ｃＰＬＡ２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、その組成物及び使用
特に食細胞において、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成を阻害できる、ｃＰＬＡ２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、炎症状態、特に関節炎、及び神経変性疾患の治療にとって強力な薬剤である。アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物は、このような疾患の治療方法に使用できる。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、病状の治療におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用についての分野に関する。より詳しくは、本発明はホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の阻害及びこの分子の活性化を伴う状態の治療のための新規アンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する。
【発明の背景】
【０００２】
本明細書に引用される全ての参照文献をはじめ、本願を通じて記載される全ての刊行物は、参照により本明細書に完全に組込まれる。
【０００３】
炎症は損傷、感染又は免疫系によって異物と認識される分子に対する身体の応答である。炎症がないこと、過度の炎症又は制御されていない炎症は、喘息、関節炎及び自己免疫疾患、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、心血管炎症及び胃腸炎症等のありとあらゆる疾患をもたらす。多数の研究により、このような炎症性疾患には初回刺激を受けた好中球、単球及びマクロファージが関与していることが実証されている。より最近では、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患の病因並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷における、ミクログリア細胞によるスーパーオキシド放出の役割も実証された。
【０００４】
食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼによるスーパーオキシドの生成及びホスホリパーゼＡ２による炎症誘発性脂質性メディエーターの生成は、宿主防御の最も重要な機能である。しかしながら、変化した生理的状態の際には、スーパーオキシドと脂質性メディエーターは、炎症反応を促進し、組織損傷をもたらすプロセス及び種々の炎症性疾患の病態生理に関与する。今日では、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、炎症状態の治療のために最も広く処方される薬物の１種である。しかしながら、それらは望ましくない副作用を示し、最も一般的なものは消化管における潰瘍形成及び出血である。さらに、これらの薬物はプロスタグランジンの産生を低減させるだけであって、炎症部位への好中球の補充において極めて重要な役割を果たすロイコトリエンの産生には影響を及ぼさない。したがって、副作用がより少ない新規抗炎症薬の探索は続いている。コルチコステロイド、抗エンドトキシン抗体、ＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト及びその他の薬剤のような炎症カスケードを遮断する薬剤を用いて多数の試験が実施されてきたが、意義深い成功はない。
【０００５】
本発明者は細胞株、細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）の発現を欠くＰＬＢ−９８５細胞の安定なクローンである細胞系統を樹立し、ｃＰＬＡ２が、炎症誘発性脂質性メディエーターの生成におけるその知られている役割に加え、食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体の構築後の活性化に必須であることを実証した。これら２種の酵素の間の関連が、ｃＰＬＡ２によって放出されたアラキドン酸（ＡＡ）による、構築されたＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化の分子基盤を提供する［Ｄａｎａ，Ｒ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４４１〜５頁、Ｌｏｗｅｎｔｈａｌ，Ａ．及びＬｅｖｙ，Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１６０３〜１０頁、Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（２０００）Ｂｌｏｏｄ．９５：６６０〜５頁、Ｐｅｓｓａｃｈ，Ｉ．ら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３３４９５〜５０３頁、Ｓｈｍｅｌｚｅｒ，Ｚ．ら（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６２：６８３〜６９２頁、Ｔａｒｓｉ−Ｔｓｕｋ，Ｄ．及びＬｅｖｙ，Ｒ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１４４：２６６５〜２６７０頁、Ｄａｎａ，Ｒ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２９７：２１７〜２２３頁、Ｈａｚａｎ−Ｈａｌｅｖｙ，Ｉ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２４１６〜１２４２３頁］。ｃＰＬＡ２はオキシダーゼ活性化に必要であるので、その阻害は炎症性メディエーターの形成を減少させるはずであるだけではなく、炎症性疾患の病因に関与している酸素ラジカルの制御されていない加速された放出も調節するはずである。さらに、発明者の研究により、ｉｎ ｖｉｖｏにおける炎症の際又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける炎症状態の際、好中球及び単球において、ｃＰＬＡ２とＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素双方のレベル及び活性が上昇することがわかった［Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２２０：２６１〜２６５頁、Ｓｈａｋｅｄ，Ｇ．ら（１９９４）Ｊ．Ｔｒａｕｍａ ３７：２２〜２９頁、Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：６６０〜６６５頁、Ｌｅｖｙ，Ｒ．及びＭａｌｅｃｈ，Ｈ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３０６６〜３０７１頁、Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２２０：２５３〜２６０頁、Ｒｅｉｚｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．ら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７：３９８〜４０４頁］。驚くべきことに、最近の報告が、好中球へのｃＰＬＡ２阻害薬ピロリジンの添加は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害しないと記載したが［Ｒｕｂｉｎ，Ｂ．Ｂ．ら（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：７５１９〜２９頁］、この効果は、好中球における薬物の十分な蓄積を許さない、応用された方法論によるものであった可能性がある（データは示していない）。ｃＰＬＡ２を阻害することによって炎症状態を治療する方法は記載されているが、それらは、気道炎症の用量依存性減弱を引き起こすトリフルオロメチルケトン（ＴＦＭＫ）のような物質の使用［米国特許出願第２００２０１６５１１９号、ＵＳＳＮ０６２７３０］、又は種々の形のＰＬＡ２を阻害したインドール化合物の使用［ＵＳ６，７９７，７０８］と関連しており、今日まで、炎症の治療のためのｃＰＬＡ２に特有の阻害薬は記載されていない。現在、強力な細胞質ＰＬＡ２阻害薬は、ヒト又は動物における臨床用途には使用できない。今までのところ、ｃＰＬＡ２に対する全ての阻害薬は基質と競合するよう設計された。全ての種類のＰＬＡ２が脂肪酸をリン脂質のｓｎ−２位から切断するので、それらはまた同一の阻害薬によって阻害される（低効率である場合もあるが）。数種の化合物がｃＰＬＡ２の特異的な阻害薬として記載されたが、それらはその他のＰＬＡ２酵素も同様に阻害することがわかり、その逆もまた同様であった。各ＰＬＡ２サブタイプの特異的阻害薬がないので、アンチセンス技術が、ＰＬＡ２の特定のタイプを阻害する有効なアプローチを提供する。実際、本明細書に示される結果から、ｃＰＬＡ２を直接標的とする薬物は、ｃＰＬＡ２活性を特異的に阻害することが示唆される。さらに、炎症誘発性メディエーターとスーパーオキシドを産生するｃＰＬＡ２とＮＡＤＰＨオキシダーゼ双方の調節ももたらす。
【０００６】
ｃＰＬＡ２ｍＲＮＡ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃＰＬＡ２転写物発現を阻害できることが過去に報告されている［ＵＳ６，００８，３４４］。しかし、これらのオリゴヌクレオチドはｃＰＬＡ２タンパク質の発現を阻害することは実証しておらず、それらはリポフェクチンの存在下で細胞に導入された。
【０００７】
さらに、ｃＰＬＡ２を標的とする３種類のその他のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されており：ＰＩ（表１、配列番号８）［Ｒｏｓｈａｋ，Ａ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４２）：２５９９９〜２６００５頁、Ｍｕｔｈａｌｉｆ，Ｍ．Ｍ．ら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４７）：３０１４９〜３０１５７頁、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２）：７５９〜７６５頁、 Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４８）：３０５０４〜３０５１１頁］、Ｐ２（表１、配列番号９）［Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）：２４０４〜２４１１頁、Ｚｈａｏ，Ｘ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２８）：２５３８５〜２５３９２頁］及びＰ３（５’−ＧＴＧＣＴＧＧＴＡＡＧＧＡＴＣＴＡＴ−３’、配列番号１２）［Ｌｏｃａｔｉ，Ｍ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１１）：６０１０〜６０１６頁］、平滑筋細胞におけるｃＰＬＡ２及びヒト単球機能を阻害する効果を主に評価している。Ｐ１はリポフェクチンとともに用いられた。Ｐ１及びＰ２は全ての塩基にホスホロチオエート修飾があり、本発明者が細胞に対して毒性であると見出した５μＭで用いた場合にのみ有意な効果を有していた。Ｐ３は１０μＭで用いられた（又はさらに高い濃度、本発明者によって用いられたものよりも１０倍高い）。
【０００８】
したがって、炎症誘発性プロセスを阻害するために、ｃＰＬＡ２ｍＲＮＡに対する新規アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供すること、及びｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成の阻害におけるその使用が本発明の目的である。したがって、本発明において特許請求されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、抗炎症薬としても求められる。
【０００９】
本発明のその他の使用及び目的は、説明が進むにつれて明らかとなろう。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様では、本発明は細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその機能的類似体、その誘導体又はその断片であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補性が前記ＯＲＦのヌクレオチド１４５〜４００の間の領域の範囲内であり、ｃＰＬＡ２タンパク質の発現を阻害できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１１】
一実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは１５〜３０までのヌクレオチド長、好ましくは、１７〜２１ヌクレオチド長である。
【００１２】
ｃＰＬＡ２ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレームの５’領域に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のいずれか１つによって表される配列を有し、これらの配列は表１に詳述されている。
【００１３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、改良されたエンドヌクレアーゼ耐性を有するよう化学修飾できる。
【００１４】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのもう１つの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドにホスホロチオエート修飾が存在し得る。さらに、例えば、配列番号４及び５によって表されるオリゴヌクレオチドのように、別のホスホロチオエート修飾が、前記オリゴヌクレオチドの１０番目のヌクレオチドに見られる場合もある。
【００１５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのさらなる実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドに２−Ｏ−メチル化のようなさらなる修飾が見られる場合もある。
【００１６】
本研究において示される特性の結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｃＰＬＡ２発現と関連している炎症過程の阻害剤として使用できる。
【００１７】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、関節リウマチ、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患並びにアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷のうちのいずれか１種の治療及び／又は予防において、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患において用いるためのものである。
【００１８】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはスーパーオキシド生成及び放出を阻害するために使用できる。詳しくは、前記阻害は好中球、単球及びマクロファージにおいて、好ましくは、好中球において達成される。
【００１９】
場合によっては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、蛍光標識手段、放射性標識手段、金属粒子標識手段及び任意の適した標識手段のうち１種で標識してもよい。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、有効薬剤として、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその機能的類似体、誘導体若しくは断片を含む医薬組成物に関する。
【００２１】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、医薬組成物の形で提供される。前記組成物は、注射、局所投与又は経口摂取によって使用するためのものである。
【００２２】
あるいは、本発明の医薬組成物は、有効薬剤として、本発明に定義される少なくとも２種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的類似体、その誘導体若しくはその断片を組合せたものを含み得る。前記組合せは、以下のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい：配列番号１と配列番号３、又は配列番号１と配列番号２、又は配列番号１と配列番号６、又は配列番号１と配列番号２及び配列番号３、又は配列番号４と配列番号６、又は配列番号２と配列番号６、又は配列番号２と配列番号３、又は配列番号３と配列番号６。
【００２３】
本発明の薬剤組成は医学的使用を目的とする。
【００２４】
一実施形態では、本発明の医薬組成物はｃＰＬＡ２発現及び／又は食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼによるフリーラジカル放出と関連している炎症過程の治療を目的とする。
【００２５】
もう１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、神経変性疾患ＡＤ、ＰＤ、ＡＬＳ並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷等のＣＮＳ関連疾患のうちのいずれか１種であり得る炎症状態の治療、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における治療を目的とする。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物はＡβプラーク蓄積と関連している状態の治療を目的とする。前記状態は通常、ＣＮＳ関連疾患、特に、神経変性疾患アルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳ、又は脳虚血性損傷及び外傷性頭部損傷である。
【００２７】
本発明の医薬組成物には、バッファー、添加剤、安定剤、希釈剤及び／又は賦形剤を場合によってさらに含めてもよい。
【００２８】
もう１つの態様では、本発明は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ、ＡＬＳ等の神経変性疾患、並びに脳虚血及び外傷性損傷のうちのいずれか１種である炎症状態の治療及び／又は予防、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における治療及び／又は予防、に用いる医薬組成物の調製のための、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療のための、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００３０】
さらに、本発明は、Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療及び／又は予防のための、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を示す。通常、前記状態としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、脳虚血損傷及び外傷性頭部損傷からなる群から選択されるＣＮＳ関連疾患がある。
【００３１】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の少なくとも１種の治療上有効量を必要とする被験体に投与することを含む、ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療方法を示す。
【００３２】
したがって、さらにもう１つの態様では、本発明は、前記炎症状態が関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ及びＡＬＳ等の神経変性疾患並びに脳虚血及び外傷性損傷のうちのいずれか１種であり得る炎症状態の治療方法、すなわち、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の少なくとも１種の治療上有効量を必要とする被験体に投与することを含む、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患及び反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における炎症状態の治療方法を提供する。
【００３３】
もう１つの態様では、本発明は、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の少なくとも１種の治療上有効量を必要とする被験体に投与することを含む、Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療方法を提供する。前記状態は通常、神経変性疾患、特に、アルツハイマー病及びパーキンソン病である。
【００３４】
最後に、本発明は、細胞、好ましくは、食細胞、すなわち、好中球、単球、マクロファージ及び／又はミクログリアを、本発明に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物と適した時間接触させることを含む、ｃＰＬＡ２発現及び／又は活性を阻害するｉｎ ｖｉｖｏ法、ｅｘ ｖｉｖｏ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏ法を提供する。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、線維芽細胞、神経細胞及び内皮細胞においてｃＰＬＡ２活性を阻害したが、食細胞と比較して低効率であり、これはおそらくはアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する前者の細胞の透過性が低いことによるものである（データは示していない）。
【発明の詳細な説明】
【００３５】
本研究では、発明者らは細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）ｍＲＮＡに対する６種の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。以下の実施例において示されるように、各アンチセンスはそれ自体、ｃＰＬＡ２の発現阻害において極めて強力であるが、オリゴヌクレオチドの種々を組合せたものは、ヒト、マウス及びラット由来の種々の食細胞並びにミクログリア細胞においてｃＰＬＡ２発現を全体的に阻害した。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｃＰＬＡ２発現阻害とＮＡＤＰＨオキシダーゼによるスーパーオキシド生成阻害の間には著しい相関があり、このことはこれまでは実証されていなかった。
【００３６】
したがって、本発明はｃＰＬＡ２ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（図１に示される）、及びその機能的類似体、その誘導体又はその断片であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補性が前記ＯＲＦのヌクレオチド１４５〜４００の間の領域内であり、ｃＰＬＡ２タンパク質の発現を阻害できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３７】
以下の実施例に示されるように、本発明によって提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害することによってスーパーオキシド生成も阻害できる。
【００３８】
本明細書に記載したように、配列番号７はｃＰＬＡ２ｍＲＮＡ配列［ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ６８８７４］に相当するｃＤＮＡ配列に関する。
【００３９】
前記のｃＰＬＡ２ｍＲＮＡのヌクレオチド１４５〜４００の間の領域は標的化するのに特に有用であるが、これはプロセスがすでに始まってしまうとタンパク質合成を中止することよりも阻害することの方がはるかに効率的であるからである（前者はＵＳ６，００８，３４４において、そのｃＰＬＡ２アンチセンス配列のほとんどに対して用いられた戦略である）。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは翻訳部位の領域（ＯＲＦの開始）を標的とするよう設計した。
【００４０】
それにもかかわらず、アンチセンスによる標的化は依然として極めて経験に基づいたものであり、最も効率的な標的化のための特異的配列及び最適条件を見出すには多数の実験が必要であるということを記載することは重要である。本明細書に記載したように、例えば、本発明者らは最初、ＯＲＦの開始に相当するｃＰＬＡ２配列のヌクレオチド１４５〜４００の間の領域を標的とする１４種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計したが、そのうち６種しか効率的に働かなかったので、その後それらをより詳細に研究した。
【００４１】
ｃＰＬＡ２ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレームの５’領域に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のいずれか１つによって表される配列を有し、これらの配列は表１に詳述されている。
【００４２】
記載したように、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、改良されたエンドヌクレアーゼ耐性を有するよう化学修飾できる。それだけには限らないが、ホスホロチオエート化又は２−Ｏ−メチル化等のエンドヌクレアーゼに向けた耐性を付与する化学修飾はいずれも採用できる。
【００４３】
したがって、ホスホロチオエート修飾は本発明のオリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドに存在し得る。さらに、例えば、配列番号４及び５によって表されるオリゴヌクレオチドにおけるように、別のホスホロチオエート修飾が前記オリゴヌクレオチドの１０番目のヌクレオチド、内部ピリミジン、に見られる場合もある。内部ピリミジンのホスホロチオエート化は安定性を高め、エンドヌクレアーゼ切断から保護することがわかっている［Ｐｉｒｏｌｌｏ，Ｋ．Ｆ．ら（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ９９：５５〜７７頁］。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、部分ホスホロチオエート化されており、したがって、全てのヌクレオチドにホスホロチオエート修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも毒性が低い。
【００４４】
それにもかかわらず、前記オリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドに２−Ｏ−メチル化のようなさらなる修飾が見られる場合もある［ＥＰ２６０，０３２］。
【００４５】
実施例５〜７において示されるように、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはｃＰＬＡ２発現及び活性と関連している炎症過程の阻害薬として使用できる。
【００４６】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ、及びＡＬＳ等の神経変性疾患並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷のうちのいずれか１種の治療及び／又は予防において、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患において使用するのに適している。
【００４７】
ヒト単球における研究により、ｃＰＬＡ２発現の阻害はまた、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害することが実証されたが［Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）同書］、別の報告ではｃＰＬＡ２欠陥マウス由来の常在腹膜マクロファージは正常刺激下でスーパーオキシドを放出し得るということが示されている［Ｇｉｊｏｎ，Ｍ．Ａ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２０１４６］。対照的に、本発明者らはここで、マウスマクロファージにおけるｃＰＬＡ２発現の阻害において効率的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、マクロファージにおける、並びに単球、好中球及びミクログリア細胞におけるスーパーオキシド生成の阻害においても効率的であるということを実証した。この相違は、「ノックアウト」動物モデルは、例えば、過剰発現及びアイソザイムの代償によって正常な表現型を有することが多く、そのため研究において遺伝子（すなわち、タンパク質又は酵素）の欠損の効果を正確に映し出さないという事実によって説明できる。本結果は、１μＭ（終濃度）という低レベルのオリゴヌクレオチドを用いて得られたことが最も重要である。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、低い、非毒性の濃度で効果的であり、これによって臨床目的における使用、すなわち、本明細書において論じたようなｃＰＬＡ２の阻害が望ましい状態を治療するための治療薬としての使用に適したものとなるということが重要である。
【００４８】
さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＬＰＳによってミクログリア細胞が活性化され、例えば、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出している状態の治療及び／又は予防における使用に適している。前記状態は、炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される。
【００４９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、スーパーオキシド生成及び放出を阻害するのに使用できる。通常、前記阻害は好中球、単球及びマクロファージにおいて、好ましくは、好中球において達成される。
【００５０】
活性化された好中球が、炎症部位に到達する第１の細胞であり、次いで、これが高レベルのエイコサノイド及びスーパーオキシドを放出し、これらが炎症過程を加速する。このため、好中球は種々の炎症性疾患の病因の直接的なエフェクターであり、その機能を直接的に阻害することは、炎症過程を低減させるための効率的な方法である。単球（及びマクロファージ）は、炎症部位に到達する第２の細胞集団であり、したがって、その阻害も炎症を止めるために重要である。
【００５１】
さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アミロイドβ（Ａβ）プラーク形成によって、又はＬＰＳ若しくはサイトカイン等のその他の作用物質によって誘発されるミクログリアによって放出されるエイコサノイド及びＲＯＳ生成を阻害するために使用できる。ＲＯＳ形成は、種々の神経疾患の病因に寄与している神経細胞の機能不全又は死滅の原因であることがわかっている。
【００５２】
「類似体及び誘導体」とは、前記核酸分子の「断片」、「変異体」、「類似体」又は「誘導体」を意味する。本発明のいずれかのオリゴヌクレオチド配列等といった分子の「断片」とは、分子のいずれかのヌクレオチドサブセットを指すことを意味する。このような分子の「変異体」とは、全分子又はその断片のいずれかと実質的に類似した天然分子を指すことを意味する。分子の「類似体」とは、それだけには限らないが、パラロガス分子又はオルソロガス分子、例えば、それぞれ、同１種に由来する相同分子又は異なる種に由来する相同分子、すなわち、種々の種における遺伝子の対応する領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、その領域については、配列中にわずかな変化を有していてもよい。
【００５３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのさらなる誘導体としては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを生物中で追跡及び／又は検出できるように標識されているものやリポーター分子と結合されているものがある。例えば、ビオチン、フルオレセイン、ローダミン、４−（４’−ジメチルアミノ−フェニラゾ）安息香酸（「ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）」）、４−（４’−ジメチルアミノ−フェニラゾ）スルホン酸（塩化スルホニル）（「ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）」、５−（（２−アミノエチル）−アミノ）−ナフタレン−１−スルホン酸（「エダンス（ＥＤＡＮＳ）」）、プソラレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）誘導体、ハプテン、シアニン、アクリジン、蛍光ロドール（ｒｈｏｄｏｌ）誘導体、コレステロール誘導体、放射性標識、及び金属粒子（例えば、金）のような、その検出を可能にする標識又はリポーター分子はいずれも適したものであり得る。
【００５４】
第２の態様では、本発明は、有効薬剤として、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその機能的類似体、その誘導体若しくはその断片を含む医薬組成物に関する。
【００５５】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、医薬組成物の形で提供される。前記組成物は、注射、局所投与又は経口摂取によって使用するためのものである。
【００５６】
あるいは、本発明の医薬組成物は、有効薬剤として、本発明に定義される少なくとも２種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的類似体、その誘導体若しくはその断片を組合せたものを含み得る。前記組合せは以下のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい：配列番号１と配列番号３、又は配列番号１と配列番号２、又は配列番号１と配列番号６、又は配列番号１と配列番号２及び配列番号３、又は配列番号４と配列番号６、又は配列番号２と配列番号６、又は配列番号２と配列番号３、又は配列番号３と配列番号６。
【００５７】
本明細書における以下に記載する実施例で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、同一反応において２種又は３種一緒に併用した場合に、ｃＰＬＡ２の阻害とスーパーオキシド生成の阻害の双方がどのようにより効率的であったのかを明らかにする。
【００５８】
一実施形態では、本発明の医薬組成物はｃＰＬＡ２発現及び／又は食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼによるフリーラジカル放出と関連している炎症過程の治療を目的とする。
【００５９】
もう１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ、及びＡＬＳ等の神経変性疾患並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷のうちのいずれか１種であり得る炎症状態の治療、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における治療を目的とする。
【００６０】
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療を目的とする。前記状態は通常、神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳ、又は脳虚血性損傷及び外傷性損傷である。
【００６１】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、ＬＰＳに対する曝露によって、ミクログリア細胞が活性化され、ＲＯＳ及び／又は炎症誘発性メディエーター（エイコサノイド）を放出している状態の治療及び／又は予防において使用されることを目的とする。前記状態は、炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される。
【００６２】
注射による、本発明の医薬組成物の好ましい使用は、皮下注射、腹膜内注射、静脈内注射及び筋肉注射である。
【００６３】
本発明の医薬組成物は通常、希釈液及び／又は緩衝剤、すなわち、その浸透圧を調整する作用物質、並びに、場合によっては１種又は複数の担体、安定剤、賦形剤及び／又は例えば、フレーバー、色、滑沢性を医薬組成物に付与することを目的とする当技術分野で公知の添加剤等をさらに含む。
【００６４】
好ましい緩衝剤としては、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５〜８．０からなり、浸透圧についても調整されているＴｒｉｓがある。
【００６５】
ｉｎ ｖｉｖｏ使用には、アンチセンスオリゴヌクレオチドを滅菌蒸留水又は滅菌生理食塩水に懸濁する。
【００６６】
担体としては、デンプン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、例えば、微晶質セルロース、キサンタンガム等が挙げられる。滑沢剤としては、硬化ヒマシ油等が挙げられる。
【００６７】
医薬組成物の調製は当技術分野では周知であり、多数の論文及び教本に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、特にその中の１５２１〜１７１２頁参照。
【００６８】
局所投与用の医薬組成物としては、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、座剤、スプレー剤、液体剤及び散剤が挙げられる。従来の薬剤担体、水性基剤、粉末基剤又は油性基剤、増粘剤等が必要である場合も、望ましいものである場合もある。
【００６９】
経口投与用組成物としては、散剤又は顆粒剤、水性媒質若しくは非水性媒質中の懸濁液又は溶液、カプセル剤、サシェ又は錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいものである場合もある。
【００７０】
非経口投与用、くも膜下腔内投与用又は脳室内投与用組成物及び製剤としては、同様に、バッファー、希釈剤並びに、それだけには限らないが、浸透促進剤、担体化合物及びその他の製薬上許容される担体又は賦形剤等のその他の適した添加剤を含み得る滅菌水溶液が挙げられる。
【００７１】
本発明の医薬組成物としては、それだけには限らないが、溶液、エマルション及びリポソーム含有製剤が挙げられる。これらの組成物は、それだけには限らないが、予め作られた液体、自己乳化型固体及び自己乳化型半固体を含む種々の成分から作製できる。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、単位投与形で提示できることが好都合であるが、これは製薬業界において周知の従来技術にしたがって調製できる。このような技術は、有効成分と薬剤担体又は賦形剤を結び付けるステップを含む。一般に、製剤は有効成分と液体担体若しくは微粉化個体担体又はその双方とを均一及び密接に結び付け、次いで、必要に応じて製剤を成形することによって調製する。このような組成物は、それだけには限らないが、錠剤、カプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、座剤及び浣腸等の多数のあり得る投与形のいずれかに製剤できる。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒質中の懸濁液として製剤してもよい。水性懸濁液には、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランをはじめとする懸濁液の粘度を高める物質をさらに含める場合もある。この懸濁液にはまた、安定剤を含めてもよい。
【００７３】
本発明の一実施形態では、医薬組成物を泡沫として製剤し使用できる。薬剤泡沫としては、それだけには限らないが、エマルション、マイクロエマルション、クリーム剤、ゼリー剤及びリポソーム等の製剤が挙げられる。これらの製剤の性質は基本的には類似しているが、最終製剤の成分及び稠度が異なる。
【００７４】
本発明の医薬組成物にはその他の有効薬剤、例えば、抗生物質、鎮痛薬等をさらに含めてもよい。
【００７５】
もう１つの態様では、本発明は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ及びＡＬＳ等の神経変性疾患並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷のうちのいずれか１種であり得る炎症状態の治療及び／又は予防、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における治療及び／又は予防に用いる医薬組成物の調製のための、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００７６】
さらに、本発明は、ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療のため並びにＡβプラーク蓄積と関連している状態の治療及び／又は予防のための、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。通常、前記状態としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳからなる群から選択される神経変性疾患、並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷がある。
【００７７】
したがって、本発明は、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療方法を示す。
【００７８】
前記治療上有効量又は投薬は、治療されようとする病状の重篤度及び応答性に応じて変わり、治療過程は、治癒が達成されるまで又は病状の減少が達成されるまで数日から数ヵ月続く。最適投薬スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定から算出できる。当業者ならば最適投与量、投薬法及び繰り返し率を容易に決定できる。最適投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対力に応じて変わり得、通常、ＥＣ５０に基づいて推定でき、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であるとわかる。通常、投与量は体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０ｍｇであり、１日、１週間、１カ月又は１年に１回若しくは複数回、又はさらに２〜２０年毎に１回与える場合がある。当業者ならば、測定された体液又は組織中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの滞留時間及び濃度に基づいて投薬の繰り返し率を容易に推定できる。
【００７９】
治療がうまくいった後、患者が、病状の再発を防ぐために維持療法を受けることが望ましい場合があり、この場合にはオリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇあたり０．０１ｇ〜１０ｍｇの範囲の維持量で１日に１回又は複数回投与される。
【００８０】
以下の実施例５〜７において実証されるように、炎症状態の治療に用いられる最適投与量は、５日から１４日までの間、毎日、１〜２ｍｇ／ｋｇ／日が与えられるか（実施例５）、又は炎症後１〜２ｍｇ／ｋｇ／日を１若しくは２用量で与えられる（実施例６及び７）。
【００８１】
ｃＰＬＡ２発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、炎症部位で上昇したｃＰＬＡ２を特異的に阻害し、正常なｃＰＬＡ２発現には影響を及ぼさないので、局所炎症性疾患の画期的な治療である。この治療は、このような疾患の病因に関与している活性化されたか又は初回刺激を受けた食細胞の活性にも影響を及ぼす場合に、さらにより有効である可能性があるが、これはこれらの細胞が高レベルのエイコサノイド及びスーパーオキシドを分泌し、これらが炎症過程を加速するからである。
【００８２】
したがって、本発明はまた、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ、ＡＬＳ等の神経変性疾患並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷のうちのいずれか１種である炎症状態の治療、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における治療方法を提供する。
【００８３】
さらに、ミクログリア細胞におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼによるスーパーオキシド生成の調節におけるｃＰＬＡ２の関与は、ｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳからなる群から選択される神経変性疾患、並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷の治療に使用できることを示唆する。
【００８４】
同様に、本発明はまた、例えば、ＬＰＳに曝露され、ミクログリア細胞が活性化され、ＲＯＳ及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出している状態の治療及び／又は予防のための方法であって、前記状態が炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される方法を提供する。前記方法は、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む。
【００８５】
最後の態様として、本発明は、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、神経変性疾患、並びに脳損傷（例えば、卒中又は外傷によって引き起こされた）の治療方法を提供する。前記状態は通常、反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出のある神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病及びパーキンソン病、又は脳虚血性損傷及び外傷性損傷である。
【００８６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを必要とする被験体に送達するには種々の投与法を使用できる。オリゴヌクレオチドは、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）腹膜内（ｉ．ｐ．）注射、経口的に（液体形で、又はカプセル剤、丸剤、トローチ剤等の投与単位形として製剤されて）によって送達できる。治療上有効であるためには、オリゴヌクレオチドは注射後、又はさらにより好ましくは、経口投与後のシステムでその安定性を可能にする方法で製剤しなくてはならない。
【００８７】
あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドはパッチ剤、軟膏剤又はクリーム剤を用い経皮送達によっても送達できる。
【００８８】
さらに、本発明に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効薬剤として含む医薬組成物は、局所又は全身治療が望まれるかどうかに応じ、さらに、治療されようとする面積に応じて、いくつかの方法で投与できる。投与は局所へ（眼へ並びに膣送達及び直腸送達をはじめとする粘膜へ、例えば、散剤又はエアロゾルの吸入又は吹送によって肺へ、例えば、噴霧器によって等、気管内へ、鼻腔内へ、上皮へ及び経皮的）、経口的又は非経口的であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹膜内若しくは筋肉内注射若しくは注入、又は頭蓋内、例えば、くも膜下腔内若しくは脳室内投与が挙げられる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【００８９】
以下の実施例において示されるように、マウス及びラット（関節炎、ＡＲＤＳ及び腹膜炎）における３種の異なる炎症モデルを用いた予備試験が、抗炎症治療としての特異的なｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を実証する。
【００９０】
本発明は特許請求の範囲によって規定され、その内容は本明細書の開示内容内に含まれるものと読み取られるべきである。
【００９１】
本発明は、開示され、説明されているが、プロセスステップ及び材料は幾らか変わり得るものとして、本明細書に開示された特定の実施例、プロセスステップ及び材料に本発明が制限されないということは理解されなくてはならない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ制限されるので、本明細書に用いた技術用語は、単に個々の実施形態を説明する目的で用いられているものであって、制限しようとするものではないということも理解されなくてはならない。
【００９２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いたように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、特に断りのない限り、複数形の指示対象を含むということは留意しなくてはならない。
【００９３】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、特に断りのない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形物は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含み、その他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外しないことを意味すると理解される。
【００９４】
以下の実施例は、本発明の態様を実施するために発明者らによって用いられた技術の代表的なものである。これらの技術は、本発明を実施するのに好ましい実施形態を例示するものであり、当業者ならば、本開示内容を踏まえ、本発明の対象とする範囲から逸脱することなく多数の改変を行うことができると認識するであろうことは理解されなくてはならない。
【実施例】
【００９５】
試験手順
分子生物学の一般法
分子生物学分野のいくつかの方法は、当業者には周知であるので本明細書では詳述しない。このような方法には、ＰＣＲ、ｃＤＮＡの発現、哺乳類細胞のトランスフェクション等が含まれる。このような方法を記載する教本としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ：０８７９６９３０９６、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．がある。さらに、例えば、ウェスタンブロットのようないくつかの免疫学的技術も、当業者には周知であるので、本明細書に記載されるどの場合においても詳述していない。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい。
【００９６】
オリゴヌクレオチド
【表１】
【００９７】
実施例１
抗ｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
ｃＰＬＡ２に対する、１４種の異なる部分ホスホロチオエート化［Ｓｔｅｉｎら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９〜３２２１頁］オリゴヌクレオチドをまず合成した。使用前に、オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣによって精製し、質量分析（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）によって純度について調べた。選抜前に、Ｂｌａｓｔプログラムを用いて特有性についてスクリーニングすることによって配列を分析し、また、Ｍｕｌｆｏｌｄを用いて、二次構造及びオリゴ対形成の欠損についても調べた［Ｊａｅｇｅｒ，Ｊ．Ａ．（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６頁］。
【００９８】
予備実験（示していない）によって、それら１４種から６種のオリゴヌクレオチドのみがｃＰＬＡ２発現の阻害において有効であるとわかり、その配列が上記表１に詳細に示されている。
【００９９】
６種のアンチセンスオリゴヌクレオチドしか有意な活性を示さなかったという事実は、これらが標的配列に対して高い特異性を有するということを示唆した。残りの８種のオリゴヌクレオチドは実験で対照として用いた。
【０１００】
これらのオリゴヌクレオチドは、５’及び３’末端双方の最後の３塩基にホスホロチオエート修飾を保持しており（表１で下線によって示されている）、ｃＰＬＡ２ｍＲＮＡの最初の４００００塩基対（Ｎ末端）についてＲＮＡＤｒａｗ Ｖ１．１［Ｍａｚｕｒａ Ｍｕｌｔｉｍｅｄｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ］を用いコンピュータを利用したアプローチを用いて設計した（表１）。
【０１０１】
部分ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド（ＰＰＳ）は、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドよりも毒性が低く、より特異的であるが、その安定性及び細胞取り込みにおいては同様である。いくつかのＰＰＳは、ＧＧＧＧ（Ｃ１０）及びＧＧＧ（Ｃ８及びＣ９）を含み、細胞取り込みを高めることがわかっている、（表１参照）。ＰＰＳＣ８、Ｃ９はまた、安定性を高め、エンドヌクレアーゼ切断から保護することがわかっている内部ピリミジン（ｔ）でのホスホロチオエート化を含む（表１、下線部）。アンチセンスオリゴヌクレオチドのうち５種は、免疫応答を刺激することがわかっているＣｐＧを含んでいなかった。裸のＰＰＳは、公開されたｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究とは対照的に、この形でｉｎ ｖｉｖｏ治療に使用できるため［Ｐｉｒｏｌｌｏ，Ｋ．Ｆ．ら（２００３）同書］、本明細書に示した実験の全てで加えられたが、これにはアンチセンス取り込みを高めるために異なる送達システムを用いた。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた全ての臨床試験は、裸のオリゴヌクレオチドを用いて実施されている。例えば、組織培養において実施された実験［Ｊａｎｓｅｎ，Ｂ．ら（２０００）Ｌａｎｃｅｔ ３５６：１７２８〜１７３３頁］とは対照的に、ｉｎ ｖｉｖｏ臨床試験は、癌患者におけるＢｃｌ−２に対するオリゴヌクレオチド送達のために陽イオン性脂質を必要としなかった。これは、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイでは通例であるが、今日まで、何故ベクターが必要でないようであるのかについてはよくわかっていない。１つの仮説としては、オリゴヌクレオチドが循環タンパク質と相互作用し、このことがまだ理解されていない方法で、オリゴヌクレオチドを分解から保護し、担体としても働くというものである［Ｄｉａｓ，Ｎ．及びＳｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃ．５４：２６３〜２６９頁］。
【０１０２】
図３〜７において示されるように、ＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドによるｃＰＬＡ２発現の阻害とスーパーオキシドの刺激された生成の間には明確な相関がある。各ＰＰＳオリゴヌクレオチドは、種々の食細胞種において、ｃＰＬＡ２タンパク質発現の有意な阻害を引き起こし、それらを組合せたものは大幅に改良された阻害を引き起こした。
【０１０３】
図３及び４に示されるように、本発明のＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドはこれまでに報告されたものよりもはるかに効率的である［ＵＳ６，００８，３３４、Ｒｏｓｈａｋ ら（１９９４）同書、Ｍｕｔｈａｌｉｆら（１９９６）同書、Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９９７）同書、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）同書、Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）同書、Ｚｈａｏ，Ｘ．ら（２００２）同書］。さらに、先の報告では、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのｍＲＮＡ合成を阻害する能力についてしか調べられていなかった［ＵＳ６，００８，３３４］。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドの両末端における修飾の数（及び種類）の効果も評価した（データは示していない）。観察された、ｃＰＬＡ２発現及びＮＡＤＰＨオキシダーゼを阻害する効率についての順位は以下の通りであった：
３修飾を有するＰＰＳ＞２修飾を有するＰＰＳ＞１修飾を有するＰＰＳ＞修飾のないもの。
【０１０５】
ＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドは、内皮細胞又は上皮細胞よりも単球について示されるように、食細胞におけるｃＰＬＡ２タンパク質発現の阻害においてより効率的であった（データは示していない）。この現象は、器官に影響を及ぼさず、炎症部位の食細胞に直接的に影響を及ぼす炎症の治療に関して特に有利である。
【０１０６】
実施例２
末梢血ヒト単球におけるｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドのｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対する効果
ｃＰＬＡ２タンパク質の発現を、発明者らによって作製され、商業マーケットで入手できるものよりもはるかに効率的であるｃＰＬＡ２に対する抗体を用いウェスタンブロット解析によって解析した（図２）。
【０１０７】
ｃＰＬＡ２発現に対する種々のＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれらを組合せたものの効果及びスーパーオキシド生成に対する効果を、末梢血ヒト単球（図３及び４）及びマウスマクロファージにおいて（図５）調べた。１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ中の細胞懸濁液に、裸の（リポフェクチン等のようなトランスフェクション溶液を含まない）ＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度は１μＭ）を、３７℃で１６時間添加した。５ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで刺激された同じ細胞のスーパーオキシド生成（シトクロムｃ還元によって）及び細胞溶解物におけるｃＰＬＡ２の発現について（ウェスタンブロット解析によって）解析した。示されるように、各ＰＰＳアンチセンスは５０〜７５％のスーパーオキシド生成阻害を引き起こし、これはそのｃＰＬＡ２発現阻害に対する効果と相関していた。ｃＰＬＡ２のレベルは、反射モードでの密度測定（ｄｅｎｓｉｍｅｔｒｙ）によって定量化した（Ｈｏｅｆｅｒ、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）。これら２つのパラメーターの間の相関は図６に実証されている。
【０１０８】
図３及び４に示されるように、それぞれＰ１［Ｒｏｓｈａｋら（１９９４）同書、Ｍｕｔｈａｌｉｆら（１９９６）同書、Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９９７）同書、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）同書］及びＰ２［Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）同書］、並びにＩＳ１及びＩＳ２［ＵＳ６，００８，３３４］は、ｃＰＬＡ２発現に対しても、スーパーオキシド生成に対しても全く効果がなかった。オリゴヌクレオチドＩＳ１及びＩＳ２はそれぞれ、ＵＳ６，００８，３３４では、１００％及び９２％のｍＲＮＡ発現阻害を引き起こすと報告されていたことは最も重要である。しかし、それらの効果はｍＲＮＡ発現阻害によって解析されただけでｃＰＬＡ２タンパク質発現阻害によっては解析されていなかった。
【０１０９】
Ｐ１、Ｐ２ ＩＳ１及びＩＳ２は、その最初の刊行物では、全ての塩基にホスホロチオエート修飾を伴って合成された。本発明者は、完全ホスホロチオエート化された場合、これらのオリゴヌクレオチドは細胞に対して毒性があり、１６時間のインキュベーションの後約６０〜７０％の細胞の死滅を引き起こすことを見出した（データは示していない）。これらの結果は、全ての塩基にホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチドははるかに毒性が高いことを示す先の報告［Ｐｉｒｏｌｌｏ，Ｋ．Ｆ．ら（２００３）同書］と一致している。したがって、この研究については、Ｐ１、Ｐ２、ＩＳ１及びＩＳ２の効果と、本発明者によって合成されたＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果をより正確に比較するために、最初のオリゴヌクレオチドとは異なる、最初と最後の３塩基にしかホスホロチオエート修飾を有さないＰ１、Ｐ２、ＩＳ１及びＩＳ２が合成されたことに留意することが重要である。
【０１１０】
図２及び３に示される結果から、発明者によって合成された（及び特許請求される）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、文献に記載されたオリゴヌクレオチドよりも優れていることが実証される。詳しくは、前者は以下であることを強調できる：
ａ．毒性が低い、
ｂ．ｃＰＬＡ２タンパク質発現阻害においてはるかに強力である。
【０１１１】
Ｐ１、Ｐ２、ＩＳ１及びＩＳ２と比べ、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは特に好ましいが、これはそれらがリポフェクチンのような細胞送達システムなしに細胞に導入され得、その活性を発揮できるためである。
【０１１２】
実施例３
末梢血ヒト好中球における、ｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドのｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対する効果
ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対する種々のＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれらを組合せたものの効果を、末梢血ヒト好中球において調べた。２×１０５個の好中球に、裸のアンチセンスオリゴヌクレオチドを３７℃で６時間添加した（１μＭ終濃度で）。好中球（９５％純度）をＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離し、デキストラン沈降及び赤血球の低張溶解によって単離した［Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：６６０〜６６５頁］。図７に示されるように、好中球とともに６時間インキュベートした後に、スーパーオキシド生成の、わずかではあるが有意な（Ｐ＜０．０５）阻害があった。別の実験では、１６時間のインキュベーション後に同様の効果が示された（データは示していない）
【０１１３】
種々のオリゴヌクレオチドアンチセンスによるスーパーオキシド生成の阻害は、細胞膜上の受容体と特異的に結合するｆＭＬＰ、オプソニン化ザイモサン（ＯＺ）（図８）、ＬＴＢ４、アンジオテンシンＩＩ又はＡＧＥ（最終糖化反応物）等の生理的アゴニストによって細胞が刺激された場合、大幅に改良された（データは示していない）
【０１１４】
ＰＰＳの効果は、好中球を炎症性疾患（関節リウマチ、喘息又は敗血症等、データは示していない）の患者から精製した場合に、好中球を健常な対照から得た場合よりも大幅に高かった。この現象は、好中球におけるｃＰＬＡ２レベルは病気の間は高く、このことは合成速度の増大を示し、それ故より標的化しやすいということを報告した発明者らの初期の研究と一致する［Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（２０００）同書］。
【０１１５】
図３〜６に表される実験は、非生理的刺激物ＰＭＡ、受容体をバイパスしてＰＫＣに対して作用するＮＡＤＰＨオキシダーゼの極めて強力なアクチベーター、を用いて実施したことに留意することが重要である。これらの条件下では、種々の受容体の発現及びその刺激物との結合の効果が排除されるため、これにより、ＮＡＤＰＨオキシダーゼに対するアンチセンスの直接的な役割を解析することが可能となったからである。
【０１１６】
実施例４
ラットミクログリアにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドのｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対する効果
アンチセンス及びそれらを組合せたものの効果を、ラット脳から単離したミクログリアで調べた。ＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチド（１μＭ終濃度で）を、ミクログリア細胞に１６時間加えた（単球に用いた条件と同様）。ｃＰＬＡ２タンパク質発現の有意な阻害があった。細胞を２ｍｇ／ｍｌ ＰＭＡ又は１０μＭのアミロイドβで刺激し、スーパーオキシド生成を蛍光プローブＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄによって分析した。図９に示されるように、アンチセンスはスーパーオキシド生成の有意な阻害を引き起こし、ｃＰＬＡ２タンパク質発現と相関していた。興味深いことに、アンチセンスＣ８は、ラット配列とは１塩基マッチしなかったが、これはスーパーオキシド生成の阻害を引き起こさず、このことはアンチセンスの高い特異性を示す。阻害は、細胞がアミロイドβで刺激された場合にかなり高かった。ミクログリアをアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに４８時間インキュベートすることによって、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成のより高い阻害が引き起こされた（データは示していない）。アミロイドβはアルツハイマー病等の脳及び神経変性疾患の病因において重要な役割を果たすので、この結果は特に重要である。
【０１１７】
全ての細胞種を×１５０アンチセンス濃縮物とともにインキュベートしても、細胞に対して毒性ではなく、ｃＰＬＡ２によって調節されない細胞機能にも影響を及ぼさなかった（データは示していない）。
【０１１８】
実施例５
炎症の動物モデル：コラーゲン関節炎
コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）は、関節リウマチ（ＲＡ）と多数の臨床上及び病理学的類似性を有する自己免疫関節炎の実験モデルである。ＣＩＡは、記載されたように、感受性動物（例えば、ＤＢＡブラックマウス）をＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）で免疫化することによって誘発される［Ｂｅｎｄｅｌｅ，Ａ．Ｍ．ら（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、４３：２６４８〜５８頁］。全てのマウスは特定の病原体を含まない環境で維持し、標準マウス食と水を与えた。ニワトリＣＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、２ｍｇ／ｍｌ）を１０ｍＭ酢酸に４℃で一晩溶解し、等容量のＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）と合わせた。ＣＦＡは１００ｍｇの加熱殺菌した結核菌（Ｈ３７Ｒａ、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）を２０ｍｌの不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）と混合することによって調製した。マウス（７〜１０週齢）の尾の基部に皮内注射し、７日目又は２１日目に追加免疫した。対照マウスはＣＩＩを含まないＣＦＡで処理した。関節炎の重篤度は、以下のスケールに従ってデジタルノギスを用いて直接検査することによってモニターした：等級０、腫脹なし；１、わずかな腫脹及び紅斑；２、明白な炎症及び３、関節硬直。各肢を等級付けし、動物あたり最大１２のスコアを与えた。動物の足から体液を吸引し、サイトカイン（ｍＲＮＡ及びタンパク質レベル）及び白血球を調べた。屠殺した後、足を採取し、固定し、脱灰し、パラフィン包埋した。切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、以下のスケールにしたがってスコアを付けた：０、炎症なし；１、滑膜細胞層のわずかな肥厚及び／又は表層下のいくらかの炎症細胞：２、滑膜表層の肥厚、表層下の浸潤及び局在する軟骨びらん及び３、滑膜腔の浸潤、パンヌス形成、軟骨破壊及び骨びらん。
【０１１９】
抗ＣＩＩ抗体の検出：ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３又はＩｇＭ及びＩｇＡに対して特異的なＨＲＰ結合二次抗体によって、ＣＩＩに対する抗体のためのＥＬＩＳＡを実施した。
【０１２０】
細胞単離：ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８に対して特異的なビオチン結合抗体とビオチン結合剤ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）を用いて、滑膜細胞の脾細胞サブセットの陽性選抜を実施した。ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ３＋滑膜細胞を陽性選択した後、滑膜細胞をビオチンＣＤ４５とともにインキュベートし、過剰のアビジン磁性ビーズを用いて負の選抜を行った。残存するＣＤ４５陰性細胞は、ＲＮＡ抽出に用いた。滑液白血球は、滑膜浸出液から得、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって精製した。
【０１２１】
ＣＩＡのモデルは、例えば、対照マウスの肢と比較して、腫大し、増悪したＣＩＡマウスの肢によって実証されたように、発明者らによってうまく開発された（図１０Ａ）。ＣＩＡマウスの肢の組織学的評価（図１０Ｂ）は、関節炎の重篤度と相関しており、図１０Ａに示されるように肢を直接検査することによってモニターした。ＣＩＡマウスの関節切片において炎症細胞（特に、好中球）の浸潤が示されている（図１０Ｃ）。ＣＩＡマウスは、重篤な歩行困難性を示した（データは示していない）。
【０１２２】
種々のＰＰＳ濃縮物及び組合せを用いて実施した予備実験に基づいて、３種の異なるＰＰＳ（２、４及び１０）を組合せたものについて２ｍｇ／ｋｇという最適濃度を規定し、これを本明細書においてカクテルと呼ぶことにした。この濃度はヒトの治療及び動物モデルにおいて用いられる範囲内である。
【０１２３】
炎症状態の治療には、アンチセンスの滅菌保存液（１００μＭ）を滅菌生理食塩水に所望の濃度で溶解し、病気のマウスにｉ．ｖ．、皮内のいずれかで、尾の基部又は炎症性関節に注射した。
【０１２４】
図１１に示されるように、１４日間毎日、２ｍｇ／ｋｇの「カクテル」の静脈内注射を行うことによって、肢の腫脹の減少（図１１Ａ）、疾患重得度スコア、マウスの運動能力及び自由に走り回る能力の完全回復（データは示していない）並びに血清ＩＬ−６及びＴＮＦαレベルの低減（図１１Ｂ）によっても検出されたように、関節炎の有意な寛解が引き起こされた。
【０１２５】
実施例６
炎症の動物モデル：腹膜炎
モデルマウス腹膜炎は、先に記載したようにＣＤ１マウスへのカンディア（Ｃａｎｄｉａ）の注射［Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ｒ Ａｇｅｎｔｓ ３：５〜１２頁］又は種々の用量のグラム陽性菌の注射によって開発されており、動物死を引き起こし、中程度の用量では中程度の疾患を引き起こすグラム陰性（大腸菌）、細菌（Ｓ．エピデルミチス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｔｉｓ））又は致死量のカンジダで腹膜炎を誘発する。５０％致死量は、Ｓ．エピデルミチスの６×１０８ＣＦＵ及び大腸菌の１．５×１０７ＣＦＵと決定された。感染及び／又は炎症のマーカーは、腹膜炎領域の血液細胞の数及び集団、血中炎症性サイトカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ１及びＩＬ６の濃度、並びに腹膜切片の組織学的解析である。致死量の細菌を注射したマウスを、細菌注射の２時間後にアンチセンスで治療し、その後種々の間隔でアンチセンスを注射する。これらの実験では、マウス生存に対するアンチセンスの効果を評価する。低用量の細菌を注射したマウスについては、アンチセンスの効果（記載したように注射した）を、感染及び／又は炎症マーカーによって病理学的に評価する。
【０１２６】
実施例７
炎症の動物モデル：無菌性腹膜炎
無菌性腹膜炎のモデルは、先に記載されたように、ＩＣＲマウスにおいて３ｍｌの滅菌４％チオグリコレート（ＴＧ）を腹膜内に注射することによって開発された［Ｓｅｇａｌ，Ｂ．Ｈ．ら（２００２）Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ７１：４１０］。炎症の評価は、腹膜炎腔における血液細胞の数及び集団、細胞を含まない腹水中及び血清中のＬＴＢ４の濃度並びに炎症性サイトカイン、ＴＮＦα及びＩＬ６の存在によって調べた。細胞を回収するために、１０ｍｌの滅菌ＰＢＳを腹腔に注射した。細胞数は、トリパンブルー染色した後に顕微鏡によって求めた。細胞集団の構成は、抗マウス好中球に対する抗体（ＭＣＡ７７１Ｆ）、抗マウスマクロファージに対する抗体（Ｆ４／８０）及び抗マウスリンパ球に対する抗体（ＣＤ３）を用い、ＦＡＣＳによって調べた。細胞集団の構成はまた、ギムザ染色した後、顕微鏡下でも調べた。図１２Ａ〜１２Ｂは、４日間の無菌性腹膜炎の間の白血球数（図１２Ａ）及び細胞集団（図１２Ｂ）の変化を示す。ＴＧ注射の２４時間後に高レベルの好中球が検出され、後に単球−マイクロファージに置き換わった。刺激された食細胞のスーパーオキシド生成の有意な上昇があり、最高速度は腹膜炎誘発の２４時間後であった。
【０１２７】
２４時間の無菌性腹膜炎の間の血清中の及び腹腔中のＬＴＢ４レベルは、図１３Ａ〜１３Ｂに示されている。腹膜炎誘発の１時間後、血中ＬＴＢ４レベルの有意な上昇があった。ＬＴＢ４レベルは５時間高く留まり、次いで、８時間後に半分にまで低下した。腹膜炎誘発の１６時間後、ＬＴＢ４は血中に検出できなかった。同様のパターンが腹腔においても観察されたが、減衰はより緩やかであり、２４時間後になってＬＴＢ４は検出されなくなった。
【０１２８】
本結果によれば、文献と一致して、腹膜炎モデルにおいて集積する最初の細胞は好中球であった。したがって、実験の第１のセットでは、無菌性腹膜炎誘発の２４時間後にアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を、主に好中球集積及び活性に対して解析した。滅菌水（０．２ｍｌ）に溶解した２用量のｃＰＬＡ２に対するＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の組合せ（「カクテル」）を、腹膜炎誘発の１時間後及び４時間後に、マウスの尾にｉ．ｖ．投与した。図１４Ａ〜１４Ｃ（２個体のマウスの結果）に実証されるように、この治療により、炎症誘発の２４時間後における、腹膜細胞による刺激されたスーパーオキシド生成のわずかな阻害と、腹腔に存在する好中球数の有意な減少（ＦＡＣＳ解析によって検出される細胞数及び細胞集団分布として表される）とが引き起こされた。３４個体の未処置マウスと比較した無菌性腹膜炎を伴う３４個体のマウスの腹膜に補充される好中球の減少及びスーパーオキシド生成に対するカクテルの効果は、図１５Ａ〜１５Ｂに示されている。刺激されていない細胞からのスーパーオキシド放出は極めて重要であるが、これは腹膜腔における腹膜細胞の挙動を反映するからである。したがって、休止細胞からのスーパーオキシドの放出を、感受性の強い方法であって、低レベルのスーパーオキシドを検出できる蛍光プローブジヒドロローダミン−１２３（１ｍＭ）を用いて評価した。図１６の代表的な結果に示されるように、腹膜炎誘発後の２４時間の間のカクテルによる治療は、腹膜細胞によるスーパーオキシドの放出を大幅に減少させた。
【０１２９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド治療の効果は、無菌性腹膜炎の４日間の間、腹膜細胞集団で調べた。補充された好中球数は劇的に減少し、補充されたマクロファージ数は、４日間の腹膜炎の間、治療されたマウスの腹膜において大幅に少なかった（図１７Ａ〜１７Ｂ）。４日間の腹膜炎の間、アンチセンス治療されたマウスの腹膜細胞による、刺激されたスーパーオキシド生成は、未処置のマウスにおけるものよりも大幅に低かった（図１８Ａ〜１８Ｂ）。
【０１３０】
アンチセンスカクテル治療は、腹膜炎誘発後の２４時間の間測定されたように（図１９Ａ〜１９Ｂ）、腹腔のＬＴＢ４レベルを低下させ、腹腔へ補充される好中球の減少と相関していた（図２０Ａ〜２０Ｂ）。
【０１３１】
ｉ．ｖ．注射の２４時間後の腹膜血液細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの集積を、蛍光標識したアンチセンスオリゴヌクレオチド（最後のヌクレオチドでＦＩＴＣで標識した）を用いて検出した（図２１Ａ〜２１Ｂ）。組織切片によって、種々の器官における蛍光アンチセンスオリゴヌクレオチドの分布も解析した（結果は示していない）。さらなる実験では、種々のアンチセンス過剰用量を、その毒性を調べるために投与した。カクテル×１００は、マウスに対して毒性はなかった（データは示していない）。
実施例８
【０１３２】
炎症の動物モデル：以下によって誘発される実験上の急性肺損傷：
１−ＬＰＳ／ザイモサン投与。
マウスに麻酔をかけ、人工呼吸させる。実験の間、酸素ガスを換気システムに連続供給する。静脈内（ｉ．ｖ．）投与の１分前に、２回の深い吸入（３×一回換気量）を行い容積の履歴を標準化させ、測定値をベースラインとする。次いで、マウスに３ｍｇ／ｋｇの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４由来ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をｉ．ｖ．で与える。２時間後、１０ｍｇ／ｋｇのサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｕｉｓｉａｅ）由来ザイモサンＡ（Ｓｉｇｍａ）をｉ．ｖ．投与する。生理食塩水処理群では、ＬＰＳとザイモサンとの代わりに生理食塩水を動物に同様に与え、対照として用いる。全ての群において、３０分間隔で４時間測定を行う。動物の中には、観察期間を６時間に延長したものもあった。肺損傷の発症を生理学的に評価するために、ＥＬ（肺コンプライアンスの逆数）を測定する。気管圧（Ｐｔｒ）、フロー及びボリューム（Ｖ）を測定する。ＥＬ及び肺抵抗（ＲＬ、データは示していない）は、運動方程式を調整することによって算出する：Ｐｔｒ＝ＥＬＶ＋ＲＬ（ｄＶ／ｄｔ）＋Ｋ（式中、Ｋは定数である）。ＥＬの変化は肺柔組織の変化及び肺の硬化を反映する。
【０１３３】
２−ＨＣｌ吸引
ベースライン測定後、麻酔し、人工呼吸したマウスに２ｍｌ／ｋｇのＨＣｌ（ｐＨ＝１．５）をｉ．ｔ．し、続いて空気塊（３０ｍｌ／ｋｇ）を与える。生理食塩水処理群では、動物に、ＨＣｌの代わりに生理食塩水を同様に与え、対照として用いる。全ての群において、測定は３０分間隔で２時間行う。動物の中には、観察期間が５時間までであるものもある。ＥＬ測定値は、急性肺損傷を評価するための生理学的パラメーターである。
肺水腫の評価−実験の最後に、肺湿潤／乾燥質量比を算出し、肺水腫を評価する。切除した肺から閉じ込められた血液を排出した後、肺湿潤質量の測定を行う。次いで、肺を重力対流オーブン中、９０℃で７２時間、一定質量まで加熱し、残渣を肺乾燥質量として計量する。
気管支肺胞洗浄液−実験の最後に、各群において気管支洗浄（ＢＡＬ）を実施する（５×１ｍｌリン酸緩衝生理食塩水を用いて）。各動物において、全注射容積の９０％（４．５ｍｌ）を一貫して回収する。ＢＡＬ液を４５０ｇで１０分間遠心分離した後、細胞画分からＢＡＬ液全体の細胞数及びＢＡＬ液の差次的細胞数を求める。上清はタンパク質含量の測定まで−７０℃で保存する。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いローリー法によって測定する。
トロンボキサン及びロイコトリエン測定は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）キットによって測定する。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡ配列（配列番号７）を示す図であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０の位置が強調表示されている。Ｃ２はヌクレオチド３４７〜３６６を包含し、Ｃ３はヌクレオチド１５５〜１７４を包含し、Ｃ４はヌクレオチド３７９〜３９９を包含し、Ｃ８はヌクレオチド３３０〜３４６を包含し、Ｃ９はヌクレオチド１８３〜２０２を包含し、Ｃ１０はヌクレオチド２９０〜３０６を包含する。
【図２Ａ】２種の抗ｃＰＬＡ２抗体（Ａｂ）間の比較を示す図である。レビー（Ｌｅｖｙ）のＡｂ［Ｈａｚａｎら（１９９７）同書］
【図２Ｂ】２種の抗ｃＰＬＡ２抗体（Ａｂ）間の比較を示す図である。市販の抗体。Ｄｉｌ．＝希釈。
【図３Ａ】ヒト末梢血単球におけるｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。対照並びにアンチセンスＰ１［Ｒｏｓｈａｋ，Ａら（１９９４）同書、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｌ．ら（１９９７）同書、Ｍｕｔｈａｌｉｆ，Ｍ．Ｍ．ら（１９９６）同書、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．ら（１９９７）同書］及びＰ２［Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）同書］と比較した場合における、アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ９及びＣ２＋Ｃ４（２＋４）の組合せで処理した後に抗ｃＰＬＡ２抗体によって検出されるｃＰＬＡ２発現阻害を示すウェスタンブロット解析。種々の処理におけるｃＰＬＡ２のレベルは、密度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）によって定量化し、ウェスタンブロット解析の下に示されている。Ｌｅｖ．＝レベル、ｄｅｎｓ．＝密度測定。
【図３Ｂ】ヒト末梢血単球におけるｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。対照並びにアンチセンスＰ１［Ｍｕｔｈａｌｉｆ，Ｍ．Ｍ．ら（１９９６）同書、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．ら（１９９７）同書］及びＰ２［Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）同書］と比較した場合における、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ９及びＣ２＋Ｃ４（２＋４）の組合せによるスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）の阻害を示すヒストグラム。これまでに記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドＰ１及びＰ２に対する、本発明のアンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド（２、３、４及び９と表される）の高い効率に留意することが重要である。
【図４Ａ】末梢血ヒト単球におけるｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。対照並びにオリゴヌクレオチドＩＳ１及びＩＳ２［ＵＳ６，００８，３４４］と比較した場合における、アンチセンス部分ホスホロチオエート化（ＰＰＳ）オリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０並びにＣ３＋Ｃ１０及びＣ８＋Ｃ１０の組合せで処理した後の、抗ｃＰＬＡ２抗体によって検出されるｃＰＬＡ２発現阻害を示すウェスタンブロット解析。種々の処理におけるｃＰＬＡ２のレベルは、密度測定によって定量化し、ウェスタンブロット解析の下に示されている。Ｌｅｖ．＝レベル；ｄｅｎｓ．＝密度測定。
【図４Ｂ】末梢血ヒト単球におけるｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。対照（ｃｏｎｔ．）並びにオリゴヌクレオチドＩＳ１及びＩＳ２［ＵＳ６，００８，３４４］と比較した場合における、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０並びに組合せＣ３＋Ｃ１０及びＣ８＋Ｃ１０によるスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）の阻害を示すヒストグラム。ＵＳ６，００８，３４４に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳ１及びＩＳ２）に対する、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（図中、２、８、９及び１０と表される）の高い効率に留意することが重要である。
【図５Ａ】腹膜マウスマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３及びＣ４並びに組合せＣ３＋Ｃ４で処理した後の、抗ｃＰＬＡ２抗体によって検出されるｃＰＬＡ２発現阻害を示すウェスタンブロット解析。
【図５Ｂ】腹膜マウスマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３及びＣ４並びに組合せＣ３＋Ｃ４によるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図５Ｃ】腹膜マウスマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ１０並びに組合せＣ２＋Ｃ１０、Ｃ３＋Ｃ１０、Ｃ４＋Ｃ１０及びＣ３＋Ｃ４によるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。略語：ｃｏｎｔ．は、対照；ＳＯ ｇｅｎは、スーパーオキシド生成。
【図６】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドで処理した後のｃＰＬＡ２発現（ｅｘｐ．）とスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）の阻害との間の相関を示す図である。Ｃｏｎｔ．＝対照。
【図７Ａ】末梢血ヒト好中球における、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２又はＣ４及び組合せＣ２＋Ｃ４で処理した後の、抗ｃＰＬＡ２抗体によって検出されるｃＰＬＡ２発現阻害を示すウェスタンブロット解析。種々の処理におけるｃＰＬＡ２のレベルは、密度測定によって定量化し、ウェスタンブロット解析の下に示されている。
【図７Ｂ】末梢血ヒト好中球における、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。ＰＭＡ処理後のｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ４又はＣ１０及び組合せＣ２＋Ｃ４、Ｃ２＋Ｃ１０、Ｃ４＋Ｃ１０、Ｃ２＋Ｃ４＋Ｃ１０によるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図７Ｃ】末梢血ヒト好中球における、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。ＯＺ処理後のｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ４又はＣ１０及び組合せＣ２＋Ｃ４、Ｃ２＋Ｃ１０、Ｃ４＋Ｃ１０、Ｃ２＋Ｃ４＋Ｃ１０によるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。略語：Ｌｅｖ．は、レベル；ｄｅｎｓ．は、密度測定；ｃｏｎｔ．は、対照；ＳＯ ｇｅｎ．は、スーパーオキシド生成。
【図８Ａ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに６時間インキュベートした後の、ＰＭＡ刺激された好中球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図８Ｂ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに４時間インキュベートした後の、ｆＭＬＰ刺激された好中球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図８Ｃ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに４時間インキュベートした後の、ＯＺ刺激された好中球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図８Ｄ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに１６時間インキュベートした後の、ＰＭＡ刺激された単球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図８Ｅ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに１６時間インキュベートした後の、ｆＭＬＰ刺激された単球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図８Ｆ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに１６時間インキュベートした後の、ＯＺ刺激された単球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラムである。略語：ＳＯ ｐｒｏｄ．は、スーパーオキシド生成；Ａｃｔ．は、活性。
【図９Ａ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドによる、ラットミクログリアにおける刺激されたスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２又はＣ４で処理した後の、抗ｃＰＬＡ２抗体によって検出されるｃＰＬＡ２発現の阻害を示すウェスタンブロット解析。
【図９Ｂ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドによる、ラットミクログリアにおける刺激されたスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ４、Ｃ８又はＣ１０、及び組合せＣ２＋Ｃ１０又はＣ４＋Ｃ１０で処理した後の、ＰＭＡによって活性化されたラットミクログリア細胞におけるスーパーオキシド生成の阻害の速度論を示すグラフ。
【図９Ｃ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドによる、ラットミクログリアにおける刺激されたスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ＰＭＡ刺激後のラットミクログリア細胞におけるスーパーオキシド生成に対する、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ８及びＣ１０、並びに組合せＣ２＋Ｃ１０及びＣ４＋Ｃ１０）の効果を示すヒストグラム。
【図９Ｄ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドによる、ラットミクログリアにおける刺激されたスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。アミロイドβ刺激後のラットミクログリア細胞におけるスーパーオキシド生成に対する、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ８及びＣ１０、並びに組合せＣ２＋Ｃ１０及びＣ２＋Ｃ４）の効果を示すヒストグラムである。略語：ｒｅｓｔ．は、休止；ａｃｔ．は、活性化；ａｓは、アンチセンス；ｋｉｎ．は、速度論；Ｔ．は、時間；ｍｉｎ．は、分。
【図１０Ａ】コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）の動物モデルを示す図である。対照（ｃｏｎｔ．）マウスと比較した、実験における増悪したＣＩＡの写真。
【図１０Ｂ】コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）の動物モデルを示す図である。対照（ｃｏｎｔ．）と比較した、ＣＩＡマウスの全足の関節組織病理学の代表的な切片の組織学的評価を示す写真（×１００）。
【図１０Ｃ】コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）の動物モデルを示す図である。ＣＩＡマウスにおける炎症細胞の浸潤を示す写真（×４００）。
【図１１Ａ】３種のｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドを組合せたもの（「カクテル」）による治療が引き起こした関節炎の寛解を示す図である。ＣＩＡマウスの腫大した肢（上、ａｒｔ．＝関節炎）及びカクテルで治療した後の肢ＣＩＡマウス（下、ａｓ＝アンチセンス治療）の写真。両写真は同倍率及び動物から同じ距離で撮影した。
【図１１Ｂ】３種のｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドを組合せたもの（「カクテル」）による治療が引き起こした関節炎の寛解を示す図である。カクテルでの静脈内治療後における、血清（ｓｅｒ．）ＩＬ−６及び血清ＴＮＦα及び疾患重篤度スコア（ｄｉｓ．ｓｅｖ．ｓｃ．）の低減。（各群５個体のマウスからの平均±ＳＥＭ）。
【図１２Ａ】無菌性腹膜炎の誘発後の腹膜細胞集団の数及び構成を示す図である。無菌性腹膜炎マウスにおける腹膜細胞数の変化（各群６個体のマウスからの平均±ＳＥＭ）。
【図１２Ｂ】無菌性腹膜炎の誘発後の腹膜細胞集団の数及び構成を示す図である。無菌性腹膜炎マウスにおける腹膜細胞集団の構成の変化。略語：ｃｅ．ｎｏ．は、細胞数；Ｔ．は、時間；ｈは、時；ｎｅｕは、好中球；ｍａｃは、マクロファージ；ｌｙｍｐは、リンパ球。
【図１３Ａ】無菌性腹膜炎の誘発後のＬＴＢ４レベルを示す図である。血清（ｓｅｒ．）におけるＬＴＢ４レベル。
【図１３Ｂ】無菌性腹膜炎の誘発後のＬＴＢ４レベルを示す図である。腹腔（ｐｅｒ．ｃａｖ．）におけるＬＴＢ４レベル。各群５個体のマウスからの平均±ＳＥＭ。Ｔ．は、時間；ｈは、時間。
【図１４Ａ】腹膜細胞集団に対するアンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療の効果及び誘発２４時間後の活性を示す図である。細胞集団（ｃｅ．ｐｏｐ．）構成のＦＡＣＳ分析。Ｎｅｕ＝好中球。
【図１４Ｂ】腹膜細胞集団に対するアンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療の効果及び誘発２４時間後の活性を示す図である。細胞数（ｃｅ．ｃｏ．）を示すグラフ。
【図１４Ｃ】腹膜細胞集団に対するアンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療の効果及び誘発２４時間後の活性を示す図である。対照健常マウス（Ｈ）、無菌性腹膜炎マウス（Ｐ）及びカクテルを静脈内注射した２４時間後の無菌性腹膜炎マウス（Ｐ＋ＡＳ）、の刺激された腹膜細胞によるスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）。
【図１５Ａ】腹膜炎誘発の２４時間後の炎症部位における、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療により低減した好中球数及びスーパーオキシド生成を示す図である。アンチセンス治療を行った好中球（ｎｅｕ）及びその治療を行わなかった好中球（ｎｅｕ）のパーセンテージを示すグラフ。
【図１５Ｂ】腹膜炎誘発の２４時間後の炎症部位における、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療により低減した好中球数及びスーパーオキシド生成を示す図である。アンチセンス治療を行った無菌性腹膜炎マウス及びその治療を行わなかった無菌性腹膜炎マウスから単離された腹膜細胞のＰＭＡによって刺激されたスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）を示すグラフ。
【図１６】腹膜炎誘発の２４時間後の炎症部位における、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療によって低減した、休止腹膜細胞による刺激されていないスーパーオキシド生成を示す図である。１μＭジヒドロローダミン−１２３を用いて評価した、アンチセンス治療を行った無菌性腹膜炎マウス及びその治療を行わない無菌性腹膜炎マウスから単離された休止腹膜細胞によるスーパーオキシド生成の検出の一例が示されている。Ｃｏ．＝数。
【図１７Ａ】無菌性腹膜炎のマウスにおける、腹膜細胞構成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療の効果を示す図である。無菌性腹膜炎の間の腹膜細胞構成。
【図１７Ｂ】無菌性腹膜炎のマウスにおける、腹膜細胞構成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療の効果を示す図である。アンチセンス治療後の腹膜細胞構成。略語：ｃｅ．ｎｏ．は、細胞数；Ｔ．は、時間；ｈは、時間；ｎｅｕは、好中球；ｍａｃは、マクロファージ；ｌｙｍｐは、リンパ球。略語：Ｎｅｕは、好中球；ｍａｃは、マクロファージ；ｌｙｍｐは、リンパ球；（各群５個体のマウスからの平均）。
【図１８Ａ】無菌性腹膜炎の間の腹膜細胞による刺激されたスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド治療の効果を示す図である。無菌性腹膜炎のマウスにおける、腹膜細胞による、刺激されたスーパーオキシド生成。
【図１８Ｂ】無菌性腹膜炎の間の腹膜細胞による刺激されたスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド治療の効果を示す図である。無菌性腹膜炎で、アンチセンスオリゴヌクレオチドで治療されたマウスにおける、腹膜細胞による刺激されたスーパーオキシド生成。各群５個体のマウスからの平均±ＳＥＭ。Ｔ．＝時間、ｈ＝時間。
【図１９Ａ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療によって低減した腹膜ＬＴＢ４レベルを示す図である。無菌性腹膜炎マウスの腹膜におけるＬＴＢ４レベル。
【図１９Ｂ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療によって低減した腹膜ＬＴＢ４レベルを示す図である。カクテルで治療した無菌性腹膜炎マウスの腹膜におけるＬＴＢ４レベル。各群５個体のマウスからの平均±ＳＥＭ。Ｔ．＝時間、ｈ＝時間。
【図２０Ａ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療によって低減した腹膜好中球数を示す図である。無菌性腹膜炎マウスの腹膜における好中球数（Ｎｅｕ Ｎｏ）。
【図２０Ｂ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療によって低減した腹膜好中球数を示す図である。カクテルで治療した無菌性腹膜炎マウスの腹膜における好中球数（Ｎｅｕ Ｎｏ）。各群５個体のマウスからの平均±ＳＥＭ。Ｔ．＝時間、ｈ＝時間。
【図２１Ａ】注射の２４時間後の腹膜血液細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの蓄積を示す図である。治療していない腹膜血液細胞。
【図２１Ｂ】注射の２４時間後の腹膜血液細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの蓄積を示す図である。アンチセンス（ａｓ）オリゴヌクレオチドで治療した腹膜血液細胞。上のパネル：光学顕微鏡。下のパネル：共焦点顕微鏡。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、病状の治療におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用についての分野に関する。より詳しくは、本発明はホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の阻害及びこの分子の活性化を伴う状態の治療のための新規アンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する。
【発明の背景】
【０００２】
本明細書に引用される全ての参照文献をはじめ、本願を通じて記載される全ての刊行物は、参照により本明細書に完全に組込まれる。
【０００３】
炎症は損傷、感染又は免疫系によって異物と認識される分子に対する身体の応答である。炎症がないこと、過度の炎症又は制御されていない炎症は、喘息、関節炎及び自己免疫疾患、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、心血管炎症及び胃腸炎症等のありとあらゆる疾患をもたらす。多数の研究により、このような炎症性疾患には初回刺激を受けた好中球、単球及びマクロファージが関与していることが実証されている。より最近では、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患の病因並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷における、ミクログリア細胞によるスーパーオキシド放出の役割も実証された。
【０００４】
食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼによるスーパーオキシドの生成及びホスホリパーゼＡ２による炎症誘発性脂質性メディエーターの生成は、宿主防御の最も重要な機能である。しかしながら、変化した生理的状態の際には、スーパーオキシドと脂質性メディエーターは、炎症反応を促進し、組織損傷をもたらすプロセス及び種々の炎症性疾患の病態生理に関与する。今日では、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、炎症状態の治療のために最も広く処方される薬物の１種である。しかしながら、それらは望ましくない副作用を示し、最も一般的なものは消化管における潰瘍形成及び出血である。さらに、これらの薬物はプロスタグランジンの産生を低減させるだけであって、炎症部位への好中球の補充において極めて重要な役割を果たすロイコトリエンの産生には影響を及ぼさない。したがって、副作用がより少ない新規抗炎症薬の探索は続いている。コルチコステロイド、抗エンドトキシン抗体、ＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト及びその他の薬剤のような炎症カスケードを遮断する薬剤を用いて多数の試験が実施されてきたが、意義深い成功はない。
【０００５】
本発明者は細胞株、細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）の発現を欠くＰＬＢ−９８５細胞の安定なクローンである細胞系統を樹立し、ｃＰＬＡ２が、炎症誘発性脂質性メディエーターの生成におけるその知られている役割に加え、食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体の構築後の活性化に必須であることを実証した。これら２種の酵素の間の関連が、ｃＰＬＡ２によって放出されたアラキドン酸（ＡＡ）による、構築されたＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化の分子基盤を提供する［Ｄａｎａ，Ｒ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４４１〜５頁、Ｌｏｗｅｎｔｈａｌ，Ａ．及びＬｅｖｙ，Ｒ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１６０３〜１０頁、Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（２０００）Ｂｌｏｏｄ．９５：６６０〜５頁、Ｐｅｓｓａｃｈ，Ｉ．ら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３３４９５〜５０３頁、Ｓｈｍｅｌｚｅｒ，Ｚ．ら（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６２：６８３〜６９２頁、Ｔａｒｓｉ−Ｔｓｕｋ，Ｄ．及びＬｅｖｙ，Ｒ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１４４：２６６５〜２６７０頁、Ｄａｎａ，Ｒ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２９７：２１７〜２２３頁、Ｈａｚａｎ−Ｈａｌｅｖｙ，Ｉ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２４１６〜１２４２３頁］。ｃＰＬＡ２はオキシダーゼ活性化に必要であるので、その阻害は炎症性メディエーターの形成を減少させるはずであるだけではなく、炎症性疾患の病因に関与している酸素ラジカルの制御されていない加速された放出も調節するはずである。さらに、発明者の研究により、ｉｎ ｖｉｖｏにおける炎症の際又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける炎症状態の際、好中球及び単球において、ｃＰＬＡ２とＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素双方のレベル及び活性が上昇することがわかった［Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２２０：２６１〜２６５頁、Ｓｈａｋｅｄ，Ｇ．ら（１９９４）Ｊ．Ｔｒａｕｍａ ３７：２２〜２９頁、Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：６６０〜６６５頁、Ｌｅｖｙ，Ｒ．及びＭａｌｅｃｈ，Ｈ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３０６６〜３０７１頁、Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２２０：２５３〜２６０頁、Ｒｅｉｚｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．ら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７：３９８〜４０４頁］。驚くべきことに、最近の報告が、好中球へのｃＰＬＡ２阻害薬ピロリジンの添加は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害しないと記載したが［Ｒｕｂｉｎ，Ｂ．Ｂ．ら（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：７５１９〜２９頁］、この効果は、好中球における薬物の十分な蓄積を許さない、応用された方法論によるものであった可能性がある（データは示していない）。ｃＰＬＡ２を阻害することによって炎症状態を治療する方法は記載されているが、それらは、気道炎症の用量依存性減弱を引き起こすトリフルオロメチルケトン（ＴＦＭＫ）のような物質の使用［米国特許出願第２００２０１６５１１９号、ＵＳＳＮ０６２７３０］、又は種々の形のＰＬＡ２を阻害したインドール化合物の使用［ＵＳ６，７９７，７０８］と関連しており、今日まで、炎症の治療のためのｃＰＬＡ２に特有の阻害薬は記載されていない。現在、強力な細胞質ＰＬＡ２阻害薬は、ヒト又は動物における臨床用途には使用できない。今までのところ、ｃＰＬＡ２に対する全ての阻害薬は基質と競合するよう設計された。全ての種類のＰＬＡ２が脂肪酸をリン脂質のｓｎ−２位から切断するので、それらはまた同一の阻害薬によって阻害される（低効率である場合もあるが）。数種の化合物がｃＰＬＡ２の特異的な阻害薬として記載されたが、それらはその他のＰＬＡ２酵素も同様に阻害することがわかり、その逆もまた同様であった。各ＰＬＡ２サブタイプの特異的阻害薬がないので、アンチセンス技術が、ＰＬＡ２の特定のタイプを阻害する有効なアプローチを提供する。実際、本明細書に示される結果から、ｃＰＬＡ２を直接標的とする薬物は、ｃＰＬＡ２活性を特異的に阻害することが示唆される。さらに、炎症誘発性メディエーターとスーパーオキシドを産生するｃＰＬＡ２とＮＡＤＰＨオキシダーゼ双方の調節ももたらす。
【０００６】
ｃＰＬＡ２ｍＲＮＡ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃＰＬＡ２転写物発現を阻害できることが過去に報告されている［ＵＳ６，００８，３４４］。しかし、これらのオリゴヌクレオチドはｃＰＬＡ２タンパク質の発現を阻害することは実証しておらず、それらはリポフェクチンの存在下で細胞に導入された。
【０００７】
さらに、ｃＰＬＡ２を標的とする３種類のその他のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されており：ＰＩ（表１、配列番号８）［Ｒｏｓｈａｋ，Ａ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４２）：２５９９９〜２６００５頁、Ｍｕｔｈａｌｉｆ，Ｍ．Ｍ．ら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４７）：３０１４９〜３０１５７頁、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２）：７５９〜７６５頁、 Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４８）：３０５０４〜３０５１１頁］、Ｐ２（表１、配列番号９）［Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）：２４０４〜２４１１頁、Ｚｈａｏ，Ｘ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２８）：２５３８５〜２５３９２頁］及びＰ３（５’−ＧＴＧＣＴＧＧＴＡＡＧＧＡＴＣＴＡＴ−３’、配列番号１２）［Ｌｏｃａｔｉ，Ｍ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１１）：６０１０〜６０１６頁］、平滑筋細胞におけるｃＰＬＡ２及びヒト単球機能を阻害する効果を主に評価している。Ｐ１はリポフェクチンとともに用いられた。Ｐ１及びＰ２は全ての塩基にホスホロチオエート修飾があり、本発明者が細胞に対して毒性であると見出した５μＭで用いた場合にのみ有意な効果を有していた。Ｐ３は１０μＭで用いられた（又はさらに高い濃度、本発明者によって用いられたものよりも１０倍高い）。
【０００８】
したがって、炎症誘発性プロセスを阻害するために、ｃＰＬＡ２ｍＲＮＡに対する新規アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供すること、及びｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成の阻害におけるその使用が本発明の目的である。したがって、本発明において特許請求されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、抗炎症薬としても求められる。
【０００９】
本発明のその他の使用及び目的は、説明が進むにつれて明らかとなろう。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様では、本発明は細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその機能的類似体、その誘導体又はその断片であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補性が前記ＯＲＦのヌクレオチド１４５〜４００の間の領域の範囲内であり、ｃＰＬＡ２タンパク質の発現を阻害できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１１】
一実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは１５〜３０までのヌクレオチド長、好ましくは、１７〜２１ヌクレオチド長である。
【００１２】
ｃＰＬＡ２ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレームの５’領域に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のいずれか１つによって表される配列を有し、これらの配列は表１に詳述されている。
【００１３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、改良されたエンドヌクレアーゼ耐性を有するよう化学修飾できる。
【００１４】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのもう１つの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドにホスホロチオエート修飾が存在し得る。さらに、例えば、配列番号４及び５によって表されるオリゴヌクレオチドのように、別のホスホロチオエート修飾が、前記オリゴヌクレオチドの１０番目のヌクレオチドに見られる場合もある。
【００１５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのさらなる実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドに２−Ｏ−メチル化のようなさらなる修飾が見られる場合もある。
【００１６】
本研究において示される特性の結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｃＰＬＡ２発現と関連している炎症過程の阻害剤として使用できる。
【００１７】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、関節リウマチ、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患並びにアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷のうちのいずれか１種の治療及び／又は予防において、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患において用いるためのものである。
【００１８】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはスーパーオキシド生成及び放出を阻害するために使用できる。詳しくは、前記阻害は好中球、単球及びマクロファージにおいて、好ましくは、好中球において達成される。
【００１９】
場合によっては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、蛍光標識手段、放射性標識手段、金属粒子標識手段及び任意の適した標識手段のうち１種で標識してもよい。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、有効薬剤として、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその機能的類似体、誘導体若しくは断片を含む医薬組成物に関する。
【００２１】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、医薬組成物の形で提供される。前記組成物は、注射、局所投与又は経口摂取によって使用するためのものである。
【００２２】
あるいは、本発明の医薬組成物は、有効薬剤として、本発明に定義される少なくとも２種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的類似体、その誘導体若しくはその断片を組合せたものを含み得る。前記組合せは、以下のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい：配列番号１と配列番号３、又は配列番号１と配列番号２、又は配列番号１と配列番号６、又は配列番号１と配列番号２及び配列番号３、又は配列番号４と配列番号６、又は配列番号２と配列番号６、又は配列番号２と配列番号３、又は配列番号３と配列番号６。
【００２３】
本発明の薬剤組成は医学的使用を目的とする。
【００２４】
一実施形態では、本発明の医薬組成物はｃＰＬＡ２発現及び／又は食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼによるフリーラジカル放出と関連している炎症過程の治療を目的とする。
【００２５】
もう１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、神経変性疾患ＡＤ、ＰＤ、ＡＬＳ並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷等のＣＮＳ関連疾患のうちのいずれか１種であり得る炎症状態の治療、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における治療を目的とする。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物はＡβプラーク蓄積と関連している状態の治療を目的とする。前記状態は通常、ＣＮＳ関連疾患、特に、神経変性疾患アルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳ、又は脳虚血性損傷及び外傷性頭部損傷である。
【００２７】
本発明の医薬組成物には、バッファー、添加剤、安定剤、希釈剤及び／又は賦形剤を場合によってさらに含めてもよい。
【００２８】
もう１つの態様では、本発明は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ、ＡＬＳ等の神経変性疾患、並びに脳虚血及び外傷性損傷のうちのいずれか１種である炎症状態の治療及び／又は予防、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における治療及び／又は予防、に用いる医薬組成物の調製のための、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療のための、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００３０】
さらに、本発明は、Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療及び／又は予防のための、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を示す。通常、前記状態としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、脳虚血損傷及び外傷性頭部損傷からなる群から選択されるＣＮＳ関連疾患がある。
【００３１】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の少なくとも１種の治療上有効量を必要とする被験体に投与することを含む、ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療方法を示す。
【００３２】
したがって、さらにもう１つの態様では、本発明は、前記炎症状態が関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ及びＡＬＳ等の神経変性疾患並びに脳虚血及び外傷性損傷のうちのいずれか１種であり得る炎症状態の治療方法、すなわち、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の少なくとも１種の治療上有効量を必要とする被験体に投与することを含む、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患及び反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における炎症状態の治療方法を提供する。
【００３３】
もう１つの態様では、本発明は、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の少なくとも１種の治療上有効量を必要とする被験体に投与することを含む、Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療方法を提供する。前記状態は通常、神経変性疾患、特に、アルツハイマー病及びパーキンソン病である。
【００３４】
最後に、本発明は、細胞、好ましくは、食細胞、すなわち、好中球、単球、マクロファージ及び／又はミクログリアを、本発明に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物と適した時間接触させることを含む、ｃＰＬＡ２発現及び／又は活性を阻害するｉｎ ｖｉｖｏ法、ｅｘ ｖｉｖｏ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏ法を提供する。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、線維芽細胞、神経細胞及び内皮細胞においてｃＰＬＡ２活性を阻害したが、食細胞と比較して低効率であり、これはおそらくはアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する前者の細胞の透過性が低いことによるものである（データは示していない）。
【発明の詳細な説明】
【００３５】
本研究では、発明者らは細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）ｍＲＮＡに対する６種の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。以下の実施例において示されるように、各アンチセンスはそれ自体、ｃＰＬＡ２の発現阻害において極めて強力であるが、オリゴヌクレオチドの種々を組合せたものは、ヒト、マウス及びラット由来の種々の食細胞並びにミクログリア細胞においてｃＰＬＡ２発現を全体的に阻害した。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｃＰＬＡ２発現阻害とＮＡＤＰＨオキシダーゼによるスーパーオキシド生成阻害の間には著しい相関があり、このことはこれまでは実証されていなかった。
【００３６】
したがって、本発明はｃＰＬＡ２ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（図１に示される）、及びその機能的類似体、その誘導体又はその断片であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補性が前記ＯＲＦのヌクレオチド１４５〜４００の間の領域内であり、ｃＰＬＡ２タンパク質の発現を阻害できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３７】
以下の実施例に示されるように、本発明によって提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害することによってスーパーオキシド生成も阻害できる。
【００３８】
本明細書に記載したように、配列番号７はｃＰＬＡ２ｍＲＮＡ配列［ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ６８８７４］に相当するｃＤＮＡ配列に関する。
【００３９】
前記のｃＰＬＡ２ｍＲＮＡのヌクレオチド１４５〜４００の間の領域は標的化するのに特に有用であるが、これはプロセスがすでに始まってしまうとタンパク質合成を中止することよりも阻害することの方がはるかに効率的であるからである（前者はＵＳ６，００８，３４４において、そのｃＰＬＡ２アンチセンス配列のほとんどに対して用いられた戦略である）。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは翻訳部位の領域（ＯＲＦの開始）を標的とするよう設計した。
【００４０】
それにもかかわらず、アンチセンスによる標的化は依然として極めて経験に基づいたものであり、最も効率的な標的化のための特異的配列及び最適条件を見出すには多数の実験が必要であるということを記載することは重要である。本明細書に記載したように、例えば、本発明者らは最初、ＯＲＦの開始に相当するｃＰＬＡ２配列のヌクレオチド１４５〜４００の間の領域を標的とする１４種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計したが、そのうち６種しか効率的に働かなかったので、その後それらをより詳細に研究した。
【００４１】
ｃＰＬＡ２ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレームの５’領域に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のいずれか１つによって表される配列を有し、これらの配列は表１に詳述されている。
【００４２】
記載したように、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、改良されたエンドヌクレアーゼ耐性を有するよう化学修飾できる。それだけには限らないが、ホスホロチオエート化又は２−Ｏ−メチル化等のエンドヌクレアーゼに向けた耐性を付与する化学修飾はいずれも採用できる。
【００４３】
したがって、ホスホロチオエート修飾は本発明のオリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドに存在し得る。さらに、例えば、配列番号４及び５によって表されるオリゴヌクレオチドにおけるように、別のホスホロチオエート修飾が前記オリゴヌクレオチドの１０番目のヌクレオチド、内部ピリミジン、に見られる場合もある。内部ピリミジンのホスホロチオエート化は安定性を高め、エンドヌクレアーゼ切断から保護することがわかっている［Ｐｉｒｏｌｌｏ，Ｋ．Ｆ．ら（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ９９：５５〜７７頁］。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、部分ホスホロチオエート化されており、したがって、全てのヌクレオチドにホスホロチオエート修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも毒性が低い。
【００４４】
それにもかかわらず、前記オリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドに２−Ｏ−メチル化のようなさらなる修飾が見られる場合もある［ＥＰ２６０，０３２］。
【００４５】
実施例５〜７において示されるように、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはｃＰＬＡ２発現及び活性と関連している炎症過程の阻害薬として使用できる。
【００４６】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ、及びＡＬＳ等の神経変性疾患並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷のうちのいずれか１種の治療及び／又は予防において、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患において使用するのに適している。
【００４７】
ヒト単球における研究により、ｃＰＬＡ２発現の阻害はまた、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害することが実証されたが［Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）同書］、別の報告ではｃＰＬＡ２欠陥マウス由来の常在腹膜マクロファージは正常刺激下でスーパーオキシドを放出し得るということが示されている［Ｇｉｊｏｎ，Ｍ．Ａ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２０１４６］。対照的に、本発明者らはここで、マウスマクロファージにおけるｃＰＬＡ２発現の阻害において効率的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、マクロファージにおける、並びに単球、好中球及びミクログリア細胞におけるスーパーオキシド生成の阻害においても効率的であるということを実証した。この相違は、「ノックアウト」動物モデルは、例えば、過剰発現及びアイソザイムの代償によって正常な表現型を有することが多く、そのため研究において遺伝子（すなわち、タンパク質又は酵素）の欠損の効果を正確に映し出さないという事実によって説明できる。本結果は、１μＭ（終濃度）という低レベルのオリゴヌクレオチドを用いて得られたことが最も重要である。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、低い、非毒性の濃度で効果的であり、これによって臨床目的における使用、すなわち、本明細書において論じたようなｃＰＬＡ２の阻害が望ましい状態を治療するための治療薬としての使用に適したものとなるということが重要である。
【００４８】
さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＬＰＳによってミクログリア細胞が活性化され、例えば、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出している状態の治療及び／又は予防における使用に適している。前記状態は、炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される。
【００４９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、スーパーオキシド生成及び放出を阻害するのに使用できる。通常、前記阻害は好中球、単球及びマクロファージにおいて、好ましくは、好中球において達成される。
【００５０】
活性化された好中球が、炎症部位に到達する第１の細胞であり、次いで、これが高レベルのエイコサノイド及びスーパーオキシドを放出し、これらが炎症過程を加速する。このため、好中球は種々の炎症性疾患の病因の直接的なエフェクターであり、その機能を直接的に阻害することは、炎症過程を低減させるための効率的な方法である。単球（及びマクロファージ）は、炎症部位に到達する第２の細胞集団であり、したがって、その阻害も炎症を止めるために重要である。
【００５１】
さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アミロイドβ（Ａβ）プラーク形成によって、又はＬＰＳ若しくはサイトカイン等のその他の作用物質によって誘発されるミクログリアによって放出されるエイコサノイド及びＲＯＳ生成を阻害するために使用できる。ＲＯＳ形成は、種々の神経疾患の病因に寄与している神経細胞の機能不全又は死滅の原因であることがわかっている。
【００５２】
「類似体及び誘導体」とは、前記核酸分子の「断片」、「変異体」、「類似体」又は「誘導体」を意味する。本発明のいずれかのオリゴヌクレオチド配列等といった分子の「断片」とは、分子のいずれかのヌクレオチドサブセットを指すことを意味する。このような分子の「変異体」とは、全分子又はその断片のいずれかと実質的に類似した天然分子を指すことを意味する。分子の「類似体」とは、それだけには限らないが、パラロガス分子又はオルソロガス分子、例えば、それぞれ、同１種に由来する相同分子又は異なる種に由来する相同分子、すなわち、種々の種における遺伝子の対応する領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、その領域については、配列中にわずかな変化を有していてもよい。
【００５３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのさらなる誘導体としては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを生物中で追跡及び／又は検出できるように標識されているものやリポーター分子と結合されているものがある。例えば、ビオチン、フルオレセイン、ローダミン、４−（４’−ジメチルアミノ−フェニラゾ）安息香酸（「ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）」）、４−（４’−ジメチルアミノ−フェニラゾ）スルホン酸（塩化スルホニル）（「ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）」、５−（（２−アミノエチル）−アミノ）−ナフタレン−１−スルホン酸（「エダンス（ＥＤＡＮＳ）」）、プソラレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）誘導体、ハプテン、シアニン、アクリジン、蛍光ロドール（ｒｈｏｄｏｌ）誘導体、コレステロール誘導体、放射性標識、及び金属粒子（例えば、金）のような、その検出を可能にする標識又はリポーター分子はいずれも適したものであり得る。
【００５４】
第２の態様では、本発明は、有効薬剤として、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその機能的類似体、その誘導体若しくはその断片を含む医薬組成物に関する。
【００５５】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、医薬組成物の形で提供される。前記組成物は、注射、局所投与又は経口摂取によって使用するためのものである。
【００５６】
あるいは、本発明の医薬組成物は、有効薬剤として、本発明に定義される少なくとも２種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその機能的類似体、その誘導体若しくはその断片を組合せたものを含み得る。前記組合せは以下のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい：配列番号１と配列番号３、又は配列番号１と配列番号２、又は配列番号１と配列番号６、又は配列番号１と配列番号２及び配列番号３、又は配列番号４と配列番号６、又は配列番号２と配列番号６、又は配列番号２と配列番号３、又は配列番号３と配列番号６。
【００５７】
本明細書における以下に記載する実施例で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、同一反応において２種又は３種一緒に併用した場合に、ｃＰＬＡ２の阻害とスーパーオキシド生成の阻害の双方がどのようにより効率的であったのかを明らかにする。
【００５８】
一実施形態では、本発明の医薬組成物はｃＰＬＡ２発現及び／又は食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼによるフリーラジカル放出と関連している炎症過程の治療を目的とする。
【００５９】
もう１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ、及びＡＬＳ等の神経変性疾患並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷のうちのいずれか１種であり得る炎症状態の治療、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における治療を目的とする。
【００６０】
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療を目的とする。前記状態は通常、神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳ、又は脳虚血性損傷及び外傷性損傷である。
【００６１】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、ＬＰＳに対する曝露によって、ミクログリア細胞が活性化され、ＲＯＳ及び／又は炎症誘発性メディエーター（エイコサノイド）を放出している状態の治療及び／又は予防において使用されることを目的とする。前記状態は、炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される。
【００６２】
注射による、本発明の医薬組成物の好ましい使用は、皮下注射、腹膜内注射、静脈内注射及び筋肉注射である。
【００６３】
本発明の医薬組成物は通常、希釈液及び／又は緩衝剤、すなわち、その浸透圧を調整する作用物質、並びに、場合によっては１種又は複数の担体、安定剤、賦形剤及び／又は例えば、フレーバー、色、滑沢性を医薬組成物に付与することを目的とする当技術分野で公知の添加剤等をさらに含む。
【００６４】
好ましい緩衝剤としては、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５〜８．０からなり、浸透圧についても調整されているＴｒｉｓがある。
【００６５】
ｉｎ ｖｉｖｏ使用には、アンチセンスオリゴヌクレオチドを滅菌蒸留水又は滅菌生理食塩水に懸濁する。
【００６６】
担体としては、デンプン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、例えば、微晶質セルロース、キサンタンガム等が挙げられる。滑沢剤としては、硬化ヒマシ油等が挙げられる。
【００６７】
医薬組成物の調製は当技術分野では周知であり、多数の論文及び教本に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、特にその中の１５２１〜１７１２頁参照。
【００６８】
局所投与用の医薬組成物としては、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、座剤、スプレー剤、液体剤及び散剤が挙げられる。従来の薬剤担体、水性基剤、粉末基剤又は油性基剤、増粘剤等が必要である場合も、望ましいものである場合もある。
【００６９】
経口投与用組成物としては、散剤又は顆粒剤、水性媒質若しくは非水性媒質中の懸濁液又は溶液、カプセル剤、サシェ又は錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいものである場合もある。
【００７０】
非経口投与用、くも膜下腔内投与用又は脳室内投与用組成物及び製剤としては、同様に、バッファー、希釈剤並びに、それだけには限らないが、浸透促進剤、担体化合物及びその他の製薬上許容される担体又は賦形剤等のその他の適した添加剤を含み得る滅菌水溶液が挙げられる。
【００７１】
本発明の医薬組成物としては、それだけには限らないが、溶液、エマルション及びリポソーム含有製剤が挙げられる。これらの組成物は、それだけには限らないが、予め作られた液体、自己乳化型固体及び自己乳化型半固体を含む種々の成分から作製できる。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、単位投与形で提示できることが好都合であるが、これは製薬業界において周知の従来技術にしたがって調製できる。このような技術は、有効成分と薬剤担体又は賦形剤を結び付けるステップを含む。一般に、製剤は有効成分と液体担体若しくは微粉化個体担体又はその双方とを均一及び密接に結び付け、次いで、必要に応じて製剤を成形することによって調製する。このような組成物は、それだけには限らないが、錠剤、カプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、座剤及び浣腸等の多数のあり得る投与形のいずれかに製剤できる。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒質中の懸濁液として製剤してもよい。水性懸濁液には、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランをはじめとする懸濁液の粘度を高める物質をさらに含める場合もある。この懸濁液にはまた、安定剤を含めてもよい。
【００７３】
本発明の一実施形態では、医薬組成物を泡沫として製剤し使用できる。薬剤泡沫としては、それだけには限らないが、エマルション、マイクロエマルション、クリーム剤、ゼリー剤及びリポソーム等の製剤が挙げられる。これらの製剤の性質は基本的には類似しているが、最終製剤の成分及び稠度が異なる。
【００７４】
本発明の医薬組成物にはその他の有効薬剤、例えば、抗生物質、鎮痛薬等をさらに含めてもよい。
【００７５】
もう１つの態様では、本発明は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ及びＡＬＳ等の神経変性疾患並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷のうちのいずれか１種であり得る炎症状態の治療及び／又は予防、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における治療及び／又は予防に用いる医薬組成物の調製のための、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００７６】
さらに、本発明は、ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療のため並びにＡβプラーク蓄積と関連している状態の治療及び／又は予防のための、本発明に定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。通常、前記状態としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳからなる群から選択される神経変性疾患、並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷がある。
【００７７】
したがって、本発明は、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療方法を示す。
【００７８】
前記治療上有効量又は投薬は、治療されようとする病状の重篤度及び応答性に応じて変わり、治療過程は、治癒が達成されるまで又は病状の減少が達成されるまで数日から数ヵ月続く。最適投薬スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定から算出できる。当業者ならば最適投与量、投薬法及び繰り返し率を容易に決定できる。最適投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対力に応じて変わり得、通常、ＥＣ５０に基づいて推定でき、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であるとわかる。通常、投与量は体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０ｍｇであり、１日、１週間、１カ月又は１年に１回若しくは複数回、又はさらに２〜２０年毎に１回与える場合がある。当業者ならば、測定された体液又は組織中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの滞留時間及び濃度に基づいて投薬の繰り返し率を容易に推定できる。
【００７９】
治療がうまくいった後、患者が、病状の再発を防ぐために維持療法を受けることが望ましい場合があり、この場合にはオリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇあたり０．０１ｇ〜１０ｍｇの範囲の維持量で１日に１回又は複数回投与される。
【００８０】
以下の実施例５〜７において実証されるように、炎症状態の治療に用いられる最適投与量は、５日から１４日までの間、毎日、１〜２ｍｇ／ｋｇ／日が与えられるか（実施例５）、又は炎症後１〜２ｍｇ／ｋｇ／日を１若しくは２用量で与えられる（実施例６及び７）。
【００８１】
ｃＰＬＡ２発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、炎症部位で上昇したｃＰＬＡ２を特異的に阻害し、正常なｃＰＬＡ２発現には影響を及ぼさないので、局所炎症性疾患の画期的な治療である。この治療は、このような疾患の病因に関与している活性化されたか又は初回刺激を受けた食細胞の活性にも影響を及ぼす場合に、さらにより有効である可能性があるが、これはこれらの細胞が高レベルのエイコサノイド及びスーパーオキシドを分泌し、これらが炎症過程を加速するからである。
【００８２】
したがって、本発明はまた、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患、ＡＤ、ＰＤ、ＡＬＳ等の神経変性疾患並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷のうちのいずれか１種である炎症状態の治療、すなわち、その病因に酸化ストレスが重要な役割を果たす全ての疾患並びに反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出がある全ての疾患における治療方法を提供する。
【００８３】
さらに、ミクログリア細胞におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼによるスーパーオキシド生成の調節におけるｃＰＬＡ２の関与は、ｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳからなる群から選択される神経変性疾患、並びに脳虚血性損傷及び外傷性損傷の治療に使用できることを示唆する。
【００８４】
同様に、本発明はまた、例えば、ＬＰＳに曝露され、ミクログリア細胞が活性化され、ＲＯＳ及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出している状態の治療及び／又は予防のための方法であって、前記状態が炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される方法を提供する。前記方法は、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む。
【００８５】
最後の態様として、本発明は、本発明に定義される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、神経変性疾患、並びに脳損傷（例えば、卒中又は外傷によって引き起こされた）の治療方法を提供する。前記状態は通常、反応性ミクログリアによるエイコサノイド及びスーパーオキシドの加速された放出のある神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病及びパーキンソン病、又は脳虚血性損傷及び外傷性損傷である。
【００８６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを必要とする被験体に送達するには種々の投与法を使用できる。オリゴヌクレオチドは、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）腹膜内（ｉ．ｐ．）注射、経口的に（液体形で、又はカプセル剤、丸剤、トローチ剤等の投与単位形として製剤されて）によって送達できる。治療上有効であるためには、オリゴヌクレオチドは注射後、又はさらにより好ましくは、経口投与後のシステムでその安定性を可能にする方法で製剤しなくてはならない。
【００８７】
あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドはパッチ剤、軟膏剤又はクリーム剤を用い経皮送達によっても送達できる。
【００８８】
さらに、本発明に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効薬剤として含む医薬組成物は、局所又は全身治療が望まれるかどうかに応じ、さらに、治療されようとする面積に応じて、いくつかの方法で投与できる。投与は局所へ（眼へ並びに膣送達及び直腸送達をはじめとする粘膜へ、例えば、散剤又はエアロゾルの吸入又は吹送によって肺へ、例えば、噴霧器によって等、気管内へ、鼻腔内へ、上皮へ及び経皮的）、経口的又は非経口的であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹膜内若しくは筋肉内注射若しくは注入、又は頭蓋内、例えば、くも膜下腔内若しくは脳室内投与が挙げられる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【００８９】
以下の実施例において示されるように、マウス及びラット（関節炎、ＡＲＤＳ及び腹膜炎）における３種の異なる炎症モデルを用いた予備試験が、抗炎症治療としての特異的なｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を実証する。
【００９０】
本発明は特許請求の範囲によって規定され、その内容は本明細書の開示内容内に含まれるものと読み取られるべきである。
【００９１】
本発明は、開示され、説明されているが、プロセスステップ及び材料は幾らか変わり得るものとして、本明細書に開示された特定の実施例、プロセスステップ及び材料に本発明が制限されないということは理解されなくてはならない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ制限されるので、本明細書に用いた技術用語は、単に個々の実施形態を説明する目的で用いられているものであって、制限しようとするものではないということも理解されなくてはならない。
【００９２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いたように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、特に断りのない限り、複数形の指示対象を含むということは留意しなくてはならない。
【００９３】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、特に断りのない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形物は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含み、その他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外しないことを意味すると理解される。
【００９４】
以下の実施例は、本発明の態様を実施するために発明者らによって用いられた技術の代表的なものである。これらの技術は、本発明を実施するのに好ましい実施形態を例示するものであり、当業者ならば、本開示内容を踏まえ、本発明の対象とする範囲から逸脱することなく多数の改変を行うことができると認識するであろうことは理解されなくてはならない。
【実施例】
【００９５】
試験手順
分子生物学の一般法
分子生物学分野のいくつかの方法は、当業者には周知であるので本明細書では詳述しない。このような方法には、ＰＣＲ、ｃＤＮＡの発現、哺乳類細胞のトランスフェクション等が含まれる。このような方法を記載する教本としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ：０８７９６９３０９６、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．がある。さらに、例えば、ウェスタンブロットのようないくつかの免疫学的技術も、当業者には周知であるので、本明細書に記載されるどの場合においても詳述していない。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい。
【００９６】
オリゴヌクレオチド
【表１】
【００９７】
実施例１
抗ｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
ｃＰＬＡ２に対する、１４種の異なる部分ホスホロチオエート化［Ｓｔｅｉｎら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９〜３２２１頁］オリゴヌクレオチドをまず合成した。使用前に、オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣによって精製し、質量分析（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）によって純度について調べた。選抜前に、Ｂｌａｓｔプログラムを用いて特有性についてスクリーニングすることによって配列を分析し、また、Ｍｕｌｆｏｌｄを用いて、二次構造及びオリゴ対形成の欠損についても調べた［Ｊａｅｇｅｒ，Ｊ．Ａ．（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６頁］。
【００９８】
予備実験（示していない）によって、それら１４種から６種のオリゴヌクレオチドのみがｃＰＬＡ２発現の阻害において有効であるとわかり、その配列が上記表１に詳細に示されている。
【００９９】
６種のアンチセンスオリゴヌクレオチドしか有意な活性を示さなかったという事実は、これらが標的配列に対して高い特異性を有するということを示唆した。残りの８種のオリゴヌクレオチドは実験で対照として用いた。
【０１００】
これらのオリゴヌクレオチドは、５’及び３’末端双方の最後の３塩基にホスホロチオエート修飾を保持しており（表１で下線によって示されている）、ｃＰＬＡ２ｍＲＮＡの最初の４００００塩基対（Ｎ末端）についてＲＮＡＤｒａｗ Ｖ１．１［Ｍａｚｕｒａ Ｍｕｌｔｉｍｅｄｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ］を用いコンピュータを利用したアプローチを用いて設計した（表１）。
【０１０１】
部分ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド（ＰＰＳ）は、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドよりも毒性が低く、より特異的であるが、その安定性及び細胞取り込みにおいては同様である。いくつかのＰＰＳは、ＧＧＧＧ（Ｃ１０）及びＧＧＧ（Ｃ８及びＣ９）を含み、細胞取り込みを高めることがわかっている、（表１参照）。ＰＰＳＣ８、Ｃ９はまた、安定性を高め、エンドヌクレアーゼ切断から保護することがわかっている内部ピリミジン（ｔ）でのホスホロチオエート化を含む（表１、下線部）。アンチセンスオリゴヌクレオチドのうち５種は、免疫応答を刺激することがわかっているＣｐＧを含んでいなかった。裸のＰＰＳは、公開されたｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究とは対照的に、この形でｉｎ ｖｉｖｏ治療に使用できるため［Ｐｉｒｏｌｌｏ，Ｋ．Ｆ．ら（２００３）同書］、本明細書に示した実験の全てで加えられたが、これにはアンチセンス取り込みを高めるために異なる送達システムを用いた。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた全ての臨床試験は、裸のオリゴヌクレオチドを用いて実施されている。例えば、組織培養において実施された実験［Ｊａｎｓｅｎ，Ｂ．ら（２０００）Ｌａｎｃｅｔ ３５６：１７２８〜１７３３頁］とは対照的に、ｉｎ ｖｉｖｏ臨床試験は、癌患者におけるＢｃｌ−２に対するオリゴヌクレオチド送達のために陽イオン性脂質を必要としなかった。これは、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイでは通例であるが、今日まで、何故ベクターが必要でないようであるのかについてはよくわかっていない。１つの仮説としては、オリゴヌクレオチドが循環タンパク質と相互作用し、このことがまだ理解されていない方法で、オリゴヌクレオチドを分解から保護し、担体としても働くというものである［Ｄｉａｓ，Ｎ．及びＳｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃ．５４：２６３〜２６９頁］。
【０１０２】
図３〜７において示されるように、ＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドによるｃＰＬＡ２発現の阻害とスーパーオキシドの刺激された生成の間には明確な相関がある。各ＰＰＳオリゴヌクレオチドは、種々の食細胞種において、ｃＰＬＡ２タンパク質発現の有意な阻害を引き起こし、それらを組合せたものは大幅に改良された阻害を引き起こした。
【０１０３】
図３及び４に示されるように、本発明のＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドはこれまでに報告されたものよりもはるかに効率的である［ＵＳ６，００８，３３４、Ｒｏｓｈａｋ ら（１９９４）同書、Ｍｕｔｈａｌｉｆら（１９９６）同書、Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９９７）同書、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）同書、Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）同書、Ｚｈａｏ，Ｘ．ら（２００２）同書］。さらに、先の報告では、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのｍＲＮＡ合成を阻害する能力についてしか調べられていなかった［ＵＳ６，００８，３３４］。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドの両末端における修飾の数（及び種類）の効果も評価した（データは示していない）。観察された、ｃＰＬＡ２発現及びＮＡＤＰＨオキシダーゼを阻害する効率についての順位は以下の通りであった：
３修飾を有するＰＰＳ＞２修飾を有するＰＰＳ＞１修飾を有するＰＰＳ＞修飾のないもの。
【０１０５】
ＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドは、内皮細胞又は上皮細胞よりも単球について示されるように、食細胞におけるｃＰＬＡ２タンパク質発現の阻害においてより効率的であった（データは示していない）。この現象は、器官に影響を及ぼさず、炎症部位の食細胞に直接的に影響を及ぼす炎症の治療に関して特に有利である。
【０１０６】
実施例２
末梢血ヒト単球におけるｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドのｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対する効果
ｃＰＬＡ２タンパク質の発現を、発明者らによって作製され、商業マーケットで入手できるものよりもはるかに効率的であるｃＰＬＡ２に対する抗体を用いウェスタンブロット解析によって解析した（図２）。
【０１０７】
ｃＰＬＡ２発現に対する種々のＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれらを組合せたものの効果及びスーパーオキシド生成に対する効果を、末梢血ヒト単球（図３及び４）及びマウスマクロファージにおいて（図５）調べた。１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ中の細胞懸濁液に、裸の（リポフェクチン等のようなトランスフェクション溶液を含まない）ＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチド（終濃度は１μＭ）を、３７℃で１６時間添加した。５ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡで刺激された同じ細胞のスーパーオキシド生成（シトクロムｃ還元によって）及び細胞溶解物におけるｃＰＬＡ２の発現について（ウェスタンブロット解析によって）解析した。示されるように、各ＰＰＳアンチセンスは５０〜７５％のスーパーオキシド生成阻害を引き起こし、これはそのｃＰＬＡ２発現阻害に対する効果と相関していた。ｃＰＬＡ２のレベルは、反射モードでの密度測定（ｄｅｎｓｉｍｅｔｒｙ）によって定量化した（Ｈｏｅｆｅｒ、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）。これら２つのパラメーターの間の相関は図６に実証されている。
【０１０８】
図３及び４に示されるように、それぞれＰ１［Ｒｏｓｈａｋら（１９９４）同書、Ｍｕｔｈａｌｉｆら（１９９６）同書、Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９９７）同書、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）同書］及びＰ２［Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）同書］、並びにＩＳ１及びＩＳ２［ＵＳ６，００８，３３４］は、ｃＰＬＡ２発現に対しても、スーパーオキシド生成に対しても全く効果がなかった。オリゴヌクレオチドＩＳ１及びＩＳ２はそれぞれ、ＵＳ６，００８，３３４では、１００％及び９２％のｍＲＮＡ発現阻害を引き起こすと報告されていたことは最も重要である。しかし、それらの効果はｍＲＮＡ発現阻害によって解析されただけでｃＰＬＡ２タンパク質発現阻害によっては解析されていなかった。
【０１０９】
Ｐ１、Ｐ２ ＩＳ１及びＩＳ２は、その最初の刊行物では、全ての塩基にホスホロチオエート修飾を伴って合成された。本発明者は、完全ホスホロチオエート化された場合、これらのオリゴヌクレオチドは細胞に対して毒性があり、１６時間のインキュベーションの後約６０〜７０％の細胞の死滅を引き起こすことを見出した（データは示していない）。これらの結果は、全ての塩基にホスホロチオエート修飾を有するオリゴヌクレオチドははるかに毒性が高いことを示す先の報告［Ｐｉｒｏｌｌｏ，Ｋ．Ｆ．ら（２００３）同書］と一致している。したがって、この研究については、Ｐ１、Ｐ２、ＩＳ１及びＩＳ２の効果と、本発明者によって合成されたＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果をより正確に比較するために、最初のオリゴヌクレオチドとは異なる、最初と最後の３塩基にしかホスホロチオエート修飾を有さないＰ１、Ｐ２、ＩＳ１及びＩＳ２が合成されたことに留意することが重要である。
【０１１０】
図２及び３に示される結果から、発明者によって合成された（及び特許請求される）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、文献に記載されたオリゴヌクレオチドよりも優れていることが実証される。詳しくは、前者は以下であることを強調できる：
ａ．毒性が低い、
ｂ．ｃＰＬＡ２タンパク質発現阻害においてはるかに強力である。
【０１１１】
Ｐ１、Ｐ２、ＩＳ１及びＩＳ２と比べ、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは特に好ましいが、これはそれらがリポフェクチンのような細胞送達システムなしに細胞に導入され得、その活性を発揮できるためである。
【０１１２】
実施例３
末梢血ヒト好中球における、ｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドのｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対する効果
ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対する種々のＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれらを組合せたものの効果を、末梢血ヒト好中球において調べた。２×１０５個の好中球に、裸のアンチセンスオリゴヌクレオチドを３７℃で６時間添加した（１μＭ終濃度で）。好中球（９５％純度）をＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離し、デキストラン沈降及び赤血球の低張溶解によって単離した［Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：６６０〜６６５頁］。図７に示されるように、好中球とともに６時間インキュベートした後に、スーパーオキシド生成の、わずかではあるが有意な（Ｐ＜０．０５）阻害があった。別の実験では、１６時間のインキュベーション後に同様の効果が示された（データは示していない）
【０１１３】
種々のオリゴヌクレオチドアンチセンスによるスーパーオキシド生成の阻害は、細胞膜上の受容体と特異的に結合するｆＭＬＰ、オプソニン化ザイモサン（ＯＺ）（図８）、ＬＴＢ４、アンジオテンシンＩＩ又はＡＧＥ（最終糖化反応物）等の生理的アゴニストによって細胞が刺激された場合、大幅に改良された（データは示していない）
【０１１４】
ＰＰＳの効果は、好中球を炎症性疾患（関節リウマチ、喘息又は敗血症等、データは示していない）の患者から精製した場合に、好中球を健常な対照から得た場合よりも大幅に高かった。この現象は、好中球におけるｃＰＬＡ２レベルは病気の間は高く、このことは合成速度の増大を示し、それ故より標的化しやすいということを報告した発明者らの初期の研究と一致する［Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（２０００）同書］。
【０１１５】
図３〜６に表される実験は、非生理的刺激物ＰＭＡ、受容体をバイパスしてＰＫＣに対して作用するＮＡＤＰＨオキシダーゼの極めて強力なアクチベーター、を用いて実施したことに留意することが重要である。これらの条件下では、種々の受容体の発現及びその刺激物との結合の効果が排除されるため、これにより、ＮＡＤＰＨオキシダーゼに対するアンチセンスの直接的な役割を解析することが可能となったからである。
【０１１６】
実施例４
ラットミクログリアにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドのｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対する効果
アンチセンス及びそれらを組合せたものの効果を、ラット脳から単離したミクログリアで調べた。ＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチド（１μＭ終濃度で）を、ミクログリア細胞に１６時間加えた（単球に用いた条件と同様）。ｃＰＬＡ２タンパク質発現の有意な阻害があった。細胞を２ｍｇ／ｍｌ ＰＭＡ又は１０μＭのアミロイドβで刺激し、スーパーオキシド生成を蛍光プローブＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄによって分析した。図９に示されるように、アンチセンスはスーパーオキシド生成の有意な阻害を引き起こし、ｃＰＬＡ２タンパク質発現と相関していた。興味深いことに、アンチセンスＣ８は、ラット配列とは１塩基マッチしなかったが、これはスーパーオキシド生成の阻害を引き起こさず、このことはアンチセンスの高い特異性を示す。阻害は、細胞がアミロイドβで刺激された場合にかなり高かった。ミクログリアをアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに４８時間インキュベートすることによって、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成のより高い阻害が引き起こされた（データは示していない）。アミロイドβはアルツハイマー病等の脳及び神経変性疾患の病因において重要な役割を果たすので、この結果は特に重要である。
【０１１７】
全ての細胞種を×１５０アンチセンス濃縮物とともにインキュベートしても、細胞に対して毒性ではなく、ｃＰＬＡ２によって調節されない細胞機能にも影響を及ぼさなかった（データは示していない）。
【０１１８】
実施例５
炎症の動物モデル：コラーゲン関節炎
コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）は、関節リウマチ（ＲＡ）と多数の臨床上及び病理学的類似性を有する自己免疫関節炎の実験モデルである。ＣＩＡは、記載されたように、感受性動物（例えば、ＤＢＡブラックマウス）をＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）で免疫化することによって誘発される［Ｂｅｎｄｅｌｅ，Ａ．Ｍ．ら（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、４３：２６４８〜５８頁］。全てのマウスは特定の病原体を含まない環境で維持し、標準マウス食と水を与えた。ニワトリＣＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、２ｍｇ／ｍｌ）を１０ｍＭ酢酸に４℃で一晩溶解し、等容量のＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）と合わせた。ＣＦＡは１００ｍｇの加熱殺菌した結核菌（Ｈ３７Ｒａ、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）を２０ｍｌの不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）と混合することによって調製した。マウス（７〜１０週齢）の尾の基部に皮内注射し、７日目又は２１日目に追加免疫した。対照マウスはＣＩＩを含まないＣＦＡで処理した。関節炎の重篤度は、以下のスケールに従ってデジタルノギスを用いて直接検査することによってモニターした：等級０、腫脹なし；１、わずかな腫脹及び紅斑；２、明白な炎症及び３、関節硬直。各肢を等級付けし、動物あたり最大１２のスコアを与えた。動物の足から体液を吸引し、サイトカイン（ｍＲＮＡ及びタンパク質レベル）及び白血球を調べた。屠殺した後、足を採取し、固定し、脱灰し、パラフィン包埋した。切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、以下のスケールにしたがってスコアを付けた：０、炎症なし；１、滑膜細胞層のわずかな肥厚及び／又は表層下のいくらかの炎症細胞：２、滑膜表層の肥厚、表層下の浸潤及び局在する軟骨びらん及び３、滑膜腔の浸潤、パンヌス形成、軟骨破壊及び骨びらん。
【０１１９】
抗ＣＩＩ抗体の検出：ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３又はＩｇＭ及びＩｇＡに対して特異的なＨＲＰ結合二次抗体によって、ＣＩＩに対する抗体のためのＥＬＩＳＡを実施した。
【０１２０】
細胞単離：ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８に対して特異的なビオチン結合抗体とビオチン結合剤ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）を用いて、滑膜細胞の脾細胞サブセットの陽性選抜を実施した。ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ３＋滑膜細胞を陽性選択した後、滑膜細胞をビオチンＣＤ４５とともにインキュベートし、過剰のアビジン磁性ビーズを用いて負の選抜を行った。残存するＣＤ４５陰性細胞は、ＲＮＡ抽出に用いた。滑液白血球は、滑膜浸出液から得、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって精製した。
【０１２１】
ＣＩＡのモデルは、例えば、対照マウスの肢と比較して、腫大し、増悪したＣＩＡマウスの肢によって実証されたように、発明者らによってうまく開発された（図１０Ａ）。ＣＩＡマウスの肢の組織学的評価（図１０Ｂ）は、関節炎の重篤度と相関しており、図１０Ａに示されるように肢を直接検査することによってモニターした。ＣＩＡマウスの関節切片において炎症細胞（特に、好中球）の浸潤が示されている（図１０Ｃ）。ＣＩＡマウスは、重篤な歩行困難性を示した（データは示していない）。
【０１２２】
種々のＰＰＳ濃縮物及び組合せを用いて実施した予備実験に基づいて、３種の異なるＰＰＳ（２、４及び１０）を組合せたものについて２ｍｇ／ｋｇという最適濃度を規定し、これを本明細書においてカクテルと呼ぶことにした。この濃度はヒトの治療及び動物モデルにおいて用いられる範囲内である。
【０１２３】
炎症状態の治療には、アンチセンスの滅菌保存液（１００μＭ）を滅菌生理食塩水に所望の濃度で溶解し、病気のマウスにｉ．ｖ．、皮内のいずれかで、尾の基部又は炎症性関節に注射した。
【０１２４】
図１１に示されるように、１４日間毎日、２ｍｇ／ｋｇの「カクテル」の静脈内注射を行うことによって、肢の腫脹の減少（図１１Ａ）、疾患重得度スコア、マウスの運動能力及び自由に走り回る能力の完全回復（データは示していない）並びに血清ＩＬ−６及びＴＮＦαレベルの低減（図１１Ｂ）によっても検出されたように、関節炎の有意な寛解が引き起こされた。
【０１２５】
実施例６
炎症の動物モデル：腹膜炎
モデルマウス腹膜炎は、先に記載したようにＣＤ１マウスへのカンディア（Ｃａｎｄｉａ）の注射［Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ｒ Ａｇｅｎｔｓ ３：５〜１２頁］又は種々の用量のグラム陽性菌の注射によって開発されており、動物死を引き起こし、中程度の用量では中程度の疾患を引き起こすグラム陰性（大腸菌）、細菌（Ｓ．エピデルミチス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｔｉｓ））又は致死量のカンジダで腹膜炎を誘発する。５０％致死量は、Ｓ．エピデルミチスの６×１０８ＣＦＵ及び大腸菌の１．５×１０７ＣＦＵと決定された。感染及び／又は炎症のマーカーは、腹膜炎領域の血液細胞の数及び集団、血中炎症性サイトカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ１及びＩＬ６の濃度、並びに腹膜切片の組織学的解析である。致死量の細菌を注射したマウスを、細菌注射の２時間後にアンチセンスで治療し、その後種々の間隔でアンチセンスを注射する。これらの実験では、マウス生存に対するアンチセンスの効果を評価する。低用量の細菌を注射したマウスについては、アンチセンスの効果（記載したように注射した）を、感染及び／又は炎症マーカーによって病理学的に評価する。
【０１２６】
実施例７
炎症の動物モデル：無菌性腹膜炎
無菌性腹膜炎のモデルは、先に記載されたように、ＩＣＲマウスにおいて３ｍｌの滅菌４％チオグリコレート（ＴＧ）を腹膜内に注射することによって開発された［Ｓｅｇａｌ，Ｂ．Ｈ．ら（２００２）Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ７１：４１０］。炎症の評価は、腹膜炎腔における血液細胞の数及び集団、細胞を含まない腹水中及び血清中のＬＴＢ４の濃度並びに炎症性サイトカイン、ＴＮＦα及びＩＬ６の存在によって調べた。細胞を回収するために、１０ｍｌの滅菌ＰＢＳを腹腔に注射した。細胞数は、トリパンブルー染色した後に顕微鏡によって求めた。細胞集団の構成は、抗マウス好中球に対する抗体（ＭＣＡ７７１Ｆ）、抗マウスマクロファージに対する抗体（Ｆ４／８０）及び抗マウスリンパ球に対する抗体（ＣＤ３）を用い、ＦＡＣＳによって調べた。細胞集団の構成はまた、ギムザ染色した後、顕微鏡下でも調べた。図１２Ａ〜１２Ｂは、４日間の無菌性腹膜炎の間の白血球数（図１２Ａ）及び細胞集団（図１２Ｂ）の変化を示す。ＴＧ注射の２４時間後に高レベルの好中球が検出され、後に単球−マイクロファージに置き換わった。刺激された食細胞のスーパーオキシド生成の有意な上昇があり、最高速度は腹膜炎誘発の２４時間後であった。
【０１２７】
２４時間の無菌性腹膜炎の間の血清中の及び腹腔中のＬＴＢ４レベルは、図１３Ａ〜１３Ｂに示されている。腹膜炎誘発の１時間後、血中ＬＴＢ４レベルの有意な上昇があった。ＬＴＢ４レベルは５時間高く留まり、次いで、８時間後に半分にまで低下した。腹膜炎誘発の１６時間後、ＬＴＢ４は血中に検出できなかった。同様のパターンが腹腔においても観察されたが、減衰はより緩やかであり、２４時間後になってＬＴＢ４は検出されなくなった。
【０１２８】
本結果によれば、文献と一致して、腹膜炎モデルにおいて集積する最初の細胞は好中球であった。したがって、実験の第１のセットでは、無菌性腹膜炎誘発の２４時間後にアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を、主に好中球集積及び活性に対して解析した。滅菌水（０．２ｍｌ）に溶解した２用量のｃＰＬＡ２に対するＰＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の組合せ（「カクテル」）を、腹膜炎誘発の１時間後及び４時間後に、マウスの尾にｉ．ｖ．投与した。図１４Ａ〜１４Ｃ（２個体のマウスの結果）に実証されるように、この治療により、炎症誘発の２４時間後における、腹膜細胞による刺激されたスーパーオキシド生成のわずかな阻害と、腹腔に存在する好中球数の有意な減少（ＦＡＣＳ解析によって検出される細胞数及び細胞集団分布として表される）とが引き起こされた。３４個体の未処置マウスと比較した無菌性腹膜炎を伴う３４個体のマウスの腹膜に補充される好中球の減少及びスーパーオキシド生成に対するカクテルの効果は、図１５Ａ〜１５Ｂに示されている。刺激されていない細胞からのスーパーオキシド放出は極めて重要であるが、これは腹膜腔における腹膜細胞の挙動を反映するからである。したがって、休止細胞からのスーパーオキシドの放出を、感受性の強い方法であって、低レベルのスーパーオキシドを検出できる蛍光プローブジヒドロローダミン−１２３（１ｍＭ）を用いて評価した。図１６の代表的な結果に示されるように、腹膜炎誘発後の２４時間の間のカクテルによる治療は、腹膜細胞によるスーパーオキシドの放出を大幅に減少させた。
【０１２９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド治療の効果は、無菌性腹膜炎の４日間の間、腹膜細胞集団で調べた。補充された好中球数は劇的に減少し、補充されたマクロファージ数は、４日間の腹膜炎の間、治療されたマウスの腹膜において大幅に少なかった（図１７Ａ〜１７Ｂ）。４日間の腹膜炎の間、アンチセンス治療されたマウスの腹膜細胞による、刺激されたスーパーオキシド生成は、未処置のマウスにおけるものよりも大幅に低かった（図１８Ａ〜１８Ｂ）。
【０１３０】
アンチセンスカクテル治療は、腹膜炎誘発後の２４時間の間測定されたように（図１９Ａ〜１９Ｂ）、腹腔のＬＴＢ４レベルを低下させ、腹腔へ補充される好中球の減少と相関していた（図２０Ａ〜２０Ｂ）。
【０１３１】
ｉ．ｖ．注射の２４時間後の腹膜血液細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの集積を、蛍光標識したアンチセンスオリゴヌクレオチド（最後のヌクレオチドでＦＩＴＣで標識した）を用いて検出した（図２１Ａ〜２１Ｂ）。組織切片によって、種々の器官における蛍光アンチセンスオリゴヌクレオチドの分布も解析した（結果は示していない）。さらなる実験では、種々のアンチセンス過剰用量を、その毒性を調べるために投与した。カクテル×１００は、マウスに対して毒性はなかった（データは示していない）。
実施例８
【０１３２】
炎症の動物モデル：以下によって誘発される実験上の急性肺損傷：
１−ＬＰＳ／ザイモサン投与。
マウスに麻酔をかけ、人工呼吸させる。実験の間、酸素ガスを換気システムに連続供給する。静脈内（ｉ．ｖ．）投与の１分前に、２回の深い吸入（３×一回換気量）を行い容積の履歴を標準化させ、測定値をベースラインとする。次いで、マウスに３ｍｇ／ｋｇの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４由来ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をｉ．ｖ．で与える。２時間後、１０ｍｇ／ｋｇのサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｕｉｓｉａｅ）由来ザイモサンＡ（Ｓｉｇｍａ）をｉ．ｖ．投与する。生理食塩水処理群では、ＬＰＳとザイモサンとの代わりに生理食塩水を動物に同様に与え、対照として用いる。全ての群において、３０分間隔で４時間測定を行う。動物の中には、観察期間を６時間に延長したものもあった。肺損傷の発症を生理学的に評価するために、ＥＬ（肺コンプライアンスの逆数）を測定する。気管圧（Ｐｔｒ）、フロー及びボリューム（Ｖ）を測定する。ＥＬ及び肺抵抗（ＲＬ、データは示していない）は、運動方程式を調整することによって算出する：Ｐｔｒ＝ＥＬＶ＋ＲＬ（ｄＶ／ｄｔ）＋Ｋ（式中、Ｋは定数である）。ＥＬの変化は肺柔組織の変化及び肺の硬化を反映する。
【０１３３】
２−ＨＣｌ吸引
ベースライン測定後、麻酔し、人工呼吸したマウスに２ｍｌ／ｋｇのＨＣｌ（ｐＨ＝１．５）をｉ．ｔ．し、続いて空気塊（３０ｍｌ／ｋｇ）を与える。生理食塩水処理群では、動物に、ＨＣｌの代わりに生理食塩水を同様に与え、対照として用いる。全ての群において、測定は３０分間隔で２時間行う。動物の中には、観察期間が５時間までであるものもある。ＥＬ測定値は、急性肺損傷を評価するための生理学的パラメーターである。
肺水腫の評価−実験の最後に、肺湿潤／乾燥質量比を算出し、肺水腫を評価する。切除した肺から閉じ込められた血液を排出した後、肺湿潤質量の測定を行う。次いで、肺を重力対流オーブン中、９０℃で７２時間、一定質量まで加熱し、残渣を肺乾燥質量として計量する。
気管支肺胞洗浄液−実験の最後に、各群において気管支洗浄（ＢＡＬ）を実施する（５×１ｍｌリン酸緩衝生理食塩水を用いて）。各動物において、全注射容積の９０％（４．５ｍｌ）を一貫して回収する。ＢＡＬ液を４５０ｇで１０分間遠心分離した後、細胞画分からＢＡＬ液全体の細胞数及びＢＡＬ液の差次的細胞数を求める。上清はタンパク質含量の測定まで−７０℃で保存する。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いローリー法によって測定する。
トロンボキサン及びロイコトリエン測定は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）キットによって測定する。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡ配列（配列番号７）を示す図であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０の位置が強調表示されている。Ｃ２はヌクレオチド３４７〜３６６を包含し、Ｃ３はヌクレオチド１５５〜１７４を包含し、Ｃ４はヌクレオチド３７９〜３９９を包含し、Ｃ８はヌクレオチド３３０〜３４６を包含し、Ｃ９はヌクレオチド１８３〜２０２を包含し、Ｃ１０はヌクレオチド２９０〜３０６を包含する。
【図２Ａ】２種の抗ｃＰＬＡ２抗体（Ａｂ）間の比較を示す図である。レビー（Ｌｅｖｙ）のＡｂ［Ｈａｚａｎら（１９９７）同書］
【図２Ｂ】２種の抗ｃＰＬＡ２抗体（Ａｂ）間の比較を示す図である。市販の抗体。Ｄｉｌ．＝希釈。
【図３Ａ】ヒト末梢血単球におけるｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。対照並びにアンチセンスＰ１［Ｒｏｓｈａｋ，Ａら（１９９４）同書、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｌ．ら（１９９７）同書、Ｍｕｔｈａｌｉｆ，Ｍ．Ｍ．ら（１９９６）同書、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．ら（１９９７）同書］及びＰ２［Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）同書］と比較した場合における、アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ９及びＣ２＋Ｃ４（２＋４）の組合せで処理した後に抗ｃＰＬＡ２抗体によって検出されるｃＰＬＡ２発現阻害を示すウェスタンブロット解析。種々の処理におけるｃＰＬＡ２のレベルは、密度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）によって定量化し、ウェスタンブロット解析の下に示されている。Ｌｅｖ．＝レベル、ｄｅｎｓ．＝密度測定。
【図３Ｂ】ヒト末梢血単球におけるｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。対照並びにアンチセンスＰ１［Ｍｕｔｈａｌｉｆ，Ｍ．Ｍ．ら（１９９６）同書、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．ら（１９９７）同書］及びＰ２［Ｌｉ，Ｑ．及びＣａｔｈｃａｒｔ，Ｍ．Ｋ．（１９９７）同書］と比較した場合における、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ９及びＣ２＋Ｃ４（２＋４）の組合せによるスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）の阻害を示すヒストグラム。これまでに記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドＰ１及びＰ２に対する、本発明のアンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド（２、３、４及び９と表される）の高い効率に留意することが重要である。
【図４Ａ】末梢血ヒト単球におけるｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。対照並びにオリゴヌクレオチドＩＳ１及びＩＳ２［ＵＳ６，００８，３４４］と比較した場合における、アンチセンス部分ホスホロチオエート化（ＰＰＳ）オリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０並びにＣ３＋Ｃ１０及びＣ８＋Ｃ１０の組合せで処理した後の、抗ｃＰＬＡ２抗体によって検出されるｃＰＬＡ２発現阻害を示すウェスタンブロット解析。種々の処理におけるｃＰＬＡ２のレベルは、密度測定によって定量化し、ウェスタンブロット解析の下に示されている。Ｌｅｖ．＝レベル；ｄｅｎｓ．＝密度測定。
【図４Ｂ】末梢血ヒト単球におけるｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。対照（ｃｏｎｔ．）並びにオリゴヌクレオチドＩＳ１及びＩＳ２［ＵＳ６，００８，３４４］と比較した場合における、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０並びに組合せＣ３＋Ｃ１０及びＣ８＋Ｃ１０によるスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）の阻害を示すヒストグラム。ＵＳ６，００８，３４４に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳ１及びＩＳ２）に対する、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（図中、２、８、９及び１０と表される）の高い効率に留意することが重要である。
【図５Ａ】腹膜マウスマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３及びＣ４並びに組合せＣ３＋Ｃ４で処理した後の、抗ｃＰＬＡ２抗体によって検出されるｃＰＬＡ２発現阻害を示すウェスタンブロット解析。
【図５Ｂ】腹膜マウスマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３及びＣ４並びに組合せＣ３＋Ｃ４によるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図５Ｃ】腹膜マウスマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ１０並びに組合せＣ２＋Ｃ１０、Ｃ３＋Ｃ１０、Ｃ４＋Ｃ１０及びＣ３＋Ｃ４によるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。略語：ｃｏｎｔ．は、対照；ＳＯ ｇｅｎは、スーパーオキシド生成。
【図６】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドで処理した後のｃＰＬＡ２発現（ｅｘｐ．）とスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）の阻害との間の相関を示す図である。Ｃｏｎｔ．＝対照。
【図７Ａ】末梢血ヒト好中球における、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２又はＣ４及び組合せＣ２＋Ｃ４で処理した後の、抗ｃＰＬＡ２抗体によって検出されるｃＰＬＡ２発現阻害を示すウェスタンブロット解析。種々の処理におけるｃＰＬＡ２のレベルは、密度測定によって定量化し、ウェスタンブロット解析の下に示されている。
【図７Ｂ】末梢血ヒト好中球における、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。ＰＭＡ処理後のｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ４又はＣ１０及び組合せＣ２＋Ｃ４、Ｃ２＋Ｃ１０、Ｃ４＋Ｃ１０、Ｃ２＋Ｃ４＋Ｃ１０によるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図７Ｃ】末梢血ヒト好中球における、ｃＰＬＡ２発現及びスーパーオキシド生成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドの効果を示す図である。ＯＺ処理後のｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ４又はＣ１０及び組合せＣ２＋Ｃ４、Ｃ２＋Ｃ１０、Ｃ４＋Ｃ１０、Ｃ２＋Ｃ４＋Ｃ１０によるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。略語：Ｌｅｖ．は、レベル；ｄｅｎｓ．は、密度測定；ｃｏｎｔ．は、対照；ＳＯ ｇｅｎ．は、スーパーオキシド生成。
【図８Ａ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに６時間インキュベートした後の、ＰＭＡ刺激された好中球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図８Ｂ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに４時間インキュベートした後の、ｆＭＬＰ刺激された好中球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図８Ｃ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに４時間インキュベートした後の、ＯＺ刺激された好中球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図８Ｄ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに１６時間インキュベートした後の、ＰＭＡ刺激された単球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図８Ｅ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに１６時間インキュベートした後の、ｆＭＬＰ刺激された単球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラム。
【図８Ｆ】好中球及びマクロファージにおける、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド処理後、生理的アゴニストによって刺激されるスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ３又はＣ４とともに１６時間インキュベートした後の、ＯＺ刺激された単球におけるスーパーオキシド生成の阻害を示すヒストグラムである。略語：ＳＯ ｐｒｏｄ．は、スーパーオキシド生成；Ａｃｔ．は、活性。
【図９Ａ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドによる、ラットミクログリアにおける刺激されたスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドＣ２又はＣ４で処理した後の、抗ｃＰＬＡ２抗体によって検出されるｃＰＬＡ２発現の阻害を示すウェスタンブロット解析。
【図９Ｂ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドによる、ラットミクログリアにおける刺激されたスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ｃＰＬＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドＣ２、Ｃ４、Ｃ８又はＣ１０、及び組合せＣ２＋Ｃ１０又はＣ４＋Ｃ１０で処理した後の、ＰＭＡによって活性化されたラットミクログリア細胞におけるスーパーオキシド生成の阻害の速度論を示すグラフ。
【図９Ｃ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドによる、ラットミクログリアにおける刺激されたスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。ＰＭＡ刺激後のラットミクログリア細胞におけるスーパーオキシド生成に対する、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ８及びＣ１０、並びに組合せＣ２＋Ｃ１０及びＣ４＋Ｃ１０）の効果を示すヒストグラム。
【図９Ｄ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドによる、ラットミクログリアにおける刺激されたスーパーオキシド生成の阻害を示す図である。アミロイドβ刺激後のラットミクログリア細胞におけるスーパーオキシド生成に対する、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ８及びＣ１０、並びに組合せＣ２＋Ｃ１０及びＣ２＋Ｃ４）の効果を示すヒストグラムである。略語：ｒｅｓｔ．は、休止；ａｃｔ．は、活性化；ａｓは、アンチセンス；ｋｉｎ．は、速度論；Ｔ．は、時間；ｍｉｎ．は、分。
【図１０Ａ】コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）の動物モデルを示す図である。対照（ｃｏｎｔ．）マウスと比較した、実験における増悪したＣＩＡの写真。
【図１０Ｂ】コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）の動物モデルを示す図である。対照（ｃｏｎｔ．）と比較した、ＣＩＡマウスの全足の関節組織病理学の代表的な切片の組織学的評価を示す写真（×１００）。
【図１０Ｃ】コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）の動物モデルを示す図である。ＣＩＡマウスにおける炎症細胞の浸潤を示す写真（×４００）。
【図１１Ａ】３種のｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドを組合せたもの（「カクテル」）による治療が引き起こした関節炎の寛解を示す図である。ＣＩＡマウスの腫大した肢（上、ａｒｔ．＝関節炎）及びカクテルで治療した後の肢ＣＩＡマウス（下、ａｓ＝アンチセンス治療）の写真。両写真は同倍率及び動物から同じ距離で撮影した。
【図１１Ｂ】３種のｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドを組合せたもの（「カクテル」）による治療が引き起こした関節炎の寛解を示す図である。カクテルでの静脈内治療後における、血清（ｓｅｒ．）ＩＬ−６及び血清ＴＮＦα及び疾患重篤度スコア（ｄｉｓ．ｓｅｖ．ｓｃ．）の低減。（各群５個体のマウスからの平均±ＳＥＭ）。
【図１２Ａ】無菌性腹膜炎の誘発後の腹膜細胞集団の数及び構成を示す図である。無菌性腹膜炎マウスにおける腹膜細胞数の変化（各群６個体のマウスからの平均±ＳＥＭ）。
【図１２Ｂ】無菌性腹膜炎の誘発後の腹膜細胞集団の数及び構成を示す図である。無菌性腹膜炎マウスにおける腹膜細胞集団の構成の変化。略語：ｃｅ．ｎｏ．は、細胞数；Ｔ．は、時間；ｈは、時；ｎｅｕは、好中球；ｍａｃは、マクロファージ；ｌｙｍｐは、リンパ球。
【図１３Ａ】無菌性腹膜炎の誘発後のＬＴＢ４レベルを示す図である。血清（ｓｅｒ．）におけるＬＴＢ４レベル。
【図１３Ｂ】無菌性腹膜炎の誘発後のＬＴＢ４レベルを示す図である。腹腔（ｐｅｒ．ｃａｖ．）におけるＬＴＢ４レベル。各群５個体のマウスからの平均±ＳＥＭ。Ｔ．は、時間；ｈは、時間。
【図１４Ａ】腹膜細胞集団に対するアンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療の効果及び誘発２４時間後の活性を示す図である。細胞集団（ｃｅ．ｐｏｐ．）構成のＦＡＣＳ分析。Ｎｅｕ＝好中球。
【図１４Ｂ】腹膜細胞集団に対するアンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療の効果及び誘発２４時間後の活性を示す図である。細胞数（ｃｅ．ｃｏ．）を示すグラフ。
【図１４Ｃ】腹膜細胞集団に対するアンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療の効果及び誘発２４時間後の活性を示す図である。対照健常マウス（Ｈ）、無菌性腹膜炎マウス（Ｐ）及びカクテルを静脈内注射した２４時間後の無菌性腹膜炎マウス（Ｐ＋ＡＳ）、の刺激された腹膜細胞によるスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）。
【図１５Ａ】腹膜炎誘発の２４時間後の炎症部位における、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療により低減した好中球数及びスーパーオキシド生成を示す図である。アンチセンス治療を行った好中球（ｎｅｕ）及びその治療を行わなかった好中球（ｎｅｕ）のパーセンテージを示すグラフ。
【図１５Ｂ】腹膜炎誘発の２４時間後の炎症部位における、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療により低減した好中球数及びスーパーオキシド生成を示す図である。アンチセンス治療を行った無菌性腹膜炎マウス及びその治療を行わなかった無菌性腹膜炎マウスから単離された腹膜細胞のＰＭＡによって刺激されたスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）を示すグラフ。
【図１６】腹膜炎誘発の２４時間後の炎症部位における、ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療によって低減した、休止腹膜細胞による刺激されていないスーパーオキシド生成を示す図である。１μＭジヒドロローダミン−１２３を用いて評価した、アンチセンス治療を行った無菌性腹膜炎マウス及びその治療を行わない無菌性腹膜炎マウスから単離された休止腹膜細胞によるスーパーオキシド生成の検出の一例が示されている。Ｃｏ．＝数。
【図１７Ａ】無菌性腹膜炎のマウスにおける、腹膜細胞構成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療の効果を示す図である。無菌性腹膜炎の間の腹膜細胞構成。
【図１７Ｂ】無菌性腹膜炎のマウスにおける、腹膜細胞構成に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療の効果を示す図である。アンチセンス治療後の腹膜細胞構成。略語：ｃｅ．ｎｏ．は、細胞数；Ｔ．は、時間；ｈは、時間；ｎｅｕは、好中球；ｍａｃは、マクロファージ；ｌｙｍｐは、リンパ球。略語：Ｎｅｕは、好中球；ｍａｃは、マクロファージ；ｌｙｍｐは、リンパ球；（各群５個体のマウスからの平均）。
【図１８Ａ】無菌性腹膜炎の間の腹膜細胞による刺激されたスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド治療の効果を示す図である。無菌性腹膜炎のマウスにおける、腹膜細胞による、刺激されたスーパーオキシド生成。
【図１８Ｂ】無菌性腹膜炎の間の腹膜細胞による刺激されたスーパーオキシド生成（ＳＯ ｐｒｏｄ．）に対するｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチド治療の効果を示す図である。無菌性腹膜炎で、アンチセンスオリゴヌクレオチドで治療されたマウスにおける、腹膜細胞による刺激されたスーパーオキシド生成。各群５個体のマウスからの平均±ＳＥＭ。Ｔ．＝時間、ｈ＝時間。
【図１９Ａ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療によって低減した腹膜ＬＴＢ４レベルを示す図である。無菌性腹膜炎マウスの腹膜におけるＬＴＢ４レベル。
【図１９Ｂ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療によって低減した腹膜ＬＴＢ４レベルを示す図である。カクテルで治療した無菌性腹膜炎マウスの腹膜におけるＬＴＢ４レベル。各群５個体のマウスからの平均±ＳＥＭ。Ｔ．＝時間、ｈ＝時間。
【図２０Ａ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療によって低減した腹膜好中球数を示す図である。無菌性腹膜炎マウスの腹膜における好中球数（Ｎｅｕ Ｎｏ）。
【図２０Ｂ】ｃＰＬＡ２アンチセンスＰＰＳオリゴヌクレオチドカクテル治療によって低減した腹膜好中球数を示す図である。カクテルで治療した無菌性腹膜炎マウスの腹膜における好中球数（Ｎｅｕ Ｎｏ）。各群５個体のマウスからの平均±ＳＥＭ。Ｔ．＝時間、ｈ＝時間。
【図２１Ａ】注射の２４時間後の腹膜血液細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの蓄積を示す図である。治療していない腹膜血液細胞。
【図２１Ｂ】注射の２４時間後の腹膜血液細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの蓄積を示す図である。アンチセンス（ａｓ）オリゴヌクレオチドで治療した腹膜血液細胞。上のパネル：光学顕微鏡。下のパネル：共焦点顕微鏡。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、その機能的類似体及び、その誘導体又はその断片であって、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補性は、前記ＯＲＦのヌクレオチド１４５〜４００の間の領域内にあり、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃＰＬＡ２タンパク質の発現を阻害できる、
アンチセンスオリゴヌクレオチド、その機能的類似体及び、その誘導体又はその断片。
【請求項２】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性も阻害できる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレームの５’領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、その機能的類似体及び、その誘導体又はその断片であって、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のいずれか１つによって表される配列を有する、
アンチセンスオリゴヌクレオチド、その機能的類似体及び、その誘導体又はその断片。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜３０までのヌクレオチド長であり、好ましくは、１７〜２１ヌクレオチド長である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドの１０番目のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドは、２−Ｏ−メチル化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
スーパーオキシドの生成及び放出を阻害するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記阻害は、好中球、単球及びマクロファージのうちのいずれか１種、好ましくは、好中球で起こる、請求項８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療のための、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
アルツハイマー病又はパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳虚血損傷及び外傷性頭部損傷からなる群から選択される中枢神経系（ＣＮＳ）関連疾患の治療及び／又は予防のための、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
ｃＰＬＡ２発現と関連している炎症過程の阻害薬として用いる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
炎症状態の治療及び／又は予防に用いる、請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記状態は、関節リウマチ、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患のうちのいずれか１種である、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ミクログリア細胞が活性化され、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出する状態の治療及び／又は予防に用いる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記状態は、炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される、請求項１５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
蛍光標識手段、放射性標識手段、金属粒子標識手段及び任意の適した標識手段のうちの１種で場合によって標識された、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効薬剤として含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも２種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを組合せたものを有効薬剤として含む医薬組成物。
【請求項２０】
前記組合せたものは、以下のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の医薬組成物：配列番号１と配列番号３、又は配列番号１と配列番号２、又は配列番号１と配列番号６、又は配列番号１と配列番号２及び配列番号３、又は配列番号４と配列番号６、又は配列番号２と配列番号６、又は配列番号２と配列番号３、又は配列番号３と配列番号６。
【請求項２１】
医学的に用いる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ｃＰＬＡ２発現及び／又は食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼによるフリーラジカル放出、と関連している炎症過程の治療のための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
炎症状態の治療のための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記状態は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患のうちの１種である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ミクログリア細胞が活性化され、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出する状態の治療及び／又は予防のための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記状態は、炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効薬剤として含む医薬組成物。
【請求項２８】
アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）並びに脳虚血性損傷及び外傷性頭部損傷からなる群から選択されるＣＮＳ関連疾患の治療及び／又は予防のための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
バッファー、添加剤、安定剤、希釈剤及び／又は賦形剤を場合によってさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記状態は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患のうちのいずれか１種である、
炎症状態の治療及び／又は予防に用いる医薬組成物の調製のための、請求項１〜７及び１２〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３１】
ミクログリア細胞が活性化され、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出する状態であって、炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される前記状態、の治療及び／又は予防に用いる医薬組成物の調製のための、請求項１〜７、１５及び１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３２】
ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療のための、請求項１〜７及び１２〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３３】
Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療及び／又は予防のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３４】
神経変性疾患、特に、アルツハイマー病及びパーキンソン病、の治療及び／又は予防のための、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
請求項１〜７及び１２〜１４のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療方法。
【請求項３６】
請求項１〜７及び１２〜１４のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、炎症状態の治療方法。
【請求項３７】
前記炎症状態は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患のうちのいずれか１種である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ミクログリア細胞が活性化され、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出する状態の治療及び／又は予防のための方法であって、
請求項１〜７、１５及び１６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む方法。
【請求項３９】
前記状態が炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療方法。
【請求項４１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病及びパーキンソン病、の治療方法。
【請求項４２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物を、適した時間、細胞と接触させることを含む、ｃＰＬＡ２発現を阻害するｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項４３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物を、適した時間、細胞と接触させることを含む、ｃＰＬＡ２活性を阻害するｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項４４】
前記細胞は、食細胞である、請求項４２及び４３に記載の方法。
【請求項１】
細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、その機能的類似体及び、その誘導体又はその断片であって、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補性は、前記ＯＲＦのヌクレオチド１４５〜４００の間の領域内にあり、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃＰＬＡ２タンパク質の発現を阻害できる、
アンチセンスオリゴヌクレオチド、その機能的類似体及び、その誘導体又はその断片。
【請求項２】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性も阻害できる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）ｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレームの５’領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、その機能的類似体及び、その誘導体又はその断片であって、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のいずれか１つによって表される配列を有する、
アンチセンスオリゴヌクレオチド、その機能的類似体及び、その誘導体又はその断片。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜３０までのヌクレオチド長であり、好ましくは、１７〜２１ヌクレオチド長である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドの１０番目のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドの最初の３ヌクレオチド及び／又は最後の３ヌクレオチドは、２−Ｏ−メチル化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
スーパーオキシドの生成及び放出を阻害するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記阻害は、好中球、単球及びマクロファージのうちのいずれか１種、好ましくは、好中球で起こる、請求項８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療のための、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
アルツハイマー病又はパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳虚血損傷及び外傷性頭部損傷からなる群から選択される中枢神経系（ＣＮＳ）関連疾患の治療及び／又は予防のための、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
ｃＰＬＡ２発現と関連している炎症過程の阻害薬として用いる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
炎症状態の治療及び／又は予防に用いる、請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記状態は、関節リウマチ、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患のうちのいずれか１種である、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ミクログリア細胞が活性化され、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出する状態の治療及び／又は予防に用いる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記状態は、炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される、請求項１５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
蛍光標識手段、放射性標識手段、金属粒子標識手段及び任意の適した標識手段のうちの１種で場合によって標識された、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効薬剤として含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも２種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを組合せたものを有効薬剤として含む医薬組成物。
【請求項２０】
前記組合せたものは、以下のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の医薬組成物：配列番号１と配列番号３、又は配列番号１と配列番号２、又は配列番号１と配列番号６、又は配列番号１と配列番号２及び配列番号３、又は配列番号４と配列番号６、又は配列番号２と配列番号６、又は配列番号２と配列番号３、又は配列番号３と配列番号６。
【請求項２１】
医学的に用いる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ｃＰＬＡ２発現及び／又は食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼによるフリーラジカル放出、と関連している炎症過程の治療のための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
炎症状態の治療のための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記状態は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患のうちの１種である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ミクログリア細胞が活性化され、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出する状態の治療及び／又は予防のための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記状態は、炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効薬剤として含む医薬組成物。
【請求項２８】
アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）並びに脳虚血性損傷及び外傷性頭部損傷からなる群から選択されるＣＮＳ関連疾患の治療及び／又は予防のための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
バッファー、添加剤、安定剤、希釈剤及び／又は賦形剤を場合によってさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記状態は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患のうちのいずれか１種である、
炎症状態の治療及び／又は予防に用いる医薬組成物の調製のための、請求項１〜７及び１２〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３１】
ミクログリア細胞が活性化され、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出する状態であって、炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される前記状態、の治療及び／又は予防に用いる医薬組成物の調製のための、請求項１〜７、１５及び１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３２】
ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療のための、請求項１〜７及び１２〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３３】
Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療及び／又は予防のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３４】
神経変性疾患、特に、アルツハイマー病及びパーキンソン病、の治療及び／又は予防のための、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
請求項１〜７及び１２〜１４のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、ｃＰＬＡ２活性化を伴う状態の治療方法。
【請求項３６】
請求項１〜７及び１２〜１４のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、炎症状態の治療方法。
【請求項３７】
前記炎症状態は、関節リウマチ、ＡＲＤＳ、喘息、鼻炎、特発性肺繊維症、腹膜炎、心血管炎症、心筋虚血、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症、敗血症、外傷、ＩＩ型糖尿病、網膜症、乾癬、胃腸炎症、硬変及び炎症性腸疾患のうちのいずれか１種である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ミクログリア細胞が活性化され、反応性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は炎症誘発性メディエーターを放出する状態の治療及び／又は予防のための方法であって、
請求項１〜７、１５及び１６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む方法。
【請求項３９】
前記状態が炎症、感染及び虚血性疾患からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、Ａβプラーク蓄積と関連している状態の治療方法。
【請求項４１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物の治療上有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病及びパーキンソン病、の治療方法。
【請求項４２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物を、適した時間、細胞と接触させることを含む、ｃＰＬＡ２発現を阻害するｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項４３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含む組成物を、適した時間、細胞と接触させることを含む、ｃＰＬＡ２活性を阻害するｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項４４】
前記細胞は、食細胞である、請求項４２及び４３に記載の方法。
【図１】
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５３３３１８（Ｐ２００７−５３３３１８Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０９０５５（Ｐ２００７−５０９０５５）
【出願日】平成１７年４月１７日（２００５．４．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／０００３９９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０１９６８
【国際公開日】平成１７年１１月３日（２００５．１１．３）
【出願人】（５０６２９５９３１）モル リサーチ アプリケーションズ リミテッド (2)
【出願人】（５０５３０７７７０）ベン−グリオン ユニヴァーシティー オブ ザ ネゲヴ リサーチ アンド デヴェロップメント オーソリティー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月１７日（２００５．４．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／０００３９９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０１９６８
【国際公開日】平成１７年１１月３日（２００５．１１．３）
【出願人】（５０６２９５９３１）モル リサーチ アプリケーションズ リミテッド (2)
【出願人】（５０５３０７７７０）ベン−グリオン ユニヴァーシティー オブ ザ ネゲヴ リサーチ アンド デヴェロップメント オーソリティー (2)
【Ｆターム（参考）】
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