γ−カルボキシル化タンパク質の製造方法
本発明は、大量のγ−カルボキシル化されたタンパク質の製造のための方法およびツールであって、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたタンパク質を単離すること、を含む前記方法およびツールに関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
技術分野
本発明は、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、ならびにγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、高収率でのγ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の製造方法にも関する。
【０００２】
背景技術
出血は臨床の一般的な問題である。それは疾患、外傷、手術および医療処置の帰結である。出血を物理的に止めることは欠かせない。出血の場所によっては、またはそれが多くの（小）血管から拡散する場合には、これが困難となるか不可能にすらなる場合がある。そこで、出血している患者は、止血をサポートする薬剤による処置を必要とする場合がある。これは、血液由来製剤（血液療法）、内因性止血剤の放出を引き起こす薬剤、組み替え凝固因子（Ｆ）、または凝血塊の溶解を遅延させる薬剤であってもよい。
【０００３】
血液由来製剤の中で、しばしば地方の病院において見られる第一選択処置は、量的置換および止血促進のための全血、酸素輸送能力の改善のための濃縮赤血球、（もし低いか問題がある場合は）血小板数の増加のための濃縮血小板、および止血（血液凝固および血小板凝集）促進のための新鮮凍結血漿である。第二選択の血漿由来製剤は、血漿クリオプレシピテート、プロトロンビン複合体濃縮製剤、活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤および精製凝固因子である。今日、不活性の（凝固ＶＩＩＩ因子およびＩＸ因子）および活性化された（凝固ＶＩＩａ因子）ヒト組み替えタンパク質として、いくつかの凝固因子が入手可能である。
【０００４】
血友病は、凝血因子の異常または欠損、または凝血促進機能を阻害する凝血因子に対する抗体のいずれかによる、先天的または後天的な出血障害である。最も一般的な血友病は、血友病Ａ（凝固ＶＩＩＩ因子の欠損）および血友病Ｂ（ＩＸ因子）である。精製または組み替えの単一凝固因子は血友病の患者の主な処置である。阻害性抗体による患者には処置における問題が生じる。当該患者においては、彼らに投与した凝固因子もまた中和されうるからである。活性型プロテインＣ（ＡＰＣ）は、活性化凝固Ｖａ因子およびＶＩＩＩａ因子の分解による血漿凝固の阻害剤である。組み替えＡＰＣは、敗血症の患者における過度の血漿凝固の効果的な処置となることが示されている。
【０００５】
精製の工程は単純ではなく、多くの工程（そのうちのいくつかは汚染ウイルスを除去すること目的とする工程）が必要となるが、治療的使用のための凝固因子はヒト血漿から得ることができる。しかし、血液由来製剤の多くの安全的手段および試験を伴ったとしても、感染性ウイルスまたはプリオンによる汚染は除去しきれない。このリスクのために、動物由来の成分を伴わない、ヒト治療用タンパク質の組み替え細胞培養からの製造が非常に望まれている。これは常に容易とは限らない。なぜなら、十分に機能的な形態で製造する（すなわち、翻訳後に正しく修飾する）ために多くのタンパク質においては哺乳類宿主が必要となるからである。凝固因子のうちで、組み替え細胞において商業的に製造されている凝固因子は、ＦＶＩＩ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）、ＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ、Ｒｅｆａｃｔｏ）およびＦＩＸ（ＢｅｎｅＦｉｘ）（ＲｏｄｄｉｅおよびＬｕｄｌａｍ、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．第１１巻、第１６９〜１７７頁、１９９７年）および活性プロテインＣ（Ｘｉｇｒｉｓ）である。十分に機能する組み替えヒト凝固因子を大量に得る場合の主な障害の１つは、ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸおよびプロテインＣに存在するＧｌａ−ドメインにある。このドメインは、カルボキシル基の付加により翻訳後に修飾されるグルタミン酸残基を含む。これらの因子の製造は、それらの過剰発現が不十分なカルボキシル化、それによるタンパク質の不活性化を引き起こすという事実により妨げられている。Ｇｌａ修飾は、γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＧＧＣＸ）と呼ばれるビタミンＫ依存性酵素の作用のよるものである。この酵素は、多くの科学者、特に凝固因子研究に関わる人々により多くの研究がなされている（ＷＯ−Ａ−８８０３９２６；Ｗｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２５４巻（５０３８）：第１６３４−１６３６頁、１９９１年；Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９０巻：第４６１１−４６１５頁、１９９３年；Ｓｔａｎｌｅｙ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２７４巻（２４）：第１６９４０−１６９４４頁、１９９９年；Ｖｏら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ 第４４５巻：第２５６−２６０頁、１９９９年；Ｂｅｇｌｅｙら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２７５巻（４６）：第３６２４５−３６２４９頁、２０００年；Ｗａｌｋｅｒら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２７６巻（１１）：第７７６９−７７７４頁、２００１年；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９９巻（３）：第１２６４−１２６９頁、２００２年；Ｃｚｅｒｗｉｅｃら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ 第２６９巻：第６１６２−６１７２頁、２００２年；Ｈａｌｌｇｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第４１巻（５０）：第１５０４５−１５０５５頁，２００２年；Ｈａｒｖｅｙら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２７８巻（１０）：第８３６３−８３６９頁、２００３年）。凝固因子ＦＩＸと共にＧＧＣＸを共発現することにより収率を増加させる試みは、少なくとも２つの科学者グループにより行われているが成功していない（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、１９９３年，ｉｂｉｄ；Ｈａｌｌｇｒｅｎら、２００２年，ｉｂｉｄ）。γ−カルボキシル化タンパク質における大きな関心を考慮すると、より多くの共発現の試みが失敗に終わり、そのため報告されなかったものと推測されうる。
【０００６】
ヒトＦＩＩ（プロトロンビン）については、十分に機能するプロトロンビンを得るためには、１０のＧｌｕ残基のうちの少なくとも８が正しく修飾されなければならない（Ｍａｌｈｏｔｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６０巻：第２７９−２８７頁、１９８５年；ＳｅｅｇｅｒｓおよびＷａｌｚ「Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）。例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞およびワクシニアウイルス発現系などのいくつかの異なる系を使用して、ｒｈＦＩＩの高い生産レベルを実現するために多くの努力がなされたが、すべて、失敗に終わるか、または不十分にカルボキシル化された生成物、すなわち機能的に不活性なプロトロンビンが得られた（Ｊφｒｇｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６２巻：第６７２９−６７３４頁、１９８７年；Ｒｕｓｓｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ 第１４巻（２）：第２２２−２３３頁、１９９１年；Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ 第３８巻（２）：第１２９−１３６頁、１９９５年；Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．第８巻（３）：第３５８−３６４頁、１９９６年；Ｒｕｓｓｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．第１０巻：第２１４−２２５頁、１９９７年；Ｖｏら、１９９９年、ｉｂｉｄ；ＷｕおよびＳｕｔｔｉｅ、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ 第９６巻（２）：第９１−９８頁、１９９９年）。以前に報告されたカルボキシル化組み替えヒトプロトロンビンの生産性は低く、変異プロトロンビンについて２０ｍｇ／Ｌ（Ｃｏｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ 第２６９巻：第１１３７４−１１３８０頁、１９９４年）、ＣＨＯ細胞で発現したヒトプロトロンビンについて０．５５ｍｇ／Ｌ（十分にカルボキシル化されたもの、Ｊφｒｇｅｎｓｅｎら、１９８７年、ｉｂｉｄ）、ＣＨＯ細胞中で２５ｍｇ／Ｌ（カルボキシル化の程度は示されていない、Ｒｕｓｓｏら、１９９７年、ｉｂｉｄ）である。
【０００７】
ＷＯ９２／１９６３６は、ヒトおよびウシのビタミンＫ依存性カルボキシラーゼのクローニングおよび配列同定を開示する。当該出願は、ビタミンＫ依存性タンパク質の調製のために、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼおよびビタミンＫ依存性タンパク質を好適な宿主細胞中で共発現することを示唆している。カルボキシラーゼおよびビタミンＫ依存性タンパク質の共発現は何ら例示されていない。
【０００８】
活性化された血液凝固因子を高収率で製造する方法が求められている。本発明は、この必要性に応えることを目的とする。
【０００９】
発明の概要
本発明の第１の側面によれば、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞であって、第１のプロモーターは第２のプロモーターよりも十分に強力であり、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼは少なくとも１０：１の比で発現する、前記宿主細胞が提供される。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼを発現するように設計された細胞であって、タンパク質（ｉ）および（ｉｉ）は１０：１〜５００：１の比で発現する、前記細胞が提供される。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、遺伝子修飾された真核宿主細胞であって：
（ｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（前記γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードする配列は、前記細胞によるγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）；および
（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド（前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）
を含み、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質およびカルボキシル化を必要とするタンパク質を少なくとも１：１０の比で発現することができる前記細胞が提供される。
【００１２】
本発明のさらなる側面によれば、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターであって、第１のプロモーターは第２のプロモーターよりも十分に強力であり、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼは少なくとも１０：１の比で発現する、前記宿主細胞が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、γ−カルボキシル化されたタンパク質の製造方法であって、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたタンパク質を単離すること、を含む前記方法が提供される。１つの態様において、当該方法はγ−カルボキシル化されたヒトＩＸ因子を製造するために使用され、別の態様において当該方法はγ−カルボキシル化されたヒトプロトロンビンを製造するために使用される。別の側面において、製造したγ−カルボキシル化されたタンパク質はヒトγ−カルボキシル化Ｘ因子である。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、哺乳類細胞系におけるγ−カルボキシル化タンパク質の製造方法であって、γ−グルタミルカルボキシラーゼと哺乳類細胞系でγ−カルボキシル化を必要とする前記タンパク質を共発現させる工程であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現量がγ−グルタミルカルボキシラーゼの発現量の少なくとも１０倍を越える前記工程、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化タンパク質を単離する工程を含む前記方法が提供される。１つの実施態様において、当該方法は、γ−カルボキシル化されたヒトＩＸ因子の製造に使用され、別の態様において、当該方法は、γ−カルボキシル化されたヒトプロトロンビンの製造に使用される。別の態様において、製造されるγ−カルボキシル化タンパク質はヒトγ−カルボキシル化Ｘ因子である。
【００１５】
本発明のさらなる側面によれば、上記の方法により製造され単離されたγ−カルボキシル化タンパク質、上記の方法により製造され単離されたγ−カルボキシル化タンパク質の凝固療法における使用、または上記の方法により製造され単離されたγ−カルボキシル化タンパク質の、凝固療法において使用するための医薬の製造における使用が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる側面によれば、血液凝固の誘導または凝固の増強または抑制の促進に適した医薬組成物の製造方法であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを１０：１〜５００：１の比で発現するように設定された宿主細胞から発現された活性なカルボキシル化タンパク質を精製すること、および精製したカルボキシル化タンパク質を１以上の医薬として許容な担体または賦形剤と混合することを含む前記方法、ならびに当該方法から得られる医薬組成物が提供される。１つの態様において、活性なカルボキシル化タンパク質はγ−カルボキシル化ヒトＩＸ因子であり、別の態様において、活性なカルボキシル化タンパク質はγ−カルボキシル化ヒトプロトロンビンである。別の態様において、活性なカルボキシル化タンパク質はγ−カルボキシル化Ｘ因子である。
【００１７】
発明の詳細な説明
我々は、ビタミンＫ依存性凝固因子およびγ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＧＧＣＸ）の異なる比での共発現に関連する、適切にカルボキシル化された組み替えビタミンＫ依存性凝固因子の発現のための異なるアプローチを創出した。一例として、ヒトプロトロンビン（ｒｈＦＩＩ）およびヒトＧＧＣＸを発現した。他者が試みたような（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、１９９３年、ｉｂｉｄ；Ｈａｌｌｇｒｅｎら、２００２年、ｉｂｉｄ）ｒｈＦＩＩおよびＧＧＣＸの双方についての強いプロモーターを使用する代わりに、我々は、ＧＧＣＸの発現量がｒｈＦＩＩの発現量の１／１０未満となるように、ＧＧＣＸの弱いまたは非常に弱い発現を組み合わせたＦＩＩの強い発現をねらった方策を用いた。驚くべきことに、この方策により、宿主細胞を動物成分を含まない化学的に定義される培地において培養した場合であっても、高レベルの分泌型の正しく修飾されたｒｈＦＩＩおよび宿主細胞の良好な生存率を実現した。
【００１８】
我々は、ヒトプロトロンビンのｍＲＮＡレベルがＧＧＣＸのｍＲＮＡレベルを少なくとも１０倍上回るように、ＧＧＣＸおよびヒトプロトロンビンを発現ベクターにクローン化した。これによりＧＧＣＸタンパク質と比較して大過剰のプロトロンビンタンパク質を生産することができた。
【００１９】
さらなる例として、我々は、同じＧＧＣＸ共発現ベクターを使用してｒｈＦＩＸを発現した。この結果、ある場合に、ＧＧＣＸｍＲＮＡレベルを少なくとも１０倍上回るレベルでＩＸ因子ｍＲＮＡを生産する細胞系が得られた。別の細胞系において、ｍＲＮＡのＩＸ因子：ＧＧＣＸの比は薬４〜５：１であった。少なくとも１０：１の比を与える細胞系のみが実質的なｒｈＦＩＸ生産性の向上を示した（表１）。
【００２０】
表１．生産性とカルボキシル化されたタンパク質：ＧＧＣＸのｍＲＮＡ比の概要
【００２１】
【表１】
【００２２】
＊生産性は同様の培養条件下でのスピナー培養から測定した。
＃Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ １９９３年および米国特許Ｎｏ．５，４６０，９５０からのデータ
ＧＧＣＸとの共発現の本方法により製造されたビタミンＫ依存性凝固因子（ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、およびそれらの活性型ＦＩＩａまたはトロンビン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ）は、外傷、手術、または肝臓、腎臓、血小板もしくは血液凝固因子の疾患に伴う出血の予防または治療において有用であることが期待されうる。同様に、凝固因子プロテインＣおよびその活性型ＡＰＣもまた、プロテインＣのレベルの減少を伴うか伴わないかによらず、凝固の増強の不全の予防また治療において有用であることが期待される。当該方法はまた、翻訳後のカルボキシル化を必要とするその他のタンパク質にも適用することができる。
【００２３】
本発明の第１の側面によれば、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞であって、第１のプロモーターは第２のプロモーターよりも十分に強力であり、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼは少なくとも１０：１の比で発現する、前記宿主細胞が提供される。
【００２４】
好ましい実施態様において、発現されるタンパク質の比は１０：１〜１０００：１、より好ましくは１０：１〜５００：１、さらに好ましくは２５：１〜２５０：１である。特に好適な比は約２００：１である。
【００２５】
別々の態様において、発現される２つのタンパク質はの比は、少なくとも１０：１、３０：１、４５：１、５０：１、１００：１、２００：１、２５０：１、３００：１、４００：１、５００：１および１０００：１でありうる。
【００２６】
ある特定の実施態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子の双方が同じ発現ベクターに位置する。別の態様において、これらの核酸分子は別々の発現ベクターに位置する。
【００２７】
本発明のさらなる側面によれば、配列番号１４および配列番号１５の核酸が提供される。
本発明のさらなる側面によれば、ヒトＩＸ因子の発現のための、配列番号１４または配列番号１５の配列を含むベクターにより形質移入または形質転換された宿主細胞が提供される。
【００２８】
本発明のさらなる側面によれば、ヒト凝固ＩＸ因子およびヒトγ−カルボキシラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞であって、前記ヒト凝固ＩＸ因子をコードする核酸およびγ−カルボキシラーゼをコードする核酸は、２つのタンパク質を各々少なくとも１０：１の比で発現することができる制御配列と操作可能なように連結している前記細胞が提供される。
【００２９】
本発明のさらなる側面によれば、ヒト凝固ＩＸ因子およびヒトγ−カルボキシラーゼ酵素を少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた非ヒト真核宿主細胞が提供される。特定の実施態様において、ヒト凝固ＩＸ因子をコードする核酸およびγ−カルボキシラーゼをコードする核酸は、２つのタンパク質を各々少なくとも１０：１の比で発現することができる制御配列と操作可能なように連結する。
【００３０】
本発明のさらなる側面によれば、ｈＣＭＶプロモーターの制御下のヒト凝固ＩＸ因子をコードする核酸、およびＳＶ４０プロモーター制御下のヒトカルボキシラーゼをコードする核酸を含む外因性の核酸を保持する宿主細胞が提供される。
【００３１】
本発明のさらなる側面によれば、配列番号１、配列番号２または配列番号３の核酸が提供される。
本発明のさらなる側面によれば、ヒトプロトロンビンの発現のための、配列番号１、配列番号２または配列番号３の配列を含むベクターにより形質移入または形質転換された宿主細胞が提供される。
【００３２】
本発明のさらなる側面によれば、ヒトプロトロンビンおよびヒトγ−カルボキシラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞であって、前記ヒトプロトロンビンをコードする核酸およびγ−カルボキシラーゼをコードする核酸は、２つのタンパク質を各々少なくとも１０：１の比で発現することができる制御配列と操作可能なように連結している前記細胞が提供される。
【００３３】
本発明のさらなる側面によれば、ヒトプロトロンビンおよびヒトγ−カルボキシラーゼ酵素を少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた非ヒト真核宿主細胞が提供される。特定の実施態様において、ヒト凝固ＩＸ因子をコードする核酸およびγ−カルボキシラーゼをコードする核酸は、２つのタンパク質を各々少なくとも１０：１の比で発現することができる制御配列と操作可能なように連結する。
【００３４】
本発明のさらなる側面によれば、ｈＣＭＶプロモーターの制御下のヒトプロトロンビンをコードする核酸、およびＳＶ４０プロモーターの制御下のヒトカルボキシラーゼをコードする核酸を含む外因性の核酸を保持する宿主細胞が提供される。
【００３５】
本発明はカルボキシル化を必要とするタンパク質としてプロトロンビンおよび凝固ＩＸ因子を使用して例示される。しかし、プロトロンビンおよびＩＸ因子以外のいくつかのタンパク質は、十分な生物学的活性が正確なγ−カルボキシル化に依存している。ヒト由来の既知のものの中で、凝固因子ＦＶＩＩのみが、現在比較的低いレベル（約１０ｍｇ／Ｌ以下）で組み替え哺乳類細胞において商業的に製造されている。本発明は、γ−カルボキシル化に依存する任意のタンパク質の生産性の改善に適用されるであろう。限定はされないが、当該タンパク質には、プロトロンビン、凝固ＩＩ因子（ＦＩＩ）、凝固ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、凝固ＩＸ因子（ＦＩＸ）、凝固Ｘ因子（ＦＸ）、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質（ＢＧＰまたはオステオカルシンとして知られている）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、プロリンリッチＧｌａポリペプチド１（ＰＲＲＧ１）、プロリンリッチＧｌａポリペプチド２（ＰＲＲＧ２）、増殖抑制特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）などが含まれる。その他の好適なタンパク質は、コブラ（Ａｃａｎｔｈｏｐｈｉｉｎａサブファミリー）の蛇毒およびイモ貝（ｃｏｎｅ ｓｎａｉｌ；Ｃｏｎｕｓ ｔｅｘｔｉｌｅ）の毒中のＦＸａ様タンパク質である。
【００３６】
これらのタンパク質の各々は、対応の核酸およびアミノ酸配列を含めて周知である。表２は、本発明において使用することができる種々のタンパク質の野生型および変異型の代表的な配列を特定する。
【００３７】
表２
【００３８】
【表２】
【００３９】
本発明は、共発現するこれらのタンパク質の１つのうちの特定のタンパク質またはタンパク質をコードする配列に限定されないことは理解されるであろう。さらに、特に血液凝固因子に関して、当該タンパク質の多くの変異型が当該技術分野において開示されている。本発明は、自然に発生する突然変異を含む当該タンパク質のこれらの変異型にも、野生型配列と同様に適用可能である。１つの態様において、本発明は、任意の野生型タンパク質または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の野生型との配列同一性を有するタンパク質において行われうる。
【００４０】
２つの配列間の配列同一性は、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＰＩＬＥＵＰ、ＧａｐまたはＦｒａｍｅＡｌｉｇｎなどのペアワイズコンピューターアラインメント分析により決定されうる。好ましいアラインメントツールはＢｅｓｔＦｉｔである。実際は、配列データベース内からクエリサーチに対する類似／同一の配列を検索する場合に、一般的には、Ｂｌａｓｔ、Ｂｌａｓｔ２、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ２、ＷａｓｈＵ Ｂｌａｓｔ２、ＦａｓｔＡ、またはＦａｓｔａ３などの好適なアルゴリズム、およびＢｌｏｓｕｍ６２などのスコア行列を使用しての類似配列の所期同定を行うことが必要である。当該アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの「ｇｏｌｄ−ｓｔａｎｄａｒｄ」アラインメントアルゴリズムに近似させることを試みるものである。したがって、類似性の評価（すなわち、２つの一次ポリペプチド配列がどのような並んでいるか）において使用するために好ましいソフトウエア／サーチエンジンプログラムはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎである。同一とは直接一致を意味し、類似では慣用の置換がされていてもよい。
【００４１】
本明細書で使用される用語「γ−グルタミルカルボキシラーゼ」または「ＧＧＣＸ」は、グルタミン酸残基のカルボキシル化を触媒するビタミンＫ依存性酵素を意味する。
ＧＧＣＸ酵素は広く分布しており、シロクジラ（Ｄｅｌｐｈｉｎａｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃａｓ）、トードフィッシュ（Ｏｐｓａｎｕｓ ｔａｕ）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、メクラウナギ（Ｍｙｘｉｎｅ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）、およびイモ貝（Ｃｏｎｕｓ ｔｅｘｔｉｌｅ）などの多くの異なる種からクローン化されている（Ｂｅｇｌｅｙら、２０００年、ｉｂｉｄ；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、２００２，ｉｂｉｄ）。イモ貝由来のカルボキシラーゼはウシのカルボキシラーゼに類似し、ＣＯＳ細胞において発現されている（Ｃｚｅｒｗｉｅｃら、２００２、ｉｂｉｄ）。ＧＧＣＸに類似する別のタンパク質が、昆虫およびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａなどの原核生物において、各々、ＮＣＢＩ受け入れ番号：ｇｉ３１２１７２３４、ｇｉ２１２９８６８５、ｇｉ２４２１６２８１、およびｇｉ２４１９７５４８で発見されている（Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、２００２，ｉｂｉｄ）。カルボキシラーゼ酵素は顕著な進化的保存性を示している。いくつかの非ヒト酵素は、我々が使用したヒトＧＧＣＸと類似の活性が確認されるか、類似の活性を有することが予想されうるものであり、したがってヒト酵素の代替として使用されうる。
【００４２】
表３は、本発明で使用されうる、予想されるヒトＧＧＣＸと類似するタンパク質（種の由来によって分類）の代表的な配列を示す。
表３
【００４３】
【表３−１】
【００４４】
【表３−２】
【００４５】
上掲のＧＧＣＸタンパク質および他の種由来のＧＧＣＸタンパク質の各々は本発明のカルボキシラーゼ酵素として使用されうる。
２つの共発現タンパク質の差別的発現を達成する１つの方法は、各々の発現制御配列の一部として異なるプロモーターを使用することである。異種のタンパク質を異なる程度および範囲で発現することができる、異なるプロモーターおよびその他の発現制御配列の例は、当該技術分野においては十分に存在する。組み替え発現技術は好適に進展しており、タンパク質発現の技術分野の当業者は、目的の比率で、カルボキシル化を必要とするタンパク質およびカルボキシラーゼの共発現を実現するためのプロモーターおよびその他の制御配列を選択することができる。使用する特定のプロモーターおよびその他の発現制御配列の選択は、個々の選択事項である。
【００４６】
１つの態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質に関連する制御配列は強力なプロモーターを含む。１つの態様において、それはヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーターである。ここで、強力なプロモーターとは、１０００転写物／細胞以上を引き起こすプロモーターと定義される。ここで、弱いプロモーターとは、１０００転写物／細胞未満を引き起こすプロモーターと定義される。
【００４７】
別の態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼに関連する制御配列は弱いプロモーターを含む。１つの態様において、これはＳＶ４０初期プロモーターである。別の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼは、γ−カルボキシラーゼを必要とするタンパク質の発現を制御するプロモーターよりも弱いγ−グルタミルカルボキシラーゼの発現を制御するプロモーターを伴う異なるプロモーター要素の制御下にある。
【００４８】
別の態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼはＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあり、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーターの制御下にある。本発明のこの特定の側面による１つの態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はヒトＸ因子である。別の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はヒトプロトロンビンである。別の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はヒトＩＸ因子である。
【００４９】
本発明は、ＩＸ因子またはプロトロンビンを過剰発現するための強力なＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ 第４１巻：第５２１−５３０頁、１９８５年）およびＧＧＣＸの発現を制御するためのより弱いＳＶ４０プロモーター（Ｗｅｎｇｅｒら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ 第２２１巻：第４１６−４１８頁、１９９４年）の使用により例示される。本発明において使用されうるその他の強力なプロモーターには、限定されないが、ｐＥＦ−１α［ヒト伸長因子−１αサブユニット遺伝子）（ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ 第１８巻：第５３２２頁、１９９０年；Ｇｏｌｄｍａｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 第２１巻：第１０１３−１０１５頁、１９９６年）、ｐＲＳＶ［ラウス肉腫ウイルス（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第７９巻：第６７７７〜６７８１頁、１９８２年）］およびｐＵｂＣ［ヒトユビキチン（Ｓｃｈｏｒｐｐら、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ 第２４巻：第１７８７〜１７８８頁、１９９６年）］が含まれる。
【００５０】
製造されるタンパク質（カルボキシル化を必要とするタンパク質）が修飾酵素に対して、少なくとも１０：１の比であるように過剰とすることを確保することが重要である。修飾酵素（γ−グルタミルカルボキシラーゼ）の低レベルの発現を実現する方法には：
１）限定はされないが、ＳＶ４０前初期プロモーター、最小化ＦＩＸプロモーター（Ｒｏｕｅｔら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２６７巻：第２０７６５〜２０７７３頁、１９９２年）またはＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター（Ｗｅｎｇｅｒら、１９９４年、ｉｂｉｄ）が含まれる、修飾酵素の発現を制御する弱いプロモーターを使用すること、
２）プロモーター強度を減ずるためにプロモーターまたは強力なプロモーターのエンハンサー配列の変異させること、
３）翻訳効率を抑制するためにＫｏｚａｋ配列（翻訳開始シグナル）を除去または変化させること（Ｋｏｚａｋ．Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ 第１５巻：第８１２５〜８１４８頁、１９８７年；Ｋｏｚａｋ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第８７頁：第８３０１〜８３０５、１９８７年、１９９０年）、
４）製造されるタンパク質（カルボキシル化を必要とするタンパク質）をコードする核酸およびＧＧＣＸをコードする核酸を別々のベクター上にクローン化し、製造されるタンパク質を含むコンストラクトの多数の複製を有する細胞が発生するように、製造されるタンパク質を含む大過剰のコンストラクトをトランスフェクションすること、
５）製造されるタンパク質をコードするＤＮＡおよびＧＧＣＸ修飾ベクターをコードするＤＮＡを別々のベクター上にクローン化し、同時にまたは別々にトランスフェクションし、製造されるタンパク質の発現を増幅するための増幅系を使用すること、
６）組み替え技術により低レベルでＧＧＣＸを発現する（しかし、内因的レベルは上回る）安定細胞系を単離し、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現のための宿主細胞系として使用すること、
７）ＧＧＣＸの基質親和性を減少させるために、ＧＧＣＸに変異（複数でもよい）を導入すること、
が含まれる。
【００５１】
これらの他に、組み替えタンパク質発現の技術分野の当業者であれば、少なくとも１０：１の比でカルボキシル化を必要とするタンパク質とカルボキシラーゼタンパク質を発現する宿主細胞を発生させるために使用されうるその他の方法に気づくであろう。
【００５２】
本発明のさらなる側面によれば、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質、および（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼを発現し、当該タンパク質（ｉ）および（ｉｉ）が１０：１〜５００：１に比で発現するように処理された、または適合させた細胞が提供される。特定の態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼは内因性のレベル（すなわち、何らの処理も適合もされていない細胞におけるレベル）を２〜５倍上回って発現されている。
【００５３】
本発明のさらなる側面によれば、（ｉ）適合させていない対応する細胞における構成要素濃度を上回るγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質、および（ｉｉ）カルボキシル化を必要とするタンパク質、を発現するように適合させた組み替え細胞であって、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質およびカルボキシル化を必要とするタンパク質の発現量が少なくとも１：１０の比となる、前記細胞が提供される。
【００５４】
本発明のさらなる側面によれば、遺伝子修飾された真核宿主細胞であって：
（ｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（前記γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードする配列は、前記細胞によるγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）；および
（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド（前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）
を含み、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質およびカルボキシル化を必要とするタンパク質を少なくとも１：１０の比で発現することができる前記細胞が提供される。
【００５５】
本発明のさらなる側面によれば、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを発現するように適合された細胞であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸およびγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸が、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現量がγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の少なくとも１０倍量であることを確保するために適した制御配列の制御下にある、前記細胞が提供される。
【００５６】
１つの態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼの少なくとも１つが、組み替え技術により細胞内へ導入された核酸から発現される。本発明を実施するための代替の方法は、内因性のタンパク質（カルボキシル化を必要とするタンパク質またはカルボキシラーゼ）の発現であって、ただし目的のレベルの発現を生じさせるために、内因性の制御配列（プロモーターなど）を異種の配列で置換することを伴う発現である。
【００５７】
宿主細胞は、好ましくは真核細胞である。限定はされないが、典型的な宿主細胞には、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳類細胞が含まれる。哺乳類細胞は特に好ましい。限定はされないが、好適な哺乳類細胞系には、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳ０、２９３、ＰｅｒＣ．６、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞、およびその派生物が含まれる。１つの態様において、宿主細胞は哺乳類細胞系ＣＨＯ−Ｓである。
【００５８】
カルボキシル化依存性タンパク質の過剰発現は、一般的には、初期に不十分にカルボキシル化された生成物をもたらす。これは宿主細胞の内因性カルボキシル化能力が制限されていることに起因する。一方で、大過剰（１６〜７０倍）のＧＧＣＸ活性の発現は、生成物の収率を改善しない（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９０巻：第４６１１〜４６１５頁、１９９３年）、（ＢｅｒｋｎｅｒおよびＰｕｄｏｔａ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．第９５巻：第４４６〜４７１頁、１９９８年）、（Ｈａｌｌｇｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第４１巻（５０）：第１５０４５〜１５０５５頁、２００２年）。この理由は十分に理解されていない。我々の発明は、ＧＧＣＸの適度な過剰発現を要求する。これにより、例えば、ＧＧＣＸ活性レベルが１．５〜４倍のみで上昇した場合、ＧＧＣＸが内因性レベルを超えて細胞から発現されることが確保される。この適度なレベルの上昇により、驚くべきことに、実施例１に示すように十分にカルボキシル化された高レベルのｒｈＦＩＩを得ることができる。
【００５９】
したがって、従前の共発現技術と本発明を区別するカルボキシル化を必要とするタンパク質およびカルボキシラーゼの発現比率は、内因的に製造されるＧＧＣＸのレベルを除外する。必要とされる高い生産性を実現するために、通常の細胞において観察されるレベルよりも高いレベルで、カルボキシラーゼおよびカルボキシル化を必要とするタンパク質を発現することが必要である。
【００６０】
好ましい態様において、構成的に発現されるカルボキシラーゼおよび／またはカルボキシル化を必要とするタンパク質をほとんど、または全く有さない細胞または細胞系が使用される。
【００６１】
１つの態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼは、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の量の１０％以下で発現される。代替のさらなる態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼは、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の量の５％、２％、１％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以下で発現される。
【００６２】
２つのタンパク質の発現の程度は、当該技術分野における当業者によく知られている技術を使用して測定されうる。これらには、例えばタンパク質の生物学的活性もしくはタンパク質の量（例えば、抗体を使用する）の測定などの直接的測定、または、例えばｍＲＮＡ転写物レベルの測定（例えば、実施例３のようなタックマン分析）を介する非直接的測定方法が含まれる。以下の参照文献はＧＧＣＸ酵素活性の測定方法を開示する（Ｌｉｎｇｅｎｆｅｌｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第３５巻：第８２３４〜８２４３頁、１９９６年；Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９５巻：第４４６〜４７１頁、１９９８年；Ｈａｌｌｇｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第４１巻（５０）：第１５０４５〜１５０５５頁、２００２年；および、Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第８９巻：第６２４２〜６２４６頁、１９９２年）。
【００６３】
本発明の目的のために、２つのタンパク質発現の比は、ｍＲＮＡ転写レベル（例えば、タックマン分析による）を介して非直接的に決定されうる。
１つの態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はビタミンＫ依存性凝固因子である。さらなる態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質は、好ましくは、プロトロンビン、凝固ＩＩ因子、凝固ＦＩＩ、凝固ＶＩＩ因子、凝固ＦＶＩＩ、凝固ＩＸ因子、凝固ＦＩＸ、凝固Ｘ因子、凝固ＦＸ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖抑制特異的タンパク質６およびアカントフィナエ（Ａｃａｎｔｈｏｐｈｉｉｎａｅ）ＦＸａ様タンパク質からなる群から選択される。
【００６４】
１つの特定の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はＩＸ因子である。別の特定の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はプロトロンビンである。別の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はＸ因子である。
【００６５】
本発明は、任意の起源由来のγ−カルボキシル化を必要とするタンパク質に対して一般的適用性を有する。しかし、発現されるタンパク質がヒトの治療目的で使用されるのであれば、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【００６６】
１つの態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼは、マウス、ラット、ウシまたはイモ貝起源のものである。別の態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼはヒトタンパク質である。
【００６７】
本発明のさらなる側面によれば、γ−カルボキシル化されたタンパク質の製造方法であって、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を、双方のタンパク質の発現に好適な条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたタンパク質を単離すること、を含む前記方法が提供される。
【００６８】
本発明のさらなる側面によれば、哺乳類細胞系におけるγ−カルボキシル化タンパク質の製造方法であり、哺乳類細胞系における前記γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質と共に、γ−グルタミルカルボキシラーゼを共発現させる工程（ここで、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現量が、γ−グルタミルカルボキシラーゼの発現量の少なくとも１０倍である）；および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたタンパク質を単離することを含む、前記方法が提供される。
【００６９】
γ−カルボキシル化されたタンパク質の製造方法であって：
ａ）カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質を少なくとも１０：１の比で共発現することができる真核宿主細胞を製造するための、カルボキシル化を必要とするタンパク質および付随する発現制御配列をコードする第１のポリヌクレオチド、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび付随する発現制御配列をコードする第２のポリヌクレオチドを導入するための真核細胞の遺伝子的修飾；
ｂ）第１および第２のポリヌクレオチドを発現させるための条件下で好適な培地中で当該細胞を培養すること；およびｃ）当該培地または宿主細胞からのカルボキシル化されたタンパク質の単離、
を含む前記方法が提供される。
【００７０】
発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、場合によってはシグナルペプチド、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、選択のための１以上の抗生物質耐性マーカー遺伝子（複数でもよい）を含む。好適な発現ベクターは、プラスミド、コスミド、またはファージもしくはレトロウイルスなどのウイルスであってもよい。ポリペプチドのコードする配列は、適切なプロモーター（すなわち、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＴＫ、ＲＳＶ、ＳＶ４０など）、制御要素および転写ターミネーター（これらは関連する発現制御配列である）の制御下に置かれ、そのため核酸をコードする核酸配列は、発現ベクターコンストラクトにより形質転換または形質移入された宿主細胞においてＲＮＡに転写される。コードする配列は、宿主細胞の外へのポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。好ましいベクターは、通常、少なくとも１つの多重クローニング部位を有するであろう。特定の態様においては、プロモーターおよび発現する遺伝子の間に位置するクローニング部位または多重クローニング部位が存在するであろう。当該クローニング部位は、当該部位に第２の核酸配列をクローニングすることによりＮ−末端融合タンパク質を作成するために使用することができ、そのため遺伝子配列とインフレームで接続している。その他の態様において、上記のＮ−末端融合のための部位と類似の様式のＣ−末端融合の作成を容易にするために、遺伝子のすぐ下流に位置するクローニング部位または多重クローニング部位が存在してもよい。
【００７１】
宿主細胞は、例えば形質移入、形質変換およびエレクトロポレーションなどの、当該技術分野における当業者に周知の種々の方法により、遺伝子修飾（追加の核酸を導入）されていてもよい。
【００７２】
本発明はまた、本発明の方法により製造される精製γ−カルボキシル化タンパク質および凝固療法におけるそれらの使用に及ぶ。
本発明のさらに別の側面によれば、対象における凝固の増加または減少を促進する方法であって、それを必要とする患者に対して、上記の方法により得た薬理学的有効量の単離したγ−カルボキシル化タンパク質を投与することを含む前記方法が提供される。
【００７３】
本発明のさらなる側面によれば、血液凝固の誘導に適した医薬組成物を製造する方法であって、少なくとも１０：１の比でγ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを発現させることに適合させた宿主細胞から発現した活性なカルボキシル化されたタンパク質を精製すること、および１以上の医薬的に許容な担体または賦形剤と当該精製したカルボキシル化されたタンパク質を混合することを含む前記方法が提供される。
【００７４】
タンパク質系の治療剤は、通常、凍結、冷蔵、室温で、および／または凍結乾燥状態で貯蔵される。
本発明の組成物は、当該技術分野において周知の、慣用の医薬賦形剤を使用して、慣用の手法により得られうるが、非経口的または障害部位への直接的な注射に適した形態であるのが最も適当であろう。
【００７５】
一般に、水性懸濁液は、１以上の懸濁剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムなど）；分散剤または湿潤剤（例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（例えば、ポリエチレンステアレート）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレート））と一緒に、微粉化された形態の活性成分を含む。水性懸濁液はまた、１以上の保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルもしくはプロピル）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、着色剤、香味剤、および／または甘味剤（例えば、スクロース、サッカリンまたはアスパルテーム）を含んでいてもよい。
【００７６】
油性懸濁液は、植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油）または鉱油（例えば、流動パラフィン）中に活性成分を懸濁させることにより製剤されうる。油性懸濁液はまた、増粘剤（例えば、蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコール）を含んでいてもよい。甘味剤（例えば上記のもの）および香味剤は口当たりのよい経口製剤を提供するために加えてもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存されうる。
【００７７】
好適な希釈剤を加えることによる注射用の水性製剤の調製に適した粉末は、一般に、好適な担体および賦形剤を伴う活性成分、懸濁剤、および１以上の安定化剤または保存料を含む。希釈剤は、例えば、保存料、等張性調整剤および安定化剤などのその他の賦形剤を含んでいてもよい。
【００７８】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油相は、植物油（例えば、オリーブ油またはラッカセイ油）または鉱油（例えば、流動パラフィン）またはそれらのいずれかの混合物であってもよい。好適な乳化剤は、例えば、天然由来のゴム（例えばアカシアゴムまたはトラガカントゴム）、天然由来のホスファチド（例えば、ダイズまたはレシチン）、脂肪酸およびヘキシトール無水物由来のエステルまたは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレート）および当該部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）などであってもよい。
【００７９】
本発明の医薬組成物はまた、無毒の非経口的に許容な希釈剤または溶媒中の無菌溶液または懸濁液の形態であってもよく、それらは、既に言及した、１以上の適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の手法により製剤されうる。無菌の注射用製剤ははまた、無毒の非経口的に許容な希釈剤または溶媒中の無菌の注射用溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール溶液）であってもよい。
【００８０】
製剤に関するさらなる情報については、読者は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５巻、第２５．２章（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；編集委員長）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０年；またはＤｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第９９巻；Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｅｕｇｅｎ Ｊ．ＭｃＮａｌｌｙ、編集主幹）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ ２０００年を参照されたい。
【００８１】
単一の剤形を製造するための１以上の賦形剤と組み合わせる活性成分の量は、処置する対象および具体的な投与経路に依存して必然的に変動するであろう。例えば、ヒトに注射することを意図した製剤は、一般に、例えば、組成物全体の約５〜約９８重量％に変動しうる、適切かつ便宜的な量の賦形剤と混合した、０．５ｍｇ〜２ｇの活性薬剤を含みうる。投与剤形は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含みうる。タンパク質治療剤は、通常、冷凍または冷凍乾燥されて貯蔵される。投与経路および投薬方法に関するさらなる情報については、読者は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５巻、第２５．３章（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；編集委員長）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０年を参照されたい。
【００８２】
治療または予防目的のための化合物の投薬規模は、状態の種類および重篤度、動物または患者の年齢および性別、および投与経路により、周知の医学原則に従って、当然に変動するであろう。治療または予防目的で化合物を使用する場合、一般的には、例えば体重１ｋｇあたり０．５ｍｇ〜７５ｍｇの範囲の日薬量が、必要であれば分割投与で与えられるように投与されるであろう。一般に、非経口投与が使用される場合はより少ない薬量が投与されるであろう。したがって、例えば、静脈内投与については、例えば、体重１ｋｇあたり０．５ｍｇ〜３０ｍｇの範囲の薬量が一般的には使用されるであろう。同様に、吸入による投与については、例えば、体重１ｋｇあたり０．５ｍｇ〜２５ｍｇの範囲の薬量が使用されるであろう。
【００８３】
本発明は、さらに、以下の非限定的実施例により記述されるであろう。
本発明の実施には、特に示されてない限り、当該技術分野における技術の範囲内の分子生物学および組み替えＤＮＡ技術の慣用の方法が使用されるであろう。当該技術は、文献において十分に説明されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１年）；Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（２００２年）；Ｇｌｏｖｅｒ＆Ｈａｍｅｓ編集、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻、第ＩＩ巻および第ＩＩＩ巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９５年）；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ＆Ｋａｐｌａｎ編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｗｅｉｒら編集、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第５版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（１９９７年）を参照されたい。
【００８４】
実施例１
ヒトＦＩＩ（ｈＰＴ）およびヒトＧＧＣＸをコードするｃＤＮＡの増幅
ヒト肝臓ｍＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｓｙｓｔｅｍを使用してｃＤＮＡ合成を実施した。以下の：
プライマーＰＴＦ０（５’−ＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡ−３’、配列番号：３）および
プライマーＰＴＥＸＴ（５’−ＣＴＡＣＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＴ−３’、配列番号：４）
を使用して、ヒトＦＩＩの増幅のためのテンプレートとして得られたｃＤＮＡを使用した。
【００８５】
プライマーｈｇｌｘ５（５’−ＴＣＣＧＣＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣＴ−３’、配列番号：５）および
ｈｇｌｘ３（５’−ＣＣＡＡＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＴ−３’、配列番号：６）
を使用して、ヒトＧＧＣＸを増幅した。
【００８６】
ＦＩＩをコードするＰＣＲ生成物を、ＴＡ−ＴＯＰＯで処理したベクターｐＣＤＮＡ３．１Ｖ５／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化した。正しい方向に挿入されたｈＦＩＩ ｃＤＮＡを有するクローンの選択により、Ｐｔｅｘｔ５コントロールコンストラクト（図１ｂ）を得た。ＳＶ４０プロモーターの制御下のＧＧＣＸをコードするｃＤＮＡは、制限酵素ＢａｍＨ１およびＮｏｔＩを使用しての、ｐＣＤＮＡ３．１Ｖ５／Ｈｉｓ ＴＡ−ＴＯＰＯからのｐＺｅｏＳＶ２＋ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのＧＧＣＸエンコーディングフラグメントの移動により得た。ＧＧＣＸインサートの下流のＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ制限部位を除去した。その後、得られたｐＺｅｏＳＶ２−ＧＧＣＸプラスミド（ＳＶ４０プロモーターおよびＧＧＣＸを含むインサートを含むが、ＧＧＣＸエンコーディング配列の下流のポリアデニル化部位およびポリアデニル化シグナルは含まない）由来の鈍化した（ｂｌｕｎｔｅｄ）ＣｌａＩ−ＢｃｌＩフラグメントをｐＣＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の鈍化した（ｂｌｕｎｔｅｄ）ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローン化した。ＰＮ３２コンストラクト（図１ａ）を得るために、ＣＭＶプロモーターに対して直列（同じ転写方向）で挿入されたｐＳＶ４０−ＧＧＣＸフラグメントを伴うクローンを選択し、Ｐｔｅｘｔ５由来の鈍化したＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ ＦＩＩをコードするフラグメントをＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。ＰＮ３２およびＰｔｅｘｔ５のＤＮＡ配列は別表２の通りである。すべてのクローン化方法は、標準的方法および／または製造者が推奨する方法にしたがった。
【００８７】
ＰＮ３２コンストラクトは、以下の重要な特徴を含む：
−ヒトプロトロンビンｃＤＮＡの転写を制御するヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーター、それに続く、効率的な転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化のためのウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニレーションシグナル。
【００８８】
明確なポリアデニル化部位およびシグナルを含まない、ヒトγ−カルボキシラーゼｃＤＮＡ（ＧＧＣＸ）の転写を制御するＳＶ４０初期プロモーター。
−図１ａに示すその他の特徴。
【００８９】
比較のために、ＧＧＣＸを含まないＰＴｅｘｔ５コンストラクトを使用した（図１ｂ）。ＰＴＥＸＴ５ヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ＰＮ３２ヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
【００９０】
得られるプロトロンビン製造細胞系
図１の２つのコンストラクトをＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。安定な形質移入体を選択し、プロトロンビン活性についての市販のアッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を使用して高生産性のクローンについてスクリーニングした。このアッセイにおいて、プロトロンビンを含むサンプルを最初にヘビ毒の毒素（エカリン、Ｓｉｇｍａより入手可能）で処理し、トロンビンを発生させた。その後、トロンビンで処理されると色を発する色素生産性基質（Ｓ−２２３８）の添加により、トロンビン活性をアッセイした。クローンの形質移入および選択は、双方のコンストラクトを平行して用いて行った。細胞培養は、９％の加熱不活性化されたウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地において行った。その後、得られたクローンを動物成分を含まない培地において成長するように適合させた。得られた最も生産性のよいクローンは、ＰＮ３２（ＦＩＩ＋ＧＧＣＸ）による形質移入によるもので、当該クローンにより、動物成分を含まない化学的に定義される培地において成長させた場合４００ｍｇ／Ｌものヒト組み替えプロトロンビンが得られた（報告されたいかなるレベルも大きく上回っている）。組み替えにより製造されたｒｈＦＩＩを精製（Ｊｏｓｉｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ、第７９０巻、第１８３〜１９７頁、２００３年に開示された方法に従った）し、さらに標準的な方法によりＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用してイオン交換クロマトグラフィーで分画し、純粋な十分にカルボキシル化されたｒｈＦＩＩを得た。発酵により製造されたｒｈＦＩＩのうちの７８ｍｇ／Ｌまでもが十分にカルボキシル化されており、ヒト血清から精製されたプロトロンビンと同じ生物活性を有していた。カルボキシル化は、タンパク質のＮ−末端配列決定、およびプロトロンビナーゼアッセイ（Ｍａｏら、ＪＢＣ、第２７３巻、第３００８６〜３００９１頁、１９９８年）により分析した。トロンビンの発生は、ヒト血小板不足血清中に組織因子を添加することにより誘発され、内因性トロンビンの潜在性は、実質的にＳｔｉｇら（Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、第１４巻、第４５７〜４６２頁、２００３年）により記載されたとおりに測定された。
【００９１】
ＰＴｅｘｔ５コンストラクトにより得られた最もよいクローンは、動物成分を含まない化学的に定義される培地において１０ｍｇ／Ｌもの生産性を示し、これは文献により報告されているのと同程度であった。ＰＴｅｘｔ５クローンから得られた十分にカルボキシル化されたプロトロンビンの割合は、約５０％と推定された。したがって、γ−カルボキシラーゼの低い発現レベルの配列を含むＰＮ３２コンストラクトを使用して、十分に活性なｒｈＦＩＩに最終的回収は少なくとも１０倍以上高かった。コンストラクトの各々について、同じ発現レベルを有するいくつかのクローンが同定された。
【００９２】
実施例２
ＣＨＯ細胞系のＧＧＣＸ活性の測定
ＰＮ３２コンストラクト（ヒトＧＧＣＸの共発現）およびＰＴＥＸＴ５（ＧＧＣＸの非共発現）を用いたトランスフェクションにより得られた２つのｒｈＦＩＩ生産ＣＨＯ−Ｓ細胞系を、各々、５μｇ／ｍＬのビタミンＫを補ったタンパク質を含まない培地を使用して、スピナー瓶中で培養した。毎日１０分の１の培地を取り替えた。７日の培養後に細胞を採取し、Ｂｅｒｋｎｅｒら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、第８９巻、第６２４２〜６２４６頁、１９９２年）に記載されたとおりにミクロソームを調製した。ヒト組み替えＦＩＩを、採取した細胞の培養上澄み液から精製した。ＧＧＣＸ活性をＢｅｒｋｎｅｒおよびＰｕｄｏｔａ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、第９５巻、第４４６〜４７１頁、１９９８年）ならびにＬｉｎｇｅｎｆｅｌｔｅｒおよびＢｅｒｋｎｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、第８２３４〜８２４３頁、１９９６年）により記載されたとおりに測定した。我々の測定により、同じ培養条件を使用した場合に、ｒｈＦＩＩのみを発現するＣＨＯ細胞系と比較して、ヒトＧＧＣＸを共発現させたＣＨＯ細胞系においてＧＧＣＸ活性は１．５倍高いことが示された。
【００９３】
実施例３
ＣＨＯ−Ｓ細胞系におけるγ−カルボキシラーゼおよびプロトロンビンのｍＲＮＡ発現のリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析
ＰＮ３２（ＦＩＩ＋ＧＧＣＸ）およびＰｔｅｘｔ５（ＦＩＩのみ）コンストラクトの各々を用いての安定的トランスフェクションにより得られた２つのＣＨＯ−Ｓ細胞系をビタミンＫを補ったタンパク質を含まない培地を使用して、スピナー瓶中で培養した。培養サンプルは、ｍＲＮＡ生産の算出されるピークレベルを調査するために、培養４、５および６日で培養サンプルを取り出した。ＲＮＡは、販売者Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎにより提供されたプロトコールに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）を用いて単離した。単離したＲＮＡを、ＡｍｂｉｏｎのキットＤＮＡ−ｆｒｅｅ（登録商標）を用いてＤＮａｓｅＩ処理した。ｃＤＮＡ合成は、ランダムヘキサマープライマーおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍのキットの内容物を使用して行った。
【００９４】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーおよびＶｉｃ標識化プローブをソフトウエア（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して選択した。
【００９５】
ヒトγ−カルボキシラーゼオリゴヌクレオチド
５´ＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＴＴ ３´
フォワードプライマー（配列番号：７）
５´ ＡＡＴＣＧＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴ ３´
リバースプライマー（配列番号：８）
５´ ＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＡＣＧＣ ３´
プローブ（配列番号：９）
アンプリコンの長さ ８６ｂｐ
ヒトプロトロンビンオリゴヌクレオチド
５´ ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＧＡ ３´
フォワードプライマー（配列番号：１０）
５´ ＣＡＴＣＣＧＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡ ３´
リバースプライマー（配列番号：１１）
５´ ＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧＧＧＣ ３´
プローブ（配列番号：１２）
アンプリコンの長さ ６９ｂｐ
【００９６】
プライマーはＯｐｅｒｏｎ／Ｑｉａｇｅｎにより作成し、プローブはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓに注文した。齧歯類ＧＡＰＤＨコントロールプライマーおよびプローブも使用した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＢＩ＃４３０８３１８ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｒｏｄｅｎｔ ＧＡＰＤＨ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、アンプリコンの長さ １７７ｂｐ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応をＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。増幅されたＰＣＲ生産物の予想された長さをアガロースゲル上で確認した。ＰＣＲ反応の効率を検査するための希釈系列を、３つすべての遺伝子において実施した。γ−カルボキシラーゼおよびプロトロンビンの発現レベルを、コントロール遺伝子、齧歯類ＧＡＰＤＨと比較して示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
検出されたｒｈＦＩＩ：ＧＧＣＸの相対的発現レベルから、サンプル回収の比に依存して、およそ７４〜２３２：１の比が算出された。ＰＮ３２でトランスフェクションされた細胞系（ｒｈＦＩＩおよびＧＧＣＸの共発現）については、細胞毎の転写数が、ＧＧＣＸ ｍＲＮＡについては約８、ｒｈＦＩＩ ｍＲＮＡについては約２０００と算出され、そこからｒｈＦＩＩ：ＧＧＣＸの比が約２５０：１と算出された。細胞毎のＧＡＰＤＨコントロールｍＲＮＡ転写は同じサンプルで約４０００であった。
【００９９】
実施例４
ヒトＦＩＩの生産
実施例１でクローン化されたヒトＦＩＩおよびＧＧＣＸ ｃＤＮＡを実施例１と同様にｐＣＤＮＡ３．１に挿入した。さらに高いＧＧＣＸレベルを得るために、ｐＺｅｏＳＶ２＋由来のポリアデニル化シグナルを、ｐＣＤＮＡ３．１の鈍化したＤｒａＩＩＩにクローン化したｐＳＶ４０−ＧＧＣＸ−ｐＡフラグメントに含めた。実施例１と逆の順番のＧＧＣＸを含むフラグメントのクローンを選択した。その後、ＦＩＩフラグメントのクローン化を実施例１と同じ方法で行った。最終のコンストラクトＰＰ６を図２に示し、ＰＰ６ヌクレオチド配列を配列番号１３に示す。
【０１００】
２つのプロトロンビン生産細胞系、Ｂ２Ｆ４およびＨ３Ｂ１０を、実施例１に記載したようにＣＨＯ−Ｓのトランスフェクションにより得た。これらの２つの細胞系由来のプロトロンビンを実施例１のように精製し、同定した。Ｂ２Ｆ４の培養は３０〜７０ｍｇ／Ｌの範囲の生産性であり、十分にカルボキシル化されたものの割合は５５〜８７％であった（ｒｈＦＩＩが増えれば十分にカルボキシル化されたものは減る）。ブチレートの添加により幾分かの高い生産性が得られたが、十分にカルボキシル化されたｒｈＦＩＩの割合は減少し、有益であるとは認められなかった。Ｈ３Ｂ１０は増殖が遅く、生産性は約５０ｍｇ／Ｌであり、培養物中の細胞数と比較して高かった。十分にカルボキシル化されたｒｈＦＩＩの割合は約６０％であった。実施例１で得られた細胞系と比較して、ＣＨＯ細胞系のＰＰ６コンストラクトを使用して製造した十分にカルボキシル化されたｒｈＦＩＩは減少した。しかし、それでも、十分に活性な組み替えプロトロンビンの生産は、以前に文献開示されたレベルを大きく上回っている。
【０１０１】
実施例５
ｍＲＮＡ量の測定による、ＣＨＯ−Ｓ細胞系におけるγ−カルボキシラーゼおよびプロトロンビンの発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
実施例４のＢ２Ｆ４およびＨ３Ｂ１０細胞系を、実施例３と同じ方法および同じプライマーによるリアルタイムＰＣＲ分析により分析した。実施例３のサンプルと等価にするために、１０ｍＬの培養サンプルを生産性のピークにおいて採取した。クローンＨ３Ｂ１０については、このクローンの増殖の遅さのためにサンプルは１０日目のものであり、Ｂ２Ｆ４クローンについては、サンプルは６日目のものであった。
【０１０２】
表４．ＧＧＣＸを共発現するプロトロンビン生産細胞系のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果。Ｂ２Ｆ４およびＨ３Ｂ１０の各々についての２つの独立の１００ｍＬスピナー培養物がリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析のためにサンプリングされた。
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
＊比較のための実施例３のＰ１Ｅ２データ。
算出されたｒｈＦＩＩ ｍＲＮＡ：ＧＧＣＸ ｍＲＮＡの比は、クローンＨ３Ｂ１０については約３０：１、クローンＢ２Ｆ４については約５０：１、およびクローンＰ１Ｅ２については約２５０：１であった。
【０１０５】
実施例６
ヒト凝固ＩＸ因子（ＦＩＸ）の生産
ヒト凝固ＩＸ因子ｃＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したヒト遺伝子プール肝臓ｃＤＮＡから増幅させた。オリゴヌクレオチドプライマーは、
５’−末端；Ｆ９ｆ．ａｍｐｌ．：
５´−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴ−３´ （配列番号：１６）， および、３’−末端；Ｆ９ｒ．ａｍｐｌ．：
５´−ＣＣＴＴＧＧＡＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＴＴＡ−３´（配列番号：１７）
であった。
【０１０６】
ＤＮＡ配列決定により、正しい配列のクローン化を確認した。ヒトＦＩＸフラグメントを、Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびクローン化プライマーを使用してＰＣＲ増幅し、末端が鈍化されたフラグメントを作成した。末端鈍化フラグメントを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化し、実施例１および実施例４の、ＥｃｏＲＶ消化および脱リン酸化されたｐＣＤＮＡ−ＧＧＣＸベクターにクローン化した。この方法において、ヒトプロトロンビンの製造（実施例１および実施例４）に使用した共発現コンストラクトに類似するヒトＦＩＸおよびＧＧＣＸの共発現のためのコンストラクトを得た。正しい配列のクローン化を、ＤＮＡ配列決定およびＣＯＳ−７細胞における一時的発現により確認した。ベクターコンストラクトＦ９ＮｏｐＡを図３ａに示し、ベクターコンストラクトＦ９ｈｇｌｘを図３ｂに示した。ベクターＦ９ＮｏｐＡおよびＦ９ｈｇｌｘの差異は、ＧＧＣＸ遺伝子の転写方向である。Ｆ９ＮｏｐＡヌクレオチド配列を配列番号１４に示し、Ｆ９ｈｇｌｘヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。
【０１０７】
ｒｈＦＩＸを産生する細胞系の確立
実施例１において記載した手法を使用して、ｒｈＦＩXコンストラクトをＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクションした。各々のＦＩＸコンストラクトについて、約３０００クローンを細胞上清のＥＬＩＳＡによりｒｈＦＩＸの発現に関してスクリーニングした。使用した抗体はＨａｅｍａｔｈｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．およびＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎのものであった。クローンを選択し、タンパク質を含まない化学的に定義されるＣＨＯ培地において増殖するように適合させた。細胞を、Ｔ−フラスコ中で３７℃またはスピナー瓶中で３２〜３７℃のいずれかで培養した。双方の培養の型において、ＣＯ２濃度を５％とした。産生されたｒｈＦＩＸを、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換クロマトグラフィーによりｐＨ７．０で均質になるまで精製した。組み替えｈＦＩＸの活性は、ＦＩＸ欠損血漿（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）を使用して凝固アッセイ（Ｃｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）により測定した。得られた最も生産性のよいｒｈＦＩＸクローンは、Ｆ９ＮｏｐＡコンストラクトを使用して得られたＮ４Ｄ５であり、Ｔ−フラスコ中のタンパク質を含まない化学的に定義される培地で培養して４μｇ／ｍＬの活性ｒｈＦＩＸを生産した。スピナー瓶で培養した場合、この同じクローンは７．１μｇ／ｍＬのｒｈＦＩＸを生産した。不完全にカルボキシル化された不活性なｒｈＦＩＸも含めた全体の生産性はウエスタンブロッティングにより少なくとも３０μｇ／ｍＬであると推定された。ｒｈＦＩＸコンストラクトＦ９ｈｇｌｘにより得られた最も生産性のよいクローンは、同様の条件下で０．７（Ｔ−フラスコ）〜１．３（スピナー）μｇ／ｍＬのｒｈＦＩＸを生産するＰ１Ｇ９であった。この結果により、Ｆ９ＮｏｐＡコンストラクトを使用しての低レベルでのＧＧＣＸの共発現によりｒｈＦＩＸ生産性は改善されたが、Ｆ９ｈｇｌｘコンストラクトを使用してのＧＧＣＸの共発現は有益性が低いことが示された。Ｎ４Ｄ５クローンを生じさせるＦ９ＮｏｐＡコンストラクトは、一般に、細胞系開発手順の間の生産性の同時スクリーニングにおいて、Ｐ１Ｇ９を生じさせるＦ９ｈｇｌｘコンストラクトよりも高いＥＬＩＳＡシグナルを与えることも確認された。
【０１０８】
Ｎ４Ｄ５細胞系の生産性は、比較可能な条件下で得られた以前に文献に開示されたレベルよりも約４〜６良く、ここで、ＩＣ４、ＩＧ８、ｒ−ＦＩＸ ＢＨＫおよびｒ−ＦＩＸ２９３は参照文献において言及されているクローンの名前である（表５）。
【０１０９】
表５．ヒトＦＩＸ産生細胞系の生産性の比較
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
実施例７
ｍＲＮＡの量の測定によるＣＨＯ−Ｓ細胞系におけるγ−カルボキシラーゼおよびＩＸ因子の発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
組み替えｈＦＩＸ産生クローンを、１００ｍＬのビタミンＫを補ったタンパク質を含まない化学的に定義される培地で、３２〜３７℃でスピナー瓶中で培養した。５〜１０ｍＬのサンプルをｒｈＦＩＸ濃度のピークで採取し、ヒトＦＩＸおよびＧＧＣＸ転写物、ならびにＧＡＰＤＨコントロール（ハウスキーピング）遺伝子の転写物の含有量を分析した。手法は実施例３の通りであった。ｒｈＦＩＸのプライマーは以下の通りであった：
ヒトＩＸ因子プライマー
５´ ＡＡＴＡＧＴＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧ ３´
フォワードプライマー（配列番号：１８）
５´ ＣＡＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧＧＡＣＴＴＣＴ ３´
リバースプライマー（配列番号：１９）
５´ ＴＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣ ３´
プローブ（配列番号：２０）
アンプリコンの長さ ８４ｂｐ。
【０１１２】
メッセンジャーＲＮＡレベルは、培養温度および培養接種物規模に依存して、異なる日にピークとなることが見いだされた。ｍＲＮＡのピークレベルは、培養培地におけるｒｈＦＩＸの濃度のピークによく対応することが見いだされた。
【０１１３】
表６．ｒｈＦＩＸ産生クローンのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果
【０１１４】
【表７】
【０１１５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析より、２＾デルタＣｔ値が培養時間および条件により変動したにもかかわらず、ＦＩＸ：ＧＧＣＸ ｍＲＮＡ比が各クローンでほぼ同一であったこともまた我々は確認した。最も良いｒｈＦＩＸ産生クローンＮ４Ｄ５について、当該比は約４５：１であった。別のクローン、Ｐ１Ｇ９の分析においては約４．５：１というより低い比が得られた。Ｐ１Ｇ９クローンは、Ｎ４Ｄ５によって製造されるｒｈＦＩＸの量の２０％のみを生産した。
【０１１６】
配列表
配列番号１
【０１１７】
【化１】
【０１１８】
【化２】
【０１１９】
【化３】
【０１２０】
配列番号２
【０１２１】
【化４】
【０１２２】
【化５】
【０１２３】
【化６】
【０１２４】
【化７】
【０１２５】
配列番号１３
ＰＰ６配列
【０１２６】
【化８】
【０１２７】
【化９】
【０１２８】
【化１０】
【０１２９】
【化１１】
【０１３０】
【化１２】
【０１３１】
配列番号１４
Ｆ９Ｎｏｐａ配列
【０１３２】
【化１３】
【０１３３】
【化１４】
【０１３４】
【化１５】
【０１３５】
【化１６】
【０１３６】
配列番号１５
Ｆ９ｈｇｌｘ
【０１３７】
【化１７】
【０１３８】
【化１８】
【０１３９】
【化１９】
【０１４０】
【化２０】
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１ａ】図１ａはＰＮ３２（プロトロンビン＋ＧＧＣＸ）共発現ベクターのプラスミドマップを例示する。
【図１ｂ】図１ｂはＰｔｅｘｔ５（プロトロンビン）発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【図２】図２はＰＰ６（プロトロンビン＋ＧＧＣＸ）共発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【図３ａ】図３ａはＦ９ＮｏｐＡ（ＩＸ因子＋ＧＧＣＸ）共発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【図３ｂ】図３ｂはＦ９ｈｇｌｘ（ＩＸ因子＋ＧＧＣＸ）共発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【発明の開示】
【０００１】
技術分野
本発明は、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、ならびにγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、高収率でのγ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の製造方法にも関する。
【０００２】
背景技術
出血は臨床の一般的な問題である。それは疾患、外傷、手術および医療処置の帰結である。出血を物理的に止めることは欠かせない。出血の場所によっては、またはそれが多くの（小）血管から拡散する場合には、これが困難となるか不可能にすらなる場合がある。そこで、出血している患者は、止血をサポートする薬剤による処置を必要とする場合がある。これは、血液由来製剤（血液療法）、内因性止血剤の放出を引き起こす薬剤、組み替え凝固因子（Ｆ）、または凝血塊の溶解を遅延させる薬剤であってもよい。
【０００３】
血液由来製剤の中で、しばしば地方の病院において見られる第一選択処置は、量的置換および止血促進のための全血、酸素輸送能力の改善のための濃縮赤血球、（もし低いか問題がある場合は）血小板数の増加のための濃縮血小板、および止血（血液凝固および血小板凝集）促進のための新鮮凍結血漿である。第二選択の血漿由来製剤は、血漿クリオプレシピテート、プロトロンビン複合体濃縮製剤、活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤および精製凝固因子である。今日、不活性の（凝固ＶＩＩＩ因子およびＩＸ因子）および活性化された（凝固ＶＩＩａ因子）ヒト組み替えタンパク質として、いくつかの凝固因子が入手可能である。
【０００４】
血友病は、凝血因子の異常または欠損、または凝血促進機能を阻害する凝血因子に対する抗体のいずれかによる、先天的または後天的な出血障害である。最も一般的な血友病は、血友病Ａ（凝固ＶＩＩＩ因子の欠損）および血友病Ｂ（ＩＸ因子）である。精製または組み替えの単一凝固因子は血友病の患者の主な処置である。阻害性抗体による患者には処置における問題が生じる。当該患者においては、彼らに投与した凝固因子もまた中和されうるからである。活性型プロテインＣ（ＡＰＣ）は、活性化凝固Ｖａ因子およびＶＩＩＩａ因子の分解による血漿凝固の阻害剤である。組み替えＡＰＣは、敗血症の患者における過度の血漿凝固の効果的な処置となることが示されている。
【０００５】
精製の工程は単純ではなく、多くの工程（そのうちのいくつかは汚染ウイルスを除去すること目的とする工程）が必要となるが、治療的使用のための凝固因子はヒト血漿から得ることができる。しかし、血液由来製剤の多くの安全的手段および試験を伴ったとしても、感染性ウイルスまたはプリオンによる汚染は除去しきれない。このリスクのために、動物由来の成分を伴わない、ヒト治療用タンパク質の組み替え細胞培養からの製造が非常に望まれている。これは常に容易とは限らない。なぜなら、十分に機能的な形態で製造する（すなわち、翻訳後に正しく修飾する）ために多くのタンパク質においては哺乳類宿主が必要となるからである。凝固因子のうちで、組み替え細胞において商業的に製造されている凝固因子は、ＦＶＩＩ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）、ＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ、Ｒｅｆａｃｔｏ）およびＦＩＸ（ＢｅｎｅＦｉｘ）（ＲｏｄｄｉｅおよびＬｕｄｌａｍ、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．第１１巻、第１６９〜１７７頁、１９９７年）および活性プロテインＣ（Ｘｉｇｒｉｓ）である。十分に機能する組み替えヒト凝固因子を大量に得る場合の主な障害の１つは、ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸおよびプロテインＣに存在するＧｌａ−ドメインにある。このドメインは、カルボキシル基の付加により翻訳後に修飾されるグルタミン酸残基を含む。これらの因子の製造は、それらの過剰発現が不十分なカルボキシル化、それによるタンパク質の不活性化を引き起こすという事実により妨げられている。Ｇｌａ修飾は、γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＧＧＣＸ）と呼ばれるビタミンＫ依存性酵素の作用のよるものである。この酵素は、多くの科学者、特に凝固因子研究に関わる人々により多くの研究がなされている（ＷＯ−Ａ−８８０３９２６；Ｗｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２５４巻（５０３８）：第１６３４−１６３６頁、１９９１年；Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９０巻：第４６１１−４６１５頁、１９９３年；Ｓｔａｎｌｅｙ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２７４巻（２４）：第１６９４０−１６９４４頁、１９９９年；Ｖｏら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ 第４４５巻：第２５６−２６０頁、１９９９年；Ｂｅｇｌｅｙら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２７５巻（４６）：第３６２４５−３６２４９頁、２０００年；Ｗａｌｋｅｒら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２７６巻（１１）：第７７６９−７７７４頁、２００１年；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９９巻（３）：第１２６４−１２６９頁、２００２年；Ｃｚｅｒｗｉｅｃら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ 第２６９巻：第６１６２−６１７２頁、２００２年；Ｈａｌｌｇｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第４１巻（５０）：第１５０４５−１５０５５頁，２００２年；Ｈａｒｖｅｙら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２７８巻（１０）：第８３６３−８３６９頁、２００３年）。凝固因子ＦＩＸと共にＧＧＣＸを共発現することにより収率を増加させる試みは、少なくとも２つの科学者グループにより行われているが成功していない（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、１９９３年，ｉｂｉｄ；Ｈａｌｌｇｒｅｎら、２００２年，ｉｂｉｄ）。γ−カルボキシル化タンパク質における大きな関心を考慮すると、より多くの共発現の試みが失敗に終わり、そのため報告されなかったものと推測されうる。
【０００６】
ヒトＦＩＩ（プロトロンビン）については、十分に機能するプロトロンビンを得るためには、１０のＧｌｕ残基のうちの少なくとも８が正しく修飾されなければならない（Ｍａｌｈｏｔｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６０巻：第２７９−２８７頁、１９８５年；ＳｅｅｇｅｒｓおよびＷａｌｚ「Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）。例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞およびワクシニアウイルス発現系などのいくつかの異なる系を使用して、ｒｈＦＩＩの高い生産レベルを実現するために多くの努力がなされたが、すべて、失敗に終わるか、または不十分にカルボキシル化された生成物、すなわち機能的に不活性なプロトロンビンが得られた（Ｊφｒｇｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６２巻：第６７２９−６７３４頁、１９８７年；Ｒｕｓｓｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ 第１４巻（２）：第２２２−２３３頁、１９９１年；Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ 第３８巻（２）：第１２９−１３６頁、１９９５年；Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．第８巻（３）：第３５８−３６４頁、１９９６年；Ｒｕｓｓｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．第１０巻：第２１４−２２５頁、１９９７年；Ｖｏら、１９９９年、ｉｂｉｄ；ＷｕおよびＳｕｔｔｉｅ、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ 第９６巻（２）：第９１−９８頁、１９９９年）。以前に報告されたカルボキシル化組み替えヒトプロトロンビンの生産性は低く、変異プロトロンビンについて２０ｍｇ／Ｌ（Ｃｏｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ 第２６９巻：第１１３７４−１１３８０頁、１９９４年）、ＣＨＯ細胞で発現したヒトプロトロンビンについて０．５５ｍｇ／Ｌ（十分にカルボキシル化されたもの、Ｊφｒｇｅｎｓｅｎら、１９８７年、ｉｂｉｄ）、ＣＨＯ細胞中で２５ｍｇ／Ｌ（カルボキシル化の程度は示されていない、Ｒｕｓｓｏら、１９９７年、ｉｂｉｄ）である。
【０００７】
ＷＯ９２／１９６３６は、ヒトおよびウシのビタミンＫ依存性カルボキシラーゼのクローニングおよび配列同定を開示する。当該出願は、ビタミンＫ依存性タンパク質の調製のために、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼおよびビタミンＫ依存性タンパク質を好適な宿主細胞中で共発現することを示唆している。カルボキシラーゼおよびビタミンＫ依存性タンパク質の共発現は何ら例示されていない。
【０００８】
活性化された血液凝固因子を高収率で製造する方法が求められている。本発明は、この必要性に応えることを目的とする。
【０００９】
発明の概要
本発明の第１の側面によれば、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞であって、第１のプロモーターは第２のプロモーターよりも十分に強力であり、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼは少なくとも１０：１の比で発現する、前記宿主細胞が提供される。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼを発現するように設計された細胞であって、タンパク質（ｉ）および（ｉｉ）は１０：１〜５００：１の比で発現する、前記細胞が提供される。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、遺伝子修飾された真核宿主細胞であって：
（ｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（前記γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードする配列は、前記細胞によるγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）；および
（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド（前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）
を含み、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質およびカルボキシル化を必要とするタンパク質を少なくとも１：１０の比で発現することができる前記細胞が提供される。
【００１２】
本発明のさらなる側面によれば、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターであって、第１のプロモーターは第２のプロモーターよりも十分に強力であり、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼは少なくとも１０：１の比で発現する、前記宿主細胞が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、γ−カルボキシル化されたタンパク質の製造方法であって、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたタンパク質を単離すること、を含む前記方法が提供される。１つの態様において、当該方法はγ−カルボキシル化されたヒトＩＸ因子を製造するために使用され、別の態様において当該方法はγ−カルボキシル化されたヒトプロトロンビンを製造するために使用される。別の側面において、製造したγ−カルボキシル化されたタンパク質はヒトγ−カルボキシル化Ｘ因子である。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、哺乳類細胞系におけるγ−カルボキシル化タンパク質の製造方法であって、γ−グルタミルカルボキシラーゼと哺乳類細胞系でγ−カルボキシル化を必要とする前記タンパク質を共発現させる工程であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現量がγ−グルタミルカルボキシラーゼの発現量の少なくとも１０倍を越える前記工程、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化タンパク質を単離する工程を含む前記方法が提供される。１つの実施態様において、当該方法は、γ−カルボキシル化されたヒトＩＸ因子の製造に使用され、別の態様において、当該方法は、γ−カルボキシル化されたヒトプロトロンビンの製造に使用される。別の態様において、製造されるγ−カルボキシル化タンパク質はヒトγ−カルボキシル化Ｘ因子である。
【００１５】
本発明のさらなる側面によれば、上記の方法により製造され単離されたγ−カルボキシル化タンパク質、上記の方法により製造され単離されたγ−カルボキシル化タンパク質の凝固療法における使用、または上記の方法により製造され単離されたγ−カルボキシル化タンパク質の、凝固療法において使用するための医薬の製造における使用が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる側面によれば、血液凝固の誘導または凝固の増強または抑制の促進に適した医薬組成物の製造方法であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを１０：１〜５００：１の比で発現するように設定された宿主細胞から発現された活性なカルボキシル化タンパク質を精製すること、および精製したカルボキシル化タンパク質を１以上の医薬として許容な担体または賦形剤と混合することを含む前記方法、ならびに当該方法から得られる医薬組成物が提供される。１つの態様において、活性なカルボキシル化タンパク質はγ−カルボキシル化ヒトＩＸ因子であり、別の態様において、活性なカルボキシル化タンパク質はγ−カルボキシル化ヒトプロトロンビンである。別の態様において、活性なカルボキシル化タンパク質はγ−カルボキシル化Ｘ因子である。
【００１７】
発明の詳細な説明
我々は、ビタミンＫ依存性凝固因子およびγ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＧＧＣＸ）の異なる比での共発現に関連する、適切にカルボキシル化された組み替えビタミンＫ依存性凝固因子の発現のための異なるアプローチを創出した。一例として、ヒトプロトロンビン（ｒｈＦＩＩ）およびヒトＧＧＣＸを発現した。他者が試みたような（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、１９９３年、ｉｂｉｄ；Ｈａｌｌｇｒｅｎら、２００２年、ｉｂｉｄ）ｒｈＦＩＩおよびＧＧＣＸの双方についての強いプロモーターを使用する代わりに、我々は、ＧＧＣＸの発現量がｒｈＦＩＩの発現量の１／１０未満となるように、ＧＧＣＸの弱いまたは非常に弱い発現を組み合わせたＦＩＩの強い発現をねらった方策を用いた。驚くべきことに、この方策により、宿主細胞を動物成分を含まない化学的に定義される培地において培養した場合であっても、高レベルの分泌型の正しく修飾されたｒｈＦＩＩおよび宿主細胞の良好な生存率を実現した。
【００１８】
我々は、ヒトプロトロンビンのｍＲＮＡレベルがＧＧＣＸのｍＲＮＡレベルを少なくとも１０倍上回るように、ＧＧＣＸおよびヒトプロトロンビンを発現ベクターにクローン化した。これによりＧＧＣＸタンパク質と比較して大過剰のプロトロンビンタンパク質を生産することができた。
【００１９】
さらなる例として、我々は、同じＧＧＣＸ共発現ベクターを使用してｒｈＦＩＸを発現した。この結果、ある場合に、ＧＧＣＸｍＲＮＡレベルを少なくとも１０倍上回るレベルでＩＸ因子ｍＲＮＡを生産する細胞系が得られた。別の細胞系において、ｍＲＮＡのＩＸ因子：ＧＧＣＸの比は薬４〜５：１であった。少なくとも１０：１の比を与える細胞系のみが実質的なｒｈＦＩＸ生産性の向上を示した（表１）。
【００２０】
表１．生産性とカルボキシル化されたタンパク質：ＧＧＣＸのｍＲＮＡ比の概要
【００２１】
【表１】
【００２２】
＊生産性は同様の培養条件下でのスピナー培養から測定した。
＃Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ １９９３年および米国特許Ｎｏ．５，４６０，９５０からのデータ
ＧＧＣＸとの共発現の本方法により製造されたビタミンＫ依存性凝固因子（ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、およびそれらの活性型ＦＩＩａまたはトロンビン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ）は、外傷、手術、または肝臓、腎臓、血小板もしくは血液凝固因子の疾患に伴う出血の予防または治療において有用であることが期待されうる。同様に、凝固因子プロテインＣおよびその活性型ＡＰＣもまた、プロテインＣのレベルの減少を伴うか伴わないかによらず、凝固の増強の不全の予防また治療において有用であることが期待される。当該方法はまた、翻訳後のカルボキシル化を必要とするその他のタンパク質にも適用することができる。
【００２３】
本発明の第１の側面によれば、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞であって、第１のプロモーターは第２のプロモーターよりも十分に強力であり、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼは少なくとも１０：１の比で発現する、前記宿主細胞が提供される。
【００２４】
好ましい実施態様において、発現されるタンパク質の比は１０：１〜１０００：１、より好ましくは１０：１〜５００：１、さらに好ましくは２５：１〜２５０：１である。特に好適な比は約２００：１である。
【００２５】
別々の態様において、発現される２つのタンパク質はの比は、少なくとも１０：１、３０：１、４５：１、５０：１、１００：１、２００：１、２５０：１、３００：１、４００：１、５００：１および１０００：１でありうる。
【００２６】
ある特定の実施態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子の双方が同じ発現ベクターに位置する。別の態様において、これらの核酸分子は別々の発現ベクターに位置する。
【００２７】
本発明のさらなる側面によれば、配列番号１４および配列番号１５の核酸が提供される。
本発明のさらなる側面によれば、ヒトＩＸ因子の発現のための、配列番号１４または配列番号１５の配列を含むベクターにより形質移入または形質転換された宿主細胞が提供される。
【００２８】
本発明のさらなる側面によれば、ヒト凝固ＩＸ因子およびヒトγ−カルボキシラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞であって、前記ヒト凝固ＩＸ因子をコードする核酸およびγ−カルボキシラーゼをコードする核酸は、２つのタンパク質を各々少なくとも１０：１の比で発現することができる制御配列と操作可能なように連結している前記細胞が提供される。
【００２９】
本発明のさらなる側面によれば、ヒト凝固ＩＸ因子およびヒトγ−カルボキシラーゼ酵素を少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた非ヒト真核宿主細胞が提供される。特定の実施態様において、ヒト凝固ＩＸ因子をコードする核酸およびγ−カルボキシラーゼをコードする核酸は、２つのタンパク質を各々少なくとも１０：１の比で発現することができる制御配列と操作可能なように連結する。
【００３０】
本発明のさらなる側面によれば、ｈＣＭＶプロモーターの制御下のヒト凝固ＩＸ因子をコードする核酸、およびＳＶ４０プロモーター制御下のヒトカルボキシラーゼをコードする核酸を含む外因性の核酸を保持する宿主細胞が提供される。
【００３１】
本発明のさらなる側面によれば、配列番号１、配列番号２または配列番号３の核酸が提供される。
本発明のさらなる側面によれば、ヒトプロトロンビンの発現のための、配列番号１、配列番号２または配列番号３の配列を含むベクターにより形質移入または形質転換された宿主細胞が提供される。
【００３２】
本発明のさらなる側面によれば、ヒトプロトロンビンおよびヒトγ−カルボキシラーゼ酵素を発現することができる宿主細胞であって、前記ヒトプロトロンビンをコードする核酸およびγ−カルボキシラーゼをコードする核酸は、２つのタンパク質を各々少なくとも１０：１の比で発現することができる制御配列と操作可能なように連結している前記細胞が提供される。
【００３３】
本発明のさらなる側面によれば、ヒトプロトロンビンおよびヒトγ−カルボキシラーゼ酵素を少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた非ヒト真核宿主細胞が提供される。特定の実施態様において、ヒト凝固ＩＸ因子をコードする核酸およびγ−カルボキシラーゼをコードする核酸は、２つのタンパク質を各々少なくとも１０：１の比で発現することができる制御配列と操作可能なように連結する。
【００３４】
本発明のさらなる側面によれば、ｈＣＭＶプロモーターの制御下のヒトプロトロンビンをコードする核酸、およびＳＶ４０プロモーターの制御下のヒトカルボキシラーゼをコードする核酸を含む外因性の核酸を保持する宿主細胞が提供される。
【００３５】
本発明はカルボキシル化を必要とするタンパク質としてプロトロンビンおよび凝固ＩＸ因子を使用して例示される。しかし、プロトロンビンおよびＩＸ因子以外のいくつかのタンパク質は、十分な生物学的活性が正確なγ−カルボキシル化に依存している。ヒト由来の既知のものの中で、凝固因子ＦＶＩＩのみが、現在比較的低いレベル（約１０ｍｇ／Ｌ以下）で組み替え哺乳類細胞において商業的に製造されている。本発明は、γ−カルボキシル化に依存する任意のタンパク質の生産性の改善に適用されるであろう。限定はされないが、当該タンパク質には、プロトロンビン、凝固ＩＩ因子（ＦＩＩ）、凝固ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、凝固ＩＸ因子（ＦＩＸ）、凝固Ｘ因子（ＦＸ）、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質（ＢＧＰまたはオステオカルシンとして知られている）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、プロリンリッチＧｌａポリペプチド１（ＰＲＲＧ１）、プロリンリッチＧｌａポリペプチド２（ＰＲＲＧ２）、増殖抑制特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）などが含まれる。その他の好適なタンパク質は、コブラ（Ａｃａｎｔｈｏｐｈｉｉｎａサブファミリー）の蛇毒およびイモ貝（ｃｏｎｅ ｓｎａｉｌ；Ｃｏｎｕｓ ｔｅｘｔｉｌｅ）の毒中のＦＸａ様タンパク質である。
【００３６】
これらのタンパク質の各々は、対応の核酸およびアミノ酸配列を含めて周知である。表２は、本発明において使用することができる種々のタンパク質の野生型および変異型の代表的な配列を特定する。
【００３７】
表２
【００３８】
【表２】
【００３９】
本発明は、共発現するこれらのタンパク質の１つのうちの特定のタンパク質またはタンパク質をコードする配列に限定されないことは理解されるであろう。さらに、特に血液凝固因子に関して、当該タンパク質の多くの変異型が当該技術分野において開示されている。本発明は、自然に発生する突然変異を含む当該タンパク質のこれらの変異型にも、野生型配列と同様に適用可能である。１つの態様において、本発明は、任意の野生型タンパク質または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の野生型との配列同一性を有するタンパク質において行われうる。
【００４０】
２つの配列間の配列同一性は、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＰＩＬＥＵＰ、ＧａｐまたはＦｒａｍｅＡｌｉｇｎなどのペアワイズコンピューターアラインメント分析により決定されうる。好ましいアラインメントツールはＢｅｓｔＦｉｔである。実際は、配列データベース内からクエリサーチに対する類似／同一の配列を検索する場合に、一般的には、Ｂｌａｓｔ、Ｂｌａｓｔ２、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ２、ＷａｓｈＵ Ｂｌａｓｔ２、ＦａｓｔＡ、またはＦａｓｔａ３などの好適なアルゴリズム、およびＢｌｏｓｕｍ６２などのスコア行列を使用しての類似配列の所期同定を行うことが必要である。当該アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの「ｇｏｌｄ−ｓｔａｎｄａｒｄ」アラインメントアルゴリズムに近似させることを試みるものである。したがって、類似性の評価（すなわち、２つの一次ポリペプチド配列がどのような並んでいるか）において使用するために好ましいソフトウエア／サーチエンジンプログラムはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎである。同一とは直接一致を意味し、類似では慣用の置換がされていてもよい。
【００４１】
本明細書で使用される用語「γ−グルタミルカルボキシラーゼ」または「ＧＧＣＸ」は、グルタミン酸残基のカルボキシル化を触媒するビタミンＫ依存性酵素を意味する。
ＧＧＣＸ酵素は広く分布しており、シロクジラ（Ｄｅｌｐｈｉｎａｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃａｓ）、トードフィッシュ（Ｏｐｓａｎｕｓ ｔａｕ）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、メクラウナギ（Ｍｙｘｉｎｅ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）、およびイモ貝（Ｃｏｎｕｓ ｔｅｘｔｉｌｅ）などの多くの異なる種からクローン化されている（Ｂｅｇｌｅｙら、２０００年、ｉｂｉｄ；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、２００２，ｉｂｉｄ）。イモ貝由来のカルボキシラーゼはウシのカルボキシラーゼに類似し、ＣＯＳ細胞において発現されている（Ｃｚｅｒｗｉｅｃら、２００２、ｉｂｉｄ）。ＧＧＣＸに類似する別のタンパク質が、昆虫およびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａなどの原核生物において、各々、ＮＣＢＩ受け入れ番号：ｇｉ３１２１７２３４、ｇｉ２１２９８６８５、ｇｉ２４２１６２８１、およびｇｉ２４１９７５４８で発見されている（Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、２００２，ｉｂｉｄ）。カルボキシラーゼ酵素は顕著な進化的保存性を示している。いくつかの非ヒト酵素は、我々が使用したヒトＧＧＣＸと類似の活性が確認されるか、類似の活性を有することが予想されうるものであり、したがってヒト酵素の代替として使用されうる。
【００４２】
表３は、本発明で使用されうる、予想されるヒトＧＧＣＸと類似するタンパク質（種の由来によって分類）の代表的な配列を示す。
表３
【００４３】
【表３−１】
【００４４】
【表３−２】
【００４５】
上掲のＧＧＣＸタンパク質および他の種由来のＧＧＣＸタンパク質の各々は本発明のカルボキシラーゼ酵素として使用されうる。
２つの共発現タンパク質の差別的発現を達成する１つの方法は、各々の発現制御配列の一部として異なるプロモーターを使用することである。異種のタンパク質を異なる程度および範囲で発現することができる、異なるプロモーターおよびその他の発現制御配列の例は、当該技術分野においては十分に存在する。組み替え発現技術は好適に進展しており、タンパク質発現の技術分野の当業者は、目的の比率で、カルボキシル化を必要とするタンパク質およびカルボキシラーゼの共発現を実現するためのプロモーターおよびその他の制御配列を選択することができる。使用する特定のプロモーターおよびその他の発現制御配列の選択は、個々の選択事項である。
【００４６】
１つの態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質に関連する制御配列は強力なプロモーターを含む。１つの態様において、それはヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーターである。ここで、強力なプロモーターとは、１０００転写物／細胞以上を引き起こすプロモーターと定義される。ここで、弱いプロモーターとは、１０００転写物／細胞未満を引き起こすプロモーターと定義される。
【００４７】
別の態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼに関連する制御配列は弱いプロモーターを含む。１つの態様において、これはＳＶ４０初期プロモーターである。別の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼは、γ−カルボキシラーゼを必要とするタンパク質の発現を制御するプロモーターよりも弱いγ−グルタミルカルボキシラーゼの発現を制御するプロモーターを伴う異なるプロモーター要素の制御下にある。
【００４８】
別の態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼはＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあり、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーターの制御下にある。本発明のこの特定の側面による１つの態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はヒトＸ因子である。別の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はヒトプロトロンビンである。別の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はヒトＩＸ因子である。
【００４９】
本発明は、ＩＸ因子またはプロトロンビンを過剰発現するための強力なＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ 第４１巻：第５２１−５３０頁、１９８５年）およびＧＧＣＸの発現を制御するためのより弱いＳＶ４０プロモーター（Ｗｅｎｇｅｒら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ 第２２１巻：第４１６−４１８頁、１９９４年）の使用により例示される。本発明において使用されうるその他の強力なプロモーターには、限定されないが、ｐＥＦ−１α［ヒト伸長因子−１αサブユニット遺伝子）（ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ 第１８巻：第５３２２頁、１９９０年；Ｇｏｌｄｍａｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 第２１巻：第１０１３−１０１５頁、１９９６年）、ｐＲＳＶ［ラウス肉腫ウイルス（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第７９巻：第６７７７〜６７８１頁、１９８２年）］およびｐＵｂＣ［ヒトユビキチン（Ｓｃｈｏｒｐｐら、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ 第２４巻：第１７８７〜１７８８頁、１９９６年）］が含まれる。
【００５０】
製造されるタンパク質（カルボキシル化を必要とするタンパク質）が修飾酵素に対して、少なくとも１０：１の比であるように過剰とすることを確保することが重要である。修飾酵素（γ−グルタミルカルボキシラーゼ）の低レベルの発現を実現する方法には：
１）限定はされないが、ＳＶ４０前初期プロモーター、最小化ＦＩＸプロモーター（Ｒｏｕｅｔら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２６７巻：第２０７６５〜２０７７３頁、１９９２年）またはＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター（Ｗｅｎｇｅｒら、１９９４年、ｉｂｉｄ）が含まれる、修飾酵素の発現を制御する弱いプロモーターを使用すること、
２）プロモーター強度を減ずるためにプロモーターまたは強力なプロモーターのエンハンサー配列の変異させること、
３）翻訳効率を抑制するためにＫｏｚａｋ配列（翻訳開始シグナル）を除去または変化させること（Ｋｏｚａｋ．Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ 第１５巻：第８１２５〜８１４８頁、１９８７年；Ｋｏｚａｋ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第８７頁：第８３０１〜８３０５、１９８７年、１９９０年）、
４）製造されるタンパク質（カルボキシル化を必要とするタンパク質）をコードする核酸およびＧＧＣＸをコードする核酸を別々のベクター上にクローン化し、製造されるタンパク質を含むコンストラクトの多数の複製を有する細胞が発生するように、製造されるタンパク質を含む大過剰のコンストラクトをトランスフェクションすること、
５）製造されるタンパク質をコードするＤＮＡおよびＧＧＣＸ修飾ベクターをコードするＤＮＡを別々のベクター上にクローン化し、同時にまたは別々にトランスフェクションし、製造されるタンパク質の発現を増幅するための増幅系を使用すること、
６）組み替え技術により低レベルでＧＧＣＸを発現する（しかし、内因的レベルは上回る）安定細胞系を単離し、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現のための宿主細胞系として使用すること、
７）ＧＧＣＸの基質親和性を減少させるために、ＧＧＣＸに変異（複数でもよい）を導入すること、
が含まれる。
【００５１】
これらの他に、組み替えタンパク質発現の技術分野の当業者であれば、少なくとも１０：１の比でカルボキシル化を必要とするタンパク質とカルボキシラーゼタンパク質を発現する宿主細胞を発生させるために使用されうるその他の方法に気づくであろう。
【００５２】
本発明のさらなる側面によれば、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質、および（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼを発現し、当該タンパク質（ｉ）および（ｉｉ）が１０：１〜５００：１に比で発現するように処理された、または適合させた細胞が提供される。特定の態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼは内因性のレベル（すなわち、何らの処理も適合もされていない細胞におけるレベル）を２〜５倍上回って発現されている。
【００５３】
本発明のさらなる側面によれば、（ｉ）適合させていない対応する細胞における構成要素濃度を上回るγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質、および（ｉｉ）カルボキシル化を必要とするタンパク質、を発現するように適合させた組み替え細胞であって、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質およびカルボキシル化を必要とするタンパク質の発現量が少なくとも１：１０の比となる、前記細胞が提供される。
【００５４】
本発明のさらなる側面によれば、遺伝子修飾された真核宿主細胞であって：
（ｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（前記γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードする配列は、前記細胞によるγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）；および
（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド（前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）
を含み、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質およびカルボキシル化を必要とするタンパク質を少なくとも１：１０の比で発現することができる前記細胞が提供される。
【００５５】
本発明のさらなる側面によれば、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを発現するように適合された細胞であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸およびγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸が、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現量がγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の少なくとも１０倍量であることを確保するために適した制御配列の制御下にある、前記細胞が提供される。
【００５６】
１つの態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼの少なくとも１つが、組み替え技術により細胞内へ導入された核酸から発現される。本発明を実施するための代替の方法は、内因性のタンパク質（カルボキシル化を必要とするタンパク質またはカルボキシラーゼ）の発現であって、ただし目的のレベルの発現を生じさせるために、内因性の制御配列（プロモーターなど）を異種の配列で置換することを伴う発現である。
【００５７】
宿主細胞は、好ましくは真核細胞である。限定はされないが、典型的な宿主細胞には、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳類細胞が含まれる。哺乳類細胞は特に好ましい。限定はされないが、好適な哺乳類細胞系には、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳ０、２９３、ＰｅｒＣ．６、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞、およびその派生物が含まれる。１つの態様において、宿主細胞は哺乳類細胞系ＣＨＯ−Ｓである。
【００５８】
カルボキシル化依存性タンパク質の過剰発現は、一般的には、初期に不十分にカルボキシル化された生成物をもたらす。これは宿主細胞の内因性カルボキシル化能力が制限されていることに起因する。一方で、大過剰（１６〜７０倍）のＧＧＣＸ活性の発現は、生成物の収率を改善しない（Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９０巻：第４６１１〜４６１５頁、１９９３年）、（ＢｅｒｋｎｅｒおよびＰｕｄｏｔａ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．第９５巻：第４４６〜４７１頁、１９９８年）、（Ｈａｌｌｇｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第４１巻（５０）：第１５０４５〜１５０５５頁、２００２年）。この理由は十分に理解されていない。我々の発明は、ＧＧＣＸの適度な過剰発現を要求する。これにより、例えば、ＧＧＣＸ活性レベルが１．５〜４倍のみで上昇した場合、ＧＧＣＸが内因性レベルを超えて細胞から発現されることが確保される。この適度なレベルの上昇により、驚くべきことに、実施例１に示すように十分にカルボキシル化された高レベルのｒｈＦＩＩを得ることができる。
【００５９】
したがって、従前の共発現技術と本発明を区別するカルボキシル化を必要とするタンパク質およびカルボキシラーゼの発現比率は、内因的に製造されるＧＧＣＸのレベルを除外する。必要とされる高い生産性を実現するために、通常の細胞において観察されるレベルよりも高いレベルで、カルボキシラーゼおよびカルボキシル化を必要とするタンパク質を発現することが必要である。
【００６０】
好ましい態様において、構成的に発現されるカルボキシラーゼおよび／またはカルボキシル化を必要とするタンパク質をほとんど、または全く有さない細胞または細胞系が使用される。
【００６１】
１つの態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼは、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の量の１０％以下で発現される。代替のさらなる態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼは、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の量の５％、２％、１％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以下で発現される。
【００６２】
２つのタンパク質の発現の程度は、当該技術分野における当業者によく知られている技術を使用して測定されうる。これらには、例えばタンパク質の生物学的活性もしくはタンパク質の量（例えば、抗体を使用する）の測定などの直接的測定、または、例えばｍＲＮＡ転写物レベルの測定（例えば、実施例３のようなタックマン分析）を介する非直接的測定方法が含まれる。以下の参照文献はＧＧＣＸ酵素活性の測定方法を開示する（Ｌｉｎｇｅｎｆｅｌｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第３５巻：第８２３４〜８２４３頁、１９９６年；Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９５巻：第４４６〜４７１頁、１９９８年；Ｈａｌｌｇｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第４１巻（５０）：第１５０４５〜１５０５５頁、２００２年；および、Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第８９巻：第６２４２〜６２４６頁、１９９２年）。
【００６３】
本発明の目的のために、２つのタンパク質発現の比は、ｍＲＮＡ転写レベル（例えば、タックマン分析による）を介して非直接的に決定されうる。
１つの態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はビタミンＫ依存性凝固因子である。さらなる態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質は、好ましくは、プロトロンビン、凝固ＩＩ因子、凝固ＦＩＩ、凝固ＶＩＩ因子、凝固ＦＶＩＩ、凝固ＩＸ因子、凝固ＦＩＸ、凝固Ｘ因子、凝固ＦＸ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖抑制特異的タンパク質６およびアカントフィナエ（Ａｃａｎｔｈｏｐｈｉｉｎａｅ）ＦＸａ様タンパク質からなる群から選択される。
【００６４】
１つの特定の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はＩＸ因子である。別の特定の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はプロトロンビンである。別の態様において、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質はＸ因子である。
【００６５】
本発明は、任意の起源由来のγ−カルボキシル化を必要とするタンパク質に対して一般的適用性を有する。しかし、発現されるタンパク質がヒトの治療目的で使用されるのであれば、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【００６６】
１つの態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼは、マウス、ラット、ウシまたはイモ貝起源のものである。別の態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼはヒトタンパク質である。
【００６７】
本発明のさらなる側面によれば、γ−カルボキシル化されたタンパク質の製造方法であって、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を、双方のタンパク質の発現に好適な条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたタンパク質を単離すること、を含む前記方法が提供される。
【００６８】
本発明のさらなる側面によれば、哺乳類細胞系におけるγ−カルボキシル化タンパク質の製造方法であり、哺乳類細胞系における前記γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質と共に、γ−グルタミルカルボキシラーゼを共発現させる工程（ここで、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現量が、γ−グルタミルカルボキシラーゼの発現量の少なくとも１０倍である）；および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたタンパク質を単離することを含む、前記方法が提供される。
【００６９】
γ−カルボキシル化されたタンパク質の製造方法であって：
ａ）カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質を少なくとも１０：１の比で共発現することができる真核宿主細胞を製造するための、カルボキシル化を必要とするタンパク質および付随する発現制御配列をコードする第１のポリヌクレオチド、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび付随する発現制御配列をコードする第２のポリヌクレオチドを導入するための真核細胞の遺伝子的修飾；
ｂ）第１および第２のポリヌクレオチドを発現させるための条件下で好適な培地中で当該細胞を培養すること；およびｃ）当該培地または宿主細胞からのカルボキシル化されたタンパク質の単離、
を含む前記方法が提供される。
【００７０】
発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、場合によってはシグナルペプチド、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、選択のための１以上の抗生物質耐性マーカー遺伝子（複数でもよい）を含む。好適な発現ベクターは、プラスミド、コスミド、またはファージもしくはレトロウイルスなどのウイルスであってもよい。ポリペプチドのコードする配列は、適切なプロモーター（すなわち、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＴＫ、ＲＳＶ、ＳＶ４０など）、制御要素および転写ターミネーター（これらは関連する発現制御配列である）の制御下に置かれ、そのため核酸をコードする核酸配列は、発現ベクターコンストラクトにより形質転換または形質移入された宿主細胞においてＲＮＡに転写される。コードする配列は、宿主細胞の外へのポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。好ましいベクターは、通常、少なくとも１つの多重クローニング部位を有するであろう。特定の態様においては、プロモーターおよび発現する遺伝子の間に位置するクローニング部位または多重クローニング部位が存在するであろう。当該クローニング部位は、当該部位に第２の核酸配列をクローニングすることによりＮ−末端融合タンパク質を作成するために使用することができ、そのため遺伝子配列とインフレームで接続している。その他の態様において、上記のＮ−末端融合のための部位と類似の様式のＣ−末端融合の作成を容易にするために、遺伝子のすぐ下流に位置するクローニング部位または多重クローニング部位が存在してもよい。
【００７１】
宿主細胞は、例えば形質移入、形質変換およびエレクトロポレーションなどの、当該技術分野における当業者に周知の種々の方法により、遺伝子修飾（追加の核酸を導入）されていてもよい。
【００７２】
本発明はまた、本発明の方法により製造される精製γ−カルボキシル化タンパク質および凝固療法におけるそれらの使用に及ぶ。
本発明のさらに別の側面によれば、対象における凝固の増加または減少を促進する方法であって、それを必要とする患者に対して、上記の方法により得た薬理学的有効量の単離したγ−カルボキシル化タンパク質を投与することを含む前記方法が提供される。
【００７３】
本発明のさらなる側面によれば、血液凝固の誘導に適した医薬組成物を製造する方法であって、少なくとも１０：１の比でγ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを発現させることに適合させた宿主細胞から発現した活性なカルボキシル化されたタンパク質を精製すること、および１以上の医薬的に許容な担体または賦形剤と当該精製したカルボキシル化されたタンパク質を混合することを含む前記方法が提供される。
【００７４】
タンパク質系の治療剤は、通常、凍結、冷蔵、室温で、および／または凍結乾燥状態で貯蔵される。
本発明の組成物は、当該技術分野において周知の、慣用の医薬賦形剤を使用して、慣用の手法により得られうるが、非経口的または障害部位への直接的な注射に適した形態であるのが最も適当であろう。
【００７５】
一般に、水性懸濁液は、１以上の懸濁剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムなど）；分散剤または湿潤剤（例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（例えば、ポリエチレンステアレート）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレート））と一緒に、微粉化された形態の活性成分を含む。水性懸濁液はまた、１以上の保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルもしくはプロピル）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、着色剤、香味剤、および／または甘味剤（例えば、スクロース、サッカリンまたはアスパルテーム）を含んでいてもよい。
【００７６】
油性懸濁液は、植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油）または鉱油（例えば、流動パラフィン）中に活性成分を懸濁させることにより製剤されうる。油性懸濁液はまた、増粘剤（例えば、蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコール）を含んでいてもよい。甘味剤（例えば上記のもの）および香味剤は口当たりのよい経口製剤を提供するために加えてもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存されうる。
【００７７】
好適な希釈剤を加えることによる注射用の水性製剤の調製に適した粉末は、一般に、好適な担体および賦形剤を伴う活性成分、懸濁剤、および１以上の安定化剤または保存料を含む。希釈剤は、例えば、保存料、等張性調整剤および安定化剤などのその他の賦形剤を含んでいてもよい。
【００７８】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油相は、植物油（例えば、オリーブ油またはラッカセイ油）または鉱油（例えば、流動パラフィン）またはそれらのいずれかの混合物であってもよい。好適な乳化剤は、例えば、天然由来のゴム（例えばアカシアゴムまたはトラガカントゴム）、天然由来のホスファチド（例えば、ダイズまたはレシチン）、脂肪酸およびヘキシトール無水物由来のエステルまたは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレート）および当該部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）などであってもよい。
【００７９】
本発明の医薬組成物はまた、無毒の非経口的に許容な希釈剤または溶媒中の無菌溶液または懸濁液の形態であってもよく、それらは、既に言及した、１以上の適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の手法により製剤されうる。無菌の注射用製剤ははまた、無毒の非経口的に許容な希釈剤または溶媒中の無菌の注射用溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール溶液）であってもよい。
【００８０】
製剤に関するさらなる情報については、読者は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５巻、第２５．２章（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；編集委員長）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０年；またはＤｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第９９巻；Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｅｕｇｅｎ Ｊ．ＭｃＮａｌｌｙ、編集主幹）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ ２０００年を参照されたい。
【００８１】
単一の剤形を製造するための１以上の賦形剤と組み合わせる活性成分の量は、処置する対象および具体的な投与経路に依存して必然的に変動するであろう。例えば、ヒトに注射することを意図した製剤は、一般に、例えば、組成物全体の約５〜約９８重量％に変動しうる、適切かつ便宜的な量の賦形剤と混合した、０．５ｍｇ〜２ｇの活性薬剤を含みうる。投与剤形は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含みうる。タンパク質治療剤は、通常、冷凍または冷凍乾燥されて貯蔵される。投与経路および投薬方法に関するさらなる情報については、読者は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５巻、第２５．３章（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；編集委員長）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０年を参照されたい。
【００８２】
治療または予防目的のための化合物の投薬規模は、状態の種類および重篤度、動物または患者の年齢および性別、および投与経路により、周知の医学原則に従って、当然に変動するであろう。治療または予防目的で化合物を使用する場合、一般的には、例えば体重１ｋｇあたり０．５ｍｇ〜７５ｍｇの範囲の日薬量が、必要であれば分割投与で与えられるように投与されるであろう。一般に、非経口投与が使用される場合はより少ない薬量が投与されるであろう。したがって、例えば、静脈内投与については、例えば、体重１ｋｇあたり０．５ｍｇ〜３０ｍｇの範囲の薬量が一般的には使用されるであろう。同様に、吸入による投与については、例えば、体重１ｋｇあたり０．５ｍｇ〜２５ｍｇの範囲の薬量が使用されるであろう。
【００８３】
本発明は、さらに、以下の非限定的実施例により記述されるであろう。
本発明の実施には、特に示されてない限り、当該技術分野における技術の範囲内の分子生物学および組み替えＤＮＡ技術の慣用の方法が使用されるであろう。当該技術は、文献において十分に説明されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１年）；Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（２００２年）；Ｇｌｏｖｅｒ＆Ｈａｍｅｓ編集、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻、第ＩＩ巻および第ＩＩＩ巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９５年）；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ＆Ｋａｐｌａｎ編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｗｅｉｒら編集、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第５版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（１９９７年）を参照されたい。
【００８４】
実施例１
ヒトＦＩＩ（ｈＰＴ）およびヒトＧＧＣＸをコードするｃＤＮＡの増幅
ヒト肝臓ｍＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｓｙｓｔｅｍを使用してｃＤＮＡ合成を実施した。以下の：
プライマーＰＴＦ０（５’−ＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡ−３’、配列番号：３）および
プライマーＰＴＥＸＴ（５’−ＣＴＡＣＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＴ−３’、配列番号：４）
を使用して、ヒトＦＩＩの増幅のためのテンプレートとして得られたｃＤＮＡを使用した。
【００８５】
プライマーｈｇｌｘ５（５’−ＴＣＣＧＣＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣＴ−３’、配列番号：５）および
ｈｇｌｘ３（５’−ＣＣＡＡＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＴ−３’、配列番号：６）
を使用して、ヒトＧＧＣＸを増幅した。
【００８６】
ＦＩＩをコードするＰＣＲ生成物を、ＴＡ−ＴＯＰＯで処理したベクターｐＣＤＮＡ３．１Ｖ５／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化した。正しい方向に挿入されたｈＦＩＩ ｃＤＮＡを有するクローンの選択により、Ｐｔｅｘｔ５コントロールコンストラクト（図１ｂ）を得た。ＳＶ４０プロモーターの制御下のＧＧＣＸをコードするｃＤＮＡは、制限酵素ＢａｍＨ１およびＮｏｔＩを使用しての、ｐＣＤＮＡ３．１Ｖ５／Ｈｉｓ ＴＡ−ＴＯＰＯからのｐＺｅｏＳＶ２＋ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのＧＧＣＸエンコーディングフラグメントの移動により得た。ＧＧＣＸインサートの下流のＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ制限部位を除去した。その後、得られたｐＺｅｏＳＶ２−ＧＧＣＸプラスミド（ＳＶ４０プロモーターおよびＧＧＣＸを含むインサートを含むが、ＧＧＣＸエンコーディング配列の下流のポリアデニル化部位およびポリアデニル化シグナルは含まない）由来の鈍化した（ｂｌｕｎｔｅｄ）ＣｌａＩ−ＢｃｌＩフラグメントをｐＣＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の鈍化した（ｂｌｕｎｔｅｄ）ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローン化した。ＰＮ３２コンストラクト（図１ａ）を得るために、ＣＭＶプロモーターに対して直列（同じ転写方向）で挿入されたｐＳＶ４０−ＧＧＣＸフラグメントを伴うクローンを選択し、Ｐｔｅｘｔ５由来の鈍化したＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ ＦＩＩをコードするフラグメントをＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。ＰＮ３２およびＰｔｅｘｔ５のＤＮＡ配列は別表２の通りである。すべてのクローン化方法は、標準的方法および／または製造者が推奨する方法にしたがった。
【００８７】
ＰＮ３２コンストラクトは、以下の重要な特徴を含む：
−ヒトプロトロンビンｃＤＮＡの転写を制御するヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーター、それに続く、効率的な転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化のためのウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニレーションシグナル。
【００８８】
明確なポリアデニル化部位およびシグナルを含まない、ヒトγ−カルボキシラーゼｃＤＮＡ（ＧＧＣＸ）の転写を制御するＳＶ４０初期プロモーター。
−図１ａに示すその他の特徴。
【００８９】
比較のために、ＧＧＣＸを含まないＰＴｅｘｔ５コンストラクトを使用した（図１ｂ）。ＰＴＥＸＴ５ヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ＰＮ３２ヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
【００９０】
得られるプロトロンビン製造細胞系
図１の２つのコンストラクトをＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。安定な形質移入体を選択し、プロトロンビン活性についての市販のアッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を使用して高生産性のクローンについてスクリーニングした。このアッセイにおいて、プロトロンビンを含むサンプルを最初にヘビ毒の毒素（エカリン、Ｓｉｇｍａより入手可能）で処理し、トロンビンを発生させた。その後、トロンビンで処理されると色を発する色素生産性基質（Ｓ−２２３８）の添加により、トロンビン活性をアッセイした。クローンの形質移入および選択は、双方のコンストラクトを平行して用いて行った。細胞培養は、９％の加熱不活性化されたウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地において行った。その後、得られたクローンを動物成分を含まない培地において成長するように適合させた。得られた最も生産性のよいクローンは、ＰＮ３２（ＦＩＩ＋ＧＧＣＸ）による形質移入によるもので、当該クローンにより、動物成分を含まない化学的に定義される培地において成長させた場合４００ｍｇ／Ｌものヒト組み替えプロトロンビンが得られた（報告されたいかなるレベルも大きく上回っている）。組み替えにより製造されたｒｈＦＩＩを精製（Ｊｏｓｉｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ、第７９０巻、第１８３〜１９７頁、２００３年に開示された方法に従った）し、さらに標準的な方法によりＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用してイオン交換クロマトグラフィーで分画し、純粋な十分にカルボキシル化されたｒｈＦＩＩを得た。発酵により製造されたｒｈＦＩＩのうちの７８ｍｇ／Ｌまでもが十分にカルボキシル化されており、ヒト血清から精製されたプロトロンビンと同じ生物活性を有していた。カルボキシル化は、タンパク質のＮ−末端配列決定、およびプロトロンビナーゼアッセイ（Ｍａｏら、ＪＢＣ、第２７３巻、第３００８６〜３００９１頁、１９９８年）により分析した。トロンビンの発生は、ヒト血小板不足血清中に組織因子を添加することにより誘発され、内因性トロンビンの潜在性は、実質的にＳｔｉｇら（Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、第１４巻、第４５７〜４６２頁、２００３年）により記載されたとおりに測定された。
【００９１】
ＰＴｅｘｔ５コンストラクトにより得られた最もよいクローンは、動物成分を含まない化学的に定義される培地において１０ｍｇ／Ｌもの生産性を示し、これは文献により報告されているのと同程度であった。ＰＴｅｘｔ５クローンから得られた十分にカルボキシル化されたプロトロンビンの割合は、約５０％と推定された。したがって、γ−カルボキシラーゼの低い発現レベルの配列を含むＰＮ３２コンストラクトを使用して、十分に活性なｒｈＦＩＩに最終的回収は少なくとも１０倍以上高かった。コンストラクトの各々について、同じ発現レベルを有するいくつかのクローンが同定された。
【００９２】
実施例２
ＣＨＯ細胞系のＧＧＣＸ活性の測定
ＰＮ３２コンストラクト（ヒトＧＧＣＸの共発現）およびＰＴＥＸＴ５（ＧＧＣＸの非共発現）を用いたトランスフェクションにより得られた２つのｒｈＦＩＩ生産ＣＨＯ−Ｓ細胞系を、各々、５μｇ／ｍＬのビタミンＫを補ったタンパク質を含まない培地を使用して、スピナー瓶中で培養した。毎日１０分の１の培地を取り替えた。７日の培養後に細胞を採取し、Ｂｅｒｋｎｅｒら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、第８９巻、第６２４２〜６２４６頁、１９９２年）に記載されたとおりにミクロソームを調製した。ヒト組み替えＦＩＩを、採取した細胞の培養上澄み液から精製した。ＧＧＣＸ活性をＢｅｒｋｎｅｒおよびＰｕｄｏｔａ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、第９５巻、第４４６〜４７１頁、１９９８年）ならびにＬｉｎｇｅｎｆｅｌｔｅｒおよびＢｅｒｋｎｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、第８２３４〜８２４３頁、１９９６年）により記載されたとおりに測定した。我々の測定により、同じ培養条件を使用した場合に、ｒｈＦＩＩのみを発現するＣＨＯ細胞系と比較して、ヒトＧＧＣＸを共発現させたＣＨＯ細胞系においてＧＧＣＸ活性は１．５倍高いことが示された。
【００９３】
実施例３
ＣＨＯ−Ｓ細胞系におけるγ−カルボキシラーゼおよびプロトロンビンのｍＲＮＡ発現のリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析
ＰＮ３２（ＦＩＩ＋ＧＧＣＸ）およびＰｔｅｘｔ５（ＦＩＩのみ）コンストラクトの各々を用いての安定的トランスフェクションにより得られた２つのＣＨＯ−Ｓ細胞系をビタミンＫを補ったタンパク質を含まない培地を使用して、スピナー瓶中で培養した。培養サンプルは、ｍＲＮＡ生産の算出されるピークレベルを調査するために、培養４、５および６日で培養サンプルを取り出した。ＲＮＡは、販売者Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎにより提供されたプロトコールに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）を用いて単離した。単離したＲＮＡを、ＡｍｂｉｏｎのキットＤＮＡ−ｆｒｅｅ（登録商標）を用いてＤＮａｓｅＩ処理した。ｃＤＮＡ合成は、ランダムヘキサマープライマーおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍのキットの内容物を使用して行った。
【００９４】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーおよびＶｉｃ標識化プローブをソフトウエア（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して選択した。
【００９５】
ヒトγ−カルボキシラーゼオリゴヌクレオチド
５´ＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＴＴ ３´
フォワードプライマー（配列番号：７）
５´ ＡＡＴＣＧＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴ ３´
リバースプライマー（配列番号：８）
５´ ＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＡＣＧＣ ３´
プローブ（配列番号：９）
アンプリコンの長さ ８６ｂｐ
ヒトプロトロンビンオリゴヌクレオチド
５´ ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＧＡ ３´
フォワードプライマー（配列番号：１０）
５´ ＣＡＴＣＣＧＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡ ３´
リバースプライマー（配列番号：１１）
５´ ＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧＧＧＣ ３´
プローブ（配列番号：１２）
アンプリコンの長さ ６９ｂｐ
【００９６】
プライマーはＯｐｅｒｏｎ／Ｑｉａｇｅｎにより作成し、プローブはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓに注文した。齧歯類ＧＡＰＤＨコントロールプライマーおよびプローブも使用した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＢＩ＃４３０８３１８ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｒｏｄｅｎｔ ＧＡＰＤＨ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、アンプリコンの長さ １７７ｂｐ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応をＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。増幅されたＰＣＲ生産物の予想された長さをアガロースゲル上で確認した。ＰＣＲ反応の効率を検査するための希釈系列を、３つすべての遺伝子において実施した。γ−カルボキシラーゼおよびプロトロンビンの発現レベルを、コントロール遺伝子、齧歯類ＧＡＰＤＨと比較して示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
検出されたｒｈＦＩＩ：ＧＧＣＸの相対的発現レベルから、サンプル回収の比に依存して、およそ７４〜２３２：１の比が算出された。ＰＮ３２でトランスフェクションされた細胞系（ｒｈＦＩＩおよびＧＧＣＸの共発現）については、細胞毎の転写数が、ＧＧＣＸ ｍＲＮＡについては約８、ｒｈＦＩＩ ｍＲＮＡについては約２０００と算出され、そこからｒｈＦＩＩ：ＧＧＣＸの比が約２５０：１と算出された。細胞毎のＧＡＰＤＨコントロールｍＲＮＡ転写は同じサンプルで約４０００であった。
【００９９】
実施例４
ヒトＦＩＩの生産
実施例１でクローン化されたヒトＦＩＩおよびＧＧＣＸ ｃＤＮＡを実施例１と同様にｐＣＤＮＡ３．１に挿入した。さらに高いＧＧＣＸレベルを得るために、ｐＺｅｏＳＶ２＋由来のポリアデニル化シグナルを、ｐＣＤＮＡ３．１の鈍化したＤｒａＩＩＩにクローン化したｐＳＶ４０−ＧＧＣＸ−ｐＡフラグメントに含めた。実施例１と逆の順番のＧＧＣＸを含むフラグメントのクローンを選択した。その後、ＦＩＩフラグメントのクローン化を実施例１と同じ方法で行った。最終のコンストラクトＰＰ６を図２に示し、ＰＰ６ヌクレオチド配列を配列番号１３に示す。
【０１００】
２つのプロトロンビン生産細胞系、Ｂ２Ｆ４およびＨ３Ｂ１０を、実施例１に記載したようにＣＨＯ−Ｓのトランスフェクションにより得た。これらの２つの細胞系由来のプロトロンビンを実施例１のように精製し、同定した。Ｂ２Ｆ４の培養は３０〜７０ｍｇ／Ｌの範囲の生産性であり、十分にカルボキシル化されたものの割合は５５〜８７％であった（ｒｈＦＩＩが増えれば十分にカルボキシル化されたものは減る）。ブチレートの添加により幾分かの高い生産性が得られたが、十分にカルボキシル化されたｒｈＦＩＩの割合は減少し、有益であるとは認められなかった。Ｈ３Ｂ１０は増殖が遅く、生産性は約５０ｍｇ／Ｌであり、培養物中の細胞数と比較して高かった。十分にカルボキシル化されたｒｈＦＩＩの割合は約６０％であった。実施例１で得られた細胞系と比較して、ＣＨＯ細胞系のＰＰ６コンストラクトを使用して製造した十分にカルボキシル化されたｒｈＦＩＩは減少した。しかし、それでも、十分に活性な組み替えプロトロンビンの生産は、以前に文献開示されたレベルを大きく上回っている。
【０１０１】
実施例５
ｍＲＮＡ量の測定による、ＣＨＯ−Ｓ細胞系におけるγ−カルボキシラーゼおよびプロトロンビンの発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
実施例４のＢ２Ｆ４およびＨ３Ｂ１０細胞系を、実施例３と同じ方法および同じプライマーによるリアルタイムＰＣＲ分析により分析した。実施例３のサンプルと等価にするために、１０ｍＬの培養サンプルを生産性のピークにおいて採取した。クローンＨ３Ｂ１０については、このクローンの増殖の遅さのためにサンプルは１０日目のものであり、Ｂ２Ｆ４クローンについては、サンプルは６日目のものであった。
【０１０２】
表４．ＧＧＣＸを共発現するプロトロンビン生産細胞系のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果。Ｂ２Ｆ４およびＨ３Ｂ１０の各々についての２つの独立の１００ｍＬスピナー培養物がリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析のためにサンプリングされた。
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
＊比較のための実施例３のＰ１Ｅ２データ。
算出されたｒｈＦＩＩ ｍＲＮＡ：ＧＧＣＸ ｍＲＮＡの比は、クローンＨ３Ｂ１０については約３０：１、クローンＢ２Ｆ４については約５０：１、およびクローンＰ１Ｅ２については約２５０：１であった。
【０１０５】
実施例６
ヒト凝固ＩＸ因子（ＦＩＸ）の生産
ヒト凝固ＩＸ因子ｃＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したヒト遺伝子プール肝臓ｃＤＮＡから増幅させた。オリゴヌクレオチドプライマーは、
５’−末端；Ｆ９ｆ．ａｍｐｌ．：
５´−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴ−３´ （配列番号：１６）， および、３’−末端；Ｆ９ｒ．ａｍｐｌ．：
５´−ＣＣＴＴＧＧＡＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＴＴＡ−３´（配列番号：１７）
であった。
【０１０６】
ＤＮＡ配列決定により、正しい配列のクローン化を確認した。ヒトＦＩＸフラグメントを、Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびクローン化プライマーを使用してＰＣＲ増幅し、末端が鈍化されたフラグメントを作成した。末端鈍化フラグメントを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化し、実施例１および実施例４の、ＥｃｏＲＶ消化および脱リン酸化されたｐＣＤＮＡ−ＧＧＣＸベクターにクローン化した。この方法において、ヒトプロトロンビンの製造（実施例１および実施例４）に使用した共発現コンストラクトに類似するヒトＦＩＸおよびＧＧＣＸの共発現のためのコンストラクトを得た。正しい配列のクローン化を、ＤＮＡ配列決定およびＣＯＳ−７細胞における一時的発現により確認した。ベクターコンストラクトＦ９ＮｏｐＡを図３ａに示し、ベクターコンストラクトＦ９ｈｇｌｘを図３ｂに示した。ベクターＦ９ＮｏｐＡおよびＦ９ｈｇｌｘの差異は、ＧＧＣＸ遺伝子の転写方向である。Ｆ９ＮｏｐＡヌクレオチド配列を配列番号１４に示し、Ｆ９ｈｇｌｘヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。
【０１０７】
ｒｈＦＩＸを産生する細胞系の確立
実施例１において記載した手法を使用して、ｒｈＦＩXコンストラクトをＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクションした。各々のＦＩＸコンストラクトについて、約３０００クローンを細胞上清のＥＬＩＳＡによりｒｈＦＩＸの発現に関してスクリーニングした。使用した抗体はＨａｅｍａｔｈｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．およびＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎのものであった。クローンを選択し、タンパク質を含まない化学的に定義されるＣＨＯ培地において増殖するように適合させた。細胞を、Ｔ−フラスコ中で３７℃またはスピナー瓶中で３２〜３７℃のいずれかで培養した。双方の培養の型において、ＣＯ２濃度を５％とした。産生されたｒｈＦＩＸを、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換クロマトグラフィーによりｐＨ７．０で均質になるまで精製した。組み替えｈＦＩＸの活性は、ＦＩＸ欠損血漿（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）を使用して凝固アッセイ（Ｃｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）により測定した。得られた最も生産性のよいｒｈＦＩＸクローンは、Ｆ９ＮｏｐＡコンストラクトを使用して得られたＮ４Ｄ５であり、Ｔ−フラスコ中のタンパク質を含まない化学的に定義される培地で培養して４μｇ／ｍＬの活性ｒｈＦＩＸを生産した。スピナー瓶で培養した場合、この同じクローンは７．１μｇ／ｍＬのｒｈＦＩＸを生産した。不完全にカルボキシル化された不活性なｒｈＦＩＸも含めた全体の生産性はウエスタンブロッティングにより少なくとも３０μｇ／ｍＬであると推定された。ｒｈＦＩＸコンストラクトＦ９ｈｇｌｘにより得られた最も生産性のよいクローンは、同様の条件下で０．７（Ｔ−フラスコ）〜１．３（スピナー）μｇ／ｍＬのｒｈＦＩＸを生産するＰ１Ｇ９であった。この結果により、Ｆ９ＮｏｐＡコンストラクトを使用しての低レベルでのＧＧＣＸの共発現によりｒｈＦＩＸ生産性は改善されたが、Ｆ９ｈｇｌｘコンストラクトを使用してのＧＧＣＸの共発現は有益性が低いことが示された。Ｎ４Ｄ５クローンを生じさせるＦ９ＮｏｐＡコンストラクトは、一般に、細胞系開発手順の間の生産性の同時スクリーニングにおいて、Ｐ１Ｇ９を生じさせるＦ９ｈｇｌｘコンストラクトよりも高いＥＬＩＳＡシグナルを与えることも確認された。
【０１０８】
Ｎ４Ｄ５細胞系の生産性は、比較可能な条件下で得られた以前に文献に開示されたレベルよりも約４〜６良く、ここで、ＩＣ４、ＩＧ８、ｒ−ＦＩＸ ＢＨＫおよびｒ−ＦＩＸ２９３は参照文献において言及されているクローンの名前である（表５）。
【０１０９】
表５．ヒトＦＩＸ産生細胞系の生産性の比較
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
実施例７
ｍＲＮＡの量の測定によるＣＨＯ−Ｓ細胞系におけるγ−カルボキシラーゼおよびＩＸ因子の発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
組み替えｈＦＩＸ産生クローンを、１００ｍＬのビタミンＫを補ったタンパク質を含まない化学的に定義される培地で、３２〜３７℃でスピナー瓶中で培養した。５〜１０ｍＬのサンプルをｒｈＦＩＸ濃度のピークで採取し、ヒトＦＩＸおよびＧＧＣＸ転写物、ならびにＧＡＰＤＨコントロール（ハウスキーピング）遺伝子の転写物の含有量を分析した。手法は実施例３の通りであった。ｒｈＦＩＸのプライマーは以下の通りであった：
ヒトＩＸ因子プライマー
５´ ＡＡＴＡＧＴＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧ ３´
フォワードプライマー（配列番号：１８）
５´ ＣＡＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧＧＡＣＴＴＣＴ ３´
リバースプライマー（配列番号：１９）
５´ ＴＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣ ３´
プローブ（配列番号：２０）
アンプリコンの長さ ８４ｂｐ。
【０１１２】
メッセンジャーＲＮＡレベルは、培養温度および培養接種物規模に依存して、異なる日にピークとなることが見いだされた。ｍＲＮＡのピークレベルは、培養培地におけるｒｈＦＩＸの濃度のピークによく対応することが見いだされた。
【０１１３】
表６．ｒｈＦＩＸ産生クローンのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果
【０１１４】
【表７】
【０１１５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析より、２＾デルタＣｔ値が培養時間および条件により変動したにもかかわらず、ＦＩＸ：ＧＧＣＸ ｍＲＮＡ比が各クローンでほぼ同一であったこともまた我々は確認した。最も良いｒｈＦＩＸ産生クローンＮ４Ｄ５について、当該比は約４５：１であった。別のクローン、Ｐ１Ｇ９の分析においては約４．５：１というより低い比が得られた。Ｐ１Ｇ９クローンは、Ｎ４Ｄ５によって製造されるｒｈＦＩＸの量の２０％のみを生産した。
【０１１６】
配列表
配列番号１
【０１１７】
【化１】
【０１１８】
【化２】
【０１１９】
【化３】
【０１２０】
配列番号２
【０１２１】
【化４】
【０１２２】
【化５】
【０１２３】
【化６】
【０１２４】
【化７】
【０１２５】
配列番号１３
ＰＰ６配列
【０１２６】
【化８】
【０１２７】
【化９】
【０１２８】
【化１０】
【０１２９】
【化１１】
【０１３０】
【化１２】
【０１３１】
配列番号１４
Ｆ９Ｎｏｐａ配列
【０１３２】
【化１３】
【０１３３】
【化１４】
【０１３４】
【化１５】
【０１３５】
【化１６】
【０１３６】
配列番号１５
Ｆ９ｈｇｌｘ
【０１３７】
【化１７】
【０１３８】
【化１８】
【０１３９】
【化１９】
【０１４０】
【化２０】
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１ａ】図１ａはＰＮ３２（プロトロンビン＋ＧＧＣＸ）共発現ベクターのプラスミドマップを例示する。
【図１ｂ】図１ｂはＰｔｅｘｔ５（プロトロンビン）発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【図２】図２はＰＰ６（プロトロンビン＋ＧＧＣＸ）共発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【図３ａ】図３ａはＦ９ＮｏｐＡ（ＩＸ因子＋ＧＧＣＸ）共発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【図３ｂ】図３ｂはＦ９ｈｇｌｘ（ＩＸ因子＋ＧＧＣＸ）共発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼが少なくとも１０：１の比で発現するように第１のプロモーターが第２のプロモーターよりも十分に強力である、前記宿主細胞。
【請求項２】
前記核酸分子が単一の発現ベクター内にある、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーターであり、第２のプロモーターがＳＶ４０初期プロモーターである、請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質、および（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼを発現するように設計された細胞であって、タンパク質（ｉ）および（ｉｉ）が１０：１〜５００：１の比で発現される前記細胞。
【請求項５】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質が、凝固ＶＩＩ因子、凝固ＦＶＩＩ、凝固ＩＸ因子、凝固ＦＩＸ、プロトロンビン、凝固ＩＩ因子、凝固ＦＩＩ、凝固Ｘ因子、凝固ＦＸ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖抑制特異的タンパク質６およびアカントフィナエ（Ａｃａｎｔｈｏｐｈｉｉｎａｅ）ＦＸａ様タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がビタミンＫ依存性凝固因子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がＩＸ因子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がＸ因子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がプロトロンビンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がヒトタンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
γ−グルタミルカルボキシラーゼがヒトタンパク質である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
哺乳類細胞、酵母細胞または昆虫細胞からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１３】
哺乳類細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
遺伝子修飾された真核宿主細胞であって、
（ｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（前記γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードする配列は、前記細胞によるγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）；および
（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド（前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）
を含み、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質およびカルボキシル化を必要とするタンパク質を少なくとも１：１０の比で発現することができる前記細胞。
【請求項１５】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含むベクターであって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼが少なくとも１０：１の比で発現するように第１のプロモーターが第２のプロモーターよりも十分に強力である、前記ベクター。
【請求項１６】
第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーターであり、第２のプロモーターがＳＶ４０初期プロモーターである、請求項３に記載のベクター。
【請求項１７】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質が、凝固ＶＩＩ因子、凝固ＦＶＩＩ、凝固ＩＸ因子、凝固ＦＩＸ、プロトロンビン、凝固ＩＩ因子、凝固ＦＩＩ、凝固Ｘ因子、凝固ＦＸ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖抑制特異的タンパク質６およびアカントフィナエ（Ａｃａｎｔｈｏｐｈｉｉｎａｅ）ＦＸａ様タンパク質からなる群から選択される、請求項３または４に記載のベクター。
【請求項１８】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がＩＸ因子である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１９】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がＸ因子である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２０】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がプロトロンビンである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２１】
γ−カルボキシル化されたタンパク質の製造方法であって、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたタンパク質を単離すること、を含む前記方法。
【請求項２２】
哺乳類細胞系におけるγ−カルボキシル化されたタンパク質の製造方法であって、γ−グルタミルカルボキシラーゼと哺乳類細胞系でのγ−カルボキシル化を必要とする前記タンパク質を共発現させる工程であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現量がγ−グルタミルカルボキシラーゼの発現量の少なくとも１０倍を越える前記工程、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化タンパク質を単離する工程を含む前記方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の方法にしたがって製造された、単離されたγ−カルボキシル化タンパク質。
【請求項２４】
請求項２１または２２にしたがって製造された、単離されたγ−カルボキシル化タンパク質の凝固療法における使用。
【請求項２５】
請求項２１または２２にしたがって製造された、単離されたγ−カルボキシル化タンパク質の凝固療法において使用される医薬の製造における使用。
【請求項２６】
血液凝固の誘導または凝固の増強または抑制の促進に適した医薬組成物の製造方法であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを１０：１〜５００：１の比で発現するように適合させた宿主細胞から発現された活性なカルボキシル化タンパク質を精製すること、および精製したカルボキシル化タンパク質を１以上の医薬として許容な担体または賦形剤と混合することを含む前記方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法により得ることができる医薬組成物。
【請求項２８】
γ−カルボキシル化されたヒトＸ因子の製造方法であって、（ｉ）ヒトＸ因子およびヒトγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたヒトＸ因子を単離すること、を含む前記方法。
【請求項２９】
請求項２８にしたがって製造された、単離されたＸ因子の凝固療法における使用。
【請求項３０】
請求項２８により製造された、単離されたＸ因子の凝固療法において使用するための医薬の製造における使用。
【請求項３１】
請求項２８の方法により得ることができるγ−カルボキシル化されたヒトＸ因子を含む医薬組成物。
【請求項３２】
γ−カルボキシル化されたヒトＩＸ因子の製造方法であって、（ｉ）ヒトＩＸ因子およびヒトγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化ＩＸ因子を単離すること、を含む前記方法。
【請求項３３】
請求項３２により製造された、単離されたＩＸ因子の凝固療法における使用。
【請求項３４】
請求項３２により製造された、単離されたＩＸ因子の凝固療法において使用するための医薬の製造における使用。
【請求項３５】
請求項３２の方法により得ることができるγ−カルボキシル化されたヒトＩＸ因子を含む医薬組成物。
【請求項３６】
γ−カルボキシル化されたヒトプロトロンビンの製造方法であって、（ｉ）ヒトプロトロンビンおよびヒトγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化プロトロンビンを単離すること、を含む前記方法。
【請求項３７】
請求項３６により製造された、単離されたプロトロンビンの凝固療法における使用。
【請求項３８】
請求項３６により製造された、単離されたプロトロンビンの凝固療法において使用するための医薬の製造における使用。
【請求項３９】
請求項３６の方法により得ることができるγ−カルボキシル化されたヒトプロトロンビンを含む医薬組成物。
【請求項４０】
対象における凝固の増加または減少を促進する方法であって、それを必要とする患者に対して、請求項２１または２２の方法により得た薬理学的有効量の単離されたγ−カルボキシル化タンパク質を投与することを含む前記方法。
【請求項１】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼが少なくとも１０：１の比で発現するように第１のプロモーターが第２のプロモーターよりも十分に強力である、前記宿主細胞。
【請求項２】
前記核酸分子が単一の発現ベクター内にある、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーターであり、第２のプロモーターがＳＶ４０初期プロモーターである、請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質、および（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼを発現するように設計された細胞であって、タンパク質（ｉ）および（ｉｉ）が１０：１〜５００：１の比で発現される前記細胞。
【請求項５】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質が、凝固ＶＩＩ因子、凝固ＦＶＩＩ、凝固ＩＸ因子、凝固ＦＩＸ、プロトロンビン、凝固ＩＩ因子、凝固ＦＩＩ、凝固Ｘ因子、凝固ＦＸ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖抑制特異的タンパク質６およびアカントフィナエ（Ａｃａｎｔｈｏｐｈｉｉｎａｅ）ＦＸａ様タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がビタミンＫ依存性凝固因子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がＩＸ因子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がＸ因子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がプロトロンビンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がヒトタンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
γ−グルタミルカルボキシラーゼがヒトタンパク質である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
哺乳類細胞、酵母細胞または昆虫細胞からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１３】
哺乳類細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
遺伝子修飾された真核宿主細胞であって、
（ｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（前記γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードする配列は、前記細胞によるγ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）；および
（ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド（前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を許容する発現制御配列に操作可能なように連結している）
を含み、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質およびカルボキシル化を必要とするタンパク質を少なくとも１：１０の比で発現することができる前記細胞。
【請求項１５】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質および第１のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼおよび第２のプロモーターを含む関連する発現制御配列をコードする核酸分子を含むベクターであって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼが少なくとも１０：１の比で発現するように第１のプロモーターが第２のプロモーターよりも十分に強力である、前記ベクター。
【請求項１６】
第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーターであり、第２のプロモーターがＳＶ４０初期プロモーターである、請求項３に記載のベクター。
【請求項１７】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質が、凝固ＶＩＩ因子、凝固ＦＶＩＩ、凝固ＩＸ因子、凝固ＦＩＸ、プロトロンビン、凝固ＩＩ因子、凝固ＦＩＩ、凝固Ｘ因子、凝固ＦＸ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖抑制特異的タンパク質６およびアカントフィナエ（Ａｃａｎｔｈｏｐｈｉｉｎａｅ）ＦＸａ様タンパク質からなる群から選択される、請求項３または４に記載のベクター。
【請求項１８】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がＩＸ因子である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１９】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がＸ因子である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２０】
γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質がプロトロンビンである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２１】
γ−カルボキシル化されたタンパク質の製造方法であって、（ｉ）γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたタンパク質を単離すること、を含む前記方法。
【請求項２２】
哺乳類細胞系におけるγ−カルボキシル化されたタンパク質の製造方法であって、γ−グルタミルカルボキシラーゼと哺乳類細胞系でのγ−カルボキシル化を必要とする前記タンパク質を共発現させる工程であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現量がγ−グルタミルカルボキシラーゼの発現量の少なくとも１０倍を越える前記工程、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化タンパク質を単離する工程を含む前記方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の方法にしたがって製造された、単離されたγ−カルボキシル化タンパク質。
【請求項２４】
請求項２１または２２にしたがって製造された、単離されたγ−カルボキシル化タンパク質の凝固療法における使用。
【請求項２５】
請求項２１または２２にしたがって製造された、単離されたγ−カルボキシル化タンパク質の凝固療法において使用される医薬の製造における使用。
【請求項２６】
血液凝固の誘導または凝固の増強または抑制の促進に適した医薬組成物の製造方法であって、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを１０：１〜５００：１の比で発現するように適合させた宿主細胞から発現された活性なカルボキシル化タンパク質を精製すること、および精製したカルボキシル化タンパク質を１以上の医薬として許容な担体または賦形剤と混合することを含む前記方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法により得ることができる医薬組成物。
【請求項２８】
γ−カルボキシル化されたヒトＸ因子の製造方法であって、（ｉ）ヒトＸ因子およびヒトγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化されたヒトＸ因子を単離すること、を含む前記方法。
【請求項２９】
請求項２８にしたがって製造された、単離されたＸ因子の凝固療法における使用。
【請求項３０】
請求項２８により製造された、単離されたＸ因子の凝固療法において使用するための医薬の製造における使用。
【請求項３１】
請求項２８の方法により得ることができるγ−カルボキシル化されたヒトＸ因子を含む医薬組成物。
【請求項３２】
γ−カルボキシル化されたヒトＩＸ因子の製造方法であって、（ｉ）ヒトＩＸ因子およびヒトγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化ＩＸ因子を単離すること、を含む前記方法。
【請求項３３】
請求項３２により製造された、単離されたＩＸ因子の凝固療法における使用。
【請求項３４】
請求項３２により製造された、単離されたＩＸ因子の凝固療法において使用するための医薬の製造における使用。
【請求項３５】
請求項３２の方法により得ることができるγ−カルボキシル化されたヒトＩＸ因子を含む医薬組成物。
【請求項３６】
γ−カルボキシル化されたヒトプロトロンビンの製造方法であって、（ｉ）ヒトプロトロンビンおよびヒトγ−グルタミルカルボキシラーゼを少なくとも１０：１の比で発現するように適合させた細胞を両方のタンパク質が発現するのに適した条件下で培養すること、および（ｉｉ）γ−カルボキシル化プロトロンビンを単離すること、を含む前記方法。
【請求項３７】
請求項３６により製造された、単離されたプロトロンビンの凝固療法における使用。
【請求項３８】
請求項３６により製造された、単離されたプロトロンビンの凝固療法において使用するための医薬の製造における使用。
【請求項３９】
請求項３６の方法により得ることができるγ−カルボキシル化されたヒトプロトロンビンを含む医薬組成物。
【請求項４０】
対象における凝固の増加または減少を促進する方法であって、それを必要とする患者に対して、請求項２１または２２の方法により得た薬理学的有効量の単離されたγ−カルボキシル化タンパク質を投与することを含む前記方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【公表番号】特表２００７−５０８８２０（Ｐ２００７−５０８８２０Ａ）
【公表日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３５３０１（Ｐ２００６−５３５３０１）
【出願日】平成１６年１０月１２日（２００４．１０．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／００１４５３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３８０１９
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（３０００２２６４１）アストラゼネカ アクチボラグ (581)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月１２日（２００４．１０．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／００１４５３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３８０１９
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（３０００２２６４１）アストラゼネカ アクチボラグ (581)
【Ｆターム（参考）】
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