アナライトを連続的に検出するための方法、使用される３官能性検出試薬及び検出デバイス
本発明は、アナライトの不均一相（heterogeneous-phase）検出のための方法、前記方法を実行するために使用する３官能性検出試薬、アナライトを検出するためのその使用、そしてまた同様に対応するアナライトを検出するためのデバイスに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アナライトの連続不均一相（heterogeneous-phase）検出のための方法、この方法において使用する３官能性検出試薬、アナライトを検出するためのその使用、並びにアナライトを検出するための対応するデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、実験室条件下において、アナライト及び特に分子を検出することに関して多くの技術がある。しかし、ますます頻繁に、特に健康上や安全上の理由のために、関心のある化合物（トキシン、化学毒性化合物、ホルモン、など）、もしくは関心のある分子から誘導されるまたは関連のある産物、あるいは事象（event）のまたは特定の活性（農薬、重金属、ホルモンなど）のマーカーの存在を迅速に検出することが必要である。
【０００３】
これらの分子は、水、空気、土壌または生物学的試料のような非常に多様なメディウム（media）中、そのほかには食品中に存在し得る。
【０００４】
最適な保護及び／またはモニタリングのために、これらの分子の検出はリアルタイムで及び連続的に行われるべきである。用語「連続的なアッセイ（continuous assaying）」は、メディウム中の関心の深い分子の濃度の存在及び変化を永久的にモニターすることを可能にし得るアッセイを意味すると意図される。
【０００５】
これらの化合物（アナライト）を検出するために今日までに使用される非常に多くの技術において、多くが、ある物質が有する特性、これらのアナライトに特異的に結合して複合体を形成する特性を利用している。これらの物質（これらは「受容体（receptor）」と呼ばれる）は、性質が非常に多様であり得る：生物学的なもの（全体、断片化または組換え型の抗体（Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）、受容体、ポリ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ペプチド核酸、レクチン、輸送タンパク質）または化学物質（キレート、合成受容体）。これらの物質の中で、抗体が最も広く用いられている。
【０００６】
このような検出方法では、シグナルによって、検出されるアナライトと受容体が反応した後に形成される複合体を定量または検出するため、標識が必要である。この標識は、アナライトまたはアナログもしくはアナライトの断片に対応する物質（Ｂ）または受容体のいずれかによって保有され得、この標識分子は、しばしばトレーサーと呼ばれる。
【０００７】
技術が、形成した複合体と遊離している物質の分離を必要とするかしないかによって、均一相（homogeneous-phase）または不均一相（heterogeneous-phase）と呼ばれる２つの主要な検出タイプに分けられる。
【０００８】
均一相アッセイは同じメディウム（medium）で行われる。これらは、複合体の形成が受容体または分子（Ｂ）により保有されるシグナルを変化させる時に用いられる：次に、複合体の形成は、シグナルの測定により直接モニターされ得る。これらの分析は分離工程を必要とせず、それらがより迅速に自動化されることを可能にする。
【０００９】
不均一相アッセイは、アナライトと受容体が反応した後に、非複合体のトレーサーと複合化に関わっているものとを分離することからなる工程を含む。この分離は２つのメディウム（media）または相：例えば固相と液相、を用いてしばしば行われる。
【００１０】
これらの基本的な原理に基づいて、特に使用する標識（例えば酵素的、放射性、またはルミネッセント）の性質について異なる多くのアッセイ方法が、記載されている（Grassi J. et al., Handbook of Experimental Pharmacology, Ed. Springer-Verlag, Berlin, 1987, 87, Chapter 5; Pelizzola D. et al., Q J Nucl. Med., 1995, 39(4) 251-263）。
【００１１】
これらにおいて、ルミネッセント化合物で標識することは、酵素標識の場合のように、他の試薬の存在を必要としない局在化シグナルが得られるという利点を有する。このタイプの標識はまた、エネルギー移動のような現象を使用することも可能とし、これは様々なメカニズム：共鳴エネルギー移動、放射性エネルギー移動（受容体は供与体により放出される光を吸収する）、電子移動に従い行われ得る（Matko J. et al., Biochemistry, 1992, 31, 703-711; Nikoobakht B. et al., Photochemistry and Photobiology, 2002, 75, 591-597）。
【００１２】
このエネルギー移動（ルミネッセント「ドナー」化合物（Ｄ）とルミネッセントであり得るかまたはあり得ない「アクセプター」化合物（Ａ）の間の、そしてＡとＤの距離に依存する）は、多くの分析を行うために使用されてきた。Ｄ及びＡ（これらは受容体またはアナライトと結合する）は、受容体／アナライト複合体が形成された時にのみにエネルギー移動が起こるように選択される。この現象は、Ｄが励起された時、Ｄのルミネッセンスが減少または消滅し、そしてＡからのルミネッセンスが発せられること（仮に後者がルミネッセントであるならば）により反映される。これらの分析においては、Ａのルミネッセンスの変化またはＤのルミネッセンスの変化が測定され、Ａ及びＤの性質が変化する。
【００１３】
このように、様々な著者がすでにＡのルミネッセンスを測定することによりアナライトを検出する方法を提案している：
− 例えば、R. Aral et al.により記載された方法（Protein Engineering, 2000, 13(5), 369-396）は、ドナー及びアクセプターとして、２つの蛍光タンパク質を使用している。これらの２つのタンパク質は分子生物学により製造され、それぞれ、同一の抗体の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のいずれかでそれぞれキメラタンパク質を形成する。抗体が向けられる（directed）分子が存在すると、２つのキメラタンパク質の複合体の形成を誘発する。そして、２つの蛍光タンパク質の距離はエネルギー移動と矛盾しない；ゆえに、Ｄを励起するとＡから蛍光が生じ、これが測定される；
− 国際出願番号ＷＯ９６／４２０１６に従うと、希土類金属（ユーロピウム、テルビウム）とキレート、クリプタートまたはマクロサイクルの錯体（ドナーとして）と蛍光タンパク質（アクセプターとして）を使用し得る。Ａ及びＤはアナライト上で同時に複合化し得る２つの受容体に結合し得、そして後者の存在は、Ｄが励起された時にＡからのルミネッセンスの放出により反映され、あるいはＡが受容体と結合し、及びＤがアナライトと結合し、そしてアナライトが存在すると、受容体と複合化するために、Dと結合したアナライトとの競合を誘発し（競合アッセイ）、そして、Ａのルミネッセンスは添加されたアナライト量に反比例する。このタイプのアッセイはタイム−リソルブドルミネッセンスアッセイ分析（time-resolved luminescence assay）と称される。
【００１４】
他の著者もまた、Dのルミネッセンスを測定することによりアナライトを検出する方法について提案している。これらのアッセイは、（これら化合物が十分に接近している場合）化合物（Ａ）がもう一方の化合物（Ｄ）のルミネッセンスを減少または抑制（「クエンチ（quench）」）する能力を利用している。ゆえに使用し得る分子Ａの範囲は広く、そして重金属、重原子、化学分子（例えばメチルレッド）、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ社（米国）により商品名Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）として販売されているものようなナノ粒子、あるいは商品名ＤＡＢＣＹＬ（登録商標）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ベルギー）、ＱＳＹ Ｄｙｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、米国）、ＥｌｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｏｓｗｅｌｌ／Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）またはＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（登録商標）（Ｂｉｏｓｅａｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、米国）として発売されている分子のような非ルミネッセンス化合物を含む。
【００１５】
例として：
− 米国特許第３９９６３４５号は、受容体として抗体を使用するアッセイにおいて、蛍光／「クエンチャー」分子のペアを使用した方法を記載する；
− M. Adamczyk et al.（Organic Letters, 2001, 3, 1797-1800）により提案された方法は、ドナーとしてバイオルミネッセントタンパク質（Aequorine（登録商標））及びアクセプターまたは「クエンチャー」としてＱＳＹ−７またはＤａｂｃｙｌ（登録商標）を使用している。Ｄはビオチン分子と結合し、そしてＡはアビジン分子と結合する。ビオチン／アビジン複合体の形成はＤのバイオルミネッセンスの減少を生じ、遊離ビオチンまたはタンパク質と結合したビオチンが存在すると、アビジンとの複合化のために、Ｄと結合したビオチンとの競合が誘発され、そしてＤのバイオルミネッセンスは添加したビオチン量と比例する；
− M. Lee et al.（J. Agr. Food Chem., 1999, 47, 2766-2770）及びSchobel et al.（Bioconjugate Chem., 1999, 10, 1107-1114）はドナー及び「クエンチャー」として２つの蛍光分子を使用することを記載している。ドナーは抗体と結合し、及びアクセプターはアナライトと結合する。上記のように、抗体−Ｄ／アナライト−Ａ複合体が形成されるとDの蛍光が減少し、これはメディウム（medium）中にアナライトが存在すると回復する；
− B. Dubertret et al.（Nature Biotechnology, 2001, 19, 365-370）及びBonnet et al.（Proc. Natl. Acad. Sci., 1999, 96, 6171-6176）は、それ自身をフォールディングすることによりそれ自身とハイブリダイズする特性を有するポリ核酸（「ビーコン（beacon）」）を使用することを記載している。その文献に記載される方法に従うと、フルオロフォア化合物（Ｄ）はポリ核酸の３’末端に付着し、及び、アクセプター（Ａ：ナノ粒子またはＤａｂｃｙｌ（登録商標））は５’末端に付着する。「ビーコン」の２つの末端は近接しているため、Ｄの蛍光はＡにより減少される。「ビーコン」の部分とハイブリダイズし得るポリ核酸（アナライト）が存在すると、後者（the latter）の線形化を誘発し、ゆえにDとAの距離が増加し、そして、ＡによるDの蛍光のクエンチングを減少する；
− 米国特許第５２７９９４３号には、重原子をルミネッセンスの「クエンチャー」として使用するアナライトの検出方法が提案されている；
− 米国特許第５２２９３０２号には、メディウム中のアナライトを検出する方法が記載され、ここで化合物は配位子またはそれらのアナログと結合し、抗体／配位子複合体が形成される時、これは、２８０nmで励起した時に抗体により放出される蛍光をクエンチする。メディウム中にアナライトが存在すると、抗体と複合体化の競合が生じ、そして抗体の蛍光を回復する；
− C.T. Chen et al.（Science, 1998, 279, 851-852）は、フルオロフォア及びクエンチャーが付着する合成受容体による、メディウム中のアナライトの検出方法について記載している。アナライトが存在しない場合、クエンチャーはその蛍光を減少するフルオロフォアと十分に近接している。受容体上でアナライトが複合化すると、クエンチャーとフルオロフォアの距離は広がり、そして後者の蛍光が増加する。
【００１６】
上記のエネルギー移動を用いた全てのアッセイは、均一相分析であるということに気づくべきである。
【００１７】
現在、アナライトを連続的に検出することに関して、フローアッセイが適していることが明らかにされており、これは、それらが試料を永久的に供給することを可能にするためである。
【００１８】
そして、フローアッセイのいくつかのタイプがすでに記載されている：
− 何人かの著者は、特に、キャピラリーの壁に固定した抗体を用いてアナライトをアッセイする方法について提案しており、この抗体は標識されたアナライトまたは標識されたこれらのアナログで飽和される。そして、アナライトをキャピラリーに通すと、抗体と結合するために標識されたアナライトとの競合が誘発される。そして、標識されたアナライトの特定の量が放出され、それがキャピラリーから出る時に検出される（特に、米国特許第５１８３７４０号及び第６３２３０４１号及びSheikh et al., Biosensor & Bioelectronics, 2001, 16, 647-652を参照）；
− 逆に、C. Barzen et al.（Biosensor & Bioelectronics, 2002, 17, 289-295）は、検出されるアナライトまたはアナライトのアナログが固定化される固相を用いたアナライトの検出方法について記載している。検出されるアナライトを含む可能性のある試料を標識された抗−アナライト抗体と共にプレインキュベートする。この溶液が固相上を通過する時、複合化していない抗体は、固定されたアナライトを介して固相に付着する。ゆえに、固相上で測定した蛍光シグナルは、試料に存在するアナライト量に反比例する。
【００１９】
− T.E. Plowman et al.（Anal. Chem., 1999, 71, 4344-4352）は、同一の固相上で様々なアナライトを同時にアッセイするアッセイ方法について開発している。この方法に従うと、様々なアナライトを認識する抗体を固相上の異なる場所に固定する。試料（様々なアナライトを含む）とフルオロフォアで標識された様々な抗−アナライト抗体を含む溶液を固相上に付着させる。最終的に、様々な抗体固定部分に対応する捕獲用抗体（capture antibodies）、アナライト及びトレース抗体（trace antibodies）の複合体由来の蛍光を測定する。これまでのアッセイのように、これは試薬を永久的に供給することを含むので、アナライトと標識抗体を混合する必要性が、この方法を連続的なアッセイに応用することを困難にする；
− F.S. Ligler et al.（Environmental Science & Technology, 1998, 32, 2461-2466）は、空気中に存在する分子を検出するためのバイオセンサーを開発した。このバイオセンサーは、アビジン分子が結合する繊維からなる。ビオチン化（biotinylated）抗−アナライト抗体は、アビジン／ビオチン複合体を介してこの繊維に固定される。この繊維の上に試料（空気中に存在し、緩衝液に溶解させた分子）、次にフルオロフォアで標識した抗−アナライト抗体を通過させることにより検出を行う。最終的に、捕獲用抗体、アナライト及びトレース抗体の複合体由来の蛍光を測定する。しかし、この方法を行うためには様々な工程が必要であり、そして標識された抗体を供給すること（これは永続されるべき）は、実際の連続的な検出を可能にしない。
【００２０】
従って、現在までに利用できる全てのフローアッセイは不均一相（固相／液相）アッセイであるということは、先行技術にある様々な既知の検出方法の記載により明らかである。実際、均一相フローアッセイは、標識されたアナライト及び／または受容体の連続した供給を要するであろうし、これは、実行するには高価で及びより難しいであろう。
【００２１】
最終的に、不均一相アナライトアッセイを行うためにキャピラリーを使用することはまた、いくつかの改変（variants）に応じて行われ得る方法に従って、特に米国特許第５９７６８９６号に、提案されている：
− この方法の第１の改変（variant）に従うと、検出されるアナライトに対する最初の受容体を、キャピラリーの内表面に固定する。アナライトを含む試料は、蛍光化合物で標識された第２の受容体（キャピラリーに付着させた最初の受容体と同一の結合部位を有しない）とプレインキュベートする。反応後、この溶液をキャピラリーに導入する；そして、アナライト／標識受容体複合体は、最初の受容体に結合することによりキャピラリー表面に付着する。洗浄後、蛍光シグナル（これは試料中のアナライト量に比例する）を測定する；
− この方法の第２の改変（variant）に従うと、アナライトのアナログをキャピラリーの内表面に固定する。検出されるアナライトを含む試料（アナライトを蛍光化合物で標識するために、あらかじめ受容体とプレインキュベートした）をキャピラリーに導入する。標識された受容体に結合するための競合が、キャピラリーの表面に付着させたアナライトと試料中に存在し得るアナライトとの間で生じる。洗浄後、蛍光シグナル（これは試料中に存在するアナライト量に反比例する）を測定する；
− この方法の第３の改変（variant）に従うと、検出されるアナライトに対する受容体をキャピラリーの内表面に固定する。アナライトを含む試料は、標識されたアナライト、または蛍光化合物により標識したこのアナライトのアナログとあらかじめ混合し、キャピラリーに導入する。次に、キャピラリーの表面に付着した受容体に結合するための競合が、標識された化合物と試料のアナライトとの間で生じる。洗浄後、蛍光シグナル（これは試料中のアナライト量と反比例する）を測定する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
これらのアッセイにおける様々な工程（インキュベート、洗浄）及びアナライトと標識化合物を混合する必要性は、これは試薬を永久的に供給することを含むため、このアッセイを連続アッセイに応用することを困難にしている。
【００２３】
さらに、上述したアナライトの不均一相検出のための全ての方法はほとんどの場合に、新しい試料中の何らかのさらなるアナライトの検出を行うことを可能にする前に行われる固相を再生するという別工程を必要とする。従って、固相を再生するというこの制限される工程は、メディウム中のアナライトを連続的に検出するこれらの様々な方法の応用を妨げる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
そのため、全てのこれらの欠点を改善し、特にアナライトの不均一相検出のための方法（これは実行することが単純であり、自動化し得、固相再生工程がアナライトの検出工程と同時に行われ得、そしてこれは後者を妨げることがない）を提供するために、本発明者は本発明の主題について開発した。
【００２５】
本発明者はまた、検出工程の前に、アナライトと標識抗体または標識アナライトとのインキュベーションを避けられるアナライトの不均一相検出のための方法において用いられ得る新規の試薬を提供することも目的とした。
【００２６】
ゆえに、本発明の第１の主題は、流体試料中のアナライトａを検出するための方法であり、それは次の工程を含むことを特徴とする：
１）以下の３つの官能性極：
ｉ）ルミネッセント基（Ｌ）、
ｉｉ）アナライトａ、アナライトａのアナログまたはアナライトａの断片から選択される分子（Ｂ）；及び
ｉｉｉ）固体支持体の表面に３官能性試薬の付着をもたらす官能基、
を含む少なくとも一つの３官能性試薬（トライポッドＹ）を、その表面の少なくとも一部上に含む固体支持体を、アナライトａに対する受容体で飽和する工程（該受容体は基Ｌのルミネッセンスをクエンチする化合物（Ｑ）（受容体−Ｑ）で標識されて、該分子（Ｂ）と該受容体−Ｑとの複合体Ｃを形成する）；
２）工程１）で得た該固体支持体を、検出されるアナライトａを含み得る流体試料と接触させる工程；
３）基Ｌにより放出されるシグナル強度を測定する工程（これは流体試料に存在するアナライトａの量に比例する）；および
４）該固体支持体を受容体−Ｑに接触させることにより該固体支持体を再生する工程。
【００２７】
この方法に従うと、工程１）では、分子（Ｂ）と受容体−Ｑの複合化を可能にする。この第１工程の最後に、Ｌのルミネッセンスは減少または抑制される。工程２）において、試料を固体支持体の表面に接触させると、該試料がアナライトａ含有する場合は、受容体−Ｑと複合体を形成するために、アナライトａと分子（Ｂ）間の競合を誘発する。アナライトａが受容体−Ｑに結合すると、受容体−Ｑは固体支持体の表面から排除され、そして、トライポッドＹ上に存在する化合物（Ｌ）から放出されるルミネッセンスが回復する。次いで、工程３）で測定されるシグナルの強度は、分析される試料に存在するアナライトａ量に比例する。再生工程４）では再び、トライポッドＹ上の受容体−Ｑを複合化し、そしてＬのルミネッセンスを抑制し、これにより、新しい試料中のアナライトａをさらに検出することが可能になる。
【００２８】
本発明に従うアナライトａの検出方法の原理は、以下のスキームＡに図示する：
【００２９】
【化１】
本発明に従う検出方法は数多くの利点を有する：
１）特に該方法で使用されるトライポッドＹの特定のコンフォーメーションのために、その特性を全く変えることなく、固相の再生からなる工程は非常に容易に行われ得る。実際、上述した全てのフローアッセイにおいて、固相に結合した複合体が形成された後にシグナルが測定される。結局、たとえ、先行技術に記載されたいくつかのアッセイ方法が、いくつかの連続アッセイを可能にしているとしても（Sheikh et al.及び米国特許第５１８３７４０号及び第６３２３０４１号；上述した）、しかしながら、これらは回数が制限されており、及び、しばしば長く及び制限された固体支持体再生工程を必要とし、これにより、形成した複合体は解離する。さらに、これらの再生工程を行うための厳しい条件（酸性または塩基性溶液を通す）は、検出方法が停止させられなければならないことを意味し、ゆえに、与えられたアナライトを連続的に分析するこれらの方法の応用を妨げる。
【００３０】
一方、本発明に従う検出方法に従うと、試料中にアナライトａが存在すると、受容体−Ｑと分子（Ｂ）の解離をもたらし；ゆえに、再生工程は非常に単純に、受容体−Ｑを添加することによりこの複合体を再形成することにある。従って、この再生工程には固相の分子の特性を損なう酸性または塩基性溶液の使用、または受容体結合部位での２つの分子の交換反応を含まず、そのキネティクス（kinetics）は複合体を形成するための反応より長い。
【００３１】
２）トライポッドＹが固定された部分でシグナルが測定され、これは先行技術に従い開発されたアッセイ（特に、上述したSheikh et al.及び米国特許第５１８３７４０号及び第６３２３０４１号、ここで、溶液中の分子に結合したシグナルはキャピラリーの出口で測定される）とは異なり、局在化シグナルを得ることを可能にする。
【００３２】
３）それらが含む分子（Ｂ）の性質に応じて互いに異なるトライポッドＹのいくつかの型を、それらの明確に相違する既知のゾーンに付着することにより、同一固体支持体上で幾つかの分子が同時に検出され得る。
【００３３】
４）測定されたシグナルは、２回の再生の間で固体支持体と接触させたアナライトａの全ての分子に対応する。本発明従う方法のこの特徴は、時間的に間隔をあけた同時測定で得られる永久的なモニタリングを可能にすることである。
【００３４】
５）このアッセイフォーマットは全ての分子に応用可能であり、これは２つの受容体がアナライトに同時に結合することを必要としないためであり、これに対して、これまでに公知のアッセイ方法（例えば上述のT.E. Plowman et al.により述べられた方法に従う方法）では時折必要とされ、そして、アナライトは十分な大きさを有することが必要とされる。
【００３５】
６）試料中にアナライトａが存在するとシグナルが出現し、先行技術から公知の大抵の競合アッセイとは異なり、出現したシグナルはより容易に検出可能である。
【００３６】
７）最終的に、検出システムはエネルギー移動現象を利用するため、仮に蛍光である場合化合物Ｑのルミネッセンスの変化、あるいは化合物（Ｌ）のルミネッセンスの減少がみられる時間の変化によってアナライトａの存在を検出及び定量することも可能にする。
【００３７】
本発明に従う方法の特に好ましい実施形態に従うと、放出されるシグナル強度を測定することからなる工程３）及び固体支持体の表面を再生することからなる工程４）は連続的に行われる。
【００３８】
本発明に従うと、固体支持体は好ましくはそれらの表面で、天然の、または修飾された後に、トライポッドＹの相補性官能基に共有結合性の結合を形成できる官能基を含む物質から選択される。これらの官能基は、特にヒドロキシル、アミン、スルフヒドリルまたはカルボキシル官能基である。
【００３９】
このような物質において、特にガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、セラミック（好ましくは酸化物型）、金属（例えばアルミニウムまたは金）、メタロイド（酸化シリコンのような）が挙げられる。
【００４０】
このような支持体は、特に管、キャピラリー、マイクロプレートのようなプレートまたはビーズ、または本発明に従う方法を実行する上で適した何らか他の形状であり得る。
【００４１】
検出されるアナライトａを含み得るまたは含み得ない流体試料は、性質や由来が多様であり得、例えば、水、液体生物学的メディウム（medium）、または溶存気体分子または固体試料由来の分子を含む代替的な液体であり得る。
【００４２】
工程３）において放出されるシグナル強度は、例えばフルオリメーター(fluorimeter)のようなルミネッセンス検出器(luminescence detector)により測定され得る。
【００４３】
本発明の方法に従うと、飽和工程１）の最後に形成される複合体Ｃは好ましくは以下の式（Ｉ）の複合体から選択される：
【００４４】
【化２】
ここで：
− 矢印はトライポッドＹの骨格構造を表し、これはペプチド、ヌクレオチドまたはグルコシド鎖、あるいは飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖炭化水素ベース鎖からなるリンカーアームであり；前記鎖は、必要に応じて一つ以上のヘテロ原子（Ｎ、ＯまたはＳのような）、及び／または一つ以上のアミノ酸で置換、割り込み及び／または終結され、そして３反応性化学官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３を含み；
− Ｌは反応性化学官能基Ｆ１によりトライポッドＹと共有結合するルミネッセント基を表し；
− Ｂは、アナライトａに特異的な受容体に非共有結合的及び可逆的に付着するアナライトａ、アナライトａの構造アナログまたはアナライトａの断片を表し、該受容体は化合物Ｑで標識され；分子（Ｂ）は反応性化学官能基Ｆ２によりトライポッドＹと共有結合され；
− Ｑは、基Ｌのルミネッセンスをクエンチする化合物を表し；
− Ｆ３はトライポッドＹの前記固体支持体表面への付着を可能にし得る反応性化学官能基を表す。
【００４５】
本発明に従うと、それぞれ互いに無関係な、官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３が：
ｉ）ルミネッセント化合物、分子（Ｂ）または固相上に存在する対応する化学官能基を介する直接的結合か；
ｉｉ）あるいは間接的結合のいずれか
を提供する。この第２の場合、該結合はあらかじめ固相表面の少なくとも一部、分子（Ｂ）及び／またはルミネッセント基に付着させた分子Ｍ２と複合体を形成し得る分子Ｍ１を、官能基Ｆ１、Ｆ２及び／またはＦ３の少なくとも一つにカップリングすることにより実施され得る。例によると、特にビオチンまたはストレプトアビジン（或いはニュートラアビジン(neutravidin)またはアビジン(avidin)）を官能基Ｆ１、Ｆ２及び／またはＦ３の一つに、そして各々ストレプトアビジン（或いはニュートラアビジンまたはアビジン(avidin)）を該固相、分子（Ｂ）及び／またはルミネッセント化合物に結合させることが可能である。本発明に従う方法の他の変化に従うと、この間接的な結合はまた、分子Ｍ３を介して生じ得、一つ以上のルミネッセント化合物または分子（Ｂ）を固相にあらかじめ結合し、これは、官能基Ｆ１、Ｆ２またはＦ３に結合される。分子Ｍ３例において、特にアルブミン及びポリリシンのようなタンパク質、ヌクレオチド、糖または他の合成誘導体が利用され得る。
【００４６】
好ましくは、Ｆ１、Ｆ２及びＦ３は同じでも異なってもよく、次の官能基から選択される：チオール；アミン；アルコール；カルボン酸官能基のような酸性官能基；活性エステルのようなエステル、例えばスクシンイミジル（succinimidyl）エステル及び無水物；イソチオシアナート（isothiocyanates）；イソシアナート（isocyanates）；アシルアジド；スルホニルクロリド；アルデヒド；グリオキサール（glyoxals）；エポキシド；オキシラン；カルボナート（carbonates）；イミドエステル；カルボジイミド；マレイミド；ニトリル；アジリジン；アクリロイル；ハロゲン化（halogenated）誘導体；ジスルフィド基；例えば、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィン及びホスファイトのようなリン含有基；ジアゾ；カルボニルジイミダゾール；ヒドラジド；アリールアジド；ヒドラジン；ジアジリン；マグネシウム化合物；リチウム化合物；クプラート（cuprates）；亜鉛化合物及び不飽和系（unsaturated systems）。
【００４７】
これらの様々な官能基及び基の中でも、特に、式Ｒ−ＮＨ２、Ｒ−ＮＨ−、（Ｒ）３−Ｎ、Ｒ−ＮＨ−ＯＲ及びＮＨ２−ＯＲのようなアミン官能基；アルコール官能基Ｒ−ＯＨ；及び式Ｒ−Ｘ（Ｘは塩素、ヨウ素、臭素またはフッ素のようなハロゲン原子を表す）のハロゲン化基；が挙げられ、前記式において、Ｒはアルキル、好ましくはＣ１−Ｃ１５アルキル、アリール、ビニルまたはアリル基を表すものと解される。
【００４８】
本発明に従うと、用語「アリール基」は、一つ以上のベンゼン、ナフタレンまたはアントラセン環を有する任意の芳香族基を意味することが意図され、前記環は必要に応じてＯ、ＮまたはＳのような一つ以上のヘテロ原子を含み、及び、ハロゲン原子及びＣ１−Ｃ４−アルキル、アミノ、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキレンアミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４アルキレンアミノまたはＣ２−Ｃ４アルケニレンアミノ基から選択される一つ以上の基で必要に応じて置換される。
【００４９】
このようなアリール基について、特に、ベンジル、フェニル、クレシル（cresyl）、トルイル、ピリジン、ピリミジン及びピラジン基が挙げられる。
【００５０】
本発明に従うと、用語「ルミネッセント基」は、与えられた波長でまたは与えられた化合物により励起された時、光量子（photon）を放出することができる任意の物質、例えばフルオロフォアまたは希土類金属を意味すると意図される。
【００５１】
このようなルミネッセント基の中で、フルオレセイン（ソジウムフルオレセイナート（sodium fluoresceinate））及びフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）のようなその誘導体；ローダミン及びテトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）のようなその誘導体；ジアミニドフェニルインド（ＤＡＰＩ）；アクリジン；６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸（ＡＭＣＡ）のスクシンイミジルエステルのような反応性アミンを有する蛍光色素；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（米国）から販売されているＢｏｄｉｐｙ（登録商標）ＦＲ−Ｂｒ２、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）Ｒ６Ｇ、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）ＴＭＲ、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）ＴＲ及びＢｏｄｉｐｙ（登録商標）５３０／５５０（励起波長／エミッション波長，ｍｍで）、５５８／５６８、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０及び６５０／６６５のような商標名Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）で販売されている蛍光色素、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ色素（Ｔｒｉｌｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）、Ｄａｂｃｙｌ（登録商標）及びＥｄａｎｓ（登録商標）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ベルギー）；エオシン；エリスロシン；６−Ｆａｍ及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄが挙げられる。
【００５２】
本発明に従うと、用語「受容体」は、アナライト、アナライトのアナログまたは後者の断片と非共有結合及び可逆的な結合（複合体）を形成できる任意の物質を意味することが意図される。この受容体は、もちろん、トライポッドＹの分子（Ｂ）の性質に応じて選択される。
【００５３】
これらの受容体は特に、生物学的な特性を有する化合物（全体の、断片化または組換え型の抗体（Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）、受容体、ポリ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ペプチド核酸、レクチン或いはトランスポータータンパク質）及び、例えば特異的に合成された受容体及びキレートのような化学的な性質を有する化合物から選択され得る。
【００５４】
このような受容体の中で、例えば、モノクローナル抗サブスタンスＰ、抗プリオンタンパク質または抗アンギオテンシンＩＩ抗体、ポリヒスチジン、ニトリロ−三酢酸−ニッケル（ＮＴＡ−ニッケル）系、及び相補的なヌクレオチドプローブが挙げられる。
【００５５】
本発明に従う検出方法の好ましい実施形態において、前記受容体は分子（Ｂ）に対してよりアナライトａに対して高い親和性を示す。
【００５６】
本発明に従うと、用語「クエンチング（quenching）化合物」（Ｑ）は、受容体が分子（Ｂ）と複合化した場合にルミネッセント化合物（Ｌ）のルミネッセンスの減少または消失を可能にする任意の分子を意味することを意図する。この化合物（性質は多様であり得る）は特に化学的な化合物（ルミネッセントまたは非ルミネッセント）、重原子またはナノ粒子であり得る。
【００５７】
このような化合物（Ｑ）において、特に、上述した基Ｌ、ローダミン及びテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）のようなその誘導体、商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）１、２及び３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｎａｎｏｇｏｌｄ Ｐａｒｔｉｃｌｕｅｓ（登録商標）（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）、Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｅｌｌｅ Ｑｕａｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｏｓｗｅｌｌ）、マラカイトグリーン及び色素ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９及びＱＳＹ（登録商標）２１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で販売されている化合物のような非蛍光分子が挙げられる。
【００５８】
分子（Ｂ）がペプチドまたはオリゴヌクレオチドである場合、本発明に従う方法に従い使用されるトライポッドＹは、官能基（Ｆ１）を含む少なくとも一つのアミノ酸（または修飾ヌクレオチド）及び官能基（Ｆ３）を含むもう一方のアミノ酸（または修飾ヌクレオチド）が前記分子（Ｂ）に添加されている間にペプチドまたはオリゴヌクレオチド合成を行うことにより調製され得、Ｆ１及びＦ３は、上述したものと同様の意味を有する。この場合、Ｆ１及びＦ３はまた、それぞれ、ルミネッセント化合物（Ｌ）及び固相表面との結合を提供する。まさに上のように、化学官能基Ｆ１及びＦ３を含むアミノ酸（またはヌクレオチド）はまた、ビオチン（例えば、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−リシン（ビオチン）−ＯＨ産物、これはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧにより販売されている）と結合したアミノ酸（またはヌクレオチド）で置換され得る。この場合、このアミノ酸（またはヌクレオチド）は、ストレプトアビジン（またはニュートラアビジンまたはアビジン）があらかじめ結合している固相表面、またはルミネッセント化合物（Ｌ）との結合を提供し、間接的な結合を形成する。
【００５９】
本発明に従う式（Ｉ）の複合体Ｃの中で、特に以下の化合物が挙げられ得る：
ｉ） （Ｂ）はペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、糖及びペプチド核酸から選択され、
ｉｉ） Ｌはフルオレセインであり、そして
ｉｉｉ） トライポッドＹの骨格は以下の構造Ｙ１〜Ｙ３から選択される：
【００６０】
【化３】
ここで、ｎ、ｍ及びｐは同じでも異なってもよく、１〜２０までの整数である。
【００６１】
構造Ｙ１〜Ｙ３の中で、以下の式（Ｙ’１）〜（Ｙ’３）の化合物は特に好ましい。
【００６２】
【化４】
本発明に従う方法で使用されるトライポッドＹは、慣用的に使用される及び当業者に周知の有機及びペプチド合成の方法に従う類似のもの（analigy）により調製され得る。
【００６３】
上述した式（Ｉ）の複合体Ｃはそれら自身新規の化合物であり、これは、この点で本発明の他の主題を構成する。
【００６４】
式（Ｉ）の複合体Ｃは、先行技術においても慣用的に使用されてきた方法に従い、本発明に従うトライポッドＹと受容体Ｑが複合化することにより調製され得る。
【００６５】
本発明の主題はまた、流体試料中のアナライトａの連続的な不均一相検出方法における、式（Ｉ）の少なくとも一つの複合体Ｃの使用である。
【００６６】
最後に、本発明の主題は、流体試料中の少なくとも一つのアナライトａの連続的な不均一相検出を行うためのデバイスであり、前記デバイスは、分析される流体試料が上述した本発明に従う少なくとも一つのトライポッドＹに付着した及び検出されるアナライトａに特異的な表面で、少なくとも一つの固体支持体上を流れるストリームを形成しているメディウムに統合され、固体支持体の反対に位置するルミネッセンス検出器が、該検出器により放出されるシグナルの強度の閾値により制御され及びトライポッドＹとの複合体を形成し得る受容体Ｑを含むリザーバを、与えられた時間、開放する引き金となるバルブコントロールにカップリングされ（このリザーバは、トライポッドＹが付着する固体支持体の上流にくるフィードバックループを介して支持体と結合する）、これにより該ストリームを通過し、及びトライポッドＹ上での複合化により後者を受容体−Ｑで飽和及び／または再生することを特徴とする。
【００６７】
特定な実施形態に従うと：
− ルミネッセンス強度値をモニターし、ルミネッセンス検出器に連動した計算システムによりアナライトａ量に二次的に翻訳される；
− イベントマーカー（例えばアラーム）はフィードバック中に位置し、あらかじめ決定した値を超えるシグナル強度の変化を表示し；
− 固体支持体は分析される試料を含む環境と結合したキャピラリーであり、この結合は試料がフローストリーム（flow stream）のそれに応じてメディウム中に分散する丸底キャプチャー（capture）フラスコにより、もしくは柔軟性のあるパイプにより行われ；
− 該ストリームはポンプ、ピストンまたは同等のものにより生み出された低圧により生じる（entrained）。
【００６８】
これらのデバイスは、特に、天然メディウム（medium）中、例えば、特に湖及び河川、あるいはスミングプール、工場、浄水場、換気装置または空調システムなどのような産業メディウム（media）中のアナライトａの存在を検出するために使用され得る。適切な場合、ガス状態の（例えば空気のような）試料を収集するために及びそれらが含む検出される成分を溶解するために、丸底キャプチャーフラスコ及びスパージングシステムが、それらに備え付けられ得る。
【００６９】
上述したことに加えて、本発明はまた次の記載から現われるであろう他の装置を含み、これはトライポッドＹの骨格の合成例、式（Ｉ）の化合物の合成例、及び流体試料中のサブスタンスＰを検出する２例、並びに、添付の図１〜８に述べる、ここで；
− 図１は、浄水場タンク内のアナライトａの存在を測定するための、本発明に従う不均一相検出デバイスの制限のない例の一般的な図を示す。このデバイスに従うと、タンクの出口に接続する柔軟性のある管１の一部を、キャピラリー管３の上に取り付ける。この管は、本発明に従う２つのタイプのトライポッド、すなわちＹａ及びＹｂを取り付けるための支持体として働き、これにより２つのタイプのアナライトの特異的な検出を可能にする。タンク由来の液体試料は、蠕動ポンプ５の作用によりキャピラリー３内を連続的なストリーム（矢印Ｆａ）として流れ、そして排出される。キャピラリー及びトライポッド Ｙａ及びＹｂが取り付けられているキャピラリーの各部分の反対側付近で、蛍光を検出できるように、フルオリメーター、７ａ及び７ｂを配置する。各検出器は、それぞれトライポッドＹａ及びＹｂにそれぞれ特異的な受容体−Ｑのリザーバ９ａ及び９ｂと連結させる。リザーバはサイドチャンネル１１ａ及び１１ｂ及び共通チャンネル１１ｃを介してキャピラリー３に接続され、トライポッドＹａ及びＹｂが取り付けられている部分の上流は、ストリームの流れの方向に関係する。共通チャンネルは、キャピラリー３及び全てのチャンネル型フィードバックループに垂直に結合する。対応するリザーバ（それぞれ９ａ及び９ｂ）を開放するために、各検出器はバルブコントロール（それぞれ１３ａ及び１３ｂ）に接続し、そして、それの内容物がキャピラリー３に注ぎ込まれ（矢印Ｆｂ）、そしてチャンネル１１ａ、１１ｂ及び１１ｃを介して対応する特定のトライポッド（ＹａまたはＹｂ）上で複合化することを可能にし、このトライポッドを再生する。この例において、再生は連続的に行われ得、この再生操作をトリガーするための閾値は、検出器の感度に従って検出され得るルミネッセンスの最小の変動に対応する。イベントマーカー１５ａ（それぞれ１５ｂ）は、各々のフィードバックループに取り付けられる。操作モードにおいて、キャリブレーション後に、トライポッドＹａ及びＹｂにより放出された蛍光シグナルＩａ及びＩｂの強度はフルオリメーターにより測定され、付属の計算デバイス（示されない）を使用して、試料中の測定対象とするアナライトの平均濃度を計算し得る。バルブ開放コントロール１３ａ（それぞれ１３ｂ）は、対応する検出器により測定される蛍光シグナルの強度により制御される。そして、対応するバルブが開放することは、関係するトライポッドの再生と一致する時間の引き金となる。仮に再生中にアナライトａが試料中の存在すると、それら（アナライトａと複合化している幾つかの受容体−Ｑ）の持続時間が長くなる。再生持続時間は、蛍光が基準とするレベルにまで戻るために要する時間により決定され得る；仮に、これがあらかじめ決められたよりも高い場合、イベントマーカーがトリガーされ得る。与えられる時間間隔に関して（for a given time interval）、あらかじめ決定した値より高いためにシグナル強度が変化する場合、イベントマーカー１５ａ（それぞれ１５ｂ）は、視覚及び／または音の警告１６によりこの事実を合図する。そして、仮に、蛍光シグナルが２回の再生の間にキャピラリーを通過した全てのアナライトａに対応する場合、蛍光はまた規則的な時間間隔で読まれ得る。他の例において、試料がガスの場合、用いられるメディウム（medium）及びストリームを作り出す方法は当業者により改造される；
− 図２は、μＭのトライポッド濃度の関数として、化合物（Ｌ）としてフルオロセイン及び分子（Ｂ）としてサブスタンスＰのアナログを含むトライポッドＹをニュートラアビジンを介してマイクロタイトレーションプレート上に固定した後に、任意の単位で、測定した蛍光を表し；
− 図３は、トライポッドと複合化するテトラメチルローダミン標識抗サブスタンスＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ）（ｎＭで）の量の関数として、化合物（Ｌ）としてフルオロセインと分子（Ｂ）としてサブスタンスＰアナログを含むトライポッドの蛍光の減少曲線（任意のユニットにおける）を表し；
− 図４は、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲにより生じる蛍光減少のサブスタンスＰによる抑制率を表し（％ ＩＤ）、これはサブスタンスＰの濃度（ｎＭで）の関数として表される；
− 図５は、本発明に従うトライポッドＹが取り付けられた固体支持体を接触させた後に（任意のユニットで）測定された蛍光を表し、前記トライポッドは、第一アッセイにおいては、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（ウェルＦｌ：ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ及びサブスタンスＰが存在しない場合に測定された蛍光、及びウェルＦｌ０：ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲは存在し、サブスタンスＰが存在しない場合に測定された蛍光）、及び様々な濃度のサブスタンスＰ（ウェルＦｌＸ：ｘ＝サブスタンスＰの濃度：１；０．１または０．０１μＭでｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲが存在する場合に測定された蛍光）と複合化され得、及び支持体再生の後に、最終的には、ウェルは再びサブスタンスＰの３つの濃度と接触させた後である；
− 図６は、１１回のサブスタンスＰ−アッセイと再生サイクル後に、ウェルＦｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘのそれぞれに関して（任意のユニットで）測定された平均の蛍光を表し；
− 図７は、ウェルＦｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘ（ｘ＝サブスタンスＰ １μＭ）において行われた１１回のアッセイそれぞれに関して（任意のユニットで）測定された蛍光を表し；
− 図８は、標識されたモノクローナル抗体ｍＡｂ ＳＰ３１に接触させた（領域１）、サブスタンスＰと接触させた（領域２）、そして、キャピラリ−に付着したトライポッドを標識したモノクローナル抗体ｍＡｂ ＳＰ３１に接触させることにより再生された（領域３）（最後の２工程は３回繰り返す）、本発明に従うトライポッド Ｙで官能基化したキャピラリーの時間の関数としての蛍光変化（任意のユニットで）を表す。
【実施例】
【００７０】
実施例１：本発明に従うトライポッドＹの式（Ｙ’１）の骨格の調製
１当量の１，２−エチルジアミンを２当量の（Ｂｏｃ）２Ｏと反応させてビス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）−１，２−エチルを生じ、続いて水素化ナトリウム存在下で１当量のフェニル３−ブロモプロパノエート（phenyl 3-bromopropanoate）と反応させ、以下の式（Ｙ’１ａ）の化合物を得る。
【００７１】
【化５】
化合物Ｙ’１ａはトリフルオロ酢酸メディウム（medium）で脱保護し、そして得られた脱保護化合物はトリエチルアミン（ＴＥＡ）及び１当量のＺクロライド（Ｚはカルボベンジルオキシ）存在下で縮合し、以下の式（Ｙ’１ｂ）の化合物を得る。
【００７２】
【化６】
Ｓ−（３−クロロプロピル）エタンチオエート（ethanethioate）及びＴＥＡ存在下で、式（Ｙ’１ｂ）の化合物は以下の式（Ｙ’１ｃ）の化合物を与え：
【００７３】
【化７】
ここで、Ｚは上記の式（Ｙ’１ｂ）の化合物で示すものと同じ意味を有し、及びＢｚはベンジル基を表す。
【００７４】
式（Ｙ’１ｃ）の化合物の酸及び第一級アミン官能基をパラジウム炭素（palladium-on-charcoal）存在下で脱保護し、そしてチオール官能基をヒドロキシルアミンの作用により脱保護し、式（Ｙ’１）の化合物を得る。
【００７５】
実施例２：本発明に従うトライポッドＹの式（Ｙ’２）の骨格の調製
３−ブロモプロピオン酸及びチオ酢酸から調製された３−［（２−オキソプロピル）チオ］プロピオン酸を上記実施例１で得られた式（Ｙ’１ｂ）の化合物と反応させ、以下の式（Ｙ’２ａ）の化合物を得る。
【００７６】
【化８】
ここで、Ｚはカルボベンジルオキシ基を表し、及びＢｚはベンジル基を表す。
【００７７】
上述した式（Ｙ’２ａ）の化合物の酸性及び第一級アミン官能基は、パラジウム炭素存在下で脱保護し、そしてチオール官能基はヒドロキシルアミンの作用により脱保護し、上述した式（Ｙ’２）の化合物を得る。
【００７８】
実施例３：本発明に従うトライポッド Ｙの式（Ｙ’３）の骨格の調製
水素化ナトリウム存在下で１当量の２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジオールと１当量のエチル３−ブロモプロパノエートを反応させ、エチル３−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロポキシ］プロパノエートを得る。続いて水素化ナトリウム存在下で、この化合物を１当量のｔｅｒｔ−ブチル３−ブロモプロピルカルバマート（tert-butyl 3-bromopropylcarbamate）と反応させ、以下の式（Y’３ａ）の化合物を得る。
【００７９】
【化９】
続いて、上記の式（Y’３ａ）の化合物をトリフルオロ酢酸メディウム（medium）中で脱保護し、そして水酸化ナトリウム存在下でジチオキソメタンと反応させ、そしてカルボキシル基をエタノール／硫酸混合液中で再保護し、以下の式（Y’３ｂ）の化合物を得る。
【００８０】
【化１０】
続いて上記の式（Y’３ｂ）の化合物を水素化ナトリウム存在下で１−（３−ヨードプロピル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンと反応させ、以下の式（Y’３ｃ）の化合物を得る：
【００８１】
【化１１】
そして、水酸化ナトリウム存在下で化合物（Y’３）を得る。
【００８２】
実施例４：本発明に従うトライポッドＹの調製
この実施例は、以下を含む本発明に従うトライポッドＹの調製を説明する：
− 分子（Ｂ）としてのサブスタンスＰアナログ、
− 固体支持体（Ｆ３）の表面にトライポッドを結合するためのＮＨ２官能基、
− ルミネッセント化合物（Ｌ）としてのフルオレセイン。
【００８３】
１）サブスタンスＰアナログの調製
興味深いことに、サブスタンスＰ（分子量：ＭＷ＝１３４９）のシークエンスは以下のようであり：
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＯＮＨ２
即ち（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）−ＣＯＮＨ２である。
【００８４】
以下のシークエンスに対応するサブスタンスＰアナログ（ＭＷ＝１９０７）を調製する：
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（ビオチン）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＣＯＮＨ２；
即ち（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−ＣＯＮＨ２である。
【００８５】
これを行うために、サブスタンスＰアナログとビオチンの、並びにＮＨ２官能基の結合は、当業者に公知の方法に従うペプチド合成、例えばMerrifirld（J. Am. Chem. Soc., 1964, 85, 2149-2154）により述べられる固相合成、の手順で行う。サブスタンスＰアナログは１０位にアラニンを含む［Ａｌａ１０］サブスタンスＰのペプチドアナログであり、これはモノクローナル抗体ＳＰ３１に対するサブスタンスＰと１３％交差反応が見られ（O. Dery, Biopolymers, 1996, 39, 67-74）、これは受容体として後述するアッセイにおいて使用される。モノクローナル抗体ＳＰ３１（ｍＡｂ ＳＰ３１）はサブスタンスＰと比較してこのアナログに対するこの低い親和性のため、固相に付着する抗体からより良く置換できるであろう。このアナログに関して、側鎖に存在する第一級アミンを除去するために、３位のリシン（Ｌｙｓ３）をまたアラニンで置換した。Ｌｙｓ３はｍＡｂ ＳＰ３１の認識部位にはないため、この置換はアナログに対する抗体の親和性を改変しない。さらに、Ｎ末端は側鎖にビオチン分子を有するリシン（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ビオチン）−ＯＨ）の付加により修飾され、そして二つのセリンは二つのＮＨ２官能基を有するリシンに続き、これらの一つはその側鎖上に存在する。
【００８６】
合成後、得られた化合物は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、そして凍結乾燥する。
【００８７】
２）フルオロセイン（Ｌ）によるサブスタンスＰアナログの標識
上述した１）で得られた化合物１００μｇ（５．２８×１０−８ｍｏｌ）を１００μｌの０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９）に溶解する。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の
フルオレセイン−ＮＨ−スクシンイミド（ＭＷ ５８６．５５）（６−（フルオレセイン−５−（及び−６）−カルボキサミド）ヘキサン酸、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社により参照番号Ｆ−６１２９で販売されているスクシンイミジルエステル）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３０．８μｌ（５．２８×１０−７ｍｏｌ）を続いて添加した。４℃の温度で１６時間撹拌した後、１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）を添加し、そして、４℃で１６時間撹拌を続け、残りの活性エステル官能基を不活化する。最終的に、７６９．２μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．０１％のソジウムアジドを添加する。本発明に従うトライポッドＹの溶液（５２．８μＭ）を得る。このトライポッドは４℃の温度で保存する。
【００８８】
実施例５：試料中のサブスタンスＰの検出およびアッセイ
１）受容体−Ｑの調製：テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）（Ｑ）による抗サブスタンスＰモノクローナル抗体ＳＰ３１の標識（ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ複合体）
ＴＭＲ（ＭＷ ５２７．５）の溶液（ＤＭＦ中の５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社により参照番号Ｃ１１７１で販売されている、５０ｍｇ／ｍｌ（１７６μｇ；３３３ｎｍｏｌ））３．５μｌを、０．１Ｍホスフェート緩衝液（ｐＨ７．４）中のｍＡｂ ＳＰ３１（１．１３６ｍｇ／ｍｌ（１ｍｇは６．６７ｎｍｏｌに相当する））８８０μｌに添加する。４℃で１６時間撹拌した後、１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）を添加し、次いで、４℃で１６時間撹拌を続け、残りの活性エステル官能基を不活化する。最終的に、標識した抗体は、ソジウムアジド０．０１％を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中でＧ−２５ゲル上の排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ｆｉｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により遊離のＴＭＲから分離する。抗体に対応する画分を合わせ、そして、１ｃｍの光学経路長のキュベットを使用して２８０及び５５５ｎｍで溶液の吸光度を測定する。
【００８９】
抗体濃度は次の等式に従って計算する：
濃度（Ｍ）＝［Ａ２８０・（Ａ５５５×０．３）］／ε
ここで：
− Ａ２８０は２８０ｎｍでの吸光度であり
− Ａ５５５は５５５ｎｍでの吸光度であり
− ０．３は２８０ｎｍ及び５５５ｎｍでのＴＭＲの吸光度の比であり
− εはモル吸光係数（ＩｇＧに関して、ε＝２０３０００ｃｍ−１Ｍ−１）である。
【００９０】
標識した抗体の濃度１．３６μＭを得た。
【００９１】
標識の程度次の等式に従い計算でき得る：
抗体分子あたりのＴＭＲ分子数＝Ａ５５５／（６５０００×抗体濃度）
ここで、数６５０００はＴＭＲの５５５ｎｍでのモル吸光係数に対応する。
【００９２】
抗体モルあたり３．６ｍｏｌＴＭＲを得る。
【００９３】
２）固体支持体の調製：ニュートラアビジンを用いた表面の官能化
固体支持体上で上記の実施例４において調製したトライポッドＹを固定できるように、第一段階として、後者をニュートラアビジンで官能化した。
【００９４】
ａ）用いた試薬
飽和緩衝液：
− ０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４；
− ０．１５Ｍ ＮａＣｌ；
− シグマ社により参照番号Ａ−７９０６で販売されている牛血清アルブミン（ＢＳＡ）：０．１％；
− ０．０１％ ソジウムアジド。
【００９５】
洗浄緩衝液：
− ０．０１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４；
− Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０：０．０５％。
【００９６】
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ社により参照番号３１０００で販売されている）の溶液（５μｇ／ｍｌ）１００μｌを、ＶＷＲ社により商品名Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｍａｔｒｉｘで販売されている（参照番号８０１２０６９６）黒色マイクロプレートのウェルに注ぐ。周囲温度で１６時間後、プレートは洗浄緩衝液で洗浄し、次いで周囲温度で１６時間、３００μｌ／ウェルの飽和緩衝液を注ぐことにより飽和する。プレートは同じ緩衝液（３００μｌ／ウェル）で、４℃で保存する。
【００９７】
３）本発明に従う（フルオレセインで標識した）トライポッドＹのマイクロタイトレーションプレートへの付着
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）による、上記の実施例４において合成したトライポッドＹ（フルオレセインで標識）の希釈範囲は、０．５μＭ濃度を範囲の最初の点として４つの連続的な１／３希釈（即ち０．１６７μＭ；０．０５５μＭ；０．０１８５μＭ及び６．２×１０−３μＭ）を作ることにより調製する。各濃度１００μｌを、デュプリケートで、ニュートラアビジンでコートしたまたは飽和工程だけを行った（ネガティブコントロール）ウェル中に注ぐ。撹拌しながら周囲温度で３時間インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、次いで１００μｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぐ。マイクロプレートを読むために、励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３０ｎｍ（これはフルオロセインに対応する励起及び発光波長）で、アナリストＡＤシステムフルオリメーター（ＬＪＬ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）によりプレートを読む。
【００９８】
結果
ニュートラアビジン（黒四角）あり及びニュートラアビジンなし（黒三角：コントロール）で得られた曲線を添付の図２に表し、ここで、蛍光（任意のユニットで）は、本発明に従うトライポッドＹの濃度（μＭ）の関数として表される。
【００９９】
これらの結果は、０．１７μＭの濃度までは本発明に従うトライポッドの濃度のそれに比例して蛍光が増加すること、そして、トライポッドによるニュートラアビジン結合部位の飽和に対応して平らになることが分かる。固定したニュートラアビジンがない場合、蛍光の増加は観察されない。
【０１００】
以下の実施例において、実施例のトライポッドＹは２０ｎｍの濃度で使用され、これらの結果から判断すると、十分なシグナルが得ることが可能である。
【０１０１】
４）複合体Ｃを形成するための、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲによる固相の飽和
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）における、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲの希釈範囲は、１００ｎＭの濃度の範囲を最初の点とし、そして６つの３倍希釈を作成することにより調製する。デュプリケートで、各濃度１００μｌを実施例４のトライポッドＹの溶液（０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中２０ｎＭの溶液）１００μｌをマイクロプレートのウェルに注ぐ。４℃で１６時間インキュベートした後、マイクロプレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、そして０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１００μｌを注ぎ、次いで蛍光を測定する。
【０１０２】
得られた結果は添付の図３に示し、ここで測定した蛍光（任意のユニットで）はｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲの濃度（ｎＭ）の関数として表される。
【０１０３】
これらの結果は、１ｎＭの抗体濃度から、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲの濃度に比例して蛍光が減少し、３３ｎＭのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲの濃度を使用した時、最大７０％までの抑制が得られることを示す。この結果は以下のことを示す：
ｉ）エピトープを認識することにより、抗体は本発明に従うトライポッドＹと複合化し、
ｉｉ）本発明に従うトライポッドＹのコンフィギュレーションは、フルオレセインからＴＭＲに至る共鳴エネルギー移動を可能とし、これによりフルオロセインの蛍光が減少する。
【０１０４】
５）固体支持体上のサブスタンスＰの検出
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）による、サブスタンスＰの希釈範囲は、２００ｎＭの濃度を範囲の最初の点とし、そして６つの３倍希釈を作成することにより調製する。そして、１００μｌの実施例４において調製したトライポッド（２０ｎＭ）及び１００μｌのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（３０ｎＭ）（またはネガティブコントロールウェルとして１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を各ウェルに注ぐ。撹拌しながら５時間周囲温度でインキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、そして１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぎ、そして蛍光を測定する。
【０１０５】
得られた結果は添付の図４に示され、ここで、サブスタンスＰ濃度の関数として（ｎＭで）、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲにより生じるサブスタンスＰの蛍光減少の抑制割合（％ ＩＤ）が示される。
【０１０６】
この抑制割合は、次の等式を使用して計算する：
％ ＩＤ＝［（Ｆｌｘ−Ｆｌ０）／（Ｆｌ−Ｆｌ０）］×１００
ここで：
− Ｆｌｘは濃度ＸのサブスタンスＰ存在下で測定した蛍光に対応し；
− ＦｌはｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ及びサブスタンスＰ非存在下で測定した蛍光に対応し；
− Ｆｌ０はｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ存在下及びサブスタンスＰ非存在下で測定した蛍光に対応する。
【０１０７】
これらの結果は、予想されたように、サブスタンスＰの濃度の増加はフルオロセインの蛍光増加を誘発すること（減少の抑制に対応して）を示す。このように標準の曲線が得られ、サブスタンスＰの検出限界はおおよそ２ｎＭである。
【０１０８】
６）固相再生試験
サブスタンスＰの３つの希釈液（それぞれ１、０．１及び０．０１μＭ）を０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製する。そして、１００μｌの上記実施例４において調製したトライポッドＹ及び１００μｌのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（５０ｎＭ）（またはネガティブコントロールウェル：Ｆｌ０ウェルに関しては０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、１００μｌ）を各ウェル中に注ぐ。ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲは５０ｎＭで使用し、固相上に存在する全てのトライポッドを複合化する。４℃で１６時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、そして、トリプリケートで、各濃度のサブスタンスＰ １００μｌを注ぐ（Ｆｌｘウェル）。Ｆｌ及びＦｌ０ウェルはまたトリプリケートで調製する。撹拌しながら周囲温度で５時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、そして、１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぎ、そして蛍光を測定する（第一アッセイ）。
【０１０９】
プレートは上述と同じ方法で再度洗浄し、そして、１００μｌのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（５０ｎＭ）（またはＦｌウェルに関しては１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を４℃で１６時間インキュベートする。プレートは再び洗浄し（５回）、そして、１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぎ、そして蛍光を測定する（プレート再生工程）。
【０１１０】
プレートは再度洗浄し（５回）、そしてＦｌ及びＦｌ０ウェルについて、１００μｌのリン酸カリウム緩衝液もしくは１００μｌのサブスタンスＰ（１、０．１及び０．０１μＭ）のいずれかを注ぐ。撹拌しながら５時間周囲温度でインキュベートした後、プレートを洗浄し（５回）、そして、１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぎ、そして蛍光を測定する（第二アッセイ）。
【０１１１】
得られた結果は添付の図５に示し、ここで、Ｆｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘウェルについて測定した蛍光（任意のユニットで）は、第一及び第二アッセイにおいて、そしてまた再生工程の後に行った測定についても示される。
【０１１２】
これらの結果は：
ｉ）検出方法の様々な工程（注入、洗浄）は固相から本発明に従うトライポッドＹの解離をもたらさない：Ｆｌウェルにおいて測定した蛍光は一定である；
ｉｉ）ｍＡｂ ＳＰ３１の注入は、固相の一様な再生：全てのＦｌｘ及びＦｌ０ウェルは同じ蛍光値、を可能にする；
ｉｉｉ）完全な再生が得られる：再生工程の後にＦｌｘウェルについて測定した蛍光は第一アッセイで行うＦｌ０ウェルのそれと同様である；
ｉｖ）同一のサブスタンスＰ濃度において同じ蛍光値が得られるため、この再生工程は同じ固相上で続いて行われる第二アッセイと適合性である、
ことを示す。
【０１１３】
７）同じ固相上での繰り返しアッセイの実現可能性の証明
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で、サブスタンスＰの３つの希釈液（１、０．１及び０．０１μＭ）を調製する。
【０１１４】
ｉ）１００μｌの上記実施例４において調製したトライポッド（２０ｎＭ）及び１００μｌのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（５０ｎＭ）または１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（ネガティブコントロール：Ｆｌ０ウェル）をマイクロプレートの各ウェル中に注ぐ。ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲは５０ｎＭの濃度で使用し、固相上に存在する全てのトライポッドを複合化する。４℃で１６時間インキュベート後、マイクロプレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、そして、トリプリケートで、各濃度のサブスタンスＰ １００μｌを注ぐ。Ｆｌ及びＦｌ０ウェルもまたトリプリケートで調製する。撹拌しながら周囲温度で５時間インキュベート後、マイクロプレートを洗浄し（５回）、そして、１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぎ、そして蛍光を測定する（第一アッセイ）。
【０１１５】
ｉｉ）プレートは再度洗浄し（５回）、そして、１００μｌのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（５０ｎＭ）（またはＦｌウェルに関しては１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を４℃で１６時間インキュベートする（再生工程）。
【０１１６】
ｉｉｉ）プレートは再度洗浄し（５回）、そして、Ｆｌ及びＦｌ０について、１００μｌのホスフェート緩衝液もしくは１００μｌのサブスタンスＰ（１、０．１及び０．０１μＭ）のいずれかを注ぐ。撹拌しながら周囲温度で５時間インキュベート後、プレートを洗浄し（５回）、そして、１００μｌのホスフェート緩衝液を注ぎ、そして蛍光を測定する（第二アッセイ）。
【０１１７】
工程ｉｉ）及びｉｉｉ）の引き続くアッセイを繰り返すために、ホスフェート緩衝液、Ｆｌ０として、及び様々な濃度のサブスタンスＰを注ぐウェルを変化させる。
【０１１８】
そして、同じ固相上で１１回の連続的なアッセイを行う。
【０１１９】
得られた結果は添付の図６及び７に示す。
【０１２０】
図６において、蛍光（任意のユニット）は、Ｆｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘの各ウェルについて、行われた１１回のアッセイの平均値に相当する。図７において、蛍光（任意のユニット）は、Ｆｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘの各ウェルについてｘ＝１μＭのサブスタンスＰで行われた１１回の各アッセイで得られた値に相当する。
【０１２１】
これらの結果は、サブスタンスＰの各濃度について、蛍光値は規則正しく、サブスタンスＰ非存在下で得られるものより高いことを表す。さらに、観察されたばらつきはランダムである：一連のアッセイを通して、蛍光に漸進的に減少することまたは増加することはない。
【０１２２】
これらの結果はまた、本発明に従う検出方法は固相上でアナライトを繰り返し分析することが可能であることを示し、各ウェル（または反応サイト）が等価な方法で再生されること、及び連続したさらなる検出することが可能である。
【０１２３】
実施例６：サブスタンスＰの検出及びキャピラリー中での再生
１）手順
ａ）使用する試薬の調製
− 蛍光分子によるトライポッドの標識：
商品名Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２タンパク質標識キット、参照番号Ａ−１０２３６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で販売されている蛍光分子による配列番号２（実施例４で上述したように）の配列のサブスタンスＰアナログの標識は、実施例４に記載したプロトコールに従い行う。トライポッド−Ａｌｅｘａ ５３２を得る。
【０１２４】
− 受容体Ｑの調製：蛍光分子でのｍＡｂ ＳＰ３１抗体の標識（ｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７複合体）：
商品名Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７サクシンイミジルエステル、参照番号Ａ−２０００６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で販売されている蛍光分子によるｍＡｂ ＳＰ３１の標識を、実施例５の工程１）に上述したプロトコールに従い行う。ｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７標識抗体を得る。
【０１２５】
− キャピラリーの調製：
四角形の横断面（square cross section）を有するボロシリケート製のキャピラリーを使用する（内寸＝０．５ｍｍ、外寸＝１ｍｍ、長さ＝２５ｍｍ）（Ｗａｌｅ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）。キャピラリーはニュートラアビジンで官能化し、そしてトライポッド−Ａｌｅｘａ ５３２の溶液中（５μＭの溶液）、４℃で一夜インキュベートする。
【０１２６】
ｂ）実験プロトコール
官能化したキャピラリーを、内径０．５１ｍｍのマニホールドチューブ（Manifold tubing）（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ）を介してギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）ポンプに接続し、様々な溶液が連続して流れるようにする。
【０１２７】
ＨｉｓＩｓ ２３ ｃｏｏｌｅｄ ＣＣＤカメラ（Ｅｕｒｏｐｉｘｅｌ、イタリア）およびコンピューター制御されたシャッターを備えた蛍光顕微鏡（水銀ランプにより励起）を使用して蛍光を測定する。
【０１２８】
画像取り込みは、５３０−５６０ｎｍの励起フィルター及び５７５−６４５ｎｍの発光フィルターを用いて、露光時間５０ｍｓｅｃで、実験を通してキャピラリーの同じ領域上で行う。
【０１２９】
上記実施例５に記載したように洗浄緩衝液でキャピラリーを洗浄した後、官能化したキャピラリーを０．１Ｍのホスフェート緩衝液（ｐＨ８．５）を充填し、最初の蛍光をｔ＝０で読む。
【０１３０】
そして、ｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７の溶液（２．６２μＭ）をキャピラリーに導入する。１０分後、キャピラリーを洗浄し（洗浄緩衝液、流速３５μｌ／分で２分）、そして、０．１Ｍのホスフェート緩衝液（ｐＨ８．５）を充填し、クエンチング後の蛍光を測定する。
【０１３１】
サブスタンスＰの溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）を続いて８０分間導入する。ｔ＝１５秒で最初に測定した後、５分毎に測定を行う。
【０１３２】
キャピラリー洗浄後（洗浄緩衝液、次いで０．１Ｍのホスフェート緩衝液、ｐＨ８．５、３５μｌ／分でそれぞれ２分）、ｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７でさらにインキュベートすることにより固相を再生する。実験はこの方法で３回繰り返す。
【０１３３】
２）結果
この実験で得られた結果は、添付の図８に示し、ここで、蛍光（任意のユニット）は時間（分）の関数として表す。
【０１３４】
これらの結果は、ｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７によるトライポッド−Ａｌｅｘａ ５３２の蛍光の減少（クエンチング）（領域１の曲線）、サブスタンスＰ存在下での蛍光の増加（領域２の曲線）及びｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７を導入することによる再生からなる工程（領域３の曲線）は、キャピラリーのような固体支持体上で、及び実施例５において使用されるそれらと異なるルミネッセント基（Ｌ）及びクエンチング基（Ｑ）を用いると効果が残るということを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、浄水場タンク内のアナライトａの存在を測定するための、本発明に従う不均一相検出デバイスの制限のない例の一般的な図を示す。
【図２】図２は、μＭのトライポッド濃度の関数として、化合物（Ｌ）としてフルオロセイン及び分子（Ｂ）としてサブスタンスＰのアナログを含むトライポッドＹをニュートラアビジンを介してマイクロタイトレーションプレート上に固定した後に、任意の単位で、測定した蛍光を表す。
【図３】図３は、トライポッドと複合化するテトラメチルローダミン標識抗サブスタンスＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ）（ｎＭで）の量の関数として、化合物（Ｌ）としてフルオロセインと分子（Ｂ）としてサブスタンスＰアナログを含むトライポッドの蛍光の減少曲線（任意のユニットにおける）を表す。
【図４】図４は、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲにより生じる蛍光減少のサブスタンスＰによる抑制率を表し（％ ＩＤ）、これはサブスタンスＰの濃度（ｎＭで）の関数として表される。
【図５】図５は、本発明に従うトライポッドＹが取り付けられた固体支持体を接触させた後に（任意のユニットで）測定された蛍光を表し、前記トライポッドは、第一アッセイにおいては、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（ウェルＦｌ：ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ及びサブスタンスＰが存在しない場合に測定された蛍光、及びウェルＦｌ０：ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲは存在し、サブスタンスＰが存在しない場合に測定された蛍光）、及び様々な濃度のサブスタンスＰ（ウェルＦｌＸ：ｘ＝サブスタンスＰの濃度：１；０．１または０．０１μＭでｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲが存在する場合に測定された蛍光）と複合化され得、及び支持体再生の後に、最終的には、ウェルは再びサブスタンスＰの３つの濃度と接触させた後である。
【図６】図６は、１１回のサブスタンスＰ−アッセイと再生サイクル後に、ウェルＦｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘのそれぞれに関して（任意のユニットで）測定された平均の蛍光を表す。
【図７】図７は、ウェルＦｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘ（ｘ＝サブスタンスＰ １μＭ）において行われた１１回のアッセイそれぞれに関して（任意のユニットで）測定された蛍光を表す。
【図８】図８は、標識されたモノクローナル抗体ｍＡｂ ＳＰ３１に接触させた（領域１）、サブスタンスＰと接触させた（領域２）、そして、キャピラリ−に付着したトライポッドを標識したモノクローナル抗体ｍＡｂ ＳＰ３１に接触させることにより再生された（領域３）（最後の２工程は３回繰り返す）、本発明に従うトライポッド Ｙで官能基化したキャピラリーの時間の関数としての蛍光変化（任意のユニットで）を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アナライトの連続不均一相（heterogeneous-phase）検出のための方法、この方法において使用する３官能性検出試薬、アナライトを検出するためのその使用、並びにアナライトを検出するための対応するデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、実験室条件下において、アナライト及び特に分子を検出することに関して多くの技術がある。しかし、ますます頻繁に、特に健康上や安全上の理由のために、関心のある化合物（トキシン、化学毒性化合物、ホルモン、など）、もしくは関心のある分子から誘導されるまたは関連のある産物、あるいは事象（event）のまたは特定の活性（農薬、重金属、ホルモンなど）のマーカーの存在を迅速に検出することが必要である。
【０００３】
これらの分子は、水、空気、土壌または生物学的試料のような非常に多様なメディウム（media）中、そのほかには食品中に存在し得る。
【０００４】
最適な保護及び／またはモニタリングのために、これらの分子の検出はリアルタイムで及び連続的に行われるべきである。用語「連続的なアッセイ（continuous assaying）」は、メディウム中の関心の深い分子の濃度の存在及び変化を永久的にモニターすることを可能にし得るアッセイを意味すると意図される。
【０００５】
これらの化合物（アナライト）を検出するために今日までに使用される非常に多くの技術において、多くが、ある物質が有する特性、これらのアナライトに特異的に結合して複合体を形成する特性を利用している。これらの物質（これらは「受容体（receptor）」と呼ばれる）は、性質が非常に多様であり得る：生物学的なもの（全体、断片化または組換え型の抗体（Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）、受容体、ポリ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ペプチド核酸、レクチン、輸送タンパク質）または化学物質（キレート、合成受容体）。これらの物質の中で、抗体が最も広く用いられている。
【０００６】
このような検出方法では、シグナルによって、検出されるアナライトと受容体が反応した後に形成される複合体を定量または検出するため、標識が必要である。この標識は、アナライトまたはアナログもしくはアナライトの断片に対応する物質（Ｂ）または受容体のいずれかによって保有され得、この標識分子は、しばしばトレーサーと呼ばれる。
【０００７】
技術が、形成した複合体と遊離している物質の分離を必要とするかしないかによって、均一相（homogeneous-phase）または不均一相（heterogeneous-phase）と呼ばれる２つの主要な検出タイプに分けられる。
【０００８】
均一相アッセイは同じメディウム（medium）で行われる。これらは、複合体の形成が受容体または分子（Ｂ）により保有されるシグナルを変化させる時に用いられる：次に、複合体の形成は、シグナルの測定により直接モニターされ得る。これらの分析は分離工程を必要とせず、それらがより迅速に自動化されることを可能にする。
【０００９】
不均一相アッセイは、アナライトと受容体が反応した後に、非複合体のトレーサーと複合化に関わっているものとを分離することからなる工程を含む。この分離は２つのメディウム（media）または相：例えば固相と液相、を用いてしばしば行われる。
【００１０】
これらの基本的な原理に基づいて、特に使用する標識（例えば酵素的、放射性、またはルミネッセント）の性質について異なる多くのアッセイ方法が、記載されている（Grassi J. et al., Handbook of Experimental Pharmacology, Ed. Springer-Verlag, Berlin, 1987, 87, Chapter 5; Pelizzola D. et al., Q J Nucl. Med., 1995, 39(4) 251-263）。
【００１１】
これらにおいて、ルミネッセント化合物で標識することは、酵素標識の場合のように、他の試薬の存在を必要としない局在化シグナルが得られるという利点を有する。このタイプの標識はまた、エネルギー移動のような現象を使用することも可能とし、これは様々なメカニズム：共鳴エネルギー移動、放射性エネルギー移動（受容体は供与体により放出される光を吸収する）、電子移動に従い行われ得る（Matko J. et al., Biochemistry, 1992, 31, 703-711; Nikoobakht B. et al., Photochemistry and Photobiology, 2002, 75, 591-597）。
【００１２】
このエネルギー移動（ルミネッセント「ドナー」化合物（Ｄ）とルミネッセントであり得るかまたはあり得ない「アクセプター」化合物（Ａ）の間の、そしてＡとＤの距離に依存する）は、多くの分析を行うために使用されてきた。Ｄ及びＡ（これらは受容体またはアナライトと結合する）は、受容体／アナライト複合体が形成された時にのみにエネルギー移動が起こるように選択される。この現象は、Ｄが励起された時、Ｄのルミネッセンスが減少または消滅し、そしてＡからのルミネッセンスが発せられること（仮に後者がルミネッセントであるならば）により反映される。これらの分析においては、Ａのルミネッセンスの変化またはＤのルミネッセンスの変化が測定され、Ａ及びＤの性質が変化する。
【００１３】
このように、様々な著者がすでにＡのルミネッセンスを測定することによりアナライトを検出する方法を提案している：
− 例えば、R. Aral et al.により記載された方法（Protein Engineering, 2000, 13(5), 369-396）は、ドナー及びアクセプターとして、２つの蛍光タンパク質を使用している。これらの２つのタンパク質は分子生物学により製造され、それぞれ、同一の抗体の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のいずれかでそれぞれキメラタンパク質を形成する。抗体が向けられる（directed）分子が存在すると、２つのキメラタンパク質の複合体の形成を誘発する。そして、２つの蛍光タンパク質の距離はエネルギー移動と矛盾しない；ゆえに、Ｄを励起するとＡから蛍光が生じ、これが測定される；
− 国際出願番号ＷＯ９６／４２０１６に従うと、希土類金属（ユーロピウム、テルビウム）とキレート、クリプタートまたはマクロサイクルの錯体（ドナーとして）と蛍光タンパク質（アクセプターとして）を使用し得る。Ａ及びＤはアナライト上で同時に複合化し得る２つの受容体に結合し得、そして後者の存在は、Ｄが励起された時にＡからのルミネッセンスの放出により反映され、あるいはＡが受容体と結合し、及びＤがアナライトと結合し、そしてアナライトが存在すると、受容体と複合化するために、Dと結合したアナライトとの競合を誘発し（競合アッセイ）、そして、Ａのルミネッセンスは添加されたアナライト量に反比例する。このタイプのアッセイはタイム−リソルブドルミネッセンスアッセイ分析（time-resolved luminescence assay）と称される。
【００１４】
他の著者もまた、Dのルミネッセンスを測定することによりアナライトを検出する方法について提案している。これらのアッセイは、（これら化合物が十分に接近している場合）化合物（Ａ）がもう一方の化合物（Ｄ）のルミネッセンスを減少または抑制（「クエンチ（quench）」）する能力を利用している。ゆえに使用し得る分子Ａの範囲は広く、そして重金属、重原子、化学分子（例えばメチルレッド）、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ社（米国）により商品名Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）として販売されているものようなナノ粒子、あるいは商品名ＤＡＢＣＹＬ（登録商標）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ベルギー）、ＱＳＹ Ｄｙｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、米国）、ＥｌｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｏｓｗｅｌｌ／Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）またはＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（登録商標）（Ｂｉｏｓｅａｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、米国）として発売されている分子のような非ルミネッセンス化合物を含む。
【００１５】
例として：
− 米国特許第３９９６３４５号は、受容体として抗体を使用するアッセイにおいて、蛍光／「クエンチャー」分子のペアを使用した方法を記載する；
− M. Adamczyk et al.（Organic Letters, 2001, 3, 1797-1800）により提案された方法は、ドナーとしてバイオルミネッセントタンパク質（Aequorine（登録商標））及びアクセプターまたは「クエンチャー」としてＱＳＹ−７またはＤａｂｃｙｌ（登録商標）を使用している。Ｄはビオチン分子と結合し、そしてＡはアビジン分子と結合する。ビオチン／アビジン複合体の形成はＤのバイオルミネッセンスの減少を生じ、遊離ビオチンまたはタンパク質と結合したビオチンが存在すると、アビジンとの複合化のために、Ｄと結合したビオチンとの競合が誘発され、そしてＤのバイオルミネッセンスは添加したビオチン量と比例する；
− M. Lee et al.（J. Agr. Food Chem., 1999, 47, 2766-2770）及びSchobel et al.（Bioconjugate Chem., 1999, 10, 1107-1114）はドナー及び「クエンチャー」として２つの蛍光分子を使用することを記載している。ドナーは抗体と結合し、及びアクセプターはアナライトと結合する。上記のように、抗体−Ｄ／アナライト−Ａ複合体が形成されるとDの蛍光が減少し、これはメディウム（medium）中にアナライトが存在すると回復する；
− B. Dubertret et al.（Nature Biotechnology, 2001, 19, 365-370）及びBonnet et al.（Proc. Natl. Acad. Sci., 1999, 96, 6171-6176）は、それ自身をフォールディングすることによりそれ自身とハイブリダイズする特性を有するポリ核酸（「ビーコン（beacon）」）を使用することを記載している。その文献に記載される方法に従うと、フルオロフォア化合物（Ｄ）はポリ核酸の３’末端に付着し、及び、アクセプター（Ａ：ナノ粒子またはＤａｂｃｙｌ（登録商標））は５’末端に付着する。「ビーコン」の２つの末端は近接しているため、Ｄの蛍光はＡにより減少される。「ビーコン」の部分とハイブリダイズし得るポリ核酸（アナライト）が存在すると、後者（the latter）の線形化を誘発し、ゆえにDとAの距離が増加し、そして、ＡによるDの蛍光のクエンチングを減少する；
− 米国特許第５２７９９４３号には、重原子をルミネッセンスの「クエンチャー」として使用するアナライトの検出方法が提案されている；
− 米国特許第５２２９３０２号には、メディウム中のアナライトを検出する方法が記載され、ここで化合物は配位子またはそれらのアナログと結合し、抗体／配位子複合体が形成される時、これは、２８０nmで励起した時に抗体により放出される蛍光をクエンチする。メディウム中にアナライトが存在すると、抗体と複合体化の競合が生じ、そして抗体の蛍光を回復する；
− C.T. Chen et al.（Science, 1998, 279, 851-852）は、フルオロフォア及びクエンチャーが付着する合成受容体による、メディウム中のアナライトの検出方法について記載している。アナライトが存在しない場合、クエンチャーはその蛍光を減少するフルオロフォアと十分に近接している。受容体上でアナライトが複合化すると、クエンチャーとフルオロフォアの距離は広がり、そして後者の蛍光が増加する。
【００１６】
上記のエネルギー移動を用いた全てのアッセイは、均一相分析であるということに気づくべきである。
【００１７】
現在、アナライトを連続的に検出することに関して、フローアッセイが適していることが明らかにされており、これは、それらが試料を永久的に供給することを可能にするためである。
【００１８】
そして、フローアッセイのいくつかのタイプがすでに記載されている：
− 何人かの著者は、特に、キャピラリーの壁に固定した抗体を用いてアナライトをアッセイする方法について提案しており、この抗体は標識されたアナライトまたは標識されたこれらのアナログで飽和される。そして、アナライトをキャピラリーに通すと、抗体と結合するために標識されたアナライトとの競合が誘発される。そして、標識されたアナライトの特定の量が放出され、それがキャピラリーから出る時に検出される（特に、米国特許第５１８３７４０号及び第６３２３０４１号及びSheikh et al., Biosensor & Bioelectronics, 2001, 16, 647-652を参照）；
− 逆に、C. Barzen et al.（Biosensor & Bioelectronics, 2002, 17, 289-295）は、検出されるアナライトまたはアナライトのアナログが固定化される固相を用いたアナライトの検出方法について記載している。検出されるアナライトを含む可能性のある試料を標識された抗−アナライト抗体と共にプレインキュベートする。この溶液が固相上を通過する時、複合化していない抗体は、固定されたアナライトを介して固相に付着する。ゆえに、固相上で測定した蛍光シグナルは、試料に存在するアナライト量に反比例する。
【００１９】
− T.E. Plowman et al.（Anal. Chem., 1999, 71, 4344-4352）は、同一の固相上で様々なアナライトを同時にアッセイするアッセイ方法について開発している。この方法に従うと、様々なアナライトを認識する抗体を固相上の異なる場所に固定する。試料（様々なアナライトを含む）とフルオロフォアで標識された様々な抗−アナライト抗体を含む溶液を固相上に付着させる。最終的に、様々な抗体固定部分に対応する捕獲用抗体（capture antibodies）、アナライト及びトレース抗体（trace antibodies）の複合体由来の蛍光を測定する。これまでのアッセイのように、これは試薬を永久的に供給することを含むので、アナライトと標識抗体を混合する必要性が、この方法を連続的なアッセイに応用することを困難にする；
− F.S. Ligler et al.（Environmental Science & Technology, 1998, 32, 2461-2466）は、空気中に存在する分子を検出するためのバイオセンサーを開発した。このバイオセンサーは、アビジン分子が結合する繊維からなる。ビオチン化（biotinylated）抗−アナライト抗体は、アビジン／ビオチン複合体を介してこの繊維に固定される。この繊維の上に試料（空気中に存在し、緩衝液に溶解させた分子）、次にフルオロフォアで標識した抗−アナライト抗体を通過させることにより検出を行う。最終的に、捕獲用抗体、アナライト及びトレース抗体の複合体由来の蛍光を測定する。しかし、この方法を行うためには様々な工程が必要であり、そして標識された抗体を供給すること（これは永続されるべき）は、実際の連続的な検出を可能にしない。
【００２０】
従って、現在までに利用できる全てのフローアッセイは不均一相（固相／液相）アッセイであるということは、先行技術にある様々な既知の検出方法の記載により明らかである。実際、均一相フローアッセイは、標識されたアナライト及び／または受容体の連続した供給を要するであろうし、これは、実行するには高価で及びより難しいであろう。
【００２１】
最終的に、不均一相アナライトアッセイを行うためにキャピラリーを使用することはまた、いくつかの改変（variants）に応じて行われ得る方法に従って、特に米国特許第５９７６８９６号に、提案されている：
− この方法の第１の改変（variant）に従うと、検出されるアナライトに対する最初の受容体を、キャピラリーの内表面に固定する。アナライトを含む試料は、蛍光化合物で標識された第２の受容体（キャピラリーに付着させた最初の受容体と同一の結合部位を有しない）とプレインキュベートする。反応後、この溶液をキャピラリーに導入する；そして、アナライト／標識受容体複合体は、最初の受容体に結合することによりキャピラリー表面に付着する。洗浄後、蛍光シグナル（これは試料中のアナライト量に比例する）を測定する；
− この方法の第２の改変（variant）に従うと、アナライトのアナログをキャピラリーの内表面に固定する。検出されるアナライトを含む試料（アナライトを蛍光化合物で標識するために、あらかじめ受容体とプレインキュベートした）をキャピラリーに導入する。標識された受容体に結合するための競合が、キャピラリーの表面に付着させたアナライトと試料中に存在し得るアナライトとの間で生じる。洗浄後、蛍光シグナル（これは試料中に存在するアナライト量に反比例する）を測定する；
− この方法の第３の改変（variant）に従うと、検出されるアナライトに対する受容体をキャピラリーの内表面に固定する。アナライトを含む試料は、標識されたアナライト、または蛍光化合物により標識したこのアナライトのアナログとあらかじめ混合し、キャピラリーに導入する。次に、キャピラリーの表面に付着した受容体に結合するための競合が、標識された化合物と試料のアナライトとの間で生じる。洗浄後、蛍光シグナル（これは試料中のアナライト量と反比例する）を測定する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
これらのアッセイにおける様々な工程（インキュベート、洗浄）及びアナライトと標識化合物を混合する必要性は、これは試薬を永久的に供給することを含むため、このアッセイを連続アッセイに応用することを困難にしている。
【００２３】
さらに、上述したアナライトの不均一相検出のための全ての方法はほとんどの場合に、新しい試料中の何らかのさらなるアナライトの検出を行うことを可能にする前に行われる固相を再生するという別工程を必要とする。従って、固相を再生するというこの制限される工程は、メディウム中のアナライトを連続的に検出するこれらの様々な方法の応用を妨げる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
そのため、全てのこれらの欠点を改善し、特にアナライトの不均一相検出のための方法（これは実行することが単純であり、自動化し得、固相再生工程がアナライトの検出工程と同時に行われ得、そしてこれは後者を妨げることがない）を提供するために、本発明者は本発明の主題について開発した。
【００２５】
本発明者はまた、検出工程の前に、アナライトと標識抗体または標識アナライトとのインキュベーションを避けられるアナライトの不均一相検出のための方法において用いられ得る新規の試薬を提供することも目的とした。
【００２６】
ゆえに、本発明の第１の主題は、流体試料中のアナライトａを検出するための方法であり、それは次の工程を含むことを特徴とする：
１）以下の３つの官能性極：
ｉ）ルミネッセント基（Ｌ）、
ｉｉ）アナライトａ、アナライトａのアナログまたはアナライトａの断片から選択される分子（Ｂ）；及び
ｉｉｉ）固体支持体の表面に３官能性試薬の付着をもたらす官能基、
を含む少なくとも一つの３官能性試薬（トライポッドＹ）を、その表面の少なくとも一部上に含む固体支持体を、アナライトａに対する受容体で飽和する工程（該受容体は基Ｌのルミネッセンスをクエンチする化合物（Ｑ）（受容体−Ｑ）で標識されて、該分子（Ｂ）と該受容体−Ｑとの複合体Ｃを形成する）；
２）工程１）で得た該固体支持体を、検出されるアナライトａを含み得る流体試料と接触させる工程；
３）基Ｌにより放出されるシグナル強度を測定する工程（これは流体試料に存在するアナライトａの量に比例する）；および
４）該固体支持体を受容体−Ｑに接触させることにより該固体支持体を再生する工程。
【００２７】
この方法に従うと、工程１）では、分子（Ｂ）と受容体−Ｑの複合化を可能にする。この第１工程の最後に、Ｌのルミネッセンスは減少または抑制される。工程２）において、試料を固体支持体の表面に接触させると、該試料がアナライトａ含有する場合は、受容体−Ｑと複合体を形成するために、アナライトａと分子（Ｂ）間の競合を誘発する。アナライトａが受容体−Ｑに結合すると、受容体−Ｑは固体支持体の表面から排除され、そして、トライポッドＹ上に存在する化合物（Ｌ）から放出されるルミネッセンスが回復する。次いで、工程３）で測定されるシグナルの強度は、分析される試料に存在するアナライトａ量に比例する。再生工程４）では再び、トライポッドＹ上の受容体−Ｑを複合化し、そしてＬのルミネッセンスを抑制し、これにより、新しい試料中のアナライトａをさらに検出することが可能になる。
【００２８】
本発明に従うアナライトａの検出方法の原理は、以下のスキームＡに図示する：
【００２９】
【化１】
本発明に従う検出方法は数多くの利点を有する：
１）特に該方法で使用されるトライポッドＹの特定のコンフォーメーションのために、その特性を全く変えることなく、固相の再生からなる工程は非常に容易に行われ得る。実際、上述した全てのフローアッセイにおいて、固相に結合した複合体が形成された後にシグナルが測定される。結局、たとえ、先行技術に記載されたいくつかのアッセイ方法が、いくつかの連続アッセイを可能にしているとしても（Sheikh et al.及び米国特許第５１８３７４０号及び第６３２３０４１号；上述した）、しかしながら、これらは回数が制限されており、及び、しばしば長く及び制限された固体支持体再生工程を必要とし、これにより、形成した複合体は解離する。さらに、これらの再生工程を行うための厳しい条件（酸性または塩基性溶液を通す）は、検出方法が停止させられなければならないことを意味し、ゆえに、与えられたアナライトを連続的に分析するこれらの方法の応用を妨げる。
【００３０】
一方、本発明に従う検出方法に従うと、試料中にアナライトａが存在すると、受容体−Ｑと分子（Ｂ）の解離をもたらし；ゆえに、再生工程は非常に単純に、受容体−Ｑを添加することによりこの複合体を再形成することにある。従って、この再生工程には固相の分子の特性を損なう酸性または塩基性溶液の使用、または受容体結合部位での２つの分子の交換反応を含まず、そのキネティクス（kinetics）は複合体を形成するための反応より長い。
【００３１】
２）トライポッドＹが固定された部分でシグナルが測定され、これは先行技術に従い開発されたアッセイ（特に、上述したSheikh et al.及び米国特許第５１８３７４０号及び第６３２３０４１号、ここで、溶液中の分子に結合したシグナルはキャピラリーの出口で測定される）とは異なり、局在化シグナルを得ることを可能にする。
【００３２】
３）それらが含む分子（Ｂ）の性質に応じて互いに異なるトライポッドＹのいくつかの型を、それらの明確に相違する既知のゾーンに付着することにより、同一固体支持体上で幾つかの分子が同時に検出され得る。
【００３３】
４）測定されたシグナルは、２回の再生の間で固体支持体と接触させたアナライトａの全ての分子に対応する。本発明従う方法のこの特徴は、時間的に間隔をあけた同時測定で得られる永久的なモニタリングを可能にすることである。
【００３４】
５）このアッセイフォーマットは全ての分子に応用可能であり、これは２つの受容体がアナライトに同時に結合することを必要としないためであり、これに対して、これまでに公知のアッセイ方法（例えば上述のT.E. Plowman et al.により述べられた方法に従う方法）では時折必要とされ、そして、アナライトは十分な大きさを有することが必要とされる。
【００３５】
６）試料中にアナライトａが存在するとシグナルが出現し、先行技術から公知の大抵の競合アッセイとは異なり、出現したシグナルはより容易に検出可能である。
【００３６】
７）最終的に、検出システムはエネルギー移動現象を利用するため、仮に蛍光である場合化合物Ｑのルミネッセンスの変化、あるいは化合物（Ｌ）のルミネッセンスの減少がみられる時間の変化によってアナライトａの存在を検出及び定量することも可能にする。
【００３７】
本発明に従う方法の特に好ましい実施形態に従うと、放出されるシグナル強度を測定することからなる工程３）及び固体支持体の表面を再生することからなる工程４）は連続的に行われる。
【００３８】
本発明に従うと、固体支持体は好ましくはそれらの表面で、天然の、または修飾された後に、トライポッドＹの相補性官能基に共有結合性の結合を形成できる官能基を含む物質から選択される。これらの官能基は、特にヒドロキシル、アミン、スルフヒドリルまたはカルボキシル官能基である。
【００３９】
このような物質において、特にガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、セラミック（好ましくは酸化物型）、金属（例えばアルミニウムまたは金）、メタロイド（酸化シリコンのような）が挙げられる。
【００４０】
このような支持体は、特に管、キャピラリー、マイクロプレートのようなプレートまたはビーズ、または本発明に従う方法を実行する上で適した何らか他の形状であり得る。
【００４１】
検出されるアナライトａを含み得るまたは含み得ない流体試料は、性質や由来が多様であり得、例えば、水、液体生物学的メディウム（medium）、または溶存気体分子または固体試料由来の分子を含む代替的な液体であり得る。
【００４２】
工程３）において放出されるシグナル強度は、例えばフルオリメーター(fluorimeter)のようなルミネッセンス検出器(luminescence detector)により測定され得る。
【００４３】
本発明の方法に従うと、飽和工程１）の最後に形成される複合体Ｃは好ましくは以下の式（Ｉ）の複合体から選択される：
【００４４】
【化２】
ここで：
− 矢印はトライポッドＹの骨格構造を表し、これはペプチド、ヌクレオチドまたはグルコシド鎖、あるいは飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖炭化水素ベース鎖からなるリンカーアームであり；前記鎖は、必要に応じて一つ以上のヘテロ原子（Ｎ、ＯまたはＳのような）、及び／または一つ以上のアミノ酸で置換、割り込み及び／または終結され、そして３反応性化学官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３を含み；
− Ｌは反応性化学官能基Ｆ１によりトライポッドＹと共有結合するルミネッセント基を表し；
− Ｂは、アナライトａに特異的な受容体に非共有結合的及び可逆的に付着するアナライトａ、アナライトａの構造アナログまたはアナライトａの断片を表し、該受容体は化合物Ｑで標識され；分子（Ｂ）は反応性化学官能基Ｆ２によりトライポッドＹと共有結合され；
− Ｑは、基Ｌのルミネッセンスをクエンチする化合物を表し；
− Ｆ３はトライポッドＹの前記固体支持体表面への付着を可能にし得る反応性化学官能基を表す。
【００４５】
本発明に従うと、それぞれ互いに無関係な、官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３が：
ｉ）ルミネッセント化合物、分子（Ｂ）または固相上に存在する対応する化学官能基を介する直接的結合か；
ｉｉ）あるいは間接的結合のいずれか
を提供する。この第２の場合、該結合はあらかじめ固相表面の少なくとも一部、分子（Ｂ）及び／またはルミネッセント基に付着させた分子Ｍ２と複合体を形成し得る分子Ｍ１を、官能基Ｆ１、Ｆ２及び／またはＦ３の少なくとも一つにカップリングすることにより実施され得る。例によると、特にビオチンまたはストレプトアビジン（或いはニュートラアビジン(neutravidin)またはアビジン(avidin)）を官能基Ｆ１、Ｆ２及び／またはＦ３の一つに、そして各々ストレプトアビジン（或いはニュートラアビジンまたはアビジン(avidin)）を該固相、分子（Ｂ）及び／またはルミネッセント化合物に結合させることが可能である。本発明に従う方法の他の変化に従うと、この間接的な結合はまた、分子Ｍ３を介して生じ得、一つ以上のルミネッセント化合物または分子（Ｂ）を固相にあらかじめ結合し、これは、官能基Ｆ１、Ｆ２またはＦ３に結合される。分子Ｍ３例において、特にアルブミン及びポリリシンのようなタンパク質、ヌクレオチド、糖または他の合成誘導体が利用され得る。
【００４６】
好ましくは、Ｆ１、Ｆ２及びＦ３は同じでも異なってもよく、次の官能基から選択される：チオール；アミン；アルコール；カルボン酸官能基のような酸性官能基；活性エステルのようなエステル、例えばスクシンイミジル（succinimidyl）エステル及び無水物；イソチオシアナート（isothiocyanates）；イソシアナート（isocyanates）；アシルアジド；スルホニルクロリド；アルデヒド；グリオキサール（glyoxals）；エポキシド；オキシラン；カルボナート（carbonates）；イミドエステル；カルボジイミド；マレイミド；ニトリル；アジリジン；アクリロイル；ハロゲン化（halogenated）誘導体；ジスルフィド基；例えば、ホスフェート、ホスホナート、ホスフィン及びホスファイトのようなリン含有基；ジアゾ；カルボニルジイミダゾール；ヒドラジド；アリールアジド；ヒドラジン；ジアジリン；マグネシウム化合物；リチウム化合物；クプラート（cuprates）；亜鉛化合物及び不飽和系（unsaturated systems）。
【００４７】
これらの様々な官能基及び基の中でも、特に、式Ｒ−ＮＨ２、Ｒ−ＮＨ−、（Ｒ）３−Ｎ、Ｒ−ＮＨ−ＯＲ及びＮＨ２−ＯＲのようなアミン官能基；アルコール官能基Ｒ−ＯＨ；及び式Ｒ−Ｘ（Ｘは塩素、ヨウ素、臭素またはフッ素のようなハロゲン原子を表す）のハロゲン化基；が挙げられ、前記式において、Ｒはアルキル、好ましくはＣ１−Ｃ１５アルキル、アリール、ビニルまたはアリル基を表すものと解される。
【００４８】
本発明に従うと、用語「アリール基」は、一つ以上のベンゼン、ナフタレンまたはアントラセン環を有する任意の芳香族基を意味することが意図され、前記環は必要に応じてＯ、ＮまたはＳのような一つ以上のヘテロ原子を含み、及び、ハロゲン原子及びＣ１−Ｃ４−アルキル、アミノ、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキレンアミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４アルキレンアミノまたはＣ２−Ｃ４アルケニレンアミノ基から選択される一つ以上の基で必要に応じて置換される。
【００４９】
このようなアリール基について、特に、ベンジル、フェニル、クレシル（cresyl）、トルイル、ピリジン、ピリミジン及びピラジン基が挙げられる。
【００５０】
本発明に従うと、用語「ルミネッセント基」は、与えられた波長でまたは与えられた化合物により励起された時、光量子（photon）を放出することができる任意の物質、例えばフルオロフォアまたは希土類金属を意味すると意図される。
【００５１】
このようなルミネッセント基の中で、フルオレセイン（ソジウムフルオレセイナート（sodium fluoresceinate））及びフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）のようなその誘導体；ローダミン及びテトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）のようなその誘導体；ジアミニドフェニルインド（ＤＡＰＩ）；アクリジン；６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸（ＡＭＣＡ）のスクシンイミジルエステルのような反応性アミンを有する蛍光色素；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（米国）から販売されているＢｏｄｉｐｙ（登録商標）ＦＲ−Ｂｒ２、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）Ｒ６Ｇ、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）ＴＭＲ、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）ＴＲ及びＢｏｄｉｐｙ（登録商標）５３０／５５０（励起波長／エミッション波長，ｍｍで）、５５８／５６８、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０及び６５０／６６５のような商標名Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）で販売されている蛍光色素、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ色素（Ｔｒｉｌｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）、Ｄａｂｃｙｌ（登録商標）及びＥｄａｎｓ（登録商標）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ベルギー）；エオシン；エリスロシン；６−Ｆａｍ及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄが挙げられる。
【００５２】
本発明に従うと、用語「受容体」は、アナライト、アナライトのアナログまたは後者の断片と非共有結合及び可逆的な結合（複合体）を形成できる任意の物質を意味することが意図される。この受容体は、もちろん、トライポッドＹの分子（Ｂ）の性質に応じて選択される。
【００５３】
これらの受容体は特に、生物学的な特性を有する化合物（全体の、断片化または組換え型の抗体（Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）、受容体、ポリ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ペプチド核酸、レクチン或いはトランスポータータンパク質）及び、例えば特異的に合成された受容体及びキレートのような化学的な性質を有する化合物から選択され得る。
【００５４】
このような受容体の中で、例えば、モノクローナル抗サブスタンスＰ、抗プリオンタンパク質または抗アンギオテンシンＩＩ抗体、ポリヒスチジン、ニトリロ−三酢酸−ニッケル（ＮＴＡ−ニッケル）系、及び相補的なヌクレオチドプローブが挙げられる。
【００５５】
本発明に従う検出方法の好ましい実施形態において、前記受容体は分子（Ｂ）に対してよりアナライトａに対して高い親和性を示す。
【００５６】
本発明に従うと、用語「クエンチング（quenching）化合物」（Ｑ）は、受容体が分子（Ｂ）と複合化した場合にルミネッセント化合物（Ｌ）のルミネッセンスの減少または消失を可能にする任意の分子を意味することを意図する。この化合物（性質は多様であり得る）は特に化学的な化合物（ルミネッセントまたは非ルミネッセント）、重原子またはナノ粒子であり得る。
【００５７】
このような化合物（Ｑ）において、特に、上述した基Ｌ、ローダミン及びテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）のようなその誘導体、商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）１、２及び３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｎａｎｏｇｏｌｄ Ｐａｒｔｉｃｌｕｅｓ（登録商標）（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）、Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｅｌｌｅ Ｑｕａｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｏｓｗｅｌｌ）、マラカイトグリーン及び色素ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９及びＱＳＹ（登録商標）２１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で販売されている化合物のような非蛍光分子が挙げられる。
【００５８】
分子（Ｂ）がペプチドまたはオリゴヌクレオチドである場合、本発明に従う方法に従い使用されるトライポッドＹは、官能基（Ｆ１）を含む少なくとも一つのアミノ酸（または修飾ヌクレオチド）及び官能基（Ｆ３）を含むもう一方のアミノ酸（または修飾ヌクレオチド）が前記分子（Ｂ）に添加されている間にペプチドまたはオリゴヌクレオチド合成を行うことにより調製され得、Ｆ１及びＦ３は、上述したものと同様の意味を有する。この場合、Ｆ１及びＦ３はまた、それぞれ、ルミネッセント化合物（Ｌ）及び固相表面との結合を提供する。まさに上のように、化学官能基Ｆ１及びＦ３を含むアミノ酸（またはヌクレオチド）はまた、ビオチン（例えば、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−リシン（ビオチン）−ＯＨ産物、これはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧにより販売されている）と結合したアミノ酸（またはヌクレオチド）で置換され得る。この場合、このアミノ酸（またはヌクレオチド）は、ストレプトアビジン（またはニュートラアビジンまたはアビジン）があらかじめ結合している固相表面、またはルミネッセント化合物（Ｌ）との結合を提供し、間接的な結合を形成する。
【００５９】
本発明に従う式（Ｉ）の複合体Ｃの中で、特に以下の化合物が挙げられ得る：
ｉ） （Ｂ）はペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、糖及びペプチド核酸から選択され、
ｉｉ） Ｌはフルオレセインであり、そして
ｉｉｉ） トライポッドＹの骨格は以下の構造Ｙ１〜Ｙ３から選択される：
【００６０】
【化３】
ここで、ｎ、ｍ及びｐは同じでも異なってもよく、１〜２０までの整数である。
【００６１】
構造Ｙ１〜Ｙ３の中で、以下の式（Ｙ’１）〜（Ｙ’３）の化合物は特に好ましい。
【００６２】
【化４】
本発明に従う方法で使用されるトライポッドＹは、慣用的に使用される及び当業者に周知の有機及びペプチド合成の方法に従う類似のもの（analigy）により調製され得る。
【００６３】
上述した式（Ｉ）の複合体Ｃはそれら自身新規の化合物であり、これは、この点で本発明の他の主題を構成する。
【００６４】
式（Ｉ）の複合体Ｃは、先行技術においても慣用的に使用されてきた方法に従い、本発明に従うトライポッドＹと受容体Ｑが複合化することにより調製され得る。
【００６５】
本発明の主題はまた、流体試料中のアナライトａの連続的な不均一相検出方法における、式（Ｉ）の少なくとも一つの複合体Ｃの使用である。
【００６６】
最後に、本発明の主題は、流体試料中の少なくとも一つのアナライトａの連続的な不均一相検出を行うためのデバイスであり、前記デバイスは、分析される流体試料が上述した本発明に従う少なくとも一つのトライポッドＹに付着した及び検出されるアナライトａに特異的な表面で、少なくとも一つの固体支持体上を流れるストリームを形成しているメディウムに統合され、固体支持体の反対に位置するルミネッセンス検出器が、該検出器により放出されるシグナルの強度の閾値により制御され及びトライポッドＹとの複合体を形成し得る受容体Ｑを含むリザーバを、与えられた時間、開放する引き金となるバルブコントロールにカップリングされ（このリザーバは、トライポッドＹが付着する固体支持体の上流にくるフィードバックループを介して支持体と結合する）、これにより該ストリームを通過し、及びトライポッドＹ上での複合化により後者を受容体−Ｑで飽和及び／または再生することを特徴とする。
【００６７】
特定な実施形態に従うと：
− ルミネッセンス強度値をモニターし、ルミネッセンス検出器に連動した計算システムによりアナライトａ量に二次的に翻訳される；
− イベントマーカー（例えばアラーム）はフィードバック中に位置し、あらかじめ決定した値を超えるシグナル強度の変化を表示し；
− 固体支持体は分析される試料を含む環境と結合したキャピラリーであり、この結合は試料がフローストリーム（flow stream）のそれに応じてメディウム中に分散する丸底キャプチャー（capture）フラスコにより、もしくは柔軟性のあるパイプにより行われ；
− 該ストリームはポンプ、ピストンまたは同等のものにより生み出された低圧により生じる（entrained）。
【００６８】
これらのデバイスは、特に、天然メディウム（medium）中、例えば、特に湖及び河川、あるいはスミングプール、工場、浄水場、換気装置または空調システムなどのような産業メディウム（media）中のアナライトａの存在を検出するために使用され得る。適切な場合、ガス状態の（例えば空気のような）試料を収集するために及びそれらが含む検出される成分を溶解するために、丸底キャプチャーフラスコ及びスパージングシステムが、それらに備え付けられ得る。
【００６９】
上述したことに加えて、本発明はまた次の記載から現われるであろう他の装置を含み、これはトライポッドＹの骨格の合成例、式（Ｉ）の化合物の合成例、及び流体試料中のサブスタンスＰを検出する２例、並びに、添付の図１〜８に述べる、ここで；
− 図１は、浄水場タンク内のアナライトａの存在を測定するための、本発明に従う不均一相検出デバイスの制限のない例の一般的な図を示す。このデバイスに従うと、タンクの出口に接続する柔軟性のある管１の一部を、キャピラリー管３の上に取り付ける。この管は、本発明に従う２つのタイプのトライポッド、すなわちＹａ及びＹｂを取り付けるための支持体として働き、これにより２つのタイプのアナライトの特異的な検出を可能にする。タンク由来の液体試料は、蠕動ポンプ５の作用によりキャピラリー３内を連続的なストリーム（矢印Ｆａ）として流れ、そして排出される。キャピラリー及びトライポッド Ｙａ及びＹｂが取り付けられているキャピラリーの各部分の反対側付近で、蛍光を検出できるように、フルオリメーター、７ａ及び７ｂを配置する。各検出器は、それぞれトライポッドＹａ及びＹｂにそれぞれ特異的な受容体−Ｑのリザーバ９ａ及び９ｂと連結させる。リザーバはサイドチャンネル１１ａ及び１１ｂ及び共通チャンネル１１ｃを介してキャピラリー３に接続され、トライポッドＹａ及びＹｂが取り付けられている部分の上流は、ストリームの流れの方向に関係する。共通チャンネルは、キャピラリー３及び全てのチャンネル型フィードバックループに垂直に結合する。対応するリザーバ（それぞれ９ａ及び９ｂ）を開放するために、各検出器はバルブコントロール（それぞれ１３ａ及び１３ｂ）に接続し、そして、それの内容物がキャピラリー３に注ぎ込まれ（矢印Ｆｂ）、そしてチャンネル１１ａ、１１ｂ及び１１ｃを介して対応する特定のトライポッド（ＹａまたはＹｂ）上で複合化することを可能にし、このトライポッドを再生する。この例において、再生は連続的に行われ得、この再生操作をトリガーするための閾値は、検出器の感度に従って検出され得るルミネッセンスの最小の変動に対応する。イベントマーカー１５ａ（それぞれ１５ｂ）は、各々のフィードバックループに取り付けられる。操作モードにおいて、キャリブレーション後に、トライポッドＹａ及びＹｂにより放出された蛍光シグナルＩａ及びＩｂの強度はフルオリメーターにより測定され、付属の計算デバイス（示されない）を使用して、試料中の測定対象とするアナライトの平均濃度を計算し得る。バルブ開放コントロール１３ａ（それぞれ１３ｂ）は、対応する検出器により測定される蛍光シグナルの強度により制御される。そして、対応するバルブが開放することは、関係するトライポッドの再生と一致する時間の引き金となる。仮に再生中にアナライトａが試料中の存在すると、それら（アナライトａと複合化している幾つかの受容体−Ｑ）の持続時間が長くなる。再生持続時間は、蛍光が基準とするレベルにまで戻るために要する時間により決定され得る；仮に、これがあらかじめ決められたよりも高い場合、イベントマーカーがトリガーされ得る。与えられる時間間隔に関して（for a given time interval）、あらかじめ決定した値より高いためにシグナル強度が変化する場合、イベントマーカー１５ａ（それぞれ１５ｂ）は、視覚及び／または音の警告１６によりこの事実を合図する。そして、仮に、蛍光シグナルが２回の再生の間にキャピラリーを通過した全てのアナライトａに対応する場合、蛍光はまた規則的な時間間隔で読まれ得る。他の例において、試料がガスの場合、用いられるメディウム（medium）及びストリームを作り出す方法は当業者により改造される；
− 図２は、μＭのトライポッド濃度の関数として、化合物（Ｌ）としてフルオロセイン及び分子（Ｂ）としてサブスタンスＰのアナログを含むトライポッドＹをニュートラアビジンを介してマイクロタイトレーションプレート上に固定した後に、任意の単位で、測定した蛍光を表し；
− 図３は、トライポッドと複合化するテトラメチルローダミン標識抗サブスタンスＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ）（ｎＭで）の量の関数として、化合物（Ｌ）としてフルオロセインと分子（Ｂ）としてサブスタンスＰアナログを含むトライポッドの蛍光の減少曲線（任意のユニットにおける）を表し；
− 図４は、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲにより生じる蛍光減少のサブスタンスＰによる抑制率を表し（％ ＩＤ）、これはサブスタンスＰの濃度（ｎＭで）の関数として表される；
− 図５は、本発明に従うトライポッドＹが取り付けられた固体支持体を接触させた後に（任意のユニットで）測定された蛍光を表し、前記トライポッドは、第一アッセイにおいては、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（ウェルＦｌ：ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ及びサブスタンスＰが存在しない場合に測定された蛍光、及びウェルＦｌ０：ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲは存在し、サブスタンスＰが存在しない場合に測定された蛍光）、及び様々な濃度のサブスタンスＰ（ウェルＦｌＸ：ｘ＝サブスタンスＰの濃度：１；０．１または０．０１μＭでｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲが存在する場合に測定された蛍光）と複合化され得、及び支持体再生の後に、最終的には、ウェルは再びサブスタンスＰの３つの濃度と接触させた後である；
− 図６は、１１回のサブスタンスＰ−アッセイと再生サイクル後に、ウェルＦｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘのそれぞれに関して（任意のユニットで）測定された平均の蛍光を表し；
− 図７は、ウェルＦｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘ（ｘ＝サブスタンスＰ １μＭ）において行われた１１回のアッセイそれぞれに関して（任意のユニットで）測定された蛍光を表し；
− 図８は、標識されたモノクローナル抗体ｍＡｂ ＳＰ３１に接触させた（領域１）、サブスタンスＰと接触させた（領域２）、そして、キャピラリ−に付着したトライポッドを標識したモノクローナル抗体ｍＡｂ ＳＰ３１に接触させることにより再生された（領域３）（最後の２工程は３回繰り返す）、本発明に従うトライポッド Ｙで官能基化したキャピラリーの時間の関数としての蛍光変化（任意のユニットで）を表す。
【実施例】
【００７０】
実施例１：本発明に従うトライポッドＹの式（Ｙ’１）の骨格の調製
１当量の１，２−エチルジアミンを２当量の（Ｂｏｃ）２Ｏと反応させてビス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）−１，２−エチルを生じ、続いて水素化ナトリウム存在下で１当量のフェニル３−ブロモプロパノエート（phenyl 3-bromopropanoate）と反応させ、以下の式（Ｙ’１ａ）の化合物を得る。
【００７１】
【化５】
化合物Ｙ’１ａはトリフルオロ酢酸メディウム（medium）で脱保護し、そして得られた脱保護化合物はトリエチルアミン（ＴＥＡ）及び１当量のＺクロライド（Ｚはカルボベンジルオキシ）存在下で縮合し、以下の式（Ｙ’１ｂ）の化合物を得る。
【００７２】
【化６】
Ｓ−（３−クロロプロピル）エタンチオエート（ethanethioate）及びＴＥＡ存在下で、式（Ｙ’１ｂ）の化合物は以下の式（Ｙ’１ｃ）の化合物を与え：
【００７３】
【化７】
ここで、Ｚは上記の式（Ｙ’１ｂ）の化合物で示すものと同じ意味を有し、及びＢｚはベンジル基を表す。
【００７４】
式（Ｙ’１ｃ）の化合物の酸及び第一級アミン官能基をパラジウム炭素（palladium-on-charcoal）存在下で脱保護し、そしてチオール官能基をヒドロキシルアミンの作用により脱保護し、式（Ｙ’１）の化合物を得る。
【００７５】
実施例２：本発明に従うトライポッドＹの式（Ｙ’２）の骨格の調製
３−ブロモプロピオン酸及びチオ酢酸から調製された３−［（２−オキソプロピル）チオ］プロピオン酸を上記実施例１で得られた式（Ｙ’１ｂ）の化合物と反応させ、以下の式（Ｙ’２ａ）の化合物を得る。
【００７６】
【化８】
ここで、Ｚはカルボベンジルオキシ基を表し、及びＢｚはベンジル基を表す。
【００７７】
上述した式（Ｙ’２ａ）の化合物の酸性及び第一級アミン官能基は、パラジウム炭素存在下で脱保護し、そしてチオール官能基はヒドロキシルアミンの作用により脱保護し、上述した式（Ｙ’２）の化合物を得る。
【００７８】
実施例３：本発明に従うトライポッド Ｙの式（Ｙ’３）の骨格の調製
水素化ナトリウム存在下で１当量の２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジオールと１当量のエチル３−ブロモプロパノエートを反応させ、エチル３−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロポキシ］プロパノエートを得る。続いて水素化ナトリウム存在下で、この化合物を１当量のｔｅｒｔ−ブチル３−ブロモプロピルカルバマート（tert-butyl 3-bromopropylcarbamate）と反応させ、以下の式（Y’３ａ）の化合物を得る。
【００７９】
【化９】
続いて、上記の式（Y’３ａ）の化合物をトリフルオロ酢酸メディウム（medium）中で脱保護し、そして水酸化ナトリウム存在下でジチオキソメタンと反応させ、そしてカルボキシル基をエタノール／硫酸混合液中で再保護し、以下の式（Y’３ｂ）の化合物を得る。
【００８０】
【化１０】
続いて上記の式（Y’３ｂ）の化合物を水素化ナトリウム存在下で１−（３−ヨードプロピル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンと反応させ、以下の式（Y’３ｃ）の化合物を得る：
【００８１】
【化１１】
そして、水酸化ナトリウム存在下で化合物（Y’３）を得る。
【００８２】
実施例４：本発明に従うトライポッドＹの調製
この実施例は、以下を含む本発明に従うトライポッドＹの調製を説明する：
− 分子（Ｂ）としてのサブスタンスＰアナログ、
− 固体支持体（Ｆ３）の表面にトライポッドを結合するためのＮＨ２官能基、
− ルミネッセント化合物（Ｌ）としてのフルオレセイン。
【００８３】
１）サブスタンスＰアナログの調製
興味深いことに、サブスタンスＰ（分子量：ＭＷ＝１３４９）のシークエンスは以下のようであり：
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＯＮＨ２
即ち（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）−ＣＯＮＨ２である。
【００８４】
以下のシークエンスに対応するサブスタンスＰアナログ（ＭＷ＝１９０７）を調製する：
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（ビオチン）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＣＯＮＨ２；
即ち（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−ＣＯＮＨ２である。
【００８５】
これを行うために、サブスタンスＰアナログとビオチンの、並びにＮＨ２官能基の結合は、当業者に公知の方法に従うペプチド合成、例えばMerrifirld（J. Am. Chem. Soc., 1964, 85, 2149-2154）により述べられる固相合成、の手順で行う。サブスタンスＰアナログは１０位にアラニンを含む［Ａｌａ１０］サブスタンスＰのペプチドアナログであり、これはモノクローナル抗体ＳＰ３１に対するサブスタンスＰと１３％交差反応が見られ（O. Dery, Biopolymers, 1996, 39, 67-74）、これは受容体として後述するアッセイにおいて使用される。モノクローナル抗体ＳＰ３１（ｍＡｂ ＳＰ３１）はサブスタンスＰと比較してこのアナログに対するこの低い親和性のため、固相に付着する抗体からより良く置換できるであろう。このアナログに関して、側鎖に存在する第一級アミンを除去するために、３位のリシン（Ｌｙｓ３）をまたアラニンで置換した。Ｌｙｓ３はｍＡｂ ＳＰ３１の認識部位にはないため、この置換はアナログに対する抗体の親和性を改変しない。さらに、Ｎ末端は側鎖にビオチン分子を有するリシン（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ビオチン）−ＯＨ）の付加により修飾され、そして二つのセリンは二つのＮＨ２官能基を有するリシンに続き、これらの一つはその側鎖上に存在する。
【００８６】
合成後、得られた化合物は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、そして凍結乾燥する。
【００８７】
２）フルオロセイン（Ｌ）によるサブスタンスＰアナログの標識
上述した１）で得られた化合物１００μｇ（５．２８×１０−８ｍｏｌ）を１００μｌの０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９）に溶解する。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の
フルオレセイン−ＮＨ−スクシンイミド（ＭＷ ５８６．５５）（６−（フルオレセイン−５−（及び−６）−カルボキサミド）ヘキサン酸、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社により参照番号Ｆ−６１２９で販売されているスクシンイミジルエステル）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３０．８μｌ（５．２８×１０−７ｍｏｌ）を続いて添加した。４℃の温度で１６時間撹拌した後、１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）を添加し、そして、４℃で１６時間撹拌を続け、残りの活性エステル官能基を不活化する。最終的に、７６９．２μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）及び０．０１％のソジウムアジドを添加する。本発明に従うトライポッドＹの溶液（５２．８μＭ）を得る。このトライポッドは４℃の温度で保存する。
【００８８】
実施例５：試料中のサブスタンスＰの検出およびアッセイ
１）受容体−Ｑの調製：テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）（Ｑ）による抗サブスタンスＰモノクローナル抗体ＳＰ３１の標識（ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ複合体）
ＴＭＲ（ＭＷ ５２７．５）の溶液（ＤＭＦ中の５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社により参照番号Ｃ１１７１で販売されている、５０ｍｇ／ｍｌ（１７６μｇ；３３３ｎｍｏｌ））３．５μｌを、０．１Ｍホスフェート緩衝液（ｐＨ７．４）中のｍＡｂ ＳＰ３１（１．１３６ｍｇ／ｍｌ（１ｍｇは６．６７ｎｍｏｌに相当する））８８０μｌに添加する。４℃で１６時間撹拌した後、１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）を添加し、次いで、４℃で１６時間撹拌を続け、残りの活性エステル官能基を不活化する。最終的に、標識した抗体は、ソジウムアジド０．０１％を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中でＧ−２５ゲル上の排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ｆｉｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により遊離のＴＭＲから分離する。抗体に対応する画分を合わせ、そして、１ｃｍの光学経路長のキュベットを使用して２８０及び５５５ｎｍで溶液の吸光度を測定する。
【００８９】
抗体濃度は次の等式に従って計算する：
濃度（Ｍ）＝［Ａ２８０・（Ａ５５５×０．３）］／ε
ここで：
− Ａ２８０は２８０ｎｍでの吸光度であり
− Ａ５５５は５５５ｎｍでの吸光度であり
− ０．３は２８０ｎｍ及び５５５ｎｍでのＴＭＲの吸光度の比であり
− εはモル吸光係数（ＩｇＧに関して、ε＝２０３０００ｃｍ−１Ｍ−１）である。
【００９０】
標識した抗体の濃度１．３６μＭを得た。
【００９１】
標識の程度次の等式に従い計算でき得る：
抗体分子あたりのＴＭＲ分子数＝Ａ５５５／（６５０００×抗体濃度）
ここで、数６５０００はＴＭＲの５５５ｎｍでのモル吸光係数に対応する。
【００９２】
抗体モルあたり３．６ｍｏｌＴＭＲを得る。
【００９３】
２）固体支持体の調製：ニュートラアビジンを用いた表面の官能化
固体支持体上で上記の実施例４において調製したトライポッドＹを固定できるように、第一段階として、後者をニュートラアビジンで官能化した。
【００９４】
ａ）用いた試薬
飽和緩衝液：
− ０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４；
− ０．１５Ｍ ＮａＣｌ；
− シグマ社により参照番号Ａ−７９０６で販売されている牛血清アルブミン（ＢＳＡ）：０．１％；
− ０．０１％ ソジウムアジド。
【００９５】
洗浄緩衝液：
− ０．０１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４；
− Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０：０．０５％。
【００９６】
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ社により参照番号３１０００で販売されている）の溶液（５μｇ／ｍｌ）１００μｌを、ＶＷＲ社により商品名Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｍａｔｒｉｘで販売されている（参照番号８０１２０６９６）黒色マイクロプレートのウェルに注ぐ。周囲温度で１６時間後、プレートは洗浄緩衝液で洗浄し、次いで周囲温度で１６時間、３００μｌ／ウェルの飽和緩衝液を注ぐことにより飽和する。プレートは同じ緩衝液（３００μｌ／ウェル）で、４℃で保存する。
【００９７】
３）本発明に従う（フルオレセインで標識した）トライポッドＹのマイクロタイトレーションプレートへの付着
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）による、上記の実施例４において合成したトライポッドＹ（フルオレセインで標識）の希釈範囲は、０．５μＭ濃度を範囲の最初の点として４つの連続的な１／３希釈（即ち０．１６７μＭ；０．０５５μＭ；０．０１８５μＭ及び６．２×１０−３μＭ）を作ることにより調製する。各濃度１００μｌを、デュプリケートで、ニュートラアビジンでコートしたまたは飽和工程だけを行った（ネガティブコントロール）ウェル中に注ぐ。撹拌しながら周囲温度で３時間インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、次いで１００μｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぐ。マイクロプレートを読むために、励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３０ｎｍ（これはフルオロセインに対応する励起及び発光波長）で、アナリストＡＤシステムフルオリメーター（ＬＪＬ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）によりプレートを読む。
【００９８】
結果
ニュートラアビジン（黒四角）あり及びニュートラアビジンなし（黒三角：コントロール）で得られた曲線を添付の図２に表し、ここで、蛍光（任意のユニットで）は、本発明に従うトライポッドＹの濃度（μＭ）の関数として表される。
【００９９】
これらの結果は、０．１７μＭの濃度までは本発明に従うトライポッドの濃度のそれに比例して蛍光が増加すること、そして、トライポッドによるニュートラアビジン結合部位の飽和に対応して平らになることが分かる。固定したニュートラアビジンがない場合、蛍光の増加は観察されない。
【０１００】
以下の実施例において、実施例のトライポッドＹは２０ｎｍの濃度で使用され、これらの結果から判断すると、十分なシグナルが得ることが可能である。
【０１０１】
４）複合体Ｃを形成するための、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲによる固相の飽和
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）における、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲの希釈範囲は、１００ｎＭの濃度の範囲を最初の点とし、そして６つの３倍希釈を作成することにより調製する。デュプリケートで、各濃度１００μｌを実施例４のトライポッドＹの溶液（０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中２０ｎＭの溶液）１００μｌをマイクロプレートのウェルに注ぐ。４℃で１６時間インキュベートした後、マイクロプレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、そして０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１００μｌを注ぎ、次いで蛍光を測定する。
【０１０２】
得られた結果は添付の図３に示し、ここで測定した蛍光（任意のユニットで）はｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲの濃度（ｎＭ）の関数として表される。
【０１０３】
これらの結果は、１ｎＭの抗体濃度から、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲの濃度に比例して蛍光が減少し、３３ｎＭのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲの濃度を使用した時、最大７０％までの抑制が得られることを示す。この結果は以下のことを示す：
ｉ）エピトープを認識することにより、抗体は本発明に従うトライポッドＹと複合化し、
ｉｉ）本発明に従うトライポッドＹのコンフィギュレーションは、フルオレセインからＴＭＲに至る共鳴エネルギー移動を可能とし、これによりフルオロセインの蛍光が減少する。
【０１０４】
５）固体支持体上のサブスタンスＰの検出
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）による、サブスタンスＰの希釈範囲は、２００ｎＭの濃度を範囲の最初の点とし、そして６つの３倍希釈を作成することにより調製する。そして、１００μｌの実施例４において調製したトライポッド（２０ｎＭ）及び１００μｌのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（３０ｎＭ）（またはネガティブコントロールウェルとして１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を各ウェルに注ぐ。撹拌しながら５時間周囲温度でインキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、そして１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぎ、そして蛍光を測定する。
【０１０５】
得られた結果は添付の図４に示され、ここで、サブスタンスＰ濃度の関数として（ｎＭで）、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲにより生じるサブスタンスＰの蛍光減少の抑制割合（％ ＩＤ）が示される。
【０１０６】
この抑制割合は、次の等式を使用して計算する：
％ ＩＤ＝［（Ｆｌｘ−Ｆｌ０）／（Ｆｌ−Ｆｌ０）］×１００
ここで：
− Ｆｌｘは濃度ＸのサブスタンスＰ存在下で測定した蛍光に対応し；
− ＦｌはｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ及びサブスタンスＰ非存在下で測定した蛍光に対応し；
− Ｆｌ０はｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ存在下及びサブスタンスＰ非存在下で測定した蛍光に対応する。
【０１０７】
これらの結果は、予想されたように、サブスタンスＰの濃度の増加はフルオロセインの蛍光増加を誘発すること（減少の抑制に対応して）を示す。このように標準の曲線が得られ、サブスタンスＰの検出限界はおおよそ２ｎＭである。
【０１０８】
６）固相再生試験
サブスタンスＰの３つの希釈液（それぞれ１、０．１及び０．０１μＭ）を０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製する。そして、１００μｌの上記実施例４において調製したトライポッドＹ及び１００μｌのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（５０ｎＭ）（またはネガティブコントロールウェル：Ｆｌ０ウェルに関しては０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、１００μｌ）を各ウェル中に注ぐ。ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲは５０ｎＭで使用し、固相上に存在する全てのトライポッドを複合化する。４℃で１６時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、そして、トリプリケートで、各濃度のサブスタンスＰ １００μｌを注ぐ（Ｆｌｘウェル）。Ｆｌ及びＦｌ０ウェルはまたトリプリケートで調製する。撹拌しながら周囲温度で５時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、そして、１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぎ、そして蛍光を測定する（第一アッセイ）。
【０１０９】
プレートは上述と同じ方法で再度洗浄し、そして、１００μｌのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（５０ｎＭ）（またはＦｌウェルに関しては１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を４℃で１６時間インキュベートする。プレートは再び洗浄し（５回）、そして、１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぎ、そして蛍光を測定する（プレート再生工程）。
【０１１０】
プレートは再度洗浄し（５回）、そしてＦｌ及びＦｌ０ウェルについて、１００μｌのリン酸カリウム緩衝液もしくは１００μｌのサブスタンスＰ（１、０．１及び０．０１μＭ）のいずれかを注ぐ。撹拌しながら５時間周囲温度でインキュベートした後、プレートを洗浄し（５回）、そして、１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぎ、そして蛍光を測定する（第二アッセイ）。
【０１１１】
得られた結果は添付の図５に示し、ここで、Ｆｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘウェルについて測定した蛍光（任意のユニットで）は、第一及び第二アッセイにおいて、そしてまた再生工程の後に行った測定についても示される。
【０１１２】
これらの結果は：
ｉ）検出方法の様々な工程（注入、洗浄）は固相から本発明に従うトライポッドＹの解離をもたらさない：Ｆｌウェルにおいて測定した蛍光は一定である；
ｉｉ）ｍＡｂ ＳＰ３１の注入は、固相の一様な再生：全てのＦｌｘ及びＦｌ０ウェルは同じ蛍光値、を可能にする；
ｉｉｉ）完全な再生が得られる：再生工程の後にＦｌｘウェルについて測定した蛍光は第一アッセイで行うＦｌ０ウェルのそれと同様である；
ｉｖ）同一のサブスタンスＰ濃度において同じ蛍光値が得られるため、この再生工程は同じ固相上で続いて行われる第二アッセイと適合性である、
ことを示す。
【０１１３】
７）同じ固相上での繰り返しアッセイの実現可能性の証明
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で、サブスタンスＰの３つの希釈液（１、０．１及び０．０１μＭ）を調製する。
【０１１４】
ｉ）１００μｌの上記実施例４において調製したトライポッド（２０ｎＭ）及び１００μｌのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（５０ｎＭ）または１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（ネガティブコントロール：Ｆｌ０ウェル）をマイクロプレートの各ウェル中に注ぐ。ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲは５０ｎＭの濃度で使用し、固相上に存在する全てのトライポッドを複合化する。４℃で１６時間インキュベート後、マイクロプレートを洗浄緩衝液で洗浄し（５回）、そして、トリプリケートで、各濃度のサブスタンスＰ １００μｌを注ぐ。Ｆｌ及びＦｌ０ウェルもまたトリプリケートで調製する。撹拌しながら周囲温度で５時間インキュベート後、マイクロプレートを洗浄し（５回）、そして、１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を注ぎ、そして蛍光を測定する（第一アッセイ）。
【０１１５】
ｉｉ）プレートは再度洗浄し（５回）、そして、１００μｌのｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（５０ｎＭ）（またはＦｌウェルに関しては１００μｌの０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を４℃で１６時間インキュベートする（再生工程）。
【０１１６】
ｉｉｉ）プレートは再度洗浄し（５回）、そして、Ｆｌ及びＦｌ０について、１００μｌのホスフェート緩衝液もしくは１００μｌのサブスタンスＰ（１、０．１及び０．０１μＭ）のいずれかを注ぐ。撹拌しながら周囲温度で５時間インキュベート後、プレートを洗浄し（５回）、そして、１００μｌのホスフェート緩衝液を注ぎ、そして蛍光を測定する（第二アッセイ）。
【０１１７】
工程ｉｉ）及びｉｉｉ）の引き続くアッセイを繰り返すために、ホスフェート緩衝液、Ｆｌ０として、及び様々な濃度のサブスタンスＰを注ぐウェルを変化させる。
【０１１８】
そして、同じ固相上で１１回の連続的なアッセイを行う。
【０１１９】
得られた結果は添付の図６及び７に示す。
【０１２０】
図６において、蛍光（任意のユニット）は、Ｆｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘの各ウェルについて、行われた１１回のアッセイの平均値に相当する。図７において、蛍光（任意のユニット）は、Ｆｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘの各ウェルについてｘ＝１μＭのサブスタンスＰで行われた１１回の各アッセイで得られた値に相当する。
【０１２１】
これらの結果は、サブスタンスＰの各濃度について、蛍光値は規則正しく、サブスタンスＰ非存在下で得られるものより高いことを表す。さらに、観察されたばらつきはランダムである：一連のアッセイを通して、蛍光に漸進的に減少することまたは増加することはない。
【０１２２】
これらの結果はまた、本発明に従う検出方法は固相上でアナライトを繰り返し分析することが可能であることを示し、各ウェル（または反応サイト）が等価な方法で再生されること、及び連続したさらなる検出することが可能である。
【０１２３】
実施例６：サブスタンスＰの検出及びキャピラリー中での再生
１）手順
ａ）使用する試薬の調製
− 蛍光分子によるトライポッドの標識：
商品名Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２タンパク質標識キット、参照番号Ａ−１０２３６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で販売されている蛍光分子による配列番号２（実施例４で上述したように）の配列のサブスタンスＰアナログの標識は、実施例４に記載したプロトコールに従い行う。トライポッド−Ａｌｅｘａ ５３２を得る。
【０１２４】
− 受容体Ｑの調製：蛍光分子でのｍＡｂ ＳＰ３１抗体の標識（ｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７複合体）：
商品名Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７サクシンイミジルエステル、参照番号Ａ−２０００６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で販売されている蛍光分子によるｍＡｂ ＳＰ３１の標識を、実施例５の工程１）に上述したプロトコールに従い行う。ｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７標識抗体を得る。
【０１２５】
− キャピラリーの調製：
四角形の横断面（square cross section）を有するボロシリケート製のキャピラリーを使用する（内寸＝０．５ｍｍ、外寸＝１ｍｍ、長さ＝２５ｍｍ）（Ｗａｌｅ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）。キャピラリーはニュートラアビジンで官能化し、そしてトライポッド−Ａｌｅｘａ ５３２の溶液中（５μＭの溶液）、４℃で一夜インキュベートする。
【０１２６】
ｂ）実験プロトコール
官能化したキャピラリーを、内径０．５１ｍｍのマニホールドチューブ（Manifold tubing）（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ）を介してギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）ポンプに接続し、様々な溶液が連続して流れるようにする。
【０１２７】
ＨｉｓＩｓ ２３ ｃｏｏｌｅｄ ＣＣＤカメラ（Ｅｕｒｏｐｉｘｅｌ、イタリア）およびコンピューター制御されたシャッターを備えた蛍光顕微鏡（水銀ランプにより励起）を使用して蛍光を測定する。
【０１２８】
画像取り込みは、５３０−５６０ｎｍの励起フィルター及び５７５−６４５ｎｍの発光フィルターを用いて、露光時間５０ｍｓｅｃで、実験を通してキャピラリーの同じ領域上で行う。
【０１２９】
上記実施例５に記載したように洗浄緩衝液でキャピラリーを洗浄した後、官能化したキャピラリーを０．１Ｍのホスフェート緩衝液（ｐＨ８．５）を充填し、最初の蛍光をｔ＝０で読む。
【０１３０】
そして、ｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７の溶液（２．６２μＭ）をキャピラリーに導入する。１０分後、キャピラリーを洗浄し（洗浄緩衝液、流速３５μｌ／分で２分）、そして、０．１Ｍのホスフェート緩衝液（ｐＨ８．５）を充填し、クエンチング後の蛍光を測定する。
【０１３１】
サブスタンスＰの溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）を続いて８０分間導入する。ｔ＝１５秒で最初に測定した後、５分毎に測定を行う。
【０１３２】
キャピラリー洗浄後（洗浄緩衝液、次いで０．１Ｍのホスフェート緩衝液、ｐＨ８．５、３５μｌ／分でそれぞれ２分）、ｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７でさらにインキュベートすることにより固相を再生する。実験はこの方法で３回繰り返す。
【０１３３】
２）結果
この実験で得られた結果は、添付の図８に示し、ここで、蛍光（任意のユニット）は時間（分）の関数として表す。
【０１３４】
これらの結果は、ｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７によるトライポッド−Ａｌｅｘａ ５３２の蛍光の減少（クエンチング）（領域１の曲線）、サブスタンスＰ存在下での蛍光の増加（領域２の曲線）及びｍＡｂ ＳＰ３１−Ａｌｅｘａ ６４７を導入することによる再生からなる工程（領域３の曲線）は、キャピラリーのような固体支持体上で、及び実施例５において使用されるそれらと異なるルミネッセント基（Ｌ）及びクエンチング基（Ｑ）を用いると効果が残るということを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、浄水場タンク内のアナライトａの存在を測定するための、本発明に従う不均一相検出デバイスの制限のない例の一般的な図を示す。
【図２】図２は、μＭのトライポッド濃度の関数として、化合物（Ｌ）としてフルオロセイン及び分子（Ｂ）としてサブスタンスＰのアナログを含むトライポッドＹをニュートラアビジンを介してマイクロタイトレーションプレート上に固定した後に、任意の単位で、測定した蛍光を表す。
【図３】図３は、トライポッドと複合化するテトラメチルローダミン標識抗サブスタンスＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ）（ｎＭで）の量の関数として、化合物（Ｌ）としてフルオロセインと分子（Ｂ）としてサブスタンスＰアナログを含むトライポッドの蛍光の減少曲線（任意のユニットにおける）を表す。
【図４】図４は、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲにより生じる蛍光減少のサブスタンスＰによる抑制率を表し（％ ＩＤ）、これはサブスタンスＰの濃度（ｎＭで）の関数として表される。
【図５】図５は、本発明に従うトライポッドＹが取り付けられた固体支持体を接触させた後に（任意のユニットで）測定された蛍光を表し、前記トライポッドは、第一アッセイにおいては、ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ（ウェルＦｌ：ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲ及びサブスタンスＰが存在しない場合に測定された蛍光、及びウェルＦｌ０：ｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲは存在し、サブスタンスＰが存在しない場合に測定された蛍光）、及び様々な濃度のサブスタンスＰ（ウェルＦｌＸ：ｘ＝サブスタンスＰの濃度：１；０．１または０．０１μＭでｍＡｂ ＳＰ３１−ＴＭＲが存在する場合に測定された蛍光）と複合化され得、及び支持体再生の後に、最終的には、ウェルは再びサブスタンスＰの３つの濃度と接触させた後である。
【図６】図６は、１１回のサブスタンスＰ−アッセイと再生サイクル後に、ウェルＦｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘのそれぞれに関して（任意のユニットで）測定された平均の蛍光を表す。
【図７】図７は、ウェルＦｌ、Ｆｌ０及びＦｌｘ（ｘ＝サブスタンスＰ １μＭ）において行われた１１回のアッセイそれぞれに関して（任意のユニットで）測定された蛍光を表す。
【図８】図８は、標識されたモノクローナル抗体ｍＡｂ ＳＰ３１に接触させた（領域１）、サブスタンスＰと接触させた（領域２）、そして、キャピラリ−に付着したトライポッドを標識したモノクローナル抗体ｍＡｂ ＳＰ３１に接触させることにより再生された（領域３）（最後の２工程は３回繰り返す）、本発明に従うトライポッド Ｙで官能基化したキャピラリーの時間の関数としての蛍光変化（任意のユニットで）を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
１）以下の３つの官能性極：
ｉ）ルミネッセント基（Ｌ）、
ｉｉ）アナライトａ、アナライトａのアナログまたはアナライトａの断片から選択される分子（Ｂ）；及び
ｉｉｉ）固体支持体の表面に３官能性試薬の付着をもたらす官能基、
を含む少なくとも一つの３官能性試薬（トライポッドＹ）を、その表面の少なくとも一部上に含む固体支持体を、アナライトａに対する受容体で飽和する工程（該受容体は基Ｌのルミネッセンスをクエンチする化合物（Ｑ）（受容体−Ｑ）で標識されて、該分子（Ｂ）と該受容体−Ｑとの複合体Ｃを形成する）；
２）工程１）で得た該固体支持体を、検出されるアナライトａを含み得る流体試料と接触させる工程；
３）基Ｌにより放出されるシグナル強度を測定する工程（これは流体試料に存在するアナライトａの量に比例する）；および
４）該固体支持体を受容体−Ｑに接触させることにより該固体支持体を再生する工程、
を含むことを特徴とする流体試料中のアナライトａを検出するための方法。
【請求項２】
それらが含有する分子（Ｂ）の性質によって互いに異なるトライポッド Ｙのいくつかのタイプが、前記固体支持体の別の及び既知の部分に付着することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程３）及び工程４）が連続的に行われることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記固体支持体がガラス、プラスチック、セラミック、金属及びメタロイドから選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
前記支持体がチューブ、キャピラリー、プレートまたはビード(bead)の形態であることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
前記流体試料が、水、液体生物学的メディウム（medium）または可溶性ガス分子または固体試料由来の分子を含む液体メディウム（medium）からなることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
工程３）で放出されるシグナル強度が蛍光検出器により測定されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
飽和工程１）の最後に形成される複合体Ｃが、以下の式（Ｉ）：
【化１】
（ここで：
− 矢印はトライポッド Ｙの骨格構造を表し、これはペプチド、ヌクレオチドまたはグルコシド鎖、あるいは飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖炭化水素ベース鎖からなるリンカーアームであり；前記鎖は、必要に応じて一つ以上のヘテロ原子（Ｎ、ＯまたはＳのような）、及び／または一つ以上のアミノ酸で置換、割り込み及び／または終結され、そして３反応性化学官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３を含み；
− Ｌは反応性化学官能基Ｆ１によりトライポッドＹと共有結合するルミネッセント基を表し；
− Ｂは、アナライトａに特異的な受容体に非共有結合的及び可逆的に付着するアナライトａ、アナライトａの構造アナログまたはアナライトａの断片を表し、該受容体は化合物Ｑで標識され；分子（Ｂ）は反応性化学官能基Ｆ２によりトライポッドＹと共有結合され；
− Ｑは、基Ｌのルミネッセンスをクエンチする化合物を表し；
− Ｆ３はトライポッドＹの前記固体支持体表面への付着を可能にし得る反応性化学官能基を表す）
の複合体から選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
互いに独立した官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３が：
ｉ）ルミネッセント化合物、分子（Ｂ）または固相上に存在する対応する化学官能基を介する直接的結合か；
ｉｉ）あるいは間接的結合のいずれか（この場合、該結合はあらかじめ固相表面の少なくとも一部、分子（Ｂ）及び／またはルミネッセント基に付着させた分子Ｍ２と複合体を形成し得る分子Ｍ１を、官能基Ｆ１、Ｆ２及び／またはＦ３の少なくとも一つにカップリングすることにより実施される）、
を提供することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３は同じでも異なってもよく、以下の官能基：チオール；アミン；アルコール；酸性官能基；エステル；イソチオシアナート（isothiocyanates）；イソシアナート（isocyanates）；アクリルアジド；スルホニルクロライド；アルデヒド；グリオキサール；エポキシド；オキシラン；カルボナート；イミドエステル；カルボジイミド；マレイミド；ニトリル；アジリジン；アクリロイル；ハロゲン化誘導体；ジスルフィド基；リン含有基；ジアゾ；カルボニルジイミダゾール；ヒドラジド；アリールアジド；ヒドラジン；ジアジリン；マグネシウム化合物；リチウム化合物；クプラート（cuprates）；亜鉛化合物及び不飽和系（unsaturated systems）、
から選択されることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３が、式Ｒ−ＮＨ２、Ｒ−ＮＨ−、（Ｒ）３−Ｎ、Ｒ−ＮＨ−ＯＲ及びＮＨ２−ＯＲのアミン官能基；アルコール官能基Ｒ−ＯＨ；及びＸがハロゲン原子を表す式Ｒ−Ｘのハロゲン化基；から選択され、該式において、Ｒはアルキル、アリール、ビニルまたはアリル基を表すと理解されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ルミネッセント基が、フルオレセイン（ソジウムフルオレセイナート（sodium fluoresceinate））及びその誘導体；ローダミン及びその誘導体；ジアミニドフェニルインド（ＤＡＰＩ）；アクリジン；反応性アミンを有する蛍光色素；商品名Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）で販売されている蛍光色素；色素Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、Ｄａｂｃｙｌ（登録商標）及びＥｄａｎｓ（登録商標）；エオシン；エリスロシン；６−Ｆａｍ及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄから選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
受容体が、全体の、断片化されたまたは組換え形態の抗体、生物学的受容体、核酸、ペプチド核酸、レクチン、輸送タンパク質、キレート及び合成受容体から選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
前記受容体が、分子（Ｂ）に対してよりアナライトａに対して高い親和性を示すことを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
クエンチング化合物（Ｑ）が、ローダミン及びその誘導体、請求項１２に記載の蛍光化合物、商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）１、２及び３、Ｎａｎｏｇｏｌｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（登録商標）、Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）、Ｅｌｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）、マラカイトグリーン、及び色素ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９及びＱＳＹ（登録商標）２１で販売されている化合物から選択される非蛍光分子、から選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
式（Ｉ）の複合体が：
ｉ）（Ｂ）はペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、糖またはペプチド核酸、
ｉｉ）Ｌはフルオレセイン、及び
ｉｉｉ）トライポッドＹの骨格は以下の構造Ｙ１〜Ｙ３から選択される：
【化２】
（ここで、ｎ、ｍおよびｐは同じでも異なってもよく、１〜２０の全てを含む整数である）である化合物から選択されることを特徴とする請求項８〜１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
構造Ｙ１〜Ｙ３が以下の式（Ｙ’１）〜（Ｙ’３）：
【化３】
の化合物から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下の式（Ｉ）：
【化４】
（ここで、Ｌ、Ｂ、Ｑ、矢印及びＦ１、Ｆ２及びＦ３は請求項８〜１７のいずれか一つにおいて定義された通りである）
に対応することを特徴とする複合体Ｃ。
【請求項１９】
流体試料中のアナライトａの連続的な不均一相（heterogeneous-phase）検出のための方法における、請求項８〜１６のいずれか一つで定義された式（Ｉ）の少なくとも一つの複合体Ｃの使用。
【請求項２０】
流体試料中の少なくとも一つのアナライトａの連続的な不均一相検出を行うためのデバイスであって、分析される流体試料が、請求項１で定義される少なくとも一つのトライポッドＹが付着し及び検出されるアナライトａに特異的な表面で少なくとも一つの固体支持体上を流れるストリームを形成するメディウムに統合され、固体支持体の反対に位置するルミネッセンス検出器が、該検出器により放出されるシグナルの強度の閾値により制御され及びトライポッドＹとの複合体を形成し得る受容体Ｑを含むリザーバを、与えられた時間、開放する引き金となるバルブコントロールに結合され（このリザーバはトライポッドＹが付着する固体支持体の上流にくるフィードバックループを介して支持体と結合する）、これにより該ストリームを通過し、及びトライポッドＹ上での複合化により後者を受容体−Ｑで飽和及び／または再生することを特徴とする、デバイス。
【請求項２１】
ルミネッセンス強度値をモニターし、そして、ルミネッセンス検出器に接続した計算システムにより二次的にアナライトａの量に変換する、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
あらかじめ決められた値を超えるシグナル強度の変化を表示するために、イベントマーカーがフィードバックループに配置される請求項２０または２１に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記固体支持体が、分析される試料を含む環境（environment）とカップリングするキャピラリーであり、該カップリングが、フローストリーム（the flow stream）のそれに対応するメディウム（medium）内で試料が拡散する丸底キャプチャー（capture）フラスコによって、またはフレキシブルパイプによって行われる請求項２０〜２２のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項２４】
ポンプ、ピストンまたは同等のものにより生み出された低圧により該ストリームが伴出される（entrain）請求項２０〜２３のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項２５】
ガスの状態で試料を集めるための、及び、それらが含む検出される成分を可溶化するための、丸底キャプチャー（capture）フラスコ及びスパージングシステムを備えることを特徴とする請求項２０〜２４のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項２６】
天然または工業メディウム（medium）中のアナライトａの存在を検出するための、請求項２０〜２５のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
【請求項２７】
デバイスが、湖、河川、スイミングプール、工場、浄水場、または換気あるいは空調システムにおいて使用されることを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【請求項１】
次の工程：
１）以下の３つの官能性極：
ｉ）ルミネッセント基（Ｌ）、
ｉｉ）アナライトａ、アナライトａのアナログまたはアナライトａの断片から選択される分子（Ｂ）；及び
ｉｉｉ）固体支持体の表面に３官能性試薬の付着をもたらす官能基、
を含む少なくとも一つの３官能性試薬（トライポッドＹ）を、その表面の少なくとも一部上に含む固体支持体を、アナライトａに対する受容体で飽和する工程（該受容体は基Ｌのルミネッセンスをクエンチする化合物（Ｑ）（受容体−Ｑ）で標識されて、該分子（Ｂ）と該受容体−Ｑとの複合体Ｃを形成する）；
２）工程１）で得た該固体支持体を、検出されるアナライトａを含み得る流体試料と接触させる工程；
３）基Ｌにより放出されるシグナル強度を測定する工程（これは流体試料に存在するアナライトａの量に比例する）；および
４）該固体支持体を受容体−Ｑに接触させることにより該固体支持体を再生する工程、
を含むことを特徴とする流体試料中のアナライトａを検出するための方法。
【請求項２】
それらが含有する分子（Ｂ）の性質によって互いに異なるトライポッド Ｙのいくつかのタイプが、前記固体支持体の別の及び既知の部分に付着することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程３）及び工程４）が連続的に行われることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記固体支持体がガラス、プラスチック、セラミック、金属及びメタロイドから選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
前記支持体がチューブ、キャピラリー、プレートまたはビード(bead)の形態であることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
前記流体試料が、水、液体生物学的メディウム（medium）または可溶性ガス分子または固体試料由来の分子を含む液体メディウム（medium）からなることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
工程３）で放出されるシグナル強度が蛍光検出器により測定されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
飽和工程１）の最後に形成される複合体Ｃが、以下の式（Ｉ）：
【化１】
（ここで：
− 矢印はトライポッド Ｙの骨格構造を表し、これはペプチド、ヌクレオチドまたはグルコシド鎖、あるいは飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖炭化水素ベース鎖からなるリンカーアームであり；前記鎖は、必要に応じて一つ以上のヘテロ原子（Ｎ、ＯまたはＳのような）、及び／または一つ以上のアミノ酸で置換、割り込み及び／または終結され、そして３反応性化学官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３を含み；
− Ｌは反応性化学官能基Ｆ１によりトライポッドＹと共有結合するルミネッセント基を表し；
− Ｂは、アナライトａに特異的な受容体に非共有結合的及び可逆的に付着するアナライトａ、アナライトａの構造アナログまたはアナライトａの断片を表し、該受容体は化合物Ｑで標識され；分子（Ｂ）は反応性化学官能基Ｆ２によりトライポッドＹと共有結合され；
− Ｑは、基Ｌのルミネッセンスをクエンチする化合物を表し；
− Ｆ３はトライポッドＹの前記固体支持体表面への付着を可能にし得る反応性化学官能基を表す）
の複合体から選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
互いに独立した官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３が：
ｉ）ルミネッセント化合物、分子（Ｂ）または固相上に存在する対応する化学官能基を介する直接的結合か；
ｉｉ）あるいは間接的結合のいずれか（この場合、該結合はあらかじめ固相表面の少なくとも一部、分子（Ｂ）及び／またはルミネッセント基に付着させた分子Ｍ２と複合体を形成し得る分子Ｍ１を、官能基Ｆ１、Ｆ２及び／またはＦ３の少なくとも一つにカップリングすることにより実施される）、
を提供することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３は同じでも異なってもよく、以下の官能基：チオール；アミン；アルコール；酸性官能基；エステル；イソチオシアナート（isothiocyanates）；イソシアナート（isocyanates）；アクリルアジド；スルホニルクロライド；アルデヒド；グリオキサール；エポキシド；オキシラン；カルボナート；イミドエステル；カルボジイミド；マレイミド；ニトリル；アジリジン；アクリロイル；ハロゲン化誘導体；ジスルフィド基；リン含有基；ジアゾ；カルボニルジイミダゾール；ヒドラジド；アリールアジド；ヒドラジン；ジアジリン；マグネシウム化合物；リチウム化合物；クプラート（cuprates）；亜鉛化合物及び不飽和系（unsaturated systems）、
から選択されることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
官能基Ｆ１、Ｆ２及びＦ３が、式Ｒ−ＮＨ２、Ｒ−ＮＨ−、（Ｒ）３−Ｎ、Ｒ−ＮＨ−ＯＲ及びＮＨ２−ＯＲのアミン官能基；アルコール官能基Ｒ−ＯＨ；及びＸがハロゲン原子を表す式Ｒ−Ｘのハロゲン化基；から選択され、該式において、Ｒはアルキル、アリール、ビニルまたはアリル基を表すと理解されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ルミネッセント基が、フルオレセイン（ソジウムフルオレセイナート（sodium fluoresceinate））及びその誘導体；ローダミン及びその誘導体；ジアミニドフェニルインド（ＤＡＰＩ）；アクリジン；反応性アミンを有する蛍光色素；商品名Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）で販売されている蛍光色素；色素Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、Ｄａｂｃｙｌ（登録商標）及びＥｄａｎｓ（登録商標）；エオシン；エリスロシン；６−Ｆａｍ及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄから選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
受容体が、全体の、断片化されたまたは組換え形態の抗体、生物学的受容体、核酸、ペプチド核酸、レクチン、輸送タンパク質、キレート及び合成受容体から選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
前記受容体が、分子（Ｂ）に対してよりアナライトａに対して高い親和性を示すことを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
クエンチング化合物（Ｑ）が、ローダミン及びその誘導体、請求項１２に記載の蛍光化合物、商品名Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）１、２及び３、Ｎａｎｏｇｏｌｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（登録商標）、Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）、Ｅｌｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）、マラカイトグリーン、及び色素ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９及びＱＳＹ（登録商標）２１で販売されている化合物から選択される非蛍光分子、から選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
式（Ｉ）の複合体が：
ｉ）（Ｂ）はペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、糖またはペプチド核酸、
ｉｉ）Ｌはフルオレセイン、及び
ｉｉｉ）トライポッドＹの骨格は以下の構造Ｙ１〜Ｙ３から選択される：
【化２】
（ここで、ｎ、ｍおよびｐは同じでも異なってもよく、１〜２０の全てを含む整数である）である化合物から選択されることを特徴とする請求項８〜１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
構造Ｙ１〜Ｙ３が以下の式（Ｙ’１）〜（Ｙ’３）：
【化３】
の化合物から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下の式（Ｉ）：
【化４】
（ここで、Ｌ、Ｂ、Ｑ、矢印及びＦ１、Ｆ２及びＦ３は請求項８〜１７のいずれか一つにおいて定義された通りである）
に対応することを特徴とする複合体Ｃ。
【請求項１９】
流体試料中のアナライトａの連続的な不均一相（heterogeneous-phase）検出のための方法における、請求項８〜１６のいずれか一つで定義された式（Ｉ）の少なくとも一つの複合体Ｃの使用。
【請求項２０】
流体試料中の少なくとも一つのアナライトａの連続的な不均一相検出を行うためのデバイスであって、分析される流体試料が、請求項１で定義される少なくとも一つのトライポッドＹが付着し及び検出されるアナライトａに特異的な表面で少なくとも一つの固体支持体上を流れるストリームを形成するメディウムに統合され、固体支持体の反対に位置するルミネッセンス検出器が、該検出器により放出されるシグナルの強度の閾値により制御され及びトライポッドＹとの複合体を形成し得る受容体Ｑを含むリザーバを、与えられた時間、開放する引き金となるバルブコントロールに結合され（このリザーバはトライポッドＹが付着する固体支持体の上流にくるフィードバックループを介して支持体と結合する）、これにより該ストリームを通過し、及びトライポッドＹ上での複合化により後者を受容体−Ｑで飽和及び／または再生することを特徴とする、デバイス。
【請求項２１】
ルミネッセンス強度値をモニターし、そして、ルミネッセンス検出器に接続した計算システムにより二次的にアナライトａの量に変換する、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
あらかじめ決められた値を超えるシグナル強度の変化を表示するために、イベントマーカーがフィードバックループに配置される請求項２０または２１に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記固体支持体が、分析される試料を含む環境（environment）とカップリングするキャピラリーであり、該カップリングが、フローストリーム（the flow stream）のそれに対応するメディウム（medium）内で試料が拡散する丸底キャプチャー（capture）フラスコによって、またはフレキシブルパイプによって行われる請求項２０〜２２のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項２４】
ポンプ、ピストンまたは同等のものにより生み出された低圧により該ストリームが伴出される（entrain）請求項２０〜２３のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項２５】
ガスの状態で試料を集めるための、及び、それらが含む検出される成分を可溶化するための、丸底キャプチャー（capture）フラスコ及びスパージングシステムを備えることを特徴とする請求項２０〜２４のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項２６】
天然または工業メディウム（medium）中のアナライトａの存在を検出するための、請求項２０〜２５のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
【請求項２７】
デバイスが、湖、河川、スイミングプール、工場、浄水場、または換気あるいは空調システムにおいて使用されることを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００６−５０８３５７（Ｐ２００６−５０８３５７Ａ）
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５６４３６（Ｐ２００４−５５６４３６）
【出願日】平成１５年１１月２８日（２００３．１１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００３５２１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５１２７１
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【出願人】（５００５１１５９０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月２８日（２００３．１１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００３５２１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５１２７１
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【出願人】（５００５１１５９０）
【Ｆターム（参考）】
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