ＴＳＥ感染の治療
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）感染は、プリオンダイマーに結合する抗体の投与によって治療される。必要に応じてオリゴマー形態および必要に応じて環状領域を有する、キャリアとプリオンタンパク質のフラグメントとの結合体が、抗体産生を刺激するために用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）因子による感染の治療のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、ヒトにおけるクロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）およびクールー病、ウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ならびにヒツジにおけるスクレイピーを含む、致命的な神経学的疾患の一群である。ＴＳＥは、感染した動物の脳組織内の正常な宿主タンパク質の病原性タンパク質への変換によって特徴づけられる。タンパク質の病原性形態は、しばしばプリオンと呼ばれ、そして物理的および化学的分解に非常に抵抗性である。プリオンは、ＴＳＥ疾患が動物間で伝わる伝染性因子であると考えられる。
【０００３】
食肉製品、特に、ウシのＴＳＥの形態であるＢＳＥに感染している可能性のある牛肉の消費に関する危険性について、近年、多くの公的な警告がなされている。この関心の多くは、ヒトによって食べられた場合、ＢＳＥプリオンが、ある場合には、異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）と呼ばれる不治のヒト形態の疾患を引き起こし得るという考えに関連する。
【０００４】
ＴＳＥに感染したヒトについての予後は良くなく、利用できる有効な治療法がない。しばしば、診断から死亡までの期間は短く、そして患者ならびに患者の周囲のヒトおよび患者の介護者の両方とも不安である。
【０００５】
プリオンタンパク質のフラグメントに対する抗体が惹起されることは公知である。Ｓｏｕａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１：３１，２３３８−２３４６頁は、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答の両方を誘発するペプチドを記載している。しかし、得られた抗体を用いても、プリオンタンパク質腫瘍の減少には至らなかった。
【０００６】
プリオンタンパク質に対する抗体を惹起するための困難性は、ペプチドフラグメントが弱い免疫原であることであり、そして得られた抗体は、しばしば親和性が弱い。純粋な病原性プリオンタンパク質自身を用いる場合、これは得られた組成物が、病原性タンパク質を含むおそれがあるという結果となり、したがって、臨床での使用に適さない。
【０００７】
抗プリオン抗体であるｍＡｂ ６Ｈ４はまた、Ｐｒｉｏｎｉｃｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから市販されている。この抗体は、代表的には、検出可能マーカーに結合された二次抗体を用いて、プリオンタンパク質を検出するために用いられ得、この二次抗体は一次抗体に結合する。
【０００８】
本発明者らによって発見された困難性は、プリオンで汚染されていると思われる器具、または汚染されていると思われるがプリオンを破壊することを意図した処理を施されている器具への、この抗体の結合が、感染力に相関しないことである。例えば、プロテアーゼで消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いで抗プリオン抗体でプロービングした、プリオン感染したマウス脳ホモジネートは、陰性の結果、すなわち抗体結合がないことを示すことが、本発明者らにより発見されている。それにもかかわらず、この材料は感染力を保持する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の目的は、ＴＳＥ因子からの罹患、ＴＳＥ因子による感染の危険性、またはＴＳＥ因子によって引き起こされる他の疾患に有効な治療法、治療薬、および／または予防薬を提供することにある。
【００１０】
さらなる目的は、プリオンタンパク質に結合しそしてプリオン疾患を治療するために用いられ得る抗体の代替の産生、および特定の実施態様では、改良された産生を提供することにある。
【００１１】
したがって、本発明は、プリオンタンパク質のダイマーに結合する抗体を投与する工程を含む、ＴＳＥ感染の治療方法を提供する。
【００１２】
抗体は、好ましくはダイマーに特異的であり、すなわちダイマーに結合するが実質的にはプリオンのモノマー形態に結合せず、そして以下に詳細に記載する方法によって得られ得る。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、プリオンタンパク質のダイマーに結合する抗体を含む、ＴＳＥ感染の治療のための薬学的組成物を提供する。
【００１４】
本発明の抗体は、プリオンタンパク質もしくはそのアナログ、または該タンパク質もしくはそのアナログのフラグメントを含む抗原で動物を免疫し、該動物から抗体を含む抽出物を得、そして該抽出物からプリオンダイマーに結合する抗体を単離することによって適切に得られる。マウス、ヒツジ、ヒト、およびウシの（ならびに他の）プリオンタンパク質配列は公知であり、したがって、例えば、少なくとも７個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１４個のアミノ酸のフラグメントであるペプチドを調製することは、簡単である。アナログは、それぞれのプリオンタンパク質配列の比較、および１以上のプリオンタンパク質ソースに由来する領域との混成物を合成することによって調製され得る。あるいは、１０個毎に２個までのアミノ酸が置換される合成配列が、調製される。
【００１５】
本発明の抗原は、ペプチドの混合物を含み得る。これらのペプチドは、１以上のプリオンタンパク質配列とは異なる領域、および／または１以上のプリオンタンパク質配列と同じ領域を含み得、この同じ領域は同一種内の変異を含み得る。
【００１６】
多くの哺乳動物のプリオンタンパク質配列間に高度の相同性があることは公知であり、重要な機能性残基および構造エレメントの両方とも非常に保存されている。したがって、本発明の免疫ペプチドを調製するために、これらの保存された配列領域またはそのフラグメントを用いることが可能である。これらのペプチドは、１以上のプリオンタンパク質配列とは異なる種々の領域を含み得る。種間の高度のプリオンタンパク質配列相同性を、図５および６に示す。
【００１７】
図５では、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重アラインメントプログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９９４）を用いて、ヒトのプリオンタンパク質前駆体であるＰｒＰｃを、ハムスター、ヒツジ、ミュールジカ、ヘラジカ、マウス、ウシ、ネコ、およびニワトリの相同タンパク質とアラインした。このアラインメントに用いた配列は、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースから入手し、そして用いた配列のデータベース登録番号を以下に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
重要な構造上の特徴は、図５のアラインした配列上に示されており、そして番号付けは、ヒトＰｒＰｃ配列を参照する。配列の重要な構造上の特徴のいくつかは以下のとおりである（括弧中の用語はこれらの特徴が図５にどのように表されているかを示す）。
【００２０】
１．シグナルペプチドは、２２／２３位で切断されて成熟タンパク質を生じる（シグナルペプチド）
２．Ｎ末端領域は、大部分は構造化されておらず、そして可撓性であるが、残基３７から５３はＰｒｏ４４でヒドロキシル化部位を形成する、伸長したＰＰＩＩへリックスを形成し得る（Ｐｒｏヒドロキシル化）
３．Ｎ末端はまた、銅結合に関与する５／６反復のセグメントを含む（反復領域）
４．タンパク分解は、Ｌｙｓ１１０とＨｉｓ１１１との間で起こり得る（切断）
５．膜貫通セグメントであると考えられる短い疎水性残基領域（疎水領域）がある
６．Ｃ末端は、３つのα−へリックス（ａ１−３）および２つのβ−シート（ｂ１−２）の一団によって特徴づけられる
７．ジスルフィド架橋は、残基Ｃｙｓ１７９と残基Ｃｙｓ２１４との間に生じる（−ＳＳ−）
８．アスパラギン残基Ａｓｎ１８１およびＡｓｎ１９７は、Ｎグリコシル化に利用される（炭水化物基；保存されたモチーフはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒである）（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）
９．残基Ｓｅｒ２３１はＧＰＩ（糖脂質）アンカー部分が付着する残基を提供する（ＧＰＩアンカー）。
【００２１】
図５の多重アラインメントの調査において、以下の機能的に重要な残基は、示した哺乳動物種では完全に保存されていた。
【００２２】
・シグナルペプチド切断部位（Ｃ２３−Ｋ２４）
・Ｐｒｏ４４ヒドロキシル化部位
・タンパク分解切断部位（Ｋ１１０−Ｈ１１１）
・Ａｒｇ−グリコシル化部位（Ｒ１８１、Ｒ１９７）
・ジスルフィド架橋（Ｃ１７９、Ｃ２１４）
・ＧＰＩアンカー（Ｓ２３１）
【００２３】
異なった領域は、Ｎ末端配列およびいくつかの構造エレメント（例えば、α−へリックス）にある傾向にあるが、β−シートおよび疎水性領域は全体的に保存されている。
【００２４】
図６は、タンパク質配列の個々の対のアラインメントに由来する同一性の割合を示す。さらに、この図は、プリオンタンパク質のアミノ酸配列の哺乳動物種間の高いレベルの同一性を証明する。好ましくは、本発明の方法および組成物に用いるためのペプチドは、同定された保存領域のフラグメントから調製される。
【００２５】
プリオンダイマーに対して選択的な抗体を作る一つの方法は、動物を免疫し、そして血清を抽出することである。これをプリオンダイマーカラムに供して、ダイマーに結合する抗体を同定する。次いで、これらの抗体を、プリオンモノマーとの交差反応性についてテストして、交差反応する抗体を除去する。除去は、プリオンモノマーを投入したカラムを用いて行われ得、次いでそこから出てくる抗体について、交差反応性がないことをテストする。
【００２６】
単離したプリオンダイマーは、本発明のさらなる実施態様を形成する。この単離された物質は、上述した方法でカラムから、または簡単にはプリオンダイマーを解析するために用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一部を切り出すことによって得られ得る。あるいは、他の分離技法を用いて、ホモジナイズしたプリオン感染マウスの脳からプリオンダイマーを抽出し得る。プリオンモノマーに結合しそして交差反応性である抗体を用いて、このようにして得た物質がプリオンダイマーであり、そして同じ分子量の他のタンパク質ではないことを確認し得る。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様では、抗体は、必要に応じて一端または両端にシステイン残基が付加された、プリオンタンパク質のフラグメントであるペプチドまたは該フラグメントを含むペプチドで、特定の例では配列番号１から８より選択されるペプチドで、動物を免疫することによって得られる。システイン残基（配列またはフラグメントについて言うときは、末端に０、１または２個のシステイン残基を有する配列またはフラグメントを含むことを意図する）の使用は、ペプチドがシステイン−システイン結合によってオリゴマーを形成し得るという利点を提供する。結果として、免疫するペプチドとしては、直鎖状モノマー、直鎖状ダイマー、環状モノマー、環状ダイマー、および反復プリオンペプチド配列および環状領域を有する他のオリゴマー形態が挙げられる。これらのペプチドは、より広範囲の免疫抗原を動物に提示させる。疾患形成因子の天然の形態をよりそっくりに模倣し得る環状形態が提示される。病原性因子のダイマー形態もよりそっくりに模倣し得るダイマー形態、そのいくつかの環状形態が提示される。したがって、本発明は、図５に示すすべてのプリオン配列のすべてのフラグメントまで及び、このフラグメントは少なくとも７アミノ酸長であり、そして一端または両端にシステイン残基を有する。
【００２８】
ペプチドは、種々の投与経路により動物に導入され得る。好ましい実施態様では、ペプチドは、腹膜中に注入され、この部位は、（ａ）外科的に容易に接近可能であり、（ｂ）一度に大量の液体を注入することができ、そして（ｃ）血流へのペプチドの迅速な吸収が可能である。
【００２９】
使用する場合、抗体は、全身循環へ送達され得る。抗体がプリオンダイマーに結合することにより、ダイマーを除去および破壊し、ならびに感染を減少させる。脳内で生じるプリオンダイマーが、血液脳関門を越えて拡散し、そしてダイマーは関門を通過した後に掃討されるので、関門の全身側の抗体の存在は濃度勾配を生じると考えられ、これが感染および疾患を減少させることを助ける。
【００３０】
抗体が血液脳関門を通過し得るように輸送ベクターに抗体を結合することが公知である。例えば、抗体は、アビジン／ビオチンを介してＯＸ２６モノクローナル抗体に結合され得、後者の抗体は血液脳関門を通過するための輸送ベクターとして作用する。さらに詳細には、Ｂｉｃｋｅｌら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４６（２００１）２４７−２７９に記載されている。したがって、本発明のさらなる実施態様は、例えば、Ｂｉｃｋｅｌらによって総説された技術を用いて、血液脳関門を通過するように適合した抗体にある。
【００３１】
本発明のさらに好ましい実施態様は、キャリアの使用により抗原に対する免疫応答を高めることにある。したがって、抗体は、動物を抗原で免疫することによって得られ、ここで、抗原は、プリオンタンパク質またはプリオンタンパク質のアナログのフラグメントである本発明のペプチドまたは該フラグメントを含む本発明のペプチドを含み、そして抗原はさらに、必要に応じてリンカーを介して、ペプチドと共有結合したキャリアを含む。これは、抗体産生の刺激を改善する利点がある。キャリアは、広範な免疫原性キャリア物質、例えば、タンパク質、熱ショックタンパク質、トキソイドから選択され得、バクテリアタンパク質およびバクテリアトキソイドのような例、特にマイコバクテリアタンパク質、百日咳タンパク質およびトキソイド、ジフテリアタンパク質およびトキソイドが挙げられる。Ｄｅ Ｓｉｌｖａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９９９ ５−６月：１０（３）；４９６−５０１には、免疫原性のキャリアとしてのＰＰＤの使用が記載されており、キャリアとしての熱ショックタンパク質は、Ｌｕｓｓｏｗら、Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９１ １０月：２１（１０）；２２９７−２３０２に記載されている。動物は、抗体のソースであり得、この場合、抗体は動物から得られ得、同定されたプリオンダイマーに結合する抗体である。動物は、処置されているかまたは処置されるべきであり得る。したがって、本発明はまた、ＴＳＥの治療方法および／またはＴＳＥ感染に対して動物を免疫する方法を提供し、本発明のペプチドおよび／または本発明の抗原を投与する工程を含む。
【００３２】
さらに、抗原／キャリアを投与する前または同時のいずれかに、動物をキャリアに対して感作することが好ましい。したがって、実施例に記載されている特定の方法では、抗体産生はキャリアに対する免疫応答を刺激する初回抗原を投与する工程を含む。また、抗体産生が改良されている利点がある。初回抗原は、それ自体のキャリアまたはキャリアのフラグメントであり得る。
【００３３】
特定の例では、キャリアは、マイコバクテリアタンパク質であり、そして初回抗原はＢＣＧワクチンを投与することによって投与される。このアプローチのさらなる詳細は、例えばＬｕｓｓｏｗら、Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９１ １０月：２１（１０）；２２９７−２３０２に記載されている。
【００３４】
本発明のさらなる局面は、本発明の単離されたペプチドおよび抗原、ならびにそれらの使用にある。
【００３５】
用語「伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）因子」は、病原性プリオンタンパク質中間体によって明らかに伝染されるすべての神経学的疾患を含むことを意図する。このようなＴＳＥとしては、代表的には、ヒト疾患のクロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ）、クールー病、致命的家族性不眠症、およびゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群が挙げられる。非ヒトＴＳＥとしては、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、スクレイピー、ネコ海綿状脳症、慢性消耗病、および伝染性ミンク脳症が挙げられる。現在、ｖＣＪＤがＢＳＥのヒト形態であると理解されるならば、あるＴＳＥ因子が種の障壁を交差し得、そして非ウシ起源の新規なＴＳＥが将来明らかになり得ることは明白である。ＴＳＥ感染という場合も、プリオン疾患をいう。
【００３６】
本発明の抗体および／またはペプチドは、英国のスクレイピー（ヒツジ）の群れのすべてまたは一部を除去するために有効な治療法、治療薬および／または予防薬に用いられ得る。ヒツジでは、しばしば群れの２０％までがスクレイピーに感染している群れがある。したがって、危険であることが知られている隔離された群れにワクチン接種すること、および／または感染したヒツジをプリオンタンパク質に結合する抗体で治療することは有益である。本発明の抗体および／またはペプチドは、同様に、英国のＢＳＥ（ウシ）の群れのすべてまたは一部を除去するために用いられ得る。
【００３７】
本発明のさらなる局面は、ＣＪＤまたは新しい異型ＣＪＤの兆候を提示している、または危険であると同定されたヒトを治療するための抗体および／またはペプチドの使用にある。
【００３８】
もう一つの実施態様では、本発明の抗体および／またはペプチドは、例えば、虫垂、扁桃腺から、または腰椎穿刺によって取り出された組織に基づく、ＴＳＥ感染の早期診断を可能にする。早期診断により、治療の成功の可能性、または少なくとも治療による延命は、増加する。
【００３９】
さらに他の実施態様では、本発明の抗体および／またはペプチドは、動物における広範なワクチン接種プログラムを提供するために用いられる。このようなワクチン接種プログラムが、事前の診断またはテストなしで行い得ることが予測される。
【００４０】
本発明の抗体は、必要に応じて、プリオンタンパク質、好ましくは特異的にプリオンダイマーに結合するモノクローナル抗体であり、そしてプリオン疾患の治療に用いられ得る。
【００４１】
実施例により詳細に記載するように、プリオン株３０１Ｖは、最終的にＢＳＥにかかったホルスタイン−フリージアンウシ由来のマウス継代単離物であり、これはプリオン株の例として用いられる。感染は脳内接種により生じることが知られており、そして臨床的徴候の発現に必要なインキュベーション期間は非常に均一である。すなわち、感染性因子の投与量が充分であるならば、疾患の古典的兆候は接種後の所定の時間で出現する（ＶＭマウスにおいて、これは１２０日である）。明らかな理由について、ヒトにおけるこれらの特性はテストされていないが、マウスのバイオアッセイが、最も近い利用可能なモデルとみなされ、したがってヒトにおけるＢＳＥ感染の良好な指標である。
【００４２】
本発明の特定の実施態様の方法および組成物は、以下により詳細に記載されており、添付の図によって説明される。
【実施例】
【００４３】
（消化したマウス脳におけるダイマー検出）
ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳のホモジネートを、プロテアーゼを用いて中性ｐＨおよび６０℃にて３０分間消化した。全タンパク質消化物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてウエスタンブロッティングによってニトロセルロースメンブランに移した。これらを細片に切断し、そしてＣＡＭＲ抗プリオン抗体（ウサギで産生）でプロービングした。一般の二次抗体（ヤギ抗ウサギ）を西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し、そしてＴＭＢ比色定量基質による検出に用いた。
【００４４】
この時点で、予測した結果は、抗プリオン抗体ｍＡｂ ６Ｈ４（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手）を用いるコントロールブロット（第７番）と同じ結果となるということであった。このコントロールブロットでは、プロテアーゼ消化した感染性コンホメーションのプリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）についての代表的な３つのバンドパターン（グリコシル化状態）が見られる。
【００４５】
しかし、この実施例におけるブロットは、このパターンを示さなかった。ブロット１は、プリオン分子のＮ末端領域に対応するＰＰＤ結合ペプチドに対して惹起したポリクローナル抗体を使用する。このレーンでは何も見られない。タンパク質のこの部分は、タンパク分解を受けやすく、そのためレーン（２および３）で何も見られないことは意外ではない。図１の左側のブロット１を参照のこと。レーン１は、分子量マーカーである。
【００４６】
ブロット２は、プリオン分子中のさらなるペプチド配列に対して惹起した第２の抗体を有する。これは、ある範囲のグリコシル化状態を有するプリオンダイマーに対応する分子量で、ほぼ等距離で強度が異なる、少なくとも９つのバンドを示す。図１のブロット２を参照のこと。
【００４７】
ブロット３抗体は、同様のプロファイルを示す；ブロット４も示すが、その結果は質が悪くて結論を得られない。図１のブロット３および４を参照のこと。
【００４８】
コントロールブロット７とともに図２に示すブロット５および６も、複数のバンドのパターンを示す。
【００４９】
（消化したマウス脳におけるダイマー検出）
上記の実施例を繰り返し、そして結果を図３および図４に示す。
【００５０】
ブロット１は、レーン１および５に分子量マーカーを示す。レーン２は、組換えマウスＰｒＰであり、組換えマウスＰｒＰオリゴマーを示す。レーン３は、プロテアーゼ消化した感染性マウス脳のホモジネートに対する抗体応答がないことを示す。レーン４は、非消化コントロールにおける抗体応答である。
【００５１】
ブロット２は、上記のとおりであるが、プロテアーゼ消化した試料におけるこれまでのバンドパターンを示す。
【００５２】
ブロット３は、抗体３応答を示す。ここでは、組換えマウスＰｒＰに対するいくつかの応答がある（レーン２）。レーン３は、複数の（ダイマーＰｒＰ）バンドパターンだけでなく、いくつかのモノマーＰｒＰ応答も示す。
【００５３】
ブロット７は、６Ｈ４ ｍＡｂ抗体コントロールである。ここでは、組換えマウスＰｒＰオリゴマーの良好な検出がある（レーン２）。レーン３は、限定的プロテアーゼ処理したＰｒＰＳｃの大量のジグリコシル化形態、加えてＢＳＥ（３０１Ｖ）株に代表的なより少量のモノグリコシル化および非グリコシル化形態を示す。ダイマー検出は明らかでない。
【００５４】
（ダイマー優先抗体を含む抗体の調製）
実施例において、本発明者らは６つのポリクローナル抗体を用いた。これらのうち３つはダイマーのみを検出しそしてモノマーに結合しないが、１つはモノマーおよびダイマーの両方と交差反応する。
【００５５】
合成したプリオン模倣ペプチドでウサギに免疫接種することによって、ポリクローナル血清を産生した。これらのペプチドを、ヒト、マウス、およびウシのプリオンタンパク質アミノ酸配列間の高い相同性の領域に基づいて設計した。
【００５６】
配列番号４、５、７および８が、ダイマー反応性抗体を産生した。
【００５７】
両端にシステインを有する（上記を参照のこと）および一端のみにシステインを有するペプチドを合成した。キャリアタンパク質の表面上の抗原の直鎖形態およびループ構造の両方を提示するために、この方法を用いた。
【００５８】
ペプチドを商業的に合成し、細菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓの弱毒化株に由来するキャリアタンパク質ＰＰＤ（精製したタンパク質誘導体）にカップリングした。これを凍結乾燥して、リンカーを介してペプチドに結合するために使用する。
【００５９】
抗プリオンポリクローナル抗体を、以下のように産生した。
【００６０】
免疫前血清の試料（約１ｍｌ）をＤｕｔｃｈウサギの群のそれぞれから採集した。ウサギに、皮内用途用に再構成して凍結乾燥したＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）ワクチンを注射した。再構成したＢＣＧワクチンの０．１ｍｌ用量を、ウサギの首筋に２ヶ所投与した。４週後、０．６ｍｇの各ペプチド−ＰＰＤ結合体を測定し（１システインおよび２システイン型のそれぞれの０．３ｍｇ）、そして１ｍｌの０．９％滅菌生理食塩水に溶解した。
【００６１】
等容量の不完全フロイントアジュバントを加え、そして各ウサギにつき得られたエマルジョンの０．７５ｍｌアリコートを各後肢に、そして０．２５ｍｌアリコートを首筋の２ヶ所に筋肉内注射した。４週後に、工程３および４のように調製したペプチド−ＰＰＤ結合体を含むブースト注射を行った。ブースト注射は、各ウサギの首筋への４ヶ所の０．２５ｍｌ注射からなる。１回目のブースト注射の７〜１４日後に、４ｍｌのテスト採血を行い、抗体力価について血清をＥＬＩＳＡによって評価した。２回目のブースト注射を１回目の４〜６週後に行った。
【００６２】
３回目のブースト注射を４〜６週後に行った。３回目のブースト注射の６〜８週後に４ｍｌのテスト採血を行って、抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。次いで、４回目のブースト注射を行った。
【００６３】
４回目のブースト注射の７〜１４日後に、４ｍｌのテスト採血を行って、抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。最後の全採血を行い、そして血液を採集した。血清を遠心分離によって分離し、そして−２０℃で保存した。
【００６４】
抗体力価の分析を、ＥＬＩＳＡを用いて行った。ペプチドに対する応答をキャリアタンパク質に対する応答と区別するために、イムノアッセイプレートを、異なるキャリアタンパク質（ＫＬＨ）に結合した同じペプチドでコーティングした。
【００６５】
記載の合成ペプチド配列の免疫接種によって産生した３つの抗体は、ダイマー形態の分子に優先的に結合する。
【００６６】
（マウスにおけるプリオン感染の治療のための、ＰＰＤ結合したプリオン由来ペプチドを用いる免疫接種プロトコル）
ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳ホモジネートの０．１％（ｗ／ｖ）懸濁液の２０ｍｌをＶＭマウスに大脳内接種した。２週後、接種したペプチド結合体に対する免疫応答を刺激するためにマウスにＢＣＧを接種した。さらに２週後、不完全フロイントアジュバントまたは適切なコントロールと１：１で混合したＰＰＤ−ペプチド結合体１００ｍｌをマウスに接種した。結合体のペプチドを、配列番号１〜８から選択し、そして以下のように対応させた：
ペプチド１＝配列番号５
ペプチド２＝配列番号６
ペプチド３＝配列番号８
【００６７】
同じ濃度の結合体のさらに３つの接種物を２週間間隔で投与した。プリオン疾患の進行の臨床兆候について次の２〜６ヶ月にわたり、マウスを観察した。１３８日後の実験の結果を、表２にまとめる。
【００６８】
【表２】
【００６９】
この実験の結果は、これらのＰＰＤ−ペプチドのそれぞれでの免疫接種が、ＴＳＥに予め曝露したマウスの平均生存期間を増加させることに成功したことを示す。ＰＰＤ−ペプチド１およびＰＰＤ−ペプチド２での免疫接種は、ＴＳＥに予め曝露したマウスの平均生存期間の特に著しい増加を示した。１３８日終了時のこれらの２つのペプチドについての結果の統計分析を以下に示す。
【００７０】
上記の実験結果を解釈する場合、マウスが予めＴＳＥに曝露されているので、実験がマウスにおけるプリオン感染の治療のためのペプチドの有効性の非常に厳格なテストを表すことを認識すべきである。したがって、本発明のペプチドは、ＴＳＥに予め曝露したマウスの生存期間を増加させることを示し、そして治療法における使用に適切な候補物である。
【００７１】
ペプチドはまた、予防的治療、すなわち感染因子の曝露の前にペプチド−キャリア結合体に動物を曝露することによる使用に適切である。
【００７２】
（ＴＳＥに予め曝露したマウスの平均生存期間におけるＰＰＤ−ペプチド１およびＰＰＤ−ペプチド２の効果の統計分析）
一元ＡＮＯＶＡ：グループ２（ＰＰＤ−ペプチド２）対グループ８（コントロール−ＢＣＧのみ）
グループ４についての分散分析
ソース ＤＦ ＳＳ ＭＳ Ｆ Ｐ
グループ８ １ ２６．８８９ ２６．８８９ ３５．２９ ０．００１
誤差 ７ ５．３３３ ０．７６２
合計 ８ ３２．２２２
【００７３】
【数１】
【００７４】
２試料Ｔ検定およびＣＩ：グループ８（コントロール−ＢＣＧのみ）、グループ２（ＰＰＤ−ペプチド２）
グループ８対グループ２についての２試料Ｔ
Ｎ 平均 標準偏差 ＳＥ平均
グループ８ ９ １２９．６７ ５．００ １．７
グループ２ ９ １３５．４４ ２．０１ ０．６７
差＝ｍｕグループ８−ｍｕグループ２
差についての推定：−５．７８
差についての９５％ＣＩ：（−９．７８、−１．７８）
差のＴ検定＝０（対なし＝）：Ｔ値＝−３．２２ Ｐ値＝０．００９ ＤＦ＝１０
【００７５】
マン−ホイットニー検定およびＣＩ：グループ８（コントロール−ＢＣＧのみ）、グループ２（ＰＰＤ−ペプチド２）
グループ８ Ｎ＝９ 中央値＝１３３．００
グループ２ Ｎ＝９ 中央値＝１３６．００
ＥＴＡ１−ＥＴＡ２についての点推定は−３．００である
ＥＴＡ１−ＥＴＡ２についての９９．２％Ｃｌは（−１３．００、−０．００）である
Ｗ＝５４．０
ＥＴＡ１＝ＥＴＡ２対ＥＴＡ１＜ＥＴＡ２の検定は０．００３１で有意である
テストは０．００１６で有意である（つながりについて調整された）
【００７６】
統計的に、コントロール群とＰＰＤ−ペプチド２で免疫した群との間に認められる差は、非常に有意であることが示された。
【００７７】
マン−ホイットニー検定およびＣＩ：グループ８（コントロール−ＢＣＧのみ）、グループ１（ＰＰＤ−ペプチド１）
グループ８ Ｎ＝ ９ 中央値＝１３３．００
グループ１ Ｎ＝１０ 中央値＝１３３．００
ＥＴＡ１−ＥＴＡ２についての点推定は−０．００である
ＥＴＡ１−ＥＴＡ２についての９５．５％ＣＩは（−１０．００、０．００）である
Ｗ＝７５．０
ＥＴＡ１＝ＥＴＡ２対ＥＴＡ１＜ＥＴＡ２の検定は０．１１８２で有意である
検定は０．０６２８で有意である（つながりについて調整された）
α＝０．０５で拒絶できない
【００７８】
２試料Ｔ検定およびＣＩ：グループ８（コントロール−ＢＣＧのみ）、グループ１（ＰＰＤ−ペプチド１）
コントロール対ＰＰＤ−ペプチド１についての２試料Ｔ
Ｎ 平均 標準偏差 ＳＥ平均
グループ８ ９ １２９．６７ ５．００ １．７
グループ１ １０ １３３．０００ ０．４７１ ０．１５
差＝ｍｕグループ８−ｍｕグループ１
差についての推定：−３．３３
差についての９５％ＣＩ：（−７．１９、０．５３）
差のＴ検定＝０（対なし＝）：Ｔ値＝−１．９９ Ｐ値＝０．０８２ ＤＦ＝８
【００７９】
統計的に、コントロール群とＰＰＤ−ペプチド１で免疫した群との間に認められる差は、有意である。
【００８０】
（プリオン疾患に感染したヒト被験者の免疫接種）
ペプチドは、上述したように本質的にＰＰＤまたはＢＣＧキャリアタンパク質に結合されている。この結合体は、当業者に公知の方法および組成物を用いて臨床患者への免疫接種を適切にするような方法で処方される。
【００８１】
結合体での最初の免疫接種、次いで２週間毎に２回の５０％濃度の注射、次いで２、３および４ヶ月目の追加の注射に基づく免疫接種プロトコルは、個体の治療方法に適切である。
【００８２】
（ウサギポリクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体の産生）
ウサギにおけるポリクローナル抗体の産生を以下に述べる。
【００８３】
Ｄｕｔｃｈウサギ（約２．５ｋｇ）を、新しい収容施設に約２週間飼育し、そして免疫前血清の試料（約１ｍｌ）をそれぞれから採集した。各ウサギに皮内用途用に再構成して凍結乾燥したＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）ワクチン（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍｉｎｓｉｔｕｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を注射した。再構成したＢＣＧワクチンの０．１ｍｌ用量を、ウサギの首筋に２ヶ所のそれぞれに投与した。ペプチド−ＰＰＤ結合体の最初の注射前４〜６週間、すべてのウサギを放飼する。
【００８４】
・等容量の不完全フロイントアジュバントを追加したペプチド−ＰＰＤ結合体（１ｍｌ）のそれぞれを合わせ、そして各ウサギにつき得られた各エマルジョンの０．７５ｍｌアリコートを各後肢に、０．２５ｍｌアリコートを首筋の２ヶ所に筋肉内注射する。４〜６週間放置する。
【００８５】
・最初のペプチド−ＰＰＤ結合体不完全フロイントアジュバント接種の４〜６週後に、最初のブースト注射を行う。ブースト注射は、各ウサギの首筋への４ヶ所の０．２５ｍｌ注射のみを含む。２回目のブーストを４〜６週の時点に行う。
【００８６】
・最初のブースト注射の７〜１４日後に、テスト採血（約４ｍｌ）を行う。
【００８７】
・最初のブースト注射の４〜６週後に２回目のブースト注射を行う。ブースト注射はまた、各ウサギの首筋への４ヶ所の０．２５ｍｌ注射のみを含む。３回目のブーストを４〜６週の時点に行う。
【００８８】
・２回目のブースト注射の４〜６週後に、３回目のブースト注射を行う。ブースト注射はまた、各ウサギの首筋への４ヶ所の０．２５ｍｌ注射のみを含む。
【００８９】
・３回目のブースト注射の６〜７週間後に、２回目のテスト採血（約４ｍｌ）を行い、そして、およそ数週の時点に４回目のブースト注射を行う。
【００９０】
４回目のブースト注射の７〜１４日後に、３回目のテスト採血（約４ｍｌ）を行う。血清分析結果を受け、次の３日以内に最後の全採血を行う。
【００９１】
マウスにおける抗体の産生のための免疫接種プロトコルは、上記のものと類似している。
【００９２】
１．再構成して凍結乾燥したＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）のマウス当たり２５ｍｌの皮内注射（０日目）
２．不完全フロイントアジュバント中のペプチド−ＰＰＤ結合体のマウス当たり８０ｍｇの腹腔内注射（２８日目）
３．２８日目のようにマウス当たり４０ｍｇを繰り返す（４２日目）
４．２８日目のようにマウス当たり４０ｍｇを繰り返す（４９日目）
５．尾静脈からテスト採血（５６日目）
６．ペプチド−ＰＰＤ結合体（アジュバントなしでなければならない）の静脈内注射（６３日目）
７．選択したマウスを融合（６６日目）
【００９３】
免疫応答を、終点を推定するために２倍希釈を用いて、遊離のペプチドまたはペプチド−ＫＬＨ結合体をコーティングしたプレートのいずれかを用いるＥＬＩＳＡによって評価する。遊離のペプチドでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートにおいて、免疫した動物については、代表的には、１：５１，２００と１：１０２，０００との間の力価が得られる。
【００９４】
モノクローナル抗体細胞株の生成のために、免疫接種したマウスの脾臓を取り出し、そして標準的方法を用いて骨髄腫細胞株と融合する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編、６章、１９６−２２４頁．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８））。適切な方法の例を以下に示すが、当業者は、他の類似のプロトコルが抗体産生細胞株の生成に使用され得ることを認識している。
【００９５】
（融合のための脾臓細胞の調製）
１．マウスを屠殺する。無菌的に脾臓を取り出し、そして１０ｍｌの無血清培地を含む組織培養ディッシュに入れる。夾雑している組織を脾臓から切り取りそして捨てる。
２．１ｍｌシリンジにつけた１９ゲージ針を用いて、脾臓を細裂する。細胞の大部分が離れるまで細裂し続け、そして脾臓を細かい部分に裂いた。ピペット操作により細胞塊を破壊する。滅菌遠心分離チューブ中に細胞および培地を移す。
３．１０ｍｌの無血清培地（予め３７℃に温める）で組織培養プレートおよび組織塊を洗浄し、そしてチューブ中で最初の１０ｍｌと合わせる。
４．細胞懸濁液を約２分間静置する。沈殿物から上清を注意深く取り除き、新しい遠心分離チューブに移す。
【００９６】
（融合技法）
融合の前に、融合パートナーとして用いる骨髄腫細胞は、凍結ストックから取り出し増殖しなければならない。
【００９７】
１．０．３ｇのＰＥＧのバイアルを５０℃の水浴中で溶解する。血清を含まない０．７ｍｌの培地を加え、３７℃の水浴に移す。
２．免疫した動物からの脾臓細胞を４００ｇにて、５分間遠心分離する。同時に２０ｍｌの骨髄腫細胞を遠心分離する。両方の細胞ペレットを、血清を含まない５ｍｌの培地に再懸濁する。
３．２つの細胞懸濁液を合わせて、１５ｍｌの丸底遠心分離チューブに移す。４００ｇで５分間遠心分離する。すべての培地を注意深く取り除く。
４．０．２ｍｌのＰＥＧ溶液を加える。チューブを軽く叩くことによって細胞を懸濁する。
５．４００ｇで５分間遠心分離する。血清を含まない５ｍｌの培地を加えて、ペレットを分散させる。必要ならば、チューブをはじいて細胞を再懸濁する。細胞をピペットで移さない。次いで、２０％ウシ胎児血清を含む５ｍｌの培地を加える。
６．４００ｇで５分間遠心分離する。上清を取り除き、そして２０％ウシ胎児血清、１×ＯＰＩおよび１×ＨＡＴを追加した１０ｍｌの培地に細胞を再懸濁する。２０％ウシ胎児血清および１×ＨＡＴを追加した２００ｍｌの培地に細胞を加える。
７．マイクロタイタープレートのウェル中に１００ｍｌの細胞を分配する。３７℃でＣＯ２インキュベーター中に入れる。
８．４〜５日後、ＨＡＴを含有する２０％ウシ胎児血清を追加した新鮮な１００ｍｌの培地の添加によって、細胞を培養する。
【００９８】
ＯＰＩは、低細胞密度でプレーティングした細胞の増殖を補助するために用いられる培地添加物である。これは、オキザロ酢酸、ピルビン酸、およびインスリンの溶液である。
ＨＡＴはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（薬剤選択培地）である。
他の通常用いられる薬剤選択方法は、ＡＨ（アザセリンおよびヒポキサンチン）である。
【００９９】
（単細胞クローニング）
陽性の組織培養上清を同定した後、次の工程は、抗体産生細胞をクローニングすることである。
・マルチウェルピペッターを用いて、９６ウェルプレートの各ウェルに２０％ＦＣＳおよび２×ＯＰＩを含む５０ｍｌの培地を加える。
・１００ｍｌのハイブリドーマ細胞懸濁液を取り出し、左上側のウェルに移す。ピペット操作により混合する。
・プレートの左側のカラムを下方に２倍希釈する（８ウェル、７希釈段階）。チップを捨てる。
・８ウェル多重チャンネルピペットを用いてプレートを交差して２倍希釈する。クローンは、２〜３日後に目に見えるようになり、そして７〜１０日後にスクリーニングの準備をするべきである。良好なウェルを選択し、培養し、そしてクローンニング手順を繰り返す。
【０１００】
（ＣＤＲ移植によるヒト化抗プリオンダイマー抗体の生成）
プリオン−ダイマーを認識するモノクローナル抗体の治療の可能性は、ＣＤＲ移植と呼ばれるプロセスによってヒト可変領域上にマウス抗体の可変領域を融合移植することにより著しく向上し得る（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．編 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６およびその中の参考文献に記載）。この方法は、マウス抗体の大部分を等価のヒトタンパク質と置換することによって、治療抗体調製物の免疫原性を減少させる。この方法を以下に簡潔に述べる。
【０１０１】
上述のように産生され特徴づけられた、マウスモノクローナルをコードするｃＤＮＡを、重鎖および軽鎖の可変領域に対して設計された特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。これらの可変領域を、ヒト抗体の定常領域上にクローニングして、当業者に公知の方法を用いてキメラ抗体を生成する（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．編 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６に含まれる参考文献に述べられている）。これらのキメラ抗体を、哺乳動物の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞；ＣＨＯ）または大腸菌のいずれかにおいて組換え発現する。
【０１０２】
（大腸菌における抗体フラグメントの組換え発現）
大腸菌における組換え発現のために、元のマウスモノクローナル抗体細胞株から増幅した、またはヒト化キメラ抗体から増幅したいずれかの可変領域を、ｓｃＦＶフラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして発現し、そして当業者公知の方法を用いて適切な大腸菌株（例えばｔｒｘＢ変異株）の細胞質またはペリプラズムに発現させる。これはＡｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．編 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６およびその後の参考文献に述べられている。
【０１０３】
ｓｃＦＶフラグメントの精製を容易にするために、可変領域を、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに６−ヒスチジンタグを含む発現ベクターにクローニングする。タグの付加は、ｓｃＦＶによるプリオンダイマーの認識または機能に影響を与えない。タンパク質の発現のために、ｔｒｘＢ変異体大腸菌株（例えば、ＡＤ４９４またはＢＬ２１ｔｒｘＢ；Ｎｏｖａｇｅｎ）におけるクローンを、適切な抗生物質を含む１００ｍｌのＬＢに接種し、そして３０℃で１晩培養する。培養物を、新鮮な培地で１：５０に希釈し、そして０．６〜１のＯＤ６００ｎｍになるまで３０℃で培養する。培養物を、ＩＰＴＧまたは発現系に適切な他のインデューサーの添加によって誘導し、そして培養物をさらに３〜４時間、２５℃で培養する。細胞材料を、遠心分離によって単離する。
【０１０４】
（抗体の精製）
抗体フラグメントを、当業者に公知の標準的方法を用いて、ハイブリドーマ上清、ヒト化ＩｇＧでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、または組換え大腸菌培養物のいずれかから精製する。簡単に言えば、モノクローナル抗体を、粗培養上清から（任意の）硫安沈殿後のプロテインＧまたはプロテインＡセファロースカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。代表的には、ハイブリドーマまたはＣＨＯ細胞株からの粗上清を４０％飽和の硫酸アンモニウムの添加によって硫安沈殿し、４℃で少なくとも１時間インキュベートする。沈殿物を４℃で３０分間１５０００ｇでの遠心分離により収集する。ペレットを約２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、そして製造業者の指示に従って、リン酸緩衝化生理食塩水で平衡化したプロテインＧセファロースまたはプロテインＡセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に載せる。精製した抗体を、１００ｍＭのグリシンｐＨ２．８を用いて溶出し、そして高いｐＨの高濃度のリン酸緩衝液中に直接収集する。精製したタンパク質をＰＢＳに対して広範囲で透析する。
【０１０５】
（大腸菌における組換え抗体フラグメントの発現および精製）
大腸菌からの組換えｓｃＦＶフラグメントの精製を、標準的方法を用いて行う。実施例５に記載したヒスチジンタグ付けしたｓｃＦｖフラグメントの場合、発現培養物からの細胞ペレットを、超音波を用いてまたは専売のデタージェント溶菌（例えば、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ；Ｎｏｖａｇｅｎ）によるいずれかで溶菌し、そして遠心分離により澄明にする。上清画分を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウムｐＨ７．４、または類似の緩衝液中のＣｕまたはＮｉとともに充填した固定化金属イオンアフィニティーキレート（ＩＭＡＣ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライする。非特異的に結合したタンパク質を除去するために洗浄した後、ｓｃＦｖを、同じ緩衝液中の０〜５００ｍＭのイミダゾールのグラジエントを用いて溶出する。イミダゾールを透析によって除去して保存する。他の標準的なタンパク質精製方法も、大腸菌からの組換え抗体フラグメントの単離に適切である。
【０１０６】
（プリオン疾患の治療のための治療用抗体調製物の処方）
精製したモノクローナル抗体もしくは組換えキメラ抗体およびこれらのフラグメントを、上記のように調製し、そして内毒素汚染がないことを示す。抗体を、適切なキャリアタンパク質（例えば、血清アルブミン）とともにまたはなしのいずれかで、０．９％塩化ナトリウムとともにまたはなしで、およびデキストロース、ソルビトール、スクロース、またはマニトールのような適切な安定化剤の存在または不在下で処方する。抗体は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で処方されるべきである。
【０１０７】
（治療用抗体でのプリオン疾患の治療）
抗プリオンダイマーモノクローナル抗体の治療応用のために、モノクローナル抗体でのリンパ腫または他のガンの治療に用いられているのと類似のプロトコルを用い得る。適切な投与スケジュールの例は、５％デキストロース水溶液を含む０．９％塩化ナトリウム中で１ｍｇ／ｍｌの濃度（最終濃度）の注入液として処方した抗体を調製することである。注入液を、数時間かけてゆっくりとした静脈内注入として適用する。使用する抗体の濃度は４００ｍｇ／ｍ２体表面積までであり、そして投与は週に１回８週にわたって繰り返される。６００ｍｇ／ｍ２を週に１回４週間のような代替の投与スケジュール、または当業者に公知の他のスケジュールも、抗体の投与に適切である。
【０１０８】
（血液脳関門を通る治療用抗体フラグメントの取り込みの改善）
抗プリオンダイマー抗体の治療応用の有効性は、抗体が中枢神経系（ＣＮＳ）に達する能力に依存する。ＣＮＳへの抗体の接近を促進させるための多数の利用可能な方法は、治療用抗体の接種とともに使用する場合、接種のみについて増強された有効性を提供し得る。このようなプロセスの特定の例は次の通りである；１）標準的方法を用いる抗トランスフェリンレセプター抗体への治療用抗体の結合：Ｌｅｅ ＨＪ、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｂ、Ｌｅｓｌｅｙ Ｊ、Ｂｉｃｋｅｌ Ｕ、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ．（２０００）「Targeting rat anti-mouse transferrin receptor monoclonal antibodies through blood-brain barrier in mouse」Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２９２：１０４８−５２および類似の論文に記載されている、２）接種後に血液脳関門を低くするために薬剤Ｃｅｒｅｐｏｒｔ（Ａｌｋｅｒｍｅｓ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の使用、３）逆行輸送による送達のための破傷風菌毒素レセプター結合ドメイン（Ｈｃ）のような因子に対する抗体の結合、４）組換え抗体産生細胞（例えば、グリアまたはシュワン細胞）のＣＮＳへの直接接種。
【０１０９】
したがって、本発明は、ＴＳＥ感染の治療およびそのための抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】本発明の抗体がプリオンダイマーに結合していることを説明するための、ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳ホモジネートのブロットを示す。
【図２】本発明の抗体がプリオンダイマーに結合していることを説明するための、ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳ホモジネートのブロットを示す。
【図３】本発明の抗体がプリオンダイマーに結合していることを説明するための、ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳ホモジネートのブロットを示す。
【図４】本発明の抗体がプリオンダイマーに結合していることを説明するための、ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳ホモジネートのブロットを示す。
【図５】選択された哺乳動物および鳥類のＰｒＰｃタンパク質の多重アラインメントを示す。
【図６】選択された哺乳動物および鳥類のＰｒＰｃタンパク質配列の配列の対の相違を示す。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）因子による感染の治療のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、ヒトにおけるクロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）およびクールー病、ウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ならびにヒツジにおけるスクレイピーを含む、致命的な神経学的疾患の一群である。ＴＳＥは、感染した動物の脳組織内の正常な宿主タンパク質の病原性タンパク質への変換によって特徴づけられる。タンパク質の病原性形態は、しばしばプリオンと呼ばれ、そして物理的および化学的分解に非常に抵抗性である。プリオンは、ＴＳＥ疾患が動物間で伝わる伝染性因子であると考えられる。
【０００３】
食肉製品、特に、ウシのＴＳＥの形態であるＢＳＥに感染している可能性のある牛肉の消費に関する危険性について、近年、多くの公的な警告がなされている。この関心の多くは、ヒトによって食べられた場合、ＢＳＥプリオンが、ある場合には、異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）と呼ばれる不治のヒト形態の疾患を引き起こし得るという考えに関連する。
【０００４】
ＴＳＥに感染したヒトについての予後は良くなく、利用できる有効な治療法がない。しばしば、診断から死亡までの期間は短く、そして患者ならびに患者の周囲のヒトおよび患者の介護者の両方とも不安である。
【０００５】
プリオンタンパク質のフラグメントに対する抗体が惹起されることは公知である。Ｓｏｕａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１：３１，２３３８−２３４６頁は、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答の両方を誘発するペプチドを記載している。しかし、得られた抗体を用いても、プリオンタンパク質腫瘍の減少には至らなかった。
【０００６】
プリオンタンパク質に対する抗体を惹起するための困難性は、ペプチドフラグメントが弱い免疫原であることであり、そして得られた抗体は、しばしば親和性が弱い。純粋な病原性プリオンタンパク質自身を用いる場合、これは得られた組成物が、病原性タンパク質を含むおそれがあるという結果となり、したがって、臨床での使用に適さない。
【０００７】
抗プリオン抗体であるｍＡｂ ６Ｈ４はまた、Ｐｒｉｏｎｉｃｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから市販されている。この抗体は、代表的には、検出可能マーカーに結合された二次抗体を用いて、プリオンタンパク質を検出するために用いられ得、この二次抗体は一次抗体に結合する。
【０００８】
本発明者らによって発見された困難性は、プリオンで汚染されていると思われる器具、または汚染されていると思われるがプリオンを破壊することを意図した処理を施されている器具への、この抗体の結合が、感染力に相関しないことである。例えば、プロテアーゼで消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いで抗プリオン抗体でプロービングした、プリオン感染したマウス脳ホモジネートは、陰性の結果、すなわち抗体結合がないことを示すことが、本発明者らにより発見されている。それにもかかわらず、この材料は感染力を保持する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の目的は、ＴＳＥ因子からの罹患、ＴＳＥ因子による感染の危険性、またはＴＳＥ因子によって引き起こされる他の疾患に有効な治療法、治療薬、および／または予防薬を提供することにある。
【００１０】
さらなる目的は、プリオンタンパク質に結合しそしてプリオン疾患を治療するために用いられ得る抗体の代替の産生、および特定の実施態様では、改良された産生を提供することにある。
【００１１】
したがって、本発明は、プリオンタンパク質のダイマーに結合する抗体を投与する工程を含む、ＴＳＥ感染の治療方法を提供する。
【００１２】
抗体は、好ましくはダイマーに特異的であり、すなわちダイマーに結合するが実質的にはプリオンのモノマー形態に結合せず、そして以下に詳細に記載する方法によって得られ得る。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、プリオンタンパク質のダイマーに結合する抗体を含む、ＴＳＥ感染の治療のための薬学的組成物を提供する。
【００１４】
本発明の抗体は、プリオンタンパク質もしくはそのアナログ、または該タンパク質もしくはそのアナログのフラグメントを含む抗原で動物を免疫し、該動物から抗体を含む抽出物を得、そして該抽出物からプリオンダイマーに結合する抗体を単離することによって適切に得られる。マウス、ヒツジ、ヒト、およびウシの（ならびに他の）プリオンタンパク質配列は公知であり、したがって、例えば、少なくとも７個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１４個のアミノ酸のフラグメントであるペプチドを調製することは、簡単である。アナログは、それぞれのプリオンタンパク質配列の比較、および１以上のプリオンタンパク質ソースに由来する領域との混成物を合成することによって調製され得る。あるいは、１０個毎に２個までのアミノ酸が置換される合成配列が、調製される。
【００１５】
本発明の抗原は、ペプチドの混合物を含み得る。これらのペプチドは、１以上のプリオンタンパク質配列とは異なる領域、および／または１以上のプリオンタンパク質配列と同じ領域を含み得、この同じ領域は同一種内の変異を含み得る。
【００１６】
多くの哺乳動物のプリオンタンパク質配列間に高度の相同性があることは公知であり、重要な機能性残基および構造エレメントの両方とも非常に保存されている。したがって、本発明の免疫ペプチドを調製するために、これらの保存された配列領域またはそのフラグメントを用いることが可能である。これらのペプチドは、１以上のプリオンタンパク質配列とは異なる種々の領域を含み得る。種間の高度のプリオンタンパク質配列相同性を、図５および６に示す。
【００１７】
図５では、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重アラインメントプログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９９４）を用いて、ヒトのプリオンタンパク質前駆体であるＰｒＰｃを、ハムスター、ヒツジ、ミュールジカ、ヘラジカ、マウス、ウシ、ネコ、およびニワトリの相同タンパク質とアラインした。このアラインメントに用いた配列は、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースから入手し、そして用いた配列のデータベース登録番号を以下に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
重要な構造上の特徴は、図５のアラインした配列上に示されており、そして番号付けは、ヒトＰｒＰｃ配列を参照する。配列の重要な構造上の特徴のいくつかは以下のとおりである（括弧中の用語はこれらの特徴が図５にどのように表されているかを示す）。
【００２０】
１．シグナルペプチドは、２２／２３位で切断されて成熟タンパク質を生じる（シグナルペプチド）
２．Ｎ末端領域は、大部分は構造化されておらず、そして可撓性であるが、残基３７から５３はＰｒｏ４４でヒドロキシル化部位を形成する、伸長したＰＰＩＩへリックスを形成し得る（Ｐｒｏヒドロキシル化）
３．Ｎ末端はまた、銅結合に関与する５／６反復のセグメントを含む（反復領域）
４．タンパク分解は、Ｌｙｓ１１０とＨｉｓ１１１との間で起こり得る（切断）
５．膜貫通セグメントであると考えられる短い疎水性残基領域（疎水領域）がある
６．Ｃ末端は、３つのα−へリックス（ａ１−３）および２つのβ−シート（ｂ１−２）の一団によって特徴づけられる
７．ジスルフィド架橋は、残基Ｃｙｓ１７９と残基Ｃｙｓ２１４との間に生じる（−ＳＳ−）
８．アスパラギン残基Ａｓｎ１８１およびＡｓｎ１９７は、Ｎグリコシル化に利用される（炭水化物基；保存されたモチーフはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒである）（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）
９．残基Ｓｅｒ２３１はＧＰＩ（糖脂質）アンカー部分が付着する残基を提供する（ＧＰＩアンカー）。
【００２１】
図５の多重アラインメントの調査において、以下の機能的に重要な残基は、示した哺乳動物種では完全に保存されていた。
【００２２】
・シグナルペプチド切断部位（Ｃ２３−Ｋ２４）
・Ｐｒｏ４４ヒドロキシル化部位
・タンパク分解切断部位（Ｋ１１０−Ｈ１１１）
・Ａｒｇ−グリコシル化部位（Ｒ１８１、Ｒ１９７）
・ジスルフィド架橋（Ｃ１７９、Ｃ２１４）
・ＧＰＩアンカー（Ｓ２３１）
【００２３】
異なった領域は、Ｎ末端配列およびいくつかの構造エレメント（例えば、α−へリックス）にある傾向にあるが、β−シートおよび疎水性領域は全体的に保存されている。
【００２４】
図６は、タンパク質配列の個々の対のアラインメントに由来する同一性の割合を示す。さらに、この図は、プリオンタンパク質のアミノ酸配列の哺乳動物種間の高いレベルの同一性を証明する。好ましくは、本発明の方法および組成物に用いるためのペプチドは、同定された保存領域のフラグメントから調製される。
【００２５】
プリオンダイマーに対して選択的な抗体を作る一つの方法は、動物を免疫し、そして血清を抽出することである。これをプリオンダイマーカラムに供して、ダイマーに結合する抗体を同定する。次いで、これらの抗体を、プリオンモノマーとの交差反応性についてテストして、交差反応する抗体を除去する。除去は、プリオンモノマーを投入したカラムを用いて行われ得、次いでそこから出てくる抗体について、交差反応性がないことをテストする。
【００２６】
単離したプリオンダイマーは、本発明のさらなる実施態様を形成する。この単離された物質は、上述した方法でカラムから、または簡単にはプリオンダイマーを解析するために用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一部を切り出すことによって得られ得る。あるいは、他の分離技法を用いて、ホモジナイズしたプリオン感染マウスの脳からプリオンダイマーを抽出し得る。プリオンモノマーに結合しそして交差反応性である抗体を用いて、このようにして得た物質がプリオンダイマーであり、そして同じ分子量の他のタンパク質ではないことを確認し得る。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様では、抗体は、必要に応じて一端または両端にシステイン残基が付加された、プリオンタンパク質のフラグメントであるペプチドまたは該フラグメントを含むペプチドで、特定の例では配列番号１から８より選択されるペプチドで、動物を免疫することによって得られる。システイン残基（配列またはフラグメントについて言うときは、末端に０、１または２個のシステイン残基を有する配列またはフラグメントを含むことを意図する）の使用は、ペプチドがシステイン−システイン結合によってオリゴマーを形成し得るという利点を提供する。結果として、免疫するペプチドとしては、直鎖状モノマー、直鎖状ダイマー、環状モノマー、環状ダイマー、および反復プリオンペプチド配列および環状領域を有する他のオリゴマー形態が挙げられる。これらのペプチドは、より広範囲の免疫抗原を動物に提示させる。疾患形成因子の天然の形態をよりそっくりに模倣し得る環状形態が提示される。病原性因子のダイマー形態もよりそっくりに模倣し得るダイマー形態、そのいくつかの環状形態が提示される。したがって、本発明は、図５に示すすべてのプリオン配列のすべてのフラグメントまで及び、このフラグメントは少なくとも７アミノ酸長であり、そして一端または両端にシステイン残基を有する。
【００２８】
ペプチドは、種々の投与経路により動物に導入され得る。好ましい実施態様では、ペプチドは、腹膜中に注入され、この部位は、（ａ）外科的に容易に接近可能であり、（ｂ）一度に大量の液体を注入することができ、そして（ｃ）血流へのペプチドの迅速な吸収が可能である。
【００２９】
使用する場合、抗体は、全身循環へ送達され得る。抗体がプリオンダイマーに結合することにより、ダイマーを除去および破壊し、ならびに感染を減少させる。脳内で生じるプリオンダイマーが、血液脳関門を越えて拡散し、そしてダイマーは関門を通過した後に掃討されるので、関門の全身側の抗体の存在は濃度勾配を生じると考えられ、これが感染および疾患を減少させることを助ける。
【００３０】
抗体が血液脳関門を通過し得るように輸送ベクターに抗体を結合することが公知である。例えば、抗体は、アビジン／ビオチンを介してＯＸ２６モノクローナル抗体に結合され得、後者の抗体は血液脳関門を通過するための輸送ベクターとして作用する。さらに詳細には、Ｂｉｃｋｅｌら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４６（２００１）２４７−２７９に記載されている。したがって、本発明のさらなる実施態様は、例えば、Ｂｉｃｋｅｌらによって総説された技術を用いて、血液脳関門を通過するように適合した抗体にある。
【００３１】
本発明のさらに好ましい実施態様は、キャリアの使用により抗原に対する免疫応答を高めることにある。したがって、抗体は、動物を抗原で免疫することによって得られ、ここで、抗原は、プリオンタンパク質またはプリオンタンパク質のアナログのフラグメントである本発明のペプチドまたは該フラグメントを含む本発明のペプチドを含み、そして抗原はさらに、必要に応じてリンカーを介して、ペプチドと共有結合したキャリアを含む。これは、抗体産生の刺激を改善する利点がある。キャリアは、広範な免疫原性キャリア物質、例えば、タンパク質、熱ショックタンパク質、トキソイドから選択され得、バクテリアタンパク質およびバクテリアトキソイドのような例、特にマイコバクテリアタンパク質、百日咳タンパク質およびトキソイド、ジフテリアタンパク質およびトキソイドが挙げられる。Ｄｅ Ｓｉｌｖａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９９９ ５−６月：１０（３）；４９６−５０１には、免疫原性のキャリアとしてのＰＰＤの使用が記載されており、キャリアとしての熱ショックタンパク質は、Ｌｕｓｓｏｗら、Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９１ １０月：２１（１０）；２２９７−２３０２に記載されている。動物は、抗体のソースであり得、この場合、抗体は動物から得られ得、同定されたプリオンダイマーに結合する抗体である。動物は、処置されているかまたは処置されるべきであり得る。したがって、本発明はまた、ＴＳＥの治療方法および／またはＴＳＥ感染に対して動物を免疫する方法を提供し、本発明のペプチドおよび／または本発明の抗原を投与する工程を含む。
【００３２】
さらに、抗原／キャリアを投与する前または同時のいずれかに、動物をキャリアに対して感作することが好ましい。したがって、実施例に記載されている特定の方法では、抗体産生はキャリアに対する免疫応答を刺激する初回抗原を投与する工程を含む。また、抗体産生が改良されている利点がある。初回抗原は、それ自体のキャリアまたはキャリアのフラグメントであり得る。
【００３３】
特定の例では、キャリアは、マイコバクテリアタンパク質であり、そして初回抗原はＢＣＧワクチンを投与することによって投与される。このアプローチのさらなる詳細は、例えばＬｕｓｓｏｗら、Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９１ １０月：２１（１０）；２２９７−２３０２に記載されている。
【００３４】
本発明のさらなる局面は、本発明の単離されたペプチドおよび抗原、ならびにそれらの使用にある。
【００３５】
用語「伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）因子」は、病原性プリオンタンパク質中間体によって明らかに伝染されるすべての神経学的疾患を含むことを意図する。このようなＴＳＥとしては、代表的には、ヒト疾患のクロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ）、クールー病、致命的家族性不眠症、およびゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群が挙げられる。非ヒトＴＳＥとしては、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、スクレイピー、ネコ海綿状脳症、慢性消耗病、および伝染性ミンク脳症が挙げられる。現在、ｖＣＪＤがＢＳＥのヒト形態であると理解されるならば、あるＴＳＥ因子が種の障壁を交差し得、そして非ウシ起源の新規なＴＳＥが将来明らかになり得ることは明白である。ＴＳＥ感染という場合も、プリオン疾患をいう。
【００３６】
本発明の抗体および／またはペプチドは、英国のスクレイピー（ヒツジ）の群れのすべてまたは一部を除去するために有効な治療法、治療薬および／または予防薬に用いられ得る。ヒツジでは、しばしば群れの２０％までがスクレイピーに感染している群れがある。したがって、危険であることが知られている隔離された群れにワクチン接種すること、および／または感染したヒツジをプリオンタンパク質に結合する抗体で治療することは有益である。本発明の抗体および／またはペプチドは、同様に、英国のＢＳＥ（ウシ）の群れのすべてまたは一部を除去するために用いられ得る。
【００３７】
本発明のさらなる局面は、ＣＪＤまたは新しい異型ＣＪＤの兆候を提示している、または危険であると同定されたヒトを治療するための抗体および／またはペプチドの使用にある。
【００３８】
もう一つの実施態様では、本発明の抗体および／またはペプチドは、例えば、虫垂、扁桃腺から、または腰椎穿刺によって取り出された組織に基づく、ＴＳＥ感染の早期診断を可能にする。早期診断により、治療の成功の可能性、または少なくとも治療による延命は、増加する。
【００３９】
さらに他の実施態様では、本発明の抗体および／またはペプチドは、動物における広範なワクチン接種プログラムを提供するために用いられる。このようなワクチン接種プログラムが、事前の診断またはテストなしで行い得ることが予測される。
【００４０】
本発明の抗体は、必要に応じて、プリオンタンパク質、好ましくは特異的にプリオンダイマーに結合するモノクローナル抗体であり、そしてプリオン疾患の治療に用いられ得る。
【００４１】
実施例により詳細に記載するように、プリオン株３０１Ｖは、最終的にＢＳＥにかかったホルスタイン−フリージアンウシ由来のマウス継代単離物であり、これはプリオン株の例として用いられる。感染は脳内接種により生じることが知られており、そして臨床的徴候の発現に必要なインキュベーション期間は非常に均一である。すなわち、感染性因子の投与量が充分であるならば、疾患の古典的兆候は接種後の所定の時間で出現する（ＶＭマウスにおいて、これは１２０日である）。明らかな理由について、ヒトにおけるこれらの特性はテストされていないが、マウスのバイオアッセイが、最も近い利用可能なモデルとみなされ、したがってヒトにおけるＢＳＥ感染の良好な指標である。
【００４２】
本発明の特定の実施態様の方法および組成物は、以下により詳細に記載されており、添付の図によって説明される。
【実施例】
【００４３】
（消化したマウス脳におけるダイマー検出）
ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳のホモジネートを、プロテアーゼを用いて中性ｐＨおよび６０℃にて３０分間消化した。全タンパク質消化物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてウエスタンブロッティングによってニトロセルロースメンブランに移した。これらを細片に切断し、そしてＣＡＭＲ抗プリオン抗体（ウサギで産生）でプロービングした。一般の二次抗体（ヤギ抗ウサギ）を西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し、そしてＴＭＢ比色定量基質による検出に用いた。
【００４４】
この時点で、予測した結果は、抗プリオン抗体ｍＡｂ ６Ｈ４（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手）を用いるコントロールブロット（第７番）と同じ結果となるということであった。このコントロールブロットでは、プロテアーゼ消化した感染性コンホメーションのプリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）についての代表的な３つのバンドパターン（グリコシル化状態）が見られる。
【００４５】
しかし、この実施例におけるブロットは、このパターンを示さなかった。ブロット１は、プリオン分子のＮ末端領域に対応するＰＰＤ結合ペプチドに対して惹起したポリクローナル抗体を使用する。このレーンでは何も見られない。タンパク質のこの部分は、タンパク分解を受けやすく、そのためレーン（２および３）で何も見られないことは意外ではない。図１の左側のブロット１を参照のこと。レーン１は、分子量マーカーである。
【００４６】
ブロット２は、プリオン分子中のさらなるペプチド配列に対して惹起した第２の抗体を有する。これは、ある範囲のグリコシル化状態を有するプリオンダイマーに対応する分子量で、ほぼ等距離で強度が異なる、少なくとも９つのバンドを示す。図１のブロット２を参照のこと。
【００４７】
ブロット３抗体は、同様のプロファイルを示す；ブロット４も示すが、その結果は質が悪くて結論を得られない。図１のブロット３および４を参照のこと。
【００４８】
コントロールブロット７とともに図２に示すブロット５および６も、複数のバンドのパターンを示す。
【００４９】
（消化したマウス脳におけるダイマー検出）
上記の実施例を繰り返し、そして結果を図３および図４に示す。
【００５０】
ブロット１は、レーン１および５に分子量マーカーを示す。レーン２は、組換えマウスＰｒＰであり、組換えマウスＰｒＰオリゴマーを示す。レーン３は、プロテアーゼ消化した感染性マウス脳のホモジネートに対する抗体応答がないことを示す。レーン４は、非消化コントロールにおける抗体応答である。
【００５１】
ブロット２は、上記のとおりであるが、プロテアーゼ消化した試料におけるこれまでのバンドパターンを示す。
【００５２】
ブロット３は、抗体３応答を示す。ここでは、組換えマウスＰｒＰに対するいくつかの応答がある（レーン２）。レーン３は、複数の（ダイマーＰｒＰ）バンドパターンだけでなく、いくつかのモノマーＰｒＰ応答も示す。
【００５３】
ブロット７は、６Ｈ４ ｍＡｂ抗体コントロールである。ここでは、組換えマウスＰｒＰオリゴマーの良好な検出がある（レーン２）。レーン３は、限定的プロテアーゼ処理したＰｒＰＳｃの大量のジグリコシル化形態、加えてＢＳＥ（３０１Ｖ）株に代表的なより少量のモノグリコシル化および非グリコシル化形態を示す。ダイマー検出は明らかでない。
【００５４】
（ダイマー優先抗体を含む抗体の調製）
実施例において、本発明者らは６つのポリクローナル抗体を用いた。これらのうち３つはダイマーのみを検出しそしてモノマーに結合しないが、１つはモノマーおよびダイマーの両方と交差反応する。
【００５５】
合成したプリオン模倣ペプチドでウサギに免疫接種することによって、ポリクローナル血清を産生した。これらのペプチドを、ヒト、マウス、およびウシのプリオンタンパク質アミノ酸配列間の高い相同性の領域に基づいて設計した。
【００５６】
配列番号４、５、７および８が、ダイマー反応性抗体を産生した。
【００５７】
両端にシステインを有する（上記を参照のこと）および一端のみにシステインを有するペプチドを合成した。キャリアタンパク質の表面上の抗原の直鎖形態およびループ構造の両方を提示するために、この方法を用いた。
【００５８】
ペプチドを商業的に合成し、細菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓの弱毒化株に由来するキャリアタンパク質ＰＰＤ（精製したタンパク質誘導体）にカップリングした。これを凍結乾燥して、リンカーを介してペプチドに結合するために使用する。
【００５９】
抗プリオンポリクローナル抗体を、以下のように産生した。
【００６０】
免疫前血清の試料（約１ｍｌ）をＤｕｔｃｈウサギの群のそれぞれから採集した。ウサギに、皮内用途用に再構成して凍結乾燥したＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）ワクチンを注射した。再構成したＢＣＧワクチンの０．１ｍｌ用量を、ウサギの首筋に２ヶ所投与した。４週後、０．６ｍｇの各ペプチド−ＰＰＤ結合体を測定し（１システインおよび２システイン型のそれぞれの０．３ｍｇ）、そして１ｍｌの０．９％滅菌生理食塩水に溶解した。
【００６１】
等容量の不完全フロイントアジュバントを加え、そして各ウサギにつき得られたエマルジョンの０．７５ｍｌアリコートを各後肢に、そして０．２５ｍｌアリコートを首筋の２ヶ所に筋肉内注射した。４週後に、工程３および４のように調製したペプチド−ＰＰＤ結合体を含むブースト注射を行った。ブースト注射は、各ウサギの首筋への４ヶ所の０．２５ｍｌ注射からなる。１回目のブースト注射の７〜１４日後に、４ｍｌのテスト採血を行い、抗体力価について血清をＥＬＩＳＡによって評価した。２回目のブースト注射を１回目の４〜６週後に行った。
【００６２】
３回目のブースト注射を４〜６週後に行った。３回目のブースト注射の６〜８週後に４ｍｌのテスト採血を行って、抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。次いで、４回目のブースト注射を行った。
【００６３】
４回目のブースト注射の７〜１４日後に、４ｍｌのテスト採血を行って、抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。最後の全採血を行い、そして血液を採集した。血清を遠心分離によって分離し、そして−２０℃で保存した。
【００６４】
抗体力価の分析を、ＥＬＩＳＡを用いて行った。ペプチドに対する応答をキャリアタンパク質に対する応答と区別するために、イムノアッセイプレートを、異なるキャリアタンパク質（ＫＬＨ）に結合した同じペプチドでコーティングした。
【００６５】
記載の合成ペプチド配列の免疫接種によって産生した３つの抗体は、ダイマー形態の分子に優先的に結合する。
【００６６】
（マウスにおけるプリオン感染の治療のための、ＰＰＤ結合したプリオン由来ペプチドを用いる免疫接種プロトコル）
ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳ホモジネートの０．１％（ｗ／ｖ）懸濁液の２０ｍｌをＶＭマウスに大脳内接種した。２週後、接種したペプチド結合体に対する免疫応答を刺激するためにマウスにＢＣＧを接種した。さらに２週後、不完全フロイントアジュバントまたは適切なコントロールと１：１で混合したＰＰＤ−ペプチド結合体１００ｍｌをマウスに接種した。結合体のペプチドを、配列番号１〜８から選択し、そして以下のように対応させた：
ペプチド１＝配列番号５
ペプチド２＝配列番号６
ペプチド３＝配列番号８
【００６７】
同じ濃度の結合体のさらに３つの接種物を２週間間隔で投与した。プリオン疾患の進行の臨床兆候について次の２〜６ヶ月にわたり、マウスを観察した。１３８日後の実験の結果を、表２にまとめる。
【００６８】
【表２】
【００６９】
この実験の結果は、これらのＰＰＤ−ペプチドのそれぞれでの免疫接種が、ＴＳＥに予め曝露したマウスの平均生存期間を増加させることに成功したことを示す。ＰＰＤ−ペプチド１およびＰＰＤ−ペプチド２での免疫接種は、ＴＳＥに予め曝露したマウスの平均生存期間の特に著しい増加を示した。１３８日終了時のこれらの２つのペプチドについての結果の統計分析を以下に示す。
【００７０】
上記の実験結果を解釈する場合、マウスが予めＴＳＥに曝露されているので、実験がマウスにおけるプリオン感染の治療のためのペプチドの有効性の非常に厳格なテストを表すことを認識すべきである。したがって、本発明のペプチドは、ＴＳＥに予め曝露したマウスの生存期間を増加させることを示し、そして治療法における使用に適切な候補物である。
【００７１】
ペプチドはまた、予防的治療、すなわち感染因子の曝露の前にペプチド−キャリア結合体に動物を曝露することによる使用に適切である。
【００７２】
（ＴＳＥに予め曝露したマウスの平均生存期間におけるＰＰＤ−ペプチド１およびＰＰＤ−ペプチド２の効果の統計分析）
一元ＡＮＯＶＡ：グループ２（ＰＰＤ−ペプチド２）対グループ８（コントロール−ＢＣＧのみ）
グループ４についての分散分析
ソース ＤＦ ＳＳ ＭＳ Ｆ Ｐ
グループ８ １ ２６．８８９ ２６．８８９ ３５．２９ ０．００１
誤差 ７ ５．３３３ ０．７６２
合計 ８ ３２．２２２
【００７３】
【数１】
【００７４】
２試料Ｔ検定およびＣＩ：グループ８（コントロール−ＢＣＧのみ）、グループ２（ＰＰＤ−ペプチド２）
グループ８対グループ２についての２試料Ｔ
Ｎ 平均 標準偏差 ＳＥ平均
グループ８ ９ １２９．６７ ５．００ １．７
グループ２ ９ １３５．４４ ２．０１ ０．６７
差＝ｍｕグループ８−ｍｕグループ２
差についての推定：−５．７８
差についての９５％ＣＩ：（−９．７８、−１．７８）
差のＴ検定＝０（対なし＝）：Ｔ値＝−３．２２ Ｐ値＝０．００９ ＤＦ＝１０
【００７５】
マン−ホイットニー検定およびＣＩ：グループ８（コントロール−ＢＣＧのみ）、グループ２（ＰＰＤ−ペプチド２）
グループ８ Ｎ＝９ 中央値＝１３３．００
グループ２ Ｎ＝９ 中央値＝１３６．００
ＥＴＡ１−ＥＴＡ２についての点推定は−３．００である
ＥＴＡ１−ＥＴＡ２についての９９．２％Ｃｌは（−１３．００、−０．００）である
Ｗ＝５４．０
ＥＴＡ１＝ＥＴＡ２対ＥＴＡ１＜ＥＴＡ２の検定は０．００３１で有意である
テストは０．００１６で有意である（つながりについて調整された）
【００７６】
統計的に、コントロール群とＰＰＤ−ペプチド２で免疫した群との間に認められる差は、非常に有意であることが示された。
【００７７】
マン−ホイットニー検定およびＣＩ：グループ８（コントロール−ＢＣＧのみ）、グループ１（ＰＰＤ−ペプチド１）
グループ８ Ｎ＝ ９ 中央値＝１３３．００
グループ１ Ｎ＝１０ 中央値＝１３３．００
ＥＴＡ１−ＥＴＡ２についての点推定は−０．００である
ＥＴＡ１−ＥＴＡ２についての９５．５％ＣＩは（−１０．００、０．００）である
Ｗ＝７５．０
ＥＴＡ１＝ＥＴＡ２対ＥＴＡ１＜ＥＴＡ２の検定は０．１１８２で有意である
検定は０．０６２８で有意である（つながりについて調整された）
α＝０．０５で拒絶できない
【００７８】
２試料Ｔ検定およびＣＩ：グループ８（コントロール−ＢＣＧのみ）、グループ１（ＰＰＤ−ペプチド１）
コントロール対ＰＰＤ−ペプチド１についての２試料Ｔ
Ｎ 平均 標準偏差 ＳＥ平均
グループ８ ９ １２９．６７ ５．００ １．７
グループ１ １０ １３３．０００ ０．４７１ ０．１５
差＝ｍｕグループ８−ｍｕグループ１
差についての推定：−３．３３
差についての９５％ＣＩ：（−７．１９、０．５３）
差のＴ検定＝０（対なし＝）：Ｔ値＝−１．９９ Ｐ値＝０．０８２ ＤＦ＝８
【００７９】
統計的に、コントロール群とＰＰＤ−ペプチド１で免疫した群との間に認められる差は、有意である。
【００８０】
（プリオン疾患に感染したヒト被験者の免疫接種）
ペプチドは、上述したように本質的にＰＰＤまたはＢＣＧキャリアタンパク質に結合されている。この結合体は、当業者に公知の方法および組成物を用いて臨床患者への免疫接種を適切にするような方法で処方される。
【００８１】
結合体での最初の免疫接種、次いで２週間毎に２回の５０％濃度の注射、次いで２、３および４ヶ月目の追加の注射に基づく免疫接種プロトコルは、個体の治療方法に適切である。
【００８２】
（ウサギポリクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体の産生）
ウサギにおけるポリクローナル抗体の産生を以下に述べる。
【００８３】
Ｄｕｔｃｈウサギ（約２．５ｋｇ）を、新しい収容施設に約２週間飼育し、そして免疫前血清の試料（約１ｍｌ）をそれぞれから採集した。各ウサギに皮内用途用に再構成して凍結乾燥したＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）ワクチン（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍｉｎｓｉｔｕｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を注射した。再構成したＢＣＧワクチンの０．１ｍｌ用量を、ウサギの首筋に２ヶ所のそれぞれに投与した。ペプチド−ＰＰＤ結合体の最初の注射前４〜６週間、すべてのウサギを放飼する。
【００８４】
・等容量の不完全フロイントアジュバントを追加したペプチド−ＰＰＤ結合体（１ｍｌ）のそれぞれを合わせ、そして各ウサギにつき得られた各エマルジョンの０．７５ｍｌアリコートを各後肢に、０．２５ｍｌアリコートを首筋の２ヶ所に筋肉内注射する。４〜６週間放置する。
【００８５】
・最初のペプチド−ＰＰＤ結合体不完全フロイントアジュバント接種の４〜６週後に、最初のブースト注射を行う。ブースト注射は、各ウサギの首筋への４ヶ所の０．２５ｍｌ注射のみを含む。２回目のブーストを４〜６週の時点に行う。
【００８６】
・最初のブースト注射の７〜１４日後に、テスト採血（約４ｍｌ）を行う。
【００８７】
・最初のブースト注射の４〜６週後に２回目のブースト注射を行う。ブースト注射はまた、各ウサギの首筋への４ヶ所の０．２５ｍｌ注射のみを含む。３回目のブーストを４〜６週の時点に行う。
【００８８】
・２回目のブースト注射の４〜６週後に、３回目のブースト注射を行う。ブースト注射はまた、各ウサギの首筋への４ヶ所の０．２５ｍｌ注射のみを含む。
【００８９】
・３回目のブースト注射の６〜７週間後に、２回目のテスト採血（約４ｍｌ）を行い、そして、およそ数週の時点に４回目のブースト注射を行う。
【００９０】
４回目のブースト注射の７〜１４日後に、３回目のテスト採血（約４ｍｌ）を行う。血清分析結果を受け、次の３日以内に最後の全採血を行う。
【００９１】
マウスにおける抗体の産生のための免疫接種プロトコルは、上記のものと類似している。
【００９２】
１．再構成して凍結乾燥したＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）のマウス当たり２５ｍｌの皮内注射（０日目）
２．不完全フロイントアジュバント中のペプチド−ＰＰＤ結合体のマウス当たり８０ｍｇの腹腔内注射（２８日目）
３．２８日目のようにマウス当たり４０ｍｇを繰り返す（４２日目）
４．２８日目のようにマウス当たり４０ｍｇを繰り返す（４９日目）
５．尾静脈からテスト採血（５６日目）
６．ペプチド−ＰＰＤ結合体（アジュバントなしでなければならない）の静脈内注射（６３日目）
７．選択したマウスを融合（６６日目）
【００９３】
免疫応答を、終点を推定するために２倍希釈を用いて、遊離のペプチドまたはペプチド−ＫＬＨ結合体をコーティングしたプレートのいずれかを用いるＥＬＩＳＡによって評価する。遊離のペプチドでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートにおいて、免疫した動物については、代表的には、１：５１，２００と１：１０２，０００との間の力価が得られる。
【００９４】
モノクローナル抗体細胞株の生成のために、免疫接種したマウスの脾臓を取り出し、そして標準的方法を用いて骨髄腫細胞株と融合する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編、６章、１９６−２２４頁．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８））。適切な方法の例を以下に示すが、当業者は、他の類似のプロトコルが抗体産生細胞株の生成に使用され得ることを認識している。
【００９５】
（融合のための脾臓細胞の調製）
１．マウスを屠殺する。無菌的に脾臓を取り出し、そして１０ｍｌの無血清培地を含む組織培養ディッシュに入れる。夾雑している組織を脾臓から切り取りそして捨てる。
２．１ｍｌシリンジにつけた１９ゲージ針を用いて、脾臓を細裂する。細胞の大部分が離れるまで細裂し続け、そして脾臓を細かい部分に裂いた。ピペット操作により細胞塊を破壊する。滅菌遠心分離チューブ中に細胞および培地を移す。
３．１０ｍｌの無血清培地（予め３７℃に温める）で組織培養プレートおよび組織塊を洗浄し、そしてチューブ中で最初の１０ｍｌと合わせる。
４．細胞懸濁液を約２分間静置する。沈殿物から上清を注意深く取り除き、新しい遠心分離チューブに移す。
【００９６】
（融合技法）
融合の前に、融合パートナーとして用いる骨髄腫細胞は、凍結ストックから取り出し増殖しなければならない。
【００９７】
１．０．３ｇのＰＥＧのバイアルを５０℃の水浴中で溶解する。血清を含まない０．７ｍｌの培地を加え、３７℃の水浴に移す。
２．免疫した動物からの脾臓細胞を４００ｇにて、５分間遠心分離する。同時に２０ｍｌの骨髄腫細胞を遠心分離する。両方の細胞ペレットを、血清を含まない５ｍｌの培地に再懸濁する。
３．２つの細胞懸濁液を合わせて、１５ｍｌの丸底遠心分離チューブに移す。４００ｇで５分間遠心分離する。すべての培地を注意深く取り除く。
４．０．２ｍｌのＰＥＧ溶液を加える。チューブを軽く叩くことによって細胞を懸濁する。
５．４００ｇで５分間遠心分離する。血清を含まない５ｍｌの培地を加えて、ペレットを分散させる。必要ならば、チューブをはじいて細胞を再懸濁する。細胞をピペットで移さない。次いで、２０％ウシ胎児血清を含む５ｍｌの培地を加える。
６．４００ｇで５分間遠心分離する。上清を取り除き、そして２０％ウシ胎児血清、１×ＯＰＩおよび１×ＨＡＴを追加した１０ｍｌの培地に細胞を再懸濁する。２０％ウシ胎児血清および１×ＨＡＴを追加した２００ｍｌの培地に細胞を加える。
７．マイクロタイタープレートのウェル中に１００ｍｌの細胞を分配する。３７℃でＣＯ２インキュベーター中に入れる。
８．４〜５日後、ＨＡＴを含有する２０％ウシ胎児血清を追加した新鮮な１００ｍｌの培地の添加によって、細胞を培養する。
【００９８】
ＯＰＩは、低細胞密度でプレーティングした細胞の増殖を補助するために用いられる培地添加物である。これは、オキザロ酢酸、ピルビン酸、およびインスリンの溶液である。
ＨＡＴはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（薬剤選択培地）である。
他の通常用いられる薬剤選択方法は、ＡＨ（アザセリンおよびヒポキサンチン）である。
【００９９】
（単細胞クローニング）
陽性の組織培養上清を同定した後、次の工程は、抗体産生細胞をクローニングすることである。
・マルチウェルピペッターを用いて、９６ウェルプレートの各ウェルに２０％ＦＣＳおよび２×ＯＰＩを含む５０ｍｌの培地を加える。
・１００ｍｌのハイブリドーマ細胞懸濁液を取り出し、左上側のウェルに移す。ピペット操作により混合する。
・プレートの左側のカラムを下方に２倍希釈する（８ウェル、７希釈段階）。チップを捨てる。
・８ウェル多重チャンネルピペットを用いてプレートを交差して２倍希釈する。クローンは、２〜３日後に目に見えるようになり、そして７〜１０日後にスクリーニングの準備をするべきである。良好なウェルを選択し、培養し、そしてクローンニング手順を繰り返す。
【０１００】
（ＣＤＲ移植によるヒト化抗プリオンダイマー抗体の生成）
プリオン−ダイマーを認識するモノクローナル抗体の治療の可能性は、ＣＤＲ移植と呼ばれるプロセスによってヒト可変領域上にマウス抗体の可変領域を融合移植することにより著しく向上し得る（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．編 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６およびその中の参考文献に記載）。この方法は、マウス抗体の大部分を等価のヒトタンパク質と置換することによって、治療抗体調製物の免疫原性を減少させる。この方法を以下に簡潔に述べる。
【０１０１】
上述のように産生され特徴づけられた、マウスモノクローナルをコードするｃＤＮＡを、重鎖および軽鎖の可変領域に対して設計された特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。これらの可変領域を、ヒト抗体の定常領域上にクローニングして、当業者に公知の方法を用いてキメラ抗体を生成する（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．編 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６に含まれる参考文献に述べられている）。これらのキメラ抗体を、哺乳動物の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞；ＣＨＯ）または大腸菌のいずれかにおいて組換え発現する。
【０１０２】
（大腸菌における抗体フラグメントの組換え発現）
大腸菌における組換え発現のために、元のマウスモノクローナル抗体細胞株から増幅した、またはヒト化キメラ抗体から増幅したいずれかの可変領域を、ｓｃＦＶフラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして発現し、そして当業者公知の方法を用いて適切な大腸菌株（例えばｔｒｘＢ変異株）の細胞質またはペリプラズムに発現させる。これはＡｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．編 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６およびその後の参考文献に述べられている。
【０１０３】
ｓｃＦＶフラグメントの精製を容易にするために、可変領域を、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに６−ヒスチジンタグを含む発現ベクターにクローニングする。タグの付加は、ｓｃＦＶによるプリオンダイマーの認識または機能に影響を与えない。タンパク質の発現のために、ｔｒｘＢ変異体大腸菌株（例えば、ＡＤ４９４またはＢＬ２１ｔｒｘＢ；Ｎｏｖａｇｅｎ）におけるクローンを、適切な抗生物質を含む１００ｍｌのＬＢに接種し、そして３０℃で１晩培養する。培養物を、新鮮な培地で１：５０に希釈し、そして０．６〜１のＯＤ６００ｎｍになるまで３０℃で培養する。培養物を、ＩＰＴＧまたは発現系に適切な他のインデューサーの添加によって誘導し、そして培養物をさらに３〜４時間、２５℃で培養する。細胞材料を、遠心分離によって単離する。
【０１０４】
（抗体の精製）
抗体フラグメントを、当業者に公知の標準的方法を用いて、ハイブリドーマ上清、ヒト化ＩｇＧでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、または組換え大腸菌培養物のいずれかから精製する。簡単に言えば、モノクローナル抗体を、粗培養上清から（任意の）硫安沈殿後のプロテインＧまたはプロテインＡセファロースカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。代表的には、ハイブリドーマまたはＣＨＯ細胞株からの粗上清を４０％飽和の硫酸アンモニウムの添加によって硫安沈殿し、４℃で少なくとも１時間インキュベートする。沈殿物を４℃で３０分間１５０００ｇでの遠心分離により収集する。ペレットを約２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、そして製造業者の指示に従って、リン酸緩衝化生理食塩水で平衡化したプロテインＧセファロースまたはプロテインＡセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に載せる。精製した抗体を、１００ｍＭのグリシンｐＨ２．８を用いて溶出し、そして高いｐＨの高濃度のリン酸緩衝液中に直接収集する。精製したタンパク質をＰＢＳに対して広範囲で透析する。
【０１０５】
（大腸菌における組換え抗体フラグメントの発現および精製）
大腸菌からの組換えｓｃＦＶフラグメントの精製を、標準的方法を用いて行う。実施例５に記載したヒスチジンタグ付けしたｓｃＦｖフラグメントの場合、発現培養物からの細胞ペレットを、超音波を用いてまたは専売のデタージェント溶菌（例えば、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ；Ｎｏｖａｇｅｎ）によるいずれかで溶菌し、そして遠心分離により澄明にする。上清画分を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウムｐＨ７．４、または類似の緩衝液中のＣｕまたはＮｉとともに充填した固定化金属イオンアフィニティーキレート（ＩＭＡＣ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライする。非特異的に結合したタンパク質を除去するために洗浄した後、ｓｃＦｖを、同じ緩衝液中の０〜５００ｍＭのイミダゾールのグラジエントを用いて溶出する。イミダゾールを透析によって除去して保存する。他の標準的なタンパク質精製方法も、大腸菌からの組換え抗体フラグメントの単離に適切である。
【０１０６】
（プリオン疾患の治療のための治療用抗体調製物の処方）
精製したモノクローナル抗体もしくは組換えキメラ抗体およびこれらのフラグメントを、上記のように調製し、そして内毒素汚染がないことを示す。抗体を、適切なキャリアタンパク質（例えば、血清アルブミン）とともにまたはなしのいずれかで、０．９％塩化ナトリウムとともにまたはなしで、およびデキストロース、ソルビトール、スクロース、またはマニトールのような適切な安定化剤の存在または不在下で処方する。抗体は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で処方されるべきである。
【０１０７】
（治療用抗体でのプリオン疾患の治療）
抗プリオンダイマーモノクローナル抗体の治療応用のために、モノクローナル抗体でのリンパ腫または他のガンの治療に用いられているのと類似のプロトコルを用い得る。適切な投与スケジュールの例は、５％デキストロース水溶液を含む０．９％塩化ナトリウム中で１ｍｇ／ｍｌの濃度（最終濃度）の注入液として処方した抗体を調製することである。注入液を、数時間かけてゆっくりとした静脈内注入として適用する。使用する抗体の濃度は４００ｍｇ／ｍ２体表面積までであり、そして投与は週に１回８週にわたって繰り返される。６００ｍｇ／ｍ２を週に１回４週間のような代替の投与スケジュール、または当業者に公知の他のスケジュールも、抗体の投与に適切である。
【０１０８】
（血液脳関門を通る治療用抗体フラグメントの取り込みの改善）
抗プリオンダイマー抗体の治療応用の有効性は、抗体が中枢神経系（ＣＮＳ）に達する能力に依存する。ＣＮＳへの抗体の接近を促進させるための多数の利用可能な方法は、治療用抗体の接種とともに使用する場合、接種のみについて増強された有効性を提供し得る。このようなプロセスの特定の例は次の通りである；１）標準的方法を用いる抗トランスフェリンレセプター抗体への治療用抗体の結合：Ｌｅｅ ＨＪ、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｂ、Ｌｅｓｌｅｙ Ｊ、Ｂｉｃｋｅｌ Ｕ、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ．（２０００）「Targeting rat anti-mouse transferrin receptor monoclonal antibodies through blood-brain barrier in mouse」Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２９２：１０４８−５２および類似の論文に記載されている、２）接種後に血液脳関門を低くするために薬剤Ｃｅｒｅｐｏｒｔ（Ａｌｋｅｒｍｅｓ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の使用、３）逆行輸送による送達のための破傷風菌毒素レセプター結合ドメイン（Ｈｃ）のような因子に対する抗体の結合、４）組換え抗体産生細胞（例えば、グリアまたはシュワン細胞）のＣＮＳへの直接接種。
【０１０９】
したがって、本発明は、ＴＳＥ感染の治療およびそのための抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】本発明の抗体がプリオンダイマーに結合していることを説明するための、ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳ホモジネートのブロットを示す。
【図２】本発明の抗体がプリオンダイマーに結合していることを説明するための、ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳ホモジネートのブロットを示す。
【図３】本発明の抗体がプリオンダイマーに結合していることを説明するための、ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳ホモジネートのブロットを示す。
【図４】本発明の抗体がプリオンダイマーに結合していることを説明するための、ＢＳＥ（３０１Ｖ）感染したマウス脳ホモジネートのブロットを示す。
【図５】選択された哺乳動物および鳥類のＰｒＰｃタンパク質の多重アラインメントを示す。
【図６】選択された哺乳動物および鳥類のＰｒＰｃタンパク質配列の配列の対の相違を示す。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリオンに結合する抗体を投与する工程を含む、ＴＳＥ感染の治療方法であって、該プリオンが、動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、方法。
【請求項２】
前記抗体がＰｒＰＳｃプリオンダイマーに特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、プリオンタンパク質もしくはそのアナログ、または該タンパク質もしくは該アナログのフラグメントで動物を免疫し、該動物から抗体を含む抽出物を得、そしてプリオンに結合する抗体を該抽出物から単離することによって得られ、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、プリオンタンパク質のフラグメントであるペプチドまたは該フラグメントを含むペプチドで動物を免疫することによって得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、必要に応じて一端または両端にシステイン残基が付加された、配列番号１から８より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、直鎖状コンホメーション、必要に応じて直鎖状ダイマー、または環状コンホメーション、必要に応じて環状ダイマーである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドがプリオンタンパク質の反復フラグメントを含む、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
クロイツフェルトヤコブ病、異型クロイツフェルトヤコブ病、クールー病、致命的家族性不眠症、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、ネコ海綿状脳症、慢性消耗症、および伝染性ミンク脳症から選択される疾患の治療のための、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
プリオンに結合する抗体を含む、ＴＳＥ感染の治療のための薬学的組成物であって、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、組成物。
【請求項１１】
前記抗体がＰｒＰＳｃプリオンダイマーに特異的である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体が、プリオンダイマーで動物を免疫し、該動物から抗体を含む抽出物を得、そしてプリオンに結合する抗体を該抽出物から単離することによって得られ、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体が、プリオンタンパク質のフラグメントであるペプチドまたは該フラグメントを含むペプチドで動物を免疫する工程によって得られる、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドが、必要に応じて一端または両端にシステイン残基が付加された、配列番号１から８より選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドが、直鎖状コンホメーション、必要に応じて直鎖状ダイマーである、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが、環状コンホメーション、必要に応じて環状ダイマーである、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ペプチドがプリオンタンパク質の反復フラグメントを含む、請求項１３から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
クロイツフェルトヤコブ病、異型クロイツフェルトヤコブ病、クールー病、致命的家族性不眠症、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、ネコ海綿状脳症、慢性消耗症、および伝染性ミンク脳症から選択される疾患の治療のための、請求項１０から１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
ＴＳＥ感染を治療するための医薬品の製造のための、プリオンに結合する抗体の使用であって、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、使用。
【請求項２０】
抗原で動物を免疫する工程であって、該抗原が、プリオンタンパク質あるいはプリオンタンパク質のアナログのフラグメントであるペプチドまたは該フラグメントを含むペプチドを含む、工程；該動物から抗体を得る工程；およびプリオンに結合する抗体を同定する工程であって、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、工程；を含む、抗体の取得方法。
【請求項２１】
前記抗原が、必要に応じてリンカーを介してペプチドに共有結合したキャリアを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記動物を前記キャリアに感作する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記キャリアに対する免疫応答を刺激する初回抗原を投与する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記キャリアが熱ショックタンパク質を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記キャリアがマイコバクテリアタンパク質であり、そして前記初回抗原がＢＣＧワクチンを投与することによって投与される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドが環状形態である、請求項２０から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原が前記ペプチドの反復の混成物を含む、請求項２０から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原が前記ペプチドの直鎖状または環状ダイマーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
プリオンタンパク質の少なくとも７つのアミノ酸のフラグメントを含む抗原であって、動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含むプリオンに結合する抗体の産生を刺激するための、抗原。
【請求項３０】
前記フラグメントが前記プリオンタンパク質の環状フラグメントである、請求項２９に記載の抗原。
【請求項３１】
前記フラグメントが前記プリオンタンパク質の直鎖状フラグメントである、請求項２９に記載の抗原。
【請求項３２】
前記抗原が、前記フラグメントの反復を含む、請求項２９から３１のいずれかに記載の抗原。
【請求項３３】
前記抗原が、前記フラグメントのダイマーを含む、請求項３２に記載の抗原。
【請求項３４】
前記フラグメントが配列番号１から８のいずれか１つを含む、請求項２９から３３のいずれかに記載の抗原。
【請求項３５】
請求項２９から３４のいずれか１つに記載の抗原に結合したキャリアを含む、抗体の産生を刺激するための結合体。
【請求項３６】
抗体産生を刺激するための医薬品の製造のための、プリオンに結合する抗体の産生を刺激する抗原の使用であって、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、使用。
【請求項３７】
前記抗原が、請求項２９から３４のいずれか１つに記載の抗原、または請求項３５に記載の結合体を含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記抗原に対する応答を刺激する初回抗原の事前または同時使用をさらに含む、請求項３６または３７に記載の使用。
【請求項３９】
請求項２９から３４のいずれかに記載の抗原、または請求項３５に記載の結合体を動物に投与する工程を含む、ＴＳＥ感染に対して動物を免疫する方法。
【請求項４０】
前記抗原が、該抗原に対する応答を刺激する初回抗原を後にまたは同時に投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項１】
プリオンに結合する抗体を投与する工程を含む、ＴＳＥ感染の治療方法であって、該プリオンが、動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、方法。
【請求項２】
前記抗体がＰｒＰＳｃプリオンダイマーに特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、プリオンタンパク質もしくはそのアナログ、または該タンパク質もしくは該アナログのフラグメントで動物を免疫し、該動物から抗体を含む抽出物を得、そしてプリオンに結合する抗体を該抽出物から単離することによって得られ、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、プリオンタンパク質のフラグメントであるペプチドまたは該フラグメントを含むペプチドで動物を免疫することによって得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、必要に応じて一端または両端にシステイン残基が付加された、配列番号１から８より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、直鎖状コンホメーション、必要に応じて直鎖状ダイマー、または環状コンホメーション、必要に応じて環状ダイマーである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドがプリオンタンパク質の反復フラグメントを含む、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
クロイツフェルトヤコブ病、異型クロイツフェルトヤコブ病、クールー病、致命的家族性不眠症、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、ネコ海綿状脳症、慢性消耗症、および伝染性ミンク脳症から選択される疾患の治療のための、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
プリオンに結合する抗体を含む、ＴＳＥ感染の治療のための薬学的組成物であって、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、組成物。
【請求項１１】
前記抗体がＰｒＰＳｃプリオンダイマーに特異的である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体が、プリオンダイマーで動物を免疫し、該動物から抗体を含む抽出物を得、そしてプリオンに結合する抗体を該抽出物から単離することによって得られ、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体が、プリオンタンパク質のフラグメントであるペプチドまたは該フラグメントを含むペプチドで動物を免疫する工程によって得られる、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドが、必要に応じて一端または両端にシステイン残基が付加された、配列番号１から８より選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドが、直鎖状コンホメーション、必要に応じて直鎖状ダイマーである、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが、環状コンホメーション、必要に応じて環状ダイマーである、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ペプチドがプリオンタンパク質の反復フラグメントを含む、請求項１３から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
クロイツフェルトヤコブ病、異型クロイツフェルトヤコブ病、クールー病、致命的家族性不眠症、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、ネコ海綿状脳症、慢性消耗症、および伝染性ミンク脳症から選択される疾患の治療のための、請求項１０から１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
ＴＳＥ感染を治療するための医薬品の製造のための、プリオンに結合する抗体の使用であって、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、使用。
【請求項２０】
抗原で動物を免疫する工程であって、該抗原が、プリオンタンパク質あるいはプリオンタンパク質のアナログのフラグメントであるペプチドまたは該フラグメントを含むペプチドを含む、工程；該動物から抗体を得る工程；およびプリオンに結合する抗体を同定する工程であって、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、工程；を含む、抗体の取得方法。
【請求項２１】
前記抗原が、必要に応じてリンカーを介してペプチドに共有結合したキャリアを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記動物を前記キャリアに感作する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記キャリアに対する免疫応答を刺激する初回抗原を投与する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記キャリアが熱ショックタンパク質を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記キャリアがマイコバクテリアタンパク質であり、そして前記初回抗原がＢＣＧワクチンを投与することによって投与される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドが環状形態である、請求項２０から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原が前記ペプチドの反復の混成物を含む、請求項２０から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原が前記ペプチドの直鎖状または環状ダイマーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
プリオンタンパク質の少なくとも７つのアミノ酸のフラグメントを含む抗原であって、動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含むプリオンに結合する抗体の産生を刺激するための、抗原。
【請求項３０】
前記フラグメントが前記プリオンタンパク質の環状フラグメントである、請求項２９に記載の抗原。
【請求項３１】
前記フラグメントが前記プリオンタンパク質の直鎖状フラグメントである、請求項２９に記載の抗原。
【請求項３２】
前記抗原が、前記フラグメントの反復を含む、請求項２９から３１のいずれかに記載の抗原。
【請求項３３】
前記抗原が、前記フラグメントのダイマーを含む、請求項３２に記載の抗原。
【請求項３４】
前記フラグメントが配列番号１から８のいずれか１つを含む、請求項２９から３３のいずれかに記載の抗原。
【請求項３５】
請求項２９から３４のいずれか１つに記載の抗原に結合したキャリアを含む、抗体の産生を刺激するための結合体。
【請求項３６】
抗体産生を刺激するための医薬品の製造のための、プリオンに結合する抗体の産生を刺激する抗原の使用であって、該プリオンが動物に感染性であるＰｒＰＳｃプリオンダイマーを含む、使用。
【請求項３７】
前記抗原が、請求項２９から３４のいずれか１つに記載の抗原、または請求項３５に記載の結合体を含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記抗原に対する応答を刺激する初回抗原の事前または同時使用をさらに含む、請求項３６または３７に記載の使用。
【請求項３９】
請求項２９から３４のいずれかに記載の抗原、または請求項３５に記載の結合体を動物に投与する工程を含む、ＴＳＥ感染に対して動物を免疫する方法。
【請求項４０】
前記抗原が、該抗原に対する応答を刺激する初回抗原を後にまたは同時に投与される、請求項３９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００６−５０１１４２（Ｐ２００６−５０１１４２Ａ）
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５７８４１８（Ｐ２００３−５７８４１８）
【出願日】平成１５年３月２０日（２００３．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００１２９５
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０８０６６５
【国際公開日】平成１５年１０月２日（２００３．１０．２）
【出願人】（５０３１９１２１０）ヘルス プロテクション エージェンシー (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年３月２０日（２００３．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００１２９５
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０８０６６５
【国際公開日】平成１５年１０月２日（２００３．１０．２）
【出願人】（５０３１９１２１０）ヘルス プロテクション エージェンシー (19)
【Ｆターム（参考）】
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