たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いた乳清たんぱくの分離回収方法
【課題】α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくを、乳清から、熱処理を施すことなく、有効にかつ迅速に分離回収する、工業的に有用な方法を提供することを目的とする。
【解決手段】たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いた乳清たんぱくの分離回収方法を提供する。
【解決手段】たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いた乳清たんぱくの分離回収方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いて、乳清（ホエー）から乳清たんぱくを分離回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛乳には多くの有用なたんぱく質が含有されているが、これらの中でもカゼインを凝固することにより得られるチーズの生産過程で副生する、乳清（ホエー）に含まれる乳清たんぱくは、さまざまな免疫機能を発現することがあることから注目されている。しかしながら、乳清はチーズ生産過程での副生成物であり、かつそこに含まれる各種の乳清たんぱく質を有効に分離することが工業的に容易ではないことから、多くの場合は活用されることなく廃棄されている。
【０００３】
乳清たんぱくの中で主要な成分は、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリンの３種類であり、これら以外にも血清アルブミン並びに免疫グロブリンであるＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどが含まれる。α−ラクトアルブミンは腫瘍細胞を致死させる作用があり、気道上部の細菌を殺菌したり、消化管粘膜を保護することに有効である。β−ラクトグロブリンは抗原性が高く、アレルゲンとして作用するため、アレルギー発症防止のために牛乳から除去することが求められることがあるが、一方ではレチナール（ビタミンＡ）を結合し、腸管からレチナールの取り込みを促進する作用があり、また長鎖脂肪酸への結合性が高いため、単離して機能性たんぱく質としての活用が期待される。ラクトフェリンは腸管から鉄の吸収を収集し、種々の細菌の増殖を抑制する効果があり、好中球などが破壊した菌体から放出された遊離鉄と結合し、組織などの酸化を防止し、免疫担当細胞の免疫応答を調節する作用がある。
そのため、牛乳あるいはチーズ生産の副生物である乳清から乳清たんぱくを工業的に回収、分離することが求められており、多くの試みがなされている。
【０００４】
乳清からα−ラクトアルブミンを回収する方法として、特許文献１には乳清のｐＨを４．０〜７．５に調整した後、８５℃以上で熱処理を施し、β−ラクトグロブリンを会合凝集させてから限外濾過膜または精密ろ過膜により、α−ラクトアルブミンを分離回収する方法が記載されている。この方法により凝集したβ−ラクトグロブリンとα−ラクトアルブミンを分離し、α−ラクトアルブミンの含有量が高い溶液を回収する方法が開示されている。
特許文献２には乳清たんぱくを脱塩し、ｐＨと温度を調整することで乳清からα−ラクトアルブミンを凝集回収し、β−ラクトグロブリンを上清液として回収する方法が開示されている。
特許文献３では、乳清をｐＨ４〜６に調整した後に、アニオン交換樹脂に接触させることにより、β−ラクトグロブリンを乳清から除去する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−２３６８８３号公報
【特許文献２】特開平７−１２３９２７号公報
【特許文献３】特許第２６５２２６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１に開示された方法では、熱処理を用いるためにたんぱく質の変性が生じる可能性があり、またβ−ラクトグロブリンの少量の混入を防ぐことは困難である。また、回収された溶液中のα−ラクトアルブミンの濃度は原液の乳清と同程度の０．１％程度であり、高濃度での回収はできない。上記特許文献２に開示された方法では、高温での熱処理を伴わないためたんぱく質の変性の可能性はないが、工程が多段に渡る事、および遠心分離工程が必要とされることから迅速かつ効率的な処理が困難であり、工業的な乳清たんぱくの分離回収用途としては応用が難しい。上記特許文献３に開示された方法では、β−ラクトグロブリンはアニオン交換樹脂に吸着されるため、高度に除去された乳清を得ることが出来るが、β−ラクトグロブリンとともに、α−ラクトアルブミンも同時に除去され、これらを分離するためには別の分離方法が必要となる。
かかる状況から本発明は、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくを、乳清から、熱処理を施すことなく、有効にかつ迅速に分離回収する、工業的に有用な方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いることにより、従来チーズ生産などの副産物として生成し、有用な成分を含有しながら、廃棄物として処理されることが多かった乳清（ホエー）から、免疫機能を有するα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくを熱処理することなく工業レベルで、効率的かつ迅速に分離回収できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
１．たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いた乳清たんぱくの分離回収方法、
２．以下の工程を含む１．に記載の乳清たんぱくの分離回収方法、
（Ａ）乳清を、アニオン交換基又はカチオン交換基を有する多孔膜に透過させることにより、乳清たんぱくの一部を該多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｂ）前記多孔膜に吸着した乳清たんぱくを、塩を含む水溶液を通液して溶出回収する工程、
（Ｃ）前記工程（Ａ）でカチオン交換基を有する多孔膜を透過した溶液又は、前記工程（Ｂ）でアニオン交換基を有する多孔膜から溶出回収した溶液を、疎水性基を有する多孔膜に透過することにより、該溶液中の乳清たんぱくの一部を該疎水性基を有する多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｄ）前記疎水性基を有する多孔膜に吸着した乳清たんぱくを、溶出回収する工程。
【０００８】
３．前記（Ａ）工程におけるアニオン交換基を有する多孔膜で吸着される乳清たんぱくが、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンであり、
前記（Ｃ）工程における疎水性基を有する多孔膜に吸着される乳清たんぱくがβ−ラクトグロブリンである、１．又は２．に記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
４．前記（Ａ）工程におけるカチオン交換基を有する多孔膜で吸着される乳清たんぱくがラクトフェリンであり、
前記（Ｃ）工程における疎水性基を有する多孔膜に吸着する乳清たんぱくがβ−ラクトグロブリンである、１．又は２．に記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
５．アニオン交換基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、１．〜３．のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
６．カチオン交換基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、１．、２．、４．のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
７．疎水性基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、１．〜４．のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の乳清たんぱくの分離回収方法を用いることにより、乳清（ホエー）から、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくを、熱処理を施すことなく工業レベルで、効率的かつ迅速に分離回収することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
本実施の形態は、たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いた乳清たんぱくの分離回収方法である。たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜はｐＨおよび塩濃度を制御することにより、たんぱく質の種類によって、選択的な吸着および非吸着の性質を有し、この特性を利用することにより、特定のたんぱく質のみを非吸着な透過成分として回収する、あるいは、特定のたんぱく質のみを吸着し、その後溶出画分として回収することにより、乳清たんぱくを分離回収することができる。
【００１１】
本実施の形態における「乳清」とはホエーとも呼ばれ、主に牛乳からカゼインを凝固してチーズを生産した際に、上澄み液として得られる副生物であるが、ヨーグルト生産時あるいはヨーグルトを静置した際に生成する上澄み液も同様に乳清であり、これらに限定されない。
本実施の形態における「乳清たんぱく」とは、乳清中に含まれるα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、血清アルブミン、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、ラクトペルオキシターゼ、リゾチーム等であり、これらの中でも特に、免疫機能を有するα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリンを分離回収の目的たんぱくとすることが好ましい、これらに限定されない。
【００１２】
本実施の形態において用いられる「たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜」とは、基材となる多孔質体及びその細孔の表面に、官能基である、アニオン交換基、カチオン交換基、疎水性基が固定されている、多孔膜である。
ｐＨ及び塩濃度などの条件を制御することにより、たんぱく質の選択的な吸着あるいは非吸着の性質を発現するものであれば、同一の多孔膜に複数の官能基が固定されていても構わない。
多孔膜の基材は、特に限定はされないが、機械的性質の保持という観点から、ポリオレフィン系重合体から構成されていることが好ましい。ポリオレフィン系重合体の例としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレンおよびフッ化ビニリデンなどのオレフィンの単独重合体、前記オレフィンの２種以上の共重合体、または１種もしくは２種以上の前記オレフィンとパーハロゲン化オレフィンとの共重合体などが挙げられる。これらの重合体の２種以上の混合物であってもよい。パーハロゲン化オレフィンの例としては、テトラフルオロエチレンおよびクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。
これらの中でも、機械的強度に特に優れ、かつ高い吸着容量が得られる素材であるという観点から、多孔膜の基材として、ポリエチレンまたはポリフッ化ビニリデンが好ましく、ポリエチレンがより好ましい。
【００１３】
多孔膜の形態は、溶液を通液することが可能な形態であれば特に限定されず、例えば、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、キャピラリー、円板または円筒状などの形態が挙げられる。これらの形態の中でも、製造のし易さ、スケールアップ性、モジュール成型した際の膜のパッキング性などの観点からは、中空糸膜が好ましい。
本実施の形態において、中空糸多孔膜とは、中空部分を有する円筒状または繊維状の多孔膜であり、中空糸の内層と外層が貫通孔である細孔によって連続しており、その細孔によって内層から外層、あるいは外層から内層に、液体または気体が透過する性質を有する多孔体を意味する。中空糸の外径および内径は、物理的に多孔膜が形状を保持することができ、かつモジュール成型可能であれば、特に限定されない。
また、基材となる多孔質体及びその細孔の表面に、グラフト鎖が固定され、さらにグラフト鎖にたんぱく質と相互作用する官能基が固定されている多孔膜を用いると、多孔膜に吸着するたんぱく質の量が増加するため、より好ましい。
【００１４】
アニオン交換基の多孔膜への固定の方法は、特に制限されないが、一般に、エポキシまたはアミンのような反応性の高い官能基を多孔膜の基材表面に導入し、その後、該官能基にアニオン交換基を有する化合物を結合させる方法によって行うことができる。
また、上記のアニオン交換基が表面に固定された多孔膜として、例えばセルロースを基材としたＳａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ及びＳａｒｔｏｂｉｎｄＤ、ポリエーテルスルホンを基材としたＰａｌｌ社製のＭｕｓｒａｎｇＱなど、市販の多孔膜も用いることができる。
カチオン交換基の多孔膜への固定の方法は、特に制限されないが、エポキシまたはアミンのような反応性の高い官能基を多孔膜の基材表面に導入し、その後該官能基にカチオン交換基を有する化合物を結合させる方法によって行うことができる。
また、上記カチオン交換基を有する多孔膜としては、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ、またはＰａｌｌ社製のＭｕｓｔａｎｇＳなど、市販の多孔膜を用いることができる。
疎水性基の多孔膜への固定の方法は、特に制限されないが、エポキシまたはアミンのような反応性の高い官能基を多孔膜の基材表面に導入し、その後、該官能基に疎水性基を有する化合物を結合させる方法によって行うことができる。
また、上記疎水性基を有する多孔膜としては、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌなど、市販の多孔膜も用いることができる。
【００１５】
官能基がグラフト鎖を介して固定されている多孔膜の製法とその性質は、特許文献及び非特許文献に多数報告されている。例えば特開平２−１３２１３２号公報及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ, ６８９(１９９５) ２１１−２１８に記載されているアニオン交換基がグラフト鎖を介して固定されている多孔膜は、多孔質体およびその細孔の表面にグラフト鎖が固定され、さらに該グラフト鎖にアニオン交換基が固定されていることを特徴とする。このような多孔膜は、アニオン交換基がグラフト鎖を介して、多孔膜表面に固定されていることで、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンの吸着量が著しく増加するため、本実施の形態における乳清たんぱくの分離回収方法に特に好ましく用いることができることを本発明者は見出した。
【００１６】
また、特開平２−１６０８４５号公報及びＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｐｒｏｇ.１９９４, １０, ７６−８１に記載されているカチオン交換基がグラフト鎖を介して固定されている多孔膜は、カチオン交換基がグラフト鎖を介して固定されている多孔膜は、多孔質体およびその細孔の表面にグラフト鎖が固定され、さらに該グラフト鎖にカチオン交換基が固定されていることを特徴とする。このような多孔膜は、カチオン交換基がグラフト鎖を介して、多孔膜表面に固定されていることで、ラクトフェリンの吸着量が著しく増加するため、本実施の形態における乳清たんぱくの分離回収方法に特に好ましく用いることができる。
加えてＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｐｒｏｇ. １９９４, １３, ８９−９５に記載されている疎水性基がグラフト鎖を介して固定されている多孔膜は、多孔質体およびその細孔の表面にグラフト鎖が固定され、さらに該グラフト鎖に疎水性基が固定されていることを特徴とする。このような多孔膜は、疎水性基がグラフト鎖を介して、多孔膜表面に固定されていることで、β−ラクトグロブリンの吸着量が著しく増加するため、本実施の形態における乳清たんぱくの分離回収方法に特に好ましく用いることができる。
【００１７】
アニオン交換基はｐＨ６．０〜８．０において、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンを吸着する性質があれば特に制限されないが、例えば、ジエチルアミノ基（ＤＥＡ、Ｅｔ２Ｎ−）、四級アンモニウム基（Ｑ、Ｒ３Ｎ＋−）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ、Ｒ３Ｎ＋−（ＣＨ２）２−）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ、Ｅｔ２Ｎ−（ＣＨ２）２−）、ジエチルアミノプロピル基（ＤＥＡＰ、Ｅｔ２Ｎ−（ＣＨ２）３−）などが挙げられる。ここで、Ｒは、特に限定されず、同一のＮに結合するＲが同一または異なっていてもよく、好適には、アルキル基、フェニル基、アラルキル基などの炭化水素基を表す。四級アンモニウム基としては、例えば、トリメチルアミノ基（トリメチルアンモニウム基、Ｍｅ３Ｎ＋−）などが挙げられる。多孔膜への化学的な固定が容易であり、高い吸着容量が得られるという観点からは、ＤＥＡおよびＱが好ましく、ＤＥＡがより好ましい。
【００１８】
カチオン交換基はｐＨ４．０〜８．０において、ラクトフェリンを吸着する性質があれば特に制限されないが、例えば、スルフォプロピル基（ＳＰ、ＳＯ２−（ＣＨ２）３−）、スルホン基（−ＳＯ３Ｈ）、カルボキシル基（ＣＯＯＨ−）などが挙げられる。
疎水性基としては０．５Ｍ〜１．０Ｍの塩を含む水溶液中のβ−ラクトグロブリンを吸着する性質があれば特に制限されないが、例えば、フェニル基、オクチル基、ブチル基などが挙げられる。
【００１９】
本実施の形態は、上記のたんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜に有用な乳清たんぱくを含む乳清を通液することで、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくを分離回収する。この際、多孔膜の官能基とたんぱく質との電荷相互作用並びに疎水性相互作用を利用して、上記たんぱく質を選択的に吸着あるいは非吸着することにより、分離回収を行うことが好ましい。このようなたんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔体としては、多孔膜以外にカラムクロマトグラフィーで用いるビーズも使用可能であるが、通液速度が速く、迅速に処理ができることから、多孔膜を用いることが望ましい。
【００２０】
電荷相互作用によりたんぱく質の選択的な吸着及び非吸着を制御する場合、そのたんぱく質の等電点（ｐＩ）により、分離回収の条件を検討する。例えばα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくの場合、それぞれのｐＩは、α−ラクトアルブミンはｐＩ＝４．９、β−ラクトグロブリンはｐＩ＝５．１、及びラクトフェリンはｐＩ＝８．２〜８．９であり、これより、ｐＨ５．０〜８．０のｐＨ範囲においては、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンはアニオン交換膜に選択的に吸着され、一方、ラクトフェリンはカチオン交換膜に選択的に吸着される。また同時に、ラクトフェリンはアニオン交換膜に選択的に非吸着で透過し、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンはカチオン交換膜に選択的に非吸着で透過する。このような電荷相互作用による選択的な吸着、非吸着の性質を利用して、ラクトフェリンのみを、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンから分離することが可能となる。
牛乳のｐＨはほぼ中性であるが、一般にカゼインを凝固しチーズを生産するには、弱酸性のｐＨ領域において行うため、チーズ生産後に副生する乳清のｐＨもこのｐＨ範囲にあり、従って電荷相互作用により乳清たんぱくを分離するためには、乳清をｐＨ５．０〜８．０の範囲に調整することが好ましい。この際、ｐＨの調整に用いるアルカリ成分は特に限定しないが、水酸化ナトリウム水溶液により調整するのが容易である。
【００２１】
ｐＩの値に差が小さい、α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンを分離するためには、電荷相互作用では達成できないため、疎水性相互作用の差を用いることが好ましい。一般に、グロブリンたんぱく質はアルブミンたんぱく質より疎水性が強く、その傾向はｐＩ近傍でより顕著となる。即ち、ｐＨが４．０〜６．０の範囲にある水溶液中に存在するβ−ラクトグロブリンはα−ラクトアルブミンより、強い疎水性を有することになり、この際水溶液の塩濃度が高いと、β−ラクトグロブリンは疎水性基に吸着することで、よりエントロピー的に自由エネルギーの低い状態になるが、α−ラクトアルブミンは水溶液中に留まることによりエンタルピー的に自由エネルギーの低い状態になることで、それぞれ安定化する。このような疎水性相互作用による選択的な吸着、非吸着の性質を利用して、α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンとを分離することが可能となる。
上記の性質は、官能基が細孔の表面に固定されている多孔膜よりも、官能基がグラフト鎖に固定され、そのグラフト鎖が細孔の表面に固定されている多孔膜の場合により顕著となり、選択的な吸着、非吸着が実現しやすい傾向がある。これは官能基が表面に固定されている前者の場合より、官能基がグラフト鎖を介して多孔膜に固定されている後者の場合の方が、たんぱく質と官能基との吸着点の数が多くなることが理由と考えられる。
【００２２】
本実施の形態において、たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜に通液する乳清の液量は、液中に含有される乳清たんぱく質の濃度と、使用する多孔膜の各乳清たんぱくに対する吸着量から適切に決定することができる。
【００２３】
本実施の形態において、アニオン交換基又はカチオン交換基を有する多孔膜と疎水性基を有する多孔膜を用いて、乳清たんぱくを分離回収する場合、
（Ａ）乳清を、アニオン交換基又はカチオン交換基を有する多孔膜に透過させることにより、乳清たんぱくの一部を該多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｂ）前記多孔膜に吸着した前記乳清たんぱくを、塩を含む水溶液を通液して溶出回収する工程、
（Ｃ）前記工程（Ａ）でカチオン交換基を有する多孔膜を透過した溶液又は、前記工程（Ｂ）でアニオン交換基を有する多孔膜から溶出回収した溶液を、疎水性基を有する多孔膜に透過することにより、該溶液中の乳清たんぱくの一部を該疎水性基を有する多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｄ）前記疎水性基を有する多孔膜に吸着した乳清たんぱくを、溶出回収する工程、
を含む工程を含むことが好ましい。
前記（Ａ）工程においてアニオン交換基を有する多孔膜を用いる場合、当該多孔膜に吸着される乳清たんぱくはα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンであり、
前記（Ｃ）工程において疎水性基を有する多孔膜を用いる場合、当該多孔膜に吸着される乳清たんぱくはβ−ラクトグロブリンである。
【００２４】
本実施の形態において、より具体的にアニオン交換基を有する多孔膜と疎水性基を有する多孔膜を用いて、乳清たんぱくを分離回収する場合、まず（ａ）乳清をアニオン交換基を有する多孔膜に通液し、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンを該多孔膜に吸着させ、ラクトフェリンが高含有量で含まれる透過液を回収する。このとき乳清は好ましくはｐＨ５．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０〜７．０に調整する。この工程（ａ）により、乳清からα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンが吸着除去され、ラクトフェリンのみが高含有量で含まれる溶液を透過液として回収することが出来る。
【００２５】
続いて（ｂ）アニオン交換基に吸着したα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンを溶出するために、高濃度の塩を含む溶液を該多孔膜に通液し、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンの混合液を溶出液として回収する。溶出に用いる塩は特に限定しないが、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウムから選ばれるいずれかの塩を用いるのが好ましく、塩化ナトリウムあるいは硫酸アンモニウムがより好ましい。また塩濃度は０．５Ｍ〜１．０Ｍが好ましく、より好ましくは０．７Ｍ〜１．０Ｍである。溶出の際の溶液のｐＨは特に限定しないが、たんぱく質の変性が生じないｐＨ４．０〜８．５が好ましく、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０である。
α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンとを分離するために続く工程（ｃ）において、（ｂ）で得られた混合溶液を、疎水性基を有する多孔膜に通液する。このとき混合溶液は、β−ラクトグロブリンの疎水性を高めるために、ｐＨ４．０〜６．０に調整する。塩濃度は工程（ｂ）の塩濃度のままで通液する。この工程（ｃ）において、β−ラクトグロブリンは多孔膜の疎水性基に吸着し、α−ラクトアルブミンが高含有量で含まれる透過液が回収される。
【００２６】
続いて、工程（ｄ）においてβ−ラクトグロブリンが吸着した疎水性基を有する多孔膜に、ｐＨ６．０〜８．５、低い塩濃度である０Ｍ〜０．３Ｍの塩を含む水溶液を通液して、β−ラクトグロブリンが高含有量で含まれる溶出画分を回収する。ここで、塩の種類は特に限定しない。
以上（ａ）から（ｄ）の工程により、アニオン交換基を有する多孔膜及び疎水性基を有する多孔膜を用いて、乳清から有用な乳清たんぱくである、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリンを、分離回収することが出来る。
【００２７】
一方、本実施の形態において、カチオン交換基を有する多孔膜と疎水性基を有する多孔膜を用いて、乳清たんぱくを分離回収する場合、まず（ａ’）乳清をカチオン交換基を有する多孔膜に通液し、ラクトフェリンを該多孔膜に吸着させ、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンが高含有量で含まれる透過液を回収する。このとき乳清は好ましくはｐＨ５．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０〜７．０に調整する。
【００２８】
続いて（ｂ’）カチオン交換基に吸着したラクトフェリンを溶出するために、高濃度の塩を含む溶液を該多孔膜に通液し、これらのたんぱくの混合液を溶出液として回収する。溶出に用いる塩は特に限定しないが、塩化ナトリウムを用いるのが好ましい。また塩濃度は０．３Ｍ〜１．０Ｍが好ましく、より好ましくは０．５Ｍ〜１．０Ｍである。溶出の際の溶液のｐＨは特に限定しないが、たんぱく質の変性が生じないｐＨ４．０〜８．５が好ましく、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０である。
α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンとを分離するために続く工程（ｃ’）において、（ａ’）で得られた混合溶液を、疎水性基を有する多孔膜に通液する。このとき混合溶液は、β−ラクトグロブリンの疎水性を高めるために、ｐＨ４．０〜６．０、０．５Ｍ〜１．０Ｍの塩を含む水溶液に調整する。用いる塩は塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウムから選ばれるいずれかの塩を用いるのが好ましく、硫酸ナトリウムあるいは硫酸アンモニウムがより好ましい。（ｃ’）において、β−ラクトグロブリンは多孔膜の疎水性基に吸着し、α−ラクトアルブミンが高含有量で含まれる透過液が回収される。
【００２９】
続いて、工程（ｄ’）においてβ−ラクトグロブリンが吸着した疎水性基を有する多孔膜に、ｐＨ６．０〜８．５、低い塩濃度である０Ｍ〜０．３Ｍの塩を含む水溶液を通液して、β−ラクトグロブリンが高含有量で含まれる溶出画分を回収する。ここで、塩の種類は特に限定しない。
以上（ａ’）から（ｄ’）の工程により、カチオン交換基を有する多孔膜及び疎水性基を有する多孔膜を用いて、乳清から有用な乳清たんぱくである、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリンを、分離回収することが出来る。
また、分離回収して得られた乳清たんぱくは、一般にクロマトグラフィーの原理を用いて、必要に応じてさらに高純度に精製することが出来る。例えば工程（ａ）により得られたラクトフェリンの回収液中には微量のリゾチームが含まれる場合があり、その除去のために、トランスフェリン回収液をｐＨ９に調整して、カチオン交換基への吸着が発現しないような条件にした上で、カチオン交換基を有する多孔膜あるいはカチオン交換クロマトグラフィーカラムに通液してリゾチームのみを吸着除去し、透過液を回収することにより、より高度に精製されたラクトフェリンを得ることが出来る。
【実施例】
【００３０】
以下、参考例、実施例に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例のみに限定されない。
【００３１】
［参考例１］ たんぱく質と相互作用する官能基がグラフト鎖を介して表面に固定された多孔膜モジュールの作成
（ｉ）中空糸多孔膜へのグラフト鎖の導入
外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、下記（ｖｉｉｉ）に記載のバブルポイント法で測定した最大細孔径が０．３μｍのポリエチレン製中空糸多孔膜を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン製中空糸多孔膜をガラス反応管に入れて、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。ここに４０℃に調整したグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）３体積部、メタノール９７体積部よりなる反応液を、中空糸多孔膜の２０質量部に注入した後、１２分間密閉状態で静置してグラフト重合反応を施し、中空糸多孔膜にグラフト鎖を導入した。なお、ＧＭＡおよびメタノールよりなる反応液は予め窒素でバブリングして、反応液内の酸素を窒素置換した。
【００３２】
グラフト重合反応後、反応管内の反応液を捨てた。次いで、反応管内にジメチルスルホキシドを入れて中空糸多孔膜を洗浄することにより、残存したグリシジルメタクリレート、そのオリゴマーおよび中空糸多孔膜に固定されなかったグラフト鎖を除去した。洗浄液を捨てた後、さらにジメチルスルホキシドを入れて２回洗浄を行った。次いでメタノールを用いて同様にして洗浄を３回行った。洗浄後の中空糸多孔膜を乾燥し、重量を測定したところ、中空糸多孔膜の重量はグラフト鎖導入前の１３８％であり、基材重量に対するグラフト鎖の重量の比として定義されるグラフト率は３８％であった。
【００３３】
（ｉｉ）アニオン交換基（３級アミノ基）のグラフト鎖への固定
乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。ジエチルアミン５０体積部、純水５０体積部の混合溶液よりなる反応液を、ガラス反応管にグラフト反応後の中空糸多孔膜に対して２０質量部を入れ、３０℃に調整した。ここにグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２１０分間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をジエチルアミノ基に置換することにより、アニオン交換基としてジエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．３ｍｍ、内径２．１ｍｍであり、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基の８０％がジエチルアミノ基によって置換されていた。
置換率Ｔはエポキシ基のモル数Ｎ０のうち、ジエチルアミノ基に置換されたモル数Ｎ１として下記式（Ｉ）を用いて算出した。
【００３４】
Ｔ＝１００×Ｎ１／Ｎ０
＝１００×｛（ｗ１−ｗ０）／Ｍ１｝／｛ｗ０（ｄｇ／（ｄｇ＋１００））／Ｍ０｝
・・・（Ｉ）
【００３５】
式（Ｉ）中、Ｍ１はジエチルアンモニウムの分子量（７３．１４）、ｗ０はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、ｗ１はジエチルアミノ基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ０はＧＭＡの分子量（１４２）である。
【００３６】
（ｉｉｉ）カチオン交換基（スルホン基）のグラフト鎖への固定
乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。亜硫酸ナトリウム１０質量部、２−プロパノール１５質量部、純水７５質量部の混合溶液よりなる反応液を、ガラス反応管にグラフト反応後の中空糸多孔膜に対して２０質量部を入れ、８０℃に調整した。ここにグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、１０分間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をスルホン基に置換することにより、カチオン交換基としてスルホン基を有する中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．３ｍｍ、内径２．１ｍｍであり、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基の３％がスルホン基によって置換されていた。
置換率Ｔはエポキシ基のモル数Ｎ０のうち、スルホン基に置換されたモル数Ｎ２として下記式（ＩＩ）を用いて算出した。
【００３７】
Ｔ＝１００×Ｎ２／Ｎ０
＝１００×｛（ｗ２−ｗ０）／Ｍ２｝／｛ｗ０（ｄｇ／（ｄｇ＋１００））／Ｍ０｝
・・・（ＩＩ）
【００３８】
式（ＩＩ）中、Ｍ２は亜硫酸ナトリウムの分子量（１０３．０５）、ｗ０はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、ｗ２はスルホン基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ０はＧＭＡの分子量（１４２）である。
【００３９】
（ｉｖ）疎水性基（フェニル基）のグラフト鎖への固定
乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。アニリン３質量部、水酸化ナトリウム０．４質量部、純水９７質量部の混合溶液よりなる反応液を、ガラス反応管にグラフト反応後の中空糸多孔膜に対して２０質量部を入れ、３０℃に調整した。ここにグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２０時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をフェニル基に置換することにより、疎水性基としてフェニル基を有する中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．３ｍｍ、内径２．１ｍｍであり、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基の７８％がフェニル基によって置換されていた。
置換率Ｔはエポキシ基のモル数Ｎ０のうち、フェニル基に置換されたモル数Ｎ３として下記式（ＩＩＩ）を用いて算出した。
【００４０】
Ｔ＝１００×Ｎ３／Ｎ０
＝１００×｛（ｗ３−ｗ０）／Ｍ３｝／｛ｗ０（ｄｇ／（ｄｇ＋１００））／Ｍ０｝
・・・（ＩＩＩ）
【００４１】
式（ＩＩＩ）中、Ｍ３はアニリンの分子量（９３．１３）、ｗ０はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、ｗ３はフェニル基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ０はＧＭＡの分子量（１４２）である。
【００４２】
（ｖ）たんぱく質と相互作用する官能基がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜モジュールの作製
（ｉｉ）〜（ｉｖ）で得られた、アニオン交換基、カチオン交換基及び疎水性基をグラフト鎖を介して固定した、それぞれの中空糸多孔膜３本ずつを束ね、中空糸多孔膜の中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をポリスルホン酸製モジュールケースに固定して、それぞれの官能基がグラフト鎖を介して固定された、３種類の中空糸多孔膜モジュールを作製した。得られたモジュールの内径は０．９ｃｍ、長さは約３．３ｃｍ、モジュールの内容積は約２ｍＬ、モジュール内に占める中空糸多孔膜の有効体積は０．８５ｍＬ、中空部分を除いた中空糸多孔膜のみの体積は０．５３ｍＬであった。これらの得られたモジュールを純水２００ｍＬを通液して洗浄し、それぞれアニオン交換膜モジュール、カチオン交換膜モジュール及び疎水性膜モジュールとして、以下の実施例等において、評価モジュールとして用いた。
【００４３】
（ｖｉ）乳清（ホエー）の作成
市販の未加工牛乳１Ｌを６５℃にて３０分間静置し殺菌した後、室温にまで冷却し、そこに攪拌しながら乳酸を加えてｐＨ５．０に調整し、攪拌を停止してそのまま６０分間静置した。牛乳中のカゼインが凝固したチーズ成分を濾紙（ワットマン製、４０）で濾すことによって取り出し、濾紙を通過した乳清をさらに０．４５μｍの精密ろ過膜（ザルトリウス製、ミニザルトプラスＳＷ１７８２９Ｋ）によって濾過することにより、清澄な乳清を得た。
（ｖｉｉ）ゲルろ過クロマトグラフィーによる乳清たんぱくの同定と定量
ＧＥヘルスケアバイオサインス社製、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００にゲルろ過カラムとして、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、Ｈｉｐｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲを取り付け、サンプル添加量１ｍＬ、バッファーとして５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０を用いて、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで通液することにより分子量分画した。
【００４４】
（ｖｉｉｉ）バブルポイント法 基材としての中空糸多孔膜の最大細孔径を、バブルポイント法を用いて測定した。長さ８ｃｍの中空糸多孔膜の一方の末端を閉塞し、他方の末端に圧力計を介して窒素ガス供給ラインを接続した。この状態で窒素ガスを供給してライン内部を窒素に置換した後、中空糸多孔膜をエタノールに浸漬した。この時、エタノールがライン内に逆流しないように極僅かに窒素で圧力をかけた状態で、中空糸多孔膜を浸漬した。中空糸多孔膜を浸漬した状態で、窒素ガスの圧力をゆっくりと増加させ、中空糸多孔膜から窒素ガスの泡が安定して出始めた圧力Ｐを記録した。これより、最大細孔径をｄ、表面張力をγとして、下記式（Ｖ）に従って、中空糸多孔膜の最大細孔径を算出した。
【００４５】
ｄ＝Ｃ１γ／Ｐ・・・（ＩＶ）
【００４６】
式（ＩＶ）中、Ｃ１は定数である。エタノールを浸漬液としたときのＣ１γ＝０．６３２（ｋｇ／ｃｍ）であり、上式にＰ（ｋｇ／ｃｍ２）を代入することにより、最大細孔径ｄ（μｍ）を求めた。
【００４７】
[実施例１]
（ｖｉ）で得られた乳清２００ｍＬをｐＨ７．５に調整した後、（ｖ）で作成したアニオン交換膜モジュールに通液し、透過液を回収した（工程（ａ））。得られた回収液を（ｖｉｉ）に従いゲルろ過クロマトグラフィーにより分析したところ、ラクトフェリンに相当する分子量８３０００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から透過液中の全たんぱく質の９３％がラクトフェリンでることが確認された。
続いてアニオン交換膜モジュールに０．７Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．０を２０ｍＬ通液し、アニオン交換膜モジュールに吸着したたんぱく質を溶出回収した（工程（ｂ））。得られた溶出液を疎水性膜モジュールに通液して透過液を回収し（工程（ｃ））、これを（ｖｉｉ）に従ってゲルろ過クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、α−ラクトアルブミンに相当する分子量１４２００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から透過液中の全たんぱく質の９５％がα−ラクトアルブミンであることが確認された。
【００４８】
次に疎水性膜モジュールに５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０を２０ｍＬ通液し、吸着したたんぱく質を溶出した（工程（ｄ））。これを（ｖｉｉ）に従ってゲルろ過クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、β−ラクトグロブリンに相当する分子量１８３００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から全たんぱく質の８９％がβ−ラクトグロブリンであることが確認された。
【００４９】
[実施例２]
（ｖｉ）で得られた乳清２００ｍＬをｐＨ７．０に調整した後、（ｖ）で作成したカチオン交換膜モジュールに通液し、透過液を回収した（工程（ａ’））。続いて、０．７Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０を２０ｍＬ通液し、カチオン交換膜モジュールに吸着したたんぱく質を溶出回収した（工程（ｂ’））。得られた回収液を（ｖｉｉ）に従いゲルろ過クロマトグラフィーにより分析したところ、ラクトフェリンに相当する分子量８３０００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から透過液中の全たんぱく質の９５％がラクトフェリンでることが確認された。
【００５０】
次に工程（ａ’）において得られたカチオン交換膜モジュールの透過回収液に硫酸アンモニウムを濃度が０．７Ｍとなるように添加し、ｐＨ５．０に調整した。これを疎水性膜モジュールに通液し、透過液を回収した（工程（ｃ’））。得られた回収液を（ｖｉｉ）に従ってゲルろ過クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、α−ラクトアルブミンに相当する分子量１４２００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から透過液中の全たんぱく質の９１％がα−ラクトアルブミンであることが確認された。
次に疎水性膜モジュールに５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０を２０ｍＬ通液し、吸着したたんぱく質を溶出した（工程（ｄ’））。これを（ｖｉｉ）に従ってゲルろ過クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、β−ラクトグロブリンに相当する分子量１８３００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から全たんぱく質の８７％がβ−ラクトグロブリンであることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のたんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜による、乳清たんぱくの分離回収方法によって、通常は廃棄されるチーズ生産後の乳清などから、有用な乳清たんぱくを効率的に、高い精度で分離回収されるという産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いて、乳清（ホエー）から乳清たんぱくを分離回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛乳には多くの有用なたんぱく質が含有されているが、これらの中でもカゼインを凝固することにより得られるチーズの生産過程で副生する、乳清（ホエー）に含まれる乳清たんぱくは、さまざまな免疫機能を発現することがあることから注目されている。しかしながら、乳清はチーズ生産過程での副生成物であり、かつそこに含まれる各種の乳清たんぱく質を有効に分離することが工業的に容易ではないことから、多くの場合は活用されることなく廃棄されている。
【０００３】
乳清たんぱくの中で主要な成分は、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリンの３種類であり、これら以外にも血清アルブミン並びに免疫グロブリンであるＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどが含まれる。α−ラクトアルブミンは腫瘍細胞を致死させる作用があり、気道上部の細菌を殺菌したり、消化管粘膜を保護することに有効である。β−ラクトグロブリンは抗原性が高く、アレルゲンとして作用するため、アレルギー発症防止のために牛乳から除去することが求められることがあるが、一方ではレチナール（ビタミンＡ）を結合し、腸管からレチナールの取り込みを促進する作用があり、また長鎖脂肪酸への結合性が高いため、単離して機能性たんぱく質としての活用が期待される。ラクトフェリンは腸管から鉄の吸収を収集し、種々の細菌の増殖を抑制する効果があり、好中球などが破壊した菌体から放出された遊離鉄と結合し、組織などの酸化を防止し、免疫担当細胞の免疫応答を調節する作用がある。
そのため、牛乳あるいはチーズ生産の副生物である乳清から乳清たんぱくを工業的に回収、分離することが求められており、多くの試みがなされている。
【０００４】
乳清からα−ラクトアルブミンを回収する方法として、特許文献１には乳清のｐＨを４．０〜７．５に調整した後、８５℃以上で熱処理を施し、β−ラクトグロブリンを会合凝集させてから限外濾過膜または精密ろ過膜により、α−ラクトアルブミンを分離回収する方法が記載されている。この方法により凝集したβ−ラクトグロブリンとα−ラクトアルブミンを分離し、α−ラクトアルブミンの含有量が高い溶液を回収する方法が開示されている。
特許文献２には乳清たんぱくを脱塩し、ｐＨと温度を調整することで乳清からα−ラクトアルブミンを凝集回収し、β−ラクトグロブリンを上清液として回収する方法が開示されている。
特許文献３では、乳清をｐＨ４〜６に調整した後に、アニオン交換樹脂に接触させることにより、β−ラクトグロブリンを乳清から除去する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−２３６８８３号公報
【特許文献２】特開平７−１２３９２７号公報
【特許文献３】特許第２６５２２６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１に開示された方法では、熱処理を用いるためにたんぱく質の変性が生じる可能性があり、またβ−ラクトグロブリンの少量の混入を防ぐことは困難である。また、回収された溶液中のα−ラクトアルブミンの濃度は原液の乳清と同程度の０．１％程度であり、高濃度での回収はできない。上記特許文献２に開示された方法では、高温での熱処理を伴わないためたんぱく質の変性の可能性はないが、工程が多段に渡る事、および遠心分離工程が必要とされることから迅速かつ効率的な処理が困難であり、工業的な乳清たんぱくの分離回収用途としては応用が難しい。上記特許文献３に開示された方法では、β−ラクトグロブリンはアニオン交換樹脂に吸着されるため、高度に除去された乳清を得ることが出来るが、β−ラクトグロブリンとともに、α−ラクトアルブミンも同時に除去され、これらを分離するためには別の分離方法が必要となる。
かかる状況から本発明は、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくを、乳清から、熱処理を施すことなく、有効にかつ迅速に分離回収する、工業的に有用な方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いることにより、従来チーズ生産などの副産物として生成し、有用な成分を含有しながら、廃棄物として処理されることが多かった乳清（ホエー）から、免疫機能を有するα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくを熱処理することなく工業レベルで、効率的かつ迅速に分離回収できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
１．たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いた乳清たんぱくの分離回収方法、
２．以下の工程を含む１．に記載の乳清たんぱくの分離回収方法、
（Ａ）乳清を、アニオン交換基又はカチオン交換基を有する多孔膜に透過させることにより、乳清たんぱくの一部を該多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｂ）前記多孔膜に吸着した乳清たんぱくを、塩を含む水溶液を通液して溶出回収する工程、
（Ｃ）前記工程（Ａ）でカチオン交換基を有する多孔膜を透過した溶液又は、前記工程（Ｂ）でアニオン交換基を有する多孔膜から溶出回収した溶液を、疎水性基を有する多孔膜に透過することにより、該溶液中の乳清たんぱくの一部を該疎水性基を有する多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｄ）前記疎水性基を有する多孔膜に吸着した乳清たんぱくを、溶出回収する工程。
【０００８】
３．前記（Ａ）工程におけるアニオン交換基を有する多孔膜で吸着される乳清たんぱくが、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンであり、
前記（Ｃ）工程における疎水性基を有する多孔膜に吸着される乳清たんぱくがβ−ラクトグロブリンである、１．又は２．に記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
４．前記（Ａ）工程におけるカチオン交換基を有する多孔膜で吸着される乳清たんぱくがラクトフェリンであり、
前記（Ｃ）工程における疎水性基を有する多孔膜に吸着する乳清たんぱくがβ−ラクトグロブリンである、１．又は２．に記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
５．アニオン交換基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、１．〜３．のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
６．カチオン交換基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、１．、２．、４．のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
７．疎水性基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、１．〜４．のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の乳清たんぱくの分離回収方法を用いることにより、乳清（ホエー）から、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくを、熱処理を施すことなく工業レベルで、効率的かつ迅速に分離回収することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
本実施の形態は、たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いた乳清たんぱくの分離回収方法である。たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜はｐＨおよび塩濃度を制御することにより、たんぱく質の種類によって、選択的な吸着および非吸着の性質を有し、この特性を利用することにより、特定のたんぱく質のみを非吸着な透過成分として回収する、あるいは、特定のたんぱく質のみを吸着し、その後溶出画分として回収することにより、乳清たんぱくを分離回収することができる。
【００１１】
本実施の形態における「乳清」とはホエーとも呼ばれ、主に牛乳からカゼインを凝固してチーズを生産した際に、上澄み液として得られる副生物であるが、ヨーグルト生産時あるいはヨーグルトを静置した際に生成する上澄み液も同様に乳清であり、これらに限定されない。
本実施の形態における「乳清たんぱく」とは、乳清中に含まれるα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、血清アルブミン、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、ラクトペルオキシターゼ、リゾチーム等であり、これらの中でも特に、免疫機能を有するα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリンを分離回収の目的たんぱくとすることが好ましい、これらに限定されない。
【００１２】
本実施の形態において用いられる「たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜」とは、基材となる多孔質体及びその細孔の表面に、官能基である、アニオン交換基、カチオン交換基、疎水性基が固定されている、多孔膜である。
ｐＨ及び塩濃度などの条件を制御することにより、たんぱく質の選択的な吸着あるいは非吸着の性質を発現するものであれば、同一の多孔膜に複数の官能基が固定されていても構わない。
多孔膜の基材は、特に限定はされないが、機械的性質の保持という観点から、ポリオレフィン系重合体から構成されていることが好ましい。ポリオレフィン系重合体の例としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレンおよびフッ化ビニリデンなどのオレフィンの単独重合体、前記オレフィンの２種以上の共重合体、または１種もしくは２種以上の前記オレフィンとパーハロゲン化オレフィンとの共重合体などが挙げられる。これらの重合体の２種以上の混合物であってもよい。パーハロゲン化オレフィンの例としては、テトラフルオロエチレンおよびクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。
これらの中でも、機械的強度に特に優れ、かつ高い吸着容量が得られる素材であるという観点から、多孔膜の基材として、ポリエチレンまたはポリフッ化ビニリデンが好ましく、ポリエチレンがより好ましい。
【００１３】
多孔膜の形態は、溶液を通液することが可能な形態であれば特に限定されず、例えば、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、キャピラリー、円板または円筒状などの形態が挙げられる。これらの形態の中でも、製造のし易さ、スケールアップ性、モジュール成型した際の膜のパッキング性などの観点からは、中空糸膜が好ましい。
本実施の形態において、中空糸多孔膜とは、中空部分を有する円筒状または繊維状の多孔膜であり、中空糸の内層と外層が貫通孔である細孔によって連続しており、その細孔によって内層から外層、あるいは外層から内層に、液体または気体が透過する性質を有する多孔体を意味する。中空糸の外径および内径は、物理的に多孔膜が形状を保持することができ、かつモジュール成型可能であれば、特に限定されない。
また、基材となる多孔質体及びその細孔の表面に、グラフト鎖が固定され、さらにグラフト鎖にたんぱく質と相互作用する官能基が固定されている多孔膜を用いると、多孔膜に吸着するたんぱく質の量が増加するため、より好ましい。
【００１４】
アニオン交換基の多孔膜への固定の方法は、特に制限されないが、一般に、エポキシまたはアミンのような反応性の高い官能基を多孔膜の基材表面に導入し、その後、該官能基にアニオン交換基を有する化合物を結合させる方法によって行うことができる。
また、上記のアニオン交換基が表面に固定された多孔膜として、例えばセルロースを基材としたＳａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ及びＳａｒｔｏｂｉｎｄＤ、ポリエーテルスルホンを基材としたＰａｌｌ社製のＭｕｓｒａｎｇＱなど、市販の多孔膜も用いることができる。
カチオン交換基の多孔膜への固定の方法は、特に制限されないが、エポキシまたはアミンのような反応性の高い官能基を多孔膜の基材表面に導入し、その後該官能基にカチオン交換基を有する化合物を結合させる方法によって行うことができる。
また、上記カチオン交換基を有する多孔膜としては、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ、またはＰａｌｌ社製のＭｕｓｔａｎｇＳなど、市販の多孔膜を用いることができる。
疎水性基の多孔膜への固定の方法は、特に制限されないが、エポキシまたはアミンのような反応性の高い官能基を多孔膜の基材表面に導入し、その後、該官能基に疎水性基を有する化合物を結合させる方法によって行うことができる。
また、上記疎水性基を有する多孔膜としては、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌなど、市販の多孔膜も用いることができる。
【００１５】
官能基がグラフト鎖を介して固定されている多孔膜の製法とその性質は、特許文献及び非特許文献に多数報告されている。例えば特開平２−１３２１３２号公報及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ, ６８９(１９９５) ２１１−２１８に記載されているアニオン交換基がグラフト鎖を介して固定されている多孔膜は、多孔質体およびその細孔の表面にグラフト鎖が固定され、さらに該グラフト鎖にアニオン交換基が固定されていることを特徴とする。このような多孔膜は、アニオン交換基がグラフト鎖を介して、多孔膜表面に固定されていることで、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンの吸着量が著しく増加するため、本実施の形態における乳清たんぱくの分離回収方法に特に好ましく用いることができることを本発明者は見出した。
【００１６】
また、特開平２−１６０８４５号公報及びＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｐｒｏｇ.１９９４, １０, ７６−８１に記載されているカチオン交換基がグラフト鎖を介して固定されている多孔膜は、カチオン交換基がグラフト鎖を介して固定されている多孔膜は、多孔質体およびその細孔の表面にグラフト鎖が固定され、さらに該グラフト鎖にカチオン交換基が固定されていることを特徴とする。このような多孔膜は、カチオン交換基がグラフト鎖を介して、多孔膜表面に固定されていることで、ラクトフェリンの吸着量が著しく増加するため、本実施の形態における乳清たんぱくの分離回収方法に特に好ましく用いることができる。
加えてＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｐｒｏｇ. １９９４, １３, ８９−９５に記載されている疎水性基がグラフト鎖を介して固定されている多孔膜は、多孔質体およびその細孔の表面にグラフト鎖が固定され、さらに該グラフト鎖に疎水性基が固定されていることを特徴とする。このような多孔膜は、疎水性基がグラフト鎖を介して、多孔膜表面に固定されていることで、β−ラクトグロブリンの吸着量が著しく増加するため、本実施の形態における乳清たんぱくの分離回収方法に特に好ましく用いることができる。
【００１７】
アニオン交換基はｐＨ６．０〜８．０において、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンを吸着する性質があれば特に制限されないが、例えば、ジエチルアミノ基（ＤＥＡ、Ｅｔ２Ｎ−）、四級アンモニウム基（Ｑ、Ｒ３Ｎ＋−）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ、Ｒ３Ｎ＋−（ＣＨ２）２−）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ、Ｅｔ２Ｎ−（ＣＨ２）２−）、ジエチルアミノプロピル基（ＤＥＡＰ、Ｅｔ２Ｎ−（ＣＨ２）３−）などが挙げられる。ここで、Ｒは、特に限定されず、同一のＮに結合するＲが同一または異なっていてもよく、好適には、アルキル基、フェニル基、アラルキル基などの炭化水素基を表す。四級アンモニウム基としては、例えば、トリメチルアミノ基（トリメチルアンモニウム基、Ｍｅ３Ｎ＋−）などが挙げられる。多孔膜への化学的な固定が容易であり、高い吸着容量が得られるという観点からは、ＤＥＡおよびＱが好ましく、ＤＥＡがより好ましい。
【００１８】
カチオン交換基はｐＨ４．０〜８．０において、ラクトフェリンを吸着する性質があれば特に制限されないが、例えば、スルフォプロピル基（ＳＰ、ＳＯ２−（ＣＨ２）３−）、スルホン基（−ＳＯ３Ｈ）、カルボキシル基（ＣＯＯＨ−）などが挙げられる。
疎水性基としては０．５Ｍ〜１．０Ｍの塩を含む水溶液中のβ−ラクトグロブリンを吸着する性質があれば特に制限されないが、例えば、フェニル基、オクチル基、ブチル基などが挙げられる。
【００１９】
本実施の形態は、上記のたんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜に有用な乳清たんぱくを含む乳清を通液することで、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくを分離回収する。この際、多孔膜の官能基とたんぱく質との電荷相互作用並びに疎水性相互作用を利用して、上記たんぱく質を選択的に吸着あるいは非吸着することにより、分離回収を行うことが好ましい。このようなたんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔体としては、多孔膜以外にカラムクロマトグラフィーで用いるビーズも使用可能であるが、通液速度が速く、迅速に処理ができることから、多孔膜を用いることが望ましい。
【００２０】
電荷相互作用によりたんぱく質の選択的な吸着及び非吸着を制御する場合、そのたんぱく質の等電点（ｐＩ）により、分離回収の条件を検討する。例えばα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリン等の乳清たんぱくの場合、それぞれのｐＩは、α−ラクトアルブミンはｐＩ＝４．９、β−ラクトグロブリンはｐＩ＝５．１、及びラクトフェリンはｐＩ＝８．２〜８．９であり、これより、ｐＨ５．０〜８．０のｐＨ範囲においては、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンはアニオン交換膜に選択的に吸着され、一方、ラクトフェリンはカチオン交換膜に選択的に吸着される。また同時に、ラクトフェリンはアニオン交換膜に選択的に非吸着で透過し、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンはカチオン交換膜に選択的に非吸着で透過する。このような電荷相互作用による選択的な吸着、非吸着の性質を利用して、ラクトフェリンのみを、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンから分離することが可能となる。
牛乳のｐＨはほぼ中性であるが、一般にカゼインを凝固しチーズを生産するには、弱酸性のｐＨ領域において行うため、チーズ生産後に副生する乳清のｐＨもこのｐＨ範囲にあり、従って電荷相互作用により乳清たんぱくを分離するためには、乳清をｐＨ５．０〜８．０の範囲に調整することが好ましい。この際、ｐＨの調整に用いるアルカリ成分は特に限定しないが、水酸化ナトリウム水溶液により調整するのが容易である。
【００２１】
ｐＩの値に差が小さい、α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンを分離するためには、電荷相互作用では達成できないため、疎水性相互作用の差を用いることが好ましい。一般に、グロブリンたんぱく質はアルブミンたんぱく質より疎水性が強く、その傾向はｐＩ近傍でより顕著となる。即ち、ｐＨが４．０〜６．０の範囲にある水溶液中に存在するβ−ラクトグロブリンはα−ラクトアルブミンより、強い疎水性を有することになり、この際水溶液の塩濃度が高いと、β−ラクトグロブリンは疎水性基に吸着することで、よりエントロピー的に自由エネルギーの低い状態になるが、α−ラクトアルブミンは水溶液中に留まることによりエンタルピー的に自由エネルギーの低い状態になることで、それぞれ安定化する。このような疎水性相互作用による選択的な吸着、非吸着の性質を利用して、α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンとを分離することが可能となる。
上記の性質は、官能基が細孔の表面に固定されている多孔膜よりも、官能基がグラフト鎖に固定され、そのグラフト鎖が細孔の表面に固定されている多孔膜の場合により顕著となり、選択的な吸着、非吸着が実現しやすい傾向がある。これは官能基が表面に固定されている前者の場合より、官能基がグラフト鎖を介して多孔膜に固定されている後者の場合の方が、たんぱく質と官能基との吸着点の数が多くなることが理由と考えられる。
【００２２】
本実施の形態において、たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜に通液する乳清の液量は、液中に含有される乳清たんぱく質の濃度と、使用する多孔膜の各乳清たんぱくに対する吸着量から適切に決定することができる。
【００２３】
本実施の形態において、アニオン交換基又はカチオン交換基を有する多孔膜と疎水性基を有する多孔膜を用いて、乳清たんぱくを分離回収する場合、
（Ａ）乳清を、アニオン交換基又はカチオン交換基を有する多孔膜に透過させることにより、乳清たんぱくの一部を該多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｂ）前記多孔膜に吸着した前記乳清たんぱくを、塩を含む水溶液を通液して溶出回収する工程、
（Ｃ）前記工程（Ａ）でカチオン交換基を有する多孔膜を透過した溶液又は、前記工程（Ｂ）でアニオン交換基を有する多孔膜から溶出回収した溶液を、疎水性基を有する多孔膜に透過することにより、該溶液中の乳清たんぱくの一部を該疎水性基を有する多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｄ）前記疎水性基を有する多孔膜に吸着した乳清たんぱくを、溶出回収する工程、
を含む工程を含むことが好ましい。
前記（Ａ）工程においてアニオン交換基を有する多孔膜を用いる場合、当該多孔膜に吸着される乳清たんぱくはα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンであり、
前記（Ｃ）工程において疎水性基を有する多孔膜を用いる場合、当該多孔膜に吸着される乳清たんぱくはβ−ラクトグロブリンである。
【００２４】
本実施の形態において、より具体的にアニオン交換基を有する多孔膜と疎水性基を有する多孔膜を用いて、乳清たんぱくを分離回収する場合、まず（ａ）乳清をアニオン交換基を有する多孔膜に通液し、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンを該多孔膜に吸着させ、ラクトフェリンが高含有量で含まれる透過液を回収する。このとき乳清は好ましくはｐＨ５．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０〜７．０に調整する。この工程（ａ）により、乳清からα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンが吸着除去され、ラクトフェリンのみが高含有量で含まれる溶液を透過液として回収することが出来る。
【００２５】
続いて（ｂ）アニオン交換基に吸着したα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンを溶出するために、高濃度の塩を含む溶液を該多孔膜に通液し、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンの混合液を溶出液として回収する。溶出に用いる塩は特に限定しないが、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウムから選ばれるいずれかの塩を用いるのが好ましく、塩化ナトリウムあるいは硫酸アンモニウムがより好ましい。また塩濃度は０．５Ｍ〜１．０Ｍが好ましく、より好ましくは０．７Ｍ〜１．０Ｍである。溶出の際の溶液のｐＨは特に限定しないが、たんぱく質の変性が生じないｐＨ４．０〜８．５が好ましく、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０である。
α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンとを分離するために続く工程（ｃ）において、（ｂ）で得られた混合溶液を、疎水性基を有する多孔膜に通液する。このとき混合溶液は、β−ラクトグロブリンの疎水性を高めるために、ｐＨ４．０〜６．０に調整する。塩濃度は工程（ｂ）の塩濃度のままで通液する。この工程（ｃ）において、β−ラクトグロブリンは多孔膜の疎水性基に吸着し、α−ラクトアルブミンが高含有量で含まれる透過液が回収される。
【００２６】
続いて、工程（ｄ）においてβ−ラクトグロブリンが吸着した疎水性基を有する多孔膜に、ｐＨ６．０〜８．５、低い塩濃度である０Ｍ〜０．３Ｍの塩を含む水溶液を通液して、β−ラクトグロブリンが高含有量で含まれる溶出画分を回収する。ここで、塩の種類は特に限定しない。
以上（ａ）から（ｄ）の工程により、アニオン交換基を有する多孔膜及び疎水性基を有する多孔膜を用いて、乳清から有用な乳清たんぱくである、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリンを、分離回収することが出来る。
【００２７】
一方、本実施の形態において、カチオン交換基を有する多孔膜と疎水性基を有する多孔膜を用いて、乳清たんぱくを分離回収する場合、まず（ａ’）乳清をカチオン交換基を有する多孔膜に通液し、ラクトフェリンを該多孔膜に吸着させ、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンが高含有量で含まれる透過液を回収する。このとき乳清は好ましくはｐＨ５．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０〜７．０に調整する。
【００２８】
続いて（ｂ’）カチオン交換基に吸着したラクトフェリンを溶出するために、高濃度の塩を含む溶液を該多孔膜に通液し、これらのたんぱくの混合液を溶出液として回収する。溶出に用いる塩は特に限定しないが、塩化ナトリウムを用いるのが好ましい。また塩濃度は０．３Ｍ〜１．０Ｍが好ましく、より好ましくは０．５Ｍ〜１．０Ｍである。溶出の際の溶液のｐＨは特に限定しないが、たんぱく質の変性が生じないｐＨ４．０〜８．５が好ましく、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０である。
α−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンとを分離するために続く工程（ｃ’）において、（ａ’）で得られた混合溶液を、疎水性基を有する多孔膜に通液する。このとき混合溶液は、β−ラクトグロブリンの疎水性を高めるために、ｐＨ４．０〜６．０、０．５Ｍ〜１．０Ｍの塩を含む水溶液に調整する。用いる塩は塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウムから選ばれるいずれかの塩を用いるのが好ましく、硫酸ナトリウムあるいは硫酸アンモニウムがより好ましい。（ｃ’）において、β−ラクトグロブリンは多孔膜の疎水性基に吸着し、α−ラクトアルブミンが高含有量で含まれる透過液が回収される。
【００２９】
続いて、工程（ｄ’）においてβ−ラクトグロブリンが吸着した疎水性基を有する多孔膜に、ｐＨ６．０〜８．５、低い塩濃度である０Ｍ〜０．３Ｍの塩を含む水溶液を通液して、β−ラクトグロブリンが高含有量で含まれる溶出画分を回収する。ここで、塩の種類は特に限定しない。
以上（ａ’）から（ｄ’）の工程により、カチオン交換基を有する多孔膜及び疎水性基を有する多孔膜を用いて、乳清から有用な乳清たんぱくである、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン及びラクトフェリンを、分離回収することが出来る。
また、分離回収して得られた乳清たんぱくは、一般にクロマトグラフィーの原理を用いて、必要に応じてさらに高純度に精製することが出来る。例えば工程（ａ）により得られたラクトフェリンの回収液中には微量のリゾチームが含まれる場合があり、その除去のために、トランスフェリン回収液をｐＨ９に調整して、カチオン交換基への吸着が発現しないような条件にした上で、カチオン交換基を有する多孔膜あるいはカチオン交換クロマトグラフィーカラムに通液してリゾチームのみを吸着除去し、透過液を回収することにより、より高度に精製されたラクトフェリンを得ることが出来る。
【実施例】
【００３０】
以下、参考例、実施例に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例のみに限定されない。
【００３１】
［参考例１］ たんぱく質と相互作用する官能基がグラフト鎖を介して表面に固定された多孔膜モジュールの作成
（ｉ）中空糸多孔膜へのグラフト鎖の導入
外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、下記（ｖｉｉｉ）に記載のバブルポイント法で測定した最大細孔径が０．３μｍのポリエチレン製中空糸多孔膜を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン製中空糸多孔膜をガラス反応管に入れて、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。ここに４０℃に調整したグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）３体積部、メタノール９７体積部よりなる反応液を、中空糸多孔膜の２０質量部に注入した後、１２分間密閉状態で静置してグラフト重合反応を施し、中空糸多孔膜にグラフト鎖を導入した。なお、ＧＭＡおよびメタノールよりなる反応液は予め窒素でバブリングして、反応液内の酸素を窒素置換した。
【００３２】
グラフト重合反応後、反応管内の反応液を捨てた。次いで、反応管内にジメチルスルホキシドを入れて中空糸多孔膜を洗浄することにより、残存したグリシジルメタクリレート、そのオリゴマーおよび中空糸多孔膜に固定されなかったグラフト鎖を除去した。洗浄液を捨てた後、さらにジメチルスルホキシドを入れて２回洗浄を行った。次いでメタノールを用いて同様にして洗浄を３回行った。洗浄後の中空糸多孔膜を乾燥し、重量を測定したところ、中空糸多孔膜の重量はグラフト鎖導入前の１３８％であり、基材重量に対するグラフト鎖の重量の比として定義されるグラフト率は３８％であった。
【００３３】
（ｉｉ）アニオン交換基（３級アミノ基）のグラフト鎖への固定
乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。ジエチルアミン５０体積部、純水５０体積部の混合溶液よりなる反応液を、ガラス反応管にグラフト反応後の中空糸多孔膜に対して２０質量部を入れ、３０℃に調整した。ここにグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２１０分間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をジエチルアミノ基に置換することにより、アニオン交換基としてジエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．３ｍｍ、内径２．１ｍｍであり、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基の８０％がジエチルアミノ基によって置換されていた。
置換率Ｔはエポキシ基のモル数Ｎ０のうち、ジエチルアミノ基に置換されたモル数Ｎ１として下記式（Ｉ）を用いて算出した。
【００３４】
Ｔ＝１００×Ｎ１／Ｎ０
＝１００×｛（ｗ１−ｗ０）／Ｍ１｝／｛ｗ０（ｄｇ／（ｄｇ＋１００））／Ｍ０｝
・・・（Ｉ）
【００３５】
式（Ｉ）中、Ｍ１はジエチルアンモニウムの分子量（７３．１４）、ｗ０はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、ｗ１はジエチルアミノ基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ０はＧＭＡの分子量（１４２）である。
【００３６】
（ｉｉｉ）カチオン交換基（スルホン基）のグラフト鎖への固定
乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。亜硫酸ナトリウム１０質量部、２−プロパノール１５質量部、純水７５質量部の混合溶液よりなる反応液を、ガラス反応管にグラフト反応後の中空糸多孔膜に対して２０質量部を入れ、８０℃に調整した。ここにグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、１０分間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をスルホン基に置換することにより、カチオン交換基としてスルホン基を有する中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．３ｍｍ、内径２．１ｍｍであり、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基の３％がスルホン基によって置換されていた。
置換率Ｔはエポキシ基のモル数Ｎ０のうち、スルホン基に置換されたモル数Ｎ２として下記式（ＩＩ）を用いて算出した。
【００３７】
Ｔ＝１００×Ｎ２／Ｎ０
＝１００×｛（ｗ２−ｗ０）／Ｍ２｝／｛ｗ０（ｄｇ／（ｄｇ＋１００））／Ｍ０｝
・・・（ＩＩ）
【００３８】
式（ＩＩ）中、Ｍ２は亜硫酸ナトリウムの分子量（１０３．０５）、ｗ０はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、ｗ２はスルホン基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ０はＧＭＡの分子量（１４２）である。
【００３９】
（ｉｖ）疎水性基（フェニル基）のグラフト鎖への固定
乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。アニリン３質量部、水酸化ナトリウム０．４質量部、純水９７質量部の混合溶液よりなる反応液を、ガラス反応管にグラフト反応後の中空糸多孔膜に対して２０質量部を入れ、３０℃に調整した。ここにグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２０時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をフェニル基に置換することにより、疎水性基としてフェニル基を有する中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．３ｍｍ、内径２．１ｍｍであり、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基の７８％がフェニル基によって置換されていた。
置換率Ｔはエポキシ基のモル数Ｎ０のうち、フェニル基に置換されたモル数Ｎ３として下記式（ＩＩＩ）を用いて算出した。
【００４０】
Ｔ＝１００×Ｎ３／Ｎ０
＝１００×｛（ｗ３−ｗ０）／Ｍ３｝／｛ｗ０（ｄｇ／（ｄｇ＋１００））／Ｍ０｝
・・・（ＩＩＩ）
【００４１】
式（ＩＩＩ）中、Ｍ３はアニリンの分子量（９３．１３）、ｗ０はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、ｗ３はフェニル基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ０はＧＭＡの分子量（１４２）である。
【００４２】
（ｖ）たんぱく質と相互作用する官能基がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜モジュールの作製
（ｉｉ）〜（ｉｖ）で得られた、アニオン交換基、カチオン交換基及び疎水性基をグラフト鎖を介して固定した、それぞれの中空糸多孔膜３本ずつを束ね、中空糸多孔膜の中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をポリスルホン酸製モジュールケースに固定して、それぞれの官能基がグラフト鎖を介して固定された、３種類の中空糸多孔膜モジュールを作製した。得られたモジュールの内径は０．９ｃｍ、長さは約３．３ｃｍ、モジュールの内容積は約２ｍＬ、モジュール内に占める中空糸多孔膜の有効体積は０．８５ｍＬ、中空部分を除いた中空糸多孔膜のみの体積は０．５３ｍＬであった。これらの得られたモジュールを純水２００ｍＬを通液して洗浄し、それぞれアニオン交換膜モジュール、カチオン交換膜モジュール及び疎水性膜モジュールとして、以下の実施例等において、評価モジュールとして用いた。
【００４３】
（ｖｉ）乳清（ホエー）の作成
市販の未加工牛乳１Ｌを６５℃にて３０分間静置し殺菌した後、室温にまで冷却し、そこに攪拌しながら乳酸を加えてｐＨ５．０に調整し、攪拌を停止してそのまま６０分間静置した。牛乳中のカゼインが凝固したチーズ成分を濾紙（ワットマン製、４０）で濾すことによって取り出し、濾紙を通過した乳清をさらに０．４５μｍの精密ろ過膜（ザルトリウス製、ミニザルトプラスＳＷ１７８２９Ｋ）によって濾過することにより、清澄な乳清を得た。
（ｖｉｉ）ゲルろ過クロマトグラフィーによる乳清たんぱくの同定と定量
ＧＥヘルスケアバイオサインス社製、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００にゲルろ過カラムとして、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、Ｈｉｐｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲを取り付け、サンプル添加量１ｍＬ、バッファーとして５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０を用いて、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで通液することにより分子量分画した。
【００４４】
（ｖｉｉｉ）バブルポイント法 基材としての中空糸多孔膜の最大細孔径を、バブルポイント法を用いて測定した。長さ８ｃｍの中空糸多孔膜の一方の末端を閉塞し、他方の末端に圧力計を介して窒素ガス供給ラインを接続した。この状態で窒素ガスを供給してライン内部を窒素に置換した後、中空糸多孔膜をエタノールに浸漬した。この時、エタノールがライン内に逆流しないように極僅かに窒素で圧力をかけた状態で、中空糸多孔膜を浸漬した。中空糸多孔膜を浸漬した状態で、窒素ガスの圧力をゆっくりと増加させ、中空糸多孔膜から窒素ガスの泡が安定して出始めた圧力Ｐを記録した。これより、最大細孔径をｄ、表面張力をγとして、下記式（Ｖ）に従って、中空糸多孔膜の最大細孔径を算出した。
【００４５】
ｄ＝Ｃ１γ／Ｐ・・・（ＩＶ）
【００４６】
式（ＩＶ）中、Ｃ１は定数である。エタノールを浸漬液としたときのＣ１γ＝０．６３２（ｋｇ／ｃｍ）であり、上式にＰ（ｋｇ／ｃｍ２）を代入することにより、最大細孔径ｄ（μｍ）を求めた。
【００４７】
[実施例１]
（ｖｉ）で得られた乳清２００ｍＬをｐＨ７．５に調整した後、（ｖ）で作成したアニオン交換膜モジュールに通液し、透過液を回収した（工程（ａ））。得られた回収液を（ｖｉｉ）に従いゲルろ過クロマトグラフィーにより分析したところ、ラクトフェリンに相当する分子量８３０００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から透過液中の全たんぱく質の９３％がラクトフェリンでることが確認された。
続いてアニオン交換膜モジュールに０．７Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．０を２０ｍＬ通液し、アニオン交換膜モジュールに吸着したたんぱく質を溶出回収した（工程（ｂ））。得られた溶出液を疎水性膜モジュールに通液して透過液を回収し（工程（ｃ））、これを（ｖｉｉ）に従ってゲルろ過クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、α−ラクトアルブミンに相当する分子量１４２００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から透過液中の全たんぱく質の９５％がα−ラクトアルブミンであることが確認された。
【００４８】
次に疎水性膜モジュールに５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０を２０ｍＬ通液し、吸着したたんぱく質を溶出した（工程（ｄ））。これを（ｖｉｉ）に従ってゲルろ過クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、β−ラクトグロブリンに相当する分子量１８３００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から全たんぱく質の８９％がβ−ラクトグロブリンであることが確認された。
【００４９】
[実施例２]
（ｖｉ）で得られた乳清２００ｍＬをｐＨ７．０に調整した後、（ｖ）で作成したカチオン交換膜モジュールに通液し、透過液を回収した（工程（ａ’））。続いて、０．７Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０を２０ｍＬ通液し、カチオン交換膜モジュールに吸着したたんぱく質を溶出回収した（工程（ｂ’））。得られた回収液を（ｖｉｉ）に従いゲルろ過クロマトグラフィーにより分析したところ、ラクトフェリンに相当する分子量８３０００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から透過液中の全たんぱく質の９５％がラクトフェリンでることが確認された。
【００５０】
次に工程（ａ’）において得られたカチオン交換膜モジュールの透過回収液に硫酸アンモニウムを濃度が０．７Ｍとなるように添加し、ｐＨ５．０に調整した。これを疎水性膜モジュールに通液し、透過液を回収した（工程（ｃ’））。得られた回収液を（ｖｉｉ）に従ってゲルろ過クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、α−ラクトアルブミンに相当する分子量１４２００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から透過液中の全たんぱく質の９１％がα−ラクトアルブミンであることが確認された。
次に疎水性膜モジュールに５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０を２０ｍＬ通液し、吸着したたんぱく質を溶出した（工程（ｄ’））。これを（ｖｉｉ）に従ってゲルろ過クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、β−ラクトグロブリンに相当する分子量１８３００の位置に最も強いピークが現れ、ピーク面積から全たんぱく質の８７％がβ−ラクトグロブリンであることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のたんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜による、乳清たんぱくの分離回収方法によって、通常は廃棄されるチーズ生産後の乳清などから、有用な乳清たんぱくを効率的に、高い精度で分離回収されるという産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いた乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項２】
以下の工程を含む請求項１に記載の乳清たんぱくの分離回収方法、
（Ａ）乳清を、アニオン交換基又はカチオン交換基を有する多孔膜に透過させることにより、乳清たんぱくの一部を該多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｂ）前記多孔膜に吸着した乳清たんぱくを、塩を含む水溶液を通液して溶出回収する工程、
（Ｃ）前記工程（Ａ）でカチオン交換基を有する多孔膜を透過した溶液又は、前記工程（Ｂ）でアニオン交換基を有する多孔膜から溶出回収した溶液を、疎水性基を有する多孔膜に透過することにより、該溶液中の乳清たんぱくの一部を該疎水性基を有する多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｄ）前記疎水性基を有する多孔膜に吸着した乳清たんぱくを、溶出回収する工程。
【請求項３】
前記（Ａ）工程におけるアニオン交換基を有する多孔膜で吸着される乳清たんぱくが、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンであり、
前記（Ｃ）工程における疎水性基を有する多孔膜に吸着される乳清たんぱくがβ−ラクトグロブリンである、請求項１又は２に記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項４】
前記（Ａ）工程におけるカチオン交換基を有する多孔膜で吸着される乳清たんぱくがラクトフェリンであり、
前記（Ｃ）工程における疎水性基を有する多孔膜に吸着する乳清たんぱくがβ−ラクトグロブリンである、請求項１又は２に記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項５】
アニオン交換基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、請求項１〜３のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項６】
カチオン交換基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、請求項１、２、４のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項７】
疎水性基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、請求項１〜４のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項１】
たんぱく質と相互作用する官能基を有する多孔膜を用いた乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項２】
以下の工程を含む請求項１に記載の乳清たんぱくの分離回収方法、
（Ａ）乳清を、アニオン交換基又はカチオン交換基を有する多孔膜に透過させることにより、乳清たんぱくの一部を該多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｂ）前記多孔膜に吸着した乳清たんぱくを、塩を含む水溶液を通液して溶出回収する工程、
（Ｃ）前記工程（Ａ）でカチオン交換基を有する多孔膜を透過した溶液又は、前記工程（Ｂ）でアニオン交換基を有する多孔膜から溶出回収した溶液を、疎水性基を有する多孔膜に透過することにより、該溶液中の乳清たんぱくの一部を該疎水性基を有する多孔膜に吸着させ、透過液を回収する工程、
（Ｄ）前記疎水性基を有する多孔膜に吸着した乳清たんぱくを、溶出回収する工程。
【請求項３】
前記（Ａ）工程におけるアニオン交換基を有する多孔膜で吸着される乳清たんぱくが、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンであり、
前記（Ｃ）工程における疎水性基を有する多孔膜に吸着される乳清たんぱくがβ−ラクトグロブリンである、請求項１又は２に記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項４】
前記（Ａ）工程におけるカチオン交換基を有する多孔膜で吸着される乳清たんぱくがラクトフェリンであり、
前記（Ｃ）工程における疎水性基を有する多孔膜に吸着する乳清たんぱくがβ−ラクトグロブリンである、請求項１又は２に記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項５】
アニオン交換基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、請求項１〜３のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項６】
カチオン交換基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、請求項１、２、４のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【請求項７】
疎水性基がグラフト鎖を介して表面に固定されている多孔膜を用いた、請求項１〜４のいずれかに記載の乳清たんぱくの分離回収方法。
【公開番号】特開２０１０−１９３８３３（Ｐ２０１０−１９３８３３Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４４６４６（Ｐ２００９−４４６４６）
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
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