アトルバスタチンを用いて患者を治療する際の、変化したバイオトランスフォーメーションについての、および不所望の薬剤作用の発生についての患者素因の測定方法
本発明は、アトルバスタチンを用いて患者を治療する際の、筋疾患の発生についての患者素因、および／または変化したバイオトランスフォーメーションについての患者素因の測定方法に関する。その際、患者の生体試料において、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子（ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子 １Ａ３）中の少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在、および／または高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現が測定される。さらに、本発明は、本方法の際に使用できるオリゴヌクレオチド、並びにこのオリゴヌクレオチドを使用する診断キットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタチンを用いて患者を治療する際の、変化するバイオトランスフォーメーションについての、および不所望の薬剤作用の発生についての患者素因を、同じバイオトランスフォーメーションする能力の遺伝的に決定される変化の結果として、測定する方法に関する。
【０００２】
筋疾患、例えばミオパシーおよび横紋筋融解症は、例えばスタチンの投与によって引き起こされることがある筋肉の疾患である。
【０００３】
作用物質アトルバスタチンが包含されるスタチンは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイム−Ａ−レダクターゼ−（ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ）−阻害剤である薬剤である。他方で、ＨＭＧ−ＣｏＡは、ヒトのコレステロール合成の中間生成物であり、そのため、スタチンは主に、脂肪物質代謝不全の際にコレステロール低下剤として使用される。その際、スタチンは、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼの阻害によって、血液中で脂質低下を引き起こす。ＨＭＧ−ＣｏＡはコレステロールの生合成に関与する物質なので、スタチンの作用下では、スタチンを投与しない場合よりも少ないコレステロールが体内で形成される。スタチンの代表には、とりわけ、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンが包含される。
【０００４】
スタチンが一般に有用な薬剤としてみなされているにもかかわらず、療法の際には問題がある、即ち、一方では、定められた用量に相応する作用の予想における不確実性に関して、および他方では、不所望の薬剤作用（ここで「ＵＡＷ」とも略され、一般に副作用としても称される）の発生のリスクにおいてである。
【０００５】
全てのスタチン、さらにアトルバスタチンは、不所望の薬剤作用を引き起こすことがあり、最も重大なものに、いわゆる中毒性ミオパシーが挙げられ、その際、骨格筋組織の構造的および機能的変化が問題である。中毒性ミオパシーの最も重大な形態は、横紋筋融解症であり、それはとりわけ、４つの手足全ての完全な麻痺の形で現れ、且つ、しばしば致命的に進行することがある。文献内には、２００３年までに、脂質低下剤によって引き起こされた横紋筋融解症の約３３５０の症例が記載された。
【０００６】
この場合、種々の現在市販のスタチンにおける作用の強さは様々であり、例えば、フルバスタチンはわずかなミオパシー頻度を有するのだが、しかしながら他方では最も高い用量でも最も弱い脂質低下作用しか示さない。
【０００７】
スタチン、例えばアトルバスタチン服用の際のさらなる不所望の薬剤作用として、肝障害、記憶力および注意力の低下、並びに攻撃性の高まり、および被刺激性の高まりが観察され、並びに、頭痛、吐き気、貧血症、神経毒、脱毛等が観察された。
【０００８】
コレステロール含有率の低下のために、スタチンを用いた、殊にアトルバスタチンを用いた治療を受ける全ての患者が不所望の薬剤作用を発生するわけではないので、且つ、患者が特定のスタチン、殊にアトルバスタチンおよびその用量に異なって反応するので、スタチン療法、殊にアトルバスタチン療法の前段階で、不所望の薬剤作用が発生するか、または、望み通りではなく治療に反応する、患者素因を測定できることが望ましい。
【０００９】
従って、本発明の課題は、スタチンを用いた患者の治療の際の不所望の薬剤作用の発生についての、もしくは変化した有効性についての、患者素因の測定方法を提供することである。
【００１０】
本発明によれば、この課題は、患者の生体試料において、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子（ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子 １Ａ３）中の少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在、および／または高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現が測定されることによって解決される。
【００１１】
本発明の基礎をなす課題は、このやり方で完全に解決される。
【００１２】
本発明者らは、多数のヒトの肝臓試料の調査を用いた独自の試みにおいて、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子における遺伝的変異が、高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現を導いたことを示すことができた。さらに、本発明者らは、高められた遺伝子発現は、スタチン アトルバスタチン（ＡＴＶ）の高められたラクトン化を伴うことを示すことができた。
【００１３】
ＡＴＶ−ラクトンについて高められた含有率は、アトルバスタチンのヒドロキシ代謝物質について高められた濃度と同様に、ミオパシーに罹患しているアトルバスタチン患者の際に見出される （Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， "Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ ｉｓ ｕｎｃｈａｎｇｅｄ ｂｕｔ ｌａｃｔｏｎ ａｎｄ ａｄｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ａｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｖｅｒａｌ−ｆｏｌｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｙｏｐａｔｈｙ"， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ２００６， ７９：５３２〜５３９参照）。加えて、細胞培養モデルについて、スタチン−ラクトンは、それぞれのスタチン酸と比較して１４〜３７倍だけ高められた筋毒性を有することが証明された （Ｓｋｏｔｔｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｔｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｙｏｔｏｘｉｃｉｔｙ： ｔｈｅ ｌａｃｔｏｎｅ ｆｏｒｍｓ ａｒｅ ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｔｈａｎ ｔｈｅ ａｃｉｄ ｆｏｒｍｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｃｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ３３：３１７−２５ （２００８））。
【００１４】
アトルバスタチンがインビボで、とりわけ、２−（オルト−）および４−（パラ）−ヒドロキシ−ＡＴＶ酸（薬理学的に作用する代謝物質）に生体内変化されることが公知である。選択的に、その遊離した酸側鎖が環式ＡＴＶ−ラクトンに転換されることがある。ＡＴＶ−ラクトンの高められた親油性に基づき、これはＡＴＶ自体よりも遙かに早くヒドロキシル化される （Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｈ， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ． Ｄｉｓｐｏｓ． ２８（１１）：１３６９−７８ （２０００）参照）。本発明者らは、従って、本知見を用いて、ＡＴＶ−ラクトンについて、およびヒドロキシ−ＡＴＶ−ラクトンについて高められた含有率が、酵素 ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼの高められた活性に、もしくはむしろ、この酵素のアイソフォーム１Ａ３の、遺伝的変異によって引き起こされた高められた活性に、起因するとみなされることを初めて示すことができた。
【００１５】
ＡＴＶのラクトン化は、たしかに、いくつかのＵＧＴアイソフォームによって触媒され得るのだが （例えばＧｏｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．： "Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ａｎｄ ｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｆｉｂｒａｔｅｓ Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ， Ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ， ａｎｄ Ｆｅｎｏｆｉｂｒｉｃ Ａｃｉｄ"， Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｃｌｉｎｉｃ． Ｐｈａｒｍａ． Ｔｈｅｒａｐ．， ２００７： ３５ （８） １３１５−１３２３参照）、ただし今まで、どのアイソフォームがインビボで主要な機能を占めているのかが今までわかっていなかった。既に言及した通り、ＵＧＴｓ（ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ）は、とりわけスタチン、例えばアトルバスタチンのラクトン化を引き起こす酵素である。ラクトン化されたスタチンは再度、スタチン自体に対して、好ましくは酵素ＣＹＰ３Ａにより、ヒドロキシ−スタチン−ラクトンに転換される。
【００１６】
ＵＧＴ１Ａ３遺伝子とは、ここで常に、この遺伝子のコーディング配列、並びにイントロン配列および遺伝子の５’−および３’−非翻訳／調節領域であると理解される。
【００１７】
今、本発明の方法を用いて、スタチン治療、殊にアトルバスタチン治療を受けるべき患者、もしくは、既にスタチン治療を受けた患者が、遺伝的に、アイソザイムＵＧＴ１Ａ３のより高い活性についての素質をもっているかどうか、且つ、それによって、増加したスタチン−ラクトンおよびヒドロキシ−スタチン−ラクトンが形成される危険（スタチン−ラクトンが薬理的に無効な代謝物質を作り出すので、このことは言及された筋疾患がみちびかれ得るか、または部分的な療法の断念がみちびかれ得る）があるかどうかをスクリーニングすることが初めて可能になる。従って、アトルバスタチンは、この場合、もしくはこの患者の際、この多型を有さない場合の患者の際と同一ではない有効性を高い確率で有している。有利には、多型の測定によってまさに、アトルバスタチンが高められた程度で生体内変化され、ひいてはその用量において、多型を有さない患者より効果がなくなるかどうかを予測できる； 本発明によって多型が同定される場合であれば、野生型の患者と類似するアトルバスタチンの有効性に達するために、アトルバスタチンの実際の用量、または計画された用量のいずれかを相応して適合でき、つまり、高めることができ、もしくは、不所望の薬剤作用を回避するために、他のスタチンまたは他の療法の試みを用いることができる。
【００１８】
本発明によれば、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子内の少なくとも１つのＳＮＰの測定によって、これに取り組んでいる。それによって、スタチンで治療される患者の療法を個々に合わせることができ、従って、スタチンの完全な他の代替物を使用するか、または、用量、ひいては特定の投与されるスタチンの有効性を、患者について個々に考慮するかのいずれかである。
【００１９】
アトルバスタチンの他に、現在、他のスタチン、例えばセリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンも使用されている。
【００２０】
上記のスタチンは、市場において現在、例えばＳｏｒｔｉｓ（登録商標）、Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標） （アトルバスタチン）， Ｂａｙｃｏｌ（登録商標）、Ｚｅｎａｓ（登録商標） （セリバスタチン）、Ｃｒａｎｏｃ（登録商標）、Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標）、Ｌｏｃｏｌ（登録商標）、Ｆｒａｃｔａｌ（登録商標） （フルバスタチン）、Ｍｅｖｉｎａｃｏｒ（登録商標） （ロバスタチン）、Ｍｅｖａｌｏｔｉｎ（登録商標）、Ｐｒａｖａｓｉｎ（登録商標）、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標） （プラバスタチン）、Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標） （ロスバスタチン）、Ｇｅｒｏｓｉｍ（登録商標）、Ｓｉｍｖａｂｅｔａ（登録商標）、Ｚｏｃｏｒ（登録商標） （シンバスタチン）およびそのそれぞれの後発医薬品の名の下で販売されている。
【００２１】
今や、本発明の方法を用いて、有利にも、狙い通り且つ個別化されたコレステロール合成抑制剤療法を、かかる療法を受けねばならない患者が上記の薬剤を用いた治療前、またはその間のいずれかでＵＧＴ１Ａ３遺伝子内のＳＮＰの存在について調査されることによって、提供することができる。それらの遺伝子の高められた発現、ひいてはＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼの高められた活性をみちびくＳＮＰが存在すれば、スタチンの代替物を用いた治療か、または予定されたスタチン以外を用いた治療か、または当初の、もしくは当初予定された以外の用量を用いた治療のいずれかを行う、もしくは先に進めることができる。
【００２２】
さらなる実施態様において、好ましくは、本発明よる方法においては少なくとも１つの以下のハプロタイプが測定される： ＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３、ＵＧＴ１Ａ３*６、および殊にＵＧＴ１Ａ３遺伝子中の以下のＳＮＰ：
【００２３】
用語「ＡＦ２９７０９３内の遺伝子位置（Ｐｏｓ．）」とは、ここで、使用可能なｒｓ番号がないＳＮＰを意味し、ＵＧＴ１遺伝子座（公に利用できるデータバンクに従いアクセス番号ＡＦ２９７０９３を用いて示される）中でのその位置が相応して述べられている。（ＵＧＴＩ遺伝子座については、例えばＥＭＢＬ−ＥＢＩデータバンク ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｅｘｐａｓｙｆｅｔｃｈ７ＡＦ２９７０９３またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＮＣＢＩのデータバンク ＧｅｎＢａｎｋ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照）。
【００２４】
ＳＮＰ（英語のＳｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）とは、特定の母集団において野生型と比較したＤＮＡストランド内での個々の塩基対の変異を意味する。ＳＮＰは、ヒトのゲノムにおける全ての遺伝的変異の約９０％であり、且つ、ゲノム内の特定の領域で不均一な強さで生じる。それは、突然変異、即ち、母集団の遺伝子プール内である程度の度合いで認められる遺伝的変化である。その際、ＳＮＰｓは、塩基、例えばシトシンと他の塩基、例えばチミンとを交換する際の置換として、または欠失あるいは挿入として生じることがある。
【００２５】
その際、ＳＮＰは常に、２つまたは非常に稀には、さらにはより多くの状態の１つを有し、且つ、対立遺伝子により伝えられる。公知のＳＮＰの大半は、ゲノム内のノンコーディング領域、即ち、遺伝子の間または個々の遺伝子のエクソン領域の間のいずれかにある範囲に関係する。原則的に、ノンコーディング領域内でのこの遺伝子変異体は制御配列、例えばプロモーター、エンハンサーまたはスプライシング部位（Ｓｐｌｅｉｓｓｓｔｅｌｌｅｎ）にも関係することがあり、ひいては遺伝子発現への作用を有する。直接、コーディング配列に関係するＳＮＰは、静止したままであることがあり、即ち、塩基交換は、類似のアミノ酸中で相応するトリプレットコードの翻訳を変更せず、したがって、ペプチド配列への影響も有さない。たしかに、特別な塩基トリプレットについての等価のｔ−ＲＮＡの異なる頻度から、翻訳効率についての差が生じ、従って、特定の遺伝子の発現は、転写後、静止ＳＮＰによって影響されることがある。いくつかのＳＮＰは、コーディング機能を有し、即ち、種々の対立遺伝子が、生じるペプチド内への種々のアミノ酸の取り込みをみちびき、その結果、その機能が変えられることがある。
【００２６】
ゲノム内で、ＳＮＰは、それが二対立遺伝子で存在する場合に、３つの可能な遺伝子型で発生でき、つまり、２つの可能なホモ接合体の形態の１つで（対立遺伝子１／対立遺伝子１または対立遺伝子２／対立遺伝子２）、または、ヘテロ接合体の形態で（対立遺伝子１／対立遺伝子２）、発生できる。隣接したＳＮＰは、種々の程度で互いに連結され得る。即ち、ある程度のパーセンテージまで、それは集団の中で、特定の組み合わせで、一緒にのみ生じ、従って、いわゆるハプロタイプを形成する。「連鎖」とはこの場合、その都度、染色体上の２つの異なる位置で存在する対立遺伝子が（同一の染色体に）一緒に転送される、即ち、連鎖して遺伝される傾向のことであると理解される。その際、一般に、対立遺伝子の際に、これが一緒に遺伝される傾向がある場合、「連鎖不平衡」（英語での「Ｌｉｎｋａｇｅ Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ」）のことを述べている。
【００２７】
ゲノムＤＮＡが二重のストランドなので、個々のＳＮＰを個々の両者のストランドに関して同定できる。本願において好ましいＳＮＰは、たしかに、ＳＮＰの多型の箇所での他のものによるヌクレオチド（Ｎｕｃｌｏｔｉｄ）の置換を含むが、しかし、ＳＮＰはより複雑であることがあり、且つ、２つの対応する配列の１つからのヌクレオチド欠失、または２つの対応する配列の１つへのヌクレオチドの挿入を有することがある。
【００２８】
例えばここでＳＮＰの測定について利用されている用語「測定する」は、ゲノム中の特定の箇所についての１つまたはそれより多くのＳＮＰの分析のための種々の手段および方法を包含し、その際、該用語は、直接的な測定、即ち、例えばシーケンシングと同様に、間接的な測定、従って例えば増幅および／またはハイブリダイゼーションも含める。
【００２９】
本発明者らは、今回、意外にも、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子内の特定のＳＮＰに基づいて、スタチン投与の際の筋疾患の発生または変化した有効性についての遺伝的素因の診断が可能であることを見出した。
【００３０】
新規の方法を用いて、今回、アトルバスタチン投与の際、個々に可能性のある筋疾患の発症、もしくは個々に可能性のあるアトルバスタチンの有効性低下を予想することが初めて可能となる。
【００３１】
その際、さらなる実施態様において、少なくとも１つのＳＮＰがＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３および ＵＧＴ１Ａ３*６ハプロタイプのＳＮＰと連鎖不平衡であるＳＮＰから選択される場合が好ましい。
【００３２】
これは、本発明による方法の枠内で、ＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３およびＵＧＴ１Ａ３*６のハプロタイプのマーカーとして同様に使用でき、ここでは明示的に挙げられていないが、しかしそれはまさに上記のＳＮＰと連鎖不平衡であるＳＮＰも検出できることを意味する（例えば、Ｍｅｎａｒｄ Ｖ． ｅｔ ａｌ，"Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ ＵＧＴｌ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ−Ｃａｎａｄｉａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ" Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ． ２００９年２月８日 参照）。
【００３３】
本発明による方法のさらなる実施態様において、高められたｍＲＮＡレベルおよび／または高められたタンパク質レベルを介して、高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現が測定される場合が好ましい。
【００３４】
ＵＧＴ１Ａ３遺伝子内での遺伝的変異が、高められたＵＧＴ１Ａ３発現、ひいてはこの酵素の高められた活性をみちびくという、本発明者らによってもたらされた証拠は、遺伝的変異が通例、低下した機能と関連付けられた、今まで（ただし単に組み換えアイソザイムを用いて）得られた知見とは逆である （例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， "Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＵＧＴｌ Ａ３： Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｎ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ"， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ２００６， ３４：１４６２−１４６７； Ｃａｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， "Ａ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＵＧＴ１Ａ３"， Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００７， １７（７）：４８１−９５参照）。
【００３５】
従って、技術水準においてＵＧＴ１Ａ３並びにＵＧＴ１Ａ３多型はたしかに既に同定されてはいるにもかかわらず、本知見および提供される方法は、新規且つ驚くべきことであり、なぜなら、該多型がＵＧＴ１Ａ３の低下した活性または発現と関連づけられたからである。しかし、本願の発明者らは、今回、該多型が、高められたＵＧＴ１Ａ３発現、その結果、高められた活性を伴い、そのことがさらに上述の通り、増加したＡＴＶのラクトン化をみちびくことをまさに見つけ出した。
【００３６】
殊に、本発明による方法の際、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子内の少なくとも１つのＳＮＰの検出のために、オリゴヌクレオチドが使用され、該オリゴヌクレオチドが表１および２に示されるオリゴヌクレオチドから、もしくは配列ＩＤ番号１ないし２７を有するオリゴヌクレオチドから選択される場合が好ましい。
【００３７】
【表１】
その際、配列ＩＤ番号１、３、５、７を有するオリゴヌクレオチドは、順方向（「ｆ」）プライマーを表し、配列ＩＤ番号２、４、６および８を有するオリゴヌクレオチドは、逆方向（「ｒ」）プライマーを表す。
【００３８】
【表２】
遺伝子位置はＧｅｎＢａｎｋアクセス番号（Ａｃｃ．番号）ＡＦ２９７０９３．１を有するデータに相応。
【００３９】
本発明者らは、このオリゴヌクレオチドを用いて、ＳＮＰ含有領域を増幅し、並びにこのオリゴヌクレオチド（プライマー）の伸長を介してＳＮＰを同定することに成功できた。従って、本発明はこのオリゴヌクレオチド自体にも関する。
【００４０】
さらなる実施態様においては、少なくとも１つのＳＮＰの測定のために、以下の方法の少なくとも１つを使用する場合が好ましい： ＰＣＲに基づく方法、ＤＮＡシーケンシング法、ハイブリダイゼーション法、質量分析、ＨＰＬＣ法、プライマー伸長法。
【００４１】
これらの方法は、従来技術において充分に知られており、且つ、既にＳＮＰの同定のために使用されている。これに関して、例としては、Ｇｒａｈａｍ Ｒ．ＴａｙｌｏｒおよびＩａｎ Ｎ．Ｍ．Ｄａｙの「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」 （Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ２００５）が教示され、その中にこれらの方法が充分に記載されている。
【００４２】
さらなる実施態様において、ＳＮＰ含有領域の増幅のために、以下のＰＣＲサイクルを使用する場合が好ましい：
約９５℃で１５分間の変性、次に、約９５℃で２０秒間、約６５℃で３０秒間、および約７２℃で１分間の段階で５サイクル； 次に、約９５℃で２０秒間、約６２℃で３０秒間および約７２℃で１分間の段階で４０サイクル； 次に、約７２℃で１０分間の最終の伸長段階。
【００４３】
さらに、本発明は、スタチンを用いた患者の治療の際の筋疾患発生についての患者素因測定のための診断キットにも関し、その際、該キットは少なくとも１つの上述の通りのオリゴヌクレオチドを有する。
【００４４】
本発明によるキットを用いて、単純な道具が提供され、それを用いて迅速に少なくとも１つの相応するＳＮＰをＵＧＴ１Ａ３遺伝子内で検出でき、それを通じて、スタチンを用いた療法の際に、高い確率で副作用としての筋疾患を発生する患者を同定できる。
【００４５】
本発明はさらに、ヒトのＵＧＴ１Ａ３遺伝子内の少なくとも１つのＳＮＰ、殊にＳＮＰ ｒｓ５５７７２６５１、ｒｓｌ９８３０２３、ｒｓ５６３０４７１３、ｒｓ４５５０７６９１、ｒｓ３８０６５９７、ｒｓ３８０６５９６、ｒｓ３８２１２４２、ｒｓ６７０６２３２、ｒｓ６４３１６２５、ｒｓ１７８６８３３６、ｒｓ７５７４２９６； ｇ．１４６３５６ （ＡＦ２９７０９３内の遺伝子位置）、ｒｓ４５４４９９９５、並びにさらにＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３およびＵＧＴ１Ａ３*６ハプロタイプと連鎖不平衡であるＳＮＰを、スタチン治療の際の筋疾患の発生についての患者素因の測定のために用いる使用にも関する。
【００４６】
本発明のさらなる利点および特徴は、以下の記載および添付の図から明らかになる。
【００４７】
前述の特徴、および以下にさらに説明される特徴は、それぞれ上述の組み合わせだけでなく、別の組み合わせまたは単独でも、本発明の範囲を逸脱することなく使用可能であることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】人体中でのスタチン アトルバスタチンのバイオトランスフォーメーションについての概要である。
【図２】種々のＵＧＴアイソザイムの活性についてのグラフであり、これによればアイソザイム１Ａ３が、ＡＴＶのラクトン化に関して最高の活性を示す。
【図３】患者の試料内でのＵＧＴ１Ａ３タンパク質の分布についてのグラフ、およびアトルバスタチンのラクトン化の活性の、ヒトの肝臓内のタンパク質含有率に対する相関についてのグラフである（右）。
【図４】ヒトの肝臓内のＵＧＴ１Ａ３ハプロタイプの構造についての概要図である。
【図５】遺伝子型−表現型（ＵＧＴ１Ａ３−ｍＲＮＡについて）の相関である。
【図６】遺伝子型−表現型（ＵＧＴ１Ａ３−タンパク質について）の相関である。
【図７】遺伝子型−表現型（ＵＧＴ１Ａ３のラクトン化活性について）の相関である。
【００４９】
図１は、スタチン アトルバスタチンの代謝についての概要図を示し、名称の下部にその構造式が示されている。「ＨＭＧＣＲ」は、酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイム−Ａ−レダクターゼ−（ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ）についての略記であり、それはスタチンによって抑制される。
【００５０】
該図面から、酵素ＵＧＴ（および本発明者らが検出できたような、主にＵＧＴ１Ａ３）が、アトルバスタチン（ＡＴＶ）の、ＡＴＶ−ラクトン（図面の下−端、中央）へのラクトン化を担っていることが察知される。
【００５１】
さらに、図面において、シトクロムＰ４５０の酵素の亜群ＣＹＰ３Ａ（それはとりわけＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ５である）が、２−ヒドロキシアトルバスタチンまたは４−ヒドロキシアトルバスタチンのいずれかへのアトルバスタチンのヒドロキシル化を触媒するが、ただし、ＡＴＶラクトンのヒドロキシル化よりも効果が少ないことが示されている（反応を明示する矢印の太さの違いによって明示）。
【００５２】
図２は、棒グラフ（左； ２Ａ）内に、２つの異なる基質濃度の際（０．６μＭ、白色のバー、および６μＭ、黒色のバー）の種々の組み換えＵＧＴアイソザイムの測定された酵素活性を示す。これによれば、アイソザイム１Ａ１および１Ａ３のみが、ＡＴＶのラクトン化に関する測定可能な活性を有し、その際、より高い基質活性の際のＵＧＴ１Ａ３が、遙かにより高い活性を示す。反応速度パラメータであるミハエリス−メンテン定数Ｋｍおよび最大活性Ｖｍａｘは、組み換えＵＧＴ１Ａ３酵素を用いて、ラクトン化活性（ｖ）の測定によって、異なる基質濃度（ｃｓ）で計測され（右； ２Ｂ）、試験バッチおよびＶｍａｘについての結果は図２Ｃに示されている。
【００５３】
図３は、左（図３Ａ）に、ＩＫＰ−肝臓バンクの１５０の肝臓試料の母集団抜き取り検査におけるＵＧＴ１Ａ３タンパク質の分布ヒストグラムを示す。該ヒストグラムの下で、例としてはウェスタンブロット分析が示されている（図３Ｂ）。特異的な抗体で標識された５５ｋＤａのタンパク質バンドは、タンパク質のグリコシル化によって引き起こされる現象において、二重バンドとして現れる。ヒストグラムにおける上昇カーブは、累積頻度を示し、且つ、波括弧は、高められた活性で可能性のある副群を示唆する。右のグラフ（図３Ｃ）は、アトルバスタチンのラクトン化の、ヒトの肝臓内のタンパク質計測に対する相関を示している。該相関は、統計的に評価された。グラフ下のボックス内に、スピアマンの順位相関係数ｒsおよび統計上の有意性をｐ値として示す。
【００５４】
図４は、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子の構造についての概要を、エクソンに関して（黒いボックス１〜５）、肝臓試料において調査された突然変異のおよその位置と共に示す（グレー： プロモーター領域； 白： コーディング領域におけるサイレント突然変異； 黒： アミノ酸交換）。その下に、ヒトの肝臓試料における調査の際に同定された、ＵＧＴ１Ａ３ハプロタイプおよびハプロタイプ変異体を表す。このために、肝臓試料に属するＤＮＡ試料を、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子型同定法を用いて遺伝子型同定した。ＳＮＰデータ（上の領域において、ゲノム位置および／またはｒｓ番号で示される）を、引き続き、Ｐｒｏｇｒａｍｍ Ｐｈａｓｅ （Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１）を用いて分析した。下の領域に、それぞれ調査された位置に属する塩基を示す。
【００５５】
図５は、調査された人間の肝臓試料（ｎ＝１５０）における、ＵＧＴ１Ａ３ ｍＲＮＡについての遺伝子型と表現型との間の相関を示す。左のグラフ（図５Ａ）に、測定された遺伝子型のそれぞれの肝臓試料が有するｍＲＮＡ値を表す。右のグラフ（図５Ｂ）は、種々のＵＧＴ１Ａ３*２ ハプロタイプ変異体のｍＲＮＡ値を示す。有意差が、「マン-ホイットニー検定法」を用いて測定された。
【００５６】
図６は、調査された人間の肝臓試料（ｎ＝１５０）のミクロソームフラクションにおける、ＵＧＴ１Ａ３ タンパク質についての遺伝子型と表現型との間の相関を示す。左のグラフ（図６Ａ）に、測定された遺伝子型のそれぞれの肝臓試料が有するＵＧＴ１Ａ３タンパク質値を表す。右のグラフ（図６Ｂ）は、種々のＵＧＴ１Ａ３*２ ハプロタイプ変異体のタンパク質値を示す。有意差が、「マン-ホイットニー検定法」を用いて測定された。
【００５７】
図７は、調査された人間の肝臓試料（ｎ＝１５０）のミクロソームフラクションにおける、アトルバスタチンのラクトン化についての遺伝子型と表現型との間の相関を示す。左のグラフ（図７Ａ）に、測定された遺伝子型のそれぞれの肝臓試料が有するｍＲＮＡ値を表す。右のグラフ（図７Ｂ）は、種々のＵＧＴ１Ａ３*２ ハプロタイプ変異体のｍＲＮＡ値を示す。有意差が、「マン-ホイットニー検定法」を用いて測定された。
【００５８】
材料および方法
患者のＤＮＡおよび肝臓試料
肝臓組織および付随する血液試料は、ＩＫＰシュトゥットガルトに設立された人間の肝臓バンクのものである。該試料は、１９９９〜２０００年に、医学的な理由に基づき、肝臓の外科手術を受けた患者から取得された （Ｗｏｌｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ： Ｓｅｘ Ｉｓ ａ Ｍａｊｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ＣＹＰ３Ａ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ； Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００３， ３８：９７８〜９８８内に記載）。全ての組織試料は、病理学者によって調査され、且つ、それにより組織学的に正常な組織のみが使用されたことが保証された。臨床上の患者の資料は、完全に匿名化され、且つ、性別、年齢、医学的診断、薬剤療法、アルコールおよび喫煙習慣、および測定された肝臓値についてのデータが含まれた。肝炎、硬変または慢性アルコール中毒を有する患者の試料は除外された。定性的に有価なＲＮＡおよび完全な資料を供する、合計１５０の肝臓試料が、この調査のために使用された。ウェスタンブロットおよび酵素活性計測のために使用される肝臓ミクロソームは、標準的な方法に従って製造された （Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．： Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＹＰ２Ｂ６ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ； Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００１， １１：３９９−４１５内に記載）。遺伝子型調査のためのゲノムＤＮＡは、それぞれの組織寄贈者の血液試料から単離された。該調査のために、局地的な倫理委員会の際に、相応の票が得られた。該調査は、ヘルシンキ宣言に適合して行われ、全ての患者は文書によって同意した。
【００５９】
ＵＧＴ１Ａ３ ｍＲＮＡの測定
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用いて、肝臓組織から調製した。ＵＧＴ１Ａ３ ｍＲＮＡの定量化は、自己発生の（ｓｅｌｂｓｔｅｎｔｗｉｃｋｅｌｔ）、特異的なＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ−ＰＣＲ Ａｓｓａｙを用い、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、ＣＡ）において行われた。そのために、イントロン１にかかっているプライマー対 １Ａ３＿ｔｑ＿ｎｅｕ＿ｆ／ｒ（下記の表３を参照）およびＦＡＭ標識ＵＧＴ１Ａ３−ＭＧＢプローブを、濃度４００ｎｍｏｌ／ｌもしくは２００ｎｍｏｌ／ｌで使用した。ＵＧＴ１Ａ４に対する交差反応性を、テンプレートとしての両者の遺伝子のＤＮＡプラスミドを調べることによって排除した（データ示さず）。ＰＣＲ反応バッチは、２ｘ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、１２．５μｌの最終用量で含み、且つ、次のＰＣＲサイクル条件が使用された： ５０℃で２分間； ９５℃で１０分間、次に、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の段階で４０サイクル。
【００６０】
【表３】
【００６１】
位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号（Ａｃｃ． Ｎｕｍｂｅｒ） ＣＣＤＳ２５０９．１ （ＵＧＴ１Ａ３）、ＣＣＤＳ３３４０５．１ （ＵＧＴ１Ａ４）およびＣＣＤＳ３３４０４．１ （ＵＧＴ１Ａ５）を有するｃＤＮＡ配列（「ｃ位置」）に相応。
【００６２】
ミクロソームＵＧＴ１Ａ３タンパク質含有率の測定
ＵＧＴ１Ａ３タンパク質は、ウェスタンブロット分析を用いて、１５０の肝臓試料から定量化された。一次抗体として、単一クローン抗体（ａｂ５７４００、ａｂｃａｍ製）を使用した。二次抗体として、ヤギ抗マウス ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ （ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、且つ、ＯＤＹＳＳＥＹ赤外線画像化システム（ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出を行った。２０μｇのヒトの肝臓ミクロソームを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ ＳＤＳ分離ゲル）に供し、且つ、ニトロセルロースメンブレン上にブロットした。該ブロットを、３μｇ／ｍｌの抗ＵＧＴ１Ａ３と共に、１％のスキムミルク／ＴＢＳＴ内で２時間にわたり、インキュベートし、該インキュベート物を、二次抗体と共に、１％のスキムミルク（ＴＢＳＴ）中で１：１０，０００に薄め、引き続き、３０分間行った。
【００６３】
ウェスタンブロットは、肝臓からの、組み換えＵＧＴ１Ａ３について約５５ｋＤａで３つのバンドを、およびＵＧＴ１Ａ３について２つのバンドをもたらした。試料の脱グリコシル化後、両者の場合においてそれぞれ１つのバンドが残っていた。肝臓ミクロソームにおける定量化のために、バンドの強度を組み合わせた。
【００６４】
相対的な定量化を、ＯＤＹＳＳＥＹソフトウェアを用いて、組み換えＵＧＴ１Ａ３（ヒトのＵＧＴ１Ａ３−スーパーソーム； ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ； カタログ番号４５６４１３）の標準曲線（５点； ０．５〜８μｇ）に対して行った。種々のブロットからの結果を、それぞれのブロットの際に使用された、プールされたミクロソームの結果について規格化した。
【００６５】
抗体の特異性を、１０μｇの組み換えＵＧＴ１Ａ１、１Ａ４、１Ａ６、１Ａ９、２Ｂ４および２Ｂ９に対して試験した。ＵＧＴ１Ａ６、１Ａ９、２Ｂ４および２Ｂ９に関しては、交差活性を見出すことができず、ＵＧＴ１Ａ１および１Ａ４に対しては、最高感度で軽度の、しかしながらデータ解析を妨げない、交差活性が識別可能であった。
【００６６】
アトルバスタチンのラクトン化のためのＵＧＴ１Ａ３活性の測定
ヒトの肝臓ミクロソームによるアトルバスタチン−ラクトン形成の計測のために、ＬＣ−ＭＳアッセイを構築した：このために、２５μｇのミクロソームを、５０ｍＭのトリスＨＣｌ中、ｐＨ７．４で、５ｍＭの塩化マグネシウム、２５μｇ／ｍｌのアラメチシンおよび１０μＭのアトルバスタチンを総容量１００μｌで用いて、１０分間、３７℃で、予備インキュベートする。該反応を、１０ｍＭのＵＤＰ−グルクロン酸を、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）の補助基質に添加することによって開始させる。該試料を３０分間インキュベートした。反応を、冷たい、２５μｌの２５０ｍＭのギ酸をアセトニトリルに添加することにより停止させ、且つ、ボルテックスした試料をただちに氷上に置いた。ＬＣ／ＭＳ定量化を遂行できるように、１０μｌの内部標準を１００μｌの試料に対して添加した。試料を５分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、且つ、ＬＣ／ＭＳ計測のためにガラス容器中に添加した。
【００６７】
ＬＣ／ＭＳ法を用いて、アトルバスタチン、アトルバスタチン−ラクトン、並びにそのパラ−およびオルト−ヒドロキシ形を、５ｎＭ〜５μＭの範囲で組み合わせて定量化できる。該試料を、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８の、Ｃ８プレカラムを有する３．５μｍ−カラムにて、１ｍＭのギ酸−およびアセトニトリル−勾配を用いて、２３分間、３０℃で分離する。該計測を、ＨＣＴ Ｅｓｑｕｉｒｅ ｐｌｕｓ質量分析計によって検出するが、ただし、該カラムにより分離された物質の電気スプレーイオン化法による。
【００６８】
ＵＧＴ１Ａ座についての遺伝的分析
Ｃａｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００７）は、シーケンシングによって、７つのプロモーター、および１３のエクソン−１−ＳＮＰ（４つのシノニム）を、２４９の患者試料中で検出した。ＵＧＴ１Ａファミリーは、エクソン１においてのみ異なり、且つ、同一のエクソン２〜５を有した。この試みは、この記載された１８のプロモーター−およびエクソン−１−ＳＮＰ、加えて１つのフレームシフト−ＳＮＰをエクソン１（ｒｓ４５５８６０３５）中で検出するための方法を樹立することにある。このＳＮＰを含む４つの領域を、Ｑｉａｇｅｎ ＨｏｔＳｔａｒポリメラーゼを用いて、１０ｎｇのゲノムＤＮＡ内で、特異的にＵＧＴ１Ａ３だけの増幅を形成するプライマーを用いて増幅した。全てのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ増幅プライマー（上記表１参照）は、より効率的な増幅を可能にするために、５’「タグ」配列（ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧ）を有していた （ソフトウェアＭａｓｓＡｒｒａｙ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ （ｖ３．０．０）の推奨）。高い特異性を保証するために、並びに高い収量を達成するために、特別なＰＣＲプロトコルを使用した：３８４ウェルのマイクロタイタープレート内のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲバッチ（容積５μＬ）は、１０ｎｇの予備乾燥されたＤＮＡ、ＨｏｔｓｔａｒＴａｑポリメラーゼを有する４μｌの「ＨｏｔｓｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）、０．１μＭの各増幅プライマー（上記表１を参照）および０．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｑｉａｇｅｎ）を含んでいた。ＰＣＲ条件（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、ＣＡ）は、以下の通りであった：９５℃で１５分間の変性、次に、９５℃で２０秒間、６５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の段階で５サイクル； 次に、９５℃で２０秒間、６２℃で３０秒間および７２℃で１分間の段階で４０サイクル； 次に、７２℃で１０分間の最終の伸長段階。特異性を確認するために、試料中のこの断片をシーケンシングし、且つ、いくつかの試料のＰＣＲ生成物を、常時、アガロースゲル上で、正確な増幅に関して、且つ水の汚染がないように制御して、試験した。
【００６９】
この断片の増幅後、過剰なｄＮＴＰｓを、最終容積７μｌで、０．３μｌのＳＡＰ（１．７Ｕ／μｌ）と共に、０．１７μｌの１０×ＳＡＰ緩衝剤（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、サンディエゴ、ＣＡ）および１．５３μｌの水中で、３７℃、２０分間、次に、１０分間８５℃で、そして２０℃で１秒間、脱リン酸化した。
【００７０】
ＳＮＰ位置の直前で終わる特異的なプライマーが設計された（上記表２参照）。増幅段階において、それをその都度、ＳＮＰ塩基に合う、標識された塩基についてのみ伸長した。アッセイのプライマーを、その生成物が質量の点で少なくとも１５Ｄａ異なるように設計した。検出可能な質量は、３０００〜８５００Ｄａの範囲内である。
【００７１】
特異的な増幅プロトコルを、ｉＰｌｅｘ酵素並びに特異的な緩衝剤条件と共に、この段階のために使用した：
プライマーの質量が６０００Ｄａより低いか高いかによって、シグナルノイズ比を最適に調整するために、０．２μｌのｉＰＬＥＸ緩衝剤の添加後、０．２μＬのｉＰＬＥＸ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｍｉｘ、および０．０４１μｌのｉＰＬＥＸ酵素 （ｉＰＬＥＸ Ｇｏｌｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を、０．０１１２もしくは００２４４μｌの伸長プライマー（５００μＭに）添加する。伸長反応の条件は以下の通りであった：９４℃で３０秒間、次に、５２℃で５秒間および８０℃で５秒間の５つのサブサイクルを有する、９４℃で５秒間の段階で４０サイクル； ７２℃で３分間の最終の伸長段階。
【００７２】
妨げになるナトリウムおよびカリウム付加物を回避するために、その都度、６ｍｇのＣｌｅａｎ Ｒｅｓｉｎ （Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）および１６μｌの水を添加することによって試料を脱塩した。室温で２０分のインキュベーション後、２０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、該試料を、ナノディスペンサーを使用しながら３８４ ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）Ａｒｒａｙｓ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）に適用し、且つ、ＭａｓｓＡｒｒａｙ（商標）Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ （Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）において分析した。オートメーション化されたスペクトル記録を、ＭａｓｓＡｒｒａｙ Ｔｙｐｅｒソフトウェアｖ ３．４．を用いて、ソフトウェアＳｐｅｃｔｒｏａｃｑｕｉｒｅおよびＤａｔｅｎａｎａｌｙｓｅを用いて実施した。自動式で分類されない試料は、マニュアルで後分析された。
【００７３】
統計およびコンピュータ支援分析
遺伝的データの評価を、公に利用できるプログラムを用いて行った。肝臓バンクの母集団における、観察されたおよび期待される対立−および遺伝子型頻度を、ハーディ−バインベルク平衡からのずれについて、オンラインで使用可能な ＤｅＦｉｎｅｔｔｉ Ｐｒｏｇｒａｍｍｓを用いて試験した （Ｓｔｒｏｍ ＴＭ ａｎｄ Ｗｉｅｎｋｅｒ ＴＦ、ハーディ−バインベルク平衡についてのＤｉＦｉｎｅｔｔｉ Ｐｒｏｇｒａｍホームページ； ｈｔｔｐ：／／ｉｈｇ．ｇｓｆ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｗ／ｈｗａｌ．ｐｌ）。ハロタイプの計算を、ＰＨＡＳＥ Ｐｒｏｇｒａｍｍｓ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ｖ２．１．１ （Ｔｈｅ Ｍａｔｔｈｅｗ Ｓｔｅｐｈｅｎｓのホームページ； ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｐｈｅｎｓｌａｂ．ｕｃｈｉｃａｇｏ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）を用い、並びにＨａｐｌｏｖｉｅｗ ｖ．３．３２ （Ｔｈｅ Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｈａｐｌｏｖｉｅｗホームページ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍｐｇ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗ／）を使用しながら実施した。
【００７４】
統計的な分析を、統計プログラムＰｒｉｓｍ ４、Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０３ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて実施した。スピアマンの順位相関係数を、ｍＲＮＡ、タンパク質および活性データの相関分析のために測定した。ハプロタイプの群間差を、「マン−ホイットニー検定法」を用いて測定した（パラメトリックではないＴ−試験）。全ての統計試験を、二面的に行い、且つ、統計的有意性はＰ＜０．０５として定義した。
【００７５】
結果
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を使用して、ＡＴＶのヒドロキシル化およびＡＴＶのラクトン化の際の個々の組み換え発現ＣＹＰ−およびＵＧＴ−酵素の役割を調査した。この際、１５０の良好に文書化された外科の肝臓試料を有する、ヒトの肝臓組織のための大きなバンクを使用して、肝臓内でＡＴＶのラクトン化を主に担っているＵＧＴアイソザイムを同定できた。さらに、ＡＴＶのバイオトランスフォーメーションを担っている、関連ＵＧＴ遺伝子のＳＮＰ並びにハプロタイプを同定するために、遺伝的分析を行った。
【００７６】
ＡＴＶのヒドロキシル化のための主酵素としてのＣＹＰ３Ａ４の同定
最も重要な薬剤代謝ＣＹＰ酵素の中で、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との両者のアイソザイムを有する、シトクロムＰ４５０のＣＹＰ３Ａ亜群は、ＡＴＶのヒドロキシル化を触媒する唯一の関連Ｐ４５０酵素である。ＣＹＰ３Ａ４の触媒活性は、共発現シトクロムｂ５と比較して数倍増強されており、前記シトクロムｂ５は、ＣＹＰ３Ａ４バイオトランスフォーメーションの公知の触媒増強剤である。
【００７７】
ＡＴＶのラクトン化のための主酵素としてのＵＧＴ１Ａ３の同定
図２Ａは、種々の組み換えＵＧＴ酵素の下で、ＵＧＴ１Ａ３が、ＡＴＶのラクトン化の触媒化について最も高い特異的な活性を有する酵素であることを示す。これに対して、ＵＧＴ１Ａ１は低い活性しか持っていない。反応速度分析により、組み換えＵＧＴ１Ａ３について、アトルバスタチン−ラクトンの形成についてのＫｍ値が１２μＭであることが判明した （図２ＢおよびＣ）。
【００７８】
１５０の肝臓試料からのＵＧＴ１Ａ３タンパク質データは、５３０倍の変異性、および異常分布を示し、並びに、より高い活性を有する副群の存在可能性を示した （図３Ａ参照）。ミクロソームＵＧＴ１Ａ３のラクトン化活性は、１５０の肝臓試料内で２０倍の変異性を示した。ラクトン化は、ＵＧＴ１Ａ３のウェスタンブロットのタンパク質データとよく相関し（図３Ｂ参照）、且つ、リアルタイムＰＣＲ分析の定量的なＵＧＴ１Ａ３ ｍＲＮＡデータともよく相関した （ｒｓ＝０．３８； Ｐ＜０．０００１； データ示さず）。
【００７９】
遺伝分析
ＵＧＴ１Ａ座のＳＮＰについての選択性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦアッセイを用いて、肝臓試料に属するＤＮＡ試料内で測定した （ｎ＝１９、図４参照）。さらに、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子型を別途測定した。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗを用いて示され得る通り、ＳＮＰの間で、連鎖不平衡が存在する。その連鎖は、ＵＧＴ１Ａ１*２８対立遺伝子のキャリアが、ほとんどの場合、ＵＧＴ１Ａ３*２対立遺伝子のキャリアでもあるというものであり、即ち、高められたＵＧＴ１Ａ３発現によって引き起こされる、アトルバスタチンの高められたラクトン化能力は、ＵＧＴ１Ａ１*２８についての遺伝子型同定を用いても予測される。
【００８０】
ｍＲＮＡのレベル、タンパク質のレベル、およびアトルバスタチンのラクトン化のレベルについての、ＵＧＴ１Ａ３についての遺伝子型と表現型との相関についての分析を、図５〜７に示す。ＵＧＴ１Ａ３*２−、*３−および*６−ハプロタイプは、ハプロタイプの最も広く行き渡った変異体であった。３つのハプロタイプの全ては、著しく高められたＵＧＴ１Ａ３タンパク質発現を示した （図５参照）。ＡＴＶのラクトン化のための活性は、ホモ接合体の*２キャリアの際に、野生型の試料と比較して２倍高められていた。*３および*６ハプロタイプのキャリアは、高められたラクトン形成を示さなかった。その際、試料数が*２キャリアの際よりも少なく、且つ、ヘテロ接合体キャリアのみが同定され得ることを考慮すべきである。従って、ホモ接合体キャリアの際、酵素活性に及ぼす効果が計測可能であることができた。従って、当該図５〜７におけるデータは、変異体と、高められた機能とが関連づけられることを明らかに示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタチンを用いて患者を治療する際の、変化するバイオトランスフォーメーションについての、および不所望の薬剤作用の発生についての患者素因を、同じバイオトランスフォーメーションする能力の遺伝的に決定される変化の結果として、測定する方法に関する。
【０００２】
筋疾患、例えばミオパシーおよび横紋筋融解症は、例えばスタチンの投与によって引き起こされることがある筋肉の疾患である。
【０００３】
作用物質アトルバスタチンが包含されるスタチンは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイム−Ａ−レダクターゼ−（ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ）−阻害剤である薬剤である。他方で、ＨＭＧ−ＣｏＡは、ヒトのコレステロール合成の中間生成物であり、そのため、スタチンは主に、脂肪物質代謝不全の際にコレステロール低下剤として使用される。その際、スタチンは、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼの阻害によって、血液中で脂質低下を引き起こす。ＨＭＧ−ＣｏＡはコレステロールの生合成に関与する物質なので、スタチンの作用下では、スタチンを投与しない場合よりも少ないコレステロールが体内で形成される。スタチンの代表には、とりわけ、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンが包含される。
【０００４】
スタチンが一般に有用な薬剤としてみなされているにもかかわらず、療法の際には問題がある、即ち、一方では、定められた用量に相応する作用の予想における不確実性に関して、および他方では、不所望の薬剤作用（ここで「ＵＡＷ」とも略され、一般に副作用としても称される）の発生のリスクにおいてである。
【０００５】
全てのスタチン、さらにアトルバスタチンは、不所望の薬剤作用を引き起こすことがあり、最も重大なものに、いわゆる中毒性ミオパシーが挙げられ、その際、骨格筋組織の構造的および機能的変化が問題である。中毒性ミオパシーの最も重大な形態は、横紋筋融解症であり、それはとりわけ、４つの手足全ての完全な麻痺の形で現れ、且つ、しばしば致命的に進行することがある。文献内には、２００３年までに、脂質低下剤によって引き起こされた横紋筋融解症の約３３５０の症例が記載された。
【０００６】
この場合、種々の現在市販のスタチンにおける作用の強さは様々であり、例えば、フルバスタチンはわずかなミオパシー頻度を有するのだが、しかしながら他方では最も高い用量でも最も弱い脂質低下作用しか示さない。
【０００７】
スタチン、例えばアトルバスタチン服用の際のさらなる不所望の薬剤作用として、肝障害、記憶力および注意力の低下、並びに攻撃性の高まり、および被刺激性の高まりが観察され、並びに、頭痛、吐き気、貧血症、神経毒、脱毛等が観察された。
【０００８】
コレステロール含有率の低下のために、スタチンを用いた、殊にアトルバスタチンを用いた治療を受ける全ての患者が不所望の薬剤作用を発生するわけではないので、且つ、患者が特定のスタチン、殊にアトルバスタチンおよびその用量に異なって反応するので、スタチン療法、殊にアトルバスタチン療法の前段階で、不所望の薬剤作用が発生するか、または、望み通りではなく治療に反応する、患者素因を測定できることが望ましい。
【０００９】
従って、本発明の課題は、スタチンを用いた患者の治療の際の不所望の薬剤作用の発生についての、もしくは変化した有効性についての、患者素因の測定方法を提供することである。
【００１０】
本発明によれば、この課題は、患者の生体試料において、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子（ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子 １Ａ３）中の少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在、および／または高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現が測定されることによって解決される。
【００１１】
本発明の基礎をなす課題は、このやり方で完全に解決される。
【００１２】
本発明者らは、多数のヒトの肝臓試料の調査を用いた独自の試みにおいて、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子における遺伝的変異が、高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現を導いたことを示すことができた。さらに、本発明者らは、高められた遺伝子発現は、スタチン アトルバスタチン（ＡＴＶ）の高められたラクトン化を伴うことを示すことができた。
【００１３】
ＡＴＶ−ラクトンについて高められた含有率は、アトルバスタチンのヒドロキシ代謝物質について高められた濃度と同様に、ミオパシーに罹患しているアトルバスタチン患者の際に見出される （Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， "Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ ｉｓ ｕｎｃｈａｎｇｅｄ ｂｕｔ ｌａｃｔｏｎ ａｎｄ ａｄｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ａｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｖｅｒａｌ−ｆｏｌｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｙｏｐａｔｈｙ"， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ２００６， ７９：５３２〜５３９参照）。加えて、細胞培養モデルについて、スタチン−ラクトンは、それぞれのスタチン酸と比較して１４〜３７倍だけ高められた筋毒性を有することが証明された （Ｓｋｏｔｔｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｔｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｙｏｔｏｘｉｃｉｔｙ： ｔｈｅ ｌａｃｔｏｎｅ ｆｏｒｍｓ ａｒｅ ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｔｈａｎ ｔｈｅ ａｃｉｄ ｆｏｒｍｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｃｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ３３：３１７−２５ （２００８））。
【００１４】
アトルバスタチンがインビボで、とりわけ、２−（オルト−）および４−（パラ）−ヒドロキシ−ＡＴＶ酸（薬理学的に作用する代謝物質）に生体内変化されることが公知である。選択的に、その遊離した酸側鎖が環式ＡＴＶ−ラクトンに転換されることがある。ＡＴＶ−ラクトンの高められた親油性に基づき、これはＡＴＶ自体よりも遙かに早くヒドロキシル化される （Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｈ， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ． Ｄｉｓｐｏｓ． ２８（１１）：１３６９−７８ （２０００）参照）。本発明者らは、従って、本知見を用いて、ＡＴＶ−ラクトンについて、およびヒドロキシ−ＡＴＶ−ラクトンについて高められた含有率が、酵素 ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼの高められた活性に、もしくはむしろ、この酵素のアイソフォーム１Ａ３の、遺伝的変異によって引き起こされた高められた活性に、起因するとみなされることを初めて示すことができた。
【００１５】
ＡＴＶのラクトン化は、たしかに、いくつかのＵＧＴアイソフォームによって触媒され得るのだが （例えばＧｏｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．： "Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ａｎｄ ｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｆｉｂｒａｔｅｓ Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ， Ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ， ａｎｄ Ｆｅｎｏｆｉｂｒｉｃ Ａｃｉｄ"， Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｃｌｉｎｉｃ． Ｐｈａｒｍａ． Ｔｈｅｒａｐ．， ２００７： ３５ （８） １３１５−１３２３参照）、ただし今まで、どのアイソフォームがインビボで主要な機能を占めているのかが今までわかっていなかった。既に言及した通り、ＵＧＴｓ（ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ）は、とりわけスタチン、例えばアトルバスタチンのラクトン化を引き起こす酵素である。ラクトン化されたスタチンは再度、スタチン自体に対して、好ましくは酵素ＣＹＰ３Ａにより、ヒドロキシ−スタチン−ラクトンに転換される。
【００１６】
ＵＧＴ１Ａ３遺伝子とは、ここで常に、この遺伝子のコーディング配列、並びにイントロン配列および遺伝子の５’−および３’−非翻訳／調節領域であると理解される。
【００１７】
今、本発明の方法を用いて、スタチン治療、殊にアトルバスタチン治療を受けるべき患者、もしくは、既にスタチン治療を受けた患者が、遺伝的に、アイソザイムＵＧＴ１Ａ３のより高い活性についての素質をもっているかどうか、且つ、それによって、増加したスタチン−ラクトンおよびヒドロキシ−スタチン−ラクトンが形成される危険（スタチン−ラクトンが薬理的に無効な代謝物質を作り出すので、このことは言及された筋疾患がみちびかれ得るか、または部分的な療法の断念がみちびかれ得る）があるかどうかをスクリーニングすることが初めて可能になる。従って、アトルバスタチンは、この場合、もしくはこの患者の際、この多型を有さない場合の患者の際と同一ではない有効性を高い確率で有している。有利には、多型の測定によってまさに、アトルバスタチンが高められた程度で生体内変化され、ひいてはその用量において、多型を有さない患者より効果がなくなるかどうかを予測できる； 本発明によって多型が同定される場合であれば、野生型の患者と類似するアトルバスタチンの有効性に達するために、アトルバスタチンの実際の用量、または計画された用量のいずれかを相応して適合でき、つまり、高めることができ、もしくは、不所望の薬剤作用を回避するために、他のスタチンまたは他の療法の試みを用いることができる。
【００１８】
本発明によれば、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子内の少なくとも１つのＳＮＰの測定によって、これに取り組んでいる。それによって、スタチンで治療される患者の療法を個々に合わせることができ、従って、スタチンの完全な他の代替物を使用するか、または、用量、ひいては特定の投与されるスタチンの有効性を、患者について個々に考慮するかのいずれかである。
【００１９】
アトルバスタチンの他に、現在、他のスタチン、例えばセリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンも使用されている。
【００２０】
上記のスタチンは、市場において現在、例えばＳｏｒｔｉｓ（登録商標）、Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標） （アトルバスタチン）， Ｂａｙｃｏｌ（登録商標）、Ｚｅｎａｓ（登録商標） （セリバスタチン）、Ｃｒａｎｏｃ（登録商標）、Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標）、Ｌｏｃｏｌ（登録商標）、Ｆｒａｃｔａｌ（登録商標） （フルバスタチン）、Ｍｅｖｉｎａｃｏｒ（登録商標） （ロバスタチン）、Ｍｅｖａｌｏｔｉｎ（登録商標）、Ｐｒａｖａｓｉｎ（登録商標）、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標） （プラバスタチン）、Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標） （ロスバスタチン）、Ｇｅｒｏｓｉｍ（登録商標）、Ｓｉｍｖａｂｅｔａ（登録商標）、Ｚｏｃｏｒ（登録商標） （シンバスタチン）およびそのそれぞれの後発医薬品の名の下で販売されている。
【００２１】
今や、本発明の方法を用いて、有利にも、狙い通り且つ個別化されたコレステロール合成抑制剤療法を、かかる療法を受けねばならない患者が上記の薬剤を用いた治療前、またはその間のいずれかでＵＧＴ１Ａ３遺伝子内のＳＮＰの存在について調査されることによって、提供することができる。それらの遺伝子の高められた発現、ひいてはＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼの高められた活性をみちびくＳＮＰが存在すれば、スタチンの代替物を用いた治療か、または予定されたスタチン以外を用いた治療か、または当初の、もしくは当初予定された以外の用量を用いた治療のいずれかを行う、もしくは先に進めることができる。
【００２２】
さらなる実施態様において、好ましくは、本発明よる方法においては少なくとも１つの以下のハプロタイプが測定される： ＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３、ＵＧＴ１Ａ３*６、および殊にＵＧＴ１Ａ３遺伝子中の以下のＳＮＰ：
【００２３】
用語「ＡＦ２９７０９３内の遺伝子位置（Ｐｏｓ．）」とは、ここで、使用可能なｒｓ番号がないＳＮＰを意味し、ＵＧＴ１遺伝子座（公に利用できるデータバンクに従いアクセス番号ＡＦ２９７０９３を用いて示される）中でのその位置が相応して述べられている。（ＵＧＴＩ遺伝子座については、例えばＥＭＢＬ−ＥＢＩデータバンク ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｅｘｐａｓｙｆｅｔｃｈ７ＡＦ２９７０９３またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＮＣＢＩのデータバンク ＧｅｎＢａｎｋ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照）。
【００２４】
ＳＮＰ（英語のＳｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）とは、特定の母集団において野生型と比較したＤＮＡストランド内での個々の塩基対の変異を意味する。ＳＮＰは、ヒトのゲノムにおける全ての遺伝的変異の約９０％であり、且つ、ゲノム内の特定の領域で不均一な強さで生じる。それは、突然変異、即ち、母集団の遺伝子プール内である程度の度合いで認められる遺伝的変化である。その際、ＳＮＰｓは、塩基、例えばシトシンと他の塩基、例えばチミンとを交換する際の置換として、または欠失あるいは挿入として生じることがある。
【００２５】
その際、ＳＮＰは常に、２つまたは非常に稀には、さらにはより多くの状態の１つを有し、且つ、対立遺伝子により伝えられる。公知のＳＮＰの大半は、ゲノム内のノンコーディング領域、即ち、遺伝子の間または個々の遺伝子のエクソン領域の間のいずれかにある範囲に関係する。原則的に、ノンコーディング領域内でのこの遺伝子変異体は制御配列、例えばプロモーター、エンハンサーまたはスプライシング部位（Ｓｐｌｅｉｓｓｓｔｅｌｌｅｎ）にも関係することがあり、ひいては遺伝子発現への作用を有する。直接、コーディング配列に関係するＳＮＰは、静止したままであることがあり、即ち、塩基交換は、類似のアミノ酸中で相応するトリプレットコードの翻訳を変更せず、したがって、ペプチド配列への影響も有さない。たしかに、特別な塩基トリプレットについての等価のｔ−ＲＮＡの異なる頻度から、翻訳効率についての差が生じ、従って、特定の遺伝子の発現は、転写後、静止ＳＮＰによって影響されることがある。いくつかのＳＮＰは、コーディング機能を有し、即ち、種々の対立遺伝子が、生じるペプチド内への種々のアミノ酸の取り込みをみちびき、その結果、その機能が変えられることがある。
【００２６】
ゲノム内で、ＳＮＰは、それが二対立遺伝子で存在する場合に、３つの可能な遺伝子型で発生でき、つまり、２つの可能なホモ接合体の形態の１つで（対立遺伝子１／対立遺伝子１または対立遺伝子２／対立遺伝子２）、または、ヘテロ接合体の形態で（対立遺伝子１／対立遺伝子２）、発生できる。隣接したＳＮＰは、種々の程度で互いに連結され得る。即ち、ある程度のパーセンテージまで、それは集団の中で、特定の組み合わせで、一緒にのみ生じ、従って、いわゆるハプロタイプを形成する。「連鎖」とはこの場合、その都度、染色体上の２つの異なる位置で存在する対立遺伝子が（同一の染色体に）一緒に転送される、即ち、連鎖して遺伝される傾向のことであると理解される。その際、一般に、対立遺伝子の際に、これが一緒に遺伝される傾向がある場合、「連鎖不平衡」（英語での「Ｌｉｎｋａｇｅ Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ」）のことを述べている。
【００２７】
ゲノムＤＮＡが二重のストランドなので、個々のＳＮＰを個々の両者のストランドに関して同定できる。本願において好ましいＳＮＰは、たしかに、ＳＮＰの多型の箇所での他のものによるヌクレオチド（Ｎｕｃｌｏｔｉｄ）の置換を含むが、しかし、ＳＮＰはより複雑であることがあり、且つ、２つの対応する配列の１つからのヌクレオチド欠失、または２つの対応する配列の１つへのヌクレオチドの挿入を有することがある。
【００２８】
例えばここでＳＮＰの測定について利用されている用語「測定する」は、ゲノム中の特定の箇所についての１つまたはそれより多くのＳＮＰの分析のための種々の手段および方法を包含し、その際、該用語は、直接的な測定、即ち、例えばシーケンシングと同様に、間接的な測定、従って例えば増幅および／またはハイブリダイゼーションも含める。
【００２９】
本発明者らは、今回、意外にも、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子内の特定のＳＮＰに基づいて、スタチン投与の際の筋疾患の発生または変化した有効性についての遺伝的素因の診断が可能であることを見出した。
【００３０】
新規の方法を用いて、今回、アトルバスタチン投与の際、個々に可能性のある筋疾患の発症、もしくは個々に可能性のあるアトルバスタチンの有効性低下を予想することが初めて可能となる。
【００３１】
その際、さらなる実施態様において、少なくとも１つのＳＮＰがＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３および ＵＧＴ１Ａ３*６ハプロタイプのＳＮＰと連鎖不平衡であるＳＮＰから選択される場合が好ましい。
【００３２】
これは、本発明による方法の枠内で、ＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３およびＵＧＴ１Ａ３*６のハプロタイプのマーカーとして同様に使用でき、ここでは明示的に挙げられていないが、しかしそれはまさに上記のＳＮＰと連鎖不平衡であるＳＮＰも検出できることを意味する（例えば、Ｍｅｎａｒｄ Ｖ． ｅｔ ａｌ，"Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ ＵＧＴｌ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ−Ｃａｎａｄｉａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ" Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ． ２００９年２月８日 参照）。
【００３３】
本発明による方法のさらなる実施態様において、高められたｍＲＮＡレベルおよび／または高められたタンパク質レベルを介して、高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現が測定される場合が好ましい。
【００３４】
ＵＧＴ１Ａ３遺伝子内での遺伝的変異が、高められたＵＧＴ１Ａ３発現、ひいてはこの酵素の高められた活性をみちびくという、本発明者らによってもたらされた証拠は、遺伝的変異が通例、低下した機能と関連付けられた、今まで（ただし単に組み換えアイソザイムを用いて）得られた知見とは逆である （例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， "Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＵＧＴｌ Ａ３： Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｎ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ"， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ２００６， ３４：１４６２−１４６７； Ｃａｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， "Ａ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＵＧＴ１Ａ３"， Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００７， １７（７）：４８１−９５参照）。
【００３５】
従って、技術水準においてＵＧＴ１Ａ３並びにＵＧＴ１Ａ３多型はたしかに既に同定されてはいるにもかかわらず、本知見および提供される方法は、新規且つ驚くべきことであり、なぜなら、該多型がＵＧＴ１Ａ３の低下した活性または発現と関連づけられたからである。しかし、本願の発明者らは、今回、該多型が、高められたＵＧＴ１Ａ３発現、その結果、高められた活性を伴い、そのことがさらに上述の通り、増加したＡＴＶのラクトン化をみちびくことをまさに見つけ出した。
【００３６】
殊に、本発明による方法の際、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子内の少なくとも１つのＳＮＰの検出のために、オリゴヌクレオチドが使用され、該オリゴヌクレオチドが表１および２に示されるオリゴヌクレオチドから、もしくは配列ＩＤ番号１ないし２７を有するオリゴヌクレオチドから選択される場合が好ましい。
【００３７】
【表１】
その際、配列ＩＤ番号１、３、５、７を有するオリゴヌクレオチドは、順方向（「ｆ」）プライマーを表し、配列ＩＤ番号２、４、６および８を有するオリゴヌクレオチドは、逆方向（「ｒ」）プライマーを表す。
【００３８】
【表２】
遺伝子位置はＧｅｎＢａｎｋアクセス番号（Ａｃｃ．番号）ＡＦ２９７０９３．１を有するデータに相応。
【００３９】
本発明者らは、このオリゴヌクレオチドを用いて、ＳＮＰ含有領域を増幅し、並びにこのオリゴヌクレオチド（プライマー）の伸長を介してＳＮＰを同定することに成功できた。従って、本発明はこのオリゴヌクレオチド自体にも関する。
【００４０】
さらなる実施態様においては、少なくとも１つのＳＮＰの測定のために、以下の方法の少なくとも１つを使用する場合が好ましい： ＰＣＲに基づく方法、ＤＮＡシーケンシング法、ハイブリダイゼーション法、質量分析、ＨＰＬＣ法、プライマー伸長法。
【００４１】
これらの方法は、従来技術において充分に知られており、且つ、既にＳＮＰの同定のために使用されている。これに関して、例としては、Ｇｒａｈａｍ Ｒ．ＴａｙｌｏｒおよびＩａｎ Ｎ．Ｍ．Ｄａｙの「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」 （Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ２００５）が教示され、その中にこれらの方法が充分に記載されている。
【００４２】
さらなる実施態様において、ＳＮＰ含有領域の増幅のために、以下のＰＣＲサイクルを使用する場合が好ましい：
約９５℃で１５分間の変性、次に、約９５℃で２０秒間、約６５℃で３０秒間、および約７２℃で１分間の段階で５サイクル； 次に、約９５℃で２０秒間、約６２℃で３０秒間および約７２℃で１分間の段階で４０サイクル； 次に、約７２℃で１０分間の最終の伸長段階。
【００４３】
さらに、本発明は、スタチンを用いた患者の治療の際の筋疾患発生についての患者素因測定のための診断キットにも関し、その際、該キットは少なくとも１つの上述の通りのオリゴヌクレオチドを有する。
【００４４】
本発明によるキットを用いて、単純な道具が提供され、それを用いて迅速に少なくとも１つの相応するＳＮＰをＵＧＴ１Ａ３遺伝子内で検出でき、それを通じて、スタチンを用いた療法の際に、高い確率で副作用としての筋疾患を発生する患者を同定できる。
【００４５】
本発明はさらに、ヒトのＵＧＴ１Ａ３遺伝子内の少なくとも１つのＳＮＰ、殊にＳＮＰ ｒｓ５５７７２６５１、ｒｓｌ９８３０２３、ｒｓ５６３０４７１３、ｒｓ４５５０７６９１、ｒｓ３８０６５９７、ｒｓ３８０６５９６、ｒｓ３８２１２４２、ｒｓ６７０６２３２、ｒｓ６４３１６２５、ｒｓ１７８６８３３６、ｒｓ７５７４２９６； ｇ．１４６３５６ （ＡＦ２９７０９３内の遺伝子位置）、ｒｓ４５４４９９９５、並びにさらにＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３およびＵＧＴ１Ａ３*６ハプロタイプと連鎖不平衡であるＳＮＰを、スタチン治療の際の筋疾患の発生についての患者素因の測定のために用いる使用にも関する。
【００４６】
本発明のさらなる利点および特徴は、以下の記載および添付の図から明らかになる。
【００４７】
前述の特徴、および以下にさらに説明される特徴は、それぞれ上述の組み合わせだけでなく、別の組み合わせまたは単独でも、本発明の範囲を逸脱することなく使用可能であることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】人体中でのスタチン アトルバスタチンのバイオトランスフォーメーションについての概要である。
【図２】種々のＵＧＴアイソザイムの活性についてのグラフであり、これによればアイソザイム１Ａ３が、ＡＴＶのラクトン化に関して最高の活性を示す。
【図３】患者の試料内でのＵＧＴ１Ａ３タンパク質の分布についてのグラフ、およびアトルバスタチンのラクトン化の活性の、ヒトの肝臓内のタンパク質含有率に対する相関についてのグラフである（右）。
【図４】ヒトの肝臓内のＵＧＴ１Ａ３ハプロタイプの構造についての概要図である。
【図５】遺伝子型−表現型（ＵＧＴ１Ａ３−ｍＲＮＡについて）の相関である。
【図６】遺伝子型−表現型（ＵＧＴ１Ａ３−タンパク質について）の相関である。
【図７】遺伝子型−表現型（ＵＧＴ１Ａ３のラクトン化活性について）の相関である。
【００４９】
図１は、スタチン アトルバスタチンの代謝についての概要図を示し、名称の下部にその構造式が示されている。「ＨＭＧＣＲ」は、酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイム−Ａ−レダクターゼ−（ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ）についての略記であり、それはスタチンによって抑制される。
【００５０】
該図面から、酵素ＵＧＴ（および本発明者らが検出できたような、主にＵＧＴ１Ａ３）が、アトルバスタチン（ＡＴＶ）の、ＡＴＶ−ラクトン（図面の下−端、中央）へのラクトン化を担っていることが察知される。
【００５１】
さらに、図面において、シトクロムＰ４５０の酵素の亜群ＣＹＰ３Ａ（それはとりわけＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ５である）が、２−ヒドロキシアトルバスタチンまたは４−ヒドロキシアトルバスタチンのいずれかへのアトルバスタチンのヒドロキシル化を触媒するが、ただし、ＡＴＶラクトンのヒドロキシル化よりも効果が少ないことが示されている（反応を明示する矢印の太さの違いによって明示）。
【００５２】
図２は、棒グラフ（左； ２Ａ）内に、２つの異なる基質濃度の際（０．６μＭ、白色のバー、および６μＭ、黒色のバー）の種々の組み換えＵＧＴアイソザイムの測定された酵素活性を示す。これによれば、アイソザイム１Ａ１および１Ａ３のみが、ＡＴＶのラクトン化に関する測定可能な活性を有し、その際、より高い基質活性の際のＵＧＴ１Ａ３が、遙かにより高い活性を示す。反応速度パラメータであるミハエリス−メンテン定数Ｋｍおよび最大活性Ｖｍａｘは、組み換えＵＧＴ１Ａ３酵素を用いて、ラクトン化活性（ｖ）の測定によって、異なる基質濃度（ｃｓ）で計測され（右； ２Ｂ）、試験バッチおよびＶｍａｘについての結果は図２Ｃに示されている。
【００５３】
図３は、左（図３Ａ）に、ＩＫＰ−肝臓バンクの１５０の肝臓試料の母集団抜き取り検査におけるＵＧＴ１Ａ３タンパク質の分布ヒストグラムを示す。該ヒストグラムの下で、例としてはウェスタンブロット分析が示されている（図３Ｂ）。特異的な抗体で標識された５５ｋＤａのタンパク質バンドは、タンパク質のグリコシル化によって引き起こされる現象において、二重バンドとして現れる。ヒストグラムにおける上昇カーブは、累積頻度を示し、且つ、波括弧は、高められた活性で可能性のある副群を示唆する。右のグラフ（図３Ｃ）は、アトルバスタチンのラクトン化の、ヒトの肝臓内のタンパク質計測に対する相関を示している。該相関は、統計的に評価された。グラフ下のボックス内に、スピアマンの順位相関係数ｒsおよび統計上の有意性をｐ値として示す。
【００５４】
図４は、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子の構造についての概要を、エクソンに関して（黒いボックス１〜５）、肝臓試料において調査された突然変異のおよその位置と共に示す（グレー： プロモーター領域； 白： コーディング領域におけるサイレント突然変異； 黒： アミノ酸交換）。その下に、ヒトの肝臓試料における調査の際に同定された、ＵＧＴ１Ａ３ハプロタイプおよびハプロタイプ変異体を表す。このために、肝臓試料に属するＤＮＡ試料を、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子型同定法を用いて遺伝子型同定した。ＳＮＰデータ（上の領域において、ゲノム位置および／またはｒｓ番号で示される）を、引き続き、Ｐｒｏｇｒａｍｍ Ｐｈａｓｅ （Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１）を用いて分析した。下の領域に、それぞれ調査された位置に属する塩基を示す。
【００５５】
図５は、調査された人間の肝臓試料（ｎ＝１５０）における、ＵＧＴ１Ａ３ ｍＲＮＡについての遺伝子型と表現型との間の相関を示す。左のグラフ（図５Ａ）に、測定された遺伝子型のそれぞれの肝臓試料が有するｍＲＮＡ値を表す。右のグラフ（図５Ｂ）は、種々のＵＧＴ１Ａ３*２ ハプロタイプ変異体のｍＲＮＡ値を示す。有意差が、「マン-ホイットニー検定法」を用いて測定された。
【００５６】
図６は、調査された人間の肝臓試料（ｎ＝１５０）のミクロソームフラクションにおける、ＵＧＴ１Ａ３ タンパク質についての遺伝子型と表現型との間の相関を示す。左のグラフ（図６Ａ）に、測定された遺伝子型のそれぞれの肝臓試料が有するＵＧＴ１Ａ３タンパク質値を表す。右のグラフ（図６Ｂ）は、種々のＵＧＴ１Ａ３*２ ハプロタイプ変異体のタンパク質値を示す。有意差が、「マン-ホイットニー検定法」を用いて測定された。
【００５７】
図７は、調査された人間の肝臓試料（ｎ＝１５０）のミクロソームフラクションにおける、アトルバスタチンのラクトン化についての遺伝子型と表現型との間の相関を示す。左のグラフ（図７Ａ）に、測定された遺伝子型のそれぞれの肝臓試料が有するｍＲＮＡ値を表す。右のグラフ（図７Ｂ）は、種々のＵＧＴ１Ａ３*２ ハプロタイプ変異体のｍＲＮＡ値を示す。有意差が、「マン-ホイットニー検定法」を用いて測定された。
【００５８】
材料および方法
患者のＤＮＡおよび肝臓試料
肝臓組織および付随する血液試料は、ＩＫＰシュトゥットガルトに設立された人間の肝臓バンクのものである。該試料は、１９９９〜２０００年に、医学的な理由に基づき、肝臓の外科手術を受けた患者から取得された （Ｗｏｌｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ： Ｓｅｘ Ｉｓ ａ Ｍａｊｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ＣＹＰ３Ａ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ； Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００３， ３８：９７８〜９８８内に記載）。全ての組織試料は、病理学者によって調査され、且つ、それにより組織学的に正常な組織のみが使用されたことが保証された。臨床上の患者の資料は、完全に匿名化され、且つ、性別、年齢、医学的診断、薬剤療法、アルコールおよび喫煙習慣、および測定された肝臓値についてのデータが含まれた。肝炎、硬変または慢性アルコール中毒を有する患者の試料は除外された。定性的に有価なＲＮＡおよび完全な資料を供する、合計１５０の肝臓試料が、この調査のために使用された。ウェスタンブロットおよび酵素活性計測のために使用される肝臓ミクロソームは、標準的な方法に従って製造された （Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．： Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＹＰ２Ｂ６ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ； Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００１， １１：３９９−４１５内に記載）。遺伝子型調査のためのゲノムＤＮＡは、それぞれの組織寄贈者の血液試料から単離された。該調査のために、局地的な倫理委員会の際に、相応の票が得られた。該調査は、ヘルシンキ宣言に適合して行われ、全ての患者は文書によって同意した。
【００５９】
ＵＧＴ１Ａ３ ｍＲＮＡの測定
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用いて、肝臓組織から調製した。ＵＧＴ１Ａ３ ｍＲＮＡの定量化は、自己発生の（ｓｅｌｂｓｔｅｎｔｗｉｃｋｅｌｔ）、特異的なＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ−ＰＣＲ Ａｓｓａｙを用い、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、ＣＡ）において行われた。そのために、イントロン１にかかっているプライマー対 １Ａ３＿ｔｑ＿ｎｅｕ＿ｆ／ｒ（下記の表３を参照）およびＦＡＭ標識ＵＧＴ１Ａ３−ＭＧＢプローブを、濃度４００ｎｍｏｌ／ｌもしくは２００ｎｍｏｌ／ｌで使用した。ＵＧＴ１Ａ４に対する交差反応性を、テンプレートとしての両者の遺伝子のＤＮＡプラスミドを調べることによって排除した（データ示さず）。ＰＣＲ反応バッチは、２ｘ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、１２．５μｌの最終用量で含み、且つ、次のＰＣＲサイクル条件が使用された： ５０℃で２分間； ９５℃で１０分間、次に、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の段階で４０サイクル。
【００６０】
【表３】
【００６１】
位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号（Ａｃｃ． Ｎｕｍｂｅｒ） ＣＣＤＳ２５０９．１ （ＵＧＴ１Ａ３）、ＣＣＤＳ３３４０５．１ （ＵＧＴ１Ａ４）およびＣＣＤＳ３３４０４．１ （ＵＧＴ１Ａ５）を有するｃＤＮＡ配列（「ｃ位置」）に相応。
【００６２】
ミクロソームＵＧＴ１Ａ３タンパク質含有率の測定
ＵＧＴ１Ａ３タンパク質は、ウェスタンブロット分析を用いて、１５０の肝臓試料から定量化された。一次抗体として、単一クローン抗体（ａｂ５７４００、ａｂｃａｍ製）を使用した。二次抗体として、ヤギ抗マウス ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ （ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、且つ、ＯＤＹＳＳＥＹ赤外線画像化システム（ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出を行った。２０μｇのヒトの肝臓ミクロソームを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ ＳＤＳ分離ゲル）に供し、且つ、ニトロセルロースメンブレン上にブロットした。該ブロットを、３μｇ／ｍｌの抗ＵＧＴ１Ａ３と共に、１％のスキムミルク／ＴＢＳＴ内で２時間にわたり、インキュベートし、該インキュベート物を、二次抗体と共に、１％のスキムミルク（ＴＢＳＴ）中で１：１０，０００に薄め、引き続き、３０分間行った。
【００６３】
ウェスタンブロットは、肝臓からの、組み換えＵＧＴ１Ａ３について約５５ｋＤａで３つのバンドを、およびＵＧＴ１Ａ３について２つのバンドをもたらした。試料の脱グリコシル化後、両者の場合においてそれぞれ１つのバンドが残っていた。肝臓ミクロソームにおける定量化のために、バンドの強度を組み合わせた。
【００６４】
相対的な定量化を、ＯＤＹＳＳＥＹソフトウェアを用いて、組み換えＵＧＴ１Ａ３（ヒトのＵＧＴ１Ａ３−スーパーソーム； ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ； カタログ番号４５６４１３）の標準曲線（５点； ０．５〜８μｇ）に対して行った。種々のブロットからの結果を、それぞれのブロットの際に使用された、プールされたミクロソームの結果について規格化した。
【００６５】
抗体の特異性を、１０μｇの組み換えＵＧＴ１Ａ１、１Ａ４、１Ａ６、１Ａ９、２Ｂ４および２Ｂ９に対して試験した。ＵＧＴ１Ａ６、１Ａ９、２Ｂ４および２Ｂ９に関しては、交差活性を見出すことができず、ＵＧＴ１Ａ１および１Ａ４に対しては、最高感度で軽度の、しかしながらデータ解析を妨げない、交差活性が識別可能であった。
【００６６】
アトルバスタチンのラクトン化のためのＵＧＴ１Ａ３活性の測定
ヒトの肝臓ミクロソームによるアトルバスタチン−ラクトン形成の計測のために、ＬＣ−ＭＳアッセイを構築した：このために、２５μｇのミクロソームを、５０ｍＭのトリスＨＣｌ中、ｐＨ７．４で、５ｍＭの塩化マグネシウム、２５μｇ／ｍｌのアラメチシンおよび１０μＭのアトルバスタチンを総容量１００μｌで用いて、１０分間、３７℃で、予備インキュベートする。該反応を、１０ｍＭのＵＤＰ−グルクロン酸を、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）の補助基質に添加することによって開始させる。該試料を３０分間インキュベートした。反応を、冷たい、２５μｌの２５０ｍＭのギ酸をアセトニトリルに添加することにより停止させ、且つ、ボルテックスした試料をただちに氷上に置いた。ＬＣ／ＭＳ定量化を遂行できるように、１０μｌの内部標準を１００μｌの試料に対して添加した。試料を５分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、且つ、ＬＣ／ＭＳ計測のためにガラス容器中に添加した。
【００６７】
ＬＣ／ＭＳ法を用いて、アトルバスタチン、アトルバスタチン−ラクトン、並びにそのパラ−およびオルト−ヒドロキシ形を、５ｎＭ〜５μＭの範囲で組み合わせて定量化できる。該試料を、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８の、Ｃ８プレカラムを有する３．５μｍ−カラムにて、１ｍＭのギ酸−およびアセトニトリル−勾配を用いて、２３分間、３０℃で分離する。該計測を、ＨＣＴ Ｅｓｑｕｉｒｅ ｐｌｕｓ質量分析計によって検出するが、ただし、該カラムにより分離された物質の電気スプレーイオン化法による。
【００６８】
ＵＧＴ１Ａ座についての遺伝的分析
Ｃａｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００７）は、シーケンシングによって、７つのプロモーター、および１３のエクソン−１−ＳＮＰ（４つのシノニム）を、２４９の患者試料中で検出した。ＵＧＴ１Ａファミリーは、エクソン１においてのみ異なり、且つ、同一のエクソン２〜５を有した。この試みは、この記載された１８のプロモーター−およびエクソン−１−ＳＮＰ、加えて１つのフレームシフト−ＳＮＰをエクソン１（ｒｓ４５５８６０３５）中で検出するための方法を樹立することにある。このＳＮＰを含む４つの領域を、Ｑｉａｇｅｎ ＨｏｔＳｔａｒポリメラーゼを用いて、１０ｎｇのゲノムＤＮＡ内で、特異的にＵＧＴ１Ａ３だけの増幅を形成するプライマーを用いて増幅した。全てのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ増幅プライマー（上記表１参照）は、より効率的な増幅を可能にするために、５’「タグ」配列（ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧ）を有していた （ソフトウェアＭａｓｓＡｒｒａｙ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ （ｖ３．０．０）の推奨）。高い特異性を保証するために、並びに高い収量を達成するために、特別なＰＣＲプロトコルを使用した：３８４ウェルのマイクロタイタープレート内のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲバッチ（容積５μＬ）は、１０ｎｇの予備乾燥されたＤＮＡ、ＨｏｔｓｔａｒＴａｑポリメラーゼを有する４μｌの「ＨｏｔｓｔａｒＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）、０．１μＭの各増幅プライマー（上記表１を参照）および０．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｑｉａｇｅｎ）を含んでいた。ＰＣＲ条件（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、ＣＡ）は、以下の通りであった：９５℃で１５分間の変性、次に、９５℃で２０秒間、６５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の段階で５サイクル； 次に、９５℃で２０秒間、６２℃で３０秒間および７２℃で１分間の段階で４０サイクル； 次に、７２℃で１０分間の最終の伸長段階。特異性を確認するために、試料中のこの断片をシーケンシングし、且つ、いくつかの試料のＰＣＲ生成物を、常時、アガロースゲル上で、正確な増幅に関して、且つ水の汚染がないように制御して、試験した。
【００６９】
この断片の増幅後、過剰なｄＮＴＰｓを、最終容積７μｌで、０．３μｌのＳＡＰ（１．７Ｕ／μｌ）と共に、０．１７μｌの１０×ＳＡＰ緩衝剤（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、サンディエゴ、ＣＡ）および１．５３μｌの水中で、３７℃、２０分間、次に、１０分間８５℃で、そして２０℃で１秒間、脱リン酸化した。
【００７０】
ＳＮＰ位置の直前で終わる特異的なプライマーが設計された（上記表２参照）。増幅段階において、それをその都度、ＳＮＰ塩基に合う、標識された塩基についてのみ伸長した。アッセイのプライマーを、その生成物が質量の点で少なくとも１５Ｄａ異なるように設計した。検出可能な質量は、３０００〜８５００Ｄａの範囲内である。
【００７１】
特異的な増幅プロトコルを、ｉＰｌｅｘ酵素並びに特異的な緩衝剤条件と共に、この段階のために使用した：
プライマーの質量が６０００Ｄａより低いか高いかによって、シグナルノイズ比を最適に調整するために、０．２μｌのｉＰＬＥＸ緩衝剤の添加後、０．２μＬのｉＰＬＥＸ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｍｉｘ、および０．０４１μｌのｉＰＬＥＸ酵素 （ｉＰＬＥＸ Ｇｏｌｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を、０．０１１２もしくは００２４４μｌの伸長プライマー（５００μＭに）添加する。伸長反応の条件は以下の通りであった：９４℃で３０秒間、次に、５２℃で５秒間および８０℃で５秒間の５つのサブサイクルを有する、９４℃で５秒間の段階で４０サイクル； ７２℃で３分間の最終の伸長段階。
【００７２】
妨げになるナトリウムおよびカリウム付加物を回避するために、その都度、６ｍｇのＣｌｅａｎ Ｒｅｓｉｎ （Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）および１６μｌの水を添加することによって試料を脱塩した。室温で２０分のインキュベーション後、２０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、該試料を、ナノディスペンサーを使用しながら３８４ ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）Ａｒｒａｙｓ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）に適用し、且つ、ＭａｓｓＡｒｒａｙ（商標）Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ （Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）において分析した。オートメーション化されたスペクトル記録を、ＭａｓｓＡｒｒａｙ Ｔｙｐｅｒソフトウェアｖ ３．４．を用いて、ソフトウェアＳｐｅｃｔｒｏａｃｑｕｉｒｅおよびＤａｔｅｎａｎａｌｙｓｅを用いて実施した。自動式で分類されない試料は、マニュアルで後分析された。
【００７３】
統計およびコンピュータ支援分析
遺伝的データの評価を、公に利用できるプログラムを用いて行った。肝臓バンクの母集団における、観察されたおよび期待される対立−および遺伝子型頻度を、ハーディ−バインベルク平衡からのずれについて、オンラインで使用可能な ＤｅＦｉｎｅｔｔｉ Ｐｒｏｇｒａｍｍｓを用いて試験した （Ｓｔｒｏｍ ＴＭ ａｎｄ Ｗｉｅｎｋｅｒ ＴＦ、ハーディ−バインベルク平衡についてのＤｉＦｉｎｅｔｔｉ Ｐｒｏｇｒａｍホームページ； ｈｔｔｐ：／／ｉｈｇ．ｇｓｆ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｗ／ｈｗａｌ．ｐｌ）。ハロタイプの計算を、ＰＨＡＳＥ Ｐｒｏｇｒａｍｍｓ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ｖ２．１．１ （Ｔｈｅ Ｍａｔｔｈｅｗ Ｓｔｅｐｈｅｎｓのホームページ； ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｐｈｅｎｓｌａｂ．ｕｃｈｉｃａｇｏ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）を用い、並びにＨａｐｌｏｖｉｅｗ ｖ．３．３２ （Ｔｈｅ Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｈａｐｌｏｖｉｅｗホームページ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍｐｇ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗ／）を使用しながら実施した。
【００７４】
統計的な分析を、統計プログラムＰｒｉｓｍ ４、Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０３ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて実施した。スピアマンの順位相関係数を、ｍＲＮＡ、タンパク質および活性データの相関分析のために測定した。ハプロタイプの群間差を、「マン−ホイットニー検定法」を用いて測定した（パラメトリックではないＴ−試験）。全ての統計試験を、二面的に行い、且つ、統計的有意性はＰ＜０．０５として定義した。
【００７５】
結果
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を使用して、ＡＴＶのヒドロキシル化およびＡＴＶのラクトン化の際の個々の組み換え発現ＣＹＰ−およびＵＧＴ−酵素の役割を調査した。この際、１５０の良好に文書化された外科の肝臓試料を有する、ヒトの肝臓組織のための大きなバンクを使用して、肝臓内でＡＴＶのラクトン化を主に担っているＵＧＴアイソザイムを同定できた。さらに、ＡＴＶのバイオトランスフォーメーションを担っている、関連ＵＧＴ遺伝子のＳＮＰ並びにハプロタイプを同定するために、遺伝的分析を行った。
【００７６】
ＡＴＶのヒドロキシル化のための主酵素としてのＣＹＰ３Ａ４の同定
最も重要な薬剤代謝ＣＹＰ酵素の中で、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との両者のアイソザイムを有する、シトクロムＰ４５０のＣＹＰ３Ａ亜群は、ＡＴＶのヒドロキシル化を触媒する唯一の関連Ｐ４５０酵素である。ＣＹＰ３Ａ４の触媒活性は、共発現シトクロムｂ５と比較して数倍増強されており、前記シトクロムｂ５は、ＣＹＰ３Ａ４バイオトランスフォーメーションの公知の触媒増強剤である。
【００７７】
ＡＴＶのラクトン化のための主酵素としてのＵＧＴ１Ａ３の同定
図２Ａは、種々の組み換えＵＧＴ酵素の下で、ＵＧＴ１Ａ３が、ＡＴＶのラクトン化の触媒化について最も高い特異的な活性を有する酵素であることを示す。これに対して、ＵＧＴ１Ａ１は低い活性しか持っていない。反応速度分析により、組み換えＵＧＴ１Ａ３について、アトルバスタチン−ラクトンの形成についてのＫｍ値が１２μＭであることが判明した （図２ＢおよびＣ）。
【００７８】
１５０の肝臓試料からのＵＧＴ１Ａ３タンパク質データは、５３０倍の変異性、および異常分布を示し、並びに、より高い活性を有する副群の存在可能性を示した （図３Ａ参照）。ミクロソームＵＧＴ１Ａ３のラクトン化活性は、１５０の肝臓試料内で２０倍の変異性を示した。ラクトン化は、ＵＧＴ１Ａ３のウェスタンブロットのタンパク質データとよく相関し（図３Ｂ参照）、且つ、リアルタイムＰＣＲ分析の定量的なＵＧＴ１Ａ３ ｍＲＮＡデータともよく相関した （ｒｓ＝０．３８； Ｐ＜０．０００１； データ示さず）。
【００７９】
遺伝分析
ＵＧＴ１Ａ座のＳＮＰについての選択性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦアッセイを用いて、肝臓試料に属するＤＮＡ試料内で測定した （ｎ＝１９、図４参照）。さらに、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子型を別途測定した。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗを用いて示され得る通り、ＳＮＰの間で、連鎖不平衡が存在する。その連鎖は、ＵＧＴ１Ａ１*２８対立遺伝子のキャリアが、ほとんどの場合、ＵＧＴ１Ａ３*２対立遺伝子のキャリアでもあるというものであり、即ち、高められたＵＧＴ１Ａ３発現によって引き起こされる、アトルバスタチンの高められたラクトン化能力は、ＵＧＴ１Ａ１*２８についての遺伝子型同定を用いても予測される。
【００８０】
ｍＲＮＡのレベル、タンパク質のレベル、およびアトルバスタチンのラクトン化のレベルについての、ＵＧＴ１Ａ３についての遺伝子型と表現型との相関についての分析を、図５〜７に示す。ＵＧＴ１Ａ３*２−、*３−および*６−ハプロタイプは、ハプロタイプの最も広く行き渡った変異体であった。３つのハプロタイプの全ては、著しく高められたＵＧＴ１Ａ３タンパク質発現を示した （図５参照）。ＡＴＶのラクトン化のための活性は、ホモ接合体の*２キャリアの際に、野生型の試料と比較して２倍高められていた。*３および*６ハプロタイプのキャリアは、高められたラクトン形成を示さなかった。その際、試料数が*２キャリアの際よりも少なく、且つ、ヘテロ接合体キャリアのみが同定され得ることを考慮すべきである。従って、ホモ接合体キャリアの際、酵素活性に及ぼす効果が計測可能であることができた。従って、当該図５〜７におけるデータは、変異体と、高められた機能とが関連づけられることを明らかに示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アトルバスタチンを用いて患者を治療する際の、筋疾患発生についての、および／または変化したバイオトランスフォーメーションについての患者素因の測定方法であって、患者の生体試料において、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子（ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子 １Ａ３）中での、少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在、および／または高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現を測定する、測定方法。
【請求項２】
以下のハプロタイプ、変異体*２ａ、*２ｃ、*２ｄを有するＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３またはＵＧＴ１Ａ３*６を測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＵＧＴ１Ａ３遺伝子において、以下のＳＮＰ：
ｒｓ５５７７２６５１、ｒｓ１９８３０２３、ｒｓ５６３０４７１３、ｒｓ４５５０７６９１、ｒｓ３８０６５９７、ｒｓ３８０６５９６、ｒｓ３８２１２４２、ｒｓ６７０６２３２、ｒｓ６４３１６２５、ｒｓ１７８６８３３６、ｒｓ７５７４２９６、ｇ．１４６３５６ （ＡＦ２９７０９３中での遺伝子位置）、ｒｓ４５４４９９９５
の少なくとも１つを測定することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの、ＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３、およびＵＧＴ１Ａ３*６ハプロタイプと連鎖不平衡であるＳＮＰを測定することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現を、高められたｍＲＮＡレベル、高められたタンパク質レベル、および／または酵素活性レベルを介して測定することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのＳＮＰの検出のために、付属の配列プロトコルからの配列ＩＤ番号１ないし２７を有するオリゴヌクレオチドから選択されるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのＳＮＰの測定のために、以下の方法：
ＰＣＲに基づく方法、ＤＮＡシーケンシング法、ハイブリダイゼーション法、質量分析、ＨＰＬＣ法、プライマー伸長法
の少なくとも１つを使用することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
筋疾患が、ミオパシーおよび横紋筋融解症から選択されることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法においてＳＮＰを検出するためのオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが付属の配列プロトコルからの配列ＩＤ番号１ないし２７を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つから選択されていることを特徴とする、オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
アトルバスタチンを用いて患者を治療する際の筋疾患発生についての患者素因を測定するための診断キットであって、該キットが請求項８に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを有する診断キット。
【請求項１１】
アトルバスタチン治療の際の、筋疾患発生についての患者素因、および／または変化したバイオトランスフォーメーションについての患者素因の測定のための、ヒトのＵＧＴ１Ａ３遺伝子中での少なくとも１つのＳＮＰの使用。
【請求項１２】
ＳＮＰが、以下：
ｒｓ５５７７２６５１、ｒｓ１９８３０２３、ｒｓ５６３０４７１３、ｒｓ４５５０７６９１、ｒｓ３８０６５９７、ｒｓ３８０６５９６、ｒｓ３８２１２４２、ｒｓ６７０６２３２、ｒｓ６４３１６２５、ｒｓ１７８６８３３６、ｒｓ７５７４２９６、ｇ．１４６３５６（ＡＦ２９７０９３中での遺伝子位置）、ｒｓ４５４４９９９５
の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ＳＮＰが、ＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３およびＵＧＴ１Ａ３*６ハプロタイプと連鎖不平衡であるＳＮＰから選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１】
アトルバスタチンを用いて患者を治療する際の、筋疾患発生についての、および／または変化したバイオトランスフォーメーションについての患者素因の測定方法であって、患者の生体試料において、ＵＧＴ１Ａ３遺伝子（ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子 １Ａ３）中での、少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在、および／または高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現を測定する、測定方法。
【請求項２】
以下のハプロタイプ、変異体*２ａ、*２ｃ、*２ｄを有するＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３またはＵＧＴ１Ａ３*６を測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＵＧＴ１Ａ３遺伝子において、以下のＳＮＰ：
ｒｓ５５７７２６５１、ｒｓ１９８３０２３、ｒｓ５６３０４７１３、ｒｓ４５５０７６９１、ｒｓ３８０６５９７、ｒｓ３８０６５９６、ｒｓ３８２１２４２、ｒｓ６７０６２３２、ｒｓ６４３１６２５、ｒｓ１７８６８３３６、ｒｓ７５７４２９６、ｇ．１４６３５６ （ＡＦ２９７０９３中での遺伝子位置）、ｒｓ４５４４９９９５
の少なくとも１つを測定することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの、ＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３、およびＵＧＴ１Ａ３*６ハプロタイプと連鎖不平衡であるＳＮＰを測定することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
高められたＵＧＴ１Ａ３遺伝子発現を、高められたｍＲＮＡレベル、高められたタンパク質レベル、および／または酵素活性レベルを介して測定することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのＳＮＰの検出のために、付属の配列プロトコルからの配列ＩＤ番号１ないし２７を有するオリゴヌクレオチドから選択されるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのＳＮＰの測定のために、以下の方法：
ＰＣＲに基づく方法、ＤＮＡシーケンシング法、ハイブリダイゼーション法、質量分析、ＨＰＬＣ法、プライマー伸長法
の少なくとも１つを使用することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
筋疾患が、ミオパシーおよび横紋筋融解症から選択されることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法においてＳＮＰを検出するためのオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが付属の配列プロトコルからの配列ＩＤ番号１ないし２７を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つから選択されていることを特徴とする、オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
アトルバスタチンを用いて患者を治療する際の筋疾患発生についての患者素因を測定するための診断キットであって、該キットが請求項８に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを有する診断キット。
【請求項１１】
アトルバスタチン治療の際の、筋疾患発生についての患者素因、および／または変化したバイオトランスフォーメーションについての患者素因の測定のための、ヒトのＵＧＴ１Ａ３遺伝子中での少なくとも１つのＳＮＰの使用。
【請求項１２】
ＳＮＰが、以下：
ｒｓ５５７７２６５１、ｒｓ１９８３０２３、ｒｓ５６３０４７１３、ｒｓ４５５０７６９１、ｒｓ３８０６５９７、ｒｓ３８０６５９６、ｒｓ３８２１２４２、ｒｓ６７０６２３２、ｒｓ６４３１６２５、ｒｓ１７８６８３３６、ｒｓ７５７４２９６、ｇ．１４６３５６（ＡＦ２９７０９３中での遺伝子位置）、ｒｓ４５４４９９９５
の少なくとも１つから選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ＳＮＰが、ＵＧＴ１Ａ３*２、ＵＧＴ１Ａ３*３およびＵＧＴ１Ａ３*６ハプロタイプと連鎖不平衡であるＳＮＰから選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５２１２０２（Ｐ２０１２−５２１２０２Ａ）
【公表日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０１２０７（Ｐ２０１２−５０１２０７）
【出願日】平成２２年２月２３日（２０１０．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５２２４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０８７３７
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３１６６５）ローベルト ボッシュ ゲゼルシャフト フュア メディツィニッシェ フォルシュング ミット ベシュレンクテル ハフツング (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｒｏｂｅｒｔ Ｂｏｓｃｈ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｅｒ ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ａｕｅｒｂａｃｈｓｔｒ． １１２， Ｄ−７０３７６ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２３日（２０１０．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５２２４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０８７３７
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３１６６５）ローベルト ボッシュ ゲゼルシャフト フュア メディツィニッシェ フォルシュング ミット ベシュレンクテル ハフツング (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｒｏｂｅｒｔ Ｂｏｓｃｈ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｅｒ ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ａｕｅｒｂａｃｈｓｔｒ． １１２， Ｄ−７０３７６ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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