ＸまたはＹ染色体担持豊富化集団に仕分けるための精子懸濁液
運動阻害剤を含む精子細胞懸濁液を開示する。そのような懸濁液中に含有される細胞は、性別豊富化された集団への精子細胞の仕分けと典型的に関連した種々の処理工程に耐えるより大きい能力を有する傾向があり、従って、増加した数の生存性または運動性精子を有する仕分け後組成物を生じる。また、そのような細胞懸濁液を形成するための方法、ならびに精子細胞を染色するための方法も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、精子細胞を仕分ける方法に関する。より具体的には、本発明は、内因性射精精子に対して、減少した運動性、より具体的には一時的に減少した運動性を有する精子細胞の懸濁液の調製に関し、ここに、該懸濁液は、例えば、精子細胞を、XまたはY染色体担持精子細胞の豊富化された集団に仕分けるための方法において用途を有する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロ受精に続く人工授精 (AI)および胚移植による動物の受精は、確立された手順である。畜産業において、１以上の所望の特徴を有する子孫に向けた繁殖成績に影響を及ぼす能力は、明白な利点を有する。一例として、雌性を好んで子孫を前もって選択して、乳牛の生産を確証することは、乳業において、経済的な利益があるであろう。性別豊富化された精液または性別豊富化された精子として知られる、XおよびY染色体担持細胞の豊富化された集団への精子の分離は、前もって選択された子孫を達成する１つの方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
性別豊富化された精液を入手するために、精子細胞は色素によって染色され、続いてXおよびY染色体担持細胞へと仕分けられなければならない。染色および仕分け方法の各々は、精子細胞生存率または運動率、特に前進運動率を減少する精子細胞に重点を置く。
【０００４】
Salisbury et al.は、細胞運動性を阻害し、周りの精漿からの炭水化物の吸収を防ぐ希釈剤に直接的に射精されたウシ精液の収集のための技術を記載する。該射精が該希釈剤へと収集され、該液体の上の空気相がガスを発生させることによって100% CO2で置き換えられると、該射精中の細胞は動かなくなった。該細胞が該希釈剤中に留まり、空気が除外される限り、該細胞は、室温にて数時間および5℃にて少なくとも8日間動かないままであった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の種々の態様のなかには、例えば、精子をXまたはY-染色体担持精子へと仕分けるのに使用される方法において用途を有する精子懸濁液がある。
【０００６】
従って、簡潔には、本発明は、生存可能な精子を含む精子細胞懸濁液および精子による炭水化物取り込みをダウンレギュレートする組成物に指向され、ここに、該懸濁液中の精子の濃度は、約1X106未満または少なくとも1 x 108 精子／mlである。
【０００７】
本発明は、さらに、生存可能な、不動精子を含む精子細胞懸濁液に指向され、ここに該懸濁液中の精子の濃度は、約1X106未満または少なくとも1 x 108 精子／mlである。
【０００８】
本発明は、さらに、生存可能な精子を含む精子細胞懸濁液に指向され、ここに該精子は、同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な運動性を有し、ここに該懸濁液中の精子の濃度は約1X106未満または少なくとも1 x 108 精子／mlである。
【０００９】
本発明は、さらに、生存可能な精子、カリウムおよび所望によりナトリウムを含む精子細胞懸濁液に指向され、ここに、該懸濁液中の精子の濃度は、少なくとも1 x 108 精子／mlであり、該カリウム対ナトリウムのモル比は、それぞれ、1:1より大きい。
【００１０】
本発明は、さらに、生存可能な精子、該精子による炭水化物取り込みをダウンレギュレートする組成物、およびDNA選択色素を含む精子細胞懸濁液に指向される。
【００１１】
本発明は、さらに、生存可能な、不動精子およびDNA選択色素を含む精子細胞懸濁液に指向される。
【００１２】
本発明は、さらに、生存可能な精子およびDNA選択色素を含む精子細胞懸濁液に指向され、ここに該精子は、同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な代謝速度および運動性を有する。
【００１３】
本発明は、さらに、生存可能な、不動精子、それらのDNAと関連したDNA選択色素を有する該精子を含む精子細胞懸濁液に指向される。
【００１４】
本発明は、さらに、生存可能な精子を含む精子細胞懸濁液に指向され、ここに該精子は、同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な代謝速度および運動性を有し、該精子は、また、それらのDNAと関連したDNA選択色素を有する。
【００１５】
本発明は、さらに、精子細胞を染色する方法に指向され、ここに該方法は、無傷の生存可能な精子細胞、運動阻害量のカリウム、およびDNA選択色素を含有する染色混合物を形成することを特徴とする。
【００１６】
本発明は、さらに、フローサイトメトリー方法における使用のために精子細胞懸濁液を形成する方法に指向され、ここに該方法は、精子細胞源を、精子細胞の運動性を阻害する組成物と組み合わせて精子細胞懸濁液を形成することを特徴とし、ここに該懸濁液中の精子細胞の濃度は、約1X106未満または少なくとも1 x 108 精子細胞／ミリリットルである。
【００１７】
本発明は、さらに、フローサイトメトリー方法における使用のために精子細胞懸濁液を形成する方法に指向され、ここに該方法は、阻害量の運動阻害剤を含有する緩衝液中の哺乳類の射精を収集して、精子細胞懸濁液を形成することを特徴とし、ここに該懸濁液は、約1X106未満または少なくとも1 x108 精子細胞／ミリリットルを含む。
【００１８】
本発明の他の態様および特徴は、ある程度明白であり、ある程度は以降に指摘されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
驚くべきことに、（同一種の）内因性射精精子に対して減少した運動性を有する精子は、XまたはY染色体担持精子の豊富化された集団への精子細胞の仕分けと典型的に関連した種々の工程に耐えるのにより大きい能力を有する傾向があることが決定されている。従って、好ましい具体例において、染色後または仕分け後組成物中に、増加した数の生存可能な精子または増加した数の運動精子、とくに前進運動精子を有する精子の性別豊富化された集団を、人工授精のために調製してもよい。
【００２０】
本発明の方法に従って、精子および該精子の運動性を阻害する１以上の組成物を含有する分散液と呼ばれる時もある懸濁液が形成され；そのような状態の阻害された運動性は、時に、不動性または精子静止状態と呼ばれる。一般的には、該懸濁液は、約1X103精子/mlないし約5X1010精子/mlの懸濁液の密度で、精子を含有するであろう。例えば、１つの具体例において、該懸濁液は、「比較的低い」密度で、つまり、約1X107精子/ml未満、好ましくは約1X106精子/ml未満、より好ましくは約1X103ないし約5X106精子/ml、さらにより好ましくは約1X103ないし約1X106精子/ml、さらにより好ましくは約1X104ないし約1X105精子/ml、および最も好ましくは約1X105精子/mlの懸濁液の密度で、精子を含有してもよい。代替の具体例において、該懸濁液は、「中程度」密度で、つまり、約1X107ないし約1X108精子/mlの懸濁液の密度で、精子を含有してもよい。さらにもう１つの代替の具体例において、該懸濁液は、「比較的高い」密度で、つまり、少なくとも約1 x 108精子/ml、好ましくは約1X108ないし約5X1010精子/ml、より好ましくは約1.5X108ないし約2X1010精子/ml、さらにより好ましくは約1.5X108ないし約2X108精子/ml、およびさらにより好ましくは約1.5X108精子/mlの懸濁液の密度で、精子を含有してもよい。従って、例えば、１つの具体例において、該懸濁液は、少なくとも約1.25 x 108、少なくとも約1.5 x 108、少なくとも約1.75 x 108、少なくとも約2 x 108、少なくとも約2.25 x 108、少なくとも約2.5 x 108、少なくとも約2.75 x 108、またはさらに少なくとも約3 x 108精子/mlの懸濁液を含有してもよい。代替の具体例において、該懸濁液は、約9X105未満、約7X105未満、約5X105未満、約2X105未満、約1X105未満、約1X104未満、またはさらに約1X103精子/ml未満の懸濁液を含有してもよい。
【００２１】
該精子懸濁液中の精子の密度は、該精子細胞が引き続いて豊富化されるまたは仕分けされ得る方法を含むいくつかの考慮によって決まる。例えば、該精子細胞は、下記により詳細に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて仕分けられてもよい。そのような例において、該緩衝精子懸濁液は、典型的には、「中程度」または「比較的高い」密度の精子を有し得る。他の仕分けまたは豊富化技術は、例えば本明細書中に記載の色素および標識のようなマーカーによって標識された、「比較的低い」密度の精子のようなより小さい密度の精子から利益を得てもよい。
【００２２】
好ましい具体例において、本発明の懸濁液中の精子は、特定の観点において、精巣上体精子の特徴的な様式において；例えば、該精子は、不動であってよく、および／または、それらは、洗浄されたまたは新しく射精された精子と比較して、より遅い速度の固有呼吸およびより早い速度の好気的解糖を有してもよい。従って、該阻害された。有利には、該阻害された精子は、（複数の）阻害剤からの分離の際、運動性に関しておよび、１つの具体例において、運動性および呼吸に関して、射精精子の特徴である（精巣上体精子の特徴ではない）様式で動く能力を有する。
【００２３】
１つの具体例において、例えば、該同一種の新たな射精液中の精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対して、分散液中の少なくとも約50%の該精子細胞のHTM-IVOS精子分析 (Hamilton-Thorne HTM-IVOSコンピューター補助精子分析システムHamilton-Thorne Research, Beverly MA)によって測定されるように、該運動阻害剤は、経路速度、前進速度、または両方を減少する。好ましくは、該同一種の新たな射精液中の精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対して、分散液中の少なくとも約60%の該精子細胞のHTM-IVOS精子分析によって測定されるように、該運動阻害剤は、経路速度、前進速度、または両方を減少する。より好ましくは、該運動阻害剤は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、同一種の新たな射精液中の精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対する分散液中の経路速度、前進速度、または両方を減少する。さらにより好ましくは、該運動阻害剤は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、同一種の新たな射精液中の精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対する分散液中の該精子細胞の少なくとも約80%の該精子細胞の少なくとも約70%の経路速度、前進速度、または両方を減少する。さらにより好ましくは、該運動阻害剤は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、同一種の新たな射精液において、精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対する分散液中の該精子細胞の少なくとも約90%の経路速度、前進速度、または両方を減少する。さらにより好ましくは、該運動阻害剤は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、同一種の新たな射精液において、精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対する分散液中の該精子細胞の少なくとも約95%の経路速度、前進速度、または両方を減少する。最も好ましくは、該運動阻害剤は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、同一種の新たな射精液において、精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対する分散液中の該精子細胞の少なくとも約99%の経路速度、前進速度、または両方を減少する。
【００２４】
阻害緩衝液に加えてあるいはその代わりに、精子細胞または精子細胞を取り囲む直接の環境（つまり、精子分散液）の温度は、単に減少されて、該細胞の運動性に影響を及ぼしてもよい。温度のそのような減少は、一般的には、不動性を増加させるであろう。さらに、例えば、精子細胞または精子分散液の温度の減少は、不動性を誘導するのに使用される阻害剤の濃度の減少を許容し得る。従って、該精子分散液は、5℃を超えない温度；好ましくは約0℃および約5℃の間；より好ましくは約3℃および約5℃の間；ならびに最も好ましくは約5℃であってもよい。別法として、該精子分散液は、約4℃ないし約50℃; 好ましくは約7℃ないし約43℃; より好ましくは約10℃ないし約39℃; さらにより好ましくは約15℃ないし約30℃; さらにより好ましくは約17℃ないし約25℃の範囲内の温度; および最も好ましくは約18℃であってよい。しかしながら、好ましくは、該精子細胞は、細胞の生存性に実質的に悪影響を及ぼす温度には暴露されない。
【００２５】
該阻害剤は、精子運動性に対して抑制作用を有する範囲の組成物のいずれかであってもよい。そのような組成物は、例えば、ウアバインのようなナトリウム/カリウムATPase阻害剤;カリウムイオンを含む組成物; およびカリウムおよびナトリウムイオンを含む組成物を含む。例えば、該懸濁液中の比較的高濃度のカリウムイオンは、精子運動性を抑制する傾向がある。従って、一般的には、該懸濁液がカリウムイオンの源を含有し、該懸濁液中の該カリウム濃度が少なくとも約0.05モル/Lであることが好ましい。より好ましくは、該カリウム濃度は、少なくとも約0.05モル/Lないし約0.5モル/Lである。さらにより好ましくは、該カリウム濃度は、少なくとも約0.1モル/Lないし約0.3モル/Lである。最も好ましくは、該カリウム濃度は、約0.173モル/Lである。そのような懸濁液は、必須ではないが、典型的には、ナトリウムイオンの源を含有するであろう。ナトリウムが存在する時、該カリウム対ナトリウムのモル比は、一般的には、同等またはそれぞれ1:1より大きい。好ましくは、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約1である。25:1である。さらにより好ましくは、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約1である。5:1である。さらにより好ましくは、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約1である。75:1である。さらにより好ましくは、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約1である。78:1である。１つの特定の具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約2:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約3:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約4:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約5:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約6:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約7:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約8:1である。
【００２６】
該精子懸濁液は、加えて、炭水化物の取り込みをダウンレギュレートすることが可能な二酸化炭素のイオンまたは源を含んでもよい。この具体例において、二酸化炭素の源は、例えば、１以上の炭水化物であってもよい。１つの現在好ましい具体例において、該精子懸濁液は、NaHCO3およびKHCOを含み、それにより、源カリウムおよびナトリウムイオンならびに二酸化炭素の分圧を提供する。例えば、１つの現在好ましい具体例において、該懸濁液は、水溶液中にNaHCO3およびKHCO3、好ましくは水中にNaHCO3、KHCO3、およびC6H8O7・H2Oを含む。一般的には、該分散液中の該KHCO3濃度は少なくとも約0.05モル/Lであってもよい。より好ましくは、該KHCO3濃度は、少なくとも約0.05モル/Lないし約0.5モル/Lである。さらにより好ましくは、該KHCO3濃度は、少なくとも約0.1モル/Lないし約0.3モル/Lである。１つの特定の好ましい具体例において、該懸濁液は、Salisbury & Graves, J. Reprod. Fertil., 6:351-359 (1963)に開示されるように、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2Oを含む阻害緩衝液を用いて形成される。該精子細胞は、それらが（複数の）運動阻害剤に暴露される限り、一般的には、静止状態のままであろう。
【００２７】
C6H8O7・H2Oが該分散液中に存在する時、該KHCO3対NaHCO3のモル比は上記のとおりであってよい。該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、一般的には、同等またはそれぞれ1:1より大きくてもよいが、一般的には、8:1のモル比を超えないであろう。好ましくは、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約1.25:1からである。さらにより好ましくは、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約1.5:1である。さらにより好ましくは、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約1.75:1である。１つの特定の具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約1.78:1である。もう１つの特定の具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約2:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約3:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約4:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約5:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約6:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約7:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約8:1である。１つの特定の好ましい具体例において、該分散液は、Salisbury & Graves, J. Reprod. Fertil., 6:351-359 (1963)において開示されるように、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2Oを含む阻害緩衝液を用いて形成される。該精子細胞は、一般的には、それらが（複数の）運動阻害剤に暴露される限り、静止状態のままであろう。
【００２８】
現在までの実験的証拠は、精子細胞の全体的な健康および他の生命特徴が、もし該細胞懸濁液が空気に対する二酸化炭素の高められた分圧を有する雰囲気下で維持されるなら、改善され得ると、さらに示唆する。好ましい具体例において、該懸濁液の上の雰囲気は、少なくとも0.9;より好ましくは、少なくとも約0.95の二酸化炭素の分圧を有する。
【００２９】
静止細胞は、運動阻害剤から該細胞を分離し、それらを空気に暴露することによって、活性状態に戻してもよい。加えて、活性状態の開始は、さらに、生理食塩水 (Salisbury et al., 1963)TCA緩衝液またはPBSのような緩衝液における該細胞の希釈によって、さらに誘発されてもよい。典型的には、活性状態に戻される少なくとも約20%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約60%、さらにより好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約80%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、さらにより好ましくは少なくとも約95%、および最も好ましくは少なくとも約99%の細胞（つまり、再活性化された細胞）は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、該運動阻害剤と組み合わされる前の該精子細胞の(つまり、新たな射精液の精子細胞の)経路速度、前進速度、または両方の少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約80%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、さらにより好ましくは少なくとも約95%、および最も好ましくは少なくとも約99%である経路速度、前進速度、または両方を有するであろう。
【００３０】
一般的には、該細胞仕分け方法は、一連の別個の工程、つまり、細胞試料の収集、細胞の染色、細胞の仕分け、仕分けられた細胞の収集、および所望により、該仕分けられた細胞の低温伸長（cryoextension）を含む。有利には、該運動阻害剤は、１以上のこれらの工程において形成されたまたは使用された精子懸濁液中に含まれてもよい。
【００３１】
細胞試料の収集
無傷の生存可能なウシ、ブタ、ウマ、または他の哺乳類精子細胞を収集し、該運動阻害剤と接触させてもよい。生存可能な精子の収集の種々の方法が知られており、例えば、手袋を使った方法、人工膣の使用、および電気射精を含む。一例として、典型的に約0.5ないし約100億の精子細胞／ミリリットルを含有するウシ精液試料を、該源哺乳類から直接的に、運動阻害剤を含有する容器へと収集して、精子懸濁液を形成してもよい。別法として、該精液試料は空容器へと収集され、引き続いて、収集後数分ないし数時間内に該運動阻害剤と接触させて、該精子懸濁液を形成してもよい。
【００３２】
緩衝液に加えて、該精子懸濁液は、ある範囲の添加剤を含有して、精子生存性を高めてもよい。例示的な添加剤は、蛋白源、抗生物質、および細胞内でおよび／または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物を含む。
【００３３】
例示的な蛋白源は、卵黄、卵黄抽出物、（熱で均質化されたおよびスキムを含む）乳、乳抽出物、大豆蛋白質、大豆蛋白質抽出物、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒト代替血清補充物（human serum substitute supplement）、およびその組合せを含む。アルブミン、およびより具体的にはウシ血清アルブミン (BSA)は、好ましい蛋白源である。例えば、もし含まれるなら、BSAは、約5.0%(w/v)未満、好ましくは約2%(w/v)未満、より好ましくは約1%(w/v)未満の量で、および最も好ましくは約0.1%(w/v)の量で、該精子懸濁液中に存在し得る。
【００３４】
BSAのような蛋白源の使用のみで、該懸濁液中の該精子細胞のパーセンテージで、受精能獲得の処理を開始してもよい。この方法が該雌の生殖器官で起こるのが好ましい。従って、希釈の間、ならびに続く染色および仕分けの間、受精能獲得の開始を阻害するために、代替の蛋白源または蛋白質代替物が該精子懸濁液に含まれてもよい。代替蛋白源または蛋白質代替物は、該精子懸濁液中の該細胞のより大きいパーセンテージでの受精能獲得の開始を阻害する能力に加えて、BSAのような典型的な蛋白源の有利な効果を有する。代替の蛋白源の例は、ヒト代替血清補充物(SSS) (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)およびコレステロール促進BSAを含むが、蛋白質代替物の例は、例えば、一般的には約30,000ないし約60,000の分子量の低ないし中程度の粘度のポリビニルアルコールのようなポリビニルアルコールを含む。一般的には、含まれるなら、これらの組成物は、一般的には約5.0%(w/v)を超えない緩衝液または緩衝溶液の総アルブミン含有量をもって、BSAに関して上記に開示されたのと同じ量で存在するであろう。
【００３５】
細胞内でおよび／または細胞外で酸化／還元反応を制御する例示的な組成物は、例えば、ピルビン酸塩、ビタミンK、リポ酸、グルタチオン、フラビン、キノン、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、およびSODミミックを含む。もし該精子懸濁液中に含まれるなら、そのような組成物は、精子の健康に悪影響を及ぼさずに、保護効果を達成するのに十分な濃度で存在し得る。例示的な濃度範囲は、使用される特定の組成物のような要因または該懸濁液中の精子の濃度によって、約10μMないし約20mMを含む。例えば、ピルビン酸塩は、約1mMないし約20mM、好ましくは約5mMないし約15mM、およびより好ましくは約10mMの濃度で該精子懸濁液中に存在し得る。ビタミンKは、約1μMないし約100μM、好ましくは約10μMないし約100μM、およびより好ましくは約100μMの濃度で、該精子懸濁液中に存在してもよい。リポ酸は、約0.1mMないし約1mM、好ましくは約0.5mMないし約1mM、およびより好ましくは約1mMの濃度で、該精子懸濁液中に存在してもよい。
【００３６】
抗生物質は、細菌の成長を阻害するために、該精子懸濁液中に含まれてもよい。例示的な抗生物質は、例えば、チロシン、ゲンタマイシン、リンコマイシン、スペクチノマイシン、リンコ-スペクチン（登録商標） (塩酸リンコマイシン-スペクチノマイシン)、ペニシリン、ストレプトマイシン、チカルシリン、またはそのいずれかの組合せを含む。もし含まれるなら、精液が純物である、緩衝された、または例えば、本明細書中で言及する添加剤のいずれかのようなさらなる物質を含有するかに拘わらず、抗生物質は、約50μgないし約800μg／精液のmlの濃度で存在し得る。The Certified Semen Services (CSS)およびNational Association of Animal Breeders (NAAB)は、精子収集および使用に関して抗生物質の使用に関するガイドラインを推奨している。
【００３７】
成長因子を該精子分散液に添加して、該精子細胞の生存性を維持するのに役立ててもよい。例示的な成長因子は、例えば、TGFβ-1およびTGFβ-2のような形質転換成長因子 (「TGF」)、および例えばIGF-1のようなインスリン様成長因子 (「IGF」)を含む。一般的には、TGFは、約0.1ng/Lないし約10μg/Lの濃度のTGFβ-1の形態でまたは約0.1ng/Lないし約200ng/Lの濃度のTGFβ-2として、精子分散液中に存在してもよく、IGFは、約0.1ng/Lないし約50μg/Lの濃度のIGF-1の形態で精子分散液中に存在し得る。そのような成長因子の使用は当該分野でよく知られており、例えば、その全文が本明細書中に引用によって援用される米国特許出願公報2003/0157473に開示される。
【００３８】
一旦収集されると、該細胞は、室温にて数時間、例えば5℃のような減少された温度で数週間、静止状態で保存されてもよく、あるいは、下記で論議するように、低温エキステンダーにおいて、数ヶ月間保存されてもよい。好ましくは、細胞の上の雰囲気は、上記で論議のように、高分圧のCO2を有する。別法として、該収集された細胞は、例えば、受精過程、染色過程、または仕分け過程において、数時間内に使用され得る。
【００３９】
細胞の染色
運動阻害剤を使用して、細胞を、該細胞の染色の間、動けなくしてもよい。精子細胞を染色する方法は、典型的には、無傷の生存可能な精子細胞、運動阻害剤、および標識と呼ばれる時もある色素を含有する、標識混合物と呼ばれる時もある染色混合物の形成を特徴とする。本発明のこの態様において、該運動阻害剤を、該精子細胞と接触させて、精子懸濁液を形成し、次いで、該懸濁液をDNA選択色素と接触させてもよい。この具体例において、該精子源は、純物の精液、または別法として、遠心分離または精液を画分へと分離する他の手段の使用によって入手される精子含有精液誘導体であってもよい。
【００４０】
代替の具体例において、該色素を運動阻害剤と組合せ、それにより色素溶液を形成してもよい。従って、例えば、自由流動粉末、または液体組成物を含む純物の固体の形態の色素は、阻害剤と組み合わされて、色素溶液を形成してもよく、これは次いで、純物の精液、精子懸濁液、または精子含有精液誘導体と組み合わされてもよい。
【００４１】
いずれかの事象において、該精子細胞は、一般的には、それらが阻害剤中に維持される限り、静止状態のままであろう (Salisbury et al., 1963)。好ましくは、しかしながら、該染色混合物は、空気に対して二酸化炭素の豊富化された分圧を有する雰囲気下で維持され；例えば、99%+ CO2である染色混合物上の雰囲気を供するのが一般的に好ましい。
【００４２】
染色混合物のpHは、ある範囲のpHのいずれかで維持されてもよく；典型的には、これは、約5.0ないし約9.0の範囲であろう。例えば、該染色混合物は、「僅かに塩基性の」pH、つまり、約5.0ないし約7.0で維持されてもよい。この具体例において、該pHは、好ましくは、約6.0ないし約7.0、より好ましくは約6.0ないし約6.5、および最も好ましくは約6.2である。別法として、該染色混合物は、「僅かに塩基性の」pH、つまり、約7.0ないし約9.0で維持され得る。この具体例において、該pHは、好ましくは約7.0ないし約8.0、より好ましくは約7.0ないし約7.5、および最も好ましくは約7.3である。
【００４３】
該染色混合物は、米国特許第5,135,759号およびWO02/41906で先述のように、１以上のUVまたは可視光励起性、DNA選択色素を用いることによって形成され得る。例示的UV光励起性、選択色素は、各々がSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から商業的に入手可能であるHoechst 33342およびHoechst 33258を含む。例示的可視光励起性色素は、Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR)から商業的に入手可能であるSYBR-14およびWO 02/41906に記載のビスベンズイミド-BODIPY（登録商標）コンジュゲート6-{[3-((2Z)-2-{[1-(ジフルオロボリル)-3,5-ジメチル-1H-ピロール-2-イル]メチレン}-2H-ピロール-5-イル)プロパノイル]アミノ}-N-[3-(メチル{3-[({4-[6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-1H,3'H-2,5'-ビベンズイミダゾール-2'-イル]フェノキシ}アセチル)アミノ]プロピル}アミノ)プロピル]ヘキサンアミド (「BBC」)を含む。これらの色素の各々は、単独でまたは組み合わせで使用されてもよく；別法として、他の細胞透過UVおよび可視光励起色素を、単独でまたは上記の色素と組み合わせて使用してもよく、但し、他所で記載のように、仕分けを可能にする濃度で使用された時、該色素は、該精子細胞の生存率を、許容できない程度まで悪影響を及ぼさない。
【００４４】
別法として、該染色混合物は、蛍光ポリアミド、より具体的には蛍光標識またはそれにコンジュゲートされた輸送体を有するポリアミドを用いて形成されてよい。そのような標識は、核酸に結合された時、蛍光を発するであろう。蛍光標識またはそれに結合した輸送体を有するポリアミドの例は、例えば、それらの各々の内容が引用によって本明細書中に援用されるBest et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(21): 12063-12068 (2003); Gygi, et al., Nucleic Acids Res., 30(13): 2790-2799 (2002); 米国特許第5,998,140号; 米国特許第6,143,901号;および米国特許第6,090,947号に記載のものを含む。
【００４５】
また、蛍光ヌクレオチド配列を使用して、精子細胞を標識してもよい。そのようなヌクレオチド配列は、標的または相補的配列にハイブリダイズされた時、蛍光を発するが、ハイブリダイズされていない状態の時、蛍光を発しない。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、（引用によって本明細書中に援用される）米国特許出願公開番号2003/0113765に開示される。
【００４６】
また、性別特異的抗体を使用して、染色混合物中の精子細胞を標識してもよい。この具体例において、例えば、性別特異的抗体を、蛍光部位（または同等の輸送体分子）とコンジュゲートしてもよい。該抗体は、X染色体を有するまたは代わりにY染色体を有する細胞のみに存在する抗原に結合し、そのような細胞は、それらの蛍光に基づき、選択的に同定することができる（対非標識細胞の非蛍光）。さらに、各抗体がそれに結合した異なる蛍光部位を有する１以上の性別特異的抗体を同時に使用してもよい。これによって、各々の異なる蛍光に基づき、X染色体を有するおよびY染色体を有する細胞の識別が可能となる。
【００４７】
また、発光性、色選択性ナノ結晶を使用して、染色混合物中の精子細胞を標識してもよい。量子ドットとも呼ばれるこれらの粒子は、それらの各々が引用によって本明細書中に援用される米国特許第6,322,901および米国特許第6,576,291によって示される。これらのナノ結晶は、例えば、ペプチド、抗体、核酸、ストレプトアビジン、および多糖類（例えば、例えば、それらの各々が引用によって本明細書中に援用される米国特許第6,207,392号; 6,423,551号; 5,990,479号、および6,326,144号参照）を含む多くの生物学的物質にコンジュゲートされており、生物学的標的を検出するために使用されている（例えば、それらの各々が引用によって本明細書中に援用される米国特許第6,207,392号および6,247,323号参照）。
【００４８】
該染色混合物中のDNA選択色素の好ましい濃度は、選択された色素への細胞の透過性、該染色混合物の温度、染色が生じるのに許容される時間の量、および引き続いての仕分け工程において望ましい豊富化の程度を含む可変要素の範囲の関数である。一般的には、該色素濃度は、好ましくは、実質的に精子生存率に悪影響を及ぼさずに、適度に短時間で所望の程度の染色を達成するのに十分である。例えば、該染色混合物のHoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14、またはBBCの濃度は、一般的には、約0.1μMおよび約1.0Mの間、好ましくは約0.1μMないし約700μM、およびより好ましくは約100μMないし約200μMであろう。特に好ましい具体例において、該染色混合物のHoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14、またはBBCの濃度は、一般的には、約400μMないし約500μMの間、および最も好ましくは約450μMであろう。従って、１組の染色条件下で、Hoechst 33342の濃度は、好ましくは、約100μMである。もう１組の染色条件下で、Hoechst 33342の濃度は、約150μMである。さらにもう１組の染色条件下で、該濃度は、好ましくは、約200μMである。さらにもう１組の染色条件下で、Hoechst 33342の濃度は、最も好ましくは、約450μMである。
【００４９】
もう１つの例として、例えば、米国特許公開番号2001/0002314に記載のもののような蛍光ポリアミドの濃度は、一般的には、約0.1μMおよび約1mMの間、好ましくは約1μMないし約1mM、より好ましくは約5μMないし約100μM、さらにより好ましくは約10μMであろう。所望により、該染色混合物は、添加剤を含有して、精子生存性を促進し得る。例示的な添加剤は、細胞試料収集に関して上記で論議したように、抗生物質、成長因子または細胞内でおよび／または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物を含む。これらの添加剤を、それに従って、該収集流体に添加してもよい。
【００５０】
一旦形成されると、該染色混合物は、ある範囲の温度のいずれかにて維持することができ；典型的には、これは約4℃ないし約50℃の範囲内であろう。例えば、該染色混合物は、「比較的低い」温度、つまり約4℃ないし約30℃の温度にて維持してもよく；この具体例において、該温度は、好ましくは、約20℃ないし約30℃、より好ましくは約25℃ないし約30℃、最も好ましくは約28℃である。別法として、該染色混合物は、「中程度の」温度範囲内、つまり、約30℃ないし約39℃の温度であってよく；この具体例において、該温度は、好ましくは、約34℃ないし約39℃、より好ましくは約37℃である。加えて、該染色混合物は、「比較的高い」温度範囲内、つまり、約40℃ないし約50℃の温度で維持されてよく；この具体例において、該温度は、好ましくは、約40℃ないし約45℃、より好ましくは約40℃ないし約43℃、最も好ましくは約41℃である。好ましい温度の選択は、一般的には、使用される（複数の）色素への細胞の透過性、該染色混合物中の（複数の）色素の濃度、細胞が該染色混合物中で維持されるであろう時間の量、および該仕分け工程において望ましい豊富化の程度を含む可変要素の範囲に基づく。
【００５１】
該染色混合物中の精子細胞による色素の取り込みは、DNA染色の所望の程度を得るのに十分な時間継続することが許容される。該期間は、典型的には、XおよびY染色体を有する精子細胞が、該２つの間の異なるおよび測定可能な蛍光強度に基づき仕分けられ得るように、該色素が該精子細胞のDNAに結合するのに十分な期間である。一般的には、これは、約160分以下、好ましくは約90分以下、さらにより好ましくは約60分以下、および最も好ましくは約5分ないし約40分であろう。
【００５２】
従って、１つの具体例において、精子細胞、運動阻害剤、および約100μMないし約200μMの濃度の色素を含む染色混合物が形成され、該染色混合物は、約41℃の温度にて、一定の期間維持される。もう１つの具体例において、該運動阻害剤は、0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3、および0.473g C6H8O7・H2O／25mLの精製水 (水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O)を含む。
【００５３】
もう１つの具体例において、精子細胞、運動阻害剤、および約400μMないし約500μMの濃度の色素を含む染色混合物が形成され、該染色混合物は、約41℃の温度にて、一定の期間維持される。もう１つの具体例において、該色素濃度は450μMである。もう１つの具体例において、該運動阻害剤は、0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3、および0.473g C6H8O7・H2O／25mLの精製水 (水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O)を含む。
【００５４】
さらにもう１つの具体例において、精子細胞、運動阻害剤、および約100μMないし約200μMの濃度で色素を含む染色混合物が形成され、該染色混合物は、約28℃の温度にて、一定の期間維持される。もう１つの具体例において、該運動阻害剤は、0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3、および0.473g C6H8O7・H2O／25mLの精製水 (水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O)を含む。
【００５５】
さらにもう１つの具体例において、精子細胞、運動阻害剤、および400μMないし約500μMの濃度で色素を含む染色混合物が形成され、該染色混合物は、約28℃の温度にて、一定の期間維持される。もう１つの具体例において、該色素濃度は450μMである。もう１つの具体例において、該運動阻害剤は、0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3、および0.473g C6H8O7・H2O／25mLの精製水 (水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O)を含む。
【００５６】
仕分け
また、運動阻害剤を使用して、該精子細胞の仕分けの間、該精子細胞を不動にしてもよい。一般的には、一旦精子が本発明に従って染色されると、それらは、蛍光に基づく分子を許容するいずれかの既知の手段によって仕分けられてもよい。一般的に使用されよく知られた方法は、米国特許5,135,759、5,985,216、6,071,689、6,149,867、および6,263,745、国際特許公報WO 99/33956およびWO 01/37655、およびその全文が本明細書中に引用によって援用される米国特許出願10/812,351、および対応する国際特許公報WO 2004/088283によって例示されそれに記載されるように、フローサイトメトリーシステムを含む。そのような方法によって仕分ける時、該精子は、試料流体において、フローサイトメーターのノズルに導入される。従って、１つの具体例において、該試料流体は、該染色された精子細胞および運動阻害剤を含む。
【００５７】
同様に、該サイトメーターを通過する時に試料流体の流れを取り囲むのに使用される該シース液は、また、運動阻害剤を含んでもよい。一般的には、該シース液は、加圧ガスを用いてまたはシリンジポンプによって、該サイトメーターのノズルに導入されてもよい。好ましくは、該加圧ガスは、二酸化炭素または窒素、より好ましくは窒素である。別法として、該加圧ガスは、二酸化炭素であってもよいが、そのような状況下で、沸騰を最小化するように注意してもよい。
【００５８】
所望により、該試料流体またはシース液は、また、細胞試料収集に関して上記で論議したように、抗生物質、細胞内または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物、または成長因子のような添加剤を含有してもよい。これらの添加剤の各々を、それにしたがって、いずれかの流体に添加してもよい。
【００５９】
該仕分けられた細胞の収集
一旦仕分けられると、該仕分けられた細胞は、収集流体を含有する容器に収集される。一般的には、該収集流体の目的は、該収集容器によって該精子細胞の衝撃を和らげることまたは該細胞に流体支持体を提供することを含む。従って、該収集流体は、細胞内でおよび／または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物、緩衝液または緩衝溶液、および蛋白源を含み得る。
【００６０】
１つの具体例において、該収集流体は、運動阻害剤および蛋白源を含む。もし含まれるなら、該蛋白源は、該精子細胞の生存性と干渉せず、該運動阻害剤と適合性のあるいずれの蛋白源であってもよい。一般的な蛋白源の例は、（熱で均質化されたおよびスキムを含む）乳、乳抽出物、卵黄、卵黄抽出物、大豆蛋白質および大豆蛋白質抽出物を含む。そのような蛋白質は、約1%(v/v)ないし約30%(v/v)、好ましくは約10%(v/v)ないし約20%(v/v)、およびより好ましくは約10%(v/v)の濃度で使用されてもよい。
【００６１】
所望により、該収集流体は、また、細胞試料収集に関して上記で論議したように、抗生物質、成長因子、または細胞内または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物のような添加剤を含有してもよい。これらの添加剤の各々を、それに従って、該収集流体に添加してもよい。
【００６２】
従って、特定の具体例において、該収集流体は、約6.2、より好ましくは約7.0、およびさらにより好ましくは約6.5のpHで、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2Oおよび10%(v/v) 卵黄を含む。好ましくは、該収集流体は、空気に対して二酸化炭素の豊富化された分圧を有する雰囲気下で維持され；例えば、該雰囲気は、0.9を超えて、より好ましくは0.95およびさらにより好ましくは0.99で二酸化炭素の分圧を有し得る。
【００６３】
より慣用的な収集流体の使用の代わりに、該仕分けられた細胞は、低温エキステンダーを含有するまたはそれによって被覆された容器に収集されてもよい。従って、１つの特定の具体例において、該仕分けられた細胞は、運動阻害剤を含む低温エキステンダーに収集される。もう１つの具体例において、該仕分けられた細胞は、運動阻害剤、水、Triladyl（登録商標） (Minitube, Verona, WI, グリセロール、トリス、クエン酸、フラクトース、5mg/100ml チロシン、25mg/100ml ゲンタマイシン、30mg/100ml スペクチノマイシン、および15mg/100ml リンコマイシンを含む)、卵黄、およびピルビン酸を含む低温エキステンダーに収集される。さらにもう１つの具体例において、該収集流体は、水中の0.097モル/LのNaHCO3, 0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O、および25g Triladyl（登録商標）、25g 卵黄、および10mM ピルビン酸／75mLの水を含む低温エキステンダーである。
【００６４】
仕分けられた細胞の低温伸長
一旦、精子が収集容器に仕分けられ、収集されると、それらは、雌の哺乳類を受精させるのに使用され得る。これはほとんど直ぐに起こり得、精子のさらなる処理をほとんど必要としない。同様に、該精子は、また、後日の使用のために冷却または冷凍されてもよい。そのような例において、該精子は、低温エキステンダーの添加から利益を得て、冷却および冷凍の結果としての生存性または解凍後の運動性に対する衝撃を最小化してもよい。
【００６５】
運動阻害剤を使用して、低温エキステンダーにおいて細胞を不動にしてもよい。一般的には、低温エキステンダーは、運動阻害剤、蛋白源、および抗凍結剤を含み得る。もし含まれるなら、蛋白源を添加して、細胞への支持体を提供し、収集容器と細胞の接触の衝撃を和らげてもよい。該蛋白源は、該精子細胞の生存性と干渉せず、該運動阻害剤と適合性のあるいずれかの蛋白源であってもよい。一般的な蛋白源の例は、（熱で均質化されたおよびスキムを含む）乳、乳抽出物、卵黄、卵黄抽出物、大豆蛋白質および大豆蛋白質抽出物を含む。そのような蛋白質は、約10%(v/v)ないし約30%(v/v)、好ましくは約10%(v/v)ないし約20%(v/v)、およびより好ましくは約20%(v/v)の濃度で発見され得る。
【００６６】
抗凍結剤は、好ましくは、低温エキステンダーに含まれて、低温衝撃を緩和または防ぐまたは精子の受精率を維持する。数多くの抗凍結剤が、当該分野で知られる。所与のエクステンダーとの使用に適当な抗凍結剤の選択は変動し得、冷凍される該精子が得られる種によって決まる。適当な抗凍結剤の例は、例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、Triladyl（登録商標）およびその組合せを含む。もし含まれるなら、これらの抗凍結剤は、約1%(v/v)ないし約15%(v/v)の量で、好ましくは約5%(v/v)ないし約10%(v/v)の量で、より好ましくは約7%(v/v)の量で、および最も好ましくは約6%(v/v)の量で、低温エキステンダー中に存在する。
【００６７】
１つの特定の具体例において、該低温エキステンダーは、運動阻害剤、水、Triladyl（登録商標）、卵黄、およびピルビン酸を含む。さらにもう１つの具体例において、該低温エキステンダーは、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O, および25g Triladyl（登録商標）、25g 卵黄、および10mM ピルビン酸／75mLの水を含む。
【００６８】
もう１つの特定の具体例において、該低温エキステンダーは、運動阻害剤、水、Triladyl（登録商標）、および卵黄を含む。さらにもう１つの具体例において、該低温エキステンダーは、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O、および25g Triladyl（登録商標）、および25g 卵黄／75mLの水を含む。
【００６９】
所望により、該低温エキステンダーは、また、細胞試料収集に関して上記で論議したように、抗生物質、成長因子または細胞内でおよび／または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物を含有し得る。これらの添加剤の各々を、それに従って、収集流体に添加してもよい。
【００７０】
本発明を詳細に記載してきて、添付の請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱することなしに、修飾および変更が可能であることが明白であろう。
【実施例】
【００７１】
実施例
以下の非限定的実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
実施例１
雄牛の精液を、人工膣を用いて、性的に成熟した雄牛から収集し、温度制御された容器内で、25℃にて、染色施設に移送した。受け取る際、該精液は、標準かつよく知られた手順 (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー(IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、いくつかの管の150X106精子/ml 懸濁液を、TCA緩衝液または炭酸系阻害剤中に精液を懸濁することによって調製した。下記の表I.は、使用された組成物および染色条件を示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
該精子懸濁液に、水中の10mM Hoechst溶液のアリコートを添加して、600μM Hoechstの濃度を得た。該精子懸濁液を、染色期間の持続期間(約1時間)、28℃の水槽に維持した。精子懸濁液を、該染色された精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、pH7.3のTCA中の25℃ 10mMピルビン酸塩を200μL添加して、静止状態の逆転を開始し、少なくとも５分間の平衡期間を許容し、IVOSによって分析して、パーセント前進運動率 (% Prog. Mot.)を測定することによって分析した。IVOS パーセント前進運動率の比較を図1-3に示す。
【００７４】
実施例２
雄牛の精液を、人工膣を用いて、性的に成熟した雄牛から収集し、温度制御された容器内で、25℃にて、染色施設に移送した。受け取る際、該精液は、標準かつよく知られた手順 (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー(IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、いくつかの管の450X106精子/ml 懸濁液を、TCA緩衝液または炭酸系阻害剤中に精液を懸濁することによって調製した。下記の表II.は、使用された組成物および染色条件を示す。
【００７５】
【表２】
【００７６】
該精子懸濁液に、水中の10mM Hoechst溶液のアリコートを添加して、1000μM Hoechstの濃度を得た。該精子懸濁液を、1時間、28℃の水槽中に維持し、次いで、各図において特異的に示されるように、TCA中の10mMピルビン酸塩またはpH6.2の炭酸系阻害剤によって、150X106精子/mlまで希釈して、仕分けに典型的な濃度まで希釈した。精子懸濁液を、各図内で指定された時間にて、染色され希釈された精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、pH7.3のTCA中の25℃ 10mMピルビン酸塩を200μL添加して、静止状態の逆転を開始し、少なくとも５分間の平衡期間を許容し、次いで、IVOSによってアリコートを分析して、パーセント前進運動率を測定することによって分析した。IVOS パーセント前進運動率の比較を、図4-6に示す。
【００７７】
実施例３
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、温度制御された容器において、25℃にて、染色施設に移した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、いくつかの管の450X106精子/ml 懸濁液を、TCA緩衝液または炭酸系阻害剤のいずれかにおいて精液を懸濁することによって調製した。下記の表IIは、使用された組成物および染色条件を示す。
【００７８】
【表３】
【００７９】
該精子懸濁液に、水中の10mM Hoechst溶液のアリコートを添加して、300μM Hoechstの濃度を得た。該精子懸濁液を、30分間、41℃の水槽中に維持し、次いで、各図において特異的に示されるように、TCA中の10 mMピルビン酸塩またはpH6.2の炭酸系阻害剤によって、150X106精子/mlに希釈されて、仕分けに典型的な濃度まで希釈した。精子懸濁液を、各図内で指定された時間にて、染色され希釈された精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、pH7.3のTCA中の25℃ 10mMピルビン酸塩を200μL添加して、静止状態の逆転を開始し、少なくとも５分間の平衡期間を許容し、IVOSによって分析して、該パーセント前進運動率を測定することによって分析した。IVOS パーセント前進運動率の比較を、図7-9において示す。
【００８０】
実施例４
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、該試料を、温度制御された容器内で25℃にて染色施設に移動するために、2部炭酸緩衝液中に希釈した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、1mLの150X106精子/ml 懸濁液を、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間、500Xgにて、該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで、41℃ TCA緩衝液 pH7.3において、該ペレットを再懸濁することによって調製した。さらなる1mLの150X106精子/mlを、pH7.3にて10mMピルビン酸塩を含有する41℃ TCA緩衝液中に精液のアリコートを懸濁することによって調製した。該精子懸濁液に、水中の10mM Hoechst溶液のアリコートを添加して、400μM Hoechstの色素濃度を得た。該精子懸濁液を、染色期間の持続期間、41℃水槽中に維持した。精子懸濁液を、該染色精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、同じ温度にて、200μLの同一緩衝液を添加し、次いでIVOSによって分析して、% 前進運動性 (% Prog Mot)を測定することによって分析した。IVOS分析の結果を、図10に要約する。
【００８１】
実施例５
精子試料を、以下を例外として、実施例４と同じ様式で、入手し調製した。染色およびIVOS分析のために精子を懸濁するのに使用した緩衝液は、TCAおよび10uM ビタミンKを含有するTCAであった。IVOS分析の結果を、図11に要約する。
【００８２】
実施例６
精子試料を、以下を例外として、実施例４と同じ様式で、入手し調製した。染色およびIVOS分析のために精子を懸濁するのに使用した緩衝液は、TCAおよび100uM ビタミンKを含有するTCAであった。IVOS分析の結果を、図12に要約する。
【００８３】
実施例７
精子試料を、以下を例外として、実施例４と同じ様式で、入手し調製した。染色およびIVOS分析のために精子を懸濁するのに使用した緩衝液は、TCAおよび1mM リポ酸を含有するTCAであった。IVOS分析の結果を、図13に要約する。
【００８４】
実施例８
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、該試料を、温度制御された容器内で25℃にて染色施設に移動するために、2部炭酸緩衝液中で希釈した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、1mLの150X106精子/ml 懸濁液を、5分間、500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで、28℃ TCA緩衝液 pH7.3において、該ペレットを再懸濁することによって調製した。さらなる1mLの150X106精子/mlを、pH7.3にて10mMピルビン酸塩を含有する28℃ TCA緩衝液において、精液のアリコートを懸濁することによって調製した。該精子懸濁液に、水中の10 mM Hoechst溶液のアリコートを添加して、600μM Hoechstの色素濃度を得た。該精子懸濁液を、染色期間の持続期間、28℃の水槽中に維持した。精子懸濁液を、染色精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、同じ温度にて同一の緩衝液を200μL添加し、次いでIVOSによって分析して、パーセント前進運動率 (% Prog Mot)を測定することによって分析した。IVOS分析の結果を、図14に要約する。
【００８５】
実施例９
精子試料を、以下を例外として、実施例８と同じ様式で入手し調製した。染色およびIVOS分析のために精子を懸濁するのに使用した緩衝液は、TCAおよび100uM ビタミンKを含有するTCAであった。IVOS分析の結果を、図15に要約する。
【００８６】
実施例１０
精子試料を、以下を例外として、実施例８と同じ様式で入手し調製した。染色およびIVOS分析のために精子を懸濁するのに使用した緩衝液は、TCAおよび1mM リポ酸を含有するTCAであった。IVOS分析の結果を、図16に要約する。
【００８７】
実施例１１
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、該試料を、温度制御された容器内で25℃にて染色施設に移動するために、2部の炭酸緩衝液中で希釈した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、1mLの150X106精子/ml 懸濁液を、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間、500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで1 ml TCA緩衝液または2.5 mM、10 mM、25 mM、または50 mMピルビン酸塩を有する1 ml TCA緩衝液において、該ペレットを再懸濁することによって調製した。該試料に、MON33342溶液を添加して、600μMの最終色素濃度を得た。該懸濁液を、28℃の水槽においてインキュベートした。染色された精子懸濁液を、染色精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、同じ温度にて同じ緩衝液を200μL添加し、次いで、IVOSによって分析して、パーセント前進運動率 (% Prog Mot)を測定することによって分析した。% Prog Motに対するIVOS結果を図17に示す。
【００８８】
実施例１２
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、該試料を、温度制御された容器内で25℃にて染色施設に移動するために、2部の炭酸緩衝液中で希釈した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。精液濃度に基づき、TCA緩衝液中の150X106精子/ml 懸濁液を1mL、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間、500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで1mL TCA緩衝液において該ペレットを再懸濁することによって調製した。TCA中の10mMピルビン酸塩における150X106精子/ml 懸濁液の1mlを、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間、500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで、1mLの10 mMピルビン酸塩 TCA緩衝液において該ペレットを再懸濁することによって調製した。試料に、SYBR 14 色素溶液を添加して、20μMの最終色素濃度を得た。該懸濁液を28℃水槽中でインキュベートした。精子懸濁液を、染色精子懸濁液から50μL アリコートを除去し、同じ温度にて同じ緩衝液を200μL添加し、次いでIVOSによって分析して、パーセント前進運動率 (% Prog Mot)を測定することによって分析した。% Prog Motに対するIVOS結果を、図１８で示す。
【００８９】
実施例１３
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、該試料を、温度制御された容器内で25℃にて染色施設に移動するために、2部炭酸緩衝液中で希釈した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、TCA緩衝液における1mLの150X106精子/ml 懸濁液を、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで1mL TCA緩衝液において該ペレットを再懸濁することによって調製した。TCAにおいて10mMピルビン酸塩中の1mlの150X106精子/ml 懸濁液を、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで、1mlの10 mMピルビン酸塩 TCA緩衝液において該ペレットを再懸濁することによって調製した。該試料に、BBC溶液を添加して、100μMの最終色素濃度を得た。該懸濁液を、28℃水槽においてインキュベートした。染色された精子懸濁液を、染色精子懸濁液から50μL アリコートを除去し、同じ温度にて同じ緩衝液を200μL添加し、次いでIVOSによって分析して、パーセント前進運動率(% Prog Mot)を測定することによって分析した。% Prog Motに対するIVOS結果を図19に示す。
【００９０】
実施例１４
精子試料を、以下を例外として、実施例４と同じ様式で入手し調製した。染色濃度は200uM BBCであった。該IVOS分析の結果を、図２０に要約する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図1は、実施例１において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAにおいてまたは10mMピルビン酸塩を含有する二酸化炭素で覆ったTCAにおいて、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素で染色された精子細胞に対して測定する。
【図２】図2は、実施例１において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH7.3の炭酸系阻害剤において、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について分析する。
【図３】図3は、実施例１において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH6.2の炭酸系阻害剤において、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について分析する。
【図４】図4は、実施例２において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAにおいて、28℃にて、1000μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について測定し、10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH6.2の炭酸系阻害剤のいずれかで1対3に希釈する。
【図５】図5は、実施例２において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、(1) 10mMピルビン酸塩を含有し、それによって1対3に希釈されたTCAまたは(2) pH7.3であり、pH6.2の炭酸系阻害剤によって1対3に希釈された炭酸系緩衝液において、28℃にて、1000μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について測定する。
【図６】図6は、実施例２において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH6.2の炭酸系阻害剤において、28℃にて、1000μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について測定する。
【図７】図7は、実施例３において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAにおいて、41℃にて、300μM Hoechst 33342色素によって染色され、次いで10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH6.2の炭酸系阻害剤のいずれかによって1対3に希釈された精子細胞について測定する。
【図８】図8は、実施例３において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率を、(1) 10mMピルビン酸塩を含有し、それによって1対3に希釈されたTCAまたは(2) pH7.3であり、pH6.2の炭酸系阻害剤によって1対3に希釈された炭酸系緩衝液において、41℃にて、300μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について測定する。
【図９】図9は、実施例３において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH6.2の炭酸系阻害剤において、41℃にて300μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について測定する。
【図１０】図10は、実施例４において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、41℃にて、400μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１１】図11は、実施例５において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10μM ビタミンKを含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、41℃にて、400μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１２】図12は、実施例６において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または100μM ビタミンKを含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、41℃にて、400μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１３】図13は、実施例７において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または1mM リポ酸を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、41℃にて、400μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１４】図14は、実施例８において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１５】図15は、実施例９において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または100μM ビタミンKを含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１６】図16は、実施例１０において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または1mM リポ酸を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１７】図17は、実施例１１において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液、2.5mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液、10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液、25mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液、および50mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液において、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１８】図18は、実施例１２において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、20μM SYBR-14色素によって染色された精子について測定する。
【図１９】図19は、実施例１３において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、100μM BBC色素によって染色された精子について測定する。
【図２０】図20は、実施例１４において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、200μM BBC色素によって染色された精子について測定する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、精子細胞を仕分ける方法に関する。より具体的には、本発明は、内因性射精精子に対して、減少した運動性、より具体的には一時的に減少した運動性を有する精子細胞の懸濁液の調製に関し、ここに、該懸濁液は、例えば、精子細胞を、XまたはY染色体担持精子細胞の豊富化された集団に仕分けるための方法において用途を有する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロ受精に続く人工授精 (AI)および胚移植による動物の受精は、確立された手順である。畜産業において、１以上の所望の特徴を有する子孫に向けた繁殖成績に影響を及ぼす能力は、明白な利点を有する。一例として、雌性を好んで子孫を前もって選択して、乳牛の生産を確証することは、乳業において、経済的な利益があるであろう。性別豊富化された精液または性別豊富化された精子として知られる、XおよびY染色体担持細胞の豊富化された集団への精子の分離は、前もって選択された子孫を達成する１つの方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
性別豊富化された精液を入手するために、精子細胞は色素によって染色され、続いてXおよびY染色体担持細胞へと仕分けられなければならない。染色および仕分け方法の各々は、精子細胞生存率または運動率、特に前進運動率を減少する精子細胞に重点を置く。
【０００４】
Salisbury et al.は、細胞運動性を阻害し、周りの精漿からの炭水化物の吸収を防ぐ希釈剤に直接的に射精されたウシ精液の収集のための技術を記載する。該射精が該希釈剤へと収集され、該液体の上の空気相がガスを発生させることによって100% CO2で置き換えられると、該射精中の細胞は動かなくなった。該細胞が該希釈剤中に留まり、空気が除外される限り、該細胞は、室温にて数時間および5℃にて少なくとも8日間動かないままであった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の種々の態様のなかには、例えば、精子をXまたはY-染色体担持精子へと仕分けるのに使用される方法において用途を有する精子懸濁液がある。
【０００６】
従って、簡潔には、本発明は、生存可能な精子を含む精子細胞懸濁液および精子による炭水化物取り込みをダウンレギュレートする組成物に指向され、ここに、該懸濁液中の精子の濃度は、約1X106未満または少なくとも1 x 108 精子／mlである。
【０００７】
本発明は、さらに、生存可能な、不動精子を含む精子細胞懸濁液に指向され、ここに該懸濁液中の精子の濃度は、約1X106未満または少なくとも1 x 108 精子／mlである。
【０００８】
本発明は、さらに、生存可能な精子を含む精子細胞懸濁液に指向され、ここに該精子は、同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な運動性を有し、ここに該懸濁液中の精子の濃度は約1X106未満または少なくとも1 x 108 精子／mlである。
【０００９】
本発明は、さらに、生存可能な精子、カリウムおよび所望によりナトリウムを含む精子細胞懸濁液に指向され、ここに、該懸濁液中の精子の濃度は、少なくとも1 x 108 精子／mlであり、該カリウム対ナトリウムのモル比は、それぞれ、1:1より大きい。
【００１０】
本発明は、さらに、生存可能な精子、該精子による炭水化物取り込みをダウンレギュレートする組成物、およびDNA選択色素を含む精子細胞懸濁液に指向される。
【００１１】
本発明は、さらに、生存可能な、不動精子およびDNA選択色素を含む精子細胞懸濁液に指向される。
【００１２】
本発明は、さらに、生存可能な精子およびDNA選択色素を含む精子細胞懸濁液に指向され、ここに該精子は、同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な代謝速度および運動性を有する。
【００１３】
本発明は、さらに、生存可能な、不動精子、それらのDNAと関連したDNA選択色素を有する該精子を含む精子細胞懸濁液に指向される。
【００１４】
本発明は、さらに、生存可能な精子を含む精子細胞懸濁液に指向され、ここに該精子は、同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な代謝速度および運動性を有し、該精子は、また、それらのDNAと関連したDNA選択色素を有する。
【００１５】
本発明は、さらに、精子細胞を染色する方法に指向され、ここに該方法は、無傷の生存可能な精子細胞、運動阻害量のカリウム、およびDNA選択色素を含有する染色混合物を形成することを特徴とする。
【００１６】
本発明は、さらに、フローサイトメトリー方法における使用のために精子細胞懸濁液を形成する方法に指向され、ここに該方法は、精子細胞源を、精子細胞の運動性を阻害する組成物と組み合わせて精子細胞懸濁液を形成することを特徴とし、ここに該懸濁液中の精子細胞の濃度は、約1X106未満または少なくとも1 x 108 精子細胞／ミリリットルである。
【００１７】
本発明は、さらに、フローサイトメトリー方法における使用のために精子細胞懸濁液を形成する方法に指向され、ここに該方法は、阻害量の運動阻害剤を含有する緩衝液中の哺乳類の射精を収集して、精子細胞懸濁液を形成することを特徴とし、ここに該懸濁液は、約1X106未満または少なくとも1 x108 精子細胞／ミリリットルを含む。
【００１８】
本発明の他の態様および特徴は、ある程度明白であり、ある程度は以降に指摘されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
驚くべきことに、（同一種の）内因性射精精子に対して減少した運動性を有する精子は、XまたはY染色体担持精子の豊富化された集団への精子細胞の仕分けと典型的に関連した種々の工程に耐えるのにより大きい能力を有する傾向があることが決定されている。従って、好ましい具体例において、染色後または仕分け後組成物中に、増加した数の生存可能な精子または増加した数の運動精子、とくに前進運動精子を有する精子の性別豊富化された集団を、人工授精のために調製してもよい。
【００２０】
本発明の方法に従って、精子および該精子の運動性を阻害する１以上の組成物を含有する分散液と呼ばれる時もある懸濁液が形成され；そのような状態の阻害された運動性は、時に、不動性または精子静止状態と呼ばれる。一般的には、該懸濁液は、約1X103精子/mlないし約5X1010精子/mlの懸濁液の密度で、精子を含有するであろう。例えば、１つの具体例において、該懸濁液は、「比較的低い」密度で、つまり、約1X107精子/ml未満、好ましくは約1X106精子/ml未満、より好ましくは約1X103ないし約5X106精子/ml、さらにより好ましくは約1X103ないし約1X106精子/ml、さらにより好ましくは約1X104ないし約1X105精子/ml、および最も好ましくは約1X105精子/mlの懸濁液の密度で、精子を含有してもよい。代替の具体例において、該懸濁液は、「中程度」密度で、つまり、約1X107ないし約1X108精子/mlの懸濁液の密度で、精子を含有してもよい。さらにもう１つの代替の具体例において、該懸濁液は、「比較的高い」密度で、つまり、少なくとも約1 x 108精子/ml、好ましくは約1X108ないし約5X1010精子/ml、より好ましくは約1.5X108ないし約2X1010精子/ml、さらにより好ましくは約1.5X108ないし約2X108精子/ml、およびさらにより好ましくは約1.5X108精子/mlの懸濁液の密度で、精子を含有してもよい。従って、例えば、１つの具体例において、該懸濁液は、少なくとも約1.25 x 108、少なくとも約1.5 x 108、少なくとも約1.75 x 108、少なくとも約2 x 108、少なくとも約2.25 x 108、少なくとも約2.5 x 108、少なくとも約2.75 x 108、またはさらに少なくとも約3 x 108精子/mlの懸濁液を含有してもよい。代替の具体例において、該懸濁液は、約9X105未満、約7X105未満、約5X105未満、約2X105未満、約1X105未満、約1X104未満、またはさらに約1X103精子/ml未満の懸濁液を含有してもよい。
【００２１】
該精子懸濁液中の精子の密度は、該精子細胞が引き続いて豊富化されるまたは仕分けされ得る方法を含むいくつかの考慮によって決まる。例えば、該精子細胞は、下記により詳細に記載されるように、フローサイトメトリーを用いて仕分けられてもよい。そのような例において、該緩衝精子懸濁液は、典型的には、「中程度」または「比較的高い」密度の精子を有し得る。他の仕分けまたは豊富化技術は、例えば本明細書中に記載の色素および標識のようなマーカーによって標識された、「比較的低い」密度の精子のようなより小さい密度の精子から利益を得てもよい。
【００２２】
好ましい具体例において、本発明の懸濁液中の精子は、特定の観点において、精巣上体精子の特徴的な様式において；例えば、該精子は、不動であってよく、および／または、それらは、洗浄されたまたは新しく射精された精子と比較して、より遅い速度の固有呼吸およびより早い速度の好気的解糖を有してもよい。従って、該阻害された。有利には、該阻害された精子は、（複数の）阻害剤からの分離の際、運動性に関しておよび、１つの具体例において、運動性および呼吸に関して、射精精子の特徴である（精巣上体精子の特徴ではない）様式で動く能力を有する。
【００２３】
１つの具体例において、例えば、該同一種の新たな射精液中の精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対して、分散液中の少なくとも約50%の該精子細胞のHTM-IVOS精子分析 (Hamilton-Thorne HTM-IVOSコンピューター補助精子分析システムHamilton-Thorne Research, Beverly MA)によって測定されるように、該運動阻害剤は、経路速度、前進速度、または両方を減少する。好ましくは、該同一種の新たな射精液中の精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対して、分散液中の少なくとも約60%の該精子細胞のHTM-IVOS精子分析によって測定されるように、該運動阻害剤は、経路速度、前進速度、または両方を減少する。より好ましくは、該運動阻害剤は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、同一種の新たな射精液中の精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対する分散液中の経路速度、前進速度、または両方を減少する。さらにより好ましくは、該運動阻害剤は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、同一種の新たな射精液中の精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対する分散液中の該精子細胞の少なくとも約80%の該精子細胞の少なくとも約70%の経路速度、前進速度、または両方を減少する。さらにより好ましくは、該運動阻害剤は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、同一種の新たな射精液において、精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対する分散液中の該精子細胞の少なくとも約90%の経路速度、前進速度、または両方を減少する。さらにより好ましくは、該運動阻害剤は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、同一種の新たな射精液において、精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対する分散液中の該精子細胞の少なくとも約95%の経路速度、前進速度、または両方を減少する。最も好ましくは、該運動阻害剤は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、同一種の新たな射精液において、精子細胞の経路速度、前進速度、または両方に対する分散液中の該精子細胞の少なくとも約99%の経路速度、前進速度、または両方を減少する。
【００２４】
阻害緩衝液に加えてあるいはその代わりに、精子細胞または精子細胞を取り囲む直接の環境（つまり、精子分散液）の温度は、単に減少されて、該細胞の運動性に影響を及ぼしてもよい。温度のそのような減少は、一般的には、不動性を増加させるであろう。さらに、例えば、精子細胞または精子分散液の温度の減少は、不動性を誘導するのに使用される阻害剤の濃度の減少を許容し得る。従って、該精子分散液は、5℃を超えない温度；好ましくは約0℃および約5℃の間；より好ましくは約3℃および約5℃の間；ならびに最も好ましくは約5℃であってもよい。別法として、該精子分散液は、約4℃ないし約50℃; 好ましくは約7℃ないし約43℃; より好ましくは約10℃ないし約39℃; さらにより好ましくは約15℃ないし約30℃; さらにより好ましくは約17℃ないし約25℃の範囲内の温度; および最も好ましくは約18℃であってよい。しかしながら、好ましくは、該精子細胞は、細胞の生存性に実質的に悪影響を及ぼす温度には暴露されない。
【００２５】
該阻害剤は、精子運動性に対して抑制作用を有する範囲の組成物のいずれかであってもよい。そのような組成物は、例えば、ウアバインのようなナトリウム/カリウムATPase阻害剤;カリウムイオンを含む組成物; およびカリウムおよびナトリウムイオンを含む組成物を含む。例えば、該懸濁液中の比較的高濃度のカリウムイオンは、精子運動性を抑制する傾向がある。従って、一般的には、該懸濁液がカリウムイオンの源を含有し、該懸濁液中の該カリウム濃度が少なくとも約0.05モル/Lであることが好ましい。より好ましくは、該カリウム濃度は、少なくとも約0.05モル/Lないし約0.5モル/Lである。さらにより好ましくは、該カリウム濃度は、少なくとも約0.1モル/Lないし約0.3モル/Lである。最も好ましくは、該カリウム濃度は、約0.173モル/Lである。そのような懸濁液は、必須ではないが、典型的には、ナトリウムイオンの源を含有するであろう。ナトリウムが存在する時、該カリウム対ナトリウムのモル比は、一般的には、同等またはそれぞれ1:1より大きい。好ましくは、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約1である。25:1である。さらにより好ましくは、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約1である。5:1である。さらにより好ましくは、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約1である。75:1である。さらにより好ましくは、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約1である。78:1である。１つの特定の具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約2:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約3:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約4:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約5:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約6:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約7:1である。さらにもう１つの具体例において、該カリウム対ナトリウムのモル比は、少なくとも約8:1である。
【００２６】
該精子懸濁液は、加えて、炭水化物の取り込みをダウンレギュレートすることが可能な二酸化炭素のイオンまたは源を含んでもよい。この具体例において、二酸化炭素の源は、例えば、１以上の炭水化物であってもよい。１つの現在好ましい具体例において、該精子懸濁液は、NaHCO3およびKHCOを含み、それにより、源カリウムおよびナトリウムイオンならびに二酸化炭素の分圧を提供する。例えば、１つの現在好ましい具体例において、該懸濁液は、水溶液中にNaHCO3およびKHCO3、好ましくは水中にNaHCO3、KHCO3、およびC6H8O7・H2Oを含む。一般的には、該分散液中の該KHCO3濃度は少なくとも約0.05モル/Lであってもよい。より好ましくは、該KHCO3濃度は、少なくとも約0.05モル/Lないし約0.5モル/Lである。さらにより好ましくは、該KHCO3濃度は、少なくとも約0.1モル/Lないし約0.3モル/Lである。１つの特定の好ましい具体例において、該懸濁液は、Salisbury & Graves, J. Reprod. Fertil., 6:351-359 (1963)に開示されるように、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2Oを含む阻害緩衝液を用いて形成される。該精子細胞は、それらが（複数の）運動阻害剤に暴露される限り、一般的には、静止状態のままであろう。
【００２７】
C6H8O7・H2Oが該分散液中に存在する時、該KHCO3対NaHCO3のモル比は上記のとおりであってよい。該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、一般的には、同等またはそれぞれ1:1より大きくてもよいが、一般的には、8:1のモル比を超えないであろう。好ましくは、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約1.25:1からである。さらにより好ましくは、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約1.5:1である。さらにより好ましくは、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約1.75:1である。１つの特定の具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約1.78:1である。もう１つの特定の具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約2:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約3:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約4:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約5:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約6:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約7:1である。さらにもう１つの具体例において、該KHCO3対C6H8O7・H2Oのモル比は、少なくとも約8:1である。１つの特定の好ましい具体例において、該分散液は、Salisbury & Graves, J. Reprod. Fertil., 6:351-359 (1963)において開示されるように、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2Oを含む阻害緩衝液を用いて形成される。該精子細胞は、一般的には、それらが（複数の）運動阻害剤に暴露される限り、静止状態のままであろう。
【００２８】
現在までの実験的証拠は、精子細胞の全体的な健康および他の生命特徴が、もし該細胞懸濁液が空気に対する二酸化炭素の高められた分圧を有する雰囲気下で維持されるなら、改善され得ると、さらに示唆する。好ましい具体例において、該懸濁液の上の雰囲気は、少なくとも0.9;より好ましくは、少なくとも約0.95の二酸化炭素の分圧を有する。
【００２９】
静止細胞は、運動阻害剤から該細胞を分離し、それらを空気に暴露することによって、活性状態に戻してもよい。加えて、活性状態の開始は、さらに、生理食塩水 (Salisbury et al., 1963)TCA緩衝液またはPBSのような緩衝液における該細胞の希釈によって、さらに誘発されてもよい。典型的には、活性状態に戻される少なくとも約20%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約60%、さらにより好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約80%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、さらにより好ましくは少なくとも約95%、および最も好ましくは少なくとも約99%の細胞（つまり、再活性化された細胞）は、HTM-IVOS精子分析によって測定されるように、該運動阻害剤と組み合わされる前の該精子細胞の(つまり、新たな射精液の精子細胞の)経路速度、前進速度、または両方の少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約80%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、さらにより好ましくは少なくとも約95%、および最も好ましくは少なくとも約99%である経路速度、前進速度、または両方を有するであろう。
【００３０】
一般的には、該細胞仕分け方法は、一連の別個の工程、つまり、細胞試料の収集、細胞の染色、細胞の仕分け、仕分けられた細胞の収集、および所望により、該仕分けられた細胞の低温伸長（cryoextension）を含む。有利には、該運動阻害剤は、１以上のこれらの工程において形成されたまたは使用された精子懸濁液中に含まれてもよい。
【００３１】
細胞試料の収集
無傷の生存可能なウシ、ブタ、ウマ、または他の哺乳類精子細胞を収集し、該運動阻害剤と接触させてもよい。生存可能な精子の収集の種々の方法が知られており、例えば、手袋を使った方法、人工膣の使用、および電気射精を含む。一例として、典型的に約0.5ないし約100億の精子細胞／ミリリットルを含有するウシ精液試料を、該源哺乳類から直接的に、運動阻害剤を含有する容器へと収集して、精子懸濁液を形成してもよい。別法として、該精液試料は空容器へと収集され、引き続いて、収集後数分ないし数時間内に該運動阻害剤と接触させて、該精子懸濁液を形成してもよい。
【００３２】
緩衝液に加えて、該精子懸濁液は、ある範囲の添加剤を含有して、精子生存性を高めてもよい。例示的な添加剤は、蛋白源、抗生物質、および細胞内でおよび／または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物を含む。
【００３３】
例示的な蛋白源は、卵黄、卵黄抽出物、（熱で均質化されたおよびスキムを含む）乳、乳抽出物、大豆蛋白質、大豆蛋白質抽出物、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒト代替血清補充物（human serum substitute supplement）、およびその組合せを含む。アルブミン、およびより具体的にはウシ血清アルブミン (BSA)は、好ましい蛋白源である。例えば、もし含まれるなら、BSAは、約5.0%(w/v)未満、好ましくは約2%(w/v)未満、より好ましくは約1%(w/v)未満の量で、および最も好ましくは約0.1%(w/v)の量で、該精子懸濁液中に存在し得る。
【００３４】
BSAのような蛋白源の使用のみで、該懸濁液中の該精子細胞のパーセンテージで、受精能獲得の処理を開始してもよい。この方法が該雌の生殖器官で起こるのが好ましい。従って、希釈の間、ならびに続く染色および仕分けの間、受精能獲得の開始を阻害するために、代替の蛋白源または蛋白質代替物が該精子懸濁液に含まれてもよい。代替蛋白源または蛋白質代替物は、該精子懸濁液中の該細胞のより大きいパーセンテージでの受精能獲得の開始を阻害する能力に加えて、BSAのような典型的な蛋白源の有利な効果を有する。代替の蛋白源の例は、ヒト代替血清補充物(SSS) (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)およびコレステロール促進BSAを含むが、蛋白質代替物の例は、例えば、一般的には約30,000ないし約60,000の分子量の低ないし中程度の粘度のポリビニルアルコールのようなポリビニルアルコールを含む。一般的には、含まれるなら、これらの組成物は、一般的には約5.0%(w/v)を超えない緩衝液または緩衝溶液の総アルブミン含有量をもって、BSAに関して上記に開示されたのと同じ量で存在するであろう。
【００３５】
細胞内でおよび／または細胞外で酸化／還元反応を制御する例示的な組成物は、例えば、ピルビン酸塩、ビタミンK、リポ酸、グルタチオン、フラビン、キノン、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、およびSODミミックを含む。もし該精子懸濁液中に含まれるなら、そのような組成物は、精子の健康に悪影響を及ぼさずに、保護効果を達成するのに十分な濃度で存在し得る。例示的な濃度範囲は、使用される特定の組成物のような要因または該懸濁液中の精子の濃度によって、約10μMないし約20mMを含む。例えば、ピルビン酸塩は、約1mMないし約20mM、好ましくは約5mMないし約15mM、およびより好ましくは約10mMの濃度で該精子懸濁液中に存在し得る。ビタミンKは、約1μMないし約100μM、好ましくは約10μMないし約100μM、およびより好ましくは約100μMの濃度で、該精子懸濁液中に存在してもよい。リポ酸は、約0.1mMないし約1mM、好ましくは約0.5mMないし約1mM、およびより好ましくは約1mMの濃度で、該精子懸濁液中に存在してもよい。
【００３６】
抗生物質は、細菌の成長を阻害するために、該精子懸濁液中に含まれてもよい。例示的な抗生物質は、例えば、チロシン、ゲンタマイシン、リンコマイシン、スペクチノマイシン、リンコ-スペクチン（登録商標） (塩酸リンコマイシン-スペクチノマイシン)、ペニシリン、ストレプトマイシン、チカルシリン、またはそのいずれかの組合せを含む。もし含まれるなら、精液が純物である、緩衝された、または例えば、本明細書中で言及する添加剤のいずれかのようなさらなる物質を含有するかに拘わらず、抗生物質は、約50μgないし約800μg／精液のmlの濃度で存在し得る。The Certified Semen Services (CSS)およびNational Association of Animal Breeders (NAAB)は、精子収集および使用に関して抗生物質の使用に関するガイドラインを推奨している。
【００３７】
成長因子を該精子分散液に添加して、該精子細胞の生存性を維持するのに役立ててもよい。例示的な成長因子は、例えば、TGFβ-1およびTGFβ-2のような形質転換成長因子 (「TGF」)、および例えばIGF-1のようなインスリン様成長因子 (「IGF」)を含む。一般的には、TGFは、約0.1ng/Lないし約10μg/Lの濃度のTGFβ-1の形態でまたは約0.1ng/Lないし約200ng/Lの濃度のTGFβ-2として、精子分散液中に存在してもよく、IGFは、約0.1ng/Lないし約50μg/Lの濃度のIGF-1の形態で精子分散液中に存在し得る。そのような成長因子の使用は当該分野でよく知られており、例えば、その全文が本明細書中に引用によって援用される米国特許出願公報2003/0157473に開示される。
【００３８】
一旦収集されると、該細胞は、室温にて数時間、例えば5℃のような減少された温度で数週間、静止状態で保存されてもよく、あるいは、下記で論議するように、低温エキステンダーにおいて、数ヶ月間保存されてもよい。好ましくは、細胞の上の雰囲気は、上記で論議のように、高分圧のCO2を有する。別法として、該収集された細胞は、例えば、受精過程、染色過程、または仕分け過程において、数時間内に使用され得る。
【００３９】
細胞の染色
運動阻害剤を使用して、細胞を、該細胞の染色の間、動けなくしてもよい。精子細胞を染色する方法は、典型的には、無傷の生存可能な精子細胞、運動阻害剤、および標識と呼ばれる時もある色素を含有する、標識混合物と呼ばれる時もある染色混合物の形成を特徴とする。本発明のこの態様において、該運動阻害剤を、該精子細胞と接触させて、精子懸濁液を形成し、次いで、該懸濁液をDNA選択色素と接触させてもよい。この具体例において、該精子源は、純物の精液、または別法として、遠心分離または精液を画分へと分離する他の手段の使用によって入手される精子含有精液誘導体であってもよい。
【００４０】
代替の具体例において、該色素を運動阻害剤と組合せ、それにより色素溶液を形成してもよい。従って、例えば、自由流動粉末、または液体組成物を含む純物の固体の形態の色素は、阻害剤と組み合わされて、色素溶液を形成してもよく、これは次いで、純物の精液、精子懸濁液、または精子含有精液誘導体と組み合わされてもよい。
【００４１】
いずれかの事象において、該精子細胞は、一般的には、それらが阻害剤中に維持される限り、静止状態のままであろう (Salisbury et al., 1963)。好ましくは、しかしながら、該染色混合物は、空気に対して二酸化炭素の豊富化された分圧を有する雰囲気下で維持され；例えば、99%+ CO2である染色混合物上の雰囲気を供するのが一般的に好ましい。
【００４２】
染色混合物のpHは、ある範囲のpHのいずれかで維持されてもよく；典型的には、これは、約5.0ないし約9.0の範囲であろう。例えば、該染色混合物は、「僅かに塩基性の」pH、つまり、約5.0ないし約7.0で維持されてもよい。この具体例において、該pHは、好ましくは、約6.0ないし約7.0、より好ましくは約6.0ないし約6.5、および最も好ましくは約6.2である。別法として、該染色混合物は、「僅かに塩基性の」pH、つまり、約7.0ないし約9.0で維持され得る。この具体例において、該pHは、好ましくは約7.0ないし約8.0、より好ましくは約7.0ないし約7.5、および最も好ましくは約7.3である。
【００４３】
該染色混合物は、米国特許第5,135,759号およびWO02/41906で先述のように、１以上のUVまたは可視光励起性、DNA選択色素を用いることによって形成され得る。例示的UV光励起性、選択色素は、各々がSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から商業的に入手可能であるHoechst 33342およびHoechst 33258を含む。例示的可視光励起性色素は、Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR)から商業的に入手可能であるSYBR-14およびWO 02/41906に記載のビスベンズイミド-BODIPY（登録商標）コンジュゲート6-{[3-((2Z)-2-{[1-(ジフルオロボリル)-3,5-ジメチル-1H-ピロール-2-イル]メチレン}-2H-ピロール-5-イル)プロパノイル]アミノ}-N-[3-(メチル{3-[({4-[6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-1H,3'H-2,5'-ビベンズイミダゾール-2'-イル]フェノキシ}アセチル)アミノ]プロピル}アミノ)プロピル]ヘキサンアミド (「BBC」)を含む。これらの色素の各々は、単独でまたは組み合わせで使用されてもよく；別法として、他の細胞透過UVおよび可視光励起色素を、単独でまたは上記の色素と組み合わせて使用してもよく、但し、他所で記載のように、仕分けを可能にする濃度で使用された時、該色素は、該精子細胞の生存率を、許容できない程度まで悪影響を及ぼさない。
【００４４】
別法として、該染色混合物は、蛍光ポリアミド、より具体的には蛍光標識またはそれにコンジュゲートされた輸送体を有するポリアミドを用いて形成されてよい。そのような標識は、核酸に結合された時、蛍光を発するであろう。蛍光標識またはそれに結合した輸送体を有するポリアミドの例は、例えば、それらの各々の内容が引用によって本明細書中に援用されるBest et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(21): 12063-12068 (2003); Gygi, et al., Nucleic Acids Res., 30(13): 2790-2799 (2002); 米国特許第5,998,140号; 米国特許第6,143,901号;および米国特許第6,090,947号に記載のものを含む。
【００４５】
また、蛍光ヌクレオチド配列を使用して、精子細胞を標識してもよい。そのようなヌクレオチド配列は、標的または相補的配列にハイブリダイズされた時、蛍光を発するが、ハイブリダイズされていない状態の時、蛍光を発しない。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、（引用によって本明細書中に援用される）米国特許出願公開番号2003/0113765に開示される。
【００４６】
また、性別特異的抗体を使用して、染色混合物中の精子細胞を標識してもよい。この具体例において、例えば、性別特異的抗体を、蛍光部位（または同等の輸送体分子）とコンジュゲートしてもよい。該抗体は、X染色体を有するまたは代わりにY染色体を有する細胞のみに存在する抗原に結合し、そのような細胞は、それらの蛍光に基づき、選択的に同定することができる（対非標識細胞の非蛍光）。さらに、各抗体がそれに結合した異なる蛍光部位を有する１以上の性別特異的抗体を同時に使用してもよい。これによって、各々の異なる蛍光に基づき、X染色体を有するおよびY染色体を有する細胞の識別が可能となる。
【００４７】
また、発光性、色選択性ナノ結晶を使用して、染色混合物中の精子細胞を標識してもよい。量子ドットとも呼ばれるこれらの粒子は、それらの各々が引用によって本明細書中に援用される米国特許第6,322,901および米国特許第6,576,291によって示される。これらのナノ結晶は、例えば、ペプチド、抗体、核酸、ストレプトアビジン、および多糖類（例えば、例えば、それらの各々が引用によって本明細書中に援用される米国特許第6,207,392号; 6,423,551号; 5,990,479号、および6,326,144号参照）を含む多くの生物学的物質にコンジュゲートされており、生物学的標的を検出するために使用されている（例えば、それらの各々が引用によって本明細書中に援用される米国特許第6,207,392号および6,247,323号参照）。
【００４８】
該染色混合物中のDNA選択色素の好ましい濃度は、選択された色素への細胞の透過性、該染色混合物の温度、染色が生じるのに許容される時間の量、および引き続いての仕分け工程において望ましい豊富化の程度を含む可変要素の範囲の関数である。一般的には、該色素濃度は、好ましくは、実質的に精子生存率に悪影響を及ぼさずに、適度に短時間で所望の程度の染色を達成するのに十分である。例えば、該染色混合物のHoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14、またはBBCの濃度は、一般的には、約0.1μMおよび約1.0Mの間、好ましくは約0.1μMないし約700μM、およびより好ましくは約100μMないし約200μMであろう。特に好ましい具体例において、該染色混合物のHoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14、またはBBCの濃度は、一般的には、約400μMないし約500μMの間、および最も好ましくは約450μMであろう。従って、１組の染色条件下で、Hoechst 33342の濃度は、好ましくは、約100μMである。もう１組の染色条件下で、Hoechst 33342の濃度は、約150μMである。さらにもう１組の染色条件下で、該濃度は、好ましくは、約200μMである。さらにもう１組の染色条件下で、Hoechst 33342の濃度は、最も好ましくは、約450μMである。
【００４９】
もう１つの例として、例えば、米国特許公開番号2001/0002314に記載のもののような蛍光ポリアミドの濃度は、一般的には、約0.1μMおよび約1mMの間、好ましくは約1μMないし約1mM、より好ましくは約5μMないし約100μM、さらにより好ましくは約10μMであろう。所望により、該染色混合物は、添加剤を含有して、精子生存性を促進し得る。例示的な添加剤は、細胞試料収集に関して上記で論議したように、抗生物質、成長因子または細胞内でおよび／または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物を含む。これらの添加剤を、それに従って、該収集流体に添加してもよい。
【００５０】
一旦形成されると、該染色混合物は、ある範囲の温度のいずれかにて維持することができ；典型的には、これは約4℃ないし約50℃の範囲内であろう。例えば、該染色混合物は、「比較的低い」温度、つまり約4℃ないし約30℃の温度にて維持してもよく；この具体例において、該温度は、好ましくは、約20℃ないし約30℃、より好ましくは約25℃ないし約30℃、最も好ましくは約28℃である。別法として、該染色混合物は、「中程度の」温度範囲内、つまり、約30℃ないし約39℃の温度であってよく；この具体例において、該温度は、好ましくは、約34℃ないし約39℃、より好ましくは約37℃である。加えて、該染色混合物は、「比較的高い」温度範囲内、つまり、約40℃ないし約50℃の温度で維持されてよく；この具体例において、該温度は、好ましくは、約40℃ないし約45℃、より好ましくは約40℃ないし約43℃、最も好ましくは約41℃である。好ましい温度の選択は、一般的には、使用される（複数の）色素への細胞の透過性、該染色混合物中の（複数の）色素の濃度、細胞が該染色混合物中で維持されるであろう時間の量、および該仕分け工程において望ましい豊富化の程度を含む可変要素の範囲に基づく。
【００５１】
該染色混合物中の精子細胞による色素の取り込みは、DNA染色の所望の程度を得るのに十分な時間継続することが許容される。該期間は、典型的には、XおよびY染色体を有する精子細胞が、該２つの間の異なるおよび測定可能な蛍光強度に基づき仕分けられ得るように、該色素が該精子細胞のDNAに結合するのに十分な期間である。一般的には、これは、約160分以下、好ましくは約90分以下、さらにより好ましくは約60分以下、および最も好ましくは約5分ないし約40分であろう。
【００５２】
従って、１つの具体例において、精子細胞、運動阻害剤、および約100μMないし約200μMの濃度の色素を含む染色混合物が形成され、該染色混合物は、約41℃の温度にて、一定の期間維持される。もう１つの具体例において、該運動阻害剤は、0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3、および0.473g C6H8O7・H2O／25mLの精製水 (水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O)を含む。
【００５３】
もう１つの具体例において、精子細胞、運動阻害剤、および約400μMないし約500μMの濃度の色素を含む染色混合物が形成され、該染色混合物は、約41℃の温度にて、一定の期間維持される。もう１つの具体例において、該色素濃度は450μMである。もう１つの具体例において、該運動阻害剤は、0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3、および0.473g C6H8O7・H2O／25mLの精製水 (水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O)を含む。
【００５４】
さらにもう１つの具体例において、精子細胞、運動阻害剤、および約100μMないし約200μMの濃度で色素を含む染色混合物が形成され、該染色混合物は、約28℃の温度にて、一定の期間維持される。もう１つの具体例において、該運動阻害剤は、0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3、および0.473g C6H8O7・H2O／25mLの精製水 (水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O)を含む。
【００５５】
さらにもう１つの具体例において、精子細胞、運動阻害剤、および400μMないし約500μMの濃度で色素を含む染色混合物が形成され、該染色混合物は、約28℃の温度にて、一定の期間維持される。もう１つの具体例において、該色素濃度は450μMである。もう１つの具体例において、該運動阻害剤は、0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3、および0.473g C6H8O7・H2O／25mLの精製水 (水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O)を含む。
【００５６】
仕分け
また、運動阻害剤を使用して、該精子細胞の仕分けの間、該精子細胞を不動にしてもよい。一般的には、一旦精子が本発明に従って染色されると、それらは、蛍光に基づく分子を許容するいずれかの既知の手段によって仕分けられてもよい。一般的に使用されよく知られた方法は、米国特許5,135,759、5,985,216、6,071,689、6,149,867、および6,263,745、国際特許公報WO 99/33956およびWO 01/37655、およびその全文が本明細書中に引用によって援用される米国特許出願10/812,351、および対応する国際特許公報WO 2004/088283によって例示されそれに記載されるように、フローサイトメトリーシステムを含む。そのような方法によって仕分ける時、該精子は、試料流体において、フローサイトメーターのノズルに導入される。従って、１つの具体例において、該試料流体は、該染色された精子細胞および運動阻害剤を含む。
【００５７】
同様に、該サイトメーターを通過する時に試料流体の流れを取り囲むのに使用される該シース液は、また、運動阻害剤を含んでもよい。一般的には、該シース液は、加圧ガスを用いてまたはシリンジポンプによって、該サイトメーターのノズルに導入されてもよい。好ましくは、該加圧ガスは、二酸化炭素または窒素、より好ましくは窒素である。別法として、該加圧ガスは、二酸化炭素であってもよいが、そのような状況下で、沸騰を最小化するように注意してもよい。
【００５８】
所望により、該試料流体またはシース液は、また、細胞試料収集に関して上記で論議したように、抗生物質、細胞内または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物、または成長因子のような添加剤を含有してもよい。これらの添加剤の各々を、それにしたがって、いずれかの流体に添加してもよい。
【００５９】
該仕分けられた細胞の収集
一旦仕分けられると、該仕分けられた細胞は、収集流体を含有する容器に収集される。一般的には、該収集流体の目的は、該収集容器によって該精子細胞の衝撃を和らげることまたは該細胞に流体支持体を提供することを含む。従って、該収集流体は、細胞内でおよび／または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物、緩衝液または緩衝溶液、および蛋白源を含み得る。
【００６０】
１つの具体例において、該収集流体は、運動阻害剤および蛋白源を含む。もし含まれるなら、該蛋白源は、該精子細胞の生存性と干渉せず、該運動阻害剤と適合性のあるいずれの蛋白源であってもよい。一般的な蛋白源の例は、（熱で均質化されたおよびスキムを含む）乳、乳抽出物、卵黄、卵黄抽出物、大豆蛋白質および大豆蛋白質抽出物を含む。そのような蛋白質は、約1%(v/v)ないし約30%(v/v)、好ましくは約10%(v/v)ないし約20%(v/v)、およびより好ましくは約10%(v/v)の濃度で使用されてもよい。
【００６１】
所望により、該収集流体は、また、細胞試料収集に関して上記で論議したように、抗生物質、成長因子、または細胞内または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物のような添加剤を含有してもよい。これらの添加剤の各々を、それに従って、該収集流体に添加してもよい。
【００６２】
従って、特定の具体例において、該収集流体は、約6.2、より好ましくは約7.0、およびさらにより好ましくは約6.5のpHで、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2Oおよび10%(v/v) 卵黄を含む。好ましくは、該収集流体は、空気に対して二酸化炭素の豊富化された分圧を有する雰囲気下で維持され；例えば、該雰囲気は、0.9を超えて、より好ましくは0.95およびさらにより好ましくは0.99で二酸化炭素の分圧を有し得る。
【００６３】
より慣用的な収集流体の使用の代わりに、該仕分けられた細胞は、低温エキステンダーを含有するまたはそれによって被覆された容器に収集されてもよい。従って、１つの特定の具体例において、該仕分けられた細胞は、運動阻害剤を含む低温エキステンダーに収集される。もう１つの具体例において、該仕分けられた細胞は、運動阻害剤、水、Triladyl（登録商標） (Minitube, Verona, WI, グリセロール、トリス、クエン酸、フラクトース、5mg/100ml チロシン、25mg/100ml ゲンタマイシン、30mg/100ml スペクチノマイシン、および15mg/100ml リンコマイシンを含む)、卵黄、およびピルビン酸を含む低温エキステンダーに収集される。さらにもう１つの具体例において、該収集流体は、水中の0.097モル/LのNaHCO3, 0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O、および25g Triladyl（登録商標）、25g 卵黄、および10mM ピルビン酸／75mLの水を含む低温エキステンダーである。
【００６４】
仕分けられた細胞の低温伸長
一旦、精子が収集容器に仕分けられ、収集されると、それらは、雌の哺乳類を受精させるのに使用され得る。これはほとんど直ぐに起こり得、精子のさらなる処理をほとんど必要としない。同様に、該精子は、また、後日の使用のために冷却または冷凍されてもよい。そのような例において、該精子は、低温エキステンダーの添加から利益を得て、冷却および冷凍の結果としての生存性または解凍後の運動性に対する衝撃を最小化してもよい。
【００６５】
運動阻害剤を使用して、低温エキステンダーにおいて細胞を不動にしてもよい。一般的には、低温エキステンダーは、運動阻害剤、蛋白源、および抗凍結剤を含み得る。もし含まれるなら、蛋白源を添加して、細胞への支持体を提供し、収集容器と細胞の接触の衝撃を和らげてもよい。該蛋白源は、該精子細胞の生存性と干渉せず、該運動阻害剤と適合性のあるいずれかの蛋白源であってもよい。一般的な蛋白源の例は、（熱で均質化されたおよびスキムを含む）乳、乳抽出物、卵黄、卵黄抽出物、大豆蛋白質および大豆蛋白質抽出物を含む。そのような蛋白質は、約10%(v/v)ないし約30%(v/v)、好ましくは約10%(v/v)ないし約20%(v/v)、およびより好ましくは約20%(v/v)の濃度で発見され得る。
【００６６】
抗凍結剤は、好ましくは、低温エキステンダーに含まれて、低温衝撃を緩和または防ぐまたは精子の受精率を維持する。数多くの抗凍結剤が、当該分野で知られる。所与のエクステンダーとの使用に適当な抗凍結剤の選択は変動し得、冷凍される該精子が得られる種によって決まる。適当な抗凍結剤の例は、例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、Triladyl（登録商標）およびその組合せを含む。もし含まれるなら、これらの抗凍結剤は、約1%(v/v)ないし約15%(v/v)の量で、好ましくは約5%(v/v)ないし約10%(v/v)の量で、より好ましくは約7%(v/v)の量で、および最も好ましくは約6%(v/v)の量で、低温エキステンダー中に存在する。
【００６７】
１つの特定の具体例において、該低温エキステンダーは、運動阻害剤、水、Triladyl（登録商標）、卵黄、およびピルビン酸を含む。さらにもう１つの具体例において、該低温エキステンダーは、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O, および25g Triladyl（登録商標）、25g 卵黄、および10mM ピルビン酸／75mLの水を含む。
【００６８】
もう１つの特定の具体例において、該低温エキステンダーは、運動阻害剤、水、Triladyl（登録商標）、および卵黄を含む。さらにもう１つの具体例において、該低温エキステンダーは、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2O、および25g Triladyl（登録商標）、および25g 卵黄／75mLの水を含む。
【００６９】
所望により、該低温エキステンダーは、また、細胞試料収集に関して上記で論議したように、抗生物質、成長因子または細胞内でおよび／または細胞外で酸化／還元反応を制御する組成物を含有し得る。これらの添加剤の各々を、それに従って、収集流体に添加してもよい。
【００７０】
本発明を詳細に記載してきて、添付の請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱することなしに、修飾および変更が可能であることが明白であろう。
【実施例】
【００７１】
実施例
以下の非限定的実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
実施例１
雄牛の精液を、人工膣を用いて、性的に成熟した雄牛から収集し、温度制御された容器内で、25℃にて、染色施設に移送した。受け取る際、該精液は、標準かつよく知られた手順 (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー(IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、いくつかの管の150X106精子/ml 懸濁液を、TCA緩衝液または炭酸系阻害剤中に精液を懸濁することによって調製した。下記の表I.は、使用された組成物および染色条件を示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
該精子懸濁液に、水中の10mM Hoechst溶液のアリコートを添加して、600μM Hoechstの濃度を得た。該精子懸濁液を、染色期間の持続期間(約1時間)、28℃の水槽に維持した。精子懸濁液を、該染色された精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、pH7.3のTCA中の25℃ 10mMピルビン酸塩を200μL添加して、静止状態の逆転を開始し、少なくとも５分間の平衡期間を許容し、IVOSによって分析して、パーセント前進運動率 (% Prog. Mot.)を測定することによって分析した。IVOS パーセント前進運動率の比較を図1-3に示す。
【００７４】
実施例２
雄牛の精液を、人工膣を用いて、性的に成熟した雄牛から収集し、温度制御された容器内で、25℃にて、染色施設に移送した。受け取る際、該精液は、標準かつよく知られた手順 (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー(IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、いくつかの管の450X106精子/ml 懸濁液を、TCA緩衝液または炭酸系阻害剤中に精液を懸濁することによって調製した。下記の表II.は、使用された組成物および染色条件を示す。
【００７５】
【表２】
【００７６】
該精子懸濁液に、水中の10mM Hoechst溶液のアリコートを添加して、1000μM Hoechstの濃度を得た。該精子懸濁液を、1時間、28℃の水槽中に維持し、次いで、各図において特異的に示されるように、TCA中の10mMピルビン酸塩またはpH6.2の炭酸系阻害剤によって、150X106精子/mlまで希釈して、仕分けに典型的な濃度まで希釈した。精子懸濁液を、各図内で指定された時間にて、染色され希釈された精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、pH7.3のTCA中の25℃ 10mMピルビン酸塩を200μL添加して、静止状態の逆転を開始し、少なくとも５分間の平衡期間を許容し、次いで、IVOSによってアリコートを分析して、パーセント前進運動率を測定することによって分析した。IVOS パーセント前進運動率の比較を、図4-6に示す。
【００７７】
実施例３
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、温度制御された容器において、25℃にて、染色施設に移した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、いくつかの管の450X106精子/ml 懸濁液を、TCA緩衝液または炭酸系阻害剤のいずれかにおいて精液を懸濁することによって調製した。下記の表IIは、使用された組成物および染色条件を示す。
【００７８】
【表３】
【００７９】
該精子懸濁液に、水中の10mM Hoechst溶液のアリコートを添加して、300μM Hoechstの濃度を得た。該精子懸濁液を、30分間、41℃の水槽中に維持し、次いで、各図において特異的に示されるように、TCA中の10 mMピルビン酸塩またはpH6.2の炭酸系阻害剤によって、150X106精子/mlに希釈されて、仕分けに典型的な濃度まで希釈した。精子懸濁液を、各図内で指定された時間にて、染色され希釈された精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、pH7.3のTCA中の25℃ 10mMピルビン酸塩を200μL添加して、静止状態の逆転を開始し、少なくとも５分間の平衡期間を許容し、IVOSによって分析して、該パーセント前進運動率を測定することによって分析した。IVOS パーセント前進運動率の比較を、図7-9において示す。
【００８０】
実施例４
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、該試料を、温度制御された容器内で25℃にて染色施設に移動するために、2部炭酸緩衝液中に希釈した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、1mLの150X106精子/ml 懸濁液を、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間、500Xgにて、該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで、41℃ TCA緩衝液 pH7.3において、該ペレットを再懸濁することによって調製した。さらなる1mLの150X106精子/mlを、pH7.3にて10mMピルビン酸塩を含有する41℃ TCA緩衝液中に精液のアリコートを懸濁することによって調製した。該精子懸濁液に、水中の10mM Hoechst溶液のアリコートを添加して、400μM Hoechstの色素濃度を得た。該精子懸濁液を、染色期間の持続期間、41℃水槽中に維持した。精子懸濁液を、該染色精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、同じ温度にて、200μLの同一緩衝液を添加し、次いでIVOSによって分析して、% 前進運動性 (% Prog Mot)を測定することによって分析した。IVOS分析の結果を、図10に要約する。
【００８１】
実施例５
精子試料を、以下を例外として、実施例４と同じ様式で、入手し調製した。染色およびIVOS分析のために精子を懸濁するのに使用した緩衝液は、TCAおよび10uM ビタミンKを含有するTCAであった。IVOS分析の結果を、図11に要約する。
【００８２】
実施例６
精子試料を、以下を例外として、実施例４と同じ様式で、入手し調製した。染色およびIVOS分析のために精子を懸濁するのに使用した緩衝液は、TCAおよび100uM ビタミンKを含有するTCAであった。IVOS分析の結果を、図12に要約する。
【００８３】
実施例７
精子試料を、以下を例外として、実施例４と同じ様式で、入手し調製した。染色およびIVOS分析のために精子を懸濁するのに使用した緩衝液は、TCAおよび1mM リポ酸を含有するTCAであった。IVOS分析の結果を、図13に要約する。
【００８４】
実施例８
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、該試料を、温度制御された容器内で25℃にて染色施設に移動するために、2部炭酸緩衝液中で希釈した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、1mLの150X106精子/ml 懸濁液を、5分間、500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで、28℃ TCA緩衝液 pH7.3において、該ペレットを再懸濁することによって調製した。さらなる1mLの150X106精子/mlを、pH7.3にて10mMピルビン酸塩を含有する28℃ TCA緩衝液において、精液のアリコートを懸濁することによって調製した。該精子懸濁液に、水中の10 mM Hoechst溶液のアリコートを添加して、600μM Hoechstの色素濃度を得た。該精子懸濁液を、染色期間の持続期間、28℃の水槽中に維持した。精子懸濁液を、染色精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、同じ温度にて同一の緩衝液を200μL添加し、次いでIVOSによって分析して、パーセント前進運動率 (% Prog Mot)を測定することによって分析した。IVOS分析の結果を、図14に要約する。
【００８５】
実施例９
精子試料を、以下を例外として、実施例８と同じ様式で入手し調製した。染色およびIVOS分析のために精子を懸濁するのに使用した緩衝液は、TCAおよび100uM ビタミンKを含有するTCAであった。IVOS分析の結果を、図15に要約する。
【００８６】
実施例１０
精子試料を、以下を例外として、実施例８と同じ様式で入手し調製した。染色およびIVOS分析のために精子を懸濁するのに使用した緩衝液は、TCAおよび1mM リポ酸を含有するTCAであった。IVOS分析の結果を、図16に要約する。
【００８７】
実施例１１
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、該試料を、温度制御された容器内で25℃にて染色施設に移動するために、2部の炭酸緩衝液中で希釈した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、1mLの150X106精子/ml 懸濁液を、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間、500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで1 ml TCA緩衝液または2.5 mM、10 mM、25 mM、または50 mMピルビン酸塩を有する1 ml TCA緩衝液において、該ペレットを再懸濁することによって調製した。該試料に、MON33342溶液を添加して、600μMの最終色素濃度を得た。該懸濁液を、28℃の水槽においてインキュベートした。染色された精子懸濁液を、染色精子懸濁液から50μLアリコートを除去し、同じ温度にて同じ緩衝液を200μL添加し、次いで、IVOSによって分析して、パーセント前進運動率 (% Prog Mot)を測定することによって分析した。% Prog Motに対するIVOS結果を図17に示す。
【００８８】
実施例１２
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、該試料を、温度制御された容器内で25℃にて染色施設に移動するために、2部の炭酸緩衝液中で希釈した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。精液濃度に基づき、TCA緩衝液中の150X106精子/ml 懸濁液を1mL、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間、500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで1mL TCA緩衝液において該ペレットを再懸濁することによって調製した。TCA中の10mMピルビン酸塩における150X106精子/ml 懸濁液の1mlを、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間、500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで、1mLの10 mMピルビン酸塩 TCA緩衝液において該ペレットを再懸濁することによって調製した。試料に、SYBR 14 色素溶液を添加して、20μMの最終色素濃度を得た。該懸濁液を28℃水槽中でインキュベートした。精子懸濁液を、染色精子懸濁液から50μL アリコートを除去し、同じ温度にて同じ緩衝液を200μL添加し、次いでIVOSによって分析して、パーセント前進運動率 (% Prog Mot)を測定することによって分析した。% Prog Motに対するIVOS結果を、図１８で示す。
【００８９】
実施例１３
雄牛の精液を、人工膣を用いて性的に成熟した雄牛から収集し、該試料を、温度制御された容器内で25℃にて染色施設に移動するために、2部炭酸緩衝液中で希釈した。受け取る際、該精液を、標準かつよく知られた手順(Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998))に従って、Hamilton-Thorn 運動性アナライザー (IVOS)によって、濃度、運動性および前進運動性について分析した。該精液濃度に基づき、TCA緩衝液における1mLの150X106精子/ml 懸濁液を、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで1mL TCA緩衝液において該ペレットを再懸濁することによって調製した。TCAにおいて10mMピルビン酸塩中の1mlの150X106精子/ml 懸濁液を、炭酸精子懸濁液のアリコートを除去し、5分間500Xgにて該精子懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで、1mlの10 mMピルビン酸塩 TCA緩衝液において該ペレットを再懸濁することによって調製した。該試料に、BBC溶液を添加して、100μMの最終色素濃度を得た。該懸濁液を、28℃水槽においてインキュベートした。染色された精子懸濁液を、染色精子懸濁液から50μL アリコートを除去し、同じ温度にて同じ緩衝液を200μL添加し、次いでIVOSによって分析して、パーセント前進運動率(% Prog Mot)を測定することによって分析した。% Prog Motに対するIVOS結果を図19に示す。
【００９０】
実施例１４
精子試料を、以下を例外として、実施例４と同じ様式で入手し調製した。染色濃度は200uM BBCであった。該IVOS分析の結果を、図２０に要約する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図1は、実施例１において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAにおいてまたは10mMピルビン酸塩を含有する二酸化炭素で覆ったTCAにおいて、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素で染色された精子細胞に対して測定する。
【図２】図2は、実施例１において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH7.3の炭酸系阻害剤において、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について分析する。
【図３】図3は、実施例１において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH6.2の炭酸系阻害剤において、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について分析する。
【図４】図4は、実施例２において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAにおいて、28℃にて、1000μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について測定し、10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH6.2の炭酸系阻害剤のいずれかで1対3に希釈する。
【図５】図5は、実施例２において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、(1) 10mMピルビン酸塩を含有し、それによって1対3に希釈されたTCAまたは(2) pH7.3であり、pH6.2の炭酸系阻害剤によって1対3に希釈された炭酸系緩衝液において、28℃にて、1000μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について測定する。
【図６】図6は、実施例２において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH6.2の炭酸系阻害剤において、28℃にて、1000μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について測定する。
【図７】図7は、実施例３において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAにおいて、41℃にて、300μM Hoechst 33342色素によって染色され、次いで10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH6.2の炭酸系阻害剤のいずれかによって1対3に希釈された精子細胞について測定する。
【図８】図8は、実施例３において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率を、(1) 10mMピルビン酸塩を含有し、それによって1対3に希釈されたTCAまたは(2) pH7.3であり、pH6.2の炭酸系阻害剤によって1対3に希釈された炭酸系緩衝液において、41℃にて、300μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について測定する。
【図９】図9は、実施例３において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子細胞のパーセント前進運動率は、10mMピルビン酸塩を含有するTCAまたはpH6.2の炭酸系阻害剤において、41℃にて300μM Hoechst 33342色素によって染色された精子細胞について測定する。
【図１０】図10は、実施例４において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、41℃にて、400μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１１】図11は、実施例５において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10μM ビタミンKを含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、41℃にて、400μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１２】図12は、実施例６において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または100μM ビタミンKを含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、41℃にて、400μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１３】図13は、実施例７において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または1mM リポ酸を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、41℃にて、400μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１４】図14は、実施例８において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１５】図15は、実施例９において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または100μM ビタミンKを含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１６】図16は、実施例１０において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または1mM リポ酸を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１７】図17は、実施例１１において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液、2.5mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液、10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液、25mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液、および50mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液において、28℃にて、600μM Hoechst 33342色素によって染色された精子について測定する。
【図１８】図18は、実施例１２において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、20μM SYBR-14色素によって染色された精子について測定する。
【図１９】図19は、実施例１３において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、100μM BBC色素によって染色された精子について測定する。
【図２０】図20は、実施例１４において実施された研究の結果を図的に示し、ここに、精子のパーセント前進運動率を、TCA緩衝液または10mMピルビン酸塩を含有するTCA緩衝液のいずれかにおいて、28℃にて、200μM BBC色素によって染色された精子について測定する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存可能な精子および該精子によって炭水化物取り込みをダウンレギュレートする組成物を含み、ここに該懸濁液中の精子の濃度が、約1X106未満または少なくとも約1 x 108 精子／mlである精子細胞懸濁液。
【請求項２】
生存可能な、不動精子を含み、ここに該懸濁液中の精子の濃度が約1X106未満または少なくとも約1 x 108 精子／mlである精子細胞懸濁液。
【請求項３】
生存可能な精子を含み、ここに該精子が、同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な運動性を有し、ここに該懸濁液中の精子の濃度が、1X106未満または少なくとも約1 x 108 精子／mlである精子細胞懸濁液。
【請求項４】
生存可能な精子、カリウムおよび所望によりナトリウムを含み、ここに該懸濁液中の精子の濃度が約1X106未満または少なくとも約1 x 108 精子／mlであり、該カリウム対ナトリウムのモル比が、それぞれ、1:1より大きい精子細胞懸濁液。
【請求項５】
該カリウム対ナトリウムのモル比が、それぞれ、1.25:1より大きい請求項４記載の懸濁液。
【請求項６】
該カリウム対ナトリウムのモル比が、それぞれ、1.5:1より大きい請求項４記載の懸濁液。
【請求項７】
該カリウム対ナトリウムのモル比が、それぞれ、1.75:1より大きい請求項４記載の懸濁液。
【請求項８】
該カリウム対ナトリウムのモル比が、それぞれ、2:1より大きい請求項４記載の懸濁液。
【請求項９】
生存可能な精子、炭水化物取り込みをダウンレギュレートする組成物、およびDNA選択色素を含む精子細胞懸濁液。
【請求項１０】
生存可能な、不動精子およびDNA選択色素を含む精子細胞懸濁液。
【請求項１１】
生存可能な精子およびDNA選択色素を含み、ここに、該精子が同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な代謝速度および運動性を有する精子細胞懸濁液。
【請求項１２】
生存可能な、不動精子を含み、ここに、該精子がそれらのDNAと関連したDNA選択色素を有する精子細胞懸濁液。
【請求項１３】
生存可能な精子を含み、ここに該精子が同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な代謝速度および運動性を有し、ここに、該精子が、それらのDNAと関連したDNA選択色素を有する精子細胞懸濁液。
【請求項１４】
該色素がDNA選択蛍光色素である請求項１０記載の懸濁液。
【請求項１５】
該色素がUV励起または可視光励起色素である請求項１０記載の懸濁液。
【請求項１６】
該色素が、Hoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14、およびビスベンズイミド-BODIPY（登録商標）コンジュゲート6-{[3-((2Z)-2-{[1-(ジフルオロボリル)-3,5-ジメチル-1H-ピロル-2-イル]メチレン}-2H-ピロル-5-イル)プロパノイル]アミノ}-N-[3-(メチル{3-[({4-[6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-1H,3'H-2,5'-ビベンズイミダゾール-2'-イル]フェノキシ}アセチル)アミノ]プロピル}アミノ)プロピル]ヘキサンアミドよりなる群から選択される請求項１０記載の懸濁液。
【請求項１７】
該懸濁液が炭酸塩源を含む請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項１８】
該懸濁液が、NaHCO3、KHCO3、およびC6H8O7・H2Oを含む請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項１９】
該懸濁液が、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2Oを含む緩衝液から形成される請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２０】
該懸濁液中の精子の濃度が少なくとも1.25 x 108 精子／mlである請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２１】
該懸濁液中の精子の濃度が少なくとも1.5 x 108 精子／mlである請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２２】
該懸濁液中の精子の濃度が少なくとも1.75 x 108精子／mlである請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２３】
該懸濁液中の精子の濃度が約9.0X105精子／ml未満である請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２４】
該懸濁液中の精子の濃度が約7X105精子／ml未満である請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２５】
該懸濁液中の精子の濃度が約5X105精子／ml未満である請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２６】
該懸濁液中の精子の濃度が約2X105精子／ml未満である請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２７】
該懸濁液中の精子の濃度が約1X105精子／ml未満である請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２８】
精子細胞を染色するための方法であって、無傷の生存可能な精子細胞、運動阻害量のカリウム、およびDNA選択色素を含有する染色混合物を形成することを特徴とする該方法。
【請求項２９】
該染色混合物が、空気に対してCO2の豊富化された分圧を有する雰囲気下にある請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
細胞仕分けでの使用のために精子細胞懸濁液を形成する方法であって、精子細胞源を、精子細胞の運動性を阻害する組成物と組み合わせて、精子細胞懸濁液を形成することを含み、ここに該懸濁液中の精子細胞の濃度は、約1X106未満または少なくとも1 x 108 精子細胞／ミリリットルであることを特徴とする該方法。
【請求項３１】
フローサイトメトリー方法での使用のために精子細胞懸濁液を形成する方法であって、阻害量の運動阻害剤を含有する緩衝液中の哺乳類の射精を収集して、精子細胞懸濁液を形成することを含み、ここに該懸濁液が、約1X106未満または少なくとも1 x108 精子細胞／ミリリットルを含むことを特徴とする該方法。
【請求項３２】
該細胞懸濁液がDNA選択色素を含む請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
さらにDNA選択色素を含む請求項１８記載の懸濁液。
【請求項１】
生存可能な精子および該精子によって炭水化物取り込みをダウンレギュレートする組成物を含み、ここに該懸濁液中の精子の濃度が、約1X106未満または少なくとも約1 x 108 精子／mlである精子細胞懸濁液。
【請求項２】
生存可能な、不動精子を含み、ここに該懸濁液中の精子の濃度が約1X106未満または少なくとも約1 x 108 精子／mlである精子細胞懸濁液。
【請求項３】
生存可能な精子を含み、ここに該精子が、同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な運動性を有し、ここに該懸濁液中の精子の濃度が、1X106未満または少なくとも約1 x 108 精子／mlである精子細胞懸濁液。
【請求項４】
生存可能な精子、カリウムおよび所望によりナトリウムを含み、ここに該懸濁液中の精子の濃度が約1X106未満または少なくとも約1 x 108 精子／mlであり、該カリウム対ナトリウムのモル比が、それぞれ、1:1より大きい精子細胞懸濁液。
【請求項５】
該カリウム対ナトリウムのモル比が、それぞれ、1.25:1より大きい請求項４記載の懸濁液。
【請求項６】
該カリウム対ナトリウムのモル比が、それぞれ、1.5:1より大きい請求項４記載の懸濁液。
【請求項７】
該カリウム対ナトリウムのモル比が、それぞれ、1.75:1より大きい請求項４記載の懸濁液。
【請求項８】
該カリウム対ナトリウムのモル比が、それぞれ、2:1より大きい請求項４記載の懸濁液。
【請求項９】
生存可能な精子、炭水化物取り込みをダウンレギュレートする組成物、およびDNA選択色素を含む精子細胞懸濁液。
【請求項１０】
生存可能な、不動精子およびDNA選択色素を含む精子細胞懸濁液。
【請求項１１】
生存可能な精子およびDNA選択色素を含み、ここに、該精子が同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な代謝速度および運動性を有する精子細胞懸濁液。
【請求項１２】
生存可能な、不動精子を含み、ここに、該精子がそれらのDNAと関連したDNA選択色素を有する精子細胞懸濁液。
【請求項１３】
生存可能な精子を含み、ここに該精子が同一種の内因性射精精子よりも精巣上体精子に特徴的な代謝速度および運動性を有し、ここに、該精子が、それらのDNAと関連したDNA選択色素を有する精子細胞懸濁液。
【請求項１４】
該色素がDNA選択蛍光色素である請求項１０記載の懸濁液。
【請求項１５】
該色素がUV励起または可視光励起色素である請求項１０記載の懸濁液。
【請求項１６】
該色素が、Hoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14、およびビスベンズイミド-BODIPY（登録商標）コンジュゲート6-{[3-((2Z)-2-{[1-(ジフルオロボリル)-3,5-ジメチル-1H-ピロル-2-イル]メチレン}-2H-ピロル-5-イル)プロパノイル]アミノ}-N-[3-(メチル{3-[({4-[6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-1H,3'H-2,5'-ビベンズイミダゾール-2'-イル]フェノキシ}アセチル)アミノ]プロピル}アミノ)プロピル]ヘキサンアミドよりなる群から選択される請求項１０記載の懸濁液。
【請求項１７】
該懸濁液が炭酸塩源を含む請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項１８】
該懸濁液が、NaHCO3、KHCO3、およびC6H8O7・H2Oを含む請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項１９】
該懸濁液が、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/L C6H8O7・H2Oを含む緩衝液から形成される請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２０】
該懸濁液中の精子の濃度が少なくとも1.25 x 108 精子／mlである請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２１】
該懸濁液中の精子の濃度が少なくとも1.5 x 108 精子／mlである請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２２】
該懸濁液中の精子の濃度が少なくとも1.75 x 108精子／mlである請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２３】
該懸濁液中の精子の濃度が約9.0X105精子／ml未満である請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２４】
該懸濁液中の精子の濃度が約7X105精子／ml未満である請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２５】
該懸濁液中の精子の濃度が約5X105精子／ml未満である請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２６】
該懸濁液中の精子の濃度が約2X105精子／ml未満である請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２７】
該懸濁液中の精子の濃度が約1X105精子／ml未満である請求項２記載の精子懸濁液。
【請求項２８】
精子細胞を染色するための方法であって、無傷の生存可能な精子細胞、運動阻害量のカリウム、およびDNA選択色素を含有する染色混合物を形成することを特徴とする該方法。
【請求項２９】
該染色混合物が、空気に対してCO2の豊富化された分圧を有する雰囲気下にある請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
細胞仕分けでの使用のために精子細胞懸濁液を形成する方法であって、精子細胞源を、精子細胞の運動性を阻害する組成物と組み合わせて、精子細胞懸濁液を形成することを含み、ここに該懸濁液中の精子細胞の濃度は、約1X106未満または少なくとも1 x 108 精子細胞／ミリリットルであることを特徴とする該方法。
【請求項３１】
フローサイトメトリー方法での使用のために精子細胞懸濁液を形成する方法であって、阻害量の運動阻害剤を含有する緩衝液中の哺乳類の射精を収集して、精子細胞懸濁液を形成することを含み、ここに該懸濁液が、約1X106未満または少なくとも1 x108 精子細胞／ミリリットルを含むことを特徴とする該方法。
【請求項３２】
該細胞懸濁液がDNA選択色素を含む請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
さらにDNA選択色素を含む請求項１８記載の懸濁液。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００７−５３１５２３（Ｐ２００７−５３１５２３Ａ）
【公表日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０６４６１（Ｐ２００７−５０６４６１）
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１０４８１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９５５９０
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０１２３１６１３）モンサント テクノロジー エルエルシー (71)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１０４８１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９５５９０
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０１２３１６１３）モンサント テクノロジー エルエルシー (71)
【Ｆターム（参考）】
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