ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法
【課題】ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの高感度の測定法を提供する。
【解決手段】（１）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の受容体基質に試料を混合し、反応する工程、（２）反応液中の生成物を測定し、（１）における試料が一定濃度のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する場合の反応生成物と比較することにより、反応生成物の量から試料のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン含量を定量する工程を有する、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法を提供する。
【解決手段】（１）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の受容体基質に試料を混合し、反応する工程、（２）反応液中の生成物を測定し、（１）における試料が一定濃度のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する場合の反応生成物と比較することにより、反応生成物の量から試料のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン含量を定量する工程を有する、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の単糖がグリコシド結合により連結した糖鎖は、生体内において、細胞内オルガネラ成分、細胞表層成分、分泌糖蛋白質成分等として存在している。糖鎖の構造は、生物種や組織毎に異なっているが、同一生物種や同一組織内においても、その発生時期や疾病等によっても異なることから、従来考えられていた蛋白質の熱安定性、親水性、電荷、プロテアーゼ耐性等の蛋白質に対する物理的性質の付与といった機能のみならず、発生・分化、神経系、免疫系、ガンの転移等の細胞間認識に糖鎖が関与していることが明らかになり、医薬品等の種々の分野への応用の観点から、近年、非常に注目されるようになった。
【０００３】
糖鎖の合成は、生体内においては糖転移酵素によって担われている。糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖の伸長を行う酵素である。糖受容体の糖鎖構造に対する糖転移酵素の特異性は厳密であり、通常、１つのグリコシド結合は対応する１つの糖転移酵素によって形成されると考えられている。このような糖転移酵素および糖ヌクレオチドを利用する糖鎖の合成は、糖鎖研究、特に有用糖鎖の簡便な合成、天然の糖鎖の修飾に利用されるという点で重要な手法である。近年、糖転移酵素遺伝子のクローニングが精力的に研究され、多数の糖転移酵素が組換え酵素として実用可能なレベルに達しつつある。しかしながら、糖供与体である糖ヌクレオチドは、一部を除き、非常に高価である。なかでも、多くの糖鎖のコア構造に含まれるＮ−アセチルグルコサミン（以下、GlcNAcと略称する場合もある）の供与体であるウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンまたはUDP-GlcNAcと略称する場合もある）は発酵法等により量産化のための開発が進められている（特許文献１および２）。これらの製造工程において得られるUDP-GlcNAcは、培養菌体から得られる抽出液を精製あるいは酵素処理した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により測定されているが、初期の抽出液の段階の微量の試料を直接測定できる迅速かつ高感度な測定法は見出されていない。
【０００４】
UDP-GlcNAcの測定法として、Morgan-Elson法の改良によるReissig法により、UDP-GlcNAcが測定可能なことが示されている。この方法では、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下、UDP-GalNAcと略称する場合もある）等の他のウリジン二リン酸−ヘキソサミンも同時に検出されるため、UDP-GlcNAcを特異的に測定することができない（非特許文献１および２）。
【０００５】
生体試料中の種々の糖ヌクレオチドの測定法として、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する場合もある）で測定する方法が、逆相クロマトグラフィー等を用いることによりなされているが、これらの方法では、UDP-GlcNAcとUDP-GalNAcを分離して検出することができない（非特許文献３）。また、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いるＨＰＡＥＣ（high-performance anion-exchange chromatography）法により、UDP-GlcNAcをUDP-GalNAc等の他の糖ヌクレオチドと分離して検出可能なことが示されている（非特許文献４）。ＨＰＡＥＣ法は高感度な測定法であるが、１サンプルの測定に約１時間を要するため、多試料の測定には時間を要し、また、試料中に含まれる夾雑物質のピークの影響が避けられない場合があるという問題点を有している。
【０００６】
一方、糖ヌクレオチドに特異的な糖転移酵素の活性を利用して、試料中の糖ヌクレオチドを直接測定する方法が示されている。これまでに、ウリジン二リン酸−グルクロン酸転移酵素の活性からウリジン二リン酸−グルクロン酸を定量する方法や、α１−６−フコース転移酵素の活性からグアノシン二リン酸−フコースを定量する方法が報告されている（非特許文献５および６）。これらの方法において、糖転移酵素は、糖供与体の糖ヌクレオチドに対して厳密な特異性を示すことから、試料中に含まれる夾雑物質の影響を受けないという利点を有している。
【特許文献１】特開平８−２３９９３号公報
【特許文献２】特開平１０−２８５９４号公報
【非特許文献１】Morgan, W. T. J. and Elson, L. A. (1934) Biochem. J., 28, 988-995
【非特許文献２】Reissig, J. L., Strominger, J. L. and LeLoir, L. F. (1955) J. Biol. Chem., 217, 959-966
【非特許文献３】Krug, E., Zweibaum, A., Schulz-Holstege, C. and Keppler, D. (1984) Biochem. J., 217, 701-708
【非特許文献４】Tomiya, N., Ailor, E., Lawrence, S. M. Betenbaugh, M. J. andLee, Y. C. (2001) Anal. Biochem., 293, 129-137
【非特許文献５】Singh, J., Schwarz, L. R. and Wiebel, F. J. (1980) Biochem. J., 189, 369-372
【非特許文献６】Noda, K., Miyoshi, E., Nakahara, S., Ihara, H., Gao, C. X., Honke, K., Yanagidani, S., Sasaki, Y., Kasahara, A., Hori, M., Hayashi, N. and Taniguchi, N. (2002) Anal. Biochem., 310, 100-106
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、試料中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを高感度に測定することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の反応において、UDP-GlcNAcの代わりに添加した試料中に一定濃度以上のUDP-GlcNAcが存在する場合に生成物が検出されることにより、試料中のUDP-GlcNAcを高感度に測定可能なことを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本願発明の一つは、（Ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の受容体基質に試料を混合し、反応する工程、（ＩＩ）反応液中の生成物を高速液体クロマトグラフィー等で測定し、（Ｉ）における試料が一定濃度のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する場合の反応生成物と比較することにより、反応生成物の量から試料のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン含量を定量する工程を有する、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法である。
また、本発明は、次の事項に係るものである。
１．（I）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の受容体基質に試料を混合し反応する工程、（II）反応液中の生成物を測定し（I）における試料が一定濃度のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する場合の反応生成物の量と比較することにより、反応生成物の量から試料のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン含量を定量する工程を有する、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法。
２．Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素がβ１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉである１の測定法。
３．反応液中の生成物を高速液体クロマトグラフィーで測定することを特徴とする１または２の測定法。
４．β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（１）、（２）、（３）及び（４）からなる群より選ばれた１種又は２種以上の化合物またはその誘導体であることを特徴とする１から３のいずれかの測定法（式中、Ｒ１は水酸基、２−アミノピリジル基あるいはその類似体、またはポリペプチド鎖を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【０００９】
【化１】
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
【化４】
【００１３】
５．β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（５）の化合物またはその誘導体であることを特徴とする１から３のいずれかの測定法（式中、ＰＡは２−アミノピリジル基を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【００１４】
【化５】
【００１５】
６．β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（６）の化合物またはその誘導体であることを特徴とする１から３のいずれかの測定法（式中、ＰＡは２−アミノピリジル基を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【００１６】
【化６】
【００１７】
７．反応が、緩衝液および２価金属の共存下において行われることを特徴とする１から６のいずれかの測定法。
８．緩衝液のpHが5.0〜9.0であることを特徴とする７の測定法。
９．２価金属がマンガン塩であることを特徴とする７の測定法。
１０．マンガン塩の濃度が5〜50mM であることを特徴とする９の測定法。
１１．マンガン塩が塩化マンガンであることを特徴とする９または１０の測定法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、試料中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを高感度に測定することができる。測定に用いる試料の精製、濃縮等の工程は不要であり、培養条件等のスクリーニング初期の段階で、多数の試料を簡便かつ迅速に測定することができる。必要な試料は数μＬの微量なレベルで測定可能であることから、貴重な試料を有効に活用することができる。本発明の実施により、医薬品等の種々の分野への応用が期待される有用糖鎖の合成に必要なＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの製造において、有用な測定法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２０】
本発明において、「Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素」（以下、ＧｎＴと略称する場合もある）は、UDP-GlcNAcを「糖供与体」の基質とし、「受容体基質」である糖鎖にＮ−アセチルグルコサミン（以下、GlcNAcと略称する場合もある）を転移して新たなグリコシド結合を生合成する酵素である。例えば、β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（以下、ＧｎＴＩと略称する場合もある）が挙げられる。
【００２１】
ＧｎＴＩとは、例えば、式（１）、（２）、（３）あるいは（４）で表される化合物ならびにそれらの誘導体を「受容体基質」とし、マンノースα１−３（Ｍａｎα１−３）分岐のマンノースにのみ、β１−２結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する。ここで「誘導体」とは、当該Ｎ−アセチルグルコサミン転移反応の妨げにならない程度に化学修飾が為されているものを意味し、例えば上記式中の糖鎖部分において１乃至数個の糖残基が付加乃至は除去されたものや、Ｒ１において種々の官能基が除去、付加あるいは置換されたもの等も包含される。例えば、Ｒ１において２−アミノピリジル基等の蛍光物質で置換されたものも使用可能である。例えば、式（５）や式（６）を「受容体基質」として使用するのが好ましい。
【００２２】
【化７】
【００２３】
【化８】
【００２４】
【化９】
【００２５】
【化１０】
【００２６】
【化１１】
【００２７】
【化１２】
【００２８】
天然由来のＧｎＴＩとしては、各種起源から公知の手法により採取、精製することによって得ることができる。例えば、ウサギ肝臓（J. Biol. Chem., 256, 799-804, 1981； J. Biol. Chem., 263, 8270-8281, 1988）、ウシ初乳（J. Biol. Chem., 255, 4885-4893,1980； Can. J. Biochem. Cell Biol., 62, 409-417, 1984）、ブタ肝臓（J. Biol.Chem., 256, 11477-11482, 1981）等から精製した報告に基いて調製することができる。また、ヒト由来ガン細胞（Ａ４３１）等の細胞を起源として調製することも可能である。
【００２９】
一方、組換えＧｎＴＩとしては、例えば、既知のＧｎＴＩ遺伝子配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9948-9952, 1990）をもとにＰＣＲにより遺伝子を入手し、大腸菌のマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）遺伝子を持つベクターｐＭＡＬｃ２にＧｎＴＩ遺伝子をクローニングし、大腸菌にＭＢＰ−ＧｎＴＩ融合タンパク質として生産させることにより調製できる。また、ＧｎＴＩの反応で生成した糖鎖を受容体基質とするＮ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩ（ＧｎＴＩＩ）等の他のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の夾雑活性を有しないという点で、大腸菌で遺伝子組換えにより生産された高純度のものを用いることが望ましい。使用する糖転移酵素の濃度は、基質の量、反応温度、pH等の反応条件によって適宜決定され得るが、数μU／ml〜数mU／mlの範囲内で使用可能であり、１μU／ml程度の低濃度でも十分に目的を達成することができる。
【００３０】
本発明における「試料」とは、UDP-GlcNAcを測定するための生体試料であり、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、大腸菌等から得られる抽出液、培地等を含む。これらの試料は、適宜希釈あるいは濃縮により、測定に供する。
【００３１】
本願発明においては、既知濃度のUDP-GlcNAcを対照として用いることにより、UDP-GlcNAcが含まれると予想される試料中のUDP-GlcNAcを定量することができる。例えば、既知濃度のUDP-GlcNAcを用いた場合の反応生成物の量と、UDP-GlcNAcが含まれると予想される試料中のUDP-GlcNAcを用いた場合の反応生成物の量とを比較して、試料中のUDP-GlcNAc量を求めることができる。
【００３２】
本発明における対照試料のUDP-GlcNAcの濃度は、好ましくは受容体基質の糖鎖に対するＫｍ値の０．００１〜１倍、より好ましくは該Ｋｍ値の０．０１〜１倍であるが、さらに低濃度のものでも十分に目的を達成することができる。UDP-GlcNAcは商業的に入手可能である。
【００３３】
本発明における受容体基質の糖鎖は、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の基質となり得る糖鎖であれば特に限定はされない。例えば、式（１）、（２）、（３）あるいは（４）で表される化合物ならびにそれらの誘導体を用いてもよい。例えば、Ｒ１において２−アミノピリジル基等の蛍光物質で置換されたものも使用可能である。例えば、式（５）や式（６）を「受容体基質」として使用するのが好ましい。
その濃度は、好ましくはＫｍ値の０．１〜１０倍、より好ましくは該Ｋｍ値の１倍程度であるが、さらに低濃度のものでも十分に目的を達成することができる。これらの糖鎖は、適切な材料から調製することも可能であるが、商業的にも入手可能である。
【００３４】
本発明において、反応系に含まれる適切な緩衝液としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が十分に機能しうる至適条件を達成し得るものであれば特に限定されないが、好ましくはpH5.0〜8.5、より好ましくはpH6.0〜9.0程度の緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等が用いられる。当該緩衝液の濃度も特に限定されないが、通常10〜100mM程度であり、好ましくは50〜100mM程度である。当該緩衝液は公知の方法で調製することができる。
【００３５】
本発明において使用する２価金属としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の活性に必要とされるマンガン塩が望ましく、塩化マンガンを用いるのがより好ましい。当該マンガン塩の濃度は通常5〜50mMであり、好ましくは10〜20ｍMの範囲で使用する。
【００３６】
本発明におけるＮ−アセチルグルコサミン転移反応は、上述のように、例えば、式（１）あるいは（２）のような構造の糖質を受容体基質として、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素共存下、糖供与体のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度を測定するための試料、適切な緩衝液および２価金属の共存下で行なわれるが、当該反応は、通常至適温度である30℃〜37℃で、1分間〜24時間、好ましくは15分間〜16時間行う。反応液量は、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が十分に機能しうるスケールであれば、特に限定されないが、通常2.5〜100μＬであり、好ましくは5〜10μＬ程度である。
【００３７】
「反応液中の生成物を測定」する方法としては、一般的に使用される糖鎖を定量する方法を用いればよい。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いるＨＰＡＥＣ（high-performance anion-exchange chromatography）法等が挙げられ、これらの方法において、蛍光検出器、ＵＶ検出器、電気伝導度測定器等を用いることで測定が可能になる。好ましくは、ＨＰＬＣがよい。
【実施例】
【００３８】
以下に、実施例を挙げて、本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらに限定されることはない。
（実施例１）
Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を用いて、種々のUDP-GlcNAc濃度におけるＮ−アセチルグルコサミン転移活性を測定した。Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素として、公知の方法（特開２００１−１７８４５３）に従い、大腸菌JM109株で発現させた組換えＧｎＴＩを調製し、反応に供した。活性測定の受容体基質には、公知の方法（J. Biochem., 105, 547-555, 1989）により２−アミノピリジンで蛍光標識した、下記の式（５）で示されるピリジルアミノ化Man3混成型糖鎖（M3-PA）を用いた。
【００３９】
【化１３】
【００４０】
反応液は、0.1mM M3-PA、0.000001〜10mM UDP-GlcNAc、50mM MnCl2、100mM MES-NaOH (pH6.1)およびＧｎＴＩを含み、全量5μlに調整し、PCRサーマルサイクラーを用いて37℃にて16時間反応させ、95℃にて５分間加熱し、反応を終了させた。反応液を水で100倍に希釈し、反応終了液を遠心後、上清をＨＰＬＣの測定サンプルとした。ＨＰＬＣの測定にはアミドカラム(TSK-Gel Amide-80、250mm x 4.6mm I.D.)を用い、200mM 酢酸-トリエチルアミン(pH7.3)/アセトニトリルの混液C(30:70)およびD(50:50)をグラジェントモードあるいはイソクラティックモードで移動相として、80℃にて、流速1ml/minで流し、励起波長320nm、検出波長400nmの蛍光をモニターして生成物のPA化糖鎖を検出した。図１は、反応液を分析したＨＰＬＣの結果の一例を示す。反応液は、0.1mM M3-PA、0.001mM UDP-GlcNAc、50mM MnCl2、100mM MES-NaOH (pH6.1)および組換えＧｎＴＩを含み、全量5μlに調整し、37℃にて16時間反応させた。混液C:D = 92:8のイソクラティックモードにより、反応液中のGlcNAc転移反応生成物の蛍光が検出され、ＧｎＴＩのGlcNAc転移活性が確認され、当該濃度のUDP-GlcNAｃが検出可能であることが示された。
（実施例２）
実施例１のGlcNAc転移反応において、反応時間を変化させ、UDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応生成物の蛍光強度の相関を調べた。図２は、反応液中のUDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応収率との関係を示す。GlcNAc転移反応収率は、ＨＰＬＣで検出されたM3-PAおよびGlcNAc転移反応生成物のピーク面積から算出した。反応時間1時間の場合、UDP-GlcNAc濃度0.01ｍM以上において、反応生成物の蛍光が検出され、ＧｎＴＩ活性が確認された。反応時間4時間の場合、UDP-GlcNAc濃度0.001ｍM以上において、ＧｎＴＩ活性が確認され、反応時間16時間の場合もほぼ同様の結果であった。これらの結果から、M3-PAをＧｎＴＩの受容体基質として用いた場合、反応液中のUDP-GlcNAc 濃度が0.001ｍMの感度で検出可能なことが示された。
（実施例３）
実施例１と同様に、下記の式（６）で示されるピリジルアミノ化Man5混成型糖鎖（M5-PA）を用い、GlcNAc転移反応において、反応時間を変化させ、UDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応生成物の蛍光強度の相関を調べた。反応液は、0.01mM M5-PA、0.00001〜1mM UDP-GlcNAc、50mM MnCl2、100mM MES-NaOH (pH6.1)および組換えＧｎＴＩを含み、全量5μlに調整し、37℃にて1時間反応させた。図３は、反応液中のUDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応収率との関係を示す。反応時間1時間の場合、UDP-GlcNAc濃度0.001ｍM以上において、反応生成物の蛍光が検出され、ＧｎＴＩ活性が確認された。M5-PAをＧｎＴＩの受容体基質として用いた場合、１時間の反応により反応液中のUDP-GlcNAc 濃度が0.001ｍMの感度で検出可能なことが示された。
【００４１】
【化１４】
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】M3-PAを受容体基質としたＧｎＴＩ反応液のＨＰＬＣの結果を示す。
【図２】M3-PAを受容体基質としたＧｎＴＩ反応液中のUDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応収率との関係を示す。
【図３】M5-PAを受容体基質としたＧｎＴＩ反応液中のUDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応収率との関係を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の単糖がグリコシド結合により連結した糖鎖は、生体内において、細胞内オルガネラ成分、細胞表層成分、分泌糖蛋白質成分等として存在している。糖鎖の構造は、生物種や組織毎に異なっているが、同一生物種や同一組織内においても、その発生時期や疾病等によっても異なることから、従来考えられていた蛋白質の熱安定性、親水性、電荷、プロテアーゼ耐性等の蛋白質に対する物理的性質の付与といった機能のみならず、発生・分化、神経系、免疫系、ガンの転移等の細胞間認識に糖鎖が関与していることが明らかになり、医薬品等の種々の分野への応用の観点から、近年、非常に注目されるようになった。
【０００３】
糖鎖の合成は、生体内においては糖転移酵素によって担われている。糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖の伸長を行う酵素である。糖受容体の糖鎖構造に対する糖転移酵素の特異性は厳密であり、通常、１つのグリコシド結合は対応する１つの糖転移酵素によって形成されると考えられている。このような糖転移酵素および糖ヌクレオチドを利用する糖鎖の合成は、糖鎖研究、特に有用糖鎖の簡便な合成、天然の糖鎖の修飾に利用されるという点で重要な手法である。近年、糖転移酵素遺伝子のクローニングが精力的に研究され、多数の糖転移酵素が組換え酵素として実用可能なレベルに達しつつある。しかしながら、糖供与体である糖ヌクレオチドは、一部を除き、非常に高価である。なかでも、多くの糖鎖のコア構造に含まれるＮ−アセチルグルコサミン（以下、GlcNAcと略称する場合もある）の供与体であるウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンまたはUDP-GlcNAcと略称する場合もある）は発酵法等により量産化のための開発が進められている（特許文献１および２）。これらの製造工程において得られるUDP-GlcNAcは、培養菌体から得られる抽出液を精製あるいは酵素処理した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により測定されているが、初期の抽出液の段階の微量の試料を直接測定できる迅速かつ高感度な測定法は見出されていない。
【０００４】
UDP-GlcNAcの測定法として、Morgan-Elson法の改良によるReissig法により、UDP-GlcNAcが測定可能なことが示されている。この方法では、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（以下、UDP-GalNAcと略称する場合もある）等の他のウリジン二リン酸−ヘキソサミンも同時に検出されるため、UDP-GlcNAcを特異的に測定することができない（非特許文献１および２）。
【０００５】
生体試料中の種々の糖ヌクレオチドの測定法として、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する場合もある）で測定する方法が、逆相クロマトグラフィー等を用いることによりなされているが、これらの方法では、UDP-GlcNAcとUDP-GalNAcを分離して検出することができない（非特許文献３）。また、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いるＨＰＡＥＣ（high-performance anion-exchange chromatography）法により、UDP-GlcNAcをUDP-GalNAc等の他の糖ヌクレオチドと分離して検出可能なことが示されている（非特許文献４）。ＨＰＡＥＣ法は高感度な測定法であるが、１サンプルの測定に約１時間を要するため、多試料の測定には時間を要し、また、試料中に含まれる夾雑物質のピークの影響が避けられない場合があるという問題点を有している。
【０００６】
一方、糖ヌクレオチドに特異的な糖転移酵素の活性を利用して、試料中の糖ヌクレオチドを直接測定する方法が示されている。これまでに、ウリジン二リン酸−グルクロン酸転移酵素の活性からウリジン二リン酸−グルクロン酸を定量する方法や、α１−６−フコース転移酵素の活性からグアノシン二リン酸−フコースを定量する方法が報告されている（非特許文献５および６）。これらの方法において、糖転移酵素は、糖供与体の糖ヌクレオチドに対して厳密な特異性を示すことから、試料中に含まれる夾雑物質の影響を受けないという利点を有している。
【特許文献１】特開平８−２３９９３号公報
【特許文献２】特開平１０−２８５９４号公報
【非特許文献１】Morgan, W. T. J. and Elson, L. A. (1934) Biochem. J., 28, 988-995
【非特許文献２】Reissig, J. L., Strominger, J. L. and LeLoir, L. F. (1955) J. Biol. Chem., 217, 959-966
【非特許文献３】Krug, E., Zweibaum, A., Schulz-Holstege, C. and Keppler, D. (1984) Biochem. J., 217, 701-708
【非特許文献４】Tomiya, N., Ailor, E., Lawrence, S. M. Betenbaugh, M. J. andLee, Y. C. (2001) Anal. Biochem., 293, 129-137
【非特許文献５】Singh, J., Schwarz, L. R. and Wiebel, F. J. (1980) Biochem. J., 189, 369-372
【非特許文献６】Noda, K., Miyoshi, E., Nakahara, S., Ihara, H., Gao, C. X., Honke, K., Yanagidani, S., Sasaki, Y., Kasahara, A., Hori, M., Hayashi, N. and Taniguchi, N. (2002) Anal. Biochem., 310, 100-106
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、試料中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを高感度に測定することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の反応において、UDP-GlcNAcの代わりに添加した試料中に一定濃度以上のUDP-GlcNAcが存在する場合に生成物が検出されることにより、試料中のUDP-GlcNAcを高感度に測定可能なことを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本願発明の一つは、（Ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の受容体基質に試料を混合し、反応する工程、（ＩＩ）反応液中の生成物を高速液体クロマトグラフィー等で測定し、（Ｉ）における試料が一定濃度のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する場合の反応生成物と比較することにより、反応生成物の量から試料のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン含量を定量する工程を有する、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法である。
また、本発明は、次の事項に係るものである。
１．（I）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の受容体基質に試料を混合し反応する工程、（II）反応液中の生成物を測定し（I）における試料が一定濃度のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する場合の反応生成物の量と比較することにより、反応生成物の量から試料のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン含量を定量する工程を有する、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法。
２．Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素がβ１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉである１の測定法。
３．反応液中の生成物を高速液体クロマトグラフィーで測定することを特徴とする１または２の測定法。
４．β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（１）、（２）、（３）及び（４）からなる群より選ばれた１種又は２種以上の化合物またはその誘導体であることを特徴とする１から３のいずれかの測定法（式中、Ｒ１は水酸基、２−アミノピリジル基あるいはその類似体、またはポリペプチド鎖を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【０００９】
【化１】
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
【化４】
【００１３】
５．β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（５）の化合物またはその誘導体であることを特徴とする１から３のいずれかの測定法（式中、ＰＡは２−アミノピリジル基を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【００１４】
【化５】
【００１５】
６．β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（６）の化合物またはその誘導体であることを特徴とする１から３のいずれかの測定法（式中、ＰＡは２−アミノピリジル基を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【００１６】
【化６】
【００１７】
７．反応が、緩衝液および２価金属の共存下において行われることを特徴とする１から６のいずれかの測定法。
８．緩衝液のpHが5.0〜9.0であることを特徴とする７の測定法。
９．２価金属がマンガン塩であることを特徴とする７の測定法。
１０．マンガン塩の濃度が5〜50mM であることを特徴とする９の測定法。
１１．マンガン塩が塩化マンガンであることを特徴とする９または１０の測定法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、試料中のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを高感度に測定することができる。測定に用いる試料の精製、濃縮等の工程は不要であり、培養条件等のスクリーニング初期の段階で、多数の試料を簡便かつ迅速に測定することができる。必要な試料は数μＬの微量なレベルで測定可能であることから、貴重な試料を有効に活用することができる。本発明の実施により、医薬品等の種々の分野への応用が期待される有用糖鎖の合成に必要なＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの製造において、有用な測定法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２０】
本発明において、「Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素」（以下、ＧｎＴと略称する場合もある）は、UDP-GlcNAcを「糖供与体」の基質とし、「受容体基質」である糖鎖にＮ−アセチルグルコサミン（以下、GlcNAcと略称する場合もある）を転移して新たなグリコシド結合を生合成する酵素である。例えば、β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（以下、ＧｎＴＩと略称する場合もある）が挙げられる。
【００２１】
ＧｎＴＩとは、例えば、式（１）、（２）、（３）あるいは（４）で表される化合物ならびにそれらの誘導体を「受容体基質」とし、マンノースα１−３（Ｍａｎα１−３）分岐のマンノースにのみ、β１−２結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する。ここで「誘導体」とは、当該Ｎ−アセチルグルコサミン転移反応の妨げにならない程度に化学修飾が為されているものを意味し、例えば上記式中の糖鎖部分において１乃至数個の糖残基が付加乃至は除去されたものや、Ｒ１において種々の官能基が除去、付加あるいは置換されたもの等も包含される。例えば、Ｒ１において２−アミノピリジル基等の蛍光物質で置換されたものも使用可能である。例えば、式（５）や式（６）を「受容体基質」として使用するのが好ましい。
【００２２】
【化７】
【００２３】
【化８】
【００２４】
【化９】
【００２５】
【化１０】
【００２６】
【化１１】
【００２７】
【化１２】
【００２８】
天然由来のＧｎＴＩとしては、各種起源から公知の手法により採取、精製することによって得ることができる。例えば、ウサギ肝臓（J. Biol. Chem., 256, 799-804, 1981； J. Biol. Chem., 263, 8270-8281, 1988）、ウシ初乳（J. Biol. Chem., 255, 4885-4893,1980； Can. J. Biochem. Cell Biol., 62, 409-417, 1984）、ブタ肝臓（J. Biol.Chem., 256, 11477-11482, 1981）等から精製した報告に基いて調製することができる。また、ヒト由来ガン細胞（Ａ４３１）等の細胞を起源として調製することも可能である。
【００２９】
一方、組換えＧｎＴＩとしては、例えば、既知のＧｎＴＩ遺伝子配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9948-9952, 1990）をもとにＰＣＲにより遺伝子を入手し、大腸菌のマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）遺伝子を持つベクターｐＭＡＬｃ２にＧｎＴＩ遺伝子をクローニングし、大腸菌にＭＢＰ−ＧｎＴＩ融合タンパク質として生産させることにより調製できる。また、ＧｎＴＩの反応で生成した糖鎖を受容体基質とするＮ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩ（ＧｎＴＩＩ）等の他のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の夾雑活性を有しないという点で、大腸菌で遺伝子組換えにより生産された高純度のものを用いることが望ましい。使用する糖転移酵素の濃度は、基質の量、反応温度、pH等の反応条件によって適宜決定され得るが、数μU／ml〜数mU／mlの範囲内で使用可能であり、１μU／ml程度の低濃度でも十分に目的を達成することができる。
【００３０】
本発明における「試料」とは、UDP-GlcNAcを測定するための生体試料であり、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、大腸菌等から得られる抽出液、培地等を含む。これらの試料は、適宜希釈あるいは濃縮により、測定に供する。
【００３１】
本願発明においては、既知濃度のUDP-GlcNAcを対照として用いることにより、UDP-GlcNAcが含まれると予想される試料中のUDP-GlcNAcを定量することができる。例えば、既知濃度のUDP-GlcNAcを用いた場合の反応生成物の量と、UDP-GlcNAcが含まれると予想される試料中のUDP-GlcNAcを用いた場合の反応生成物の量とを比較して、試料中のUDP-GlcNAc量を求めることができる。
【００３２】
本発明における対照試料のUDP-GlcNAcの濃度は、好ましくは受容体基質の糖鎖に対するＫｍ値の０．００１〜１倍、より好ましくは該Ｋｍ値の０．０１〜１倍であるが、さらに低濃度のものでも十分に目的を達成することができる。UDP-GlcNAcは商業的に入手可能である。
【００３３】
本発明における受容体基質の糖鎖は、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の基質となり得る糖鎖であれば特に限定はされない。例えば、式（１）、（２）、（３）あるいは（４）で表される化合物ならびにそれらの誘導体を用いてもよい。例えば、Ｒ１において２−アミノピリジル基等の蛍光物質で置換されたものも使用可能である。例えば、式（５）や式（６）を「受容体基質」として使用するのが好ましい。
その濃度は、好ましくはＫｍ値の０．１〜１０倍、より好ましくは該Ｋｍ値の１倍程度であるが、さらに低濃度のものでも十分に目的を達成することができる。これらの糖鎖は、適切な材料から調製することも可能であるが、商業的にも入手可能である。
【００３４】
本発明において、反応系に含まれる適切な緩衝液としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が十分に機能しうる至適条件を達成し得るものであれば特に限定されないが、好ましくはpH5.0〜8.5、より好ましくはpH6.0〜9.0程度の緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等が用いられる。当該緩衝液の濃度も特に限定されないが、通常10〜100mM程度であり、好ましくは50〜100mM程度である。当該緩衝液は公知の方法で調製することができる。
【００３５】
本発明において使用する２価金属としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の活性に必要とされるマンガン塩が望ましく、塩化マンガンを用いるのがより好ましい。当該マンガン塩の濃度は通常5〜50mMであり、好ましくは10〜20ｍMの範囲で使用する。
【００３６】
本発明におけるＮ−アセチルグルコサミン転移反応は、上述のように、例えば、式（１）あるいは（２）のような構造の糖質を受容体基質として、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素共存下、糖供与体のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度を測定するための試料、適切な緩衝液および２価金属の共存下で行なわれるが、当該反応は、通常至適温度である30℃〜37℃で、1分間〜24時間、好ましくは15分間〜16時間行う。反応液量は、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が十分に機能しうるスケールであれば、特に限定されないが、通常2.5〜100μＬであり、好ましくは5〜10μＬ程度である。
【００３７】
「反応液中の生成物を測定」する方法としては、一般的に使用される糖鎖を定量する方法を用いればよい。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いるＨＰＡＥＣ（high-performance anion-exchange chromatography）法等が挙げられ、これらの方法において、蛍光検出器、ＵＶ検出器、電気伝導度測定器等を用いることで測定が可能になる。好ましくは、ＨＰＬＣがよい。
【実施例】
【００３８】
以下に、実施例を挙げて、本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらに限定されることはない。
（実施例１）
Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を用いて、種々のUDP-GlcNAc濃度におけるＮ−アセチルグルコサミン転移活性を測定した。Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素として、公知の方法（特開２００１−１７８４５３）に従い、大腸菌JM109株で発現させた組換えＧｎＴＩを調製し、反応に供した。活性測定の受容体基質には、公知の方法（J. Biochem., 105, 547-555, 1989）により２−アミノピリジンで蛍光標識した、下記の式（５）で示されるピリジルアミノ化Man3混成型糖鎖（M3-PA）を用いた。
【００３９】
【化１３】
【００４０】
反応液は、0.1mM M3-PA、0.000001〜10mM UDP-GlcNAc、50mM MnCl2、100mM MES-NaOH (pH6.1)およびＧｎＴＩを含み、全量5μlに調整し、PCRサーマルサイクラーを用いて37℃にて16時間反応させ、95℃にて５分間加熱し、反応を終了させた。反応液を水で100倍に希釈し、反応終了液を遠心後、上清をＨＰＬＣの測定サンプルとした。ＨＰＬＣの測定にはアミドカラム(TSK-Gel Amide-80、250mm x 4.6mm I.D.)を用い、200mM 酢酸-トリエチルアミン(pH7.3)/アセトニトリルの混液C(30:70)およびD(50:50)をグラジェントモードあるいはイソクラティックモードで移動相として、80℃にて、流速1ml/minで流し、励起波長320nm、検出波長400nmの蛍光をモニターして生成物のPA化糖鎖を検出した。図１は、反応液を分析したＨＰＬＣの結果の一例を示す。反応液は、0.1mM M3-PA、0.001mM UDP-GlcNAc、50mM MnCl2、100mM MES-NaOH (pH6.1)および組換えＧｎＴＩを含み、全量5μlに調整し、37℃にて16時間反応させた。混液C:D = 92:8のイソクラティックモードにより、反応液中のGlcNAc転移反応生成物の蛍光が検出され、ＧｎＴＩのGlcNAc転移活性が確認され、当該濃度のUDP-GlcNAｃが検出可能であることが示された。
（実施例２）
実施例１のGlcNAc転移反応において、反応時間を変化させ、UDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応生成物の蛍光強度の相関を調べた。図２は、反応液中のUDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応収率との関係を示す。GlcNAc転移反応収率は、ＨＰＬＣで検出されたM3-PAおよびGlcNAc転移反応生成物のピーク面積から算出した。反応時間1時間の場合、UDP-GlcNAc濃度0.01ｍM以上において、反応生成物の蛍光が検出され、ＧｎＴＩ活性が確認された。反応時間4時間の場合、UDP-GlcNAc濃度0.001ｍM以上において、ＧｎＴＩ活性が確認され、反応時間16時間の場合もほぼ同様の結果であった。これらの結果から、M3-PAをＧｎＴＩの受容体基質として用いた場合、反応液中のUDP-GlcNAc 濃度が0.001ｍMの感度で検出可能なことが示された。
（実施例３）
実施例１と同様に、下記の式（６）で示されるピリジルアミノ化Man5混成型糖鎖（M5-PA）を用い、GlcNAc転移反応において、反応時間を変化させ、UDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応生成物の蛍光強度の相関を調べた。反応液は、0.01mM M5-PA、0.00001〜1mM UDP-GlcNAc、50mM MnCl2、100mM MES-NaOH (pH6.1)および組換えＧｎＴＩを含み、全量5μlに調整し、37℃にて1時間反応させた。図３は、反応液中のUDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応収率との関係を示す。反応時間1時間の場合、UDP-GlcNAc濃度0.001ｍM以上において、反応生成物の蛍光が検出され、ＧｎＴＩ活性が確認された。M5-PAをＧｎＴＩの受容体基質として用いた場合、１時間の反応により反応液中のUDP-GlcNAc 濃度が0.001ｍMの感度で検出可能なことが示された。
【００４１】
【化１４】
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】M3-PAを受容体基質としたＧｎＴＩ反応液のＨＰＬＣの結果を示す。
【図２】M3-PAを受容体基質としたＧｎＴＩ反応液中のUDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応収率との関係を示す。
【図３】M5-PAを受容体基質としたＧｎＴＩ反応液中のUDP-GlcNAc濃度とGlcNAc転移反応収率との関係を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（I）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の受容体基質に試料を混合し反応する工程、（II）反応液中の生成物を測定し（I）における試料が一定濃度のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する場合の反応生成物の量と比較することにより、反応生成物の量から試料のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン含量を定量する工程を有する、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法。
【請求項２】
Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素がβ１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉである、請求項１に記載の測定法。
【請求項３】
反応液中の生成物を高速液体クロマトグラフィーで測定することを特徴とする請求項１または２に記載の測定法。
【請求項４】
β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（１）、（２）、（３）及び（４）からなる群より選ばれた１種又は２種以上の化合物またはその誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の測定法（式中、Ｒ１は水酸基、２−アミノピリジル基あるいはその類似体、またはポリペプチド鎖を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【請求項５】
β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（５）の化合物またはその誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の測定法（式中、ＰＡは２−アミノピリジル基を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【化５】
【請求項６】
β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（６）の化合物またはその誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の測定法（式中、ＰＡは２−アミノピリジル基を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【化６】
【請求項７】
反応が、緩衝液および２価金属の共存下において行われることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の測定法。
【請求項８】
緩衝液のpHが5.0〜9.0であることを特徴とする請求項７に記載の測定法。
【請求項９】
２価金属がマンガン塩であることを特徴とする請求項７に記載の測定法。
【請求項１０】
マンガン塩の濃度が5〜50mM であることを特徴とする請求項９に記載の測定法。
【請求項１１】
マンガン塩が塩化マンガンであることを特徴とする請求項９または１０に記載の測定法。
【請求項１】
（I）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の受容体基質に試料を混合し反応する工程、（II）反応液中の生成物を測定し（I）における試料が一定濃度のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する場合の反応生成物の量と比較することにより、反応生成物の量から試料のウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン含量を定量する工程を有する、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの測定法。
【請求項２】
Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素がβ１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉである、請求項１に記載の測定法。
【請求項３】
反応液中の生成物を高速液体クロマトグラフィーで測定することを特徴とする請求項１または２に記載の測定法。
【請求項４】
β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（１）、（２）、（３）及び（４）からなる群より選ばれた１種又は２種以上の化合物またはその誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の測定法（式中、Ｒ１は水酸基、２−アミノピリジル基あるいはその類似体、またはポリペプチド鎖を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【請求項５】
β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（５）の化合物またはその誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の測定法（式中、ＰＡは２−アミノピリジル基を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【化５】
【請求項６】
β１−２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Iの受容体基質が、下記の式（６）の化合物またはその誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の測定法（式中、ＰＡは２−アミノピリジル基を示し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）。
【化６】
【請求項７】
反応が、緩衝液および２価金属の共存下において行われることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の測定法。
【請求項８】
緩衝液のpHが5.0〜9.0であることを特徴とする請求項７に記載の測定法。
【請求項９】
２価金属がマンガン塩であることを特徴とする請求項７に記載の測定法。
【請求項１０】
マンガン塩の濃度が5〜50mM であることを特徴とする請求項９に記載の測定法。
【請求項１１】
マンガン塩が塩化マンガンであることを特徴とする請求項９または１０に記載の測定法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２０４２９５（Ｐ２００６−２０４２９５Ａ）
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３７６２４１（Ｐ２００５−３７６２４１）
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構 植物利用エネルギー使用合理化工業原料生産技術開発／植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構 植物利用エネルギー使用合理化工業原料生産技術開発／植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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