ｐＨ安定性のエンベロープ付きウィルスの生産方法
本発明は、ｐＨ安定性のエンベロープ付きウィルス粒子の生産方法であって、前記ウィルスが低ｐＨ条件下の宿主細胞の感染のために、及び、低ｐＨ条件下の細胞培養細胞でのインキュベーションのために使用される方法、また同様に、細胞培養において高速成長、増加したｐＨ及び温度安定性を示し、かつ、ヒトレセプター特異性を有する、この方法により得られたインフルエンザウィルスに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐＨ安定性のエンベロープ付きウィルスの生産方法であって、前記ウィルスが、低ｐＨの条件下で細胞培養細胞を用いてインキュベーションされる方法を提供する。このようなウィルスは、細胞培養中で高速成長、増加したｐＨ及び温度安定性を示し、かつ、ヒトレセプター特異性を有する、新規インフルエンザウィルスを含む。
【０００２】
背景技術：
ウィルス感染の年間のエピデミックにより引き起こされる疾病の予防には、ワクチン接種が最も重要な公衆衛生手段である。ワクチンの効率的供給は、大量のワクチン材料（例えばウィルス）を迅速に生産することができることに依存している。ワクチンの迅速な開発及びその豊富な入手性は、多くのヒト及び動物疾病を撲滅するのに決定的である。ワクチン生産の遅延及びその量の不足は、疾病の大発生に取り組むにあたり問題を生じることがある。
【０００３】
胚含有（embryonated）ニワトリ卵におけるウィルス、特にインフルエンザウィルスの成長は、インフルエンザウィルス粒子の効率的な生産を生じることが示されてきており、これは、不活化したか又は弱毒化生インフルエンザウィルスワクチン株のいずれかの生産のために使用されることができる。にもかかわらず、過去数年の間に集中的な努力が、細胞培養を使用するウィルス生産システムの確立において為されてきており、というのも、卵を基礎とする方法は、パンデミックの場合に問題となることがある、特異的な病原体−不含卵の安定した供給を必要とするからである。この細胞を基礎とする技術は、卵供給者とは独立した代替的生産方法であり、かつ、種ウィルスが入手可能であるとすぐさま開始されることができる。このことの他に、哺乳類細胞において成長したウィルスから調製された不活化したインフルエンザワクチンは、より多くの交差反応性血清抗体を誘導することが示されており、かつ、卵成長ワクチンよりも良好な保護を明らかにする（Alymova et al., 1998, J Virol 72, 4472-7）。さらに、以前の結果によれば、ヒト単離物のレセプター特異性及び抗原特性は、胚含有ニワトリ卵においてウィルスの成長後に変更される（Mochalova et al., 2003, Virology 313, 473-80, Romanova et al., 2003, Virology 307, 90-7）。
【０００４】
他方では、組織培養におけるウィルスの多重増殖（multiple propagation）は、融合の高められたｐＨを有するＨＡ突然変異体をしばしば生じ（Lin et al., 1997, Virology 233, 402-10）、これは、ウィルスの熱変性に対する減少した安定性と相関している（Ruigrok et al., 1986）。任意のタンパク質の構造及びその安定性は、非共有相互作用、例えば疎水力、ファンデルワールス相互作用、水素結合、及びイオン相互作用を基礎とする。ウィルスの細胞培養への適応の際に生じる突然変異は、ＨＡ分子中の変化したイオン相互作用及び塩架橋のために、減少したタンパク質安定性により誘導される融合のｐＨの閾値を高めることが知られている（Rachakonda et al., 2007, Faseb J 21 , 995-1002）。界面ＨＡ１−ＨＡ２又はＨＡ２−ＨＡ２領域での又はＨＡ２のＮ末端中のいずれかで通常見出される脱安定化突然変異は、次に、細胞表面レセプターに対する減少した結合を生じることができ（Korte et al., 2007, Rachakonda et al., 2007, Faseb J 21 , 995-1002, Shental-Bechor et al., 2002, Biochim Biophys Acta 1565, 81 -9）、これは、生ウィルス調製物の減少したウィルス感染性及び引き続き減少した免疫原性を生じる。
【０００５】
Massaab (Massaab H. F., Journal of Immunology. 1969, 102, pp. 728-732)は、初代ニワトリ腎臓組織培養及び胚含有卵における成長に対する適応前及び後に異なる遺伝子マーカーを使用して低温適応したインフルエンザウィルスの生物学的及び免疫学的な特性を試験した。これら株が、当初の「野生型」株に比較して低ｐＨに対してより感受性であり、かつ、感染性及び赤血球凝集収量における顕著な減少を示したことが言及されている。
【０００６】
Fiszman et al (Journal of Virology, 1974, 13, pp. 801 -808)は、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）に対する低ｐＨ（ｐＨ６．６）の作用を検証し、かつ、ウィルス粒子又はヌクレオキャプシドが検出されなかったことを示した。Ackermann W and Massaab H. F. (Journal of Experimental Medicine FEB 1954, 99, pp 105-117)は、インフルエンザウィルスの成長サイクルの際のウィルス阻害剤、アルファ−アミノ−ｐ−メトキシ−フェニルメタンスルホン酸の作用を開示する。
【０００７】
いかなる安全性及び供給問題をも回避するために、高い安定性及び免疫原性である細胞培養からワクチンウィルス調製物を大量に獲得することの困難性のために、本発明の課題は、効果的かつ安定なウィルスを生じる入手可能な方法を作成することである。この課題は、本願の実施態様の提供により達成される。
【０００８】
本発明は、ウィルス懸濁物の希釈及び宿主細胞感染の間の低下したｐＨ条件を採用することによる、組織培養中でのｐＨ安定性のエンベロープ付きウィルスの生産方法に関する。本発明の方法は、現在使用される方法に由来するウィルス粒子に比較して、増加した安定性及び免疫原性のウィルスも提供する。
【０００９】
図面：
図１：用量６．０ ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／動物で単一鼻腔内免疫化後のフェレットにおいて比較したＷｉｓｃ．ΔＮＳ１及びＷｉｓｃ． ΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒの免疫原性、
図２
Ａ）マウスモデル中での血清抗体の誘導
Ｂ）免疫化したマウスの肺及び鼻甲介（nasal turbinate）中の攻撃ウィルスの生殖（Reproduction）、
図３
Ａ．当初及び突然変異体ウィルスのＨＡ分子の配列比較。部位指向的突然変異生成による２つのヌクレオチド（ａａ）から（ｔｔ）への置換は、ＨＡ２サブユニットの部位５８位でＫからＩのアミノ酸変更を生じた。
Ｂ．ヒト赤血球を用いたＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスの融合活性。
Ｃ．ＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスでの免疫化後のマウス鼻洗浄におけるＩｇＡ抗体力価。
Ｄ．ＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスでの免疫化後のマウス血清におけるＨＡＩ抗体力価。
Ｅ．マウスについてのＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスの感染性、
図４：低ｐＨに向けたウィーン／２８及びウィーン／２８＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒウィルスの感受性。
【００１０】
発明の詳細な説明：
本発明は、以下の工程：
ａ）ｐＨ５．２〜５．９、好ましくは５．４〜５．８、最も好ましくは約５．６を有する溶液中でウィルスを希釈する工程、
ｂ）宿主細胞を少なくとも１の感染性ウィルス粒子で感染させる工程、その際：
ｉ）前記ウィルス粒子を前記細胞に添加する；及び
ｉｉ）前記細胞及びウィルス粒子を、ウィルス／細胞複合体を提供するために、ｐＨ５．２〜５．９、好ましくは５．４〜５．８、最も好ましくは約５．６でインキュベーションする、
ｃ）この感染した宿主細胞をウィルスを増殖させるために培養する工程、
ｄ）前記ウィルスを回収する工程、及び場合により；
ｅ）前記ウィルスを精製及び／又は特性決定する工程
を含むこと特徴とするエンベロープ付きウィルスの生産方法に関する。
【００１１】
前記方法により得られたウィルスは、実験規模量のウィルス生産、また同様にワクチンウィルスの大規模生産のために使用されることができる。
【００１２】
「大規模生産」は、少なくとも２００ｌ、好ましくは少なくとも５００ｌ、好ましくは約１０００ｌの最小培養体積における生産を意味する。
【００１３】
エンベロープ付きウィルスを含有するワクチン調製物は、十分なワクチン接種を提供するために免疫原性でなくてはならない。特に、不活化したパンデミックインフルエンザウィルスワクチン、例えば、トリインフルエンザに対するワクチンは免疫原性が乏しく、かつ、ヒトにおいて保護的抗体応答を誘発するために高用量を必要とすることがある。保護的抗体応答は、ウィルス感染に対する決定的な免疫性を提供する。ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質はインフルエンザウィルスでのウィルス感染により、及び不活化及び生弱毒化流感ワクチン（flu vaccine）の両方でのワクチン接種により誘導される保護的抗体応答の主要な標的である。ＨＡ抗原の構造的統合性（structure integrity）は、保護的抗体応答を誘発するために決定的である。
【００１４】
本発明者らは、本発明の方法が、ｐＨ安定性及び増加した免疫原性を包含するウィルスを提供することを示した。このようにして生産されたウィルス粒子のＨＡタンパク質は、好ましくは低ｐＨで増加した安定性を示す。有利には、このウィルスは、より高温で、具体的には６０℃までの温度で増加した安定性も示すことができる。これらウィルスは、高められた温度、例えば６０℃で数分間から数時間貯蔵された場合ですら、ＨＡの赤血球凝集活性を顕著に失わない。「顕著でない（Not significant）」とは、供給源ウィルスに比較して赤血球凝集活性が４倍より少なく減少したことを意味する。高められた温度への曝露の後でさえ、前記ウィルスは、数週間から数ヶ月０℃〜１２℃、好ましくは４℃の温度で貯蔵される場合に安定性を維持する。したがって、本発明により生産されたウィルスは、安定なＨＡ分子を含むので、ワクチン調製物のために極めて有利である。
【００１５】
前記方法は、具体的には、インフルエンザ、はしか、ムンプス、狂犬病、ＲＳウィルス、エボラ及びハンタウィルスを含むいくつかの重要なヒトの病原体を包含する動物ウィルスの一群であるマイナス鎖ＲＮＡウィルスのために使用されることができる。
【００１６】
これらＲＮＡウィルスのゲノムは、単分子であるか又は分節化していてよく、（−）極性の単鎖であることができる。２つの本質的な要求が、これらウィルス間で共有されている：そのゲノムＲＮＡｓはウィルスＲＮＡ中へと効率的にコピー導入されなくてはならず、この形態は、子孫ウィルス粒子中への組み込みのために使用され、かつ、ウィルスタンパク質へと翻訳されるｍＲＮＡへと転写されることができる。真核性宿主細胞は典型的には、ＲＮＡテンプレートの複製のための又はマイナス鎖のＲＮＡテンプレートからのポリペプチドの翻訳のための機構を含まない。したがって、マイナス鎖のＲＮＡウィルスは、子孫へのアセンブリーのために新規ゲノムＲＮＡの、及び、ウィルスタンパク質への翻訳のためにｍＲＮＡｓの、合成を触媒作用するために、ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしかつ所有する。
【００１７】
ゲノムウィルスＲＮＡは、ウィルスが伝達されるように、ウィルス粒子中へとパッケージされなくてはならない。子孫ウィルス粒子がアセンブリー化されるプロセス及びアセンブリーの間に生じるタンパク質／タンパク質相互作用は、ＲＮＡウィルス間で類似している。ウィルス粒子の形成は、ＲＮＡゲノムを１の宿主細胞から別の宿主細胞へと単一の宿主内で又は異なる宿主生物間で効率的に伝達することを保証する。
【００１８】
ネガティブ−センスゲノムの、エンベロープ付きの、単鎖ＲＮＡを含むウィルス科は、分節化してないゲノムを有する群（パラミクソウィルス科（Paramyxoviridae）、ラブドウィルス科（Rhabdoviridae）、フィロウィルス科（Filoviridae）及びボルナ病ウィルス（Borna Disease Virus）、トガウィルス科（Togaviridae））、又は、分節化ゲノムを有する群（オルトミクソウィルス科（Orthomyxoviridae）、ブンヤウィルス科（Bunyaviridae）及びアレナウィルス科（Arenavihdae））に分類される。オルトミクソウィルス科は、インフルエンザ、タイプＡ、Ｂ及びＣウィルス、また同様にトゴト（Thogoto）及びドリウィルス（Dhori viruse）及び感染性サケ貧血ウィルスのウィルスを含む。
【００１９】
好ましい態様は、インフルエンザウィルス、ＲＳウィルス（ＲＳＶ）、ニューキャッスル疾病ウィルス（ＮＶＤ）、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）及びパラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ）を含むが、これに限定されるものでない。
【００２０】
インフルエンザビリオンは、単鎖ＲＮＡゲノムを含む内側リボ核タンパク質コア（ヘリックス状ヌクレオキャプシド）及びマトリックスタンパク質（Ｍ１）により内部で裏打ちされている外側リポタンパク質エンベロープからなる。インフルエンザＡウィルスの分節化したゲノムは、８つの分子の、線状の、負の極性の、単鎖のＲＮＡｓからなり、このＲＮＡｓは次のものを含めた１１つのポリペプチドをコードする（いくつかのインフルエンザＡ株においては１０つ）：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡ）及び核タンパク質（ＮＰ）、これはヌクレオキャプシドを形成する；マトリックス膜タンパク質（Ｍ１、Ｍ２）；２の表面糖タンパク質、これは脂質含有エンベロープから放出される：ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）；非構造タンパク質（ＮＳ１）及び核輸送タンパク質（ＮＥＰ）。大抵のインフルエンザＡ株は、アポトーシス促進特性を有すると思われている第１１番目のタンパク質（ＰＢ１−Ｆ２）をもコードする。
【００２１】
ゲノムの転写及び複製は、核中で生じ、アセンブリーは形質膜上での出芽を介して生じる。ウィルスは、混合した感染の間に遺伝子を再配列（reassort）することができる。インフルエンザウィルスは、ＨＡを介して、細胞膜糖タンパク質及び糖脂質中のシアリルオリゴ糖に吸着する。ビリオンのエンドサイトーシスに続き、ＨＡ分子中のコンフォメーション変化が細胞エンドソーム内で生じ、これは、膜融合を容易にし、このようにして脱外被を引き起こす。ヌクレオキャプシドは、ウィルスＲＮＡが転写される核へと移動する。ウィルスｍＲＮＡは、ウィルスエンドヌクレアーゼが細胞の非相同ｍＲＮＡｓ（heterologous mRNAs）からキャップ化５′末端を切断する独特の機構により転写され、このｍＲＮＡｓは次いで、ウィルストランスクリプターゼによるウィルスＲＮＡテンプレートの転写のためのプライマーとして機能する。転写産物は、そのテンプレート末端から１５〜２２塩基の部位で終結し、ここではオリゴ（Ｕ）配列がポリ（Ａ）領域（poly(A) tract）の付加のためのシグナルとして機能する。このように生産される８つのウィルスＲＮＡ分子のうち、６つがモノシストトニックメッセージであり、これはＨＡ、ＮＡ、ＮＰを示すタンパク質、及びウィルスポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡ中に直接的に翻訳される。他の２つの転写物はスプライスングを受け、それぞれ２つのｍＲＮＡｓを生じ、これは、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１及びＮＥＰを生産するための異なるリーディングフレームに翻訳される。言い換えると、８つのウィルスＲＮＡ分節は、１１つのタンパク質をコードする：９つの構造的タンパク質及び２つの非構造的タンパク質（ＮＳ１及び最近発見されたＰＢ１−Ｆ２）である。
【００２２】
このウィルスは、天然に発生する株、変異体又は突然変異体から選択されてよい；突然変異作成したウィルス（例えば、突然変異原への曝露、繰り返された継代及び／又は非許容性宿主中への継代により作製される）；再配列物（分節化したウィルスゲノムの場合）；及び／又は遺伝子改変されたウィルス（例えば、「逆遺伝子」技術を使用して）、これは所望のフェノタイプを有する。
【００２３】
「継代させた（passaged）」との用語は、定義されたウィルス粒子数で宿主細胞を接種させ、前記ウィルスを定義された日数、典型的には２〜３日後に回収すること、と定義される。前記ウィルスは、１日につき約２〜４の複製ラウンドを有するはずである。
【００２４】
この分野においては、エピデミックインフルエンザに対する年間（annual）のワクチン接種のためのワクチン株の調製において使用される野生型ウィルスが、世界保健機構（ＷＨＯ）により毎年勧告されることが良く知られている。これら株は次に、再配列ワクチン株の生産のために使用されてよく、これは一般的には、野生型ウィルスのＮＡ及び／又はＨＡ遺伝子を、ドナーウィルス（しばしば、マスタードナーウィルス又はＭＤＶとも呼ばれる）由来のこの残りの遺伝子分節と組み合わせ、これは特定の所望される特徴を有するものである。例えば、ＭＶＤ株は低温適応された（cold-adapted）温度感受性の、弱毒化した、かつ／又は高い成長速度を有してよい。
【００２５】
具体的な一実施態様によれば、インフルエンザウィルスは弱毒化したインフルエンザウィルスである。具体的には、インフルエンザウィルスは、宿主細胞の生得免疫応答を阻害する病原性因子内での欠失又は改変を含む。弱毒は例示的に、低温適応されたウィルス株由来であるか又はＮＳ１遺伝子内の欠失又は改変（ΔＮＳ１ウィルス）のためであってよく、これはWO99/64571及びWO99/64068に説明されるとおりであり、これは参照により全体が本願に組み込まれる。これらウィルスは複製不全であり、というのもこれらは動物の気道において不稔複製を経るからである。代替的に、ウィルスは、ＰＢ１−Ｆ２遺伝子の欠失又は改変を含むことができる。
【００２６】
本発明によれば、前記ウィルスは更に、ＨＡ分子の安定性を増加させることができるＨＡ遺伝子内の改変を更に含んでよい。例えば、Steinhauer et al. (1991 , PNAS. 88: 11525-1152)は、インフルエンザロストックウィルス（Ｈ７Ｎ１）のＨＡ2中のＫ５８Ｉ突然変異が、非突然変異ウィルスに比較して膜融合の減少したｐＨ値の原因であることを同定した。このことは、野生型ウィルスに比較した０．７より低いｐＨでのＨＡの突然変異した形態において酸性ｐＨにより誘導されたＨＡのコンフォメーション変化が生じることを示唆している。Ｘ−３１インフルエンザウィルス（Ｈ３サブタイプ）に対する突然変異の導入により、同じ作用が示されている。
【００２７】
「再配列物」との用語は、ウィルスに関する場合には、このウィルスが、１より多い親ウィルス株又は供給源由来の遺伝的及び／又はポリペプチド成分を含むことを示す。例えば、７：１再配列物は、第１の親ウィルス由来の、７つのウィルスのゲノム分節（又は遺伝子分節）と、第２の親ウィルス由来の、単独の相補ウィルスゲノム分節（これは例えば、ヘマグルチニン又はノイラミニダーゼをコードする）を含む。６：２再配列物は、６つのゲノム分節、最も一般的には６つの内部遺伝子を第１の親ウィルス由来で、そして、２つの相補分節、例えばヘマグルチニン及びノイラミニダーゼを異なる親ウィルス由来で、含む。
【００２８】
具体的には、前記インフルエンザウィルスワクチンは、インターパンデミック又はパンデミックウィルス株、例えばＨ１、Ｈ３又はＢ株のもの由来である。これら株は、本発明による方法により生産される場合に高度に増加した免疫原性を示すことが示されている。
【００２９】
ウィルスの培養のために本発明による方法において使用されることができる細胞は、培養されることができ、かつ、エンベロープ付きウィルス、具体的にはインフルエンザウィルスで感染されることができる任意の所望のタイプの細胞であることができる。具体的には、これは、ＢＳＣ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫウィルス、ＣＶ−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス細胞、ヒト細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＥＫ（トリ胚腎臓）、ＣＥＦ（トリ胚繊維芽細胞）、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｔ−ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳＯ、ＰｅｒＣ６（ヒト網膜細胞）であることができる。
【００３０】
前記ウィルスの希釈のためには、ｐＨ値の範囲、具体的にはｐＨ５．２〜５．９、具体的には５．４〜５．８を提供でき、かつ、細胞にとって生理学的である任意の緩衝液が使用されることができる。例えば、これは、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ−エタンスルホン酸）緩衝液、クエン酸緩衝液又は酢酸緩衝液であることができ、具体的にはＰＢＳを基礎とする緩衝液を使用する。さらに、この希釈溶液に成分が添加されることもでき、例えばこれは、塩、例えば塩化ナトリウム、ジ−ナトリウムヒドロキシ−ホスファート又はカリウムジヒドロキシ−ホスファートその他である。
【００３１】
希釈との用語は、ウィルス懸濁物が、細胞の生産的感染に十分であるウィルス粒子の含量に希釈されることを意味する。
【００３２】
本発明による方法によれば、適した細胞が少なくとも１のウィルス粒子で感染される。十分な感染のために必要なウィルス粒子の数は、当業者により容易に決定されることができる。前記ウィルスを使用した細胞の感染は具体的には、ｍ．ｏ．ｉ（感染多重度）約０．０００１〜１０、好ましくは０．００１〜０．５で実施されることができる。
【００３３】
場合により、マクロライドポリエン抗生物質又は誘導体が、この希釈工程の間に希釈溶液中に及び／又は感染及び／又は培養の間に存在することができる。具体的には、前記抗生物質はアムホテリシンＢ又はその誘導体である。具体的には、前記マクロライドポリエン抗生物質は、感染前に、例えば、感染６０〜３０分前に、より有利には３０分前に添加されることができる。ウィルスインキュベーション又は培養のために使用される抗生物質の最適濃度は、０．２０〜０．５０μｇ／ｍｌ、具体的には０．２５μｇ／ｍｌである。
【００３４】
細胞への、特に細胞レセプターへの結合のためのウィルスのインキュベーションのための温度は２０℃〜３８℃であることができる。インキュベーションのためのｐＨは好ましくは５．４〜５．８である。細胞中へのウィルスの取り込みのために十分な時間の決定のためには、ウィルスは、標準的手順により、例えば染料でのラベル化又は電子顕微鏡により、モニターされることができる。具体的には、この期間は少なくとも５分間〜６０分間、好ましくは２０〜６０分間室温である。
【００３５】
ヘマグルチニンの前駆体タンパク質を切断するプロテアーゼが添加されることができ、かつ、細胞へのウィルスの取り込みは本発明により、インフルエンザウィルスでの細胞の感染の直前、同時又は直後に実施されることができる。この添加が感染と同時に実施される場合には、前記プロテアーゼは、感染すべき細胞培地に直接的に添加されるか、又は、濃縮物としてウィルス接種物と一緒に添加されることができる。前記プロテアーゼは好ましくはセリンプロテアーゼ、特に好ましくはトリプシンである。トリプシンが使用される場合には、この培養培地に添加される終濃度は、好ましくは１〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは５〜３０μｇ／ｍｌである。
【００３６】
感染後に、この感染した細胞培養物をさらにウィルスを複製させるために培養し、特に、最大の細胞変性作用又は最大量のウィルス抗原が検出されることができるまでである。この回収は、代わりに培養の間の任意の時間点であることができる。
【００３７】
宿主細胞の培養のためのｐＨは、例えば、６．５〜７．５であることができる。培養のためのｐＨは、培養のために使用される宿主細胞のｐＨ安定性に依存する。これは、異なるｐＨ条件下での宿主細胞の生存性の試験により決定されることができる。
【００３８】
培養及び増殖との用語は、本発明によれば同じ意味合いを有する。
【００３９】
培養のためには、細胞の培養のために使用可能な任意の培地が適当である。具体的には、この培地は、SFM opti-pro（商標）培地であることができ、腎臓上皮及び関連細胞を発現するウィルスの培養のための低タンパク質培地である。細胞は、２０〜４０℃、具体的には３０〜４０℃の温度で培養されることができる。
【００４０】
ウィルスは宿主細胞中で少なくとも１代（one passage）にわたり継代されることができるが、通常は幾つかの代が必要であり、例えば少なくとも３代である。
【００４１】
この方法の具体的実施態様によれば、この複製したインフルエンザウィルスの回収及び単離は、感染後２〜１０日、好ましくは３〜７日で実施される。細胞又は細胞残留物は、当業者により知られている方法を利用して、培養培地から分離され、回収されることができ、これは例えばセパレーター又はフィルターによる。この濃縮に引き続き、この培養培地中に存在するインフルエンザウィルスは当業者に知られている方法により実施され、これは例えば、勾配遠心分離、濾過、沈殿及びその他である。
【００４２】
本発明者により成功して、エンベロープ付きウィルスの希釈及び低ｐＨ条件下での細胞の感染が、低ｐＨで安定性及び増加した免疫原性を示すエンベロープ付きウィルスを生じることが見出された。これらウィルスは、高められた温度及び／又は高速成長を細胞培養及び／又はヒトレセプター特異性において示すこともできる。これは意外であり、というのも、Scholtissek(1985, Archives Virol., 85, 1-11)は、低ｐＨ値ではインフルエンザウィルスの感染性が不可逆的に失われることを示しているからである。ｐＨ及び熱安定性の間には相関が存在しないことも言及された。
【００４３】
本発明の更なる一実施態様として、例えば、ワクチン接種目的のための種ウィルス又はウィルスとして有用であるインフルエンザウィルスも提供される。前記インフルエンザウィルスは、高められた温度で検出可能な赤血球凝集活性を保持し、ｐＨ範囲５．４〜５．８で安定な感染性を保持し、細胞培養中で高速成長し、かつ、ヒトレセプター特異性を有する。「種ウィルス」は、細胞培養を接種するために使用されるウィルスとして定義される。
【００４４】
本発明の実施態様により検出可能な赤血球凝集活性は、使用される供給源ウィルスに比較して赤血球凝集活性の４倍より多くない減少として定義される。前記供給源ウィルスは、例えば、鼻スワブ（nasal swab）から直接的に単離されたウィルスであることができる。
【００４５】
更なる一実施態様によれば、ワクチンウィルスとして有用であるウィルスが提供されることができる。前記ウィルス粒子は低ｐＨで安定であり、かつ、既知の細胞培養手順により、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ又はＭＤＢＫ細胞から得られるウィルスに比較して同様の又は増加した免疫原性を示す。具体的には、前記ウィルスは、細胞培養において、本発明による方法に曝露されていないウィルスに比較して増加した成長速度を示す。さらに、前記ウィルスは、温度安定性であり、かつ、ヒトレセプター特異性を有する。
【００４６】
本発明による温度安定性は、赤血球凝集活性が６０℃までの温度で１５分間までの期間で顕著に減少しないことを意味する。ｐＨ安定性は、ｐＨ５．６、好ましくは５．４〜５．８、好ましくは５．２〜５．９でのウィルスの安定性として定義される。高速成長は、６ｌｏｇ ＴＣＩＤ ５０／ｍｌまで、好ましくは７ｌｏｇ ＴＣＩＤ ５０／ｍｌ超の成長速度を意味する。
【００４７】
前記ウィルスは、本出願において説明されているとおりの方法により得られることができる。前記ウィルスは特に、ワクチン処方物又は治療用処方物のために有用である。これら処方物中に含有されるインフルエンザウィルスは、弱毒したウィルス又は不活化したウィルスのいずれかであることができる。不活化は、この分野で知られている任意の方法により実施されることができ、例えば、ホルマリン又は死滅したウィルスワクチンの作出において使用される他の剤を用いた処置又は非イオン界面活性剤又はＵＶ光に対する曝露を用いた処置により実施されることができる。インフルエンザウィルス含有調製物は、任意の経路により、例えば、皮下、鼻腔内又は筋肉内に投与されることができる。
【００４８】
代替的に、前記インフルエンザウィルスを含有する調製物は更に、製薬学的に許容可能なキャリアー又はアジュバントであってこの投与された調製物の免疫原性を促進すると知られているものを含むことができる。
【００４９】
好ましくは、前記調製物は、粘膜を介して、具体的には鼻腔内適用により投与され、というのも、これらウィルスは、上で列記した特性、すなわち、ｐＨ安定性、温度安定性、高成長率及びヒトレセプター特異性の結果として、高免疫原性であるからである。
【００５０】
これら特性を含むインフルエンザウィルスは以前に説明も示唆もされない。
【００５１】
上述の説明は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるものである。しかし、このような実施例は、本発明の実施態様の１又は複数を実施する方法を単に代表するものであり、本発明の範囲を限定するものと理解してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、用量６．０ ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／動物で単一鼻腔内免疫化後のフェレットにおいて比較したＷｉｓｃ．ΔＮＳ１及びＷｉｓｃ． ΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒの免疫原性を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、マウスモデル中での血清抗体の誘導を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、免疫化したマウスの肺及び鼻甲介中の攻撃ウィルスの生殖を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、当初及び突然変異体ウィルスのＨＡ分子の配列比較を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒト赤血球を用いたＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスの融合活性を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスでの免疫化後のマウス鼻洗浄におけるＩｇＡ抗体力価を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスでの免疫化後のマウス血清におけるＨＡＩ抗体力価を示す図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、マウスについてのＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスの感染性を示す図である。
【図４】図４は、低ｐＨに向けたウィーン／２８及びウィーン／２８＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒウィルスの感受性を示す図である。
【００５３】
実施例：
実施例１：
エピデミック株由来の表面糖タンパク質を有する２つのインフルエンザ株
Ａ／ウィスコンシン／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）及びＷＨＯワクチン株ＩＶＲ−１１６（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９及びＡ／プエルトリコ／８／３４の再配列物）由来の他の全ての遺伝子を、ＮＳ１オープンリーディングフレームを欠失するＮＳ遺伝子（ΔＮＳ１）と組み合わせて、逆遺伝子学により構築した。得られたウィルスは、ＨＡ分子の配列中の１のアミノ酸置換により異なっており、これは、Ｖｅｒｏ細胞上の異なる継代条件のためである。第１のウィルス、Ｗｉｓｃ．ΔＮＳ１と名付けたものは、低ｐＨ緩衝液を用いたウィルス接種材料の予備処理でもってＶｅｒｏｓ細胞上で常に継代された、すなわち：
このウィルスをＭＥＳ感染緩衝液（０．１Ｍ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2；ｐＨ＝５．６）中で希釈し、これは、適したｍｏｉにまで０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢで補給されていた。Ｖｅｒｏ細胞を感染緩衝液で洗浄し、このウィルス接種材料をこの細胞に適用し、３０分間インキュベーションした。次いで、この接種材料を除去し、細胞を血清不含のＯｐｔｉ−ｐｒｏ培地（０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ及び５μｇ／ｍｌのトリプシンで補給されている）中でインキュベーションした。
【００５４】
この方法は、臨床的スワブ中に見出される当初ウィルスＨＡ配列の保存を生じた。第２のウィルスは、中性条件で標準的手段により増殖され、かつ、ＨＡ２サブユニット中の１の置換を獲得し、すなわち、Ｇ７５Ｒである（第１表）。第１表は、スワブ中に存在するウィルスに比較したＨＡ分子の配列比較を示す。
【００５５】
異なる条件で培養された２のウィルスのＨＡヌクレオチド配列が比較された。ウィルスＷｉｓｃ．ΔＮＳは、ＨＡ分子中のいかなる突然変異も獲得しなかったが、その一方で、ＨＡ２サブユニット中に局在する１の突然変異Ｇ７５ＲがウィルスＷｉｓｃ．ΔＮＳ＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒ中で同定された。
【００５６】
第１表：
【表１】
【００５７】
次に、両方のウィルスを、次の方法により、低ｐＨに向けたその安定性において比較した。前記ウィルスを、ｐＨ範囲５．６〜７．５を有する感染ＭＥＳ緩衝液中で、定義されたｍｏｉを獲得するために希釈し、かつ、このウィルスで細胞を感染させるために、３０分間の引き続くインキュベーションとともに前記Ｖｅｒｏ細胞に適用した。その後で、この接種材料を除去し、細胞を４〜９ｈにわたり３７℃でインキュベーションし（前記株に依存する）、次いで、固定し、このインフルエンザＮＰタンパク質を免疫蛍光法により検出した。
【００５８】
この試験は、ウィルスＷｉｓｃ．ΔＮＳ１が、中性条件と同様の同じ効力でもってｐＨ５．６の細胞感染で安定であるように見え、その一方で、突然変異体ウィルスＷｉｓｃ．ΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｇ７５ＲはｐＨ５．６の細胞感染で細胞を感染させる能力を完全に失いｐＨ５．８でだけ中性条件と同様の同じ効力を有することを明らかにした（結果示さず）。
【００５９】
用量６．０ ｌｏｇ ＴＣＩＤ ５０／動物で単一鼻腔内免疫化後のフェレットにおいてＷｉｓｃ．ΔＮＳ１及びＷｉｓｃ．ΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒウィルスの免疫原性が比較された。この得られた結果は、ＨＡ Ｗｉｓｃ．ΔＮＳ１の完全配列を有するウィルスが、ウィルスＷｉｓｃ．ΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒ（ＧＭＴ２７．９）に比較して、顕著により高い血清抗体力価を誘導したことを実証し、これは、ＨＡＩ試験（ＧＭＴ２０２．９）により測定された。
【００６０】
実施例２：
エピデミック株Ａ／ブリズベン／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）からの表面糖タンパク質を有する２つのＨ１Ｎ１インフルエンザ株及びＷＨＯ株ＩＶＲ−１１６からの他の全ての遺伝子が、ＮＳ１オープンリーディングフレームを欠失するＮＳ遺伝子（ΔＮＳ１）と組み合わせて、逆遺伝子学により構築された。得られたウィルスは、ＨＡ分子の配列中の１のアミノ酸置換により異なっており、これは、Ｖｅｒｏ細胞上の異なる継代条件のためであるように見える。第１のウィルス、ブリズベンΔＮＳ１と名付けられたものを、アムホテリシンＢの存在下で低ｐＨ条件で継代させた。この手順は、ＨＡ配列の保存を生じ、これは、臨床試料からのＭＤＣＫ細胞において単離されたウィルスのものと類似しているように見えた（継代１）。
【００６１】
第２のウィルス、ブリズベンΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｎ１６Ｉと名付けたもの、を標準的方法により継代し、ＨＡ２サブユニット中の１の置換を獲得し、すなわち、Ｎ１６Ｉである（第２表）。第２表は、初期単離物に比較したＨＡ分子の配列比較を示す。
【００６２】
第２表：
【表２】
【００６３】
異なる条件で培養された２のウィルスのＨＡヌクレオチド配列が比較された。ウィルス ブリズベンΔＮＳは、ＨＡ分子中のいかなる突然変異も獲得しなかったが、その一方で、ＨＡ２サブユニット中に局在する１の突然変異Ｎ１６Ｉがウィルス ブリズベンΔＮＳ＿ＨＡ２＿Ｎ１６Ｉ中で同定された。
【００６４】
低ｐＨに向けたウィルス安定性の比較は、ウィルス ブリズベンΔＮＳ１が安定であるように見えることを明らかにした。免疫蛍光アッセイにおいて、同じ量の染色されたＶｅｒｏ細胞を５．６と低いｐＨ及びｐＨ７．５で観察した。突然変異体ウィルス ブリズベンΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｎ１６Ｉは、たったｐＨ５．８であまり安定に細胞を感染せず、ｐＨ５．６では全く感染しなかった。免疫蛍光シグナルは、緩衝液ｐＨ５．６と組み合わせたウィルスで感染させた細胞で可視可能でなかった（結果示さず）。
【００６５】
両方のウィルスの免疫原性を、ウィルス用量５．６ ｌｏｇ ＴＣＩＤ ５０／動物を用いてマウスの単一鼻腔内免疫化後に比較した。この得られた結果は次のことを明らかにした：、ウィルス ブリズベンΔＮＳ１が、ブリズベンΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｎ１６Ｉに比較してより免疫原性であり、より高レベルの血清抗体（ＨＡ１試験により測定）及び動物のより良好な保護を誘導し、これはマウスの肺及び鼻甲介中の攻撃ウィルス（challenge virus）の減少した複製により示唆された（図２Ａ、Ｂ）。図２Ｂは、具体的に、免疫化したマウスの肺及び鼻甲介中の攻撃ウィルスの生殖を開示する。
【００６６】
実施例３：
標準条件でのＶｅｒｏ細胞上のインフルエンザＢ株の培養もまた、ＨＡ分子中の界面ＨＡ１−ＨＡ２又はＨＡ２−ＨＡ２領域のいずれかの脱安定突然変異の様子も生じ、これは、動物モデル中の突然変異ウィルスの減少した安定性及び次には減少した免疫原性に関連している（データ示さず）。
【００６７】
実施例４：
以前に、過去数十年の間に循環した、Ｈ５Ｎ１高度病原性トリウィルスが、ｐＨ５．６を有するヒト鼻洗浄（nasal washings）を用いた処置に耐えないことが見出された。これらは、Ｖｅｒｏ細胞の接種の間に同じｐＨ５．６を有する酸性緩衝液での処置にも耐えなかった。この不安定性の理由が、細胞膜で融合を実施するために、ＨＡ分子がこのコンフォメーションを変更する高ｐＨにあり、これは、Ｈ５Ｎ１ウィルスにとってはｐＨ５．６の値を有するが、一方でヒトウィルスにとってはこれは５．２〜５．４の範囲内にあることが見出された。
【００６８】
Steinhauer et al.は、ＨＡ２中の１の置換、すなわち、Ｈ７Ｎ７ウィルスのＫ５８Ｉが、０．７単位だけ融合のｐＨを顕著に減少できたことを実証している。Ｈ３Ｎ２ウィルス中のこの突然変異の導入は、同様の作用を有した。
【００６９】
この変更は、Ａ／ＶＮ１２０３／０４ΔＮＳ１（Ｈ５Ｎ１）ウィルス（再配列物、ＨＡ、ＮＡ及びＭ遺伝子をＡ／ＶＮ／１２０３／０４から、かつ、ＩＶＲ−１１６ワクチン株から残りの遺伝子を受け継ぎ、ΔＮＳ１遺伝子と組み合わせて）のＨＡタンパク質に対する部位指向した突然変異作成により導入され、レスキューされたウィルスＶＮ１２０３ ＨＡ Ｋ５８Ｉと名付けられた（図３Ａ）。図３Ａは、当初及び突然変異体ウィルスのＨＡ分子の配列比較を示す。
【００７０】
両方のウィルスのＨＡを、トリプシン依存性の様式で改変した。突然変異したウィルスＶＮ１２０３ ＨＡ Ｋ５８Ｉのための融合のｐＨは、ヒト赤血球を用いた溶血実験において０．３単位で減少した（データ示さず）。
【００７１】
さらに、ウィルスＶＮ １２０３ ＨＡ Ｋ５８Ｉは、ｐＨ５．６での感染性の減少した損失を示した。免疫蛍光アッセイにおいて、ほとんど同じ量の染色細胞がｐＨ５．６及び７．５でウィルスＶＮ １２０３ ＨＡ Ｋ５６Ｉを用いて為された感染後に観察され、その一方で、染色細胞は、感染がｐＨ５．６でＶＮ １２０３ウィルスを用いて実施された場合に可視可能でなかった（データ示さず）。
【００７２】
マウスの鼻腔内免疫化後の免疫応答を誘導するための両方のウィルスの能力が比較された。後免疫化４週間後に、マウス血清及び鼻洗浄物（nasal washings）を獲得し、かつ、ＨＡＩ及びＩｇＡ抗体を測定した。図３Ｂに示されるとおり、ＶＮ１２０３ ＨＡ Ｋ５８Ｉウィルスは、当初ＨＡ配列を有するウィルスＶＮ１２０３に比較して、４倍より高い力価のＩｇＡ抗体を誘導した。
【００７３】
図３Ｂは、ＶＮ １２０３及びＶＮ １２０３ Ｋ５８Ｉウィルスを用いた免疫化後のマウス鼻洗浄物におけるＩｇＡ抗体力価を示す。
【００７４】
図３Ｃは、ＶＮ １２０３及びＶＮ １２０３ Ｋ５８Ｉウィルスを用いた免疫化後のマウス血清中のＨＡＩ抗体力価を示す。
【００７５】
低ｐＨに向けた増加したＨＡ安定性が、哺乳類のためのより良好なウィルス感染性を生じることを証明するために、２つの類似する（analogous）再配列物ＶＮ １２０３Ｒ及びＶＮ １２０３Ｒ ＨＡ Ｋ５８Ｉ（コンピテントＮＳ遺伝子を含有する）が構築された。コンピテントＮＳ遺伝子の存在は、免疫コンピテント生物の気道における効率的なウィルス成長のために必要であった。異なる用量で利用されたそれぞれのこれらウィルスを用いた鼻腔内接種後の上方気道中の両方のウィルスのウィルス成長を比較した。突然変異したＨＡ ＶＮ１２０３Ｒ ＨＡ Ｋ５８Ｉを有するウィルスが、非改変ＶＮ １２０３Ｒウィルスの４．５ｌｏｇ ＭＩＤ50に比較してＭＩＤ50値（マウス感染用量−マウスの５０％を感染させる用量）２．５ｌｏｇで上方気道中で成長するマウスにとって１００倍超の感染性であることが見出された（図３Ｅ）。
【００７６】
図３Ｅは、異なる用量での鼻腔内感染後のマウスの上方気道中のウィルスの生殖を示す。
【００７７】
実施例５：熱安定性
酸性接種を用いたウィルスの増殖は、熱不活性化に対するウィルス安定性も保存した。熱安定性は、高められた温度で１５分間でのウィルスのインキュベーション後のウィルス赤血球凝集力価の滴定（titration）により確認された。低ｐＨ接種で培養されたウィルス（ブリズベンΔＮＳ１ Ｈ１Ｎ１、ウィスコンシンΔＮＳ１ Ｈ３Ｎ２、ブリズベンΔＮＳ１ Ｈ３Ｎ３）は、６０℃への曝露後にさえも赤血球凝集活性を保持したことが見出された。標準条件で培養され、ＨＡ中の脱安定突然変異を獲得したウィルス（ニューカレドニアΔＮＳ１＿ＨＡ２＿１１３、ウィスコンシンΔＮＳ１＿ＨＡ＿２１８＿２２５＿７５＿８１Ｈ３Ｎ２）は、６０℃での処置に耐えることができず、１５分間後に赤血球凝集活性を完全に失った（第１表）。トリインフルエンザウィルスに関しては、多塩基性切断部位（トリプシン依存性の様式で）の改変だけを有するＨＡを含有する株が５５℃での処置にさえ耐えなかった（香港１５６ΔＮＳ１ Ｈ５Ｎ１、ＶＮ１２０３（６：２）（Ｈ５Ｎ１）、ＶＮ１２０３ Ｈ５Ｎ１）ことが見出され、処置の１５分間の間に赤血球を凝集させる能力を完全に失った。これらウィルスの閾値は５０℃であった。ＨＡ外部ドメイン（ectodomain）中のＨＡ２サブユニット中の突然変異Ｋ５８Ｉの導入は、５５℃までウィルス安定性を増加させた。
【００７８】
第３表：
【表３】
【００７９】
ヒトインフルエンザウィルス ブリズベンΔＮＳ１ Ｈ１Ｎ１、ウィスコンシンΔＮＳ１ Ｈ３Ｎ２、ブリズベンΔＮＳ１ Ｈ３Ｎ２、ニューカレドニアΔＮＳ１＿ＨＡ２＿１１３、ウィスコンシンΔＮＳ１＿ＨＡ１＿２１８＿２２５＿７５＿８１ Ｈ３Ｎ２を、相応するエピデミックウィルスからの表面抗原ＨＡ及びＮＡ及びＩＶＲ−１１６株由来の他の全ての遺伝子を有する６：２再配列物として獲得した。ＩＶＲ−１１６− Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウィルス由来の表面糖タンパク質を含有する不活化したワクチンの生産のためにＷＨＯにより推奨されている株。全てのウィルスのＮＳ遺伝子は、ＮＳ１オープンリーディングフレームを欠失していた。
【００８０】
トリウィルスを、５；３（ＶＮ１２０３ Ｈ５Ｎ１及びＶＮ １２０３／０４ ＨＡ Ｋ５８Ｉ Ｈ５Ｎ１）又は６：２（ＶＮ１２０３（６：２）Ｈ５Ｎ１）再配列物として獲得し、これは、トリウィルスＡ／ベトナム／１２０３／０４又はＡ／香港／１５６／９７のＨＡ、ＮＡ及びＭ（５：３の場合）遺伝子及びＩＶＲ−１１６株からの他の全ての遺伝子を受け継ぐ。高度病原性トリ株のＨＡ切断部位は、低病原性トリウィルスのものへと置換した。この研究における全てのトリウィルスは、ＮＳ１オープンリーディングフレームを欠失するＮＳ遺伝子を含有した。
【００８１】
実施例６：
エピデミックウィルスＡ／ウィーン／２８／０６（Ｈ３Ｎ２）からのＨＡ及びＮＡ遺伝子を、そして、ＷＨＯ株ＩＶＲ−１１６からの他の全ての遺伝子を、ＮＳ１オープンリーディングフレームを欠失するＮＳ遺伝子（ΔＮＳ１）と組み合わせて含有する２つのインフルエンザ６：２再配列物を、逆遺伝子学により構築した。得られたウィルスは、ＨＡ分子のＨＡ２サブユニットの配列中の１のアミノ酸置換により異なっており、これは、Ｖｅｒｏ細胞上の異なる継代条件のためであるように見える。第１のウィルス、ウィーン／２８と名付けられたものを、ｐＨ６．５を有する培地の存在下で培養し、その一方で、第２のウィルス（ウィーン２８＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒ）を標準条件で培養した。ウィルス ウィーン／２８＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒは、ＨＡ２サブユニット中のＧ７５Ｒの位置でウィーン／２８に比較してＨＡの配列中で異なっており、これは、当初野生型ウィルス中には存在しない。この置換は、ウィーン／２８ウィルスに比較して、低ｐＨでウィーン／２８＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒウィルスの減少した感染性を生じ、これは、酸性緩衝液中のウィルスの予備インキュベーション（３０分間）と引き続く感染力価の滴定により測定された（図４）。
【００８２】
実施例７：
ウィルスＡ／ブリズベン／１０／２００７（卵由来、ＮＩＢＳＣ、ＵＫから取得）を、ＭＤＣＫ及びＶｅｒｏ細胞に対して並行して５回継代させた。５回の継代の後に、両方の生じる変異体は、当初ウィルスに対し、その感染性について異なる値のｐＨで免疫蛍光アッセイにおいて比較された。この得られたデータは、ｐＨ５．６及び中性ｐＨ７．５で同じ効率でもって当初ウィルスＡ／ブリズベン／１０／２００７が細胞を感染させることを明らかに実証した。しかし、相応する細胞株に対する５回の継代後に両方のウィルスは、ｐＨ５．６で細胞感染させる能力を失った。この細胞のポジティブ染色はｐＨ５．８でだけ観察されたが、しかし、ｐＨ５．６を有する緩衝液が使用された場合に染色した細胞は可視可能でなかった（結果示さず）。ＨＡ遺伝子の配列決定は、ＨＡ分子中で位置１６０でＤ→Ｅの同じ突然変異を両方の変異体が獲得したことを明らかにした。
【００８３】
実施例８：
ウィルスＡ／ソロモン諸島／３／０６（卵由来、ＮＩＢＳＣ、ＵＫから取得）を、異なる２つの経路によって為された連続的継代（consecutive passage）によりＶｅｒｏ細胞に適応させた：標準（中性）条件で又は酸性で（ｐＨ５．６での感染）。中性ｐＨで継代した結果物ウィルスは、４．７ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌから６．７ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌへとＶｅｒｏ細胞での成長能を改善したが、しかし、免疫蛍光アッセイにおいてｐＨ５．６で細胞を感染させる能力を失った。染色されていない細胞が、緩衝液ｐＨ５．６と組み合わせたウィルスを用いた細胞の感染後に観察され、その一方で、中性感染では全体的な単層（monolayer）が染色された。酸性条件での感染を用いたＶｅｒｏ細胞上での成長に適応させたウィルスＡ／ソロモン諸島／３／６０は、力価７．６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌに達し、かつ、同時に、低ｐＨ条件で感染性を保存した。免疫蛍光アッセイにおいて、ｐＨ５．６及び７．５での感染後に染色した細胞の同様の分布が観察された。
【００８４】
実施例９：
新規Ｈ１Ｎ１サブタイプのウィルスＡ／カリフォルニア／７／０９（卵由来、ＣＤＣから取得）を、酸性条件で為された幾つかの連続的継代によりＶｅｒｏ細胞に適応させた（ｐＨ５．６での細胞の感染）。結果物ウィルスをＡ／カリフォルニア／７／０９−酸と名付けた。当初の及び適応させたウィルスを、引き続く精製を伴う、バイオリアクター中の少規模（１０Ｌ）生産のために使用した。赤血球凝集力価（ＨＡ）により測定したＡ／カリフォルニア／７／０９−酸ウィルスの収量は、各生産工程後にＡ／カリフォルニア／７／０９ウィルスよりも２〜８倍より高かった。結果は第４表に示される。
【００８５】
第４表：Ａ／カリフォルニア／７／０９及びＡ／カリフォルニア／７／０９−酸ウィルスの収量
【表４】
【００８６】
両方のウィルスを回収し、不活化ワクチンの精製のために使用される標準的手順に応じて精製し、かつ比較した。この得られた結果は、全ての測定したパラメーターにおいて、ウィルスＡ／カリフォルニア／７／０９−酸が、Ａ／カリフォルニア／７／０９に比較してより良好であったことを明らかにした（第５表）。
【００８７】
第５表：Ａ／カリフォルニア／７／０９及びＡ／カリフォルニア／７／０９−酸ウィルスの精製した調製物の比較
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐＨ安定性のエンベロープ付きウィルスの生産方法であって、前記ウィルスが、低ｐＨの条件下で細胞培養細胞を用いてインキュベーションされる方法を提供する。このようなウィルスは、細胞培養中で高速成長、増加したｐＨ及び温度安定性を示し、かつ、ヒトレセプター特異性を有する、新規インフルエンザウィルスを含む。
【０００２】
背景技術：
ウィルス感染の年間のエピデミックにより引き起こされる疾病の予防には、ワクチン接種が最も重要な公衆衛生手段である。ワクチンの効率的供給は、大量のワクチン材料（例えばウィルス）を迅速に生産することができることに依存している。ワクチンの迅速な開発及びその豊富な入手性は、多くのヒト及び動物疾病を撲滅するのに決定的である。ワクチン生産の遅延及びその量の不足は、疾病の大発生に取り組むにあたり問題を生じることがある。
【０００３】
胚含有（embryonated）ニワトリ卵におけるウィルス、特にインフルエンザウィルスの成長は、インフルエンザウィルス粒子の効率的な生産を生じることが示されてきており、これは、不活化したか又は弱毒化生インフルエンザウィルスワクチン株のいずれかの生産のために使用されることができる。にもかかわらず、過去数年の間に集中的な努力が、細胞培養を使用するウィルス生産システムの確立において為されてきており、というのも、卵を基礎とする方法は、パンデミックの場合に問題となることがある、特異的な病原体−不含卵の安定した供給を必要とするからである。この細胞を基礎とする技術は、卵供給者とは独立した代替的生産方法であり、かつ、種ウィルスが入手可能であるとすぐさま開始されることができる。このことの他に、哺乳類細胞において成長したウィルスから調製された不活化したインフルエンザワクチンは、より多くの交差反応性血清抗体を誘導することが示されており、かつ、卵成長ワクチンよりも良好な保護を明らかにする（Alymova et al., 1998, J Virol 72, 4472-7）。さらに、以前の結果によれば、ヒト単離物のレセプター特異性及び抗原特性は、胚含有ニワトリ卵においてウィルスの成長後に変更される（Mochalova et al., 2003, Virology 313, 473-80, Romanova et al., 2003, Virology 307, 90-7）。
【０００４】
他方では、組織培養におけるウィルスの多重増殖（multiple propagation）は、融合の高められたｐＨを有するＨＡ突然変異体をしばしば生じ（Lin et al., 1997, Virology 233, 402-10）、これは、ウィルスの熱変性に対する減少した安定性と相関している（Ruigrok et al., 1986）。任意のタンパク質の構造及びその安定性は、非共有相互作用、例えば疎水力、ファンデルワールス相互作用、水素結合、及びイオン相互作用を基礎とする。ウィルスの細胞培養への適応の際に生じる突然変異は、ＨＡ分子中の変化したイオン相互作用及び塩架橋のために、減少したタンパク質安定性により誘導される融合のｐＨの閾値を高めることが知られている（Rachakonda et al., 2007, Faseb J 21 , 995-1002）。界面ＨＡ１−ＨＡ２又はＨＡ２−ＨＡ２領域での又はＨＡ２のＮ末端中のいずれかで通常見出される脱安定化突然変異は、次に、細胞表面レセプターに対する減少した結合を生じることができ（Korte et al., 2007, Rachakonda et al., 2007, Faseb J 21 , 995-1002, Shental-Bechor et al., 2002, Biochim Biophys Acta 1565, 81 -9）、これは、生ウィルス調製物の減少したウィルス感染性及び引き続き減少した免疫原性を生じる。
【０００５】
Massaab (Massaab H. F., Journal of Immunology. 1969, 102, pp. 728-732)は、初代ニワトリ腎臓組織培養及び胚含有卵における成長に対する適応前及び後に異なる遺伝子マーカーを使用して低温適応したインフルエンザウィルスの生物学的及び免疫学的な特性を試験した。これら株が、当初の「野生型」株に比較して低ｐＨに対してより感受性であり、かつ、感染性及び赤血球凝集収量における顕著な減少を示したことが言及されている。
【０００６】
Fiszman et al (Journal of Virology, 1974, 13, pp. 801 -808)は、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）に対する低ｐＨ（ｐＨ６．６）の作用を検証し、かつ、ウィルス粒子又はヌクレオキャプシドが検出されなかったことを示した。Ackermann W and Massaab H. F. (Journal of Experimental Medicine FEB 1954, 99, pp 105-117)は、インフルエンザウィルスの成長サイクルの際のウィルス阻害剤、アルファ−アミノ−ｐ−メトキシ−フェニルメタンスルホン酸の作用を開示する。
【０００７】
いかなる安全性及び供給問題をも回避するために、高い安定性及び免疫原性である細胞培養からワクチンウィルス調製物を大量に獲得することの困難性のために、本発明の課題は、効果的かつ安定なウィルスを生じる入手可能な方法を作成することである。この課題は、本願の実施態様の提供により達成される。
【０００８】
本発明は、ウィルス懸濁物の希釈及び宿主細胞感染の間の低下したｐＨ条件を採用することによる、組織培養中でのｐＨ安定性のエンベロープ付きウィルスの生産方法に関する。本発明の方法は、現在使用される方法に由来するウィルス粒子に比較して、増加した安定性及び免疫原性のウィルスも提供する。
【０００９】
図面：
図１：用量６．０ ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／動物で単一鼻腔内免疫化後のフェレットにおいて比較したＷｉｓｃ．ΔＮＳ１及びＷｉｓｃ． ΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒの免疫原性、
図２
Ａ）マウスモデル中での血清抗体の誘導
Ｂ）免疫化したマウスの肺及び鼻甲介（nasal turbinate）中の攻撃ウィルスの生殖（Reproduction）、
図３
Ａ．当初及び突然変異体ウィルスのＨＡ分子の配列比較。部位指向的突然変異生成による２つのヌクレオチド（ａａ）から（ｔｔ）への置換は、ＨＡ２サブユニットの部位５８位でＫからＩのアミノ酸変更を生じた。
Ｂ．ヒト赤血球を用いたＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスの融合活性。
Ｃ．ＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスでの免疫化後のマウス鼻洗浄におけるＩｇＡ抗体力価。
Ｄ．ＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスでの免疫化後のマウス血清におけるＨＡＩ抗体力価。
Ｅ．マウスについてのＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスの感染性、
図４：低ｐＨに向けたウィーン／２８及びウィーン／２８＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒウィルスの感受性。
【００１０】
発明の詳細な説明：
本発明は、以下の工程：
ａ）ｐＨ５．２〜５．９、好ましくは５．４〜５．８、最も好ましくは約５．６を有する溶液中でウィルスを希釈する工程、
ｂ）宿主細胞を少なくとも１の感染性ウィルス粒子で感染させる工程、その際：
ｉ）前記ウィルス粒子を前記細胞に添加する；及び
ｉｉ）前記細胞及びウィルス粒子を、ウィルス／細胞複合体を提供するために、ｐＨ５．２〜５．９、好ましくは５．４〜５．８、最も好ましくは約５．６でインキュベーションする、
ｃ）この感染した宿主細胞をウィルスを増殖させるために培養する工程、
ｄ）前記ウィルスを回収する工程、及び場合により；
ｅ）前記ウィルスを精製及び／又は特性決定する工程
を含むこと特徴とするエンベロープ付きウィルスの生産方法に関する。
【００１１】
前記方法により得られたウィルスは、実験規模量のウィルス生産、また同様にワクチンウィルスの大規模生産のために使用されることができる。
【００１２】
「大規模生産」は、少なくとも２００ｌ、好ましくは少なくとも５００ｌ、好ましくは約１０００ｌの最小培養体積における生産を意味する。
【００１３】
エンベロープ付きウィルスを含有するワクチン調製物は、十分なワクチン接種を提供するために免疫原性でなくてはならない。特に、不活化したパンデミックインフルエンザウィルスワクチン、例えば、トリインフルエンザに対するワクチンは免疫原性が乏しく、かつ、ヒトにおいて保護的抗体応答を誘発するために高用量を必要とすることがある。保護的抗体応答は、ウィルス感染に対する決定的な免疫性を提供する。ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質はインフルエンザウィルスでのウィルス感染により、及び不活化及び生弱毒化流感ワクチン（flu vaccine）の両方でのワクチン接種により誘導される保護的抗体応答の主要な標的である。ＨＡ抗原の構造的統合性（structure integrity）は、保護的抗体応答を誘発するために決定的である。
【００１４】
本発明者らは、本発明の方法が、ｐＨ安定性及び増加した免疫原性を包含するウィルスを提供することを示した。このようにして生産されたウィルス粒子のＨＡタンパク質は、好ましくは低ｐＨで増加した安定性を示す。有利には、このウィルスは、より高温で、具体的には６０℃までの温度で増加した安定性も示すことができる。これらウィルスは、高められた温度、例えば６０℃で数分間から数時間貯蔵された場合ですら、ＨＡの赤血球凝集活性を顕著に失わない。「顕著でない（Not significant）」とは、供給源ウィルスに比較して赤血球凝集活性が４倍より少なく減少したことを意味する。高められた温度への曝露の後でさえ、前記ウィルスは、数週間から数ヶ月０℃〜１２℃、好ましくは４℃の温度で貯蔵される場合に安定性を維持する。したがって、本発明により生産されたウィルスは、安定なＨＡ分子を含むので、ワクチン調製物のために極めて有利である。
【００１５】
前記方法は、具体的には、インフルエンザ、はしか、ムンプス、狂犬病、ＲＳウィルス、エボラ及びハンタウィルスを含むいくつかの重要なヒトの病原体を包含する動物ウィルスの一群であるマイナス鎖ＲＮＡウィルスのために使用されることができる。
【００１６】
これらＲＮＡウィルスのゲノムは、単分子であるか又は分節化していてよく、（−）極性の単鎖であることができる。２つの本質的な要求が、これらウィルス間で共有されている：そのゲノムＲＮＡｓはウィルスＲＮＡ中へと効率的にコピー導入されなくてはならず、この形態は、子孫ウィルス粒子中への組み込みのために使用され、かつ、ウィルスタンパク質へと翻訳されるｍＲＮＡへと転写されることができる。真核性宿主細胞は典型的には、ＲＮＡテンプレートの複製のための又はマイナス鎖のＲＮＡテンプレートからのポリペプチドの翻訳のための機構を含まない。したがって、マイナス鎖のＲＮＡウィルスは、子孫へのアセンブリーのために新規ゲノムＲＮＡの、及び、ウィルスタンパク質への翻訳のためにｍＲＮＡｓの、合成を触媒作用するために、ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしかつ所有する。
【００１７】
ゲノムウィルスＲＮＡは、ウィルスが伝達されるように、ウィルス粒子中へとパッケージされなくてはならない。子孫ウィルス粒子がアセンブリー化されるプロセス及びアセンブリーの間に生じるタンパク質／タンパク質相互作用は、ＲＮＡウィルス間で類似している。ウィルス粒子の形成は、ＲＮＡゲノムを１の宿主細胞から別の宿主細胞へと単一の宿主内で又は異なる宿主生物間で効率的に伝達することを保証する。
【００１８】
ネガティブ−センスゲノムの、エンベロープ付きの、単鎖ＲＮＡを含むウィルス科は、分節化してないゲノムを有する群（パラミクソウィルス科（Paramyxoviridae）、ラブドウィルス科（Rhabdoviridae）、フィロウィルス科（Filoviridae）及びボルナ病ウィルス（Borna Disease Virus）、トガウィルス科（Togaviridae））、又は、分節化ゲノムを有する群（オルトミクソウィルス科（Orthomyxoviridae）、ブンヤウィルス科（Bunyaviridae）及びアレナウィルス科（Arenavihdae））に分類される。オルトミクソウィルス科は、インフルエンザ、タイプＡ、Ｂ及びＣウィルス、また同様にトゴト（Thogoto）及びドリウィルス（Dhori viruse）及び感染性サケ貧血ウィルスのウィルスを含む。
【００１９】
好ましい態様は、インフルエンザウィルス、ＲＳウィルス（ＲＳＶ）、ニューキャッスル疾病ウィルス（ＮＶＤ）、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）及びパラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ）を含むが、これに限定されるものでない。
【００２０】
インフルエンザビリオンは、単鎖ＲＮＡゲノムを含む内側リボ核タンパク質コア（ヘリックス状ヌクレオキャプシド）及びマトリックスタンパク質（Ｍ１）により内部で裏打ちされている外側リポタンパク質エンベロープからなる。インフルエンザＡウィルスの分節化したゲノムは、８つの分子の、線状の、負の極性の、単鎖のＲＮＡｓからなり、このＲＮＡｓは次のものを含めた１１つのポリペプチドをコードする（いくつかのインフルエンザＡ株においては１０つ）：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡ）及び核タンパク質（ＮＰ）、これはヌクレオキャプシドを形成する；マトリックス膜タンパク質（Ｍ１、Ｍ２）；２の表面糖タンパク質、これは脂質含有エンベロープから放出される：ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）；非構造タンパク質（ＮＳ１）及び核輸送タンパク質（ＮＥＰ）。大抵のインフルエンザＡ株は、アポトーシス促進特性を有すると思われている第１１番目のタンパク質（ＰＢ１−Ｆ２）をもコードする。
【００２１】
ゲノムの転写及び複製は、核中で生じ、アセンブリーは形質膜上での出芽を介して生じる。ウィルスは、混合した感染の間に遺伝子を再配列（reassort）することができる。インフルエンザウィルスは、ＨＡを介して、細胞膜糖タンパク質及び糖脂質中のシアリルオリゴ糖に吸着する。ビリオンのエンドサイトーシスに続き、ＨＡ分子中のコンフォメーション変化が細胞エンドソーム内で生じ、これは、膜融合を容易にし、このようにして脱外被を引き起こす。ヌクレオキャプシドは、ウィルスＲＮＡが転写される核へと移動する。ウィルスｍＲＮＡは、ウィルスエンドヌクレアーゼが細胞の非相同ｍＲＮＡｓ（heterologous mRNAs）からキャップ化５′末端を切断する独特の機構により転写され、このｍＲＮＡｓは次いで、ウィルストランスクリプターゼによるウィルスＲＮＡテンプレートの転写のためのプライマーとして機能する。転写産物は、そのテンプレート末端から１５〜２２塩基の部位で終結し、ここではオリゴ（Ｕ）配列がポリ（Ａ）領域（poly(A) tract）の付加のためのシグナルとして機能する。このように生産される８つのウィルスＲＮＡ分子のうち、６つがモノシストトニックメッセージであり、これはＨＡ、ＮＡ、ＮＰを示すタンパク質、及びウィルスポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡ中に直接的に翻訳される。他の２つの転写物はスプライスングを受け、それぞれ２つのｍＲＮＡｓを生じ、これは、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１及びＮＥＰを生産するための異なるリーディングフレームに翻訳される。言い換えると、８つのウィルスＲＮＡ分節は、１１つのタンパク質をコードする：９つの構造的タンパク質及び２つの非構造的タンパク質（ＮＳ１及び最近発見されたＰＢ１−Ｆ２）である。
【００２２】
このウィルスは、天然に発生する株、変異体又は突然変異体から選択されてよい；突然変異作成したウィルス（例えば、突然変異原への曝露、繰り返された継代及び／又は非許容性宿主中への継代により作製される）；再配列物（分節化したウィルスゲノムの場合）；及び／又は遺伝子改変されたウィルス（例えば、「逆遺伝子」技術を使用して）、これは所望のフェノタイプを有する。
【００２３】
「継代させた（passaged）」との用語は、定義されたウィルス粒子数で宿主細胞を接種させ、前記ウィルスを定義された日数、典型的には２〜３日後に回収すること、と定義される。前記ウィルスは、１日につき約２〜４の複製ラウンドを有するはずである。
【００２４】
この分野においては、エピデミックインフルエンザに対する年間（annual）のワクチン接種のためのワクチン株の調製において使用される野生型ウィルスが、世界保健機構（ＷＨＯ）により毎年勧告されることが良く知られている。これら株は次に、再配列ワクチン株の生産のために使用されてよく、これは一般的には、野生型ウィルスのＮＡ及び／又はＨＡ遺伝子を、ドナーウィルス（しばしば、マスタードナーウィルス又はＭＤＶとも呼ばれる）由来のこの残りの遺伝子分節と組み合わせ、これは特定の所望される特徴を有するものである。例えば、ＭＶＤ株は低温適応された（cold-adapted）温度感受性の、弱毒化した、かつ／又は高い成長速度を有してよい。
【００２５】
具体的な一実施態様によれば、インフルエンザウィルスは弱毒化したインフルエンザウィルスである。具体的には、インフルエンザウィルスは、宿主細胞の生得免疫応答を阻害する病原性因子内での欠失又は改変を含む。弱毒は例示的に、低温適応されたウィルス株由来であるか又はＮＳ１遺伝子内の欠失又は改変（ΔＮＳ１ウィルス）のためであってよく、これはWO99/64571及びWO99/64068に説明されるとおりであり、これは参照により全体が本願に組み込まれる。これらウィルスは複製不全であり、というのもこれらは動物の気道において不稔複製を経るからである。代替的に、ウィルスは、ＰＢ１−Ｆ２遺伝子の欠失又は改変を含むことができる。
【００２６】
本発明によれば、前記ウィルスは更に、ＨＡ分子の安定性を増加させることができるＨＡ遺伝子内の改変を更に含んでよい。例えば、Steinhauer et al. (1991 , PNAS. 88: 11525-1152)は、インフルエンザロストックウィルス（Ｈ７Ｎ１）のＨＡ2中のＫ５８Ｉ突然変異が、非突然変異ウィルスに比較して膜融合の減少したｐＨ値の原因であることを同定した。このことは、野生型ウィルスに比較した０．７より低いｐＨでのＨＡの突然変異した形態において酸性ｐＨにより誘導されたＨＡのコンフォメーション変化が生じることを示唆している。Ｘ−３１インフルエンザウィルス（Ｈ３サブタイプ）に対する突然変異の導入により、同じ作用が示されている。
【００２７】
「再配列物」との用語は、ウィルスに関する場合には、このウィルスが、１より多い親ウィルス株又は供給源由来の遺伝的及び／又はポリペプチド成分を含むことを示す。例えば、７：１再配列物は、第１の親ウィルス由来の、７つのウィルスのゲノム分節（又は遺伝子分節）と、第２の親ウィルス由来の、単独の相補ウィルスゲノム分節（これは例えば、ヘマグルチニン又はノイラミニダーゼをコードする）を含む。６：２再配列物は、６つのゲノム分節、最も一般的には６つの内部遺伝子を第１の親ウィルス由来で、そして、２つの相補分節、例えばヘマグルチニン及びノイラミニダーゼを異なる親ウィルス由来で、含む。
【００２８】
具体的には、前記インフルエンザウィルスワクチンは、インターパンデミック又はパンデミックウィルス株、例えばＨ１、Ｈ３又はＢ株のもの由来である。これら株は、本発明による方法により生産される場合に高度に増加した免疫原性を示すことが示されている。
【００２９】
ウィルスの培養のために本発明による方法において使用されることができる細胞は、培養されることができ、かつ、エンベロープ付きウィルス、具体的にはインフルエンザウィルスで感染されることができる任意の所望のタイプの細胞であることができる。具体的には、これは、ＢＳＣ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫウィルス、ＣＶ−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス細胞、ヒト細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＥＫ（トリ胚腎臓）、ＣＥＦ（トリ胚繊維芽細胞）、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｔ−ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳＯ、ＰｅｒＣ６（ヒト網膜細胞）であることができる。
【００３０】
前記ウィルスの希釈のためには、ｐＨ値の範囲、具体的にはｐＨ５．２〜５．９、具体的には５．４〜５．８を提供でき、かつ、細胞にとって生理学的である任意の緩衝液が使用されることができる。例えば、これは、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ−エタンスルホン酸）緩衝液、クエン酸緩衝液又は酢酸緩衝液であることができ、具体的にはＰＢＳを基礎とする緩衝液を使用する。さらに、この希釈溶液に成分が添加されることもでき、例えばこれは、塩、例えば塩化ナトリウム、ジ−ナトリウムヒドロキシ−ホスファート又はカリウムジヒドロキシ−ホスファートその他である。
【００３１】
希釈との用語は、ウィルス懸濁物が、細胞の生産的感染に十分であるウィルス粒子の含量に希釈されることを意味する。
【００３２】
本発明による方法によれば、適した細胞が少なくとも１のウィルス粒子で感染される。十分な感染のために必要なウィルス粒子の数は、当業者により容易に決定されることができる。前記ウィルスを使用した細胞の感染は具体的には、ｍ．ｏ．ｉ（感染多重度）約０．０００１〜１０、好ましくは０．００１〜０．５で実施されることができる。
【００３３】
場合により、マクロライドポリエン抗生物質又は誘導体が、この希釈工程の間に希釈溶液中に及び／又は感染及び／又は培養の間に存在することができる。具体的には、前記抗生物質はアムホテリシンＢ又はその誘導体である。具体的には、前記マクロライドポリエン抗生物質は、感染前に、例えば、感染６０〜３０分前に、より有利には３０分前に添加されることができる。ウィルスインキュベーション又は培養のために使用される抗生物質の最適濃度は、０．２０〜０．５０μｇ／ｍｌ、具体的には０．２５μｇ／ｍｌである。
【００３４】
細胞への、特に細胞レセプターへの結合のためのウィルスのインキュベーションのための温度は２０℃〜３８℃であることができる。インキュベーションのためのｐＨは好ましくは５．４〜５．８である。細胞中へのウィルスの取り込みのために十分な時間の決定のためには、ウィルスは、標準的手順により、例えば染料でのラベル化又は電子顕微鏡により、モニターされることができる。具体的には、この期間は少なくとも５分間〜６０分間、好ましくは２０〜６０分間室温である。
【００３５】
ヘマグルチニンの前駆体タンパク質を切断するプロテアーゼが添加されることができ、かつ、細胞へのウィルスの取り込みは本発明により、インフルエンザウィルスでの細胞の感染の直前、同時又は直後に実施されることができる。この添加が感染と同時に実施される場合には、前記プロテアーゼは、感染すべき細胞培地に直接的に添加されるか、又は、濃縮物としてウィルス接種物と一緒に添加されることができる。前記プロテアーゼは好ましくはセリンプロテアーゼ、特に好ましくはトリプシンである。トリプシンが使用される場合には、この培養培地に添加される終濃度は、好ましくは１〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは５〜３０μｇ／ｍｌである。
【００３６】
感染後に、この感染した細胞培養物をさらにウィルスを複製させるために培養し、特に、最大の細胞変性作用又は最大量のウィルス抗原が検出されることができるまでである。この回収は、代わりに培養の間の任意の時間点であることができる。
【００３７】
宿主細胞の培養のためのｐＨは、例えば、６．５〜７．５であることができる。培養のためのｐＨは、培養のために使用される宿主細胞のｐＨ安定性に依存する。これは、異なるｐＨ条件下での宿主細胞の生存性の試験により決定されることができる。
【００３８】
培養及び増殖との用語は、本発明によれば同じ意味合いを有する。
【００３９】
培養のためには、細胞の培養のために使用可能な任意の培地が適当である。具体的には、この培地は、SFM opti-pro（商標）培地であることができ、腎臓上皮及び関連細胞を発現するウィルスの培養のための低タンパク質培地である。細胞は、２０〜４０℃、具体的には３０〜４０℃の温度で培養されることができる。
【００４０】
ウィルスは宿主細胞中で少なくとも１代（one passage）にわたり継代されることができるが、通常は幾つかの代が必要であり、例えば少なくとも３代である。
【００４１】
この方法の具体的実施態様によれば、この複製したインフルエンザウィルスの回収及び単離は、感染後２〜１０日、好ましくは３〜７日で実施される。細胞又は細胞残留物は、当業者により知られている方法を利用して、培養培地から分離され、回収されることができ、これは例えばセパレーター又はフィルターによる。この濃縮に引き続き、この培養培地中に存在するインフルエンザウィルスは当業者に知られている方法により実施され、これは例えば、勾配遠心分離、濾過、沈殿及びその他である。
【００４２】
本発明者により成功して、エンベロープ付きウィルスの希釈及び低ｐＨ条件下での細胞の感染が、低ｐＨで安定性及び増加した免疫原性を示すエンベロープ付きウィルスを生じることが見出された。これらウィルスは、高められた温度及び／又は高速成長を細胞培養及び／又はヒトレセプター特異性において示すこともできる。これは意外であり、というのも、Scholtissek(1985, Archives Virol., 85, 1-11)は、低ｐＨ値ではインフルエンザウィルスの感染性が不可逆的に失われることを示しているからである。ｐＨ及び熱安定性の間には相関が存在しないことも言及された。
【００４３】
本発明の更なる一実施態様として、例えば、ワクチン接種目的のための種ウィルス又はウィルスとして有用であるインフルエンザウィルスも提供される。前記インフルエンザウィルスは、高められた温度で検出可能な赤血球凝集活性を保持し、ｐＨ範囲５．４〜５．８で安定な感染性を保持し、細胞培養中で高速成長し、かつ、ヒトレセプター特異性を有する。「種ウィルス」は、細胞培養を接種するために使用されるウィルスとして定義される。
【００４４】
本発明の実施態様により検出可能な赤血球凝集活性は、使用される供給源ウィルスに比較して赤血球凝集活性の４倍より多くない減少として定義される。前記供給源ウィルスは、例えば、鼻スワブ（nasal swab）から直接的に単離されたウィルスであることができる。
【００４５】
更なる一実施態様によれば、ワクチンウィルスとして有用であるウィルスが提供されることができる。前記ウィルス粒子は低ｐＨで安定であり、かつ、既知の細胞培養手順により、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ又はＭＤＢＫ細胞から得られるウィルスに比較して同様の又は増加した免疫原性を示す。具体的には、前記ウィルスは、細胞培養において、本発明による方法に曝露されていないウィルスに比較して増加した成長速度を示す。さらに、前記ウィルスは、温度安定性であり、かつ、ヒトレセプター特異性を有する。
【００４６】
本発明による温度安定性は、赤血球凝集活性が６０℃までの温度で１５分間までの期間で顕著に減少しないことを意味する。ｐＨ安定性は、ｐＨ５．６、好ましくは５．４〜５．８、好ましくは５．２〜５．９でのウィルスの安定性として定義される。高速成長は、６ｌｏｇ ＴＣＩＤ ５０／ｍｌまで、好ましくは７ｌｏｇ ＴＣＩＤ ５０／ｍｌ超の成長速度を意味する。
【００４７】
前記ウィルスは、本出願において説明されているとおりの方法により得られることができる。前記ウィルスは特に、ワクチン処方物又は治療用処方物のために有用である。これら処方物中に含有されるインフルエンザウィルスは、弱毒したウィルス又は不活化したウィルスのいずれかであることができる。不活化は、この分野で知られている任意の方法により実施されることができ、例えば、ホルマリン又は死滅したウィルスワクチンの作出において使用される他の剤を用いた処置又は非イオン界面活性剤又はＵＶ光に対する曝露を用いた処置により実施されることができる。インフルエンザウィルス含有調製物は、任意の経路により、例えば、皮下、鼻腔内又は筋肉内に投与されることができる。
【００４８】
代替的に、前記インフルエンザウィルスを含有する調製物は更に、製薬学的に許容可能なキャリアー又はアジュバントであってこの投与された調製物の免疫原性を促進すると知られているものを含むことができる。
【００４９】
好ましくは、前記調製物は、粘膜を介して、具体的には鼻腔内適用により投与され、というのも、これらウィルスは、上で列記した特性、すなわち、ｐＨ安定性、温度安定性、高成長率及びヒトレセプター特異性の結果として、高免疫原性であるからである。
【００５０】
これら特性を含むインフルエンザウィルスは以前に説明も示唆もされない。
【００５１】
上述の説明は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるものである。しかし、このような実施例は、本発明の実施態様の１又は複数を実施する方法を単に代表するものであり、本発明の範囲を限定するものと理解してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、用量６．０ ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／動物で単一鼻腔内免疫化後のフェレットにおいて比較したＷｉｓｃ．ΔＮＳ１及びＷｉｓｃ． ΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒの免疫原性を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、マウスモデル中での血清抗体の誘導を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、免疫化したマウスの肺及び鼻甲介中の攻撃ウィルスの生殖を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、当初及び突然変異体ウィルスのＨＡ分子の配列比較を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒト赤血球を用いたＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスの融合活性を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスでの免疫化後のマウス鼻洗浄におけるＩｇＡ抗体力価を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスでの免疫化後のマウス血清におけるＨＡＩ抗体力価を示す図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、マウスについてのＶＮ１２０３及びＶＮ１２０３ Ｋ５８Ｉウィルスの感染性を示す図である。
【図４】図４は、低ｐＨに向けたウィーン／２８及びウィーン／２８＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒウィルスの感受性を示す図である。
【００５３】
実施例：
実施例１：
エピデミック株由来の表面糖タンパク質を有する２つのインフルエンザ株
Ａ／ウィスコンシン／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）及びＷＨＯワクチン株ＩＶＲ−１１６（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９及びＡ／プエルトリコ／８／３４の再配列物）由来の他の全ての遺伝子を、ＮＳ１オープンリーディングフレームを欠失するＮＳ遺伝子（ΔＮＳ１）と組み合わせて、逆遺伝子学により構築した。得られたウィルスは、ＨＡ分子の配列中の１のアミノ酸置換により異なっており、これは、Ｖｅｒｏ細胞上の異なる継代条件のためである。第１のウィルス、Ｗｉｓｃ．ΔＮＳ１と名付けたものは、低ｐＨ緩衝液を用いたウィルス接種材料の予備処理でもってＶｅｒｏｓ細胞上で常に継代された、すなわち：
このウィルスをＭＥＳ感染緩衝液（０．１Ｍ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2；ｐＨ＝５．６）中で希釈し、これは、適したｍｏｉにまで０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢで補給されていた。Ｖｅｒｏ細胞を感染緩衝液で洗浄し、このウィルス接種材料をこの細胞に適用し、３０分間インキュベーションした。次いで、この接種材料を除去し、細胞を血清不含のＯｐｔｉ−ｐｒｏ培地（０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ及び５μｇ／ｍｌのトリプシンで補給されている）中でインキュベーションした。
【００５４】
この方法は、臨床的スワブ中に見出される当初ウィルスＨＡ配列の保存を生じた。第２のウィルスは、中性条件で標準的手段により増殖され、かつ、ＨＡ２サブユニット中の１の置換を獲得し、すなわち、Ｇ７５Ｒである（第１表）。第１表は、スワブ中に存在するウィルスに比較したＨＡ分子の配列比較を示す。
【００５５】
異なる条件で培養された２のウィルスのＨＡヌクレオチド配列が比較された。ウィルスＷｉｓｃ．ΔＮＳは、ＨＡ分子中のいかなる突然変異も獲得しなかったが、その一方で、ＨＡ２サブユニット中に局在する１の突然変異Ｇ７５ＲがウィルスＷｉｓｃ．ΔＮＳ＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒ中で同定された。
【００５６】
第１表：
【表１】
【００５７】
次に、両方のウィルスを、次の方法により、低ｐＨに向けたその安定性において比較した。前記ウィルスを、ｐＨ範囲５．６〜７．５を有する感染ＭＥＳ緩衝液中で、定義されたｍｏｉを獲得するために希釈し、かつ、このウィルスで細胞を感染させるために、３０分間の引き続くインキュベーションとともに前記Ｖｅｒｏ細胞に適用した。その後で、この接種材料を除去し、細胞を４〜９ｈにわたり３７℃でインキュベーションし（前記株に依存する）、次いで、固定し、このインフルエンザＮＰタンパク質を免疫蛍光法により検出した。
【００５８】
この試験は、ウィルスＷｉｓｃ．ΔＮＳ１が、中性条件と同様の同じ効力でもってｐＨ５．６の細胞感染で安定であるように見え、その一方で、突然変異体ウィルスＷｉｓｃ．ΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｇ７５ＲはｐＨ５．６の細胞感染で細胞を感染させる能力を完全に失いｐＨ５．８でだけ中性条件と同様の同じ効力を有することを明らかにした（結果示さず）。
【００５９】
用量６．０ ｌｏｇ ＴＣＩＤ ５０／動物で単一鼻腔内免疫化後のフェレットにおいてＷｉｓｃ．ΔＮＳ１及びＷｉｓｃ．ΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒウィルスの免疫原性が比較された。この得られた結果は、ＨＡ Ｗｉｓｃ．ΔＮＳ１の完全配列を有するウィルスが、ウィルスＷｉｓｃ．ΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒ（ＧＭＴ２７．９）に比較して、顕著により高い血清抗体力価を誘導したことを実証し、これは、ＨＡＩ試験（ＧＭＴ２０２．９）により測定された。
【００６０】
実施例２：
エピデミック株Ａ／ブリズベン／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）からの表面糖タンパク質を有する２つのＨ１Ｎ１インフルエンザ株及びＷＨＯ株ＩＶＲ−１１６からの他の全ての遺伝子が、ＮＳ１オープンリーディングフレームを欠失するＮＳ遺伝子（ΔＮＳ１）と組み合わせて、逆遺伝子学により構築された。得られたウィルスは、ＨＡ分子の配列中の１のアミノ酸置換により異なっており、これは、Ｖｅｒｏ細胞上の異なる継代条件のためであるように見える。第１のウィルス、ブリズベンΔＮＳ１と名付けられたものを、アムホテリシンＢの存在下で低ｐＨ条件で継代させた。この手順は、ＨＡ配列の保存を生じ、これは、臨床試料からのＭＤＣＫ細胞において単離されたウィルスのものと類似しているように見えた（継代１）。
【００６１】
第２のウィルス、ブリズベンΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｎ１６Ｉと名付けたもの、を標準的方法により継代し、ＨＡ２サブユニット中の１の置換を獲得し、すなわち、Ｎ１６Ｉである（第２表）。第２表は、初期単離物に比較したＨＡ分子の配列比較を示す。
【００６２】
第２表：
【表２】
【００６３】
異なる条件で培養された２のウィルスのＨＡヌクレオチド配列が比較された。ウィルス ブリズベンΔＮＳは、ＨＡ分子中のいかなる突然変異も獲得しなかったが、その一方で、ＨＡ２サブユニット中に局在する１の突然変異Ｎ１６Ｉがウィルス ブリズベンΔＮＳ＿ＨＡ２＿Ｎ１６Ｉ中で同定された。
【００６４】
低ｐＨに向けたウィルス安定性の比較は、ウィルス ブリズベンΔＮＳ１が安定であるように見えることを明らかにした。免疫蛍光アッセイにおいて、同じ量の染色されたＶｅｒｏ細胞を５．６と低いｐＨ及びｐＨ７．５で観察した。突然変異体ウィルス ブリズベンΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｎ１６Ｉは、たったｐＨ５．８であまり安定に細胞を感染せず、ｐＨ５．６では全く感染しなかった。免疫蛍光シグナルは、緩衝液ｐＨ５．６と組み合わせたウィルスで感染させた細胞で可視可能でなかった（結果示さず）。
【００６５】
両方のウィルスの免疫原性を、ウィルス用量５．６ ｌｏｇ ＴＣＩＤ ５０／動物を用いてマウスの単一鼻腔内免疫化後に比較した。この得られた結果は次のことを明らかにした：、ウィルス ブリズベンΔＮＳ１が、ブリズベンΔＮＳ１＿ＨＡ２＿Ｎ１６Ｉに比較してより免疫原性であり、より高レベルの血清抗体（ＨＡ１試験により測定）及び動物のより良好な保護を誘導し、これはマウスの肺及び鼻甲介中の攻撃ウィルス（challenge virus）の減少した複製により示唆された（図２Ａ、Ｂ）。図２Ｂは、具体的に、免疫化したマウスの肺及び鼻甲介中の攻撃ウィルスの生殖を開示する。
【００６６】
実施例３：
標準条件でのＶｅｒｏ細胞上のインフルエンザＢ株の培養もまた、ＨＡ分子中の界面ＨＡ１−ＨＡ２又はＨＡ２−ＨＡ２領域のいずれかの脱安定突然変異の様子も生じ、これは、動物モデル中の突然変異ウィルスの減少した安定性及び次には減少した免疫原性に関連している（データ示さず）。
【００６７】
実施例４：
以前に、過去数十年の間に循環した、Ｈ５Ｎ１高度病原性トリウィルスが、ｐＨ５．６を有するヒト鼻洗浄（nasal washings）を用いた処置に耐えないことが見出された。これらは、Ｖｅｒｏ細胞の接種の間に同じｐＨ５．６を有する酸性緩衝液での処置にも耐えなかった。この不安定性の理由が、細胞膜で融合を実施するために、ＨＡ分子がこのコンフォメーションを変更する高ｐＨにあり、これは、Ｈ５Ｎ１ウィルスにとってはｐＨ５．６の値を有するが、一方でヒトウィルスにとってはこれは５．２〜５．４の範囲内にあることが見出された。
【００６８】
Steinhauer et al.は、ＨＡ２中の１の置換、すなわち、Ｈ７Ｎ７ウィルスのＫ５８Ｉが、０．７単位だけ融合のｐＨを顕著に減少できたことを実証している。Ｈ３Ｎ２ウィルス中のこの突然変異の導入は、同様の作用を有した。
【００６９】
この変更は、Ａ／ＶＮ１２０３／０４ΔＮＳ１（Ｈ５Ｎ１）ウィルス（再配列物、ＨＡ、ＮＡ及びＭ遺伝子をＡ／ＶＮ／１２０３／０４から、かつ、ＩＶＲ−１１６ワクチン株から残りの遺伝子を受け継ぎ、ΔＮＳ１遺伝子と組み合わせて）のＨＡタンパク質に対する部位指向した突然変異作成により導入され、レスキューされたウィルスＶＮ１２０３ ＨＡ Ｋ５８Ｉと名付けられた（図３Ａ）。図３Ａは、当初及び突然変異体ウィルスのＨＡ分子の配列比較を示す。
【００７０】
両方のウィルスのＨＡを、トリプシン依存性の様式で改変した。突然変異したウィルスＶＮ１２０３ ＨＡ Ｋ５８Ｉのための融合のｐＨは、ヒト赤血球を用いた溶血実験において０．３単位で減少した（データ示さず）。
【００７１】
さらに、ウィルスＶＮ １２０３ ＨＡ Ｋ５８Ｉは、ｐＨ５．６での感染性の減少した損失を示した。免疫蛍光アッセイにおいて、ほとんど同じ量の染色細胞がｐＨ５．６及び７．５でウィルスＶＮ １２０３ ＨＡ Ｋ５６Ｉを用いて為された感染後に観察され、その一方で、染色細胞は、感染がｐＨ５．６でＶＮ １２０３ウィルスを用いて実施された場合に可視可能でなかった（データ示さず）。
【００７２】
マウスの鼻腔内免疫化後の免疫応答を誘導するための両方のウィルスの能力が比較された。後免疫化４週間後に、マウス血清及び鼻洗浄物（nasal washings）を獲得し、かつ、ＨＡＩ及びＩｇＡ抗体を測定した。図３Ｂに示されるとおり、ＶＮ１２０３ ＨＡ Ｋ５８Ｉウィルスは、当初ＨＡ配列を有するウィルスＶＮ１２０３に比較して、４倍より高い力価のＩｇＡ抗体を誘導した。
【００７３】
図３Ｂは、ＶＮ １２０３及びＶＮ １２０３ Ｋ５８Ｉウィルスを用いた免疫化後のマウス鼻洗浄物におけるＩｇＡ抗体力価を示す。
【００７４】
図３Ｃは、ＶＮ １２０３及びＶＮ １２０３ Ｋ５８Ｉウィルスを用いた免疫化後のマウス血清中のＨＡＩ抗体力価を示す。
【００７５】
低ｐＨに向けた増加したＨＡ安定性が、哺乳類のためのより良好なウィルス感染性を生じることを証明するために、２つの類似する（analogous）再配列物ＶＮ １２０３Ｒ及びＶＮ １２０３Ｒ ＨＡ Ｋ５８Ｉ（コンピテントＮＳ遺伝子を含有する）が構築された。コンピテントＮＳ遺伝子の存在は、免疫コンピテント生物の気道における効率的なウィルス成長のために必要であった。異なる用量で利用されたそれぞれのこれらウィルスを用いた鼻腔内接種後の上方気道中の両方のウィルスのウィルス成長を比較した。突然変異したＨＡ ＶＮ１２０３Ｒ ＨＡ Ｋ５８Ｉを有するウィルスが、非改変ＶＮ １２０３Ｒウィルスの４．５ｌｏｇ ＭＩＤ50に比較してＭＩＤ50値（マウス感染用量−マウスの５０％を感染させる用量）２．５ｌｏｇで上方気道中で成長するマウスにとって１００倍超の感染性であることが見出された（図３Ｅ）。
【００７６】
図３Ｅは、異なる用量での鼻腔内感染後のマウスの上方気道中のウィルスの生殖を示す。
【００７７】
実施例５：熱安定性
酸性接種を用いたウィルスの増殖は、熱不活性化に対するウィルス安定性も保存した。熱安定性は、高められた温度で１５分間でのウィルスのインキュベーション後のウィルス赤血球凝集力価の滴定（titration）により確認された。低ｐＨ接種で培養されたウィルス（ブリズベンΔＮＳ１ Ｈ１Ｎ１、ウィスコンシンΔＮＳ１ Ｈ３Ｎ２、ブリズベンΔＮＳ１ Ｈ３Ｎ３）は、６０℃への曝露後にさえも赤血球凝集活性を保持したことが見出された。標準条件で培養され、ＨＡ中の脱安定突然変異を獲得したウィルス（ニューカレドニアΔＮＳ１＿ＨＡ２＿１１３、ウィスコンシンΔＮＳ１＿ＨＡ＿２１８＿２２５＿７５＿８１Ｈ３Ｎ２）は、６０℃での処置に耐えることができず、１５分間後に赤血球凝集活性を完全に失った（第１表）。トリインフルエンザウィルスに関しては、多塩基性切断部位（トリプシン依存性の様式で）の改変だけを有するＨＡを含有する株が５５℃での処置にさえ耐えなかった（香港１５６ΔＮＳ１ Ｈ５Ｎ１、ＶＮ１２０３（６：２）（Ｈ５Ｎ１）、ＶＮ１２０３ Ｈ５Ｎ１）ことが見出され、処置の１５分間の間に赤血球を凝集させる能力を完全に失った。これらウィルスの閾値は５０℃であった。ＨＡ外部ドメイン（ectodomain）中のＨＡ２サブユニット中の突然変異Ｋ５８Ｉの導入は、５５℃までウィルス安定性を増加させた。
【００７８】
第３表：
【表３】
【００７９】
ヒトインフルエンザウィルス ブリズベンΔＮＳ１ Ｈ１Ｎ１、ウィスコンシンΔＮＳ１ Ｈ３Ｎ２、ブリズベンΔＮＳ１ Ｈ３Ｎ２、ニューカレドニアΔＮＳ１＿ＨＡ２＿１１３、ウィスコンシンΔＮＳ１＿ＨＡ１＿２１８＿２２５＿７５＿８１ Ｈ３Ｎ２を、相応するエピデミックウィルスからの表面抗原ＨＡ及びＮＡ及びＩＶＲ−１１６株由来の他の全ての遺伝子を有する６：２再配列物として獲得した。ＩＶＲ−１１６− Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウィルス由来の表面糖タンパク質を含有する不活化したワクチンの生産のためにＷＨＯにより推奨されている株。全てのウィルスのＮＳ遺伝子は、ＮＳ１オープンリーディングフレームを欠失していた。
【００８０】
トリウィルスを、５；３（ＶＮ１２０３ Ｈ５Ｎ１及びＶＮ １２０３／０４ ＨＡ Ｋ５８Ｉ Ｈ５Ｎ１）又は６：２（ＶＮ１２０３（６：２）Ｈ５Ｎ１）再配列物として獲得し、これは、トリウィルスＡ／ベトナム／１２０３／０４又はＡ／香港／１５６／９７のＨＡ、ＮＡ及びＭ（５：３の場合）遺伝子及びＩＶＲ−１１６株からの他の全ての遺伝子を受け継ぐ。高度病原性トリ株のＨＡ切断部位は、低病原性トリウィルスのものへと置換した。この研究における全てのトリウィルスは、ＮＳ１オープンリーディングフレームを欠失するＮＳ遺伝子を含有した。
【００８１】
実施例６：
エピデミックウィルスＡ／ウィーン／２８／０６（Ｈ３Ｎ２）からのＨＡ及びＮＡ遺伝子を、そして、ＷＨＯ株ＩＶＲ−１１６からの他の全ての遺伝子を、ＮＳ１オープンリーディングフレームを欠失するＮＳ遺伝子（ΔＮＳ１）と組み合わせて含有する２つのインフルエンザ６：２再配列物を、逆遺伝子学により構築した。得られたウィルスは、ＨＡ分子のＨＡ２サブユニットの配列中の１のアミノ酸置換により異なっており、これは、Ｖｅｒｏ細胞上の異なる継代条件のためであるように見える。第１のウィルス、ウィーン／２８と名付けられたものを、ｐＨ６．５を有する培地の存在下で培養し、その一方で、第２のウィルス（ウィーン２８＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒ）を標準条件で培養した。ウィルス ウィーン／２８＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒは、ＨＡ２サブユニット中のＧ７５Ｒの位置でウィーン／２８に比較してＨＡの配列中で異なっており、これは、当初野生型ウィルス中には存在しない。この置換は、ウィーン／２８ウィルスに比較して、低ｐＨでウィーン／２８＿ＨＡ２＿Ｇ７５Ｒウィルスの減少した感染性を生じ、これは、酸性緩衝液中のウィルスの予備インキュベーション（３０分間）と引き続く感染力価の滴定により測定された（図４）。
【００８２】
実施例７：
ウィルスＡ／ブリズベン／１０／２００７（卵由来、ＮＩＢＳＣ、ＵＫから取得）を、ＭＤＣＫ及びＶｅｒｏ細胞に対して並行して５回継代させた。５回の継代の後に、両方の生じる変異体は、当初ウィルスに対し、その感染性について異なる値のｐＨで免疫蛍光アッセイにおいて比較された。この得られたデータは、ｐＨ５．６及び中性ｐＨ７．５で同じ効率でもって当初ウィルスＡ／ブリズベン／１０／２００７が細胞を感染させることを明らかに実証した。しかし、相応する細胞株に対する５回の継代後に両方のウィルスは、ｐＨ５．６で細胞感染させる能力を失った。この細胞のポジティブ染色はｐＨ５．８でだけ観察されたが、しかし、ｐＨ５．６を有する緩衝液が使用された場合に染色した細胞は可視可能でなかった（結果示さず）。ＨＡ遺伝子の配列決定は、ＨＡ分子中で位置１６０でＤ→Ｅの同じ突然変異を両方の変異体が獲得したことを明らかにした。
【００８３】
実施例８：
ウィルスＡ／ソロモン諸島／３／０６（卵由来、ＮＩＢＳＣ、ＵＫから取得）を、異なる２つの経路によって為された連続的継代（consecutive passage）によりＶｅｒｏ細胞に適応させた：標準（中性）条件で又は酸性で（ｐＨ５．６での感染）。中性ｐＨで継代した結果物ウィルスは、４．７ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌから６．７ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌへとＶｅｒｏ細胞での成長能を改善したが、しかし、免疫蛍光アッセイにおいてｐＨ５．６で細胞を感染させる能力を失った。染色されていない細胞が、緩衝液ｐＨ５．６と組み合わせたウィルスを用いた細胞の感染後に観察され、その一方で、中性感染では全体的な単層（monolayer）が染色された。酸性条件での感染を用いたＶｅｒｏ細胞上での成長に適応させたウィルスＡ／ソロモン諸島／３／６０は、力価７．６ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０／ｍｌに達し、かつ、同時に、低ｐＨ条件で感染性を保存した。免疫蛍光アッセイにおいて、ｐＨ５．６及び７．５での感染後に染色した細胞の同様の分布が観察された。
【００８４】
実施例９：
新規Ｈ１Ｎ１サブタイプのウィルスＡ／カリフォルニア／７／０９（卵由来、ＣＤＣから取得）を、酸性条件で為された幾つかの連続的継代によりＶｅｒｏ細胞に適応させた（ｐＨ５．６での細胞の感染）。結果物ウィルスをＡ／カリフォルニア／７／０９−酸と名付けた。当初の及び適応させたウィルスを、引き続く精製を伴う、バイオリアクター中の少規模（１０Ｌ）生産のために使用した。赤血球凝集力価（ＨＡ）により測定したＡ／カリフォルニア／７／０９−酸ウィルスの収量は、各生産工程後にＡ／カリフォルニア／７／０９ウィルスよりも２〜８倍より高かった。結果は第４表に示される。
【００８５】
第４表：Ａ／カリフォルニア／７／０９及びＡ／カリフォルニア／７／０９−酸ウィルスの収量
【表４】
【００８６】
両方のウィルスを回収し、不活化ワクチンの精製のために使用される標準的手順に応じて精製し、かつ比較した。この得られた結果は、全ての測定したパラメーターにおいて、ウィルスＡ／カリフォルニア／７／０９−酸が、Ａ／カリフォルニア／７／０９に比較してより良好であったことを明らかにした（第５表）。
【００８７】
第５表：Ａ／カリフォルニア／７／０９及びＡ／カリフォルニア／７／０９−酸ウィルスの精製した調製物の比較
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）ｐＨ５．２〜５．９、好ましくは５．５〜５．８、最も好ましくは約５．６を有する溶液中にウィルスを希釈する工程、
ｂ）宿主細胞を少なくとも１の感染性ウィルス粒子で感染させる工程、その際：
ｉ）このウィルス粒子を前記細胞に添加する；及び
ｉｉ）前記細胞及び前記ウィルス粒子を、ウィルス／細胞複合体を提供するために、ｐＨ５．２〜５．９、好ましくは５．５〜５．８、最も好ましくは約５．６でインキュベーションする、
ｃ）この感染した宿主細胞を、ウィルスを増殖させるために培養する工程、
ｄ）このウィルスを回収する工程；及び
ｅ）場合により、このウィルスを精製及び／又は特性決定する工程
を含むこと特徴とするインフルエンザウィルスの生産方法。
【請求項２】
マクロライドポリエン抗生物質又は誘導体が添加され、好ましくはアムホテリシンＢであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞が組織培養細胞であり、好ましくはＢＳＣ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス細胞、ヒト細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｔ−ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０、ＰｅｒＣ６からなる群から選択されていることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ウィルスがインフルエンザＡ、Ｂ又はＣであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
インフルエンザウィルスが弱毒化したインフルエンザウィルスであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
インフルエンザウィルスが、ＮＳ１遺伝子内での欠失又は改変を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
インフルエンザウィルスが低温適応したウィルスであることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ウィルスが、ｐＨ値の範囲を提供することができ、かつ、細胞にとって生理学的である緩衝液中で希釈され、好ましくはこれが、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液及び酢酸緩衝液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
培養培地が、細胞を培養するために使用され、かつ、この培養培地が好ましくはSFM opti-pro（商標）培地であることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ウィルスが、少なくとも１代にわたり宿主細胞中で継代されることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ウィルスが赤血球凝集活性を高められた温度で保持し、５．５〜５．８のｐＨ範囲で感染性を保持し、細胞培養において高速成長であり、好ましくはヒトレセプター特異性を有することを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項記載の方法により得られるインフルエンザウィルス。
【請求項１２】
種ウィルスとしての、請求項１１記載のインフルエンザウィルスを含有するエンベロープ付きウィルス粒子の使用。
【請求項１３】
ワクチンウィルスの大規模生産のための、請求項１１又は１２記載のインフルエンザウィルスを含有するエンベロープ付きウィルス粒子の使用。
【請求項１４】
請求項１１記載のインフルエンザウィルス及び製薬学的に許容可能なキャリアー又はアジュバントを含有する、ワクチン接種又はウィルス疾病の治療に有用な組成物。
【請求項１】
以下の工程：
ａ）ｐＨ５．２〜５．９、好ましくは５．５〜５．８、最も好ましくは約５．６を有する溶液中にウィルスを希釈する工程、
ｂ）宿主細胞を少なくとも１の感染性ウィルス粒子で感染させる工程、その際：
ｉ）このウィルス粒子を前記細胞に添加する；及び
ｉｉ）前記細胞及び前記ウィルス粒子を、ウィルス／細胞複合体を提供するために、ｐＨ５．２〜５．９、好ましくは５．５〜５．８、最も好ましくは約５．６でインキュベーションする、
ｃ）この感染した宿主細胞を、ウィルスを増殖させるために培養する工程、
ｄ）このウィルスを回収する工程；及び
ｅ）場合により、このウィルスを精製及び／又は特性決定する工程
を含むこと特徴とするインフルエンザウィルスの生産方法。
【請求項２】
マクロライドポリエン抗生物質又は誘導体が添加され、好ましくはアムホテリシンＢであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞が組織培養細胞であり、好ましくはＢＳＣ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス細胞、ヒト細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｔ−ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０、ＰｅｒＣ６からなる群から選択されていることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ウィルスがインフルエンザＡ、Ｂ又はＣであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
インフルエンザウィルスが弱毒化したインフルエンザウィルスであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
インフルエンザウィルスが、ＮＳ１遺伝子内での欠失又は改変を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
インフルエンザウィルスが低温適応したウィルスであることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ウィルスが、ｐＨ値の範囲を提供することができ、かつ、細胞にとって生理学的である緩衝液中で希釈され、好ましくはこれが、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液及び酢酸緩衝液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
培養培地が、細胞を培養するために使用され、かつ、この培養培地が好ましくはSFM opti-pro（商標）培地であることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ウィルスが、少なくとも１代にわたり宿主細胞中で継代されることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ウィルスが赤血球凝集活性を高められた温度で保持し、５．５〜５．８のｐＨ範囲で感染性を保持し、細胞培養において高速成長であり、好ましくはヒトレセプター特異性を有することを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項記載の方法により得られるインフルエンザウィルス。
【請求項１２】
種ウィルスとしての、請求項１１記載のインフルエンザウィルスを含有するエンベロープ付きウィルス粒子の使用。
【請求項１３】
ワクチンウィルスの大規模生産のための、請求項１１又は１２記載のインフルエンザウィルスを含有するエンベロープ付きウィルス粒子の使用。
【請求項１４】
請求項１１記載のインフルエンザウィルス及び製薬学的に許容可能なキャリアー又はアジュバントを含有する、ワクチン接種又はウィルス疾病の治療に有用な組成物。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５０９６８４（Ｐ２０１２−５０９６８４Ａ）
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３７９６２（Ｐ２０１１−５３７９６２）
【出願日】平成２１年１１月２５日（２００９．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５８１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６０９２１
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（５１０１７３０３０）アヴィール グリーン ヒルズ バイオテクノロジー リサーチ ディベロプメント トレード アクチエンゲゼルシャフト (3)
【氏名又は名称原語表記】ＡＶＩＲ Ｇｒｅｅｎ Ｈｉｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｒａｄｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｆｏｒｓｔｈａｕｓｇａｓｓｅ １１， Ａ−１２００ Ｗｉｅｎ， Ａｕｓｔｒｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２５日（２００９．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５８１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６０９２１
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（５１０１７３０３０）アヴィール グリーン ヒルズ バイオテクノロジー リサーチ ディベロプメント トレード アクチエンゲゼルシャフト (3)
【氏名又は名称原語表記】ＡＶＩＲ Ｇｒｅｅｎ Ｈｉｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｒａｄｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｆｏｒｓｔｈａｕｓｇａｓｓｅ １１， Ａ−１２００ Ｗｉｅｎ， Ａｕｓｔｒｉａ
【Ｆターム（参考）】
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