がんの併用療法
特異的オリゴヌクレオチド配列は、皮下投与されると、特に、粘膜に（例えば、鼻腔内に、膣内に、または直腸内に）投与されると、インビボでは動物試験において、またインビトロでは健常対象およびＣＬＬに罹患している患者の血液から収集されたヒトＰＢＭＣにおいて確認されたように、様々なヒトのがんの形態に対して顕著な効果を有する。これらの化合物はまた、放射線療法、ホルモン療法、外科的介入、化学療法、免疫療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択されるがん療法と併用されることが好ましく、患者への抗体の投与を含む免疫学的治療と併用されることが最も好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、医薬の分野に関し、特に、単独で、または既存の療法および将来の療法と併用して、がんの治療に使用される新規の化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん治療は、標的手法（ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ）の段階に入った。そのような手法の１つは、免疫系を使用して悪性細胞を認識し、排除することである。合成ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ ＤＮＡ）は、組織化された強力な腫瘍特異的免疫応答を刺激する能力を有する作用物質の比較的新しいクラスである（Ｋｒｉｅｇ，Ａ Ｍ．、１９９６およびＫｒｉｅｇ，Ａ Ｍら、１９９９）。
【０００３】
最近の研究によって、ＣｐＧ ＤＮＡ配列について少なくとも３つのクラスが存在し、それぞれが異なる物理的特性と生物学的作用を有することが明らかにされている。がんのいくつかの動物モデルにおける予備研究により、ＣｐＧ ＤＮＡには、がんの免疫療法において多くの用途があり得ることが示唆されている。ＣｐＧ ＤＮＡには、先天性免疫を活性化させること、抗体依存性細胞傷害性を増強すること、および特異的防御免疫反応を誘発する強力なワクチンアジュバントとして作用することによって腫瘍の退行を誘導する能力がある。初期の臨床試験ではＣｐＧ ＤＮＡをヒトに安全に投与できることが示され、これらの作用物質ががんの免疫療法においてどのように役割を果たし得るかを理解するための研究が進められいる（Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ Ｅら、２００３）。
【０００４】
先の特許（米国特許第６，４９８，１４７号）には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが示されており、インビトロでの腫瘍細胞のアンチセンス阻害、ならびに同系Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるインビボでの腫瘍増殖のアンチセンス阻害を示す動物実験が開示されている。これらのマウスは、４０ｍｇ／ｇのセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの腹腔内注射によって治療された。組織学的分析は、局所的な腫瘍壊死、それに続いて広範囲に及ぶ分節状壊死を示した。
【０００５】
Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、西欧諸国において最も一般的な白血病である。Ｂ−ＣＬＬは白血球および骨髄のがんであり、血液細胞、特に、Ｂリンパ球の無制限増幅および／または細胞死（アポトーシス）の低減を特徴とし、成人の白血病の最も一般的な形態である。その罹患率は、７０歳以上でおよそ１０万人に５０人である。白血病は、通常、数年、さらには数十年の長引く自然経過をたどるが、最終的に、複数の細胞が連続して遺伝子欠損を獲得すると急速に進行する。欠損Ｂ−ＣＬＬ細胞とその環境の相互関係が変化した結果である可能性が高い、異常に長い寿命が原因となり、モノクローナルＢ−ＣＬＬ細胞が絶えず蓄積する点で、Ｂ−ＣＬＬは多くの他の悪性腫瘍と異なる。サイトカインが、細胞恒常性および細胞間でのダイアログ（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ｄｉａｌｏｇｕｅ）における必須要素であり、この環境において決定的に重要であると提起されている（Ｃａｌｉｇａｒｉｓ−Ｃａｐｐｉｏら、１９９９およびＲｏｚｍａｎら、１９９５）。
【０００６】
Ｂ−ＣＬＬについての共通の最初の形質転換事象は明らかにされていない。染色体の転座は、遺伝子再構成プロセスの間に主に起こると考えられており、他のリンパ性悪性疾患においても共通しているが、Ｂ−ＣＬＬにおいては稀である。核型異常は、この疾患の経過の間に頻度と回数が増える傾向にある。転座が見られる場合、これらは、融合遺伝子の形成または腫瘍遺伝子の過剰発現よりもむしろ遺伝子欠失を生じる傾向がある。Ｂ−ＣＬＬにおいて最も一般的な遺伝的異常は、１３ｑ欠失（症例のうちの５０％）、１３ｑ４欠失（緩慢な経過と関係がある）、１２トリソミー（１２ｑ１３−１５、ｐ５３を抑制するＭＤＭＱ腫瘍タンパク質の過剰発現を伴う、症例のうちの２５％）、１１ｇ２２−ｑ２３欠失（ＡＴＭの欠失、症例のうちの１０％）、および１７ｐ欠失（ｐ５３の欠失）（これはアポトーシスに対する耐性を引き起こし、多くの場合、がんは難治性となる）である（Ｇａｉｄａｎら、１９９１およびＤｏｈｎｅｒら、１９９９）。
【０００７】
Ｂ−ＣＬＬ細胞は、他の状況で活性化状態を示す、ＣＤ２３（ＩｇＥについての低親和性受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα鎖）、およびＣＤ２７（共刺激分子）などの表面分子を発現する。いくつかのタンパク質の発現と会合は、アポトーシスのプロセスを厳密に調節する。これらのタンパク質の相対的平衡により、細胞の寿命が制御される。このシステムに関与している遺伝子としては、ＢＣＬ−２ファミリー、腫瘍壊死因子受容体、ならびに、Ｍｙｃおよびｐ５３などの遺伝子が挙げられる（Ｏｓｏｒｉｏら、１９９９）。これらの遺伝子によって促進される死経路は全て、カスパーゼのプロテアーゼファミリーによって提示される、共通する「破壊」カスケードを有するとみられる。Ｂ−ＣＬＬ細胞は、ＢＣＬ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバー（ｂａｄ−２、ｂｃｌ−ｎ、ｂａｘ）の産物を一貫して高レベル発現するが、Ｂｃｌ−２機能の阻害剤であるＢｃｌ−６は著しく減少する。Ｂｃｌ−２の過剰発現に関与している機構は、現在のところ明らかになっていない。Ｂ−ＣＬＬの白血球細胞は、Ｆａｓについては陰性であるか、または弱陽性である。これらは一般的に、刺激によって誘導されたＦａｓの発現の後でもなお、抗Ｆａｓ抗体を介した死に対して依然耐性がある。珍しい高感度の場合、細胞死は、まだ特性化されていない機構によるＢｃｌ−２の発現と無関係に起こる。Ｂｃｌ−２の過剰発現およびＦａｓ経路は、Ｂ−ＣＬＬの病態生理学と関係がある機構であるが、必ずしも重要な原因となる事象ではないとみられる。サイトカインを含む媒介因子は、最初の病因因子をアポトーシスの最終経路と関連付けていると思われる。
【０００８】
ほとんどのＢ−ＣＬＬ細胞は細胞周期のＧ０期にあり、正常なリンパ球の増殖を誘導する、コンカナバリン−Ａ、ホルボールエステル、または受容体の架橋などの従来の方法によって増殖期に入るように誘導することはできない。ごく一部の細胞だけが、明らかにはなっていない促進シグナルに応答してクローン集団を大きくするようである。増殖を促進するサイトカインは、インビボでこの刺激を提供し得る（Ｄａｎｃｅｓｃｏら、１９９２）。
【０００９】
Ｂ−ＣＬＬ細胞は、正常なＢ細胞のプールを消費して蓄積する。一方、Ｔ細胞の総数は、通常は増加する。骨髄Ｔ−リンパ球は、関節リウマチおよびサルコイドーシスなどの自己免疫疾患において見られるように、大部分がＣＤ４＋細胞である。末梢血において、Ｔｈ２優勢サイトカインの表現形が頻繁に存在する。ＴＣＲレパートリーの異常も報告されている。複数の報告が、Ｔ−リンパ球および間質細胞が、Ｂ−ＣＬＬ細胞の寿命を持続させることができる環境をサポートすることにおいて重要な役割を果たし得ることを示す。悪性細胞およびそれらのＴ細胞環境はいずれも、表面分子およびそれらの受容体のバニティー（ｖａｎｉｔｙ）：ＣＤ５とそのリガンドＣＤ７２、ＣＤ２７、およびＣＤ７０を発現する。これらの研究結果は、細胞の自己保存を直接生じるかまたは間接的に生じ得る（サイトカイン）相互作用の様々な可能性を開く。そのような非常に長い生存時間は、順に、遺伝子突然変異および遺伝的不安定性が蓄積する可能性を増大させ、これは、細胞周期チェックポイントの異常調節および細胞傷害性療法に対する耐性によって疾患の進行に有利なように働く（Ｋｌｅｉｎら、２０００）。
【００１０】
Ｂ−ＣＬＬ細胞とその環境の共生的相互作用は、ほぼ確実にサイトカインの分泌によって媒介され、接着分子によって調節される。Ｂ−ＣＬＬへのサイトカイン関与の研究は、この白血病における増殖および寿命の延長の媒介因子としての様々なサイトカインをサポートするかまたは反証するデータの実質的な部分を生じた。サイトカインの産生の研究により、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＴＮＦ−β、およびＴＮＦ−αについての逆転写ポリメラーゼ連鎖反応シグナルが明らかにされている（Ｐｉｓｔｏｉａら、１９９７）。これらの研究結果は、ＩＬ−４、ＩＬ−３、およびＩＬ−６について負の結果を示した他の研究と相矛盾している（Ｔａｎｇｙｅら、１９９９）。対照的に、正常なＢ−リンパ球では、ＴＧＦ−βならびにＩＬ１Ｏの分泌が示されている。これらの細胞について、構成的である他のサイトカインの産生は報告されていない。
【００１１】
がんの免疫療法は、１世紀以上にわたり研究されてきたが、この１０年間でようやく、様々な抗体ベースの産物が様々な形態のがん患者の管理に導入されたにすぎない。現在、これは臨床研究が最も盛んな領域の１つであり、８種類の治療薬がすでに腫瘍学において承認されている。腫瘍関連マーカーに対する抗体は、数十年にわたり、免疫組織学およびインビトロでの免疫測定法において医療法の一部とされており、現在、がんの検出および治療のための重要な生物学的作用物質としての理解が広まりつつある（Ｓｔｒｏｍｅら、２００７）。分子工学は、そのような抗体ベースの治療薬の可能性を証明し、それにより、頻繁に投与することができる様々な構築物、およびヒト化抗体またはヒト抗体が得られる。
【００１２】
ＣＤ２０は、一部の患者のＢ細胞が極めて低レベルでＣＤ２０抗原を発現しているＣＬＬ患者において、Ｂ細胞の表面上で様々に発現される。ＣＤ２０（ヒトＢリンパ球制限分化抗原（ｈｕｍａｎ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ））は、プレＢリンパ球および成熟Ｂリンパ球上に存在するおよそ３５ｋＤの分子量を有する、疎水性の膜貫通タンパク質である。この抗原はまた、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）においてはＢ細胞のうちの９０％を上回る細胞上でも発現されるが、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常な血漿細胞、または他の正常な組織上では見られない。ＣＤ２０は、細胞周期の開始および分化のための活性化プロセスの初期の工程（単数または複数）を調節し、おそらく、カルシウムイオンチャネルとして機能する。ＣＤ２０は、細胞表面から脱落することはなく、抗体を結合してもインターナライズしない。遊離のＣＤ２０抗原は、循環中に見られない（Ｐｅｓｃｏｖｉｔｚ、２００６）。
【００１３】
抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブは、ヒトＣＤ２０に対する、遺伝子操作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体であり（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．による、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）またはＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、これは、再発性の、または難治性の、悪性度の低い、または濾胞性の、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫およびＢ−ＣＬＬを有する患者の治療に使用される。リツキシマブは、ＣＤ２０抗原を介してこれが結合するＢ細胞への攻撃およびＢ細胞の死滅に対して体の自然防御を動員することによって作用する。作用機序についてのインビトロで研究により、リツキシマブがヒト補体に結合し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によってリンパＢ細胞株を溶解させることが明らかにされている（Ｒｅｆｆら、１９９４）。さらに、リツキシマブは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）についてのアッセイにおいて相当な活性を有する。インビボでの前臨床試験では、おそらく、補体および細胞を介したプロセスによって、リツキシマブが、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ）の末梢血、リンパ節、および骨髄からＢ細胞を枯渇させることが示されている（Ｒｅｆｆら、１９９４）。リツキシマブはＣＬＬ患者において成功例があるが、ＣＬＬ患者の分析は、Ｂ−ＣＬＬ細胞の表面上でのＣＤ２０の密度が、極めて低いレベルでＣＤ２０抗原を発現する一部の患者のＢ細胞の場合にやはり様々であることを示す。さらに、リンパ腫を治療するために、リツキシマブがＰＦ−３５１２６７６（以前は、ＣｐＧ７９０９、ＴＬＲ９活性化オリゴヌクレオチド）と組み合わせて投与された最近の臨床試験で、望ましい結果を示すことはできていない（Ｌｅｏｎａｒｄら、２００７）。
【００１４】
リツキシマブに加えて、Ｂ細胞悪性疾患についての典型的な治療は、放射線療法および化学療法剤の投与である。ＣＬＬの場合、従来の外部放射線療法が、悪性細胞を破壊するために使用される。しかし、この治療において、副作用が制限要因である。血液学的悪性疾患に広く使用されている別の治療は化学療法である。併用化学療法は、部分寛解または完全緩解に達した成功例がいくつかある。残念なことに、化学療法によって得られたこれらの寛解は長続きしない場合が多い。
【００１５】
逆に、ＣＤ２３の発現は、Ｂ−ＣＬＬにおいて一貫して高レベルで存在することが明らかにされている。ＣＤ２３白血球分化抗原は、いくつかの造血系の細胞上で発現される４５ｋＤのＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、これは、ＩｇＥについての低親和性受容体（ＦｃｙＲＩＩ）として機能する（Ｐａｔｈａｎら、２００８）。これは、Ｃ型レクチンファミリーの１つのメンバーであり、細胞外レクチン結合ドメインと膜貫通領域との間にα−へリックス・コイルドコイル・スターク（α−ｈｅｌｉｃａｌ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｓｔａｌｋ）を含む。このスターク構造は、そのリガンド（例えば、ＩｇＧ）を結合する際の、膜に結合したＣＤ２３の三量体へのオリゴマー化に寄与していると考えられる。タンパク質分解されると、膜に結合されたＣＤ２３は、いくつかの可溶性ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）分子量種（３７ｋＤ、２９ｋＤ、および１６ｋＤ）を生じる。ＩｇＥの産生の調節に関与していることに加えて、ＣＤ２３はまた、胚中心Ｂ細胞の生存を促進するとも推測されている。ＣＤ２３の発現は、正常な活性化された濾胞性Ｂ細胞中でもＢ−ＣＬＬ細胞中でも高度にアップレギュレーションされる。
【００１６】
ルミリキシマブ（Ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）は、モノクローナルキメラ抗ＣＤ２３抗体（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃによる、現在臨床試験中である）であり、これは、マカクザルの可変領域とヒトの定常領域（ＩｇＧ１、κ）とを持ち、もともとは活性化されたヒトの血液Ｂ細胞によるＩｇＥの産生を阻害するために開発されたものである。これは、現在、Ｂ−ＣＬＬ患者において使用するための第ＩＩＩ相試験中である。インビトロでの研究により、ルミリキシマブが、ミトコンドリアの死経路を介してＢ−ＣＬＬ細胞中でのカスパーゼ依存性アポトーシスを誘導することが示されている（Ｐａｔｈａｎら、２００８）。したがって、これは、リツキシマブとは異なる機序を介して腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するとみられる。
【００１７】
いくつかの他の抗体が、がんの治療について最近になって承認された。アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）またはＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｉｌｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによる抗ＣＤ５２）（Ｋｅａｔｉｎｇら、２００２）は、２００１年に、難治性ＣＬＬの治療について承認された。ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）は、結腸がん、小細胞肺がん、および乳がんの治療に使用される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂである。トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（ＲｏｃｈｅによるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、ＨＥＲ−２標的を過剰発現する転移性乳がん腫瘍に有効なヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂである（Ｓｔｒｏｍｅら、２００７）。
【００１８】
オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）およびヴェルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）も、がん（例えば、ＣＬＬ）の治療について提案されている。
【００１９】
抗体薬物（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ）をより有効にするために、腫瘍細胞の表面上にある特異的抗原標的のアップレギュレーションが役に立つ可能性がある。そのような効果を得るための１つの方法は、免疫調節オリゴヌクレオチドで細胞を刺激することであり得る。免疫刺激効果は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む合成のＤＮＡベースのオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用によって得ることができる。そのようなＣｐＧ ＯＤＮは、Ｂ細胞の増殖、サイトカインおよび免疫グロブリンの分泌、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性、ならびにＩＦＮ−γの分泌を誘導するヒト白血球およびマウス白血球に対する高い免疫刺激効果を有する。ＣｐＧ ＯＤＮはまた、樹状細胞（ＤＣ）および他の抗原提示細胞を活性化させ、それにより、共刺激分子の発現、および分泌型サイトカイン、特に、Ｔｈ１様Ｔ細胞応答の発生を促進することにおいて重要であるＴｈ１様サイトカインの発現を導く（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）。ＣｐＧ−ＯＤＮによる受容体密度の増大は、細胞に対するオリゴヌクレオチドの直接の効果に媒介され得るか、または、サイトカインの誘導に媒介され得る。抗原密度の増大、または標的受容体を発現する細胞の集団の増大により、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のいずれかを増強させることによって、腫瘍細胞をより効率よく死滅させることができる。
【００２０】
ＣｐＧモチーフだけがオリゴヌクレオチドの効力についての責任を担うわけではないとの指摘がある。このモチーフが所望される機能に必要がないとの指摘もさらに存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
がんについてのオリゴヌクレオチドベースの治療的手法を開発することに相当の労力が費やされており、これまでに時折成功例が報告されてきたにもかかわらず、改善された効力を示し、最小限しか副作用を示さないかまたは副作用を示さない新規の化合物および投与の態様が依然必要とされている。
【００２２】
抗体療法は、一般的にはコストが高く、とりわけ、効率に関して改良が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは驚くべきことに、インビボでは動物実験において、またインビトロではＣＬＬ患者および健常対象由来のＰＢＭＣを使用して確認されたように、特異的オリゴヌクレオチド配列は、皮下投与された場合に、または特に、粘膜に（例えば、経口で、肺に、鼻腔内に、直腸内に、もしくは膣内に）局所投与された場合に、様々なヒトのがんの形態に対して大きな効果を有することを見出した。
【００２４】
さらに、単独で、または他の治療と併用して大きな治療効果を示す新規の配列が開発されており、インビボでは動物実験において、またインビトロではヒト材料で試験されている。これらのオリゴヌクレオチドは、アポトーシスを誘導するために、特に、細胞表面受容体の発現を増大させるために使用される。本発明のオリゴヌクレオチドは、がんを治療するための免疫学的手法と併用することができ、特に、特異的受容体に対して特異的であるモノクローナル抗体と併用することができる。本発明の複数の実施形態は、参照により本明細書中に組み込まれる添付の特許請求の範囲で定義される。
【００２５】
本発明は、添付の図面を参照して、以下の説明、非限定的な実施例、および特許請求の範囲でさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】は、対照（ＰＢＳ）と比較した、配列番号１および配列番号２の５０μｇの物質の皮下投与後の、誘導された皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについての、経時的な腫瘍容積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図１Ｂ】は、配列番号４の５０μｇもしくは１５０μｇの物質の皮下投与後、または５０μｇの物質の鼻腔内(i.n.)投与後の、誘導された皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについての、経時的な腫瘍容積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図２Ａ】配列番号１〜４に記載される化合物での７２時間の処理後の、インビトロでのヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６に対する増殖抑制効果を示す棒グラフである。ここでは、「−」は陰性対照を示す。細胞増殖は、Ｋｉ−６７陽性細胞のフローサイトメトリーによって測定した。棒は、未処理（Ｍ）の細胞と比較した処理した細胞の相対的な増殖±ＳＥＭを示す。
【図２Ｂ】配列番号１〜４に記載される化合物での７２時間の処理後の、インビトロでのヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６におけるアポトーシスの誘導を示す棒グラフである。ここでは、「−」は陰性対照を示す。アポトーシスは、７−ＡＡＤ陽性細胞のフローサイトメトリーによって測定した。
【図２Ｃ】配列番号１、配列番号３、および配列番号４に記載される化合物での４８時間の処理後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫細胞株中のＢ細胞増殖マーカーＣＤ２０の表面発現を示す棒グラフからなる。ＣＤ２０の表面発現はフローサイトメトリーによって測定した。「−」は陰性対照を示す。棒は、未処理（Ｍ）の細胞と比較した処理した細胞の相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図２Ｄ】配列番号１、配列番号３、および配列番号４に記載される化合物での７２時間の処理後の、インビトロでのヒトバーキットリンパ腫細胞株の細胞の生存を示すグラフである。ここでは、「−」は陰性対照を示す。細胞の生存は、トリパンブルー陽性細胞を除き、処理の開始後３日間、毎日細胞をカウントすることによって測定した。線は、未処理（Ｍ）の細胞と比較した処理した細胞の相対的な細胞の生存を示す。
【図３Ａ−Ｃ】フローサイトメトリーによって測定した、実験用化合物での４８時間の処理によって、ＣＬＬ患者由来のＣＤ１９陽性Ｂ細胞上でＣＤ２０（図３Ａ）、ＣＤ２３（図３Ｂ）、およびＣＤ８０（図３Ｃ）のアップレギュレーションがどのように誘導されるかを示すグラフである。全ての化合物（配列番号１〜８）は、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの濃度で試験した。棒は、１８個の試料におけるＣＤ２０の表面発現の平均ＭＦＩ値±ＳＥＭを示す。「−」は陰性対照を示す。
【図３Ｄ】フローサイトメトリーを使用してＣＤ６９陽性／ＣＤ５６陽性細胞を染色することによって測定した、実験用化合物での４８時間の処理によって、ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣ中のＮＫ細胞の活性化がどのように誘導されるかを示すグラフである。これらの化合物は、配列番号１〜７に示される。「−」は陰性対照を示す。棒は、１８個の試料における活性化されたＮＫ細胞の平均割合（％）±ＳＥＭを示す。
【図３Ｅ】実験用化合物での７２時間の処理により、ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＳにおいてＢ細胞のアポトーシスが誘導されることを示すグラフである。全ての化合物（配列番号１〜６）は、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの濃度で試験した。アポトーシスは、ＣＤ１９陽性細胞の７−ＡＡＤでの染色によって測定し、続いて、フローサイトメトリーによって分析した。棒は、１０個の試料における誘導されたアポトーシスの平均割合（％）±ＳＥＭを示す。
【図４Ａ】未処理の細胞と比較した、上記化合物への３０分、２時間、および６時間の暴露後に２５μＭの濃度の配列番号１で処理した健常ＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ−６の産生の増大を示すグラフである。
【図４Ｂ】未処理の細胞と比較した、上記化合物への３０分、２時間、および６時間の暴露後に２５μＭの濃度の配列番号１で処理した健常ＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ−１０の産生の増大を示すグラフである。
【図４Ｃ】未処理の細胞と比較した、上記化合物への３０分、２時間、および６時間の暴露後に２５μＭの濃度の配列番号１で処理した健常ＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＰ−１０の産生の増大を示すグラフである。
【図４Ｄ】７２時間継続して処理した細胞および未処理の細胞と比較した、上記化合物への２時間、６時間、および２４時間の暴露後に０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの濃度の配列番号１で処理したＣＬＬ Ｂ細胞上でのＣＤ２０の表面発現のアップレギュレーションを示すグラフである。ＣＤ２０の発現は、フローサイトメトリーによって分析し、棒は、４人の患者の試料によるＣＤ２０の表面発現の平均割合（％）±ＳＥＭを示す。
【図４Ｅ】７２時間継続して処理した細胞および未処理の細胞と比較した、上記化合物への２時間、６時間、および２４時間の暴露後に０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの濃度の配列番号１で処理したＣＬＬ−ＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞の活性化を示すグラフである。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ６９陽性ＣＤ５６陽性細胞の割合（％）をＦＡＣＳで測定することによって分析した。棒は、４人の患者の試料による平均割合（％）±ＳＥＭを示す。
【図５Ａ−Ｅ】ヒトＣＬＬ患者由来のＢ細胞に対するインビトロでのリツキシマブの増強効率を示すグラフである。ＣＬＬ Ｂ細胞は、本発明の化合物：配列番号１（図５Ａ）、配列番号３（図５Ｂ）、配列番号４（図５Ｃ）、配列番号７（図５Ｄ）、または配列番号８（図５Ｅ）で４８時間前処理し、続いて、ＡＤＣＣを介したアポトーシスの分析のためにリツキシマブで２４時間処理した（図５Ａ〜Ｅ）。棒は、アネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）および７−ＡＡＤでのＣＤ１９陽性細胞の二重染色によって測定した、ＣＤ１９陽性ＣＬＬ細胞のアポトーシスの平均割合（％）±ＳＥＭを示す。ｎ＝１８。
【図５Ｆ】ＣＤＣに媒介される細胞死を示すグラフである。ＣＬＬ Ｂ細胞は、本発明の化合物：配列番号１（図５Ｆ）、配列番号３、配列番号４、配列番号７、または配列番号８（データは示さず）で４８時間前処理し、続いて、ＣＤＣに媒介されるアポトーシスの分析のために４時間、３０％ヒト血清を補充した培地中でリツキシマブで処理した（図５Ｆ）。棒は、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤでのＣＤ１９陽性細胞の二重染色によって測定した、ＣＤ１９陽性ＣＬＬ細胞のアポトーシスの平均割合（％）±ＳＥＭを示す。ｎ＝１８。
【図５Ｇ】投与順序の重要性を示すグラフである。ここでは、図５Ａは、リツキシマブの投与前に配列番号１によってＣＤ２０の発現を増大させた場合のアポトーシスの平均割合（％）±ＳＥＭを示し、図５Ｇは、配列番号１の４８時間前にリツキシマブを添加した場合の対応する結果を示す。ｎ＝１０。
【図６Ａ−Ｅ】併用療法に対して弱く反応する試料に対する、併用療法に十分に反応するＣＬＬ試料におけるサイトカインの誘導を示すグラフである。細胞上清は、配列番号１〜６での処理の４８時間後に収集し、続いて、ＩＬ−６（図６Ａ）、ＩＬ−１０（図６Ｂ）、ＩＬ−１２（図６Ｃ）、ＩＰ−１０（図６Ｄ）、およびＴＮＦ−α（図６Ｅ）の含有量についてサイトメトリービーズアレイ（ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ）（ＣＢＡ）によって分析した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明が詳細に記載される前に、記載される特定の配列、または記載される方法の工程は変わり得るので、本発明は、そのような配列および方法に限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものにすぎず、限定とは意図されないこともまた理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合は、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」にはまた、文脈上別のことが明記されていない限りは、複数の指示対象も含まれることにも留意されなければならない。したがって、例えば、「配列（ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」への言及には、２つ以上のそのような配列が含まれるなどである。
【００２８】
さらに、用語「約」は、適用できる場合は、所定の値の±２％の偏差を、好ましくは、その数値の±５％の偏差、最も好ましくは、±１０％の偏差を示すために使用される。
【００２９】
用語「がん」は、任意の悪性の腫瘍性疾患、すなわち、異常であり、かつ抑制されない細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性の増殖または腫瘍をいうように意味される。用語「がん」は、特に、本発明の記載に含まれる動物実験において説明されるように、充実性の限局性腫瘍と、限定ではないが、実施例で研究した白血病の１つの形態である慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）などの非充実性のがんの形態の両方を含むように意味される。
【００３０】
用語「免疫調節」は、哺乳動物などの脊椎動物に投与されると、生物において免疫系を刺激するかもしくは免疫系を抑制するかのいずれか、またはその両方である免疫反応をいう。本明細書中で使用される場合は、用語「哺乳動物」には、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、畜牛（ｃａｔｔｌｅ）、雌牛（ｃｏｗ）、ブタ、ウサギ、ヒト以外の霊長類、およびヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
用語「免疫調節応答」は、免疫調節オリゴヌクレオチドでチャレンジされた場合の免疫反応の変化を記載する。この変化は、多くの場合は、インターフェロンなどの特定のサイトカインの放出を通じて、ならびに、増殖などの他の生理学的パラメーターを通じて測定することができる。それと同時に、この反応は、問われている免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されたサイトカインに依存して、免疫系を刺激するように、さらには免疫系を抑制するように作用するものであり得る。
【００３２】
ヒト細胞株を使用してインビトロで行った実験は、本発明のオリゴヌクレオチドが増殖を低下させること、およびアポトーシスを誘導することの両方ができることを示す。加えて、インビボでの用量の減少（１５０μｇから５０μｇに）は、皮下投与において反応を有意に改善した。驚くべきことに、粘膜への適用（本明細書中では、鼻腔内投与の形態で試験した）は、マウスモデルにおいて、同程度に有効な投与方法をもたらした。
【００３３】
本発明者らはまた、本発明の化合物が、細胞表面マーカー（本明細書中では、細胞表面マーカーＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０によって説明される）の発現を誘発または増大させることができることも見出した。
【００３４】
したがって、本発明者らは、本発明の一実施形態として、複数の化合物および複数の方法をがんの治療に利用できるようにする。ここでは、表１に示す本発明の化合物が、アポトーシスを増大させるため、および／または細胞表面マーカーＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０の１種類または複数の発現をアップレギュレーションするために単独で、または放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法もしくは免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、もしくはこれらの任意の組合せから選択される抗腫瘍療法と併用してのいずれかで使用される。上記抗腫瘍治療が免疫療法または免疫調節療法であり、これが患者への抗体の投与を含むことが最も好ましい。
【００３５】
現在利用できる抗体の例としては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、およびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
抗腫瘍療法と併用される場合は、本発明の化合物は、抗腫瘍療法の前に、好ましくは、この療法の少なくとも約１２時間前、より好ましくは約２４時間前、最も好ましくは約４８時間前に投与されることが好ましい。免疫療法と併用される場合、特に、抗体の投与を含む療法と組み合わせる場合は、本発明の化合物は、好ましくは、患者への抗体の投与の前に、最も好ましくは、特異的抗体が標的とする細胞表面分子または細胞表面マーカーのアップレギュレーションを可能にするために、十分に前に投与される。
【００３７】
本発明は、特異的ヌクレオチド、すなわち、配列番号１〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列を利用できるようにする。表１を参照のこと。
【００３８】
【表１】
【００３９】
上記配列、配列番号１〜７は本発明者らによって設計され、配列番号４を除き、本発明者らが知る限りは、これまでには知られていない。配列番号４は、１９９３年に最初に公開された（Ｓｏｋｏｌｏｓｋｉら、１９９３）。
【００４０】
配列番号７は、ＣＧの代わりにＧＣを含む、すなわち、ＣｐＧモチーフを持たない完全にホスホロチオ化されたＩＤＸ０１５０（配列番号４）である。
【００４１】
配列番号８は陰性対照としてのみ使用され、特許請求の範囲には含まれない。
【００４２】
配列番号１〜７のいずれか１つに記載されるオリゴヌクレオチド配列は、リン酸骨格修飾を有している少なくとも１つのヌクレオチドを含み得る。上記リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエート修飾またはホスホロジチオエート修飾であることが好ましい。
【００４３】
本発明にはまた、がんを治療するための医薬品を製造するための、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用も含まれる。
【００４４】
特に、アポトーシスの誘導および／または細胞表面マーカーの発現の増大によるがんを治療するための医薬品を製造するための、配列番号１〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【００４５】
これに対応して、本発明にはまた、がんの治療において細胞表面マーカーのアップレギュレーションおよび／またはアポトーシスの誘導の少なくとも１つを達成するために有効な用量で皮下投与される医薬品を製造するための、配列番号１〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用も含まれる。上記用量は、がん治療のために、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの間である。
【００４６】
特に、配列、配列番号１、配列番号４、および配列番号６は、ＣＬＬ Ｂ細胞において示されるように、細胞表面マーカー、特に、ＣＤ２０の有望なアップレギュレーターであることが示されている。
【００４７】
上記医薬品は、皮下に、鼻腔内に、経口で、静脈内に、または粘膜に、例えば、経口で、粘膜に対して局所に、直腸内に、膣内に、吸入によってなどで投与することができる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態には、上記で定義されたような使用が含まれる。ここでは、抗腫瘍治療は、上記オリゴヌクレオチドの投与の前に、後に、または本質的に同時に投与される。この抗腫瘍治療は、放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法もしくは免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択される。
【００４９】
抗腫瘍治療は、好ましくは、患者への抗体の投与を含む療法などの、免疫療法または免疫調節療法である。抗体の投与などの免疫学的治療の場合、本発明の化合物は、抗体の投与の前に投与されることが好ましい。時間は、細胞表面マーカーの発現の所望されるアップレギュレーションが達成されるように選択され、好ましくは、抗体の投与の少なくとも約１２時間前、より好ましくは約２４時間前、最も好ましくは４８時間前である。本発明の化合物の追加用量が、細胞表面マーカーのアップレギュレーションをブーストする（ｂｏｏｓｔ）ために、抗体の投与後に投与されなければならない場合があることも考えられる。
【００５０】
配列番号１〜７のいずれか１つに記載されるオリゴヌクレオチド配列に、リン酸骨格修飾を有している少なくとも１つのヌクレオチドが含まれ得る、上記抗腫瘍治療の使用。上記リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエート修飾またはホスホロジチオエート修飾であることが好ましい。
【００５１】
結果として、本発明にはまた、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列が、その必要がある患者に投与される、がんの治療方法も含まれる。
【００５２】
上記で定義されたように、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つにおける少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸骨格修飾を含み得る。上記リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエート修飾またはホスホロジチオエート修飾であることが好ましい。
【００５３】
本発明の治療方法の一実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、粘膜に投与される、すなわち、それが必要な患者の粘膜に局所投与される。粘膜投与としては、経口投与、肺投与、直腸投与、膣内投与、および鼻腔内投与が挙げられる。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。
【００５４】
別の実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、それが必要な患者に皮下投与される。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００５５】
本発明者らは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、および配列番号７に記載されるオリゴヌクレオチドが、がんを治療するための他の手法と併用されると相乗効果を発揮することを、インビトロでヒトの材料において確認した。したがって、本発明の一実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、特に、上記抗腫瘍治療が抗体の投与を含む場合には、抗腫瘍治療の前に、または抗腫瘍治療と本質的に同時に投与され、抗腫瘍治療の前に投与されることが最も好ましい。
【００５６】
上記で概説されたように、この抗腫瘍治療は、放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法または免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択される。
【００５７】
上記抗腫瘍治療は、好ましくは、患者への抗体の投与を含む免疫療法である。抗体の例としては、現在使用されている抗体、ならびに評価段階にある抗体、例えば、リツキシマブ、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、アルツズマブ（ａｌｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、イブリツモマブ（ＣＤ２０に対する）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、アレムツズマブ（ＣＤ５２）、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ）（ＣＤ８０）、エプラツジマブ（ｅｐｒａｔｕｚｉｍａｂ）（ＣＤ２２）、およびダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（ＣＤ２５）が挙げられる。
【００５８】
がんの抗腫瘍治療の１つの実施形態では、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列が、それが必要な患者に投与される。上記オリゴヌクレオチドは、それが必要な患者に対して、粘膜に、または皮下に局所投与される。
【００５９】
がんの治療の別の実施形態においては、配列番号１〜７から選択されるオリゴヌクレオチド配列が、細胞表面マーカーＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０の少なくとも１つの発現を誘発させるための有効用量で投与される。上記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはリン酸骨格修飾を有し、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。上記オリゴヌクレオチドは、抗腫瘍治療の前に、または抗腫瘍治療と本質的に同時に投与され得る。ここでは、抗腫瘍治療は、放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法または免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択される。上記抗腫瘍治療は免疫学的治療であり、これは、患者への抗体の投与の前の、または患者への抗体の投与と併用される、上記オリゴヌクレオチド配列の投与を含む。
【００６０】
本発明の上記実施形態の任意の１つにおいては、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの細胞表面分子または細胞表面マーカー、特に、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０から選択される細胞表面マーカーの発現を誘発するか、または増大させるか、またはアップレギュレーションするために有効な用量で投与される。上記オリゴヌクレオチドはリン酸骨格修飾を有し得る。
【００６１】
がんの治療のためには多数の手法があるという事実は当業者に周知である。がんのタイプ、その位置および進行状態、ならびに患者の症状に応じていくつかの療法が使用されることは、がんとの闘いに特徴的である。結果として、多くの場合に、いくつかの療法が連続して使用されるか、または併用される。外科的介入、放射線療法、および化学療法などの一部の療法が何十年にもわたり行われてきたが、他の療法が最近考えられており、多くはなおも実験的使用の段階にある。当然、新しい手法が絶えず開発されており、本発明のオリゴヌクレオチド、それらの使用および治療方法については、将来の治療との併用においても有用性が見出されるであろうと考えられる。本発明者らは、現在は、本発明のオリゴヌクレオチド、それらの使用、および治療方法が、以下のような抗腫瘍治療との併用において有用であると考えているが、それらに限定されることは望ましくない：放射線療法、ホルモン療法、外科的介入、化学療法、免疫療法もしくは免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せ。
【００６２】
抗腫瘍治療は、患者への抗体の投与を含む免疫療法または免疫調節療法であることが好ましい。
【００６３】
上記オリゴヌクレオチドは、治療有効用量で投与される。「治療有効用量」の定義は、疾患および治療の状況に応じて様々であり、「治療有効用量」は、単独で、または他の治療と併用して、患者の状態の測定できるほどの改善をもたらす用量である。
【００６４】
一実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の量で皮下投与される。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与される。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与される。
【００６５】
上記オリゴヌクレオチドは、皮下に、静脈内に、または粘膜に（例えば、経口で、鼻腔内に、直腸内に、または膣内に）、単回投与で投与され得るか、または反復投与で投与され得る。
【００６６】
本発明のヌクレオチドは、皮下投与されるか、または粘膜に局所投与され得る。用語「粘膜に局所に」には、経口投与、肺投与、直腸投与、膣内投与、および鼻腔内投与が含まれる。ヌクレオチドは、適切な水性緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）であるがこれに限定されない）などの、任意の適切な処方物において投与され得る。上記ヌクレオチドは、適切なゲルを形成するポリマー（例えば、キトサンなど）などの粘膜への接着を増大させるように設計された適切な処方物、脂溶性投与ビヒクル（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）、リポソーム、またはミセルなどのヌクレオチドの細胞による取込みを促進する処方物、または適切なゲルを形成し、かつヌクレオチドの細胞による取込みを促進する処方物において投与されることが企図される。鼻腔投与に利用できる方法およびデバイスがいくつか存在する：局所作用または全身作用のいずれかを持つ、液体処方物、粉末処方物、および噴霧処方物の単回投与または複数回投与。本発明は、鼻粘膜にヌクレオチドを投与するための特定の方法またはデバイスに限定されない。最初の動物実験により、ピペットによる単純な滴下により満足のいく効果がもたらされることが示されたが、ヒトでの使用については、信頼できる単回投与または複数回投与のためのデバイスが好ましい。
【００６７】
好ましくは、上記医薬品の投与経路は、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、粘膜投与、および腹腔内投与から選択される。好ましくは、粘膜投与は、経口投与、胃内投与、鼻腔内投与、眼内投与、直腸投与、泌尿生殖器投与、および膣内投与から選択される。
【００６８】
一実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、静脈注射または静脈内注入によって投与される。
【００６９】
別の実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、それが必要な患者に皮下投与される。
【００７０】
本発明者らはまた、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載されるオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物を利用できるようにする。上記薬学的組成物は、生理食塩水、リポソーム、界面活性剤、粘膜付着性化合物、酵素阻害剤、胆汁酸塩、吸収促進剤、シクロデキストリン、またはこれらの任意の組合せから選択される、薬理学的に適合し、かつ生理学的に許容される賦形剤または担体をさらに含むことが好ましい。
【００７１】
本発明の別の実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、例えば、適切な緩衝液に懸濁させた上記オリゴヌクレオチドを含む水性浣腸剤の形態で、直腸への滴下によって結腸の粘膜に投与される。
【００７２】
本発明の別の実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、適切な緩衝液に懸濁させた上記オリゴヌクレオチドを含むエアゾールの吸入によって、または適切な緩衝液に懸濁させた上記オリゴヌクレオチドをまた含む洗浄を行うことによって、肺または気道の粘膜に投与される。
【００７３】
本発明のさらに別の実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、適切なビヒクルに懸濁した上記オリゴヌクレオチドを含む溶液、緩衝液、ゲル、軟膏、ペーストなどの塗布によって、尿道、膣などの泌尿生殖路の粘膜に投与される。
【００７４】
鼻粘膜への塗布による効果は全身的であることが示されているが、泌尿生殖路、気道、または小腸の粘膜などの他の部位への塗布が、これらの臓器またはその付近にある腫瘍の治療にはより適していると考えられる。
【００７５】
本発明は、実験のセクションに示され、添付の図面で説明されるインビボでのデータおよびインビトロでのデータによってサポートされるように、がんの治療における有用性を見出す。
【００７６】
本発明の実施形態には多くの利点がある。今までのところは、本発明者らによって定義される用量でのオリゴヌクレオチドの投与は、顕著な副作用を誘発することはない。さらに、粘膜への投与は容易であり、早く、痛みがなく、驚くことに全身的な効果を生じる。腫瘍部位の状態に対する影響は、実験において見られる増殖の低下およびアポトーシスの誘導に関与する１つの要因であると考えられるが、これは唯一の要因ではない。この効果は、単独で、または既存の抗がん治療および将来の抗がん治療と併用して、がんとの闘うための有望な手法を提示すると考えられる。
【実施例１】
【００７７】
１．動物実験
ＲＭＡリンパ腫細胞の皮下増殖に対する効果を、同系Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスにおいて、オリゴヌクレオチドの投与後にインビボで調べた。この実験の目的は、皮下腫瘍の増殖の実験用マウスモデルにおいて様々なオリゴヌクレオチドの腫瘍増殖阻害効果を調べることであった。実験用の皮下腫瘍は、インビボでの、維持されたＲＭＡ腫瘍細胞のレシピエントＢ６マウスへの接種によって誘導することができることが知られている。
【００７８】
１．１ 試験システム
腫瘍細胞のタイプと誘導
マウスでの皮下腫瘍の誘導は、インビボで増殖させたラウシャー・ウイルス（Ｒａｕｃｈｅｒ ｖｉｒｕｓ）に誘導されたリンパ腫細胞（ＲＭＡ）の細胞懸濁液（１０3）の、動物の右脇腹への接種によって行った。
【００７９】
被験物品の処方と調製
配列番号１、配列番号２、および配列番号４は、Ｉｎｄｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎによって、「すぐに使用できる」濃度（２．５μｇ／μＬ〜１．２５μｇ／μＬ）で供給され、届けられた。これらは、使用するまで４℃で維持した。
【００８０】
１．２ 動物の材料と条件
種、株、および供給業者
使用したマウスは、ＭＴＣ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎで飼育施設（ｈｏｕｓｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）から入手した同系交配のＣ５７ＢＬ／６／Ｂｙマウスであった。
【００８１】
１．３ 実験手順／実験計画
実験手順
簡単に説明すると、この実験は、以下の操作を含んでいた：ＲＭＡ腫瘍細胞をＢ６マウスにおいて腹水腫瘍として増殖させて、インビトロでの増殖に適応させた腫瘍細胞の供給源を提供した。回復後、少量のＲＭＡ腫瘍細胞（１０3個の細胞）を、レシピエントＢ６／Ｂｙマウスの右脇腹に接種した。
【００８２】
腫瘍細胞の接種後、全てのマウスを、注射部位の触診によって１週間に２回モニターした。いずれかのマウスにおいて腫瘍増殖の最初の兆候が見られた時点で、マウスを複数のグループに分け、３回の投与（１００μｌ）を、３日間毎日試験物質の単回投与で投与した。試験物質は、動物の左脇腹に皮下投与した。マウスの１つのグループには、５０μｇ（４０μｌ）の配列番号４を鼻腔内に投与した。対照動物の１つのグループには、ビヒクルのみ（ＰＢＳ）の１００μｌの注射を投与した。
【００８３】
腫瘍の増殖速度の評価
マウスを継続してモニターし、個々のマウスを、手での触診によって追跡調査した。腫瘍が現れるとすぐに、皮下腫瘍の増殖を、キャリパーを使用して毎日測定し、がん容積（ｃａｎｃｅｒ ｍａｓｓ ｖｏｌｕｍｅ）（ｍｍ3）として表した。
【００８４】
最終手順
腫瘍を持つ動物を、その増殖している腫瘍の大きさが１５００ｍｍ3に達した時点で屠殺した。腫瘍を生じていない動物全てを、最長２ヶ月間モニターし、その時点でマウスを屠殺した。
【００８５】
１．４ 結果
試験した個々の化合物は、最長１０日の観察期間の間に、腫瘍の増殖に対して阻害効果を示した（図１Ａおよび図１Ｂ）。配列番号１および配列番号２は、この実験の設定においては、腫瘍の増殖を低下させる同等の能力を示した（図１Ａ）。
【００８６】
配列番号４もまた、腫瘍の増殖を低下させた（図１Ｂ）。驚くべきことに、低用量（５０μｇ対１５０μｇ）により、腫瘍増殖の著しい低下が生じた。同じように驚くべきことに、同じ用量（５０μｇ）を鼻腔内に投与した場合にも、同等の大幅な腫瘍増殖の低下が生じた（図１Ｂを参照のこと）。
【００８７】
２．ヒト細胞株を用いたインビトロでの実験
２種類の認められているヒト腫瘍モデル細胞株を使用した。この実験の目的は、様々なオリゴヌクレオチドについて、腫瘍細胞の増殖を阻害する能力と、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する能力を調べることであった。第２の目的は、ヒトのがんに対する効果の予測となる別の設定において、実験動物で得られた効果を実験することであった。ＣｐＧモチーフを含まない陰性対照を使用した。
【００８８】
２．１ ヒト結腸がん細胞株
ヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を、本発明のヌクレオチドである配列番号１〜４のそれぞれで、組織培養培地中で７２時間処理した。細胞の増殖と細胞死を、当業者に公知の手順にしたがって、それぞれＫｉ−６７染色および７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）染色を使用してＦＡＣＳ分析によって分析した。Ｋｉ−６７は増殖している細胞によって発現され、アポトーシス細胞は、７−ＡＡＤを使用して同定することができた。
【００８９】
２．２ ヒトリンパ腫細胞株
ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉを、本発明のヌクレオチドである配列番号１、配列番号３、および配列番号４のそれぞれで、組織培養培地中で２４時間、４８時間、および７２時間刺激した。様々な表面発現マーカーの発現を、文献に記載されているようにＦＡＣＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって分析した（例えば、Ｇｕｒｓｅｌら、２００２；Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒら、２００１；Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒら、２００５ａ；Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒら、２００５ｂを参照のこと）。
【００９０】
２．３ 結果
図２Ａで見られるように、配列番号１〜４に記載される化合物は全て、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞の増殖を低下させることができた。特に、配列番号２〜４での７２時間の処理によって、未処理の細胞と比較して腫瘍増殖の顕著な低下が達成された。
【００９１】
図２Ｂは、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する同じ化合物の能力を示す。ここでは、上記化合物、特に、配列番号２〜４は、未処理の細胞と比較して、７２時間の処理後に高い割合でアポトーシスを誘導した。配列番号１は、ＨＣＴ１１６細胞株のアポトーシスを誘導することはなかった。
【００９２】
図２Ｃに示すように、配列番号１は、４８時間の処理の後に、Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞株においてＢ細胞増殖マーカーＣＤ２０の細胞表面発現を強くアップレギュレーションした。配列番号３は、ＣＤ２０の表面発現に対して中程度の効果があり、配列番号４はＣＤ２０の表面発現に対しては効果がなかった。
【００９３】
図２Ｄは、配列番号１および配列番号３での７２時間の処理は、Ｄａｕｄｉ細胞の細胞生存の顕著な低下を生じ、一方、配列番号４はＤａｕｄｉ細胞の細胞生存には効果がなかったことを示す。
【００９４】
３．ＣＬＬ血液から単離したＰＢＭＣ中での細胞表面受容体の発現
３．１ 材料および方法
ヘパリン化末梢血は、顕著な循環器疾患を有しているＢ細胞性慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）と診断された患者（ｎ＝２０）から、インフォームドコンセント後に得た。全ての患者は、常用されている免疫表現形の基準、形態学的基準、および臨床的基準によって診断された。
【００９５】
単核細胞画分を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｅｒｏｍｅｄ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）勾配遠心分離によって単離した。これらの細胞を、すぐに、４８ウェルプレート中の容量５００μｌの完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む）中で、２×１０6細胞／ｍｌの濃度で３７℃でインキュベーションし、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの、７種類のオリゴヌクレオチド化合物のそれぞれで処理した。細胞の画分を、ＦＡＣＳによる表面抗原の発現の直接の分析のために、４種類の抗体の２つ混合物（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ８０、およびＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ５６、ＣＤ６９）それぞれで染色した。
【００９６】
４８時間のインキュベーションの後、２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレート中でスピンダウンさせ、１００μｌの２％ＦＣＳ（ＰＢＳ中）中に再懸濁し、抗体混合物の２つのセット（上記）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。次に、細胞を、純粋なＰＢＳで２回洗浄し、続いて表面抗原の発現分析のためにＦＡＣＳＡｒｒａｙバイオアナライザーを使用してＦＡＣＳによって分析した。０日目から３日後、細胞の残りをアポトーシス分析のために収集した。これらの細胞を、９６ウェルプレート中でスピンダウンさせ、上記と同様に２％ＦＣＳ中に再懸濁し、ＣＤ１９とＣＤ３の抗体混合物（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤで、それぞれ初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの分析のために、室温で１０分間染色した。これらの細胞を、上記のようにフローサイトメトリーによって分析した。
【００９７】
３．２ 結果
結果は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、および配列番号６での４８時間の処理により、ＣＬＬ患者由来のＢ細胞上でのＣＤ２０のアップレギュレーションが誘導されたこと（図３Ａ）、ならびにＣＬＬ患者由来のＢ細胞上でのＣＤ８０のアップレギュレーションが誘導されたこと（図３Ｃ）を示す。配列番号２、配列番号５、および配列番号７はＣＤ２０の発現をアップレギュレーションすることはなく（図３Ａ）、配列番号２はＣＤ８０の発現を増強させることはなかった（図３Ｃ）。
【００９８】
ＣＤ２３の発現は、全ての配列番号（１〜７）によってアップレギュレーションされたが、配列番号１、配列番号２、配列番号５、および配列番号６によってほぼ大部分がアップレギュレーションされ（図３Ｂ）、配列番号２、配列番号５、および配列番号６は、受容体を相当にアップレギュレーションした。
【００９９】
ＣＤ５６陽性細胞のＣＤ６９染色により測定したように、配列番号１〜７での４８時間の処理によってＮＫ細胞の活性化が誘導されることもまた示された（図３Ｄ）。
【０１００】
結果はまた、配列番号１および配列番号４〜６が、７２時間の処理の後に、ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣにおいてＢ細胞のアポトーシスを誘導することも示す（図３Ｅ）。配列番号２および配列番号３は、Ｂ ＣＬＬ細胞のアポトーシスを誘導することはなかった。
【０１０１】
４．パルス実験
４．１ 実験の設計
サイトカインプロフィールと表面マーカーの発現を、それぞれ、１人の健常なボランティア由来のＰＢＭＣおよび４人のＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣを使用して、いわゆるパルス実験において決定した。サイトカインプロフィールは、インビトロでの４８時間の培養後に決定し、細胞表面マーカーの染色を、７２時間後にＦＡＣＳによって行った。
【０１０２】
ＰＢＭＣを、実施例３および実施例４に記載したように調製し、培養した。次に、ＰＢＭＣを、３０分間、２時間、または６時間の予め決定した時間、配列番号２に曝し、続いて洗浄した。洗浄は以下のように行った。プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、新しい培地を添加した。遠心分離を繰り返し行い、第２の上清を新しい培地に置き換えた。次に、ＰＢＭＣを、所望される時点まで４８時間（サイトカインプロフィール）または７２時間（表面マーカーの染色）、さらに培養した。
【０１０３】
サイトカインプロフィールは、４８時間のインビトロでの培養後に決定した。健常ＰＢＭＣを、上記の時間、配列番号１に曝し、上清を、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＰ−１０の含有量について分析した。サイトカイン濃度は、ｐｇ／ｍｌとして示す。
【０１０４】
表面マーカーの染色は、７２時間のインビトロでの培養後に行った。ＣＬＬ−ＰＢＭＣを、上記の時間、配列番号１で処理し、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、およびＣＤ６９の細胞表面発現をＦＡＣＳによって分析した。
【０１０５】
４．２．結果
結果は、オリゴヌクレオチドをわずか３０分後に洗浄することによって除去した場合にもなお、顕著な長期的効果があることを示し、このことは、鼻腔内投与、またはオリゴヌクレオチドが約３０分よりも長い間留まることが期待されない他の粘膜への投与の実現可能性をサポートする。
【０１０６】
結果はまた、オリゴヌクレオチドを、２時間後、およびまた、より長い滞留時間が期待される直腸投与に相当する６時間後に洗浄することにより除去した場合にも、顕著な効果を示した。これらの結果を、サイトカイン分析については図４Ａ、Ｂ、およびＣに、表面マーカーの染色については図４Ｄおよび４Ｅに示す。
【０１０７】
この実験を、これらの結果を不死化ヒト細胞株を用いて行った実験よりもすぐれた精度を持つインビボでの設定に転換できるようにするヒトＣＬＬ−ＰＢＭＣを使用して行ったことにも留意されたい。注目すべきは、罹患患者から得たＰＢＭＣには悪性Ｂ細胞が含まれ、実験用化合物の効果が治療に関係がある標的について直接見られることである。
【０１０８】
５．実験用化合物とリツキシマブの同時投与
５．１ 材料および方法
ヘパリン化末梢血は、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の患者から、インフォームドコンセント後に得た。全ての患者は、常用されている免疫表現形の基準、形態学的基準、および臨床的基準によって診断された。
【０１０９】
単核細胞画分を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｅｒｏｍｅｄ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）勾配遠心分離によって単離した。これらの細胞を、すぐに、４８ウェルプレート中の用量５００μｌの完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む）中で、２×１０6細胞／ｍｌの濃度で３７℃でインキュベーションした。
【０１１０】
これらの細胞を、１μＭ、１０μＭ、または２５μＭの実験用化合物、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７、または配列番号８とともにインキュベーションした。４８時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、完全培地中に再懸濁した。ＡＤＣＣアッセイのために、ＣＤ２０特異的モノクローナル抗体であるリツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）を、架橋剤として使用した１０μｇのＦ（ａｂ）2ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｎｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡから入手した）とともに、５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの最終濃度になるように添加した。ＣＤＣアッセイについては、細胞を、３０％のヒト血清（ＲＰＭＩ中）中でインキュベーションし、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７、または配列番号８での４８時間の前処理後に、リツキシマブで４時間処理し、その後、フローサイトメトリーによってアポトーシスについて分析した。一部の細胞は、０日目に４８時間、リツキシマブで処理し、２日目に配列番号１を２４時間かけて添加した（逆実験（ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ））。
【０１１１】
０日目から３日後（ＡＤＣＣ）（または、ＣＤＣアッセイについては２日と４時間後）、細胞をアポトーシスの分析のために収集した。これらの細胞を、９６ウェルプレート中でスピンダウンさせ、上記と同様に２％のＦＣＳ中に再懸濁し、ＣＤ１９とＣＤ３との抗体混合物（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤで、それぞれ初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの分析のために、室温で１０分間染色した。これらの細胞を、上記のようにフローサイトメトリーによって分析した。
【０１１２】
５．２ 結果
結果は、配列番号１とのプレインキュベーションにより、ＣＬＬ患者由来のＢ細胞のリツキシマブを介したアポトーシスの効率が有意に増大したことを明らかに示す。背景に記載したように、リツキシマブがヒト補体に結合し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によってリンパＢ細胞株を溶解させることが知られている。さらに、リツキシマブは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）についてのアッセイにおいて有意な活性が示されている。これらの結果は、配列番号１とリツキシマブとの組合せにより、ＣＬＬ Ｂ細胞のアポトーシスの割合の有意な増大を生じることを示す。１０μＭの配列番号１での前処理によっては、リツキシマブのみによって達成されたアポトーシスの割合よりもほぼ２倍高いアポトーシスの割合が誘導された（図５Ａ）。配列番号３での前処理によっては、配列番号１での前処理と同程度に有効な、リツキシマブを介したアポトーシスの増強が生じた（図５Ｂ）。配列番号４または配列番号７を使用したＣＬＬ−ＰＢＭＣの前処理は、有効というほどではなかった（図５ＣおよびＤ）が、配列番号８での細胞の前処理によっては、リツキシマブに誘導される細胞死には影響はなかった（図５Ｅ）。観察されたアポトーシスの増大は、ＡＤＣＣアッセイにおいてのみ見られ（図５Ａ）、ＣＤＣアッセイにおいては効果は観察されなかった（図５Ｆ、およびデータは示さず）。
【０１１３】
さらに、これらの実験は、投与順序が重要であることを示す。図５Ａに示すように、配列番号１の事前投与によっては、Ｂ細胞のリツキシマブを介したアポトーシスが有意に増加したが、逆実験（すなわち、細胞を最初にリツキシマブで処理し、リツキシマブでの４８時間の処理後に配列番号１を添加した）によっては、リツキシマブのみで処理した細胞と比較して、アポトーシスの増加は生じなかった。図５Ｇを参照のこと。
【０１１４】
６．実験用化合物とリツキシマブとで処理した細胞のサイトカイン分析
６．１ 材料および方法
ＣＬＬ血液から単離したＰＢＭＣを、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの配列番号１〜６で処理した。４８時間の処理後、上清を収集し、ＣＢＡによってサイトカイン含有量を分析した。分析は、様々なＣＬＬ試料間の差異を調べるために行った。
【０１１５】
６．２ 結果
結果は、実験用化合物とリツキシマブとでの併用療法に十分反応するＣＬＬ試料が、併用療法に十分には反応しない試料と比較して、多量のＴｈ１様サイトカインを発現したことを示す。図６Ａに見られるように、併用療法に十分に反応する試料は、反応しない細胞と比較して少量しかＩＬ−６を産生しない。一方、反応性の細胞は、より多くのＩＬ−１０（図６Ｂ）、ＩＬ−１２（図６Ｃ）、ＩＰ−１０（図６Ｄ）、およびＴＮＦ−α（図６Ｅ）を産生した。Ｇ−ＣＳＦの発現には差異はなかった（データは示さず）。
【０１１６】
まとめると、本発明は、上記オリゴヌクレオチドが細胞表面受容体の調節を誘導し、それにより、慢性リンパ球性白血病を治療するために使用される抗体ベースの治療の効率の増大が導かれることを記載している。調べた化合物は、最初に、健常ＰＢＭＣにおけるサイトカイン誘導のそれらのそれぞれのパターンに基づいて選択した。驚くべきことに、ＣＬＬ細胞上で発現される表面抗原に対する効果を分析するために使用した場合には、本発明者らは、全ての化合物が全ての受容体をアップレギュレーションするわけではなく、むしろ、特定の化合物が特定の受容体をアップレギュレーションしたことを見出した。例えば、配列番号１は、細胞表面マーカーＣＤ２０およびＣＤ８０についての最も強力なアップレギュレーターであり、一方、配列番号６は、ＣＤ２３についてのもっとの強力なアップレギュレーターであった。配列番号３は、ＮＫ細胞上のＣＤ６９の強いアップレギュレーションによって示されるように、ＮＫ細胞の最も強力な活性化因子であった。配列番号１とリツキシマブとでのＣＬＬ−ＰＢＭＣの併用療法によっては、単独で使用したリツキシマブと比較して、リツキシマブを介したＡＤＣＣの有意な増加が生じた。ＣＤ２０をアップレギュレーションするそれらの様々な能力によって示されるように、様々な化合物が、リツキシマブに誘導されるＡＤＣＣを増強させる様々な能力を有していた。しかし、驚くべきことに、補体システムを介した細胞死は増加しなかった。このことは、補体システムの活性化がＡＤＣＣの活性化よりも患者にとって毒性がより強いとみなされる場合には、副作用の誘導について重要であり得る。まとめると、これらの結果は、特異的化合物を特異的抗体と併用できる場合には、本発明の化合物がＣＬＬを治療するために設計されたモノクローナル抗体療法の効力を高めることを示す。
【０１１７】
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示してきたが、これは、例示の目的のために例として行われたにすぎず、以下の添付の特許請求の範囲に関する限定を意図するものではない。特に、様々な置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に対して行われ得ることが、本発明者によって考えられる。
【０１１８】
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【技術分野】
【０００１】
本出願は、医薬の分野に関し、特に、単独で、または既存の療法および将来の療法と併用して、がんの治療に使用される新規の化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん治療は、標的手法（ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ）の段階に入った。そのような手法の１つは、免疫系を使用して悪性細胞を認識し、排除することである。合成ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ ＤＮＡ）は、組織化された強力な腫瘍特異的免疫応答を刺激する能力を有する作用物質の比較的新しいクラスである（Ｋｒｉｅｇ，Ａ Ｍ．、１９９６およびＫｒｉｅｇ，Ａ Ｍら、１９９９）。
【０００３】
最近の研究によって、ＣｐＧ ＤＮＡ配列について少なくとも３つのクラスが存在し、それぞれが異なる物理的特性と生物学的作用を有することが明らかにされている。がんのいくつかの動物モデルにおける予備研究により、ＣｐＧ ＤＮＡには、がんの免疫療法において多くの用途があり得ることが示唆されている。ＣｐＧ ＤＮＡには、先天性免疫を活性化させること、抗体依存性細胞傷害性を増強すること、および特異的防御免疫反応を誘発する強力なワクチンアジュバントとして作用することによって腫瘍の退行を誘導する能力がある。初期の臨床試験ではＣｐＧ ＤＮＡをヒトに安全に投与できることが示され、これらの作用物質ががんの免疫療法においてどのように役割を果たし得るかを理解するための研究が進められいる（Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ Ｅら、２００３）。
【０００４】
先の特許（米国特許第６，４９８，１４７号）には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが示されており、インビトロでの腫瘍細胞のアンチセンス阻害、ならびに同系Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるインビボでの腫瘍増殖のアンチセンス阻害を示す動物実験が開示されている。これらのマウスは、４０ｍｇ／ｇのセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの腹腔内注射によって治療された。組織学的分析は、局所的な腫瘍壊死、それに続いて広範囲に及ぶ分節状壊死を示した。
【０００５】
Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、西欧諸国において最も一般的な白血病である。Ｂ−ＣＬＬは白血球および骨髄のがんであり、血液細胞、特に、Ｂリンパ球の無制限増幅および／または細胞死（アポトーシス）の低減を特徴とし、成人の白血病の最も一般的な形態である。その罹患率は、７０歳以上でおよそ１０万人に５０人である。白血病は、通常、数年、さらには数十年の長引く自然経過をたどるが、最終的に、複数の細胞が連続して遺伝子欠損を獲得すると急速に進行する。欠損Ｂ−ＣＬＬ細胞とその環境の相互関係が変化した結果である可能性が高い、異常に長い寿命が原因となり、モノクローナルＢ−ＣＬＬ細胞が絶えず蓄積する点で、Ｂ−ＣＬＬは多くの他の悪性腫瘍と異なる。サイトカインが、細胞恒常性および細胞間でのダイアログ（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ｄｉａｌｏｇｕｅ）における必須要素であり、この環境において決定的に重要であると提起されている（Ｃａｌｉｇａｒｉｓ−Ｃａｐｐｉｏら、１９９９およびＲｏｚｍａｎら、１９９５）。
【０００６】
Ｂ−ＣＬＬについての共通の最初の形質転換事象は明らかにされていない。染色体の転座は、遺伝子再構成プロセスの間に主に起こると考えられており、他のリンパ性悪性疾患においても共通しているが、Ｂ−ＣＬＬにおいては稀である。核型異常は、この疾患の経過の間に頻度と回数が増える傾向にある。転座が見られる場合、これらは、融合遺伝子の形成または腫瘍遺伝子の過剰発現よりもむしろ遺伝子欠失を生じる傾向がある。Ｂ−ＣＬＬにおいて最も一般的な遺伝的異常は、１３ｑ欠失（症例のうちの５０％）、１３ｑ４欠失（緩慢な経過と関係がある）、１２トリソミー（１２ｑ１３−１５、ｐ５３を抑制するＭＤＭＱ腫瘍タンパク質の過剰発現を伴う、症例のうちの２５％）、１１ｇ２２−ｑ２３欠失（ＡＴＭの欠失、症例のうちの１０％）、および１７ｐ欠失（ｐ５３の欠失）（これはアポトーシスに対する耐性を引き起こし、多くの場合、がんは難治性となる）である（Ｇａｉｄａｎら、１９９１およびＤｏｈｎｅｒら、１９９９）。
【０００７】
Ｂ−ＣＬＬ細胞は、他の状況で活性化状態を示す、ＣＤ２３（ＩｇＥについての低親和性受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα鎖）、およびＣＤ２７（共刺激分子）などの表面分子を発現する。いくつかのタンパク質の発現と会合は、アポトーシスのプロセスを厳密に調節する。これらのタンパク質の相対的平衡により、細胞の寿命が制御される。このシステムに関与している遺伝子としては、ＢＣＬ−２ファミリー、腫瘍壊死因子受容体、ならびに、Ｍｙｃおよびｐ５３などの遺伝子が挙げられる（Ｏｓｏｒｉｏら、１９９９）。これらの遺伝子によって促進される死経路は全て、カスパーゼのプロテアーゼファミリーによって提示される、共通する「破壊」カスケードを有するとみられる。Ｂ−ＣＬＬ細胞は、ＢＣＬ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバー（ｂａｄ−２、ｂｃｌ−ｎ、ｂａｘ）の産物を一貫して高レベル発現するが、Ｂｃｌ−２機能の阻害剤であるＢｃｌ−６は著しく減少する。Ｂｃｌ−２の過剰発現に関与している機構は、現在のところ明らかになっていない。Ｂ−ＣＬＬの白血球細胞は、Ｆａｓについては陰性であるか、または弱陽性である。これらは一般的に、刺激によって誘導されたＦａｓの発現の後でもなお、抗Ｆａｓ抗体を介した死に対して依然耐性がある。珍しい高感度の場合、細胞死は、まだ特性化されていない機構によるＢｃｌ−２の発現と無関係に起こる。Ｂｃｌ−２の過剰発現およびＦａｓ経路は、Ｂ−ＣＬＬの病態生理学と関係がある機構であるが、必ずしも重要な原因となる事象ではないとみられる。サイトカインを含む媒介因子は、最初の病因因子をアポトーシスの最終経路と関連付けていると思われる。
【０００８】
ほとんどのＢ−ＣＬＬ細胞は細胞周期のＧ０期にあり、正常なリンパ球の増殖を誘導する、コンカナバリン−Ａ、ホルボールエステル、または受容体の架橋などの従来の方法によって増殖期に入るように誘導することはできない。ごく一部の細胞だけが、明らかにはなっていない促進シグナルに応答してクローン集団を大きくするようである。増殖を促進するサイトカインは、インビボでこの刺激を提供し得る（Ｄａｎｃｅｓｃｏら、１９９２）。
【０００９】
Ｂ−ＣＬＬ細胞は、正常なＢ細胞のプールを消費して蓄積する。一方、Ｔ細胞の総数は、通常は増加する。骨髄Ｔ−リンパ球は、関節リウマチおよびサルコイドーシスなどの自己免疫疾患において見られるように、大部分がＣＤ４＋細胞である。末梢血において、Ｔｈ２優勢サイトカインの表現形が頻繁に存在する。ＴＣＲレパートリーの異常も報告されている。複数の報告が、Ｔ−リンパ球および間質細胞が、Ｂ−ＣＬＬ細胞の寿命を持続させることができる環境をサポートすることにおいて重要な役割を果たし得ることを示す。悪性細胞およびそれらのＴ細胞環境はいずれも、表面分子およびそれらの受容体のバニティー（ｖａｎｉｔｙ）：ＣＤ５とそのリガンドＣＤ７２、ＣＤ２７、およびＣＤ７０を発現する。これらの研究結果は、細胞の自己保存を直接生じるかまたは間接的に生じ得る（サイトカイン）相互作用の様々な可能性を開く。そのような非常に長い生存時間は、順に、遺伝子突然変異および遺伝的不安定性が蓄積する可能性を増大させ、これは、細胞周期チェックポイントの異常調節および細胞傷害性療法に対する耐性によって疾患の進行に有利なように働く（Ｋｌｅｉｎら、２０００）。
【００１０】
Ｂ−ＣＬＬ細胞とその環境の共生的相互作用は、ほぼ確実にサイトカインの分泌によって媒介され、接着分子によって調節される。Ｂ−ＣＬＬへのサイトカイン関与の研究は、この白血病における増殖および寿命の延長の媒介因子としての様々なサイトカインをサポートするかまたは反証するデータの実質的な部分を生じた。サイトカインの産生の研究により、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＴＮＦ−β、およびＴＮＦ−αについての逆転写ポリメラーゼ連鎖反応シグナルが明らかにされている（Ｐｉｓｔｏｉａら、１９９７）。これらの研究結果は、ＩＬ−４、ＩＬ−３、およびＩＬ−６について負の結果を示した他の研究と相矛盾している（Ｔａｎｇｙｅら、１９９９）。対照的に、正常なＢ−リンパ球では、ＴＧＦ−βならびにＩＬ１Ｏの分泌が示されている。これらの細胞について、構成的である他のサイトカインの産生は報告されていない。
【００１１】
がんの免疫療法は、１世紀以上にわたり研究されてきたが、この１０年間でようやく、様々な抗体ベースの産物が様々な形態のがん患者の管理に導入されたにすぎない。現在、これは臨床研究が最も盛んな領域の１つであり、８種類の治療薬がすでに腫瘍学において承認されている。腫瘍関連マーカーに対する抗体は、数十年にわたり、免疫組織学およびインビトロでの免疫測定法において医療法の一部とされており、現在、がんの検出および治療のための重要な生物学的作用物質としての理解が広まりつつある（Ｓｔｒｏｍｅら、２００７）。分子工学は、そのような抗体ベースの治療薬の可能性を証明し、それにより、頻繁に投与することができる様々な構築物、およびヒト化抗体またはヒト抗体が得られる。
【００１２】
ＣＤ２０は、一部の患者のＢ細胞が極めて低レベルでＣＤ２０抗原を発現しているＣＬＬ患者において、Ｂ細胞の表面上で様々に発現される。ＣＤ２０（ヒトＢリンパ球制限分化抗原（ｈｕｍａｎ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ））は、プレＢリンパ球および成熟Ｂリンパ球上に存在するおよそ３５ｋＤの分子量を有する、疎水性の膜貫通タンパク質である。この抗原はまた、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）においてはＢ細胞のうちの９０％を上回る細胞上でも発現されるが、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常な血漿細胞、または他の正常な組織上では見られない。ＣＤ２０は、細胞周期の開始および分化のための活性化プロセスの初期の工程（単数または複数）を調節し、おそらく、カルシウムイオンチャネルとして機能する。ＣＤ２０は、細胞表面から脱落することはなく、抗体を結合してもインターナライズしない。遊離のＣＤ２０抗原は、循環中に見られない（Ｐｅｓｃｏｖｉｔｚ、２００６）。
【００１３】
抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブは、ヒトＣＤ２０に対する、遺伝子操作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体であり（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．による、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）またはＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、これは、再発性の、または難治性の、悪性度の低い、または濾胞性の、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫およびＢ−ＣＬＬを有する患者の治療に使用される。リツキシマブは、ＣＤ２０抗原を介してこれが結合するＢ細胞への攻撃およびＢ細胞の死滅に対して体の自然防御を動員することによって作用する。作用機序についてのインビトロで研究により、リツキシマブがヒト補体に結合し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によってリンパＢ細胞株を溶解させることが明らかにされている（Ｒｅｆｆら、１９９４）。さらに、リツキシマブは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）についてのアッセイにおいて相当な活性を有する。インビボでの前臨床試験では、おそらく、補体および細胞を介したプロセスによって、リツキシマブが、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ）の末梢血、リンパ節、および骨髄からＢ細胞を枯渇させることが示されている（Ｒｅｆｆら、１９９４）。リツキシマブはＣＬＬ患者において成功例があるが、ＣＬＬ患者の分析は、Ｂ−ＣＬＬ細胞の表面上でのＣＤ２０の密度が、極めて低いレベルでＣＤ２０抗原を発現する一部の患者のＢ細胞の場合にやはり様々であることを示す。さらに、リンパ腫を治療するために、リツキシマブがＰＦ−３５１２６７６（以前は、ＣｐＧ７９０９、ＴＬＲ９活性化オリゴヌクレオチド）と組み合わせて投与された最近の臨床試験で、望ましい結果を示すことはできていない（Ｌｅｏｎａｒｄら、２００７）。
【００１４】
リツキシマブに加えて、Ｂ細胞悪性疾患についての典型的な治療は、放射線療法および化学療法剤の投与である。ＣＬＬの場合、従来の外部放射線療法が、悪性細胞を破壊するために使用される。しかし、この治療において、副作用が制限要因である。血液学的悪性疾患に広く使用されている別の治療は化学療法である。併用化学療法は、部分寛解または完全緩解に達した成功例がいくつかある。残念なことに、化学療法によって得られたこれらの寛解は長続きしない場合が多い。
【００１５】
逆に、ＣＤ２３の発現は、Ｂ−ＣＬＬにおいて一貫して高レベルで存在することが明らかにされている。ＣＤ２３白血球分化抗原は、いくつかの造血系の細胞上で発現される４５ｋＤのＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、これは、ＩｇＥについての低親和性受容体（ＦｃｙＲＩＩ）として機能する（Ｐａｔｈａｎら、２００８）。これは、Ｃ型レクチンファミリーの１つのメンバーであり、細胞外レクチン結合ドメインと膜貫通領域との間にα−へリックス・コイルドコイル・スターク（α−ｈｅｌｉｃａｌ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｓｔａｌｋ）を含む。このスターク構造は、そのリガンド（例えば、ＩｇＧ）を結合する際の、膜に結合したＣＤ２３の三量体へのオリゴマー化に寄与していると考えられる。タンパク質分解されると、膜に結合されたＣＤ２３は、いくつかの可溶性ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）分子量種（３７ｋＤ、２９ｋＤ、および１６ｋＤ）を生じる。ＩｇＥの産生の調節に関与していることに加えて、ＣＤ２３はまた、胚中心Ｂ細胞の生存を促進するとも推測されている。ＣＤ２３の発現は、正常な活性化された濾胞性Ｂ細胞中でもＢ−ＣＬＬ細胞中でも高度にアップレギュレーションされる。
【００１６】
ルミリキシマブ（Ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）は、モノクローナルキメラ抗ＣＤ２３抗体（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃによる、現在臨床試験中である）であり、これは、マカクザルの可変領域とヒトの定常領域（ＩｇＧ１、κ）とを持ち、もともとは活性化されたヒトの血液Ｂ細胞によるＩｇＥの産生を阻害するために開発されたものである。これは、現在、Ｂ−ＣＬＬ患者において使用するための第ＩＩＩ相試験中である。インビトロでの研究により、ルミリキシマブが、ミトコンドリアの死経路を介してＢ−ＣＬＬ細胞中でのカスパーゼ依存性アポトーシスを誘導することが示されている（Ｐａｔｈａｎら、２００８）。したがって、これは、リツキシマブとは異なる機序を介して腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するとみられる。
【００１７】
いくつかの他の抗体が、がんの治療について最近になって承認された。アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）またはＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｉｌｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによる抗ＣＤ５２）（Ｋｅａｔｉｎｇら、２００２）は、２００１年に、難治性ＣＬＬの治療について承認された。ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）は、結腸がん、小細胞肺がん、および乳がんの治療に使用される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂである。トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（ＲｏｃｈｅによるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、ＨＥＲ−２標的を過剰発現する転移性乳がん腫瘍に有効なヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂである（Ｓｔｒｏｍｅら、２００７）。
【００１８】
オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）およびヴェルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）も、がん（例えば、ＣＬＬ）の治療について提案されている。
【００１９】
抗体薬物（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ）をより有効にするために、腫瘍細胞の表面上にある特異的抗原標的のアップレギュレーションが役に立つ可能性がある。そのような効果を得るための１つの方法は、免疫調節オリゴヌクレオチドで細胞を刺激することであり得る。免疫刺激効果は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む合成のＤＮＡベースのオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用によって得ることができる。そのようなＣｐＧ ＯＤＮは、Ｂ細胞の増殖、サイトカインおよび免疫グロブリンの分泌、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性、ならびにＩＦＮ−γの分泌を誘導するヒト白血球およびマウス白血球に対する高い免疫刺激効果を有する。ＣｐＧ ＯＤＮはまた、樹状細胞（ＤＣ）および他の抗原提示細胞を活性化させ、それにより、共刺激分子の発現、および分泌型サイトカイン、特に、Ｔｈ１様Ｔ細胞応答の発生を促進することにおいて重要であるＴｈ１様サイトカインの発現を導く（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）。ＣｐＧ−ＯＤＮによる受容体密度の増大は、細胞に対するオリゴヌクレオチドの直接の効果に媒介され得るか、または、サイトカインの誘導に媒介され得る。抗原密度の増大、または標的受容体を発現する細胞の集団の増大により、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のいずれかを増強させることによって、腫瘍細胞をより効率よく死滅させることができる。
【００２０】
ＣｐＧモチーフだけがオリゴヌクレオチドの効力についての責任を担うわけではないとの指摘がある。このモチーフが所望される機能に必要がないとの指摘もさらに存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
がんについてのオリゴヌクレオチドベースの治療的手法を開発することに相当の労力が費やされており、これまでに時折成功例が報告されてきたにもかかわらず、改善された効力を示し、最小限しか副作用を示さないかまたは副作用を示さない新規の化合物および投与の態様が依然必要とされている。
【００２２】
抗体療法は、一般的にはコストが高く、とりわけ、効率に関して改良が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは驚くべきことに、インビボでは動物実験において、またインビトロではＣＬＬ患者および健常対象由来のＰＢＭＣを使用して確認されたように、特異的オリゴヌクレオチド配列は、皮下投与された場合に、または特に、粘膜に（例えば、経口で、肺に、鼻腔内に、直腸内に、もしくは膣内に）局所投与された場合に、様々なヒトのがんの形態に対して大きな効果を有することを見出した。
【００２４】
さらに、単独で、または他の治療と併用して大きな治療効果を示す新規の配列が開発されており、インビボでは動物実験において、またインビトロではヒト材料で試験されている。これらのオリゴヌクレオチドは、アポトーシスを誘導するために、特に、細胞表面受容体の発現を増大させるために使用される。本発明のオリゴヌクレオチドは、がんを治療するための免疫学的手法と併用することができ、特に、特異的受容体に対して特異的であるモノクローナル抗体と併用することができる。本発明の複数の実施形態は、参照により本明細書中に組み込まれる添付の特許請求の範囲で定義される。
【００２５】
本発明は、添付の図面を参照して、以下の説明、非限定的な実施例、および特許請求の範囲でさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】は、対照（ＰＢＳ）と比較した、配列番号１および配列番号２の５０μｇの物質の皮下投与後の、誘導された皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについての、経時的な腫瘍容積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図１Ｂ】は、配列番号４の５０μｇもしくは１５０μｇの物質の皮下投与後、または５０μｇの物質の鼻腔内(i.n.)投与後の、誘導された皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについての、経時的な腫瘍容積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図２Ａ】配列番号１〜４に記載される化合物での７２時間の処理後の、インビトロでのヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６に対する増殖抑制効果を示す棒グラフである。ここでは、「−」は陰性対照を示す。細胞増殖は、Ｋｉ−６７陽性細胞のフローサイトメトリーによって測定した。棒は、未処理（Ｍ）の細胞と比較した処理した細胞の相対的な増殖±ＳＥＭを示す。
【図２Ｂ】配列番号１〜４に記載される化合物での７２時間の処理後の、インビトロでのヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６におけるアポトーシスの誘導を示す棒グラフである。ここでは、「−」は陰性対照を示す。アポトーシスは、７−ＡＡＤ陽性細胞のフローサイトメトリーによって測定した。
【図２Ｃ】配列番号１、配列番号３、および配列番号４に記載される化合物での４８時間の処理後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫細胞株中のＢ細胞増殖マーカーＣＤ２０の表面発現を示す棒グラフからなる。ＣＤ２０の表面発現はフローサイトメトリーによって測定した。「−」は陰性対照を示す。棒は、未処理（Ｍ）の細胞と比較した処理した細胞の相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図２Ｄ】配列番号１、配列番号３、および配列番号４に記載される化合物での７２時間の処理後の、インビトロでのヒトバーキットリンパ腫細胞株の細胞の生存を示すグラフである。ここでは、「−」は陰性対照を示す。細胞の生存は、トリパンブルー陽性細胞を除き、処理の開始後３日間、毎日細胞をカウントすることによって測定した。線は、未処理（Ｍ）の細胞と比較した処理した細胞の相対的な細胞の生存を示す。
【図３Ａ−Ｃ】フローサイトメトリーによって測定した、実験用化合物での４８時間の処理によって、ＣＬＬ患者由来のＣＤ１９陽性Ｂ細胞上でＣＤ２０（図３Ａ）、ＣＤ２３（図３Ｂ）、およびＣＤ８０（図３Ｃ）のアップレギュレーションがどのように誘導されるかを示すグラフである。全ての化合物（配列番号１〜８）は、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの濃度で試験した。棒は、１８個の試料におけるＣＤ２０の表面発現の平均ＭＦＩ値±ＳＥＭを示す。「−」は陰性対照を示す。
【図３Ｄ】フローサイトメトリーを使用してＣＤ６９陽性／ＣＤ５６陽性細胞を染色することによって測定した、実験用化合物での４８時間の処理によって、ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣ中のＮＫ細胞の活性化がどのように誘導されるかを示すグラフである。これらの化合物は、配列番号１〜７に示される。「−」は陰性対照を示す。棒は、１８個の試料における活性化されたＮＫ細胞の平均割合（％）±ＳＥＭを示す。
【図３Ｅ】実験用化合物での７２時間の処理により、ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＳにおいてＢ細胞のアポトーシスが誘導されることを示すグラフである。全ての化合物（配列番号１〜６）は、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの濃度で試験した。アポトーシスは、ＣＤ１９陽性細胞の７−ＡＡＤでの染色によって測定し、続いて、フローサイトメトリーによって分析した。棒は、１０個の試料における誘導されたアポトーシスの平均割合（％）±ＳＥＭを示す。
【図４Ａ】未処理の細胞と比較した、上記化合物への３０分、２時間、および６時間の暴露後に２５μＭの濃度の配列番号１で処理した健常ＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ−６の産生の増大を示すグラフである。
【図４Ｂ】未処理の細胞と比較した、上記化合物への３０分、２時間、および６時間の暴露後に２５μＭの濃度の配列番号１で処理した健常ＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ−１０の産生の増大を示すグラフである。
【図４Ｃ】未処理の細胞と比較した、上記化合物への３０分、２時間、および６時間の暴露後に２５μＭの濃度の配列番号１で処理した健常ＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＰ−１０の産生の増大を示すグラフである。
【図４Ｄ】７２時間継続して処理した細胞および未処理の細胞と比較した、上記化合物への２時間、６時間、および２４時間の暴露後に０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの濃度の配列番号１で処理したＣＬＬ Ｂ細胞上でのＣＤ２０の表面発現のアップレギュレーションを示すグラフである。ＣＤ２０の発現は、フローサイトメトリーによって分析し、棒は、４人の患者の試料によるＣＤ２０の表面発現の平均割合（％）±ＳＥＭを示す。
【図４Ｅ】７２時間継続して処理した細胞および未処理の細胞と比較した、上記化合物への２時間、６時間、および２４時間の暴露後に０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの濃度の配列番号１で処理したＣＬＬ−ＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞の活性化を示すグラフである。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ６９陽性ＣＤ５６陽性細胞の割合（％）をＦＡＣＳで測定することによって分析した。棒は、４人の患者の試料による平均割合（％）±ＳＥＭを示す。
【図５Ａ−Ｅ】ヒトＣＬＬ患者由来のＢ細胞に対するインビトロでのリツキシマブの増強効率を示すグラフである。ＣＬＬ Ｂ細胞は、本発明の化合物：配列番号１（図５Ａ）、配列番号３（図５Ｂ）、配列番号４（図５Ｃ）、配列番号７（図５Ｄ）、または配列番号８（図５Ｅ）で４８時間前処理し、続いて、ＡＤＣＣを介したアポトーシスの分析のためにリツキシマブで２４時間処理した（図５Ａ〜Ｅ）。棒は、アネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）および７−ＡＡＤでのＣＤ１９陽性細胞の二重染色によって測定した、ＣＤ１９陽性ＣＬＬ細胞のアポトーシスの平均割合（％）±ＳＥＭを示す。ｎ＝１８。
【図５Ｆ】ＣＤＣに媒介される細胞死を示すグラフである。ＣＬＬ Ｂ細胞は、本発明の化合物：配列番号１（図５Ｆ）、配列番号３、配列番号４、配列番号７、または配列番号８（データは示さず）で４８時間前処理し、続いて、ＣＤＣに媒介されるアポトーシスの分析のために４時間、３０％ヒト血清を補充した培地中でリツキシマブで処理した（図５Ｆ）。棒は、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤでのＣＤ１９陽性細胞の二重染色によって測定した、ＣＤ１９陽性ＣＬＬ細胞のアポトーシスの平均割合（％）±ＳＥＭを示す。ｎ＝１８。
【図５Ｇ】投与順序の重要性を示すグラフである。ここでは、図５Ａは、リツキシマブの投与前に配列番号１によってＣＤ２０の発現を増大させた場合のアポトーシスの平均割合（％）±ＳＥＭを示し、図５Ｇは、配列番号１の４８時間前にリツキシマブを添加した場合の対応する結果を示す。ｎ＝１０。
【図６Ａ−Ｅ】併用療法に対して弱く反応する試料に対する、併用療法に十分に反応するＣＬＬ試料におけるサイトカインの誘導を示すグラフである。細胞上清は、配列番号１〜６での処理の４８時間後に収集し、続いて、ＩＬ−６（図６Ａ）、ＩＬ−１０（図６Ｂ）、ＩＬ−１２（図６Ｃ）、ＩＰ−１０（図６Ｄ）、およびＴＮＦ−α（図６Ｅ）の含有量についてサイトメトリービーズアレイ（ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ）（ＣＢＡ）によって分析した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明が詳細に記載される前に、記載される特定の配列、または記載される方法の工程は変わり得るので、本発明は、そのような配列および方法に限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものにすぎず、限定とは意図されないこともまた理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合は、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」にはまた、文脈上別のことが明記されていない限りは、複数の指示対象も含まれることにも留意されなければならない。したがって、例えば、「配列（ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」への言及には、２つ以上のそのような配列が含まれるなどである。
【００２８】
さらに、用語「約」は、適用できる場合は、所定の値の±２％の偏差を、好ましくは、その数値の±５％の偏差、最も好ましくは、±１０％の偏差を示すために使用される。
【００２９】
用語「がん」は、任意の悪性の腫瘍性疾患、すなわち、異常であり、かつ抑制されない細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性の増殖または腫瘍をいうように意味される。用語「がん」は、特に、本発明の記載に含まれる動物実験において説明されるように、充実性の限局性腫瘍と、限定ではないが、実施例で研究した白血病の１つの形態である慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）などの非充実性のがんの形態の両方を含むように意味される。
【００３０】
用語「免疫調節」は、哺乳動物などの脊椎動物に投与されると、生物において免疫系を刺激するかもしくは免疫系を抑制するかのいずれか、またはその両方である免疫反応をいう。本明細書中で使用される場合は、用語「哺乳動物」には、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、畜牛（ｃａｔｔｌｅ）、雌牛（ｃｏｗ）、ブタ、ウサギ、ヒト以外の霊長類、およびヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
用語「免疫調節応答」は、免疫調節オリゴヌクレオチドでチャレンジされた場合の免疫反応の変化を記載する。この変化は、多くの場合は、インターフェロンなどの特定のサイトカインの放出を通じて、ならびに、増殖などの他の生理学的パラメーターを通じて測定することができる。それと同時に、この反応は、問われている免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されたサイトカインに依存して、免疫系を刺激するように、さらには免疫系を抑制するように作用するものであり得る。
【００３２】
ヒト細胞株を使用してインビトロで行った実験は、本発明のオリゴヌクレオチドが増殖を低下させること、およびアポトーシスを誘導することの両方ができることを示す。加えて、インビボでの用量の減少（１５０μｇから５０μｇに）は、皮下投与において反応を有意に改善した。驚くべきことに、粘膜への適用（本明細書中では、鼻腔内投与の形態で試験した）は、マウスモデルにおいて、同程度に有効な投与方法をもたらした。
【００３３】
本発明者らはまた、本発明の化合物が、細胞表面マーカー（本明細書中では、細胞表面マーカーＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０によって説明される）の発現を誘発または増大させることができることも見出した。
【００３４】
したがって、本発明者らは、本発明の一実施形態として、複数の化合物および複数の方法をがんの治療に利用できるようにする。ここでは、表１に示す本発明の化合物が、アポトーシスを増大させるため、および／または細胞表面マーカーＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０の１種類または複数の発現をアップレギュレーションするために単独で、または放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法もしくは免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、もしくはこれらの任意の組合せから選択される抗腫瘍療法と併用してのいずれかで使用される。上記抗腫瘍治療が免疫療法または免疫調節療法であり、これが患者への抗体の投与を含むことが最も好ましい。
【００３５】
現在利用できる抗体の例としては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、およびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
抗腫瘍療法と併用される場合は、本発明の化合物は、抗腫瘍療法の前に、好ましくは、この療法の少なくとも約１２時間前、より好ましくは約２４時間前、最も好ましくは約４８時間前に投与されることが好ましい。免疫療法と併用される場合、特に、抗体の投与を含む療法と組み合わせる場合は、本発明の化合物は、好ましくは、患者への抗体の投与の前に、最も好ましくは、特異的抗体が標的とする細胞表面分子または細胞表面マーカーのアップレギュレーションを可能にするために、十分に前に投与される。
【００３７】
本発明は、特異的ヌクレオチド、すなわち、配列番号１〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列を利用できるようにする。表１を参照のこと。
【００３８】
【表１】
【００３９】
上記配列、配列番号１〜７は本発明者らによって設計され、配列番号４を除き、本発明者らが知る限りは、これまでには知られていない。配列番号４は、１９９３年に最初に公開された（Ｓｏｋｏｌｏｓｋｉら、１９９３）。
【００４０】
配列番号７は、ＣＧの代わりにＧＣを含む、すなわち、ＣｐＧモチーフを持たない完全にホスホロチオ化されたＩＤＸ０１５０（配列番号４）である。
【００４１】
配列番号８は陰性対照としてのみ使用され、特許請求の範囲には含まれない。
【００４２】
配列番号１〜７のいずれか１つに記載されるオリゴヌクレオチド配列は、リン酸骨格修飾を有している少なくとも１つのヌクレオチドを含み得る。上記リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエート修飾またはホスホロジチオエート修飾であることが好ましい。
【００４３】
本発明にはまた、がんを治療するための医薬品を製造するための、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用も含まれる。
【００４４】
特に、アポトーシスの誘導および／または細胞表面マーカーの発現の増大によるがんを治療するための医薬品を製造するための、配列番号１〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【００４５】
これに対応して、本発明にはまた、がんの治療において細胞表面マーカーのアップレギュレーションおよび／またはアポトーシスの誘導の少なくとも１つを達成するために有効な用量で皮下投与される医薬品を製造するための、配列番号１〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用も含まれる。上記用量は、がん治療のために、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの間である。
【００４６】
特に、配列、配列番号１、配列番号４、および配列番号６は、ＣＬＬ Ｂ細胞において示されるように、細胞表面マーカー、特に、ＣＤ２０の有望なアップレギュレーターであることが示されている。
【００４７】
上記医薬品は、皮下に、鼻腔内に、経口で、静脈内に、または粘膜に、例えば、経口で、粘膜に対して局所に、直腸内に、膣内に、吸入によってなどで投与することができる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態には、上記で定義されたような使用が含まれる。ここでは、抗腫瘍治療は、上記オリゴヌクレオチドの投与の前に、後に、または本質的に同時に投与される。この抗腫瘍治療は、放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法もしくは免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択される。
【００４９】
抗腫瘍治療は、好ましくは、患者への抗体の投与を含む療法などの、免疫療法または免疫調節療法である。抗体の投与などの免疫学的治療の場合、本発明の化合物は、抗体の投与の前に投与されることが好ましい。時間は、細胞表面マーカーの発現の所望されるアップレギュレーションが達成されるように選択され、好ましくは、抗体の投与の少なくとも約１２時間前、より好ましくは約２４時間前、最も好ましくは４８時間前である。本発明の化合物の追加用量が、細胞表面マーカーのアップレギュレーションをブーストする（ｂｏｏｓｔ）ために、抗体の投与後に投与されなければならない場合があることも考えられる。
【００５０】
配列番号１〜７のいずれか１つに記載されるオリゴヌクレオチド配列に、リン酸骨格修飾を有している少なくとも１つのヌクレオチドが含まれ得る、上記抗腫瘍治療の使用。上記リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエート修飾またはホスホロジチオエート修飾であることが好ましい。
【００５１】
結果として、本発明にはまた、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列が、その必要がある患者に投与される、がんの治療方法も含まれる。
【００５２】
上記で定義されたように、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つにおける少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸骨格修飾を含み得る。上記リン酸骨格修飾は、ホスホロチオエート修飾またはホスホロジチオエート修飾であることが好ましい。
【００５３】
本発明の治療方法の一実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、粘膜に投与される、すなわち、それが必要な患者の粘膜に局所投与される。粘膜投与としては、経口投与、肺投与、直腸投与、膣内投与、および鼻腔内投与が挙げられる。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。
【００５４】
別の実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、それが必要な患者に皮下投与される。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００５５】
本発明者らは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、および配列番号７に記載されるオリゴヌクレオチドが、がんを治療するための他の手法と併用されると相乗効果を発揮することを、インビトロでヒトの材料において確認した。したがって、本発明の一実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、特に、上記抗腫瘍治療が抗体の投与を含む場合には、抗腫瘍治療の前に、または抗腫瘍治療と本質的に同時に投与され、抗腫瘍治療の前に投与されることが最も好ましい。
【００５６】
上記で概説されたように、この抗腫瘍治療は、放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法または免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択される。
【００５７】
上記抗腫瘍治療は、好ましくは、患者への抗体の投与を含む免疫療法である。抗体の例としては、現在使用されている抗体、ならびに評価段階にある抗体、例えば、リツキシマブ、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、アルツズマブ（ａｌｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、イブリツモマブ（ＣＤ２０に対する）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、アレムツズマブ（ＣＤ５２）、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ）（ＣＤ８０）、エプラツジマブ（ｅｐｒａｔｕｚｉｍａｂ）（ＣＤ２２）、およびダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（ＣＤ２５）が挙げられる。
【００５８】
がんの抗腫瘍治療の１つの実施形態では、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載される単離されたオリゴヌクレオチド配列が、それが必要な患者に投与される。上記オリゴヌクレオチドは、それが必要な患者に対して、粘膜に、または皮下に局所投与される。
【００５９】
がんの治療の別の実施形態においては、配列番号１〜７から選択されるオリゴヌクレオチド配列が、細胞表面マーカーＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０の少なくとも１つの発現を誘発させるための有効用量で投与される。上記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはリン酸骨格修飾を有し、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。上記オリゴヌクレオチドは、抗腫瘍治療の前に、または抗腫瘍治療と本質的に同時に投与され得る。ここでは、抗腫瘍治療は、放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法または免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択される。上記抗腫瘍治療は免疫学的治療であり、これは、患者への抗体の投与の前の、または患者への抗体の投与と併用される、上記オリゴヌクレオチド配列の投与を含む。
【００６０】
本発明の上記実施形態の任意の１つにおいては、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの細胞表面分子または細胞表面マーカー、特に、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０から選択される細胞表面マーカーの発現を誘発するか、または増大させるか、またはアップレギュレーションするために有効な用量で投与される。上記オリゴヌクレオチドはリン酸骨格修飾を有し得る。
【００６１】
がんの治療のためには多数の手法があるという事実は当業者に周知である。がんのタイプ、その位置および進行状態、ならびに患者の症状に応じていくつかの療法が使用されることは、がんとの闘いに特徴的である。結果として、多くの場合に、いくつかの療法が連続して使用されるか、または併用される。外科的介入、放射線療法、および化学療法などの一部の療法が何十年にもわたり行われてきたが、他の療法が最近考えられており、多くはなおも実験的使用の段階にある。当然、新しい手法が絶えず開発されており、本発明のオリゴヌクレオチド、それらの使用および治療方法については、将来の治療との併用においても有用性が見出されるであろうと考えられる。本発明者らは、現在は、本発明のオリゴヌクレオチド、それらの使用、および治療方法が、以下のような抗腫瘍治療との併用において有用であると考えているが、それらに限定されることは望ましくない：放射線療法、ホルモン療法、外科的介入、化学療法、免疫療法もしくは免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せ。
【００６２】
抗腫瘍治療は、患者への抗体の投与を含む免疫療法または免疫調節療法であることが好ましい。
【００６３】
上記オリゴヌクレオチドは、治療有効用量で投与される。「治療有効用量」の定義は、疾患および治療の状況に応じて様々であり、「治療有効用量」は、単独で、または他の治療と併用して、患者の状態の測定できるほどの改善をもたらす用量である。
【００６４】
一実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の量で皮下投与される。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与される。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与される。
【００６５】
上記オリゴヌクレオチドは、皮下に、静脈内に、または粘膜に（例えば、経口で、鼻腔内に、直腸内に、または膣内に）、単回投与で投与され得るか、または反復投与で投与され得る。
【００６６】
本発明のヌクレオチドは、皮下投与されるか、または粘膜に局所投与され得る。用語「粘膜に局所に」には、経口投与、肺投与、直腸投与、膣内投与、および鼻腔内投与が含まれる。ヌクレオチドは、適切な水性緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）であるがこれに限定されない）などの、任意の適切な処方物において投与され得る。上記ヌクレオチドは、適切なゲルを形成するポリマー（例えば、キトサンなど）などの粘膜への接着を増大させるように設計された適切な処方物、脂溶性投与ビヒクル（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）、リポソーム、またはミセルなどのヌクレオチドの細胞による取込みを促進する処方物、または適切なゲルを形成し、かつヌクレオチドの細胞による取込みを促進する処方物において投与されることが企図される。鼻腔投与に利用できる方法およびデバイスがいくつか存在する：局所作用または全身作用のいずれかを持つ、液体処方物、粉末処方物、および噴霧処方物の単回投与または複数回投与。本発明は、鼻粘膜にヌクレオチドを投与するための特定の方法またはデバイスに限定されない。最初の動物実験により、ピペットによる単純な滴下により満足のいく効果がもたらされることが示されたが、ヒトでの使用については、信頼できる単回投与または複数回投与のためのデバイスが好ましい。
【００６７】
好ましくは、上記医薬品の投与経路は、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、粘膜投与、および腹腔内投与から選択される。好ましくは、粘膜投与は、経口投与、胃内投与、鼻腔内投与、眼内投与、直腸投与、泌尿生殖器投与、および膣内投与から選択される。
【００６８】
一実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、静脈注射または静脈内注入によって投与される。
【００６９】
別の実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、それが必要な患者に皮下投与される。
【００７０】
本発明者らはまた、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載されるオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物を利用できるようにする。上記薬学的組成物は、生理食塩水、リポソーム、界面活性剤、粘膜付着性化合物、酵素阻害剤、胆汁酸塩、吸収促進剤、シクロデキストリン、またはこれらの任意の組合せから選択される、薬理学的に適合し、かつ生理学的に許容される賦形剤または担体をさらに含むことが好ましい。
【００７１】
本発明の別の実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、例えば、適切な緩衝液に懸濁させた上記オリゴヌクレオチドを含む水性浣腸剤の形態で、直腸への滴下によって結腸の粘膜に投与される。
【００７２】
本発明の別の実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、適切な緩衝液に懸濁させた上記オリゴヌクレオチドを含むエアゾールの吸入によって、または適切な緩衝液に懸濁させた上記オリゴヌクレオチドをまた含む洗浄を行うことによって、肺または気道の粘膜に投与される。
【００７３】
本発明のさらに別の実施形態によれば、上記オリゴヌクレオチドは、適切なビヒクルに懸濁した上記オリゴヌクレオチドを含む溶液、緩衝液、ゲル、軟膏、ペーストなどの塗布によって、尿道、膣などの泌尿生殖路の粘膜に投与される。
【００７４】
鼻粘膜への塗布による効果は全身的であることが示されているが、泌尿生殖路、気道、または小腸の粘膜などの他の部位への塗布が、これらの臓器またはその付近にある腫瘍の治療にはより適していると考えられる。
【００７５】
本発明は、実験のセクションに示され、添付の図面で説明されるインビボでのデータおよびインビトロでのデータによってサポートされるように、がんの治療における有用性を見出す。
【００７６】
本発明の実施形態には多くの利点がある。今までのところは、本発明者らによって定義される用量でのオリゴヌクレオチドの投与は、顕著な副作用を誘発することはない。さらに、粘膜への投与は容易であり、早く、痛みがなく、驚くことに全身的な効果を生じる。腫瘍部位の状態に対する影響は、実験において見られる増殖の低下およびアポトーシスの誘導に関与する１つの要因であると考えられるが、これは唯一の要因ではない。この効果は、単独で、または既存の抗がん治療および将来の抗がん治療と併用して、がんとの闘うための有望な手法を提示すると考えられる。
【実施例１】
【００７７】
１．動物実験
ＲＭＡリンパ腫細胞の皮下増殖に対する効果を、同系Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスにおいて、オリゴヌクレオチドの投与後にインビボで調べた。この実験の目的は、皮下腫瘍の増殖の実験用マウスモデルにおいて様々なオリゴヌクレオチドの腫瘍増殖阻害効果を調べることであった。実験用の皮下腫瘍は、インビボでの、維持されたＲＭＡ腫瘍細胞のレシピエントＢ６マウスへの接種によって誘導することができることが知られている。
【００７８】
１．１ 試験システム
腫瘍細胞のタイプと誘導
マウスでの皮下腫瘍の誘導は、インビボで増殖させたラウシャー・ウイルス（Ｒａｕｃｈｅｒ ｖｉｒｕｓ）に誘導されたリンパ腫細胞（ＲＭＡ）の細胞懸濁液（１０3）の、動物の右脇腹への接種によって行った。
【００７９】
被験物品の処方と調製
配列番号１、配列番号２、および配列番号４は、Ｉｎｄｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎによって、「すぐに使用できる」濃度（２．５μｇ／μＬ〜１．２５μｇ／μＬ）で供給され、届けられた。これらは、使用するまで４℃で維持した。
【００８０】
１．２ 動物の材料と条件
種、株、および供給業者
使用したマウスは、ＭＴＣ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎで飼育施設（ｈｏｕｓｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）から入手した同系交配のＣ５７ＢＬ／６／Ｂｙマウスであった。
【００８１】
１．３ 実験手順／実験計画
実験手順
簡単に説明すると、この実験は、以下の操作を含んでいた：ＲＭＡ腫瘍細胞をＢ６マウスにおいて腹水腫瘍として増殖させて、インビトロでの増殖に適応させた腫瘍細胞の供給源を提供した。回復後、少量のＲＭＡ腫瘍細胞（１０3個の細胞）を、レシピエントＢ６／Ｂｙマウスの右脇腹に接種した。
【００８２】
腫瘍細胞の接種後、全てのマウスを、注射部位の触診によって１週間に２回モニターした。いずれかのマウスにおいて腫瘍増殖の最初の兆候が見られた時点で、マウスを複数のグループに分け、３回の投与（１００μｌ）を、３日間毎日試験物質の単回投与で投与した。試験物質は、動物の左脇腹に皮下投与した。マウスの１つのグループには、５０μｇ（４０μｌ）の配列番号４を鼻腔内に投与した。対照動物の１つのグループには、ビヒクルのみ（ＰＢＳ）の１００μｌの注射を投与した。
【００８３】
腫瘍の増殖速度の評価
マウスを継続してモニターし、個々のマウスを、手での触診によって追跡調査した。腫瘍が現れるとすぐに、皮下腫瘍の増殖を、キャリパーを使用して毎日測定し、がん容積（ｃａｎｃｅｒ ｍａｓｓ ｖｏｌｕｍｅ）（ｍｍ3）として表した。
【００８４】
最終手順
腫瘍を持つ動物を、その増殖している腫瘍の大きさが１５００ｍｍ3に達した時点で屠殺した。腫瘍を生じていない動物全てを、最長２ヶ月間モニターし、その時点でマウスを屠殺した。
【００８５】
１．４ 結果
試験した個々の化合物は、最長１０日の観察期間の間に、腫瘍の増殖に対して阻害効果を示した（図１Ａおよび図１Ｂ）。配列番号１および配列番号２は、この実験の設定においては、腫瘍の増殖を低下させる同等の能力を示した（図１Ａ）。
【００８６】
配列番号４もまた、腫瘍の増殖を低下させた（図１Ｂ）。驚くべきことに、低用量（５０μｇ対１５０μｇ）により、腫瘍増殖の著しい低下が生じた。同じように驚くべきことに、同じ用量（５０μｇ）を鼻腔内に投与した場合にも、同等の大幅な腫瘍増殖の低下が生じた（図１Ｂを参照のこと）。
【００８７】
２．ヒト細胞株を用いたインビトロでの実験
２種類の認められているヒト腫瘍モデル細胞株を使用した。この実験の目的は、様々なオリゴヌクレオチドについて、腫瘍細胞の増殖を阻害する能力と、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する能力を調べることであった。第２の目的は、ヒトのがんに対する効果の予測となる別の設定において、実験動物で得られた効果を実験することであった。ＣｐＧモチーフを含まない陰性対照を使用した。
【００８８】
２．１ ヒト結腸がん細胞株
ヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を、本発明のヌクレオチドである配列番号１〜４のそれぞれで、組織培養培地中で７２時間処理した。細胞の増殖と細胞死を、当業者に公知の手順にしたがって、それぞれＫｉ−６７染色および７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）染色を使用してＦＡＣＳ分析によって分析した。Ｋｉ−６７は増殖している細胞によって発現され、アポトーシス細胞は、７−ＡＡＤを使用して同定することができた。
【００８９】
２．２ ヒトリンパ腫細胞株
ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉを、本発明のヌクレオチドである配列番号１、配列番号３、および配列番号４のそれぞれで、組織培養培地中で２４時間、４８時間、および７２時間刺激した。様々な表面発現マーカーの発現を、文献に記載されているようにＦＡＣＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって分析した（例えば、Ｇｕｒｓｅｌら、２００２；Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒら、２００１；Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒら、２００５ａ；Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒら、２００５ｂを参照のこと）。
【００９０】
２．３ 結果
図２Ａで見られるように、配列番号１〜４に記載される化合物は全て、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞の増殖を低下させることができた。特に、配列番号２〜４での７２時間の処理によって、未処理の細胞と比較して腫瘍増殖の顕著な低下が達成された。
【００９１】
図２Ｂは、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する同じ化合物の能力を示す。ここでは、上記化合物、特に、配列番号２〜４は、未処理の細胞と比較して、７２時間の処理後に高い割合でアポトーシスを誘導した。配列番号１は、ＨＣＴ１１６細胞株のアポトーシスを誘導することはなかった。
【００９２】
図２Ｃに示すように、配列番号１は、４８時間の処理の後に、Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞株においてＢ細胞増殖マーカーＣＤ２０の細胞表面発現を強くアップレギュレーションした。配列番号３は、ＣＤ２０の表面発現に対して中程度の効果があり、配列番号４はＣＤ２０の表面発現に対しては効果がなかった。
【００９３】
図２Ｄは、配列番号１および配列番号３での７２時間の処理は、Ｄａｕｄｉ細胞の細胞生存の顕著な低下を生じ、一方、配列番号４はＤａｕｄｉ細胞の細胞生存には効果がなかったことを示す。
【００９４】
３．ＣＬＬ血液から単離したＰＢＭＣ中での細胞表面受容体の発現
３．１ 材料および方法
ヘパリン化末梢血は、顕著な循環器疾患を有しているＢ細胞性慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）と診断された患者（ｎ＝２０）から、インフォームドコンセント後に得た。全ての患者は、常用されている免疫表現形の基準、形態学的基準、および臨床的基準によって診断された。
【００９５】
単核細胞画分を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｅｒｏｍｅｄ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）勾配遠心分離によって単離した。これらの細胞を、すぐに、４８ウェルプレート中の容量５００μｌの完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む）中で、２×１０6細胞／ｍｌの濃度で３７℃でインキュベーションし、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの、７種類のオリゴヌクレオチド化合物のそれぞれで処理した。細胞の画分を、ＦＡＣＳによる表面抗原の発現の直接の分析のために、４種類の抗体の２つ混合物（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ８０、およびＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ５６、ＣＤ６９）それぞれで染色した。
【００９６】
４８時間のインキュベーションの後、２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレート中でスピンダウンさせ、１００μｌの２％ＦＣＳ（ＰＢＳ中）中に再懸濁し、抗体混合物の２つのセット（上記）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。次に、細胞を、純粋なＰＢＳで２回洗浄し、続いて表面抗原の発現分析のためにＦＡＣＳＡｒｒａｙバイオアナライザーを使用してＦＡＣＳによって分析した。０日目から３日後、細胞の残りをアポトーシス分析のために収集した。これらの細胞を、９６ウェルプレート中でスピンダウンさせ、上記と同様に２％ＦＣＳ中に再懸濁し、ＣＤ１９とＣＤ３の抗体混合物（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに、４℃で３０分間インキュベーションした。これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤで、それぞれ初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの分析のために、室温で１０分間染色した。これらの細胞を、上記のようにフローサイトメトリーによって分析した。
【００９７】
３．２ 結果
結果は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、および配列番号６での４８時間の処理により、ＣＬＬ患者由来のＢ細胞上でのＣＤ２０のアップレギュレーションが誘導されたこと（図３Ａ）、ならびにＣＬＬ患者由来のＢ細胞上でのＣＤ８０のアップレギュレーションが誘導されたこと（図３Ｃ）を示す。配列番号２、配列番号５、および配列番号７はＣＤ２０の発現をアップレギュレーションすることはなく（図３Ａ）、配列番号２はＣＤ８０の発現を増強させることはなかった（図３Ｃ）。
【００９８】
ＣＤ２３の発現は、全ての配列番号（１〜７）によってアップレギュレーションされたが、配列番号１、配列番号２、配列番号５、および配列番号６によってほぼ大部分がアップレギュレーションされ（図３Ｂ）、配列番号２、配列番号５、および配列番号６は、受容体を相当にアップレギュレーションした。
【００９９】
ＣＤ５６陽性細胞のＣＤ６９染色により測定したように、配列番号１〜７での４８時間の処理によってＮＫ細胞の活性化が誘導されることもまた示された（図３Ｄ）。
【０１００】
結果はまた、配列番号１および配列番号４〜６が、７２時間の処理の後に、ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣにおいてＢ細胞のアポトーシスを誘導することも示す（図３Ｅ）。配列番号２および配列番号３は、Ｂ ＣＬＬ細胞のアポトーシスを誘導することはなかった。
【０１０１】
４．パルス実験
４．１ 実験の設計
サイトカインプロフィールと表面マーカーの発現を、それぞれ、１人の健常なボランティア由来のＰＢＭＣおよび４人のＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣを使用して、いわゆるパルス実験において決定した。サイトカインプロフィールは、インビトロでの４８時間の培養後に決定し、細胞表面マーカーの染色を、７２時間後にＦＡＣＳによって行った。
【０１０２】
ＰＢＭＣを、実施例３および実施例４に記載したように調製し、培養した。次に、ＰＢＭＣを、３０分間、２時間、または６時間の予め決定した時間、配列番号２に曝し、続いて洗浄した。洗浄は以下のように行った。プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、新しい培地を添加した。遠心分離を繰り返し行い、第２の上清を新しい培地に置き換えた。次に、ＰＢＭＣを、所望される時点まで４８時間（サイトカインプロフィール）または７２時間（表面マーカーの染色）、さらに培養した。
【０１０３】
サイトカインプロフィールは、４８時間のインビトロでの培養後に決定した。健常ＰＢＭＣを、上記の時間、配列番号１に曝し、上清を、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＰ−１０の含有量について分析した。サイトカイン濃度は、ｐｇ／ｍｌとして示す。
【０１０４】
表面マーカーの染色は、７２時間のインビトロでの培養後に行った。ＣＬＬ−ＰＢＭＣを、上記の時間、配列番号１で処理し、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、およびＣＤ６９の細胞表面発現をＦＡＣＳによって分析した。
【０１０５】
４．２．結果
結果は、オリゴヌクレオチドをわずか３０分後に洗浄することによって除去した場合にもなお、顕著な長期的効果があることを示し、このことは、鼻腔内投与、またはオリゴヌクレオチドが約３０分よりも長い間留まることが期待されない他の粘膜への投与の実現可能性をサポートする。
【０１０６】
結果はまた、オリゴヌクレオチドを、２時間後、およびまた、より長い滞留時間が期待される直腸投与に相当する６時間後に洗浄することにより除去した場合にも、顕著な効果を示した。これらの結果を、サイトカイン分析については図４Ａ、Ｂ、およびＣに、表面マーカーの染色については図４Ｄおよび４Ｅに示す。
【０１０７】
この実験を、これらの結果を不死化ヒト細胞株を用いて行った実験よりもすぐれた精度を持つインビボでの設定に転換できるようにするヒトＣＬＬ−ＰＢＭＣを使用して行ったことにも留意されたい。注目すべきは、罹患患者から得たＰＢＭＣには悪性Ｂ細胞が含まれ、実験用化合物の効果が治療に関係がある標的について直接見られることである。
【０１０８】
５．実験用化合物とリツキシマブの同時投与
５．１ 材料および方法
ヘパリン化末梢血は、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の患者から、インフォームドコンセント後に得た。全ての患者は、常用されている免疫表現形の基準、形態学的基準、および臨床的基準によって診断された。
【０１０９】
単核細胞画分を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｅｒｏｍｅｄ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）勾配遠心分離によって単離した。これらの細胞を、すぐに、４８ウェルプレート中の用量５００μｌの完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む）中で、２×１０6細胞／ｍｌの濃度で３７℃でインキュベーションした。
【０１１０】
これらの細胞を、１μＭ、１０μＭ、または２５μＭの実験用化合物、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７、または配列番号８とともにインキュベーションした。４８時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、完全培地中に再懸濁した。ＡＤＣＣアッセイのために、ＣＤ２０特異的モノクローナル抗体であるリツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）を、架橋剤として使用した１０μｇのＦ（ａｂ）2ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｎｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡから入手した）とともに、５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの最終濃度になるように添加した。ＣＤＣアッセイについては、細胞を、３０％のヒト血清（ＲＰＭＩ中）中でインキュベーションし、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７、または配列番号８での４８時間の前処理後に、リツキシマブで４時間処理し、その後、フローサイトメトリーによってアポトーシスについて分析した。一部の細胞は、０日目に４８時間、リツキシマブで処理し、２日目に配列番号１を２４時間かけて添加した（逆実験（ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ））。
【０１１１】
０日目から３日後（ＡＤＣＣ）（または、ＣＤＣアッセイについては２日と４時間後）、細胞をアポトーシスの分析のために収集した。これらの細胞を、９６ウェルプレート中でスピンダウンさせ、上記と同様に２％のＦＣＳ中に再懸濁し、ＣＤ１９とＣＤ３との抗体混合物（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに４℃で３０分間インキュベーションした。これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤで、それぞれ初期アポトーシスおよび後期アポトーシスの分析のために、室温で１０分間染色した。これらの細胞を、上記のようにフローサイトメトリーによって分析した。
【０１１２】
５．２ 結果
結果は、配列番号１とのプレインキュベーションにより、ＣＬＬ患者由来のＢ細胞のリツキシマブを介したアポトーシスの効率が有意に増大したことを明らかに示す。背景に記載したように、リツキシマブがヒト補体に結合し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によってリンパＢ細胞株を溶解させることが知られている。さらに、リツキシマブは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）についてのアッセイにおいて有意な活性が示されている。これらの結果は、配列番号１とリツキシマブとの組合せにより、ＣＬＬ Ｂ細胞のアポトーシスの割合の有意な増大を生じることを示す。１０μＭの配列番号１での前処理によっては、リツキシマブのみによって達成されたアポトーシスの割合よりもほぼ２倍高いアポトーシスの割合が誘導された（図５Ａ）。配列番号３での前処理によっては、配列番号１での前処理と同程度に有効な、リツキシマブを介したアポトーシスの増強が生じた（図５Ｂ）。配列番号４または配列番号７を使用したＣＬＬ−ＰＢＭＣの前処理は、有効というほどではなかった（図５ＣおよびＤ）が、配列番号８での細胞の前処理によっては、リツキシマブに誘導される細胞死には影響はなかった（図５Ｅ）。観察されたアポトーシスの増大は、ＡＤＣＣアッセイにおいてのみ見られ（図５Ａ）、ＣＤＣアッセイにおいては効果は観察されなかった（図５Ｆ、およびデータは示さず）。
【０１１３】
さらに、これらの実験は、投与順序が重要であることを示す。図５Ａに示すように、配列番号１の事前投与によっては、Ｂ細胞のリツキシマブを介したアポトーシスが有意に増加したが、逆実験（すなわち、細胞を最初にリツキシマブで処理し、リツキシマブでの４８時間の処理後に配列番号１を添加した）によっては、リツキシマブのみで処理した細胞と比較して、アポトーシスの増加は生じなかった。図５Ｇを参照のこと。
【０１１４】
６．実験用化合物とリツキシマブとで処理した細胞のサイトカイン分析
６．１ 材料および方法
ＣＬＬ血液から単離したＰＢＭＣを、１μＭ、１０μＭ、および２５μＭの配列番号１〜６で処理した。４８時間の処理後、上清を収集し、ＣＢＡによってサイトカイン含有量を分析した。分析は、様々なＣＬＬ試料間の差異を調べるために行った。
【０１１５】
６．２ 結果
結果は、実験用化合物とリツキシマブとでの併用療法に十分反応するＣＬＬ試料が、併用療法に十分には反応しない試料と比較して、多量のＴｈ１様サイトカインを発現したことを示す。図６Ａに見られるように、併用療法に十分に反応する試料は、反応しない細胞と比較して少量しかＩＬ−６を産生しない。一方、反応性の細胞は、より多くのＩＬ−１０（図６Ｂ）、ＩＬ−１２（図６Ｃ）、ＩＰ−１０（図６Ｄ）、およびＴＮＦ−α（図６Ｅ）を産生した。Ｇ−ＣＳＦの発現には差異はなかった（データは示さず）。
【０１１６】
まとめると、本発明は、上記オリゴヌクレオチドが細胞表面受容体の調節を誘導し、それにより、慢性リンパ球性白血病を治療するために使用される抗体ベースの治療の効率の増大が導かれることを記載している。調べた化合物は、最初に、健常ＰＢＭＣにおけるサイトカイン誘導のそれらのそれぞれのパターンに基づいて選択した。驚くべきことに、ＣＬＬ細胞上で発現される表面抗原に対する効果を分析するために使用した場合には、本発明者らは、全ての化合物が全ての受容体をアップレギュレーションするわけではなく、むしろ、特定の化合物が特定の受容体をアップレギュレーションしたことを見出した。例えば、配列番号１は、細胞表面マーカーＣＤ２０およびＣＤ８０についての最も強力なアップレギュレーターであり、一方、配列番号６は、ＣＤ２３についてのもっとの強力なアップレギュレーターであった。配列番号３は、ＮＫ細胞上のＣＤ６９の強いアップレギュレーションによって示されるように、ＮＫ細胞の最も強力な活性化因子であった。配列番号１とリツキシマブとでのＣＬＬ−ＰＢＭＣの併用療法によっては、単独で使用したリツキシマブと比較して、リツキシマブを介したＡＤＣＣの有意な増加が生じた。ＣＤ２０をアップレギュレーションするそれらの様々な能力によって示されるように、様々な化合物が、リツキシマブに誘導されるＡＤＣＣを増強させる様々な能力を有していた。しかし、驚くべきことに、補体システムを介した細胞死は増加しなかった。このことは、補体システムの活性化がＡＤＣＣの活性化よりも患者にとって毒性がより強いとみなされる場合には、副作用の誘導について重要であり得る。まとめると、これらの結果は、特異的化合物を特異的抗体と併用できる場合には、本発明の化合物がＣＬＬを治療するために設計されたモノクローナル抗体療法の効力を高めることを示す。
【０１１７】
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示してきたが、これは、例示の目的のために例として行われたにすぎず、以下の添付の特許請求の範囲に関する限定を意図するものではない。特に、様々な置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に対して行われ得ることが、本発明者によって考えられる。
【０１１８】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項２】
少なくとも１つのヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項３】
がんを治療するための医薬品を製造するための、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【請求項４】
アポトーシスを誘導するための医薬品を製造するための、配列番号１〜７に記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【請求項５】
ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０から選択される細胞表面抗原の発現をアップレギュレーションするための医薬品を製造するための、配列番号１〜７に記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【請求項６】
ＣＤ２０を誘導するための医薬品を製造するための、配列番号１、配列番号４、または配列番号６に記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【請求項７】
前記医薬品が、細胞表面マーカーＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０の少なくとも１つの発現をアップレギュレーションするために有効な用量で、粘膜に局所投与されるか、または皮下投与される、請求項３、５、および６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記用量が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の間である、請求項３から７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが抗腫瘍治療の投与前に投与される、請求項３から７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗腫瘍治療が、放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法もしくは免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記抗腫瘍治療が免疫療法または免疫調節療法であり、患者への抗体の投与を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、請求項３から１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列が、それが必要な患者に投与される、がんの治療方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、それが必要な患者の粘膜に局所投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、それが必要な患者に皮下投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１〜７から選択されるオリゴヌクレオチド配列が、細胞表面マーカーＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０の少なくとも１つの発現を誘発するために有効な用量で投与される、がんの治療方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量で投与される、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、抗腫瘍治療の前に、または抗腫瘍治療と本質的に同時に投与される、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗腫瘍治療が、放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法もしくは免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗腫瘍治療が免疫学的治療であり、患者への抗体の投与を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチド配列が、抗体の投与前に患者に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項２】
少なくとも１つのヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項３】
がんを治療するための医薬品を製造するための、配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【請求項４】
アポトーシスを誘導するための医薬品を製造するための、配列番号１〜７に記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【請求項５】
ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０から選択される細胞表面抗原の発現をアップレギュレーションするための医薬品を製造するための、配列番号１〜７に記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【請求項６】
ＣＤ２０を誘導するための医薬品を製造するための、配列番号１、配列番号４、または配列番号６に記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【請求項７】
前記医薬品が、細胞表面マーカーＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０の少なくとも１つの発現をアップレギュレーションするために有効な用量で、粘膜に局所投与されるか、または皮下投与される、請求項３、５、および６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記用量が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の間である、請求項３から７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが抗腫瘍治療の投与前に投与される、請求項３から７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗腫瘍治療が、放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法もしくは免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記抗腫瘍治療が免疫療法または免疫調節療法であり、患者への抗体の投与を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、請求項３から１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
配列番号１〜３および５〜７のいずれか１つに記載の単離されたオリゴヌクレオチド配列が、それが必要な患者に投与される、がんの治療方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、それが必要な患者の粘膜に局所投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、それが必要な患者に皮下投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１〜７から選択されるオリゴヌクレオチド配列が、細胞表面マーカーＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ６９、およびＣＤ８０の少なくとも１つの発現を誘発するために有効な用量で投与される、がんの治療方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量で投与される、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、抗腫瘍治療の前に、または抗腫瘍治療と本質的に同時に投与される、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗腫瘍治療が、放射線療法、ホルモン療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、免疫療法もしくは免疫調節療法、光線力学的療法、レーザー療法、温熱療法、凍結療法、血管新生抑制剤、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗腫瘍治療が免疫学的治療であり、患者への抗体の投与を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチド配列が、抗体の投与前に患者に投与される、請求項１９に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【公表番号】特表２０１１−５２４８９９（Ｐ２０１１−５２４８９９Ａ）
【公表日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１４５４１（Ｐ２０１１−５１４５４１）
【出願日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００９／０５０７７１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５４５６５
【国際公開日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【出願人】（５０８００３０１１）インデックス・ファーマシューティカルズ・アクチエボラーグ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００９／０５０７７１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５４５６５
【国際公開日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【出願人】（５０８００３０１１）インデックス・ファーマシューティカルズ・アクチエボラーグ (12)
【Ｆターム（参考）】
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