ＴＡＧ−７２に対するヒト化モノクローナル抗体
本発明は、癌特異抗原ＴＡＧ−７２(tumor-associated glycoprotein-72)に特異的なヒト化抗体及び前記抗体を含む組成物に関する。具体的に、本発明は、ＴＡＧ−７２に特異的なヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖を突然変異させて抗原に対する親和度を増加させたヒト化抗体、前記ヒト化抗体の軽鎖をヒト軽鎖で置換した抗体、及び前記抗体を含む抗癌組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、癌特異抗原ＴＡＧ−７２に特異的なヒト化抗体、及び前記ヒト化抗体を含む抗癌組成物に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
腫瘍特異糖タンパク質−７２（tumor-associated glycoprotein-72、以下「ＴＡＧ−７２」という）は、一種のムチン(mucin)タンパク質であって、例えば大腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、卵素癌などといった広範囲なヒト癌腫(humancarcinomas)に発現する癌特異抗原である。ＴＡＧ−７２に特異的な抗体としては、１９８０年代初め、米国ＮＩＨ国立癌研究所(NIH National Cancer Institute)のＪｅｆｆｒｅｙ Ｓｃｈｌｏｍ博士グループによって、ヒト乳癌組織の膜分画を免疫原として用いて製造したＢ７２．３マウスモノクローナル抗体が最初報告された(Colcher et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(5):3199-3203)。その後、Ｂ７２．３より抗原結合親和度の高い２世代抗体であるＣＣ４９とＣＣ８２などが同研究グループによって開発された(Muraro et al., 1988, Cancer Res., 48(16):4588-4596)。
【０００３】
ＣＣ４９またはＣＣ８３は、８０％以上の大腸癌と約５０％の乳癌に結合したが、正常組織には殆ど結合しなかった。また、１３１Ｉで標識されたＣＣ４９またはＣＣ８３を用いて癌患者を対象として生体内イメージングを行った結果、原発性癌と転移した癌を検出した(Divgi et al.,1994, Nucl. Med. Biol.,21(1):9-15)。ところが、マウスモノクローナル抗体を人体に繰り返し投与したとき、人体免疫反応の誘発により、副作用が生じるか或いは治療効果が減少した。このような免疫反応を最小限に減らすために、マウス抗体の抗原結合部位であるＣＤＲ(complementarity determining region)とＦＲ(framework region)の幾らかのアミノ酸残基をヒト抗体に移植させたヒト化抗体を製造してきた(Owens et al, 1994, J. Immunol. Methods, 168(2):149-65)。実際、このようなヒト化抗体を患者に繰り返し投与する場合、人体免疫反応が大幅減少することが報告された(Brown et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2663)。
【０００４】
ＴＡＧ−７２抗体に対するヒト化抗体研究の一環として、マウス抗体のＣＤＲがヒトモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖のＦｒに移植され且つ抗原結合−位置構造の保存に必要なマウスＦｒ残基は保有する、マウスモノクローナル抗体ＣＣ４９のヒト化抗体（ＨｕＣＣ４９）が製造された(Kashmiri et al., Hybridoma 14:461-473, 1995)。
【０００５】
米国特許第５，９７６，５３１号は、ヒトカッパーサブグループIV生殖系列遺伝子（human kappa subgroup IV germline gene：Ｈｕｍ４ＶＬ）由来の軽鎖可変領域ＶＬと、ＴＡＧ−７２との結合能を持つ３次構造を形成するために軽鎖可変領域に結合することが可能な重鎖可変領域ＶＨとを有するＴＡＧ−７２特異的抗体であるＨｕｍ４ＶＬ、ＶＨ抗体について記述している。
【０００６】
米国特許第６，４９５，１３７号は、ＣＣ４９、ＣＣ８３、ＣＣ４６、ＣＣ９２、ＣＣ３０、ＣＣ１１などのＴＡＧ−７２に対するマウス抗体(murine anti-TAG-72 antibody)軽鎖ＣＤＲがＨｕｍ４ＶＬに移植されたＣＤＲ移植軽鎖(CDR-grafted light chain)を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体またはその断片について開示している。
【０００７】
この他にも、多様なＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体が開発されたにも拘わらず、依然として、高い抗原結合性を持ちながらもヒトにおいて免疫反応を誘発させるおそれの低い抗体が必要であった。
【０００８】
そこで、本発明者らは、先行発明において、ＴＡＧ−７２に対するマウス抗体ＣＣ４９のＣＤＲ及びＦＲ配列と最も類似したヒト遺伝子を検索し、このヒト遺伝子を対象としてヒト化抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子を製造した後、これらを発現ベクターにクローニングして宿主細胞を形質転換し、しかる後に、これを培養してヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫを開発した（韓国特許第０３１８７６１号）。ヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫは、既存のヒト化抗体ＨｕＣＣ４９に比べてＣＤＲ及びＦＲのアミノ酸残基がよりヒトに近く置換され、ヒトに対してさらに減少した免疫原性を持つが、抗原結合能は既存の抗体と実質的に殆ど類似である。それにも拘わらず、人体における免疫反応の誘発は減少させ且つ抗原結合能及び親和度はさらに増加させた、機能的に優れた抗体に対する必要性は依然として求められている。
【０００９】
このような背景の下で、本発明者らは、ＴＡＧ−７２に対する結合能及び親和力に優れた抗体を製造するために、既存のヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖可変領域のＣＤＲ３領域を無作為に突然変異させてヒト化重鎖ライブラリ細胞を製作し、このライブラリ細胞を対象としてコロニーリフトアッセイ(colony lift assay)を施して抗原結合能の高い変異体クローンを選別した後、選別されたクローンを対象として競争的ＥＬＩＳＡを行って各クローンの抗原結合能を分析する方法によって、ＴＡＧ−７２に対する抗原結合能と抗原結合親和度が増加した新規抗体を製造し、ひいては前記新規ヒト化抗体の軽鎖をヒト軽鎖で置換したヒト化抗体を製造することにより、本発明を完成した。
【００１０】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、（i）配列番号１のアミノ酸配列において１００番〜１０３番のアミン酸残基の少なくとも一つが置換できる重鎖可変領域、及び（ii）配列番号２１または配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有する、ＴＡＧ−７２(tumor-associated glycoprotein-72)に対するヒト化抗体を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、前記重鎖可変領域をコードする核酸配列、及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む組み換えベクターを提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、前記形質転換体を培養して前記ヒト化抗体を製造する方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、前記抗体を含む抗癌組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、前記抗体を投与して癌を治療または予防する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、前記抗体を投与して癌を診断する方法を提供することにある。
【００１８】
本発明の前記および他の目的、特徴および他の利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能であろう。
【００１９】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、（i）配列番号１のアミノ酸配列において１００番〜１０３番のアミノ酸残基が下記配列式１で表される配列を持つアミノ酸配列の重鎖可変領域、及び（ii）配列番号２１または配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有する、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体に関する。
【００２０】
［配列式１］
−Ｘ１００−Ｘ１０１−Ｘ１０２−Ｘ１０３−
式中、Ｘ１００はロイシン（Ｌｅｕ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０１はイソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）またはアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０２はメチオニン（Ｍｅｔ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０３はアラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）またはグリシン（ｇｌｙ）アミノ酸残基である。
【００２１】
マウス由来抗体は、人体内で抗原として作用し、これに対する新しい抗体（Human Anti-Mouse Antibody：ＨＡＭＡ、ヒト抗マウス抗体）が生成されるために好ましくない免疫反応を誘発する。このような点を克服するために、人体において非ヒト抗体の免疫原性を減少させるための提案が行われた。ヒト化(Humanization)技術と命名されたこの技術は、一般に、抗体分子のポリペプチド鎖を暗号化するＤＮＡ配列を操作する組み換えＤＮＡ技術を使用する。ヒト化抗体製造の初期方法は、非ヒト抗体の抗原結合部位全体からなる抗体結合部位と、ヒト抗体の不変領域とを連結させたキメラ抗体を生産するものである。国際公開特許第ＷＯ８６／０１５３３は、マウス抗体起源の可変性領域のみをヒト抗体不変領域と結合させてヒト化させたキメラ抗体を製造する方法を開示している。このようなキメラ抗体の場合、マウス抗体より免疫反応を少なく起こし且つ機能を増進させるという利点を示した。ところが、キメラ抗体は、マウスの可変領域、すなわち言い換えれば非ヒト可変性領域のアミノ酸配列を依然として含有しているので、ヒトに繰り返し投与する場合、依然としてＨＡＭＡ反応を起こす。
【００２２】
キメラ抗体をさらにヒト化させるために、抗原間の結合機能を示すマウスモノクローナル抗体のＣＤＲ部分をヒト抗体のＦＲと組み換えさせる試みが、マウス抗体の結合特異性と親和度を維持させながら人体には免疫反応を誘発しないという概念の下にあった(Jones et al., 1986, Nature, 4;321(6069):522-525)。前述したマウス抗体のＣＤＲループ(loop)部分をヒト抗体に移植するＣＤＲ移植方法によって製造されたヒト化抗体は、非ヒトアミノ酸配列を一層小さい割合で含んでいるため、キメラ抗体よりＨＡＭＡ反応を一層少なく起こるようにもするが、抗原結合親和度が低い可能性がある。抗体の結合能を維持するために、元抗体であるマウス抗体のＦＲ領域が必要となる可能性もあるので、ＣＤＲ構造に影響すると推定される幾つかのＦＲ領域のアミノ酸残基をマウス抗体のもので置換して元来のマウス抗体と類似の水準に親和度を増進させることもできた(Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323-327; Queen et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10023-10029; Tempest et al., 1991, Biol. Technology, 9:266-271; Co et al., 1991, Nature, 351:501-502)。
【００２３】
本発明において、用語「ヒト化抗体(humanized antibody)」とは、以上述べたように、ヒトに対して免疫原性がないかまたは免疫原性が減少した抗体を総称する。ヒト化抗体はアミノ酸配列が変形された抗体(altered antibody)であり、抗体のアミノ酸配列は所望の目的に合わせて再構成することができる。このような数多くの変化は、一つまたは幾つかのアミノ酸を変化させることから、抗体の可変及び／または不変領域を安全に再構成することまで可能である。一般に可変領域の変形が抗原結合能と親和度を増大させるために行われるのに比べ、不変領域における変形は補体(complement)の固定、膜との相互作用及びその他の効果剤の機能といった細胞内作用を増大させるために行われる。
【００２４】
本発明に関連したヒト化抗体は、マウス抗体ＣＣ４９の軽鎖及び重鎖の配列と最も類似した遺伝子をジーンバンクデータベース(GeneBank data base)から選別し、これらの遺伝子それぞれをヒト軽鎖不変領域遺伝子Ｃκ及びヒト重鎖不変領域遺伝子Ｃγ１と組み換えさせて得た先行発明のヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖可変領域のＣＤＲ３部位を突然変異させて得た抗体であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域と配列番号２１で表されるアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域とを有するＡＫＡ／ＨｚＫより抗原結合能及び親和度が増加した抗体である。
【００２５】
前記において、用語「可変領域」とは、抗原と特異的に結合する機能を行いながら、配列上の多くの変異(variation)を示す抗体分子の部分を意味する。この可変領域には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が存在する。相補性決定領域（complementarity determining regions：ＣＤＲ）は、抗原の認識に関与する環状の部位であって、この部位の配列が変わるにつれて抗体の抗原に対する特異性が決定される重要な部位である。本発明は、具体的に、ＣＤＲ３のアミノ酸配列変異によって、抗原結合親和度を増加させた抗体を製造した。ＣＤＲの間に適切な配向で存在する「フレームワーク領域（frame work：ＦＲ）」は、ＣＤＲ環を支持する役割を果たし、具体的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含む。本発明の抗体重鎖可変領域は、１番〜３０番のＦＲ１部位、３１番〜３５番のＣＤＲ１、３６番〜４９番のＦＲ２、５０番〜６６番のＣＤＲ２、６７番〜９８番のＦＲ３、９９番〜１０４番のＣＤＲ３、及び１０５番〜１１５番のＦＲ４からなっている。本発明の抗体軽鎖可変領域は、１番〜２３番のＦＲ１部位、２４番〜４０番のＣＤＲ１、４１番〜５５番のＦＲ２、５６番〜６２番のＣＤＲ２、６３番〜９４番のＦＲ３、９５番〜１０３番のＣＤＲ３、及び１０４番〜１１３番のＦＲ４からなっている。
【００２６】
本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列において重鎖可変領域中のＣＤＲ３の１０１番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９７番）のアスパラギン（Ａｓｎ）残基が脂肪族(aliphatic)残基で置換されるとき、ＴＡＧ−７２に対する親和度が増加することが分かった。本発明において、脂肪族タンパク質は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはアラニンを意味する。
【００２７】
具体的な様態として、本発明は、（i）配列番号１のアミノ酸配列において１０１番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９７番）のアスパラギン残基が脂肪族残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはアラニン残基で置換され、１００番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９６番）のロイシン残基がトリプトファン残基で置換され、及び／または１０２番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９８）のメチオニン残基がグルタミン残基で置換され、及び／または１０３番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９９）のアラニン残基がグルタミン残基、グリシンで置換されたアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び（ii）配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。
【００２８】
より好ましくは、重鎖可変領域の１０１番のアスパラギン残基がバリン、１０２番のメチオニン残基がグルタミン、１０３番のアラニン残基がグリシンで置換されたものである。よって、配列番号２で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体３Ｃ４を提供する。また、より好ましくは、重鎖可変領域の１０１番のアスパラギン残基がイソロイシン、１０２番のメチオニン残基がグルタミン、１０３番のアラニン残基がグリシンで置換されたものである。よって、配列番号３で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体３Ｄ５を提供する。また、より好ましくは、重鎖可変領域の１０１番のアスパラギン残基がイソロイシン、１００番のロイシン残基がトリプトファン、１０３番のアラニン残基がグルタミンで置換されたものである。よって、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体３Ｅ８を提供する。また、より好ましくは、重鎖可変領域の１０１番のアスパラギン残基がバリンで置換されたものである。よって、配列番号５で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体ＮＶを提供する。また、より好ましくは、重鎖可変領域の１０１番のアスパラギン残基がイソロイシンで置換されたものである。よって、配列番号６で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体ＮＩを提供する。
【００２９】
前記の抗体はいずれも、既存の抗体ＡＫＡ／ＨｚＫより親和度が大きく増加した抗体であって、全(whole)抗体３Ｃ４は１．３３×１０−９Ｍ、全抗体３Ｄ５は２．２７×１０−９Ｍ、全抗体３Ｅ８は０．６５×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）をそれぞれ有するが、これらの数値は、ＡＫＡ／ＨｚＫの１．４５×１０−８Ｍよりそれぞれ約１１倍、６倍及び２２倍が増加した数値である。全抗体ＮＶは１．６６×１０−９Ｍ、全抗体ＮＩは３．３８×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）をそれぞれ有し、これらの数値は、ＡＫＡ／ＨｚＫの１．４５×１０−８Ｍよりそれぞれ約８倍及び４倍が増加した数値である。
【００３０】
本発明者らは、前記抗体の軽鎖をヒト軽鎖で代替しようとした。
【００３１】
ヒト化軽鎖を代替して重軽可変領域と共に使用できるヒト軽鎖を選別するために、ヒトＰＢＬ(peripheral blood lymphocytes)からヒト軽鎖ライブラリを製作した後、ヒト軽鎖ＤＮＡ断片を、最も優れた効果を示すヒト化抗体３ＥＢのＦａｂ発現ベクターであるｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８にヒト化軽鎖遺伝子の代わりに挿入し、抗原結合能の高い変異体クローンを選別するためにリフトアッセイを行った。細胞クローンの結合能が野性型３Ｅ８ Ｆａｂに比べて優れたクローンを分離した後、このクローンの軽鎖可変領域の塩基配列を確認したところ、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を持つことを確認することができた。前記の方法によって得た、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を持つヒト軽鎖可変領域は、通常の遺伝子組み換え方法によって前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域で代替することができる。
【００３２】
別の具体的な様態として、本発明は、１０１番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９７番）のアスパラギン残基が脂肪族残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはアラニン残基で置換され、１００番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９６番）のロイシン残基がトリプトファン残基で置換され、及び／または１０２番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９８）のメチオニン残基がグルタミン残基で置換され、及び／または１０３番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９９）のアラニン残基がグルタミン残基、グリシンで置換されたアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び（ii）配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。
【００３３】
好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。また、好ましくは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。また、好ましくは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。また、好ましくは、配列番号５で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。また、好ましくは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。
【００３４】
前記の抗体はいずれも、既存の抗体ＡＫＡ／ＨｚＫより親和度が大幅増加した抗体である。その中でも、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体３Ｅ８／ＢＳＭ２２が最も好ましい。全３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体は、３Ｅ８抗体の０．６５×１０−９Ｍより約１．５倍が増加した０．４５×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）を有する。
【００３５】
本発明において、「抗体」は、全抗体型だけでなく、抗体分子の機能的断片を含む。全抗体は２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を持つ構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合によって連結されている。抗体分子の機能的断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の不変領域、及び重鎖の第１不変領域ＣＨ１を持つ構造であって、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に少なくとも一つのシステイン残基を含むヒンジ領域を持つという点において、Ｆａｂと差異がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを持っている最小の抗体断片である。Ｆｖ断片を生成する組み換え技術は、国際公開特許ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合によって重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合によって連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すると、Ｆａｂを得ることができ、全抗体をペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、好ましくは、遺伝子組み換え技術によって製作することができる。本発明において、抗体は、好ましくはＦａｂ型または全抗体型である。
【００３６】
本発明で提供するヒト化抗体は、全種類の不変領域と組み換え的な方法によって結合できる。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）タイプを持ち、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を持つ。軽鎖不変領域は、カッパー（κ）及びラムダ（λ）タイプを持つ(Coleman et al., Fundamental Immunology, 2nd Ed., 1989, 55-73)。好ましくは、重鎖不変領域はガンマ１及びガンマ３であり、最も好ましくは、重鎖不変領域はガンマ１イソタイプである。好ましくは、軽鎖不変領域はカッパータイプである。本発明において、好ましい抗体はカッパー（κ）軽鎖とガンマ１（γ１）重鎖を持つＦａｂ型またはＩｇＧ１型である。
【００３７】
本発明の抗体の不変領域は、そのアミノ酸配列が変異された変異体を含む。好ましくは、免疫グロブリン不変領域変異体は、変異体のタンパク質配列がヒトのそれと相異しなくて免疫反応を誘発しない範囲内において、アミノ酸配列上の誘導と修飾によってタンパク質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性または可溶性が増加し、或いは硫化結合形成、発現宿主との親和性、補体との結合、Ｆｃ受容体との結合、及び抗体依存性細胞毒性などが改善された変異体である。
【００３８】
別の様態において、本発明は、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域をコードする核酸配列に関する。
【００３９】
重鎖可変領域をコードする核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において１０１番のアスパラギン残基が脂肪族残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはアラニン残基で置換され、１００番のロイシン残基がトリトプファン残基で置換され、及び／または１０２番のメチオニン残基がグルタミン残基で置換され、及び／または１０３番のアラニン残基がグルタミン残基、グリシンで置換されたアミノ酸配列をコードする。好ましくは、配列番号２、３、４、５または６で表されるアミノ酸配列をコードする配列である。
【００４０】
より好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は配列番号１６のヌクレオチド配列を持つ核酸配列であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は配列番号１７のヌクレオチド配列を持つ核酸配列であり、配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は配列番号１８のヌクレオチド配列を持つ核酸配列であり、配列番号５で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は配列番号１９のヌクレオチド配列を持つ核酸配列であり、配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は配列番号２０のヌクレオチド配列を持つ核酸配列である。
【００４１】
軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、配列番号２２で表される軽鎖可変領域をコードする。好ましくは、配列番号２３のヌクレオチド配列を持つ核酸配列である。
【００４２】
前記抗体の不変領域及び可変領域をコードする核酸配列は、組み換え発現ベクターに挿入されて発現する。
【００４３】
別の様態として、本発明は、前記重鎖可変領域をコードする核酸配列、及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む組み換えベクターに関する。
【００４４】
好ましくは、配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列からなるグループの中から選択される重鎖可変領域、及び配列番号２１または２２で表されるアミノ酸配列からなるグループの中から選択される軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む組み換えベクターに関する。具体的な例において、ｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、ｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８、ｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、ｐＣ３−Ｑ−ＮＩまたはｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２である組み換えベクターを提供する。また、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｃ４、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｄ５、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＶ、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＩまたはｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２である組み換えベクターを提供する。
【００４５】
本発明において、用語「組み換えベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現することが可能な発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００４６】
本発明において、「作動可能に連結された(operably linked)」とは、一般的機能を行うように、核酸発現調節配列と、目的タンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。組み換えベクターの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡの切断及び連結は、当該技術分野で一般に知られている酵素などを用いて容易に実現することができる。
【００４７】
本発明の適切な発現ベクターは、例えばプロモータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどの発現調節エレメントの他にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列を含むことができる。開始コドン及び終結コドンは、一般に、免疫原性標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部と見なされるもので、遺伝子作製物が投与されたとき、個体において必ず作用を示さなければならず、コーディング配列とインフレーム(in frame)にあるべきである。一般プロモータは、構成的または誘導性である。原核細胞にはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３及びＴ７のプロモータがあるが、前記例示に限定されるものではない。真核細胞には猿ウィルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫ウィルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶの長末端反復部（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモータだけでなく、β−アクチンプロモータ、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネイン由来のプロモータがあるが、前記例示に限定されるものではない。
【００４８】
発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含むことができる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、または表面タンパク質の発現といった選択可能な表現型を与えるマーカーが使用できる。選択剤(selective agent)が処理された環境では選別マーカーを発現する細胞のみが生存するので、形質転換された細胞が選別可能である。また、ベクターは、複製可能な発現ベクターの場合、複製が開始される特定の核酸配列である複製起点(replication origin)を含むことができる。ウィルス（例えば、バキュロウィルス）またはファージベクター、及びレトロウィルスベクターのような、宿主細胞のゲノム内に挿入できるベクターも使用可能である。
【００４９】
全抗体または抗体断片を発現するベクターは、軽鎖と重鎖を一つのベクターで同時に発現させるベクターシステム、または軽鎖と重鎖をそれぞれ別途のベクターで発現させるシステムが可能である。後者の場合、２つのベクターは同時形質転換(co-transformation)及び標的形質転換(targeted transformation)によって宿主細胞に導入し、軽鎖（または重鎖）を含有するベクターで形質転換された細胞を選別し、軽鎖を発現する選別された細胞を重鎖（または軽鎖）含有ベクターでさらに形質転換することにより、軽鎖及び重鎖の両方ともを発現する細胞を最終的に選別する。
【００５０】
Ｆａｂ型の抗体を作製するために、ヒト軽鎖の可変領域ＶＬと不変領域ＣＬ及びヒト重鎖の可変領域ＶＨと第１不変領域ドメインＣＨ１のアミノ酸をコードする遺伝子が挿入されたベクターを利用する。本発明では、具体的には例えばｐＣｏｍｂ３ＨＳＳベクターを使用し、より好ましくは、重鎖の一番目のアミノ酸であるグルタミンを維持させるために、ベクターのｘｈｏＩ位置の前にあるアミノ酸配列ＥＶＱＬ（グルタミン酸−バリン−グルタミン−ロイシン）をＱＶＱＬ（グルタミン−バリン−グルタミン−ロイシン）に変形し、及び／または可溶性Ｆａｂを発現させるためにｇｅｎｅIIIを除去したベクターｐＣ３−Ｑを使用した。このベクターはｌａｃＺプロモータを有し、シグナルペプチドはＯｍｐＡとｐｅｌＢを持つことを特徴とする。
【００５１】
好ましい様態において、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、配列番号３で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−３ＥＢ、配列番号５で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−ＮＩ、並びに配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２などを提供する。
【００５２】
全抗体を製作するために、ヒト軽鎖の可変領域ＶＬと不変領域ＣＬ、及びヒト重鎖の可変領域ＶＨと全不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３をコードする遺伝子が挿入されたベクターを用いる。本発明の具体的な例では、ｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ（ＫＣＴＣ ８６７１Ｐ：韓国登録特許第１６２０２１号）を用いて作った、２つの発現単位を持つｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒを用いた。前記ベクターは、それぞれのプロモータにおいて、重鎖と軽鎖が発現する２つのＣＭＶプロモータを有することを特徴とする。
【００５３】
好ましい様態において、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｃ４、配列番号３で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｄ５、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８、配列番号５で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＶ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＩ、並びに配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２などを提供する。
【００５４】
その中でも、全抗体３Ｅ８を発現するｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８ベクターは、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００１年６月２１日に第ＫＣＴＣ １０３９ＢＰ号で寄託され、全抗体３Ｅ８／ＢＳＭ２２を発現するｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２ベクターは、ＫＣＴＣに２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４７ＢＰ号で寄託された。
【００５５】
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体に関する。
【００５６】
前記ベクターの適切な宿主細胞は、例えばエシェリキアコリ(Escherichia coli)、バチルスサブチルス(Bacillus subtilis)、ストレプトミセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、プロテウスミラビリス(Proteus mirabilis)、スタヒロコッカス(Staphylococcus)などの原核細胞であってもよい。また、アスペルギルス属(Aspergillus species)などの真菌、ピキア酵母(Pichia pastoris)、サッカロマイセスセレヴィジエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、アカバンカビ(Neurospora crassa)などの酵母、その他の下等真核細胞、及び昆虫からの細胞などの高等真核生物の細胞といった真核細胞であってもよい。また、植物、哺乳動物から由来してもよい。好ましくは、猿腎臓細胞７（ＣＯＳ７：monkey kidney cells）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、ＣＨＯ(Chinese hamster ovary)細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ(baby hamster kidney)細胞、ＭＤＣＫ、骨隋腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及び２９３細胞を含むが、これに限定されるものではない。好ましくは、ＣＨＯ細胞である。本発明のｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８ベクターが、ＣＨＯ細胞としてリポフェクタミンを用いた方法で形質転換された、形質転換細胞株９Ｅ８を製造し、ＫＣＴＣに２００１年６月２１日に第ＫＣＴＣ １０４０ＢＰ号で寄託した。また、本発明のｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２ベクターをＣＨＯ細胞に形質転換して形質転換細胞株４Ｄ１２−Ｂ３１を製造し、ＫＣＴＣに２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４６ＢＰ号で寄託した。
【００５７】
本発明において、宿主細胞への「形質転換」は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法も含み、当分野で公知になっているように、宿主細胞に応じて適切な標準技術を選択して行うことができる。このような方法は、電気衝撃遺伝子伝達法(electroporation)、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌、アグロバクテリア媒介形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミン、及び乾燥／抑制媒介形質転換方法などを含むが、前記例示に限定されるものではない。
【００５８】
別の様態として、本発明は、前記形質転換体を培養してヒト化抗体を製造する方法に関する。
【００５９】
前記抗体の製造において、形質転換体の培養は、当業界に知られている適切な培地と培養条件に応じて行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。
【００６０】
形質転換体を培養して得た抗体は、精製していない状態で使用でき、さらに多様な通常の方法、例えば透析、塩沈殿、クロマトグラフィーなどを用いることができ、これらを単独でまたは組み合わせて用いることができる。その中でもクロマトグラフィーが最も多く用いられており、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどがある。
【００６１】
前記方法で製作された抗体は、抗原に対する親和度が増加した抗体である。用語「親和度」は、抗原の特定の部位を特異的に認識し結合する能力であって、このような抗体の抗原に対する特異性と共に高度の親和度は、免疫反応において重要な要素である。本発明では、重鎖可変領域を無作為に突然変異させてヒト化重鎖ライブラリ細胞を製作し、このライブラリ細胞を対象としてコロニーリフトアッセイを施して抗原結合能の高い変異体クローンをまず選別し、選別されたクローンを対象として競争的ＥＬＩＳＡを行って各クローンの親和度を調査した。その他にも、抗原に対する親和度を測定するための多様な方法を使用することができるが、表面プラスモン共鳴技術（surface plasmon resonance technology：ＳＲＰ）がその例である。
【００６２】
本源に用いられる用語「ＫＤ」は、特定抗体−抗原相互作用の解離定数を称し、抗体の抗原に対する親和度を測定する尺度として使用された。前記方法によって製作した本発明の抗体は、抗原ＴＡＧ−７２に結合可能な能力が元来の抗体ＡＫＡ／ＨｚＫより著しかった。
【００６３】
したがって、前記方法によって製作された親和度が増加した抗体は、癌の診断及び治療に有用に応用できる。抗体は、それ自体、または抗体を含む組成物として提供できる。
【００６４】
別の様態として、本発明は、前記抗体を用いて癌を診断する方法に関する。
【００６５】
本発明の抗体は、ＴＡＧ−７２に高い親和性で結合するので、ＴＡＧ−７２と前記抗体との結合体の形成を検出ラベル(detection label)のシグナルサイズを定性または定量的に測定することができ、これによって癌か否かを診断することができる。抗原−抗体複合体の形成を定性または定量的に測定することを可能にするラベルは、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微粒子、レドックス分子及び放射線同位元素などが例示されるが、これらに限定されるものではない。実際、免疫組織化学的染色(immunohistochemistry)結果、本発明の抗体が大腸癌に対して非常に強い反応性を示すことを確認した。
【００６６】
また、本発明の抗体は、イメージングマーカー(imaging marker)に結合させて患者に投与し、これを確認することにより、ヒトの腫瘍またはそれらの転移を診断することができる。本発明の抗体は、既存の抗体より抗原に対する親和力が高く、よりヒト化された抗体なので、患者への投与に非常に適する。抗体−イメージングマーカー結合体(antibody-imaging marker conjugated)の投与及び確認と抗体のイメージングマーカーへの連結方法は、(Goldenberg et al., 1978, New England J. Med. 298, 1384-1388; Goldenberg et al., 1983,J. Amer. Med. Assoc. 280, 630-635; Goldengerg et al.,1983, Gastroenterol. 84, 524-532; Siccardi et al., 1986, Cancer Res. 46, 4817-4822; Epenetos et al., 1985, Cancer 55, 984-987; Philben et al., 1986, Cancer 57, 571-576; Chiou et al., 1986, Cancer Inst. 76, 849-855; Colcher et al., 1983, Cancer Res., 43, 736-742; Colcher, E. et al., Laboratory Research Methods in Biology and Medicine Immunodiagnostics. New York, Alan R. Liss. pp. 215-258(1983); Keenan, A.M. et al., 1984, J. Nucl. Med. 25, 1197-1203; Colcher D. et al., 1987, Cancer Res. 47, 1185-1189; Estaban, J.M. et al., 1987, Intl. J. Cancer 39, 50-59; Martin, D.T., et al., 1984, Curr. Surg. 41, 193-194; Martin, E.W. Jr. et al., 1986, Hybridoma 5, S97-S108; Martin, D.T. et al., 1985, Am. J. Surg. 150, 672-675; Meares et al., Anal. Biochem. 1984, 142, 68-78; and Krejcarek et al., 1977, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77, 581-585)などの文献に記述されている。投与量は、患者の年齢と体重に応じて変わり得る。抗体−イメージングマーカー結合体の投与量は、正常組織とは区別される腫瘍部位を可視化させるか或いは確認することができるように効果的な量でなければならない。
【００６７】
抗体に結合することが可能なイメージングマーカーの例は、当分野の技術者に公知になっており、ガンマスキャナ(gamma scanner)または手動ガンマプローブ(hand held gamma probe)または陽性子放出断層撮影器(positron Emission Tomograpy)などを用いて診断画像(diagnostic imaging)によって確認することが可能な物質と、核磁気共鳴分光器(nuclear magnetic resonance spectrometer)などを用いた核磁気共鳴画像によって確認することが可能な物質とを含む。
【００６８】
ガンマスキャナなどによって確認できる物質の適切な例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７ＬＵ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅおよび９９ｍＴｃなどの放射性同位元素を含む。１２５Ｉ、１２３Ｉ、１５３Ｓｍおよび９９ｍＴＣは、少ないエネルギーと広範囲な確認が適切なので好ましい。核磁気共鳴分光器などを用いて確認できる物質の例としては、ガドリニウム（Gadolinium：Ｇｄ）がある。
【００６９】
別の様態として、本発明は、前記抗体を含む抗癌組成物に関する。
【００７０】
本発明において、用語「抗癌」とは、「予防」及び「治療」を含む。ここで、「予防」とは、本発明の抗体を含む組成物の投与によって癌を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、本発明の抗体投与によって癌の症状を好転させるか或いは有利に変更する全ての行為を意味する。
【００７１】
本発明の抗体は、ヒト大腸癌を異種移植したマウスで既存のＡＫＡ／ＨｚＫより高く吸収され、血液における保有力も高かった。ヒト大腸癌を異腫移植したマウスを本発明の抗体に投与する場合、５０％生存率は対照群のマウスより大幅増加した。
【００７２】
本発明の組成物で治療することが可能な癌は、ＴＡＧ−７２が発現するすべての癌を含む。ＴＡＧ−７２はヒト癌腫において広範囲に発現するので、本発明の組成物はＴＡＧ−７２発現のあるすべての癌、例えば大腸癌、卵素癌、胃癌、膵臓癌、乳癌などを治療することができる。
【００７３】
治療用抗体として用いられる場合、その抗体は、既存の治療剤と直接またはリンカーなどを介して間接的にカップリング（例えば、共有結合）されて抗体−治療剤結合体の形で生体内に投入され、癌の治療に利用される。抗体−治療剤結合体において抗体との結合が可能な治療剤は、例えば化学治療剤、放射性核腫(radionuclide)、免疫治療剤、サイトカイン、ケモカイン、毒素、生物作用剤、酵素阻害物質、異形機能性抗体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない：（１）(Goldengerg et al., 1981, Cancer Res. 41, 4354-4360)などの文献に記述されている、１３１Ｉ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、６７Ｇａ、１２５Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１５３Ｓｍ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎなどの放射性核腫(radionuclide)に結合した抗体；（２）(Chabner et al., 1985, Cancer, Principles and Practice of Oncology, Philadelphia, PA, J.B. Lippincott Co. Vol. 1, pp. 290-328)などの文献に記述されている、メトトレキサート(methotrexate)、アドリアマイシン(adriamycin)、及び例えばインターフェロンなどのリンポカイン(lympokine)といった生物学的反応変形体または薬物に結合した抗体；（３）(Uhr et al., 1983, Monoclonal antibodies and Cancer, Academic Press, Inc., pp. 85-98)などの文献に記述されている、リシン、アブリン、ジフテリアなどの毒素に結合した抗体；（４）(Perez et al., 1986, J. Exper. Med. 163, 166-178; and Lau et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 82, 8648-8652)などの文献に記述されている、他の抗体に結合してその複合体が癌細胞と効能細胞の両方ともに結合する異形機能性抗体(heterofunctional antibodies)；（５）(Herlyn et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., (USA) 79, 4761-4765)などの文献に記述されている、自然的な、すなわち非−連関または非−複合された抗体。
【００７４】
抗体組成物の場合、投与方式に応じて許容可能な担体を含んで適切な製剤に製造される。投与方式に適した製剤は、公知になっており、典型的に膜を通過した移動を容易にする界面活性剤を含む。このような界面活性剤は、ステロイドから誘導されたものであるか、或いはＤＯＴＭＡ（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylammonium chloride）などの陽イオン性脂質、またはコレステロールヘミサクシネートやホスファチジルグリセロールなどの各種化合物などがある。
【００７５】
別の様態として、本発明は、前記抗体を投与して癌を治療する方法に関する。
【００７６】
前記組成物は、癌を治療するに十分な量で患者に投与されるが、その投与量は、癌の種類、患者の年齢、体重、症状の特性及び度合い、現治療法の種類、治療回数、投与形態及び経路などの多様な要因によって異なるうえ、当分野の専門家によって決定できる。本発明の組成物は、前記薬理学的または生理学的成分を共に投与または順次投与することができ、また、追加の従来の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができる。このような投与は、単一投与または多重投与である。前記要素を全て考慮に入れて、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定できる。
【００７７】
本発明において、「投与」がいずれの適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味する場合、本発明の抗体を含む組成物の投与経路は、目的の組織に到達することができればいずれの一般的な経路であってもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、胚内投与、および直腸内投与が可能であるが、前記例示に限定されるものではない。ところが、経口投与の際に、タンパク質は消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコートするか、或いは胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞へ移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００７８】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００７９】
まず、本発明のＴＡＧ−７２に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を製作した：
ヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖可変領域は、配列番号１で表されるアミノ酸配列から構成されており、１番〜３０番のＦＲ１部位、３１番〜３５番のＣＤＲ１、３６番〜４９番のＦＲ２、５０番〜６６番のＣＤＲ２、６７番〜９８番のＦＲ３、９９番〜１０４番のＣＤＲ３、及び１０５番〜１１５番のＦＲ４からなっている。その中でも、ＣＤＲ３部位を任意の他のアミノ酸に突然変異させ、元来のＡＫＡ／ＨｚＫ抗体よりＴＡＧ−７２に対する抗原結合能に優れた新規抗体を製造した。
【００８０】
配列番号１で表されるＡＫＡ／ＨｚＫヒト化抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列のうち、ＣＤＲ３部位を示す９９番目のアミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）、１００番目のロイシン（Ｌｅｕ）、１０１番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、１０２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）及び１０３番目のアラニン（Ａｌａ）を無作為に突然変異させた。具体的に、ヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの遺伝子発現ベクターｐＣ３−Ｑ−ＡＫＡ／ＨｚＫ（韓国特許登録第０３１８７６１号のｐＣ３−Ｑ−ＨｚＣＣ４９Ｆａｂ−１−ｄｇIIIベクターの重鎖可変領域の９７番トレオニン残基をアラニンで置換させたもの）を鋳型として、重鎖ＣＤＲ３部位が突然変異された配列を含むプライマーを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＣＤＲ３部位が突然変異されたＤＮＡ断片を得た（図１）。得られたＤＮＡ断片とｐＣ３−Ｑ−ＡＫＡ／ＨｚＫベクターをそれぞれＸｈｏＩとＡｐａＩで切断した後、精製し、切断された２つのＤＮＡ断片を結合させた後、ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｎ ｂｌｕｅ（米国、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に形質転換させた。
【００８１】
ＴＡＧ−７２に対する抗原結合親和度が増加した新規抗体を製造するために、前記で製造したヒト化重鎖ライブラリを含んでいるＥ．ｃｏｌｉに対して３回にわたってコロニーリフトアッセイ(J. Immunol. Meth. 272: 219-233, 2003)を行い、１、２、３回検索した後に得られたクローンの抗原結合能がＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂに比べて優れるかを調べるために、ビオチン結合ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂを用いた競争的ＥＬＩＳＡを行った。前記検索過程で選択されたクローンの抗原結合能を確認した結果、９７番のアスパラギン残基が非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンまたはバリンで置換された変異体が、ＡＫＡ／ＨｚＫより高い抗原結合能を持つことが分かった。
【００８２】
前記過程によって分離した変異体クローンをそれぞれ３Ｃ４、３Ｄ５、３Ｅ８、ＮＶ、ＮＩと命名し、前記変異体クローンの重鎖可変領域の塩基配列を分析した結果、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６で表されるアミノ酸配列を持つことを確認した（図３）。
【００８３】
Ｆａｂ型の抗体を全ＩｇＧ型に製造するために、重鎖及び軽鎖の可変領域を全ＩｇＧ型の発現ベクターに挿入する一般的な組み換え方法を行った。まず、抗体遺伝子の信号配列と変異体の可変領域とを連結したＤＮＡ断片を組み換えＰＣＲ方法によって合成し、これをヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの全ＩｇＧ型の発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＡＫＡ／ＨｚＫ（韓国特許第０３１８７６１号）内の重鎖遺伝子の同一制限酵素位置に挿入して全ＩｇＧ型の抗体発現プラスミドを製造した。その中でも、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８は、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００１年６月２１日に第ＫＣＴＣ １０３９ＢＰ号で寄託した。
【００８４】
前記製造した発現ベクターを細胞内に形質転換させて形質転換体を製造した。ｄｈｆｒ欠乏ＣＨＯ細胞を継代培養した後、前記全抗体発現ベクターでリポフェクタミンを用いて形質転換させ、その後、Ｇ４１８添加の選択培地とＭＴＸ添加の選択培地で生き残った細胞クローンを分離することにより、本発明の変異体抗体を発現するベクターで形質転換された細胞株を製造することができた。その中でも、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８で形質転換された形質転換細胞株９Ｅ８をＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００１年６月２１日に第ＫＣＴＣ １０４０ＢＰ号で寄託した。
【００８５】
前記で製造した形質転換細胞株で発現する抗体が癌の診断及び治療に使用できるかを確認するために、抗体の抗原結合親和度を決定した。その結果、本発明の方法で製造された抗体はいずれも既存の抗体ＡＫＡ／ＨｚＫより親和度が大きく増加した。変異体の抗原結合親和度をＡＫＡ／ＨｚＫと比較した結果、ＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の親和度（ＫＤ）は１．４５×１０−８Ｍであり、全抗体３Ｃ４は１．３３×１０−９Ｍ、全抗体３Ｄ５は２．２７×１０−９Ｍ、全抗体３Ｅ８は０．６５×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）を持ち、これらの数値はＡＫＡ／ＨｚＫの１．４５×１０−８Ｍよりそれぞれ１１倍、６倍及び２２倍が増加した数値である。全抗体ＮＶは１．６６×１０−９Ｍ、全抗体ＮＩは３．３８×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）を持ち、これらの数値はＡＫＡ／ＨｚＫの１．４５×１０−８Ｍよりそれぞれ約８倍及び４倍が増加した数値である。
【００８６】
次いで、３Ｅ８のヒト化軽鎖を任意のヒト軽鎖で置換させ、３Ｅ８抗体よりヒトへの投与の際に免疫反応を誘発する可能性が減少し且つＴＡＧ−７２に対する抗原結合能に優れた抗体を製造するために、配列番号２１で表される軽鎖可変領域をヒト抗体の軽鎖で置換した新規抗体を製造した。
【００８７】
本発明のヒト化抗体の軽鎖を代替することが可能なヒト軽鎖を選別するために、ＰＢＬ(peripheral blood lymphocytes)からヒト軽鎖ライブラリを製造した。具体的に、ヒトＰＢＬから総ＲＮＡを分離し、これを鋳型としてヒト軽鎖ｃＤＮＡを選択的に合成した後、ｃＤＮＡを鋳型としてヒト軽鎖(Kappa chain)可変領域(variable region)の５’特異プライマーとヒトカッパー軽鎖不変領域の３’末端特異プライマーを用いてヒト抗体軽鎖遺伝子をＰＣＲを用いて選択的に増幅した。前記ＰＣＲから得たＤＮＡ断片とｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８ベクターをそれぞれＳａｃＩとＸｂａＩで切断した後、精製し、精製された２つのＤＮＡ断片を接合(ligation)させた後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｎ ｂｌｕｅを形質転換させた。
【００８８】
ＴＡＧ−７２に対する抗原結合親和度が増加した新規抗体を製造するために、前記で製造したヒト軽鎖ライブラリを含んでいるＥ．ｃｏｌｉに対して３回にわたってコロニーリフトアッセイを行い、１、２、３回検索した後に得られたクローンの抗原結合能が３Ｅ８ Ｆａｂに比べて優れるかを調べるために、ビオチン結合３Ｅ８ Ｆａｂを用いた競争的ＥＬＩＳＡを行った。
【００８９】
前記検索過程で選別されたクローンの抗原結合能を確認して、３Ｅ８ Ｆａｂと類似の抗原結合能を持つクローンを分離し、精製されたＦａｂ抗体の抗原結合能を確認した結果、本発明の３Ｅ８ Ｆａｂより高い抗原結合能を持つことを確認した。このクローンをｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２と命名した。３Ｅ８／ＢＳＭ２２クローンの軽鎖可変領域塩基配列を確認した結果、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を持ち、これをコードする核酸配列は配列番号２３のヌクレオチド配列を持った。
【００９０】
前記ヒト軽鎖可変領域を含む全ＩｇＧ型のヒト化抗体を製造するために、ヒト化抗体３Ｅ８の発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８の軽鎖可変領域遺伝子のクローニング位置に、配列番号２３の核酸配列を持つ軽鎖可変領域遺伝子をクローニングした。
【００９１】
前記発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８の軽鎖遺伝子内に可変領域遺伝子のみをクローニングし得るように、可変領域と不変領域の連結部位にＢｓｉＷＩ制限酵素認識配列を入れたカセットベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８を製造した。その後、抗体遺伝子の信号配列と前記ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２内にあるヒト軽鎖可変領域配列を組み換えＰＣＲ方法で連結して合成し、ＨｉｎｄIIIとＢｓｉＷＩ制限酵素を用いてｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８のＨｉｎｄIII−ＢｓｉＷＩ位置にサブクローニングしてｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２を製造した。ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２は、ＫＣＴＣに２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４７ＢＰ号で寄託した。
【００９２】
リポフェクタミンを用いて前記で製造した本発明の発現プラスミドを動物細胞に導入して形質転換させ、これの動物細胞で全ＩｇＧを発現させた。
【００９３】
前記で製造された動物細胞で発現する抗体の抗原結合親和度を競争的ＥＬＩＳＡ方法で測定し、本発明の３Ｅ８抗体の抗原結合親和度と比較した結果、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体は、３Ｅ８抗体より抗原結合能にさらに優れることを確認した（図９）。具体的に、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の親和度（ＫＤ）は約０．４５×１０−９Ｍであるが、３Ｅ８抗体のＫＤは０．６５×１０−９Ｍと決定され、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体が３Ｅ８抗体より約１．５倍さらに高い抗原結合親和度を持つことを確認した。
【００９４】
前記で製造した本発明の発現プラスミドｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２をｄｈｆｒ欠乏ＣＨＯ細胞にトランスフェクションさせた後、Ｇ４１８添加の選択培地とＭＴＸ添加の選択培地で生き残った細胞クローンを分離することにより、本発明のｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２発現ベクターで形質転換された形質転換細胞株４Ｄ１２−Ｂ３１を製造し、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４６ＢＰ号で寄託した。
【００９５】
前記結果より確認されるように、本発明の新規な抗体は、抗原結合親和度に優れ且つ免疫誘発能の低いヒト化抗体なので、癌の診断及び治療に有用に使用できる。
【００９６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００９７】
実施例１-ＡＫＡヒト化重鎖ＣＤＲ３のライブラリ製造
ヒト化抗体ＡＫＡより抗原結合親和度が増加した新規なヒト化抗体を製造するために、まず、配列番号１で表されるＡＫＡ抗体のヒト化重鎖ＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうち、１番目の９９番セリン（Ｓｅｒ）、２番目の１００番ロイシン（Ｌｅｕ）、３番目の１０１番アスパラギン（Ａｓｎ）、４番目の１０２番メチオニン（Ｍｅｔ）及び５番目の１０３番アラニン（Ａｌａ）を無作為に突然変異させた（図１）。
【００９８】
具体的に、ヒト化抗体ＡＫＡの遺伝子発現ベクターｐＣ３−Ｑ−ＡＫＡ／ＨｚＫ（韓国登録特許第３１８７６１号）を鋳型として、配列番号７で表されるプライマーＶＨ１３５と配列番号８で表されるプライマーＨＣＤＲ３ＢＡＣＫの対、及び配列番号９で表されるプライマーＨＣＤＲ３ＦＯＲＷＡＲＤと配列番号１０で表されるプライマーＬＨＳ１１の対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３分間予備変性した後、９５℃で５０秒間、５５℃で５０秒間、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素(polymerase)を用いて２５回行った。プライマーＶＨ１３５とＨＣＤＲ３ＢＡＣＫの対を用いたＰＣＲから得られた２９６ｂｐ ＤＮＡ断片と、プライマーＨＣＤＲ３ＦＯＲＷＡＲＤとＬＨＳ１１の対を用いたＰＣＲから得られた１８０ｂｐサイズのＤＮＡ断片をアニーリングし、プライマーＶＨ１３５とＬＨＳ１１を用いて組み換えＰＣＲを行い、４５８ｂｐサイズのＤＮＡ断片を得た。組み換えＰＣＲ反応は、９５℃で３分間予備変性した後、９５℃で５０秒間、５５℃で５０秒間、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を用いて２５回行った。前記組み換えＰＣＲから得たＤＮＡ断片と、ｐＣ３−Ｑ−ＡＫＡ／ＨｚＫベクターをそれぞれ制限酵素ＸｈｏＩとＡｐａＩで切断した後、精製し、切断された２つのＤＮＡ断片を１６℃で一晩放置して接合させた後、７０℃で１０分間加熱して酵素を不活性化させた。その後、グリコゲンと３Ｍ酢酸ナトリウム(sodium acetate)を２０μＬずつ添加させ、−２０℃でエタノールを加えてＤＮＡを一晩沈殿させた。沈殿したＤＮＡを７０％のエタノールで洗浄した後、乾燥させて２０μＬの蒸留水に懸濁させ、前記ライブラリＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｎ Ｂｌｕｅに電気衝撃遺伝子伝達法(electroporation)で形質転換させた。前記形質転換過程を具体的に説明すると、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｎ Ｂｌｕｅ細胞を２×ＹＴ５００ｍＬで３７℃におけるＯＤ(Optical density)が０．５〜０．７程度となるまで振とう培養した後、氷上で３０分間放置した。４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液を除去した後、沈殿した細胞を１０％グリセロール５００ｍＬに懸濁した。４℃、５０００ｒｐｍで１５分間さらに遠心分離して上澄み液を除去した後、沈殿した細胞を１０％グリセロール２５０ｍＬに懸濁し、４℃、５０００ｒｐｍで１５分間さらに遠心分離した。上澄み液を除去し、沈殿した細胞を１０％グリセロール２０ｍＬに懸濁した後、４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液を除去し、しかる後に、細胞を１０％グリセロール１〜２ｍＬに懸濁してコンピテント(competent)細胞を製造した。前記コンピテント細胞を１．５ｍＬのチューブに３００μＬずつ分注し、使用するまで−７０℃に保管した。
【００９９】
実施例２−抗原結合能の高い変異体クローンの選別
ＴＡＧ−７２に結合する新規ヒト化抗体を探し出すために、前記実施例１で製造したライブラリ細胞をコロニーリフトアッセイ方法(Radosevic et al,. J. Immunol. Methods, 2003, 272(1-2), 219-233)で検索を行った（図２）。
【０１００】
このために、まず、２×ＹＴＡプレートに直接ニトロセルロース膜(nitrocellulose membrane)を敷き、その上に約１，０００，０００個の細胞を塗抹した後、一晩培養させる。このときの膜をマスタ膜(master membrane)という。
【０１０１】
その間、抗原結合能の強い細胞を探すための捕獲膜(capture membrane)にＴＡＧ−７２（＋）抗原としてのＢＳＭ（bovine submaillary mucin、ｔｙｐｅ−Ｉ−Ｓ、Ｓｉｇｍａ社製）を１０μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ(phosphate buffered saline)と共に３７℃で６時間放置してコートした。この膜をＰＢＳで２回程度洗浄した後、５％脱脂乳(skim milk)を添加して３７℃で２時間放置した。脱脂乳を除去した後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１ｍＭ ＩＰＴＧ(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)入りの２×ＹＴ培地に濡らした。この捕獲膜を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１ｍＭ ＩＰＴＧ入りの２×ＹＴプレート上にのせた後、その上に、ライブラリ細胞を塗抹したマスタ膜をのせて、常温で１６〜２４時間放置した。
【０１０２】
前記捕獲膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りのＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で５回洗浄した後、脱脂乳入りのＰＢＳによって３７℃で６時間放置した。抗原としてのＢＳＭに結合したクローンを探すために、捕獲膜にホースラディシュペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)が付着している抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体を１：１０００で希釈して添加した後、３７℃で１時間放置した。結合していない抗体を無くすために、ＰＢＳＴで５回程度洗浄し、ＥＣＬで反応させて抗原結合能を確認した。
【０１０３】
このように抗原結合能を確認した細胞を同位置のマスタ膜から得て２×ＹＴＡを添加した後、３７℃でＯＤが約０．７となるまで成長させた後、前記と同様の過程によってコロニーリフトアッセイを行った。１、２及び３次スクリーニングの後に得られたＦａｂクローンの結合能が野性型ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂに比べて優れるかを調べるために、競争的ＥＬＩＳＡを行った。
【０１０４】
競争的ＥＬＩＳＡのために、３次スクリーニングの後に得られたＥ．ｃｏｌｉ Ｆａｂクローンを３７℃で振とう培養しながら、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ値が０．５〜１．０となるように成長させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧ溶液で３０℃で一晩培養してＦａｂの発現を誘導した。培養上澄み液のみを分離し、前記Ｆａｂ抗体が野生型ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂに比べて抗原結合能に優れるかを調べるために、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにＢＳＭ各１μｇずつを一晩中コートし、２％ＢＳＡでブロックさせた後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ビオチン結合野生型ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂ抗体（１ｍｇ／ｍＬで１：２０００の濃度で希釈して使用）と前記検索過程で得たＦａｂ抗体をそれぞれ２５μＬずつ一つのウェルに共に入れた後、３７℃で１時間反応させ、ＴＢＳ−Ｔによって抗原に結合していない抗体を除去した。ＴＡＧ−７２に結合するビオチン化ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂの相対的な量を確認するために、ビオチンと結合することが可能なストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(Streptavidin-alkaline phosphatase)を１：１０００の濃度で希釈して５０μＬずつ添加し、３７℃で３０分間反応した。結合していないストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを除去するために、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、パラ−ニトロフェニルスルフェニル(para-nitrophenylphosphate)溶液５０μＬで少なくとも２０分間発色させ、４０５〜４５０ｎｍで吸光度を測定した。この際、陽性対照群(positive control)は５μｇ／ｍＬのＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂと１０μｇ／ｍＬのＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂを使用し、陰性対照群は２％ＢＳＡのみを使用した。競争的ＥＬＩＳＡにおいて、対照群のＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂを入れた値よりＥＬＩＳＡ値をさらに低く示す変異体クローンを選別し、次の実施例３と同様に各クローンの抗原結合能を分析した。
【０１０５】
実施例３−変異体クローンの抗原結合能の分析
前記検索過程で選択された各クローンＦａｂの抗原結合能を分析するために、変異体クローンを３７℃で振とう培養しながら６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ値が０．５〜１．０となるように成長させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧ溶液で３０℃で一晩培養してＦａｂの発現を誘導した。細胞を収去し、ＴＥＳ（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ スクロース緩衝溶液）を用いて浸透圧衝撃(osmotic shock)を与え、ペリプラズム抽出物(periplasmic extract)に在る、溶解された変異体Ｆａｂ抗体を確保した。
【０１０６】
変異体Ｆａｂの抗原結合特性と結合能を調べるために、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにＢＳＭとＢＳＡの各１μずつを一晩中コートし、２％ＢＳＡでブロックさせた後、ＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。ペリプラズム抽出物に存在するＦａｂ抗体を添加して３７℃で１時間反応させ、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液によって、抗原に結合していない抗体を除去した。２次抗体で抗ヒトＦ（ａｂ’）２ＩｇＧ ＨＲＰをＴＢＳ−Ｔで希釈して結合させ、ＯＰＤとＨ２Ｏ２で発色させて４９２ｎｍで吸光度を測定した。
【０１０７】
その結果、野性型ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂより著しく優れた抗原結合能を持つクローンを分離し、各変異体クローンのＨＣＤＲ３部位塩基配列をＴ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖ２．０ ＤＮＡシーケンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で決定して全塩基配列を確認した結果、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６で表される相異なるアミノ酸配列をコードしていることを確認した（図３参照）。この変異体のＦａｂをそれぞれ３Ｃ４、３Ｄ５、３Ｅ８、ＮＶ、ＮＩと命名し、これらの発現ベクターをそれぞれｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、ｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８、ｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、ｐＣ３−Ｑ−ＮＩと命名した。
【０１０８】
実施例４−ヒト化クローンの全ＩｇＧ発現のための発現プラスミドの製造
抗原結合能に最も優れたＦａｂ変異体３Ｅ８から全ＩｇＧ型の抗体を製造するために、抗体遺伝子の信号配列、前記Ｆａｂ変異体の可変領域、ヒト抗体の不変領域を組み換えＰＣＲ方法を用いて合成した（図４）。
【０１０９】
具体的に、抗体遺伝子の信号配列を合成するために、全ＩｇＧ型のヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＡＫＡ／ＨｚＫを鋳型とし、配列番号１１で表されるプライマーＬＨＳ３９と配列番号１２で表されるプライマーＬＨＳ４３の対を用いてＰＣＲを行った。その結果、９６ｂｐサイズのＤＮＡ断片を合成した。
【０１１０】
また、前記Ｆａｂ変異体の重鎖の可変領域遺伝子の前部分を合成するために、前記ｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、ｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８、ｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、ｐＣ３−Ｑ−ＮＩベクターを鋳型として、配列番号１３で表されるプライマーＬＨＳ４４と配列番号１４で表されるｔｙｐｅ Ｃ ｂａｃｋプライマーを用いてＰＣＲを行った結果、３０６ｂｐサイズのＤＮＡ断片が合成された。しかも、前記可変領域遺伝子の後ろ部分を合成するために、ｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、ｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８、ｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、ｐＣ３−Ｑ−ＮＩベクターをそれぞれ鋳型として、前方プライマーとして、配列番号１５で表されるｔｙｐｅ Ｃ ｆｏｒｗａｒｄプライマーを用い、後方プライマーとして、配列番号１０で表されるＬＨＳ１１プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３分間予備変性した後、９４℃で５０秒間、５５℃で５０秒間、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を用いて２５回行った。その結果、１５９ｂｐサイズのＤＮＡ断片が合成されたことを確認した。前記３つのＤＮＡ断片（９６ｂｐ、３０６ｂｐ、１５９ｂｐ）を鋳型とし、配列番号１０で表されるプライマーＬＨＳ１１と配列番号１１で表されるプライマーＬＨＳ３９でＰＣＲを行ってこれらを互いに連結することにより、それぞれ５３１ｂｐサイズのＤＮＡ断片を合成し、前記ＤＮＡ断片の両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、既存のＡＫＡ／ＨｚＫヒト化抗体遺伝子がクローニングされている動物発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＡＫＡ／ＨｚＫのＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩの位置に挿入して本発明の発現プラスミドを製造し、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｃ４、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｄ５、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＶ、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＩと命名し、特にｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８は２００１年６月２日付けで生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（受託番号；ＫＣＴＣ １０３９ＢＰ）。
【０１１１】
実施例５−ヒト化抗体の抗原結合親和度の決定
前記で製造された抗体の抗原結合能及び抗原結合親和度を決定するために、まず、前記実施例４で製造した本発明の発現プラスミドを動物細胞内に導入させて全ＩｇＧ型の抗体を製造した。
【０１１２】
まず、ＣＯＳ７細胞を、牛胎児血清が１０％添加されたＤＭＥＭ培養培地（ＧＩＢＣＯ）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で継代培養した。前記細胞を１００ｍｍの培養皿に１×１０６細胞／ｍＬの濃度で接種し、３７℃で一晩培養した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ（ＧＩＢＣＯ）溶液で３回洗浄した。一方、前記で製造した抗体発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｃ４、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｄ５、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＶ、ｐｄＣＶＭ−ｄｈｆｒ−ＮＩを５μｇずつ取ってＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ５００μＬで希釈し、２５μＬのリポフェクタミン（Lipofectamine、ＧＩＢＣＯ）も同様にＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ５００μＬで希釈した。前記発現ベクターとリポフェクタミン希釈液を１５ｍＬのチューブに混合してＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を製造した後、これを１５分以上室温で放置した。前記それぞれのＤＮＡ−リポフェクタミン混合物に５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉを添加し、これをきれいに洗浄されたＣＯＳ７細胞に均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で４８時間培養することにより、本発明の３Ｃ４、３Ｄ５、３Ｅ８、ＮＶ及びＮＩ抗体を発現させた。
【０１１３】
前記細胞の培養液から得た３Ｃ４、３Ｄ５、３Ｅ８、ＮＶ、ＮＩ抗体の抗原結合能と抗原結合親和度をＥＬＩＳＡで測定した。まず、ＢＳＭをウェル当たり２５０ｎｇずつ免疫プレート(immunoplate)に入れた後、４℃で一晩培養してプレートに結合させ、その後、２％ＢＳＡでブロックさせ、ＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。前記で得た全ＩｇＧ変異体が含まれたＣＯＳ７細胞培養液をＰＢＳを用いて希釈した後、同一の濃度でプレートに添加して３７℃で３０分間反応させ、抗原に結合していない抗体をＴＢＳ−Ｔで除去した。２次抗体として用いられた抗ヒトＩｇＧ(Fc specific)−ＨＲＰをＴＢＳ−Ｔを用いて１：５０００の濃度で希釈して前記１次抗体に結合させ、ＯＰＤとＨ２Ｏ２で発色させて４９２ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１４】
３Ｅ８抗体の抗原結合親和度をＡＫＡ／ＨｚＫと比較、決定するために、本発明者らは、様々な濃度の競争抗原と亜飽和(submaximum)濃度の３Ｃ４、３Ｄ５、３Ｅ８、ＮＶ、ＮＩ或いはＡＫＡ／ＨｚＫ抗体を混合して３７℃で３時間静置した後、２５０ｎｇの抗原を予め結合させたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加えて３０分間結合させ、しかる後に、抗ヒトＩｇＧ(Fc specific)−ＨＲＰを結合させる競争的(competitive)ＥＬＩＳＡ方法によって発色の度合いを測定した。
【０１１５】
その結果、ＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の親和度（ＫＤ）は、１．４５×１０−８Ｍ、３Ｃ４は１．３３×１０−９Ｍ、３Ｄ５は２．２７×１０−９Ｍ、３Ｅ８は０．６５×１０−９Ｍ、ＮＶは１．６６×１０−９Ｍ、ＮＩは３．３８×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）を持つことが分かった。これは、各変異体抗体がＡＫＡ／ＨｚＫの１．４５×１０−８Ｍよりそれぞれ約１１倍、６倍、２２倍、８倍及び４倍が増加した抗体であることを意味する（図５ａ及び図５ｂ）。
【０１１６】
実施例６−３Ｅ８抗体の発現細胞株の製造
前記３Ｅ８抗体を生産するために、３Ｅ８抗体の発現ベクターであるｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８で形質転換されたＣＨＯ細胞株を製造した。
【０１１７】
まず、ＤＨＦＲ−ｍｉｎｕｓ ＣＨＯ細胞株であるＤＧ４４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９０９６）を、牛胎児血清が１０％添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地（ＧＩＢＣＯ）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で継代培養した。前記細胞を１００ｍｍの培養皿に１×１０６細胞／ｍＬの濃度で接種し、３７℃で一晩培養した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ（ＧＩＢＣＯ）溶液で３回洗浄した。一方、実施例４で製造した抗体発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８を５μｇ取ってＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ５００μＬで希釈し、２５μＬのリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ）も同様にＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ５００μＬで希釈した。前記抗体発現ベクターとリポフェクタミン希釈液を１５ｍＬのチューブに混合してＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を製造した後、これを１５分以上室温で放置した。前記それぞれのＤＮＡ−リポフェクタミン混合物に５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉを添加し、これをきれいに洗浄されたＤＧ４４細胞に均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で６時間培養し、これに子牛血清２０％含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地３ｍＬを添加して同一の条件で４８時間培養した。このように変異体発現ベクターが形質転換された形質転換細胞を、ヌクレオチドの添加されていないＭＥＭ−α培地に１０％透析されたＦＢＳと５５０μｇ／μＬ濃度のＧ４１８が添加されて製造された選択培地で１×１０４細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、９６ウェルプレートに分注した。１週間以上培養した後、コロニーを形成する各細胞クローンが生成する抗体の量をＥＬＩＳＡ方法で測定して、高濃度で抗体を発現する細胞クローンを選別した。
【０１１８】
ＥＬＩＳＡは、抗ヒトＩｇＧをウェル当たり１００ｎｇずつ免疫プレートに入れた後、４℃で一晩培養してプレートに結合させた、その後２％ＢＳＡでブロックさせ、ＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。前記で得た細胞培養液をＰＢＳを用いて希釈した後、プレートに添加して３７℃で１時間反応させ、抗原に結合していない抗体をＴＢＳ−Ｔで除去した。２次抗体として用いられた抗ヒトＩｇＧ(Fc specific)−ＨＲＰをＴＢＳ−Ｔを用いて１：５０００の濃度で希釈して前記１次抗体と結合させ、ＯＰＤとＨ２Ｏ２で発色させて４９２ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１９】
これらのクローンの中から、多量の抗体を分泌するクローンを選定し、２０ｎＭ ＭＴＸを添加した培地で２週間培養した後、さらに８０ｎＭ ＭＴＸが添加された選択培地で培養した。これらのクローンの中から、最も高い濃度で抗体を発現するクローンを選択して９Ｅ８細胞株と命名し、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００１年６月２１日に第ＫＣＴＣ １０４０ＢＰ号で寄託した。
【０１２０】
実施例７−全ＩｇＧ変異体の精製及び抗原結合親和度の確認
前記実施例６で製造した９Ｅ８細胞株を無血清培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII）で培養した後、前記培養液をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を通過させ、カラムに結合した抗体を０．１Ｍグリシン溶液（ｐＨ７．０）で溶出させた後、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ９．０）で中和させ、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）で透析した。精製された３Ｅ８抗体を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル相で電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した。
【０１２１】
その結果、図６に示すように、この抗体を還元させたとき、重鎖及び軽鎖の分子量として知られている５５ｋＤａ及び２５ｋＤａの分子量を示すタンパク質バンドが検出された（レイン１参照）。前記結果より、本発明の９Ｅ８細胞が四量体からなる全抗体を製造することを確認した。
【０１２２】
また、精製された３Ｅ８抗体の抗原結合親和度を前記実施例５と同様の方法で測定した結果、約０．６５×１０−９Ｍであることを確認した。
【０１２３】
実施例８−ヒト軽鎖ライブラリの製造
前記の３Ｅ８ヒト化抗体よりＨＡＭＡ反応の可能性が少なく且つ抗原結合能はそのまま保有した、新規な抗体を製造しようとした。このために、３Ｅ８抗体のヒト化軽鎖をヒト軽鎖で代替するために、まず、Ｈｏｆｍａｎ等の方法(Hofman et al., 1982, Am. J. Clin. Pathol., 77(6):710-713)を用いて分離したヒトＰＢＬ(peripheral blood lymphocytes)からヒト軽鎖ライブラリを製作した。
【０１２４】
具体的に、ヒトＰＢＬからＲＮＡを分離し、これを鋳型として、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と配列番号２４で表されるプライマーＣＫ１ｄを用いてヒト軽鎖ｃＤＮＡを選択的に合成した。さらに、前記ｃＤＮＡを鋳型とし、ヒト軽鎖のＫａｐｐａ可変領域の配列番号２５〜配列番号２９で表される５’特異プライマーＶＫ１、ＶＫ２、ＶＫ３、ＶＫ４及びＶＫ５とプライマーＣＫ１ｄをそれぞれ対として用いて、ヒト抗体軽鎖遺伝子をＰＣＲによって選択的に増幅した。
【０１２５】
この際、これらのＰＣＲ反応は、９５℃で５分間予備変性した後、９５℃で５０秒間、５５℃で５０秒間、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用し、ヒト抗体の多様性を高めるために２０回行った。
【０１２６】
前記ＰＣＲから得たヒト軽鎖ライブラリのＤＮＡ断片をＳａｃＩ−ＸｂａＩで切断した後、本発明のヒト化抗体３Ｅ８のＦａｂ発現ベクターであるｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８のＳａｃＩ−ＸｂａＩ位置に挿入した。
【０１２７】
具体的に、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８ベクターをそれぞれ制限酵素ＳａｃＩとＸｂａＩで切断して精製し、前記ＰＣＲから得たＤＮＡ断片を１６℃で一晩放置して接合させた後、７０℃で１０分間加熱して酵素を不活性化させた。その後、グリコゲンと３Ｍ酢酸ナトリウムを添加させ、−２０℃でエタノールを加えてＤＮＡを一晩沈殿させた。沈殿したＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させて２０μＬの蒸留水に懸濁し、前記ライブラリＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｎ ｂｌｕｅに電気衝撃遺伝子伝達法によって導入した。
【０１２８】
実施例９−抗原結合能の高い３Ｅ８／ＢＳＭ２２変異体クローンの選別
実施例８で製造したライブラリ細胞からＴＡＧ−７２に結合する新規抗体を探し出すために、前記実施例２と同様にコロニーリフトアッセイを行った。抗原結合能を示す細胞クローンの結合能が野性型３Ｅ８ Ｆａｂに比べて優れるかを調べるために、前記実施例２と同様に、ビオチン結合３Ｅ８ Ｆａｂ抗体を用いて競争的ＥＬＩＳＡを行った。その結果、対照群である３Ｅ８ Ｆａｂを入れた値よりＥＬＩＳＡ値をさらに低く示す変異体クローンを得た。
【０１２９】
実施例３と同様に、各クローンの抗原結合能を分析した結果、野性型である３Ｅ８ Ｆａｂより優れた抗原結合能を持つクローンを分離した。このクローンの軽鎖可変領域の塩基配列をＴ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖ２．０ ＤＮＡシーケンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で決定して確認した結果、配列番号２２で表されるアミノ酸配列をコードしていることを確認した（図７）。この変異体のＦａｂを３Ｅ８／ＢＳＭ２２と命名し、この発現ベクターをｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２と命名した。
【０１３０】
実施例１０−全ＩｇＧ型の３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の発現プラスミドの製造
前記３Ｅ８／ＢＳＭ２２のヒト軽鎖を含む全ＩｇＧ型の３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体を製造するために、本発明のヒト化抗体３Ｅ８の発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８の軽鎖遺伝子のクローニング位置に前記ヒト軽鎖遺伝子をクローニングした。
【０１３１】
まず、本発明者らは、前記発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８の軽鎖遺伝子内に可変領域遺伝子のみをクローニングし得るように、可変領域と不変領域との連結部位にＢｓｉＷＩ制限酵素認識配列を入れたカセットベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８を製造した（図８）。具体的に、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８を鋳型として、配列番号３０で表されるプライマーＬＨＳ４２とＫＣＢｓｉＷＩｂａｃｋ、及び配列番号３２で表されるプライマーＫＣＢｓｉＷＩｆｏｒとＣＫ１ｄをそれぞれ対として用いてＰＣＲを行った後、さらに、配列番号３０で表されるプライマーＬＨＳ４２とＣＫ１ｄを用いて組み換えＰＣＲを行った。これを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで切った後、元々のｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８ベクターの軽鎖部位に置換してｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８を製作した（図８）。
【０１３２】
その後、本発明者らは、軽鎖遺伝子の信号配列と前記ＢＳＭ２２の可変領域配列とを組み換えＰＣＲ方法で連結して可変領域遺伝子を合成した。具体的に、抗体遺伝子の信号配列を合成するために、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＡＫＡ／ＨｚＫを鋳型とし、配列番号３０及び配列番号３３で表されるプライマーＬＨＳ４２及びＫＣｌｅａｄｅｒＢａｃｋを対としてＰＣＲを行った。また、前記Ｆａｂのヒト軽鎖可変領域遺伝子を合成するために、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２に配列番号３４及び配列番号３１で表されるプライマーＫＣｆｏｒ及びＫＣＢｓｉＷＩｂａｃｋを用いてＰＣＲを行い、さらに、信号配列とヒト軽鎖可変領域とを連結するために、配列番号３０及び配列番号３１で表されるプライマーＬＨＳ４２及びＫＣＢｓｉＷＩｂａｃｋを用いて組み換えＰＣＲを行った。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で５分間予備変性した後、９４℃で５０秒、５５℃で５０秒、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を用いて３０回行った。
【０１３３】
前記ＤＮＡ断片の両端を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢｓｉＷＩで切断した後、前記動物発現ベクターであるｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８のＨｉｎｄIII−ＢｓｉＷＩ位置に挿入して本発明の発現プラスミドを製造し、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２と命名した。このｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２は、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４７ＢＰ号で寄託した。
【０１３４】
実施例１１−３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の抗原結合親和度の決定
本発明の３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の抗原結合親和度を決定するために、本発明の発現プラスミドｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２を前記実施例５と同様にＣＯＳ７細胞に導入させて全ＩｇＧを製造した後、細胞培養液に存在する本発明の３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の抗原結合親和度を競争的ＥＬＩＳＡによって測定した。その結果、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体のＫＤは約４．５×１０−１０Ｍであるが、３Ｅ８抗体のＫＤは６．５×１０−１０Ｍと決定され、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体が３Ｅ８抗体より約１．５倍さらに高い抗原結合親和度を持つことを確認した（図９）。
【０１３５】
実施例１２−３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の発現細胞株の製造
前記３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体を生産するために、前記実施例６と同様に、発現ベクターであるｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２で形質転換されたＣＨＯ細胞株を製造した。
【０１３６】
このＣＨＯ細胞株の中から、高濃度で抗体を発現する成長速度の良い細胞株を選択して、４Ｄ１２−Ｂ３１細胞株と命名し、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４６ＢＰ号で寄託した。
【０１３７】
実施例１３−ＡＫＡと３Ｅ８抗体の生物学的分布(Biodistribution)及び癌ターゲッティング(tumor targeting)
ヒト大腸癌を異種移植した胸腺欠損マウス(athymic mice)の３Ｅ８及びＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の生体内分布及び癌ターゲッティング能力を研究した。精製された３Ｅ８及びＡＫＡ／ＨｚＫを１２５Ｉ−放射性同位元素で標識し、放射化学的(radiochemical)純度をＴＬＣ(Thin layer chromatography)を用いて測定した結果、９９％以上であった。１２５Ｉで標識されたＡＫＡ／ＨｚＫまたは３Ｅ８をマウスモデルに静脈内注射し、１２５Ｉ−ＡＫＡ／ＨｚＫまたは３Ｅ８の生体内分布を、注射４、２４、４８及び７２時間後に調査した。各癌または分化された組織における％ＩＤ／ｇは、図１０及び表１に示した。ＡＫＡ／ＨｚＫ（図１０のＡ）及び３Ｅ８（図１０のＢ）は、癌にターゲッティングすることを示し、２４時間で最大を示し、全ての調査時点で、癌は３Ｅ８をＡＫＡ／ＨｚＫより高く吸収した。ところが、１２５Ｉ−３Ｅ８は、試験期間中に、癌において大抵には維持されるが、癌に蓄積された１２５Ｉ−ＡＫＡ／ＨｚＫは、時間依存的方式で減少した。その結果、注射２４、４８または７２時間後、癌の１２５Ｉ−３Ｅ８吸収は１２５Ｉ−ＡＫＡ／ＨｚＫに比べてそれぞれ約１６７％、２２４％または２３６％であった。これは、３Ｅ８がＡＫＡ／ＨｚＫより親和度が高くて癌に対する結合力が高いことを意味する。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】
実施例１４−３Ｅ８の放射免疫治療効果
３Ｅ８抗体の抗癌効果を試験するために、２つの方法、すなわち癌成長阻害効果の分析と生存率の分析によって試験した。まず、癌成長阻害効果を分析するために、ヒト大腸癌を異種移植した８匹の胸腺欠損マウス(athymic mice)の静脈に１３１Ｉ−３Ｅ８（２０ｍｇ／７．４ＭＢｑ、２００ｍＣｉ）で週１回ずつ６回投与した。対照群のマウス（８匹）では、１３１Ｉ−３Ｅ８の代わりに３Ｅ８を使用した。その結果、１３１Ｉ−３Ｅ８で投与されたマウスは癌の成長が遅延することが分かった（図１１）。治療したマウスにおける癌のＴｄ(tumor doubling time)１３．２日は、対照群マウス（ｕｎｌａｂｅｌｅｄ ３Ｅ８）５．６日より著しく長かった。対照群マウスの体重は時間経過に伴って１０２％程度であり、治療したマウスの体重は元体重の８７％に減少したことからみて、体重の変化は激しくないことが分かった。
【０１４０】
１３１Ｉ−３Ｅ８で治療されたマウスの生存率を考察するために、胸腺欠損マウス（７匹）に６週間毎週１３１Ｉ−３Ｅ８ ７．４ＭＢｑで投与した。治療を受けたマウスの５０％生存率は、対照群マウスの４２．５日から９０．５日に延長され、対照群マウスより５０％生存率が２．１倍高いことを示す（図１２）。対照群マウスの体重は時間経過に伴ってあまり増加せず、治療したマウスの体重は１０％程度減少したことからみて、体重の変化は激しくないことが分かった。
【０１４１】
〔産業上の利用可能性〕
本発明のＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖を突然変異させ、抗原に対する親和度の増加したヒト化抗体、及び前記ヒト化抗体の軽鎖をヒト軽鎖で置換して抗原結合親和度が増加したヒト化抗体を提供することにより、このような抗体またはこれを含む抗癌組成物は、既存のＡＫＡ／ＨｚＫ抗体よりＴＡＧ−７２抗原に対する結合親和度が高く、既存のＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体より癌の診断及び治療に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、配列番号１で表される、癌特異抗原ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖ＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうち、９９番目から１０３番目までのアミノ酸を無作為に突然変異させ、突然変異された抗体の発現ベクターを製造する方法を示す概略図である。
【図２】図２は、抗原に対する親和度の高い変異体Ｆａｂクローンを選別するためのコロニーリフトアッセイを示す。
【図３】図３は、抗原に対する親和度の高い変異体クローンの重鎖可変領域アミノ酸配列を示す結果である。
【図４】図４は、抗原結合親和度の最も高い変異体３Ｅ８の全ＩｇＧ発現のためのプラスミドを製造する方法を示す概略図である。
【図５ａ】図５ａは、ＩｇＧ型の３Ｅ８、３Ｃ４、３Ｄ５、ＮＶ及びＮＩ抗体と既存のＩｇＧ型のＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の抗原結合能を比較して示すグラフである。
【図５ｂ】図５ｂは、ＩｇＧ型の３Ｅ８、３Ｃ４、３Ｄ５、ＮＶ及びＮＩ抗体と既存のＩｇＧ型のＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の抗原結合能を比較して示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の抗体を還元した場合と還元していない場合の分子量を示す電気泳動写真である。
【０１４３】
レイン１：還元した場合、レイン２：還元していない場合
【図７】図７は、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体のヒト軽鎖可変領域アミノ酸配列をＡＫＡ／ＨｚＫの軽鎖可変領域のアミノ酸配列と比較したものである。
【図８】図８は、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の全ＩｇＧ発現のためのプラスミドを製造する方法を示す概略図である。
【図９】図９は、３Ｅ８と３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の抗原結合親和度をＡＫＡ／ＨｚＫと比較した結果を示す（白丸は３ＥＢ、黒三角は３Ｅ８／ＢＳＭ２２、黒丸はＡＫＡ／ＨｚＫを示す）。
【図１０】図１０は、ヒト大腸癌を異種移植した胸腺欠損マウス(athymic mice)の３Ｅ８及びＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の生体内分布及び癌ターゲッティング能力を研究したものであって、１２５Ｉで標識されたＡＫＡ／ＨｚＫまたは３Ｅ８をマウスモデルに静脈内注射し、１２５Ｉ−ＡＫＡ／ＨｚＫ（Ａ）または１２５３Ｅ８（Ｂ）生体内分布におけるＡＫＡと３Ｅ８抗体の生物学的分布及び癌ターゲッティング能力を考察したものである。
【図１１】図１１は、癌成長阻害効果を分析するために３Ｅ８抗体の放射免疫治療効果を考察したものであって、１２５Ｉ−３Ｅ８（黒丸）、３Ｅ８（黒四角）が投与されたマウスにおける癌のＴｄ（ａ）及び体重変化（ｂ）を考察したものである。
【図１２】図１２は、癌成長阻害効果を分析するために３Ｅ８抗体の放射免疫治療効果を考察したものであって、１２５Ｉ−３Ｅ８（黒丸）、３Ｅ８（黒四角）が投与されたマウスにおける生存率（ａ）及び体重変化（ｂ）を考察したものである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、癌特異抗原ＴＡＧ−７２に特異的なヒト化抗体、及び前記ヒト化抗体を含む抗癌組成物に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
腫瘍特異糖タンパク質−７２（tumor-associated glycoprotein-72、以下「ＴＡＧ−７２」という）は、一種のムチン(mucin)タンパク質であって、例えば大腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、卵素癌などといった広範囲なヒト癌腫(humancarcinomas)に発現する癌特異抗原である。ＴＡＧ−７２に特異的な抗体としては、１９８０年代初め、米国ＮＩＨ国立癌研究所(NIH National Cancer Institute)のＪｅｆｆｒｅｙ Ｓｃｈｌｏｍ博士グループによって、ヒト乳癌組織の膜分画を免疫原として用いて製造したＢ７２．３マウスモノクローナル抗体が最初報告された(Colcher et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(5):3199-3203)。その後、Ｂ７２．３より抗原結合親和度の高い２世代抗体であるＣＣ４９とＣＣ８２などが同研究グループによって開発された(Muraro et al., 1988, Cancer Res., 48(16):4588-4596)。
【０００３】
ＣＣ４９またはＣＣ８３は、８０％以上の大腸癌と約５０％の乳癌に結合したが、正常組織には殆ど結合しなかった。また、１３１Ｉで標識されたＣＣ４９またはＣＣ８３を用いて癌患者を対象として生体内イメージングを行った結果、原発性癌と転移した癌を検出した(Divgi et al.,1994, Nucl. Med. Biol.,21(1):9-15)。ところが、マウスモノクローナル抗体を人体に繰り返し投与したとき、人体免疫反応の誘発により、副作用が生じるか或いは治療効果が減少した。このような免疫反応を最小限に減らすために、マウス抗体の抗原結合部位であるＣＤＲ(complementarity determining region)とＦＲ(framework region)の幾らかのアミノ酸残基をヒト抗体に移植させたヒト化抗体を製造してきた(Owens et al, 1994, J. Immunol. Methods, 168(2):149-65)。実際、このようなヒト化抗体を患者に繰り返し投与する場合、人体免疫反応が大幅減少することが報告された(Brown et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2663)。
【０００４】
ＴＡＧ−７２抗体に対するヒト化抗体研究の一環として、マウス抗体のＣＤＲがヒトモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖のＦｒに移植され且つ抗原結合−位置構造の保存に必要なマウスＦｒ残基は保有する、マウスモノクローナル抗体ＣＣ４９のヒト化抗体（ＨｕＣＣ４９）が製造された(Kashmiri et al., Hybridoma 14:461-473, 1995)。
【０００５】
米国特許第５，９７６，５３１号は、ヒトカッパーサブグループIV生殖系列遺伝子（human kappa subgroup IV germline gene：Ｈｕｍ４ＶＬ）由来の軽鎖可変領域ＶＬと、ＴＡＧ−７２との結合能を持つ３次構造を形成するために軽鎖可変領域に結合することが可能な重鎖可変領域ＶＨとを有するＴＡＧ−７２特異的抗体であるＨｕｍ４ＶＬ、ＶＨ抗体について記述している。
【０００６】
米国特許第６，４９５，１３７号は、ＣＣ４９、ＣＣ８３、ＣＣ４６、ＣＣ９２、ＣＣ３０、ＣＣ１１などのＴＡＧ−７２に対するマウス抗体(murine anti-TAG-72 antibody)軽鎖ＣＤＲがＨｕｍ４ＶＬに移植されたＣＤＲ移植軽鎖(CDR-grafted light chain)を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体またはその断片について開示している。
【０００７】
この他にも、多様なＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体が開発されたにも拘わらず、依然として、高い抗原結合性を持ちながらもヒトにおいて免疫反応を誘発させるおそれの低い抗体が必要であった。
【０００８】
そこで、本発明者らは、先行発明において、ＴＡＧ−７２に対するマウス抗体ＣＣ４９のＣＤＲ及びＦＲ配列と最も類似したヒト遺伝子を検索し、このヒト遺伝子を対象としてヒト化抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子を製造した後、これらを発現ベクターにクローニングして宿主細胞を形質転換し、しかる後に、これを培養してヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫを開発した（韓国特許第０３１８７６１号）。ヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫは、既存のヒト化抗体ＨｕＣＣ４９に比べてＣＤＲ及びＦＲのアミノ酸残基がよりヒトに近く置換され、ヒトに対してさらに減少した免疫原性を持つが、抗原結合能は既存の抗体と実質的に殆ど類似である。それにも拘わらず、人体における免疫反応の誘発は減少させ且つ抗原結合能及び親和度はさらに増加させた、機能的に優れた抗体に対する必要性は依然として求められている。
【０００９】
このような背景の下で、本発明者らは、ＴＡＧ−７２に対する結合能及び親和力に優れた抗体を製造するために、既存のヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖可変領域のＣＤＲ３領域を無作為に突然変異させてヒト化重鎖ライブラリ細胞を製作し、このライブラリ細胞を対象としてコロニーリフトアッセイ(colony lift assay)を施して抗原結合能の高い変異体クローンを選別した後、選別されたクローンを対象として競争的ＥＬＩＳＡを行って各クローンの抗原結合能を分析する方法によって、ＴＡＧ−７２に対する抗原結合能と抗原結合親和度が増加した新規抗体を製造し、ひいては前記新規ヒト化抗体の軽鎖をヒト軽鎖で置換したヒト化抗体を製造することにより、本発明を完成した。
【００１０】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、（i）配列番号１のアミノ酸配列において１００番〜１０３番のアミン酸残基の少なくとも一つが置換できる重鎖可変領域、及び（ii）配列番号２１または配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有する、ＴＡＧ−７２(tumor-associated glycoprotein-72)に対するヒト化抗体を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、前記重鎖可変領域をコードする核酸配列、及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む組み換えベクターを提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、前記形質転換体を培養して前記ヒト化抗体を製造する方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、前記抗体を含む抗癌組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、前記抗体を投与して癌を治療または予防する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、前記抗体を投与して癌を診断する方法を提供することにある。
【００１８】
本発明の前記および他の目的、特徴および他の利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能であろう。
【００１９】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、（i）配列番号１のアミノ酸配列において１００番〜１０３番のアミノ酸残基が下記配列式１で表される配列を持つアミノ酸配列の重鎖可変領域、及び（ii）配列番号２１または配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有する、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体に関する。
【００２０】
［配列式１］
−Ｘ１００−Ｘ１０１−Ｘ１０２−Ｘ１０３−
式中、Ｘ１００はロイシン（Ｌｅｕ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０１はイソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）またはアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０２はメチオニン（Ｍｅｔ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０３はアラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）またはグリシン（ｇｌｙ）アミノ酸残基である。
【００２１】
マウス由来抗体は、人体内で抗原として作用し、これに対する新しい抗体（Human Anti-Mouse Antibody：ＨＡＭＡ、ヒト抗マウス抗体）が生成されるために好ましくない免疫反応を誘発する。このような点を克服するために、人体において非ヒト抗体の免疫原性を減少させるための提案が行われた。ヒト化(Humanization)技術と命名されたこの技術は、一般に、抗体分子のポリペプチド鎖を暗号化するＤＮＡ配列を操作する組み換えＤＮＡ技術を使用する。ヒト化抗体製造の初期方法は、非ヒト抗体の抗原結合部位全体からなる抗体結合部位と、ヒト抗体の不変領域とを連結させたキメラ抗体を生産するものである。国際公開特許第ＷＯ８６／０１５３３は、マウス抗体起源の可変性領域のみをヒト抗体不変領域と結合させてヒト化させたキメラ抗体を製造する方法を開示している。このようなキメラ抗体の場合、マウス抗体より免疫反応を少なく起こし且つ機能を増進させるという利点を示した。ところが、キメラ抗体は、マウスの可変領域、すなわち言い換えれば非ヒト可変性領域のアミノ酸配列を依然として含有しているので、ヒトに繰り返し投与する場合、依然としてＨＡＭＡ反応を起こす。
【００２２】
キメラ抗体をさらにヒト化させるために、抗原間の結合機能を示すマウスモノクローナル抗体のＣＤＲ部分をヒト抗体のＦＲと組み換えさせる試みが、マウス抗体の結合特異性と親和度を維持させながら人体には免疫反応を誘発しないという概念の下にあった(Jones et al., 1986, Nature, 4;321(6069):522-525)。前述したマウス抗体のＣＤＲループ(loop)部分をヒト抗体に移植するＣＤＲ移植方法によって製造されたヒト化抗体は、非ヒトアミノ酸配列を一層小さい割合で含んでいるため、キメラ抗体よりＨＡＭＡ反応を一層少なく起こるようにもするが、抗原結合親和度が低い可能性がある。抗体の結合能を維持するために、元抗体であるマウス抗体のＦＲ領域が必要となる可能性もあるので、ＣＤＲ構造に影響すると推定される幾つかのＦＲ領域のアミノ酸残基をマウス抗体のもので置換して元来のマウス抗体と類似の水準に親和度を増進させることもできた(Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323-327; Queen et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10023-10029; Tempest et al., 1991, Biol. Technology, 9:266-271; Co et al., 1991, Nature, 351:501-502)。
【００２３】
本発明において、用語「ヒト化抗体(humanized antibody)」とは、以上述べたように、ヒトに対して免疫原性がないかまたは免疫原性が減少した抗体を総称する。ヒト化抗体はアミノ酸配列が変形された抗体(altered antibody)であり、抗体のアミノ酸配列は所望の目的に合わせて再構成することができる。このような数多くの変化は、一つまたは幾つかのアミノ酸を変化させることから、抗体の可変及び／または不変領域を安全に再構成することまで可能である。一般に可変領域の変形が抗原結合能と親和度を増大させるために行われるのに比べ、不変領域における変形は補体(complement)の固定、膜との相互作用及びその他の効果剤の機能といった細胞内作用を増大させるために行われる。
【００２４】
本発明に関連したヒト化抗体は、マウス抗体ＣＣ４９の軽鎖及び重鎖の配列と最も類似した遺伝子をジーンバンクデータベース(GeneBank data base)から選別し、これらの遺伝子それぞれをヒト軽鎖不変領域遺伝子Ｃκ及びヒト重鎖不変領域遺伝子Ｃγ１と組み換えさせて得た先行発明のヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖可変領域のＣＤＲ３部位を突然変異させて得た抗体であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域と配列番号２１で表されるアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域とを有するＡＫＡ／ＨｚＫより抗原結合能及び親和度が増加した抗体である。
【００２５】
前記において、用語「可変領域」とは、抗原と特異的に結合する機能を行いながら、配列上の多くの変異(variation)を示す抗体分子の部分を意味する。この可変領域には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が存在する。相補性決定領域（complementarity determining regions：ＣＤＲ）は、抗原の認識に関与する環状の部位であって、この部位の配列が変わるにつれて抗体の抗原に対する特異性が決定される重要な部位である。本発明は、具体的に、ＣＤＲ３のアミノ酸配列変異によって、抗原結合親和度を増加させた抗体を製造した。ＣＤＲの間に適切な配向で存在する「フレームワーク領域（frame work：ＦＲ）」は、ＣＤＲ環を支持する役割を果たし、具体的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含む。本発明の抗体重鎖可変領域は、１番〜３０番のＦＲ１部位、３１番〜３５番のＣＤＲ１、３６番〜４９番のＦＲ２、５０番〜６６番のＣＤＲ２、６７番〜９８番のＦＲ３、９９番〜１０４番のＣＤＲ３、及び１０５番〜１１５番のＦＲ４からなっている。本発明の抗体軽鎖可変領域は、１番〜２３番のＦＲ１部位、２４番〜４０番のＣＤＲ１、４１番〜５５番のＦＲ２、５６番〜６２番のＣＤＲ２、６３番〜９４番のＦＲ３、９５番〜１０３番のＣＤＲ３、及び１０４番〜１１３番のＦＲ４からなっている。
【００２６】
本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列において重鎖可変領域中のＣＤＲ３の１０１番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９７番）のアスパラギン（Ａｓｎ）残基が脂肪族(aliphatic)残基で置換されるとき、ＴＡＧ−７２に対する親和度が増加することが分かった。本発明において、脂肪族タンパク質は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはアラニンを意味する。
【００２７】
具体的な様態として、本発明は、（i）配列番号１のアミノ酸配列において１０１番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９７番）のアスパラギン残基が脂肪族残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはアラニン残基で置換され、１００番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９６番）のロイシン残基がトリプトファン残基で置換され、及び／または１０２番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９８）のメチオニン残基がグルタミン残基で置換され、及び／または１０３番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９９）のアラニン残基がグルタミン残基、グリシンで置換されたアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び（ii）配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。
【００２８】
より好ましくは、重鎖可変領域の１０１番のアスパラギン残基がバリン、１０２番のメチオニン残基がグルタミン、１０３番のアラニン残基がグリシンで置換されたものである。よって、配列番号２で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体３Ｃ４を提供する。また、より好ましくは、重鎖可変領域の１０１番のアスパラギン残基がイソロイシン、１０２番のメチオニン残基がグルタミン、１０３番のアラニン残基がグリシンで置換されたものである。よって、配列番号３で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体３Ｄ５を提供する。また、より好ましくは、重鎖可変領域の１０１番のアスパラギン残基がイソロイシン、１００番のロイシン残基がトリプトファン、１０３番のアラニン残基がグルタミンで置換されたものである。よって、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体３Ｅ８を提供する。また、より好ましくは、重鎖可変領域の１０１番のアスパラギン残基がバリンで置換されたものである。よって、配列番号５で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体ＮＶを提供する。また、より好ましくは、重鎖可変領域の１０１番のアスパラギン残基がイソロイシンで置換されたものである。よって、配列番号６で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体ＮＩを提供する。
【００２９】
前記の抗体はいずれも、既存の抗体ＡＫＡ／ＨｚＫより親和度が大きく増加した抗体であって、全(whole)抗体３Ｃ４は１．３３×１０−９Ｍ、全抗体３Ｄ５は２．２７×１０−９Ｍ、全抗体３Ｅ８は０．６５×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）をそれぞれ有するが、これらの数値は、ＡＫＡ／ＨｚＫの１．４５×１０−８Ｍよりそれぞれ約１１倍、６倍及び２２倍が増加した数値である。全抗体ＮＶは１．６６×１０−９Ｍ、全抗体ＮＩは３．３８×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）をそれぞれ有し、これらの数値は、ＡＫＡ／ＨｚＫの１．４５×１０−８Ｍよりそれぞれ約８倍及び４倍が増加した数値である。
【００３０】
本発明者らは、前記抗体の軽鎖をヒト軽鎖で代替しようとした。
【００３１】
ヒト化軽鎖を代替して重軽可変領域と共に使用できるヒト軽鎖を選別するために、ヒトＰＢＬ(peripheral blood lymphocytes)からヒト軽鎖ライブラリを製作した後、ヒト軽鎖ＤＮＡ断片を、最も優れた効果を示すヒト化抗体３ＥＢのＦａｂ発現ベクターであるｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８にヒト化軽鎖遺伝子の代わりに挿入し、抗原結合能の高い変異体クローンを選別するためにリフトアッセイを行った。細胞クローンの結合能が野性型３Ｅ８ Ｆａｂに比べて優れたクローンを分離した後、このクローンの軽鎖可変領域の塩基配列を確認したところ、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を持つことを確認することができた。前記の方法によって得た、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を持つヒト軽鎖可変領域は、通常の遺伝子組み換え方法によって前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域で代替することができる。
【００３２】
別の具体的な様態として、本発明は、１０１番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９７番）のアスパラギン残基が脂肪族残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはアラニン残基で置換され、１００番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９６番）のロイシン残基がトリプトファン残基で置換され、及び／または１０２番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９８）のメチオニン残基がグルタミン残基で置換され、及び／または１０３番（Ｋａｂａｔ Ｎｏ：９９）のアラニン残基がグルタミン残基、グリシンで置換されたアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び（ii）配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。
【００３３】
好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。また、好ましくは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。また、好ましくは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。また、好ましくは、配列番号５で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。また、好ましくは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体を提供する。
【００３４】
前記の抗体はいずれも、既存の抗体ＡＫＡ／ＨｚＫより親和度が大幅増加した抗体である。その中でも、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体３Ｅ８／ＢＳＭ２２が最も好ましい。全３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体は、３Ｅ８抗体の０．６５×１０−９Ｍより約１．５倍が増加した０．４５×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）を有する。
【００３５】
本発明において、「抗体」は、全抗体型だけでなく、抗体分子の機能的断片を含む。全抗体は２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を持つ構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合によって連結されている。抗体分子の機能的断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の不変領域、及び重鎖の第１不変領域ＣＨ１を持つ構造であって、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に少なくとも一つのシステイン残基を含むヒンジ領域を持つという点において、Ｆａｂと差異がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを持っている最小の抗体断片である。Ｆｖ断片を生成する組み換え技術は、国際公開特許ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合によって重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合によって連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すると、Ｆａｂを得ることができ、全抗体をペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、好ましくは、遺伝子組み換え技術によって製作することができる。本発明において、抗体は、好ましくはＦａｂ型または全抗体型である。
【００３６】
本発明で提供するヒト化抗体は、全種類の不変領域と組み換え的な方法によって結合できる。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）タイプを持ち、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を持つ。軽鎖不変領域は、カッパー（κ）及びラムダ（λ）タイプを持つ(Coleman et al., Fundamental Immunology, 2nd Ed., 1989, 55-73)。好ましくは、重鎖不変領域はガンマ１及びガンマ３であり、最も好ましくは、重鎖不変領域はガンマ１イソタイプである。好ましくは、軽鎖不変領域はカッパータイプである。本発明において、好ましい抗体はカッパー（κ）軽鎖とガンマ１（γ１）重鎖を持つＦａｂ型またはＩｇＧ１型である。
【００３７】
本発明の抗体の不変領域は、そのアミノ酸配列が変異された変異体を含む。好ましくは、免疫グロブリン不変領域変異体は、変異体のタンパク質配列がヒトのそれと相異しなくて免疫反応を誘発しない範囲内において、アミノ酸配列上の誘導と修飾によってタンパク質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性または可溶性が増加し、或いは硫化結合形成、発現宿主との親和性、補体との結合、Ｆｃ受容体との結合、及び抗体依存性細胞毒性などが改善された変異体である。
【００３８】
別の様態において、本発明は、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域をコードする核酸配列に関する。
【００３９】
重鎖可変領域をコードする核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において１０１番のアスパラギン残基が脂肪族残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはアラニン残基で置換され、１００番のロイシン残基がトリトプファン残基で置換され、及び／または１０２番のメチオニン残基がグルタミン残基で置換され、及び／または１０３番のアラニン残基がグルタミン残基、グリシンで置換されたアミノ酸配列をコードする。好ましくは、配列番号２、３、４、５または６で表されるアミノ酸配列をコードする配列である。
【００４０】
より好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は配列番号１６のヌクレオチド配列を持つ核酸配列であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は配列番号１７のヌクレオチド配列を持つ核酸配列であり、配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は配列番号１８のヌクレオチド配列を持つ核酸配列であり、配列番号５で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は配列番号１９のヌクレオチド配列を持つ核酸配列であり、配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は配列番号２０のヌクレオチド配列を持つ核酸配列である。
【００４１】
軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、配列番号２２で表される軽鎖可変領域をコードする。好ましくは、配列番号２３のヌクレオチド配列を持つ核酸配列である。
【００４２】
前記抗体の不変領域及び可変領域をコードする核酸配列は、組み換え発現ベクターに挿入されて発現する。
【００４３】
別の様態として、本発明は、前記重鎖可変領域をコードする核酸配列、及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む組み換えベクターに関する。
【００４４】
好ましくは、配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列からなるグループの中から選択される重鎖可変領域、及び配列番号２１または２２で表されるアミノ酸配列からなるグループの中から選択される軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む組み換えベクターに関する。具体的な例において、ｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、ｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８、ｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、ｐＣ３−Ｑ−ＮＩまたはｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２である組み換えベクターを提供する。また、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｃ４、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｄ５、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＶ、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＩまたはｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２である組み換えベクターを提供する。
【００４５】
本発明において、用語「組み換えベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現することが可能な発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００４６】
本発明において、「作動可能に連結された(operably linked)」とは、一般的機能を行うように、核酸発現調節配列と、目的タンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。組み換えベクターの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡの切断及び連結は、当該技術分野で一般に知られている酵素などを用いて容易に実現することができる。
【００４７】
本発明の適切な発現ベクターは、例えばプロモータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどの発現調節エレメントの他にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列を含むことができる。開始コドン及び終結コドンは、一般に、免疫原性標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部と見なされるもので、遺伝子作製物が投与されたとき、個体において必ず作用を示さなければならず、コーディング配列とインフレーム(in frame)にあるべきである。一般プロモータは、構成的または誘導性である。原核細胞にはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３及びＴ７のプロモータがあるが、前記例示に限定されるものではない。真核細胞には猿ウィルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫ウィルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶの長末端反復部（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモータだけでなく、β−アクチンプロモータ、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネイン由来のプロモータがあるが、前記例示に限定されるものではない。
【００４８】
発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含むことができる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、または表面タンパク質の発現といった選択可能な表現型を与えるマーカーが使用できる。選択剤(selective agent)が処理された環境では選別マーカーを発現する細胞のみが生存するので、形質転換された細胞が選別可能である。また、ベクターは、複製可能な発現ベクターの場合、複製が開始される特定の核酸配列である複製起点(replication origin)を含むことができる。ウィルス（例えば、バキュロウィルス）またはファージベクター、及びレトロウィルスベクターのような、宿主細胞のゲノム内に挿入できるベクターも使用可能である。
【００４９】
全抗体または抗体断片を発現するベクターは、軽鎖と重鎖を一つのベクターで同時に発現させるベクターシステム、または軽鎖と重鎖をそれぞれ別途のベクターで発現させるシステムが可能である。後者の場合、２つのベクターは同時形質転換(co-transformation)及び標的形質転換(targeted transformation)によって宿主細胞に導入し、軽鎖（または重鎖）を含有するベクターで形質転換された細胞を選別し、軽鎖を発現する選別された細胞を重鎖（または軽鎖）含有ベクターでさらに形質転換することにより、軽鎖及び重鎖の両方ともを発現する細胞を最終的に選別する。
【００５０】
Ｆａｂ型の抗体を作製するために、ヒト軽鎖の可変領域ＶＬと不変領域ＣＬ及びヒト重鎖の可変領域ＶＨと第１不変領域ドメインＣＨ１のアミノ酸をコードする遺伝子が挿入されたベクターを利用する。本発明では、具体的には例えばｐＣｏｍｂ３ＨＳＳベクターを使用し、より好ましくは、重鎖の一番目のアミノ酸であるグルタミンを維持させるために、ベクターのｘｈｏＩ位置の前にあるアミノ酸配列ＥＶＱＬ（グルタミン酸−バリン−グルタミン−ロイシン）をＱＶＱＬ（グルタミン−バリン−グルタミン−ロイシン）に変形し、及び／または可溶性Ｆａｂを発現させるためにｇｅｎｅIIIを除去したベクターｐＣ３−Ｑを使用した。このベクターはｌａｃＺプロモータを有し、シグナルペプチドはＯｍｐＡとｐｅｌＢを持つことを特徴とする。
【００５１】
好ましい様態において、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、配列番号３で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−３ＥＢ、配列番号５で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−ＮＩ、並びに配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表される軽鎖可変領域を含むｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２などを提供する。
【００５２】
全抗体を製作するために、ヒト軽鎖の可変領域ＶＬと不変領域ＣＬ、及びヒト重鎖の可変領域ＶＨと全不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３をコードする遺伝子が挿入されたベクターを用いる。本発明の具体的な例では、ｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ（ＫＣＴＣ ８６７１Ｐ：韓国登録特許第１６２０２１号）を用いて作った、２つの発現単位を持つｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒを用いた。前記ベクターは、それぞれのプロモータにおいて、重鎖と軽鎖が発現する２つのＣＭＶプロモータを有することを特徴とする。
【００５３】
好ましい様態において、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｃ４、配列番号３で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｄ５、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８、配列番号５で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＶ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２１で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＩ、並びに配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、及び配列番号２２で表される軽鎖可変領域を含むｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２などを提供する。
【００５４】
その中でも、全抗体３Ｅ８を発現するｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８ベクターは、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００１年６月２１日に第ＫＣＴＣ １０３９ＢＰ号で寄託され、全抗体３Ｅ８／ＢＳＭ２２を発現するｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２ベクターは、ＫＣＴＣに２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４７ＢＰ号で寄託された。
【００５５】
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体に関する。
【００５６】
前記ベクターの適切な宿主細胞は、例えばエシェリキアコリ(Escherichia coli)、バチルスサブチルス(Bacillus subtilis)、ストレプトミセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、プロテウスミラビリス(Proteus mirabilis)、スタヒロコッカス(Staphylococcus)などの原核細胞であってもよい。また、アスペルギルス属(Aspergillus species)などの真菌、ピキア酵母(Pichia pastoris)、サッカロマイセスセレヴィジエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、アカバンカビ(Neurospora crassa)などの酵母、その他の下等真核細胞、及び昆虫からの細胞などの高等真核生物の細胞といった真核細胞であってもよい。また、植物、哺乳動物から由来してもよい。好ましくは、猿腎臓細胞７（ＣＯＳ７：monkey kidney cells）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、ＣＨＯ(Chinese hamster ovary)細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ(baby hamster kidney)細胞、ＭＤＣＫ、骨隋腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及び２９３細胞を含むが、これに限定されるものではない。好ましくは、ＣＨＯ細胞である。本発明のｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８ベクターが、ＣＨＯ細胞としてリポフェクタミンを用いた方法で形質転換された、形質転換細胞株９Ｅ８を製造し、ＫＣＴＣに２００１年６月２１日に第ＫＣＴＣ １０４０ＢＰ号で寄託した。また、本発明のｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２ベクターをＣＨＯ細胞に形質転換して形質転換細胞株４Ｄ１２−Ｂ３１を製造し、ＫＣＴＣに２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４６ＢＰ号で寄託した。
【００５７】
本発明において、宿主細胞への「形質転換」は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法も含み、当分野で公知になっているように、宿主細胞に応じて適切な標準技術を選択して行うことができる。このような方法は、電気衝撃遺伝子伝達法(electroporation)、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌、アグロバクテリア媒介形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミン、及び乾燥／抑制媒介形質転換方法などを含むが、前記例示に限定されるものではない。
【００５８】
別の様態として、本発明は、前記形質転換体を培養してヒト化抗体を製造する方法に関する。
【００５９】
前記抗体の製造において、形質転換体の培養は、当業界に知られている適切な培地と培養条件に応じて行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。
【００６０】
形質転換体を培養して得た抗体は、精製していない状態で使用でき、さらに多様な通常の方法、例えば透析、塩沈殿、クロマトグラフィーなどを用いることができ、これらを単独でまたは組み合わせて用いることができる。その中でもクロマトグラフィーが最も多く用いられており、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどがある。
【００６１】
前記方法で製作された抗体は、抗原に対する親和度が増加した抗体である。用語「親和度」は、抗原の特定の部位を特異的に認識し結合する能力であって、このような抗体の抗原に対する特異性と共に高度の親和度は、免疫反応において重要な要素である。本発明では、重鎖可変領域を無作為に突然変異させてヒト化重鎖ライブラリ細胞を製作し、このライブラリ細胞を対象としてコロニーリフトアッセイを施して抗原結合能の高い変異体クローンをまず選別し、選別されたクローンを対象として競争的ＥＬＩＳＡを行って各クローンの親和度を調査した。その他にも、抗原に対する親和度を測定するための多様な方法を使用することができるが、表面プラスモン共鳴技術（surface plasmon resonance technology：ＳＲＰ）がその例である。
【００６２】
本源に用いられる用語「ＫＤ」は、特定抗体−抗原相互作用の解離定数を称し、抗体の抗原に対する親和度を測定する尺度として使用された。前記方法によって製作した本発明の抗体は、抗原ＴＡＧ−７２に結合可能な能力が元来の抗体ＡＫＡ／ＨｚＫより著しかった。
【００６３】
したがって、前記方法によって製作された親和度が増加した抗体は、癌の診断及び治療に有用に応用できる。抗体は、それ自体、または抗体を含む組成物として提供できる。
【００６４】
別の様態として、本発明は、前記抗体を用いて癌を診断する方法に関する。
【００６５】
本発明の抗体は、ＴＡＧ−７２に高い親和性で結合するので、ＴＡＧ−７２と前記抗体との結合体の形成を検出ラベル(detection label)のシグナルサイズを定性または定量的に測定することができ、これによって癌か否かを診断することができる。抗原−抗体複合体の形成を定性または定量的に測定することを可能にするラベルは、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微粒子、レドックス分子及び放射線同位元素などが例示されるが、これらに限定されるものではない。実際、免疫組織化学的染色(immunohistochemistry)結果、本発明の抗体が大腸癌に対して非常に強い反応性を示すことを確認した。
【００６６】
また、本発明の抗体は、イメージングマーカー(imaging marker)に結合させて患者に投与し、これを確認することにより、ヒトの腫瘍またはそれらの転移を診断することができる。本発明の抗体は、既存の抗体より抗原に対する親和力が高く、よりヒト化された抗体なので、患者への投与に非常に適する。抗体−イメージングマーカー結合体(antibody-imaging marker conjugated)の投与及び確認と抗体のイメージングマーカーへの連結方法は、(Goldenberg et al., 1978, New England J. Med. 298, 1384-1388; Goldenberg et al., 1983,J. Amer. Med. Assoc. 280, 630-635; Goldengerg et al.,1983, Gastroenterol. 84, 524-532; Siccardi et al., 1986, Cancer Res. 46, 4817-4822; Epenetos et al., 1985, Cancer 55, 984-987; Philben et al., 1986, Cancer 57, 571-576; Chiou et al., 1986, Cancer Inst. 76, 849-855; Colcher et al., 1983, Cancer Res., 43, 736-742; Colcher, E. et al., Laboratory Research Methods in Biology and Medicine Immunodiagnostics. New York, Alan R. Liss. pp. 215-258(1983); Keenan, A.M. et al., 1984, J. Nucl. Med. 25, 1197-1203; Colcher D. et al., 1987, Cancer Res. 47, 1185-1189; Estaban, J.M. et al., 1987, Intl. J. Cancer 39, 50-59; Martin, D.T., et al., 1984, Curr. Surg. 41, 193-194; Martin, E.W. Jr. et al., 1986, Hybridoma 5, S97-S108; Martin, D.T. et al., 1985, Am. J. Surg. 150, 672-675; Meares et al., Anal. Biochem. 1984, 142, 68-78; and Krejcarek et al., 1977, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77, 581-585)などの文献に記述されている。投与量は、患者の年齢と体重に応じて変わり得る。抗体−イメージングマーカー結合体の投与量は、正常組織とは区別される腫瘍部位を可視化させるか或いは確認することができるように効果的な量でなければならない。
【００６７】
抗体に結合することが可能なイメージングマーカーの例は、当分野の技術者に公知になっており、ガンマスキャナ(gamma scanner)または手動ガンマプローブ(hand held gamma probe)または陽性子放出断層撮影器(positron Emission Tomograpy)などを用いて診断画像(diagnostic imaging)によって確認することが可能な物質と、核磁気共鳴分光器(nuclear magnetic resonance spectrometer)などを用いた核磁気共鳴画像によって確認することが可能な物質とを含む。
【００６８】
ガンマスキャナなどによって確認できる物質の適切な例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７ＬＵ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅおよび９９ｍＴｃなどの放射性同位元素を含む。１２５Ｉ、１２３Ｉ、１５３Ｓｍおよび９９ｍＴＣは、少ないエネルギーと広範囲な確認が適切なので好ましい。核磁気共鳴分光器などを用いて確認できる物質の例としては、ガドリニウム（Gadolinium：Ｇｄ）がある。
【００６９】
別の様態として、本発明は、前記抗体を含む抗癌組成物に関する。
【００７０】
本発明において、用語「抗癌」とは、「予防」及び「治療」を含む。ここで、「予防」とは、本発明の抗体を含む組成物の投与によって癌を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、本発明の抗体投与によって癌の症状を好転させるか或いは有利に変更する全ての行為を意味する。
【００７１】
本発明の抗体は、ヒト大腸癌を異種移植したマウスで既存のＡＫＡ／ＨｚＫより高く吸収され、血液における保有力も高かった。ヒト大腸癌を異腫移植したマウスを本発明の抗体に投与する場合、５０％生存率は対照群のマウスより大幅増加した。
【００７２】
本発明の組成物で治療することが可能な癌は、ＴＡＧ−７２が発現するすべての癌を含む。ＴＡＧ−７２はヒト癌腫において広範囲に発現するので、本発明の組成物はＴＡＧ−７２発現のあるすべての癌、例えば大腸癌、卵素癌、胃癌、膵臓癌、乳癌などを治療することができる。
【００７３】
治療用抗体として用いられる場合、その抗体は、既存の治療剤と直接またはリンカーなどを介して間接的にカップリング（例えば、共有結合）されて抗体−治療剤結合体の形で生体内に投入され、癌の治療に利用される。抗体−治療剤結合体において抗体との結合が可能な治療剤は、例えば化学治療剤、放射性核腫(radionuclide)、免疫治療剤、サイトカイン、ケモカイン、毒素、生物作用剤、酵素阻害物質、異形機能性抗体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない：（１）(Goldengerg et al., 1981, Cancer Res. 41, 4354-4360)などの文献に記述されている、１３１Ｉ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、６７Ｇａ、１２５Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１５３Ｓｍ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎなどの放射性核腫(radionuclide)に結合した抗体；（２）(Chabner et al., 1985, Cancer, Principles and Practice of Oncology, Philadelphia, PA, J.B. Lippincott Co. Vol. 1, pp. 290-328)などの文献に記述されている、メトトレキサート(methotrexate)、アドリアマイシン(adriamycin)、及び例えばインターフェロンなどのリンポカイン(lympokine)といった生物学的反応変形体または薬物に結合した抗体；（３）(Uhr et al., 1983, Monoclonal antibodies and Cancer, Academic Press, Inc., pp. 85-98)などの文献に記述されている、リシン、アブリン、ジフテリアなどの毒素に結合した抗体；（４）(Perez et al., 1986, J. Exper. Med. 163, 166-178; and Lau et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 82, 8648-8652)などの文献に記述されている、他の抗体に結合してその複合体が癌細胞と効能細胞の両方ともに結合する異形機能性抗体(heterofunctional antibodies)；（５）(Herlyn et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., (USA) 79, 4761-4765)などの文献に記述されている、自然的な、すなわち非−連関または非−複合された抗体。
【００７４】
抗体組成物の場合、投与方式に応じて許容可能な担体を含んで適切な製剤に製造される。投与方式に適した製剤は、公知になっており、典型的に膜を通過した移動を容易にする界面活性剤を含む。このような界面活性剤は、ステロイドから誘導されたものであるか、或いはＤＯＴＭＡ（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylammonium chloride）などの陽イオン性脂質、またはコレステロールヘミサクシネートやホスファチジルグリセロールなどの各種化合物などがある。
【００７５】
別の様態として、本発明は、前記抗体を投与して癌を治療する方法に関する。
【００７６】
前記組成物は、癌を治療するに十分な量で患者に投与されるが、その投与量は、癌の種類、患者の年齢、体重、症状の特性及び度合い、現治療法の種類、治療回数、投与形態及び経路などの多様な要因によって異なるうえ、当分野の専門家によって決定できる。本発明の組成物は、前記薬理学的または生理学的成分を共に投与または順次投与することができ、また、追加の従来の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができる。このような投与は、単一投与または多重投与である。前記要素を全て考慮に入れて、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定できる。
【００７７】
本発明において、「投与」がいずれの適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味する場合、本発明の抗体を含む組成物の投与経路は、目的の組織に到達することができればいずれの一般的な経路であってもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、胚内投与、および直腸内投与が可能であるが、前記例示に限定されるものではない。ところが、経口投与の際に、タンパク質は消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコートするか、或いは胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞へ移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００７８】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００７９】
まず、本発明のＴＡＧ−７２に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を製作した：
ヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖可変領域は、配列番号１で表されるアミノ酸配列から構成されており、１番〜３０番のＦＲ１部位、３１番〜３５番のＣＤＲ１、３６番〜４９番のＦＲ２、５０番〜６６番のＣＤＲ２、６７番〜９８番のＦＲ３、９９番〜１０４番のＣＤＲ３、及び１０５番〜１１５番のＦＲ４からなっている。その中でも、ＣＤＲ３部位を任意の他のアミノ酸に突然変異させ、元来のＡＫＡ／ＨｚＫ抗体よりＴＡＧ−７２に対する抗原結合能に優れた新規抗体を製造した。
【００８０】
配列番号１で表されるＡＫＡ／ＨｚＫヒト化抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列のうち、ＣＤＲ３部位を示す９９番目のアミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）、１００番目のロイシン（Ｌｅｕ）、１０１番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、１０２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）及び１０３番目のアラニン（Ａｌａ）を無作為に突然変異させた。具体的に、ヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの遺伝子発現ベクターｐＣ３−Ｑ−ＡＫＡ／ＨｚＫ（韓国特許登録第０３１８７６１号のｐＣ３−Ｑ−ＨｚＣＣ４９Ｆａｂ−１−ｄｇIIIベクターの重鎖可変領域の９７番トレオニン残基をアラニンで置換させたもの）を鋳型として、重鎖ＣＤＲ３部位が突然変異された配列を含むプライマーを用いてＰＣＲを行い、その結果、ＣＤＲ３部位が突然変異されたＤＮＡ断片を得た（図１）。得られたＤＮＡ断片とｐＣ３−Ｑ−ＡＫＡ／ＨｚＫベクターをそれぞれＸｈｏＩとＡｐａＩで切断した後、精製し、切断された２つのＤＮＡ断片を結合させた後、ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｎ ｂｌｕｅ（米国、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に形質転換させた。
【００８１】
ＴＡＧ−７２に対する抗原結合親和度が増加した新規抗体を製造するために、前記で製造したヒト化重鎖ライブラリを含んでいるＥ．ｃｏｌｉに対して３回にわたってコロニーリフトアッセイ(J. Immunol. Meth. 272: 219-233, 2003)を行い、１、２、３回検索した後に得られたクローンの抗原結合能がＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂに比べて優れるかを調べるために、ビオチン結合ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂを用いた競争的ＥＬＩＳＡを行った。前記検索過程で選択されたクローンの抗原結合能を確認した結果、９７番のアスパラギン残基が非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンまたはバリンで置換された変異体が、ＡＫＡ／ＨｚＫより高い抗原結合能を持つことが分かった。
【００８２】
前記過程によって分離した変異体クローンをそれぞれ３Ｃ４、３Ｄ５、３Ｅ８、ＮＶ、ＮＩと命名し、前記変異体クローンの重鎖可変領域の塩基配列を分析した結果、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６で表されるアミノ酸配列を持つことを確認した（図３）。
【００８３】
Ｆａｂ型の抗体を全ＩｇＧ型に製造するために、重鎖及び軽鎖の可変領域を全ＩｇＧ型の発現ベクターに挿入する一般的な組み換え方法を行った。まず、抗体遺伝子の信号配列と変異体の可変領域とを連結したＤＮＡ断片を組み換えＰＣＲ方法によって合成し、これをヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの全ＩｇＧ型の発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＡＫＡ／ＨｚＫ（韓国特許第０３１８７６１号）内の重鎖遺伝子の同一制限酵素位置に挿入して全ＩｇＧ型の抗体発現プラスミドを製造した。その中でも、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８は、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００１年６月２１日に第ＫＣＴＣ １０３９ＢＰ号で寄託した。
【００８４】
前記製造した発現ベクターを細胞内に形質転換させて形質転換体を製造した。ｄｈｆｒ欠乏ＣＨＯ細胞を継代培養した後、前記全抗体発現ベクターでリポフェクタミンを用いて形質転換させ、その後、Ｇ４１８添加の選択培地とＭＴＸ添加の選択培地で生き残った細胞クローンを分離することにより、本発明の変異体抗体を発現するベクターで形質転換された細胞株を製造することができた。その中でも、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８で形質転換された形質転換細胞株９Ｅ８をＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００１年６月２１日に第ＫＣＴＣ １０４０ＢＰ号で寄託した。
【００８５】
前記で製造した形質転換細胞株で発現する抗体が癌の診断及び治療に使用できるかを確認するために、抗体の抗原結合親和度を決定した。その結果、本発明の方法で製造された抗体はいずれも既存の抗体ＡＫＡ／ＨｚＫより親和度が大きく増加した。変異体の抗原結合親和度をＡＫＡ／ＨｚＫと比較した結果、ＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の親和度（ＫＤ）は１．４５×１０−８Ｍであり、全抗体３Ｃ４は１．３３×１０−９Ｍ、全抗体３Ｄ５は２．２７×１０−９Ｍ、全抗体３Ｅ８は０．６５×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）を持ち、これらの数値はＡＫＡ／ＨｚＫの１．４５×１０−８Ｍよりそれぞれ１１倍、６倍及び２２倍が増加した数値である。全抗体ＮＶは１．６６×１０−９Ｍ、全抗体ＮＩは３．３８×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）を持ち、これらの数値はＡＫＡ／ＨｚＫの１．４５×１０−８Ｍよりそれぞれ約８倍及び４倍が増加した数値である。
【００８６】
次いで、３Ｅ８のヒト化軽鎖を任意のヒト軽鎖で置換させ、３Ｅ８抗体よりヒトへの投与の際に免疫反応を誘発する可能性が減少し且つＴＡＧ−７２に対する抗原結合能に優れた抗体を製造するために、配列番号２１で表される軽鎖可変領域をヒト抗体の軽鎖で置換した新規抗体を製造した。
【００８７】
本発明のヒト化抗体の軽鎖を代替することが可能なヒト軽鎖を選別するために、ＰＢＬ(peripheral blood lymphocytes)からヒト軽鎖ライブラリを製造した。具体的に、ヒトＰＢＬから総ＲＮＡを分離し、これを鋳型としてヒト軽鎖ｃＤＮＡを選択的に合成した後、ｃＤＮＡを鋳型としてヒト軽鎖(Kappa chain)可変領域(variable region)の５’特異プライマーとヒトカッパー軽鎖不変領域の３’末端特異プライマーを用いてヒト抗体軽鎖遺伝子をＰＣＲを用いて選択的に増幅した。前記ＰＣＲから得たＤＮＡ断片とｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８ベクターをそれぞれＳａｃＩとＸｂａＩで切断した後、精製し、精製された２つのＤＮＡ断片を接合(ligation)させた後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｎ ｂｌｕｅを形質転換させた。
【００８８】
ＴＡＧ−７２に対する抗原結合親和度が増加した新規抗体を製造するために、前記で製造したヒト軽鎖ライブラリを含んでいるＥ．ｃｏｌｉに対して３回にわたってコロニーリフトアッセイを行い、１、２、３回検索した後に得られたクローンの抗原結合能が３Ｅ８ Ｆａｂに比べて優れるかを調べるために、ビオチン結合３Ｅ８ Ｆａｂを用いた競争的ＥＬＩＳＡを行った。
【００８９】
前記検索過程で選別されたクローンの抗原結合能を確認して、３Ｅ８ Ｆａｂと類似の抗原結合能を持つクローンを分離し、精製されたＦａｂ抗体の抗原結合能を確認した結果、本発明の３Ｅ８ Ｆａｂより高い抗原結合能を持つことを確認した。このクローンをｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２と命名した。３Ｅ８／ＢＳＭ２２クローンの軽鎖可変領域塩基配列を確認した結果、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を持ち、これをコードする核酸配列は配列番号２３のヌクレオチド配列を持った。
【００９０】
前記ヒト軽鎖可変領域を含む全ＩｇＧ型のヒト化抗体を製造するために、ヒト化抗体３Ｅ８の発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８の軽鎖可変領域遺伝子のクローニング位置に、配列番号２３の核酸配列を持つ軽鎖可変領域遺伝子をクローニングした。
【００９１】
前記発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８の軽鎖遺伝子内に可変領域遺伝子のみをクローニングし得るように、可変領域と不変領域の連結部位にＢｓｉＷＩ制限酵素認識配列を入れたカセットベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８を製造した。その後、抗体遺伝子の信号配列と前記ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２内にあるヒト軽鎖可変領域配列を組み換えＰＣＲ方法で連結して合成し、ＨｉｎｄIIIとＢｓｉＷＩ制限酵素を用いてｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８のＨｉｎｄIII−ＢｓｉＷＩ位置にサブクローニングしてｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２を製造した。ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２は、ＫＣＴＣに２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４７ＢＰ号で寄託した。
【００９２】
リポフェクタミンを用いて前記で製造した本発明の発現プラスミドを動物細胞に導入して形質転換させ、これの動物細胞で全ＩｇＧを発現させた。
【００９３】
前記で製造された動物細胞で発現する抗体の抗原結合親和度を競争的ＥＬＩＳＡ方法で測定し、本発明の３Ｅ８抗体の抗原結合親和度と比較した結果、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体は、３Ｅ８抗体より抗原結合能にさらに優れることを確認した（図９）。具体的に、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の親和度（ＫＤ）は約０．４５×１０−９Ｍであるが、３Ｅ８抗体のＫＤは０．６５×１０−９Ｍと決定され、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体が３Ｅ８抗体より約１．５倍さらに高い抗原結合親和度を持つことを確認した。
【００９４】
前記で製造した本発明の発現プラスミドｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２をｄｈｆｒ欠乏ＣＨＯ細胞にトランスフェクションさせた後、Ｇ４１８添加の選択培地とＭＴＸ添加の選択培地で生き残った細胞クローンを分離することにより、本発明のｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２発現ベクターで形質転換された形質転換細胞株４Ｄ１２−Ｂ３１を製造し、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４６ＢＰ号で寄託した。
【００９５】
前記結果より確認されるように、本発明の新規な抗体は、抗原結合親和度に優れ且つ免疫誘発能の低いヒト化抗体なので、癌の診断及び治療に有用に使用できる。
【００９６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００９７】
実施例１-ＡＫＡヒト化重鎖ＣＤＲ３のライブラリ製造
ヒト化抗体ＡＫＡより抗原結合親和度が増加した新規なヒト化抗体を製造するために、まず、配列番号１で表されるＡＫＡ抗体のヒト化重鎖ＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうち、１番目の９９番セリン（Ｓｅｒ）、２番目の１００番ロイシン（Ｌｅｕ）、３番目の１０１番アスパラギン（Ａｓｎ）、４番目の１０２番メチオニン（Ｍｅｔ）及び５番目の１０３番アラニン（Ａｌａ）を無作為に突然変異させた（図１）。
【００９８】
具体的に、ヒト化抗体ＡＫＡの遺伝子発現ベクターｐＣ３−Ｑ−ＡＫＡ／ＨｚＫ（韓国登録特許第３１８７６１号）を鋳型として、配列番号７で表されるプライマーＶＨ１３５と配列番号８で表されるプライマーＨＣＤＲ３ＢＡＣＫの対、及び配列番号９で表されるプライマーＨＣＤＲ３ＦＯＲＷＡＲＤと配列番号１０で表されるプライマーＬＨＳ１１の対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３分間予備変性した後、９５℃で５０秒間、５５℃で５０秒間、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素(polymerase)を用いて２５回行った。プライマーＶＨ１３５とＨＣＤＲ３ＢＡＣＫの対を用いたＰＣＲから得られた２９６ｂｐ ＤＮＡ断片と、プライマーＨＣＤＲ３ＦＯＲＷＡＲＤとＬＨＳ１１の対を用いたＰＣＲから得られた１８０ｂｐサイズのＤＮＡ断片をアニーリングし、プライマーＶＨ１３５とＬＨＳ１１を用いて組み換えＰＣＲを行い、４５８ｂｐサイズのＤＮＡ断片を得た。組み換えＰＣＲ反応は、９５℃で３分間予備変性した後、９５℃で５０秒間、５５℃で５０秒間、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を用いて２５回行った。前記組み換えＰＣＲから得たＤＮＡ断片と、ｐＣ３−Ｑ−ＡＫＡ／ＨｚＫベクターをそれぞれ制限酵素ＸｈｏＩとＡｐａＩで切断した後、精製し、切断された２つのＤＮＡ断片を１６℃で一晩放置して接合させた後、７０℃で１０分間加熱して酵素を不活性化させた。その後、グリコゲンと３Ｍ酢酸ナトリウム(sodium acetate)を２０μＬずつ添加させ、−２０℃でエタノールを加えてＤＮＡを一晩沈殿させた。沈殿したＤＮＡを７０％のエタノールで洗浄した後、乾燥させて２０μＬの蒸留水に懸濁させ、前記ライブラリＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｎ Ｂｌｕｅに電気衝撃遺伝子伝達法(electroporation)で形質転換させた。前記形質転換過程を具体的に説明すると、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｎ Ｂｌｕｅ細胞を２×ＹＴ５００ｍＬで３７℃におけるＯＤ(Optical density)が０．５〜０．７程度となるまで振とう培養した後、氷上で３０分間放置した。４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液を除去した後、沈殿した細胞を１０％グリセロール５００ｍＬに懸濁した。４℃、５０００ｒｐｍで１５分間さらに遠心分離して上澄み液を除去した後、沈殿した細胞を１０％グリセロール２５０ｍＬに懸濁し、４℃、５０００ｒｐｍで１５分間さらに遠心分離した。上澄み液を除去し、沈殿した細胞を１０％グリセロール２０ｍＬに懸濁した後、４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液を除去し、しかる後に、細胞を１０％グリセロール１〜２ｍＬに懸濁してコンピテント(competent)細胞を製造した。前記コンピテント細胞を１．５ｍＬのチューブに３００μＬずつ分注し、使用するまで−７０℃に保管した。
【００９９】
実施例２−抗原結合能の高い変異体クローンの選別
ＴＡＧ−７２に結合する新規ヒト化抗体を探し出すために、前記実施例１で製造したライブラリ細胞をコロニーリフトアッセイ方法(Radosevic et al,. J. Immunol. Methods, 2003, 272(1-2), 219-233)で検索を行った（図２）。
【０１００】
このために、まず、２×ＹＴＡプレートに直接ニトロセルロース膜(nitrocellulose membrane)を敷き、その上に約１，０００，０００個の細胞を塗抹した後、一晩培養させる。このときの膜をマスタ膜(master membrane)という。
【０１０１】
その間、抗原結合能の強い細胞を探すための捕獲膜(capture membrane)にＴＡＧ−７２（＋）抗原としてのＢＳＭ（bovine submaillary mucin、ｔｙｐｅ−Ｉ−Ｓ、Ｓｉｇｍａ社製）を１０μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ(phosphate buffered saline)と共に３７℃で６時間放置してコートした。この膜をＰＢＳで２回程度洗浄した後、５％脱脂乳(skim milk)を添加して３７℃で２時間放置した。脱脂乳を除去した後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１ｍＭ ＩＰＴＧ(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)入りの２×ＹＴ培地に濡らした。この捕獲膜を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１ｍＭ ＩＰＴＧ入りの２×ＹＴプレート上にのせた後、その上に、ライブラリ細胞を塗抹したマスタ膜をのせて、常温で１６〜２４時間放置した。
【０１０２】
前記捕獲膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りのＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で５回洗浄した後、脱脂乳入りのＰＢＳによって３７℃で６時間放置した。抗原としてのＢＳＭに結合したクローンを探すために、捕獲膜にホースラディシュペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)が付着している抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体を１：１０００で希釈して添加した後、３７℃で１時間放置した。結合していない抗体を無くすために、ＰＢＳＴで５回程度洗浄し、ＥＣＬで反応させて抗原結合能を確認した。
【０１０３】
このように抗原結合能を確認した細胞を同位置のマスタ膜から得て２×ＹＴＡを添加した後、３７℃でＯＤが約０．７となるまで成長させた後、前記と同様の過程によってコロニーリフトアッセイを行った。１、２及び３次スクリーニングの後に得られたＦａｂクローンの結合能が野性型ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂに比べて優れるかを調べるために、競争的ＥＬＩＳＡを行った。
【０１０４】
競争的ＥＬＩＳＡのために、３次スクリーニングの後に得られたＥ．ｃｏｌｉ Ｆａｂクローンを３７℃で振とう培養しながら、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ値が０．５〜１．０となるように成長させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧ溶液で３０℃で一晩培養してＦａｂの発現を誘導した。培養上澄み液のみを分離し、前記Ｆａｂ抗体が野生型ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂに比べて抗原結合能に優れるかを調べるために、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにＢＳＭ各１μｇずつを一晩中コートし、２％ＢＳＡでブロックさせた後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ビオチン結合野生型ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂ抗体（１ｍｇ／ｍＬで１：２０００の濃度で希釈して使用）と前記検索過程で得たＦａｂ抗体をそれぞれ２５μＬずつ一つのウェルに共に入れた後、３７℃で１時間反応させ、ＴＢＳ−Ｔによって抗原に結合していない抗体を除去した。ＴＡＧ−７２に結合するビオチン化ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂの相対的な量を確認するために、ビオチンと結合することが可能なストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(Streptavidin-alkaline phosphatase)を１：１０００の濃度で希釈して５０μＬずつ添加し、３７℃で３０分間反応した。結合していないストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを除去するために、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、パラ−ニトロフェニルスルフェニル(para-nitrophenylphosphate)溶液５０μＬで少なくとも２０分間発色させ、４０５〜４５０ｎｍで吸光度を測定した。この際、陽性対照群(positive control)は５μｇ／ｍＬのＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂと１０μｇ／ｍＬのＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂを使用し、陰性対照群は２％ＢＳＡのみを使用した。競争的ＥＬＩＳＡにおいて、対照群のＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂを入れた値よりＥＬＩＳＡ値をさらに低く示す変異体クローンを選別し、次の実施例３と同様に各クローンの抗原結合能を分析した。
【０１０５】
実施例３−変異体クローンの抗原結合能の分析
前記検索過程で選択された各クローンＦａｂの抗原結合能を分析するために、変異体クローンを３７℃で振とう培養しながら６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ値が０．５〜１．０となるように成長させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧ溶液で３０℃で一晩培養してＦａｂの発現を誘導した。細胞を収去し、ＴＥＳ（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ スクロース緩衝溶液）を用いて浸透圧衝撃(osmotic shock)を与え、ペリプラズム抽出物(periplasmic extract)に在る、溶解された変異体Ｆａｂ抗体を確保した。
【０１０６】
変異体Ｆａｂの抗原結合特性と結合能を調べるために、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにＢＳＭとＢＳＡの各１μずつを一晩中コートし、２％ＢＳＡでブロックさせた後、ＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。ペリプラズム抽出物に存在するＦａｂ抗体を添加して３７℃で１時間反応させ、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液によって、抗原に結合していない抗体を除去した。２次抗体で抗ヒトＦ（ａｂ’）２ＩｇＧ ＨＲＰをＴＢＳ−Ｔで希釈して結合させ、ＯＰＤとＨ２Ｏ２で発色させて４９２ｎｍで吸光度を測定した。
【０１０７】
その結果、野性型ＡＫＡ／ＨｚＫ Ｆａｂより著しく優れた抗原結合能を持つクローンを分離し、各変異体クローンのＨＣＤＲ３部位塩基配列をＴ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖ２．０ ＤＮＡシーケンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で決定して全塩基配列を確認した結果、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６で表される相異なるアミノ酸配列をコードしていることを確認した（図３参照）。この変異体のＦａｂをそれぞれ３Ｃ４、３Ｄ５、３Ｅ８、ＮＶ、ＮＩと命名し、これらの発現ベクターをそれぞれｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、ｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８、ｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、ｐＣ３−Ｑ−ＮＩと命名した。
【０１０８】
実施例４−ヒト化クローンの全ＩｇＧ発現のための発現プラスミドの製造
抗原結合能に最も優れたＦａｂ変異体３Ｅ８から全ＩｇＧ型の抗体を製造するために、抗体遺伝子の信号配列、前記Ｆａｂ変異体の可変領域、ヒト抗体の不変領域を組み換えＰＣＲ方法を用いて合成した（図４）。
【０１０９】
具体的に、抗体遺伝子の信号配列を合成するために、全ＩｇＧ型のヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＡＫＡ／ＨｚＫを鋳型とし、配列番号１１で表されるプライマーＬＨＳ３９と配列番号１２で表されるプライマーＬＨＳ４３の対を用いてＰＣＲを行った。その結果、９６ｂｐサイズのＤＮＡ断片を合成した。
【０１１０】
また、前記Ｆａｂ変異体の重鎖の可変領域遺伝子の前部分を合成するために、前記ｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、ｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８、ｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、ｐＣ３−Ｑ−ＮＩベクターを鋳型として、配列番号１３で表されるプライマーＬＨＳ４４と配列番号１４で表されるｔｙｐｅ Ｃ ｂａｃｋプライマーを用いてＰＣＲを行った結果、３０６ｂｐサイズのＤＮＡ断片が合成された。しかも、前記可変領域遺伝子の後ろ部分を合成するために、ｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、ｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８、ｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、ｐＣ３−Ｑ−ＮＩベクターをそれぞれ鋳型として、前方プライマーとして、配列番号１５で表されるｔｙｐｅ Ｃ ｆｏｒｗａｒｄプライマーを用い、後方プライマーとして、配列番号１０で表されるＬＨＳ１１プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３分間予備変性した後、９４℃で５０秒間、５５℃で５０秒間、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を用いて２５回行った。その結果、１５９ｂｐサイズのＤＮＡ断片が合成されたことを確認した。前記３つのＤＮＡ断片（９６ｂｐ、３０６ｂｐ、１５９ｂｐ）を鋳型とし、配列番号１０で表されるプライマーＬＨＳ１１と配列番号１１で表されるプライマーＬＨＳ３９でＰＣＲを行ってこれらを互いに連結することにより、それぞれ５３１ｂｐサイズのＤＮＡ断片を合成し、前記ＤＮＡ断片の両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、既存のＡＫＡ／ＨｚＫヒト化抗体遺伝子がクローニングされている動物発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＡＫＡ／ＨｚＫのＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩの位置に挿入して本発明の発現プラスミドを製造し、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｃ４、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｄ５、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＶ、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＩと命名し、特にｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８は２００１年６月２日付けで生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（受託番号；ＫＣＴＣ １０３９ＢＰ）。
【０１１１】
実施例５−ヒト化抗体の抗原結合親和度の決定
前記で製造された抗体の抗原結合能及び抗原結合親和度を決定するために、まず、前記実施例４で製造した本発明の発現プラスミドを動物細胞内に導入させて全ＩｇＧ型の抗体を製造した。
【０１１２】
まず、ＣＯＳ７細胞を、牛胎児血清が１０％添加されたＤＭＥＭ培養培地（ＧＩＢＣＯ）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で継代培養した。前記細胞を１００ｍｍの培養皿に１×１０６細胞／ｍＬの濃度で接種し、３７℃で一晩培養した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ（ＧＩＢＣＯ）溶液で３回洗浄した。一方、前記で製造した抗体発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｃ４、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｄ５、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＶ、ｐｄＣＶＭ−ｄｈｆｒ−ＮＩを５μｇずつ取ってＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ５００μＬで希釈し、２５μＬのリポフェクタミン（Lipofectamine、ＧＩＢＣＯ）も同様にＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ５００μＬで希釈した。前記発現ベクターとリポフェクタミン希釈液を１５ｍＬのチューブに混合してＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を製造した後、これを１５分以上室温で放置した。前記それぞれのＤＮＡ−リポフェクタミン混合物に５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉを添加し、これをきれいに洗浄されたＣＯＳ７細胞に均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で４８時間培養することにより、本発明の３Ｃ４、３Ｄ５、３Ｅ８、ＮＶ及びＮＩ抗体を発現させた。
【０１１３】
前記細胞の培養液から得た３Ｃ４、３Ｄ５、３Ｅ８、ＮＶ、ＮＩ抗体の抗原結合能と抗原結合親和度をＥＬＩＳＡで測定した。まず、ＢＳＭをウェル当たり２５０ｎｇずつ免疫プレート(immunoplate)に入れた後、４℃で一晩培養してプレートに結合させ、その後、２％ＢＳＡでブロックさせ、ＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。前記で得た全ＩｇＧ変異体が含まれたＣＯＳ７細胞培養液をＰＢＳを用いて希釈した後、同一の濃度でプレートに添加して３７℃で３０分間反応させ、抗原に結合していない抗体をＴＢＳ−Ｔで除去した。２次抗体として用いられた抗ヒトＩｇＧ(Fc specific)−ＨＲＰをＴＢＳ−Ｔを用いて１：５０００の濃度で希釈して前記１次抗体に結合させ、ＯＰＤとＨ２Ｏ２で発色させて４９２ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１４】
３Ｅ８抗体の抗原結合親和度をＡＫＡ／ＨｚＫと比較、決定するために、本発明者らは、様々な濃度の競争抗原と亜飽和(submaximum)濃度の３Ｃ４、３Ｄ５、３Ｅ８、ＮＶ、ＮＩ或いはＡＫＡ／ＨｚＫ抗体を混合して３７℃で３時間静置した後、２５０ｎｇの抗原を予め結合させたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加えて３０分間結合させ、しかる後に、抗ヒトＩｇＧ(Fc specific)−ＨＲＰを結合させる競争的(competitive)ＥＬＩＳＡ方法によって発色の度合いを測定した。
【０１１５】
その結果、ＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の親和度（ＫＤ）は、１．４５×１０−８Ｍ、３Ｃ４は１．３３×１０−９Ｍ、３Ｄ５は２．２７×１０−９Ｍ、３Ｅ８は０．６５×１０−９Ｍ、ＮＶは１．６６×１０−９Ｍ、ＮＩは３．３８×１０−９Ｍの抗原結合親和度（ＫＤ）を持つことが分かった。これは、各変異体抗体がＡＫＡ／ＨｚＫの１．４５×１０−８Ｍよりそれぞれ約１１倍、６倍、２２倍、８倍及び４倍が増加した抗体であることを意味する（図５ａ及び図５ｂ）。
【０１１６】
実施例６−３Ｅ８抗体の発現細胞株の製造
前記３Ｅ８抗体を生産するために、３Ｅ８抗体の発現ベクターであるｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８で形質転換されたＣＨＯ細胞株を製造した。
【０１１７】
まず、ＤＨＦＲ−ｍｉｎｕｓ ＣＨＯ細胞株であるＤＧ４４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９０９６）を、牛胎児血清が１０％添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地（ＧＩＢＣＯ）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で継代培養した。前記細胞を１００ｍｍの培養皿に１×１０６細胞／ｍＬの濃度で接種し、３７℃で一晩培養した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ（ＧＩＢＣＯ）溶液で３回洗浄した。一方、実施例４で製造した抗体発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８を５μｇ取ってＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ５００μＬで希釈し、２５μＬのリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ）も同様にＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ５００μＬで希釈した。前記抗体発現ベクターとリポフェクタミン希釈液を１５ｍＬのチューブに混合してＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を製造した後、これを１５分以上室温で放置した。前記それぞれのＤＮＡ−リポフェクタミン混合物に５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉを添加し、これをきれいに洗浄されたＤＧ４４細胞に均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で６時間培養し、これに子牛血清２０％含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地３ｍＬを添加して同一の条件で４８時間培養した。このように変異体発現ベクターが形質転換された形質転換細胞を、ヌクレオチドの添加されていないＭＥＭ−α培地に１０％透析されたＦＢＳと５５０μｇ／μＬ濃度のＧ４１８が添加されて製造された選択培地で１×１０４細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、９６ウェルプレートに分注した。１週間以上培養した後、コロニーを形成する各細胞クローンが生成する抗体の量をＥＬＩＳＡ方法で測定して、高濃度で抗体を発現する細胞クローンを選別した。
【０１１８】
ＥＬＩＳＡは、抗ヒトＩｇＧをウェル当たり１００ｎｇずつ免疫プレートに入れた後、４℃で一晩培養してプレートに結合させた、その後２％ＢＳＡでブロックさせ、ＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。前記で得た細胞培養液をＰＢＳを用いて希釈した後、プレートに添加して３７℃で１時間反応させ、抗原に結合していない抗体をＴＢＳ−Ｔで除去した。２次抗体として用いられた抗ヒトＩｇＧ(Fc specific)−ＨＲＰをＴＢＳ−Ｔを用いて１：５０００の濃度で希釈して前記１次抗体と結合させ、ＯＰＤとＨ２Ｏ２で発色させて４９２ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１９】
これらのクローンの中から、多量の抗体を分泌するクローンを選定し、２０ｎＭ ＭＴＸを添加した培地で２週間培養した後、さらに８０ｎＭ ＭＴＸが添加された選択培地で培養した。これらのクローンの中から、最も高い濃度で抗体を発現するクローンを選択して９Ｅ８細胞株と命名し、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００１年６月２１日に第ＫＣＴＣ １０４０ＢＰ号で寄託した。
【０１２０】
実施例７−全ＩｇＧ変異体の精製及び抗原結合親和度の確認
前記実施例６で製造した９Ｅ８細胞株を無血清培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII）で培養した後、前記培養液をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を通過させ、カラムに結合した抗体を０．１Ｍグリシン溶液（ｐＨ７．０）で溶出させた後、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ９．０）で中和させ、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）で透析した。精製された３Ｅ８抗体を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル相で電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した。
【０１２１】
その結果、図６に示すように、この抗体を還元させたとき、重鎖及び軽鎖の分子量として知られている５５ｋＤａ及び２５ｋＤａの分子量を示すタンパク質バンドが検出された（レイン１参照）。前記結果より、本発明の９Ｅ８細胞が四量体からなる全抗体を製造することを確認した。
【０１２２】
また、精製された３Ｅ８抗体の抗原結合親和度を前記実施例５と同様の方法で測定した結果、約０．６５×１０−９Ｍであることを確認した。
【０１２３】
実施例８−ヒト軽鎖ライブラリの製造
前記の３Ｅ８ヒト化抗体よりＨＡＭＡ反応の可能性が少なく且つ抗原結合能はそのまま保有した、新規な抗体を製造しようとした。このために、３Ｅ８抗体のヒト化軽鎖をヒト軽鎖で代替するために、まず、Ｈｏｆｍａｎ等の方法(Hofman et al., 1982, Am. J. Clin. Pathol., 77(6):710-713)を用いて分離したヒトＰＢＬ(peripheral blood lymphocytes)からヒト軽鎖ライブラリを製作した。
【０１２４】
具体的に、ヒトＰＢＬからＲＮＡを分離し、これを鋳型として、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と配列番号２４で表されるプライマーＣＫ１ｄを用いてヒト軽鎖ｃＤＮＡを選択的に合成した。さらに、前記ｃＤＮＡを鋳型とし、ヒト軽鎖のＫａｐｐａ可変領域の配列番号２５〜配列番号２９で表される５’特異プライマーＶＫ１、ＶＫ２、ＶＫ３、ＶＫ４及びＶＫ５とプライマーＣＫ１ｄをそれぞれ対として用いて、ヒト抗体軽鎖遺伝子をＰＣＲによって選択的に増幅した。
【０１２５】
この際、これらのＰＣＲ反応は、９５℃で５分間予備変性した後、９５℃で５０秒間、５５℃で５０秒間、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用し、ヒト抗体の多様性を高めるために２０回行った。
【０１２６】
前記ＰＣＲから得たヒト軽鎖ライブラリのＤＮＡ断片をＳａｃＩ−ＸｂａＩで切断した後、本発明のヒト化抗体３Ｅ８のＦａｂ発現ベクターであるｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８のＳａｃＩ−ＸｂａＩ位置に挿入した。
【０１２７】
具体的に、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８ベクターをそれぞれ制限酵素ＳａｃＩとＸｂａＩで切断して精製し、前記ＰＣＲから得たＤＮＡ断片を１６℃で一晩放置して接合させた後、７０℃で１０分間加熱して酵素を不活性化させた。その後、グリコゲンと３Ｍ酢酸ナトリウムを添加させ、−２０℃でエタノールを加えてＤＮＡを一晩沈殿させた。沈殿したＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させて２０μＬの蒸留水に懸濁し、前記ライブラリＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｅｎ ｂｌｕｅに電気衝撃遺伝子伝達法によって導入した。
【０１２８】
実施例９−抗原結合能の高い３Ｅ８／ＢＳＭ２２変異体クローンの選別
実施例８で製造したライブラリ細胞からＴＡＧ−７２に結合する新規抗体を探し出すために、前記実施例２と同様にコロニーリフトアッセイを行った。抗原結合能を示す細胞クローンの結合能が野性型３Ｅ８ Ｆａｂに比べて優れるかを調べるために、前記実施例２と同様に、ビオチン結合３Ｅ８ Ｆａｂ抗体を用いて競争的ＥＬＩＳＡを行った。その結果、対照群である３Ｅ８ Ｆａｂを入れた値よりＥＬＩＳＡ値をさらに低く示す変異体クローンを得た。
【０１２９】
実施例３と同様に、各クローンの抗原結合能を分析した結果、野性型である３Ｅ８ Ｆａｂより優れた抗原結合能を持つクローンを分離した。このクローンの軽鎖可変領域の塩基配列をＴ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖ２．０ ＤＮＡシーケンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で決定して確認した結果、配列番号２２で表されるアミノ酸配列をコードしていることを確認した（図７）。この変異体のＦａｂを３Ｅ８／ＢＳＭ２２と命名し、この発現ベクターをｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２と命名した。
【０１３０】
実施例１０−全ＩｇＧ型の３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の発現プラスミドの製造
前記３Ｅ８／ＢＳＭ２２のヒト軽鎖を含む全ＩｇＧ型の３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体を製造するために、本発明のヒト化抗体３Ｅ８の発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８の軽鎖遺伝子のクローニング位置に前記ヒト軽鎖遺伝子をクローニングした。
【０１３１】
まず、本発明者らは、前記発現ベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８の軽鎖遺伝子内に可変領域遺伝子のみをクローニングし得るように、可変領域と不変領域との連結部位にＢｓｉＷＩ制限酵素認識配列を入れたカセットベクターｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８を製造した（図８）。具体的に、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８を鋳型として、配列番号３０で表されるプライマーＬＨＳ４２とＫＣＢｓｉＷＩｂａｃｋ、及び配列番号３２で表されるプライマーＫＣＢｓｉＷＩｆｏｒとＣＫ１ｄをそれぞれ対として用いてＰＣＲを行った後、さらに、配列番号３０で表されるプライマーＬＨＳ４２とＣＫ１ｄを用いて組み換えＰＣＲを行った。これを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで切った後、元々のｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８ベクターの軽鎖部位に置換してｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８を製作した（図８）。
【０１３２】
その後、本発明者らは、軽鎖遺伝子の信号配列と前記ＢＳＭ２２の可変領域配列とを組み換えＰＣＲ方法で連結して可変領域遺伝子を合成した。具体的に、抗体遺伝子の信号配列を合成するために、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＡＫＡ／ＨｚＫを鋳型とし、配列番号３０及び配列番号３３で表されるプライマーＬＨＳ４２及びＫＣｌｅａｄｅｒＢａｃｋを対としてＰＣＲを行った。また、前記Ｆａｂのヒト軽鎖可変領域遺伝子を合成するために、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２に配列番号３４及び配列番号３１で表されるプライマーＫＣｆｏｒ及びＫＣＢｓｉＷＩｂａｃｋを用いてＰＣＲを行い、さらに、信号配列とヒト軽鎖可変領域とを連結するために、配列番号３０及び配列番号３１で表されるプライマーＬＨＳ４２及びＫＣＢｓｉＷＩｂａｃｋを用いて組み換えＰＣＲを行った。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で５分間予備変性した後、９４℃で５０秒、５５℃で５０秒、７２℃で１分間Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を用いて３０回行った。
【０１３３】
前記ＤＮＡ断片の両端を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢｓｉＷＩで切断した後、前記動物発現ベクターであるｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８のＨｉｎｄIII−ＢｓｉＷＩ位置に挿入して本発明の発現プラスミドを製造し、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２と命名した。このｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２は、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４７ＢＰ号で寄託した。
【０１３４】
実施例１１−３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の抗原結合親和度の決定
本発明の３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の抗原結合親和度を決定するために、本発明の発現プラスミドｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２を前記実施例５と同様にＣＯＳ７細胞に導入させて全ＩｇＧを製造した後、細胞培養液に存在する本発明の３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の抗原結合親和度を競争的ＥＬＩＳＡによって測定した。その結果、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体のＫＤは約４．５×１０−１０Ｍであるが、３Ｅ８抗体のＫＤは６．５×１０−１０Ｍと決定され、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体が３Ｅ８抗体より約１．５倍さらに高い抗原結合親和度を持つことを確認した（図９）。
【０１３５】
実施例１２−３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の発現細胞株の製造
前記３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体を生産するために、前記実施例６と同様に、発現ベクターであるｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２で形質転換されたＣＨＯ細胞株を製造した。
【０１３６】
このＣＨＯ細胞株の中から、高濃度で抗体を発現する成長速度の良い細胞株を選択して、４Ｄ１２−Ｂ３１細胞株と命名し、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、大韓民国大田市儒城区魚慇洞５２）に２００４年５月３１日に第ＫＣＴＣ １０６４６ＢＰ号で寄託した。
【０１３７】
実施例１３−ＡＫＡと３Ｅ８抗体の生物学的分布(Biodistribution)及び癌ターゲッティング(tumor targeting)
ヒト大腸癌を異種移植した胸腺欠損マウス(athymic mice)の３Ｅ８及びＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の生体内分布及び癌ターゲッティング能力を研究した。精製された３Ｅ８及びＡＫＡ／ＨｚＫを１２５Ｉ−放射性同位元素で標識し、放射化学的(radiochemical)純度をＴＬＣ(Thin layer chromatography)を用いて測定した結果、９９％以上であった。１２５Ｉで標識されたＡＫＡ／ＨｚＫまたは３Ｅ８をマウスモデルに静脈内注射し、１２５Ｉ−ＡＫＡ／ＨｚＫまたは３Ｅ８の生体内分布を、注射４、２４、４８及び７２時間後に調査した。各癌または分化された組織における％ＩＤ／ｇは、図１０及び表１に示した。ＡＫＡ／ＨｚＫ（図１０のＡ）及び３Ｅ８（図１０のＢ）は、癌にターゲッティングすることを示し、２４時間で最大を示し、全ての調査時点で、癌は３Ｅ８をＡＫＡ／ＨｚＫより高く吸収した。ところが、１２５Ｉ−３Ｅ８は、試験期間中に、癌において大抵には維持されるが、癌に蓄積された１２５Ｉ−ＡＫＡ／ＨｚＫは、時間依存的方式で減少した。その結果、注射２４、４８または７２時間後、癌の１２５Ｉ−３Ｅ８吸収は１２５Ｉ−ＡＫＡ／ＨｚＫに比べてそれぞれ約１６７％、２２４％または２３６％であった。これは、３Ｅ８がＡＫＡ／ＨｚＫより親和度が高くて癌に対する結合力が高いことを意味する。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】
実施例１４−３Ｅ８の放射免疫治療効果
３Ｅ８抗体の抗癌効果を試験するために、２つの方法、すなわち癌成長阻害効果の分析と生存率の分析によって試験した。まず、癌成長阻害効果を分析するために、ヒト大腸癌を異種移植した８匹の胸腺欠損マウス(athymic mice)の静脈に１３１Ｉ−３Ｅ８（２０ｍｇ／７．４ＭＢｑ、２００ｍＣｉ）で週１回ずつ６回投与した。対照群のマウス（８匹）では、１３１Ｉ−３Ｅ８の代わりに３Ｅ８を使用した。その結果、１３１Ｉ−３Ｅ８で投与されたマウスは癌の成長が遅延することが分かった（図１１）。治療したマウスにおける癌のＴｄ(tumor doubling time)１３．２日は、対照群マウス（ｕｎｌａｂｅｌｅｄ ３Ｅ８）５．６日より著しく長かった。対照群マウスの体重は時間経過に伴って１０２％程度であり、治療したマウスの体重は元体重の８７％に減少したことからみて、体重の変化は激しくないことが分かった。
【０１４０】
１３１Ｉ−３Ｅ８で治療されたマウスの生存率を考察するために、胸腺欠損マウス（７匹）に６週間毎週１３１Ｉ−３Ｅ８ ７．４ＭＢｑで投与した。治療を受けたマウスの５０％生存率は、対照群マウスの４２．５日から９０．５日に延長され、対照群マウスより５０％生存率が２．１倍高いことを示す（図１２）。対照群マウスの体重は時間経過に伴ってあまり増加せず、治療したマウスの体重は１０％程度減少したことからみて、体重の変化は激しくないことが分かった。
【０１４１】
〔産業上の利用可能性〕
本発明のＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖を突然変異させ、抗原に対する親和度の増加したヒト化抗体、及び前記ヒト化抗体の軽鎖をヒト軽鎖で置換して抗原結合親和度が増加したヒト化抗体を提供することにより、このような抗体またはこれを含む抗癌組成物は、既存のＡＫＡ／ＨｚＫ抗体よりＴＡＧ−７２抗原に対する結合親和度が高く、既存のＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体より癌の診断及び治療に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、配列番号１で表される、癌特異抗原ＴＡＧ−７２に対するヒト化抗体ＡＫＡ／ＨｚＫの重鎖ＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうち、９９番目から１０３番目までのアミノ酸を無作為に突然変異させ、突然変異された抗体の発現ベクターを製造する方法を示す概略図である。
【図２】図２は、抗原に対する親和度の高い変異体Ｆａｂクローンを選別するためのコロニーリフトアッセイを示す。
【図３】図３は、抗原に対する親和度の高い変異体クローンの重鎖可変領域アミノ酸配列を示す結果である。
【図４】図４は、抗原結合親和度の最も高い変異体３Ｅ８の全ＩｇＧ発現のためのプラスミドを製造する方法を示す概略図である。
【図５ａ】図５ａは、ＩｇＧ型の３Ｅ８、３Ｃ４、３Ｄ５、ＮＶ及びＮＩ抗体と既存のＩｇＧ型のＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の抗原結合能を比較して示すグラフである。
【図５ｂ】図５ｂは、ＩｇＧ型の３Ｅ８、３Ｃ４、３Ｄ５、ＮＶ及びＮＩ抗体と既存のＩｇＧ型のＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の抗原結合能を比較して示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の抗体を還元した場合と還元していない場合の分子量を示す電気泳動写真である。
【０１４３】
レイン１：還元した場合、レイン２：還元していない場合
【図７】図７は、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体のヒト軽鎖可変領域アミノ酸配列をＡＫＡ／ＨｚＫの軽鎖可変領域のアミノ酸配列と比較したものである。
【図８】図８は、３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の全ＩｇＧ発現のためのプラスミドを製造する方法を示す概略図である。
【図９】図９は、３Ｅ８と３Ｅ８／ＢＳＭ２２抗体の抗原結合親和度をＡＫＡ／ＨｚＫと比較した結果を示す（白丸は３ＥＢ、黒三角は３Ｅ８／ＢＳＭ２２、黒丸はＡＫＡ／ＨｚＫを示す）。
【図１０】図１０は、ヒト大腸癌を異種移植した胸腺欠損マウス(athymic mice)の３Ｅ８及びＡＫＡ／ＨｚＫ抗体の生体内分布及び癌ターゲッティング能力を研究したものであって、１２５Ｉで標識されたＡＫＡ／ＨｚＫまたは３Ｅ８をマウスモデルに静脈内注射し、１２５Ｉ−ＡＫＡ／ＨｚＫ（Ａ）または１２５３Ｅ８（Ｂ）生体内分布におけるＡＫＡと３Ｅ８抗体の生物学的分布及び癌ターゲッティング能力を考察したものである。
【図１１】図１１は、癌成長阻害効果を分析するために３Ｅ８抗体の放射免疫治療効果を考察したものであって、１２５Ｉ−３Ｅ８（黒丸）、３Ｅ８（黒四角）が投与されたマウスにおける癌のＴｄ（ａ）及び体重変化（ｂ）を考察したものである。
【図１２】図１２は、癌成長阻害効果を分析するために３Ｅ８抗体の放射免疫治療効果を考察したものであって、１２５Ｉ−３Ｅ８（黒丸）、３Ｅ８（黒四角）が投与されたマウスにおける生存率（ａ）及び体重変化（ｂ）を考察したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）配列番号１のアミノ酸配列において１００番〜１０３番のアミノ酸残基が下記配列式１で表される配列を持つアミノ酸配列の重鎖可変領域、及び（ii）配列番号２１または配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有する、ＴＡＧ−７２(tumor-associated glycoprotein-72)に対するヒト化抗体。
［配列式１］
−Ｘ１００−Ｘ１０１−Ｘ１０２−Ｘ１０３−
（式中、Ｘ１００はロイシン（Ｌｅｕ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０１はイソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）またはアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０２はメチオニン（Ｍｅｔ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０３はアラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）またはグリシン（ｇｌｙ）アミノ酸残基である。）
【請求項２】
Ｘ１０１がイソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）またはロイシン（Ｌｅｕ）である、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列よりなる群から選択される、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の重鎖可変領域をコードする核酸配列。
【請求項５】
配列番号２２で表される軽鎖可変領域をコードする核酸配列。
【請求項６】
請求項１に記載の重鎖可変領域をコードする核酸配列及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、組み換えベクター。
【請求項７】
プラスミドｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、ｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８、ｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、ｐＣ３−Ｑ−ＮＩまたはｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２である、請求項６に記載の組み換えベクター。
【請求項８】
プラスミドｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｃ４、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｄ５、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＶ、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＩまたはｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２である、請求項６に記載の組み換えベクター。
【請求項９】
請求項６に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
ＫＣＴＣ １０４０ＢＰで寄託された、請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
ＫＣＴＣ １０６４６ＢＰで寄託された、請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項９に記載の形質転換体を培養して請求項１に記載のヒト化抗体を製造する方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体及び薬剤学的に許容される担体を含む抗癌組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体を用いて癌を治療する方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体を用いて癌を診断する方法。
【請求項１】
（i）配列番号１のアミノ酸配列において１００番〜１０３番のアミノ酸残基が下記配列式１で表される配列を持つアミノ酸配列の重鎖可変領域、及び（ii）配列番号２１または配列番号２２で表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有する、ＴＡＧ−７２(tumor-associated glycoprotein-72)に対するヒト化抗体。
［配列式１］
−Ｘ１００−Ｘ１０１−Ｘ１０２−Ｘ１０３−
（式中、Ｘ１００はロイシン（Ｌｅｕ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０１はイソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）またはアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０２はメチオニン（Ｍｅｔ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）アミノ酸残基であり、
Ｘ１０３はアラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）またはグリシン（ｇｌｙ）アミノ酸残基である。）
【請求項２】
Ｘ１０１がイソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）またはロイシン（Ｌｅｕ）である、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列よりなる群から選択される、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の重鎖可変領域をコードする核酸配列。
【請求項５】
配列番号２２で表される軽鎖可変領域をコードする核酸配列。
【請求項６】
請求項１に記載の重鎖可変領域をコードする核酸配列及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、組み換えベクター。
【請求項７】
プラスミドｐＣ３−Ｑ−３Ｃ４、ｐＣ３−Ｑ−３Ｄ５、ｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８、ｐＣ３−Ｑ−ＮＶ、ｐＣ３−Ｑ−ＮＩまたはｐＣ３−Ｑ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２である、請求項６に記載の組み換えベクター。
【請求項８】
プラスミドｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｃ４、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｄ５、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＶ、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＮＩまたはｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒＣ−３Ｅ８／ＢＳＭ２２である、請求項６に記載の組み換えベクター。
【請求項９】
請求項６に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
ＫＣＴＣ １０４０ＢＰで寄託された、請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
ＫＣＴＣ １０６４６ＢＰで寄託された、請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項９に記載の形質転換体を培養して請求項１に記載のヒト化抗体を製造する方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体及び薬剤学的に許容される担体を含む抗癌組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体を用いて癌を治療する方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体を用いて癌を診断する方法。
【図３】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００８−５０９６５６（Ｐ２００８−５０９６５６Ａ）
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１４８９０（Ｐ２００７−５１４８９０）
【出願日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００１３２２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２１１８０
【国際公開日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【出願人】（５０５０９３３６７）コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００１３２２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２１１８０
【国際公開日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【出願人】（５０５０９３３６７）コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
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