アカパンカビ由来のγ−ブチロベタインヒドロキシラーゼ
本発明は、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ（γ−ＢＢＨ）をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、該組み換えベクターで形質転換された形質転換体、該ポリヌクレオチドによりコードされるγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ、及びγ-ブチロベタインを、該ポリヌクレオチドによりコードされるγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼでヒドロキシル化して、Ｌ−カルニチンを製造する方法に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ（γ−ＢＢＨ）に関するものである。より具体的には、本発明は、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、該組み換えベクターで形質転換された形質転換体、該ポリヌクレオチドによりコードされるγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ、及びγ-ブチロベタインを、該ポリヌクレオチドによりコードされるγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼでヒドロキシル化して、Ｌ−カルニチンを製造する方法に関するものである。
【０００２】
〔背景技術〕
ビタミンＢＴと呼ばれているＬ−カルニチン（３−ヒドロキシ−４−トリメチルアミノ酪酸）は、１９０５年、最初に、ロシアの科学者であるＧｕｌｅｗｉｔｓｃｈとＫｒｉｍｂｅｒｇによりウシの筋肉組織から分離され、その化学構造が１９３２年に確認された、人体代謝において極めて重要な天然のビタミン様物質である。Ｌ−カルニチンは、通常、生体内に存在し、ミトコンドリアの内膜を通過して、活性長鎖遊離脂肪酸の運搬体としての役割を行うようになる。ミトコンドリアの内膜は、アシル−ＣｏＡ誘導体に対しては不透過性であるため、Ｌ−カルニチンとのエステル化反応が生じた場合に限って長鎖遊離脂肪酸を通過させる。人体内に骨格筋、肝臓、心臓、腎臓におけるＬ−カルニチンの数値が低いと、長鎖遊離脂肪酸をエネルギー源として利用しにくくなるので、成長遅延、心筋症、筋衰弱等のカルニチン代謝異常症にかかる恐れがある。若し、体内でＬ−カルニチンが適当量に合成されなければ、欠乏症状を避けるために、これを食品から吸収しなければならない。特に、Ｌ−カルニチンを自ら生合成できない幼児にとっては、Ｌ−カルニチンは必須栄養素である。
【０００３】
Ｌ−カルニチンは、医薬品の活性成分として用いられる。カルニチン欠乏及びその他の治療学的療法、特に、心疾患の場合は、Ｌ−カルニチンの補充が必要である。最近、このような治療用としてのＬ−カルニチンの使用が重要なものと知られている（Ｒ．Ａ．Ｆｒｅｎｋｅｌ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｍｃ Ｇａｒｒｙ，“Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｉｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８０）。
【０００４】
生体内でのＬ−カルニチンの作用は、極めて重要なものと明らかになっているが、これらを大量生産するためには、生物学的抽出法は適当でない。これを容易に得るためには、光学異性体を含むＤＬ−カルニチンを用いる方法がある。この方法は、Ｄ−カルニチンを含有しているため、生体内での作用に際して副作用を引き起こす（Ｃｕｒｒ．Ｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．２８，１９５−１９８，１９８０）。多くの場合、Ｄ−カルニチンは、生体内でＬ−カルニチンと競争的に作用し、長鎖遊離脂肪酸のミトコンドリア内でのβ-酸化を妨害するようになり、これは、腎臓の機能が著しく低下した患者の場合、さらに深刻な阻害を誘発するものと知られている。
【０００５】
光学的に純粋なＬ−カルニチンを得る方法として、化学的光学分割方法（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１６６，４２６）、微生物や酵素を用いた生物学的方法（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１８７，０９３）、キラル化合物を出発物質としてＬ−カルニチンを得る方法（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，４２０，５９９ Ｂ２）のような様々な方法が試みられている。
【０００６】
Ｌ−カルニチンを得るための様々な方法のうち、微生物や酵素を用いた生物学的方法において、γ-ブチロベタインから光学的に純粋なＬ−カルニチンを得るために用いられる酵素が、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼである。この酵素は、マウスとヒトから分離され（Ｒｅｂｏｕｃｈｅ ａｎｄ Ｅｎｇｅｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５：８７００−８７０５，１９８０）、既に遺伝子配列は明からになっている。哺乳類等の高等生物体内でのＬ−カルニチンの生合成は、前駆物質として蛋白質の一部であるリシンを用いるのに対して、アカパンカビは、遊離リシンから光学的に純粋なＬ−カルニチンを産生することができるものと知られている（Ｆｒａｅｎｋｅｌ，Ｂｉｏｌ Ｂｕｌｌ，１０４：３５９−３７１，１９５３）。これについてのメカニズムをみると、Ｓ−アデノシルメチオニンがリシンにメチル基供与体として作用して、ε−Ｎ−トリメチルリシンを合成し、これは、β−ヒドロキシ−トリメチルリシンを合成する。合成されたβ−ヒドロキシ−トリメチルリシンは、トリメチルアミノブチルアルデヒドを経て、γ-ブチロベタインが合成される。
【０００７】
本発明の前に、上述したようなメカニズムにより生成されたγ-ブチロベタインを前駆物質としてＬ−カルニチンを産生するアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子配列が確認されたことはない。
【０００８】
〔発明の開示〕
このような背景のもとで、本発明は、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子を新たに明らかにしており、このような遺伝子により発現されたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを用いて、γ-ブチロベタインからＬ−カルニチンを生物学的方法で産生することが可能となった。
【０００９】
本発明の上記並びにその他の目的と新規な特徴は本明細書の以下の記述と添付図面から明らかにされるであろう。
【００１０】
〔発明を実施するための最良の形態〕
一態様として、本発明は、アカパンカビ由来の配列番号１のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を提供する。
【００１１】
本発明者は、糸状菌のアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子を確保するために、異種由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を比較分析し、保存領域を確認した後、これに基づいてデータベースに登録されたアカパンカビの全体の遺伝子配列と比較し、部分一致を示す遺伝子から、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの機能を示す候補遺伝子を決定し、その遺伝子を確保可能なプライマーを合成した。アカパンカビからｃＤＮＡライブラリーを作製し、既に決定されたプライマーを用いて、標的遺伝子のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを大腸菌内へ形質転換するための組み換えベクターを構築し、構築された組み換えベクターを大腸菌へ形質転換し、形質転換体から挿入された遺伝子を決定した。挿入された遺伝子の蛋白質発現のために、ＩＰＴＧで発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、蛋白質の発現を確認した。対照群に比べて、蛋白質の特異的発現が確認された大腸菌に対して、γ-ブチロベタインを基質として、Ｌ−カルニチンが産生されることを確認した（表１）。
【００１２】
本発明は、上述のように確認された、本発明の以前には明らかになったことがないアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子配列の確認に基づいており、本発明者らにより新たに明らかになったアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼのポリヌクレオチド配列を配列番号１で表わした。
【００１３】
本発明は、上記した配列番号１のポリヌクレオチド配列を有する遺伝子を含んで発現される場合、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの活性を有するポリペプチドをコードする前記配列番号１のポリヌクレオチドの断片、誘導体のような変異体も、本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
他の態様として、本発明は、前記配列番号１のポリヌクレオチドと７０％以上の相同性を有し、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明において、ポリヌクレオチド遺伝子、またはこのようなポリヌクレオチド遺伝子によりコードされる蛋白質、またはポリペプチドについて用いられた用語の「相同性」とは、野生のアミノ酸配列、及び野生の核酸配列との類似した程度を示すためのものであり、蛋白質の場合、本発明のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ蛋白質のアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、同一であってもよいアミノ酸配列を含む。一般に、蛋白質相同物は、標的蛋白質と同一の活性部位を含んでいる。遺伝子の場合、本発明のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、同一であってもよい遺伝子配列を含む。このような相同性の比較は、目視、または市販の比較プログラムを用いて行う。市販のコンピュータプログラムは、二つ以上の配列間の相同性を百分率（％で計算することができる。相同性（％）は、隣接した配列について計算されてもよい。
【００１６】
また他の態様として、本発明は、配列番号１の配列と７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
また他の態様として、本発明は、配列番号２に記載されたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
本発明により、前記アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド遺伝子をベクターに挿入し、これを発現させることにより、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを多量に得ることができる。
【００１９】
したがって、また他の態様として、本発明は、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。
【００２０】
本発明における「ベクター」は、適当な宿主細胞において蛋白質の発現を調節可能な調節配列に動作可能に連結されたＤＮＡ配列及びその他の遺伝子操作を容易にし、または、蛋白質の発現を最適化するために導入される配列を含有するＤＮＡ構築物のことをいう。このような調節配列には転写を調節するためのプロモータ、転写を調節するために選択的に加えられたオペレーター、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位及び転写／翻訳の終了を調節する配列が含まれる。外来遺伝子を挿入するためのベクターとしては、プラスミド、ウイルス、コスミッド等の様々な形態のベクターを用いることができる。
【００２１】
ベクターは、クローニング・ベクター及び発現ベクターを含み、クローニング・ベクターは、外来ＤＮＡが挿入されて複製可能なプラスミドであって、形質転換の際に宿主バクテリア細胞に外来ＤＮＡを伝達させる。発現ベクターは、通常、外来ＤＮＡの断片が挿入されたキャリアであって、二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、外来ＤＮＡは、宿主細胞において自然発生しないＤＮＡである異種のＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一旦、宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡと無関係に複製することができ、挿入された外来ＤＮＡが生成されることが可能である。当業界に周知のように、宿主細胞における移入遺伝子の発現量を高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内において機能を発揮する転写及び翻訳発現調節配列に動作可能に連結されなければならない。
【００２２】
本発明により作製されたアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させるためのベクターｐＴ７−ＢＢＨ２（Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α ＣＪ２００４）は、２００４年１月２７日付で寄託機関の韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ：ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５５７で寄託された。
【００２３】
また他の態様として、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００２４】
本願の明細書に用いられた用語の「形質転換」は、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体外要素として、または染色体の統合により、複製可能になることを意味する。本発明による形質転換に用いられる宿主細胞は、原核または真核細胞の全てを含むことができる。通常は、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現量が高い宿主が用いられる。細菌、例えば、エシェリキア、シュードモナス、バシラス、ストレプトミセス、真菌、酵母のような周知の真核及び原核宿主、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ９）のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０等の動物細胞が用いられる宿主細胞の例である。好ましくは、大腸菌が用いられる。
【００２５】
上記した配列番号１のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示され、一つの態様として、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを提供する。
【００２６】
また他の態様として、本発明は、配列番号２の配列と７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ活性を有する変異体からなる群より選ばれる、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを提供する。
【００２７】
本発明によるγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを、図５に示すように、γ-ブチロベタインをＬ−カルニチンを提供するのに用いることができ、これにより光学的に純粋なＬ−カルニチンを得ることができる。
【００２８】
したがって、また他の態様として、本発明は、γ-ブチロベタインを上記したγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼでヒドロキシル化して、Ｌ−カルニチンを製造する方法を提供する。
【００２９】
かくして得られたＬ−カルニチンは、カルニチン欠乏及びその他の治療学的療法において、Ｌ−カルニチンの補充に用いられ得る。
【００３０】
以下、本発明を、下記の実施例により、さらに詳述する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１：アカパンカビｃＤＮＡライブラリーの作製
アカパンカビのｃＤＮＡを得るために、先ず、アカパンカビからｍＲＮＡを分離し、ｐｏｌｙＴプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡは、ＡＤ５クローニング・ベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩに挿入されており、プラスミド化したｃＤＮＡプールを得るために、下記の過程を行った。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＮＮ３２２菌株を、ＬＢ ｋｍ（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）＋０．２％マルトースで一晩培養し、遠心分離を用いて、菌株細胞を収穫した後、１ｍｌの１０ｍＭ−ＭｇＳＯ４溶液に懸濁した。この菌株をｃＤＮＡプールを保有した３．５×１０７λと共に３０℃で３０分間撹拌せずに培養した。２ｍｌのＬＢ培地を加え、感染した菌株を３０℃で１時間の間振盪培養した。これを、ＬＢ＋アンピシリン（７５μｌ／ｍｌ）培地に塗り浸けた。生成したコロニーからプラスミドを分離し、ｃＤＮＡライブラリーの作製した。
【００３２】
実施例２：γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子獲得のためのプライマーの作製
アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼと、ヒト、ラット、シュードモナスからのγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼとの、アミノ酸配列を比較した（図３）。
【００３３】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ １をアカパンカビ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ２をヒト、 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ３をラット、 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ４をシュードモナスからの配列とすると、以下のような配列相同性を示した（Ｓｔａｒｔ ｏｆ Ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）：
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（１：２）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：１１％
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（１：３）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：１１％
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（１：４）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：１０％
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（２：３）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：８８％
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（２：４）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：２９％
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（３：４）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：２９％
このように、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼは、ヒトのγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼとは１１％の相同性を示した。
【００３４】
上記したように、アカパンカビの遺伝体情報を探索し、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼのクローニングのためのプライマーを以下のように作製した。
プライマー１：
5’-ATG AAT TCC ATA TGA TGG CCA CGG CAG CGG TTC AG-3’（配列番号３）
プライマー２：
5’-ATT AGT CGA CTC AAT ACC CTC CCC CAC CCT G -3’（配列番号４）
【００３５】
実施例３：γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの暗号化遺伝子の獲得
実施例１から獲得したアカパンカビｃＤＮＡライブラリーから、実施例２で作製されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子を増幅し、アガロース電気泳動の結果、約１．４ｋｂｐでバンドを確認し、自動の塩基配列分析を通じて、遺伝子の塩基配列を確認した。また、分析された塩基配列をＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴの検索エンジンを用いて、塩基配列上の類似した情報を検索した結果、アカパンカのゲノム配列が全く同一の遺伝子が検索され、その遺伝子の機能予測は、仮定的蛋白質とのみ命名された状態であることを確認した。ポリメラーゼ連鎖反応の産物をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し、同じ制限酵素で切断したｐＵＣ１９に結合して、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５へ形質転換し、ブルー・ホワイトスクリーニングにより分離された形質転換体から、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子が挿入されたプラスミドを確認した。
【００３６】
実施例４：プラスミドｐＴ７−ＢＢＨ２の構築
得られたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子が含有されたプラスミドから、ＮｄｅＩとＳａｌＩの制限酵素で切断した後、低融点アガロースゲルに電気泳動し、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子ＤＮＡのみを分離精製した後、ＮｄｅＩとＳａｌＩで処理されたｐＴ７−７に挿入した（図４）。結合混合物をＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５菌株へ形質転換した後、アンピシリンが含有された固体平板培地で形質転換体を分離した。分離された形質転換体から組み換えプラスミドを分離し、ＮｄｅＩとＳａｌＩで切断して、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子の挿入を確認し、これをｐＴ７−ＢＢＨ２と命名した。このような組み換えプラスミドをＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αに導入し、寄託名をＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α ＣＪ２００４として、２００４年１月２７日付で、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ：ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５５７で寄託した。
【００３７】
実施例５：プラスミドｐＴ７−ＢＢＨ２の発現菌株のＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）への形質転換
アンピシリン選択マーカーを有しているｐＴ７−ＢＢＨ２プラスミドを発現菌株のＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換した。Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、乳糖またはＩＰＴＧにより、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを産生する菌株であって、この際に産生されたＴ７ポリメラーゼにより、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子の転写が誘発される。アンピシリンが含有された固体平板培地に塗り付けて選別された形質転換体からプラスミドを精製し、ＮｄｅＩとＳａｌＩの制限酵素で切断して、挿入された遺伝子とプラスミドの大きさを確認することにより、構築されたｐＴ７−ＢＢＨ２プラスミドが導入されたことを確認した。
【００３８】
実施例６：γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの発現
γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの発現を確認するために、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にｐＴ７−ＢＢＨ２が形質転換された形質転換体のＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７−ＢＢＨ２を培養した。５０ｍｌのＬＢ培地またはアンピシリンが加えられたＬＢ培地を入れた２５０ｍｌバッフル付きフラスコにおいて、ＯＤ６００値が０．６となるまで培養した後、１ｍＭのＩＰＴＧを入れ、さらに４時間の間培養した。４，０００ｘｇで１５分間遠心分離して菌株を収穫し、１ｍｌの溶解溶液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４に１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｇ／リットル グリセロール、及び１ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁した。細胞を氷中に浸漬した後、超音波粉砕機を用いて、１０秒ずつ５回繰り返して細胞を破砕した。破砕後、４℃、１０，０００ｘｇで約２０〜３０分間遠心分離し、細胞残屑は除去し、上澄み液のみを集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、約４６ｋＤａのγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを確認した。必要に応じて、ブラッドフォード溶液を用いて蛋白質量を測定した。
【００３９】
実施例７：Ｌ−カルニチンの分析法
アカパンカビの粗抽出物を５００ｕｌのアッセイバッファ（２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に２０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ−ケトグルタル酸、１０ｍＭ−アスコルビン酸ナトリウム、２ｇ／リットル Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２５ｍＭ （ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２、及び０．２ｍＭ−ブチロベタイン）に入れた後、３７℃で１時間の間処理した。５００μｌの上澄み液を取って、１．２Ｍの過塩素酸５００μｌと混ぜた。混合した溶液を室温で１０分間培養した後、５分間遠心分離した。上澄み液６００μｌと０．７ＭのＫ３ＰＯ４３２０μｌを混合し、氷浴で２０分間放置した。混合液を５分間遠心分離し、７５０μｌの上澄み液を採取し、２５０μｌの滅菌蒸留水と混合して希釈させた。この溶液に１００μｌのＤＮＴＢ／Ｈ２Ｏ２を入れ、室温で１０分間放置した。５０μｌのカタラーゼ溶液を入れ、３０分間室温で待機した後、遠心分離して、上澄み液１ｍｌを得た。１ｍｌに５０μｌのアセチルＣｏＡを入れ、室温で５分間放置した。２．２６μｌのカルニチンアセチルトランスフェラーゼを入れ、常温で１０分間放置した。４０５ｎｍで吸光度を測定した後、Ｌ−カルニチンの量を計算した。
【００４０】
実施例８：発現されたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子をγ-ブチロベタインを基質としたＬ−カルニチン生成能の確認
実施例５で構築されたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ遺伝子へ形質転換された大腸菌を、５０ｍｌのＬＢまたはアンピシリンが加えられたＬＢ培地を入れた２５０ｍｌバッフル付きフラスコにおいて、ＯＤ６００値が０．６となるまで培養した後、１ｍＭのＩＰＴＧを入れ、正確な酵素の三次構造の形成を成しながら、封入体の形成を防止するために、２５℃で８時間以上培養した。４，０００（ｘｇ）で１５分間遠心分離して発現菌株を収穫し、蛋白質の粗抽出物を実施例６の方法で得た。蛋白質１．０ｍｇ／ｍｌを含有する粗抽出物、及びγ-ブチロベタイン０．５ｍｇ／ｍｌを含む反応液を４時間反応させた後、実施例７の方法でＬ−カルニチンの含量を下記の表１のように確認した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
〔産業上利用可能性〕
本発明により、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを暗号化する新規な遺伝子を明らかにすることにより、γ-ブチロベタインから光学的に純粋なＬ−カルニチンを産生するのに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ（γ−ＢＢＨ）を含まない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを含む大腸菌とを、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で発現を誘導した後、菌体を破砕し、上澄み液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により分析した図である。
【図２】図２は、増幅したγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼｃＤＮＡ遺伝子をｐＴ７−７にクローニングした後、これを、０．８％アガロースゲル上で分析した図である。
【図３】図３は、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼと、ヒト、ラット、シュードモナスから分離されたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼとの、核酸塩基配列の比較を示す図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＴ７−ＢＢＨ２の構成を示す図である。
【図５】図５は、γ-ブチロベタインからＬ−カルニチンを産生する機序を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ（γ−ＢＢＨ）に関するものである。より具体的には、本発明は、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、該組み換えベクターで形質転換された形質転換体、該ポリヌクレオチドによりコードされるγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ、及びγ-ブチロベタインを、該ポリヌクレオチドによりコードされるγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼでヒドロキシル化して、Ｌ−カルニチンを製造する方法に関するものである。
【０００２】
〔背景技術〕
ビタミンＢＴと呼ばれているＬ−カルニチン（３−ヒドロキシ−４−トリメチルアミノ酪酸）は、１９０５年、最初に、ロシアの科学者であるＧｕｌｅｗｉｔｓｃｈとＫｒｉｍｂｅｒｇによりウシの筋肉組織から分離され、その化学構造が１９３２年に確認された、人体代謝において極めて重要な天然のビタミン様物質である。Ｌ−カルニチンは、通常、生体内に存在し、ミトコンドリアの内膜を通過して、活性長鎖遊離脂肪酸の運搬体としての役割を行うようになる。ミトコンドリアの内膜は、アシル−ＣｏＡ誘導体に対しては不透過性であるため、Ｌ−カルニチンとのエステル化反応が生じた場合に限って長鎖遊離脂肪酸を通過させる。人体内に骨格筋、肝臓、心臓、腎臓におけるＬ−カルニチンの数値が低いと、長鎖遊離脂肪酸をエネルギー源として利用しにくくなるので、成長遅延、心筋症、筋衰弱等のカルニチン代謝異常症にかかる恐れがある。若し、体内でＬ−カルニチンが適当量に合成されなければ、欠乏症状を避けるために、これを食品から吸収しなければならない。特に、Ｌ−カルニチンを自ら生合成できない幼児にとっては、Ｌ−カルニチンは必須栄養素である。
【０００３】
Ｌ−カルニチンは、医薬品の活性成分として用いられる。カルニチン欠乏及びその他の治療学的療法、特に、心疾患の場合は、Ｌ−カルニチンの補充が必要である。最近、このような治療用としてのＬ−カルニチンの使用が重要なものと知られている（Ｒ．Ａ．Ｆｒｅｎｋｅｌ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｍｃ Ｇａｒｒｙ，“Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｉｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８０）。
【０００４】
生体内でのＬ−カルニチンの作用は、極めて重要なものと明らかになっているが、これらを大量生産するためには、生物学的抽出法は適当でない。これを容易に得るためには、光学異性体を含むＤＬ−カルニチンを用いる方法がある。この方法は、Ｄ−カルニチンを含有しているため、生体内での作用に際して副作用を引き起こす（Ｃｕｒｒ．Ｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．２８，１９５−１９８，１９８０）。多くの場合、Ｄ−カルニチンは、生体内でＬ−カルニチンと競争的に作用し、長鎖遊離脂肪酸のミトコンドリア内でのβ-酸化を妨害するようになり、これは、腎臓の機能が著しく低下した患者の場合、さらに深刻な阻害を誘発するものと知られている。
【０００５】
光学的に純粋なＬ−カルニチンを得る方法として、化学的光学分割方法（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１６６，４２６）、微生物や酵素を用いた生物学的方法（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１８７，０９３）、キラル化合物を出発物質としてＬ−カルニチンを得る方法（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，４２０，５９９ Ｂ２）のような様々な方法が試みられている。
【０００６】
Ｌ−カルニチンを得るための様々な方法のうち、微生物や酵素を用いた生物学的方法において、γ-ブチロベタインから光学的に純粋なＬ−カルニチンを得るために用いられる酵素が、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼである。この酵素は、マウスとヒトから分離され（Ｒｅｂｏｕｃｈｅ ａｎｄ Ｅｎｇｅｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５：８７００−８７０５，１９８０）、既に遺伝子配列は明からになっている。哺乳類等の高等生物体内でのＬ−カルニチンの生合成は、前駆物質として蛋白質の一部であるリシンを用いるのに対して、アカパンカビは、遊離リシンから光学的に純粋なＬ−カルニチンを産生することができるものと知られている（Ｆｒａｅｎｋｅｌ，Ｂｉｏｌ Ｂｕｌｌ，１０４：３５９−３７１，１９５３）。これについてのメカニズムをみると、Ｓ−アデノシルメチオニンがリシンにメチル基供与体として作用して、ε−Ｎ−トリメチルリシンを合成し、これは、β−ヒドロキシ−トリメチルリシンを合成する。合成されたβ−ヒドロキシ−トリメチルリシンは、トリメチルアミノブチルアルデヒドを経て、γ-ブチロベタインが合成される。
【０００７】
本発明の前に、上述したようなメカニズムにより生成されたγ-ブチロベタインを前駆物質としてＬ−カルニチンを産生するアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子配列が確認されたことはない。
【０００８】
〔発明の開示〕
このような背景のもとで、本発明は、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子を新たに明らかにしており、このような遺伝子により発現されたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを用いて、γ-ブチロベタインからＬ−カルニチンを生物学的方法で産生することが可能となった。
【０００９】
本発明の上記並びにその他の目的と新規な特徴は本明細書の以下の記述と添付図面から明らかにされるであろう。
【００１０】
〔発明を実施するための最良の形態〕
一態様として、本発明は、アカパンカビ由来の配列番号１のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を提供する。
【００１１】
本発明者は、糸状菌のアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子を確保するために、異種由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を比較分析し、保存領域を確認した後、これに基づいてデータベースに登録されたアカパンカビの全体の遺伝子配列と比較し、部分一致を示す遺伝子から、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの機能を示す候補遺伝子を決定し、その遺伝子を確保可能なプライマーを合成した。アカパンカビからｃＤＮＡライブラリーを作製し、既に決定されたプライマーを用いて、標的遺伝子のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを大腸菌内へ形質転換するための組み換えベクターを構築し、構築された組み換えベクターを大腸菌へ形質転換し、形質転換体から挿入された遺伝子を決定した。挿入された遺伝子の蛋白質発現のために、ＩＰＴＧで発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、蛋白質の発現を確認した。対照群に比べて、蛋白質の特異的発現が確認された大腸菌に対して、γ-ブチロベタインを基質として、Ｌ−カルニチンが産生されることを確認した（表１）。
【００１２】
本発明は、上述のように確認された、本発明の以前には明らかになったことがないアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子配列の確認に基づいており、本発明者らにより新たに明らかになったアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼのポリヌクレオチド配列を配列番号１で表わした。
【００１３】
本発明は、上記した配列番号１のポリヌクレオチド配列を有する遺伝子を含んで発現される場合、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの活性を有するポリペプチドをコードする前記配列番号１のポリヌクレオチドの断片、誘導体のような変異体も、本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
他の態様として、本発明は、前記配列番号１のポリヌクレオチドと７０％以上の相同性を有し、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明において、ポリヌクレオチド遺伝子、またはこのようなポリヌクレオチド遺伝子によりコードされる蛋白質、またはポリペプチドについて用いられた用語の「相同性」とは、野生のアミノ酸配列、及び野生の核酸配列との類似した程度を示すためのものであり、蛋白質の場合、本発明のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ蛋白質のアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、同一であってもよいアミノ酸配列を含む。一般に、蛋白質相同物は、標的蛋白質と同一の活性部位を含んでいる。遺伝子の場合、本発明のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、同一であってもよい遺伝子配列を含む。このような相同性の比較は、目視、または市販の比較プログラムを用いて行う。市販のコンピュータプログラムは、二つ以上の配列間の相同性を百分率（％で計算することができる。相同性（％）は、隣接した配列について計算されてもよい。
【００１６】
また他の態様として、本発明は、配列番号１の配列と７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
また他の態様として、本発明は、配列番号２に記載されたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
本発明により、前記アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド遺伝子をベクターに挿入し、これを発現させることにより、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを多量に得ることができる。
【００１９】
したがって、また他の態様として、本発明は、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。
【００２０】
本発明における「ベクター」は、適当な宿主細胞において蛋白質の発現を調節可能な調節配列に動作可能に連結されたＤＮＡ配列及びその他の遺伝子操作を容易にし、または、蛋白質の発現を最適化するために導入される配列を含有するＤＮＡ構築物のことをいう。このような調節配列には転写を調節するためのプロモータ、転写を調節するために選択的に加えられたオペレーター、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位及び転写／翻訳の終了を調節する配列が含まれる。外来遺伝子を挿入するためのベクターとしては、プラスミド、ウイルス、コスミッド等の様々な形態のベクターを用いることができる。
【００２１】
ベクターは、クローニング・ベクター及び発現ベクターを含み、クローニング・ベクターは、外来ＤＮＡが挿入されて複製可能なプラスミドであって、形質転換の際に宿主バクテリア細胞に外来ＤＮＡを伝達させる。発現ベクターは、通常、外来ＤＮＡの断片が挿入されたキャリアであって、二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、外来ＤＮＡは、宿主細胞において自然発生しないＤＮＡである異種のＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一旦、宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡと無関係に複製することができ、挿入された外来ＤＮＡが生成されることが可能である。当業界に周知のように、宿主細胞における移入遺伝子の発現量を高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内において機能を発揮する転写及び翻訳発現調節配列に動作可能に連結されなければならない。
【００２２】
本発明により作製されたアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させるためのベクターｐＴ７−ＢＢＨ２（Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α ＣＪ２００４）は、２００４年１月２７日付で寄託機関の韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ：ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５５７で寄託された。
【００２３】
また他の態様として、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００２４】
本願の明細書に用いられた用語の「形質転換」は、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体外要素として、または染色体の統合により、複製可能になることを意味する。本発明による形質転換に用いられる宿主細胞は、原核または真核細胞の全てを含むことができる。通常は、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現量が高い宿主が用いられる。細菌、例えば、エシェリキア、シュードモナス、バシラス、ストレプトミセス、真菌、酵母のような周知の真核及び原核宿主、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ９）のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０等の動物細胞が用いられる宿主細胞の例である。好ましくは、大腸菌が用いられる。
【００２５】
上記した配列番号１のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示され、一つの態様として、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するアカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを提供する。
【００２６】
また他の態様として、本発明は、配列番号２の配列と７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ活性を有する変異体からなる群より選ばれる、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを提供する。
【００２７】
本発明によるγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを、図５に示すように、γ-ブチロベタインをＬ−カルニチンを提供するのに用いることができ、これにより光学的に純粋なＬ−カルニチンを得ることができる。
【００２８】
したがって、また他の態様として、本発明は、γ-ブチロベタインを上記したγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼでヒドロキシル化して、Ｌ−カルニチンを製造する方法を提供する。
【００２９】
かくして得られたＬ−カルニチンは、カルニチン欠乏及びその他の治療学的療法において、Ｌ−カルニチンの補充に用いられ得る。
【００３０】
以下、本発明を、下記の実施例により、さらに詳述する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１：アカパンカビｃＤＮＡライブラリーの作製
アカパンカビのｃＤＮＡを得るために、先ず、アカパンカビからｍＲＮＡを分離し、ｐｏｌｙＴプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡは、ＡＤ５クローニング・ベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩに挿入されており、プラスミド化したｃＤＮＡプールを得るために、下記の過程を行った。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＮＮ３２２菌株を、ＬＢ ｋｍ（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）＋０．２％マルトースで一晩培養し、遠心分離を用いて、菌株細胞を収穫した後、１ｍｌの１０ｍＭ−ＭｇＳＯ４溶液に懸濁した。この菌株をｃＤＮＡプールを保有した３．５×１０７λと共に３０℃で３０分間撹拌せずに培養した。２ｍｌのＬＢ培地を加え、感染した菌株を３０℃で１時間の間振盪培養した。これを、ＬＢ＋アンピシリン（７５μｌ／ｍｌ）培地に塗り浸けた。生成したコロニーからプラスミドを分離し、ｃＤＮＡライブラリーの作製した。
【００３２】
実施例２：γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子獲得のためのプライマーの作製
アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼと、ヒト、ラット、シュードモナスからのγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼとの、アミノ酸配列を比較した（図３）。
【００３３】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ １をアカパンカビ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ２をヒト、 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ３をラット、 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ４をシュードモナスからの配列とすると、以下のような配列相同性を示した（Ｓｔａｒｔ ｏｆ Ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）：
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（１：２）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：１１％
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（１：３）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：１１％
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（１：４）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：１０％
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（２：３）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：８８％
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（２：４）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：２９％
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（３：４）Ａｌｉｇｎｅｄ．Ｓｏｒｃｅ：２９％
このように、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼは、ヒトのγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼとは１１％の相同性を示した。
【００３４】
上記したように、アカパンカビの遺伝体情報を探索し、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼのクローニングのためのプライマーを以下のように作製した。
プライマー１：
5’-ATG AAT TCC ATA TGA TGG CCA CGG CAG CGG TTC AG-3’（配列番号３）
プライマー２：
5’-ATT AGT CGA CTC AAT ACC CTC CCC CAC CCT G -3’（配列番号４）
【００３５】
実施例３：γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの暗号化遺伝子の獲得
実施例１から獲得したアカパンカビｃＤＮＡライブラリーから、実施例２で作製されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子を増幅し、アガロース電気泳動の結果、約１．４ｋｂｐでバンドを確認し、自動の塩基配列分析を通じて、遺伝子の塩基配列を確認した。また、分析された塩基配列をＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴの検索エンジンを用いて、塩基配列上の類似した情報を検索した結果、アカパンカのゲノム配列が全く同一の遺伝子が検索され、その遺伝子の機能予測は、仮定的蛋白質とのみ命名された状態であることを確認した。ポリメラーゼ連鎖反応の産物をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し、同じ制限酵素で切断したｐＵＣ１９に結合して、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５へ形質転換し、ブルー・ホワイトスクリーニングにより分離された形質転換体から、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子が挿入されたプラスミドを確認した。
【００３６】
実施例４：プラスミドｐＴ７−ＢＢＨ２の構築
得られたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子が含有されたプラスミドから、ＮｄｅＩとＳａｌＩの制限酵素で切断した後、低融点アガロースゲルに電気泳動し、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子ＤＮＡのみを分離精製した後、ＮｄｅＩとＳａｌＩで処理されたｐＴ７−７に挿入した（図４）。結合混合物をＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５菌株へ形質転換した後、アンピシリンが含有された固体平板培地で形質転換体を分離した。分離された形質転換体から組み換えプラスミドを分離し、ＮｄｅＩとＳａｌＩで切断して、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子の挿入を確認し、これをｐＴ７−ＢＢＨ２と命名した。このような組み換えプラスミドをＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αに導入し、寄託名をＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α ＣＪ２００４として、２００４年１月２７日付で、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ：ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５５７で寄託した。
【００３７】
実施例５：プラスミドｐＴ７−ＢＢＨ２の発現菌株のＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）への形質転換
アンピシリン選択マーカーを有しているｐＴ７−ＢＢＨ２プラスミドを発現菌株のＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換した。Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、乳糖またはＩＰＴＧにより、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを産生する菌株であって、この際に産生されたＴ７ポリメラーゼにより、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子の転写が誘発される。アンピシリンが含有された固体平板培地に塗り付けて選別された形質転換体からプラスミドを精製し、ＮｄｅＩとＳａｌＩの制限酵素で切断して、挿入された遺伝子とプラスミドの大きさを確認することにより、構築されたｐＴ７−ＢＢＨ２プラスミドが導入されたことを確認した。
【００３８】
実施例６：γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの発現
γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの発現を確認するために、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にｐＴ７−ＢＢＨ２が形質転換された形質転換体のＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ７−ＢＢＨ２を培養した。５０ｍｌのＬＢ培地またはアンピシリンが加えられたＬＢ培地を入れた２５０ｍｌバッフル付きフラスコにおいて、ＯＤ６００値が０．６となるまで培養した後、１ｍＭのＩＰＴＧを入れ、さらに４時間の間培養した。４，０００ｘｇで１５分間遠心分離して菌株を収穫し、１ｍｌの溶解溶液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４に１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｇ／リットル グリセロール、及び１ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁した。細胞を氷中に浸漬した後、超音波粉砕機を用いて、１０秒ずつ５回繰り返して細胞を破砕した。破砕後、４℃、１０，０００ｘｇで約２０〜３０分間遠心分離し、細胞残屑は除去し、上澄み液のみを集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、約４６ｋＤａのγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを確認した。必要に応じて、ブラッドフォード溶液を用いて蛋白質量を測定した。
【００３９】
実施例７：Ｌ−カルニチンの分析法
アカパンカビの粗抽出物を５００ｕｌのアッセイバッファ（２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に２０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ−ケトグルタル酸、１０ｍＭ−アスコルビン酸ナトリウム、２ｇ／リットル Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２５ｍＭ （ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２、及び０．２ｍＭ−ブチロベタイン）に入れた後、３７℃で１時間の間処理した。５００μｌの上澄み液を取って、１．２Ｍの過塩素酸５００μｌと混ぜた。混合した溶液を室温で１０分間培養した後、５分間遠心分離した。上澄み液６００μｌと０．７ＭのＫ３ＰＯ４３２０μｌを混合し、氷浴で２０分間放置した。混合液を５分間遠心分離し、７５０μｌの上澄み液を採取し、２５０μｌの滅菌蒸留水と混合して希釈させた。この溶液に１００μｌのＤＮＴＢ／Ｈ２Ｏ２を入れ、室温で１０分間放置した。５０μｌのカタラーゼ溶液を入れ、３０分間室温で待機した後、遠心分離して、上澄み液１ｍｌを得た。１ｍｌに５０μｌのアセチルＣｏＡを入れ、室温で５分間放置した。２．２６μｌのカルニチンアセチルトランスフェラーゼを入れ、常温で１０分間放置した。４０５ｎｍで吸光度を測定した後、Ｌ−カルニチンの量を計算した。
【００４０】
実施例８：発現されたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼの遺伝子をγ-ブチロベタインを基質としたＬ−カルニチン生成能の確認
実施例５で構築されたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ遺伝子へ形質転換された大腸菌を、５０ｍｌのＬＢまたはアンピシリンが加えられたＬＢ培地を入れた２５０ｍｌバッフル付きフラスコにおいて、ＯＤ６００値が０．６となるまで培養した後、１ｍＭのＩＰＴＧを入れ、正確な酵素の三次構造の形成を成しながら、封入体の形成を防止するために、２５℃で８時間以上培養した。４，０００（ｘｇ）で１５分間遠心分離して発現菌株を収穫し、蛋白質の粗抽出物を実施例６の方法で得た。蛋白質１．０ｍｇ／ｍｌを含有する粗抽出物、及びγ-ブチロベタイン０．５ｍｇ／ｍｌを含む反応液を４時間反応させた後、実施例７の方法でＬ−カルニチンの含量を下記の表１のように確認した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
〔産業上利用可能性〕
本発明により、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを暗号化する新規な遺伝子を明らかにすることにより、γ-ブチロベタインから光学的に純粋なＬ−カルニチンを産生するのに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ（γ−ＢＢＨ）を含まない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼを含む大腸菌とを、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で発現を誘導した後、菌体を破砕し、上澄み液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により分析した図である。
【図２】図２は、増幅したγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼｃＤＮＡ遺伝子をｐＴ７−７にクローニングした後、これを、０．８％アガロースゲル上で分析した図である。
【図３】図３は、アカパンカビ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼと、ヒト、ラット、シュードモナスから分離されたγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼとの、核酸塩基配列の比較を示す図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＴ７−ＢＢＨ２の構成を示す図である。
【図５】図５は、γ-ブチロベタインからＬ−カルニチンを産生する機序を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされるポリヌクレオチドまたは配列番号２に記載されたγ−ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドの中から選ばれる遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項３】
寄託番号ＫＣＣＭ−１０５５７である請求項２に記載の組み換えベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子を含む組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
配列番号１のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸配列を有するγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ。
【請求項７】
γ-ブチロベタインを、請求項６に記載のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼでヒドロキシル化して、Ｌ−カルニチンを製造する方法。
【請求項１】
配列番号１で表わされるポリヌクレオチドまたは配列番号２に記載されたγ−ブチロベタインヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドの中から選ばれる遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項３】
寄託番号ＫＣＣＭ−１０５５７である請求項２に記載の組み換えベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子を含む組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
配列番号１のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列の中から選ばれるアミノ酸配列を有するγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ。
【請求項７】
γ-ブチロベタインを、請求項６に記載のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼでヒドロキシル化して、Ｌ−カルニチンを製造する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５２５２２１（Ｐ２００７−５２５２２１Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００６８７（Ｐ２００７−５００６８７）
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００５３２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８３０８９
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０２１７２６９６）シージェイ コーポレイション (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００５３２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８３０８９
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０２１７２６９６）シージェイ コーポレイション (8)
【Ｆターム（参考）】
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