ＴＬＲ７の合成ＲＮＡベースのアゴニスト
本発明は、免疫治療適用のための免疫調節剤としての新規安定化オリゴリボヌクレオチド類の治療使用に関する。具体的に、本発明は、改善されたヌクレアーゼおよびＲＮａｓｅ安定性を有し、ＴＬＲ７を介して免疫調節性活性を選択的に誘発する新規ＲＮＡベースのオリゴリボヌクレオチド類を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年２月１０日出願の米国仮出願番号６１／１５１,２１１の利益を主張し、その開示は引用により本明細書に明示的に包含させる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に、免疫調節剤としてオリゴリボヌクレオチド類を使用する免疫学および免疫療法適用に関する。より具体的に、本発明は、免疫調節性ＲＮＡ組成物およびトール様受容体７(ＴＬＲ７)を介する免疫応答調節のためのその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連分野の要約
免疫応答は、応答に関与する細胞のサブセットに基づく先天的応答および適応応答の両方が関与する。例えば、遅延型過敏および細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)活性化のような古典的細胞媒介性機能に関与するＴヘルパー(Ｔｈ)細胞はＴｈ１細胞であり、一方、Ｂ細胞活性化のヘルパー細胞として関与するＴｈ細胞は、Ｔｈ２細胞である。免疫応答のタイプは、抗原暴露に応答して産生されるサイトカイン類およびケモカイン類に影響される。サイトカイン類は、Ｔヘルパー１(Ｔｈ１)細胞とＴヘルパー２(Ｔｈ２)細胞の均衡に作用することにより免疫応答を制御する手段を提供し、それは、起こる免疫応答のタイプに直接影響する。均衡がＴｈ１細胞の細胞数増加に傾いたならば、細胞媒介性免疫応答が起こり、これは、細胞毒性Ｔ細胞(ＣＴＬ)の活性化を含む。均衡がＴｈ２細胞の細胞数増加に傾いたならば、体液性または抗体免疫応答が起こる。これらの免疫応答のそれぞれが、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞から分泌されるサイトカイン類の異なるセットをもたらす。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞により分泌されるサイトカイン類の差異は、これらの２種のＴ細胞サブセットの異なる生物学的機能の結果であり得る。
【０００４】
Ｔｈ１細胞は、抗原(例えば、ウイルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞)に対する身体の先天的応答に関与する。抗原に対する最初の応答は、抗原提示細胞(例えば、活性化マクロファージおよび樹状細胞)からのＩＬ−１２分泌と、それに付随するＴｈ１細胞活性化であり得る。活性化Ｔｈ１細胞は、ある種のサイトカイン類(例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマおよび他のサイトカイン類)の分泌を引き起こし、それに付随して抗原特異的ＣＴＬが活性化する。Ｔｈ２細胞は、細菌、寄生虫、抗原、およびアレルゲンに応答して活性化されることが既知であり、ある種のサイトカイン類(例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３および他のサイトカイン類)およびケモカイン類を介して身体の適応免疫応答(例えば、免疫グロブリン産生および好酸球活性化)を仲介し得る。これらのサイトカイン類のいくつかがＢ細胞増殖および抗体産生増加を引き起こし得る。加えて、これらのサイトカイン類のいくつかが他のサイトカイン類の放出を刺激または阻害し得る(例えば、ＩＬ−１０は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γ分泌および樹状細胞からのＩＬ−１２分泌を阻害する)。最終的に、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の均衡、および選択した刺激に応答して遊離されたサイトカイン類およびケモカイン類が、身体の免疫系の疾患に対する応答に重要な役割を有する。例えば、ＩＦＮ−αはＣ型肝炎を阻止し得、そしてＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β(それぞれＣＣＬ３およびＣＣＬ４としても既知)はＨＩＶ−１感染を阻止し得る。Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答の最適な平衡化が、種々の疾患の処置および予防に免疫系が使用される機会を提供する。
【０００５】
Ｔｈ１免疫応答を、哺乳動物で、例えば非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む細菌または合成ＤＮＡの導入により誘発でき、その免疫応答は、パターン認識受容体(ＰＲＲ)として知られるある種の免疫細胞上の受容体への、特異的オリゴヌクレオチド配列(例えば、非メチル化ＣｐＧ)の提示に由来する。これらのＰＲＲのいくつかはトール様受容体(ＴＬＲ)である。
【０００６】
ＴＬＲは、微生物感染に応答した先天的免疫応答の誘発に密接に関係する。脊椎動物で、ＴＬＲは病原体関連分子構造(ＰＡＭＰ)を認識することが知られている、少なくとも１１種のタンパク質(ＴＬＲ１からＴＬＲ１１)のファミリーを構成する。いくつかのＴＬＲは、細胞外病原体を検知し、応答を開始するために細胞表面に位置し、他のＴＬＲは、細胞内病原体を検知し、応答を開始するために細胞内部に位置する。表１は、ＴＬＲ、それに対する既知アゴニストおよびＴＬＲを含むことが知られている細胞型を示す(Diebold, S.S. et al. (2004) Science 303: 1529-31; Liew, F. et al. (2005) Nature 5: 446-58; Hemmi, H. et al. (2002) Nat. Immunol. 3: 196-200; Jurk, M. et al., (2002) Nat. Immunol. 3: 499; Lee, J. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6646-51; Alexopoulou, L. (2001) Nature 413: 732-38)。
【表１】
【０００７】
リガンドとＴＬＲの相互作用が仲介するシグナル伝達経路は、ＴＬＲファミリーのほとんどのメンバーが共有し、ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体(ＴＩＲドメイン)、骨髄分化マーカー８８(ＭｙＤ８８)、ＩＬ−１Ｒ関連キナーゼ(ＩＲＡＫ)、インターフェロン制御因子(ＩＲＦ)、ＴＮＦ受容体関連因子(ＴＲＡＦ)、ＴＧＦβ−活性化キナーゼ１、ＩκＢキナーゼ類、ＩκＢ、およびＮＦ−κＢを含む(例えば：Akira, S. (2003) J. Biol. Chem. 278: 38105およびGeller et al. (2008) Curr. Drug Dev. Tech. 5: 29-38参照)。より具体的に、ＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、９、および１１に関して、このシグナル伝達カスケードは、ホモ二量体としてエンドソーム膜または細胞表面に存在する膜結合ＴＬＲと相互作用し、そして活性化するＰＡＭＰリガンドから開始する。活性化後、受容体は、立体構造変化を受けて、ＴＬＲ３以外の全ＴＬＲシグナル伝達経路に共通するアダプタータンパク質であるＴＩＲドメイン含有タンパク質ＭｙＤ８８の動員が可能となる。ＭｙＤ８８はＩＲＡＫ４を動員し、それはＩＲＡＫ１をリン酸化および活性化する。活性化ＩＲＡＫ１はＴＲＡＦ６と結合し、それは、ポリユビキチンのＴＲＡＦ６への付加を触媒する。ユビキチン付加はＴＡＫ／ＴＡＢ複合体を活性化し、続いてリン酸化ＩＲＦが、ＮＦ−κＢ放出および核への輸送をもたらす。核内のＮＦ−κＢは炎症誘発性遺伝子の発現を誘発する(例えば、Trinchieri and Sher (2007) Nat. Rev. Immunol. 7: 179-90参照)。
【０００８】
ＴＬＲおよびそこから生じるシグナル伝達の選択的局在化は、免疫応答におけるそれらの役割のいくつかの見解を提供する。免疫応答は、応答に関与する細胞サブセットに基づき、先天的および適応応答の両方を含む。例えば、遅延型過敏および細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)活性化のような古典的細胞媒介性機能に関与するＴヘルパー細胞はＴｈ１細胞である。この応答は、抗原(例えば、ウイルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞)に対する身体の先天的応答であり、ＩＦＮ−ガンマの分泌と、それに付随するＣＴＬの活性化をもたらす。
【０００９】
炎症性応答制御への関与の結果として、ＴＬＲは、自己免疫性、感染性疾患、および炎症を含む多くの疾患の病因に役割を有することが示されている(Papadimitraki et al. (2007) J. Autoimmun. 29: 310-18; Sun et al. (2007) Inflam. Allergy Drug Targets 6: 223-35; Diebold (2008) Adv. Drug Deliv. Rev. 60: 813-23; Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol. 5: 975-79; Tse and Horner (2008) Semin. Immunopathol. 30: 53-62; Tobias & Curtiss (2008) Semin. Immunopathol. 30: 23-27; Ropert et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30: 41-51; Lee et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30: 3-9; Gao et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30: 29-40; Vijay-Kumar et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30: 11-21)。
【００１０】
ＣｐＧジヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド類を使用した免疫応答の刺激が検討されている(Zhao, Q. et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 26: 173-82)。その後、ＴＬＲ９が細菌および合成ＤＮＡに存在する非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが検討されている(Hemmi, H. et al. (2000) Nature 408: 740-45)。ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類の他の修飾もまた、ＴＬＲ９を介して作用するおよび免疫応答を調節する能力に影響する(例えば、Zhao et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 51: 173-82; Zhao et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 52: 1537-44; Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7: 495-502; Zhao et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 3453-58; Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 1051-54; Yu et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 2585-88; Yu et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11: 2263-67; and Kandimalla et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9: 807-13参照)。加えて、構造活性相関試験が、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドによりもたらされるものとは異なる特異的免疫応答プロファイルを誘発する合成モチーフおよび新規ＤＮＡベースの構造の同定を可能にしている。(Kandimalla, E.R. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 6925-30; Kandimalla, E.R. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 14303-08; Cong, Y.P. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 310: 1133-39; Kandimalla, E.R. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306: 948-53; Kandimalla, E.R. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 2393-400; Yu, D. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11: 459-64; Bhagat, L. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-61; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30: 4460-69; Yu, D. et al. (2002) J. Med. Chem. 45: 4540-48; Yu, D. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 83-90; Kandimalla, E.R. et al. (2002) Bioconjug. Chem. 13: 966-74; Yu, D.K. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30: 1613-19; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9: 2803-08; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11: 2263-67; Kandimalla, E.R. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9: 807-13; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 2585-88; Putta, M.R. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34: 3231-38)。しかしながら、現在まで、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対する天然リガンドは未知であった。
【００１１】
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が、多くのヌクレオシド類を含むウイルスおよび合成一本鎖ＲＮＡおよび小分子を認識することが示されている(Diebold, S.S., et al. (2004) Science 303: 1529-31)。Dieboldらは、インフルエンザウイルスに対するＩＦＮ−α応答が、インフルエンザゲノムＲＮＡのエンドソーム認識ならびにＴＬＲ７およびＭｙＤ８８の手段によるシグナル伝達を必要とすることを示し、ＴＬＲ７に対するリガンドとしてｓｓＲＮＡを同定した。ある種の合成化合物、イミダゾキノロン類、イミキモド(Ｒ−８３７)、およびレシキモド(Ｒ−８４８)は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のリガンドである(Hemmi, H. et al. (2002) Nat. Immunol 3: 196-200; Jurk, M. et al. (2002) Nat. Immunol 3: 499)。加えて、ある種のグアノシン類似体、例えば７−デアザ−Ｇ、７−チア−８−オキソ−Ｇ(ＴＯＧ)、および７−アリル−８−オキソ−Ｇ(ロキソリビン)が、高濃度でＴＬＲ７を活性化することが示されている(Lee, J. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6646-51)。しかしながら、これらの小分子、例えば、イミキモドは他の受容体を介して作用することも知られている(Schon, M.P. et al. (2006) J. Invest. Dermatol. 126: 1338-47)。
【００１２】
ＴＬＲ７またはＴＬＲ８認識についての特異的ｓｓＲＮＡモチーフが何も知られていないこと、および刺激性ｓｓＲＮＡ分子が広範囲である可能性は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が、自己ＲＮＡおよびウイルスＲＮＡの両方を認識できることを示唆する。最近、ある種のＧＵリッチオリゴリボヌクレオチド類が免疫賦活性であり、Ｎ−[１−(２,３−ジオレオイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート(ＤＯＴＡＰ)または他の脂質試薬と複合体化したときＴＬＲ７およびＴＬＲ８を介して作用することが示された(Heil et al. (2004) Science 303: 1526-29; Lipford et al., 国際公開番号ＷＯ０３／０８６２８０; Wagner et al., 国際公開番号ＷＯ９８／３２４６２)。しかしながら、ＲＮＡ分子が、長年、例えばリボザイムとして、および最近はｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡとして使用されており、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡとして使用されるＲＮＡはＧＵジヌクレオチドを含む。加えて、多くのこれらのＲＮＡ分子が、脂質の存在下、ＴＬＲ刺激を介して免疫応答を誘発することが示されている(Kariko et al. (2005) Immunity 23: 165-75; Ma, Z. et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 330: 755-59)。しかしながら、これらのＲＮＡ分子の不安定さが、多くの領域(例えば、ヒト疾患の予防および処置)でのこれらの分子の使用および適用を妨げている。
【００１３】
リボースまたはデオキシリボース糖を含むオリゴヌクレオチド類およびオリゴデオキシヌクレオチド類が、診断的プロービング、ＰＣＲプライミング、遺伝子発現のアンチセンス阻害、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、およびトール様受容体(ＴＬＲ)に基づく免疫治療剤を含み、これらに限定されない広範な分野で使用されている。最近、多くの刊行物に、免疫調節剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド類の使用、ならびに、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、癌、および感染症のような多くの疾患のための免疫療法適用におけるそれらの単独でのまたはアジュバントとしての使用が記載されている。
【００１４】
ＤＮＡオリゴヌクレオチド類がＴＬＲ９により認識され、一方でＲＮＡオリゴヌクレオチド類がＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８により認識されるとの事実は、ＤＮＡとＲＮＡの間の三次元構造の差異による可能性が高い。しかしながら、ＤＮＡとＲＮＡの間の化学的差異もまた、ＤＮＡを、ＲＮＡよりはるかに化学的および酵素的に安定化している。
【００１５】
ＲＮＡは広範な細胞外リボヌクレアーゼ類(ＲＮａｓｅ)により急速に分解され、それにより、抗原提示細胞に到達する自己ｓｓＲＮＡは、たとえあったとしても、ほんの僅かであることが確実である。核酸類のエキソヌクレアーゼ分解は、ほとんど３'−ヌクレアーゼ消化であり、僅かな割合が５'−エキソヌクレアーゼ作用を介する。エキソヌクレアーゼ消化に加えて、ＲＮＡはまた、ＲＮａｓｅのエンドヌクレアーゼ活性によっても分解され得る。ＲＮＡベースの分子は、現在まで、ヌクレアーゼ類に対する安定性を提供するために脂質と複合体化しなければならない。
【００１６】
これらのリボヌクレアーゼ類は、自己免疫性反応性を妨げる必須機能を提供する一方で、リボヌクレアーゼ類が合成ｓｓＲＮＡおよび天然ｓｓＲＮＡの両方を急速に分解するため、免疫療法に利用するために設計された合成ｓｓＲＮＡ分子にとって、本質的な問題を提起する。このハードルを越えるため、ｓｓＲＮＡ分子の分解に対する保護が、ｓｓＲＮＡのリポソームへの封入、ポリチレンイミンとの縮合、Ｎ−[１−(２,３−ジオレオイルオキシ)−プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート(ＤＯＴＡＰ)のような分子によると複合体化によって試みられている。しかしながら、これらの保護手段は、不安定なままでいるｓｓＲＮＡに適用される二次的手段であり、これらの保護手段の、ｓｓＲＮＡ(天然または合成)のインビボでの効力および免疫調節性活性に対する影響は不明なままである。
【００１７】
Agrawalら(米国特許出願公開番号２００８／０１７１７１２)は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に結合する新規ＳＩＭＲＡ組成物群を記載する。しかしながら、ＴＬＲ７に選択的に結合する化合物を開発する課題が残っている。観念的には、この課題は、併用したときワクチン接種の効果を改善する、または免疫応答の誘発または増強が有益である疾患、例えば癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染症、皮膚障害、アレルギー、喘息、または病原体が原因の疾患を処置および／または予防するような多くの臨床上適切な適用が行われる新規免疫治療剤として作用し得る本質的に安定なＲＮＡを基本とする分子の設計によって解決されるものである。
【発明の概要】
【００１８】
発明の要約
第一の面において、本発明は、ＴＬＲ７を特異的に活性化し、さらに下に定義する新規安定化免疫調節性ＲＮＡ(ＳＩＭＲＡ)化合物、およびＴＬＲ７を介する免疫応答の誘発および／または増強のためのそれらの使用に関する。本発明の新規化学物質は、免疫応答の誘発が実質的により有効であり、分解に対する感受性が実質的により低い、免疫応答誘発および／または増強化合物を提供する。本発明の方法は、免疫療法適用のためのサイトカインおよび／またはケモカインプロファイルを修飾するためのＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの使用を可能にする。
【００１９】
第一の面の他の態様において、本発明は、アジュバントとしてＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を提供する。
【００２０】
第二の面において、本発明は医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の少なくとも１個および生理学的に許容されるまたは薬学的に許容される担体を含む。
【００２１】
第三の面において、本発明は個体における免疫応答を誘発する方法であって、脊椎動物に本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の少なくとも１個を投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
第四の面において、本発明は、免疫応答の誘発および／または増強が有益である疾患または障害、例えば癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染症、皮膚障害、アレルギー、喘息、または病原体が原因の疾患を有する患者の治療的処置方法であって、かかる障害または疾患を有する該患者に、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の少なくとも１個を薬学的有効量で投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
第五の面において、本発明は脊椎動物における免疫応答の誘発および／または増強が有益である疾患または障害、例えば癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、喘息、または病原体が原因の疾患の予防的処置方法であって、かかる障害または疾患に感受性の脊椎動物に、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の少なくとも１個を薬学的有効量で投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
第六の面において、本発明は、サイトカインまたはケモカイン類を産生できる細胞(例えば、免疫細胞、ＰＢＭＣ)を単離する方法であって、かかる細胞を標準細胞培養条件下で培養し、かかる細胞を、単離細胞のサイトカイン類またはケモカイン類の産生または分泌レベルが増加するように、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の少なくとも１個でエクスビボで処置し、処置細胞を、疾患の予防または処置のためにサイトカインまたはケモカイン治療を必要とする患者に投与または再投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明のこの面のさらなる態様において、疾患の予防または処置のためにサイトカインまたはケモカイン治療を必要とする患者に、第六の面の単離した、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ処置細胞を、１種以上の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物および／または１種以上のＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストと組み合わせて投与する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の平行合成のための合成スキーム。ＤＭＴｒ＝４,４'−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を実施例１に従い合成した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
好ましい態様の詳細な記載
本発明は、免疫療法適用のための免疫調節剤としてのオリゴリボヌクレオチド類の治療的使用に関する。具体的に、本発明は、ＴＬＲ７を介して選択的に免疫応答を調節する、インビボ安定性が改善されたＲＮＡベースのオリゴヌクレオチド類(ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物)を提供する。種々の先天的および獲得免疫応答機構を、例えば安定なＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を用いる樹状細胞および他の抗原提示細胞の活性化を介して開始することにより、得られるサイトカインプロファイルは、病原体、感染細胞、または腫瘍細胞の破壊と、抗原特異的抗体およびＣＴＬ応答の発生をもたらす。それ故に、本発明は、各々固有の免疫調節特性を有する、一連のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を提供する。この方法で、免疫応答の範囲および性質は、ある適応に望ましい一連の免疫調節性特性を有するＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を提供することにより、種々の医学的適応のためにカスタマイズできる。本明細書に引用する特許、特許出願、および参考文献は、各々が具体的におよび個々に引用により包含させると示されるのと同定度に引用により本明細書に包含させる。ここに引用する何らかの参考文献の、何らかの教示と本明細書の間に矛盾があるときには、本発明の目的で本明細書が優先される。
【００２８】
本発明は、免疫応答増強のためのＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の使用方法を提供する。かかる方法は、成人および小児ならびに獣医適用における、癌、自己免疫障害、喘息、呼吸器アレルギー、食物アレルギー、皮膚アレルギー、および細菌、寄生虫、およびウイルス感染の処置およびワクチンアジュバントとしての適用を含み、これらに限定されない免疫療法適用への使用が見出される。それ故に、本発明は、さらに、免疫療法のための最適レベルの免疫調節効果を有する新規ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物、ならびにかかる化合物の製造および使用方法を提供する。加えて、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物は、アジュバントとして、または疾患の予防および処置のためのＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の免疫調節効果を消滅させない、該疾患または状態の処置に有用な薬剤と組み合わせて、有用である。
【００２９】
定義
用語“２'−置換リボヌクレオシド”または“２'−置換アラビノシド”は、一般に、ペントース基の２'位のヒドロキシル基が置換され、２'−置換または２'−Ｏ−置換リボヌクレオシドとなったリボヌクレオシド類またはアラビノヌクレオシド類を意味する。ある態様において、かかる置換は、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級ヒドロカルビル基、ハロゲン原子、または６〜１０個の炭素原子を有するアリール基での置換であり、ここで、かかるヒドロカルビル基、またはアリール基は非置換であっても、例えば、ハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、またはアミノ基で置換されていてもよい。本発明のアラビノヌクレオシド類は、アラビノ−Ｇ、アラビノ−Ｃ、アラビノ−Ｕ、アラビノ−Ａを含み、これらに限定されない。２'−Ｏ−置換リボヌクレオシド類または２'−Ｏ−置換−アラビノシド類の例は、２'−アミノ、２'−フルオロ、２'−アリル、２'−Ｏ−アルキルおよび２'−プロパルギルリボヌクレオシド類またはアラビノシド類、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシド類または２'−Ｏ−メチルアラビノシド類、および２'−Ｏ−メトキシエトキシリボヌクレオシド類または２'−Ｏ−メトキシエトキシアラビノシド類を含み、これらに限定されない。
【００３０】
用語“３'”は、方向性で使用されるとき、一般に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の他の領域または位置から３'(糖の３'位置に向かう)の該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の領域または位置を意味する。
【００３１】
用語“５'”は、方向性で使用されるとき、一般に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の他の領域または位置から５'(糖の５'位置に向かう)の該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の領域または位置を意味する。
【００３２】
用語“約”は、一般に、その正確な数値が重要ではないことを意味する。例えば、オリゴリボヌクレオチド類中のリボヌクレオシド残基の数は重要ではなく、そして１個または２個少ないリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシド残基、または１個から数個の付加的リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシド残基を有するオリゴリボヌクレオチド類が、上に記載した態様の各々と同等であるとして考慮される。
【００３３】
用語“アジュバント”は、一般に、ワクチンまたは抗原のような免疫剤に追加したとき、該混合物への暴露によるレシピエント宿主における該薬剤に対する免疫応答を増強または強化する物質を意味する。
【００３４】
用語“気道炎症”は、一般に、喘息を含む、感染性アレルゲンが原因の呼吸管の炎症を意味する。
【００３５】
用語“アレルゲン”は、一般に、物質への暴露によりアレルギー性応答を誘発する、分子、通常タンパク質の抗原または抗原性部分を意味する。典型的に対象は、例えば、膨疹および発赤試験により、または当分野で既知の任意の方法により示されるように、アレルゲンに対してアレルギーである。分子は、該分子への暴露によりほんの僅かな割合の対象しかアレルギー性(例えば、ＩｇＥ)免疫応答を誘発しなくても、アレルゲンと言う。
【００３６】
用語“アレルギー”は、一般に、食物アレルギー、呼吸器アレルギー、および皮膚アレルギーを含み、これらに限定されない。
【００３７】
用語“抗原”は、一般に、抗体により、またはＴ細胞抗原受容体により認識され、選択的に結合させる物質を意味する。抗原はペプチド類、タンパク質類、ヌクレオシド類、ヌクレオチド類、およびそれらの組合せを含み得て、これらに限定されない。抗原は天然でも合成でもよく、一般的に、該抗原に特異的である免疫応答を誘発する。
【００３８】
用語“自己免疫障害”は、一般に、“自己”抗原が免疫系による攻撃を受ける障害を意味する。
【００３９】
３'または５'分解の遮断または“キャップ”もしくは“キャッピング”は、オリゴリボヌクレオチドの３'または５'端が、ヌクレアーゼ分解(例えば、３'−エキソヌクレアーゼ分解)の阻害に十分な他の分子(例えば、リンカーまたは他の非ＲＮＡヌクレオチド)に結合していることを意味する。
【００４０】
用語“担体”は、一般に、全ての賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、マイクロスフェア、リポソーム封入、または医薬製剤への使用が当分野で既知の他の物質を含む。担体、賦形剤、または希釈剤の特性は、特定の適用のための投与経路によることは当然である。これらの物質を含む薬学的に許容される製剤の製造は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００４１】
用語“共投与”は、一般に、免疫応答を調節するために十分に短い間隔での少なくとも２種の異なる物質の投与を意味する。共投与は少なくとも２種の異なる物質の同時投与を含む。
【００４２】
用語“相補性”は、一般にある核酸とハイブリダイズする能力を有することを意味する。かかるハイブリダイゼーションは、通常、好ましくはワトソン−クリックまたはフーグスティーン塩基対を形成するための、相補鎖間の水素結合の結果であるが、他の形態の水素結合、ならびに塩基スタッキングもハイブリダイゼーションをもたらし得る。
【００４３】
用語“免疫調節性オリゴリボヌクレオチド”は、一般に、魚、鳥、または哺乳動物のような脊椎動物に応答したとき、免疫応答を誘発するか、または抑制するオリゴリボヌクレオチドを意味する。
【００４４】
用語“と組み合わせて”は、一般に、一患者における同じ疾患の処置の経過中であり、そしてＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物と、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の免疫調節効果を消滅させない、該疾患または状態の処置に有用な薬剤の投与を含む。かかる投与は、同時投与または共投与を含む任意の順番であってよく、ならびに時間的に数秒から最長数日離れ、または数分から数日離れ、または数分から数時間離れていてよい。かかる組合せ処置はまた、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物および／または独立して該薬剤の１回を超える投与を含み得る。ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物および該薬剤の投与は、同じ投与経路でも異なる投与経路でもよい。
【００４５】
用語“個体”または“対象”は、一般に、ヒトのような哺乳動物を意味する。哺乳動物は、一般に、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、およびウサギを含み、これらに限定されない。
【００４６】
用語“線状合成”は、一般に免疫調節性オリゴリボヌクレオチドの一端から始まり、他端へと直線的に進む合成を意味する。線状合成は、免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類への同一のまたは同一ではない(長さ、塩基組成および／または取り込まれている化学修飾の点で)モノマー単位の取り込みを可能にする。
【００４７】
用語“リンカー”は、一般に、オリゴリボヌクレオチドに糖、塩基、または主鎖を介して、共有または非共有結合の方法で結合できる全ての基を意味する。リンカーは、２個以上のヌクレオシド類の結合に使用でき、またはオリゴリボヌクレオチド内の５'および／または３'末端ヌクレオチドの結合に使用できる。かかるリンカーは、非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオチドリンカーのいずれでもよい。
【００４８】
用語“修飾ヌクレオシド”は、一般に、修飾ヘテロ環塩基、修飾糖部分、またはそれらの任意の組合せを含むヌクレオシドを意味する。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、ここに記載する非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。本発明の目的で、修飾ヌクレオシド、ピリミジンまたはプリン類似体または天然に存在しないピリミジンまたはプリンを互換的に使用でき、天然に存在しない塩基および／または天然に存在しない糖基を含むヌクレオシドと言う。本発明の目的で、塩基は、グアニン、シトシン、アデニン、またはウラシルでないならば非天然であると見なす。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、ＴＬＲ７活性を妨害することなく安定性を改善するために、オリゴリボヌクレオチドの選択した位置に置き換えて入れることができる２'−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、または２'−デオキシ−２'−置換−アラビノシドである。
【００４９】
用語“調節”または“刺激”は、一般に、応答の誘発および／または増強に由来し得る応答または応答における質的差異のような変化を意味する。
【００５０】
用語“非ヌクレオチドリンカー”は、一般に、共有または非共有結合によりオリゴリボヌクレオチドに結合できる、ヌクレオチド架橋以外の化学基を意味する。好ましくはかかる非ヌクレオチドリンカーは、約２Å〜約２００Å長であり、ｃｉｓ配向でもｔｒａｎｓ配向でもよい。
【００５１】
用語“ヌクレオチド架橋”は、一般に、隣接ヌクレオシド間の、ホスフェート、非ホスフェート、荷電、または中性基(例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート)から成る、糖を介して２個のヌクレオシドを結合させる(例えば、３'−３'、２'−３'、２'−５'、３'−５')化学架橋を意味する。
【００５２】
用語“ペプチド”は、一般に、該ペプチドがハプテンであってもなくても、生物学的応答、例えば、抗体産生またはサイトカイン活性に影響を与えるために十分な長さおよび組成である、ポリペプチド類を意味する。用語“ペプチド”は、修飾アミノ酸類(天然に存在しても存在しなくても)を含んでよく、ここで、かかる修飾は、リン酸化、グリコシル化、ペグ化、脂質化(lipidization)、およびメチル化を含む。
【００５３】
用語“薬学的に許容される”または“生理学的に許容される”は、一般に、本発明の化合物の有効性を妨げず、細胞、細胞培養、組織、または生物のような生物学的系と適合する物質を意味する。好ましくは、生物学的系は脊椎動物のような生存生物である。
【００５４】
用語“薬学的有効量”は、一般に、有益な結果のような所望の生物学的作用をもたらすのに十分な量を意味する。それ故に、“薬学的有効量”はそれが投与される状況による。薬学的有効量を、１回以上の予防的または治療的投与で投与してよい。
【００５５】
用語“ＳＩＭＲＡ”は、一般に安定化免疫調節性ＲＮＡ化合物を意味し、ここで、該化合物は、一本鎖ＲＮＡ(ｓｓＲＮＡ)および／または二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)、および３'末端を保護または安定化するための修飾(例えば、３'分解を遮断することによりまたは３'末端をキャッピングすることによりまたは２個以上のオリゴリボヌクレオチドの３'末端を連結することにより)を含んでよいが、ＳＩＭＲＡは、非修飾オリゴリボヌクレオチドよりインビボで安定であるか、または安定であるはずであり、それ故に、その免疫調節性能に影響する。ＳＩＭＲＡは修飾オリゴリボヌクレオチド類を含み得る。ＳＩＭＲＡ化合物は、オリゴリボヌクレオチドの安定性をさらに改善するために、その５'末端(例えば、５'分解を遮断することによりまたは５'末端をキャッピングすることにより)にも修飾を含んでよい。ＳＩＭＲＡは直鎖でも分枝鎖でもよく、核酸類は、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、または別の架橋を介して連結された、リボヌクレオシドのポリマーである。ＳＩＭＲＡはリボース糖残基またはその誘導体に共有結合したプリン(アデニン(Ａ)またはグアニン(Ｇ)またはその誘導体(例えば、７−デアザ−Ｇ、アラビノ−Ｇおよびアラビノ−Ａ))またはピリミジン(シトシン(Ｃ)またはウラシル(Ｕ)、またはその誘導体(例えば、アラビノ−Ｃおよびアラビノ−Ｕ))塩基を含み得る。
【００５６】
用語“処置”は、一般に、症状の軽減、疾患進行の遅延または改善を含み得る、有益なまたは望む結果を得るための方法を意味する。
【００５７】
用語“ウイルス疾患”は、一般に、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、および帯状疱疹を含み、これらに限定されない、その病原因子としてウイルスを有する疾患を意味する。
【００５８】
第一の面において、本発明は新規ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を提供する。本出願は、免疫調節性オリゴリボヌクレオチドの３'末端を保護するための修飾(例えば、３'分解の遮断または３'末端のキャッピングによるまた２個以上のオリゴリボヌクレオチドの３'末端の連結による)が、その免疫調節性能に驚くほど影響することを示す。加えて、この保護がオリゴリボヌクレオチド類の安定性を驚くほど改善し、脂質会合または他の保護手段の必要性を無くすことが確認された。さらに、３'末端に追加したまたは組み合わせた５'分解の遮断または５'末端のキャッピングもまたオリゴリボヌクレオチドの安定性を改善できる。
【００５９】
本発明において、新規ＳＩＭＲＡ化合物でのＴＬＲ７の活性化および独特の免疫応答(例えば、サイトカインおよび／またはケモカインプロファイルの変化)の誘発が証明される。それ故に、本発明は、ＴＬＲ７サイトカインおよび／またはケモカインの活性化を介して、それに関連するプロファイルが、免疫調節性オリゴリボヌクレオチドの一部として修飾塩基、修飾糖類、主鎖、リンカー、結合、および／またはキャップを含む修飾化学構造を使用して調節できることを示す。
【００６０】
一つの態様において、本発明は、３'末端で、またはヌクレオシド間架橋または官能化核酸塩基または糖を介して非ヌクレオチドリンカーに連結した少なくとも２個のＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドを含む免疫調節性化合物を提供する。本発明のかかる態様は、少なくとも１個の利用できる５'末端を有してよく、それはキャップをしてもキャップをしなくてもよい。この構造が、脂質会合または他の保護の必要なしに、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物にさらなる安定性(例えば、エキソヌクレアーゼ活性の阻害)を提供することが確認された。“利用できる５'末端”は、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの５'末端が、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物のＴＬＲ７を介する免疫応答の調節を妨げる方法で修飾されていないことを意味する。
【００６１】
本発明のこの面の他の態は、少なくとも２個のオリゴリボヌクレオチド類を含み、ここで、本免疫調節性化合物は、表２の式Ｉ〜IVで示される構造を有し、これに限定されない。
【表２】
【００６２】
ドメインＡ、Ｂ、およびＣは、独立して約２〜約３５リボヌクレオチド長、およびある態様において約２〜約２０、または約２〜約１２、または約２〜約１１、または約２〜約８リボヌクレオチド長であり得る。ドメインＡ、Ｂ、およびＣは同一であっても、同一でなくてもよい。ドメインＡ、Ｂ、およびＣは、独立して、自己相補性ドメイン、ホモまたはヘテロリボヌクレオチド配列、またはリンカーを有するまたは有さない５'−３'または２'−５'ＲＮＡであり得る。式IVに使用される、“ｎ”は１から無限までである。
【００６３】
“Ｘ”は、３'または５'架橋、リン酸基、核酸塩基、非ＲＮＡヌクレオチドを介してよいドメインＡ、Ｂ、および／またはＣを結合またはキャッピングするリンカー、または脂肪族、芳香族性、アリール、環状、キラル、キラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ〜トリまたはヘキサポリエチレングリコール、またはヘテロ環基、またはそれらの組合せであり得る非ヌクレオチドリンカーである。
【００６４】
さらなる態様において、本発明は、非ヌクレオチドリンカーにより連結された少なくとも２個のオリゴリボヌクレオチドを含むＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物であり、ここで、これらの免疫調節性オリゴリボヌクレオチドの配列は、少なくとも部分的に自己相補性である。これらのオリゴリボヌクレオチドの相補性配列が分子間水素結合を可能にし、それによりオリゴリボヌクレオチドの二次構造を取ることを可能にする。付加的オリゴリボヌクレオチドを一緒に連結し、それにより、例えば式IVのような、本発明のオリゴリボヌクレオチドの鎖、または多量体を形成できる。
【００６５】
同様の考察が、異なる塩基配列の免疫調節性オリゴリボヌクレオチド間の分子間塩基対形成に当てはまる。それ故に、複数の免疫調節性オリゴリボヌクレオチドを一緒に使用するとき、この複数の免疫調節性オリゴリボヌクレオチドは、必須ではないが、互いに少なくとも部分的に相補性の配列を含んでよい。一つの態様において複数の免疫調節性オリゴリボヌクレオチドは、第一配列を有する免疫調節性オリゴリボヌクレオチドおよび第二の配列を有する免疫調節性オリゴリボヌクレオチドを含み、ここで、第一の配列および第二の配は、少なくとも４０％または少なくとも５０％相補性である。例えば、少なくとも５０％相補性である２個の８量体の場合、それらは、４個、５個、６個、７個、または８個のＧ−Ｃ、Ａ−Ｕ、および／またはＧ−Ｕ不安定塩基対を形成し得る。かかる塩基対は、必ずしもではないが、相補性免疫調節性オリゴリボヌクレオチドのいずれかの末端に位置する塩基を含む。相補性の程度は、複数免疫調節性オリゴリボヌクレオチド間のアライメントに依存し得て、かかるアライメントは、一または多ヌクレオシドオーバーハングを有しても有さなくてもよい。他の態様において、相補性の程度は少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％である。
【００６６】
当業者には認識される通り、記載した免疫調節性化合物は、複数ドメインの配列が分子間水素結合を可能にする相補性であるため、二次構造を有し得る。さらに、表２の式IIIおよびIVに示される通り、付加的な連結されたＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドが分子間水素結合を介して結合でき、それにより鎖、または多量体を形成し、ここで、任意の数の架橋したＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドを取り込んでよい。
【００６７】
他の態様において、本発明は、３'または５'末端で、またはヌクレオシド間架橋または官能化核酸塩基または糖を介して非ヌクレオチドリンカーに連結した少なくとも２個のＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該リンカー(例えば、キャップ)が少なくとも１個の５'末端に結合している、免疫調節性化合物を提供する。この構造は、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物にさらなる安定性(例えば、エキソヌクレアーゼ活性の阻害)を与えることが確認された。ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの５'末端は、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物のＴＬＲ７を介する免疫応答の調節を妨げる方法で修飾されていない。
【００６８】
ある態様において、オリゴリボヌクレオチド類は、各々独立して約２〜約３５個のリボヌクレオシド残基を有する。それ故に、ある態様においてオリゴリボヌクレオチドは、独立して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５リボヌクレオチド長であり得る。好ましくは、オリゴリボヌクレオチドは約４〜約３０個のリボヌクレオシド残基、より好ましくは約４〜約２０個のリボヌクレオシド残基または約４〜約１１個のリボヌクレオシド残基である。ある態様において、免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類は、約１〜約１８個、または約１〜約１１個、または約５〜約１４個のリボヌクレオシド残基を有するオリゴリボヌクレオチド類を含む。ある態様において、オリゴリボヌクレオチド類の１個以上は、１１個のリボヌクレオチド類または約８〜約１４個のリボヌクレオチド類または約１０〜約１２個のリボヌクレオチド類を有する。免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類に関連して、好ましい態様は、約１〜約３５個のリボヌクレオチド類、好ましくは約５〜約２６個のリボヌクレオチド類、より好ましくは約１３〜約２６個のリボヌクレオチド類を含む。好ましくは、免疫調節性オリゴリボヌクレオチドは、少なくとも１個のホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートリボヌクレオシド間架橋を有する。
【００６９】
例示的態様において、各リボヌクレオシド単位は、ヘテロ環塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２'−デオキシ−２'−置換アラビノース、２'−Ｏ−置換リボースまたはアラビノースまたはヘキソース糖基を含む。リボヌクレオシド残基は、多数の既知のリボヌクレオシド間結合のいずれかによって結合できる。かかるリボヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル(Ｐｏ)、ホスホロチオエート(Ｐｓ)、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンリボヌクレオシド間結合、またはそれらの任意の組合せを含み、これらに限定されない。
【００７０】
加えて、例示的オリゴリボヌクレオチドを、交互のホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合(例えば、Ｎ１ＰｏＮ２ＰｓＮ３ＰｏＮｎＰｓ、ここで、Ｎは本発明のリボヌクレオシドである)、ホスホジエステル結合区画とその後のホスホロチオエート結合区画(例えば、Ｎ１ＰｏＮ２ＰｏＮ３ＰｏＮｎＰｏＮ１ＰｓＮ２ＰｓＮ３ＰｓＮｎＰｓ、ここで、Ｎは本発明のリボヌクレオシドである)、およびホスホロチオエート結合区画とその後のホスホジエステル結合区画(例えば、Ｎ１ＰｓＮ２ＰｓＮ３ＰｓＮｎＰｓＮ１ＰｏＮ２ＰｏＮ３ＰｏＮｎＰｏ、ここで、Ｎは本発明のリボヌクレオシドである)を含み、これらに限定されない、かかるリボヌクレオシド間結合の任意の組合せで結合してよい。
【００７１】
本リボヌクレオチドについてのコンジュゲーション可能な位置を下の式Ｖで示し、式中、Ｂはヘテロ環塩基を意味する。
【化１】
【００７２】
本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物は、天然に存在するリボヌクレオシド類、修飾リボヌクレオシド類、またはそれらの混合物を含み得る。
【００７３】
本発明において、新規ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物は、ある種の化学修飾を取り込むことによりヒトＴＬＲ７により認識され、免疫応答の誘発をもたらす。かかる化学修飾は、グアニン類似体、例えば７−デアザ−Ｇ、ａｒａ−Ｇ、６−チオ−Ｇ、イノシン、Ｉｓｏ−Ｇ、ロキソリビン、ＴＯＧ(７−チオ−８−オキソ)−Ｇ、８−ブロモ−Ｇ、８−ヒドロキシ−Ｇ、５−アミノホルマイシンＢ、オキソホルマイシン、７−メチル−Ｇ、９−ｐ−クロロフェニル−８−アザ−Ｇ、９−フェニル−Ｇ、９−ヘキシル−グアニン、７−デアザ−９−ベンジル−Ｇ、６−クロロ−７−デアザグアニン、６−メトキシ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザ−Ｇ(ＰＰＧ)、２−(ジメチルアミノ)グアノシン、７−メチル−６−チオグアノシン、８−ベンジルオキシグアノシン、９−デアザグアノシン、および１−(Ｂ−Ｄ−リボフラノシル)−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンを含み、これらに限定されない。化学修飾はまた、アデニン類似体、例えば９−ベンジル−８−ヒドロキシ−２−(２−メトキシエトキシ)アデニン、２−アミノ−Ｎ２−Ｏ−、メチルアデノシン、８−アザ−７−デアザ−Ａ、７−デアザ−Ａ、ａｒａ−Ａ、ビダラビン、２−アミノアデノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、８−アザアデノシン、および５−ヨードツベルシジンも含み、これらに限定されない。化学修飾はまた、シトシンおよびウラシル類似体、例えばシュードウリジン、ａｒａ−Ｃ、ａｒａ−Ｕ、５−メチルシチジン、４−チオウリジン、Ｎ４−エチルウリジン、ゼブラリン、５−アミノアリルウリジン、Ｎ３−メチルウリジン、および５−フルオロウリジンも含み、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の“免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類”は、３'または２'末端で、または官能化リボースまたは官能化リボ核酸塩基で非ヌクレオチドまたはヌクレオチドリンカーを介して共有結合的にまたは非共有結合的に連結した、少なくとも２個のオリゴリボヌクレオチドを含むＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物である。非共有結合的架橋は、静電相互作用、疎水性相互作用、π−スタッキング相互作用、および水素結合を含み、これらに限定されない。
【００７５】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは、表３に記載したものを含んでよく、これらに限定されない。
【表３】
【００７６】
ある態様において、小分子リンカーは、グリセロールまたは式ＨＯ−(ＣＨ２)ｏ−ＣＨ(ＯＨ)−(ＣＨ２)ｐ−ＯＨ(式中、ｏおよびｐは独立して１〜約６、１〜約４、または１〜約３の整数である)のグリセロールホモログである。ある他の態様において、小分子リンカーは１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。かかる誘導体のいくつかは、式ＨＯ−(ＣＨ２)ｍ−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ２−ＮＨＣ(Ｏ)−(ＣＨ２)ｍ−ＯＨ(式中、ｍは０〜約１０、０〜約６、２〜約６、または２〜約４の整数である)を有する。
【００７７】
本発明に従ういくつかの非ヌクレオチドリンカーは、表２の式IIにより示される通り、２個を超えるオリゴリボヌクレオチドの結合を可能にする。例えば、小分子リンカーグリセロールは、オリゴリボヌクレオチドが共有結合し得る３個のヒドロキシル基を有する。本発明のいくつかの免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類は、それ故、３'末端で非ヌクレオチドリンカーに連結した２個を超えるオリゴリボヌクレオチド類(例えば、ドメインＣなど、付加的ドメインは、ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤについて上に定義したオリゴリボヌクレオチド類を含む)を含む。
【００７８】
本発明の免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類は、好都合に、自動合成装置およびホスホロアミデート法を使用して合成できる。ある態様において、免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類は、線状合成法により合成する。別の合成方法は、合成が中央リンカー部分から外側へと進む“平行合成”である(図１参照)。米国特許番号５,９１２,３３２に記載の通り、固体支持体結合リンカーを平行合成に使用できる。あるいは、普遍的固体支持体(例えばホスフェート結合制御細孔ガラス(phosphate attached controlled pore glass))支持体を使用できる。
【００７９】
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類の平行合成はいくつかの点で線状合成より有利である：(１)平行合成は同一モノマー単位の取り込みを可能にする；(２)線状合成と異なり、両方の(または全ての)モノマー単位を同時に合成でき、それにより、合成工程数および合成に必要な時間は、モノマー単位の合成と同じである；そして(３)合成工程の減少により、最終免疫調節性オリゴリボヌクレオチド生成物の純度および収率が改善される。
【００８０】
合成プロトコールの最後に、免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類を、修飾ヌクレオシドが取り込まれたら、好都合なことに濃アンモニア溶液で、またはホスホロアミデート供給社の推奨通り脱保護できる。生成物免疫調節性オリゴリボヌクレオチドは、好ましくは逆相ＨＰＬＣにより精製し、脱トリチル化し、脱塩し、そして透析する。
【００８１】
表４は、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を示す。特にことわらない限り、全てのヌクレオシド類はリボヌクレオシド類であり、そして全ての架橋はホスホロチオエートである。
【表４】
【表５】
Ｇ１＝７−デアザ−Ｇ；Ｘ＝１,２,３−プロパンジオール
【００８２】
第二の面において、本発明は、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。
【００８３】
第三の面において、本発明は、脊椎動物においてＴＬＲ７仲介免疫応答を起こす方法であって、該脊椎動物に本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を投与することを含む、方法を提供する。ある態様において、脊椎動物は哺乳動物である。好ましい態様において、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を、免疫調節の必要な脊椎動物に投与する。
【００８４】
第四の面において、本発明は、疾患または障害を有する患者の治療的処置方法であって、該患者に本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を投与する方法を提供する。種々の態様において、処置する疾患または障害は、癌、自己免疫障害、感染性疾患、気道炎症、炎症性障害、アレルギー、喘息、または病原体が原因の疾患を含み、これらに限定されない、免疫調節が望ましい可能性があるものである。病原体は細菌、寄生虫、真菌、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。
【００８５】
第五の面において、本発明は疾患または障害の予防方法であって、該患者に本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を投与する方法を提供する。種々の態様において、予防する疾患または障害は、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、アレルギー、喘息、または病原体が原因の疾患を含み、これらに限定されない、免疫調節が望ましい可能性があるものである。病原体は細菌、寄生虫、真菌、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。
【００８６】
第六の面において、本発明は、障害の予防または処置方法であって、サイトカイン類またはケモカイン類を産生できる細胞キャップ(免疫細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＰＢＭＣ、ｐＤＣおよびリンパ系細胞を含み、これらに限定されない)を単離し、かかる細胞を標準細胞培養条件下で培養し、かかる細胞を、単離細胞のサイトカイン類またはケモカイン類産生または分泌レベルが増加するようにＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡでエクスビボで処置し、処置細胞を、疾患の予防または処置のためにサイトカインまたはケモカイン治療を必要とする患者に投与または再投与することを含む、方法を提供する。本発明のこの面は、活性化免疫細胞を産生するための標準養子細胞免疫療法技術に従う。
【００８７】
本発明のこの面のある態様において、サイトカイン類またはケモカイン類を産生できる細胞を、疾患または障害を有しているまたは有していない対象から単離し得る。かかる単離は、同定および選択を含む場合があり、下の具体的実施例に記載したものを含む、標準細胞単離法を使用して行い得る。かかる単離細胞を、標準細胞培養法に従い、標準細胞培養条件を使用して培養し、これは、下の具体的実施例に記載した培養法および条件を含み得る。本発明のこの態様のさらなる面において、単離細胞を、少なくとも１個の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの存在下、かかる１個以上の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの非存在下で培養した単離細胞と比較して、サイトカイン類および／またはケモカイン類の産生および／または分泌の誘発、増加または向上に十分な量および時間で、培養する。かかる時間は秒単位から、分単位、時間単位、日単位までである。かかる単離したＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ処置細胞は、ドナーへの再投与、または第二の組織学的に適合する患者への投与により、有用性を見ることができ、ここで、かかるドナーまたは第二の患者は、サイトカイン類および／またはケモカイン類の産生および／または分泌の誘発、増加または向上を必要とする。例えば、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、アレルギー、喘息または病原体が原因の疾患を有するドナーへの再投与または第二の患者への投与。かかる再投与または投与は、カテーテルまたは注射投与または任意の他の有効な経路を含む、多様な方式を使用して達成し得る。本発明のこの面はまた、免疫応答を開始する能力が限られているかまたは不完全であり得るまたは免疫無防備状態である患者(例えば、ＨＩＶに感染している患者および骨髄移植患者)への有用性も見ることができる。本発明のこの面はまた、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの、単離したＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ処置細胞を投与したまたは再投与した患者への投与と組み合わせても有用性を見ることができる。
【００８８】
本発明の方法の全てにおいて、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物は、単独で、またはＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の免疫調節効果を消滅させない、該疾患または状態の処置または予防に有用な他の薬剤と組み合わせて、直接免疫調節効果を生じることにより多様に作用し得る。本発明の何れの方法においても、疾患または状態の処置または予防に有用な薬剤は、ワクチン、抗原、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド類、ＴＬＲアゴニスト(例えば、ＴＬＲ９のアゴニストおよび／またはＴＬＲ７のアゴニストおよび／またはＴＬＲ８のアゴニスト)、化学療法剤(伝統的化学療法剤および近代的標的治療剤)、標的治療剤、活性化細胞、ペプチド類、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ペプチドワクチン、タンパク質ワクチン、ＤＮＡワクチン、アジュバント、および共刺激分子(例えば、サイトカイン類、ケモカイン類、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド類または修飾アミノ酸を含むペプチド類)、またはそれらの組合せを含み、これらに限定されない。例えば、癌の処置において、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を、１種以上の化学療法化合物、標的治療剤および／またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与することが意図される。あるいは、本薬剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含み得る。あるいは、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物に対する免疫応答の特性または強度を高めるために、他のアジュバントと組み合わせて投与できる。
【００８９】
本発明の方法の全てにおいて、単独で、または何れかの他の薬剤と組み合わせた本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物の投与は、非経腸、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、または点眼剤または洗口剤形態を含み、これらに限定されない任意の経路により行うことができる。本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物の治療組成物の投与は、薬学的有効量を使用する既知方法を使用して、疾患の症状を軽減する、または疾患の疾病指示マーカーを低下させるのに十分な期間行うことができる。例えば、疾患および／または障害の処置のための薬学的に有効量の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物は、症状を軽減するまたは減らす、または腫瘍、癌、または細菌、ウイルス、または真菌感染を遅延もしくは軽減するために必要な量である。ワクチンアジュバントとして使用するための薬学的有効量は、ワクチンまたは抗原に対する対象の免疫応答をブーストするのに有用な量である。併用する抗原に対する免疫応答を調節する組成物の投与に関連して、薬学的に有効量の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物は、その抗原を単独で投与したときに得られる免疫応答と比較して、所望の調節を達成するのに十分な量である。特定の適用についての有効量は処置する疾患または状態、投与する特定のオリゴヌクレオチド、対象の体格または疾患または状態の重症度のような因子によって変わり得る。当業者は、過度の実験を要することなく、特定のオリゴヌクレオチドの薬学的有効量を経験的に決定できる。
【００９０】
全身投与するとき、治療組成物は、好ましくは本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物の血中濃度を約０.０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルに到達させるのに十分な投与量で投与する。局所投与については、これより遙かに低濃度で有効であり得て、かつ遙かに高い濃度が許容され得る。好ましくは、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物の総投与量は、約０.００１mg／患者／日〜約２００mg／kg体重／日の範囲である。治療的有効量の本発明の治療組成物の１種以上を、同時に、または連続的に一処置として個体に投与することが望ましいことがある。
【００９１】
本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物は、場合により１種以上のアレルゲンおよび／または抗原(自己または外来)、免疫原性タンパク質またはペプチド、例えばキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、コレラ毒素Ｂサブユニット、または任意の他の免疫原性担体タンパク質と連結してよい。本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を、ＴＬＲアゴニスト(例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９のアゴニスト)、フロイント不完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ(ＭＰＬ)、ミョウバン、ならびにＱＳ−２１およびイミキモドを含むサポニン類、またはそれらの組合せを含み、これらに限定されない他の化合物(例えば、アジュバント)と組み合わせても使用できる。
【００９２】
本発明のこの面の方法は、免疫系の試験モデルとして有用である。本方法はまた、ヒトまたは動物疾患の予防または治療的処置にも有用である。例えば、本方法は、小児、成人、および獣医用ワクチン適用に有用である。
【００９３】
以下の実施例は、本発明のある種の例示的態様をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００９４】
実施例１
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド合成
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類を、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置でのホスホロアミデート化学を用いて、化学合成した。Ｎ−アセチル保護した(Ｕ以外)２'−Ｏ−ＴＢＤＭＳ ＲＮＡモノマー、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵをSigma-Aldrichから購入した。７−デアザ−Ｇ、イノシンをChemGenes Corporationから購入した。０.２５Ｍ ５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、ＰＡＣ−無水物キャップＡおよびキャップＢをGlen Researchから購入した。３％トリクロロ酢酸(ＴＣＡ)のジクロロメタン(ＤＣＭ)溶液および５％３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン−１,１−ジオキシド(Beaucage reagent)は社内で製造した。
【００９５】
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類を１−２μM規模で標準ＲＮＡ合成プロトコールを使用して合成した。
【００９６】
開裂および塩基脱保護
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類を固体支持体から開裂し、エキソ−環状−アミン類の保護基をメチルアミンおよび水酸化アンモニウム溶液中で除去した。得られる溶液をSpeedVacで完全に乾燥させた。
【００９７】
ＩＥ ＨＰＬＣ精製
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類をイオン交換ＨＰＬＣにより精製した。Dionex DNAPac 100カラムを使用。粗免疫調節性オリゴリボヌクレオチド溶液をＨＰＬＣに注入した。上記勾配を行い、フラクションを回収した。９０％を超えて所望の生成物を含む全フラクションを混合し、溶液をほとんど乾固するまでRotoVapで蒸発させた。無ＲＮＡｓｅ水を添加して、最終体積１０mlとした。
【００９８】
Ｃ−１８逆相脱塩
Watersから購入したC-18 Sep-Pakカートリッジを、１０mlのアセトニトリル、続いて１０mlの０.５Ｍ 酢酸ナトリウムをカートリッジを通すことにより洗浄した。次いで、１０mlの免疫調節性オリゴリボヌクレオチド溶液をカートリッジに載せた。１５mlの水を使用して、塩を洗い流した。免疫調節性オリゴリボヌクレオチドを、最後に１mlの５０％アセトニトリルの水溶液を使用して溶出した。溶液をSpeedVacに３０分間入れた。残った溶液を０.２ミクロン・フィルターを通して濾過し、凍結乾燥させた。固体を無ＲＮＡｓｅ水に再溶解して、所望の濃度とした。最終溶液を０℃未満で貯蔵した。オリゴリボヌクレオチド類を、キャピラリー電気泳動、イオン交換ＨＰＬＣ、およびＰＡＧＥ分析により純度を分析し、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析で分子量を分析した。
【００９９】
実施例２
ＴＬＲ発現ＨＥＫ２９３細胞を用いるアッセイプロトコール
ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３ＸＬ／ヒトＴＬＲ７またはＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３ＸＬ／ヒトＴＬＲ８細胞(InvivoGen, San Diego, CA)を、４８ウェルプレートで、１０％熱不活性化ＦＢＳ添加２５０μl／ウェルＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【０１００】
レポーター遺伝子形質転換
ヒトＴＬＲ７またはＴＬＲ８を安定に発現するＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３ＸＬ細胞(InvivoGen, San Diego, CA)を、４８ウェルプレートで、１０％熱不活性化ＦＢＳ添加２５０μl／ウェルＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。８０％コンフルエンスで、培養物を、培養培地中４μl／mlのリポフェクタミン(Invitrogen, Carlsbad, CA)の存在下、４００ng／mlのＳＥＡＰ(分泌型のヒト胚アルカリホスファターゼ)レポータープラスミド(pNifty2-Seap)(Invivogen)で一過性にトランスフェクションした。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを、別々に無血清培地で希釈し、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、希釈したＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物を室温で２０分間インキュベートした。１００ngのプラスミドＤＮＡおよび１μlのリポフェクタミンを含む２５μl量のＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を、細胞培養プレートの各ウェルに添加し、培養を４時間続けた。
【０１０１】
ＩＭＯ処置
トランスフェクション後、培地を新鮮培養培地に変えた。ヒトＴＬＲ７またはＴＬＲ８を発現するＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９ＸＬ細胞を、５０μg／mlの本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡまたはＰＢＳコントロールで刺激し、培養を１８〜２０時間続けた。ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ処置の最後に、３０μlの培養上清を各処置から取り、製造者のプロトコールに従うＳＥＡＰアッセイに使用した(InvivoGen)。
【０１０２】
ＳＥＡＰ(分泌型のヒト胚アルカリホスファターゼ)アッセイ
簡単に言うと、培養上清をｐ−ニトロフェニル(phynyl)ホスフェート基質とインキュベートし、黄色の発色をプレートリーダーで４０５nmで測定した。
【０１０３】
ヒトＴＬＲ７およびＴＬＲ８発現ＨＥＫ２９３細胞中のＴＬＲ７およびＴＬＲ８活性を表５に示す。表５に示すデータは、ＨＥＫ２９３細胞を５０μg／mlの本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢレベルをＳＥＡＰ(分泌型のヒト胚アルカリホスファターゼ)アッセイを使用して測定して作成した。データは、ＮＦ−κＢ活性のＰＢＳコントロールに対する増加倍率として示す。(Putta, M.R. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34: 3231-38)。表５に示すデータは、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの投与が明確かつ特異的ＴＬＲ７仲介免疫応答プロファイルを生じさせることを示す。
【表６】
Ｇ１＝７−デアザ−Ｇ；Ｘ＝１,２,３−プロパンジオール(グリセロール)
【０１０４】
実施例３
ヒト細胞培養プロトコール
ヒトＰＢＭＣ単離
新たに採血した健常ボランティアの血液(CBR Laboratories, Boston, MA)由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Ficoll密度勾配遠心法(Histopaque-1077, Sigma)により単離した。
【０１０５】
ヒトｐＤＣ単離
新たに採血した健常ボランティアの血液(CBR Laboratories, Boston, MA)由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Ficoll密度勾配遠心法(Histopaque-1077, Sigma)により単離できる。ｐＤＣを、製造者の指示に従いＢＤＣＡ４細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を使用するポジティブ選択によりＰＢＭＣから単離できる。
【０１０６】
ヒトｍＤＣ単離
新たに採血した健常ボランティアの血液(CBR Laboratories, Boston, MA)由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Ficoll密度勾配遠心法(Histopaque-1077, Sigma)により単離できる。骨髄樹状細胞(ｍＤＣ)を、製造者の指示に従いＢＤＣＡ４細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を使用するポジティブ選択によりＰＢＭＣから単離できる。
【０１０７】
マルチプレックスサイトカインアッセイ
ヒトＰＢＭＣを、５×１０６細胞／mlを使用して４８ウェルプレートに播種した。ｐＤＣを、９６ウェル皿に１×１０６細胞／mlを使用して播種できる。ＤＰＢＳ(ｐＨ７.４；Mediatech)に溶解した本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を、細胞培養に最終濃度５０または１００μg／mlで添加した。次いで細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をルミネックスマルチプレックスまたはＥＬＩＳＡアッセイのために回収した。実験を３個のウェルで行った。ＩＦＮ−α、ＩＬ−６、またはＴＮＦ−αの濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカイン抗体およびスタンダートを含む必要な試薬をPharMingenから購入した。
【０１０８】
ルミネックスマルチプレックスアッセイを、Biosourceヒトマルチプレックスサイトカインアッセイキットを使用して、Luminex 100/200装置で行い、データをApplied Cytometry Systems(Sacramento, CA)が提供するStarStationソフトウェアを使用して解析した。
【０１０９】
ヒトＰＢＭＣからのサイトカイン濃度を表６に示す。表６に示すデータは、新たに採血した健常ボランティアの血液からＰＢＭＣを単離し、１００μg／ml用量のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡと２４時間培養し；上清を回収し、サイトカイン濃度用ルミネックスマルチプレックスアッセイで解析することにより作成した。表６に示す結果は、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡオリゴヌクレオチド類の投与が、独特のサイトカインおよびケモカインプロファイルをもたらすことを証明する。
【表７】
Ｇ１＝７−デアザ−Ｇ；Ｘ＝１,２,３−プロパンジオール(グリセロール)
＊データ５０μg／ml濃度
【０１１０】
実施例４
ＴＬＲ７アゴニスト化合物で処置したマウスモデルにおけるインビボサイトカイン分泌
５〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをTaconic Farms, Germantown, NYから得て、Idera Pharmaceutical's IACUC approved animal protocolsに従い飼養した。マウス(ｎ＝３)に、個々の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を２５mg／kg(１回投与量)で皮下注射(ｓ.ｃ.)した。血清を、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ投与２時間後後眼窩放血により採取し、サイトカインおよびケモカイン濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡまたはルミネックスマルチプレックスアッセイにより測定した。結果を表７にしめし、これは、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡオリゴヌクレオチド類のインビボ投与が独特のサイトカインおよびケモカインプロファイルをもたらすことを証明する。サイトカインおよびケモカイン抗体およびスタンダードを含む全ての試薬をPharMingen(San Diego, CA)から購入した。
【表９】
Ｇ１＝７−デアザ−Ｇ；Ｘ＝１,２,３−プロパンジオール(グリセロール)
【０１１１】
実施例５
血清安定性アッセイ
約０.５ＯＤの例示的な本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を、個々に１％ヒト血清のＰＢＳ溶液中、３０分間、３７℃でインキュベートしてよい。１％ヒト血清中、３０分間のインキュベーション後、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物をアニオン交換ＨＰＬＣで解析して、血清処置前に存在したＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の量と比較して、残留している完全長ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の割合を決定してよい。結果は、ＲＮＡベースの化合物上に為した本発明の化学修飾が、その安定性を増強できることを証明するものであると予測される。
【０１１２】
均等物
上に記載した発明は、明瞭化および理解の目的で幾分詳細に記載しているが、当業者には、本明細書の解釈から、本発明の真の範囲および添付する特許請求の範囲から逸脱することなく、形式および詳細を変化させ得ることは当然である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年２月１０日出願の米国仮出願番号６１／１５１,２１１の利益を主張し、その開示は引用により本明細書に明示的に包含させる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に、免疫調節剤としてオリゴリボヌクレオチド類を使用する免疫学および免疫療法適用に関する。より具体的に、本発明は、免疫調節性ＲＮＡ組成物およびトール様受容体７(ＴＬＲ７)を介する免疫応答調節のためのその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連分野の要約
免疫応答は、応答に関与する細胞のサブセットに基づく先天的応答および適応応答の両方が関与する。例えば、遅延型過敏および細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)活性化のような古典的細胞媒介性機能に関与するＴヘルパー(Ｔｈ)細胞はＴｈ１細胞であり、一方、Ｂ細胞活性化のヘルパー細胞として関与するＴｈ細胞は、Ｔｈ２細胞である。免疫応答のタイプは、抗原暴露に応答して産生されるサイトカイン類およびケモカイン類に影響される。サイトカイン類は、Ｔヘルパー１(Ｔｈ１)細胞とＴヘルパー２(Ｔｈ２)細胞の均衡に作用することにより免疫応答を制御する手段を提供し、それは、起こる免疫応答のタイプに直接影響する。均衡がＴｈ１細胞の細胞数増加に傾いたならば、細胞媒介性免疫応答が起こり、これは、細胞毒性Ｔ細胞(ＣＴＬ)の活性化を含む。均衡がＴｈ２細胞の細胞数増加に傾いたならば、体液性または抗体免疫応答が起こる。これらの免疫応答のそれぞれが、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞から分泌されるサイトカイン類の異なるセットをもたらす。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞により分泌されるサイトカイン類の差異は、これらの２種のＴ細胞サブセットの異なる生物学的機能の結果であり得る。
【０００４】
Ｔｈ１細胞は、抗原(例えば、ウイルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞)に対する身体の先天的応答に関与する。抗原に対する最初の応答は、抗原提示細胞(例えば、活性化マクロファージおよび樹状細胞)からのＩＬ−１２分泌と、それに付随するＴｈ１細胞活性化であり得る。活性化Ｔｈ１細胞は、ある種のサイトカイン類(例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマおよび他のサイトカイン類)の分泌を引き起こし、それに付随して抗原特異的ＣＴＬが活性化する。Ｔｈ２細胞は、細菌、寄生虫、抗原、およびアレルゲンに応答して活性化されることが既知であり、ある種のサイトカイン類(例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３および他のサイトカイン類)およびケモカイン類を介して身体の適応免疫応答(例えば、免疫グロブリン産生および好酸球活性化)を仲介し得る。これらのサイトカイン類のいくつかがＢ細胞増殖および抗体産生増加を引き起こし得る。加えて、これらのサイトカイン類のいくつかが他のサイトカイン類の放出を刺激または阻害し得る(例えば、ＩＬ−１０は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γ分泌および樹状細胞からのＩＬ−１２分泌を阻害する)。最終的に、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の均衡、および選択した刺激に応答して遊離されたサイトカイン類およびケモカイン類が、身体の免疫系の疾患に対する応答に重要な役割を有する。例えば、ＩＦＮ−αはＣ型肝炎を阻止し得、そしてＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β(それぞれＣＣＬ３およびＣＣＬ４としても既知)はＨＩＶ−１感染を阻止し得る。Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答の最適な平衡化が、種々の疾患の処置および予防に免疫系が使用される機会を提供する。
【０００５】
Ｔｈ１免疫応答を、哺乳動物で、例えば非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む細菌または合成ＤＮＡの導入により誘発でき、その免疫応答は、パターン認識受容体(ＰＲＲ)として知られるある種の免疫細胞上の受容体への、特異的オリゴヌクレオチド配列(例えば、非メチル化ＣｐＧ)の提示に由来する。これらのＰＲＲのいくつかはトール様受容体(ＴＬＲ)である。
【０００６】
ＴＬＲは、微生物感染に応答した先天的免疫応答の誘発に密接に関係する。脊椎動物で、ＴＬＲは病原体関連分子構造(ＰＡＭＰ)を認識することが知られている、少なくとも１１種のタンパク質(ＴＬＲ１からＴＬＲ１１)のファミリーを構成する。いくつかのＴＬＲは、細胞外病原体を検知し、応答を開始するために細胞表面に位置し、他のＴＬＲは、細胞内病原体を検知し、応答を開始するために細胞内部に位置する。表１は、ＴＬＲ、それに対する既知アゴニストおよびＴＬＲを含むことが知られている細胞型を示す(Diebold, S.S. et al. (2004) Science 303: 1529-31; Liew, F. et al. (2005) Nature 5: 446-58; Hemmi, H. et al. (2002) Nat. Immunol. 3: 196-200; Jurk, M. et al., (2002) Nat. Immunol. 3: 499; Lee, J. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6646-51; Alexopoulou, L. (2001) Nature 413: 732-38)。
【表１】
【０００７】
リガンドとＴＬＲの相互作用が仲介するシグナル伝達経路は、ＴＬＲファミリーのほとんどのメンバーが共有し、ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体(ＴＩＲドメイン)、骨髄分化マーカー８８(ＭｙＤ８８)、ＩＬ−１Ｒ関連キナーゼ(ＩＲＡＫ)、インターフェロン制御因子(ＩＲＦ)、ＴＮＦ受容体関連因子(ＴＲＡＦ)、ＴＧＦβ−活性化キナーゼ１、ＩκＢキナーゼ類、ＩκＢ、およびＮＦ−κＢを含む(例えば：Akira, S. (2003) J. Biol. Chem. 278: 38105およびGeller et al. (2008) Curr. Drug Dev. Tech. 5: 29-38参照)。より具体的に、ＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、９、および１１に関して、このシグナル伝達カスケードは、ホモ二量体としてエンドソーム膜または細胞表面に存在する膜結合ＴＬＲと相互作用し、そして活性化するＰＡＭＰリガンドから開始する。活性化後、受容体は、立体構造変化を受けて、ＴＬＲ３以外の全ＴＬＲシグナル伝達経路に共通するアダプタータンパク質であるＴＩＲドメイン含有タンパク質ＭｙＤ８８の動員が可能となる。ＭｙＤ８８はＩＲＡＫ４を動員し、それはＩＲＡＫ１をリン酸化および活性化する。活性化ＩＲＡＫ１はＴＲＡＦ６と結合し、それは、ポリユビキチンのＴＲＡＦ６への付加を触媒する。ユビキチン付加はＴＡＫ／ＴＡＢ複合体を活性化し、続いてリン酸化ＩＲＦが、ＮＦ−κＢ放出および核への輸送をもたらす。核内のＮＦ−κＢは炎症誘発性遺伝子の発現を誘発する(例えば、Trinchieri and Sher (2007) Nat. Rev. Immunol. 7: 179-90参照)。
【０００８】
ＴＬＲおよびそこから生じるシグナル伝達の選択的局在化は、免疫応答におけるそれらの役割のいくつかの見解を提供する。免疫応答は、応答に関与する細胞サブセットに基づき、先天的および適応応答の両方を含む。例えば、遅延型過敏および細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)活性化のような古典的細胞媒介性機能に関与するＴヘルパー細胞はＴｈ１細胞である。この応答は、抗原(例えば、ウイルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞)に対する身体の先天的応答であり、ＩＦＮ−ガンマの分泌と、それに付随するＣＴＬの活性化をもたらす。
【０００９】
炎症性応答制御への関与の結果として、ＴＬＲは、自己免疫性、感染性疾患、および炎症を含む多くの疾患の病因に役割を有することが示されている(Papadimitraki et al. (2007) J. Autoimmun. 29: 310-18; Sun et al. (2007) Inflam. Allergy Drug Targets 6: 223-35; Diebold (2008) Adv. Drug Deliv. Rev. 60: 813-23; Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol. 5: 975-79; Tse and Horner (2008) Semin. Immunopathol. 30: 53-62; Tobias & Curtiss (2008) Semin. Immunopathol. 30: 23-27; Ropert et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30: 41-51; Lee et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30: 3-9; Gao et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30: 29-40; Vijay-Kumar et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30: 11-21)。
【００１０】
ＣｐＧジヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド類を使用した免疫応答の刺激が検討されている(Zhao, Q. et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 26: 173-82)。その後、ＴＬＲ９が細菌および合成ＤＮＡに存在する非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが検討されている(Hemmi, H. et al. (2000) Nature 408: 740-45)。ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類の他の修飾もまた、ＴＬＲ９を介して作用するおよび免疫応答を調節する能力に影響する(例えば、Zhao et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 51: 173-82; Zhao et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 52: 1537-44; Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7: 495-502; Zhao et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 3453-58; Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 1051-54; Yu et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 2585-88; Yu et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11: 2263-67; and Kandimalla et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9: 807-13参照)。加えて、構造活性相関試験が、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドによりもたらされるものとは異なる特異的免疫応答プロファイルを誘発する合成モチーフおよび新規ＤＮＡベースの構造の同定を可能にしている。(Kandimalla, E.R. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 6925-30; Kandimalla, E.R. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 14303-08; Cong, Y.P. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 310: 1133-39; Kandimalla, E.R. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306: 948-53; Kandimalla, E.R. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 2393-400; Yu, D. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11: 459-64; Bhagat, L. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-61; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30: 4460-69; Yu, D. et al. (2002) J. Med. Chem. 45: 4540-48; Yu, D. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 83-90; Kandimalla, E.R. et al. (2002) Bioconjug. Chem. 13: 966-74; Yu, D.K. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30: 1613-19; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9: 2803-08; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11: 2263-67; Kandimalla, E.R. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9: 807-13; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 2585-88; Putta, M.R. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34: 3231-38)。しかしながら、現在まで、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対する天然リガンドは未知であった。
【００１１】
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が、多くのヌクレオシド類を含むウイルスおよび合成一本鎖ＲＮＡおよび小分子を認識することが示されている(Diebold, S.S., et al. (2004) Science 303: 1529-31)。Dieboldらは、インフルエンザウイルスに対するＩＦＮ−α応答が、インフルエンザゲノムＲＮＡのエンドソーム認識ならびにＴＬＲ７およびＭｙＤ８８の手段によるシグナル伝達を必要とすることを示し、ＴＬＲ７に対するリガンドとしてｓｓＲＮＡを同定した。ある種の合成化合物、イミダゾキノロン類、イミキモド(Ｒ−８３７)、およびレシキモド(Ｒ−８４８)は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のリガンドである(Hemmi, H. et al. (2002) Nat. Immunol 3: 196-200; Jurk, M. et al. (2002) Nat. Immunol 3: 499)。加えて、ある種のグアノシン類似体、例えば７−デアザ−Ｇ、７−チア−８−オキソ−Ｇ(ＴＯＧ)、および７−アリル−８−オキソ−Ｇ(ロキソリビン)が、高濃度でＴＬＲ７を活性化することが示されている(Lee, J. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6646-51)。しかしながら、これらの小分子、例えば、イミキモドは他の受容体を介して作用することも知られている(Schon, M.P. et al. (2006) J. Invest. Dermatol. 126: 1338-47)。
【００１２】
ＴＬＲ７またはＴＬＲ８認識についての特異的ｓｓＲＮＡモチーフが何も知られていないこと、および刺激性ｓｓＲＮＡ分子が広範囲である可能性は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が、自己ＲＮＡおよびウイルスＲＮＡの両方を認識できることを示唆する。最近、ある種のＧＵリッチオリゴリボヌクレオチド類が免疫賦活性であり、Ｎ−[１−(２,３−ジオレオイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート(ＤＯＴＡＰ)または他の脂質試薬と複合体化したときＴＬＲ７およびＴＬＲ８を介して作用することが示された(Heil et al. (2004) Science 303: 1526-29; Lipford et al., 国際公開番号ＷＯ０３／０８６２８０; Wagner et al., 国際公開番号ＷＯ９８／３２４６２)。しかしながら、ＲＮＡ分子が、長年、例えばリボザイムとして、および最近はｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡとして使用されており、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡとして使用されるＲＮＡはＧＵジヌクレオチドを含む。加えて、多くのこれらのＲＮＡ分子が、脂質の存在下、ＴＬＲ刺激を介して免疫応答を誘発することが示されている(Kariko et al. (2005) Immunity 23: 165-75; Ma, Z. et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 330: 755-59)。しかしながら、これらのＲＮＡ分子の不安定さが、多くの領域(例えば、ヒト疾患の予防および処置)でのこれらの分子の使用および適用を妨げている。
【００１３】
リボースまたはデオキシリボース糖を含むオリゴヌクレオチド類およびオリゴデオキシヌクレオチド類が、診断的プロービング、ＰＣＲプライミング、遺伝子発現のアンチセンス阻害、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、およびトール様受容体(ＴＬＲ)に基づく免疫治療剤を含み、これらに限定されない広範な分野で使用されている。最近、多くの刊行物に、免疫調節剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド類の使用、ならびに、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、癌、および感染症のような多くの疾患のための免疫療法適用におけるそれらの単独でのまたはアジュバントとしての使用が記載されている。
【００１４】
ＤＮＡオリゴヌクレオチド類がＴＬＲ９により認識され、一方でＲＮＡオリゴヌクレオチド類がＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８により認識されるとの事実は、ＤＮＡとＲＮＡの間の三次元構造の差異による可能性が高い。しかしながら、ＤＮＡとＲＮＡの間の化学的差異もまた、ＤＮＡを、ＲＮＡよりはるかに化学的および酵素的に安定化している。
【００１５】
ＲＮＡは広範な細胞外リボヌクレアーゼ類(ＲＮａｓｅ)により急速に分解され、それにより、抗原提示細胞に到達する自己ｓｓＲＮＡは、たとえあったとしても、ほんの僅かであることが確実である。核酸類のエキソヌクレアーゼ分解は、ほとんど３'−ヌクレアーゼ消化であり、僅かな割合が５'−エキソヌクレアーゼ作用を介する。エキソヌクレアーゼ消化に加えて、ＲＮＡはまた、ＲＮａｓｅのエンドヌクレアーゼ活性によっても分解され得る。ＲＮＡベースの分子は、現在まで、ヌクレアーゼ類に対する安定性を提供するために脂質と複合体化しなければならない。
【００１６】
これらのリボヌクレアーゼ類は、自己免疫性反応性を妨げる必須機能を提供する一方で、リボヌクレアーゼ類が合成ｓｓＲＮＡおよび天然ｓｓＲＮＡの両方を急速に分解するため、免疫療法に利用するために設計された合成ｓｓＲＮＡ分子にとって、本質的な問題を提起する。このハードルを越えるため、ｓｓＲＮＡ分子の分解に対する保護が、ｓｓＲＮＡのリポソームへの封入、ポリチレンイミンとの縮合、Ｎ−[１−(２,３−ジオレオイルオキシ)−プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート(ＤＯＴＡＰ)のような分子によると複合体化によって試みられている。しかしながら、これらの保護手段は、不安定なままでいるｓｓＲＮＡに適用される二次的手段であり、これらの保護手段の、ｓｓＲＮＡ(天然または合成)のインビボでの効力および免疫調節性活性に対する影響は不明なままである。
【００１７】
Agrawalら(米国特許出願公開番号２００８／０１７１７１２)は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に結合する新規ＳＩＭＲＡ組成物群を記載する。しかしながら、ＴＬＲ７に選択的に結合する化合物を開発する課題が残っている。観念的には、この課題は、併用したときワクチン接種の効果を改善する、または免疫応答の誘発または増強が有益である疾患、例えば癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染症、皮膚障害、アレルギー、喘息、または病原体が原因の疾患を処置および／または予防するような多くの臨床上適切な適用が行われる新規免疫治療剤として作用し得る本質的に安定なＲＮＡを基本とする分子の設計によって解決されるものである。
【発明の概要】
【００１８】
発明の要約
第一の面において、本発明は、ＴＬＲ７を特異的に活性化し、さらに下に定義する新規安定化免疫調節性ＲＮＡ(ＳＩＭＲＡ)化合物、およびＴＬＲ７を介する免疫応答の誘発および／または増強のためのそれらの使用に関する。本発明の新規化学物質は、免疫応答の誘発が実質的により有効であり、分解に対する感受性が実質的により低い、免疫応答誘発および／または増強化合物を提供する。本発明の方法は、免疫療法適用のためのサイトカインおよび／またはケモカインプロファイルを修飾するためのＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの使用を可能にする。
【００１９】
第一の面の他の態様において、本発明は、アジュバントとしてＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を提供する。
【００２０】
第二の面において、本発明は医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の少なくとも１個および生理学的に許容されるまたは薬学的に許容される担体を含む。
【００２１】
第三の面において、本発明は個体における免疫応答を誘発する方法であって、脊椎動物に本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の少なくとも１個を投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
第四の面において、本発明は、免疫応答の誘発および／または増強が有益である疾患または障害、例えば癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染症、皮膚障害、アレルギー、喘息、または病原体が原因の疾患を有する患者の治療的処置方法であって、かかる障害または疾患を有する該患者に、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の少なくとも１個を薬学的有効量で投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
第五の面において、本発明は脊椎動物における免疫応答の誘発および／または増強が有益である疾患または障害、例えば癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、喘息、または病原体が原因の疾患の予防的処置方法であって、かかる障害または疾患に感受性の脊椎動物に、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の少なくとも１個を薬学的有効量で投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
第六の面において、本発明は、サイトカインまたはケモカイン類を産生できる細胞(例えば、免疫細胞、ＰＢＭＣ)を単離する方法であって、かかる細胞を標準細胞培養条件下で培養し、かかる細胞を、単離細胞のサイトカイン類またはケモカイン類の産生または分泌レベルが増加するように、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の少なくとも１個でエクスビボで処置し、処置細胞を、疾患の予防または処置のためにサイトカインまたはケモカイン治療を必要とする患者に投与または再投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明のこの面のさらなる態様において、疾患の予防または処置のためにサイトカインまたはケモカイン治療を必要とする患者に、第六の面の単離した、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ処置細胞を、１種以上の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物および／または１種以上のＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストと組み合わせて投与する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の平行合成のための合成スキーム。ＤＭＴｒ＝４,４'−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を実施例１に従い合成した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
好ましい態様の詳細な記載
本発明は、免疫療法適用のための免疫調節剤としてのオリゴリボヌクレオチド類の治療的使用に関する。具体的に、本発明は、ＴＬＲ７を介して選択的に免疫応答を調節する、インビボ安定性が改善されたＲＮＡベースのオリゴヌクレオチド類(ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物)を提供する。種々の先天的および獲得免疫応答機構を、例えば安定なＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を用いる樹状細胞および他の抗原提示細胞の活性化を介して開始することにより、得られるサイトカインプロファイルは、病原体、感染細胞、または腫瘍細胞の破壊と、抗原特異的抗体およびＣＴＬ応答の発生をもたらす。それ故に、本発明は、各々固有の免疫調節特性を有する、一連のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を提供する。この方法で、免疫応答の範囲および性質は、ある適応に望ましい一連の免疫調節性特性を有するＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を提供することにより、種々の医学的適応のためにカスタマイズできる。本明細書に引用する特許、特許出願、および参考文献は、各々が具体的におよび個々に引用により包含させると示されるのと同定度に引用により本明細書に包含させる。ここに引用する何らかの参考文献の、何らかの教示と本明細書の間に矛盾があるときには、本発明の目的で本明細書が優先される。
【００２８】
本発明は、免疫応答増強のためのＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の使用方法を提供する。かかる方法は、成人および小児ならびに獣医適用における、癌、自己免疫障害、喘息、呼吸器アレルギー、食物アレルギー、皮膚アレルギー、および細菌、寄生虫、およびウイルス感染の処置およびワクチンアジュバントとしての適用を含み、これらに限定されない免疫療法適用への使用が見出される。それ故に、本発明は、さらに、免疫療法のための最適レベルの免疫調節効果を有する新規ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物、ならびにかかる化合物の製造および使用方法を提供する。加えて、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物は、アジュバントとして、または疾患の予防および処置のためのＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の免疫調節効果を消滅させない、該疾患または状態の処置に有用な薬剤と組み合わせて、有用である。
【００２９】
定義
用語“２'−置換リボヌクレオシド”または“２'−置換アラビノシド”は、一般に、ペントース基の２'位のヒドロキシル基が置換され、２'−置換または２'−Ｏ−置換リボヌクレオシドとなったリボヌクレオシド類またはアラビノヌクレオシド類を意味する。ある態様において、かかる置換は、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級ヒドロカルビル基、ハロゲン原子、または６〜１０個の炭素原子を有するアリール基での置換であり、ここで、かかるヒドロカルビル基、またはアリール基は非置換であっても、例えば、ハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、またはアミノ基で置換されていてもよい。本発明のアラビノヌクレオシド類は、アラビノ−Ｇ、アラビノ−Ｃ、アラビノ−Ｕ、アラビノ−Ａを含み、これらに限定されない。２'−Ｏ−置換リボヌクレオシド類または２'−Ｏ−置換−アラビノシド類の例は、２'−アミノ、２'−フルオロ、２'−アリル、２'−Ｏ−アルキルおよび２'−プロパルギルリボヌクレオシド類またはアラビノシド類、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシド類または２'−Ｏ−メチルアラビノシド類、および２'−Ｏ−メトキシエトキシリボヌクレオシド類または２'−Ｏ−メトキシエトキシアラビノシド類を含み、これらに限定されない。
【００３０】
用語“３'”は、方向性で使用されるとき、一般に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の他の領域または位置から３'(糖の３'位置に向かう)の該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の領域または位置を意味する。
【００３１】
用語“５'”は、方向性で使用されるとき、一般に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の他の領域または位置から５'(糖の５'位置に向かう)の該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド内の領域または位置を意味する。
【００３２】
用語“約”は、一般に、その正確な数値が重要ではないことを意味する。例えば、オリゴリボヌクレオチド類中のリボヌクレオシド残基の数は重要ではなく、そして１個または２個少ないリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシド残基、または１個から数個の付加的リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシド残基を有するオリゴリボヌクレオチド類が、上に記載した態様の各々と同等であるとして考慮される。
【００３３】
用語“アジュバント”は、一般に、ワクチンまたは抗原のような免疫剤に追加したとき、該混合物への暴露によるレシピエント宿主における該薬剤に対する免疫応答を増強または強化する物質を意味する。
【００３４】
用語“気道炎症”は、一般に、喘息を含む、感染性アレルゲンが原因の呼吸管の炎症を意味する。
【００３５】
用語“アレルゲン”は、一般に、物質への暴露によりアレルギー性応答を誘発する、分子、通常タンパク質の抗原または抗原性部分を意味する。典型的に対象は、例えば、膨疹および発赤試験により、または当分野で既知の任意の方法により示されるように、アレルゲンに対してアレルギーである。分子は、該分子への暴露によりほんの僅かな割合の対象しかアレルギー性(例えば、ＩｇＥ)免疫応答を誘発しなくても、アレルゲンと言う。
【００３６】
用語“アレルギー”は、一般に、食物アレルギー、呼吸器アレルギー、および皮膚アレルギーを含み、これらに限定されない。
【００３７】
用語“抗原”は、一般に、抗体により、またはＴ細胞抗原受容体により認識され、選択的に結合させる物質を意味する。抗原はペプチド類、タンパク質類、ヌクレオシド類、ヌクレオチド類、およびそれらの組合せを含み得て、これらに限定されない。抗原は天然でも合成でもよく、一般的に、該抗原に特異的である免疫応答を誘発する。
【００３８】
用語“自己免疫障害”は、一般に、“自己”抗原が免疫系による攻撃を受ける障害を意味する。
【００３９】
３'または５'分解の遮断または“キャップ”もしくは“キャッピング”は、オリゴリボヌクレオチドの３'または５'端が、ヌクレアーゼ分解(例えば、３'−エキソヌクレアーゼ分解)の阻害に十分な他の分子(例えば、リンカーまたは他の非ＲＮＡヌクレオチド)に結合していることを意味する。
【００４０】
用語“担体”は、一般に、全ての賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、マイクロスフェア、リポソーム封入、または医薬製剤への使用が当分野で既知の他の物質を含む。担体、賦形剤、または希釈剤の特性は、特定の適用のための投与経路によることは当然である。これらの物質を含む薬学的に許容される製剤の製造は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００４１】
用語“共投与”は、一般に、免疫応答を調節するために十分に短い間隔での少なくとも２種の異なる物質の投与を意味する。共投与は少なくとも２種の異なる物質の同時投与を含む。
【００４２】
用語“相補性”は、一般にある核酸とハイブリダイズする能力を有することを意味する。かかるハイブリダイゼーションは、通常、好ましくはワトソン−クリックまたはフーグスティーン塩基対を形成するための、相補鎖間の水素結合の結果であるが、他の形態の水素結合、ならびに塩基スタッキングもハイブリダイゼーションをもたらし得る。
【００４３】
用語“免疫調節性オリゴリボヌクレオチド”は、一般に、魚、鳥、または哺乳動物のような脊椎動物に応答したとき、免疫応答を誘発するか、または抑制するオリゴリボヌクレオチドを意味する。
【００４４】
用語“と組み合わせて”は、一般に、一患者における同じ疾患の処置の経過中であり、そしてＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物と、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の免疫調節効果を消滅させない、該疾患または状態の処置に有用な薬剤の投与を含む。かかる投与は、同時投与または共投与を含む任意の順番であってよく、ならびに時間的に数秒から最長数日離れ、または数分から数日離れ、または数分から数時間離れていてよい。かかる組合せ処置はまた、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物および／または独立して該薬剤の１回を超える投与を含み得る。ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物および該薬剤の投与は、同じ投与経路でも異なる投与経路でもよい。
【００４５】
用語“個体”または“対象”は、一般に、ヒトのような哺乳動物を意味する。哺乳動物は、一般に、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、およびウサギを含み、これらに限定されない。
【００４６】
用語“線状合成”は、一般に免疫調節性オリゴリボヌクレオチドの一端から始まり、他端へと直線的に進む合成を意味する。線状合成は、免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類への同一のまたは同一ではない(長さ、塩基組成および／または取り込まれている化学修飾の点で)モノマー単位の取り込みを可能にする。
【００４７】
用語“リンカー”は、一般に、オリゴリボヌクレオチドに糖、塩基、または主鎖を介して、共有または非共有結合の方法で結合できる全ての基を意味する。リンカーは、２個以上のヌクレオシド類の結合に使用でき、またはオリゴリボヌクレオチド内の５'および／または３'末端ヌクレオチドの結合に使用できる。かかるリンカーは、非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオチドリンカーのいずれでもよい。
【００４８】
用語“修飾ヌクレオシド”は、一般に、修飾ヘテロ環塩基、修飾糖部分、またはそれらの任意の組合せを含むヌクレオシドを意味する。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、ここに記載する非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。本発明の目的で、修飾ヌクレオシド、ピリミジンまたはプリン類似体または天然に存在しないピリミジンまたはプリンを互換的に使用でき、天然に存在しない塩基および／または天然に存在しない糖基を含むヌクレオシドと言う。本発明の目的で、塩基は、グアニン、シトシン、アデニン、またはウラシルでないならば非天然であると見なす。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、ＴＬＲ７活性を妨害することなく安定性を改善するために、オリゴリボヌクレオチドの選択した位置に置き換えて入れることができる２'−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、または２'−デオキシ−２'−置換−アラビノシドである。
【００４９】
用語“調節”または“刺激”は、一般に、応答の誘発および／または増強に由来し得る応答または応答における質的差異のような変化を意味する。
【００５０】
用語“非ヌクレオチドリンカー”は、一般に、共有または非共有結合によりオリゴリボヌクレオチドに結合できる、ヌクレオチド架橋以外の化学基を意味する。好ましくはかかる非ヌクレオチドリンカーは、約２Å〜約２００Å長であり、ｃｉｓ配向でもｔｒａｎｓ配向でもよい。
【００５１】
用語“ヌクレオチド架橋”は、一般に、隣接ヌクレオシド間の、ホスフェート、非ホスフェート、荷電、または中性基(例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート)から成る、糖を介して２個のヌクレオシドを結合させる(例えば、３'−３'、２'−３'、２'−５'、３'−５')化学架橋を意味する。
【００５２】
用語“ペプチド”は、一般に、該ペプチドがハプテンであってもなくても、生物学的応答、例えば、抗体産生またはサイトカイン活性に影響を与えるために十分な長さおよび組成である、ポリペプチド類を意味する。用語“ペプチド”は、修飾アミノ酸類(天然に存在しても存在しなくても)を含んでよく、ここで、かかる修飾は、リン酸化、グリコシル化、ペグ化、脂質化(lipidization)、およびメチル化を含む。
【００５３】
用語“薬学的に許容される”または“生理学的に許容される”は、一般に、本発明の化合物の有効性を妨げず、細胞、細胞培養、組織、または生物のような生物学的系と適合する物質を意味する。好ましくは、生物学的系は脊椎動物のような生存生物である。
【００５４】
用語“薬学的有効量”は、一般に、有益な結果のような所望の生物学的作用をもたらすのに十分な量を意味する。それ故に、“薬学的有効量”はそれが投与される状況による。薬学的有効量を、１回以上の予防的または治療的投与で投与してよい。
【００５５】
用語“ＳＩＭＲＡ”は、一般に安定化免疫調節性ＲＮＡ化合物を意味し、ここで、該化合物は、一本鎖ＲＮＡ(ｓｓＲＮＡ)および／または二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)、および３'末端を保護または安定化するための修飾(例えば、３'分解を遮断することによりまたは３'末端をキャッピングすることによりまたは２個以上のオリゴリボヌクレオチドの３'末端を連結することにより)を含んでよいが、ＳＩＭＲＡは、非修飾オリゴリボヌクレオチドよりインビボで安定であるか、または安定であるはずであり、それ故に、その免疫調節性能に影響する。ＳＩＭＲＡは修飾オリゴリボヌクレオチド類を含み得る。ＳＩＭＲＡ化合物は、オリゴリボヌクレオチドの安定性をさらに改善するために、その５'末端(例えば、５'分解を遮断することによりまたは５'末端をキャッピングすることにより)にも修飾を含んでよい。ＳＩＭＲＡは直鎖でも分枝鎖でもよく、核酸類は、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、または別の架橋を介して連結された、リボヌクレオシドのポリマーである。ＳＩＭＲＡはリボース糖残基またはその誘導体に共有結合したプリン(アデニン(Ａ)またはグアニン(Ｇ)またはその誘導体(例えば、７−デアザ−Ｇ、アラビノ−Ｇおよびアラビノ−Ａ))またはピリミジン(シトシン(Ｃ)またはウラシル(Ｕ)、またはその誘導体(例えば、アラビノ−Ｃおよびアラビノ−Ｕ))塩基を含み得る。
【００５６】
用語“処置”は、一般に、症状の軽減、疾患進行の遅延または改善を含み得る、有益なまたは望む結果を得るための方法を意味する。
【００５７】
用語“ウイルス疾患”は、一般に、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、および帯状疱疹を含み、これらに限定されない、その病原因子としてウイルスを有する疾患を意味する。
【００５８】
第一の面において、本発明は新規ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を提供する。本出願は、免疫調節性オリゴリボヌクレオチドの３'末端を保護するための修飾(例えば、３'分解の遮断または３'末端のキャッピングによるまた２個以上のオリゴリボヌクレオチドの３'末端の連結による)が、その免疫調節性能に驚くほど影響することを示す。加えて、この保護がオリゴリボヌクレオチド類の安定性を驚くほど改善し、脂質会合または他の保護手段の必要性を無くすことが確認された。さらに、３'末端に追加したまたは組み合わせた５'分解の遮断または５'末端のキャッピングもまたオリゴリボヌクレオチドの安定性を改善できる。
【００５９】
本発明において、新規ＳＩＭＲＡ化合物でのＴＬＲ７の活性化および独特の免疫応答(例えば、サイトカインおよび／またはケモカインプロファイルの変化)の誘発が証明される。それ故に、本発明は、ＴＬＲ７サイトカインおよび／またはケモカインの活性化を介して、それに関連するプロファイルが、免疫調節性オリゴリボヌクレオチドの一部として修飾塩基、修飾糖類、主鎖、リンカー、結合、および／またはキャップを含む修飾化学構造を使用して調節できることを示す。
【００６０】
一つの態様において、本発明は、３'末端で、またはヌクレオシド間架橋または官能化核酸塩基または糖を介して非ヌクレオチドリンカーに連結した少なくとも２個のＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドを含む免疫調節性化合物を提供する。本発明のかかる態様は、少なくとも１個の利用できる５'末端を有してよく、それはキャップをしてもキャップをしなくてもよい。この構造が、脂質会合または他の保護の必要なしに、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物にさらなる安定性(例えば、エキソヌクレアーゼ活性の阻害)を提供することが確認された。“利用できる５'末端”は、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの５'末端が、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物のＴＬＲ７を介する免疫応答の調節を妨げる方法で修飾されていないことを意味する。
【００６１】
本発明のこの面の他の態は、少なくとも２個のオリゴリボヌクレオチド類を含み、ここで、本免疫調節性化合物は、表２の式Ｉ〜IVで示される構造を有し、これに限定されない。
【表２】
【００６２】
ドメインＡ、Ｂ、およびＣは、独立して約２〜約３５リボヌクレオチド長、およびある態様において約２〜約２０、または約２〜約１２、または約２〜約１１、または約２〜約８リボヌクレオチド長であり得る。ドメインＡ、Ｂ、およびＣは同一であっても、同一でなくてもよい。ドメインＡ、Ｂ、およびＣは、独立して、自己相補性ドメイン、ホモまたはヘテロリボヌクレオチド配列、またはリンカーを有するまたは有さない５'−３'または２'−５'ＲＮＡであり得る。式IVに使用される、“ｎ”は１から無限までである。
【００６３】
“Ｘ”は、３'または５'架橋、リン酸基、核酸塩基、非ＲＮＡヌクレオチドを介してよいドメインＡ、Ｂ、および／またはＣを結合またはキャッピングするリンカー、または脂肪族、芳香族性、アリール、環状、キラル、キラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ〜トリまたはヘキサポリエチレングリコール、またはヘテロ環基、またはそれらの組合せであり得る非ヌクレオチドリンカーである。
【００６４】
さらなる態様において、本発明は、非ヌクレオチドリンカーにより連結された少なくとも２個のオリゴリボヌクレオチドを含むＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物であり、ここで、これらの免疫調節性オリゴリボヌクレオチドの配列は、少なくとも部分的に自己相補性である。これらのオリゴリボヌクレオチドの相補性配列が分子間水素結合を可能にし、それによりオリゴリボヌクレオチドの二次構造を取ることを可能にする。付加的オリゴリボヌクレオチドを一緒に連結し、それにより、例えば式IVのような、本発明のオリゴリボヌクレオチドの鎖、または多量体を形成できる。
【００６５】
同様の考察が、異なる塩基配列の免疫調節性オリゴリボヌクレオチド間の分子間塩基対形成に当てはまる。それ故に、複数の免疫調節性オリゴリボヌクレオチドを一緒に使用するとき、この複数の免疫調節性オリゴリボヌクレオチドは、必須ではないが、互いに少なくとも部分的に相補性の配列を含んでよい。一つの態様において複数の免疫調節性オリゴリボヌクレオチドは、第一配列を有する免疫調節性オリゴリボヌクレオチドおよび第二の配列を有する免疫調節性オリゴリボヌクレオチドを含み、ここで、第一の配列および第二の配は、少なくとも４０％または少なくとも５０％相補性である。例えば、少なくとも５０％相補性である２個の８量体の場合、それらは、４個、５個、６個、７個、または８個のＧ−Ｃ、Ａ−Ｕ、および／またはＧ−Ｕ不安定塩基対を形成し得る。かかる塩基対は、必ずしもではないが、相補性免疫調節性オリゴリボヌクレオチドのいずれかの末端に位置する塩基を含む。相補性の程度は、複数免疫調節性オリゴリボヌクレオチド間のアライメントに依存し得て、かかるアライメントは、一または多ヌクレオシドオーバーハングを有しても有さなくてもよい。他の態様において、相補性の程度は少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％である。
【００６６】
当業者には認識される通り、記載した免疫調節性化合物は、複数ドメインの配列が分子間水素結合を可能にする相補性であるため、二次構造を有し得る。さらに、表２の式IIIおよびIVに示される通り、付加的な連結されたＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドが分子間水素結合を介して結合でき、それにより鎖、または多量体を形成し、ここで、任意の数の架橋したＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドを取り込んでよい。
【００６７】
他の態様において、本発明は、３'または５'末端で、またはヌクレオシド間架橋または官能化核酸塩基または糖を介して非ヌクレオチドリンカーに連結した少なくとも２個のＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該リンカー(例えば、キャップ)が少なくとも１個の５'末端に結合している、免疫調節性化合物を提供する。この構造は、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物にさらなる安定性(例えば、エキソヌクレアーゼ活性の阻害)を与えることが確認された。ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの５'末端は、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物のＴＬＲ７を介する免疫応答の調節を妨げる方法で修飾されていない。
【００６８】
ある態様において、オリゴリボヌクレオチド類は、各々独立して約２〜約３５個のリボヌクレオシド残基を有する。それ故に、ある態様においてオリゴリボヌクレオチドは、独立して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５リボヌクレオチド長であり得る。好ましくは、オリゴリボヌクレオチドは約４〜約３０個のリボヌクレオシド残基、より好ましくは約４〜約２０個のリボヌクレオシド残基または約４〜約１１個のリボヌクレオシド残基である。ある態様において、免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類は、約１〜約１８個、または約１〜約１１個、または約５〜約１４個のリボヌクレオシド残基を有するオリゴリボヌクレオチド類を含む。ある態様において、オリゴリボヌクレオチド類の１個以上は、１１個のリボヌクレオチド類または約８〜約１４個のリボヌクレオチド類または約１０〜約１２個のリボヌクレオチド類を有する。免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類に関連して、好ましい態様は、約１〜約３５個のリボヌクレオチド類、好ましくは約５〜約２６個のリボヌクレオチド類、より好ましくは約１３〜約２６個のリボヌクレオチド類を含む。好ましくは、免疫調節性オリゴリボヌクレオチドは、少なくとも１個のホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートリボヌクレオシド間架橋を有する。
【００６９】
例示的態様において、各リボヌクレオシド単位は、ヘテロ環塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２'−デオキシ−２'−置換アラビノース、２'−Ｏ−置換リボースまたはアラビノースまたはヘキソース糖基を含む。リボヌクレオシド残基は、多数の既知のリボヌクレオシド間結合のいずれかによって結合できる。かかるリボヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル(Ｐｏ)、ホスホロチオエート(Ｐｓ)、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンリボヌクレオシド間結合、またはそれらの任意の組合せを含み、これらに限定されない。
【００７０】
加えて、例示的オリゴリボヌクレオチドを、交互のホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合(例えば、Ｎ１ＰｏＮ２ＰｓＮ３ＰｏＮｎＰｓ、ここで、Ｎは本発明のリボヌクレオシドである)、ホスホジエステル結合区画とその後のホスホロチオエート結合区画(例えば、Ｎ１ＰｏＮ２ＰｏＮ３ＰｏＮｎＰｏＮ１ＰｓＮ２ＰｓＮ３ＰｓＮｎＰｓ、ここで、Ｎは本発明のリボヌクレオシドである)、およびホスホロチオエート結合区画とその後のホスホジエステル結合区画(例えば、Ｎ１ＰｓＮ２ＰｓＮ３ＰｓＮｎＰｓＮ１ＰｏＮ２ＰｏＮ３ＰｏＮｎＰｏ、ここで、Ｎは本発明のリボヌクレオシドである)を含み、これらに限定されない、かかるリボヌクレオシド間結合の任意の組合せで結合してよい。
【００７１】
本リボヌクレオチドについてのコンジュゲーション可能な位置を下の式Ｖで示し、式中、Ｂはヘテロ環塩基を意味する。
【化１】
【００７２】
本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物は、天然に存在するリボヌクレオシド類、修飾リボヌクレオシド類、またはそれらの混合物を含み得る。
【００７３】
本発明において、新規ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物は、ある種の化学修飾を取り込むことによりヒトＴＬＲ７により認識され、免疫応答の誘発をもたらす。かかる化学修飾は、グアニン類似体、例えば７−デアザ−Ｇ、ａｒａ−Ｇ、６−チオ−Ｇ、イノシン、Ｉｓｏ−Ｇ、ロキソリビン、ＴＯＧ(７−チオ−８−オキソ)−Ｇ、８−ブロモ−Ｇ、８−ヒドロキシ−Ｇ、５−アミノホルマイシンＢ、オキソホルマイシン、７−メチル−Ｇ、９−ｐ−クロロフェニル−８−アザ−Ｇ、９−フェニル−Ｇ、９−ヘキシル−グアニン、７−デアザ−９−ベンジル−Ｇ、６−クロロ−７−デアザグアニン、６−メトキシ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザ−Ｇ(ＰＰＧ)、２−(ジメチルアミノ)グアノシン、７−メチル−６−チオグアノシン、８−ベンジルオキシグアノシン、９−デアザグアノシン、および１−(Ｂ−Ｄ−リボフラノシル)−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンを含み、これらに限定されない。化学修飾はまた、アデニン類似体、例えば９−ベンジル−８−ヒドロキシ−２−(２−メトキシエトキシ)アデニン、２−アミノ−Ｎ２−Ｏ−、メチルアデノシン、８−アザ−７−デアザ−Ａ、７−デアザ−Ａ、ａｒａ−Ａ、ビダラビン、２−アミノアデノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、８−アザアデノシン、および５−ヨードツベルシジンも含み、これらに限定されない。化学修飾はまた、シトシンおよびウラシル類似体、例えばシュードウリジン、ａｒａ−Ｃ、ａｒａ−Ｕ、５−メチルシチジン、４−チオウリジン、Ｎ４−エチルウリジン、ゼブラリン、５−アミノアリルウリジン、Ｎ３−メチルウリジン、および５−フルオロウリジンも含み、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の“免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類”は、３'または２'末端で、または官能化リボースまたは官能化リボ核酸塩基で非ヌクレオチドまたはヌクレオチドリンカーを介して共有結合的にまたは非共有結合的に連結した、少なくとも２個のオリゴリボヌクレオチドを含むＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物である。非共有結合的架橋は、静電相互作用、疎水性相互作用、π−スタッキング相互作用、および水素結合を含み、これらに限定されない。
【００７５】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは、表３に記載したものを含んでよく、これらに限定されない。
【表３】
【００７６】
ある態様において、小分子リンカーは、グリセロールまたは式ＨＯ−(ＣＨ２)ｏ−ＣＨ(ＯＨ)−(ＣＨ２)ｐ−ＯＨ(式中、ｏおよびｐは独立して１〜約６、１〜約４、または１〜約３の整数である)のグリセロールホモログである。ある他の態様において、小分子リンカーは１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。かかる誘導体のいくつかは、式ＨＯ−(ＣＨ２)ｍ−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ２−ＮＨＣ(Ｏ)−(ＣＨ２)ｍ−ＯＨ(式中、ｍは０〜約１０、０〜約６、２〜約６、または２〜約４の整数である)を有する。
【００７７】
本発明に従ういくつかの非ヌクレオチドリンカーは、表２の式IIにより示される通り、２個を超えるオリゴリボヌクレオチドの結合を可能にする。例えば、小分子リンカーグリセロールは、オリゴリボヌクレオチドが共有結合し得る３個のヒドロキシル基を有する。本発明のいくつかの免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類は、それ故、３'末端で非ヌクレオチドリンカーに連結した２個を超えるオリゴリボヌクレオチド類(例えば、ドメインＣなど、付加的ドメインは、ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤについて上に定義したオリゴリボヌクレオチド類を含む)を含む。
【００７８】
本発明の免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類は、好都合に、自動合成装置およびホスホロアミデート法を使用して合成できる。ある態様において、免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類は、線状合成法により合成する。別の合成方法は、合成が中央リンカー部分から外側へと進む“平行合成”である(図１参照)。米国特許番号５,９１２,３３２に記載の通り、固体支持体結合リンカーを平行合成に使用できる。あるいは、普遍的固体支持体(例えばホスフェート結合制御細孔ガラス(phosphate attached controlled pore glass))支持体を使用できる。
【００７９】
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類の平行合成はいくつかの点で線状合成より有利である：(１)平行合成は同一モノマー単位の取り込みを可能にする；(２)線状合成と異なり、両方の(または全ての)モノマー単位を同時に合成でき、それにより、合成工程数および合成に必要な時間は、モノマー単位の合成と同じである；そして(３)合成工程の減少により、最終免疫調節性オリゴリボヌクレオチド生成物の純度および収率が改善される。
【００８０】
合成プロトコールの最後に、免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類を、修飾ヌクレオシドが取り込まれたら、好都合なことに濃アンモニア溶液で、またはホスホロアミデート供給社の推奨通り脱保護できる。生成物免疫調節性オリゴリボヌクレオチドは、好ましくは逆相ＨＰＬＣにより精製し、脱トリチル化し、脱塩し、そして透析する。
【００８１】
表４は、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を示す。特にことわらない限り、全てのヌクレオシド類はリボヌクレオシド類であり、そして全ての架橋はホスホロチオエートである。
【表４】
【表５】
Ｇ１＝７−デアザ−Ｇ；Ｘ＝１,２,３−プロパンジオール
【００８２】
第二の面において、本発明は、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。
【００８３】
第三の面において、本発明は、脊椎動物においてＴＬＲ７仲介免疫応答を起こす方法であって、該脊椎動物に本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を投与することを含む、方法を提供する。ある態様において、脊椎動物は哺乳動物である。好ましい態様において、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を、免疫調節の必要な脊椎動物に投与する。
【００８４】
第四の面において、本発明は、疾患または障害を有する患者の治療的処置方法であって、該患者に本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を投与する方法を提供する。種々の態様において、処置する疾患または障害は、癌、自己免疫障害、感染性疾患、気道炎症、炎症性障害、アレルギー、喘息、または病原体が原因の疾患を含み、これらに限定されない、免疫調節が望ましい可能性があるものである。病原体は細菌、寄生虫、真菌、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。
【００８５】
第五の面において、本発明は疾患または障害の予防方法であって、該患者に本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を投与する方法を提供する。種々の態様において、予防する疾患または障害は、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、アレルギー、喘息、または病原体が原因の疾患を含み、これらに限定されない、免疫調節が望ましい可能性があるものである。病原体は細菌、寄生虫、真菌、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。
【００８６】
第六の面において、本発明は、障害の予防または処置方法であって、サイトカイン類またはケモカイン類を産生できる細胞キャップ(免疫細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＰＢＭＣ、ｐＤＣおよびリンパ系細胞を含み、これらに限定されない)を単離し、かかる細胞を標準細胞培養条件下で培養し、かかる細胞を、単離細胞のサイトカイン類またはケモカイン類産生または分泌レベルが増加するようにＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡでエクスビボで処置し、処置細胞を、疾患の予防または処置のためにサイトカインまたはケモカイン治療を必要とする患者に投与または再投与することを含む、方法を提供する。本発明のこの面は、活性化免疫細胞を産生するための標準養子細胞免疫療法技術に従う。
【００８７】
本発明のこの面のある態様において、サイトカイン類またはケモカイン類を産生できる細胞を、疾患または障害を有しているまたは有していない対象から単離し得る。かかる単離は、同定および選択を含む場合があり、下の具体的実施例に記載したものを含む、標準細胞単離法を使用して行い得る。かかる単離細胞を、標準細胞培養法に従い、標準細胞培養条件を使用して培養し、これは、下の具体的実施例に記載した培養法および条件を含み得る。本発明のこの態様のさらなる面において、単離細胞を、少なくとも１個の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの存在下、かかる１個以上の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの非存在下で培養した単離細胞と比較して、サイトカイン類および／またはケモカイン類の産生および／または分泌の誘発、増加または向上に十分な量および時間で、培養する。かかる時間は秒単位から、分単位、時間単位、日単位までである。かかる単離したＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ処置細胞は、ドナーへの再投与、または第二の組織学的に適合する患者への投与により、有用性を見ることができ、ここで、かかるドナーまたは第二の患者は、サイトカイン類および／またはケモカイン類の産生および／または分泌の誘発、増加または向上を必要とする。例えば、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、アレルギー、喘息または病原体が原因の疾患を有するドナーへの再投与または第二の患者への投与。かかる再投与または投与は、カテーテルまたは注射投与または任意の他の有効な経路を含む、多様な方式を使用して達成し得る。本発明のこの面はまた、免疫応答を開始する能力が限られているかまたは不完全であり得るまたは免疫無防備状態である患者(例えば、ＨＩＶに感染している患者および骨髄移植患者)への有用性も見ることができる。本発明のこの面はまた、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの、単離したＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ処置細胞を投与したまたは再投与した患者への投与と組み合わせても有用性を見ることができる。
【００８８】
本発明の方法の全てにおいて、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物は、単独で、またはＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の免疫調節効果を消滅させない、該疾患または状態の処置または予防に有用な他の薬剤と組み合わせて、直接免疫調節効果を生じることにより多様に作用し得る。本発明の何れの方法においても、疾患または状態の処置または予防に有用な薬剤は、ワクチン、抗原、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド類、ＴＬＲアゴニスト(例えば、ＴＬＲ９のアゴニストおよび／またはＴＬＲ７のアゴニストおよび／またはＴＬＲ８のアゴニスト)、化学療法剤(伝統的化学療法剤および近代的標的治療剤)、標的治療剤、活性化細胞、ペプチド類、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ペプチドワクチン、タンパク質ワクチン、ＤＮＡワクチン、アジュバント、および共刺激分子(例えば、サイトカイン類、ケモカイン類、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド類または修飾アミノ酸を含むペプチド類)、またはそれらの組合せを含み、これらに限定されない。例えば、癌の処置において、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を、１種以上の化学療法化合物、標的治療剤および／またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与することが意図される。あるいは、本薬剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含み得る。あるいは、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物に対する免疫応答の特性または強度を高めるために、他のアジュバントと組み合わせて投与できる。
【００８９】
本発明の方法の全てにおいて、単独で、または何れかの他の薬剤と組み合わせた本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物の投与は、非経腸、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、皮膚パッチ、または点眼剤または洗口剤形態を含み、これらに限定されない任意の経路により行うことができる。本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物の治療組成物の投与は、薬学的有効量を使用する既知方法を使用して、疾患の症状を軽減する、または疾患の疾病指示マーカーを低下させるのに十分な期間行うことができる。例えば、疾患および／または障害の処置のための薬学的に有効量の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物は、症状を軽減するまたは減らす、または腫瘍、癌、または細菌、ウイルス、または真菌感染を遅延もしくは軽減するために必要な量である。ワクチンアジュバントとして使用するための薬学的有効量は、ワクチンまたは抗原に対する対象の免疫応答をブーストするのに有用な量である。併用する抗原に対する免疫応答を調節する組成物の投与に関連して、薬学的に有効量の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物は、その抗原を単独で投与したときに得られる免疫応答と比較して、所望の調節を達成するのに十分な量である。特定の適用についての有効量は処置する疾患または状態、投与する特定のオリゴヌクレオチド、対象の体格または疾患または状態の重症度のような因子によって変わり得る。当業者は、過度の実験を要することなく、特定のオリゴヌクレオチドの薬学的有効量を経験的に決定できる。
【００９０】
全身投与するとき、治療組成物は、好ましくは本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物の血中濃度を約０.０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルに到達させるのに十分な投与量で投与する。局所投与については、これより遙かに低濃度で有効であり得て、かつ遙かに高い濃度が許容され得る。好ましくは、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物の総投与量は、約０.００１mg／患者／日〜約２００mg／kg体重／日の範囲である。治療的有効量の本発明の治療組成物の１種以上を、同時に、または連続的に一処置として個体に投与することが望ましいことがある。
【００９１】
本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物は、場合により１種以上のアレルゲンおよび／または抗原(自己または外来)、免疫原性タンパク質またはペプチド、例えばキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、コレラ毒素Ｂサブユニット、または任意の他の免疫原性担体タンパク質と連結してよい。本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を、ＴＬＲアゴニスト(例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９のアゴニスト)、フロイント不完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ(ＭＰＬ)、ミョウバン、ならびにＱＳ−２１およびイミキモドを含むサポニン類、またはそれらの組合せを含み、これらに限定されない他の化合物(例えば、アジュバント)と組み合わせても使用できる。
【００９２】
本発明のこの面の方法は、免疫系の試験モデルとして有用である。本方法はまた、ヒトまたは動物疾患の予防または治療的処置にも有用である。例えば、本方法は、小児、成人、および獣医用ワクチン適用に有用である。
【００９３】
以下の実施例は、本発明のある種の例示的態様をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００９４】
実施例１
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド合成
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類を、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置でのホスホロアミデート化学を用いて、化学合成した。Ｎ−アセチル保護した(Ｕ以外)２'−Ｏ−ＴＢＤＭＳ ＲＮＡモノマー、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵをSigma-Aldrichから購入した。７−デアザ−Ｇ、イノシンをChemGenes Corporationから購入した。０.２５Ｍ ５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、ＰＡＣ−無水物キャップＡおよびキャップＢをGlen Researchから購入した。３％トリクロロ酢酸(ＴＣＡ)のジクロロメタン(ＤＣＭ)溶液および５％３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン−１,１−ジオキシド(Beaucage reagent)は社内で製造した。
【００９５】
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類を１−２μM規模で標準ＲＮＡ合成プロトコールを使用して合成した。
【００９６】
開裂および塩基脱保護
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類を固体支持体から開裂し、エキソ−環状−アミン類の保護基をメチルアミンおよび水酸化アンモニウム溶液中で除去した。得られる溶液をSpeedVacで完全に乾燥させた。
【００９７】
ＩＥ ＨＰＬＣ精製
免疫調節性オリゴリボヌクレオチド類をイオン交換ＨＰＬＣにより精製した。Dionex DNAPac 100カラムを使用。粗免疫調節性オリゴリボヌクレオチド溶液をＨＰＬＣに注入した。上記勾配を行い、フラクションを回収した。９０％を超えて所望の生成物を含む全フラクションを混合し、溶液をほとんど乾固するまでRotoVapで蒸発させた。無ＲＮＡｓｅ水を添加して、最終体積１０mlとした。
【００９８】
Ｃ−１８逆相脱塩
Watersから購入したC-18 Sep-Pakカートリッジを、１０mlのアセトニトリル、続いて１０mlの０.５Ｍ 酢酸ナトリウムをカートリッジを通すことにより洗浄した。次いで、１０mlの免疫調節性オリゴリボヌクレオチド溶液をカートリッジに載せた。１５mlの水を使用して、塩を洗い流した。免疫調節性オリゴリボヌクレオチドを、最後に１mlの５０％アセトニトリルの水溶液を使用して溶出した。溶液をSpeedVacに３０分間入れた。残った溶液を０.２ミクロン・フィルターを通して濾過し、凍結乾燥させた。固体を無ＲＮＡｓｅ水に再溶解して、所望の濃度とした。最終溶液を０℃未満で貯蔵した。オリゴリボヌクレオチド類を、キャピラリー電気泳動、イオン交換ＨＰＬＣ、およびＰＡＧＥ分析により純度を分析し、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析で分子量を分析した。
【００９９】
実施例２
ＴＬＲ発現ＨＥＫ２９３細胞を用いるアッセイプロトコール
ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３ＸＬ／ヒトＴＬＲ７またはＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３ＸＬ／ヒトＴＬＲ８細胞(InvivoGen, San Diego, CA)を、４８ウェルプレートで、１０％熱不活性化ＦＢＳ添加２５０μl／ウェルＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【０１００】
レポーター遺伝子形質転換
ヒトＴＬＲ７またはＴＬＲ８を安定に発現するＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３ＸＬ細胞(InvivoGen, San Diego, CA)を、４８ウェルプレートで、１０％熱不活性化ＦＢＳ添加２５０μl／ウェルＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。８０％コンフルエンスで、培養物を、培養培地中４μl／mlのリポフェクタミン(Invitrogen, Carlsbad, CA)の存在下、４００ng／mlのＳＥＡＰ(分泌型のヒト胚アルカリホスファターゼ)レポータープラスミド(pNifty2-Seap)(Invivogen)で一過性にトランスフェクションした。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを、別々に無血清培地で希釈し、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、希釈したＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物を室温で２０分間インキュベートした。１００ngのプラスミドＤＮＡおよび１μlのリポフェクタミンを含む２５μl量のＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を、細胞培養プレートの各ウェルに添加し、培養を４時間続けた。
【０１０１】
ＩＭＯ処置
トランスフェクション後、培地を新鮮培養培地に変えた。ヒトＴＬＲ７またはＴＬＲ８を発現するＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９ＸＬ細胞を、５０μg／mlの本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡまたはＰＢＳコントロールで刺激し、培養を１８〜２０時間続けた。ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ処置の最後に、３０μlの培養上清を各処置から取り、製造者のプロトコールに従うＳＥＡＰアッセイに使用した(InvivoGen)。
【０１０２】
ＳＥＡＰ(分泌型のヒト胚アルカリホスファターゼ)アッセイ
簡単に言うと、培養上清をｐ−ニトロフェニル(phynyl)ホスフェート基質とインキュベートし、黄色の発色をプレートリーダーで４０５nmで測定した。
【０１０３】
ヒトＴＬＲ７およびＴＬＲ８発現ＨＥＫ２９３細胞中のＴＬＲ７およびＴＬＲ８活性を表５に示す。表５に示すデータは、ＨＥＫ２９３細胞を５０μg／mlの本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢレベルをＳＥＡＰ(分泌型のヒト胚アルカリホスファターゼ)アッセイを使用して測定して作成した。データは、ＮＦ−κＢ活性のＰＢＳコントロールに対する増加倍率として示す。(Putta, M.R. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34: 3231-38)。表５に示すデータは、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡの投与が明確かつ特異的ＴＬＲ７仲介免疫応答プロファイルを生じさせることを示す。
【表６】
Ｇ１＝７−デアザ−Ｇ；Ｘ＝１,２,３−プロパンジオール(グリセロール)
【０１０４】
実施例３
ヒト細胞培養プロトコール
ヒトＰＢＭＣ単離
新たに採血した健常ボランティアの血液(CBR Laboratories, Boston, MA)由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Ficoll密度勾配遠心法(Histopaque-1077, Sigma)により単離した。
【０１０５】
ヒトｐＤＣ単離
新たに採血した健常ボランティアの血液(CBR Laboratories, Boston, MA)由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Ficoll密度勾配遠心法(Histopaque-1077, Sigma)により単離できる。ｐＤＣを、製造者の指示に従いＢＤＣＡ４細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を使用するポジティブ選択によりＰＢＭＣから単離できる。
【０１０６】
ヒトｍＤＣ単離
新たに採血した健常ボランティアの血液(CBR Laboratories, Boston, MA)由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Ficoll密度勾配遠心法(Histopaque-1077, Sigma)により単離できる。骨髄樹状細胞(ｍＤＣ)を、製造者の指示に従いＢＤＣＡ４細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を使用するポジティブ選択によりＰＢＭＣから単離できる。
【０１０７】
マルチプレックスサイトカインアッセイ
ヒトＰＢＭＣを、５×１０６細胞／mlを使用して４８ウェルプレートに播種した。ｐＤＣを、９６ウェル皿に１×１０６細胞／mlを使用して播種できる。ＤＰＢＳ(ｐＨ７.４；Mediatech)に溶解した本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を、細胞培養に最終濃度５０または１００μg／mlで添加した。次いで細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をルミネックスマルチプレックスまたはＥＬＩＳＡアッセイのために回収した。実験を３個のウェルで行った。ＩＦＮ−α、ＩＬ−６、またはＴＮＦ−αの濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカイン抗体およびスタンダートを含む必要な試薬をPharMingenから購入した。
【０１０８】
ルミネックスマルチプレックスアッセイを、Biosourceヒトマルチプレックスサイトカインアッセイキットを使用して、Luminex 100/200装置で行い、データをApplied Cytometry Systems(Sacramento, CA)が提供するStarStationソフトウェアを使用して解析した。
【０１０９】
ヒトＰＢＭＣからのサイトカイン濃度を表６に示す。表６に示すデータは、新たに採血した健常ボランティアの血液からＰＢＭＣを単離し、１００μg／ml用量のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡと２４時間培養し；上清を回収し、サイトカイン濃度用ルミネックスマルチプレックスアッセイで解析することにより作成した。表６に示す結果は、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡオリゴヌクレオチド類の投与が、独特のサイトカインおよびケモカインプロファイルをもたらすことを証明する。
【表７】
Ｇ１＝７−デアザ−Ｇ；Ｘ＝１,２,３−プロパンジオール(グリセロール)
＊データ５０μg／ml濃度
【０１１０】
実施例４
ＴＬＲ７アゴニスト化合物で処置したマウスモデルにおけるインビボサイトカイン分泌
５〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをTaconic Farms, Germantown, NYから得て、Idera Pharmaceutical's IACUC approved animal protocolsに従い飼養した。マウス(ｎ＝３)に、個々の本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を２５mg／kg(１回投与量)で皮下注射(ｓ.ｃ.)した。血清を、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ投与２時間後後眼窩放血により採取し、サイトカインおよびケモカイン濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡまたはルミネックスマルチプレックスアッセイにより測定した。結果を表７にしめし、これは、本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡオリゴヌクレオチド類のインビボ投与が独特のサイトカインおよびケモカインプロファイルをもたらすことを証明する。サイトカインおよびケモカイン抗体およびスタンダードを含む全ての試薬をPharMingen(San Diego, CA)から購入した。
【表９】
Ｇ１＝７−デアザ−Ｇ；Ｘ＝１,２,３−プロパンジオール(グリセロール)
【０１１１】
実施例５
血清安定性アッセイ
約０.５ＯＤの例示的な本発明のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲ化合物を、個々に１％ヒト血清のＰＢＳ溶液中、３０分間、３７℃でインキュベートしてよい。１％ヒト血清中、３０分間のインキュベーション後、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物をアニオン交換ＨＰＬＣで解析して、血清処置前に存在したＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の量と比較して、残留している完全長ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物の割合を決定してよい。結果は、ＲＮＡベースの化合物上に為した本発明の化学修飾が、その安定性を増強できることを証明するものであると予測される。
【０１１２】
均等物
上に記載した発明は、明瞭化および理解の目的で幾分詳細に記載しているが、当業者には、本明細書の解釈から、本発明の真の範囲および添付する特許請求の範囲から逸脱することなく、形式および詳細を変化させ得ることは当然である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＩＭＲＡ＃１、ＳＩＭＲＡ＃２、ＳＩＭＲＡ＃３、ＳＩＭＲＡ＃４、ＳＩＭＲＡ＃５、ＳＩＭＲＡ＃６、ＳＩＭＲＡ＃７、ＳＩＭＲＡ＃８、ＳＩＭＲＡ＃９、ＳＩＭＲＡ＃１０、ＳＩＭＲＡ＃１１、ＳＩＭＲＡ＃１２、ＳＩＭＲＡ＃１３、ＳＩＭＲＡ＃１４、ＳＩＭＲＡ＃１５、ＳＩＭＲＡ＃１６、ＳＩＭＲＡ＃１７、ＳＩＭＲＡ＃１８、ＳＩＭＲＡ＃１９、ＳＩＭＲＡ＃２０、ＳＩＭＲＡ＃２１、ＳＩＭＲＡ＃２２、ＳＩＭＲＡ＃２３、ＳＩＭＲＡ＃２４、ＳＩＭＲＡ＃２５、ＳＩＭＲＡ＃２６、ＳＩＭＲＡ＃２７、ＳＩＭＲＡ＃２８、ＳＩＭＲＡ＃２９、ＳＩＭＲＡ＃３０、およびＳＩＭＲＡ＃３１から成る群から選択される、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物。
【請求項２】
請求項１に記載のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物および生理学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３】
個体における免疫応答を誘発する方法であって、脊椎動物に請求項１に記載のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を投与することを含む方法。
【請求項４】
免疫応答の調節が有益である疾患または障害を有する脊椎動物の治療的処置方法であって、該脊椎動物に請求項１に記載のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を薬学的有効量で投与することを含む方法。
【請求項５】
疾患または障害が癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、喘息または病原体が原因の疾患である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１種以上の化学療法化合物の投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
標的治療剤の投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
抗体の投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡワクチン、タンパク質ワクチンおよびペプチドワクチンから成る群から選択されるワクチンの投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
抗原の投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
アジュバントをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
免疫応答の調節が有益である疾患または障害を有する個体を予防的に処置する方法であって、該脊椎動物に請求項１に記載のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を薬学的有効量で投与することを含む、方法。
【請求項１３】
疾患または障害が脊椎動物における癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、喘息または病原体が原因の疾患である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１種以上の化学療法化合物の投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的治療剤の投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抗体の投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡワクチン、タンパク質ワクチンおよびペプチドワクチンから成る群から選択されるワクチンの投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
抗原の投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
アジュバントの投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１】
ＳＩＭＲＡ＃１、ＳＩＭＲＡ＃２、ＳＩＭＲＡ＃３、ＳＩＭＲＡ＃４、ＳＩＭＲＡ＃５、ＳＩＭＲＡ＃６、ＳＩＭＲＡ＃７、ＳＩＭＲＡ＃８、ＳＩＭＲＡ＃９、ＳＩＭＲＡ＃１０、ＳＩＭＲＡ＃１１、ＳＩＭＲＡ＃１２、ＳＩＭＲＡ＃１３、ＳＩＭＲＡ＃１４、ＳＩＭＲＡ＃１５、ＳＩＭＲＡ＃１６、ＳＩＭＲＡ＃１７、ＳＩＭＲＡ＃１８、ＳＩＭＲＡ＃１９、ＳＩＭＲＡ＃２０、ＳＩＭＲＡ＃２１、ＳＩＭＲＡ＃２２、ＳＩＭＲＡ＃２３、ＳＩＭＲＡ＃２４、ＳＩＭＲＡ＃２５、ＳＩＭＲＡ＃２６、ＳＩＭＲＡ＃２７、ＳＩＭＲＡ＃２８、ＳＩＭＲＡ＃２９、ＳＩＭＲＡ＃３０、およびＳＩＭＲＡ＃３１から成る群から選択される、ＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物。
【請求項２】
請求項１に記載のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物および生理学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３】
個体における免疫応答を誘発する方法であって、脊椎動物に請求項１に記載のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を投与することを含む方法。
【請求項４】
免疫応答の調節が有益である疾患または障害を有する脊椎動物の治療的処置方法であって、該脊椎動物に請求項１に記載のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を薬学的有効量で投与することを含む方法。
【請求項５】
疾患または障害が癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、喘息または病原体が原因の疾患である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１種以上の化学療法化合物の投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
標的治療剤の投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
抗体の投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡワクチン、タンパク質ワクチンおよびペプチドワクチンから成る群から選択されるワクチンの投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
抗原の投与をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
アジュバントをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
免疫応答の調節が有益である疾患または障害を有する個体を予防的に処置する方法であって、該脊椎動物に請求項１に記載のＴＬＲ７特異的ＳＩＭＲＡ化合物を薬学的有効量で投与することを含む、方法。
【請求項１３】
疾患または障害が脊椎動物における癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、喘息または病原体が原因の疾患である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１種以上の化学療法化合物の投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的治療剤の投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抗体の投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡワクチン、タンパク質ワクチンおよびペプチドワクチンから成る群から選択されるワクチンの投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
抗原の投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
アジュバントの投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１２−５１７２２６（Ｐ２０１２−５１７２２６Ａ）
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４９３４７（Ｐ２０１１−５４９３４７）
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２３７６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９３７０５
【国際公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２３７６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９３７０５
【国際公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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