ＴＧＦ−βを利用した遺伝子療法
【課題】退行性関節炎を治療するための遺伝子治療法の提供。
【解決手段】トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属する１因子をエンコードし、プロモーターにリンクしたＤＮＡシーケンスを含む発現ベクターを製造し、これを培養結合組織細胞（繊維芽細胞など）にトランスフェクションさせ、形質転換された結合組織細胞を哺乳動物宿主の関節炎性関節腔に注入することにより関節腔内で結合組織、ガラス軟骨などの再生を促進する。膝関節の退行性関節炎の刺激を確認するために、一部が欠損された軟骨モデルを作った。細胞−媒介遺伝子治療法を処置した一部軟骨欠損は、新たに形成されたガラス軟骨で覆われ、これは、細胞がこの部位で生存して基質の形成を刺激するということを示す。完全に剥がれた軟骨部位は繊維コラーゲンで覆われた。
【解決手段】トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属する１因子をエンコードし、プロモーターにリンクしたＤＮＡシーケンスを含む発現ベクターを製造し、これを培養結合組織細胞（繊維芽細胞など）にトランスフェクションさせ、形質転換された結合組織細胞を哺乳動物宿主の関節炎性関節腔に注入することにより関節腔内で結合組織、ガラス軟骨などの再生を促進する。膝関節の退行性関節炎の刺激を確認するために、一部が欠損された軟骨モデルを作った。細胞−媒介遺伝子治療法を処置した一部軟骨欠損は、新たに形成されたガラス軟骨で覆われ、これは、細胞がこの部位で生存して基質の形成を刺激するということを示す。完全に剥がれた軟骨部位は繊維コラーゲンで覆われた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物宿主の結合組織を再生するのに用いるための、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子を符号化する少なくとも１つの遺伝子を、少なくとも１つの哺乳動物の結合組織に導入する方法に関する。又、本発明は、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子を符号化する遺伝子を含むDNAベクター分子を含有する結合組織細胞柱に関する。
【背景技術】
【０００２】
整形外科分野において、退行性関節炎又は骨関節炎は、軟骨欠損と関わり、最も頻発する疾病である。膝、臀部、肩及び手首のような身体の殆ど全ての関節において発生する。このような疾病の原因は、ガラス関節軟骨の退行である（Mankin et al., J Bone Joint Surg, 52A: 460-466, 1982）。関節のガラス軟骨は変形され、細動し、又、究極的には陥没することとなる。もし、退行された軟骨がどうあろうとも再生することができるのであれば、多くの患者らは、彼らを衰弱させる苦痛なしに生活を営むことができるようになる。現在では、欠損されたガラス軟骨を再生する方法が報告されていない。
【０００３】
経口、静脈内、筋肉内投与のような薬物伝達の伝統的な経路では、薬物を関節に伝達するのには非効果的である。一般的に関節内に注入された薬物は半減期が短い。薬物を関節内に注入することのもう一つの短所は、関節炎のような慢性的な状態を治療するための、関節腔における十分な薬物濃度を得るためには、頻繁に、反復的に注入しないといけないということである。今までの治療剤は、関節に選択的に到達できなかったため、持続的な関節内の治療容量を獲得するためには、高濃度の薬物に哺乳動物宿主の全身を露出させる必要があったのである。このような方法においては、非標的器官が露出されることにより、抗関節炎薬物が、胃腸亢進、哺乳動物宿主の血液、心血管、肝臓、及び、腎臓系の変化のような深刻な副作用をより悪化する傾向があったのである。
【０００４】
整形外科分野において、いくつかのサイトカインが整形外科的疾病の治療剤の候補として考えられてきた。骨形成蛋白質（bone morphogenic protein）は、骨形成の效果的な促進因子として認識されてきており（Ozkaynak et al., EMBO J, 9:2085-2093, 1990; Sampath and Rueger, Complications in ortho, 101-107, 1994）、TGF−βが骨形成及び軟骨形成の促進因子として報告されたことがある（Joyce et al., J Cell Biology, 110:2195-2207,1990）。
【０００５】
トランスフォーミング成長因子−β（TGF−β）は、多機能性サイトカインに認識され（Sporn and Roberts, Nature (London), 332:217- 219, 1988）、細胞成長、分化、及び、細胞外基質蛋白質の合成を調節する役割をする（Madri et al., J Cell Biology, 106: 1375-1384,1988）。TGF−βは、上皮細胞と破骨類似細胞（osteoclast−like cells ）のインビトロでの成長を阻害するが（Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85: 5683-5687, 1988）、インビボ軟骨の骨化（enchodral ossification）を刺激して究極的には骨形成を促進する（Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993; and Matsumoto et al., In vivo, 8: 215-220,1994）。TGF−β−誘導骨形成は、骨膜下（subperiosteal）多機能性細胞を刺激して窮極的には軟骨形成細胞に分化するようにする（Joyce et al., J Cell Biology, 110: 2195-2207, 1990; and Miettinen et al., J Cell Biology, 127-6: 2021-2036, 1994.）。
【０００６】
整形外科学でのTGF−βの生物学的效果が報告されたことがある（Andrew et al., Calcif Tissue In. 52: 74-78, 1993; Borque et al., Int J Dev Biol., 37:573-579, 1993; Carrington et al., J Cell Biology, 107:1969-1975, 1988; Lind et al., A Orthop Scand. 64(5) : 553-556, 1993; Matsumoto et al., In vivo, 8:215-220, 1994）。マウス胚で、ステイニングの結果は、TGF−βが、結合組職、軟骨、及び、骨のような肝葉から由来した組職と密接に係わっていることを見せてくれる。発生学的観察に加えて、TGF−βは、骨形成と軟骨形成部位に存在する。また、それは、兎の脛骨の骨折の治療を向上させることができる。最近、TGF−βの治療的価値が報告されたことがあるが（Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; and Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556,1993）、その效果の持続時間が短いことと高価である点が、臨床的に広く適用されることを阻んできた。
【０００７】
TGF−βがインビボで不活性の状態に分解されることによって、注入されたTGF−βの作用の持続する時間が短いため、関節炎の治療のためにTGF−βを関節内に注入することは望ましくない。よって、TGF−βを長期間放出する新しい方法がガラス軟骨の再生のための必要である。
【０００８】
軟骨細胞を自家移植して関節の軟骨を再生することが報告されたことはあるが（Brittberg et al., New Engl J Med 331: 889- 895, 1994）、このような方法は軟組織を二度にかけて広く切除する手術を伴う。もし関節内注入で退行性関節炎の治療が十分であるならば、患者にとって経済的にも身体的にも大きな恩恵となることであろう。
【０００９】
特定の蛋白質を特定の部位に伝逹する方法である遺伝子療法が、このような問題を解く方法になり得る（Wolff and Lederberg, Gene Therapeutics ed. Jon A. wolff, 3-25, 1994; and Jenks, J Natl Cancer Inst, 89(16): 1182-1184, 1997）。
【００１０】
米国特許第５、８５８、３５５号、及び、第５、７６６、５８５号は、ＩＲＡＰ（インターロイキンー１受容体拮抗剤蛋白質）遺伝子のウイルスまたはプラスミドコンストラクトを製造する段階；滑膜細胞（synovial cell） （５、８５８、３５５）、及び骨髄細胞（５、７６６、５８５）を、前記コンストラクトでトランスフェクションさせる段階；及び形質転換された細胞を兎の関節内に注入する段階を開示する。しかし、TGF−βスーパーファミリーに属する遺伝子を結合組職を再生するのに使用したことは開示されたことがない。
【００１１】
米国特許第５、８４６、９３１号及び第５、７００、７７４号には、軟骨性組職の形成を維持し、軟骨性組職を誘導するために、TGF−β"スーパーファミリー"に属する骨形成蛋白質（BMP）を含む組成物を、切形の副甲状線ホルモン関連のペプチドと一緒に注入するのが開示されている。しかし、BMP遺伝子を利用した遺伝子治療法に対する開示はない。
【００１２】
このような先行技術の開示にもかかわらず、哺乳動物宿主を治療するために、哺乳動物宿主の結合組職の少なくとも１つの細胞に発現産物（product）をエンコードする少なくとも１つの遺伝子をインビトロ方法で、あるいはインビボ導入する方法に対する実在的、かつ、実質的な要求が残ってしまう。また、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子をエンコードする遺伝子を、宿主細胞で結合組織を再生するのに使用する方法が必要である。より具体的には、TGF−βスーパーファミリー蛋白質をエンコードする遺伝子を、宿主の結合組織細胞でインビボ発現させる方法が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記記載の要求に応じたものである。本発明は、哺乳動物の結合組織の少なくとも１つの細胞に、発現産物をエンコードする少なくとも１つの遺伝子を導入する、哺乳動物宿主治療方法を提供する。この方法は、発現産物をエンコードする遺伝子を含むDNAベクター分子を製造するために組換え技術を使用する段階と、発現産物をエンコードする遺伝子を含むDNAベクター分子を結合組織細胞内に導入する段階を含む。ＤＮＡベクター分子は、ターゲット細胞や組織に伝達され維持され得る任意のＤＮＡ分子であり、究極的に目的の発現産物をエンコードする遺伝子が安定に発現することができる。本発明において、用いられる望ましいDNAベクター分子は、ウイルス系列あるいはプラスミド系列のDNAベクター分子である。本方法は、望ましくは、治療の用途として哺乳動物の結合組織細胞に発現産物をエンコードする遺伝子を導入することを含む。
【００１４】
本発明は、ａ）トランスフォーミング成長因子蛋白質スーパーファミリーのうちの１因子を符号化し、プロモーターに作動的にリンクされたDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを製造する段階；
ｂ）培養された結合組織細胞集団を、前記組換えベクターでインビトロトランスフェクションさせることにより、形質転換された結合組織細胞集団を製造する段階；及び
ｃ）前記形質転換された結合組織細胞を、哺乳動物宿主の関節炎性関節腔に、関節内注射して移植することにより、前記DNAシーケンスが前記関節腔内で発現されて結合組織を再生する段階；
を含む関節炎の治療方法に関するものである。
【００１５】
組換えベクターは、レトロウイルスベクターであり得るが、これに限定せず、レトロウイルスベクターであることが望ましい。又、前記ベクターは、プラスミドベクターであり得る。
【００１６】
本発明の方法は、形質転換された結合組織細胞集団が移植される前には保管される段階を含む。前記細胞は、移植される前には、液体窒素下で１０％ＤＭＳＯで保管され得る。
【００１７】
結合組織細胞は、繊維芽細胞、間葉細胞、造骨細胞、又は、軟骨細胞を含むが、これらに限定されるものではない。前記繊維芽細胞は、NIH 3T3細胞、又は、ヒト包皮繊維芽細胞であり得る。
【００１８】
結合組織は、軟骨、靭帯、又は、腱を含むが、これらに限定されるものではない。前記軟骨はガラス軟骨であり得る。
【００１９】
本発明の方法は、トランスフォーミング成長因子β（TGF−β）を含むトランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子を使用する。前記トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子としては、TGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、BMP−２、BMP−３、BMP−４、BMP−５、BMP−６、又は、BMP−７であり得る。望ましくは、TGF−βは、ヒト又は豚のTGF−β１、TGF−β２、又は、TGF−β３である。
【００２０】
又、本発明は、ａ）トランスフォーミング成長因子蛋白質スーパーファミリーのうちの１因子をエンコードし、プロモーターに作動的にリンクされたDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを製造する段階；
ｂ）培養された結合組織細胞集団を、前記組換えベクターでインビトロトランスフェクションさせることにより、形質転換された結合組織細胞集団を製造する段階；及び
ｃ）前記形質転換された結合組織細胞を、哺乳動物宿主の関節炎性関節腔に、関節内注射して移植することにより、前記DNAシーケンスが前記関節腔内で発現されてガラス軟骨を再生する段階；
を含むガラス軟骨の再生方法に関するものである。
【００２１】
トランスフェクション方法は、リポソームカプセル法、カルシウム・ホスファート共沈法、電気穿孔法、DEAE−デキストラン媒介法によって達成され得る。
【００２２】
好ましくは、本発明の方法は、ｐｍＴβ１プラスミドを利用することを含む。
【００２３】
又、本発明は、トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子をエンコードするDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを含有する結合組織細胞柱に関するものである。結合組織細胞柱は、繊維芽細胞柱、間葉細胞柱、軟骨細胞柱、造骨細胞柱、又は、骨細胞柱であり得るが、これらに限定されるものではない。前記繊維芽細胞柱は、ヒトの包皮繊維芽細胞柱又はNIH 3T3細胞柱であり得る。
【００２４】
本発明による結合組織細胞柱は、トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子を含む。好ましくは、トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子が、TGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、BMP−２、BMP−３、BMP−４、BMP−５、BMP−６、又はBMP−７である。より好ましくは、メンバーが、ヒト又は豚のTGF−β１、TGF−β２、又は、TGF−β３である。
【００２５】
更に、本発明の結合組織細胞柱は、組換えベクターｐｍＴβ１を含有する細胞を含むことができる。
【００２６】
本発明の上記の目的と、本発明の上記の目的とは異なる更なる目的は、下記発明の詳細な説明、それに添付された参考図面、及び、請求項より具体化される。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本明細書で用いられる"患者"というのは、ヒトのみならず、動物系に属するメンバーも含む。
【００２８】
本明細書で用いられる"哺乳動物宿主"というのは、ヒトのみならず、動物系に属するメンバーも含む。
【００２９】
本明細書で用いられる"結合組織"というのは、他の組職や機関を連結し、支持する任意の組職であり、哺乳動物の靭帯、軟骨、腱、骨、及び滑膜を含むがこれに限定されるものではない。
【００３０】
本明細書で用いられる"結合組職細胞"または"結合組織の細胞"というのは、脂肪細胞（adipocytes）と平滑筋細胞のみならず、コラーゲン性の細胞外基質を分泌する繊維芽細胞、軟骨細胞、及び、骨細胞（osteoblasts／osteocytes）のような結合組織に存在する細胞を含む。望ましくは、結合組職細胞は、繊維芽細胞、軟骨細胞、及び、骨細胞である。より望ましくは、結合組職細胞は、繊維芽細胞である。また、結合組職細胞は、未成熟した繊維芽細胞として知られた肝葉細胞を含む。本発明が単一タイプの細胞のみでならず、混合された結合組職細胞の培養物を使用することができるということを認識することができる。
【００３１】
本明細書で用いられる"結合組織細胞柱"というのは、共通の母細胞から由来した多数の結合組職細胞を含む。
【００３２】
本明細書で用いられる"ガラス軟骨"というのは、関節表面を覆っている結合組織をいう。例を挙げると、ガラス軟骨は、関節軟骨、肋軟骨、及び、鼻軟骨を含むが、これに限定されるものではない。
【００３３】
具体的には、ガラス軟骨は、自家−復元し、変化に反応し、摩擦のない安定な運動を提供するものと知られている。関節のガラス軟骨は、同一関節内のガラス軟骨であっても、その厚さ、細胞密度、基質組成、及び、機械的性質が多様ではあるが、同一の普遍的構造と機能を有する。ガラス軟骨のいくつかの機能としては、圧迫に対する突発硬直、復元力、負荷（weight loads）を分散させる例外的な能力、軟骨下骨に対する最大ストレスを最小化する能力、そして、優れた耐久性を含む。
【００３４】
肉眼で、及び組職学的に、ガラス軟骨は、変形に耐える滑らかで堅い表面に見える。軟骨の細胞外基質は軟骨細胞を含むが、血管、リンパ管、または神経はない。軟骨細胞と基質間の相互作用を維持する精巧で、かつ、よく整えられた構造は、ガラス軟骨の構造と機能を維持するようにし、一方、代謝活動は少なくするようにする。ドリスコルの文献（O'Driscoll, J. Bone Joint Surg。、 80A: 1795−1812、1988）では、ガラス軟骨の構造と機能について詳細に開示しており、上記文献はその全体として本明細書に参考として含まれる。
【００３５】
本明細書で用いられる"トランスフォーミング成長因子−β（TGF−β）スーパーファミリー"は、胚発生の間の広い範囲にわたって、分化過程に影響を及ぼす構造的に連関された蛋白質の１グループを含む。前記ファミリーは、正常な男性発達のために必要なミュラー（Mullerian）阻害物質（MIS）（Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990）、背側−腹面軸形成と成虫盤（imaginal disk）の形態発生に必要なショウジョウバエ・デカペンタプレジック（decapentaplegic）（DPP）遺伝子産物（Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987）、卵のベジタルポール（vegetal pole）に位置する海胆（Xenopus）Vg−1遺伝子産物（Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987）、海胆胚の中胚葉と後胚葉の構造形成を誘導することができる（Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990）アックティビン（activines）（Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986）、及びde novo軟骨及び骨形成を誘導することができる（Sampath, et al., J. Biol.）骨形成蛋白質（BMP−2、 3、 4、 5、 6及び7のようなBMP、osteogenin、OP−1）を含む。前記TGF−β遺伝子産物は、脂肪形成（adipogenesis）、筋肉発生（myogenesis）、軟骨形成（chondrogenesis）、血液生成（hematopoiesis）、及び、上皮細胞分化を含む多様な分化過程に影響を及ぼすことができる（Massague, Cell 49:437, 1987）のを想起しつつ、この文献はその全体として本明細書に参考として含まれる。
【００３６】
TGF−βファミリーの蛋白質は、初めに巨大前駆体蛋白質として合成され、次いで、Ｃ−末端から約１１０−１４０アミノ酸付近の塩基性残基のクラスターで蛋白分解によって切断される。蛋白質のC−末端部位は、皆構造的に係わっていて、ファミリ−メンバーたちは、それらの類似性の程度によって異なるサーブグループに分類することができる。特定サーブグループ内の類似性は、70％から90％のアミノ酸序列の相同性を見せるが、サーブグループ間の相同性は確実に低く、一般的にせいぜい20％から50％位である。それぞれの場合、活性種は、C−末端切片の二硫化結合二量体と見られる。研究されたファミリーメンバーの大部分において、同型二量体種が、生物学的に活性であることと発見されたが、また、インヒビン（inhibins）（Ung, et al., Nature, 321:779, 1986）とTGF−β's（Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987）ような他のファミリメンバーでは、異型二量体が検出され、これらはそれぞれの同型二量体に対して相違する生物学的性質を有することと見られる。
【００３７】
TGF−β遺伝子のスーパーファミリーメンバーには、TGF−β２、TGF−β３、TGF−β４（ニワトリ）、TGF−β1、TGF−β5（海胆）、BMP−2、BMP−4、ショウジョウバエDPP、 BMP−5、BMP−6、Vgr1、OP−1／BMP−7、ショウジョウバエ60A、GDF−1、海胆Vgf、BMP−3、インヒビン−βA、インヒビン−βB、インヒビン−α、及び、MISが含まれる。このような遺伝子は、Massagueの文献（Massague、 Ann．Rev．Biochem．67:735−791、1988）に開示されており、上記文献は、その全体として本明細書に参考として挿入される。
【００３８】
望ましくは、TGF−β遺伝子のスーパーファミリーメンバーはTGF−βである。より望ましくは、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6、あるいはBMP−7である。より望ましくは、ヒトまたは豚のTGF−βである。より望ましくは、ヒトまたは豚のTGF−β1、TGF−β2あるいはTGF−β3である。最も望ましくは、ヒトまたは豚のTGF−β1である。
【００３９】
本明細書で用いられる"選択マーカー"というのは、導入されたDNAを安定に維持する細胞によって発現され、細胞が形態発生的形質転換または酵素活性のような変形された表現型を発現するようにする、遺伝子産物を含む。トランスフェクションされた遺伝子を発現する細胞は、同細胞に抗生剤やあるいは他の薬物に抵抗性を付与する酵素活性を有するような、選択マーカーをエンコードする二番目の遺伝子を同一の細胞に導入することによって分離されることができる。選択マーカーの例としては、チミジンキナーゼ（thymidine kinase）、ジヒドロフォレートレドッターゼ（dihydrofolate reductase）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（aminoglycoside phosphotransferase）（カナマイシン、ネオマイシン、及び、ゼネチシン（geneticin）のようなアミノグリコシド系抗生剤に抵抗性を付与する）、ハイグロマイシン B ホスホトランスフェラーゼ、 キサンチン−グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ、CAD（de novo ウリジン生合成−カルバミル ホスファート シンセターゼ、アルパルテート トランスカルバミラーゼ、及びジヒドロオロターゼ（dihydroorotase）の初めの三種の酵素活性を有する一つの蛋白質）、アデノシン ジアミナーゼ、及びアスパラギンシンセターゼを含むが、これに限定されるものではない（Sambrook et al. Molecular Cloning, Chapter 16. 1989）。上記文献は、その全体として本明細書に参照として含まれる。
【００４０】
本明細書で用いられる"プローモーター"というのは、活性で、かつ、真核細胞で転写を調節する任意のDNAシーケンスであり得る。プローモーターは、真核細胞及び／または原核細胞で活性である。望ましくは、プローモーターは、哺乳動物細胞で活性がある。プローモーターは、恒常的に発現されるか誘導されることができる。望ましくは、プロモーターは誘導可能である。望ましくは、プローモーターは、外部の刺激によって誘導可能である。より望ましくは、プローモーターは、ホルモン又は金属によって誘導される。より望ましくは、プローモーターは重金属によって誘導される。最も望ましくは、プローモーターは、メタロチオネイン遺伝子プローモーターである。さらに、転写を調節する"エンハンサーエレメント"が、DNAベクターコンストラクトに挿入されることができ、本発明のコンストラクトと共に目的とする遺伝子の発現を増加させるために使われ得る。
【００４１】
本明細書で用いられる"DC−col"というのは、陽イオン性コレステロール誘導体を含む陽イオン性リポソームを意味する。"DC−chol"分子は、３価アミノグループ、中間長さスペイサーアーム（２原子）、及び、カルバモイル−リンカーボンド（carbamoyl linker bond）を含む（Gao et al., Biochem. Biophys. Res, Commun., 179:280-285, 1991）。
【００４２】
本明細書で用いられる"SF−chol"は、陽イオン性リポソームの一形態として定義される。
【００４３】
本明細書でリポソームと連関して用いられる"生物学的に活性である"というのは、機能的なDNA及び/または蛋白質をターゲットセルに導入する能力をいう。
【００４４】
本明細書での核酸、蛋白質、蛋白質切片、または、それらの誘導体と関連して用いられる"生物学的に活性である"というのは、ワイルドタイプの核酸や蛋白質によって知られた生物学的機能を模倣する核酸またはアミノ酸序列の能力として定義される。
【００４５】
本明細書でのリポソーム伝達の文脈で用いられるときの"維持"というのは、導入されたDNAが細胞内に残存するようにする能力をいう。他の文脈で用いられるときは、治療的效果を持つようにするために、ターゲットDNAがターゲット細胞や組職内に存在するようにする能力を意味する。
【００４６】
本発明は、目的するDNAシーケンスを哺乳動物宿主の結合組職細胞にインビボあるいはエクスビボ伝逹する技術を開示する。エクスビボ技術は、ターゲット結合組職細胞を培養すること、DNAシーケンス、DNAベクターまたは他の意図する伝逹ビークルを結合組職細胞でインビトロトランスフェクションさせること、そして目的する遺伝子産物がインビボ発現されるようにするために変形された結合組職細胞を哺乳動物宿主のターゲット関節に移植することを含む。
【００４７】
繊維芽細胞のインビトロ増殖を代替する方法として、目的する発現産物をエンコードする遺伝子をリポソーム内に導入し、関節部位に直接的に注入し、この時、リポソームは、結合組職細胞と融合して、結果的にはTGF−βスーパーファミリーに属する遺伝子産物がインビボ発現されるようにする。
【００４８】
結合組職細胞のインビトロ増殖を代替する方法として、目的する発現産物をエンコードする遺伝子をnaked DNA状態で関節部位に導入する。Naked DNAは、結合組職細胞に入り、窮極的には、TGF−βスーパーファミリーに属する遺伝子産物がインビボ発現されるようにする。
【００４９】
本明細書を通じて開示された結合組織異常を治療するエクスビボ方法の一つは、まず、蛋白質またはそれの生物学的に活性がある切片をエンコードするDNAシーケンスを含む組換えウイルスまたはプラスミドベクターを製造することを含む。次に、この組換えベクターをインビトロ培養された結合組職細胞のポピュレーションを感染又はトランスフェクションさせるために使い、結局、ベクターを含有する結合細胞のポピュレーションを作る。次に、このような結合組職細胞を哺乳動物宿主のターゲット関節腔に移植して関節腔内で蛋白質あるいは蛋白質切片の発現を起こす。目的するDNAシーケンスの発現は、結合組職異常と係る有害な関節疾患を実質的に軽減するのに有用である。
【００５０】
ヒト患者を治療するために好まれる細胞のソースが自家繊維芽細胞のような患者自分の結合組職細胞であるということは、当業者ならよく分かっているはずである。
【００５１】
より具体的には、本方法は、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子あるいはその生物学的に活性のある誘導体や切片をエンコードする遺伝子と、選択マーカーあるいはその生物学的に活性のある誘導体や切片を利用することを含む。
【００５２】
本発明の他の実施例は、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの少なくとも１つの因子あるいはそれの生物学的に活性のある誘導体や切片をエンコードする遺伝子を利用し、DNAプラスミドベクターとしては、利用される伝逹方法とは関係なしに伝逹の時にターゲットの細胞や組職に安定に維持されることができるとして、当業者に知られた任意のDNAプラスミドベクターを使うことを含む。
【００５３】
その方法の一つとして、ウイルスDNAベクター分子であっても、あるいは、プラスミドDNAベクター分子であっても、いずれにしてもDNAベクター分子をターゲットの細胞あるいは組職に直接伝逹するのである。また、この方法は、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子あるいはそれの生物学的に活性のある誘導体や切片をエンコードすることができる遺伝子を利用することを含む。
【００５４】
本発明のもう一つの実施例は、哺乳動物宿主を治療する用途として、結合組織の少なくとも一つの細胞に、発現産物をエンコードする少なくとも一つの遺伝子を導入する方法を提供する。本方法は、結合組職細胞に発現産物をエンコードする遺伝子を導入する非−ウイルス的手段を利用することを含む。より詳細には、本方法は、リポソームカプセル法、カルシウム−ホスファート共沈法、電気穿孔法、または、DEAE−デキストラン媒介法を含んでおり、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子あるいはそれの生物学的に活性のある誘導体や切片をエンコードすることができる遺伝子と、選択マーカーあるいはそれの生物学的に活性がある誘導体や切片を利用することを含む。
【００５５】
本発明のもう一つの実施例は、哺乳動物宿主を治療する用途として、結合組織の少なくとも一つの細胞に、発現産物をエンコードする少なくとも一つの遺伝子を導入する追加的方法を提供する。本追加的方法は、ターゲットの細胞や組職にDNAベクター分子を伝逹するウイルスを利用する生物学的手段を利用することを含む。望ましくは、ウイルスは、擬ウイルスがターゲット細胞内に運ばれて安定に維持されるようにゲノムが変形されたが、ターゲットの細胞や組職内で複製される能力を持っていない擬ウイルスである。変形されたウイルスゲノムを組換えDNA技術を使用してもっと増幅すれば、その結果、ウイルスゲノムは、ターゲットの細胞や組職内で発現される、目的とする異種由来（heterologous）遺伝子を含むDNAベクター分子として機能するようになる。
【００５６】
本発明の望ましい実施例は、本明細書内に記載されたエクスビボ技術を利用したレトロウイルスベクターの使用を通じて、哺乳動物宿主の結合組織にTGF−β遺伝子を伝逹することにより、ターゲット関節腔にTGF−βを伝逹する方法である。言い換えれば、機能的なTGF−β蛋白質または蛋白質切片をエンコードする目的のDNAシーケンスを、選択したレトロウイルスベクターでサブクローニングし、次に、組換えウイルスベクターを適正タイターに培養し、培養された結合組職細胞にインビトロトランスフェクションさせるのに用い、そして形質転換された結合組職細胞、望ましくは自家移植された細胞をターゲット関節内に望ましくは関節内注射によって移植するのである。
【００５７】
本発明の他の望ましい方法は、アデノウイルス（adenovirus）ベクター、アデノ−関連ウイルスベクター（AAV）、または、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター（HSV）を使い、哺乳動物宿主の結合組織にTGF−βスーパーファミリー遺伝子をインビボ直接伝逹することを含む。言い換えれば、機能的TGF−β蛋白質または蛋白質切片をエンコードする目的のDNAシーケンスを、それぞれのウイルスベクターにサブクローニングする。次に、TGF−β包含ウイルスベクターを適正タイターに培養した後、望ましくは関節内注射によって関節腔に注入する。
【００５８】
目的とする遺伝子を含むDNA分子を、関節内に直接関節内注射することは、受容体結合組職細胞のトランスフェクションを起こし、したがって異種由来目的遺伝子の安定した発現を増進させるためのDNAベクター含有−繊維芽細胞の移植だけではなく、除去、インビトロ培養、トランスフェクション、選択という過程を排除することができる。
【００５９】
DNA分子を関節のターゲット結合組織に導入する方法は、DNA分子を陽イオン性リポソーム内にカプセル化する方法、目的とするDNAシーケンスをレトロウイルスまたはプラスミドベクターにサブクローニングする方法、または、DNA分子自体を関節内に直接注入する方法を含むが、これに限定されるものではない。膝関節に導入される形態に関係なく、DNA分子は、DNAベクター分子として、すなわち組換えウイルスDNAベクター分子あるいは組換えDNAプラスミドベクター分子として導入されるのが望ましい。異種由来目的の遺伝子の発現は、真核細胞で活性的なプローモーター切片を、異種由来遺伝子のコーディング部位のアップストリーム（upstream）に挿入することで保障される。当該技術分野における通常的の技術の一つは、DNA分子が結合組織に入り、適正水準に発現されることを保障するベクターを構築する既存の戦略と技術を利用するものである。
【００６０】
望ましい実施例においては、遺伝子治療法のための伝逹システムとして次期に使うために、膝関節から取り出した繊維芽細胞をインビトロ培養する。培養可能細胞が開示された特定の結合組織の使用に限定されないということは明白である。インビトロ培養技術に、他の組職ソースを利用することも可能である。本発明において、遺伝子を使う方法は、関節炎を予防するか、あるいは治療する方法に皆利用することができる。適用分野が単に膝関節の治療における予防または治療的適用に限定されないということは明白である。病気にかかりやすい任意の関節での関節炎を治療するために、予防的にまたは治療的に本発明を利用するのが可能である。
【００６１】
本発明の他の実施例においては、患者に対する治療的に有效な量の非経口投与のために、TGF−βスーパーファミリー蛋白質をエンコードする遺伝子と、薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【００６２】
本発明の他の実施例は、患者に対する予防的に有效な量の非経口投与のために、TGF−βスーパーファミリー蛋白質をエンコードする遺伝子と、薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【００６３】
本発明の他の実施例においては、遺伝子を細胞内に、インビトロ導入することを含む、上記に技術された通りの方法を提供する。また、この方法は、次いで、トランスフェクションされた細胞を哺乳動物宿主に移植する段階を含む。この方法は、トランスフェクションされた細胞を哺乳動物宿主に移植する前に結合組職細胞をトランスフェクションさせた後、形質転換された結合組職細胞を保管する段階を含む。トランスフェクションされた結合組職細胞を10％ DMSO内で液体窒素下に氷らせて保管することができるということは、当業者にとって容易であろう。この方法は、関節炎の発病する可能性が高い哺乳動物宿主において、関節炎の発病を実質的に防止するために上記の方法を使用することを含む。
【００６４】
本発明の他の実施例においては、上記に技術された通り、哺乳動物宿主を治療するのに使うために、発現産物をエンコードする遺伝子を含むウイルスベクターを哺乳動物宿主内に直接導入することにより、細胞のインビボトランスフェクションを起こす段階を含む、発現産物をエンコードする少なくとも一つの遺伝子を哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも一つの細胞内に導入する方法を含む。望ましくは、この方法は、関節内注射によって哺乳動物宿主内に直接導入することを含む。この方法は、関節炎の発病する可能性が高い哺乳動物宿主における、関節炎の発病を実質的に阻害するために上記の方法を使うことを含む。また、この方法は、治療的用途として関節炎性哺乳動物宿主に上記の方法を使用することを含む。これに加えて、本方法は、上記で定義された通り、結合組織をリペアーして再生させるのに上記の方法を使用することを含む。
【００６５】
リポソームを利用するウイルスベクターは、レトロウイルスに結合組職細胞のトランスフェクションと挿入を行うために必要となるような細胞分裂によっては制限されないということは、当該技術分野に詳しい当業者にとっては容易であろう。上記で記述した通り非−ウイルス手段を利用するこの方法は、遺伝子として、TGF−βスーパーファミリーに属する１メンバーをエンコードすることができる遺伝子と、抗生剤耐性遺伝子のような選択マーカー遺伝子を利用することを含む。
【００６６】
本発明の他の実施例においては、軟骨のような結合組織を再生するためのコラーゲンのインビボ発現を起こすために、本明細書内に開示された任意の方法を介して、TGF−βスーパーファミリーの１メンバーをエンコードするDNAシーケンスを哺乳動物宿主の結合組織に伝逹するのである。
【００６７】
本発明を限定するためのものではなく、単なる１例として開示された具体的方法において、TGF−βコードシーケンスを含むDNAプラスミドベクターを、メタロチオネイン（metallothionein）プローモーターのダウンストリーム（downstream）に連結した。
【００６８】
結合組織は、治療を目的にしにくい機関である。当該技術分野で公知である薬物伝逹の静脈及び経口ルートとしては、このような結合組職にはよく近付くことができず、哺乳動物宿主の身体全体を治療剤に露出させなければならない短所がある。より詳細には、既存の関節内注射で蛋白質を関節に注入することは、関節に至る直接的な接近路を提供する。しかし、カプセル化された蛋白質形態で注射された薬物の大部分は、関節内で短い半減期を持つ。本発明は、このような問題を、哺乳動物宿主を治療するのに使うことができる蛋白質をエンコードする遺伝子を哺乳動物宿主の結合組織内に導入することによって解決する。より具体的には、本発明は、抗−関節炎性の性質を持った蛋白質をエンコードする遺伝子を哺乳動物宿主の結合組織内に導入する方法を提供する。
【００６９】
本発明において、遺伝子治療法は、TGF−βの投与に係わる短い作用持続時間と高費用の問題を解決するために適用されたのである。形質転換された細胞は、形態的な変化なしに、組職培養で６週以上生存することができたのである。生存能力と作用持続時間を確認するために、兎のアキレス腱に細胞を注射したのである。もし、細胞に対してインビボ栄養の供給が充分であれば、細胞は、周りの細胞を刺激するのに充分長い時間生存することができたし、TGF−βを製造することができたのである。細胞は、腱内及び関節内環境全てに機能的であった。
【００７０】
トランスフェクションされた細胞の濃度は、局地的な作用において重要な要素である。先行の実験（Joyce et al．、supra、1990）で、TGF−βの用量が形成された組職のタイプを決定した。具体的に、膜間骨形成に対する軟骨形成の割合は、用量が低くなるに連れて減少した。TGF−βは、また、初期造骨細胞とMC3T3細胞の刺激において二相性（biphasic）である（Centrella et al., Endocrinology, 119:2306-2312, 1986）。すなわち、濃度によって刺激することもできるし、阻害することもできる（Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85:5683-5687, 1988）。そこで、提供された実施例において、NIH 3T3−TGF−β1細胞は、104、105、及び106cells／mlの各々の濃度でコラーゲン合成を促進した。腱は、106cells／mlの濃度で一番肥大となった。
【００７１】
実施例において、106cells／ml濃度の細胞0．3ｍｌを関節に注入した。標本は、注入後2週から6週までにかけて回収した。関節の環境は腱の環境とは違う。細胞は関節内でより自由に動くことができる。それらは、細胞と選択的親和性を有した部位へ動くはずである。滑膜、半月板（meniscus）及び軟骨欠損部位は細胞の付着可能な部位である。注入6週後、再生された組職が、一部及び完全に損傷された軟骨欠損部位で観察されたが、滑膜や半月板では観察されなかった。損傷された部位に対するこのような選択的親和性は、臨床的適用のための更なる利点である。もし退行性関節炎が、細胞を関節に直接注入することで治療することができるのであれば、患者は大手術なしに簡便に治療を受けることができる。
【００７２】
注入された細胞から分泌されたTGF−βは、二つの可能性のある方法によってガラス軟骨の再生を刺激することができる。一つは、損傷された部位に残っている軟骨細胞が、それらの細胞の表面にTGF−β受容体を生産することである（Brand et al., J Biol Chem, 270:8274-8284, 1995; Cheifetz et al., Cell, 48:409-415, 1987; Dumont et al., M Cell Endo, 111:57-66, 1995; Lopez-Casillas et al., Cell, 67:785-795, 1991; Miettinen et al., J Cell Biology, 127:6, 2021-2036, 1994; and Wrana et al., Nature, 370:341-347, 1994）。このような受容体は、損傷された部位に付着した、注入された細胞から分泌したTGF−βによって刺激されることができる。TGF−βが、インビボ潜在性形態で分泌されるため（Wakefield et al., J Biol Chem, 263,7646-7654,1988）、潜在性TGF−βは活性化過程が必要である。もう一つは、潜在性TGF−βまたは形質転換された細胞から分泌されたTGF−βが、一部欠損された軟骨層の細胞外基質でTGF−β結合蛋白質（LTBT）に結合するのである（Dallas et al., J Cell Biol, 131:539-549, 1995）。
【００７３】
作用のメカニズムに関わらず、ガラス軟骨の合成に関する観察は、TGF−βが高濃度に長時間持続されれば、ガラス軟骨の再生を刺激することができるということを示唆する。局地的高濃度を達成するためのビ−クルは、局地的刺激のための決定的な要素ではないが、理論的には、軟骨細胞が軟骨の損傷された部位にTGF−βを伝逹するための最も最適のビークルとなり得る（Brittberg et al., New Engl J Med 331:889-895, 1994）。コラーゲン二層基質は、形質転換された細胞の局地的分布のための、他に可能なビークルである（Frenkel et al., J Bone J Surg (Br) 79-B:831-836, 1997）。
【００７４】
新たに形成された組職の性質を組職学的な方法で調査したのである。Ｈ＆Ｅステイニングでは、新たに形成された組職は、周りのガラス軟骨と同一であった（図４）。新たに形成された組職の性質を評価するため、組職をサフラニン−Ｏステイニングした（Rosenburg, J Bone Joint Surg, 53A:69-82, 1971）。繊維状コラーゲンが白色である反面、新たに形成された組職は赤色に染色され、それがガラス軟骨であることを示す（図５）。
【００７５】
完全に欠損された部位の細胞は、繊維状コラーゲンを生産したのである。TGF−β刺激に対する骨性基質がバリヤーとして作用するため、周りの造骨細胞は刺激されないこともあり得る。周りの細胞を刺激する代りに、NIH 3T3−TGF−β1細胞は、自家発生促進によって繊維状コラーゲンを生産した。細胞がオートクライン及びパラクリン活性化によって刺激されたという事実は、TGF−β1発現コンストラクトを有する安定に形質転換された軟骨細胞で、退行性関節炎を治療することができる蓋然性を増加させる。
【００７６】
TGF−β発現コンストラクトによって安定に形質転換された細胞柱は、腱と膝関節で生存することができる。細胞柱は、腱と完全に欠損された軟骨部位で繊維状コラーゲンを生産する。しかし、細胞柱は、一部欠損された関節軟骨では、ガラス軟骨を生産する。オートクライン及びパラクリンモードの作用による刺激メカニズムは、TGF−βスーパーファミリー遺伝子のうちの１メンバーを利用した遺伝子治療法が、ガラス軟骨の損傷に対する新しい治療法であることを示す。
【００７７】
本発明者らは、TGF−β1発現コンストラクトをトランスフェクションさせることで、安定な繊維芽細胞（NIH 3T3−TGF−β1、及びヒト包皮繊維芽細胞TGF−β1）細胞柱を作った。このようなTGF−β−生産細胞は、活性的なTGF−βを高濃度に長時間インビボ維持した。
【００７８】
遺伝子療法及び、具体的に、細胞−媒介遺伝子療法の可能性について、解決するべき１つ目の問題は、細胞のインビボ生存可能性である。TGF−βが兔疫細胞をインビトロ抑制することができても、細胞が高效率の兔疫監視システムを持った他種の組職では、生存することができないかもしれないということである。２つ目に、インビボ遺伝子の発現のための最適濃度が決められるべきものである。本発明者らは、この問題を解決するために、細胞を３つの異なる濃度で兎のアキレス腱に注射した。使われた関節内注射の濃度は、腱内注射の最適濃度から決めた。３つ目は、関節内で細胞が軟骨の再生を刺激する方法に関するものである。
【００７９】
注入された細胞の作用モードには二つがある。一つは、分泌されたTGF−βによって周りの細胞が活性化することであり（paracrine活性化）（Snyder, Sci Am, 253(4): 132-140, 1985）、もう一つは、自家−活性化である（オートクライン活性化）。細胞の濃度が、経路に影響を与えることができるが、周りの環境が作用モードを決めるのに一番重要な要素となり得る。関節間の関節流液と靭帯の内部は、血液の供給、栄養の供給、及び、周りの細胞の面で、二つ相異なっている環境である。細胞の作用モードを確認するために、トランスフェクションされた細胞を二つ相異なっている環境に注射した。本研究の全体的目的は、整形外科的疾病のための、TGF−β−媒介遺伝子治療法を評価することであり、インビボ作用のモードを確認するのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明を制限するものではない。
【００８１】
（実施例１−材料及び方法）
（プラスミドの構造）
メタロチオネイン発現コンストラクト（pM）を製造するために、増幅のためのオリゴヌクレオチドに含まれた Xba I 及び Bam HI 制限酵素サイトを利用して、ゲノムDNAを利用したポリメラーゼチェーン反応でメタロチオネイン Ｉプローモーター（−660/+63）を製造した。増幅された切片を、pBluescript（Stratagene，La Jolla， CA）のXba I−Bam HIサイトでサブクローニングした。TGF−β1コード序列を含む1．2−kb Bgl II 切片と3'末端の成長ホルモンポリーAサイトをpMのBam HI−SalＩサイト内にサブクローニングしてプラスミドpmTβ1を製造した。
【００８２】
（細胞培養及びトランスフェクション）
TGF−β cDNAを、繊維芽細胞（NIH 3T3−TGF−β1）内に、またはヒト包皮繊維芽細胞／TGF−β1内にトランスフェクションさせた。これらを、10％仔牛胎児血清が含まれたDulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）（Gibco−BRL、 Rockville、 MD）で培養した。TGF−β１ cDNAシーケンスをメタロチオネイン遺伝子プローモーターを持ったpmTβ1ベクターに付加した。また、ネオマイシン抵抗性遺伝子シーケンスもベクター内に挿入した。
【００８３】
このベクターを細胞内に導入するために、カルシウムホスファート法を使った。トランスフェクションされた遺伝子シーケンスを持った細胞を選別するために、ネオマイシン（300 μg／ｍｌ）を培地に添加した。次に、生存するコロニーを選別し、TGF−β1 mRNA発現は、Northern分析とTGF−β1 ELISA分析法（R&D System）で確認した。TGF−β1を発現する細胞を注入直前まで液体窒素に保管して培養した。
【００８４】
（Northern Blot分析）
グアニジウム イソチオシアネート／フェノール／クロロホルムを使って細胞からトータルRNAを分離した。トータルRNAを0．66 M ホルムアルデヒドを含む1．0％アガロース−ゲル上で電気泳動させて、DURALON−UV膜に移し、UV STRATALINKER（STRATAGENE）と交差結合させた。Blotsを前混成化し、65℃で1％仔牛血清アルブミン、7％（w/v） SDS、0．5 M 燐酸ナトリウム及び1mM EDTAを含む溶液で混成化した。混成化したblotsをフィルム露出前に0．1％ SDS、 1Ｘ SSCで20分間50℃で洗浄した。RNA blotsをヒトTGF−β1の32P−ラベルしたcDNA プローブで混成化した。β−アクチンのプローブを試料ローディングのためのコントロールとして利用した。
【００８５】
（兎への細胞注入）
2．0−2．5kg体重のニュージーランド白い兎を動物モデルとして選択した。ケタミン（Ketamine）とロームプン（roumpun）で痲酔させた後、各兎を消毒した。アキレス腱を露出させて、腱の中間部位に104、105及び106cells／ml濃度の細胞を0．2ｍｌ−0．3ｍｌ注入した。トランスフェクションされたDNAの発現のために、兎の飲み物に硝酸亜鉛を添加した。アキレス腱の実験で、最適濃度を決定した後、関節内注射を行った。膝関節を露出させて、ナイフで一部及び完全に軟骨欠損を作った。軟骨下骨を露出させないように注意しながら、ガラス軟骨層に一部欠損を作った。完全欠損は、ガラス軟骨を全部とり除いた後、軟骨下骨が露出されるようにした。外科的傷を縫合した後、106cells／ml濃度の細胞を関節内に注射し、硝酸亜鉛を飲み物に添加した。
【００８６】
（組職学的検査）
腱と膝関節を回収した後、標本をホルマリンで固定させて、硝酸で脱石灰した。それらをパラフィン−ブロックに埋め込み、0．8μm厚さの薄切れに切った。再生された組職を顕微鏡で観察するためにヘマトキシリン−エオシン及びサフラニン−Oステイニングを利用した。
【００８７】
（実施例２−結果）
（安定な細胞柱）
トランスフェクションは、カルシウム−ホスファート共沈法を利用して行った（図1）。生存したコロニーの約80％が、転移遺伝子（transgene） mRNAを発現した。このような選別されたTGF−β1−生産細胞を、硝酸亜鉛溶液で培養した。細胞を100μM 硝酸亜鉛溶液で培養するとmRNAが生産される。TGF−β1分泌速度は、約32ng/106細胞/24hrだった。
【００８８】
（兎のアキレス軟骨欠損の再生）
NIH 3T3−TGF−β1細胞の生存を確認するために、兎のアキレス腱を観察した。肉眼で観察する場合、106cells／ml濃度の方が、104及び105の濃度より腱がもっと厚かった。一部及び完全に軟骨に欠損を作った後、106cells／ml濃度のNIH 3T3−TGF−β1細胞0．3ｍｌを膝関節内に注射した。注入後2から6週まで関節を調査した。一部欠損された軟骨では、新たに形成されたガラス関節が観察された；2週経過後、ガラス関節が現われ、６週経過後、軟骨欠損がガラス軟骨で覆われた（図２）。再生された軟骨の厚さは、時間が経つにつれて厚くなった（図3）。注入された細胞がTGF−β1を分泌し、これはTGF−β1抗原を使った兔疫組職化学ステイニングによって確認された（図３）。TGF−β1のトランスフェクションがない正常繊維芽細胞が注入された反対側は、ガラス軟骨で覆われなかった。一部欠損された部位では、再生されたガラス軟骨がサフラニン−Oステイニングによって赤色に染色された（図４）。（新たに形成された軟骨の深さは殆ど損失された深みと等しい。）このような結果は、注入された細胞が、作用のパラクリン作用モードを介して、周りの正常軟骨細胞を活性化させること示す。
【００８９】
完全欠損された軟骨で再生された組職は、ガラス軟骨ではなく、繊維状コラーゲンだった。サフラニン−Ｏステイニングにおいて、それは、ガラス軟骨で現われた赤い色ではなく、白く染色された。（図５）。軟骨は、繊維状組職で覆われ、これは、このような細胞たちが、単にオートクラインモードによって活性化されたことを意味する。TGF−βによって刺激され得る周りの造骨細胞が、厚い脱石灰されたの骨基質の存在によって、TGF−βによって刺激されることが遮断されることと見られる。注入された細胞は、このバリヤーのため、造骨細胞を刺激することができないかもしれない。
【００９０】
TGF−β1トランスフェクション細胞を兎のアキレス腱に注射した。腱が非常に拡大され、コントロールの腱に比べて肉眼でももっと厚いことを確認できた（図７）。顕微鏡での観察では、Ｈ＆Ｅステイニングによって、注入されたNIH 3T3−TGF−β1細胞が兎のアキレス腱で生存し、繊維状コラーゲンを生産することを確認した（図８）。再生された腱組職をTGF−β1抗体を利用して兔疫組職化学的に染色した結果、腱でTGF−β1の発現を確認した（図９）。
【００９１】
本発明を例示するために具体的な実施例を上記の通り記述したが、下記請求項で定義された発明の範疇を脱しない本発明の多くの変形がありえることは、当業者間には明白な事実である。
【００９２】
本明細書に記載したすべての参考文献はその全体で参照として挿入される。
【００９３】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】TGF−β１mRNAの発現。NIH 3T3細胞または、亜鉛の存在可否に関わらず成長することができるTGF−β1発現ベクターであるpmTβ1に安定的に形質転換されたNIH 3T3細胞から、トータルＲＮＡを分離した。トータルＲＮＡ（15mg）をTGF−β1 cDNAやコントロールに使用したβアクチンcDNAでプローブした。
【図２】再生された軟骨の肉眼観察。２Ａ．大腿関節隆起（大腿顆）に四角形の部分的な軟骨欠損を作って膝関節にTGF−β1でトランスフェクションしていないNIH 3T3細胞を注入した。欠損は回復されなかった。２Ｂ．NIH 3T3−TGF−β1細胞注入の６週後に、新たに形成された組職によって欠損が回復した。再生された組職の色は、周りの軟骨の色とほぼ同一であった。
【図３】再生された軟骨の顕微鏡におる観察（Ｘ２００）。３Ａ及び３Ｂ．コントロール細胞を注入して4週及び６週後、欠損部位のヘマトキシリンーエオシン（Ｈ＆Ｅ）分析。初期欠損部を覆う組職がない。３Ｃ及び３Ｄ．TGF−β1トランスフェクション細胞を注入して4週及び6週後、欠損部位のヘマトキシリンーエオシン（Ｈ＆Ｅ）分析。TGF−β1トランスフェクション細胞を注入後4週目には、部分的に欠損部位がガラス軟骨で覆われた。注入後４週及び６週後には、再生された組職が厚くなり、６週後には正常な軟骨とその高さがほぼ同一となった。組職学的には再生された軟骨（矢印）が周りのガラス軟骨とほぼ同一となった。
【図４】兎の関節におけるTGF−β1発現に関する兔疫組職化学的分析（Ｘ２００）。茶色のイミュノ−ペルオキシダーゼ反応産物は、NIH 3T3−TGF−β1細胞で組換えTGF−β1が高水準に発現することを示す（４Ｂ）。４Ａは、コントロール細胞を注入した兎の関節におけるガラス軟骨を示す。
【図５】Ｈ＆Ｅステイニング（Ａ）と、サフラニン−Ｏステイニング（Ｂ）を利用して、再生された組職の顕微鏡観察（Ｘ２００）５Ａ．部分的に欠損された部位で、再生されたガラス軟骨がＨ＆Ｅステイニング（黒い矢印）によって見られる。５Ｂ．完全に剥がれた軟骨部位で、再生された組職（白い矢印）は、繊維性コラーゲンであった。
【図６】ｐｍＴβ１のプラスミドマップ。
【図７】TGF−β1にトランスフェクションされた細胞を注入した兎のアキレス腱の肉眼形態。７Ａ．コントロール細胞を注入した腱。７Ｂ．注入6週後のTGF−β1に形質転換された細胞を注入した腱。７Ｃ．７Ａに図示した腱の断面図。７Ｄ．７Ｂに図示した腱の断面図。
【図８】Ｈ＆Ｅでステイニングした兎のアキレス腱に再生された組職の顕微鏡観察。８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、注入6週後の、コントロール細胞を注入した腱を示す。 ８Ａ Ｘ５０拡大。 ８Ｂ Ｘ２００拡大。 ８Ｃ Ｘ６００拡大。 ８Ｄ、８Ｅ、及び、８Ｆは、注入6週後の、TGF−β1にトランスフェクションされた細胞を注入した腱を示す。８Ｄ Ｘ５０拡大。 ８Ｅ Ｘ２００拡大。８Ｆ Ｘ６００拡大。腱に注入したTGF−β1にトランスフェクションされた細胞は、内在性腱より少し丸く見られる。纎維状コラーゲンが、オートクライン及びパラクリン作用モードに生成され、腱が肥大となった。TGF−β1にトランスフェクションされた細胞が注入された後腱が肥大となった。
【図９】Ａ，ＢはＨ＆Ｅステイニング（Ａ）と、TGF−β1抗体による兔疫組職化学的ステイニング（Ｂ）を利用した兎のアキレス腱に再生された組職の顕微鏡観察。茶色のイミュノ−ペルオキシダーゼ反応産物は、NIH 3T3−TGF−β1細胞で組換えTGF−β1が高水準に発現することを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物宿主の結合組織を再生するのに用いるための、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子を符号化する少なくとも１つの遺伝子を、少なくとも１つの哺乳動物の結合組織に導入する方法に関する。又、本発明は、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子を符号化する遺伝子を含むDNAベクター分子を含有する結合組織細胞柱に関する。
【背景技術】
【０００２】
整形外科分野において、退行性関節炎又は骨関節炎は、軟骨欠損と関わり、最も頻発する疾病である。膝、臀部、肩及び手首のような身体の殆ど全ての関節において発生する。このような疾病の原因は、ガラス関節軟骨の退行である（Mankin et al., J Bone Joint Surg, 52A: 460-466, 1982）。関節のガラス軟骨は変形され、細動し、又、究極的には陥没することとなる。もし、退行された軟骨がどうあろうとも再生することができるのであれば、多くの患者らは、彼らを衰弱させる苦痛なしに生活を営むことができるようになる。現在では、欠損されたガラス軟骨を再生する方法が報告されていない。
【０００３】
経口、静脈内、筋肉内投与のような薬物伝達の伝統的な経路では、薬物を関節に伝達するのには非効果的である。一般的に関節内に注入された薬物は半減期が短い。薬物を関節内に注入することのもう一つの短所は、関節炎のような慢性的な状態を治療するための、関節腔における十分な薬物濃度を得るためには、頻繁に、反復的に注入しないといけないということである。今までの治療剤は、関節に選択的に到達できなかったため、持続的な関節内の治療容量を獲得するためには、高濃度の薬物に哺乳動物宿主の全身を露出させる必要があったのである。このような方法においては、非標的器官が露出されることにより、抗関節炎薬物が、胃腸亢進、哺乳動物宿主の血液、心血管、肝臓、及び、腎臓系の変化のような深刻な副作用をより悪化する傾向があったのである。
【０００４】
整形外科分野において、いくつかのサイトカインが整形外科的疾病の治療剤の候補として考えられてきた。骨形成蛋白質（bone morphogenic protein）は、骨形成の效果的な促進因子として認識されてきており（Ozkaynak et al., EMBO J, 9:2085-2093, 1990; Sampath and Rueger, Complications in ortho, 101-107, 1994）、TGF−βが骨形成及び軟骨形成の促進因子として報告されたことがある（Joyce et al., J Cell Biology, 110:2195-2207,1990）。
【０００５】
トランスフォーミング成長因子−β（TGF−β）は、多機能性サイトカインに認識され（Sporn and Roberts, Nature (London), 332:217- 219, 1988）、細胞成長、分化、及び、細胞外基質蛋白質の合成を調節する役割をする（Madri et al., J Cell Biology, 106: 1375-1384,1988）。TGF−βは、上皮細胞と破骨類似細胞（osteoclast−like cells ）のインビトロでの成長を阻害するが（Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85: 5683-5687, 1988）、インビボ軟骨の骨化（enchodral ossification）を刺激して究極的には骨形成を促進する（Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993; and Matsumoto et al., In vivo, 8: 215-220,1994）。TGF−β−誘導骨形成は、骨膜下（subperiosteal）多機能性細胞を刺激して窮極的には軟骨形成細胞に分化するようにする（Joyce et al., J Cell Biology, 110: 2195-2207, 1990; and Miettinen et al., J Cell Biology, 127-6: 2021-2036, 1994.）。
【０００６】
整形外科学でのTGF−βの生物学的效果が報告されたことがある（Andrew et al., Calcif Tissue In. 52: 74-78, 1993; Borque et al., Int J Dev Biol., 37:573-579, 1993; Carrington et al., J Cell Biology, 107:1969-1975, 1988; Lind et al., A Orthop Scand. 64(5) : 553-556, 1993; Matsumoto et al., In vivo, 8:215-220, 1994）。マウス胚で、ステイニングの結果は、TGF−βが、結合組職、軟骨、及び、骨のような肝葉から由来した組職と密接に係わっていることを見せてくれる。発生学的観察に加えて、TGF−βは、骨形成と軟骨形成部位に存在する。また、それは、兎の脛骨の骨折の治療を向上させることができる。最近、TGF−βの治療的価値が報告されたことがあるが（Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; and Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556,1993）、その效果の持続時間が短いことと高価である点が、臨床的に広く適用されることを阻んできた。
【０００７】
TGF−βがインビボで不活性の状態に分解されることによって、注入されたTGF−βの作用の持続する時間が短いため、関節炎の治療のためにTGF−βを関節内に注入することは望ましくない。よって、TGF−βを長期間放出する新しい方法がガラス軟骨の再生のための必要である。
【０００８】
軟骨細胞を自家移植して関節の軟骨を再生することが報告されたことはあるが（Brittberg et al., New Engl J Med 331: 889- 895, 1994）、このような方法は軟組織を二度にかけて広く切除する手術を伴う。もし関節内注入で退行性関節炎の治療が十分であるならば、患者にとって経済的にも身体的にも大きな恩恵となることであろう。
【０００９】
特定の蛋白質を特定の部位に伝逹する方法である遺伝子療法が、このような問題を解く方法になり得る（Wolff and Lederberg, Gene Therapeutics ed. Jon A. wolff, 3-25, 1994; and Jenks, J Natl Cancer Inst, 89(16): 1182-1184, 1997）。
【００１０】
米国特許第５、８５８、３５５号、及び、第５、７６６、５８５号は、ＩＲＡＰ（インターロイキンー１受容体拮抗剤蛋白質）遺伝子のウイルスまたはプラスミドコンストラクトを製造する段階；滑膜細胞（synovial cell） （５、８５８、３５５）、及び骨髄細胞（５、７６６、５８５）を、前記コンストラクトでトランスフェクションさせる段階；及び形質転換された細胞を兎の関節内に注入する段階を開示する。しかし、TGF−βスーパーファミリーに属する遺伝子を結合組職を再生するのに使用したことは開示されたことがない。
【００１１】
米国特許第５、８４６、９３１号及び第５、７００、７７４号には、軟骨性組職の形成を維持し、軟骨性組職を誘導するために、TGF−β"スーパーファミリー"に属する骨形成蛋白質（BMP）を含む組成物を、切形の副甲状線ホルモン関連のペプチドと一緒に注入するのが開示されている。しかし、BMP遺伝子を利用した遺伝子治療法に対する開示はない。
【００１２】
このような先行技術の開示にもかかわらず、哺乳動物宿主を治療するために、哺乳動物宿主の結合組職の少なくとも１つの細胞に発現産物（product）をエンコードする少なくとも１つの遺伝子をインビトロ方法で、あるいはインビボ導入する方法に対する実在的、かつ、実質的な要求が残ってしまう。また、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子をエンコードする遺伝子を、宿主細胞で結合組織を再生するのに使用する方法が必要である。より具体的には、TGF−βスーパーファミリー蛋白質をエンコードする遺伝子を、宿主の結合組織細胞でインビボ発現させる方法が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記記載の要求に応じたものである。本発明は、哺乳動物の結合組織の少なくとも１つの細胞に、発現産物をエンコードする少なくとも１つの遺伝子を導入する、哺乳動物宿主治療方法を提供する。この方法は、発現産物をエンコードする遺伝子を含むDNAベクター分子を製造するために組換え技術を使用する段階と、発現産物をエンコードする遺伝子を含むDNAベクター分子を結合組織細胞内に導入する段階を含む。ＤＮＡベクター分子は、ターゲット細胞や組織に伝達され維持され得る任意のＤＮＡ分子であり、究極的に目的の発現産物をエンコードする遺伝子が安定に発現することができる。本発明において、用いられる望ましいDNAベクター分子は、ウイルス系列あるいはプラスミド系列のDNAベクター分子である。本方法は、望ましくは、治療の用途として哺乳動物の結合組織細胞に発現産物をエンコードする遺伝子を導入することを含む。
【００１４】
本発明は、ａ）トランスフォーミング成長因子蛋白質スーパーファミリーのうちの１因子を符号化し、プロモーターに作動的にリンクされたDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを製造する段階；
ｂ）培養された結合組織細胞集団を、前記組換えベクターでインビトロトランスフェクションさせることにより、形質転換された結合組織細胞集団を製造する段階；及び
ｃ）前記形質転換された結合組織細胞を、哺乳動物宿主の関節炎性関節腔に、関節内注射して移植することにより、前記DNAシーケンスが前記関節腔内で発現されて結合組織を再生する段階；
を含む関節炎の治療方法に関するものである。
【００１５】
組換えベクターは、レトロウイルスベクターであり得るが、これに限定せず、レトロウイルスベクターであることが望ましい。又、前記ベクターは、プラスミドベクターであり得る。
【００１６】
本発明の方法は、形質転換された結合組織細胞集団が移植される前には保管される段階を含む。前記細胞は、移植される前には、液体窒素下で１０％ＤＭＳＯで保管され得る。
【００１７】
結合組織細胞は、繊維芽細胞、間葉細胞、造骨細胞、又は、軟骨細胞を含むが、これらに限定されるものではない。前記繊維芽細胞は、NIH 3T3細胞、又は、ヒト包皮繊維芽細胞であり得る。
【００１８】
結合組織は、軟骨、靭帯、又は、腱を含むが、これらに限定されるものではない。前記軟骨はガラス軟骨であり得る。
【００１９】
本発明の方法は、トランスフォーミング成長因子β（TGF−β）を含むトランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子を使用する。前記トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子としては、TGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、BMP−２、BMP−３、BMP−４、BMP−５、BMP−６、又は、BMP−７であり得る。望ましくは、TGF−βは、ヒト又は豚のTGF−β１、TGF−β２、又は、TGF−β３である。
【００２０】
又、本発明は、ａ）トランスフォーミング成長因子蛋白質スーパーファミリーのうちの１因子をエンコードし、プロモーターに作動的にリンクされたDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを製造する段階；
ｂ）培養された結合組織細胞集団を、前記組換えベクターでインビトロトランスフェクションさせることにより、形質転換された結合組織細胞集団を製造する段階；及び
ｃ）前記形質転換された結合組織細胞を、哺乳動物宿主の関節炎性関節腔に、関節内注射して移植することにより、前記DNAシーケンスが前記関節腔内で発現されてガラス軟骨を再生する段階；
を含むガラス軟骨の再生方法に関するものである。
【００２１】
トランスフェクション方法は、リポソームカプセル法、カルシウム・ホスファート共沈法、電気穿孔法、DEAE−デキストラン媒介法によって達成され得る。
【００２２】
好ましくは、本発明の方法は、ｐｍＴβ１プラスミドを利用することを含む。
【００２３】
又、本発明は、トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子をエンコードするDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを含有する結合組織細胞柱に関するものである。結合組織細胞柱は、繊維芽細胞柱、間葉細胞柱、軟骨細胞柱、造骨細胞柱、又は、骨細胞柱であり得るが、これらに限定されるものではない。前記繊維芽細胞柱は、ヒトの包皮繊維芽細胞柱又はNIH 3T3細胞柱であり得る。
【００２４】
本発明による結合組織細胞柱は、トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子を含む。好ましくは、トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子が、TGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、BMP−２、BMP−３、BMP−４、BMP−５、BMP−６、又はBMP−７である。より好ましくは、メンバーが、ヒト又は豚のTGF−β１、TGF−β２、又は、TGF−β３である。
【００２５】
更に、本発明の結合組織細胞柱は、組換えベクターｐｍＴβ１を含有する細胞を含むことができる。
【００２６】
本発明の上記の目的と、本発明の上記の目的とは異なる更なる目的は、下記発明の詳細な説明、それに添付された参考図面、及び、請求項より具体化される。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本明細書で用いられる"患者"というのは、ヒトのみならず、動物系に属するメンバーも含む。
【００２８】
本明細書で用いられる"哺乳動物宿主"というのは、ヒトのみならず、動物系に属するメンバーも含む。
【００２９】
本明細書で用いられる"結合組織"というのは、他の組職や機関を連結し、支持する任意の組職であり、哺乳動物の靭帯、軟骨、腱、骨、及び滑膜を含むがこれに限定されるものではない。
【００３０】
本明細書で用いられる"結合組職細胞"または"結合組織の細胞"というのは、脂肪細胞（adipocytes）と平滑筋細胞のみならず、コラーゲン性の細胞外基質を分泌する繊維芽細胞、軟骨細胞、及び、骨細胞（osteoblasts／osteocytes）のような結合組織に存在する細胞を含む。望ましくは、結合組職細胞は、繊維芽細胞、軟骨細胞、及び、骨細胞である。より望ましくは、結合組職細胞は、繊維芽細胞である。また、結合組職細胞は、未成熟した繊維芽細胞として知られた肝葉細胞を含む。本発明が単一タイプの細胞のみでならず、混合された結合組職細胞の培養物を使用することができるということを認識することができる。
【００３１】
本明細書で用いられる"結合組織細胞柱"というのは、共通の母細胞から由来した多数の結合組職細胞を含む。
【００３２】
本明細書で用いられる"ガラス軟骨"というのは、関節表面を覆っている結合組織をいう。例を挙げると、ガラス軟骨は、関節軟骨、肋軟骨、及び、鼻軟骨を含むが、これに限定されるものではない。
【００３３】
具体的には、ガラス軟骨は、自家−復元し、変化に反応し、摩擦のない安定な運動を提供するものと知られている。関節のガラス軟骨は、同一関節内のガラス軟骨であっても、その厚さ、細胞密度、基質組成、及び、機械的性質が多様ではあるが、同一の普遍的構造と機能を有する。ガラス軟骨のいくつかの機能としては、圧迫に対する突発硬直、復元力、負荷（weight loads）を分散させる例外的な能力、軟骨下骨に対する最大ストレスを最小化する能力、そして、優れた耐久性を含む。
【００３４】
肉眼で、及び組職学的に、ガラス軟骨は、変形に耐える滑らかで堅い表面に見える。軟骨の細胞外基質は軟骨細胞を含むが、血管、リンパ管、または神経はない。軟骨細胞と基質間の相互作用を維持する精巧で、かつ、よく整えられた構造は、ガラス軟骨の構造と機能を維持するようにし、一方、代謝活動は少なくするようにする。ドリスコルの文献（O'Driscoll, J. Bone Joint Surg。、 80A: 1795−1812、1988）では、ガラス軟骨の構造と機能について詳細に開示しており、上記文献はその全体として本明細書に参考として含まれる。
【００３５】
本明細書で用いられる"トランスフォーミング成長因子−β（TGF−β）スーパーファミリー"は、胚発生の間の広い範囲にわたって、分化過程に影響を及ぼす構造的に連関された蛋白質の１グループを含む。前記ファミリーは、正常な男性発達のために必要なミュラー（Mullerian）阻害物質（MIS）（Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990）、背側−腹面軸形成と成虫盤（imaginal disk）の形態発生に必要なショウジョウバエ・デカペンタプレジック（decapentaplegic）（DPP）遺伝子産物（Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987）、卵のベジタルポール（vegetal pole）に位置する海胆（Xenopus）Vg−1遺伝子産物（Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987）、海胆胚の中胚葉と後胚葉の構造形成を誘導することができる（Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990）アックティビン（activines）（Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986）、及びde novo軟骨及び骨形成を誘導することができる（Sampath, et al., J. Biol.）骨形成蛋白質（BMP−2、 3、 4、 5、 6及び7のようなBMP、osteogenin、OP−1）を含む。前記TGF−β遺伝子産物は、脂肪形成（adipogenesis）、筋肉発生（myogenesis）、軟骨形成（chondrogenesis）、血液生成（hematopoiesis）、及び、上皮細胞分化を含む多様な分化過程に影響を及ぼすことができる（Massague, Cell 49:437, 1987）のを想起しつつ、この文献はその全体として本明細書に参考として含まれる。
【００３６】
TGF−βファミリーの蛋白質は、初めに巨大前駆体蛋白質として合成され、次いで、Ｃ−末端から約１１０−１４０アミノ酸付近の塩基性残基のクラスターで蛋白分解によって切断される。蛋白質のC−末端部位は、皆構造的に係わっていて、ファミリ−メンバーたちは、それらの類似性の程度によって異なるサーブグループに分類することができる。特定サーブグループ内の類似性は、70％から90％のアミノ酸序列の相同性を見せるが、サーブグループ間の相同性は確実に低く、一般的にせいぜい20％から50％位である。それぞれの場合、活性種は、C−末端切片の二硫化結合二量体と見られる。研究されたファミリーメンバーの大部分において、同型二量体種が、生物学的に活性であることと発見されたが、また、インヒビン（inhibins）（Ung, et al., Nature, 321:779, 1986）とTGF−β's（Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987）ような他のファミリメンバーでは、異型二量体が検出され、これらはそれぞれの同型二量体に対して相違する生物学的性質を有することと見られる。
【００３７】
TGF−β遺伝子のスーパーファミリーメンバーには、TGF−β２、TGF−β３、TGF−β４（ニワトリ）、TGF−β1、TGF−β5（海胆）、BMP−2、BMP−4、ショウジョウバエDPP、 BMP−5、BMP−6、Vgr1、OP−1／BMP−7、ショウジョウバエ60A、GDF−1、海胆Vgf、BMP−3、インヒビン−βA、インヒビン−βB、インヒビン−α、及び、MISが含まれる。このような遺伝子は、Massagueの文献（Massague、 Ann．Rev．Biochem．67:735−791、1988）に開示されており、上記文献は、その全体として本明細書に参考として挿入される。
【００３８】
望ましくは、TGF−β遺伝子のスーパーファミリーメンバーはTGF−βである。より望ましくは、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6、あるいはBMP−7である。より望ましくは、ヒトまたは豚のTGF−βである。より望ましくは、ヒトまたは豚のTGF−β1、TGF−β2あるいはTGF−β3である。最も望ましくは、ヒトまたは豚のTGF−β1である。
【００３９】
本明細書で用いられる"選択マーカー"というのは、導入されたDNAを安定に維持する細胞によって発現され、細胞が形態発生的形質転換または酵素活性のような変形された表現型を発現するようにする、遺伝子産物を含む。トランスフェクションされた遺伝子を発現する細胞は、同細胞に抗生剤やあるいは他の薬物に抵抗性を付与する酵素活性を有するような、選択マーカーをエンコードする二番目の遺伝子を同一の細胞に導入することによって分離されることができる。選択マーカーの例としては、チミジンキナーゼ（thymidine kinase）、ジヒドロフォレートレドッターゼ（dihydrofolate reductase）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（aminoglycoside phosphotransferase）（カナマイシン、ネオマイシン、及び、ゼネチシン（geneticin）のようなアミノグリコシド系抗生剤に抵抗性を付与する）、ハイグロマイシン B ホスホトランスフェラーゼ、 キサンチン−グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ、CAD（de novo ウリジン生合成−カルバミル ホスファート シンセターゼ、アルパルテート トランスカルバミラーゼ、及びジヒドロオロターゼ（dihydroorotase）の初めの三種の酵素活性を有する一つの蛋白質）、アデノシン ジアミナーゼ、及びアスパラギンシンセターゼを含むが、これに限定されるものではない（Sambrook et al. Molecular Cloning, Chapter 16. 1989）。上記文献は、その全体として本明細書に参照として含まれる。
【００４０】
本明細書で用いられる"プローモーター"というのは、活性で、かつ、真核細胞で転写を調節する任意のDNAシーケンスであり得る。プローモーターは、真核細胞及び／または原核細胞で活性である。望ましくは、プローモーターは、哺乳動物細胞で活性がある。プローモーターは、恒常的に発現されるか誘導されることができる。望ましくは、プロモーターは誘導可能である。望ましくは、プローモーターは、外部の刺激によって誘導可能である。より望ましくは、プローモーターは、ホルモン又は金属によって誘導される。より望ましくは、プローモーターは重金属によって誘導される。最も望ましくは、プローモーターは、メタロチオネイン遺伝子プローモーターである。さらに、転写を調節する"エンハンサーエレメント"が、DNAベクターコンストラクトに挿入されることができ、本発明のコンストラクトと共に目的とする遺伝子の発現を増加させるために使われ得る。
【００４１】
本明細書で用いられる"DC−col"というのは、陽イオン性コレステロール誘導体を含む陽イオン性リポソームを意味する。"DC−chol"分子は、３価アミノグループ、中間長さスペイサーアーム（２原子）、及び、カルバモイル−リンカーボンド（carbamoyl linker bond）を含む（Gao et al., Biochem. Biophys. Res, Commun., 179:280-285, 1991）。
【００４２】
本明細書で用いられる"SF−chol"は、陽イオン性リポソームの一形態として定義される。
【００４３】
本明細書でリポソームと連関して用いられる"生物学的に活性である"というのは、機能的なDNA及び/または蛋白質をターゲットセルに導入する能力をいう。
【００４４】
本明細書での核酸、蛋白質、蛋白質切片、または、それらの誘導体と関連して用いられる"生物学的に活性である"というのは、ワイルドタイプの核酸や蛋白質によって知られた生物学的機能を模倣する核酸またはアミノ酸序列の能力として定義される。
【００４５】
本明細書でのリポソーム伝達の文脈で用いられるときの"維持"というのは、導入されたDNAが細胞内に残存するようにする能力をいう。他の文脈で用いられるときは、治療的效果を持つようにするために、ターゲットDNAがターゲット細胞や組職内に存在するようにする能力を意味する。
【００４６】
本発明は、目的するDNAシーケンスを哺乳動物宿主の結合組職細胞にインビボあるいはエクスビボ伝逹する技術を開示する。エクスビボ技術は、ターゲット結合組職細胞を培養すること、DNAシーケンス、DNAベクターまたは他の意図する伝逹ビークルを結合組職細胞でインビトロトランスフェクションさせること、そして目的する遺伝子産物がインビボ発現されるようにするために変形された結合組職細胞を哺乳動物宿主のターゲット関節に移植することを含む。
【００４７】
繊維芽細胞のインビトロ増殖を代替する方法として、目的する発現産物をエンコードする遺伝子をリポソーム内に導入し、関節部位に直接的に注入し、この時、リポソームは、結合組職細胞と融合して、結果的にはTGF−βスーパーファミリーに属する遺伝子産物がインビボ発現されるようにする。
【００４８】
結合組職細胞のインビトロ増殖を代替する方法として、目的する発現産物をエンコードする遺伝子をnaked DNA状態で関節部位に導入する。Naked DNAは、結合組職細胞に入り、窮極的には、TGF−βスーパーファミリーに属する遺伝子産物がインビボ発現されるようにする。
【００４９】
本明細書を通じて開示された結合組織異常を治療するエクスビボ方法の一つは、まず、蛋白質またはそれの生物学的に活性がある切片をエンコードするDNAシーケンスを含む組換えウイルスまたはプラスミドベクターを製造することを含む。次に、この組換えベクターをインビトロ培養された結合組職細胞のポピュレーションを感染又はトランスフェクションさせるために使い、結局、ベクターを含有する結合細胞のポピュレーションを作る。次に、このような結合組職細胞を哺乳動物宿主のターゲット関節腔に移植して関節腔内で蛋白質あるいは蛋白質切片の発現を起こす。目的するDNAシーケンスの発現は、結合組職異常と係る有害な関節疾患を実質的に軽減するのに有用である。
【００５０】
ヒト患者を治療するために好まれる細胞のソースが自家繊維芽細胞のような患者自分の結合組職細胞であるということは、当業者ならよく分かっているはずである。
【００５１】
より具体的には、本方法は、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子あるいはその生物学的に活性のある誘導体や切片をエンコードする遺伝子と、選択マーカーあるいはその生物学的に活性のある誘導体や切片を利用することを含む。
【００５２】
本発明の他の実施例は、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの少なくとも１つの因子あるいはそれの生物学的に活性のある誘導体や切片をエンコードする遺伝子を利用し、DNAプラスミドベクターとしては、利用される伝逹方法とは関係なしに伝逹の時にターゲットの細胞や組職に安定に維持されることができるとして、当業者に知られた任意のDNAプラスミドベクターを使うことを含む。
【００５３】
その方法の一つとして、ウイルスDNAベクター分子であっても、あるいは、プラスミドDNAベクター分子であっても、いずれにしてもDNAベクター分子をターゲットの細胞あるいは組職に直接伝逹するのである。また、この方法は、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子あるいはそれの生物学的に活性のある誘導体や切片をエンコードすることができる遺伝子を利用することを含む。
【００５４】
本発明のもう一つの実施例は、哺乳動物宿主を治療する用途として、結合組織の少なくとも一つの細胞に、発現産物をエンコードする少なくとも一つの遺伝子を導入する方法を提供する。本方法は、結合組職細胞に発現産物をエンコードする遺伝子を導入する非−ウイルス的手段を利用することを含む。より詳細には、本方法は、リポソームカプセル法、カルシウム−ホスファート共沈法、電気穿孔法、または、DEAE−デキストラン媒介法を含んでおり、遺伝子として、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのうちの１因子あるいはそれの生物学的に活性のある誘導体や切片をエンコードすることができる遺伝子と、選択マーカーあるいはそれの生物学的に活性がある誘導体や切片を利用することを含む。
【００５５】
本発明のもう一つの実施例は、哺乳動物宿主を治療する用途として、結合組織の少なくとも一つの細胞に、発現産物をエンコードする少なくとも一つの遺伝子を導入する追加的方法を提供する。本追加的方法は、ターゲットの細胞や組職にDNAベクター分子を伝逹するウイルスを利用する生物学的手段を利用することを含む。望ましくは、ウイルスは、擬ウイルスがターゲット細胞内に運ばれて安定に維持されるようにゲノムが変形されたが、ターゲットの細胞や組職内で複製される能力を持っていない擬ウイルスである。変形されたウイルスゲノムを組換えDNA技術を使用してもっと増幅すれば、その結果、ウイルスゲノムは、ターゲットの細胞や組職内で発現される、目的とする異種由来（heterologous）遺伝子を含むDNAベクター分子として機能するようになる。
【００５６】
本発明の望ましい実施例は、本明細書内に記載されたエクスビボ技術を利用したレトロウイルスベクターの使用を通じて、哺乳動物宿主の結合組織にTGF−β遺伝子を伝逹することにより、ターゲット関節腔にTGF−βを伝逹する方法である。言い換えれば、機能的なTGF−β蛋白質または蛋白質切片をエンコードする目的のDNAシーケンスを、選択したレトロウイルスベクターでサブクローニングし、次に、組換えウイルスベクターを適正タイターに培養し、培養された結合組職細胞にインビトロトランスフェクションさせるのに用い、そして形質転換された結合組職細胞、望ましくは自家移植された細胞をターゲット関節内に望ましくは関節内注射によって移植するのである。
【００５７】
本発明の他の望ましい方法は、アデノウイルス（adenovirus）ベクター、アデノ−関連ウイルスベクター（AAV）、または、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター（HSV）を使い、哺乳動物宿主の結合組織にTGF−βスーパーファミリー遺伝子をインビボ直接伝逹することを含む。言い換えれば、機能的TGF−β蛋白質または蛋白質切片をエンコードする目的のDNAシーケンスを、それぞれのウイルスベクターにサブクローニングする。次に、TGF−β包含ウイルスベクターを適正タイターに培養した後、望ましくは関節内注射によって関節腔に注入する。
【００５８】
目的とする遺伝子を含むDNA分子を、関節内に直接関節内注射することは、受容体結合組職細胞のトランスフェクションを起こし、したがって異種由来目的遺伝子の安定した発現を増進させるためのDNAベクター含有−繊維芽細胞の移植だけではなく、除去、インビトロ培養、トランスフェクション、選択という過程を排除することができる。
【００５９】
DNA分子を関節のターゲット結合組織に導入する方法は、DNA分子を陽イオン性リポソーム内にカプセル化する方法、目的とするDNAシーケンスをレトロウイルスまたはプラスミドベクターにサブクローニングする方法、または、DNA分子自体を関節内に直接注入する方法を含むが、これに限定されるものではない。膝関節に導入される形態に関係なく、DNA分子は、DNAベクター分子として、すなわち組換えウイルスDNAベクター分子あるいは組換えDNAプラスミドベクター分子として導入されるのが望ましい。異種由来目的の遺伝子の発現は、真核細胞で活性的なプローモーター切片を、異種由来遺伝子のコーディング部位のアップストリーム（upstream）に挿入することで保障される。当該技術分野における通常的の技術の一つは、DNA分子が結合組織に入り、適正水準に発現されることを保障するベクターを構築する既存の戦略と技術を利用するものである。
【００６０】
望ましい実施例においては、遺伝子治療法のための伝逹システムとして次期に使うために、膝関節から取り出した繊維芽細胞をインビトロ培養する。培養可能細胞が開示された特定の結合組織の使用に限定されないということは明白である。インビトロ培養技術に、他の組職ソースを利用することも可能である。本発明において、遺伝子を使う方法は、関節炎を予防するか、あるいは治療する方法に皆利用することができる。適用分野が単に膝関節の治療における予防または治療的適用に限定されないということは明白である。病気にかかりやすい任意の関節での関節炎を治療するために、予防的にまたは治療的に本発明を利用するのが可能である。
【００６１】
本発明の他の実施例においては、患者に対する治療的に有效な量の非経口投与のために、TGF−βスーパーファミリー蛋白質をエンコードする遺伝子と、薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【００６２】
本発明の他の実施例は、患者に対する予防的に有效な量の非経口投与のために、TGF−βスーパーファミリー蛋白質をエンコードする遺伝子と、薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【００６３】
本発明の他の実施例においては、遺伝子を細胞内に、インビトロ導入することを含む、上記に技術された通りの方法を提供する。また、この方法は、次いで、トランスフェクションされた細胞を哺乳動物宿主に移植する段階を含む。この方法は、トランスフェクションされた細胞を哺乳動物宿主に移植する前に結合組職細胞をトランスフェクションさせた後、形質転換された結合組職細胞を保管する段階を含む。トランスフェクションされた結合組職細胞を10％ DMSO内で液体窒素下に氷らせて保管することができるということは、当業者にとって容易であろう。この方法は、関節炎の発病する可能性が高い哺乳動物宿主において、関節炎の発病を実質的に防止するために上記の方法を使用することを含む。
【００６４】
本発明の他の実施例においては、上記に技術された通り、哺乳動物宿主を治療するのに使うために、発現産物をエンコードする遺伝子を含むウイルスベクターを哺乳動物宿主内に直接導入することにより、細胞のインビボトランスフェクションを起こす段階を含む、発現産物をエンコードする少なくとも一つの遺伝子を哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも一つの細胞内に導入する方法を含む。望ましくは、この方法は、関節内注射によって哺乳動物宿主内に直接導入することを含む。この方法は、関節炎の発病する可能性が高い哺乳動物宿主における、関節炎の発病を実質的に阻害するために上記の方法を使うことを含む。また、この方法は、治療的用途として関節炎性哺乳動物宿主に上記の方法を使用することを含む。これに加えて、本方法は、上記で定義された通り、結合組織をリペアーして再生させるのに上記の方法を使用することを含む。
【００６５】
リポソームを利用するウイルスベクターは、レトロウイルスに結合組職細胞のトランスフェクションと挿入を行うために必要となるような細胞分裂によっては制限されないということは、当該技術分野に詳しい当業者にとっては容易であろう。上記で記述した通り非−ウイルス手段を利用するこの方法は、遺伝子として、TGF−βスーパーファミリーに属する１メンバーをエンコードすることができる遺伝子と、抗生剤耐性遺伝子のような選択マーカー遺伝子を利用することを含む。
【００６６】
本発明の他の実施例においては、軟骨のような結合組織を再生するためのコラーゲンのインビボ発現を起こすために、本明細書内に開示された任意の方法を介して、TGF−βスーパーファミリーの１メンバーをエンコードするDNAシーケンスを哺乳動物宿主の結合組織に伝逹するのである。
【００６７】
本発明を限定するためのものではなく、単なる１例として開示された具体的方法において、TGF−βコードシーケンスを含むDNAプラスミドベクターを、メタロチオネイン（metallothionein）プローモーターのダウンストリーム（downstream）に連結した。
【００６８】
結合組織は、治療を目的にしにくい機関である。当該技術分野で公知である薬物伝逹の静脈及び経口ルートとしては、このような結合組職にはよく近付くことができず、哺乳動物宿主の身体全体を治療剤に露出させなければならない短所がある。より詳細には、既存の関節内注射で蛋白質を関節に注入することは、関節に至る直接的な接近路を提供する。しかし、カプセル化された蛋白質形態で注射された薬物の大部分は、関節内で短い半減期を持つ。本発明は、このような問題を、哺乳動物宿主を治療するのに使うことができる蛋白質をエンコードする遺伝子を哺乳動物宿主の結合組織内に導入することによって解決する。より具体的には、本発明は、抗−関節炎性の性質を持った蛋白質をエンコードする遺伝子を哺乳動物宿主の結合組織内に導入する方法を提供する。
【００６９】
本発明において、遺伝子治療法は、TGF−βの投与に係わる短い作用持続時間と高費用の問題を解決するために適用されたのである。形質転換された細胞は、形態的な変化なしに、組職培養で６週以上生存することができたのである。生存能力と作用持続時間を確認するために、兎のアキレス腱に細胞を注射したのである。もし、細胞に対してインビボ栄養の供給が充分であれば、細胞は、周りの細胞を刺激するのに充分長い時間生存することができたし、TGF−βを製造することができたのである。細胞は、腱内及び関節内環境全てに機能的であった。
【００７０】
トランスフェクションされた細胞の濃度は、局地的な作用において重要な要素である。先行の実験（Joyce et al．、supra、1990）で、TGF−βの用量が形成された組職のタイプを決定した。具体的に、膜間骨形成に対する軟骨形成の割合は、用量が低くなるに連れて減少した。TGF−βは、また、初期造骨細胞とMC3T3細胞の刺激において二相性（biphasic）である（Centrella et al., Endocrinology, 119:2306-2312, 1986）。すなわち、濃度によって刺激することもできるし、阻害することもできる（Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85:5683-5687, 1988）。そこで、提供された実施例において、NIH 3T3−TGF−β1細胞は、104、105、及び106cells／mlの各々の濃度でコラーゲン合成を促進した。腱は、106cells／mlの濃度で一番肥大となった。
【００７１】
実施例において、106cells／ml濃度の細胞0．3ｍｌを関節に注入した。標本は、注入後2週から6週までにかけて回収した。関節の環境は腱の環境とは違う。細胞は関節内でより自由に動くことができる。それらは、細胞と選択的親和性を有した部位へ動くはずである。滑膜、半月板（meniscus）及び軟骨欠損部位は細胞の付着可能な部位である。注入6週後、再生された組職が、一部及び完全に損傷された軟骨欠損部位で観察されたが、滑膜や半月板では観察されなかった。損傷された部位に対するこのような選択的親和性は、臨床的適用のための更なる利点である。もし退行性関節炎が、細胞を関節に直接注入することで治療することができるのであれば、患者は大手術なしに簡便に治療を受けることができる。
【００７２】
注入された細胞から分泌されたTGF−βは、二つの可能性のある方法によってガラス軟骨の再生を刺激することができる。一つは、損傷された部位に残っている軟骨細胞が、それらの細胞の表面にTGF−β受容体を生産することである（Brand et al., J Biol Chem, 270:8274-8284, 1995; Cheifetz et al., Cell, 48:409-415, 1987; Dumont et al., M Cell Endo, 111:57-66, 1995; Lopez-Casillas et al., Cell, 67:785-795, 1991; Miettinen et al., J Cell Biology, 127:6, 2021-2036, 1994; and Wrana et al., Nature, 370:341-347, 1994）。このような受容体は、損傷された部位に付着した、注入された細胞から分泌したTGF−βによって刺激されることができる。TGF−βが、インビボ潜在性形態で分泌されるため（Wakefield et al., J Biol Chem, 263,7646-7654,1988）、潜在性TGF−βは活性化過程が必要である。もう一つは、潜在性TGF−βまたは形質転換された細胞から分泌されたTGF−βが、一部欠損された軟骨層の細胞外基質でTGF−β結合蛋白質（LTBT）に結合するのである（Dallas et al., J Cell Biol, 131:539-549, 1995）。
【００７３】
作用のメカニズムに関わらず、ガラス軟骨の合成に関する観察は、TGF−βが高濃度に長時間持続されれば、ガラス軟骨の再生を刺激することができるということを示唆する。局地的高濃度を達成するためのビ−クルは、局地的刺激のための決定的な要素ではないが、理論的には、軟骨細胞が軟骨の損傷された部位にTGF−βを伝逹するための最も最適のビークルとなり得る（Brittberg et al., New Engl J Med 331:889-895, 1994）。コラーゲン二層基質は、形質転換された細胞の局地的分布のための、他に可能なビークルである（Frenkel et al., J Bone J Surg (Br) 79-B:831-836, 1997）。
【００７４】
新たに形成された組職の性質を組職学的な方法で調査したのである。Ｈ＆Ｅステイニングでは、新たに形成された組職は、周りのガラス軟骨と同一であった（図４）。新たに形成された組職の性質を評価するため、組職をサフラニン−Ｏステイニングした（Rosenburg, J Bone Joint Surg, 53A:69-82, 1971）。繊維状コラーゲンが白色である反面、新たに形成された組職は赤色に染色され、それがガラス軟骨であることを示す（図５）。
【００７５】
完全に欠損された部位の細胞は、繊維状コラーゲンを生産したのである。TGF−β刺激に対する骨性基質がバリヤーとして作用するため、周りの造骨細胞は刺激されないこともあり得る。周りの細胞を刺激する代りに、NIH 3T3−TGF−β1細胞は、自家発生促進によって繊維状コラーゲンを生産した。細胞がオートクライン及びパラクリン活性化によって刺激されたという事実は、TGF−β1発現コンストラクトを有する安定に形質転換された軟骨細胞で、退行性関節炎を治療することができる蓋然性を増加させる。
【００７６】
TGF−β発現コンストラクトによって安定に形質転換された細胞柱は、腱と膝関節で生存することができる。細胞柱は、腱と完全に欠損された軟骨部位で繊維状コラーゲンを生産する。しかし、細胞柱は、一部欠損された関節軟骨では、ガラス軟骨を生産する。オートクライン及びパラクリンモードの作用による刺激メカニズムは、TGF−βスーパーファミリー遺伝子のうちの１メンバーを利用した遺伝子治療法が、ガラス軟骨の損傷に対する新しい治療法であることを示す。
【００７７】
本発明者らは、TGF−β1発現コンストラクトをトランスフェクションさせることで、安定な繊維芽細胞（NIH 3T3−TGF−β1、及びヒト包皮繊維芽細胞TGF−β1）細胞柱を作った。このようなTGF−β−生産細胞は、活性的なTGF−βを高濃度に長時間インビボ維持した。
【００７８】
遺伝子療法及び、具体的に、細胞−媒介遺伝子療法の可能性について、解決するべき１つ目の問題は、細胞のインビボ生存可能性である。TGF−βが兔疫細胞をインビトロ抑制することができても、細胞が高效率の兔疫監視システムを持った他種の組職では、生存することができないかもしれないということである。２つ目に、インビボ遺伝子の発現のための最適濃度が決められるべきものである。本発明者らは、この問題を解決するために、細胞を３つの異なる濃度で兎のアキレス腱に注射した。使われた関節内注射の濃度は、腱内注射の最適濃度から決めた。３つ目は、関節内で細胞が軟骨の再生を刺激する方法に関するものである。
【００７９】
注入された細胞の作用モードには二つがある。一つは、分泌されたTGF−βによって周りの細胞が活性化することであり（paracrine活性化）（Snyder, Sci Am, 253(4): 132-140, 1985）、もう一つは、自家−活性化である（オートクライン活性化）。細胞の濃度が、経路に影響を与えることができるが、周りの環境が作用モードを決めるのに一番重要な要素となり得る。関節間の関節流液と靭帯の内部は、血液の供給、栄養の供給、及び、周りの細胞の面で、二つ相異なっている環境である。細胞の作用モードを確認するために、トランスフェクションされた細胞を二つ相異なっている環境に注射した。本研究の全体的目的は、整形外科的疾病のための、TGF−β−媒介遺伝子治療法を評価することであり、インビボ作用のモードを確認するのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明を制限するものではない。
【００８１】
（実施例１−材料及び方法）
（プラスミドの構造）
メタロチオネイン発現コンストラクト（pM）を製造するために、増幅のためのオリゴヌクレオチドに含まれた Xba I 及び Bam HI 制限酵素サイトを利用して、ゲノムDNAを利用したポリメラーゼチェーン反応でメタロチオネイン Ｉプローモーター（−660/+63）を製造した。増幅された切片を、pBluescript（Stratagene，La Jolla， CA）のXba I−Bam HIサイトでサブクローニングした。TGF−β1コード序列を含む1．2−kb Bgl II 切片と3'末端の成長ホルモンポリーAサイトをpMのBam HI−SalＩサイト内にサブクローニングしてプラスミドpmTβ1を製造した。
【００８２】
（細胞培養及びトランスフェクション）
TGF−β cDNAを、繊維芽細胞（NIH 3T3−TGF−β1）内に、またはヒト包皮繊維芽細胞／TGF−β1内にトランスフェクションさせた。これらを、10％仔牛胎児血清が含まれたDulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）（Gibco−BRL、 Rockville、 MD）で培養した。TGF−β１ cDNAシーケンスをメタロチオネイン遺伝子プローモーターを持ったpmTβ1ベクターに付加した。また、ネオマイシン抵抗性遺伝子シーケンスもベクター内に挿入した。
【００８３】
このベクターを細胞内に導入するために、カルシウムホスファート法を使った。トランスフェクションされた遺伝子シーケンスを持った細胞を選別するために、ネオマイシン（300 μg／ｍｌ）を培地に添加した。次に、生存するコロニーを選別し、TGF−β1 mRNA発現は、Northern分析とTGF−β1 ELISA分析法（R&D System）で確認した。TGF−β1を発現する細胞を注入直前まで液体窒素に保管して培養した。
【００８４】
（Northern Blot分析）
グアニジウム イソチオシアネート／フェノール／クロロホルムを使って細胞からトータルRNAを分離した。トータルRNAを0．66 M ホルムアルデヒドを含む1．0％アガロース−ゲル上で電気泳動させて、DURALON−UV膜に移し、UV STRATALINKER（STRATAGENE）と交差結合させた。Blotsを前混成化し、65℃で1％仔牛血清アルブミン、7％（w/v） SDS、0．5 M 燐酸ナトリウム及び1mM EDTAを含む溶液で混成化した。混成化したblotsをフィルム露出前に0．1％ SDS、 1Ｘ SSCで20分間50℃で洗浄した。RNA blotsをヒトTGF−β1の32P−ラベルしたcDNA プローブで混成化した。β−アクチンのプローブを試料ローディングのためのコントロールとして利用した。
【００８５】
（兎への細胞注入）
2．0−2．5kg体重のニュージーランド白い兎を動物モデルとして選択した。ケタミン（Ketamine）とロームプン（roumpun）で痲酔させた後、各兎を消毒した。アキレス腱を露出させて、腱の中間部位に104、105及び106cells／ml濃度の細胞を0．2ｍｌ−0．3ｍｌ注入した。トランスフェクションされたDNAの発現のために、兎の飲み物に硝酸亜鉛を添加した。アキレス腱の実験で、最適濃度を決定した後、関節内注射を行った。膝関節を露出させて、ナイフで一部及び完全に軟骨欠損を作った。軟骨下骨を露出させないように注意しながら、ガラス軟骨層に一部欠損を作った。完全欠損は、ガラス軟骨を全部とり除いた後、軟骨下骨が露出されるようにした。外科的傷を縫合した後、106cells／ml濃度の細胞を関節内に注射し、硝酸亜鉛を飲み物に添加した。
【００８６】
（組職学的検査）
腱と膝関節を回収した後、標本をホルマリンで固定させて、硝酸で脱石灰した。それらをパラフィン−ブロックに埋め込み、0．8μm厚さの薄切れに切った。再生された組職を顕微鏡で観察するためにヘマトキシリン−エオシン及びサフラニン−Oステイニングを利用した。
【００８７】
（実施例２−結果）
（安定な細胞柱）
トランスフェクションは、カルシウム−ホスファート共沈法を利用して行った（図1）。生存したコロニーの約80％が、転移遺伝子（transgene） mRNAを発現した。このような選別されたTGF−β1−生産細胞を、硝酸亜鉛溶液で培養した。細胞を100μM 硝酸亜鉛溶液で培養するとmRNAが生産される。TGF−β1分泌速度は、約32ng/106細胞/24hrだった。
【００８８】
（兎のアキレス軟骨欠損の再生）
NIH 3T3−TGF−β1細胞の生存を確認するために、兎のアキレス腱を観察した。肉眼で観察する場合、106cells／ml濃度の方が、104及び105の濃度より腱がもっと厚かった。一部及び完全に軟骨に欠損を作った後、106cells／ml濃度のNIH 3T3−TGF−β1細胞0．3ｍｌを膝関節内に注射した。注入後2から6週まで関節を調査した。一部欠損された軟骨では、新たに形成されたガラス関節が観察された；2週経過後、ガラス関節が現われ、６週経過後、軟骨欠損がガラス軟骨で覆われた（図２）。再生された軟骨の厚さは、時間が経つにつれて厚くなった（図3）。注入された細胞がTGF−β1を分泌し、これはTGF−β1抗原を使った兔疫組職化学ステイニングによって確認された（図３）。TGF−β1のトランスフェクションがない正常繊維芽細胞が注入された反対側は、ガラス軟骨で覆われなかった。一部欠損された部位では、再生されたガラス軟骨がサフラニン−Oステイニングによって赤色に染色された（図４）。（新たに形成された軟骨の深さは殆ど損失された深みと等しい。）このような結果は、注入された細胞が、作用のパラクリン作用モードを介して、周りの正常軟骨細胞を活性化させること示す。
【００８９】
完全欠損された軟骨で再生された組職は、ガラス軟骨ではなく、繊維状コラーゲンだった。サフラニン−Ｏステイニングにおいて、それは、ガラス軟骨で現われた赤い色ではなく、白く染色された。（図５）。軟骨は、繊維状組職で覆われ、これは、このような細胞たちが、単にオートクラインモードによって活性化されたことを意味する。TGF−βによって刺激され得る周りの造骨細胞が、厚い脱石灰されたの骨基質の存在によって、TGF−βによって刺激されることが遮断されることと見られる。注入された細胞は、このバリヤーのため、造骨細胞を刺激することができないかもしれない。
【００９０】
TGF−β1トランスフェクション細胞を兎のアキレス腱に注射した。腱が非常に拡大され、コントロールの腱に比べて肉眼でももっと厚いことを確認できた（図７）。顕微鏡での観察では、Ｈ＆Ｅステイニングによって、注入されたNIH 3T3−TGF−β1細胞が兎のアキレス腱で生存し、繊維状コラーゲンを生産することを確認した（図８）。再生された腱組職をTGF−β1抗体を利用して兔疫組職化学的に染色した結果、腱でTGF−β1の発現を確認した（図９）。
【００９１】
本発明を例示するために具体的な実施例を上記の通り記述したが、下記請求項で定義された発明の範疇を脱しない本発明の多くの変形がありえることは、当業者間には明白な事実である。
【００９２】
本明細書に記載したすべての参考文献はその全体で参照として挿入される。
【００９３】
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Wrana JL, Attisano L, Wieser R, Ventura F and Massague J: Mechanism of activation of the TGF-B receptor. Nature, 370: 341-347, 1994.
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】TGF−β１mRNAの発現。NIH 3T3細胞または、亜鉛の存在可否に関わらず成長することができるTGF−β1発現ベクターであるpmTβ1に安定的に形質転換されたNIH 3T3細胞から、トータルＲＮＡを分離した。トータルＲＮＡ（15mg）をTGF−β1 cDNAやコントロールに使用したβアクチンcDNAでプローブした。
【図２】再生された軟骨の肉眼観察。２Ａ．大腿関節隆起（大腿顆）に四角形の部分的な軟骨欠損を作って膝関節にTGF−β1でトランスフェクションしていないNIH 3T3細胞を注入した。欠損は回復されなかった。２Ｂ．NIH 3T3−TGF−β1細胞注入の６週後に、新たに形成された組職によって欠損が回復した。再生された組職の色は、周りの軟骨の色とほぼ同一であった。
【図３】再生された軟骨の顕微鏡におる観察（Ｘ２００）。３Ａ及び３Ｂ．コントロール細胞を注入して4週及び６週後、欠損部位のヘマトキシリンーエオシン（Ｈ＆Ｅ）分析。初期欠損部を覆う組職がない。３Ｃ及び３Ｄ．TGF−β1トランスフェクション細胞を注入して4週及び6週後、欠損部位のヘマトキシリンーエオシン（Ｈ＆Ｅ）分析。TGF−β1トランスフェクション細胞を注入後4週目には、部分的に欠損部位がガラス軟骨で覆われた。注入後４週及び６週後には、再生された組職が厚くなり、６週後には正常な軟骨とその高さがほぼ同一となった。組職学的には再生された軟骨（矢印）が周りのガラス軟骨とほぼ同一となった。
【図４】兎の関節におけるTGF−β1発現に関する兔疫組職化学的分析（Ｘ２００）。茶色のイミュノ−ペルオキシダーゼ反応産物は、NIH 3T3−TGF−β1細胞で組換えTGF−β1が高水準に発現することを示す（４Ｂ）。４Ａは、コントロール細胞を注入した兎の関節におけるガラス軟骨を示す。
【図５】Ｈ＆Ｅステイニング（Ａ）と、サフラニン−Ｏステイニング（Ｂ）を利用して、再生された組職の顕微鏡観察（Ｘ２００）５Ａ．部分的に欠損された部位で、再生されたガラス軟骨がＨ＆Ｅステイニング（黒い矢印）によって見られる。５Ｂ．完全に剥がれた軟骨部位で、再生された組職（白い矢印）は、繊維性コラーゲンであった。
【図６】ｐｍＴβ１のプラスミドマップ。
【図７】TGF−β1にトランスフェクションされた細胞を注入した兎のアキレス腱の肉眼形態。７Ａ．コントロール細胞を注入した腱。７Ｂ．注入6週後のTGF−β1に形質転換された細胞を注入した腱。７Ｃ．７Ａに図示した腱の断面図。７Ｄ．７Ｂに図示した腱の断面図。
【図８】Ｈ＆Ｅでステイニングした兎のアキレス腱に再生された組職の顕微鏡観察。８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、注入6週後の、コントロール細胞を注入した腱を示す。 ８Ａ Ｘ５０拡大。 ８Ｂ Ｘ２００拡大。 ８Ｃ Ｘ６００拡大。 ８Ｄ、８Ｅ、及び、８Ｆは、注入6週後の、TGF−β1にトランスフェクションされた細胞を注入した腱を示す。８Ｄ Ｘ５０拡大。 ８Ｅ Ｘ２００拡大。８Ｆ Ｘ６００拡大。腱に注入したTGF−β1にトランスフェクションされた細胞は、内在性腱より少し丸く見られる。纎維状コラーゲンが、オートクライン及びパラクリン作用モードに生成され、腱が肥大となった。TGF−β1にトランスフェクションされた細胞が注入された後腱が肥大となった。
【図９】Ａ，ＢはＨ＆Ｅステイニング（Ａ）と、TGF−β1抗体による兔疫組職化学的ステイニング（Ｂ）を利用した兎のアキレス腱に再生された組職の顕微鏡観察。茶色のイミュノ−ペルオキシダーゼ反応産物は、NIH 3T3−TGF−β1細胞で組換えTGF−β1が高水準に発現することを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）トランスフォーミング成長因子（transforming growth factor）蛋白質スーパーファミリーのうちの１因子を符号化し、プロモーターに作動的にリンクされたDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを製造する段階；
ｂ）培養された結合組織細胞集団を、前記組換えベクターでインヴィトロでトランスフェクションさせることにより、形質転換された結合組織細胞集団を製造する段階；及び
ｃ）前記形質転換された結合組織細胞を、哺乳動物宿主の関節炎性関節腔に、関節内注射して移植することにより、前記DNAシーケンスが前記関節腔内で発現されて結合組織を再生する段階；
を含む関節炎の治療方法。
【請求項２】
前記組換えウイルスベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記組換えベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記形質転換された結合組織細胞集団は、移植される前には保管されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記形質転換された結合組織細胞集団は、移植される前には、液体窒素下で１０％ＤＭＳＯで保管されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記結合組織細胞は、繊維芽細胞、間葉細胞、造骨細胞、又は、軟骨細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記繊維芽細胞は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞又はヒト包皮（foreskin）繊維芽細胞であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記結合組織は、軟骨、靭帯、又は、腱であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記軟骨はガラス軟骨であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子がTGF−βであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子がTGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、BMP−２、BMP−３、BMP−４、BMP−５、BMP−６、又は、BMP−７であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記TGF−βは、ヒト又は豚のTGF−β１、TGF−β２、又は、TGF−β３であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ａ）トランスフォーミング成長因子蛋白質スーパーファミリーのうちの１因子をエンコードし、プロモーターに作動的にリンクされたDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを製造する段階；
ｂ）培養された結合組織細胞集団を、前記組換えベクターでインビトロトランスフェクションさせることにより、形質転換された結合組織細胞集団を製造する段階；及び
ｃ）前記形質転換された結合組織細胞を、哺乳動物宿主の関節炎性関節腔に、関節内注射して移植することにより、前記DNAシーケンスが前記関節腔内で発現されてガラス軟骨を再生する段階；
を含むガラス軟骨の再生方法。
【請求項１４】
前記トランスフェクションは、リポソームカプセル法、カルシウム・ホスファート共沈法、電気穿孔法、そしてDEAE−デキストラン媒介法によって成ることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記プラスミドがｐｍＴβ１であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１６】
トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子をエンコードするDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを含む結合組織細胞柱（connective tissue cell line）。
【請求項１７】
前記結合組織細胞柱は、繊維芽細胞柱、間葉細胞柱、軟骨細胞柱、造骨細胞柱、又は、骨細胞柱であることを特徴とする請求項１６記載の結合組織細胞柱。
【請求項１８】
前記繊維芽細胞柱は、ヒトの包皮の繊維芽細胞柱又はＮＩＨ ３Ｔ３細胞柱であることを特徴とする請求項１７記載の結合組織細胞柱。
【請求項１９】
前記トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子がTGF−βであることを特徴とする請求項１６記載の結合組織細胞柱。
【請求項２０】
前記トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子が、TGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、BMP−２、BMP−３、 BMP−４、BMP−５、BMP−６、又は、BMP−７であることを特徴とする請求項１６記載の結合組織細胞柱。
【請求項２１】
前記TGF−βは、ヒト又は豚のTGF−β１、TGF−β２、又は、TGF−β３であることを特徴とする請求項１９記載の結合組織細胞柱。
【請求項２２】
前記組換えベクターはｐｍＴβ１であることを特徴とする請求項１６記載の結合組織細胞柱。
【請求項１】
ａ）トランスフォーミング成長因子（transforming growth factor）蛋白質スーパーファミリーのうちの１因子を符号化し、プロモーターに作動的にリンクされたDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを製造する段階；
ｂ）培養された結合組織細胞集団を、前記組換えベクターでインヴィトロでトランスフェクションさせることにより、形質転換された結合組織細胞集団を製造する段階；及び
ｃ）前記形質転換された結合組織細胞を、哺乳動物宿主の関節炎性関節腔に、関節内注射して移植することにより、前記DNAシーケンスが前記関節腔内で発現されて結合組織を再生する段階；
を含む関節炎の治療方法。
【請求項２】
前記組換えウイルスベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記組換えベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記形質転換された結合組織細胞集団は、移植される前には保管されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記形質転換された結合組織細胞集団は、移植される前には、液体窒素下で１０％ＤＭＳＯで保管されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記結合組織細胞は、繊維芽細胞、間葉細胞、造骨細胞、又は、軟骨細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記繊維芽細胞は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞又はヒト包皮（foreskin）繊維芽細胞であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記結合組織は、軟骨、靭帯、又は、腱であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記軟骨はガラス軟骨であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子がTGF−βであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子がTGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、BMP−２、BMP−３、BMP−４、BMP−５、BMP−６、又は、BMP−７であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記TGF−βは、ヒト又は豚のTGF−β１、TGF−β２、又は、TGF−β３であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ａ）トランスフォーミング成長因子蛋白質スーパーファミリーのうちの１因子をエンコードし、プロモーターに作動的にリンクされたDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを製造する段階；
ｂ）培養された結合組織細胞集団を、前記組換えベクターでインビトロトランスフェクションさせることにより、形質転換された結合組織細胞集団を製造する段階；及び
ｃ）前記形質転換された結合組織細胞を、哺乳動物宿主の関節炎性関節腔に、関節内注射して移植することにより、前記DNAシーケンスが前記関節腔内で発現されてガラス軟骨を再生する段階；
を含むガラス軟骨の再生方法。
【請求項１４】
前記トランスフェクションは、リポソームカプセル法、カルシウム・ホスファート共沈法、電気穿孔法、そしてDEAE−デキストラン媒介法によって成ることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記プラスミドがｐｍＴβ１であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１６】
トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子をエンコードするDNAシーケンスを含む組換えウイルス又はプラスミドベクターを含む結合組織細胞柱（connective tissue cell line）。
【請求項１７】
前記結合組織細胞柱は、繊維芽細胞柱、間葉細胞柱、軟骨細胞柱、造骨細胞柱、又は、骨細胞柱であることを特徴とする請求項１６記載の結合組織細胞柱。
【請求項１８】
前記繊維芽細胞柱は、ヒトの包皮の繊維芽細胞柱又はＮＩＨ ３Ｔ３細胞柱であることを特徴とする請求項１７記載の結合組織細胞柱。
【請求項１９】
前記トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子がTGF−βであることを特徴とする請求項１６記載の結合組織細胞柱。
【請求項２０】
前記トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーのうちの１因子が、TGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、BMP−２、BMP−３、 BMP−４、BMP−５、BMP−６、又は、BMP−７であることを特徴とする請求項１６記載の結合組織細胞柱。
【請求項２１】
前記TGF−βは、ヒト又は豚のTGF−β１、TGF−β２、又は、TGF−β３であることを特徴とする請求項１９記載の結合組織細胞柱。
【請求項２２】
前記組換えベクターはｐｍＴβ１であることを特徴とする請求項１６記載の結合組織細胞柱。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００７−８９５０（Ｐ２００７−８９５０Ａ）
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１９５７７１（Ｐ２００６−１９５７７１）
【出願日】平成１８年７月１８日（２００６．７．１８）
【分割の表示】特願２０００−６１５０６０（Ｐ２０００−６１５０６０）の分割
【原出願日】平成１２年５月３日（２０００．５．３）
【出願人】（３０２０４８２６７）ティシュージェン インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１８日（２００６．７．１８）
【分割の表示】特願２０００−６１５０６０（Ｐ２０００−６１５０６０）の分割
【原出願日】平成１２年５月３日（２０００．５．３）
【出願人】（３０２０４８２６７）ティシュージェン インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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