アピオス花を用いた血糖値上昇抑制物質および糖尿病予防用食品素材
【課題】 アピオス生産における廃棄物である花を用いることによって、人体において保健機能を発揮できる物質、およびそのような物質に基づく食品素材を提供すること。
【解決手段】 アピオス花の抽出物を調製し、カラムクロマトグラフィー手法によって分画し、ラジカル消去活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性を指標に成分を分離・精製した。その結果、マルターゼ阻害作用を有する成分としてＡＦＬ６０Ｆ２８−１が単離され、これは（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリル酸β−Ｄ−グルコピラノシル（カフェオイルβ−Ｄ−グルコピラノシド）、または２−Ｏ−［３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリロイル］−Ｄ−グルコピラノースであることを同定した。この成分を含む活性画分ＡＦＬ６０をマウスに投与した結果、正常マウスおよび糖尿病モデルマウスにおいて、血糖値の上昇抑制効果が認められた。
【解決手段】 アピオス花の抽出物を調製し、カラムクロマトグラフィー手法によって分画し、ラジカル消去活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性を指標に成分を分離・精製した。その結果、マルターゼ阻害作用を有する成分としてＡＦＬ６０Ｆ２８−１が単離され、これは（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリル酸β−Ｄ−グルコピラノシル（カフェオイルβ−Ｄ−グルコピラノシド）、または２−Ｏ−［３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリロイル］−Ｄ−グルコピラノースであることを同定した。この成分を含む活性画分ＡＦＬ６０をマウスに投与した結果、正常マウスおよび糖尿病モデルマウスにおいて、血糖値の上昇抑制効果が認められた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアピオス花を用いた血糖値上昇抑制物質および糖尿病予防用食品素材に係り、特に、アピオス生産における廃棄物である花の有効利用によって得ることの可能な、アピオス花を用いた血糖値上昇抑制物質および糖尿病予防用食品素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
アピオス（別名ホドイモ）は、北米原産のマメ科のツル性植物であり、日本では青森県から広まったと言われている。つまり、リンゴを導入した際に苗木の土中にアピオスが混じっていたと考えられており、国内における栽培は、種芋も栽培法もすべて青森県に由来するものである。現在農産物として扱われているものはＡｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ であり、球状の根茎部が食用となる。
【０００３】
過去には、愛用者の経験談をもとに夢の健康作物としてマスコミでも取り上げられ、星川らはその栽培法について研究した（K.Hoshikawa., et al.: The growth of Apios (Apios americana Medikus), a new crop, under field conditions. Jpn. J. Crop Sci., 64, 323-327, 1995.）。しかし、その滋養強壮効果等の様々な生理作用についてはあくまでも伝承の類であり、科学的根拠には乏しいものだった。
【０００４】
そこで本願発明者らは、アピオス粉末を高血圧ラット（ＳＨＲ）に与えたところ、７〜１１％の降圧効果および中性脂肪の減少効果を見出した。この結果を元にして行った研究において、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を指標としてアピオスの降圧成分を探索し、ＡＣＥ阻害ペプチドを発見し、特許出願した（特許文献１）。また、県内産地の一つである五戸町の株式会社倉石地域振興公社は、本願発明者らと連携して新規製品開発を行っている。
【０００５】
なおアピオスのイモ部分については本願発明者らが既に、その生理作用に関する科学的報告をしている（非特許文献１、２）。なおまた、アピオス栽培においては、夏に咲く花を摘み取ることが良いイモを作るための一手段であると言われており、摘み取られた花は廃棄されているのが現状である。
【０００６】
さて一方、平成１８年国民健康・栄養調査結果の概要（厚生労働省健康局総務課生活習慣病対策室）によれば、生活習慣病有病者の状況は、糖尿病が強く疑われる人が約８２０万人、糖尿病の可能性を否定できない人が約１０５０万人、合計約１８７０万人と推定されており、平成１４年と比較して糖尿病が強く疑われる人は８０万人、可能性が否定できない人は２５０万人もの増加が見られた。また４０〜７４歳では、男性の２人に１人、女性の５人に１人が、メタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）が強く疑われる者またはその予備群と考えられている。
【０００７】
このような状況下、食生活改善による生活習慣病の一次予防の重要性が増し、国民の健康志向は高まっている。加えて２００８年４月より特定健診制度もスタートし、健診結果によっては、改善の指導及び結果の報告が求められ、医療費圧縮の施策推進として、治療から予防へのシフトが図られている。このようなことを背景として予防医学の一助としての保健機能食品への関心は高まり、厚生労働省認可の特定保健用食品およびいわゆる健康食品を含めた市場規模は、一般用医薬品の年間売り上げより多い１兆円以上であり、バイオテクノロジー戦略大綱では、２０１０年には３．２兆円を超えると推計している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−３２６７９０号公報「アピオスの酢酸・酵素処理物製造方法、アピオス由来ペプチドおよびその製造方法」
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】K. Iwai., et al.: Ingestion of Apios americana Medikus tuber suppresses blood pressure and improves plasma lipids in spontaneously hypertensive rats. Nutr. Res., 27, 218-224, 2007.
【非特許文献２】岩井邦久, 他: 「県産農水産物を活用した産業振興モデル」成果報告書, 財団法人21あおもり産業総合支援センター, 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、アピオス栽培においては良いイモを作るために花が摘み取られ、そしてそれは廃棄されており、その有効利用が模索されている現状である。この花を有効利用できれば、資源の有効活用と廃棄物産出低減の両方を図ることができる。さらに上述のように本願発明者らによって、アピオスのイモ部分の生理作用については血圧降下作用など身体に良い健康効果を明らかにされているが、殊アピオス花に関する生理作用およびその利用については従来、特段の技術開示文献は従来見当たらない。
【００１１】
そこで本発明が解決しようとする課題は、アピオス生産における廃棄物である花を用いることによって、人体において保健機能を発揮できる物質、およびそのような物質に基づく食品素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、アピオス花が含有するポリフェノールの生理作用を検討し、近年増加している生活習慣病の予防に資する生理活性成分の探索を行った。生理作用としては、特に増加が顕著である糖尿病予防に寄与するα−グルコシダーゼ阻害活性に焦点を当てた。さらに、生理活性の有用性を確認するために動物試験を行った。その結果、アピオス花が有用な生理活性成分を備えていることを見出し、本発明の完成に至った。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下の通りである。
【００１３】
〔１〕 アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花を用いた血糖値上昇抑制効果具有物。
〔２〕 アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花抽出物を用いた血糖値上昇抑制物質。
〔３〕 アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花から抽出される、α−グルコシダーゼ阻害作用を備えた化合物を用いた血糖値上昇抑制物質。
〔４〕 〔１〕に記載の血糖値上昇抑制効果具有物を用いた、糖尿病予防用食品素材。
〔５〕 〔２〕または〔３〕に記載の血糖値上昇抑制物質を用いた、糖尿病予防用食品素材。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のアピオス花を用いた血糖値上昇抑制物質および糖尿病予防用食品素材は上述のように構成されるため、これによれば、従来未利用であったアピオス生産における廃棄物である花を有効利用して、α−グルコシダーゼ阻害作用を有し血糖値上昇抑制効果の得られる食品素材を得、これに基づきかかる作用効果を有する食品を実現することができる。さらに、アピオス栽培における廃棄物産出を削減することもできる。
【００１５】
本願発明は、アピオス花の有用性を実証し、新規な健康的食素材開発の可能性を広げ、ひいては増加する生活習慣病予備群から有病者への歯止め策の一助とする上でも大いに意義深いものである。従来、花を食することができる植物性食物は、ブロッコリーや菊など、限られた種類しか存在しない。つまり本発明によれば、アピオス花に明らかとなったα−グルコシダーゼ阻害活性により、生活習慣病の予防に寄与する新たな食資源を提供、開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】アピオス花の写真である。
【図１Ｂ】アピオス花乾燥物の写真である。
【図２】活性画分の分画法を示すフロー図である。
【図３】ＡＦＬ４０およびＡＦＬ６０のセミ分取ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】ＡＦＬ６０Ｆ２８を更に精製した結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図６】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の１Ｈ−ＮＭＲ分析結果を示すグラフである。
【図７】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示すグラフである。
【図８】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１のＤＥＰＴ分析結果を示すグラフである。
【図９Ａ】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の化学構造を示す構造式である。
【図９Ｂ】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の化学構造を示す構造式である。
【図１０】正常マウスにＡＦＬ６０とマルトースを同時に単回経口投与した後の血漿中グルコース濃度推移を示すグラフである。
【図１１】糖尿病モデルマウスにＡＦＬ６０とマルトースを同時に単回経口投与した後の血漿中グルコース濃度推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明について、詳細に説明する。
図１Ａ、１Ｂはそれぞれ、アピオス花、アピオス花乾燥物の写真である。
本発明の「アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花を用いた血糖値上昇抑制効果具有物」とは、アピオス花を用いることによって、血糖値上昇抑制効果を備えた物を広く指す。つまりアピオス花をどのように処理するかしないか、そのような処理形態・利用形態の如何に関わらず、アピオス花を用いたものであれば全て、かかる本発明に該当する。
【００１８】
さらに、かかる効果を備えた「物」には、粉状・粒状・液状・流体状といった不定形の物の他、一定の形態を備えた物も、また逆に化学物質レベルのような物質レベルの物も、広く含む。したがって、アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花からの抽出物であって、血糖値上昇抑制効果を具有する物も、当然ながら本発明の範囲内である。
【００１９】
また、かかる「血糖値上昇抑制効果具有物」を用いた糖尿病予防用食品素材も、その種類・形態等は何ら制限されず、本発明の血糖値上昇抑制効果具有物を用いたものである限り、あらゆる種類・形態の食品素材が本発明に該当する。
【００２０】
本発明の「アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花抽出物を用いた血糖値上昇抑制物質」は特に、実施例に後述するように、アピオス花から抽出されるα−グルコシダーゼ阻害作用を備えた化合物を用いた血糖値上昇抑制物質である。
【００２１】
また、かかる「血糖値上昇抑制物質」を用いた糖尿病予防用食品素材も、その種類・形態等は何ら制限されず、本発明の血糖値上昇抑制効果具有物を用いたものである限り、あらゆる種類・形態の食品素材が本発明に該当する。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を完成するに至った研究経過をもって実施例とし、本発明をより詳細に説明するが、本発明がかかる実施例に限定されるものではない。
実施例詳述の前にまず、研究経過における若干の用語について、一部、本研究との関連も含めて説明する。
【００２３】
〈α−グルコシダーゼ阻害活性〉
ヒトが摂取する糖質の多くは多糖類のデンプンだが、最終的には小腸粘膜上皮細胞の刷子縁膜に存在する数種類のα−グルコシダーゼ（二糖類水解酵素）により単糖類に分解され、小腸絨毛上皮から吸収される。糖尿病患者は小腸におけるこれらの酵素活性が亢進しており、食後の急激な血糖上昇にはインスリン分泌不足やインスリン抵抗性とともにこの酵素活性の亢進が関与していると考えられている。特に２型糖尿病患者の高血糖改善には食事療法が基本であるが、糖質の消化吸収を遅延させることによる血糖コントロールの観点から、α−グルコシダーゼ阻害薬が開発されている（ W. Puls, U. Keup: Influence of an α-amylase inhibitor (Bay 7791) on blood glucose serum insulin and NEFA in starch loading tests in rats dog and man. Diabetologia, 9, 97-101, 1973.）。
【００２４】
食事との関連性が強いことや、特定保健用食品として開発するメリットが大きいこと等から、最近では食品素材からα−グルコシダーゼ阻害成分を探索する研究も盛んに行われており（T. Matsui, et al.: In vitro survey of α-glucosidase inhibitory food components. Biosci. Biotechnol.Biochem., 60, 2019-2022, 1996.）、バナバ（鈴木裕子, 他: バナバ(Lagerstroemia speciosa L.) 葉抽出物のラットにおける食後血糖上昇抑制作用およびその作用様式. 日本栄養・食糧学会誌. 54, 131-137, 2001.）、桑葉（小島芳弘: 桑葉の保健機能, 食品と開発, 37 (10), 54-56, 2002.）、タモギタケ（藤野正行, 何普明: タモギタケ熱水抽出物によるII 型糖尿病モデルマウスの血糖値抑制. 日本食品科学工学会誌, 45, 618-623, 1998.）等が見出されている。
【００２５】
特に桑葉からはグルコースと構造が類似した成分が抽出され、１−ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ（ＤＮＪ）として同定されている（N. Peyrieras, et al.: Effects of the glucosidase inhibitors nojirimycin and deoxynojirimycin on thebiosynthesis of membrane and secretory glycoproteins. EMBO J., 2, 823-832, 1983.、他）。このように、α−グルコシダーゼ阻害作用は高血糖の抑制・改善に有益であり、糖尿病予防を目指す食品の開発や研究の多くは、糖質の分解と吸収を阻害・遅延させ、過血糖を改善するものが主流である。
【００２６】
〈ポリフェノール〉
ポリフェノールは植物細胞の生成、活性化などを助ける働きを持つ。その有効性は抗酸化作用に基づくものであるため、動脈硬化、糖尿病、ガン等の予防、老化抑制等の様々な生体調整機能に関係している。アピオス花中のポリフェノールとしてはアントシアニン類等が本願発明者により類推されているが（岩井邦久, 他: 「県産農水産物を活用した産業振興モデル」成果報告書, 財団法人21 あおもり産業総合支援センター, 2005.）、詳細は解明されていない。
【００２７】
＜Ａ 研究方法＞
アピオス花の利用価値を高めるため、アピオス花が持つ有益な生理活性、特にα−グルコシダーゼ阻害活性、抗酸化活性等を探索し、それら活性成分の解明（構造決定）を行った。
＜Ａ−１．試料調製＞
五戸町倉石地域で８月に採取したアピオス花を５０〜６０℃で温風乾燥した。これをギ酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および１％ギ酸含有メタノール（ギ酸／ＭｅＯＨ）中でホモジナイズし、攪拌抽出を行い、遠心分離にて得た上清を濃縮乾固し凍結乾燥して粗抽出物を調製し、Ｆｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法によるポリフェノール濃度（Gao X., et al.: J. Sci. Food Agric., 80, 2021-2027, 2000. 以下も同じ。）、ＤＰＰＨラジカル消去活性（須田郁夫: 抗酸化機能, 分光学的抗酸化機能評価. 食品機能研究法, 篠原和毅他編, pp.218-220, 光琳, 2000. 以下も同じ。）、α−グルコシダーゼ（マルターゼ）阻害活性（鈴木裕子, 他: バナバ(Lagerstroemia speciosa L.) 葉抽出物のラットにおける食後血糖上昇抑制作用およびその作用様式. 日本栄養・食糧学会誌. 54, 131-137, 2001. 以下も同じ。）を測定し、最適な抽出方法を決定した。
【００２８】
＜Ａ−２．生理活性の測定＞
ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定では、試料をエタノールで溶解および希釈し、ＤＰＰＨ溶液を添加混合し、５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準物質としたＴｒｏｌｏｘの吸光度から検量線を作成し、試料１μｇ当たりのラジカル消去活性をＴｒｏｌｏｘ相当量として算出した。
【００２９】
マルターゼ阻害活性の測定では、マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した試料にマルトース（基質）を混合し、プレインキュベートした。この混合液にラット小腸粉末由来の粗酵素液を添加混合し、３７℃でインキュベートした。経時的にサンプリングし、ムロターゼ−ＧＯＤ法により測定したグルコース生成量から酵素反応速度を求め、酵素＋基質のみの反応速度を１００％とし、試料添加時の酵素活性阻害率を算出した。試料濃度と阻害率の関係から、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を阻害活性として算出した。
【００３０】
＜Ａ−３．アピオス花活性画分の大量調製＞
アピオス花ギ酸／ＭｅＯＨ抽出物を大量に調製し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（３７×９８０ｍｍ）によって分画を行った。１回の処理で抽出物２ｇを負荷し、ＭｅＯＨ含量０，２０，４０，６０，９９および１００％の１％ギ酸／ＭｅＯＨ混合溶液を４５０ｍＬずつ流速２ｍＬ／ｍｉｎで流した。溶出物（ＡＦＬ０，ＡＦＬ２０，ＡＦＬ４０，ＡＦＬ６０，ＡＦＬ９９，ＡＦＬ１００）を収集し、濃縮・凍結乾燥を施し、この処理を繰り返すことで、活性画分を大量に調製した。全画分の総ポリフェノール濃度、ＤＰＰＨラジカル消去活性およびマルターゼ阻害活性を測定し、活性画分を確定した。
図２は、活性画分の分画法を示すフロー図である。
【００３１】
＜Ａ−４．アピオス花ポリフェノールの分析＞
Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０で分画したＡＦＬ０，ＡＦＬ２０，ＡＦＬ４０，ＡＦＬ６０，ＡＦＬ９９およびＡＦＬ１００を高速液体クロマトグラフィー−フォトダイオードアレイ検出（ＨＰＬＣ−ＰＤＡ）で分析し、各画分中に含まれるポリフェノール類を分析した。分析システムはＷａｔｅｒｓ ２６９５（Ｗａｔｅｒｓ社）、カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（粒径５μｍ，４．６Ｘ１５０ｍｍ）を使用し、カラム温度４０℃にて移動相としたＡ液１０％ギ酸およびＢ液アセトニトリルを０〜３５分間でＢ液０〜７０％に変化させるリニアグラジエントで、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで流した。分析注入量は１０μＬで、２９９８ＰＤＡ検出器（Ｗａｔｅｒｓ社）によって２００〜８００ｎｍの波長範囲で検出した。
【００３２】
＜Ａ−５．主要なポリフェノールの分取、活性成分の分離・精製＞
ＡＦＬ６０（マルターゼ阻害画分）を分取ＨＰＬＣに供し、主要なピークを分取した。分取ＨＰＬＣは、ポンプおよびインジェクターにＷ６００（Ｗａｔｅｒｓ社）、カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２０Ｘ３００ｍｍ）、移動相にＡ液１０％ギ酸およびＢ液アセトニトリルを使用し、カラム温度４０℃にて、Ｂ液濃度を０〜７０分で０％から７０％に変化させるリニアグラジエント（７０〜９０分でＢ液１００％、その後初期条件に平衡化）条件で、流速５．０ｍＬ／ｍｉｎで溶出した。ＡＦＬ６０の注入量は５００μＬとし、波長２８０ｎｍで検出した。ＥＹＥＬＡ製フラクションコレクターＤＣ−１５００を使用し、１０〜５４分の分取区間で１分間隔にてピークを分取した。分取した活性ポリフェノールのＨＰＬＣ−ＰＤＡによる分析と精製を行った。装置、カラムおよび移動相は既述した分析条件と同じであり、移動相のグラジエント条件を０〜６０分で０〜３５％に変化させるリニアグラジエントに変更した。
【００３３】
＜Ａ−６．活性成分の構造決定＞
構造決定は核磁気共鳴（ＮＭＲ）および液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって分析し、活性成分の構造同定を行った。
【００３４】
＜Ａ−７．アピオス花活性画分の生理効果の検討＞
アピオス花活性画分ＡＦＬ６０を大量に調製し、生理効果を検討するため、マルトースを投与する糖負荷試験を行った。動物には、正常マウスとして雄性ｄｄＹマウス（１０週齢）および糖尿病モデルマウスとして雄性ＫＫ−Ａｙマウス（１０週齢）を用い、ＡＦＬ６０とマルトースを混合し、２０時間の絶食下で単回経口投与した。ＡＦＬ６０の投与量は０，６２．５，１２５および２５０ｍｇ／ｋｇとして０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁し、マルトースの投与量は０．６ｇ／ｋｇとした。投与後０，０．５，１および２時間に、ヘパリン処理済プラスチック製キャピラリーチューブを用いて眼窩底採血を行い、血液を直ちにヘマトクリット遠心機（３２２０，クボタ）で遠心分離（１２，０００ｒｐｍＸ２分）し、血漿を採取した。適宜０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液で希釈し、血漿中グルコース濃度をグルコースＣII-テストワコー（和光純薬工業）にて測定した。
【００３５】
＜Ｂ 結果および考察＞
＜Ｂ−１．アピオス花活性画分の大量調製＞
アピオス花の抽出では、ギ酸およびＴＦＡ抽出に比べて１％ギ酸／ＭｅＯＨ抽出が総ポリフェノール濃度、ＤＰＰＨラジカル消去活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性いずれも優れており、活性成分を得るためには１％ギ酸／ＭｅＯＨ 抽出が適していることが明らかになった。
表１に、アピオス花ギ酸／ＭｅＯＨ抽出物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーで分画した時の収量、総ポリフェノール濃度、ＤＰＰＨラジカル消去活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性を示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
分画した７０％はＡＦＬ０に集まったが、これにはポリフェノールはほとんど含まれず、ＤＰＰＨラジカル消去活性およびグルコシダーゼ阻害活性も認められず、ほとんどが糖質であることが推察された。総ポリフェノール濃度が最も高かったのはＡＦＬ４０だったが、ＤＰＰＨラジカル消去活性およびグルコシダーゼ阻害活性が最も強かったのはＡＦＬ６０であった。したがって、ＡＦＬ６０を活性成分同定のための分取に使用した。
【００３８】
＜Ｂ−２．アピオス花活性成分の解明＞
１）セミ分取逆相カラムの使用による主要なポリフェノールの分取
リニアグラジエント溶出条件でセミ分取ＨＰＬＣによる分画を行い、ＡＦＬ６０からピークを大量に分離した。フラクションコレクターを使用し、保持時間１０〜５４分で１分間隔にてピーク分取を行った。
図３は、ＡＦＬ４０およびＡＦＬ６０のセミ分取ＨＰＬＣクロマトグラムである。その結果、図示するように、ＡＦＬ６０から３３分および３６分に非常に大きなピークを得た。また、ＡＦＬ４０も同様に処理すると３４，３７および３９分に主要なピークを得た。
【００３９】
分取したこれらのピークのマルターゼ阻害活性を測定すると、阻害活性が強かったのはＦｒ．２５，Ｆｒ．２８およびＦｒ．２９であり、これらにおけるマルターゼ阻害率はいずれも５０％以上であった。Ｆｒ．２５は収量が少ないため、Ｆｒ．２８およびＦｒ．２９を活性ポリフェノールとして収集し、更に精製した。ＡＦＬ４０もＦｒ．２９およびＦｒ．３０がこれらと類似性が考えられたため、同様に収集した。
【００４０】
２）活性ポリフェノールの分離・精製
ＡＦＬ６０から分取したＦｒ．２８（ＡＦＬ６０Ｆ２８）をＨＰＬＣで再度分析すると、４〜５本のピークが混在していた。これらはポリフェノール化合物であることが示唆された。
そこで、ＨＰＬＣ条件を変更しＡＦＬ６０Ｆ２８を更に精製した結果、主要ピーク＃１〜＃５が得られた。これらは、３２０ｎｍに吸収極大を有する成分が１種類、２８０ｎｍに吸収極大を持つ成分が２種類、５２５ｎｍに吸収極大を持つ成分が２種類であった。
図４は、ＡＦＬ６０Ｆ２８をさらに精製した結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００４１】
表２は、これらピーク＃１〜＃５のマルターゼ阻害活性を示すものである。各収量は０．４〜０．８ｍｇであり、ＡＦＬ６０Ｆ２８の３〜６％に相当した。ピーク＃４および＃５はアントシアニンであることが示されたが、阻害率は３０％以下と低く、最も阻害が強かったのは＃１（ＡＦＬ６０Ｆ２８−１）で、この成分は３３０ｎｍに吸収極大を持つポリフェノール化合物であることが示唆された。
【００４２】
【表２】
【００４３】
図５は、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した結果を示すクロマトグラムである。その結果、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１は分子量が３４２と推定された。また、
図６は、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の１Ｈ−ＮＭＲ分析結果を示すグラフ、
図７は、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示すグラフ、そして
図８は、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１のＤＥＰＴ分析結果を示すグラフである。
【００４４】
以上の分析結果からＡＦＬ６０Ｆ２８−１は、
分子式がＣ１５Ｈ１８Ｏ９の、（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリル酸β−Ｄ−グルコピラノシル（カフェオイルβ−Ｄ−グルコピラノシド）か、もしくは、
２−Ｏ−［３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリロイル］−Ｄ−グルコピラノース のいずれかであることが示された。
図９Ａ、９Ｂはこれらの構造式である。
【００４５】
＜Ｂ−３．アピオス花活性画分の生理効果＞
アピオス花活性画分としてＡＦＬ６０をマルトースと混合し、マウスに単回経口投与する負荷試験を行った。
図１０は、正常マウスにＡＦＬ６０とマルトースを同時に単回経口投与した後の血漿中グルコース濃度推移を示すグラフである。マルトースの投与量は０．６ｇ／ｋｇであり、データは５匹の平均値±標準偏差を示す。図示するように、正常マウスである雄性ｄｄＹマウスに負荷した時、マルトース（Ｍａｌ）単独の投与では投与後０．５時間での血糖値が絶食下血糖値の２．５倍に増加したのに対し、ＡＦＬ６０を混合して負荷した場合は、血糖値の上昇は２倍以下に抑えられた。統計的有意差はなかったものの、この抑制は投与後０．５時間だけでなく、１時間でも見られた。また、用量依存性が認められた。したがって、アピオス花には正常マウスの血糖値に対する上昇抑制効果のあることが示された。
【００４６】
同様の検討を糖尿病モデルＫＫ−Ａｙマウスでも行った。
図１１は、糖尿病モデルマウスにＡＦＬ６０とマルトースを同時に単回経口投与した後の血漿中グルコース濃度推移を示すグラフである。マルトースの投与量は０．６ｇ／ｋｇであり、データは５匹の平均値±標準偏差を示す。その結果、図示するように、血糖値はマルトース投与後１時間で最大となり、そのレベルは絶食下血糖値の２．７倍に達した。ｄｄＹに比べて血糖値の低下は遅く、糖尿病モデル特有の血糖値推移を示した。ＡＦＬ６０を投与した場合、０．５時間ではマルトース単独と血糖値に差はなかったが、投与後１時間以降でマルトース単独よりも低い血糖値推移を示し、血糖値の上昇抑制あるいは抑制傾向が示された。
【００４７】
これらの結果から、ＡＦＬ６０には血糖上昇抑制効果があることが示された。なお糖尿病モデルマウスでは、少ない用量でより高い効果が認められた。つまり、少量の使用によって充分に血糖上昇抑制効果を得られることが示された。これは、必要以上に用量が多い場合にはかえって、ＡＦＬ６０に含まれる成分が消化管内で何らかの変化を起こして糖質としての吸収・血糖値の上昇に結びつくという機作が考えられる。かかる現象は正常マウスでは見られなかったことであるが、ｄｄＹマウスとＫＫ−Ａｙマウスの糖質吸収および配糖体の分解に関する生体機能の違いが関与しているものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
以上述べた通り本発明では、従来廃棄されているアピオス花の高付加価値化と有効利用を目的に、生理活性の探索、活性成分の同定を行った。つまり、アピオス花の抽出物を調製し、カラムクロマトグラフィー手法によって分画し、ラジカル消去活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性を指標に成分を分離・精製した。その結果、マルターゼ（α−グルコシダーゼの一種）阻害作用を有する成分としてＡＦＬ６０Ｆ２８−１が単離され、これは（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリル酸β−Ｄ−グルコピラノシル（カフェオイルβ−Ｄ−グルコピラノシド）、または２−Ｏ−［３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリロイル］−Ｄ−グルコピラノースであることを同定した。これら化合物がα−グルコシダーゼ阻害作用を有することが、本発明により初めて明らかとなった。
【００４９】
さらに、この成分を含む活性画分ＡＦＬ６０をマウスに投与した結果、正常マウスおよび糖尿病モデルマウスにおいて、血糖値の上昇抑制効果が認められた。これらの結果より、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１、ならびにＡＦＬ６０Ｆ２８−１を含むＡＦＬ６０画分およびアピオス花は、糖尿病予防に資する新たな健康食素材として有用であることが明らかとなった。食生活改善による生活習慣病の一次予防の重要性が増し、国民の健康志向が高まりを見せる状況下、血糖値上昇抑制効果を備えた食品素材・食品開発の基礎となる本発明の意義は大きく、産業上利用性の高い発明である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はアピオス花を用いた血糖値上昇抑制物質および糖尿病予防用食品素材に係り、特に、アピオス生産における廃棄物である花の有効利用によって得ることの可能な、アピオス花を用いた血糖値上昇抑制物質および糖尿病予防用食品素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
アピオス（別名ホドイモ）は、北米原産のマメ科のツル性植物であり、日本では青森県から広まったと言われている。つまり、リンゴを導入した際に苗木の土中にアピオスが混じっていたと考えられており、国内における栽培は、種芋も栽培法もすべて青森県に由来するものである。現在農産物として扱われているものはＡｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ であり、球状の根茎部が食用となる。
【０００３】
過去には、愛用者の経験談をもとに夢の健康作物としてマスコミでも取り上げられ、星川らはその栽培法について研究した（K.Hoshikawa., et al.: The growth of Apios (Apios americana Medikus), a new crop, under field conditions. Jpn. J. Crop Sci., 64, 323-327, 1995.）。しかし、その滋養強壮効果等の様々な生理作用についてはあくまでも伝承の類であり、科学的根拠には乏しいものだった。
【０００４】
そこで本願発明者らは、アピオス粉末を高血圧ラット（ＳＨＲ）に与えたところ、７〜１１％の降圧効果および中性脂肪の減少効果を見出した。この結果を元にして行った研究において、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を指標としてアピオスの降圧成分を探索し、ＡＣＥ阻害ペプチドを発見し、特許出願した（特許文献１）。また、県内産地の一つである五戸町の株式会社倉石地域振興公社は、本願発明者らと連携して新規製品開発を行っている。
【０００５】
なおアピオスのイモ部分については本願発明者らが既に、その生理作用に関する科学的報告をしている（非特許文献１、２）。なおまた、アピオス栽培においては、夏に咲く花を摘み取ることが良いイモを作るための一手段であると言われており、摘み取られた花は廃棄されているのが現状である。
【０００６】
さて一方、平成１８年国民健康・栄養調査結果の概要（厚生労働省健康局総務課生活習慣病対策室）によれば、生活習慣病有病者の状況は、糖尿病が強く疑われる人が約８２０万人、糖尿病の可能性を否定できない人が約１０５０万人、合計約１８７０万人と推定されており、平成１４年と比較して糖尿病が強く疑われる人は８０万人、可能性が否定できない人は２５０万人もの増加が見られた。また４０〜７４歳では、男性の２人に１人、女性の５人に１人が、メタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）が強く疑われる者またはその予備群と考えられている。
【０００７】
このような状況下、食生活改善による生活習慣病の一次予防の重要性が増し、国民の健康志向は高まっている。加えて２００８年４月より特定健診制度もスタートし、健診結果によっては、改善の指導及び結果の報告が求められ、医療費圧縮の施策推進として、治療から予防へのシフトが図られている。このようなことを背景として予防医学の一助としての保健機能食品への関心は高まり、厚生労働省認可の特定保健用食品およびいわゆる健康食品を含めた市場規模は、一般用医薬品の年間売り上げより多い１兆円以上であり、バイオテクノロジー戦略大綱では、２０１０年には３．２兆円を超えると推計している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−３２６７９０号公報「アピオスの酢酸・酵素処理物製造方法、アピオス由来ペプチドおよびその製造方法」
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】K. Iwai., et al.: Ingestion of Apios americana Medikus tuber suppresses blood pressure and improves plasma lipids in spontaneously hypertensive rats. Nutr. Res., 27, 218-224, 2007.
【非特許文献２】岩井邦久, 他: 「県産農水産物を活用した産業振興モデル」成果報告書, 財団法人21あおもり産業総合支援センター, 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、アピオス栽培においては良いイモを作るために花が摘み取られ、そしてそれは廃棄されており、その有効利用が模索されている現状である。この花を有効利用できれば、資源の有効活用と廃棄物産出低減の両方を図ることができる。さらに上述のように本願発明者らによって、アピオスのイモ部分の生理作用については血圧降下作用など身体に良い健康効果を明らかにされているが、殊アピオス花に関する生理作用およびその利用については従来、特段の技術開示文献は従来見当たらない。
【００１１】
そこで本発明が解決しようとする課題は、アピオス生産における廃棄物である花を用いることによって、人体において保健機能を発揮できる物質、およびそのような物質に基づく食品素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、アピオス花が含有するポリフェノールの生理作用を検討し、近年増加している生活習慣病の予防に資する生理活性成分の探索を行った。生理作用としては、特に増加が顕著である糖尿病予防に寄与するα−グルコシダーゼ阻害活性に焦点を当てた。さらに、生理活性の有用性を確認するために動物試験を行った。その結果、アピオス花が有用な生理活性成分を備えていることを見出し、本発明の完成に至った。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下の通りである。
【００１３】
〔１〕 アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花を用いた血糖値上昇抑制効果具有物。
〔２〕 アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花抽出物を用いた血糖値上昇抑制物質。
〔３〕 アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花から抽出される、α−グルコシダーゼ阻害作用を備えた化合物を用いた血糖値上昇抑制物質。
〔４〕 〔１〕に記載の血糖値上昇抑制効果具有物を用いた、糖尿病予防用食品素材。
〔５〕 〔２〕または〔３〕に記載の血糖値上昇抑制物質を用いた、糖尿病予防用食品素材。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のアピオス花を用いた血糖値上昇抑制物質および糖尿病予防用食品素材は上述のように構成されるため、これによれば、従来未利用であったアピオス生産における廃棄物である花を有効利用して、α−グルコシダーゼ阻害作用を有し血糖値上昇抑制効果の得られる食品素材を得、これに基づきかかる作用効果を有する食品を実現することができる。さらに、アピオス栽培における廃棄物産出を削減することもできる。
【００１５】
本願発明は、アピオス花の有用性を実証し、新規な健康的食素材開発の可能性を広げ、ひいては増加する生活習慣病予備群から有病者への歯止め策の一助とする上でも大いに意義深いものである。従来、花を食することができる植物性食物は、ブロッコリーや菊など、限られた種類しか存在しない。つまり本発明によれば、アピオス花に明らかとなったα−グルコシダーゼ阻害活性により、生活習慣病の予防に寄与する新たな食資源を提供、開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】アピオス花の写真である。
【図１Ｂ】アピオス花乾燥物の写真である。
【図２】活性画分の分画法を示すフロー図である。
【図３】ＡＦＬ４０およびＡＦＬ６０のセミ分取ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】ＡＦＬ６０Ｆ２８を更に精製した結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図６】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の１Ｈ−ＮＭＲ分析結果を示すグラフである。
【図７】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示すグラフである。
【図８】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１のＤＥＰＴ分析結果を示すグラフである。
【図９Ａ】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の化学構造を示す構造式である。
【図９Ｂ】ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の化学構造を示す構造式である。
【図１０】正常マウスにＡＦＬ６０とマルトースを同時に単回経口投与した後の血漿中グルコース濃度推移を示すグラフである。
【図１１】糖尿病モデルマウスにＡＦＬ６０とマルトースを同時に単回経口投与した後の血漿中グルコース濃度推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明について、詳細に説明する。
図１Ａ、１Ｂはそれぞれ、アピオス花、アピオス花乾燥物の写真である。
本発明の「アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花を用いた血糖値上昇抑制効果具有物」とは、アピオス花を用いることによって、血糖値上昇抑制効果を備えた物を広く指す。つまりアピオス花をどのように処理するかしないか、そのような処理形態・利用形態の如何に関わらず、アピオス花を用いたものであれば全て、かかる本発明に該当する。
【００１８】
さらに、かかる効果を備えた「物」には、粉状・粒状・液状・流体状といった不定形の物の他、一定の形態を備えた物も、また逆に化学物質レベルのような物質レベルの物も、広く含む。したがって、アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花からの抽出物であって、血糖値上昇抑制効果を具有する物も、当然ながら本発明の範囲内である。
【００１９】
また、かかる「血糖値上昇抑制効果具有物」を用いた糖尿病予防用食品素材も、その種類・形態等は何ら制限されず、本発明の血糖値上昇抑制効果具有物を用いたものである限り、あらゆる種類・形態の食品素材が本発明に該当する。
【００２０】
本発明の「アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花抽出物を用いた血糖値上昇抑制物質」は特に、実施例に後述するように、アピオス花から抽出されるα−グルコシダーゼ阻害作用を備えた化合物を用いた血糖値上昇抑制物質である。
【００２１】
また、かかる「血糖値上昇抑制物質」を用いた糖尿病予防用食品素材も、その種類・形態等は何ら制限されず、本発明の血糖値上昇抑制効果具有物を用いたものである限り、あらゆる種類・形態の食品素材が本発明に該当する。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を完成するに至った研究経過をもって実施例とし、本発明をより詳細に説明するが、本発明がかかる実施例に限定されるものではない。
実施例詳述の前にまず、研究経過における若干の用語について、一部、本研究との関連も含めて説明する。
【００２３】
〈α−グルコシダーゼ阻害活性〉
ヒトが摂取する糖質の多くは多糖類のデンプンだが、最終的には小腸粘膜上皮細胞の刷子縁膜に存在する数種類のα−グルコシダーゼ（二糖類水解酵素）により単糖類に分解され、小腸絨毛上皮から吸収される。糖尿病患者は小腸におけるこれらの酵素活性が亢進しており、食後の急激な血糖上昇にはインスリン分泌不足やインスリン抵抗性とともにこの酵素活性の亢進が関与していると考えられている。特に２型糖尿病患者の高血糖改善には食事療法が基本であるが、糖質の消化吸収を遅延させることによる血糖コントロールの観点から、α−グルコシダーゼ阻害薬が開発されている（ W. Puls, U. Keup: Influence of an α-amylase inhibitor (Bay 7791) on blood glucose serum insulin and NEFA in starch loading tests in rats dog and man. Diabetologia, 9, 97-101, 1973.）。
【００２４】
食事との関連性が強いことや、特定保健用食品として開発するメリットが大きいこと等から、最近では食品素材からα−グルコシダーゼ阻害成分を探索する研究も盛んに行われており（T. Matsui, et al.: In vitro survey of α-glucosidase inhibitory food components. Biosci. Biotechnol.Biochem., 60, 2019-2022, 1996.）、バナバ（鈴木裕子, 他: バナバ(Lagerstroemia speciosa L.) 葉抽出物のラットにおける食後血糖上昇抑制作用およびその作用様式. 日本栄養・食糧学会誌. 54, 131-137, 2001.）、桑葉（小島芳弘: 桑葉の保健機能, 食品と開発, 37 (10), 54-56, 2002.）、タモギタケ（藤野正行, 何普明: タモギタケ熱水抽出物によるII 型糖尿病モデルマウスの血糖値抑制. 日本食品科学工学会誌, 45, 618-623, 1998.）等が見出されている。
【００２５】
特に桑葉からはグルコースと構造が類似した成分が抽出され、１−ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ（ＤＮＪ）として同定されている（N. Peyrieras, et al.: Effects of the glucosidase inhibitors nojirimycin and deoxynojirimycin on thebiosynthesis of membrane and secretory glycoproteins. EMBO J., 2, 823-832, 1983.、他）。このように、α−グルコシダーゼ阻害作用は高血糖の抑制・改善に有益であり、糖尿病予防を目指す食品の開発や研究の多くは、糖質の分解と吸収を阻害・遅延させ、過血糖を改善するものが主流である。
【００２６】
〈ポリフェノール〉
ポリフェノールは植物細胞の生成、活性化などを助ける働きを持つ。その有効性は抗酸化作用に基づくものであるため、動脈硬化、糖尿病、ガン等の予防、老化抑制等の様々な生体調整機能に関係している。アピオス花中のポリフェノールとしてはアントシアニン類等が本願発明者により類推されているが（岩井邦久, 他: 「県産農水産物を活用した産業振興モデル」成果報告書, 財団法人21 あおもり産業総合支援センター, 2005.）、詳細は解明されていない。
【００２７】
＜Ａ 研究方法＞
アピオス花の利用価値を高めるため、アピオス花が持つ有益な生理活性、特にα−グルコシダーゼ阻害活性、抗酸化活性等を探索し、それら活性成分の解明（構造決定）を行った。
＜Ａ−１．試料調製＞
五戸町倉石地域で８月に採取したアピオス花を５０〜６０℃で温風乾燥した。これをギ酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および１％ギ酸含有メタノール（ギ酸／ＭｅＯＨ）中でホモジナイズし、攪拌抽出を行い、遠心分離にて得た上清を濃縮乾固し凍結乾燥して粗抽出物を調製し、Ｆｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法によるポリフェノール濃度（Gao X., et al.: J. Sci. Food Agric., 80, 2021-2027, 2000. 以下も同じ。）、ＤＰＰＨラジカル消去活性（須田郁夫: 抗酸化機能, 分光学的抗酸化機能評価. 食品機能研究法, 篠原和毅他編, pp.218-220, 光琳, 2000. 以下も同じ。）、α−グルコシダーゼ（マルターゼ）阻害活性（鈴木裕子, 他: バナバ(Lagerstroemia speciosa L.) 葉抽出物のラットにおける食後血糖上昇抑制作用およびその作用様式. 日本栄養・食糧学会誌. 54, 131-137, 2001. 以下も同じ。）を測定し、最適な抽出方法を決定した。
【００２８】
＜Ａ−２．生理活性の測定＞
ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定では、試料をエタノールで溶解および希釈し、ＤＰＰＨ溶液を添加混合し、５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準物質としたＴｒｏｌｏｘの吸光度から検量線を作成し、試料１μｇ当たりのラジカル消去活性をＴｒｏｌｏｘ相当量として算出した。
【００２９】
マルターゼ阻害活性の測定では、マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した試料にマルトース（基質）を混合し、プレインキュベートした。この混合液にラット小腸粉末由来の粗酵素液を添加混合し、３７℃でインキュベートした。経時的にサンプリングし、ムロターゼ−ＧＯＤ法により測定したグルコース生成量から酵素反応速度を求め、酵素＋基質のみの反応速度を１００％とし、試料添加時の酵素活性阻害率を算出した。試料濃度と阻害率の関係から、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を阻害活性として算出した。
【００３０】
＜Ａ−３．アピオス花活性画分の大量調製＞
アピオス花ギ酸／ＭｅＯＨ抽出物を大量に調製し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（３７×９８０ｍｍ）によって分画を行った。１回の処理で抽出物２ｇを負荷し、ＭｅＯＨ含量０，２０，４０，６０，９９および１００％の１％ギ酸／ＭｅＯＨ混合溶液を４５０ｍＬずつ流速２ｍＬ／ｍｉｎで流した。溶出物（ＡＦＬ０，ＡＦＬ２０，ＡＦＬ４０，ＡＦＬ６０，ＡＦＬ９９，ＡＦＬ１００）を収集し、濃縮・凍結乾燥を施し、この処理を繰り返すことで、活性画分を大量に調製した。全画分の総ポリフェノール濃度、ＤＰＰＨラジカル消去活性およびマルターゼ阻害活性を測定し、活性画分を確定した。
図２は、活性画分の分画法を示すフロー図である。
【００３１】
＜Ａ−４．アピオス花ポリフェノールの分析＞
Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０で分画したＡＦＬ０，ＡＦＬ２０，ＡＦＬ４０，ＡＦＬ６０，ＡＦＬ９９およびＡＦＬ１００を高速液体クロマトグラフィー−フォトダイオードアレイ検出（ＨＰＬＣ−ＰＤＡ）で分析し、各画分中に含まれるポリフェノール類を分析した。分析システムはＷａｔｅｒｓ ２６９５（Ｗａｔｅｒｓ社）、カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（粒径５μｍ，４．６Ｘ１５０ｍｍ）を使用し、カラム温度４０℃にて移動相としたＡ液１０％ギ酸およびＢ液アセトニトリルを０〜３５分間でＢ液０〜７０％に変化させるリニアグラジエントで、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで流した。分析注入量は１０μＬで、２９９８ＰＤＡ検出器（Ｗａｔｅｒｓ社）によって２００〜８００ｎｍの波長範囲で検出した。
【００３２】
＜Ａ−５．主要なポリフェノールの分取、活性成分の分離・精製＞
ＡＦＬ６０（マルターゼ阻害画分）を分取ＨＰＬＣに供し、主要なピークを分取した。分取ＨＰＬＣは、ポンプおよびインジェクターにＷ６００（Ｗａｔｅｒｓ社）、カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２０Ｘ３００ｍｍ）、移動相にＡ液１０％ギ酸およびＢ液アセトニトリルを使用し、カラム温度４０℃にて、Ｂ液濃度を０〜７０分で０％から７０％に変化させるリニアグラジエント（７０〜９０分でＢ液１００％、その後初期条件に平衡化）条件で、流速５．０ｍＬ／ｍｉｎで溶出した。ＡＦＬ６０の注入量は５００μＬとし、波長２８０ｎｍで検出した。ＥＹＥＬＡ製フラクションコレクターＤＣ−１５００を使用し、１０〜５４分の分取区間で１分間隔にてピークを分取した。分取した活性ポリフェノールのＨＰＬＣ−ＰＤＡによる分析と精製を行った。装置、カラムおよび移動相は既述した分析条件と同じであり、移動相のグラジエント条件を０〜６０分で０〜３５％に変化させるリニアグラジエントに変更した。
【００３３】
＜Ａ−６．活性成分の構造決定＞
構造決定は核磁気共鳴（ＮＭＲ）および液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって分析し、活性成分の構造同定を行った。
【００３４】
＜Ａ−７．アピオス花活性画分の生理効果の検討＞
アピオス花活性画分ＡＦＬ６０を大量に調製し、生理効果を検討するため、マルトースを投与する糖負荷試験を行った。動物には、正常マウスとして雄性ｄｄＹマウス（１０週齢）および糖尿病モデルマウスとして雄性ＫＫ−Ａｙマウス（１０週齢）を用い、ＡＦＬ６０とマルトースを混合し、２０時間の絶食下で単回経口投与した。ＡＦＬ６０の投与量は０，６２．５，１２５および２５０ｍｇ／ｋｇとして０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁し、マルトースの投与量は０．６ｇ／ｋｇとした。投与後０，０．５，１および２時間に、ヘパリン処理済プラスチック製キャピラリーチューブを用いて眼窩底採血を行い、血液を直ちにヘマトクリット遠心機（３２２０，クボタ）で遠心分離（１２，０００ｒｐｍＸ２分）し、血漿を採取した。適宜０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液で希釈し、血漿中グルコース濃度をグルコースＣII-テストワコー（和光純薬工業）にて測定した。
【００３５】
＜Ｂ 結果および考察＞
＜Ｂ−１．アピオス花活性画分の大量調製＞
アピオス花の抽出では、ギ酸およびＴＦＡ抽出に比べて１％ギ酸／ＭｅＯＨ抽出が総ポリフェノール濃度、ＤＰＰＨラジカル消去活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性いずれも優れており、活性成分を得るためには１％ギ酸／ＭｅＯＨ 抽出が適していることが明らかになった。
表１に、アピオス花ギ酸／ＭｅＯＨ抽出物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーで分画した時の収量、総ポリフェノール濃度、ＤＰＰＨラジカル消去活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性を示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
分画した７０％はＡＦＬ０に集まったが、これにはポリフェノールはほとんど含まれず、ＤＰＰＨラジカル消去活性およびグルコシダーゼ阻害活性も認められず、ほとんどが糖質であることが推察された。総ポリフェノール濃度が最も高かったのはＡＦＬ４０だったが、ＤＰＰＨラジカル消去活性およびグルコシダーゼ阻害活性が最も強かったのはＡＦＬ６０であった。したがって、ＡＦＬ６０を活性成分同定のための分取に使用した。
【００３８】
＜Ｂ−２．アピオス花活性成分の解明＞
１）セミ分取逆相カラムの使用による主要なポリフェノールの分取
リニアグラジエント溶出条件でセミ分取ＨＰＬＣによる分画を行い、ＡＦＬ６０からピークを大量に分離した。フラクションコレクターを使用し、保持時間１０〜５４分で１分間隔にてピーク分取を行った。
図３は、ＡＦＬ４０およびＡＦＬ６０のセミ分取ＨＰＬＣクロマトグラムである。その結果、図示するように、ＡＦＬ６０から３３分および３６分に非常に大きなピークを得た。また、ＡＦＬ４０も同様に処理すると３４，３７および３９分に主要なピークを得た。
【００３９】
分取したこれらのピークのマルターゼ阻害活性を測定すると、阻害活性が強かったのはＦｒ．２５，Ｆｒ．２８およびＦｒ．２９であり、これらにおけるマルターゼ阻害率はいずれも５０％以上であった。Ｆｒ．２５は収量が少ないため、Ｆｒ．２８およびＦｒ．２９を活性ポリフェノールとして収集し、更に精製した。ＡＦＬ４０もＦｒ．２９およびＦｒ．３０がこれらと類似性が考えられたため、同様に収集した。
【００４０】
２）活性ポリフェノールの分離・精製
ＡＦＬ６０から分取したＦｒ．２８（ＡＦＬ６０Ｆ２８）をＨＰＬＣで再度分析すると、４〜５本のピークが混在していた。これらはポリフェノール化合物であることが示唆された。
そこで、ＨＰＬＣ条件を変更しＡＦＬ６０Ｆ２８を更に精製した結果、主要ピーク＃１〜＃５が得られた。これらは、３２０ｎｍに吸収極大を有する成分が１種類、２８０ｎｍに吸収極大を持つ成分が２種類、５２５ｎｍに吸収極大を持つ成分が２種類であった。
図４は、ＡＦＬ６０Ｆ２８をさらに精製した結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００４１】
表２は、これらピーク＃１〜＃５のマルターゼ阻害活性を示すものである。各収量は０．４〜０．８ｍｇであり、ＡＦＬ６０Ｆ２８の３〜６％に相当した。ピーク＃４および＃５はアントシアニンであることが示されたが、阻害率は３０％以下と低く、最も阻害が強かったのは＃１（ＡＦＬ６０Ｆ２８−１）で、この成分は３３０ｎｍに吸収極大を持つポリフェノール化合物であることが示唆された。
【００４２】
【表２】
【００４３】
図５は、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した結果を示すクロマトグラムである。その結果、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１は分子量が３４２と推定された。また、
図６は、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の１Ｈ−ＮＭＲ分析結果を示すグラフ、
図７は、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１の１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示すグラフ、そして
図８は、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１のＤＥＰＴ分析結果を示すグラフである。
【００４４】
以上の分析結果からＡＦＬ６０Ｆ２８−１は、
分子式がＣ１５Ｈ１８Ｏ９の、（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリル酸β−Ｄ−グルコピラノシル（カフェオイルβ−Ｄ−グルコピラノシド）か、もしくは、
２−Ｏ−［３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリロイル］−Ｄ−グルコピラノース のいずれかであることが示された。
図９Ａ、９Ｂはこれらの構造式である。
【００４５】
＜Ｂ−３．アピオス花活性画分の生理効果＞
アピオス花活性画分としてＡＦＬ６０をマルトースと混合し、マウスに単回経口投与する負荷試験を行った。
図１０は、正常マウスにＡＦＬ６０とマルトースを同時に単回経口投与した後の血漿中グルコース濃度推移を示すグラフである。マルトースの投与量は０．６ｇ／ｋｇであり、データは５匹の平均値±標準偏差を示す。図示するように、正常マウスである雄性ｄｄＹマウスに負荷した時、マルトース（Ｍａｌ）単独の投与では投与後０．５時間での血糖値が絶食下血糖値の２．５倍に増加したのに対し、ＡＦＬ６０を混合して負荷した場合は、血糖値の上昇は２倍以下に抑えられた。統計的有意差はなかったものの、この抑制は投与後０．５時間だけでなく、１時間でも見られた。また、用量依存性が認められた。したがって、アピオス花には正常マウスの血糖値に対する上昇抑制効果のあることが示された。
【００４６】
同様の検討を糖尿病モデルＫＫ−Ａｙマウスでも行った。
図１１は、糖尿病モデルマウスにＡＦＬ６０とマルトースを同時に単回経口投与した後の血漿中グルコース濃度推移を示すグラフである。マルトースの投与量は０．６ｇ／ｋｇであり、データは５匹の平均値±標準偏差を示す。その結果、図示するように、血糖値はマルトース投与後１時間で最大となり、そのレベルは絶食下血糖値の２．７倍に達した。ｄｄＹに比べて血糖値の低下は遅く、糖尿病モデル特有の血糖値推移を示した。ＡＦＬ６０を投与した場合、０．５時間ではマルトース単独と血糖値に差はなかったが、投与後１時間以降でマルトース単独よりも低い血糖値推移を示し、血糖値の上昇抑制あるいは抑制傾向が示された。
【００４７】
これらの結果から、ＡＦＬ６０には血糖上昇抑制効果があることが示された。なお糖尿病モデルマウスでは、少ない用量でより高い効果が認められた。つまり、少量の使用によって充分に血糖上昇抑制効果を得られることが示された。これは、必要以上に用量が多い場合にはかえって、ＡＦＬ６０に含まれる成分が消化管内で何らかの変化を起こして糖質としての吸収・血糖値の上昇に結びつくという機作が考えられる。かかる現象は正常マウスでは見られなかったことであるが、ｄｄＹマウスとＫＫ−Ａｙマウスの糖質吸収および配糖体の分解に関する生体機能の違いが関与しているものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
以上述べた通り本発明では、従来廃棄されているアピオス花の高付加価値化と有効利用を目的に、生理活性の探索、活性成分の同定を行った。つまり、アピオス花の抽出物を調製し、カラムクロマトグラフィー手法によって分画し、ラジカル消去活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性を指標に成分を分離・精製した。その結果、マルターゼ（α−グルコシダーゼの一種）阻害作用を有する成分としてＡＦＬ６０Ｆ２８−１が単離され、これは（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリル酸β−Ｄ−グルコピラノシル（カフェオイルβ−Ｄ−グルコピラノシド）、または２−Ｏ−［３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリロイル］−Ｄ−グルコピラノースであることを同定した。これら化合物がα−グルコシダーゼ阻害作用を有することが、本発明により初めて明らかとなった。
【００４９】
さらに、この成分を含む活性画分ＡＦＬ６０をマウスに投与した結果、正常マウスおよび糖尿病モデルマウスにおいて、血糖値の上昇抑制効果が認められた。これらの結果より、ＡＦＬ６０Ｆ２８−１、ならびにＡＦＬ６０Ｆ２８−１を含むＡＦＬ６０画分およびアピオス花は、糖尿病予防に資する新たな健康食素材として有用であることが明らかとなった。食生活改善による生活習慣病の一次予防の重要性が増し、国民の健康志向が高まりを見せる状況下、血糖値上昇抑制効果を備えた食品素材・食品開発の基礎となる本発明の意義は大きく、産業上利用性の高い発明である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花を用いた血糖値上昇抑制効果具有物。
【請求項２】
アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花抽出物を用いた血糖値上昇抑制物質。
【請求項３】
アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花から抽出される、α-グルコシダーゼ阻害作用を備えた化合物を用いた血糖値上昇抑制物質。
【請求項４】
請求項１に記載の血糖値上昇抑制効果具有物を用いた、糖尿病予防用食品素材。
【請求項５】
請求項２または３に記載の血糖値上昇抑制物質を用いた、糖尿病予防用食品素材。
【請求項１】
アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花を用いた血糖値上昇抑制効果具有物。
【請求項２】
アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花抽出物を用いた血糖値上昇抑制物質。
【請求項３】
アピオス（Ａｐｉｏｓ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｅｄｉｋｕｓ）花から抽出される、α-グルコシダーゼ阻害作用を備えた化合物を用いた血糖値上昇抑制物質。
【請求項４】
請求項１に記載の血糖値上昇抑制効果具有物を用いた、糖尿病予防用食品素材。
【請求項５】
請求項２または３に記載の血糖値上昇抑制物質を用いた、糖尿病予防用食品素材。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【公開番号】特開２０１１−３７８００（Ｐ２０１１−３７８００Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８９０００（Ｐ２００９−１８９０００）
【出願日】平成２１年８月１８日（２００９．８．１８）
【出願人】（５０８１０５１８６）公立大学法人青森県立保健大学 (8)
【出願人】（５０４３５０８８７）株式会社倉石地域振興公社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１８日（２００９．８．１８）
【出願人】（５０８１０５１８６）公立大学法人青森県立保健大学 (8)
【出願人】（５０４３５０８８７）株式会社倉石地域振興公社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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