アミノ末端修飾ペプチドの分離方法および分離用組成物
【課題】多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態において、Ｎ末端修飾ペプチドをより簡便に分離することができる技術を提供する。
【解決手段】アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離する方法であって、アミノ末端非修飾ペプチドのα-アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基とを選択的に反応させて該アミノ末端非修飾ペプチドを該イソシアネート結合樹脂に結合させることにより、ペプチド混合物から該アミノ末端非修飾ペプチドを除去することを特徴とするアミノ末端修飾ペプチドの分離方法等を提供する。
【解決手段】アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離する方法であって、アミノ末端非修飾ペプチドのα-アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基とを選択的に反応させて該アミノ末端非修飾ペプチドを該イソシアネート結合樹脂に結合させることにより、ペプチド混合物から該アミノ末端非修飾ペプチドを除去することを特徴とするアミノ末端修飾ペプチドの分離方法等を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ末端修飾ペプチドの分離方法および分離用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ末端（以下、Ｎ末端と記すこともある。）が修飾されたペプチド（以下、Ｎ末端修飾ペプチドと記すこともある。）を同定する方法としては、例えば、タンパク質の断片化により生成される全てのペプチドをエドマン分解法に供してＮ末端修飾ペプチドを同定する方法や、タンパク質中のリジン残基のε−アミノ基を保護した後に該タンパク質を断片化して生成されるペプチドをアセチル化処理し、該アセチル化処理前後の試料の逆相クロマトグラフィーにおける溶出位置の比較からタンパク質のＮ末端修飾ペプチドを同定する方法（特許文献１参照）等が知られている。
【特許文献１】特開平８−２７１８０号公報（平成８（１９９６）年１月３０日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これらの方法は、必要工程数が多い、操作が煩雑である等の点から、必ずしも満足できる方法とは言い難い。また、多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態（すなわち、粗精製段階）では、タンパク質（ペプチド）の内部配列に由来するペプチドが多数を占めるため、Ｎ末端修飾ペプチドの同定が妨害される。よって、上述したような方法は、比較的精製された状態でのペプチドのＮ末端解析には有効であるが、粗精製段階でのＮ末端修飾ペプチドの同定には有効でない。このような方法を用いてＮ末端修飾ペプチドを同定するためには多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態からＮ末端修飾ペプチドを分離する必要があった。
【０００４】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態においてもＮ末端修飾ペプチドをより簡便に分離することができるＮ末端修飾ペプチドの分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下の発明を含む。
［発明１］
アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離する方法であって、アミノ末端非修飾ペプチドのα−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基とを選択的に反応させて該アミノ末端非修飾ペプチドを該イソシアネート結合樹脂に結合させることにより、ペプチド混合物から該アミノ末端非修飾ペプチドを除去することを特徴とするアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
［発明２］
上記ペプチド混合物が生体試料由来のペプチド混合物である発明１に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
［発明３］
アミノ末端非修飾ペプチドのα−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基との選択的な反応が酸性条件下で行われる発明１又は２に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
［発明４］
発明１〜３のいずれか一項に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法により分離された該アミノ末端修飾ペプチドを質量分析することによって同定するアミノ末端修飾ペプチドの同定方法。
［発明５］
アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離するための組成物であって、イソシアネート結合樹脂を含んでいることを特徴とするアミノ末端修飾ペプチド分離用組成物。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態においてもＮ末端修飾ペプチドをより簡便に分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
生体内において、タンパク質は、翻訳後に種々のプロセシングや修飾を受け、標的部位に移行し、機能を持ったタンパク質に成熟する。メチオニンアミノペプチダーゼによるＮ末端翻訳開始メチオニンの切断や、分泌タンパク質でみられるＮ末端シグナルペプチドの除去などは、Ｎ末端プロセシングの代表的な例である。タンパク質のＮ末端の修飾、例えば、アセチル化、フォルミル化、ピログルタミル化、ミリストイル化などは、タンパク質に一般的に生じる翻訳後修飾である。例えば、哺乳類においては９０％以上、酵母においては４０％以上の細胞質タンパク質が、Ｎ末端アセチル化されているといわれている。細菌のタンパク質では、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎなどの僅かな例を除いて、Ｎ末端はアセチル化されていないといわれていたが、最近、古細菌由来タンパク質のＮ末端網羅的解析が行われ、約２０％のタンパク質はＮ末端がアセチル化されていると報告されている。
【０００９】
生体内で実際に機能しているタンパク質を網羅的に解析するプロテオミクスにおいて、タンパク質のＮ末端領域に着目した網羅的な解析（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｏｍｅ）が着目され、最近、タンパク質のＮ末端ペプチドの網羅的な解析手法に関する報告が数多くなされている。Ｎ末端プロセシングや翻訳後修飾は、主に細胞内でのタンパク質の安定化や局在の制御に関するものであったが、ある種のプロテアーゼによるＮ末端領域のプロセシングは、タンパク質の活性制御、生体機能の制御に密接に関連しており、こうしたプロセシングの解明は、生理機能のみならず、疾病の解明や新たな治療薬の開発にもつながるものと考えられている。
【００１０】
生理活性ペプチドもタンパク質翻訳後プロセシング産物の一種である。生理活性ペプチドのＮ末端部分の修飾としては、Ｎ末端ピログルタミル化やＮ末端アセチル化が知られている。タンパク質のＮ末端は様々な修飾や多様な切断を受ける部位であり、その構造は生体内での機能と密接に結びついている。また、ペプチドーム解析においては、ペプチドＮ末端の修飾は機能と密接に結びついていることから、Ｎ末端修飾ペプチドにフォーカスをあてた解析法は、新規な生理活性ペプチドを探索する上で有効な方法になるものと考えられる。
【００１１】
タンパク質やペプチドのＮ末端配列を解析する上で重要な技術として知られているエドマン分解法では、Ｎ末端が修飾されたタンパク質やペプチドは解析不可能である。また、解析には高純度の試料が必要なことから、プロテオームやペプチドームなどの網羅的解析には適していない。質量分析法は、Ｎ末端が修飾されたタンパク質やペプチドでも解析可能であり、タンパク質の同定や配列決定に有効な手法といえる。しかし、実際には、タンパク質をトリプシンなどの酵素により切断し、生じたペプチド混合物を質量分析するので、質量分析法を用いたタンパク質の解析では、タンパク質を切断してから測定する必要があり、タンパク質の末端情報が失われてしまう。従って、ペプチド混合物中からＮ末端ペプチドを効率的に同定することは困難であった。また、生体に内在するペプチドの解析においては、非常に複雑な混合物であるために、Ｎ末端修飾ペプチドや他の修飾ペプチドは同定結果からしばしば漏れてしまうという問題があった。
【００１２】
本発明を用いれば、多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態においてもＮ末端修飾ペプチドをより簡便に分離することができる。また、後述する実施例において示すように、本発明を用いて得られたＮ末端修飾ペプチドの画分にはＮ末端非修飾ペプチドがほとんど含まれていない。このように、Ｎ末端非修飾ペプチドがサンプル中に多数含まれている場合であってもマススペクトルで検出し得ない程度までＮ末端非修飾ペプチドを除去し得るということは、容易に予測し得る程度をはるかに超える結果であり、イソシアネート結合樹脂の未知の属性といえる。すなわち、本発明は、イソシアネート結合樹脂の未知の属性により、Ｎ末端修飾ペプチドの分離という新たな用途への使用に適することを見いだしたことに基づく発明である。
【００１３】
本発明が適用されるタンパク質（ペプチド）サンプルは生体由来であっても、人為的に作製されたものであってもよい。例えば、Ｎ末端修飾ペプチドは、Ｎ末端が修飾されたタンパク質（以下、Ｎ末端修飾タンパク質と記すこともある。）を断片化することによって調製されてもよい。この断片化の方法は特に限定されず、例えば新生化学実験講座１タンパク質ＩＩ一次構造（東京化学同人）等に記載の化学的断片化、消化酵素を用いた断片化等が挙げられる。より具体的には例えば、化学的断片化としてはＢｒＣＮによる断片化方法が挙げられ、消化酵素による断片化としてはトリプシン、キモトリプシン等を用いた消化が挙げられる。後述する実施例において示すように、尿または脳組織由来のタンパク質（ペプチド）サンプルを用いた場合であっても、本発明により簡便かつ迅速にＮ末端修飾ペプチドを分離することができる。
【００１４】
イソシアネート結合樹脂とは、イソシアネート基が結合した樹脂であり、例えばアミノプロピル基を有する樹脂に二価反応性のＮＣＯを有するＭＤＩ（メチレンジフェニル４，４’−ジイソシアネート）を作用させたＲｅｓｉｎ−ＮＣＯ等が挙げられる。Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯの調製法としては、アミノプロピル基を有する樹脂Ｐｏｒｏｓ２０ＮＨ（５０ｍｇ）をアセトニトリルで洗浄した後、４００μＬのアセトニトリル中に懸濁する。次に、この懸濁液に４００μＬの０．５Ｍ ＭＤＩ／ＭｅＣＮを添加し、攪拌しながら室温で６０分間反応させ、反応完了後、樹脂をアセトニトリルで洗浄し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃにて乾燥させ、乾燥後、樹脂をＡｒ置換して−２０℃で保存する方法が挙げられる。なお、イソシアネート結合樹脂は、イソシアネート基を結合させた樹脂であればよい。また、利用可能な樹脂は特に限定されず、当業者は、イソシアネート基の樹脂への結合方法を、利用する樹脂に応じて適宜選択し得る。
【００１５】
アミノ末端修飾ペプチド分離用組成物は、上述したようなイソシアネート結合樹脂を含んでいればよい。本明細書中で使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図される。例えば、後述するように、イソシアネート結合樹脂をアセトニトリルに懸濁した態様であってもよい。また、アミノ末端修飾ペプチド分離用組成物は、アミノ末端修飾ペプチド分離用キットであり得る。本明細書中で使用される場合、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であることが意図される。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは各材料を使用するための指示書を備えている。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。アミノ末端修飾ペプチド分離用キットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備えていてもよい。さらに、アミノ末端修飾ペプチド分離用キットは、アミノ末端修飾ペプチドの分離／同定に必要な器具をあわせて備えていてもよい。
【００１６】
本発明に好ましい「アミノ末端修飾」としては、アシル化が挙げられる。実施例において示すように、アミノ末端がアセチル化されているペプチド（Ｎ末端アセチル化ペプチド）が非常に効率よく検出されているが、本発明に好ましい「アミノ末端修飾」はアセチル化に限定されず、フォルミル化、ピログルタミル化、ミリストイル化などであってもよい。
【００１７】
アミノ末端非修飾ペプチドのＮ末端α−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基とを選択的に反応させる条件としては、ペプチドのリジン残基のε−アミノ基には作用せず、且つアミノ末端非修飾ペプチドのＮ末端α−アミノ基と反応する条件であればよい。例えば、ｐＨが約６の溶媒中にて室温でアミノ末端非修飾ペプチドのＮ末端α−アミノ基にイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基を反応させる方法を挙げることができる。この方法において、反応系に用いる溶媒は、後処理の簡便さを考慮すると揮発性のものが好ましく、例えばピリジン−酢酸等が挙げられる。
【００１８】
より具体的なアミノ末端非修飾ペプチドのＮ末端α−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基とを選択的に反応させる方法としては、使用前にアセトニトリルで洗浄したＲｅｓｉｎ−ＮＣＯ（１．８ｍｇ）を４５μＬのアセトニトリルに懸濁し、このＲｅｓｉｎ−ＮＣＯ懸濁液に、０．０５Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）にペプチドを溶解させたペプチド溶解液５〜８μＬを添加し、室温で２０分間反応させる方法が挙げられる。
【００１９】
この場合、アミノ末端非修飾ペプチドのＮ末端α−アミノ基がＲｅｓｉｎ−ＮＣＯとＲｅｓｉｎ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ペプチドを形成することにより、アミノ末端非修飾ペプチドはＲｅｓｉｎ−ＮＣＯにトラップ（結合）される。一方、Ｎ末端修飾ペプチド（Ｌｙｓ含有ペプチドを含む）は、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯと反応せずに、溶液中にインタクトな状態として存在するため、遠心分離した後、上清から回収することが可能である。このような方法を用いることによって、アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端非修飾ペプチドを除去し、該混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離することができる。
【００２０】
回収されたＮ末端修飾ペプチドは、質量分析法に供されることによって、同定が可能となる。このとき、例えば反応液に揮発性の溶媒を用いた場合は、溶媒を減圧下に溜去すればよく、不揮発性の塩を含む溶媒を用いた場合は脱塩処理を行った後、溶媒を減圧溜去すればよい。
【００２１】
質量分析法によるＮ末端修飾ペプチドの同定方法については、質量分析できる方法であればよく、質量分析装置の種類やイオン化法は特に限定されない。例えば、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｍ＠ＬＤＩ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒや４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を挙げることができる。具体的な質量分析方法としては、マトリックスとしてＣＨＣＡを０．１％ ＴＦＡ−水／アセトニトリル（５０／５０）に溶解させた飽和溶液を使用し、このマトリックス溶液０．５μＬとペプチド試料溶液０．５μＬとを混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定を行う方法が挙げられる。
【００２２】
また、タンデム質量分析法に供することにより、Ｎ末端修飾ペプチドのＮ末端における修飾基の同定及びアミノ酸配列決定が可能であり、或いは新生化学実験化学講座１タンパク質ＩＩ一次構造（東京化学同人）等の記載に準じてＮ末端修飾ペプチドのＮ末端修飾基を除去しエドマン分解法によりアミノ酸配列を解析することも可能である。
【００２３】
アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物は生体試料由来のペプチド混合物であってもよい。この生体試料由来のペプチド混合物としては、特に限定されないが、例えば、動物の尿中のタンパク質及びペプチドや、脳抽出物由来のタンパク質及びペプチド等が挙げられる。
【００２４】
尿タンパク質消化物からのＮ末端修飾ペプチドの分離方法について、以下に述べる。
【００２５】
尿試料１０ｍＬを限外ろ過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ−１５ （１０，０００Ｄａ Ｃｕｔ ｏｆｆ）に供し、タンパク質画分を収集する。尿タンパク質画分を乾燥した後、５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム水溶液に溶解し、ＤＴＴ（１．５ｍｇ）、ヨード酢酸（２ｍｇ）を添加し、５０℃で６０分間反応させることにより還元アルキル化処理する。反応後に、限外ろ過フィルターを用いて反応試薬を除去し、トリプシン（１．５３μｇ）を添加し、３７℃で１２時間反応させることにより尿タンパク質トリプシン消化物を得る。ゲルろ過カラムＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ２０００ＳＷ（７．５×３００ｍｍ）を、０．１％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ／アセトニトリル＝９０／１０の移動相を用いて平衡化し、尿タンパク質トリプシン消化物をカラムに供し、ペプチド画分として保持時間１７分〜２５分の画分を収集する。
【００２６】
得られた試料（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎトリプシン消化物換算：約７ｎｍｏｌ）を３５μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）に溶解し、２００ｐｍｏｌ／μＬ試料とする。本試料溶液１μＬ（２００ｐｍｏｌ）に０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）を５μＬ添加し、合成ペプチドＲ８６−１及びＲ８６−２（各５ｐｍｏｌ）をスパイクし、アセトニトリル４５μＬを加える。試料溶液の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定試料として取り出す（反応前試料）。試料溶液に３．６ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加し、室温にて２０分間攪拌し、反応後試料の上清を一部（０．５μＬ）取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定試料とする（反応後試料）。反応後上清試料は、乾燥させた後に、質量分析解析試料として使用する。
【００２７】
なお、Ｒ８６−１はＡｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨからなるＮ末端アミノ基がアセチル基によって修飾されている合成ペプチドであり、Ｒ８６−２はＮＨ２−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨからなるＮ末端アミノ基が修飾されていない合成ペプチドである。
【００２８】
尿ペプチドからのＮ末端修飾ペプチドの分離方法について、以下に述べる。尿（１０ｍＬ分）粗精製タンパク質のゲルろ過ペプチド画分試料乾燥品（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎトリプシン消化物換算：約５ｎｍｏｌ）を２５μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）に溶解し、２００ｐｍｏｌ／μＬ溶液とする。本試料溶液５μＬ（尿換算２ｍＬ）に０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）を５μＬ添加し、アセトニトリル９０μＬをさらに添加する。試料溶液の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定試料として取り出す（反応前試料）。試料溶液に９ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加し、室温にて２０分間攪拌し、反応後試料の上清を一部（０．５μＬ）取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定試料とする（反応後試料）。反応後上清試料は、乾燥させた後に、質量分析解析試料として使用する。
【００２９】
脳ペプチドからのＮ末端修飾ペプチドの分離方法について、以下に述べる。
【００３０】
ラット脳組織（約１ｇ）を沸騰した熱水（５ｍｌ）に入れ、１０分間煮沸する。これを冷却した後、最終濃度１Ｍとなるように酢酸を添加する。組織をホモジナイズした後に遠心分離し、回収した上清を４℃に冷却してアセトン沈殿（アセトン濃度６６％）を行う。上清を乾燥した後に、０．１％ＴＦＡ水に溶解してＣ１８カラムに供する。０．１％ ＴＦＡ水および１０％アセトニトリル含有０．１％ ＴＦＡ水でカラムを洗浄した後、６５％アセトニトリル含有０．１％ ＴＦＡ水で溶出した溶出液をペプチド画分とする。
【００３１】
ペプチド画分の乾燥品１ｍｇ（ラット脳１／２０量）を、１Ｍ酢酸水溶液５００μＬに溶解し、この溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−１０限外ろ過フィルターに入れた後に、遠心分離する。低分子量画分（ＬＭＷ画分）を回収かつ乾燥したものを、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯ処理試料とする。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１０ ＬＭＷ画分乾燥試料に５μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）、４５μＬのアセトニトリルを添加して、試料を溶解する。溶液０．５μＬを取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ試料とする（Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯ処理前試料）。試料溶液に、合成ペプチドＲ８６−１を２ｐｍｏｌスパイクし、３．６ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯ樹脂を添加して、室温で２０分間反応させる。反応後試料の上清一部（０．５μＬ）取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ試料とする（Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯ処理後試料）。反応後上清試料は、乾燥させた後に、質量分析解析試料として使用する。
【００３２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００３３】
次に、試験例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
〔試験例１：Ｎ末端修飾タンパク質Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ（ＣａＭ）の分離〕
Ｎ末端修飾タンパク質ＣａＭを用いて、本発明の方法によるＮ末端ペプチド分離について評価した。図１Ａ〜図１Ｂは、ＣａＭのトリプシン消化物（３０ｐｍｏｌ）を７μＬの０．０５Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）、４５μＬのアセトニトリルに溶解した溶液（０．５μＬ）のＭＡＬＤＩマススペクトルであり、図１ＡがＣａＭトリプシン消化物のＭＡＬＤＩマススペクトル、図１ＢがＲｅｓｉｎ−ＮＣＯ処理後のＭＡＬＤＩマススペクトルである。ＣａＭのＮ末端はアセチル化されていることが報告されており、ｍ／ｚ１５６３がＮ末端由来ペプチドＡｃ−ＡＤＱＬＴＥＥＱＩＡＥＦＫ（配列番号１）である。他の印をつけたピークは内部由来のペプチドである。１．８ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯとのインキュベーション後、溶液の一部（０．５μＬ）を取り出し、ＭＡＬＤＩマススペクトルを取得した。ＣａＭ内部配列由来のペプチドピークは全て消失し、Ｎ末端由来のピーク（ｍ／ｚ １５６３）のみが検出された。本Ｎ末端由来ペプチド断片は、Ｌｙｓ含有ペプチドであるが、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯと反応することなく、溶媒中から回収された。本試験例に示すように、タンパク質中のＬｙｓを保護処理することなく、トリプシン消化混合物から、Ｎ末端由来のペプチドが分離できた。
【００３５】
〔試験例２：Ｎ末端修飾タンパク質チトクロムｃの分離〕
Ｎ末端修飾タンパク質であるチトクロムｃをキモトリプシンにより切断した。溶媒０．０５Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）に溶解したチトクロムｃ−キモトリプシン消化物（４０ｐｍｏｌ／７μＬ）に、アセトニトリル４５μＬを添加し、溶液の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析した（図２Ａ〜図２Ｂ）。帰属できたチトクロムｃ−キモトリプシン消化物に印をつけた（図２Ａ）。１．８ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加して反応させた後のＭＡＬＤＩマススペクトルが図２Ｂである。図に示すように、Ｎ末端由来ペプチドであるｍ／ｚ １１６２が検出された。ＭＳ／ＭＳを行い、チトクロムｃのＮ末端由来ペプチドＡｃ−ＧＤＶＥＫＧＫＫＩＦ（配列番号２）であることが確認できた。このペプチドは、Ｌｙｓ３個を含むが、樹脂にトラップされることなく、溶液中から回収することができた。このように、本発明の方法は、断片化に通常用いられるトリプシン以外でも利用でき、Ｎ末端ペプチドの分離、同定法として汎用性が高く、有効である。
【００３６】
〔試験例３：尿タンパク質トリプシン消化物からのＮ末端修飾ペプチドの分離〕
図３Ａは、尿タンパク質トリプシン消化物２００ｐｍｏｌ（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎトリプシン消化物換算量）に、合成ペプチドＲ８６−１及びＲ８６−２（各５ｐｍｏｌ、Ｒ８６−１、Ｒ８６−２はそれぞれ、Ａｃ−ＹＧＧＦＬＳＹＰＬＫ及びＮＨ２−ＹＧＧＦＬＳＹＰＬＫ配列を有する合成ペプチド（配列番号６））を添加した試料に対して、５μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）、４５μＬのアセトニトリルで溶解した試料の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析したスペクトルである。非常に多数の尿タンパク質トリプシン消化物由来のピークが検出された。試料中の添加したペプチドの濃度は１００ｆｍｏｌ／μＬであり、図３Ａ中のＭＡＬＤＩマススペクトル中にも強度は弱いながら、添加したペプチドが検出されていた。図３Ｂは、尿タンパク質消化物試料に３．５ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加して反応させた後のＭＡＬＤＩマススペクトルである。添加したペプチドのうち、Ｎ末端未修飾ペプチドであるＲ８６−２のピークは、反応後に消失した。一方、Ｎ末端修飾ペプチドであるＲ８６−１のピークは、ｍ／ｚ １１８６にはっきりと検出された。本結果は、多数のペプチドが混在する複雑な生体試料においても、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯはＮ末端未修飾ペプチドと効率よく反応、結合し、機能することを示している。実際に新たに出現したピークがＮ末端修飾ペプチドであるかどうかを調べるため、ＭＳ／ＭＳスペクトルを取得し、各ピークの同定を行った。各ピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦマススペクトルを取得し、Ｍａｓｃｏｔによってペプチドの同定を行った。表１に同定結果をまとめた。矢印で示した主要なピークは全てＮ末端修飾ペプチドであることが判明し、それらの構造は既に報告されているものであった。
【００３７】
【表１】
【００３８】
〔試験例４：尿ペプチド画分（〜１０ｋＤａ）のＮ末端修飾ペプチドの分離〕
図４Ａ〜図４Ｄは、尿ペプチド画分試料１ｎｍｏｌ（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎトリプシン消化物換算量）を、１０μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）、９０μＬのアセトニトリルで溶解した試料の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析したスペクトルである。尿ペプチド画分にはＵｒｏｍｏｄｕｌｉｎ由来のペプチドが多量に含まれており（１４，１５）、図４Ａにおいても、Ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎの断片ペプチドが主ピークとして検出されている（ｍ／ｚ １９１１，１６８０）。図４Ａの一部拡大図を図４Ｃに示す。図４Ｂは、試料溶液に９ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加して反応させた後の上清のＭＡＬＤＩマススペクトルである。図４Ｂの一部拡大図を図４Ｄに示す。Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯを使用することにより、溶液中に多量に存在したＵｒｏｍｏｄｕｌｉｎ由来ペプチドのピークは消失した。反応後のスペクトルをみると、Ｎ末端修飾ペプチドと考えられる新たなピークが検出された。尿ペプチド画分試料については、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯを使用することにより、主要成分であるＵｒｏｍｏｄｕｌｉｎ由来ペプチドが除去され、Ｎ末端修飾ペプチドと予想されるマイナー成分の検出が可能であることが示された。
【００３９】
〔試験例５：脳ペプチド中のＮ末端修飾ペプチドの分離〕
図５Ａは、ラット脳ペプチド画分（ラット脳１／２０）に、５μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）、４５μＬのアセトニトリルを添加し、一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析した結果である。図５Ａの一部拡大図を図５Ｃに示す。多数のペプチドピークが検出されている。図５Ｂは、３．６ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加して反応させた後のＭＡＬＤＩマススペクトルである。図５Ｂの一部拡大図を図５Ｄに示す。反応前に検出されていたピークのほとんどは消失し、Ｎ末端修飾ペプチドと考えられる新たなピークが検出された。ＮａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯ処理後の試料ペプチド（修飾ペプチド）の分離、同定をさらに行い、表２に示す７種類のＮ末端修飾ペプチドの同定結果を得た（Ｍａｓｃｏｔ ｓｃｏｒｅ ３０以上）。
【００４０】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により、多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態においてもＮ末端由来のペプチドをより簡便に分離することができるＮ末端修飾ペプチド分離用組成物、およびＮ末端修飾ペプチドの分離方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】試験例１の結果を示した図である。
【図１Ｂ】試験例１の結果を示した図である。
【図２Ａ】試験例２の結果を示した図である。
【図２Ｂ】試験例２の結果を示した図である。
【図３Ａ】試験例３の結果を示した図である。
【図３Ｂ】試験例３の結果を示した図である。
【図４Ａ】試験例４の結果を示した図である。
【図４Ｂ】試験例４の結果を示した図である。
【図４Ｃ】試験例４の結果を示した図である。
【図４Ｄ】試験例４の結果を示した図である。
【図５Ａ】試験例５の結果を示した図である。
【図５Ｂ】試験例５の結果を示した図である。
【図５Ｃ】試験例５の結果を示した図である。
【図５Ｄ】試験例５の結果を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ末端修飾ペプチドの分離方法および分離用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ末端（以下、Ｎ末端と記すこともある。）が修飾されたペプチド（以下、Ｎ末端修飾ペプチドと記すこともある。）を同定する方法としては、例えば、タンパク質の断片化により生成される全てのペプチドをエドマン分解法に供してＮ末端修飾ペプチドを同定する方法や、タンパク質中のリジン残基のε−アミノ基を保護した後に該タンパク質を断片化して生成されるペプチドをアセチル化処理し、該アセチル化処理前後の試料の逆相クロマトグラフィーにおける溶出位置の比較からタンパク質のＮ末端修飾ペプチドを同定する方法（特許文献１参照）等が知られている。
【特許文献１】特開平８−２７１８０号公報（平成８（１９９６）年１月３０日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これらの方法は、必要工程数が多い、操作が煩雑である等の点から、必ずしも満足できる方法とは言い難い。また、多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態（すなわち、粗精製段階）では、タンパク質（ペプチド）の内部配列に由来するペプチドが多数を占めるため、Ｎ末端修飾ペプチドの同定が妨害される。よって、上述したような方法は、比較的精製された状態でのペプチドのＮ末端解析には有効であるが、粗精製段階でのＮ末端修飾ペプチドの同定には有効でない。このような方法を用いてＮ末端修飾ペプチドを同定するためには多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態からＮ末端修飾ペプチドを分離する必要があった。
【０００４】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態においてもＮ末端修飾ペプチドをより簡便に分離することができるＮ末端修飾ペプチドの分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下の発明を含む。
［発明１］
アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離する方法であって、アミノ末端非修飾ペプチドのα−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基とを選択的に反応させて該アミノ末端非修飾ペプチドを該イソシアネート結合樹脂に結合させることにより、ペプチド混合物から該アミノ末端非修飾ペプチドを除去することを特徴とするアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
［発明２］
上記ペプチド混合物が生体試料由来のペプチド混合物である発明１に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
［発明３］
アミノ末端非修飾ペプチドのα−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基との選択的な反応が酸性条件下で行われる発明１又は２に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
［発明４］
発明１〜３のいずれか一項に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法により分離された該アミノ末端修飾ペプチドを質量分析することによって同定するアミノ末端修飾ペプチドの同定方法。
［発明５］
アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離するための組成物であって、イソシアネート結合樹脂を含んでいることを特徴とするアミノ末端修飾ペプチド分離用組成物。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態においてもＮ末端修飾ペプチドをより簡便に分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
生体内において、タンパク質は、翻訳後に種々のプロセシングや修飾を受け、標的部位に移行し、機能を持ったタンパク質に成熟する。メチオニンアミノペプチダーゼによるＮ末端翻訳開始メチオニンの切断や、分泌タンパク質でみられるＮ末端シグナルペプチドの除去などは、Ｎ末端プロセシングの代表的な例である。タンパク質のＮ末端の修飾、例えば、アセチル化、フォルミル化、ピログルタミル化、ミリストイル化などは、タンパク質に一般的に生じる翻訳後修飾である。例えば、哺乳類においては９０％以上、酵母においては４０％以上の細胞質タンパク質が、Ｎ末端アセチル化されているといわれている。細菌のタンパク質では、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎなどの僅かな例を除いて、Ｎ末端はアセチル化されていないといわれていたが、最近、古細菌由来タンパク質のＮ末端網羅的解析が行われ、約２０％のタンパク質はＮ末端がアセチル化されていると報告されている。
【０００９】
生体内で実際に機能しているタンパク質を網羅的に解析するプロテオミクスにおいて、タンパク質のＮ末端領域に着目した網羅的な解析（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｏｍｅ）が着目され、最近、タンパク質のＮ末端ペプチドの網羅的な解析手法に関する報告が数多くなされている。Ｎ末端プロセシングや翻訳後修飾は、主に細胞内でのタンパク質の安定化や局在の制御に関するものであったが、ある種のプロテアーゼによるＮ末端領域のプロセシングは、タンパク質の活性制御、生体機能の制御に密接に関連しており、こうしたプロセシングの解明は、生理機能のみならず、疾病の解明や新たな治療薬の開発にもつながるものと考えられている。
【００１０】
生理活性ペプチドもタンパク質翻訳後プロセシング産物の一種である。生理活性ペプチドのＮ末端部分の修飾としては、Ｎ末端ピログルタミル化やＮ末端アセチル化が知られている。タンパク質のＮ末端は様々な修飾や多様な切断を受ける部位であり、その構造は生体内での機能と密接に結びついている。また、ペプチドーム解析においては、ペプチドＮ末端の修飾は機能と密接に結びついていることから、Ｎ末端修飾ペプチドにフォーカスをあてた解析法は、新規な生理活性ペプチドを探索する上で有効な方法になるものと考えられる。
【００１１】
タンパク質やペプチドのＮ末端配列を解析する上で重要な技術として知られているエドマン分解法では、Ｎ末端が修飾されたタンパク質やペプチドは解析不可能である。また、解析には高純度の試料が必要なことから、プロテオームやペプチドームなどの網羅的解析には適していない。質量分析法は、Ｎ末端が修飾されたタンパク質やペプチドでも解析可能であり、タンパク質の同定や配列決定に有効な手法といえる。しかし、実際には、タンパク質をトリプシンなどの酵素により切断し、生じたペプチド混合物を質量分析するので、質量分析法を用いたタンパク質の解析では、タンパク質を切断してから測定する必要があり、タンパク質の末端情報が失われてしまう。従って、ペプチド混合物中からＮ末端ペプチドを効率的に同定することは困難であった。また、生体に内在するペプチドの解析においては、非常に複雑な混合物であるために、Ｎ末端修飾ペプチドや他の修飾ペプチドは同定結果からしばしば漏れてしまうという問題があった。
【００１２】
本発明を用いれば、多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態においてもＮ末端修飾ペプチドをより簡便に分離することができる。また、後述する実施例において示すように、本発明を用いて得られたＮ末端修飾ペプチドの画分にはＮ末端非修飾ペプチドがほとんど含まれていない。このように、Ｎ末端非修飾ペプチドがサンプル中に多数含まれている場合であってもマススペクトルで検出し得ない程度までＮ末端非修飾ペプチドを除去し得るということは、容易に予測し得る程度をはるかに超える結果であり、イソシアネート結合樹脂の未知の属性といえる。すなわち、本発明は、イソシアネート結合樹脂の未知の属性により、Ｎ末端修飾ペプチドの分離という新たな用途への使用に適することを見いだしたことに基づく発明である。
【００１３】
本発明が適用されるタンパク質（ペプチド）サンプルは生体由来であっても、人為的に作製されたものであってもよい。例えば、Ｎ末端修飾ペプチドは、Ｎ末端が修飾されたタンパク質（以下、Ｎ末端修飾タンパク質と記すこともある。）を断片化することによって調製されてもよい。この断片化の方法は特に限定されず、例えば新生化学実験講座１タンパク質ＩＩ一次構造（東京化学同人）等に記載の化学的断片化、消化酵素を用いた断片化等が挙げられる。より具体的には例えば、化学的断片化としてはＢｒＣＮによる断片化方法が挙げられ、消化酵素による断片化としてはトリプシン、キモトリプシン等を用いた消化が挙げられる。後述する実施例において示すように、尿または脳組織由来のタンパク質（ペプチド）サンプルを用いた場合であっても、本発明により簡便かつ迅速にＮ末端修飾ペプチドを分離することができる。
【００１４】
イソシアネート結合樹脂とは、イソシアネート基が結合した樹脂であり、例えばアミノプロピル基を有する樹脂に二価反応性のＮＣＯを有するＭＤＩ（メチレンジフェニル４，４’−ジイソシアネート）を作用させたＲｅｓｉｎ−ＮＣＯ等が挙げられる。Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯの調製法としては、アミノプロピル基を有する樹脂Ｐｏｒｏｓ２０ＮＨ（５０ｍｇ）をアセトニトリルで洗浄した後、４００μＬのアセトニトリル中に懸濁する。次に、この懸濁液に４００μＬの０．５Ｍ ＭＤＩ／ＭｅＣＮを添加し、攪拌しながら室温で６０分間反応させ、反応完了後、樹脂をアセトニトリルで洗浄し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃにて乾燥させ、乾燥後、樹脂をＡｒ置換して−２０℃で保存する方法が挙げられる。なお、イソシアネート結合樹脂は、イソシアネート基を結合させた樹脂であればよい。また、利用可能な樹脂は特に限定されず、当業者は、イソシアネート基の樹脂への結合方法を、利用する樹脂に応じて適宜選択し得る。
【００１５】
アミノ末端修飾ペプチド分離用組成物は、上述したようなイソシアネート結合樹脂を含んでいればよい。本明細書中で使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図される。例えば、後述するように、イソシアネート結合樹脂をアセトニトリルに懸濁した態様であってもよい。また、アミノ末端修飾ペプチド分離用組成物は、アミノ末端修飾ペプチド分離用キットであり得る。本明細書中で使用される場合、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であることが意図される。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは各材料を使用するための指示書を備えている。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。アミノ末端修飾ペプチド分離用キットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備えていてもよい。さらに、アミノ末端修飾ペプチド分離用キットは、アミノ末端修飾ペプチドの分離／同定に必要な器具をあわせて備えていてもよい。
【００１６】
本発明に好ましい「アミノ末端修飾」としては、アシル化が挙げられる。実施例において示すように、アミノ末端がアセチル化されているペプチド（Ｎ末端アセチル化ペプチド）が非常に効率よく検出されているが、本発明に好ましい「アミノ末端修飾」はアセチル化に限定されず、フォルミル化、ピログルタミル化、ミリストイル化などであってもよい。
【００１７】
アミノ末端非修飾ペプチドのＮ末端α−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基とを選択的に反応させる条件としては、ペプチドのリジン残基のε−アミノ基には作用せず、且つアミノ末端非修飾ペプチドのＮ末端α−アミノ基と反応する条件であればよい。例えば、ｐＨが約６の溶媒中にて室温でアミノ末端非修飾ペプチドのＮ末端α−アミノ基にイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基を反応させる方法を挙げることができる。この方法において、反応系に用いる溶媒は、後処理の簡便さを考慮すると揮発性のものが好ましく、例えばピリジン−酢酸等が挙げられる。
【００１８】
より具体的なアミノ末端非修飾ペプチドのＮ末端α−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基とを選択的に反応させる方法としては、使用前にアセトニトリルで洗浄したＲｅｓｉｎ−ＮＣＯ（１．８ｍｇ）を４５μＬのアセトニトリルに懸濁し、このＲｅｓｉｎ−ＮＣＯ懸濁液に、０．０５Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）にペプチドを溶解させたペプチド溶解液５〜８μＬを添加し、室温で２０分間反応させる方法が挙げられる。
【００１９】
この場合、アミノ末端非修飾ペプチドのＮ末端α−アミノ基がＲｅｓｉｎ−ＮＣＯとＲｅｓｉｎ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ペプチドを形成することにより、アミノ末端非修飾ペプチドはＲｅｓｉｎ−ＮＣＯにトラップ（結合）される。一方、Ｎ末端修飾ペプチド（Ｌｙｓ含有ペプチドを含む）は、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯと反応せずに、溶液中にインタクトな状態として存在するため、遠心分離した後、上清から回収することが可能である。このような方法を用いることによって、アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端非修飾ペプチドを除去し、該混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離することができる。
【００２０】
回収されたＮ末端修飾ペプチドは、質量分析法に供されることによって、同定が可能となる。このとき、例えば反応液に揮発性の溶媒を用いた場合は、溶媒を減圧下に溜去すればよく、不揮発性の塩を含む溶媒を用いた場合は脱塩処理を行った後、溶媒を減圧溜去すればよい。
【００２１】
質量分析法によるＮ末端修飾ペプチドの同定方法については、質量分析できる方法であればよく、質量分析装置の種類やイオン化法は特に限定されない。例えば、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｍ＠ＬＤＩ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒや４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を挙げることができる。具体的な質量分析方法としては、マトリックスとしてＣＨＣＡを０．１％ ＴＦＡ−水／アセトニトリル（５０／５０）に溶解させた飽和溶液を使用し、このマトリックス溶液０．５μＬとペプチド試料溶液０．５μＬとを混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定を行う方法が挙げられる。
【００２２】
また、タンデム質量分析法に供することにより、Ｎ末端修飾ペプチドのＮ末端における修飾基の同定及びアミノ酸配列決定が可能であり、或いは新生化学実験化学講座１タンパク質ＩＩ一次構造（東京化学同人）等の記載に準じてＮ末端修飾ペプチドのＮ末端修飾基を除去しエドマン分解法によりアミノ酸配列を解析することも可能である。
【００２３】
アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物は生体試料由来のペプチド混合物であってもよい。この生体試料由来のペプチド混合物としては、特に限定されないが、例えば、動物の尿中のタンパク質及びペプチドや、脳抽出物由来のタンパク質及びペプチド等が挙げられる。
【００２４】
尿タンパク質消化物からのＮ末端修飾ペプチドの分離方法について、以下に述べる。
【００２５】
尿試料１０ｍＬを限外ろ過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ−１５ （１０，０００Ｄａ Ｃｕｔ ｏｆｆ）に供し、タンパク質画分を収集する。尿タンパク質画分を乾燥した後、５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム水溶液に溶解し、ＤＴＴ（１．５ｍｇ）、ヨード酢酸（２ｍｇ）を添加し、５０℃で６０分間反応させることにより還元アルキル化処理する。反応後に、限外ろ過フィルターを用いて反応試薬を除去し、トリプシン（１．５３μｇ）を添加し、３７℃で１２時間反応させることにより尿タンパク質トリプシン消化物を得る。ゲルろ過カラムＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ２０００ＳＷ（７．５×３００ｍｍ）を、０．１％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ／アセトニトリル＝９０／１０の移動相を用いて平衡化し、尿タンパク質トリプシン消化物をカラムに供し、ペプチド画分として保持時間１７分〜２５分の画分を収集する。
【００２６】
得られた試料（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎトリプシン消化物換算：約７ｎｍｏｌ）を３５μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）に溶解し、２００ｐｍｏｌ／μＬ試料とする。本試料溶液１μＬ（２００ｐｍｏｌ）に０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）を５μＬ添加し、合成ペプチドＲ８６−１及びＲ８６−２（各５ｐｍｏｌ）をスパイクし、アセトニトリル４５μＬを加える。試料溶液の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定試料として取り出す（反応前試料）。試料溶液に３．６ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加し、室温にて２０分間攪拌し、反応後試料の上清を一部（０．５μＬ）取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定試料とする（反応後試料）。反応後上清試料は、乾燥させた後に、質量分析解析試料として使用する。
【００２７】
なお、Ｒ８６−１はＡｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨからなるＮ末端アミノ基がアセチル基によって修飾されている合成ペプチドであり、Ｒ８６−２はＮＨ２−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＨからなるＮ末端アミノ基が修飾されていない合成ペプチドである。
【００２８】
尿ペプチドからのＮ末端修飾ペプチドの分離方法について、以下に述べる。尿（１０ｍＬ分）粗精製タンパク質のゲルろ過ペプチド画分試料乾燥品（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎトリプシン消化物換算：約５ｎｍｏｌ）を２５μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）に溶解し、２００ｐｍｏｌ／μＬ溶液とする。本試料溶液５μＬ（尿換算２ｍＬ）に０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）を５μＬ添加し、アセトニトリル９０μＬをさらに添加する。試料溶液の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定試料として取り出す（反応前試料）。試料溶液に９ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加し、室温にて２０分間攪拌し、反応後試料の上清を一部（０．５μＬ）取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定試料とする（反応後試料）。反応後上清試料は、乾燥させた後に、質量分析解析試料として使用する。
【００２９】
脳ペプチドからのＮ末端修飾ペプチドの分離方法について、以下に述べる。
【００３０】
ラット脳組織（約１ｇ）を沸騰した熱水（５ｍｌ）に入れ、１０分間煮沸する。これを冷却した後、最終濃度１Ｍとなるように酢酸を添加する。組織をホモジナイズした後に遠心分離し、回収した上清を４℃に冷却してアセトン沈殿（アセトン濃度６６％）を行う。上清を乾燥した後に、０．１％ＴＦＡ水に溶解してＣ１８カラムに供する。０．１％ ＴＦＡ水および１０％アセトニトリル含有０．１％ ＴＦＡ水でカラムを洗浄した後、６５％アセトニトリル含有０．１％ ＴＦＡ水で溶出した溶出液をペプチド画分とする。
【００３１】
ペプチド画分の乾燥品１ｍｇ（ラット脳１／２０量）を、１Ｍ酢酸水溶液５００μＬに溶解し、この溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−１０限外ろ過フィルターに入れた後に、遠心分離する。低分子量画分（ＬＭＷ画分）を回収かつ乾燥したものを、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯ処理試料とする。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１０ ＬＭＷ画分乾燥試料に５μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）、４５μＬのアセトニトリルを添加して、試料を溶解する。溶液０．５μＬを取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ試料とする（Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯ処理前試料）。試料溶液に、合成ペプチドＲ８６−１を２ｐｍｏｌスパイクし、３．６ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯ樹脂を添加して、室温で２０分間反応させる。反応後試料の上清一部（０．５μＬ）取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ試料とする（Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯ処理後試料）。反応後上清試料は、乾燥させた後に、質量分析解析試料として使用する。
【００３２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００３３】
次に、試験例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
〔試験例１：Ｎ末端修飾タンパク質Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ（ＣａＭ）の分離〕
Ｎ末端修飾タンパク質ＣａＭを用いて、本発明の方法によるＮ末端ペプチド分離について評価した。図１Ａ〜図１Ｂは、ＣａＭのトリプシン消化物（３０ｐｍｏｌ）を７μＬの０．０５Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）、４５μＬのアセトニトリルに溶解した溶液（０．５μＬ）のＭＡＬＤＩマススペクトルであり、図１ＡがＣａＭトリプシン消化物のＭＡＬＤＩマススペクトル、図１ＢがＲｅｓｉｎ−ＮＣＯ処理後のＭＡＬＤＩマススペクトルである。ＣａＭのＮ末端はアセチル化されていることが報告されており、ｍ／ｚ１５６３がＮ末端由来ペプチドＡｃ−ＡＤＱＬＴＥＥＱＩＡＥＦＫ（配列番号１）である。他の印をつけたピークは内部由来のペプチドである。１．８ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯとのインキュベーション後、溶液の一部（０．５μＬ）を取り出し、ＭＡＬＤＩマススペクトルを取得した。ＣａＭ内部配列由来のペプチドピークは全て消失し、Ｎ末端由来のピーク（ｍ／ｚ １５６３）のみが検出された。本Ｎ末端由来ペプチド断片は、Ｌｙｓ含有ペプチドであるが、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯと反応することなく、溶媒中から回収された。本試験例に示すように、タンパク質中のＬｙｓを保護処理することなく、トリプシン消化混合物から、Ｎ末端由来のペプチドが分離できた。
【００３５】
〔試験例２：Ｎ末端修飾タンパク質チトクロムｃの分離〕
Ｎ末端修飾タンパク質であるチトクロムｃをキモトリプシンにより切断した。溶媒０．０５Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）に溶解したチトクロムｃ−キモトリプシン消化物（４０ｐｍｏｌ／７μＬ）に、アセトニトリル４５μＬを添加し、溶液の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析した（図２Ａ〜図２Ｂ）。帰属できたチトクロムｃ−キモトリプシン消化物に印をつけた（図２Ａ）。１．８ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加して反応させた後のＭＡＬＤＩマススペクトルが図２Ｂである。図に示すように、Ｎ末端由来ペプチドであるｍ／ｚ １１６２が検出された。ＭＳ／ＭＳを行い、チトクロムｃのＮ末端由来ペプチドＡｃ−ＧＤＶＥＫＧＫＫＩＦ（配列番号２）であることが確認できた。このペプチドは、Ｌｙｓ３個を含むが、樹脂にトラップされることなく、溶液中から回収することができた。このように、本発明の方法は、断片化に通常用いられるトリプシン以外でも利用でき、Ｎ末端ペプチドの分離、同定法として汎用性が高く、有効である。
【００３６】
〔試験例３：尿タンパク質トリプシン消化物からのＮ末端修飾ペプチドの分離〕
図３Ａは、尿タンパク質トリプシン消化物２００ｐｍｏｌ（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎトリプシン消化物換算量）に、合成ペプチドＲ８６−１及びＲ８６−２（各５ｐｍｏｌ、Ｒ８６−１、Ｒ８６−２はそれぞれ、Ａｃ−ＹＧＧＦＬＳＹＰＬＫ及びＮＨ２−ＹＧＧＦＬＳＹＰＬＫ配列を有する合成ペプチド（配列番号６））を添加した試料に対して、５μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）、４５μＬのアセトニトリルで溶解した試料の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析したスペクトルである。非常に多数の尿タンパク質トリプシン消化物由来のピークが検出された。試料中の添加したペプチドの濃度は１００ｆｍｏｌ／μＬであり、図３Ａ中のＭＡＬＤＩマススペクトル中にも強度は弱いながら、添加したペプチドが検出されていた。図３Ｂは、尿タンパク質消化物試料に３．５ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加して反応させた後のＭＡＬＤＩマススペクトルである。添加したペプチドのうち、Ｎ末端未修飾ペプチドであるＲ８６−２のピークは、反応後に消失した。一方、Ｎ末端修飾ペプチドであるＲ８６−１のピークは、ｍ／ｚ １１８６にはっきりと検出された。本結果は、多数のペプチドが混在する複雑な生体試料においても、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯはＮ末端未修飾ペプチドと効率よく反応、結合し、機能することを示している。実際に新たに出現したピークがＮ末端修飾ペプチドであるかどうかを調べるため、ＭＳ／ＭＳスペクトルを取得し、各ピークの同定を行った。各ピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦマススペクトルを取得し、Ｍａｓｃｏｔによってペプチドの同定を行った。表１に同定結果をまとめた。矢印で示した主要なピークは全てＮ末端修飾ペプチドであることが判明し、それらの構造は既に報告されているものであった。
【００３７】
【表１】
【００３８】
〔試験例４：尿ペプチド画分（〜１０ｋＤａ）のＮ末端修飾ペプチドの分離〕
図４Ａ〜図４Ｄは、尿ペプチド画分試料１ｎｍｏｌ（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎトリプシン消化物換算量）を、１０μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）、９０μＬのアセトニトリルで溶解した試料の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析したスペクトルである。尿ペプチド画分にはＵｒｏｍｏｄｕｌｉｎ由来のペプチドが多量に含まれており（１４，１５）、図４Ａにおいても、Ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎの断片ペプチドが主ピークとして検出されている（ｍ／ｚ １９１１，１６８０）。図４Ａの一部拡大図を図４Ｃに示す。図４Ｂは、試料溶液に９ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加して反応させた後の上清のＭＡＬＤＩマススペクトルである。図４Ｂの一部拡大図を図４Ｄに示す。Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯを使用することにより、溶液中に多量に存在したＵｒｏｍｏｄｕｌｉｎ由来ペプチドのピークは消失した。反応後のスペクトルをみると、Ｎ末端修飾ペプチドと考えられる新たなピークが検出された。尿ペプチド画分試料については、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯを使用することにより、主要成分であるＵｒｏｍｏｄｕｌｉｎ由来ペプチドが除去され、Ｎ末端修飾ペプチドと予想されるマイナー成分の検出が可能であることが示された。
【００３９】
〔試験例５：脳ペプチド中のＮ末端修飾ペプチドの分離〕
図５Ａは、ラット脳ペプチド画分（ラット脳１／２０）に、５μＬの０．１Ｍ リン酸−ＴＥＡ（ｐＨ３．５）、４５μＬのアセトニトリルを添加し、一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析した結果である。図５Ａの一部拡大図を図５Ｃに示す。多数のペプチドピークが検出されている。図５Ｂは、３．６ｍｇのＲｅｓｉｎ−ＮＣＯを添加して反応させた後のＭＡＬＤＩマススペクトルである。図５Ｂの一部拡大図を図５Ｄに示す。反応前に検出されていたピークのほとんどは消失し、Ｎ末端修飾ペプチドと考えられる新たなピークが検出された。ＮａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、Ｒｅｓｉｎ−ＮＣＯ処理後の試料ペプチド（修飾ペプチド）の分離、同定をさらに行い、表２に示す７種類のＮ末端修飾ペプチドの同定結果を得た（Ｍａｓｃｏｔ ｓｃｏｒｅ ３０以上）。
【００４０】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により、多数のタンパク質（ペプチド）が混合している状態においてもＮ末端由来のペプチドをより簡便に分離することができるＮ末端修飾ペプチド分離用組成物、およびＮ末端修飾ペプチドの分離方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】試験例１の結果を示した図である。
【図１Ｂ】試験例１の結果を示した図である。
【図２Ａ】試験例２の結果を示した図である。
【図２Ｂ】試験例２の結果を示した図である。
【図３Ａ】試験例３の結果を示した図である。
【図３Ｂ】試験例３の結果を示した図である。
【図４Ａ】試験例４の結果を示した図である。
【図４Ｂ】試験例４の結果を示した図である。
【図４Ｃ】試験例４の結果を示した図である。
【図４Ｄ】試験例４の結果を示した図である。
【図５Ａ】試験例５の結果を示した図である。
【図５Ｂ】試験例５の結果を示した図である。
【図５Ｃ】試験例５の結果を示した図である。
【図５Ｄ】試験例５の結果を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離する方法であって、
アミノ末端非修飾ペプチドのα−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基とを選択的に反応させて該アミノ末端非修飾ペプチドを該イソシアネート結合樹脂に結合させることにより、ペプチド混合物から該アミノ末端非修飾ペプチドを除去することを特徴とするアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
【請求項２】
前記ペプチド混合物が生体試料由来のペプチド混合物であることを特徴とする請求項１に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
【請求項３】
アミノ末端非修飾ペプチドのα−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基との選択的な反応が酸性条件下で行われることを特徴とする請求項１又は２に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法により分離された該アミノ末端修飾ペプチドを質量分析することによって同定することを特徴とするアミノ末端修飾ペプチドの同定方法。
【請求項５】
アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離するための組成物であって、イソシアネート結合樹脂を含んでいることを特徴とするアミノ末端修飾ペプチド分離用組成物。
【請求項１】
アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離する方法であって、
アミノ末端非修飾ペプチドのα−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基とを選択的に反応させて該アミノ末端非修飾ペプチドを該イソシアネート結合樹脂に結合させることにより、ペプチド混合物から該アミノ末端非修飾ペプチドを除去することを特徴とするアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
【請求項２】
前記ペプチド混合物が生体試料由来のペプチド混合物であることを特徴とする請求項１に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
【請求項３】
アミノ末端非修飾ペプチドのα−アミノ基とイソシアネート結合樹脂のイソシアネート基との選択的な反応が酸性条件下で行われることを特徴とする請求項１又は２に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のアミノ末端修飾ペプチドの分離方法により分離された該アミノ末端修飾ペプチドを質量分析することによって同定することを特徴とするアミノ末端修飾ペプチドの同定方法。
【請求項５】
アミノ末端修飾ペプチドとアミノ末端非修飾ペプチドとを含むペプチド混合物からアミノ末端修飾ペプチドを分離するための組成物であって、イソシアネート結合樹脂を含んでいることを特徴とするアミノ末端修飾ペプチド分離用組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【公開番号】特開２００９−１８４９８３（Ｐ２００９−１８４９８３Ａ）
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８０９１（Ｐ２００８−２８０９１）
【出願日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年８月１０日 大阪大学主催の「大阪大学博士論文公開発表審査会」に文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年９月１４日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｊｏｕｒｎａｌｓ／ａｎｃｈａｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ」「ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ３．ａｃｓ．ｏｒｇ／ａｃｓ／ｊｏｕｒｎａｌｓ／ｔｏｃ．ｐａｇｅ？ｉｎｃｏｄｅｎ＝ａｎｃｈａｍ＆ｉｎｄｅｃａｄｅ＝０＆ｉｎｖｏｌｕｍｅ＝７９＆ｉｎｉｓｓｕｅ＝２０」「ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ａｂｓｔｒａｃｔ．ｃｇｉ／ａｎｃｈａｍ／２００７／７９／ｉ２０／ａｂｓ／ａｃ０７１２９４ａ．ｈｔｍｌ」に発表
【出願人】（３９００００６８６）株式会社住化分析センター (72)
【出願人】（５０８０４０７４０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年８月１０日 大阪大学主催の「大阪大学博士論文公開発表審査会」に文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年９月１４日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｊｏｕｒｎａｌｓ／ａｎｃｈａｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ」「ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ３．ａｃｓ．ｏｒｇ／ａｃｓ／ｊｏｕｒｎａｌｓ／ｔｏｃ．ｐａｇｅ？ｉｎｃｏｄｅｎ＝ａｎｃｈａｍ＆ｉｎｄｅｃａｄｅ＝０＆ｉｎｖｏｌｕｍｅ＝７９＆ｉｎｉｓｓｕｅ＝２０」「ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ａｂｓｔｒａｃｔ．ｃｇｉ／ａｎｃｈａｍ／２００７／７９／ｉ２０／ａｂｓ／ａｃ０７１２９４ａ．ｈｔｍｌ」に発表
【出願人】（３９００００６８６）株式会社住化分析センター (72)
【出願人】（５０８０４０７４０）
【Ｆターム（参考）】
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