アミノピラゾール化合物
本発明は、慢性骨髄増殖性疾患ならびに様々な癌、例えば、神経膠芽腫、乳癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、および白血病の治療において有用な、アミノピラゾール化合物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）は、サイトカインの情報伝達に関与するチロシンキナーゼファミリーのメンバーである。ＪＡＫ２は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）情報伝達経路（赤血球の分化およびＳｔａｔ５の活性化等）における、中心的役割を有する。
【０００３】
近年の研究において、慢性骨髄増殖性疾患（真性多血症、本態性血小板増加症、および骨髄化生を伴う骨髄硬化症等）および血栓性疾患（活性化プロテインＣ抵抗性、内臓静脈血栓症、バッド・キアリ症候群、および門脈血栓症等）を有する患者は、ＪＡＫ２における後天性の活性化突然変異を頻繁に有することが示された。当該変異（アミノ酸位置６１７でのバリンからフェニルアラニンへの置換）は、構成的チロシンリン酸化活性を、未知の機構によってもたらす。ＪＡＫ２変異の構成的活性は、増加したレベルのリン酸化ＪＡＫ２、ｐＳＴＡＴ５、およびＳＴＡＴ５転写活性をもたらし、これらは骨髄増殖性疾患および白血病（非定型慢性骨髄性白血病等）の病理発生をもたらす。さらに、ＪＡＫ２は、インターロイキン６依存性オートクリンループ（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｌｏｏｐ）、または固形癌および血液腫瘍（例えば、神経膠芽腫、乳癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、原発性および二次性の急性骨髄性白血病、Ｔ細胞性（Ｔ−ｌｉｎｅａｇｅ）およびＢ細胞性（Ｂ−ｌｉｎｅａｇｅ）の急性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群）における他の遺伝子変異によって活性化される。
【０００４】
様々なアミノピラゾールチロシンキナーゼ阻害剤が報告されている。例えば、特許文献１および特許文献２を参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０６０８７５３８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７０６４７９７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、チロシンキナーゼ（ＪＡＫ２等）を阻害するさらなる化合物に対するニーズが依然として存在する。本発明は、ＪＡＫ２情報伝達経路が活性化されるか、またはＪＡＫ／ＳＴＡＴ情報伝達が調節不全にされる、骨髄増殖性疾患の治療のための臨床用途を有すると考えられる新規なアミノピラゾール化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩を提供する。
【０００８】
本発明は、哺乳類における、真性多血症、本態性血小板増加症、および骨髄化生を伴う骨髄硬化症からなる群から選択される慢性骨髄増殖性疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳類に、有効量の３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩を投与する工程を含む治療方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、患者における、神経膠芽腫、乳癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、ならびに白血病、例えば非定型慢性骨髄性白血病、原発性および二次性の急性骨髄性白血病、Ｔ細胞性およびＢ細胞性の急性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに骨髄増殖性疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする患者に、有効量の３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩を投与する工程を含む治療方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンもしくはその薬理学的に許容できる塩、および薬理学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明はまた、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンもしくはその薬理学的に許容できる塩、および薬理学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を、別の治療成分と組み合わせて提供する。
【００１２】
本発明はまた、薬物としての使用のための、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩を提供する。さらに、本発明は、慢性骨髄増殖性疾患の治療のための薬物の製造における、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩の使用を提供する。特に、これらの慢性骨髄増殖性疾患は、真性多血症、本態性血小板増加症、および骨髄化生を伴う骨髄硬化症からなる群から選択される。さらに、本発明は、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩を有効成分として含む、真性多血症、本態性血小板増加症、および骨髄化生を伴う骨髄硬化症からなる群から選択される慢性骨髄増殖性疾患の治療のための医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の化合物は、塩を形成できることが当業者によって理解されるだろう。本発明の化合物はアミンであり、従って、いくつかの無機酸および有機酸のいずれかと反応し、薬理学的に許容できる酸付加塩を形成する。このような薬理学的に許容できる酸付加塩、および、これらを調製するための一般的な方法論は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）；Ｌ．Ｄ．Ｂｉｇｈｌｅｙ、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ、Ｄ．Ｃ．Ｍｏｎｋｈｏｕｓｅの、“Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、Ｊ．ＳｗａｒｂｒｉｃｋおよびＪ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ編集、Ｖｏｌ．１３、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ １９９５、ｐｐ．４５３−４９９；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ ６６、Ｎｏ．１、１９７７年、１月を参照。
【００１４】
下記の調製物および例は、ＣｈｅｍＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０を使用して命名した。
【００１５】
スキーム１：
調製１
１−（４−メトキシベンジル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン
方法１：
１Ｌの丸底フラスコ中で、５−アミノ−３−メチルピラゾール（２２．８ｇ、２３４．８ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルピロリドン（２００ｍＬ）を混合した。フラスコを、０℃まで冷却し、窒素下に置いた。水酸化ナトリウム（９．３９ｇ、１．０当量（ｅｑｕｉｖ．））をフラスコに加え、３０分間（ｍｉｎ）撹拌した。Ｎ−メチルピロリドン（１００ｍＬ）中のα−クロロ−４−メトキシトルエン（３１ｍＬ、１．０当量）の溶液を、フラスコに滴下した。当該反応物を、室温（ＲＴ）まで、ゆっくりと一晩加温した。当該反応物を水で希釈し、酢酸エチル（ＥＡ）で抽出した。有機物を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。真空中で濃縮した。シリカのプラグ上で精製した（ヘキサン→２：１ ヘキサン：ＥＡ →３：２ ヘキサン：ＥＡ→１：１ ヘキサン：ＥＡ→１：２ ヘキサン：ＥＡ→ＥＡ）。所望の画分を濃縮し、標記の化合物を得た（１０．８ｇ、２１％）。ＬＣＭＳ（４分間）＝２１８．０（Ｍ＋１）。
【００１６】
方法２：
Ａ．（Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（４−メトキシベンジリデン）ヒドラジンカルボキシラート
４−メトキシベンズアルデヒド（４００ｇ、２．９４ｍｏｌ）を、トルエン（７５０ｍＬ）中のカルバジン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４００ｇ、２．９４ｍｏｌ）の溶液に、２０分間かけて、５０℃で加えた。１時間（ｈ）かけて還流まで加熱し、トルエンとの共沸混合物中の水を収集した。さらなる水が全く収集されなくなった後に、６０℃まで冷却した。ヘキサンを、生成物が溶液から沈殿するまで加えた。さらに２０℃まで浴を冷却した。固形物を濾過によって収集し、窒素圧を使用して乾燥させ、標記の化合物を得た（７５０．５ｇ、９１％）。１ＨＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ジメチルスルホキシド−ｄ６（ＤＭＳＯ−ｄ６）］δ １０．６−１０．８（ｂｓ，１Ｈ）、７．８８−８．０（Ｓ，１Ｈ）、７．５−７．５５（ｄ，２Ｈ）、６．９５−７．０（ｄ，２Ｈ）、１．４５（ｓ，９Ｈ）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４９［Ｍ−Ｈ］。
【００１７】
Ｂ．ｔｅｒｔ−ブチル ２−（４−メトキシベンジル）ヒドラジンカルボキシラート
ＥＡ（１００ｍＬ）中でスラリーにした１０％ パラジウム炭素（水湿潤品、２０ｇ）を、密封した圧力反応器に、真空搬送装置を介して加えた。搬送ラインを最少量のＥＡでリンスした。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１０００ｍＬ）中に溶解された（Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（４−メトキシベンジリデン）ヒドラジンカルボキシラート（３２０ｇ、１．２８ｍｏｌ）を、真空搬送装置を介して入れ、ラインを最少量のＴＨＦでリンスした。当該反応器を５０ＰＳＩ（約３４４ｋＰａ）まで、Ｈ２で加圧し、当該反応器の中身を２０±１０℃で混合した。当該反応を続け、さらなる水素の取り込みが認められなくなるまで、水素圧力を５０ＰＳＩ（約３４４ｋＰａ）に維持した。反応溶液を濾過し、触媒を除去し、触媒濾過ケーキをＴＨＦ（５００ｍＬ）で洗浄した。当該洗浄物を反応濾液に加えた。当該溶液を真空中で濃縮し、標記の化合物（３３７ｇ、８６％）を油状物として得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．１−８．３（ｓ，１Ｈ）、７．１−７．３（ｄ，２Ｈ）、６．８−６．９（ｄ，２Ｈ）、４．４−４．６（ｂｓ，１Ｈ）、３．７−３．８（ｓ，２Ｈ）、３．６−３．７（ｓ，３Ｈ）、１．３−１．５（ｓ，９Ｈ）。
【００１８】
Ｃ．（４−メトキシベンジル）ヒドラジン二塩酸塩
ジオキサン（２０００ｍＬ、８．００ｍｏｌ ＨＣｌ）中の４Ｎ 塩化水素の溶液に、最少量のジオキサン中に溶解された、ｔｅｒｔ−ブチル ２−（４−メトキシベンジル）ヒドラジンカルボキシラート（３２４ｇ、１．０９ｍｏｌ）を、ゆっくりと１時間かけて加えた。沈殿物が徐々に形成した。溶液を、１６時間、２０±５℃で撹拌させた。固形物を濾過によって収集した。当該固形物をヘプタン（２０００ｍＬ）中でスラリーにし、当該固形物を濾過によって単離した。当該固形物を、窒素圧を使用して乾燥し、標記の化合物を得た（２４２．３ｇ、１．０８ｍｏｌ、９８％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．２−９．０（ｂｓ，５Ｈ）、７．３−７．４（ｄ，２Ｈ）、６．８−７．０（ｄ，２Ｈ）、４．０（ｓ，２Ｈ）、３．７（ｓ，３Ｈ）。
【００１９】
Ｄ．１−（４−メトキシベンジル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−アミンおよび１−（４−メトキシベンジル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン
カリウム ｔｅｒｔ−ブトキシド（１９１．８９ｇ、１．７１ｍｏｌ）およびＴＨＦ（２０００ｍＬ）を、２２℃で混合した。均一な溶液が得られるまで混合した。５℃まで冷却した。アセトニトリル（８４．２５ｇ、２．０５ｍｏｌ）および酢酸メチル（１２６．７ｇ、１．７１ｍｏｌ）の予混合した溶液を、カリウム ｔｅｒｔ−ブトキシド溶液に、４５分間かけて、温度を１０℃未満に維持しながら加えた。加え終わった後に、反応物を２０±５℃まで加温させ、約２時間撹拌した。（４−メトキシベンジル）ヒドラジン二塩酸塩（２５０ｇ）を、当該反応物に、約５分間かけて数回に分けて加え、次いで、ジオキサン（２６２．５ｇ、１．００ｍｏｌ）中の４Ｎ 塩化水素を、温度を＜３０℃に維持する速度で加えた。加え終わったときに、２５±５℃で約１６時間撹拌させた。固形物を濾過によって単離し、ＴＨＦ（５００ｍＬ）で洗浄した。粗製の固形物を、ジクロロメタン（ＤＣＭ、４Ｌ）および水（２Ｌ）中で、ｐＨを５Ｎ ＮａＯＨで＞１０に調整してスラリーにした。層を沈降させ、有機層を収集した。水層をＤＣＭ（２Ｌ）で洗浄した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、当該溶液を、固形物となるまで真空中で濃縮し、１６５ｇの粗製物を得た。当該粗製物を酢酸イソプロピル（６６０ｍＬ）中で還流まで加熱し、できるだけ多くの固形物を溶解した。３３℃まで冷却し、ヘキサン（６００ｍＬ）をゆっくりと１時間かけて加えた。１０℃まで冷却し、温度を１０℃に１０分間維持した。固形物を濾過によって単離し、ヘキサン（２００ｍＬ）で洗浄し、窒素圧を使用して乾燥し、標記の化合物の混合物を得た（９１．５ｇ、０．４ｍｏｌ、４７％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７．２−７．３（ｄ，２Ｈ）、６．７−６．９（ｄ，２Ｈ）、５．１（ｂｓ，２Ｈ）、５．０（ｓ，１Ｈ）、４．９（ｓ，２Ｈ）、３．６−３．８（ｓ，３Ｈ）、１．９（ｓ，３Ｈ）。
【００２０】
注意：これらの中間体は、クロマトグラフィーによって分離できる。しかし、この場合、これらは混合物として単離され、ベンジル保護基の除去を伴い、同じ生成物をもたらす下記の最終段階において使用できる。
【００２１】
調製２
２−クロロ−１−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）エタノン
１Ｌの丸底フラスコ中で、４’−クロロ−２’−フルオロアセトフェノン（４０ｇ、２３１．８ｍｍｏｌ）、ヘプタン（１２０ｍＬ）、およびメタノール（１６ｍＬ）を混合した。０℃まで冷却し、窒素下に置いた。塩化スルフリル（２１．５ｍＬ、１．１５当量）をヘプタン（１２０ｍＬ）中で溶解し、滴下漏斗に入れた。当該反応物に６０分間かけて滴下した。２．５時間、０℃で撹拌し、この間に白色の沈殿物が形成した。当該滴下漏斗に１Ｍ 炭酸水素ナトリウム（４００ｍＬ）を入れ、次いで、当該反応物に滴下した。全てのガス発生が停止した後に、二相性の懸濁液を濾過し、標記の化合物（３８．１８ｇ、８０％）を白色針状晶として収集した。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ５．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、７．４３（ｍ，１Ｈ）、７．６３（ｍ，１Ｈ）、７．８９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）。
【００２２】
調製３
（Ｅ）−Ｎ’−（６−クロロピリダジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトイミドアミド
２Ｌの丸底フラスコ中で、３−クロロ−６−ピリダジンアミン（４３．２ｇ、３３３．５ｍｍｏｌ）、トルエン（５００ｍＬ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドジメチルアセタール（６７．８ｍＬ、１．２５当量）を混合した。還流冷却器を取り付け、次いで、還流まで２時間加熱した。室温まで冷却させた。真空中で濃縮した。粗製物質をヘキサンで粉末にし、濾過し、標記の化合物（６０．４ｇ、９１％）を淡い黄褐色固体として単離した。ＭＳ＝１９９．０（Ｍ＋１）。
【００２３】
調製４
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン
丸底フラスコ中で、（Ｅ）−Ｎ’−（６−クロロピリダジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトイミドアミド（３６．６１ｇ、１８４．３ｍｍｏｌ）、２−クロロ−１−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）エタノン（３８．１５ｇ、１当量）、およびジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）を混合した。窒素下に置き、次いで、１２０℃で４時間加熱した。室温まで冷却させ、一晩撹拌した。ＥＡ（１Ｌ）および水（５００ｍＬ）で希釈した。有機物を水で３回抽出し、次いで、飽和塩化ナトリウム水溶液で抽出した。有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮した。シリカプラグによって精製し（ヘキサン→４：１ ヘキサン：ＥＡ→３：１ ヘキサン：ＥＡ→２：１ ヘキサン：ＥＡ→１：１ ヘキサン：ＥＡ）、標記の化合物（３３．８ｇ、５７％）を淡い緑色固形物として単離した。ＬＣＭＳ（４分間＝３２４．０，３２６．０，Ｍ＋１）。
【００２４】
調製５
２−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンゾイル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオン
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン（５．６ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−フタロイルグリシン（６．０ｇ、１．７当量）、アセトニトリル（６０ｍＬ）、水（１５ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（０．２６ｍＬ、０．２当量）、および硝酸銀（２９４ｍｇ、０．１当量）を丸底フラスコ中で、取り付けた滴下漏斗で混合し、窒素下に置いた。７０℃まで加熱し、この温度で１５分間維持した。過硫酸アンモニウム（７．１ｇ、１．８当量）を水（１５ｍＬ）中に溶解し、滴下漏斗に入れた。当該反応フラスコに、およそ２０分間かけて滴下した。反応物を７０℃で１時間加熱した。この間に沈殿物が形成した。ブフナー漏斗を介して濾過し、標記の化合物の粗製物（７．３ｇ、８７％）を、オフホワイトの固体として単離した。ＬＣＭＳ（４分間）＝４８３．０，４８５．０，Ｍ＋１。
【００２５】
調製６
（８−（アミノメチル）−６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）（４−クロロ−２−フルオロフェニル）メタノン
２−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンゾイル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオン（７．３０ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、エタノール（２００ｍＬ）、およびヒドラジン（１．４５ｍＬ、３当量）を、丸底フラスコ中で混合し、窒素下に置いた。２日間、室温で撹拌した。２時間、５０℃で加熱し、次いで、反応物を真空中で濃縮した。ＥＡで希釈した。有機物を、１Ｎ ＨＣｌ（ａｑ）で洗浄し、生成物を水層に入れた。当該水層を、１Ｎ ＮａＯＨ（ａｑ）で塩基性にし、ＥＡで抽出した。ＥＡ層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮し、標記の化合物の粗製物（１．２ｇ、２３％）を淡い緑色固形物として得た。ＭＳ＝３５５．０，３５３．０（Ｍ＋１）。
【００２６】
調製７
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン
（８−（アミノメチル）−６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）（４−クロロ−２−フルオロフェニル）メタノン（１．１５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、水（１２ｍＬ）、炭酸カリウム（４９５ｍｇ、１．１当量）、および２−ブロモエチルエーテル（０．４７ｍＬ、１．１当量）を、２０ｍＬ マイクロ波反応容器中で混合した。圧着キャップで密封し、次いで、マイクロ波反応器中で、１２０℃で２０分間加熱した。室温まで冷却し、ＥＡおよび水の間に分配した。ＥＡ層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮した。シリカゲル上で精製し（４：１ ヘキサン：ＥＡ→２：１ ヘキサン：ＥＡ→１：１ ヘキサン：ＥＡ）、標記の化合物（０．４３ｇ、３１％）を淡い黄色フォームとして得た。ＬＣＭＳ（４分間）＝４２３．０，４２５．０，Ｍ＋１。
【００２７】
調製８
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノール
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）−イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン（０．４３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびメタノール（１５ｍＬ）を、丸底フラスコ中で混合した。窒素下に置き、０℃まで冷却した。水素化ホウ素ナトリウム（５８ｍｇ、１．５当量）を一度に加えた。５分間、この温度で撹拌し、次いで、冷却槽を取り除き、室温まで加温させた。１５分間後、反応物を水でクエンチし、次いで、ＥＡで抽出した。有機物を、水、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮し、標記の化合物（０．４ｇ、９３％）を得た。ＬＣＭＳ（４分間）＝４２５．０，４２７．０，Ｍ＋１。
【００２８】
調製９
４−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）モルホリン
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）−イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノール（０．４ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）、１，２−ジクロロエタン（２５ｍＬ）、トリエチルシラン（０．４５ｍＬ、３当量）、およびトリフルオロ酢酸（０．５７ｍＬ、８当量）を、丸底フラスコ中で混合し、窒素下に置いた。７０℃で一晩加熱した。反応物を真空中で濃縮した。Ｖａｒｉａｎ ＭｅｇａＥｌｕｔ（登録商標）１０グラム ＳＣＸ イオン交換カートリッジ（メタノールで予洗した）上にのせた。メタノールで溶出し、非塩基性の不純物を除去した。メタノール中の２Ｍ アンモニアで溶出した。真空中で濃縮し、標記の化合物（０．３６ｇ、９４％）を得た。ＬＣＭＳ（４分間）＝４０９．０，４１１．０，Ｍ＋１。
【００２９】
調製１０
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−Ｎ−（１−（４−メトキシベンジル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン
４−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）モルホリン（０．３６ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）、１−（４−メトキシベンジル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン（０．２４８ｇ、１．３当量）、炭酸カリウム（０．３０ｇ、２．５当量）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（０．０７６ｇ、０．１５当量）、水（２ｍＬ）、および１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）を、丸底フラスコ中で混合した。窒素で完全に脱気し、次いでビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０．１０ｇ、０．２当量）を加えた。還流冷却器を取り付け、窒素下に置いた。反応物を還流で一晩加熱した。反応物をセライトプラグに通した。ＥＡで当該プラグを洗浄した。分液漏斗に移し、水で洗浄した。有機層を塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮した。シリカゲル上で精製し（ＥＡ→１０％ メタノール：ＥＡ）、標記の化合物（０．４４７ｇ、８６％）を淡黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（４分間）＝５９０．２，５９１．２，Ｍ＋１。
【実施例】
【００３０】
実施例１
【化１】
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−Ｎ−（１−（４−メトキシベンジル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン（０．４４７ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を、２０ｍＬ マイクロ波反応チューブ中で混合した。圧着キャップで密封し、次いで、マイクロ波反応器中で、１２０℃で２０分間加熱した。過剰量のＮａＯＨ水溶液で塩基性にしたＥＡおよび水の間に分配した。有機層をＮａＯＨ水溶液で３回洗浄し、次いで、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮した。シリカゲル上で精製し（ＥＡ→１０％ メタノール：ＥＡ）、標記の化合物（０．２４６ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（８分間）＝４７０．０，Ｍ＋１。
【００３１】
実施例２
【化２】
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン塩酸塩
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン（０．１ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）を、ナシフラスコ中で混合し、窒素下に置いた。塩化水素（４Ｍ、１，４−ジオキサン中、０．０５３ｍＬ、１．０当量）を加え、室温で、窒素下で、１．５時間撹拌させた。真空中で濃縮し、次いで、真空下で、無水エタノールから、２回エバポレートした。一晩、真空オーブン（６０℃）中で乾燥し、標記の化合物（０．１１ｇ，１０２％）を得た。ＬＣＭＳ（８分間）＝４７０．０，Ｍ＋１。
【００３２】
スキーム２：
調製１１
（Ｅ）−Ｎ’−（６−クロロピリダジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトイミドアミド
６−クロロピリダジン−３−アミン（１．５００ｋｇ、１１．５８ｍｏｌ）、１，１−ジメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（２．３１３ｋｇ、１７．３７ｍｏｌ）およびシクロペンチルメチルエーテル（８．２５Ｌ）を混合し、次いで、得られたメタノール副産物を蒸留しながら、９８℃まで加熱した。４時間後、反応混合物を常温まで冷却し、ヘプタン（１１．２Ｌ）を当該反応溶液に、生成物を結晶化するために加えた。標記の化合物を濾過によって収集し、乾燥した（１．４９４ｋｇ、６４．９５％；ｍｐ＝７３℃）。
【００３３】
調製１２
２−クロロ−１−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）エタノン
ヘプタン（１．５Ｌ）、メタノール（０．４Ｌ）、および１−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）エタノン（１ｋｇ、５．８１ｍｏｌ）の混合物を、＜５℃まで冷却しながら撹拌した。塩化スルフリル（０．６０８Ｌ、１．０２ｋｇ、７．５５ｍｏｌ）を、ヘプタン（１．５Ｌ）溶液として、当該混合物に、添加の間、反応温度を＜１５℃に維持しながら滴下した。２時間後、当該反応物を、常温で、水酸化ナトリウム（５Ｎ、２．０Ｌ）でｐＨ６までクエンチした。当該反応混合物を塩化メチレン（２Ｌ）で抽出し、抽出物を濃縮し、白色固形物を形成した。濾過し、当該固形物を乾燥した。
【００３４】
調製１３
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン
２−クロロ−１−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）エタノン（１．５ｋｇ、５．４４ｍｏｌ）、および（Ｅ）−Ｎ’−（６−クロロピリダジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトイミドアミド（１．１９ｋｇ、５．７２ｍｏｌ）をＤＭＦ（１０．１４Ｌ）中で混合し、１２０℃で５時間加熱した。冷却後、水（３０Ｌ）を加え、撹拌し、生成物を結晶化させた。生成物を濾過によって収集し、ケーキを水（２×１２Ｌ）およびヘプタン（２×１０Ｌ）でリンスし、次いで、真空下で乾燥させ、標記の化合物を得た（１．４９０ｋｇ、８４．４４％；ｍｐ＝１６０℃、Ｍ＋＝３２４）。
【００３５】
調製１４
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン
エタノール（１２Ｌ）、（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン（８９７．７０ｇ、２．７７ｍｏｌ）およびビス（２，４−ペンタンジオナト）−オキソバナジウム（ＩＶ）（１４６．８１ｇ、５５３．６７ｍｍｏｌ）を、反応容器に、窒素雰囲気で加えた。４−メチルモルホリン ４−オキシド（３．８９ｋｇ、３３．２１ｍｏｌ）のエタノール（６Ｌ）溶液を、１５０分間かけて、反応温度を２３〜３３℃に維持しながら滴下した。次いで、当該反応物を４０℃で４８時間加熱した。当該反応物を冷却し、溶剤（１３Ｌ）の除去によって濃縮した。得られた混合物を濾過し、濾過ケーキをヘキサン（１Ｌ）でリンスし、次いで乾燥した。（７２８ｇ、６６．２５％；ｍｐ １４５〜１４７℃；Ｍ＋＝４２３）。
【００３６】
調製１５
４−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）モルホリン塩酸塩
２６℃で、トリエチルシラン（１１０ｇ、９４６ｍｍｏｌ）および（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン（５０．１ｇ、１１７．０６ｍｍｏｌ）を混合し、溶液を生成した。トリフルオロ酢酸（１５０ｍＬ、１．９８ｍｏｌ）を、当該反応混合物に加え、次いで、７８℃で２４時間加熱した。当該反応物を常温まで冷却し、混合物を分離し、最上層を除去した。最下層を酢酸エチル（１Ｌ）で溶解し、ｐＨを水酸化ナトリウム（４Ｎ、５００ｍＬ）で１１に調整した。有機層を分離し、ＨＣｌ（４Ｍ、エチルエーテル中）を当該有機層に加え、ＨＣｌ塩を形成した。当該ＨＣｌ塩を濾過し、乾燥した。（１００ｇ（９６％）；ｍｐ＝２３７〜２３８℃；Ｍ＋＝４０９）。
【００３７】
調製１６
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン塩酸塩および遊離塩基
塩化パラジウム（１６０ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）および４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（１．１０ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２５ｍＬ）中で混合することによって活性触媒を調製し、加温して溶液を生成した。あらかじめ作製した触媒を、ＤＭＦ（６５ｍＬ）中の３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（３．０ｇ、２９．６５ｍｍｏｌ）、４−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）モルホリン塩酸塩（９．０ｇ、２０．１９ｍｍｏｌ）、炭酸水素カリウム（６．０ｇ、５９．９３ｍｍｏｌ）の溶液に加え、１５０℃まで１時間加熱した。反応物を６０℃まで冷却し、メルカプトプロピル官能化シリカ（５００ｍｇ）を加え、１時間撹拌し、次いで濾過し、シリカを除去した。常温まで冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン（１２５ｍＬ）を加え、水で抽出し、ＤＭＦを除去した。ＨＣｌを有機溶液に加え、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン塩酸塩を形成した。ＨＣｌ塩（１．１ｇ）を、ｎ−ブタノール（１０ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（１０ｍＬ、１Ｎ）に加え、撹拌した。得られた混合物を濾過し、０．２２ｇの遊離塩基、イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン、３−［（４−クロロ−２−フルオロフェニル）メチル］−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（４−モルホリニルメチル）を得た（収率２２％、Ｍ＋１＝４７０）。
【００３８】
実施例３
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンの作製
任意に、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンおよび賦形剤を、適切なスクリーンに通した。３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン、アルファ化デンプン、および５％ ジメチコンを有するアルファ化デンプンを、適切なタンブルビン（ｔｕｍｂｌｅ ｂｉｎ）（増圧バー（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ ｂａｒ）を有するもの、または有さないもの）または他の適切な混合設備を使用して混ぜ、混合した。交互に、ジメチコンを、混合の間、液体添加システムを介して加えた。混合した粉末を、カプセルに、適切なカプセル封入設備を使用して充填した。質量の均一性および適切な工程内のパラメータを、充填工程の間モニターした。任意に、最終的なカプセルを異物分離し、または、手作業の工程もしくは自動化された工程のいずれかによって磨いた。
【００３９】
ＪＡＫ２ ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイ
Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳ
ＪＡＫ２ ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイは、赤血球前駆細胞中のＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５の構成的活性化を模倣し、これは赤血球の過剰産生（真性多血症（ＰＶ）のマーカー）を引き起こす。
【００４０】
ＴＦ−１（ヒト赤白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ））細胞は、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０７５％ 炭酸水素ナトリウム、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１×抗生物質／抗真菌剤（インビトロジェン、カリフォルニア州、カールズバッド）および０．４５％ グルコースを含む、ＲＰＭＩ １６４０（ＲＰＭＩ−１６４０は、Ｍｏｏｒｅらによって、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで開発された。その処方は、炭酸水素塩緩衝系ならびにアミノ酸およびビタミンの量の変更を利用した培地のＲＰＭＩ−１６３０シリーズに基づく）中で維持した。当該培地に、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）を、最終濃度２ｎｇ／ｍＬで補充した。細胞を、３７℃で、５％ ＣＯ２で維持した。細胞を無血清培地中で飢我させ、内在性の増殖因子を除去した。ＴＦ−１細胞を計測し、細胞を収集し、９６ウェルプレートあたり２×１０７細胞を、ウェルあたり２×１０５細胞の密度で播種した。細胞を２回、無補充のＲＰＭＩ １６４０（０．０７５％ 炭酸水素ナトリウム、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１×抗生物質／抗真菌剤、および０．４５％ グルコースを含むＲＰＭＩ １６４０）でリンスし、その後、細胞を、最終濃度５×１０５細胞／ｍＬで、０．６％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で懸濁した。希釈された細胞を組織培養フラスコに戻し入れ、一晩、３７℃でインキュベーションした。試験化合物を１００％ ＤＭＳＯ中で、１０ｍＭの濃度で調製した。化合物を、１０時点の２００×濃度反応域（４ｍＭ〜２００ｎＭ）で、１００％ ＤＭＳＯで、１：３で連続希釈した。別々の９６ディープウェルプレート中で、２．５μＬの２００×化合物溶液を、４×濃度の化合物のプレートにおける１０％ ＦＢＳを含む１２５μＬの完全ＲＰＭＩ １６４０培地に加えた。
【００４１】
アッセイを行うために、血清飢餓細胞を収集し、無補充のＲＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄した。細胞を、１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ培地中で、最終濃度８×１０５細胞／ｍＬで懸濁した。２５０μＬの希釈された細胞（２×１０５細胞）の分割量を、４×濃度の化合物のプレート中の各ウェルに加えた。細胞をボルテックスによって混合し、当該プレートを３７℃の水浴中で１０分間インキュベーションした。６．４ユニット／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）の未使用の４×希釈標準溶液を、あらかじめ加温した１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ １６４０培地を使用して調製した。細胞を化合物で１０分間処理した後に、１２５μＬのＥＰＯ培地を、各ウェルに加え、プレートをボルテックスした。細胞を３７℃の水浴中で２０分間インキュベーションし、インキュベーション時間の間、５分ごとに混合した。最終的な１０時点の濃度反応域は、ＤＭＳＯは０．５％、およびＥＰＯは１．６Ｕ／ｍＬの最終濃度で、２０μＭ〜１ｎＭだった。細胞の処理後、５００μＬの１％ ホルムアルデヒド溶液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で新たに作製し、３７℃で加温を維持した）を、各ウェルに加えた。プレートを密封し、８〜１０回反転させて混合した。プレートを３７℃の水浴中に１０分間置いた。インキュベーション後、セルプレートを１２００ｒｐｍで５分間、室温で（ＲＴ）で遠心した。上清を吸引し、１００μＬの細胞（２×１０５細胞）を残した。細胞をボルテックスし、遠心工程を繰り返すことによって８００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、最終的な洗浄後、約２×１０５細胞を含む１００μＬを残した。８００μＬの冷やした９０％ メタノールの分割量を細胞に加え、−２０℃で一晩置いた。プレートを遠心し、メタノールを除去した。細胞をＦＡＣＳ バッファー（５％ ＦＢＳおよび０．０２％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄した。２００μＬの、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）バッファー中の１〜１０の希釈度のマウス抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）の分割量を細胞に加えた。細胞をよく混合し、室温で、暗所で２時間インキュベーションした。細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、１００μＬの細胞を残した。２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ニュージャージー州、モリスプレーンズ）の希釈標準溶液をＰＢＳで調製した。２００μＬの分割量を各ウェルに加え、細胞を、室温で、暗所で１０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）を細胞に加えた。細胞を９６ウェル黒色組織培養プレートに移し、密封した。プレートをスピンダウンした。平均蛍光強度のデータを収集し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ａｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標）ＶＴｉを使用して分析した。化合物処理を媒体と比較し、阻害率のデータを特定した。異なるＩＣ５０を有する２つの試験化合物間の最小有意比（ｍｉｎｉｍｕｍ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｒａｔｉｏ、ＭＳＲ）は、２．２であると特定した。相対ＩＣ５０を、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ４．０での、４パラメータのロジスティック曲線のフィッティング解析（ｆｉｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して算出した。３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンについて、ＩＣ５０＝０．０３３μＭ、ｎ＝４である。このアッセイの結果は、３−（４−クロロ−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンが強力なＪＡＫ２阻害剤であることを示す。
【００４２】
ＪＡＫ３ ＩＬ−２−ＮＫ−９２／ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイ
Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳ
ＩＬ−２は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞中のＪＡＫ３経路を活性化し、ＮＫおよびＣＤ８リンパ球増殖を引き起こす。従って、ＩＬ−２に刺激されたＮＫ９２／ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ でのＪＡＫ２化合物のＪＡＫ３細胞活性の評価を可能にする。
【００４３】
ＮＫ−９２（ナチュラルキラー）細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州、マナサス）を、１５％ ウシ胎児血清、１５％ ウマ血清および１×抗生物質／抗真菌剤（インビトロジェン、カリフォルニア州、カールズバッド）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）α中で維持した。当該培地に、ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州、ミネアポリス）を、最終濃度４ｎｇ／ｍＬで補充した。細胞を３７℃で５％ ＣＯ２で維持した。細胞を無血清培地中で飢我させ、内在性の増殖因子を除去した。ＮＫ−９２細胞を計測し、収集し、９６ウェルプレートあたり２×１０７細胞を、ウェルあたり密度２×１０５細胞で播種した。細胞を無補充のＭＥＭ α（ＭＥＭ α）で２回リンスした後に、細胞を、０．６％ 血清（０．３％ ＦＢＳ、０．３％ ウマ血清）を含むＭＥＭ α中で、最終濃度８×１０５細胞／ｍＬで懸濁した。希釈された細胞を組織培養フラスコに入れ戻し、一晩、３７℃でインキュベーションした。試験化合物を１００％ ＤＭＳＯ中で、濃度１０ｍＭで調製した。化合物を、１００％ ＤＭＳＯで、１０時点の２００×濃度反応域（４ｍＭ〜２００ｎＭ）で、１：３で連続希釈した。別々の９６ディープウェルプレート中に、２．５μＬの２００×化合物溶液を、４×濃度の化合物のプレートにおける１２５μＬの１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ １６４０培地に加えた。
【００４４】
アッセイを行うために、血清飢餓細胞を収集し、無補充のＲＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄した。細胞を１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で最終濃度８×１０５細胞／ｍＬで懸濁した。２５０μＬの希釈された細胞（２×１０５細胞）の分割量を、４×濃度の化合物のプレート中の各ウェルに加えた。細胞をボルテックスによって混合し、当該プレートを３７℃の水浴中で１０分間インキュベーションした。２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２の未使用の４×希釈標準溶液を、あらかじめ加温した１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ培地を使用して調製した。細胞を化合物で１０分間処理した後に、１２５μＬのＩＬ−２培地を各ウェルに加えた。細胞をボルテックスによって混合した。細胞を３７℃の水浴中で２０分間インキュベーションし、インキュベーション時間の間、５分ごとに混合した。最終的な１０時点の濃度反応域は、ＤＭＳＯは０．５％、およびＩＬ−２は０．５ｎｇ／ｍＬの最終濃度で２０μＭ〜１ｎＭだった。細胞の処理後、５００μＬの１％ ホルムアルデヒド溶液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で新たに作製し、３７℃で加温を維持した）を、各ウェルに加えた。プレートを密封し、８〜１０回反転させて混合した。プレートを３７℃の水浴中に１０分間置いた。インキュベーション後、セルプレートを１２００ｒｐｍで５分間、室温で遠心した。上清を吸引し、１００μＬの細胞（２×１０５細胞）を残した。細胞をボルテックスし、遠心工程を繰り返すことによって、８００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、最終的な洗浄後、約２×１０５細胞を含む１００μＬを残した。８００μＬの冷やした９０％ メタノールの分割量を細胞に加え、−２０℃で一晩置いた。プレートを遠心し、メタノールを除去した。細胞をＦＡＣＳ バッファー（５％ ＦＢＳおよび０．０２％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄した。２００μＬの、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）バッファー中の１〜１０の希釈度のマウス抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）の分割量を、細胞に加えた。細胞をよく混合し、室温で、暗所で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬの細胞を残した。２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ニュージャージー州、モリスプレーンズ）の希釈標準溶液をＰＢＳで調製した。２００μＬの分割量を各ウェルに加え、細胞を、室温で、暗所で１０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）を細胞に加えた。細胞を９６ウェル黒色組織培養プレートに移し、密封した。プレートをスピンダウンした。平均蛍光強度のデータを収集し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ａｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標）ＶＴｉを使用して分析した。化合物処理を媒体と比較し、阻害率のデータを特定した。ＭＳＲは、２．０６であると特定した。相対ＩＣ５０を、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ４．０での、４パラメータのロジスティック曲線のフィッティング解析を使用して算出した。３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンについて、ＩＣ５０＝０．９４μＭ、ｎ＝４である。ＪＡＫ３ ＩＬ２−ＮＫ９２−ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイの結果は、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ−［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンが、作用の弱いＪＡＫ３阻害剤であることを示す（ＩＣ５０＝０．０３３μＭである、ＪＡＫ２ ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイの結果と比較した場合）。これらの結果から、ＪＡＫ３／ＪＡＫ２の比は、ＩＣ５０について、２８．５倍であることを特定した。これは、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンがＪＡＫ３に対して選択的なＪＡＫ２阻害剤であることを示す。
【００４５】
Ｂａ／Ｆ３ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆセルベースアッセイ
Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳ
ＪＡＫ２標的阻害を、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ発現Ｂａ／Ｆ３中で、ウエスタンブロットによって、Ｗｅｒｎｉｇら（Ｗｅｒｎｉｇ Ｇら、Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＴＧ１０１３４８，ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＪＡＫ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，Ａｐｒ；１３（４）：３１１−２０）が報告したように評価した。培地スループット（ｍｅｄｉｕｍ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓアッセイを、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆを発現しているＢａ／Ｆ３細胞中のＪＡＫ２標的阻害を評価するために確立した。このアッセイは、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異に関連する疾患を治療するための効果的な治療薬の発見を可能にする。
【００４６】
ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆを発現しているＢａ／Ｆ３（マウスのプロＢ）細胞を、１０％ ＦＢＳ、０．０７％ 炭酸水素ナトリウム、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１×抗生物質／抗真菌剤（インビトロジェン、カリフォルニア州、カールズバッド）および０．４５％ グルコース（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）を含むＲＰＭＩ １６４０中で維持した。細胞を、３７℃で５％ ＣＯ２で維持した。試験化合物を、１００％ ＤＭＳＯ中で、濃度１０ｍＭで調製した。化合物を１０時点の２００×濃度反応域（４ｍＭ〜２００ｎＭ）で、１００％ ＤＭＳＯで、１：３で連続希釈した。別々の９６ディープウェルプレート中で、２．５μＬの２００×化合物溶液を、４×濃度の化合物のプレートにおける、１０％ ＦＢＳを含む１２５μＬの完全ＲＰＭＩ １６４０培地に加えた。
【００４７】
アッセイを行うために、細胞を収集し、無補充のＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄した。次いで、細胞を、１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ培地中で、最終濃度４×１０５／ｍＬで懸濁した。次に、５００μＬの細胞（２×１０５細胞）を、９６ディープウェルプレートに移した。最後に、２．５μＬ（１：２００希釈）の化合物ストック溶液を細胞に加え、細胞とともに３７℃の水浴中で６０分間インキュベーションした。
【００４８】
細胞の処理後、５００μＬの１％ ホルムアルデヒド溶液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で新たに作製し、３７℃で加温を維持した）を、各ウェルに加えた。プレートを密封し、８〜１０回反転させて混合した。プレートを３７℃の水浴中に１０分間置いた。インキュベーション後、セルプレートを１２００ｒｐｍで５分間、室温で遠心した。上清を吸引し、１００μＬの細胞（２×１０５細胞）を残した。細胞をボルテックスし、遠心工程を繰り返すことによって８００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、最終的な洗浄後、約２×１０５細胞を含む１００μＬを残した。８００μＬの冷やした９０％ メタノールの分割量を細胞に加え、−２０℃で一晩置いた。プレートを遠心し、メタノールを除去した。細胞をＦＡＣＳ バッファー（５％ ＦＢＳおよび０．０％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄した。２００μＬの、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）バッファー中の１〜１０の希釈度のマウス抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）の分割量を細胞に加えた。細胞をよく混合し、室温で、暗所で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬの細胞を残した。２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ニュージャージー州、モリスプレーンズ）の希釈標準溶液を、ＰＢＳで調製した。２００μＬの分割量を各ウェルに加え、細胞を、室温で、暗所で１０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）を細胞に加えた。細胞を９６ウェル黒色組織培養プレートに移し、密封した。当該プレートをスピンダウンした。平均蛍光強度のデータを収集し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ａｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標）ＶＴｉを使用して分析した。化合物処理を媒体と比較し、阻害率のデータを特定した。相対ＩＣ５０を、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ４．０での、４パラメータのロジスティック曲線のフィッティング解析を使用して算出した。３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンについて、ＩＣ５０＝０．０３μＭである。このアッセイの結果は、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンが、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ遺伝子を発現しているＢａ／Ｆ３細胞中のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ標的を効果的に阻害することを示す。
【００４９】
本発明の化合物は、好ましくは、様々な経路によって投与される医薬組成物として処方される。最も好ましくは、このような組成物は、経口投与のためのものである。このような医薬組成物およびその調製方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら編集、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９９５）を参照。
【００５０】
本発明の化合物は、広い投与量の範囲にわたって、全体的に有効である。例えば、１日あたりの投与量は、通常、１日あたりの総量が約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは、１日あたりの総量が５００ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは１日あたりの総量が６００ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内である。いくつかの場合では、上記の範囲の下限を下回る投与量のレベルが十分以上である可能性があり、一方、他の場合では、さらに多くの用量が使用される可能性がある。上記の投与量の範囲は、多少なりとも本発明の範囲を制限することを意図したものではない。実際に投与される化合物の量は、医師によって、関連する状況（治療される症状、選択された投与経路、実際の化合物または投与される化合物、年齢、体重、および個々の患者の反応、および患者の症候の重症度等）の観点から決定されることが理解されるだろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）は、サイトカインの情報伝達に関与するチロシンキナーゼファミリーのメンバーである。ＪＡＫ２は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）情報伝達経路（赤血球の分化およびＳｔａｔ５の活性化等）における、中心的役割を有する。
【０００３】
近年の研究において、慢性骨髄増殖性疾患（真性多血症、本態性血小板増加症、および骨髄化生を伴う骨髄硬化症等）および血栓性疾患（活性化プロテインＣ抵抗性、内臓静脈血栓症、バッド・キアリ症候群、および門脈血栓症等）を有する患者は、ＪＡＫ２における後天性の活性化突然変異を頻繁に有することが示された。当該変異（アミノ酸位置６１７でのバリンからフェニルアラニンへの置換）は、構成的チロシンリン酸化活性を、未知の機構によってもたらす。ＪＡＫ２変異の構成的活性は、増加したレベルのリン酸化ＪＡＫ２、ｐＳＴＡＴ５、およびＳＴＡＴ５転写活性をもたらし、これらは骨髄増殖性疾患および白血病（非定型慢性骨髄性白血病等）の病理発生をもたらす。さらに、ＪＡＫ２は、インターロイキン６依存性オートクリンループ（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｌｏｏｐ）、または固形癌および血液腫瘍（例えば、神経膠芽腫、乳癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、原発性および二次性の急性骨髄性白血病、Ｔ細胞性（Ｔ−ｌｉｎｅａｇｅ）およびＢ細胞性（Ｂ−ｌｉｎｅａｇｅ）の急性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群）における他の遺伝子変異によって活性化される。
【０００４】
様々なアミノピラゾールチロシンキナーゼ阻害剤が報告されている。例えば、特許文献１および特許文献２を参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０６０８７５３８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７０６４７９７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、チロシンキナーゼ（ＪＡＫ２等）を阻害するさらなる化合物に対するニーズが依然として存在する。本発明は、ＪＡＫ２情報伝達経路が活性化されるか、またはＪＡＫ／ＳＴＡＴ情報伝達が調節不全にされる、骨髄増殖性疾患の治療のための臨床用途を有すると考えられる新規なアミノピラゾール化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩を提供する。
【０００８】
本発明は、哺乳類における、真性多血症、本態性血小板増加症、および骨髄化生を伴う骨髄硬化症からなる群から選択される慢性骨髄増殖性疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳類に、有効量の３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩を投与する工程を含む治療方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、患者における、神経膠芽腫、乳癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、ならびに白血病、例えば非定型慢性骨髄性白血病、原発性および二次性の急性骨髄性白血病、Ｔ細胞性およびＢ細胞性の急性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに骨髄増殖性疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする患者に、有効量の３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩を投与する工程を含む治療方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンもしくはその薬理学的に許容できる塩、および薬理学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明はまた、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンもしくはその薬理学的に許容できる塩、および薬理学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を、別の治療成分と組み合わせて提供する。
【００１２】
本発明はまた、薬物としての使用のための、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩を提供する。さらに、本発明は、慢性骨髄増殖性疾患の治療のための薬物の製造における、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩の使用を提供する。特に、これらの慢性骨髄増殖性疾患は、真性多血症、本態性血小板増加症、および骨髄化生を伴う骨髄硬化症からなる群から選択される。さらに、本発明は、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンまたはその薬理学的に許容できる塩を有効成分として含む、真性多血症、本態性血小板増加症、および骨髄化生を伴う骨髄硬化症からなる群から選択される慢性骨髄増殖性疾患の治療のための医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の化合物は、塩を形成できることが当業者によって理解されるだろう。本発明の化合物はアミンであり、従って、いくつかの無機酸および有機酸のいずれかと反応し、薬理学的に許容できる酸付加塩を形成する。このような薬理学的に許容できる酸付加塩、および、これらを調製するための一般的な方法論は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）；Ｌ．Ｄ．Ｂｉｇｈｌｅｙ、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ、Ｄ．Ｃ．Ｍｏｎｋｈｏｕｓｅの、“Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、Ｊ．ＳｗａｒｂｒｉｃｋおよびＪ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ編集、Ｖｏｌ．１３、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｂａｓｅｌ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ １９９５、ｐｐ．４５３−４９９；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ ６６、Ｎｏ．１、１９７７年、１月を参照。
【００１４】
下記の調製物および例は、ＣｈｅｍＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０を使用して命名した。
【００１５】
スキーム１：
調製１
１−（４−メトキシベンジル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン
方法１：
１Ｌの丸底フラスコ中で、５−アミノ−３−メチルピラゾール（２２．８ｇ、２３４．８ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルピロリドン（２００ｍＬ）を混合した。フラスコを、０℃まで冷却し、窒素下に置いた。水酸化ナトリウム（９．３９ｇ、１．０当量（ｅｑｕｉｖ．））をフラスコに加え、３０分間（ｍｉｎ）撹拌した。Ｎ−メチルピロリドン（１００ｍＬ）中のα−クロロ−４−メトキシトルエン（３１ｍＬ、１．０当量）の溶液を、フラスコに滴下した。当該反応物を、室温（ＲＴ）まで、ゆっくりと一晩加温した。当該反応物を水で希釈し、酢酸エチル（ＥＡ）で抽出した。有機物を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。真空中で濃縮した。シリカのプラグ上で精製した（ヘキサン→２：１ ヘキサン：ＥＡ →３：２ ヘキサン：ＥＡ→１：１ ヘキサン：ＥＡ→１：２ ヘキサン：ＥＡ→ＥＡ）。所望の画分を濃縮し、標記の化合物を得た（１０．８ｇ、２１％）。ＬＣＭＳ（４分間）＝２１８．０（Ｍ＋１）。
【００１６】
方法２：
Ａ．（Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（４−メトキシベンジリデン）ヒドラジンカルボキシラート
４−メトキシベンズアルデヒド（４００ｇ、２．９４ｍｏｌ）を、トルエン（７５０ｍＬ）中のカルバジン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４００ｇ、２．９４ｍｏｌ）の溶液に、２０分間かけて、５０℃で加えた。１時間（ｈ）かけて還流まで加熱し、トルエンとの共沸混合物中の水を収集した。さらなる水が全く収集されなくなった後に、６０℃まで冷却した。ヘキサンを、生成物が溶液から沈殿するまで加えた。さらに２０℃まで浴を冷却した。固形物を濾過によって収集し、窒素圧を使用して乾燥させ、標記の化合物を得た（７５０．５ｇ、９１％）。１ＨＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ジメチルスルホキシド−ｄ６（ＤＭＳＯ−ｄ６）］δ １０．６−１０．８（ｂｓ，１Ｈ）、７．８８−８．０（Ｓ，１Ｈ）、７．５−７．５５（ｄ，２Ｈ）、６．９５−７．０（ｄ，２Ｈ）、１．４５（ｓ，９Ｈ）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４９［Ｍ−Ｈ］。
【００１７】
Ｂ．ｔｅｒｔ−ブチル ２−（４−メトキシベンジル）ヒドラジンカルボキシラート
ＥＡ（１００ｍＬ）中でスラリーにした１０％ パラジウム炭素（水湿潤品、２０ｇ）を、密封した圧力反応器に、真空搬送装置を介して加えた。搬送ラインを最少量のＥＡでリンスした。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１０００ｍＬ）中に溶解された（Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル ２−（４−メトキシベンジリデン）ヒドラジンカルボキシラート（３２０ｇ、１．２８ｍｏｌ）を、真空搬送装置を介して入れ、ラインを最少量のＴＨＦでリンスした。当該反応器を５０ＰＳＩ（約３４４ｋＰａ）まで、Ｈ２で加圧し、当該反応器の中身を２０±１０℃で混合した。当該反応を続け、さらなる水素の取り込みが認められなくなるまで、水素圧力を５０ＰＳＩ（約３４４ｋＰａ）に維持した。反応溶液を濾過し、触媒を除去し、触媒濾過ケーキをＴＨＦ（５００ｍＬ）で洗浄した。当該洗浄物を反応濾液に加えた。当該溶液を真空中で濃縮し、標記の化合物（３３７ｇ、８６％）を油状物として得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．１−８．３（ｓ，１Ｈ）、７．１−７．３（ｄ，２Ｈ）、６．８−６．９（ｄ，２Ｈ）、４．４−４．６（ｂｓ，１Ｈ）、３．７−３．８（ｓ，２Ｈ）、３．６−３．７（ｓ，３Ｈ）、１．３−１．５（ｓ，９Ｈ）。
【００１８】
Ｃ．（４−メトキシベンジル）ヒドラジン二塩酸塩
ジオキサン（２０００ｍＬ、８．００ｍｏｌ ＨＣｌ）中の４Ｎ 塩化水素の溶液に、最少量のジオキサン中に溶解された、ｔｅｒｔ−ブチル ２−（４−メトキシベンジル）ヒドラジンカルボキシラート（３２４ｇ、１．０９ｍｏｌ）を、ゆっくりと１時間かけて加えた。沈殿物が徐々に形成した。溶液を、１６時間、２０±５℃で撹拌させた。固形物を濾過によって収集した。当該固形物をヘプタン（２０００ｍＬ）中でスラリーにし、当該固形物を濾過によって単離した。当該固形物を、窒素圧を使用して乾燥し、標記の化合物を得た（２４２．３ｇ、１．０８ｍｏｌ、９８％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．２−９．０（ｂｓ，５Ｈ）、７．３−７．４（ｄ，２Ｈ）、６．８−７．０（ｄ，２Ｈ）、４．０（ｓ，２Ｈ）、３．７（ｓ，３Ｈ）。
【００１９】
Ｄ．１−（４−メトキシベンジル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−アミンおよび１−（４−メトキシベンジル）−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン
カリウム ｔｅｒｔ−ブトキシド（１９１．８９ｇ、１．７１ｍｏｌ）およびＴＨＦ（２０００ｍＬ）を、２２℃で混合した。均一な溶液が得られるまで混合した。５℃まで冷却した。アセトニトリル（８４．２５ｇ、２．０５ｍｏｌ）および酢酸メチル（１２６．７ｇ、１．７１ｍｏｌ）の予混合した溶液を、カリウム ｔｅｒｔ−ブトキシド溶液に、４５分間かけて、温度を１０℃未満に維持しながら加えた。加え終わった後に、反応物を２０±５℃まで加温させ、約２時間撹拌した。（４−メトキシベンジル）ヒドラジン二塩酸塩（２５０ｇ）を、当該反応物に、約５分間かけて数回に分けて加え、次いで、ジオキサン（２６２．５ｇ、１．００ｍｏｌ）中の４Ｎ 塩化水素を、温度を＜３０℃に維持する速度で加えた。加え終わったときに、２５±５℃で約１６時間撹拌させた。固形物を濾過によって単離し、ＴＨＦ（５００ｍＬ）で洗浄した。粗製の固形物を、ジクロロメタン（ＤＣＭ、４Ｌ）および水（２Ｌ）中で、ｐＨを５Ｎ ＮａＯＨで＞１０に調整してスラリーにした。層を沈降させ、有機層を収集した。水層をＤＣＭ（２Ｌ）で洗浄した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、当該溶液を、固形物となるまで真空中で濃縮し、１６５ｇの粗製物を得た。当該粗製物を酢酸イソプロピル（６６０ｍＬ）中で還流まで加熱し、できるだけ多くの固形物を溶解した。３３℃まで冷却し、ヘキサン（６００ｍＬ）をゆっくりと１時間かけて加えた。１０℃まで冷却し、温度を１０℃に１０分間維持した。固形物を濾過によって単離し、ヘキサン（２００ｍＬ）で洗浄し、窒素圧を使用して乾燥し、標記の化合物の混合物を得た（９１．５ｇ、０．４ｍｏｌ、４７％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７．２−７．３（ｄ，２Ｈ）、６．７−６．９（ｄ，２Ｈ）、５．１（ｂｓ，２Ｈ）、５．０（ｓ，１Ｈ）、４．９（ｓ，２Ｈ）、３．６−３．８（ｓ，３Ｈ）、１．９（ｓ，３Ｈ）。
【００２０】
注意：これらの中間体は、クロマトグラフィーによって分離できる。しかし、この場合、これらは混合物として単離され、ベンジル保護基の除去を伴い、同じ生成物をもたらす下記の最終段階において使用できる。
【００２１】
調製２
２−クロロ−１−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）エタノン
１Ｌの丸底フラスコ中で、４’−クロロ−２’−フルオロアセトフェノン（４０ｇ、２３１．８ｍｍｏｌ）、ヘプタン（１２０ｍＬ）、およびメタノール（１６ｍＬ）を混合した。０℃まで冷却し、窒素下に置いた。塩化スルフリル（２１．５ｍＬ、１．１５当量）をヘプタン（１２０ｍＬ）中で溶解し、滴下漏斗に入れた。当該反応物に６０分間かけて滴下した。２．５時間、０℃で撹拌し、この間に白色の沈殿物が形成した。当該滴下漏斗に１Ｍ 炭酸水素ナトリウム（４００ｍＬ）を入れ、次いで、当該反応物に滴下した。全てのガス発生が停止した後に、二相性の懸濁液を濾過し、標記の化合物（３８．１８ｇ、８０％）を白色針状晶として収集した。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ５．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、７．４３（ｍ，１Ｈ）、７．６３（ｍ，１Ｈ）、７．８９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）。
【００２２】
調製３
（Ｅ）−Ｎ’−（６−クロロピリダジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトイミドアミド
２Ｌの丸底フラスコ中で、３−クロロ−６−ピリダジンアミン（４３．２ｇ、３３３．５ｍｍｏｌ）、トルエン（５００ｍＬ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドジメチルアセタール（６７．８ｍＬ、１．２５当量）を混合した。還流冷却器を取り付け、次いで、還流まで２時間加熱した。室温まで冷却させた。真空中で濃縮した。粗製物質をヘキサンで粉末にし、濾過し、標記の化合物（６０．４ｇ、９１％）を淡い黄褐色固体として単離した。ＭＳ＝１９９．０（Ｍ＋１）。
【００２３】
調製４
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン
丸底フラスコ中で、（Ｅ）−Ｎ’−（６−クロロピリダジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトイミドアミド（３６．６１ｇ、１８４．３ｍｍｏｌ）、２−クロロ−１−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）エタノン（３８．１５ｇ、１当量）、およびジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）を混合した。窒素下に置き、次いで、１２０℃で４時間加熱した。室温まで冷却させ、一晩撹拌した。ＥＡ（１Ｌ）および水（５００ｍＬ）で希釈した。有機物を水で３回抽出し、次いで、飽和塩化ナトリウム水溶液で抽出した。有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮した。シリカプラグによって精製し（ヘキサン→４：１ ヘキサン：ＥＡ→３：１ ヘキサン：ＥＡ→２：１ ヘキサン：ＥＡ→１：１ ヘキサン：ＥＡ）、標記の化合物（３３．８ｇ、５７％）を淡い緑色固形物として単離した。ＬＣＭＳ（４分間＝３２４．０，３２６．０，Ｍ＋１）。
【００２４】
調製５
２−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンゾイル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオン
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン（５．６ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−フタロイルグリシン（６．０ｇ、１．７当量）、アセトニトリル（６０ｍＬ）、水（１５ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（０．２６ｍＬ、０．２当量）、および硝酸銀（２９４ｍｇ、０．１当量）を丸底フラスコ中で、取り付けた滴下漏斗で混合し、窒素下に置いた。７０℃まで加熱し、この温度で１５分間維持した。過硫酸アンモニウム（７．１ｇ、１．８当量）を水（１５ｍＬ）中に溶解し、滴下漏斗に入れた。当該反応フラスコに、およそ２０分間かけて滴下した。反応物を７０℃で１時間加熱した。この間に沈殿物が形成した。ブフナー漏斗を介して濾過し、標記の化合物の粗製物（７．３ｇ、８７％）を、オフホワイトの固体として単離した。ＬＣＭＳ（４分間）＝４８３．０，４８５．０，Ｍ＋１。
【００２５】
調製６
（８−（アミノメチル）−６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）（４−クロロ−２−フルオロフェニル）メタノン
２−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンゾイル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオン（７．３０ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、エタノール（２００ｍＬ）、およびヒドラジン（１．４５ｍＬ、３当量）を、丸底フラスコ中で混合し、窒素下に置いた。２日間、室温で撹拌した。２時間、５０℃で加熱し、次いで、反応物を真空中で濃縮した。ＥＡで希釈した。有機物を、１Ｎ ＨＣｌ（ａｑ）で洗浄し、生成物を水層に入れた。当該水層を、１Ｎ ＮａＯＨ（ａｑ）で塩基性にし、ＥＡで抽出した。ＥＡ層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮し、標記の化合物の粗製物（１．２ｇ、２３％）を淡い緑色固形物として得た。ＭＳ＝３５５．０，３５３．０（Ｍ＋１）。
【００２６】
調製７
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン
（８−（アミノメチル）−６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）（４−クロロ−２−フルオロフェニル）メタノン（１．１５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、水（１２ｍＬ）、炭酸カリウム（４９５ｍｇ、１．１当量）、および２−ブロモエチルエーテル（０．４７ｍＬ、１．１当量）を、２０ｍＬ マイクロ波反応容器中で混合した。圧着キャップで密封し、次いで、マイクロ波反応器中で、１２０℃で２０分間加熱した。室温まで冷却し、ＥＡおよび水の間に分配した。ＥＡ層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮した。シリカゲル上で精製し（４：１ ヘキサン：ＥＡ→２：１ ヘキサン：ＥＡ→１：１ ヘキサン：ＥＡ）、標記の化合物（０．４３ｇ、３１％）を淡い黄色フォームとして得た。ＬＣＭＳ（４分間）＝４２３．０，４２５．０，Ｍ＋１。
【００２７】
調製８
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノール
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）−イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン（０．４３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびメタノール（１５ｍＬ）を、丸底フラスコ中で混合した。窒素下に置き、０℃まで冷却した。水素化ホウ素ナトリウム（５８ｍｇ、１．５当量）を一度に加えた。５分間、この温度で撹拌し、次いで、冷却槽を取り除き、室温まで加温させた。１５分間後、反応物を水でクエンチし、次いで、ＥＡで抽出した。有機物を、水、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮し、標記の化合物（０．４ｇ、９３％）を得た。ＬＣＭＳ（４分間）＝４２５．０，４２７．０，Ｍ＋１。
【００２８】
調製９
４−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）モルホリン
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）−イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノール（０．４ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）、１，２−ジクロロエタン（２５ｍＬ）、トリエチルシラン（０．４５ｍＬ、３当量）、およびトリフルオロ酢酸（０．５７ｍＬ、８当量）を、丸底フラスコ中で混合し、窒素下に置いた。７０℃で一晩加熱した。反応物を真空中で濃縮した。Ｖａｒｉａｎ ＭｅｇａＥｌｕｔ（登録商標）１０グラム ＳＣＸ イオン交換カートリッジ（メタノールで予洗した）上にのせた。メタノールで溶出し、非塩基性の不純物を除去した。メタノール中の２Ｍ アンモニアで溶出した。真空中で濃縮し、標記の化合物（０．３６ｇ、９４％）を得た。ＬＣＭＳ（４分間）＝４０９．０，４１１．０，Ｍ＋１。
【００２９】
調製１０
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−Ｎ−（１−（４−メトキシベンジル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン
４−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）モルホリン（０．３６ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）、１−（４−メトキシベンジル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン（０．２４８ｇ、１．３当量）、炭酸カリウム（０．３０ｇ、２．５当量）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（０．０７６ｇ、０．１５当量）、水（２ｍＬ）、および１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）を、丸底フラスコ中で混合した。窒素で完全に脱気し、次いでビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０．１０ｇ、０．２当量）を加えた。還流冷却器を取り付け、窒素下に置いた。反応物を還流で一晩加熱した。反応物をセライトプラグに通した。ＥＡで当該プラグを洗浄した。分液漏斗に移し、水で洗浄した。有機層を塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮した。シリカゲル上で精製し（ＥＡ→１０％ メタノール：ＥＡ）、標記の化合物（０．４４７ｇ、８６％）を淡黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（４分間）＝５９０．２，５９１．２，Ｍ＋１。
【実施例】
【００３０】
実施例１
【化１】
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−Ｎ−（１−（４−メトキシベンジル）−５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン（０．４４７ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を、２０ｍＬ マイクロ波反応チューブ中で混合した。圧着キャップで密封し、次いで、マイクロ波反応器中で、１２０℃で２０分間加熱した。過剰量のＮａＯＨ水溶液で塩基性にしたＥＡおよび水の間に分配した。有機層をＮａＯＨ水溶液で３回洗浄し、次いで、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過し、真空中で濃縮した。シリカゲル上で精製し（ＥＡ→１０％ メタノール：ＥＡ）、標記の化合物（０．２４６ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（８分間）＝４７０．０，Ｍ＋１。
【００３１】
実施例２
【化２】
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン塩酸塩
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン（０．１ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）を、ナシフラスコ中で混合し、窒素下に置いた。塩化水素（４Ｍ、１，４−ジオキサン中、０．０５３ｍＬ、１．０当量）を加え、室温で、窒素下で、１．５時間撹拌させた。真空中で濃縮し、次いで、真空下で、無水エタノールから、２回エバポレートした。一晩、真空オーブン（６０℃）中で乾燥し、標記の化合物（０．１１ｇ，１０２％）を得た。ＬＣＭＳ（８分間）＝４７０．０，Ｍ＋１。
【００３２】
スキーム２：
調製１１
（Ｅ）−Ｎ’−（６−クロロピリダジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトイミドアミド
６−クロロピリダジン−３−アミン（１．５００ｋｇ、１１．５８ｍｏｌ）、１，１−ジメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（２．３１３ｋｇ、１７．３７ｍｏｌ）およびシクロペンチルメチルエーテル（８．２５Ｌ）を混合し、次いで、得られたメタノール副産物を蒸留しながら、９８℃まで加熱した。４時間後、反応混合物を常温まで冷却し、ヘプタン（１１．２Ｌ）を当該反応溶液に、生成物を結晶化するために加えた。標記の化合物を濾過によって収集し、乾燥した（１．４９４ｋｇ、６４．９５％；ｍｐ＝７３℃）。
【００３３】
調製１２
２−クロロ−１−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）エタノン
ヘプタン（１．５Ｌ）、メタノール（０．４Ｌ）、および１−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）エタノン（１ｋｇ、５．８１ｍｏｌ）の混合物を、＜５℃まで冷却しながら撹拌した。塩化スルフリル（０．６０８Ｌ、１．０２ｋｇ、７．５５ｍｏｌ）を、ヘプタン（１．５Ｌ）溶液として、当該混合物に、添加の間、反応温度を＜１５℃に維持しながら滴下した。２時間後、当該反応物を、常温で、水酸化ナトリウム（５Ｎ、２．０Ｌ）でｐＨ６までクエンチした。当該反応混合物を塩化メチレン（２Ｌ）で抽出し、抽出物を濃縮し、白色固形物を形成した。濾過し、当該固形物を乾燥した。
【００３４】
調製１３
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン
２−クロロ−１−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）エタノン（１．５ｋｇ、５．４４ｍｏｌ）、および（Ｅ）−Ｎ’−（６−クロロピリダジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトイミドアミド（１．１９ｋｇ、５．７２ｍｏｌ）をＤＭＦ（１０．１４Ｌ）中で混合し、１２０℃で５時間加熱した。冷却後、水（３０Ｌ）を加え、撹拌し、生成物を結晶化させた。生成物を濾過によって収集し、ケーキを水（２×１２Ｌ）およびヘプタン（２×１０Ｌ）でリンスし、次いで、真空下で乾燥させ、標記の化合物を得た（１．４９０ｋｇ、８４．４４％；ｍｐ＝１６０℃、Ｍ＋＝３２４）。
【００３５】
調製１４
（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン
エタノール（１２Ｌ）、（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン（８９７．７０ｇ、２．７７ｍｏｌ）およびビス（２，４−ペンタンジオナト）−オキソバナジウム（ＩＶ）（１４６．８１ｇ、５５３．６７ｍｍｏｌ）を、反応容器に、窒素雰囲気で加えた。４−メチルモルホリン ４−オキシド（３．８９ｋｇ、３３．２１ｍｏｌ）のエタノール（６Ｌ）溶液を、１５０分間かけて、反応温度を２３〜３３℃に維持しながら滴下した。次いで、当該反応物を４０℃で４８時間加熱した。当該反応物を冷却し、溶剤（１３Ｌ）の除去によって濃縮した。得られた混合物を濾過し、濾過ケーキをヘキサン（１Ｌ）でリンスし、次いで乾燥した。（７２８ｇ、６６．２５％；ｍｐ １４５〜１４７℃；Ｍ＋＝４２３）。
【００３６】
調製１５
４−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）モルホリン塩酸塩
２６℃で、トリエチルシラン（１１０ｇ、９４６ｍｍｏｌ）および（４−クロロ−２−フルオロフェニル）（６−クロロ−２−メチル−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）メタノン（５０．１ｇ、１１７．０６ｍｍｏｌ）を混合し、溶液を生成した。トリフルオロ酢酸（１５０ｍＬ、１．９８ｍｏｌ）を、当該反応混合物に加え、次いで、７８℃で２４時間加熱した。当該反応物を常温まで冷却し、混合物を分離し、最上層を除去した。最下層を酢酸エチル（１Ｌ）で溶解し、ｐＨを水酸化ナトリウム（４Ｎ、５００ｍＬ）で１１に調整した。有機層を分離し、ＨＣｌ（４Ｍ、エチルエーテル中）を当該有機層に加え、ＨＣｌ塩を形成した。当該ＨＣｌ塩を濾過し、乾燥した。（１００ｇ（９６％）；ｍｐ＝２３７〜２３８℃；Ｍ＋＝４０９）。
【００３７】
調製１６
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン塩酸塩および遊離塩基
塩化パラジウム（１６０ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）および４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（１．１０ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２５ｍＬ）中で混合することによって活性触媒を調製し、加温して溶液を生成した。あらかじめ作製した触媒を、ＤＭＦ（６５ｍＬ）中の３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（３．０ｇ、２９．６５ｍｍｏｌ）、４−（（６−クロロ−３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチルイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−８−イル）メチル）モルホリン塩酸塩（９．０ｇ、２０．１９ｍｍｏｌ）、炭酸水素カリウム（６．０ｇ、５９．９３ｍｍｏｌ）の溶液に加え、１５０℃まで１時間加熱した。反応物を６０℃まで冷却し、メルカプトプロピル官能化シリカ（５００ｍｇ）を加え、１時間撹拌し、次いで濾過し、シリカを除去した。常温まで冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン（１２５ｍＬ）を加え、水で抽出し、ＤＭＦを除去した。ＨＣｌを有機溶液に加え、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン塩酸塩を形成した。ＨＣｌ塩（１．１ｇ）を、ｎ−ブタノール（１０ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（１０ｍＬ、１Ｎ）に加え、撹拌した。得られた混合物を濾過し、０．２２ｇの遊離塩基、イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン、３−［（４−クロロ−２−フルオロフェニル）メチル］−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（４−モルホリニルメチル）を得た（収率２２％、Ｍ＋１＝４７０）。
【００３８】
実施例３
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンの作製
任意に、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンおよび賦形剤を、適切なスクリーンに通した。３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン、アルファ化デンプン、および５％ ジメチコンを有するアルファ化デンプンを、適切なタンブルビン（ｔｕｍｂｌｅ ｂｉｎ）（増圧バー（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ ｂａｒ）を有するもの、または有さないもの）または他の適切な混合設備を使用して混ぜ、混合した。交互に、ジメチコンを、混合の間、液体添加システムを介して加えた。混合した粉末を、カプセルに、適切なカプセル封入設備を使用して充填した。質量の均一性および適切な工程内のパラメータを、充填工程の間モニターした。任意に、最終的なカプセルを異物分離し、または、手作業の工程もしくは自動化された工程のいずれかによって磨いた。
【００３９】
ＪＡＫ２ ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイ
Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳ
ＪＡＫ２ ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイは、赤血球前駆細胞中のＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５の構成的活性化を模倣し、これは赤血球の過剰産生（真性多血症（ＰＶ）のマーカー）を引き起こす。
【００４０】
ＴＦ−１（ヒト赤白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ））細胞は、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０７５％ 炭酸水素ナトリウム、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１×抗生物質／抗真菌剤（インビトロジェン、カリフォルニア州、カールズバッド）および０．４５％ グルコースを含む、ＲＰＭＩ １６４０（ＲＰＭＩ−１６４０は、Ｍｏｏｒｅらによって、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで開発された。その処方は、炭酸水素塩緩衝系ならびにアミノ酸およびビタミンの量の変更を利用した培地のＲＰＭＩ−１６３０シリーズに基づく）中で維持した。当該培地に、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）を、最終濃度２ｎｇ／ｍＬで補充した。細胞を、３７℃で、５％ ＣＯ２で維持した。細胞を無血清培地中で飢我させ、内在性の増殖因子を除去した。ＴＦ−１細胞を計測し、細胞を収集し、９６ウェルプレートあたり２×１０７細胞を、ウェルあたり２×１０５細胞の密度で播種した。細胞を２回、無補充のＲＰＭＩ １６４０（０．０７５％ 炭酸水素ナトリウム、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１×抗生物質／抗真菌剤、および０．４５％ グルコースを含むＲＰＭＩ １６４０）でリンスし、その後、細胞を、最終濃度５×１０５細胞／ｍＬで、０．６％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で懸濁した。希釈された細胞を組織培養フラスコに戻し入れ、一晩、３７℃でインキュベーションした。試験化合物を１００％ ＤＭＳＯ中で、１０ｍＭの濃度で調製した。化合物を、１０時点の２００×濃度反応域（４ｍＭ〜２００ｎＭ）で、１００％ ＤＭＳＯで、１：３で連続希釈した。別々の９６ディープウェルプレート中で、２．５μＬの２００×化合物溶液を、４×濃度の化合物のプレートにおける１０％ ＦＢＳを含む１２５μＬの完全ＲＰＭＩ １６４０培地に加えた。
【００４１】
アッセイを行うために、血清飢餓細胞を収集し、無補充のＲＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄した。細胞を、１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ培地中で、最終濃度８×１０５細胞／ｍＬで懸濁した。２５０μＬの希釈された細胞（２×１０５細胞）の分割量を、４×濃度の化合物のプレート中の各ウェルに加えた。細胞をボルテックスによって混合し、当該プレートを３７℃の水浴中で１０分間インキュベーションした。６．４ユニット／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）の未使用の４×希釈標準溶液を、あらかじめ加温した１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ １６４０培地を使用して調製した。細胞を化合物で１０分間処理した後に、１２５μＬのＥＰＯ培地を、各ウェルに加え、プレートをボルテックスした。細胞を３７℃の水浴中で２０分間インキュベーションし、インキュベーション時間の間、５分ごとに混合した。最終的な１０時点の濃度反応域は、ＤＭＳＯは０．５％、およびＥＰＯは１．６Ｕ／ｍＬの最終濃度で、２０μＭ〜１ｎＭだった。細胞の処理後、５００μＬの１％ ホルムアルデヒド溶液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で新たに作製し、３７℃で加温を維持した）を、各ウェルに加えた。プレートを密封し、８〜１０回反転させて混合した。プレートを３７℃の水浴中に１０分間置いた。インキュベーション後、セルプレートを１２００ｒｐｍで５分間、室温で（ＲＴ）で遠心した。上清を吸引し、１００μＬの細胞（２×１０５細胞）を残した。細胞をボルテックスし、遠心工程を繰り返すことによって８００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、最終的な洗浄後、約２×１０５細胞を含む１００μＬを残した。８００μＬの冷やした９０％ メタノールの分割量を細胞に加え、−２０℃で一晩置いた。プレートを遠心し、メタノールを除去した。細胞をＦＡＣＳ バッファー（５％ ＦＢＳおよび０．０２％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄した。２００μＬの、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）バッファー中の１〜１０の希釈度のマウス抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）の分割量を細胞に加えた。細胞をよく混合し、室温で、暗所で２時間インキュベーションした。細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、１００μＬの細胞を残した。２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ニュージャージー州、モリスプレーンズ）の希釈標準溶液をＰＢＳで調製した。２００μＬの分割量を各ウェルに加え、細胞を、室温で、暗所で１０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）を細胞に加えた。細胞を９６ウェル黒色組織培養プレートに移し、密封した。プレートをスピンダウンした。平均蛍光強度のデータを収集し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ａｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標）ＶＴｉを使用して分析した。化合物処理を媒体と比較し、阻害率のデータを特定した。異なるＩＣ５０を有する２つの試験化合物間の最小有意比（ｍｉｎｉｍｕｍ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｒａｔｉｏ、ＭＳＲ）は、２．２であると特定した。相対ＩＣ５０を、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ４．０での、４パラメータのロジスティック曲線のフィッティング解析（ｆｉｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して算出した。３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンについて、ＩＣ５０＝０．０３３μＭ、ｎ＝４である。このアッセイの結果は、３−（４−クロロ−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンが強力なＪＡＫ２阻害剤であることを示す。
【００４２】
ＪＡＫ３ ＩＬ−２−ＮＫ−９２／ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイ
Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳ
ＩＬ−２は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞中のＪＡＫ３経路を活性化し、ＮＫおよびＣＤ８リンパ球増殖を引き起こす。従って、ＩＬ−２に刺激されたＮＫ９２／ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ でのＪＡＫ２化合物のＪＡＫ３細胞活性の評価を可能にする。
【００４３】
ＮＫ−９２（ナチュラルキラー）細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州、マナサス）を、１５％ ウシ胎児血清、１５％ ウマ血清および１×抗生物質／抗真菌剤（インビトロジェン、カリフォルニア州、カールズバッド）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）α中で維持した。当該培地に、ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州、ミネアポリス）を、最終濃度４ｎｇ／ｍＬで補充した。細胞を３７℃で５％ ＣＯ２で維持した。細胞を無血清培地中で飢我させ、内在性の増殖因子を除去した。ＮＫ−９２細胞を計測し、収集し、９６ウェルプレートあたり２×１０７細胞を、ウェルあたり密度２×１０５細胞で播種した。細胞を無補充のＭＥＭ α（ＭＥＭ α）で２回リンスした後に、細胞を、０．６％ 血清（０．３％ ＦＢＳ、０．３％ ウマ血清）を含むＭＥＭ α中で、最終濃度８×１０５細胞／ｍＬで懸濁した。希釈された細胞を組織培養フラスコに入れ戻し、一晩、３７℃でインキュベーションした。試験化合物を１００％ ＤＭＳＯ中で、濃度１０ｍＭで調製した。化合物を、１００％ ＤＭＳＯで、１０時点の２００×濃度反応域（４ｍＭ〜２００ｎＭ）で、１：３で連続希釈した。別々の９６ディープウェルプレート中に、２．５μＬの２００×化合物溶液を、４×濃度の化合物のプレートにおける１２５μＬの１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ １６４０培地に加えた。
【００４４】
アッセイを行うために、血清飢餓細胞を収集し、無補充のＲＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄した。細胞を１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で最終濃度８×１０５細胞／ｍＬで懸濁した。２５０μＬの希釈された細胞（２×１０５細胞）の分割量を、４×濃度の化合物のプレート中の各ウェルに加えた。細胞をボルテックスによって混合し、当該プレートを３７℃の水浴中で１０分間インキュベーションした。２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２の未使用の４×希釈標準溶液を、あらかじめ加温した１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ培地を使用して調製した。細胞を化合物で１０分間処理した後に、１２５μＬのＩＬ−２培地を各ウェルに加えた。細胞をボルテックスによって混合した。細胞を３７℃の水浴中で２０分間インキュベーションし、インキュベーション時間の間、５分ごとに混合した。最終的な１０時点の濃度反応域は、ＤＭＳＯは０．５％、およびＩＬ−２は０．５ｎｇ／ｍＬの最終濃度で２０μＭ〜１ｎＭだった。細胞の処理後、５００μＬの１％ ホルムアルデヒド溶液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で新たに作製し、３７℃で加温を維持した）を、各ウェルに加えた。プレートを密封し、８〜１０回反転させて混合した。プレートを３７℃の水浴中に１０分間置いた。インキュベーション後、セルプレートを１２００ｒｐｍで５分間、室温で遠心した。上清を吸引し、１００μＬの細胞（２×１０５細胞）を残した。細胞をボルテックスし、遠心工程を繰り返すことによって、８００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、最終的な洗浄後、約２×１０５細胞を含む１００μＬを残した。８００μＬの冷やした９０％ メタノールの分割量を細胞に加え、−２０℃で一晩置いた。プレートを遠心し、メタノールを除去した。細胞をＦＡＣＳ バッファー（５％ ＦＢＳおよび０．０２％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄した。２００μＬの、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）バッファー中の１〜１０の希釈度のマウス抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）の分割量を、細胞に加えた。細胞をよく混合し、室温で、暗所で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬの細胞を残した。２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ニュージャージー州、モリスプレーンズ）の希釈標準溶液をＰＢＳで調製した。２００μＬの分割量を各ウェルに加え、細胞を、室温で、暗所で１０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）を細胞に加えた。細胞を９６ウェル黒色組織培養プレートに移し、密封した。プレートをスピンダウンした。平均蛍光強度のデータを収集し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ａｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標）ＶＴｉを使用して分析した。化合物処理を媒体と比較し、阻害率のデータを特定した。ＭＳＲは、２．０６であると特定した。相対ＩＣ５０を、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ４．０での、４パラメータのロジスティック曲線のフィッティング解析を使用して算出した。３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンについて、ＩＣ５０＝０．９４μＭ、ｎ＝４である。ＪＡＫ３ ＩＬ２−ＮＫ９２−ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイの結果は、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ−［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンが、作用の弱いＪＡＫ３阻害剤であることを示す（ＩＣ５０＝０．０３３μＭである、ＪＡＫ２ ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５セルベースアッセイの結果と比較した場合）。これらの結果から、ＪＡＫ３／ＪＡＫ２の比は、ＩＣ５０について、２８．５倍であることを特定した。これは、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンがＪＡＫ３に対して選択的なＪＡＫ２阻害剤であることを示す。
【００４５】
Ｂａ／Ｆ３ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆセルベースアッセイ
Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳ
ＪＡＫ２標的阻害を、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ発現Ｂａ／Ｆ３中で、ウエスタンブロットによって、Ｗｅｒｎｉｇら（Ｗｅｒｎｉｇ Ｇら、Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＴＧ１０１３４８，ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＪＡＫ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，Ａｐｒ；１３（４）：３１１−２０）が報告したように評価した。培地スループット（ｍｅｄｉｕｍ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓアッセイを、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆを発現しているＢａ／Ｆ３細胞中のＪＡＫ２標的阻害を評価するために確立した。このアッセイは、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異に関連する疾患を治療するための効果的な治療薬の発見を可能にする。
【００４６】
ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆを発現しているＢａ／Ｆ３（マウスのプロＢ）細胞を、１０％ ＦＢＳ、０．０７％ 炭酸水素ナトリウム、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１×抗生物質／抗真菌剤（インビトロジェン、カリフォルニア州、カールズバッド）および０．４５％ グルコース（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）を含むＲＰＭＩ １６４０中で維持した。細胞を、３７℃で５％ ＣＯ２で維持した。試験化合物を、１００％ ＤＭＳＯ中で、濃度１０ｍＭで調製した。化合物を１０時点の２００×濃度反応域（４ｍＭ〜２００ｎＭ）で、１００％ ＤＭＳＯで、１：３で連続希釈した。別々の９６ディープウェルプレート中で、２．５μＬの２００×化合物溶液を、４×濃度の化合物のプレートにおける、１０％ ＦＢＳを含む１２５μＬの完全ＲＰＭＩ １６４０培地に加えた。
【００４７】
アッセイを行うために、細胞を収集し、無補充のＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄した。次いで、細胞を、１０％ ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ培地中で、最終濃度４×１０５／ｍＬで懸濁した。次に、５００μＬの細胞（２×１０５細胞）を、９６ディープウェルプレートに移した。最後に、２．５μＬ（１：２００希釈）の化合物ストック溶液を細胞に加え、細胞とともに３７℃の水浴中で６０分間インキュベーションした。
【００４８】
細胞の処理後、５００μＬの１％ ホルムアルデヒド溶液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で新たに作製し、３７℃で加温を維持した）を、各ウェルに加えた。プレートを密封し、８〜１０回反転させて混合した。プレートを３７℃の水浴中に１０分間置いた。インキュベーション後、セルプレートを１２００ｒｐｍで５分間、室温で遠心した。上清を吸引し、１００μＬの細胞（２×１０５細胞）を残した。細胞をボルテックスし、遠心工程を繰り返すことによって８００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、最終的な洗浄後、約２×１０５細胞を含む１００μＬを残した。８００μＬの冷やした９０％ メタノールの分割量を細胞に加え、−２０℃で一晩置いた。プレートを遠心し、メタノールを除去した。細胞をＦＡＣＳ バッファー（５％ ＦＢＳおよび０．０％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄した。２００μＬの、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）バッファー中の１〜１０の希釈度のマウス抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）の分割量を細胞に加えた。細胞をよく混合し、室温で、暗所で２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬの細胞を残した。２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ニュージャージー州、モリスプレーンズ）の希釈標準溶液を、ＰＢＳで調製した。２００μＬの分割量を各ウェルに加え、細胞を、室温で、暗所で１０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）を細胞に加えた。細胞を９６ウェル黒色組織培養プレートに移し、密封した。当該プレートをスピンダウンした。平均蛍光強度のデータを収集し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ａｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標）ＶＴｉを使用して分析した。化合物処理を媒体と比較し、阻害率のデータを特定した。相対ＩＣ５０を、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ４．０での、４パラメータのロジスティック曲線のフィッティング解析を使用して算出した。３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンについて、ＩＣ５０＝０．０３μＭである。このアッセイの結果は、３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンが、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ遺伝子を発現しているＢａ／Ｆ３細胞中のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ標的を効果的に阻害することを示す。
【００４９】
本発明の化合物は、好ましくは、様々な経路によって投与される医薬組成物として処方される。最も好ましくは、このような組成物は、経口投与のためのものである。このような医薬組成物およびその調製方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら編集、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９９５）を参照。
【００５０】
本発明の化合物は、広い投与量の範囲にわたって、全体的に有効である。例えば、１日あたりの投与量は、通常、１日あたりの総量が約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは、１日あたりの総量が５００ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは１日あたりの総量が６００ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内である。いくつかの場合では、上記の範囲の下限を下回る投与量のレベルが十分以上である可能性があり、一方、他の場合では、さらに多くの用量が使用される可能性がある。上記の投与量の範囲は、多少なりとも本発明の範囲を制限することを意図したものではない。実際に投与される化合物の量は、医師によって、関連する状況（治療される症状、選択された投与経路、実際の化合物または投与される化合物、年齢、体重、および個々の患者の反応、および患者の症候の重症度等）の観点から決定されることが理解されるだろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項２】
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン塩酸塩である請求項１記載の化合物。
【請求項４】
哺乳類における、真性多血症、本態性血小板増加症、および骨髄化生を伴う骨髄硬化症からなる群から選択される慢性骨髄増殖性疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳類に、有効量の３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン、またはその薬理学的に許容できる塩を投与する工程を含む治療方法。
【請求項５】
患者における、神経膠芽腫、乳癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、ならびに白血病（非定型慢性骨髄性白血病、原発性および二次性の急性骨髄性白血病、Ｔ細胞性およびＢ細胞性の急性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、および骨髄増殖性疾患等）の治療方法であって、このような治療を必要とする患者に、有効量の３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン、またはその薬理学的に許容できる塩を投与する工程を含む治療方法。
【請求項６】
請求項１、２もしくは３いずれか１項記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩、および薬理学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
薬物としての使用のための、請求項１、２もしくは３いずれか１項記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項８】
神経膠芽腫、乳癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、ならびに白血病、Ｔ細胞性およびＢ細胞性の急性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに骨髄増殖性疾患の治療における使用のための、請求項１、２もしくは３いずれか１項記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項９】
慢性骨髄増殖性疾患の治療における使用のための請求項８記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項１０】
治療を必要とする患者におけるＪＡＫ２変異の活性に関連する症状の治療方法であって、前記患者に請求項１、２もしくは３いずれか１項記載の化合物を投与する工程を含む治療方法。
【請求項１】
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項２】
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミンである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン塩酸塩である請求項１記載の化合物。
【請求項４】
哺乳類における、真性多血症、本態性血小板増加症、および骨髄化生を伴う骨髄硬化症からなる群から選択される慢性骨髄増殖性疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする哺乳類に、有効量の３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン、またはその薬理学的に許容できる塩を投与する工程を含む治療方法。
【請求項５】
患者における、神経膠芽腫、乳癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、ならびに白血病（非定型慢性骨髄性白血病、原発性および二次性の急性骨髄性白血病、Ｔ細胞性およびＢ細胞性の急性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、および骨髄増殖性疾患等）の治療方法であって、このような治療を必要とする患者に、有効量の３−（４−クロロ−２−フルオロベンジル）−２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−８−（モルホリノメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−６−アミン、またはその薬理学的に許容できる塩を投与する工程を含む治療方法。
【請求項６】
請求項１、２もしくは３いずれか１項記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩、および薬理学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
薬物としての使用のための、請求項１、２もしくは３いずれか１項記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項８】
神経膠芽腫、乳癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、ならびに白血病、Ｔ細胞性およびＢ細胞性の急性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに骨髄増殖性疾患の治療における使用のための、請求項１、２もしくは３いずれか１項記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項９】
慢性骨髄増殖性疾患の治療における使用のための請求項８記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項１０】
治療を必要とする患者におけるＪＡＫ２変異の活性に関連する症状の治療方法であって、前記患者に請求項１、２もしくは３いずれか１項記載の化合物を投与する工程を含む治療方法。
【公表番号】特表２０１２−５１２１５８（Ｐ２０１２−５１２１５８Ａ）
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４０８０９（Ｐ２０１１−５４０８０９）
【出願日】平成２１年１２月８日（２００９．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７０５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７４９４７
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月８日（２００９．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７０５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７４９４７
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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