞の注入後日数をｘ軸に示す。
【００２２】
【図１３】図１３は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＰＭＡにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１３のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（メタノール抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２３】
【図１４】図１４は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＴＮＦにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１４のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（メタノール抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２４】
【図１５】図１５は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＰＭＡにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１５のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（水抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２５】
【図１６】図１６は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＴＮＦにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１６のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（水抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２６】
【図１７】図１７は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＴＮＦにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１７のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（ヘキサン抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２７】
【図１８】図１８は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＰＭＡにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１８のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（ヘキサン抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２８】
【図１９】図１９は、図１４の反復実験、すなわち種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＴＮＦにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１９のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（メタノール抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２９】
【図２０】図２０は、図１３の反復実験、すなわち種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＰＭＡにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図２０のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（メタノール抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００３０】
【図２１】図２１は、８ｍｇ／ｍｌの濃度で腹腔内投与したＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物による、ヌードマウスでの腫瘍増殖（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）の抑制を試験する実験結果を示すグラフである。図２１のグラフは、標準化した腫瘍体積をｙ軸に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の注入後日数をｘ軸に示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書において、以下の用語は次に定義された意味を有する。
【００３２】
項目が「ａ」または「ａｎ」により導入される場合、１またはそれ以上の項目を意味すると解されるべきである。
【００３３】
「成分」は、単独の分子、化学物質、大分子、化合物、元素またはそれらの組み合わせの気体、液体または固体を意味する。
【００３４】
「成分ソリューション」は、液体、固体、または気体中に含有、懸濁、保持または分散させた１以上の成分の混合物を意味する。
【００３５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味するが、限定はされない。
【００３６】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味するが、限定はされない。
【００３７】
「状態」は、限定はされないが、不調のまたは正常に機能しない、身体の器官、部分、構造またはシステム、疾患、疾病、病気、病、身体的または精神的苦痛、身体的または精神的ストレス、身体的または精神的感覚、身体的または精神的苦悩、身体的または精神的痛みなどの特定の健康状態を意味する。状態は癌または炎症を含みうる。
【００３８】
「ＣＯＸ−２」はシクロオキシゲナーゼ−２を意味する。
【００３９】
「エクストレーター（抽出器）」は、溶媒または溶液を包含しうる少なくとも１つのフラスコ、材料を包含しうる少なくとも１つのチャンバー、およびチャンバーとフラスコに流体連結する少なくとも１つのコンデンサーを有する、装置、機械、器具、道具、またはその組み合わせを意味する。エクストラクターは、抽出プロセスのある時点で溶媒を回収することが可能な漏斗を有していてもよい。エクストラクターの連結にシンブルが使用されてもよい。エクストラクターの連結にフィルターが使用されてもよい。エクストラクターは、エクストラクターの完全性を低下させずに加熱に付すことが可能であってもよい。限定はされないが、エクストラクターとしては、Ｆｒａｎｚ ｖｏｎ Ｓｏｘｈｌｅｔにより１８７９年頃に発明されたソックスレー抽出器、および限定はされないが、Ｇｅｒｈａｒｄｔ ＧｍｂＨ製のＳｏｘｔｈｅｒｍＴＭ抽出器、ＦＯＳＳＴＭ製のオートマチックまたはセミオートマチック抽出器であるＳｏｘｔｅｃ ＳｙｓｔｅｍＴＭなどが挙げられる。
【００４０】
「グラインド（すりつぶし）」は、対象の細粉化、打撃による粉砕、切断、粉砕、すり下ろし、激しい研磨、削り、のこぎりでの切断、刈り落とし、溶解、またはそれらの組合せを意味する。
【００４１】
「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は含むことを意味するが、限定はされない。
【００４２】
「ＩＣ５０」は、化合物または処方について、ＣＯＸ−２の５０％阻害を生み出す化合物または処方の濃度を意味する。
【００４３】
「阻害」は、酵素の活性を少なくとも部分的に減少させることを意味する。
【００４４】
「材料（原料、ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、限定はされないが、皮、幹、葉、芽、茎、根、花、花粉、枝、若枝、果実、スリップ、野菜、種、またはそれらの組み合わせを意味する。
【００４５】
「非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）」は、求められる効果が全身性である患者への成分の投与経路のタイプである。限定はされないが、非経口としては、注射または注入（ここで、当該注射または注入は、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、皮下、骨内、皮内、腹膜内である）、経皮、経粘膜、吸入、またはその組み合わせにより、患者に成分を投与することが挙げられる。
【００４６】
「患者」は、ヒトまたはその他の如何なる哺乳類をも意味する。
【００４７】
「医薬として許容な賦形剤」は、患者へ成分を投与するのに伴う、担体、希釈剤、アジュバント、添加剤、またはそれらの組合せを意味する。医薬として許容な賦形剤としては、限定はされないが、ポリエチレングリコール；ワックス；ラクトース；グルコース；スクロース；ステアリン酸マグネシウム；ケイ素誘導体；硫酸カルシウム；リン酸ジカルシウム；デンプン；セルロース誘導体；ゼラチン；天然および合成ゴム、例えば、限定はされないが、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、およびワックス；好適なオイル；生理食塩水；糖溶液、限定はされないが、例えば、デキストロース水溶液またはグルコース水溶液；ＤＭＳＯ；グリコール、限定はされないが、例えば、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール；滑沢剤、限定はされないが、例えば、オレイン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、タルク、およびステアリン酸マグネシウム；崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、寒天、デンプン、およびキサンタンガム）；および吸収性担体、限定はされないが、例えば、ベントナイトおよびクロニンが挙げられうる。
【００４８】
「溶媒」は、溶液（ソリューション）を形成するために、１以上の成分を懸濁させる、取り出す、引き出す、分離する、または引き込む能力を有する、液体またはガスである。
【００４９】
「治療有効量」は、患者に投与した際に、状態の処置のための少なくとも部分的な効果に十分な成分量を意味する。治療有効量は、状態、成分の投与経路、および処置される患者の年齢、体重などに依存して変動しうる。
【００５０】
「処置（治療、ｔｒｅａｔ）」は、状態について、患者によって認識されなくても、状態の任意の症状を少なくとも部分的に抑制、低減、緩和すること、状態または状態の症状の発現を遅延させること、状態の任意の症状を少なくとも部分的に治癒させること、または状態若しくは状態の症状を少なくとも部分的に予防または阻害すること、またはその組み合わせを意味する。
【００５１】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．は、Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ Ｌｉｎｄｌｅｙ科の植物であり、限定はされないが、中央アメリカの熱帯地域およびカリブ海の島々などの中央アメリカに典型的には生育している。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の慣用名としては、限定はされないが、イエローモンビン、カジャフルーツ、ジョボ、およびイエロースパニッシュプラムが挙げられる。ＣＯＸ−２を阻害するＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、本明細書に記載した方法を使用して製造される。抽出方法には、少なくとも部分的にＣＯＸ−２を阻害するＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の成分を抽出するための溶媒の使用が含まれる。本明細書に記載した抽出物は患者における炎症の処置に使用されうる。あるいは、本明細書に記載した抽出物は、患者における癌の処置に使用されうる。ＣＯＸ−２の阻害は、ヒトにおいて炎症を低減させ、癌細胞のアポトーシスおよび増殖低減に貢献することは、当該技術分野における当業者によく理解されている。
【００５２】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、以下のように製造されうる。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、入手し、乾燥し、細かくしてもしてもよい。あるいは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、小片にしてその後乾燥してもよい。材料は、材料由来の液体の残留のほとんどを除去するために、限定はされないが、乾燥オーブンなどのオーブンにおいて、約４５℃、または４６〜６５℃の範囲の温度で乾燥させてもよい。乾燥材料は、抽出プロセスの次の段階の前に、約−２０℃で、または約４℃で、または−７０〜−８０℃で貯蔵してもよい。あるいは、抽出プロセスの次の段階を直ぐに始めてもよい。もちろん、その他の適当な乾燥温度を使用してもよい。
【００５３】
乾燥の前後いずれかにおいて、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、より小さい粒子サイズとなるように粉砕してもよい。約２０〜５０ミクロンの粒子サイズを得るために、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、例えば、Ｗｉｌｅｙミル回転粉砕機などの好適なグラインダーまたは粉砕機を使用して粉砕してもよい。さらに、分離および約２０〜５０ミクロンの粒子サイズを得るために、フィルターを使用してもよい。抽出プロセスの段階の後または間に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料を、実質的に気密性のプラスチックバッグまたはその他の容器内で、−２０℃、または約４℃または−７０〜−８０℃またはその他の好適な温度で貯蔵してもよい。
【００５４】
約１０〜１００グラムのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、エクストラクターを使用して抽出に付されうる。成分の極性または溶解性に基づいて、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料から種々の成分を抽出し分離するために、エクストラクターに関連して異なる極性の溶媒を使用してもよい。最初に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料を、濾紙から作成された「シンブル（ｔｈｉｍｂｌｅ）」の内側に配置してよい。シンブルは如何なる好適な透過性材料から作成されてもよい。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料を伴うシンブルは、エクストラクターに導入されうる。エクストラクターは、溶媒を含むフラスコとコンデンサーを有しうる。溶媒は加熱されてもよく、加熱により溶媒を蒸発させてもよい。熱せられた溶媒の蒸気はコンデンサーにたどり着き、そこで冷却され、チャンバー内およびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料上に滴下する。エクストラクター内で、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料を含むチャンバーは温められた溶媒でゆっくりと満たされる。その時、材料からの成分が材料から抽出され、溶媒により成分の溶液が形成する。チャンバーがほぼ満たされるとき、成分の溶液はサイフォン作用により空になり、フラスコに戻り落ちる。各サイクルの間に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料からの成分は溶媒に抽出され、成分の溶液が得られる。このサイクルは各溶媒を用いて多数回繰り返してもよい。抽出プロセスの間に、シンブル中のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料からの成分を抽出するために、きれいで温かい溶媒が使用されうる。
【００５５】
エクストラクターに関して使用されうる溶媒について、例えばヘキサン−１（「ヘキサン」）などの非極性溶媒または、限定はされないが例えば、ペンタン、シクロヘキサン、ヘプタン、トリクロロエチレン、四塩化炭素、ジイソプロピルエーテルまたはトルエンなどのその他の非極性溶媒が使用されうる。例えばエチルアセテート−２（「酢酸エチル」）などの中程度の極性溶媒、または特定はされないが例えば、キシレン、メチルブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ｎ−ブタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ブチルアセテート、クロロホルム、ｎ−プロパノール、またはメチルエチルケトンなどのその他の中程度の極性溶媒が使用されうる。メタノール−３（「メタノール」）などの極性溶媒、または例えば限定はされないが、アセトン、エタノール、アセトニトリル、酢酸、ジメチルホルムアミド、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのその他の極性溶媒が使用されうる。非極性溶媒、中程度の極性溶媒、または極性溶媒を用いての抽出は、４５℃、または限定はされないが約２６℃〜約６０℃などのその他の好適な温度において行われうる。比較的純粋な水（「水性溶媒」）が、約１２時間、または約４時間〜１２時間、またはその他の好適な時間、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料を浸漬することによる成分の抽出に使用されうる。当該材料は、極性溶媒、中程度の極性溶媒または非極性溶媒のいずれかを使用し、固体成分を濾別して成分溶液を得た後に残留する。あるいは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、抽出方法の間のいずれかの時点でまたはいずれかの溶媒による材料の処理から独立して、比較的純粋な水に浸漬させてもよい。対照として、抽出にさらす時間の効果を評価するために、定期的にサンプルを抜き出し分析してもよい。
【００５６】
上記プロセスの後に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の種々の成分を含む溶媒、成分溶液がエクストラクターのフラスコに存在する。ロータリーエバポレーター、またはその他の好適なエバポレーター、例えば限定はされないが、減圧乾燥機、減圧オーブン、窒素ガス、サーモフエル（ｔｈｅｒｍｏｆｕｅｌ）濃縮機、遠心分離およびスプレードライヤーなど、またはその他の好適な乾燥プロセスを使用しての成分溶液の乾燥により、液体は少なくとも部分的に除去されうる。この乾燥プロセスにより、成分溶液から実質的に全ての液体を除去してもよい。得られた抽出物は冷凍してもフリーズドライしてもよい。抽出物は少なくとも部分的に乾燥した粉末の形態で貯蔵してもよい。抽出物は、あらかじめ秤量されたシンチレーションバイアルに移してもよく、−２０℃で、または約４℃で冷蔵庫に、または−７０〜−８０℃で、またはその他の好適な温度で貯蔵してもよい。
【００５７】
ヘキサン、酢酸エチル、メタノールおよび水を使用した場合、上記方法の結果として４つのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物が得られ、各抽出物は使用された溶媒により抽出された成分を含む。これらの抽出物は、ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、メタノール抽出物、および水抽出物（集合的に、「４つの抽出物」）と称せられる。
【００５８】
実験結果
【００５９】
実験結果は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物がＣＯＸ−２を阻害するために使用されうることを示す。本明細書に記載された結果は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物がＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を抑制することを示す。本明細書に記載された結果はまた、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物がＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞、ヒトメラノーマ細胞系の増殖を抑制すること、およびヒト乳癌細胞系において細胞コロニー数を減少させることを示す。さらに、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、哺乳類脂肪体に移植されたＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞から生じる腫瘍を有するヌードマウスにおいて腫瘍容積の増殖抑制をもたらす。
【００６０】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物およびＣＯＸ−２阻害
【００６１】
ヒト組み換えＣＯＸ−２のペルオキシダーゼ活性をアッセイすることによる、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物が少なくとも部分的にＣＯＸ−２を阻害するかを確認するための実験が行われた（「ＣＯＸ−２阻害アッセイ」）。ＣＯＸ−２阻害アッセイは、４つの抽出物の各々において実施された。
【００６２】
ＣＯＸ−２阻害アッセイは水浴の使用により約３７℃で維持および実施された。要するに、反応バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍＭ フェノールを含有）中のヒト組み換えＣＯＸ−２、ヘム、およびアラキドン酸を４つの抽出物のそれぞれとともに２分間インキュベートした。酸化されたテトラメチル−ｐ−フェニルジアミンの出現により、比色分析的にペルオキシダーゼ活性の存在が示された。
【００６３】
ＣＯＸ−２阻害アッセイの準備において、乾燥抽出物をメタノール、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）、またはエタノールに溶解させ、その後反応バッファーで希釈した。抽出物の最終の濃度は９μｇ／ｍｌであった。２分間のインキュベーションの後、ＣＯＸ−２の活性を停止するために１Ｍ塩酸を加えた。ＣＯＸ−２阻害剤として知られるＤＵＰ−６７９を内部標準として使用し、予想通り約２００ｎＭのＩＣ５０でＣＯＸ−２を阻害した。ＣＯＸ−２の阻害パーセンテージは、抽出物を含む反応で定量されたＣＯＸ−２活性を、何らＣＯＸ−２阻害剤を含まない反応で定量されたＣＯＸ−２活性から差し引き、その結果を抽出物を含まない反応で定量されたＣＯＸ−２活性で割ることにより算出した。抽出物によるＣＯＸ−２の阻害パーセンテージは５％〜８３％の範囲であった。この結果により、メタノール抽出物がＣＯＸ−２の阻害において酢酸エチル抽出物、ヘキサン抽出物および水抽出物と比してこの濃度でより効果的でありうることが示された。酢酸エチル抽出物、ヘキサン抽出物または水抽出物が別の濃度でＣＯＸ−２阻害においてより効果的である可能性がある。ＣＯＸ−２阻害アッセイは同じ可変条件で少なくとも４回行った。上記ＣＯＸ−２阻害アッセイの結果を図１〜４に示す。ＣＯＸ−２の相対的阻害はＩＣ５０値の取得に関与しうる。
【００６４】
さらに、１．５６μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度においてＣＯＸ−２阻害アッセイでメタノール抽出物を使用した。２つの同一の実験結果を図５および図６に示す。メタノール抽出物は図５では８．９μｇ／ｍｌのＩＣ５０を示し、図６では９．０μｇ／ｍｌを示した。ＣＯＸ−２のより強い阻害は、メタノール抽出物のより高い濃度に相関しうる。
【００６５】
ヒト癌細胞の増殖におけるメタノール抽出物の効果を判断するためにさらなるアッセイを行った。ヒトメラノーマ細胞系、ＳＫ−Ｍｅｌ２８を２つの独立した実験に使用した。メタノール抽出物を１．６μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度でＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞に投与した。通常種々の増殖因子を含む血清はＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞増殖の阻害の妨げとなりうるので、メタノール抽出物をヒト増殖血清の存在下または非存在下にＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞に投与した。細胞増殖を示す比色変化を発生させるテトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩、または「ＭＴＳ」）を電子カップリング試薬（フェナジンエトスルフェート、または「ＰＥＳ」）と組み合わせて使用するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により細胞増殖を測定した。４９０ｎｍでの吸収を記録することにより、メタノール抽出物によるＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖の抑制を測定した。アッセイの結果を図７および８に示す。図７は、メタノール抽出物が１００μｇ／ｍｌで、血清が補充された増殖培地中でのヒトメラノーマ細胞系ＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖を約４０％抑制し、ＩＣ５０が１００μｇ／ｍｌ以上であることを示す。メタノール抽出物によるＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖抑制はまた、血清を含まない増殖培地中でのＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞についてもアッセイされており、その結果を図８に示す。図８に示すとおり、ＩＣ５０が７５μｇ／ｍｌであるメタノール抽出物によるＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞増殖の顕著な抑制が観察された。また、図７〜８には、ＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖をメタノール抽出物が濃度依存的に抑制したことを示す結果が説明されている。
【００６６】
ＣＯＸ−２の阻害の原因となるメタノール抽出物の成分を同定するために、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物をセミ分取カラムにおいて分画した。メタノール抽出物を、５０μｌのインジェクション量で、ＣＴＣ ＡｎａｌｙｔｉｃｓＴＭＰＡＬＴＭインジェクター（液体クロマトグラフィー自動インジェクター）を使用するＡｇｉｌｅｎｔＴＭＺｏｒｂａｘＴＭＸＤＢ Ｃ１８ ２１．２×１００ｍｍカラムにロードした。メタノール抽出物をＳｈｉｍａｄｚｕＴＭＬＣ−６ＴＭバイナリー高圧システムを使用して溶出した。第１の移動相は０．０５％のトリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）を含む水であり、第２の移動相は０．０５％のＴＦＡを含むメタノールであった。１５ｃｍの長さのリストリクションキャピラリーによる、３０μｍの内径（「ｉｄ」）で、約５００：１のスプリット比となる２つのＶａｌｃｏ Ｙフィッティングを有するカラム後の分割（ｐｏｓｔ−ｃｏｌｕｍｎ ｓｐｌｉｔ）を使用した。フラクションコレクターはＡｄｖａｎｔｅｃで、０．８分で画分を開始し、０．２０分ごとの回収ステップに基づく時間設定を用いた。もちろん、その他の可変事項は同じまたは類似の分画を行うために用いられ得る。異なる時間に溶出するフラクションを回収し、窒素下またはフリーズドライにより乾燥し、比較的純粋なフラクションを得ることができる。乾燥したフラクションは、当該技術分野で知られた方法にしたがって、限定はされないが、炎症または癌に関連する疾患などの、ＣＯＸ−２を阻害することにより処置されうる任意の疾患または病気を処置するための医薬に導入することができる。
【００６７】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物のフラクションによるＣＯＸ−２の阻害をＣＯＸ−２阻害アッセイにより試験した。ＣＯＸ−２阻害アッセイのための乾燥フラクションを調製するために、乾燥したフラクションを０．５％ＤＭＳＯの濃度となるように１００％ＤＭＳＯおよび水に懸濁させた。０．５％ＤＭＳＯのみの対照をＣＯＸ−２阻害アッセイに含めてもよい。フラクションを、限定はされないが例えば、１．５６〜１００μｇ／ｍｌの異なる濃度で試験した。１０μｇ／ｍｌでの、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．メタノール抽出物のフラクションを使用したＣＯＸ−２阻害アッセイの結果を図９に示す。図９は、ｘ軸に溶出時間（分）によるフラクションナンバーを示し（以後、溶出時間（分）は各フラクションの特定番号とする）、ｙ軸にヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージを示す。図９において確認されるように、それぞれ１分および２分で溶出したフラクション１および２は最大のＣＯＸ−２阻害を示し、フラクション８、９および１０もまた顕著なＣＯＸ−２阻害を示した。フラクション３、４、５、６、７、１１および１２はいくらかの阻害を示した。
【００６８】
最もＣＯＸ−２阻害を示したフラクション、特にフラクション１および２は、０．６ｍｌ／分の流速での水−アセトニトリルグラジエントによる溶出で、ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ１８逆相カラム（１００×２．１ｍｍ、５ｍｍ）での分析用液体クロマトグラフィー−質量分析（「ＬＣ−ＭＳ」）を使用して構造のプロファイリングを行った。図１０Ａ〜１０Ｄは、フラクション１および２の質量分析を示す。図１０Ａ〜１０Ｄに示されるとおり、フラクション１および２に存在しうる成分として、アナカルド酸誘導体またはジヒドロキシフェニルトリカルボン酸誘導体が挙げられる。
【００６９】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物およびＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイ
【００７０】
ＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイにより、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物が、ヒト胎児腎臓２９３細胞においてインビトロで炎症応答を抑制することが示された。ヒト胎児腎臓２９３細胞においてインビトロでの炎症応答を試験するための、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物によるＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイの結果は結論に至らなかった（ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｖｅ）。ＮＦ−ＫａｐｐａＢは転写因子である。ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化／発現は多くの初期炎症応答の１つであり、炎症の指標であることは、当該技術分野の当業者により理解されるであろう。ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化の阻害は、対応する炎症の阻害に関与しうる。よって、ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を阻害する抽出物は患者における炎症を処置しうる。図１３〜２０は、ＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化における、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物の効果を試験するためのＮＦ−ＫａｐｐａＢレポーター遺伝子アッセイの結果を示す。ヒト胎児腎臓２９３細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＮＦ−ＫａｐｐａＢ応答エレメントを含むＤＮＡプラスミドによりトランスフェクションした。ＮＦ−ＫａｐｐａＢが活性化した場合、ルシフェラーゼの発現が増加する。ルシフェラーゼの発現はルシフェラーゼが光を産出する酵素反応により測定される。高度の光はＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化の増加に対応する。ヒト胎児腎臓２９３細胞はプレートに播種し、活性炭処理済み培地中に一晩おいた。
【００７１】
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）およびＰＭＡ（ホルボールエステル）の両方がＮＦ−ＫａｐｐａＢの強力な活性化剤として知られている。ヒト胎児腎臓２９３細胞をＤＭＳＯのみおよび２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＭＡに接触させ、第２の実験でＤＭＳＯのみおよび５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＮＦに接触させ、上記処理群のそれぞれに、ＤＭＳＯに溶解させた、２０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌまたは０．２μｇ／ｍｌの用量範囲のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物およびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物を加え、一晩インキュベートした。ルシフェラーゼアッセイのために翌日、細胞を回収し、溶解させた。各処理後に残存するＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化パーセントを観測した。ＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化はＤＭＳＯおよび既知の活性化剤（ＴＮＦまたはＰＭＡ）を含む対照に対して１００％に標準化した。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物を使用したＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイの結果を図１３〜１４および図１９〜２０に記載する。図１３および２０は、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞におけるＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための２つの別々の実験の結果を示すグラフである。図１３に示すとおり、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌ処置群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約５３％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約７７％であり、およびの０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約６３％であった。図２０では、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌ処置群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約４４％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約５４％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約５３％であった。図１４および１９は、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞におけるＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための２つの別々の実験の結果を示すグラフである。図１４に示すとおり、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌ処置群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約７２％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約７１％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約１０１％であった。図１９では、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌ処理群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約８５％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約１０２％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約７９％であった。
【００７２】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物を使用したＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイの結果を図１５および１６に記載する。図１５は、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための実験の結果を示すグラフである。図１５に示されるとおり、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌ処置群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約６３％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞において約５０％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞において約７４％であった。図１６は、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための実験の結果を示すグラフである。ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌ処置群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約９４％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞において約７８％であり、および０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞において約１０３％であった。
【００７３】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物を使用したＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイの結果を図１７および１８に記載する。図１７は、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための実験の結果を示すグラフである。図１７に示すとおり、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌ処理群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性は約９９％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞において約８０％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞において約１０３％であった。図１８は、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための実験の結果を示すグラフである。図１８に示すとおり、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌ処理群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性は約２７％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞において約６８％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞において約８０％であった。
【００７４】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物および癌の増殖
【００７５】
インビトロ細胞培養アッセイにより、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物が癌細胞系における細胞コロニー形成の増殖を抑制することが示された。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物、およびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物を用いてのインビトロ細胞培養アッセイの結果は結論的ではなかった。図１１は、３つの乳癌細胞系：ＭＣＦ−７（エストロゲン受容体ポジティブヒト乳癌細胞系）、ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒトの転移性乳管癌サンプル由来のエストロゲン非依存性癌細胞系）、およびＭＤＡ−ＭＢ−３６１（脳転移組織由来のエストロゲン受容体ポジティブヒト乳癌細胞系）を使用した結果を示す。
【００７６】
ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１の細胞を、培養プレート上の血清を補填した培地に播種した。１０μｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解させたＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物に細胞を接触させた。７〜１０日の増殖アッセイを行った。５０細胞が１コロニーに対応するように、染色して手動で計測することにより細胞コロニー数をカウントして細胞の増殖を観察した。図１１のグラフにおける結果は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物への初期の暴露を生存し、目視可能なコロニーを形成するまでに増殖した細胞の数を示す。各細胞系のコロニーカウント（コロニー数）の生データを、処置群（１００％）の対照により標準化した。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物に接触させた各細胞系の標準化された細胞コロニーカウントを図１１に示し、各バーはＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物に接触させた特定の細胞系における２度のサンプルの平均である。図１１のグラフは、ｘ軸に細胞系を、ｙ軸に対照を１００％として標準化した細胞コロニーカウントを示す。図１１に示すとおり、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物は、他の細胞系と比較して最大の程度でＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖を阻害し、標準化した細胞コロニーカウントで１２．７％であり、ＭＣＦ−７の増殖は標準化した細胞コロニーカウントで約５７．２％であり、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１は標準化した細胞コロニーカウントで約８３％であった。
【００７７】
実験結果は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物は、インビボでの乳癌腫瘍増殖を抑制しうることを示している。雌のヌードマウス１０匹にＲｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１００μｌ、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＴＭ）および５×１０６ＭＣＦ−７細胞（エストロゲン受容体ポジティブヒト乳癌細胞）を乳房脂肪体に注射し、雌のヌードマウス１０匹にＲｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１００μｌ、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＴＭ）および５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を皮下背面部位に注射し、上記の全ては５０μｌリン酸バッファー生理食塩水（「ＰＢＳ」）に懸濁させた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射したマウスについては注射後約１０日で、ＭＣＦ−７細胞を注射したマウスについては注射後約１５日で腫瘍が形成し、その後、ヌードマウスを処置群に無作為に分けた。ヌードマウスの１群には、５０μｌのＤＭＳＯ：ＰＢＳ溶液に懸濁させたＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物（最終濃度が８ｍｇ／ｍｌ）を２０ｍｇ／ｋｇ／マウスで毎日腹腔内に注射した。ＤＭＳＯ：ＰＢＳ溶液に懸濁させる前に、乾燥した酢酸エチル抽出物を純エタノールに再懸濁させ、等分し、エタノールを蒸発させ、乾燥粉末が得られた。ヌードマウスの対照群は、１：５のＤＭＳＯ：ＰＢＳ溶液（「対照」）のみで処理した。ヌードマウスには、対照またはＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物のいずれかを投与した。腫瘍は一日おきに計測した。腫瘍容積は、腫瘍の短軸および長軸をキャリパーで計測し（ｍｍ）、４．１９×（長軸／２）×（短軸／２）２の式を用いることにより腫瘍容積を算出し、立方ミリメートル（ｍｍ３）の腫瘍容積を得た。腫瘍容積値は標準化した。
【００７８】
上記方法を使用する２度の実験結果を、ｙ軸にｍｍ３で標準化した腫瘍容積が表示され、ｘ軸にはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞またはＭＣＦ−７細胞の注射後日数が表示された図１２および図２１に示す。図１２に示された実験においてマウスにＭＣＦ−７細胞を乳房脂肪体に注射し、対照群として５匹のマウスを、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物を８ｍｇ／ｍｌの最終濃度で連続する１４日間のそれぞれで投与した群として５匹のマウスを用いた。腫瘍の計測を１日ごとに行い、注射後１５日で開始した。折れ線グラフ１０はＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物を投与した５匹のヌードマウスの結果を示し、折れ線グラフ１２は、対照を投与した５匹のヌードマウスの結果を示す。図２１に示された実験において、１０匹の雌ヌードマウスには、２カ所の皮下背面部位にＭＤＡ−ＭＢ−２３１を注射した。折れ線グラフ１４は最終濃度８ｍｇ／ｍｌでＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物を投与した５匹のヌードマウスの結果を示し、折れ線グラフ１６は、対照を投与した５匹のヌードマウスの結果を示し、それぞれは注射後１０日に開始した。図１２および２１に示されるとおり、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物は、対照と比較して腫瘍の増殖を抑制する。
【００７９】
腹腔内注射により状態を処置する成分が、患者へ非経口的な投与された場合に状態を処置しうることは、当該技術分野の当業者には理解される。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、乳癌の処置のために非経口的に患者に投与されうる。
【００８０】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、本明細書に記載した方法を使用して製造されうる。メタノール、または限定はされないが、極性、非極性、中程度の極性または水性溶媒などのいくつかの他の溶媒が、少なくとも部分的にＣＯＸ−２を阻害するＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の成分を抽出するために使用されうる。ＣＯＸ−２は一般的に炎症と呼ばれる免疫応答に寄与する酵素であるので、ＣＯＸ−２の阻害は炎症の抑制をもたらすことは、当該技術分野の当業者に理解される。ＣＯＸ−２の阻害が癌細胞のアポトーシスまたは癌細胞の増殖の抑制をもたらすこともまた、当該技術分野の当業者に理解される。よって、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は医薬に導入してもよく、および癌細胞の増殖を抑制するか、または癌細胞のアポトーシスを誘導するかのいずれかによる癌の処置が期待されうる。当該抽出物はまた、濃縮または乾燥し、医薬に導入されうる。あるいは、ＣＯＸ−２を阻害する特定のフラクションをさらに単離するために、当該抽出物を分画してもよい。限定を伴わない例として、フラクション１〜２およびフラクション８、９および１０は、その任意の組合せでまたは各々で、患者のＣＯＸ−２を少なくとも部分的に阻害する医薬に導入してもよい。
【００８１】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を含有する医薬は、炎症の処置または癌の処置のために、患者へ治療有効量で投与してもよい。医薬はＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を含有するように調製してもよく、当該技術分野の当業者により知られた手法により、患者に投与するために製剤化してもよい。
【００８２】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を含有する医薬は、化合物を混合し配合するために、当該技術分野の当業者に知られた慣用の手法により調製されうる。例えば、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物または酢酸エチル抽出物は、またはフラクション１〜２またはフラクション８、９および１０の単独または組み合わせなどのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物または酢酸エチル抽出物のフラクションは、治療有効量で、患者を処置するための抽出物の経口投与または腸内投与を容易にするために、医薬として許容される賦形剤の使用により、溶液、懸濁液、粉剤、カプセル、錠剤、または液剤に製剤化されうる。あるいは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物またはＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物の特定のフラクションは、非経口投与を容易にするために、医薬として許容される賦形剤に導入してもよい。別の態様において、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物またはＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物のフラクションの単独または組み合わせは、局所適用または経皮適用のために、医薬として許容な賦形剤を使用して、溶液、クリームまたはゲルに導入されうる。
【００８３】
上述の具体的な詳細事項はこの発明の特定の態様を記載するが、当該技術分野の当業者であれば、添付の特許請求の範囲に記載した発明の要点および範囲からはずれることなく、また均等論を考慮することなく、この発明の細部において種々の変更がなされうることを認識するであろう。したがって、この発明は、本明細書に示されたおよび記載された具体的な詳細事項に限定されないことが了解されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年８月１日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／９５３，３２２、および２００８年２月１８日に出願された米国特許出願Ｎｏ．１２／０３２，９８７の優先権を主張し、これらの出願の開示は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願は概して、炎症および癌の処置のための植物抽出物に関する。
【背景技術】
【０００３】
関節リュウマチは慢性炎症性疾患であり、複数の組織に影響を及ぼすが、典型的には関節において最も顕著な症状を生じさせる。当該疾患は進行性であり、変形性であり、最終的には衰弱性である。関節での慢性炎症により、軟組織、滑膜および軟骨の破壊、ならびに骨の関節面の浸食が引き起こされる。当該疾患には、米国、欧州および日本において３２０万人以上の人々が罹患しているものと算定されている。当該疾患は女性に多く、疾患者の過半数を占めると見積もられている。
【０００４】
炎症は、外部の物質やけがに対して生体を防御するための自然防御であるが、特定の疾患において問題を生じさせる場合がある。不適切な炎症は、グルココルチコイドであるコルチゾールのような従来のステロイド、組み換えＤＮＡ技術により製造される治療用タンパク質、および／または非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）により処置されうる。
【０００５】
プロスタグランジンは、生体の細胞により生産され、疼痛、炎症および発熱の促進を含む多くの主要な機能に関与している。さらに、いくつかのプロスタグランジンは、血液凝固に必要な血小板の機能をサポートし、酸のダメージ効果から胃の内面を保護している。プロスタグランジンは酵素シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）により生体の細胞内で生産される。
【０００６】
ＣＯＸ−２は、限定はされないが例えば疼痛を含む多くの機能に関与する酵素である。ＣＯＸ−２は具体的には、炎症に応答する生体領域に特異的に存在するが、胃には存在しない。ＣＯＸ−２は我々の生体内で、理想的には限られた理由により活性となるが、食習慣、ストレスおよび怪我などの要因によりＣＯＸ−２活性は増加しうる。継続的な理由によりＣＯＸ−２が活性であるとき、継続的な疼痛が生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
具体的な作用機作は完全には理解されていないが、ＣＯＸ−２の阻害が癌細胞のアポトーシスを生じさせることが見出されている。Ｊｏｈｎｓｅｎら、「Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ Ｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ， ａｎｄ Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；６４巻、７２１０〜７２１５頁（２００４年１０月１５日）；およびＬａｕら、「Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｐ５３／ｈｄｍ２ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６巻、１９２０−１９３１頁（２００７年）を参照されたい。
【０００８】
したがって、ＣＯＸ−２を阻害する植物抽出物は、限定はされないが例えば炎症、関節炎、筋肉痛および癌などの種々の疾患を処置しうる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＣＯＸ−２を阻害する方法、ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を阻害する方法、炎症の処置方法、または癌の処置方法は、患者への、治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．（スポンディアス モンビンＬ．）の抽出物の投与を含みうる。本明細書に記載する医薬は、医薬として許容な賦形剤、および賦形剤中に懸濁させた治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を含んでいてもよい。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物の製造方法は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．材料をエクストラクターおよび溶媒で処理することにより成分溶液（成分ソリューション、ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を作ること、および成分溶液から少なくとも一部の液体を除去することにより抽出物を製造することを含みうる。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、種々の溶媒を使用して抽出される成分を含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、９μｇ／ｍｌの濃度における、４つの異なる溶媒を使用して抽出したＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物による、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＸ−２の阻害を試験する実験結果を示すグラフである。図１のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料由来成分の抽出に使用した溶媒をｘ軸に示す。
【００１１】
【図２】図２は、図１の実験の反復の結果を示すグラフである。図２のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料由来成分の抽出に使用した溶媒をｘ軸に示す。
【００１２】
【図３】図３は、図１の実験の別の反復の結果を示すグラフである。図３のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料由来成分の抽出に使用した溶媒をｘ軸に示す。
【００１３】
【図４】図４は、図１の実験のさらに別の反復の結果を示すグラフである。図４のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料由来成分の抽出に使用した溶媒をｘ軸に示す。
【００１４】
【図５】図５は、種々の濃度における、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物による、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＸ−２の阻害を試験する実験結果を示すグラフである。図５のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に示す。
【００１５】
【図６】図６は、図５の実験の反復の結果を示すグラフである。図６のグラフは、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に示す。
【００１６】
【図７】図７は、種々の濃度における、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物により生じる血清を含む培地中で培養されたＳＫ−Ｍｅｌ２８ヒトメラノーマ細胞の細胞増殖の抑制を試験する実験結果を示すグラフである。図７のグラフは、細胞増殖の抑制のパーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に示す。
【００１７】
【図８】図８は、ＳＫ−Ｍｅｌ２８ヒトメラノーマ細胞を血清を含まない培地にて培養したこと以外は、図７の実験と同様の実験の結果を示すグラフである。図８のグラフは、細胞増殖の抑制のパーセンテージをｙ軸に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に示す。
【００１８】
【図９】図９は、１０μｇ／ｍｌの濃度における、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物のフラクションによる、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＸ−２の阻害を試験する実験結果を示すグラフであり、ヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージをｙ軸に、溶出時間（分）により特定されるフラクションをｘ軸に示す。
【００１９】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の図９におけるフラクション１および２に関係する液体クロマトグラフィー−質量分析と質量検出に基づく高速液体クロマトグラフィープロファイルである。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の図９におけるフラクション１および２に関係する液体クロマトグラフィー−質量分析と質量検出に基づく高速液体クロマトグラフィープロファイルである。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の図９におけるフラクション１および２に関係する液体クロマトグラフィー−質量分析と質量検出に基づく高速液体クロマトグラフィープロファイルである。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物の図９におけるフラクション１および２に関係する液体クロマトグラフィー−質量分析と質量検出に基づく高速液体クロマトグラフィープロファイルである。
【００２０】
【図１１】図１１は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物により処理した３つの乳癌細胞系の細胞コロニー数を試験する実験結果の示すグラフである。図１１のグラフは、細胞系をｘ軸に、対照を１００％として標準化した細胞コロニー数パーセントをｙ軸に示す。
【００２１】
【図１２】図１２は、８ｍｇ／ｍｌの濃度で腹腔内投与したＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物による、ヌードマウスでの腫瘍増殖（ＭＣＦ−７細胞）の抑制を試験する実験結果を示すグラフである。図１２のグラフは、標準化した腫瘍体積をｙ軸に、ＭＣＦ−７細胞の注入後日数をｘ軸に示す。
【００２２】
【図１３】図１３は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＰＭＡにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１３のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（メタノール抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２３】
【図１４】図１４は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＴＮＦにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１４のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（メタノール抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２４】
【図１５】図１５は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＰＭＡにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１５のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（水抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２５】
【図１６】図１６は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＴＮＦにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１６のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（水抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２６】
【図１７】図１７は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＴＮＦにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１７のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（ヘキサン抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２７】
【図１８】図１８は、種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＰＭＡにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１８のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（ヘキサン抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２８】
【図１９】図１９は、図１４の反復実験、すなわち種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＴＮＦにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図１９のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（メタノール抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００２９】
【図２０】図２０は、図１３の反復実験、すなわち種々の濃度のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、および既知のＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化剤、すなわちＰＭＡにさらしたヒト胎児腎臓２９３細胞でのＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験する実験結果を示すグラフである。図２０のグラフは、処置群をｘ軸とし、対照（メタノール抽出物を加えない）を１００％に標準化したＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を示す。
【００３０】
【図２１】図２１は、８ｍｇ／ｍｌの濃度で腹腔内投与したＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物による、ヌードマウスでの腫瘍増殖（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）の抑制を試験する実験結果を示すグラフである。図２１のグラフは、標準化した腫瘍体積をｙ軸に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の注入後日数をｘ軸に示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書において、以下の用語は次に定義された意味を有する。
【００３２】
項目が「ａ」または「ａｎ」により導入される場合、１またはそれ以上の項目を意味すると解されるべきである。
【００３３】
「成分」は、単独の分子、化学物質、大分子、化合物、元素またはそれらの組み合わせの気体、液体または固体を意味する。
【００３４】
「成分ソリューション」は、液体、固体、または気体中に含有、懸濁、保持または分散させた１以上の成分の混合物を意味する。
【００３５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味するが、限定はされない。
【００３６】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味するが、限定はされない。
【００３７】
「状態」は、限定はされないが、不調のまたは正常に機能しない、身体の器官、部分、構造またはシステム、疾患、疾病、病気、病、身体的または精神的苦痛、身体的または精神的ストレス、身体的または精神的感覚、身体的または精神的苦悩、身体的または精神的痛みなどの特定の健康状態を意味する。状態は癌または炎症を含みうる。
【００３８】
「ＣＯＸ−２」はシクロオキシゲナーゼ−２を意味する。
【００３９】
「エクストレーター（抽出器）」は、溶媒または溶液を包含しうる少なくとも１つのフラスコ、材料を包含しうる少なくとも１つのチャンバー、およびチャンバーとフラスコに流体連結する少なくとも１つのコンデンサーを有する、装置、機械、器具、道具、またはその組み合わせを意味する。エクストラクターは、抽出プロセスのある時点で溶媒を回収することが可能な漏斗を有していてもよい。エクストラクターの連結にシンブルが使用されてもよい。エクストラクターの連結にフィルターが使用されてもよい。エクストラクターは、エクストラクターの完全性を低下させずに加熱に付すことが可能であってもよい。限定はされないが、エクストラクターとしては、Ｆｒａｎｚ ｖｏｎ Ｓｏｘｈｌｅｔにより１８７９年頃に発明されたソックスレー抽出器、および限定はされないが、Ｇｅｒｈａｒｄｔ ＧｍｂＨ製のＳｏｘｔｈｅｒｍＴＭ抽出器、ＦＯＳＳＴＭ製のオートマチックまたはセミオートマチック抽出器であるＳｏｘｔｅｃ ＳｙｓｔｅｍＴＭなどが挙げられる。
【００４０】
「グラインド（すりつぶし）」は、対象の細粉化、打撃による粉砕、切断、粉砕、すり下ろし、激しい研磨、削り、のこぎりでの切断、刈り落とし、溶解、またはそれらの組合せを意味する。
【００４１】
「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は含むことを意味するが、限定はされない。
【００４２】
「ＩＣ５０」は、化合物または処方について、ＣＯＸ−２の５０％阻害を生み出す化合物または処方の濃度を意味する。
【００４３】
「阻害」は、酵素の活性を少なくとも部分的に減少させることを意味する。
【００４４】
「材料（原料、ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、限定はされないが、皮、幹、葉、芽、茎、根、花、花粉、枝、若枝、果実、スリップ、野菜、種、またはそれらの組み合わせを意味する。
【００４５】
「非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）」は、求められる効果が全身性である患者への成分の投与経路のタイプである。限定はされないが、非経口としては、注射または注入（ここで、当該注射または注入は、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、皮下、骨内、皮内、腹膜内である）、経皮、経粘膜、吸入、またはその組み合わせにより、患者に成分を投与することが挙げられる。
【００４６】
「患者」は、ヒトまたはその他の如何なる哺乳類をも意味する。
【００４７】
「医薬として許容な賦形剤」は、患者へ成分を投与するのに伴う、担体、希釈剤、アジュバント、添加剤、またはそれらの組合せを意味する。医薬として許容な賦形剤としては、限定はされないが、ポリエチレングリコール；ワックス；ラクトース；グルコース；スクロース；ステアリン酸マグネシウム；ケイ素誘導体；硫酸カルシウム；リン酸ジカルシウム；デンプン；セルロース誘導体；ゼラチン；天然および合成ゴム、例えば、限定はされないが、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、およびワックス；好適なオイル；生理食塩水；糖溶液、限定はされないが、例えば、デキストロース水溶液またはグルコース水溶液；ＤＭＳＯ；グリコール、限定はされないが、例えば、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール；滑沢剤、限定はされないが、例えば、オレイン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、タルク、およびステアリン酸マグネシウム；崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、寒天、デンプン、およびキサンタンガム）；および吸収性担体、限定はされないが、例えば、ベントナイトおよびクロニンが挙げられうる。
【００４８】
「溶媒」は、溶液（ソリューション）を形成するために、１以上の成分を懸濁させる、取り出す、引き出す、分離する、または引き込む能力を有する、液体またはガスである。
【００４９】
「治療有効量」は、患者に投与した際に、状態の処置のための少なくとも部分的な効果に十分な成分量を意味する。治療有効量は、状態、成分の投与経路、および処置される患者の年齢、体重などに依存して変動しうる。
【００５０】
「処置（治療、ｔｒｅａｔ）」は、状態について、患者によって認識されなくても、状態の任意の症状を少なくとも部分的に抑制、低減、緩和すること、状態または状態の症状の発現を遅延させること、状態の任意の症状を少なくとも部分的に治癒させること、または状態若しくは状態の症状を少なくとも部分的に予防または阻害すること、またはその組み合わせを意味する。
【００５１】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．は、Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ Ｌｉｎｄｌｅｙ科の植物であり、限定はされないが、中央アメリカの熱帯地域およびカリブ海の島々などの中央アメリカに典型的には生育している。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の慣用名としては、限定はされないが、イエローモンビン、カジャフルーツ、ジョボ、およびイエロースパニッシュプラムが挙げられる。ＣＯＸ−２を阻害するＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、本明細書に記載した方法を使用して製造される。抽出方法には、少なくとも部分的にＣＯＸ−２を阻害するＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の成分を抽出するための溶媒の使用が含まれる。本明細書に記載した抽出物は患者における炎症の処置に使用されうる。あるいは、本明細書に記載した抽出物は、患者における癌の処置に使用されうる。ＣＯＸ−２の阻害は、ヒトにおいて炎症を低減させ、癌細胞のアポトーシスおよび増殖低減に貢献することは、当該技術分野における当業者によく理解されている。
【００５２】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、以下のように製造されうる。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、入手し、乾燥し、細かくしてもしてもよい。あるいは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、小片にしてその後乾燥してもよい。材料は、材料由来の液体の残留のほとんどを除去するために、限定はされないが、乾燥オーブンなどのオーブンにおいて、約４５℃、または４６〜６５℃の範囲の温度で乾燥させてもよい。乾燥材料は、抽出プロセスの次の段階の前に、約−２０℃で、または約４℃で、または−７０〜−８０℃で貯蔵してもよい。あるいは、抽出プロセスの次の段階を直ぐに始めてもよい。もちろん、その他の適当な乾燥温度を使用してもよい。
【００５３】
乾燥の前後いずれかにおいて、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、より小さい粒子サイズとなるように粉砕してもよい。約２０〜５０ミクロンの粒子サイズを得るために、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、例えば、Ｗｉｌｅｙミル回転粉砕機などの好適なグラインダーまたは粉砕機を使用して粉砕してもよい。さらに、分離および約２０〜５０ミクロンの粒子サイズを得るために、フィルターを使用してもよい。抽出プロセスの段階の後または間に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料を、実質的に気密性のプラスチックバッグまたはその他の容器内で、−２０℃、または約４℃または−７０〜−８０℃またはその他の好適な温度で貯蔵してもよい。
【００５４】
約１０〜１００グラムのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、エクストラクターを使用して抽出に付されうる。成分の極性または溶解性に基づいて、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料から種々の成分を抽出し分離するために、エクストラクターに関連して異なる極性の溶媒を使用してもよい。最初に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料を、濾紙から作成された「シンブル（ｔｈｉｍｂｌｅ）」の内側に配置してよい。シンブルは如何なる好適な透過性材料から作成されてもよい。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料を伴うシンブルは、エクストラクターに導入されうる。エクストラクターは、溶媒を含むフラスコとコンデンサーを有しうる。溶媒は加熱されてもよく、加熱により溶媒を蒸発させてもよい。熱せられた溶媒の蒸気はコンデンサーにたどり着き、そこで冷却され、チャンバー内およびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料上に滴下する。エクストラクター内で、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料を含むチャンバーは温められた溶媒でゆっくりと満たされる。その時、材料からの成分が材料から抽出され、溶媒により成分の溶液が形成する。チャンバーがほぼ満たされるとき、成分の溶液はサイフォン作用により空になり、フラスコに戻り落ちる。各サイクルの間に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料からの成分は溶媒に抽出され、成分の溶液が得られる。このサイクルは各溶媒を用いて多数回繰り返してもよい。抽出プロセスの間に、シンブル中のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料からの成分を抽出するために、きれいで温かい溶媒が使用されうる。
【００５５】
エクストラクターに関して使用されうる溶媒について、例えばヘキサン−１（「ヘキサン」）などの非極性溶媒または、限定はされないが例えば、ペンタン、シクロヘキサン、ヘプタン、トリクロロエチレン、四塩化炭素、ジイソプロピルエーテルまたはトルエンなどのその他の非極性溶媒が使用されうる。例えばエチルアセテート−２（「酢酸エチル」）などの中程度の極性溶媒、または特定はされないが例えば、キシレン、メチルブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ｎ−ブタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ブチルアセテート、クロロホルム、ｎ−プロパノール、またはメチルエチルケトンなどのその他の中程度の極性溶媒が使用されうる。メタノール−３（「メタノール」）などの極性溶媒、または例えば限定はされないが、アセトン、エタノール、アセトニトリル、酢酸、ジメチルホルムアミド、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのその他の極性溶媒が使用されうる。非極性溶媒、中程度の極性溶媒、または極性溶媒を用いての抽出は、４５℃、または限定はされないが約２６℃〜約６０℃などのその他の好適な温度において行われうる。比較的純粋な水（「水性溶媒」）が、約１２時間、または約４時間〜１２時間、またはその他の好適な時間、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料を浸漬することによる成分の抽出に使用されうる。当該材料は、極性溶媒、中程度の極性溶媒または非極性溶媒のいずれかを使用し、固体成分を濾別して成分溶液を得た後に残留する。あるいは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の材料は、抽出方法の間のいずれかの時点でまたはいずれかの溶媒による材料の処理から独立して、比較的純粋な水に浸漬させてもよい。対照として、抽出にさらす時間の効果を評価するために、定期的にサンプルを抜き出し分析してもよい。
【００５６】
上記プロセスの後に、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の種々の成分を含む溶媒、成分溶液がエクストラクターのフラスコに存在する。ロータリーエバポレーター、またはその他の好適なエバポレーター、例えば限定はされないが、減圧乾燥機、減圧オーブン、窒素ガス、サーモフエル（ｔｈｅｒｍｏｆｕｅｌ）濃縮機、遠心分離およびスプレードライヤーなど、またはその他の好適な乾燥プロセスを使用しての成分溶液の乾燥により、液体は少なくとも部分的に除去されうる。この乾燥プロセスにより、成分溶液から実質的に全ての液体を除去してもよい。得られた抽出物は冷凍してもフリーズドライしてもよい。抽出物は少なくとも部分的に乾燥した粉末の形態で貯蔵してもよい。抽出物は、あらかじめ秤量されたシンチレーションバイアルに移してもよく、−２０℃で、または約４℃で冷蔵庫に、または−７０〜−８０℃で、またはその他の好適な温度で貯蔵してもよい。
【００５７】
ヘキサン、酢酸エチル、メタノールおよび水を使用した場合、上記方法の結果として４つのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物が得られ、各抽出物は使用された溶媒により抽出された成分を含む。これらの抽出物は、ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、メタノール抽出物、および水抽出物（集合的に、「４つの抽出物」）と称せられる。
【００５８】
実験結果
【００５９】
実験結果は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物がＣＯＸ−２を阻害するために使用されうることを示す。本明細書に記載された結果は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物がＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を抑制することを示す。本明細書に記載された結果はまた、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物がＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞、ヒトメラノーマ細胞系の増殖を抑制すること、およびヒト乳癌細胞系において細胞コロニー数を減少させることを示す。さらに、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、哺乳類脂肪体に移植されたＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞から生じる腫瘍を有するヌードマウスにおいて腫瘍容積の増殖抑制をもたらす。
【００６０】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物およびＣＯＸ−２阻害
【００６１】
ヒト組み換えＣＯＸ−２のペルオキシダーゼ活性をアッセイすることによる、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物が少なくとも部分的にＣＯＸ−２を阻害するかを確認するための実験が行われた（「ＣＯＸ−２阻害アッセイ」）。ＣＯＸ−２阻害アッセイは、４つの抽出物の各々において実施された。
【００６２】
ＣＯＸ−２阻害アッセイは水浴の使用により約３７℃で維持および実施された。要するに、反応バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍＭ フェノールを含有）中のヒト組み換えＣＯＸ−２、ヘム、およびアラキドン酸を４つの抽出物のそれぞれとともに２分間インキュベートした。酸化されたテトラメチル−ｐ−フェニルジアミンの出現により、比色分析的にペルオキシダーゼ活性の存在が示された。
【００６３】
ＣＯＸ−２阻害アッセイの準備において、乾燥抽出物をメタノール、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）、またはエタノールに溶解させ、その後反応バッファーで希釈した。抽出物の最終の濃度は９μｇ／ｍｌであった。２分間のインキュベーションの後、ＣＯＸ−２の活性を停止するために１Ｍ塩酸を加えた。ＣＯＸ−２阻害剤として知られるＤＵＰ−６７９を内部標準として使用し、予想通り約２００ｎＭのＩＣ５０でＣＯＸ−２を阻害した。ＣＯＸ−２の阻害パーセンテージは、抽出物を含む反応で定量されたＣＯＸ−２活性を、何らＣＯＸ−２阻害剤を含まない反応で定量されたＣＯＸ−２活性から差し引き、その結果を抽出物を含まない反応で定量されたＣＯＸ−２活性で割ることにより算出した。抽出物によるＣＯＸ−２の阻害パーセンテージは５％〜８３％の範囲であった。この結果により、メタノール抽出物がＣＯＸ−２の阻害において酢酸エチル抽出物、ヘキサン抽出物および水抽出物と比してこの濃度でより効果的でありうることが示された。酢酸エチル抽出物、ヘキサン抽出物または水抽出物が別の濃度でＣＯＸ−２阻害においてより効果的である可能性がある。ＣＯＸ−２阻害アッセイは同じ可変条件で少なくとも４回行った。上記ＣＯＸ−２阻害アッセイの結果を図１〜４に示す。ＣＯＸ−２の相対的阻害はＩＣ５０値の取得に関与しうる。
【００６４】
さらに、１．５６μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度においてＣＯＸ−２阻害アッセイでメタノール抽出物を使用した。２つの同一の実験結果を図５および図６に示す。メタノール抽出物は図５では８．９μｇ／ｍｌのＩＣ５０を示し、図６では９．０μｇ／ｍｌを示した。ＣＯＸ−２のより強い阻害は、メタノール抽出物のより高い濃度に相関しうる。
【００６５】
ヒト癌細胞の増殖におけるメタノール抽出物の効果を判断するためにさらなるアッセイを行った。ヒトメラノーマ細胞系、ＳＫ−Ｍｅｌ２８を２つの独立した実験に使用した。メタノール抽出物を１．６μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度でＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞に投与した。通常種々の増殖因子を含む血清はＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞増殖の阻害の妨げとなりうるので、メタノール抽出物をヒト増殖血清の存在下または非存在下にＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞に投与した。細胞増殖を示す比色変化を発生させるテトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩、または「ＭＴＳ」）を電子カップリング試薬（フェナジンエトスルフェート、または「ＰＥＳ」）と組み合わせて使用するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により細胞増殖を測定した。４９０ｎｍでの吸収を記録することにより、メタノール抽出物によるＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖の抑制を測定した。アッセイの結果を図７および８に示す。図７は、メタノール抽出物が１００μｇ／ｍｌで、血清が補充された増殖培地中でのヒトメラノーマ細胞系ＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖を約４０％抑制し、ＩＣ５０が１００μｇ／ｍｌ以上であることを示す。メタノール抽出物によるＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖抑制はまた、血清を含まない増殖培地中でのＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞についてもアッセイされており、その結果を図８に示す。図８に示すとおり、ＩＣ５０が７５μｇ／ｍｌであるメタノール抽出物によるＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞増殖の顕著な抑制が観察された。また、図７〜８には、ＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖をメタノール抽出物が濃度依存的に抑制したことを示す結果が説明されている。
【００６６】
ＣＯＸ−２の阻害の原因となるメタノール抽出物の成分を同定するために、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物をセミ分取カラムにおいて分画した。メタノール抽出物を、５０μｌのインジェクション量で、ＣＴＣ ＡｎａｌｙｔｉｃｓＴＭＰＡＬＴＭインジェクター（液体クロマトグラフィー自動インジェクター）を使用するＡｇｉｌｅｎｔＴＭＺｏｒｂａｘＴＭＸＤＢ Ｃ１８ ２１．２×１００ｍｍカラムにロードした。メタノール抽出物をＳｈｉｍａｄｚｕＴＭＬＣ−６ＴＭバイナリー高圧システムを使用して溶出した。第１の移動相は０．０５％のトリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）を含む水であり、第２の移動相は０．０５％のＴＦＡを含むメタノールであった。１５ｃｍの長さのリストリクションキャピラリーによる、３０μｍの内径（「ｉｄ」）で、約５００：１のスプリット比となる２つのＶａｌｃｏ Ｙフィッティングを有するカラム後の分割（ｐｏｓｔ−ｃｏｌｕｍｎ ｓｐｌｉｔ）を使用した。フラクションコレクターはＡｄｖａｎｔｅｃで、０．８分で画分を開始し、０．２０分ごとの回収ステップに基づく時間設定を用いた。もちろん、その他の可変事項は同じまたは類似の分画を行うために用いられ得る。異なる時間に溶出するフラクションを回収し、窒素下またはフリーズドライにより乾燥し、比較的純粋なフラクションを得ることができる。乾燥したフラクションは、当該技術分野で知られた方法にしたがって、限定はされないが、炎症または癌に関連する疾患などの、ＣＯＸ−２を阻害することにより処置されうる任意の疾患または病気を処置するための医薬に導入することができる。
【００６７】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物のフラクションによるＣＯＸ−２の阻害をＣＯＸ−２阻害アッセイにより試験した。ＣＯＸ−２阻害アッセイのための乾燥フラクションを調製するために、乾燥したフラクションを０．５％ＤＭＳＯの濃度となるように１００％ＤＭＳＯおよび水に懸濁させた。０．５％ＤＭＳＯのみの対照をＣＯＸ−２阻害アッセイに含めてもよい。フラクションを、限定はされないが例えば、１．５６〜１００μｇ／ｍｌの異なる濃度で試験した。１０μｇ／ｍｌでの、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．メタノール抽出物のフラクションを使用したＣＯＸ−２阻害アッセイの結果を図９に示す。図９は、ｘ軸に溶出時間（分）によるフラクションナンバーを示し（以後、溶出時間（分）は各フラクションの特定番号とする）、ｙ軸にヒト組み換えＣＯＸ−２の阻害パーセンテージを示す。図９において確認されるように、それぞれ１分および２分で溶出したフラクション１および２は最大のＣＯＸ−２阻害を示し、フラクション８、９および１０もまた顕著なＣＯＸ−２阻害を示した。フラクション３、４、５、６、７、１１および１２はいくらかの阻害を示した。
【００６８】
最もＣＯＸ−２阻害を示したフラクション、特にフラクション１および２は、０．６ｍｌ／分の流速での水−アセトニトリルグラジエントによる溶出で、ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ１８逆相カラム（１００×２．１ｍｍ、５ｍｍ）での分析用液体クロマトグラフィー−質量分析（「ＬＣ−ＭＳ」）を使用して構造のプロファイリングを行った。図１０Ａ〜１０Ｄは、フラクション１および２の質量分析を示す。図１０Ａ〜１０Ｄに示されるとおり、フラクション１および２に存在しうる成分として、アナカルド酸誘導体またはジヒドロキシフェニルトリカルボン酸誘導体が挙げられる。
【００６９】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物およびＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイ
【００７０】
ＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイにより、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物が、ヒト胎児腎臓２９３細胞においてインビトロで炎症応答を抑制することが示された。ヒト胎児腎臓２９３細胞においてインビトロでの炎症応答を試験するための、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物によるＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイの結果は結論に至らなかった（ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｖｅ）。ＮＦ−ＫａｐｐａＢは転写因子である。ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化／発現は多くの初期炎症応答の１つであり、炎症の指標であることは、当該技術分野の当業者により理解されるであろう。ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化の阻害は、対応する炎症の阻害に関与しうる。よって、ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を阻害する抽出物は患者における炎症を処置しうる。図１３〜２０は、ＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化における、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物の効果を試験するためのＮＦ−ＫａｐｐａＢレポーター遺伝子アッセイの結果を示す。ヒト胎児腎臓２９３細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＮＦ−ＫａｐｐａＢ応答エレメントを含むＤＮＡプラスミドによりトランスフェクションした。ＮＦ−ＫａｐｐａＢが活性化した場合、ルシフェラーゼの発現が増加する。ルシフェラーゼの発現はルシフェラーゼが光を産出する酵素反応により測定される。高度の光はＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化の増加に対応する。ヒト胎児腎臓２９３細胞はプレートに播種し、活性炭処理済み培地中に一晩おいた。
【００７１】
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）およびＰＭＡ（ホルボールエステル）の両方がＮＦ−ＫａｐｐａＢの強力な活性化剤として知られている。ヒト胎児腎臓２９３細胞をＤＭＳＯのみおよび２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＭＡに接触させ、第２の実験でＤＭＳＯのみおよび５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＮＦに接触させ、上記処理群のそれぞれに、ＤＭＳＯに溶解させた、２０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌまたは０．２μｇ／ｍｌの用量範囲のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物およびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物を加え、一晩インキュベートした。ルシフェラーゼアッセイのために翌日、細胞を回収し、溶解させた。各処理後に残存するＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化パーセントを観測した。ＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化はＤＭＳＯおよび既知の活性化剤（ＴＮＦまたはＰＭＡ）を含む対照に対して１００％に標準化した。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物を使用したＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイの結果を図１３〜１４および図１９〜２０に記載する。図１３および２０は、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞におけるＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための２つの別々の実験の結果を示すグラフである。図１３に示すとおり、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌ処置群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約５３％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約７７％であり、およびの０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約６３％であった。図２０では、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌ処置群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約４４％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約５４％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約５３％であった。図１４および１９は、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞におけるＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための２つの別々の実験の結果を示すグラフである。図１４に示すとおり、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌ処置群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約７２％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約７１％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約１０１％であった。図１９では、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌ処理群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約８５％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約１０２％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物で処理した細胞において約７９％であった。
【００７２】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物を使用したＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイの結果を図１５および１６に記載する。図１５は、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための実験の結果を示すグラフである。図１５に示されるとおり、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌ処置群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約６３％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞において約５０％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞において約７４％であった。図１６は、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための実験の結果を示すグラフである。ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌ処置群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢの活性化は約９４％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞において約７８％であり、および０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物で処理した細胞において約１０３％であった。
【００７３】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物を使用したＮＦ−ＫａｐｐａＢアッセイの結果を図１７および１８に記載する。図１７は、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための実験の結果を示すグラフである。図１７に示すとおり、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌ処理群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性は約９９％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞において約８０％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞において約１０３％であった。図１８は、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌおよびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化を試験するための実験の結果を示すグラフである。図１８に示すとおり、ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌ処理群において、２０μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞においてＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性は約２７％であり、２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞において約６８％であり、０．２μｇ／ｍｌのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物で処理した細胞において約８０％であった。
【００７４】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物および癌の増殖
【００７５】
インビトロ細胞培養アッセイにより、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物が癌細胞系における細胞コロニー形成の増殖を抑制することが示された。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の水抽出物、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のヘキサン抽出物、およびＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物を用いてのインビトロ細胞培養アッセイの結果は結論的ではなかった。図１１は、３つの乳癌細胞系：ＭＣＦ−７（エストロゲン受容体ポジティブヒト乳癌細胞系）、ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒトの転移性乳管癌サンプル由来のエストロゲン非依存性癌細胞系）、およびＭＤＡ−ＭＢ−３６１（脳転移組織由来のエストロゲン受容体ポジティブヒト乳癌細胞系）を使用した結果を示す。
【００７６】
ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１の細胞を、培養プレート上の血清を補填した培地に播種した。１０μｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解させたＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物に細胞を接触させた。７〜１０日の増殖アッセイを行った。５０細胞が１コロニーに対応するように、染色して手動で計測することにより細胞コロニー数をカウントして細胞の増殖を観察した。図１１のグラフにおける結果は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物への初期の暴露を生存し、目視可能なコロニーを形成するまでに増殖した細胞の数を示す。各細胞系のコロニーカウント（コロニー数）の生データを、処置群（１００％）の対照により標準化した。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物に接触させた各細胞系の標準化された細胞コロニーカウントを図１１に示し、各バーはＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物に接触させた特定の細胞系における２度のサンプルの平均である。図１１のグラフは、ｘ軸に細胞系を、ｙ軸に対照を１００％として標準化した細胞コロニーカウントを示す。図１１に示すとおり、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物は、他の細胞系と比較して最大の程度でＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖を阻害し、標準化した細胞コロニーカウントで１２．７％であり、ＭＣＦ−７の増殖は標準化した細胞コロニーカウントで約５７．２％であり、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１は標準化した細胞コロニーカウントで約８３％であった。
【００７７】
実験結果は、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物は、インビボでの乳癌腫瘍増殖を抑制しうることを示している。雌のヌードマウス１０匹にＲｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１００μｌ、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＴＭ）および５×１０６ＭＣＦ−７細胞（エストロゲン受容体ポジティブヒト乳癌細胞）を乳房脂肪体に注射し、雌のヌードマウス１０匹にＲｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１００μｌ、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＴＭ）および５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を皮下背面部位に注射し、上記の全ては５０μｌリン酸バッファー生理食塩水（「ＰＢＳ」）に懸濁させた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射したマウスについては注射後約１０日で、ＭＣＦ−７細胞を注射したマウスについては注射後約１５日で腫瘍が形成し、その後、ヌードマウスを処置群に無作為に分けた。ヌードマウスの１群には、５０μｌのＤＭＳＯ：ＰＢＳ溶液に懸濁させたＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物（最終濃度が８ｍｇ／ｍｌ）を２０ｍｇ／ｋｇ／マウスで毎日腹腔内に注射した。ＤＭＳＯ：ＰＢＳ溶液に懸濁させる前に、乾燥した酢酸エチル抽出物を純エタノールに再懸濁させ、等分し、エタノールを蒸発させ、乾燥粉末が得られた。ヌードマウスの対照群は、１：５のＤＭＳＯ：ＰＢＳ溶液（「対照」）のみで処理した。ヌードマウスには、対照またはＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物のいずれかを投与した。腫瘍は一日おきに計測した。腫瘍容積は、腫瘍の短軸および長軸をキャリパーで計測し（ｍｍ）、４．１９×（長軸／２）×（短軸／２）２の式を用いることにより腫瘍容積を算出し、立方ミリメートル（ｍｍ３）の腫瘍容積を得た。腫瘍容積値は標準化した。
【００７８】
上記方法を使用する２度の実験結果を、ｙ軸にｍｍ３で標準化した腫瘍容積が表示され、ｘ軸にはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞またはＭＣＦ−７細胞の注射後日数が表示された図１２および図２１に示す。図１２に示された実験においてマウスにＭＣＦ−７細胞を乳房脂肪体に注射し、対照群として５匹のマウスを、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物を８ｍｇ／ｍｌの最終濃度で連続する１４日間のそれぞれで投与した群として５匹のマウスを用いた。腫瘍の計測を１日ごとに行い、注射後１５日で開始した。折れ線グラフ１０はＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物を投与した５匹のヌードマウスの結果を示し、折れ線グラフ１２は、対照を投与した５匹のヌードマウスの結果を示す。図２１に示された実験において、１０匹の雌ヌードマウスには、２カ所の皮下背面部位にＭＤＡ−ＭＢ−２３１を注射した。折れ線グラフ１４は最終濃度８ｍｇ／ｍｌでＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物を投与した５匹のヌードマウスの結果を示し、折れ線グラフ１６は、対照を投与した５匹のヌードマウスの結果を示し、それぞれは注射後１０日に開始した。図１２および２１に示されるとおり、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の酢酸エチル抽出物は、対照と比較して腫瘍の増殖を抑制する。
【００７９】
腹腔内注射により状態を処置する成分が、患者へ非経口的な投与された場合に状態を処置しうることは、当該技術分野の当業者には理解される。Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、乳癌の処置のために非経口的に患者に投与されうる。
【００８０】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は、本明細書に記載した方法を使用して製造されうる。メタノール、または限定はされないが、極性、非極性、中程度の極性または水性溶媒などのいくつかの他の溶媒が、少なくとも部分的にＣＯＸ−２を阻害するＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の成分を抽出するために使用されうる。ＣＯＸ−２は一般的に炎症と呼ばれる免疫応答に寄与する酵素であるので、ＣＯＸ−２の阻害は炎症の抑制をもたらすことは、当該技術分野の当業者に理解される。ＣＯＸ−２の阻害が癌細胞のアポトーシスまたは癌細胞の増殖の抑制をもたらすこともまた、当該技術分野の当業者に理解される。よって、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物は医薬に導入してもよく、および癌細胞の増殖を抑制するか、または癌細胞のアポトーシスを誘導するかのいずれかによる癌の処置が期待されうる。当該抽出物はまた、濃縮または乾燥し、医薬に導入されうる。あるいは、ＣＯＸ−２を阻害する特定のフラクションをさらに単離するために、当該抽出物を分画してもよい。限定を伴わない例として、フラクション１〜２およびフラクション８、９および１０は、その任意の組合せでまたは各々で、患者のＣＯＸ−２を少なくとも部分的に阻害する医薬に導入してもよい。
【００８１】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を含有する医薬は、炎症の処置または癌の処置のために、患者へ治療有効量で投与してもよい。医薬はＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を含有するように調製してもよく、当該技術分野の当業者により知られた手法により、患者に投与するために製剤化してもよい。
【００８２】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を含有する医薬は、化合物を混合し配合するために、当該技術分野の当業者に知られた慣用の手法により調製されうる。例えば、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物または酢酸エチル抽出物は、またはフラクション１〜２またはフラクション８、９および１０の単独または組み合わせなどのＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．のメタノール抽出物または酢酸エチル抽出物のフラクションは、治療有効量で、患者を処置するための抽出物の経口投与または腸内投与を容易にするために、医薬として許容される賦形剤の使用により、溶液、懸濁液、粉剤、カプセル、錠剤、または液剤に製剤化されうる。あるいは、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物またはＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物の特定のフラクションは、非経口投与を容易にするために、医薬として許容される賦形剤に導入してもよい。別の態様において、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物またはＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物のフラクションの単独または組み合わせは、局所適用または経皮適用のために、医薬として許容な賦形剤を使用して、溶液、クリームまたはゲルに導入されうる。
【００８３】
上述の具体的な詳細事項はこの発明の特定の態様を記載するが、当該技術分野の当業者であれば、添付の特許請求の範囲に記載した発明の要点および範囲からはずれることなく、また均等論を考慮することなく、この発明の細部において種々の変更がなされうることを認識するであろう。したがって、この発明は、本明細書に示されたおよび記載された具体的な詳細事項に限定されないことが了解されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、ＣＯＸ−２の阻害方法。
【請求項２】
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水抽出物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、炎症の処置方法。
【請求項４】
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水抽出物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、癌の処置方法。
【請求項６】
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水抽出物からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
医薬として許容な賦形剤；および当該賦形剤中に懸濁した治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を含む医薬。
【請求項８】
極性溶媒；非極性溶媒；中程度の極性溶媒；および水性溶媒からなる群から選択される溶媒を使用して抽出された成分を含む、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物。
【請求項９】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物の製造方法であって、
エクストラクターおよび溶媒を用いてＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．材料を処理することにより成分溶液を作成すること；および
当該成分溶液から液体を少なくとも部分的に除去することにより抽出物を製造すること
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記溶媒が、極性溶媒；非極性溶媒；中程度の極性溶媒；および水性溶媒からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶媒が、メタノール；酢酸エチル；ヘキサン；および水からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出物を分画することにより、前記抽出物の少なくとも１つのフラクションを得ることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
セミ分取カラムにおいて前記抽出物を分画することにより、前記抽出物の少なくとも１つのフラクションを得ることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶媒がメタノールを含み、前記の少なくとも１つのフラクションが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分および１２分からなる群から選択される溶出時間を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物の製造方法であって、
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．材料を乾燥させること；
前記材料をすりつぶすこと；
エクストラクターおよび溶媒を用いて前記材料を処理することにより成分溶液を作成すること；および
当該成分溶液から液体を少なくとも部分的に除去することにより抽出物を製造すること
を含む、前記方法。
【請求項１６】
治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、乳癌の処置方法。
【請求項１７】
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水抽出物からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の前記抽出物が、医薬として許容な賦形剤中で、非経口で投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化の阻害方法。
【請求項２０】
前記抽出物がヘキサン抽出物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抽出物がメタノール抽出物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記抽出物が水抽出物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、ＣＯＸ−２の阻害方法。
【請求項２】
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水抽出物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、炎症の処置方法。
【請求項４】
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水抽出物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、癌の処置方法。
【請求項６】
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水抽出物からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
医薬として許容な賦形剤；および当該賦形剤中に懸濁した治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を含む医薬。
【請求項８】
極性溶媒；非極性溶媒；中程度の極性溶媒；および水性溶媒からなる群から選択される溶媒を使用して抽出された成分を含む、Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物。
【請求項９】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物の製造方法であって、
エクストラクターおよび溶媒を用いてＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．材料を処理することにより成分溶液を作成すること；および
当該成分溶液から液体を少なくとも部分的に除去することにより抽出物を製造すること
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記溶媒が、極性溶媒；非極性溶媒；中程度の極性溶媒；および水性溶媒からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶媒が、メタノール；酢酸エチル；ヘキサン；および水からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出物を分画することにより、前記抽出物の少なくとも１つのフラクションを得ることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
セミ分取カラムにおいて前記抽出物を分画することにより、前記抽出物の少なくとも１つのフラクションを得ることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶媒がメタノールを含み、前記の少なくとも１つのフラクションが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分および１２分からなる群から選択される溶出時間を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物の製造方法であって、
Ｓｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．材料を乾燥させること；
前記材料をすりつぶすこと；
エクストラクターおよび溶媒を用いて前記材料を処理することにより成分溶液を作成すること；および
当該成分溶液から液体を少なくとも部分的に除去することにより抽出物を製造すること
を含む、前記方法。
【請求項１６】
治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、乳癌の処置方法。
【請求項１７】
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水抽出物からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の前記抽出物が、医薬として許容な賦形剤中で、非経口で投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療有効量のＳｐｏｎｄｉａｓ ｍｏｍｂｉｎ Ｌ．の抽出物を患者に投与することを含む、ＮＦ−ＫａｐｐａＢ活性化の阻害方法。
【請求項２０】
前記抽出物がヘキサン抽出物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抽出物がメタノール抽出物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記抽出物が水抽出物を含む、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図２１】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図２１】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１０−５３５２３６（Ｐ２０１０−５３５２３６Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０１５６（Ｐ２０１０−５２０１５６）
【出願日】平成２０年７月３０日（２００８．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７１６２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１８３６３
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（５１０００６７２７）セルバメディカ・エルエルシー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月３０日（２００８．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７１６２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１８３６３
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（５１０００６７２７）セルバメディカ・エルエルシー (3)
【Ｆターム（参考）】
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