アラザイムを有効成分とする癌予防及び治療用組成物
本発明は、アラザイムを有効成分とする癌の予防及び治療用薬学的組成物に関する。詳細には、アラニコラプロテオチリクスが生産するアラザイムをヒト肺癌細胞株が移植されたヌードマウスに投与すると、体重の増加、腫瘍細胞の抑制及び浸潤減少現象が現われて、ＭＭＰ−９、ＮＦ−κＢ及びＰＣＮＡの発現様相が減少される。また、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に処理すると、腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるｐ２１、ＰＣＮＡ、ＶＥＧＦ、ＢＣｌ２、ｐ−ｐ３８、ＰＫＣ及びＭＭＰ−１の発現が減少され、腫瘍発生を抑制する役割をするカタラーゼの発現が増加される。したがって、アラザイムを癌の予防及び治療用薬学的組成物として有用に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アラザイム（ａｒａｚｙｍｅ）を有効成分とする癌予防及び治療用組成物に関するもので、より詳細には、アラニコラプロテオチリクス（Ａｒａｎｉｃｏｌａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）が生産するアラザイムを含む癌予防及び治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は、非正常的で非制御性かつ無秩序な細胞増殖の産物である。このような腫瘍が、破壊的な成長性、浸湿性及び転移性を有する場合は、悪性に分類される。浸湿性というのは、周囲組織を浸潤または破壊する性質で、一般的に組織の境界をなす基底層を破壊して腫瘍が局所的に伝播されることを意味して、たびたび体内の循環系にも流入する。転移というのは、一般的にリンパ管または血管によって、原発位置とは異なる所に腫瘍細胞が広がることを意味する。転移はまた、腸液性体腔または他の空間を通じて直接伸長して腫瘍細胞を移動させることを意味したりする。
【０００３】
癌の発病には、遺伝的素因も深く関与するが、環境的要因も大きな影響を及ぼし、先進国であればあるほど癌の発病が増加する傾向を示している。これに関する可能な原因としては、農薬、殺虫剤などの使用量及び食品内の残留量の増加、食品保存剤、防腐剤、着色剤などが添加された加工食品の消費増加、水質、土壌、大気汚染の増加、現代人のストレス増加、活動量の減少、そして豊かな食生活による肥満などが報告されている（Ｋｉｍ ＨＪ，等，Ｌｉｖ Ｓｃｉ ｏｆ Ｔｊ Ｕｎｉｖ．，１９９７年，第３巻，９９−１３０頁（非特許文献１）；Ｊａｃｏｂｓ ＭＭ，Ｎｕｔｒ Ｔｏｄ，１９９３年，第２８（３）巻，１９−２３頁（非特許文献２））。
【０００４】
腫瘍が成長と転移をするためには、新生血管形成が必須過程である（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，１９９０年，第８２巻，４−６頁（非特許文献３））。新生血管形成は、増殖する腫瘍に栄養分と酸素を供給するだけではなく、原発病場所から血管壁を通じた腫瘍細胞の貫通と遠隔臓器への転移を可能にする（Ｋｉｍ ＫＪ，等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３年，第３６２巻，８４１−８４４頁（非特許文献４））。
【０００５】
現在、癌は主に３種の治療法、すなわち外科的な手術、放射線照射及び化学療法の中で１種またはこれらの組み合わせによって治療されている。手術は、疾病組織を大部分除去することを含む。このような外科的手術は、特定部位、例えば乳房、結腸および皮膚に位置した腫瘍を除去するには効果的であるが、脊椎のような一部区域にある腫瘍を治療したり、白血病のような分散性腫瘍疾患を治療したりするのには、使用することができない。
【０００６】
化学療法は、細胞複製または細胞代謝を崩壊させて、乳房、肺及び精巣の癌を治療するのに多く使用されるが、腫瘍疾病を治療するのに使用される全身性化学療法の副作用は、癌治療を受ける患者たちにとって最も問題になる。このような副作用の中で、吐き気と嘔吐は、最も一般的で深刻な副作用である。化学療法による副作用は、患者の生命に大きな影響を及ぼし、治療に対する患者の順応性を急激に変化させ得る。また、化学治療剤と係わる副作用には、一般的にこのような薬物の投与時に注意しなければならない用量制限毒性（ＤＬＴ）がある。例えば、粘膜炎は、多くの抗癌剤、例えば抗代謝物質細胞毒素体である５−フルオロウラシル、メトトレキセート及び抗腫瘍抗生剤（例、ドキソルビシン）などに対する用量制限毒性である。このような化学療法由来の副作用の中で大部分は、ひどい場合には、入院を要したり痛症を治療するために痛み止めを必要としたりする。このように化学治療剤及び放射線治療による副作用は、癌患者の臨床的処置時の主な問題となっている。また、従来の抗癌剤は、正常細胞まで殺傷する場合が多いため、最近では正常細胞には作用しないで癌細胞にのみ作用することができる新しい機序の抗癌剤に対する研究が進められている。
【０００７】
一方、本発明者等は、新しいタンパク質分解酵素を開発しようと努力した結果、韓国産ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ）から新規微生物であるアラニコラプロテオチリクス（Ａｒａｎｉｃｏｌａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＨＹ−３菌株（受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ；ＷＯ０１／５７２２２号（特許文献１））を分離し、本菌株から新規なタンパク質分解酵素であるアラザイムを分離した。アラザイムは、低温と高い塩濃度で安定したタンパク質分解活性を示すのみならず、人の体温である３７℃で最も高い活性を示し、広いｐＨ範囲でも安定した活性を示すことを発見して、本タンパク質分解酵素の遺伝子を確認した（ＷＯ０１／５７２２２号（特許文献１））。
【０００８】
本発明者等は、アラニコラプロテオチリクス菌株に由来したアラザイムの効果を調査した結果、アラザイムは、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌード（Ｎｕｄｅ）マウスにおいて、体重の増加と腫瘍細胞抑制作用を起こし、ＭＭＰ−９、ＮＦ−κＢ及びＰＣＮＡの発現様相を減少させ、またヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）で、ｐ２１、ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＢＣｌ２（Ｂ−ｃｅｌｌ ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ ２）、ｐ−ｐ３８、ＰＫＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）及びＭＭＰ−１（Ｍａｔｒｉｘ ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）の発現は、減少させて、カタラーゼの発現は、増加させることを確認して、癌予防及び治療用組成物として有用に使用できることを明らかにして本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ０１／５７２２２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｉｍ ＨＪ，等，Ｌｉｖ Ｓｃｉ ｏｆ Ｔｊ Ｕｎｉｖ．，１９９７年，第３巻，９９−１３０頁
【非特許文献２】Ｊａｃｏｂｓ ＭＭ，Ｎｕｔｒ Ｔｏｄ，１９９３年，第２８（３）巻，１９−２３頁
【非特許文献３】Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，１９９０年，第８２巻，４−６頁
【非特許文献４】Ｋｉｍ ＫＪ，等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３年，第３６２巻，８４１−８４４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、アラニコラプロテオチリクスが生産するアラザイムを有効成分とする癌予防及び治療用組成物、及びこれを使用した予防及び治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、アラザイムを有効成分として含む癌予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを有効成分として含む癌予防及び改善用健康食品を提供する。
【００１４】
また、本発明は、薬学的に有効量のアラザイムを癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、薬学的に有効量のアラザイムを癌にかかった個体に投与する工程を含む癌予防方法を提供する。
【００１６】
同時に、本発明は、アラザイムを癌予防及び治療剤の製造に使用する用途を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のアラニコラプロテオチリクスが生産するアラザイムは、腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるＭＭＰ−９、ＮＦ−κＢ、ｐ２１、ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＢＣｌ２（Ｂ−ｃｅｌｌ ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ ２）、ｐ−ｐ３８、ＰＫＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）及びＭＭＰ−１（Ｍａｔｒｉｘ ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）の発現を減少させて、腫瘍発生を抑制する役割をするカタラーゼの発現を増加させることにより、癌予防及び治療用組成物として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、体重の変化を示したグラフである： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図２】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、腫瘍の大きさを示したグラフである： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；＊：ｐ＜０．０５；及び＊＊：ｐ＜０．０１。
【図３】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後の組織学的写真である（１３倍率及び３３倍率）： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図４】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＭＭＰ−９の免疫組織学的写真である（３３倍率及び６６倍率）： 対照群：アラザイム ０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム １５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム ３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム ６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図５】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＭＭＰ−９の免疫組織化学的発現程度を示したグラフである： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図６】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＮＦ−κＢの免疫組織学的写真である（３３倍率及び６６倍率）： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図７】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＮＦ−κＢの免疫組織化学的発現程度を示したグラフである： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図８】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＰＣＮＡの免疫組織学的写真である（６６倍率及び１３２倍率）： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図９】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＰＣＮＡの免疫組織化学的発現程度を示したグラフである： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図１０】ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）でアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）処理による腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるタンパク質の発現変化を観察した免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）結果を示した図である。
【図１１】ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）でアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）処理による腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるタンパク質の発現変化程度を相対的割合で示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２０】
本発明のアラザイムは、下記の方法で製造することができる：
１）アラニコラプロテオチリクス菌株を培養して培養液を得る工程；
２）前記培養液をろ過して上澄み液を得る工程；及び
３）上澄み液内に含まれた前記アラザイムを樹脂を使用して精製する工程。前記製造方法において、アラザイムを生産する微生物として、アラニコラプロテオチリクス菌株を使用するのが好ましく、韓国生命工学研究院遺伝子銀行に１９９６年７月２９日付けで寄託された受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ号のアラニコラプロテオチリクスＨＹ−３を使用することがより好ましいが、これに限定されるものではない。アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３菌株は、ジョロウグモの腸内から分離した好気性のグラム陰性細菌であり、０．５〜０．８ｍｍの大きさの球形で運動性を有していて、カタラーゼには陽性反応を、オキシダーゼには、陰性反応を示す（ＷＯ０１／５７２２２号）。
【００２１】
本発明では、前記のような方法で得られたアラザイムを使用することが好ましく、下記のような方法で生産されたアラザイムを使用することがさらに好ましい。アラニコラプロテオチリクス菌株の培養のために使用する原料は、純粋精製時に簡便で高純度の結果物が得られ得る医薬品水準の物が好ましく、培養後、アンモニウムスルファート沈澱（またはアセトン沈澱）を遂行する。このようなアンモニウムスルファートまたはアセトン沈澱後、遠心分離及びろ過を通じてアラザイムのみを回収する。これは、微生物で生産される他の大部分のタンパク質は、アラザイムと沈澱濃度が異なることを利用したものである。アラザイムを回収した後、膜ろ過を使用した１次不純物の精製及び限外ろ過器を使用して最後に純粋分離精製する。このようにして得られた溶液状態の高濃度アラザイムを凍結乾燥器でパウダータイプに製造したものを使用する。
【００２２】
また、本発明は、下記のような方法でアラザイムを製造することができる：
１）アラザイムのコード領域を含む塩基配列のＤＮＡを発現ベクターにクローニングする工程、
２）前記工程１）でクローニングされた発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、
３）前記工程２）で形質転換された宿主細胞を選別する工程、及び
４）前記３）で選別された宿主細胞で発現したアラザイムを得る工程。前記製造方法において、工程１）でアラザイムのコード領域を含む塩基配列は、配列番号：２で表わされるもの、配列番号：２で表わされた塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるＤＮＡであれば好ましい。ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション後の洗浄時に決定される。ストリンジェントな条件中の一つは、常温で６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分洗浄した後、４５℃で２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間の洗浄して、５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間の洗浄を二度繰り返す。より好ましいストリンジェントな条件は、より高い温度を使用することである。前記ストリンジェントな条件の他の部分は、同様に行なう終わりの二度の３０分は、６０℃で０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで洗浄する。また他のストリンジェントな条件は、前記ストリンジェントな条件で最後の二度を６５℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄することである。当業者なら必要なストリンジェントな条件を得るために、このような条件を明確に設定することができる。また、発現ベクターとしては、当業界に広く知られたグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌など、商業的に使用可能なベクターを使用することができ、スクリーニングのための薬剤耐性遺伝子を導入することが好ましい。アラザイム遺伝子にいかなる影響も与えないなら、どのようなベクターであってもかまわない。
【００２３】
前記製造方法において、工程２）の宿主細胞としては、細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などがあり、酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉａ）及びピシア（Ｐｈｉｃｉａ）からなる群から選択して使用することができるが、特別にこれに制限されるものではない。
【００２４】
前記製造方法において、工程３）の形質転換された宿主細胞の選別は、ベクターで導入した薬剤耐性遺伝子を使用したスクリーニングとサザンブロッティングまたは、ＰＣＲを使用したスクリーニングを併用して選別することが好ましい。
【００２５】
前記製造方法において、工程４）で得られたアラザイムは、タンパク質のどのような精製方法によって精製されたものであっても、実質的に精製されたタンパク質なら含まれる。このような精製されたタンパク質の例を挙げると、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外ろ過、塩析、溶媒沈澱、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析または再結晶などを適切に選択または組み合わせて実質的に精製されたタンパク質を例に挙げることができるが、このようなものに限定されるものではない。前記のようにＤＮＡからコードされるアラザイムは、当業者に広く知られたタンパク質発現系を使用して得ることができる。また、アラザイムを発現する細胞の培養物から回収・精製することができる。
【００２６】
本発明のアラザイムは、
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号：２で表わされる塩基配列のコード領域を含むＤＮＡによってコードされるタンパク質、
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列で一つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列で構成され、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質、及び
（ｄ）配列番号：２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるＤＮＡによってコードされるタンパク質であり、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質からなる群から選択されたいずれかひとつであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２７】
前記ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すると、相同性が高い塩基配列を有したＤＮＡが選別されて結果的に分離するタンパク質には、アラザイムと機能的に同一なタンパク質が含まれる可能性が高くなる。相同性が高い塩基配列というのは、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有した配列を意味する。また、アミノ酸配列は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の高い相同性の配列なら可能である。前記の相同性の割合は、当業界の当業者によって選択された普通のアルゴリズムで決定することができる。前記ハイブリダイゼーションは、当業界でよく知られたストリンジェントな条件（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｋ．）下のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで提供され、ハイブリダイゼーションでのストリンジェントな条件は、前記で言及したようにハイブリダイゼーション後の洗浄時に決定される。
【００２８】
本発明は、アラザイムを有効成分として含む癌予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００２９】
前記癌は、肺癌、乳癌、肝癌、胃癌、結腸癌、骨癌、膵臓癌、頭部癌、頚部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門付近癌、ファロピウス管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頚部癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫または中枢神経系腫瘍であることを特徴とする。
【００３０】
本発明者等は、前記アラザイムの抗癌効能を検定するために、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌード（Ｎｕｄｅ）マウスを対照群（アラザイム０ｍｇ／ｋｇ投与）、Ｔ１（アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ投与）、Ｔ２（アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ投与）及びＴ３（アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ投与）の４つのグループに分けて、アラザイムを反復経口投与した（表１参照）。アラザイムは、滅菌注射用水に溶解させて週６回経口投与用ゾンデ（ｚｏｎｄｅ）を使用して強制投与を実施した。アラザイム投与後、体重測定及び一般症状を観察し、腫瘍の発生程度を週１回ずつ観察して、その大きさを測定し、アラザイム投与１２週後に剖検を実施した。肉眼病理所見では、すべての臓器で特別な異常所見が観察されなかったし、顕微鏡観察においてもアラザイム投与による実質臓器の異常所見は、すべての個体で観察されなかった。体重は、アラザイムを３００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ２）及び６００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ３）投与したグループで増加した（表２及び図１参照）。ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌードマウスから採取した腫瘍組織の大きさ測定及びヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）で免疫組織化学的観察を実施した結果、３００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ２）及び６００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ３）のアラザイムを投与したグループで、アラザイムの濃度依存的に腫瘍発生抑制効果及び腫瘍細胞浸潤現象の減少が観察された（図２及び図３参照）。
【００３１】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）は、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）を分解する蛋白分解酵素であり（Ｍａｔｒｉｓａｎ ＬＭ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，１９９０年，第６巻，１２１−１２５頁）、ＭＭＰの生成が増加すると炎症とともに多くの種類の癌で浸潤度と転移が増加することが知られている（Ｓｔｅａｒｎｓ ＭＡ，等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９３年，第５３巻，８７８−８８３頁）。腫瘍の転移過程の中で血管基底膜の最も重要な構造物であるコラーゲンタイプ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ）ＩＶの分解が成り立って初めて体内血流への転移が可能で、このようなコラーゲンタイプＩＶの分解は、ＭＭＰの中で主にＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２によって行われる（Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ，等，Ｃｅｌｌ，１９９１年，第６４巻，３２７−３３６頁）。ＭＭＰはまた、新生血管形成において血管内皮細胞の移動と発芽に必要な物質として認識されている（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃ，等，Ｄｅｖｅｌ Ｂｉｏｌ，１９９４年，第１６２巻，４９９−５１０頁）。ＭＭＰの活性は、１）ＭＭＰ遺伝子の転写調節、２）前駆体の活性、３）脂質特異性の差、及び４）αマクログロブリン（α−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ）と組織マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＴＩＭＰｓ）のようなＭＭＰ抑制物質などによって調節される（Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ．Ｈ，Ｊ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ，１９９３年，第６４巻，４７４−４８４頁）。ＭＭＰ−９の発現を調節する上位信号伝達機序には、ミトゲン活性化プロテインキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；ＭＡＰＫ）を含む成長因子、サイトカイン、腫瘍促進因子などが関与する。この中で、ｐ３８キナーゼ及び細胞外部の信号によって調節されたタンパク質キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；ＥＲＫ）は、炎症サイトカインやアポトーシス関連信号及び成長因子等によって活性化される。活性化したＭＡＰＫは、核に移動してＭＭＰ始発体周辺の転写因子結合部と反応して多様な転写因子を活性化させることで、下位標的タンパク質の発現を調節する。大部分の癌は、癌細胞の基質浸湿、原発部位から血管系への移動、血管による二次病巣への移動、二次腫瘍の形成という過程を通じて、原発部位から二次病巣に転移される。癌細胞の基質浸湿には、蛋白分解酵素による細胞外基質の分解が要求されるが、ＭＭＰは、細胞外基質を分解する最も核心的な酵素である。多様なＭＭＰの中で、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９は、それぞれ７２及び９２ｋＤａのコラゲナーゼとして細胞の基底膜を形成するコラーゲンを分解して癌の浸湿と転移を促進する（Ｈｉｍｅｌｓｔｅｉｎ ＢＰ，等，Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１９９４年，第１４巻，２４６−２５８頁）。
【００３２】
本発明者等は、前記のようなヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌードマウスを使用して、アラザイムの投与によってＭＭＰ−９の発現が減少されることを確認することができた（図４及び図５参照）。これは、アラザイムの抗癌効能を示す。
【００３３】
核転写因子−カッパーＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−κＢ；ＮＦ−κＢ）は、多様な環境的刺激に対する反応で活性化される誘導転写因子である（Ｂａｅｕｅｒｌｅ，ＰＡ ａｎｄ Ｂａｉｃｈｗａｌ，ＶＲ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７年，第６５巻，１１１−１３７頁；Ａｕｐｈａｎ，Ｎ，等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５年，第２７０巻，２８６−２９０頁）。暫定的形態のＮＦ−κＢは、細胞質にある抑制タンパク質、Ｉ−κＢに結合されている。多様なＮＦ−κＢ活性因子、すなわち腫瘍壊死因子、ＩＬ−１、リポポリサッカライド及びＵＶ（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）などの刺激は、抑制タンパク質であるＩ−κＢのリン酸化反応及びユビキチンが標識される過程を通じて分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を誘導するようになる。このような過程は、Ｉ−κＢと分離したＮＦ−κＢを核に移動させて標的遺伝子のプロモーター部位にあるＮＦ−κＢ−結合位置（ＮＦ−κＢ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）との結合を可能にして、標的遺伝子の発現を促進させる（Ｂａｌｄｗｉｎ，ＡＳ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６年，第１４巻，６４９−６８３頁；Ｈｕｘｆｏｒｄ Ｔ，等，Ｃｅｌｌ，１９９８年，第９５巻，７５９−７７０頁）。ＮＦ−κＢは、薬物不応性のまた他の影響因子である。これは、サイトカイン合成の重要な調節因子であり、免疫反応や炎症反応に関与する多様な遺伝子の発現を増加させる転写因子で活性化になれば、核内に移動して炎症遺伝子の発現を増加させる。
【００３４】
本発明者等は、前記のようなヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌードマウスを使用して、アラザイムの投与によってＮＦ−κＢの発現が減少されたことを確認することができた（図６及び図７参照）。これは、アラザイムによる腫瘍細胞の減少を意味する。
【００３５】
ＰＣＮＡは、細胞周期中Ｇ０期（Ｇ０ ｐｈａｓｅ）には存在しないで、Ｇ１期（Ｇ１ ｐｈａｓｅ）の間に増加し始めて、Ｓ期（Ｓ ｐｈａｓｅ）で最も多く合成されて、Ｇ２期（Ｇ２ ｐｈａｓｅ）で減少する、３６ｋＤａの細胞内ＤＮＡポリメラーゼデルタ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｄｅｌｔａ）の補助的なタンパク質で、細胞のＤＮＡ合成と細胞の増殖に必須であることが知られている（Ｍｉｙａｇａｗａ Ｓ，等，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｍａｔｏｌ，１９８９年，第９３巻，６７８−６８１頁）。一般的に、ＰＣＮＡの組織免疫蛍光法は、腫瘍組織で成長に関与する部分がどの程度なのかを知る尺度として作用する。ＰＣＮＡ発現は、角質細胞の増殖状態、神経膠症、着色された皮膚病変、肺の非小細胞性癌の組織病理学的等級と関連あるといわれてきた（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ Ｃ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１９９２年，第１０３巻，２９３−２９８頁）。
【００３６】
本発明者等は、前記のようなヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌードマウスを使用して、アラザイムの投与によってＰＣＮＡの発現が減少することを確認することができ（図８及び図９参照）、これは腫瘍組織の成長が減少したことを意味する。
【００３７】
本発明者等は、前記アラザイムの抗癌効能を検定するために、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）にアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）を処理した後、腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるタンパク質の発現変化を観察した。前記のヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、ヒトの乳腺腫瘍細胞の中でエストロゲン受容体を有していない悪性乳癌細胞株である（Ｌｉｕ Ｙ，等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００６年，第３４４巻，１２６３−１２７０頁；Ｗｙａｔｔ ＣＡ，等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５年，第６５巻，１１１０１−１１１０８頁）。ｐ２１は、ＣＤＫ（Ｃｙｃｌｉｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅ）の阻害剤としてサイクリンＡ、Ｄ、Ｅなどの発現を調節することで腫瘍細胞の成長、分化に関与するタンパク質として知られている（Ｗｅｓｔｈｏｆ Ｇ，等，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２００６年，第２７巻，２５２−６０頁；Ｒａｙａｌａ ＳＫ，等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６年，第６６巻，５９８５−５９８８頁）。
【００３８】
本発明者等は、ヒト乳癌細胞に処理されたアラザイムによって、ｐ２１の発現が抑制されることを確認することができた。
【００３９】
ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ）細胞内信号伝達経路（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）に属するｐ３８は、ストレス関連メカニズムによって発現されるタンパク質で、乳癌細胞で細胞成長を促進させることが知られている（Ｌｏｗｅ ＬＣ，等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００５年，第３２９巻，７７２−７７９頁；Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｆ，等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４年，第２３巻，７０５３−７０６６頁）。
【００４０】
本発明者等は、ヒト乳癌細胞に処理されたアラザイムによって、ｐ３８の発現が抑制されることを確認することができた。
【００４１】
プロテインキナーゼは、細胞成長／分化／遺伝子発現に関与して、ＰＫＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）は、悪性腫瘍で上向き調節される（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｆ，等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４年，第２３巻，７０５３−７０６６頁；Ｒｉｂｅｉｒｏ−Ｓｉｌｖａ Ａ，等，Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２００６年，第２１巻，３７３−３８２頁；Ｔａｎ Ｍ，等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００６年，第２５巻，３２８６−３２９５頁）。
【００４２】
本発明者等は、ヒト乳癌細胞に処理されたアラザイムによって、ＰＫＣが下向き調節されることを確認することで、腫瘍細胞の増殖抑制に影響を与えることが分かる。
【００４３】
本発明者等は、ヒト乳癌細胞に処理されたアラザイムによって、腫瘍細胞の増殖の標識マーカータンパク質であるＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）（Ｋｕｍａｒａｇｕｒｕｐａｒａｎ Ｒ，等，Ｒｅｓ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．２００６年，第８１巻，２１８−２２４頁；Ｌｙｚｏｇｕｂｏｖ Ｖ，等，Ｅｘｐ Ｏｎｃｏｌ．２００５年，第２７巻，１４１−１４４頁）、腫瘍の血管新生のマーカーとして知られたＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｋｏｕ Ｂ，等，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ．２００５年，第１５巻，２３９−２４７頁）、腫瘍の浸湿と転移に関与するＭＭＰ−１（Ｍａｔｒｉｘ ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）（Ｚｈａｎｇ Ｃ，等，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００６年，第１３巻，９４７−９５５；Ｗｙａｔｔ ＣＡ，等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５年，第６５巻，１１１０１−１１１０８頁）及びＢＣｌ２（Ｂ−ｃｅｌｌ ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ２）（Ｋｕｍａｒａｇｕｒｕｐａｒａｎ Ｒ，等，Ｒｅｓ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．２００６年，第８１巻，２１８−２２４頁；Ｅｍｉ Ｍ，等，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５年，第７巻，Ｒ９４０−Ｒ９５２頁；Ｓｉｒｖｅｎｔ ＪＪ，等，Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２００４年，第１９巻，７５９−７７０頁）のタンパク質発現が、アラザイムを処理しない対照群に比べて有意に抑制されることを確認した。
【００４４】
腫瘍の発生において腫瘍細胞が産生するＲＯＳ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ）は、腫瘍細胞の増殖に重要であることが知られている（Ｔａｓ Ｆ，等，Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ．２００５年，第２２巻，１１−１５頁）。カタラーゼは、過酸化水素のようなＲＯＳを除去することで、腫瘍発生を抑制する役割をする（Ｔａｓ Ｆ，等，Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ．２００５年，第２２巻，１１−１５頁；Ｏｚｋａｎ Ａ，等，Ｅｘｐ Ｏｎｃｏｌ．２００６年，第２８巻，８６−８８頁）。
【００４５】
本発明者等は、カタラーゼの発現がヒト乳癌細胞でアラザイムの処理によって上向き調節されることが観察されることで、アラザイムの作用は、腫瘍細胞の成長と増殖そして分化を抑制するだけでなく、悪性腫瘍において腫瘍の転移に関与するＭＭＰ及びＰＫＣを抑制することで、腫瘍細胞の転移抑制効能を示す。
【００４６】
本発明者等は、アラザイムをメスのウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットに経口投与して毒性実験を遂行した結果、０、１２５０、２５００及び５０００ｍｇ／ｋｇ濃度で一般症状と肉眼病理所見において何らの異常所見が現われなかった。以上のように経口投与毒性試験による５０％致死量（ＬＤ５０）は、少なくとも ５，０００ｍｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断される。ゆえに、本発明のアラザイムは、乳癌予防及び治療用組成物に有用に使用することができる。
【００４７】
本発明のアラザイムに、追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。投与のためには、追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的で許容可能な担体には、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、散剤、錠剤、カプセル剤、丸薬、顆粒または注射液剤に製剤化できる。さらに当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０年）に開示されている方法を使用して、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００４８】
本発明の癌予防及び治療用薬学的組成物は、目的とする方法によって、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）したり経口投与したりすることができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明によるアラザイムの一日投与量は、０．０１〜５０００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回ないし数回に分けて投与することがより好ましい。
【００４９】
また、本発明は、薬学的に有効な量のアラザイムを癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。
【００５０】
また、本発明は、薬学的に有効な量のアラザイムを癌にかかった個体に投与する工程を含む癌予防方法を提供する。
【００５１】
また、本発明は、アラザイムを癌予防及び治療剤の製造に使用する用途を提供する。
【００５２】
本発明のアラザイムは、上述したように、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌードマウス及び乳癌細胞で実験した結果、腫瘍細胞成長、増殖または分化に係わるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９、ＮＦ−κＢ、ｐ２１、ＰＣＮＡ、ＶＥＧＦ、ＢＣｌ２、ｐ−ｐ３８及びＰＫＣの発現を阻害して、腫瘍発生を抑制するカタラーゼの発現を促進するので、癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法または予防方法、または、癌予防及び治療剤の製造に使用することができる。
【００５３】
同時に、本発明は、アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを有効成分として含む癌予防用健康食品を提供する。
【００５４】
本発明のアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを食品添加物に使用する場合、アラニコラプロテオチリクスの培養液または前記のアラザイムをそのまま添加したり他の食品または食品成分とともに使用したりすることができ、通常的な方法によって適切に使用することができる。アラザイムは、前記のような同一方法で得て使用する。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって相応しく決定することができる。一般的に、食品または飲料の製造時には、本発明のアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムは、原料に対して０．０１〜１０重量部、好ましくは０．０５〜１重量部の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的にしたりまたは健康調節を目的にしたりする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲の以下であり得るが、安全性の面で何らの問題がないので、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。
【００５５】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常的な意味での健康食品を全て含む。
【００５６】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料と同様に様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物はブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、サイクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の飲料組成物１００ｍｌ当り一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【００５７】
前記の外にアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムは、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などに添加することができる。その他に天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉にも、アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを添加することができる。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明のアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム１００重量部当り０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００５８】
以下、本発明を実施例、実験例及び製剤例によって詳細に説明する。但し、下記の実施例、実験例及び製剤例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が、下記の実施例、実験例及び製剤例に限定されるものではない。
【００５９】
＜実施例１＞アラザイム（ａｒａｚｙｍｅ）の製造
本発明の有効成分であるアラザイムを製造するために、アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３菌株（ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）を培養培地（バクトトリップトン０．５％、酵母抽出物０．５％、塩化ナトリウム０．１％、塩化カリウム０．０５％、塩化カルシウム０．０２％、硫酸マグネシウム０．０２％）で、２２℃で１８時間培養した。培養液を２μｍ膜ろ過（２μｍフィルター，Ｓａｔｏｒｉｕｓ，米国）を使用して菌体と上澄み液を分離した後、分離した上澄み液を１０ｋＤａの膜ろ過（１０ｋＤａ膜フィルター，Ｐａｌｌ ｓｅｐｔ，ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国）を使用して濃縮した。本発明のアラザイムは、基本的に陰イオンの特性を有するので、濃縮液を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で前処理したＤＥＡＥセルローズ（ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，Ｓｉｇｍａ，米国）を使用したイオン交換樹脂（ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎ，Ｓｉｇｍａ，米国）と２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で前処理したセファデックスＧ−７５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５，Ｓｉｇｍａ，米国）を使用したゲルろ過交換樹脂を使用して精製した。精製された酵素液は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電気泳動をしてバンド傾向を確認したが、その結果、本発明のアラザイムは、小単位を持たないモノマーであり、約５１．５ｋＤａの分子量を有するバンドを示すことを確認した。ただ、アラザイム生産のためのアラニコラプロテオチリクスＨＹ−３菌株（ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）は、多様な産業用培地で生産が可能で、生産された培養液も多様な方法で分離及び精製して使用することができる。本発明のアラザイムは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされる塩基配列を有する。
【００６０】
＜実施例２＞マウス試験群の構成及び投与
本発明では、ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌｊＢｇｉ系統の５週齢特定病原体不在（ＳＰＦ）ヌード（Ｎｕｄｅ）マウス（オリエント、韓国）平均体重１５ｇの個体を使用した。マウスは、入手後、動物室で約７日間検疫及び順化させ、順化期間中に一般症状を観察して健康な動物のみを選抜して試験に使用した。本発明で使用されたマウスの場合、温度２２±３℃、相対湿度５０±１０％、照明時間１２時間（０８：００点灯〜２０：００消灯）に設定された自動温湿度調節装置を設置した動物室で順化及び飼育した。環境条件は、定期的（３ヶ月に１回）に測定した。環境測定の結果、試験に影響を及ぼすと思われる変動は認められなかった。全試験期間ポリカーボネート製飼育箱［２４０Ｗ×３９０Ｌ×１７５Ｈ（ｍｍ）］に５匹以下ずつ収容した。個別識別は、油性マジックペンを使用した皮膚標識法と飼育箱別個体識別カード表示法を使用した。飼料は、実験動物用固形飼料（ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，５０５ Ｎｏｒｔｈ ４ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ｉｎ ４７３７４，米国）を放射線照射（１３．２ｋＧｙ）滅菌して自由摂取させた。水はカーボンフィルターを通じて浄化した上水道水を水差しを使用して自由摂取させた。
【００６１】
一週間の順化期間が経過した後、ヒト肺癌細胞であるＡ５４９細胞株を１×１０７細胞でマウスの左側わき皮下に移植して癌を誘発させ、同時に４つのグループ（対照群、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及び表１）に分離した後、１２週間アラザイムを０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１５０ｍｇ／ｋｇ（Ｔ１）、３００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ２）及び６００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ３）の濃度で週６回、ゾンデを使用して経口投与した。全実験期間中に体重測定及び一般症状観察を実施して１２週後に剖検を実施した。
【００６２】
実験群の構成は、下記の表１のとおりである。
【００６３】
（表１）実験群の構成
【００６４】
＜実施例３＞細胞培養
本発明では、エストロゲン受容体に陰性であるヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＴＢ−２６）を使用し、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，米国）から分譲を受けて使用した。
【００６５】
＜３−１＞細胞培養条件
本試験に使用されたヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、１０％ＦＢＳと１％アンピシリンを含有したＤＭＥＭ培地を使用して３７℃、５％ＣＯ２培養器で２〜３日ごとに継代しながら培養した。また、細胞培養用ディッシュは、全て滅菌された製品を使用した。
【００６６】
＜３−２＞アラザイムの処理
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、６ウェルにそれぞれ６×１０５細胞／ウェルの細胞を接種した後、３７℃の培養器で一晩培養し、試験物質処理前４時間の間１％ＦＢＳが含まれた栄養欠乏（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）培地に交替して培養することで、細胞周期停止（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ）を誘導した。アラザイムを注射用滅菌注射用水に希釈した後、６０μｇ／ｍｌの濃度に調剤して適用した後、再び２４時間３７℃の培養器で培養した。
【００６７】
＜実験例１＞アラザイム投与が体重変化に及ぼす影響の調査
前記＜実施例２＞と同様にヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）をヌードマウスに移植した後、１週間に一回ずつ体重を測定することで、体重変化を観察して動物の一般症状を観察した。
【００６８】
全実験期間（１２週）を経てアラザイム投与群は、体重が増加する様相を示したが、この中で特に３００ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｔ２）及び６００ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｔ３）で体重の増加が顕著だった（表２及び図１）。
【００６９】
（表２）マウスの体重
対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ経口投与、
Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ経口投与、
Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ経口投与、
Ｔ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ経口投与。
【００７０】
＜実験例２＞アラザイム投与が腫瘍成長に及ぼす影響の調査
ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）をヌードマウスに移植した後、５週目から肉眼的に腫瘍大きさを確認することができ、以後８週間、一週間に一度ずつカリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）を使用してそれぞれのマウスの腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の体積は、腫瘍の長径と短径を測定して下記の式１で計算した。
＜式１＞
腫瘍の体積（ｍｍ３）＝（長径×短径２）／２
【００７１】
測定した結果の全実験期間アラザイムを３００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ２）及び６００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ３）投与した群で、対照群に比べて腫瘍の大きさが減少し、統計学的有意性が観察された（図２）。
【００７２】
＜実験例３＞アラザイム投与が肺癌組織に及ぼす影響の調査
ヌードマウスにヒト肺癌細胞株を移植した１２週後にエチルエーテルで麻酔して屠殺して、腫瘍及び実質臓器を採取した。採取した腫瘍組織の重さを測定し、心臓、肝臓、肺、膵臓、腎臓、脾臓などの臓器を採取した。採取した腫瘍と臓器は、１０％中性ホルマリンに２４時間固定させた後、自動組織処理装置で組織処理を遂行した。組織処理過程を経た腫瘍と臓器は、パラフィン包埋後４μｍの厚さに薄切りしてヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を実施して光学顕微鏡で観察した。
【００７３】
その結果、アラザイム投与群は、対照群に比べて腫瘍細胞浸潤が弱く進行されていた（図３）。
【００７４】
＜実験例４＞アラザイム投与がＭＭＰ−９の発現に及ぼす影響の調査
ＭＭＰ−９の免疫組織化学的観察のために、ホルマリンに固定した後、製作されたパラフィン包埋組織を４μｍの厚さに薄切りして脱パラフィンした後、内因性過酸化酵素の活性を抑制させるために、３％Ｈ２Ｏ２に３０分間処理して、０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、組織の抗原発現を増加させるために０．０１Ｍのクエン酸塩緩衝液で処理して、マイクロ波で高熱処理した。非特異的反応を抑制するために、２０ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３７℃で１０分間処理した後、リン酸緩衝食塩水で洗浄後、１時間ブロッキングさせた。その後、抗ウサギ１次抗体であるＭＭＰ−９（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ，米国）を４℃で一晩の間処理した後、ＰＢＳ緩衝液で５分間３回洗浄してビオチンと結合させた。ビオチンと結合された１次抗体を緩衝液で洗浄した後、ストレプトアビジンに接合されたＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ−Ｒｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を付着させて、Ｈｉｓｔｏｓｔａｎｔｉｎ−ｐｌｕｓ ｂｕｌｋ ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，米国）で３７℃で３０分間反応させて充分に洗浄した後、３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｅｄ；ＤＡＢ、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，米国）溶液で発色させて蒸留水で洗浄した後、Ｍｅｙｅｒ’ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，米国）で対照染色を実施して光学顕微鏡で観察した。
【００７５】
その結果、アラザイム投与群は、対照群に比べてＭＭＰ−９の発現様相が減少した（図４及び図５）。
【００７６】
ＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）生成の増加時、炎症とともに多くの種類の癌において浸潤度と転移が増加することが知られている。また、これは多くのＭＭＰのうち、主にＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２によってなされる。特に、ＭＭＰ−９の発現を調節する上位信号伝達機序には、ＭＡＰＫを含む成長因子、サイトカイン、腫瘍促進因子などが関与する。ＭＭＰ−９の発現様相の減少は、癌の浸潤と転移が抑制されていることを意味する。
【００７７】
＜実験例５＞アラザイム投与がＮＦ−κＢの発現に及ぼす影響の調査
ＮＦ−κＢの免疫組織化学的観察のために、前記実験例４と同じ過程を遂行して、１次抗体は、ＭＭＰ−９の代りに抗ウサギ１次抗体であるＮＦ−κＢ（１：２００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国）を使用した。
【００７８】
その結果、アラザイム投与群は、対照群に比べてＮＦ−κＢの発現様相が減少した（図６及び図７）。
【００７９】
ＮＦ−κＢは、多様な環境的因子に対する反応で活性化する誘導転写因子である。また、薬物不応性のまた他の影響因子でもある。これは、サイトカイン合成の重要な因子であり、免疫反応や炎症反応に関与する多様な遺伝子の発現を増加させる転写因子で、活性化すると核内に移動して炎症遺伝子の発現を増加させる。ＮＦ−κＢの発現減少は、癌が抑制されていることを意味する。
【００８０】
＜実験例６＞アラザイム投与がＰＣＮＡの発現に及ぼす影響の調査
ＰＣＮＡの免疫組織化学的観察のために、前記実験例４と同じ過程を遂行し、１次抗体は、ＭＭＰ−９の代りに抗マウス１次抗体であるＰＣＮＡ（１：８００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ，米国）を使用した。
【００８１】
その結果、アラザイム投与群は、対照群に比べてＰＣＮＡの発現様相が減少した（図８及び図９）。
【００８２】
ＰＣＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼデルタの補助的なタンパク質で、ＰＣＮＡの発現は、角質細胞の増殖状態、神経膠症、着色された皮膚病変、肺の非小細胞性癌の組織病理学的等級と関連があることが知られているので、ＰＣＮＡの組織免疫蛍光法は、腫瘍組織での成長に関与する部分がどの程度なのかを知る尺度として作用する。ＰＣＮＡの発現の減少は、腫瘍組織の成長が抑制されていることを意味する。
【００８３】
＜実験例７＞アラザイム投与がヒト乳癌細胞のタンパク質発現に及ぼす影響の調査
前記＜実施例３＞と同様にアラザイムを処理したヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において、腫瘍発生と関連あるタンパク質の発現様相を観察するために免疫ブロッティングを実施した。０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）と蛋白質分解酵素抑制剤カクテルタブレット（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔ，Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を溶解させたＲＩＰＡ緩衝液にアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）を処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を融解させた後、１４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して上澄み液を取得した。取得された細胞質タンパク質試料をブラッドフォード方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ＭＭ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７７年，第７２巻，２４８−２５４頁）にしたがってタンパク質濃度を測定した後、それぞれのタンパク質試料を８０ｇ／ウェルで８〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用して電気泳動を遂行した。電気泳動されたゲル内のタンパク質をＰＶＤＦ膜（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ）に電気移動（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）を遂行した。同じ量のタンパク質がローディングされたものをクマシブルー染色を通じて確認した。３％牛血清アルブミンをリン酸緩衝食塩水に溶解させたブロッキング溶液に１時間ブロッキング後、１次抗体であるｐ−２１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国）、β−アクチン（１：５００ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国）に反応させた。０．５％ツイーン２００が溶解されたＴＢＳ緩衝液で充分に洗浄して、１次抗体に対応する２次抗体である抗ヤギＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国）を１：１，０００〜１：２，０００の割合に希釈して室温で１時間反応させた。また、ＴＢＳ緩衝液で充分に洗浄後、特異的な反応を観察するために化学発光基質（Ｓｕｐｅｒ ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＰＩＥＲＣＥ，米国）と反応させて医学用Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ，日本）に露出させた。ｐ−２１以外の１次抗体では、ｐ−ｐ３８、ＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＢＣｌ２、ＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １）及びカタラーゼを使用し、前記抗体の製造社は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国である。前記の１次抗体に該当する各々の２次抗体を使用して、前記のような方法で遂行した。ｐ−ｐ３８に対応する２次抗体は、抗ウサギＨＲＰ抗体、ＰＣＮＡに対応する２次抗体は、抗ヤギＨＲＰ抗体、ＶＥＧＦに対応する２次抗体は、抗ヤギＨＲＰ抗体、ＢＣｌ２に対応する２次抗体は、抗ウサギＨＲＰ抗体、ＭＭＰ−１に対応する２次抗体は、抗マウスＨＲＰ抗体、カタラーゼに対応する２次抗体は、抗ヤギＨＲＰ抗体にし、前記２次抗体の製造社は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国である。
【００８４】
その結果、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）にアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）の適用は、ｐ２１、ＰＣＮＡ、ＶＥＧＦ及びＢＣｌ２の顕著な抑制効能を示した。また、アラザイムを処理しない対照群に比べて、ｐ−ｐ３８、ＰＫＣ及びＭＭＰ−１の発現が減少したことが観察された。カタラーゼにおいては、アラザイム処理群で発現量が増加したことを観察することができた（図１）。
【００８５】
また、前記の結果を基にして、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）にアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）を処理した後、腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるタンパク質の発現変化程度を相対的割合で示し（図２）、結果は図１のとおりである。
【００８６】
＜実験例８＞アラザイムの急性毒性実験
本発明のアラザイムに対する急性毒性を調べるために、下記のような実験を遂行した。
【００８７】
ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）系統の９週齢特定病原体不在（ＳＰＦ）メスのラット（オリエント、韓国）に対して、それぞれ４匹ずつ４群に分けて、温度２２±３℃、湿度５５±１０％、照明１２Ｌ／１２Ｄ条件の動物室内で飼育した。ラット入手後、動物室で１週間検疫及び順化過程を経た。全試験期間の間、ポリカーボネート製飼育箱［２４０Ｗ×３９０Ｌ×１７５Ｈ（ｍｍ）］で５匹以下ずつ収容した。個体識別は、油性マジックペンを使用した皮膚標識法と飼育箱別個体識別カード表示法を使用した。実験動物用固形飼料（ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，米国）は滅菌し、水は上水道水を水差しを使用して自由に摂取させた。
【００８８】
前記実施例のアラザイムを０、１２５０、２５００及び５０００ｍｇ／ｋｇの濃度で注射用滅菌注射用水に溶解して、１０ｍｌ／ｋｇの用量に調剤してラットに経口投与用ゾンデを使用して単回経口投与した。一週間の順化期間を経て、４つのグループに分離した後、１０週齢のラットにアラザイムを濃度別に投与した後、一般症状観察を実施した後、アラザイムの実質臓器に対する実質毒性を評価するために２４時間後に剖検を実施した。
【００８９】
メスのラットにアラザイムを経口投与した後、試験物質投与による一般症状を正確に観察して毒性を評価するために、動物の行動、外観、機能に対する観察を実施した。
【００９０】
実験の結果、アラザイム投与後の動物の活動性、歩行、気質、ひきつけなどにいては何らの異常症状が観察されず、被毛状態、眼球周辺、耳、生殖器、四肢状態、尾状態などの動物の外観観察及び呼吸状態、唾液分泌、糞便、嘔吐などの機能観察でも何らの異常症状が観察されなかった。アラザイム投与後２４時間に、剖検を実施した。肉眼剖検所見でも、全臓器でアラザイム投与による何らの異常も観察されなかった。アラザイム致死量（ＬＤ５０）は、５０００ｍｇ／ｋｇ以上の高濃度であると判断される。顕微鏡学的観察において、肝、心臓、肺、すい臓などの実質臓器では、何らの病理学的異常所見が観察されなかった。
【００９１】
下記に本発明の組成物のための製剤例を例示する。
【００９２】
＜製剤例１＞薬学的製剤の製造
＜１−１＞散剤の製造
アラザイム ２ｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合した後、気密包に充填して散剤を製造した。
【００９３】
＜１−２＞錠剤の製造
アラザイム １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【００９４】
＜１−３＞カプセル剤の製造
アラザイム １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００９５】
＜１−４＞丸薬の製造
アラザイム １ｇ
乳糖 １．５ｇ
グリセリン １ｇ
キシリトール ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法によって１丸薬当り４ｇになるように製造した。
【００９６】
＜１−５＞顆粒の製造
アラザイム １５０ｍｇ
大豆抽出物 ５０ｍｇ
ブドウ糖 ２００ｍｇ
澱粉 ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％エチルアルコール１００ｍｇを添加して、摂氏６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、包に充填した。
【００９７】
＜１−６＞注射液剤の製造
アラザイム １０μｇ／ｍｌ
薄い塩酸ＢＰ ｐＨ７．６になるまで
注射用塩化ナトリウムＢＰ 最大１ｍｌ
適当な容積の注射用塩化ナトリウムＢＰの中にアラザイムを溶解させて、生成された溶液のｐＨを薄い塩酸ＢＰを使用してｐＨ７．６に調節して、注射用塩化ナトリウムＢＰを使用して容積を調節して充分に混合した。溶液を透明ガラスの５ｍｌタイプＩアンプル中に充填させて、ガラスを溶解させることで入口を封入して、１２０℃で１５分以上オートクレーブさせて殺菌して注射液剤を製造した。
【００９８】
＜製剤例２＞食品の製造
前記製剤例１の散剤、錠剤、カプセル剤、丸薬及び顆粒を食品に応用しても良く、前記のアラニコラプロテオチリクスの培養液、またはそれから分離したアラザイムを含む食品を下記のように製造した。
【００９９】
＜２−１＞小麦粉食品の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１〜１０．０重量部を小麦粉に添加して、この混合物を使用して通常の方法でパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して、健康増進用食品を製造した。
【０１００】
＜２−２＞スープ及び肉汁（ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１〜１．０重量部をスープ及び肉汁に添加して、通常の方法で健康増進用肉加工製品、麺類のスープ及び肉汁を製造した。
【０１０１】
＜２−３＞グランドビーフの製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム１０重量部をグラウンドビーフに添加して、通常の方法で健康増進用グラウンドビーフを製造した。
【０１０２】
＜２−４＞乳製品の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１〜１．０重量部を牛乳に添加して、前記牛乳を使用して通常の方法で、バター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【０１０３】
＜２−５＞禅食（Ｓｕｎ−Ｓｉｋ）の製造
玄米、麦、もち米、鳩麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【０１０４】
黒豆、黒ごま、えごまも公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【０１０５】
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを真空濃縮機で減圧、濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を粉砕機で粒度６０メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。
【０１０６】
前記で製造した穀物類、種実類及びアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムの乾燥粉末を、次の割合で配合して通常の方法で製造した。
穀物類（玄米３０重量部、鳩麦１５重量部、麦２０重量部）、
種実類（えごま７重量部、黒豆８重量部、黒ごま７重量部）、
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムの乾燥粉末（１重量部）、
霊芝（０．５重量部）、
地黄（０．５重量部）。
【０１０７】
＜製剤例３＞飲料の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを含む飲料を次のように製造した。
【０１０８】
＜３−１＞健康飲料の製造
液状果糖（０．５％）、オリゴ糖（２％）、砂糖（２％）、食塩（０．５％）、水（７５％）のような副材料とアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを均質に配合して瞬間殺菌をした後、これをガラス瓶、ペット瓶など小包装容器に包装して健康飲料を製造した。
【０１０９】
＜３−２＞野菜ジュースの製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．５ｇをトマトまたはにんじんなどの野菜のジュース１，０００ｍｌに加えて、通常の方法で健康増進用野菜ジュースを製造した。
【０１１０】
＜３−３＞果物ジュースの製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１ｇをリンゴまたはブドウなどの果物のジュース１，０００ｍｌに加えて、通常の方法で健康増進用果物ジュースを製造した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アラザイム（ａｒａｚｙｍｅ）を有効成分とする癌予防及び治療用組成物に関するもので、より詳細には、アラニコラプロテオチリクス（Ａｒａｎｉｃｏｌａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）が生産するアラザイムを含む癌予防及び治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は、非正常的で非制御性かつ無秩序な細胞増殖の産物である。このような腫瘍が、破壊的な成長性、浸湿性及び転移性を有する場合は、悪性に分類される。浸湿性というのは、周囲組織を浸潤または破壊する性質で、一般的に組織の境界をなす基底層を破壊して腫瘍が局所的に伝播されることを意味して、たびたび体内の循環系にも流入する。転移というのは、一般的にリンパ管または血管によって、原発位置とは異なる所に腫瘍細胞が広がることを意味する。転移はまた、腸液性体腔または他の空間を通じて直接伸長して腫瘍細胞を移動させることを意味したりする。
【０００３】
癌の発病には、遺伝的素因も深く関与するが、環境的要因も大きな影響を及ぼし、先進国であればあるほど癌の発病が増加する傾向を示している。これに関する可能な原因としては、農薬、殺虫剤などの使用量及び食品内の残留量の増加、食品保存剤、防腐剤、着色剤などが添加された加工食品の消費増加、水質、土壌、大気汚染の増加、現代人のストレス増加、活動量の減少、そして豊かな食生活による肥満などが報告されている（Ｋｉｍ ＨＪ，等，Ｌｉｖ Ｓｃｉ ｏｆ Ｔｊ Ｕｎｉｖ．，１９９７年，第３巻，９９−１３０頁（非特許文献１）；Ｊａｃｏｂｓ ＭＭ，Ｎｕｔｒ Ｔｏｄ，１９９３年，第２８（３）巻，１９−２３頁（非特許文献２））。
【０００４】
腫瘍が成長と転移をするためには、新生血管形成が必須過程である（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，１９９０年，第８２巻，４−６頁（非特許文献３））。新生血管形成は、増殖する腫瘍に栄養分と酸素を供給するだけではなく、原発病場所から血管壁を通じた腫瘍細胞の貫通と遠隔臓器への転移を可能にする（Ｋｉｍ ＫＪ，等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３年，第３６２巻，８４１−８４４頁（非特許文献４））。
【０００５】
現在、癌は主に３種の治療法、すなわち外科的な手術、放射線照射及び化学療法の中で１種またはこれらの組み合わせによって治療されている。手術は、疾病組織を大部分除去することを含む。このような外科的手術は、特定部位、例えば乳房、結腸および皮膚に位置した腫瘍を除去するには効果的であるが、脊椎のような一部区域にある腫瘍を治療したり、白血病のような分散性腫瘍疾患を治療したりするのには、使用することができない。
【０００６】
化学療法は、細胞複製または細胞代謝を崩壊させて、乳房、肺及び精巣の癌を治療するのに多く使用されるが、腫瘍疾病を治療するのに使用される全身性化学療法の副作用は、癌治療を受ける患者たちにとって最も問題になる。このような副作用の中で、吐き気と嘔吐は、最も一般的で深刻な副作用である。化学療法による副作用は、患者の生命に大きな影響を及ぼし、治療に対する患者の順応性を急激に変化させ得る。また、化学治療剤と係わる副作用には、一般的にこのような薬物の投与時に注意しなければならない用量制限毒性（ＤＬＴ）がある。例えば、粘膜炎は、多くの抗癌剤、例えば抗代謝物質細胞毒素体である５−フルオロウラシル、メトトレキセート及び抗腫瘍抗生剤（例、ドキソルビシン）などに対する用量制限毒性である。このような化学療法由来の副作用の中で大部分は、ひどい場合には、入院を要したり痛症を治療するために痛み止めを必要としたりする。このように化学治療剤及び放射線治療による副作用は、癌患者の臨床的処置時の主な問題となっている。また、従来の抗癌剤は、正常細胞まで殺傷する場合が多いため、最近では正常細胞には作用しないで癌細胞にのみ作用することができる新しい機序の抗癌剤に対する研究が進められている。
【０００７】
一方、本発明者等は、新しいタンパク質分解酵素を開発しようと努力した結果、韓国産ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ）から新規微生物であるアラニコラプロテオチリクス（Ａｒａｎｉｃｏｌａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＨＹ−３菌株（受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ；ＷＯ０１／５７２２２号（特許文献１））を分離し、本菌株から新規なタンパク質分解酵素であるアラザイムを分離した。アラザイムは、低温と高い塩濃度で安定したタンパク質分解活性を示すのみならず、人の体温である３７℃で最も高い活性を示し、広いｐＨ範囲でも安定した活性を示すことを発見して、本タンパク質分解酵素の遺伝子を確認した（ＷＯ０１／５７２２２号（特許文献１））。
【０００８】
本発明者等は、アラニコラプロテオチリクス菌株に由来したアラザイムの効果を調査した結果、アラザイムは、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌード（Ｎｕｄｅ）マウスにおいて、体重の増加と腫瘍細胞抑制作用を起こし、ＭＭＰ−９、ＮＦ−κＢ及びＰＣＮＡの発現様相を減少させ、またヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）で、ｐ２１、ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＢＣｌ２（Ｂ−ｃｅｌｌ ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ ２）、ｐ−ｐ３８、ＰＫＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）及びＭＭＰ−１（Ｍａｔｒｉｘ ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）の発現は、減少させて、カタラーゼの発現は、増加させることを確認して、癌予防及び治療用組成物として有用に使用できることを明らかにして本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ０１／５７２２２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｉｍ ＨＪ，等，Ｌｉｖ Ｓｃｉ ｏｆ Ｔｊ Ｕｎｉｖ．，１９９７年，第３巻，９９−１３０頁
【非特許文献２】Ｊａｃｏｂｓ ＭＭ，Ｎｕｔｒ Ｔｏｄ，１９９３年，第２８（３）巻，１９−２３頁
【非特許文献３】Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，１９９０年，第８２巻，４−６頁
【非特許文献４】Ｋｉｍ ＫＪ，等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３年，第３６２巻，８４１−８４４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、アラニコラプロテオチリクスが生産するアラザイムを有効成分とする癌予防及び治療用組成物、及びこれを使用した予防及び治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、アラザイムを有効成分として含む癌予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを有効成分として含む癌予防及び改善用健康食品を提供する。
【００１４】
また、本発明は、薬学的に有効量のアラザイムを癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、薬学的に有効量のアラザイムを癌にかかった個体に投与する工程を含む癌予防方法を提供する。
【００１６】
同時に、本発明は、アラザイムを癌予防及び治療剤の製造に使用する用途を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のアラニコラプロテオチリクスが生産するアラザイムは、腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるＭＭＰ−９、ＮＦ−κＢ、ｐ２１、ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＢＣｌ２（Ｂ−ｃｅｌｌ ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ ２）、ｐ−ｐ３８、ＰＫＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）及びＭＭＰ−１（Ｍａｔｒｉｘ ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）の発現を減少させて、腫瘍発生を抑制する役割をするカタラーゼの発現を増加させることにより、癌予防及び治療用組成物として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、体重の変化を示したグラフである： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図２】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、腫瘍の大きさを示したグラフである： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；＊：ｐ＜０．０５；及び＊＊：ｐ＜０．０１。
【図３】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後の組織学的写真である（１３倍率及び３３倍率）： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図４】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＭＭＰ−９の免疫組織学的写真である（３３倍率及び６６倍率）： 対照群：アラザイム ０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム １５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム ３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム ６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図５】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＭＭＰ−９の免疫組織化学的発現程度を示したグラフである： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図６】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＮＦ−κＢの免疫組織学的写真である（３３倍率及び６６倍率）： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図７】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＮＦ−κＢの免疫組織化学的発現程度を示したグラフである： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図８】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＰＣＮＡの免疫組織学的写真である（６６倍率及び１３２倍率）： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図９】ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）が移植されたヌードマウスにアラザイムを投与した後、ＰＣＮＡの免疫組織化学的発現程度を示したグラフである： 対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与；Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ、経口投与；及びＴ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ、経口投与。
【図１０】ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）でアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）処理による腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるタンパク質の発現変化を観察した免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）結果を示した図である。
【図１１】ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）でアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）処理による腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるタンパク質の発現変化程度を相対的割合で示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２０】
本発明のアラザイムは、下記の方法で製造することができる：
１）アラニコラプロテオチリクス菌株を培養して培養液を得る工程；
２）前記培養液をろ過して上澄み液を得る工程；及び
３）上澄み液内に含まれた前記アラザイムを樹脂を使用して精製する工程。前記製造方法において、アラザイムを生産する微生物として、アラニコラプロテオチリクス菌株を使用するのが好ましく、韓国生命工学研究院遺伝子銀行に１９９６年７月２９日付けで寄託された受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ号のアラニコラプロテオチリクスＨＹ−３を使用することがより好ましいが、これに限定されるものではない。アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３菌株は、ジョロウグモの腸内から分離した好気性のグラム陰性細菌であり、０．５〜０．８ｍｍの大きさの球形で運動性を有していて、カタラーゼには陽性反応を、オキシダーゼには、陰性反応を示す（ＷＯ０１／５７２２２号）。
【００２１】
本発明では、前記のような方法で得られたアラザイムを使用することが好ましく、下記のような方法で生産されたアラザイムを使用することがさらに好ましい。アラニコラプロテオチリクス菌株の培養のために使用する原料は、純粋精製時に簡便で高純度の結果物が得られ得る医薬品水準の物が好ましく、培養後、アンモニウムスルファート沈澱（またはアセトン沈澱）を遂行する。このようなアンモニウムスルファートまたはアセトン沈澱後、遠心分離及びろ過を通じてアラザイムのみを回収する。これは、微生物で生産される他の大部分のタンパク質は、アラザイムと沈澱濃度が異なることを利用したものである。アラザイムを回収した後、膜ろ過を使用した１次不純物の精製及び限外ろ過器を使用して最後に純粋分離精製する。このようにして得られた溶液状態の高濃度アラザイムを凍結乾燥器でパウダータイプに製造したものを使用する。
【００２２】
また、本発明は、下記のような方法でアラザイムを製造することができる：
１）アラザイムのコード領域を含む塩基配列のＤＮＡを発現ベクターにクローニングする工程、
２）前記工程１）でクローニングされた発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、
３）前記工程２）で形質転換された宿主細胞を選別する工程、及び
４）前記３）で選別された宿主細胞で発現したアラザイムを得る工程。前記製造方法において、工程１）でアラザイムのコード領域を含む塩基配列は、配列番号：２で表わされるもの、配列番号：２で表わされた塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるＤＮＡであれば好ましい。ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション後の洗浄時に決定される。ストリンジェントな条件中の一つは、常温で６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分洗浄した後、４５℃で２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間の洗浄して、５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間の洗浄を二度繰り返す。より好ましいストリンジェントな条件は、より高い温度を使用することである。前記ストリンジェントな条件の他の部分は、同様に行なう終わりの二度の３０分は、６０℃で０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで洗浄する。また他のストリンジェントな条件は、前記ストリンジェントな条件で最後の二度を６５℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄することである。当業者なら必要なストリンジェントな条件を得るために、このような条件を明確に設定することができる。また、発現ベクターとしては、当業界に広く知られたグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌など、商業的に使用可能なベクターを使用することができ、スクリーニングのための薬剤耐性遺伝子を導入することが好ましい。アラザイム遺伝子にいかなる影響も与えないなら、どのようなベクターであってもかまわない。
【００２３】
前記製造方法において、工程２）の宿主細胞としては、細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などがあり、酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉａ）及びピシア（Ｐｈｉｃｉａ）からなる群から選択して使用することができるが、特別にこれに制限されるものではない。
【００２４】
前記製造方法において、工程３）の形質転換された宿主細胞の選別は、ベクターで導入した薬剤耐性遺伝子を使用したスクリーニングとサザンブロッティングまたは、ＰＣＲを使用したスクリーニングを併用して選別することが好ましい。
【００２５】
前記製造方法において、工程４）で得られたアラザイムは、タンパク質のどのような精製方法によって精製されたものであっても、実質的に精製されたタンパク質なら含まれる。このような精製されたタンパク質の例を挙げると、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外ろ過、塩析、溶媒沈澱、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析または再結晶などを適切に選択または組み合わせて実質的に精製されたタンパク質を例に挙げることができるが、このようなものに限定されるものではない。前記のようにＤＮＡからコードされるアラザイムは、当業者に広く知られたタンパク質発現系を使用して得ることができる。また、アラザイムを発現する細胞の培養物から回収・精製することができる。
【００２６】
本発明のアラザイムは、
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号：２で表わされる塩基配列のコード領域を含むＤＮＡによってコードされるタンパク質、
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列で一つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列で構成され、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質、及び
（ｄ）配列番号：２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるＤＮＡによってコードされるタンパク質であり、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質からなる群から選択されたいずれかひとつであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２７】
前記ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すると、相同性が高い塩基配列を有したＤＮＡが選別されて結果的に分離するタンパク質には、アラザイムと機能的に同一なタンパク質が含まれる可能性が高くなる。相同性が高い塩基配列というのは、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有した配列を意味する。また、アミノ酸配列は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の高い相同性の配列なら可能である。前記の相同性の割合は、当業界の当業者によって選択された普通のアルゴリズムで決定することができる。前記ハイブリダイゼーションは、当業界でよく知られたストリンジェントな条件（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｋ．）下のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで提供され、ハイブリダイゼーションでのストリンジェントな条件は、前記で言及したようにハイブリダイゼーション後の洗浄時に決定される。
【００２８】
本発明は、アラザイムを有効成分として含む癌予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００２９】
前記癌は、肺癌、乳癌、肝癌、胃癌、結腸癌、骨癌、膵臓癌、頭部癌、頚部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門付近癌、ファロピウス管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頚部癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫または中枢神経系腫瘍であることを特徴とする。
【００３０】
本発明者等は、前記アラザイムの抗癌効能を検定するために、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌード（Ｎｕｄｅ）マウスを対照群（アラザイム０ｍｇ／ｋｇ投与）、Ｔ１（アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ投与）、Ｔ２（アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ投与）及びＴ３（アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ投与）の４つのグループに分けて、アラザイムを反復経口投与した（表１参照）。アラザイムは、滅菌注射用水に溶解させて週６回経口投与用ゾンデ（ｚｏｎｄｅ）を使用して強制投与を実施した。アラザイム投与後、体重測定及び一般症状を観察し、腫瘍の発生程度を週１回ずつ観察して、その大きさを測定し、アラザイム投与１２週後に剖検を実施した。肉眼病理所見では、すべての臓器で特別な異常所見が観察されなかったし、顕微鏡観察においてもアラザイム投与による実質臓器の異常所見は、すべての個体で観察されなかった。体重は、アラザイムを３００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ２）及び６００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ３）投与したグループで増加した（表２及び図１参照）。ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌードマウスから採取した腫瘍組織の大きさ測定及びヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）で免疫組織化学的観察を実施した結果、３００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ２）及び６００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ３）のアラザイムを投与したグループで、アラザイムの濃度依存的に腫瘍発生抑制効果及び腫瘍細胞浸潤現象の減少が観察された（図２及び図３参照）。
【００３１】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）は、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）を分解する蛋白分解酵素であり（Ｍａｔｒｉｓａｎ ＬＭ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，１９９０年，第６巻，１２１−１２５頁）、ＭＭＰの生成が増加すると炎症とともに多くの種類の癌で浸潤度と転移が増加することが知られている（Ｓｔｅａｒｎｓ ＭＡ，等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９３年，第５３巻，８７８−８８３頁）。腫瘍の転移過程の中で血管基底膜の最も重要な構造物であるコラーゲンタイプ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ）ＩＶの分解が成り立って初めて体内血流への転移が可能で、このようなコラーゲンタイプＩＶの分解は、ＭＭＰの中で主にＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２によって行われる（Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ，等，Ｃｅｌｌ，１９９１年，第６４巻，３２７−３３６頁）。ＭＭＰはまた、新生血管形成において血管内皮細胞の移動と発芽に必要な物質として認識されている（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃ，等，Ｄｅｖｅｌ Ｂｉｏｌ，１９９４年，第１６２巻，４９９−５１０頁）。ＭＭＰの活性は、１）ＭＭＰ遺伝子の転写調節、２）前駆体の活性、３）脂質特異性の差、及び４）αマクログロブリン（α−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ）と組織マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＴＩＭＰｓ）のようなＭＭＰ抑制物質などによって調節される（Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ．Ｈ，Ｊ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ，１９９３年，第６４巻，４７４−４８４頁）。ＭＭＰ−９の発現を調節する上位信号伝達機序には、ミトゲン活性化プロテインキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；ＭＡＰＫ）を含む成長因子、サイトカイン、腫瘍促進因子などが関与する。この中で、ｐ３８キナーゼ及び細胞外部の信号によって調節されたタンパク質キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；ＥＲＫ）は、炎症サイトカインやアポトーシス関連信号及び成長因子等によって活性化される。活性化したＭＡＰＫは、核に移動してＭＭＰ始発体周辺の転写因子結合部と反応して多様な転写因子を活性化させることで、下位標的タンパク質の発現を調節する。大部分の癌は、癌細胞の基質浸湿、原発部位から血管系への移動、血管による二次病巣への移動、二次腫瘍の形成という過程を通じて、原発部位から二次病巣に転移される。癌細胞の基質浸湿には、蛋白分解酵素による細胞外基質の分解が要求されるが、ＭＭＰは、細胞外基質を分解する最も核心的な酵素である。多様なＭＭＰの中で、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９は、それぞれ７２及び９２ｋＤａのコラゲナーゼとして細胞の基底膜を形成するコラーゲンを分解して癌の浸湿と転移を促進する（Ｈｉｍｅｌｓｔｅｉｎ ＢＰ，等，Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１９９４年，第１４巻，２４６−２５８頁）。
【００３２】
本発明者等は、前記のようなヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌードマウスを使用して、アラザイムの投与によってＭＭＰ−９の発現が減少されることを確認することができた（図４及び図５参照）。これは、アラザイムの抗癌効能を示す。
【００３３】
核転写因子−カッパーＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−κＢ；ＮＦ−κＢ）は、多様な環境的刺激に対する反応で活性化される誘導転写因子である（Ｂａｅｕｅｒｌｅ，ＰＡ ａｎｄ Ｂａｉｃｈｗａｌ，ＶＲ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７年，第６５巻，１１１−１３７頁；Ａｕｐｈａｎ，Ｎ，等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５年，第２７０巻，２８６−２９０頁）。暫定的形態のＮＦ−κＢは、細胞質にある抑制タンパク質、Ｉ−κＢに結合されている。多様なＮＦ−κＢ活性因子、すなわち腫瘍壊死因子、ＩＬ−１、リポポリサッカライド及びＵＶ（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）などの刺激は、抑制タンパク質であるＩ−κＢのリン酸化反応及びユビキチンが標識される過程を通じて分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を誘導するようになる。このような過程は、Ｉ−κＢと分離したＮＦ−κＢを核に移動させて標的遺伝子のプロモーター部位にあるＮＦ−κＢ−結合位置（ＮＦ−κＢ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）との結合を可能にして、標的遺伝子の発現を促進させる（Ｂａｌｄｗｉｎ，ＡＳ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６年，第１４巻，６４９−６８３頁；Ｈｕｘｆｏｒｄ Ｔ，等，Ｃｅｌｌ，１９９８年，第９５巻，７５９−７７０頁）。ＮＦ−κＢは、薬物不応性のまた他の影響因子である。これは、サイトカイン合成の重要な調節因子であり、免疫反応や炎症反応に関与する多様な遺伝子の発現を増加させる転写因子で活性化になれば、核内に移動して炎症遺伝子の発現を増加させる。
【００３４】
本発明者等は、前記のようなヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌードマウスを使用して、アラザイムの投与によってＮＦ−κＢの発現が減少されたことを確認することができた（図６及び図７参照）。これは、アラザイムによる腫瘍細胞の減少を意味する。
【００３５】
ＰＣＮＡは、細胞周期中Ｇ０期（Ｇ０ ｐｈａｓｅ）には存在しないで、Ｇ１期（Ｇ１ ｐｈａｓｅ）の間に増加し始めて、Ｓ期（Ｓ ｐｈａｓｅ）で最も多く合成されて、Ｇ２期（Ｇ２ ｐｈａｓｅ）で減少する、３６ｋＤａの細胞内ＤＮＡポリメラーゼデルタ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｄｅｌｔａ）の補助的なタンパク質で、細胞のＤＮＡ合成と細胞の増殖に必須であることが知られている（Ｍｉｙａｇａｗａ Ｓ，等，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｍａｔｏｌ，１９８９年，第９３巻，６７８−６８１頁）。一般的に、ＰＣＮＡの組織免疫蛍光法は、腫瘍組織で成長に関与する部分がどの程度なのかを知る尺度として作用する。ＰＣＮＡ発現は、角質細胞の増殖状態、神経膠症、着色された皮膚病変、肺の非小細胞性癌の組織病理学的等級と関連あるといわれてきた（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ Ｃ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１９９２年，第１０３巻，２９３−２９８頁）。
【００３６】
本発明者等は、前記のようなヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌードマウスを使用して、アラザイムの投与によってＰＣＮＡの発現が減少することを確認することができ（図８及び図９参照）、これは腫瘍組織の成長が減少したことを意味する。
【００３７】
本発明者等は、前記アラザイムの抗癌効能を検定するために、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）にアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）を処理した後、腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるタンパク質の発現変化を観察した。前記のヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、ヒトの乳腺腫瘍細胞の中でエストロゲン受容体を有していない悪性乳癌細胞株である（Ｌｉｕ Ｙ，等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００６年，第３４４巻，１２６３−１２７０頁；Ｗｙａｔｔ ＣＡ，等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５年，第６５巻，１１１０１−１１１０８頁）。ｐ２１は、ＣＤＫ（Ｃｙｃｌｉｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅ）の阻害剤としてサイクリンＡ、Ｄ、Ｅなどの発現を調節することで腫瘍細胞の成長、分化に関与するタンパク質として知られている（Ｗｅｓｔｈｏｆ Ｇ，等，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２００６年，第２７巻，２５２−６０頁；Ｒａｙａｌａ ＳＫ，等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６年，第６６巻，５９８５−５９８８頁）。
【００３８】
本発明者等は、ヒト乳癌細胞に処理されたアラザイムによって、ｐ２１の発現が抑制されることを確認することができた。
【００３９】
ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ）細胞内信号伝達経路（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）に属するｐ３８は、ストレス関連メカニズムによって発現されるタンパク質で、乳癌細胞で細胞成長を促進させることが知られている（Ｌｏｗｅ ＬＣ，等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００５年，第３２９巻，７７２−７７９頁；Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｆ，等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４年，第２３巻，７０５３−７０６６頁）。
【００４０】
本発明者等は、ヒト乳癌細胞に処理されたアラザイムによって、ｐ３８の発現が抑制されることを確認することができた。
【００４１】
プロテインキナーゼは、細胞成長／分化／遺伝子発現に関与して、ＰＫＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）は、悪性腫瘍で上向き調節される（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｆ，等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４年，第２３巻，７０５３−７０６６頁；Ｒｉｂｅｉｒｏ−Ｓｉｌｖａ Ａ，等，Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２００６年，第２１巻，３７３−３８２頁；Ｔａｎ Ｍ，等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００６年，第２５巻，３２８６−３２９５頁）。
【００４２】
本発明者等は、ヒト乳癌細胞に処理されたアラザイムによって、ＰＫＣが下向き調節されることを確認することで、腫瘍細胞の増殖抑制に影響を与えることが分かる。
【００４３】
本発明者等は、ヒト乳癌細胞に処理されたアラザイムによって、腫瘍細胞の増殖の標識マーカータンパク質であるＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）（Ｋｕｍａｒａｇｕｒｕｐａｒａｎ Ｒ，等，Ｒｅｓ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．２００６年，第８１巻，２１８−２２４頁；Ｌｙｚｏｇｕｂｏｖ Ｖ，等，Ｅｘｐ Ｏｎｃｏｌ．２００５年，第２７巻，１４１−１４４頁）、腫瘍の血管新生のマーカーとして知られたＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｋｏｕ Ｂ，等，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ．２００５年，第１５巻，２３９−２４７頁）、腫瘍の浸湿と転移に関与するＭＭＰ−１（Ｍａｔｒｉｘ ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）（Ｚｈａｎｇ Ｃ，等，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００６年，第１３巻，９４７−９５５；Ｗｙａｔｔ ＣＡ，等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５年，第６５巻，１１１０１−１１１０８頁）及びＢＣｌ２（Ｂ−ｃｅｌｌ ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ２）（Ｋｕｍａｒａｇｕｒｕｐａｒａｎ Ｒ，等，Ｒｅｓ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．２００６年，第８１巻，２１８−２２４頁；Ｅｍｉ Ｍ，等，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５年，第７巻，Ｒ９４０−Ｒ９５２頁；Ｓｉｒｖｅｎｔ ＪＪ，等，Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２００４年，第１９巻，７５９−７７０頁）のタンパク質発現が、アラザイムを処理しない対照群に比べて有意に抑制されることを確認した。
【００４４】
腫瘍の発生において腫瘍細胞が産生するＲＯＳ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ）は、腫瘍細胞の増殖に重要であることが知られている（Ｔａｓ Ｆ，等，Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ．２００５年，第２２巻，１１−１５頁）。カタラーゼは、過酸化水素のようなＲＯＳを除去することで、腫瘍発生を抑制する役割をする（Ｔａｓ Ｆ，等，Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ．２００５年，第２２巻，１１−１５頁；Ｏｚｋａｎ Ａ，等，Ｅｘｐ Ｏｎｃｏｌ．２００６年，第２８巻，８６−８８頁）。
【００４５】
本発明者等は、カタラーゼの発現がヒト乳癌細胞でアラザイムの処理によって上向き調節されることが観察されることで、アラザイムの作用は、腫瘍細胞の成長と増殖そして分化を抑制するだけでなく、悪性腫瘍において腫瘍の転移に関与するＭＭＰ及びＰＫＣを抑制することで、腫瘍細胞の転移抑制効能を示す。
【００４６】
本発明者等は、アラザイムをメスのウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットに経口投与して毒性実験を遂行した結果、０、１２５０、２５００及び５０００ｍｇ／ｋｇ濃度で一般症状と肉眼病理所見において何らの異常所見が現われなかった。以上のように経口投与毒性試験による５０％致死量（ＬＤ５０）は、少なくとも ５，０００ｍｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断される。ゆえに、本発明のアラザイムは、乳癌予防及び治療用組成物に有用に使用することができる。
【００４７】
本発明のアラザイムに、追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。投与のためには、追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的で許容可能な担体には、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、散剤、錠剤、カプセル剤、丸薬、顆粒または注射液剤に製剤化できる。さらに当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０年）に開示されている方法を使用して、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００４８】
本発明の癌予防及び治療用薬学的組成物は、目的とする方法によって、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）したり経口投与したりすることができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明によるアラザイムの一日投与量は、０．０１〜５０００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回ないし数回に分けて投与することがより好ましい。
【００４９】
また、本発明は、薬学的に有効な量のアラザイムを癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。
【００５０】
また、本発明は、薬学的に有効な量のアラザイムを癌にかかった個体に投与する工程を含む癌予防方法を提供する。
【００５１】
また、本発明は、アラザイムを癌予防及び治療剤の製造に使用する用途を提供する。
【００５２】
本発明のアラザイムは、上述したように、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を移植したヌードマウス及び乳癌細胞で実験した結果、腫瘍細胞成長、増殖または分化に係わるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９、ＮＦ−κＢ、ｐ２１、ＰＣＮＡ、ＶＥＧＦ、ＢＣｌ２、ｐ−ｐ３８及びＰＫＣの発現を阻害して、腫瘍発生を抑制するカタラーゼの発現を促進するので、癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法または予防方法、または、癌予防及び治療剤の製造に使用することができる。
【００５３】
同時に、本発明は、アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを有効成分として含む癌予防用健康食品を提供する。
【００５４】
本発明のアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを食品添加物に使用する場合、アラニコラプロテオチリクスの培養液または前記のアラザイムをそのまま添加したり他の食品または食品成分とともに使用したりすることができ、通常的な方法によって適切に使用することができる。アラザイムは、前記のような同一方法で得て使用する。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって相応しく決定することができる。一般的に、食品または飲料の製造時には、本発明のアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムは、原料に対して０．０１〜１０重量部、好ましくは０．０５〜１重量部の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的にしたりまたは健康調節を目的にしたりする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲の以下であり得るが、安全性の面で何らの問題がないので、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。
【００５５】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常的な意味での健康食品を全て含む。
【００５６】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料と同様に様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物はブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、サイクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の飲料組成物１００ｍｌ当り一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【００５７】
前記の外にアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムは、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などに添加することができる。その他に天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉にも、アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを添加することができる。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明のアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム１００重量部当り０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００５８】
以下、本発明を実施例、実験例及び製剤例によって詳細に説明する。但し、下記の実施例、実験例及び製剤例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が、下記の実施例、実験例及び製剤例に限定されるものではない。
【００５９】
＜実施例１＞アラザイム（ａｒａｚｙｍｅ）の製造
本発明の有効成分であるアラザイムを製造するために、アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３菌株（ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）を培養培地（バクトトリップトン０．５％、酵母抽出物０．５％、塩化ナトリウム０．１％、塩化カリウム０．０５％、塩化カルシウム０．０２％、硫酸マグネシウム０．０２％）で、２２℃で１８時間培養した。培養液を２μｍ膜ろ過（２μｍフィルター，Ｓａｔｏｒｉｕｓ，米国）を使用して菌体と上澄み液を分離した後、分離した上澄み液を１０ｋＤａの膜ろ過（１０ｋＤａ膜フィルター，Ｐａｌｌ ｓｅｐｔ，ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国）を使用して濃縮した。本発明のアラザイムは、基本的に陰イオンの特性を有するので、濃縮液を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で前処理したＤＥＡＥセルローズ（ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，Ｓｉｇｍａ，米国）を使用したイオン交換樹脂（ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎ，Ｓｉｇｍａ，米国）と２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で前処理したセファデックスＧ−７５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５，Ｓｉｇｍａ，米国）を使用したゲルろ過交換樹脂を使用して精製した。精製された酵素液は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電気泳動をしてバンド傾向を確認したが、その結果、本発明のアラザイムは、小単位を持たないモノマーであり、約５１．５ｋＤａの分子量を有するバンドを示すことを確認した。ただ、アラザイム生産のためのアラニコラプロテオチリクスＨＹ−３菌株（ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）は、多様な産業用培地で生産が可能で、生産された培養液も多様な方法で分離及び精製して使用することができる。本発明のアラザイムは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされる塩基配列を有する。
【００６０】
＜実施例２＞マウス試験群の構成及び投与
本発明では、ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌｊＢｇｉ系統の５週齢特定病原体不在（ＳＰＦ）ヌード（Ｎｕｄｅ）マウス（オリエント、韓国）平均体重１５ｇの個体を使用した。マウスは、入手後、動物室で約７日間検疫及び順化させ、順化期間中に一般症状を観察して健康な動物のみを選抜して試験に使用した。本発明で使用されたマウスの場合、温度２２±３℃、相対湿度５０±１０％、照明時間１２時間（０８：００点灯〜２０：００消灯）に設定された自動温湿度調節装置を設置した動物室で順化及び飼育した。環境条件は、定期的（３ヶ月に１回）に測定した。環境測定の結果、試験に影響を及ぼすと思われる変動は認められなかった。全試験期間ポリカーボネート製飼育箱［２４０Ｗ×３９０Ｌ×１７５Ｈ（ｍｍ）］に５匹以下ずつ収容した。個別識別は、油性マジックペンを使用した皮膚標識法と飼育箱別個体識別カード表示法を使用した。飼料は、実験動物用固形飼料（ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，５０５ Ｎｏｒｔｈ ４ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ｉｎ ４７３７４，米国）を放射線照射（１３．２ｋＧｙ）滅菌して自由摂取させた。水はカーボンフィルターを通じて浄化した上水道水を水差しを使用して自由摂取させた。
【００６１】
一週間の順化期間が経過した後、ヒト肺癌細胞であるＡ５４９細胞株を１×１０７細胞でマウスの左側わき皮下に移植して癌を誘発させ、同時に４つのグループ（対照群、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３及び表１）に分離した後、１２週間アラザイムを０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１５０ｍｇ／ｋｇ（Ｔ１）、３００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ２）及び６００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ３）の濃度で週６回、ゾンデを使用して経口投与した。全実験期間中に体重測定及び一般症状観察を実施して１２週後に剖検を実施した。
【００６２】
実験群の構成は、下記の表１のとおりである。
【００６３】
（表１）実験群の構成
【００６４】
＜実施例３＞細胞培養
本発明では、エストロゲン受容体に陰性であるヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＴＢ−２６）を使用し、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，米国）から分譲を受けて使用した。
【００６５】
＜３−１＞細胞培養条件
本試験に使用されたヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、１０％ＦＢＳと１％アンピシリンを含有したＤＭＥＭ培地を使用して３７℃、５％ＣＯ２培養器で２〜３日ごとに継代しながら培養した。また、細胞培養用ディッシュは、全て滅菌された製品を使用した。
【００６６】
＜３−２＞アラザイムの処理
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、６ウェルにそれぞれ６×１０５細胞／ウェルの細胞を接種した後、３７℃の培養器で一晩培養し、試験物質処理前４時間の間１％ＦＢＳが含まれた栄養欠乏（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）培地に交替して培養することで、細胞周期停止（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ）を誘導した。アラザイムを注射用滅菌注射用水に希釈した後、６０μｇ／ｍｌの濃度に調剤して適用した後、再び２４時間３７℃の培養器で培養した。
【００６７】
＜実験例１＞アラザイム投与が体重変化に及ぼす影響の調査
前記＜実施例２＞と同様にヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）をヌードマウスに移植した後、１週間に一回ずつ体重を測定することで、体重変化を観察して動物の一般症状を観察した。
【００６８】
全実験期間（１２週）を経てアラザイム投与群は、体重が増加する様相を示したが、この中で特に３００ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｔ２）及び６００ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｔ３）で体重の増加が顕著だった（表２及び図１）。
【００６９】
（表２）マウスの体重
対照群：アラザイム０ｍｇ／ｋｇ経口投与、
Ｔ１：アラザイム１５０ｍｇ／ｋｇ経口投与、
Ｔ２：アラザイム３００ｍｇ／ｋｇ経口投与、
Ｔ３：アラザイム６００ｍｇ／ｋｇ経口投与。
【００７０】
＜実験例２＞アラザイム投与が腫瘍成長に及ぼす影響の調査
ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）をヌードマウスに移植した後、５週目から肉眼的に腫瘍大きさを確認することができ、以後８週間、一週間に一度ずつカリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）を使用してそれぞれのマウスの腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の体積は、腫瘍の長径と短径を測定して下記の式１で計算した。
＜式１＞
腫瘍の体積（ｍｍ３）＝（長径×短径２）／２
【００７１】
測定した結果の全実験期間アラザイムを３００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ２）及び６００ｍｇ／ｋｇ（Ｔ３）投与した群で、対照群に比べて腫瘍の大きさが減少し、統計学的有意性が観察された（図２）。
【００７２】
＜実験例３＞アラザイム投与が肺癌組織に及ぼす影響の調査
ヌードマウスにヒト肺癌細胞株を移植した１２週後にエチルエーテルで麻酔して屠殺して、腫瘍及び実質臓器を採取した。採取した腫瘍組織の重さを測定し、心臓、肝臓、肺、膵臓、腎臓、脾臓などの臓器を採取した。採取した腫瘍と臓器は、１０％中性ホルマリンに２４時間固定させた後、自動組織処理装置で組織処理を遂行した。組織処理過程を経た腫瘍と臓器は、パラフィン包埋後４μｍの厚さに薄切りしてヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を実施して光学顕微鏡で観察した。
【００７３】
その結果、アラザイム投与群は、対照群に比べて腫瘍細胞浸潤が弱く進行されていた（図３）。
【００７４】
＜実験例４＞アラザイム投与がＭＭＰ−９の発現に及ぼす影響の調査
ＭＭＰ−９の免疫組織化学的観察のために、ホルマリンに固定した後、製作されたパラフィン包埋組織を４μｍの厚さに薄切りして脱パラフィンした後、内因性過酸化酵素の活性を抑制させるために、３％Ｈ２Ｏ２に３０分間処理して、０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、組織の抗原発現を増加させるために０．０１Ｍのクエン酸塩緩衝液で処理して、マイクロ波で高熱処理した。非特異的反応を抑制するために、２０ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３７℃で１０分間処理した後、リン酸緩衝食塩水で洗浄後、１時間ブロッキングさせた。その後、抗ウサギ１次抗体であるＭＭＰ−９（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ，米国）を４℃で一晩の間処理した後、ＰＢＳ緩衝液で５分間３回洗浄してビオチンと結合させた。ビオチンと結合された１次抗体を緩衝液で洗浄した後、ストレプトアビジンに接合されたＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ−Ｒｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を付着させて、Ｈｉｓｔｏｓｔａｎｔｉｎ−ｐｌｕｓ ｂｕｌｋ ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，米国）で３７℃で３０分間反応させて充分に洗浄した後、３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｅｄ；ＤＡＢ、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，米国）溶液で発色させて蒸留水で洗浄した後、Ｍｅｙｅｒ’ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，米国）で対照染色を実施して光学顕微鏡で観察した。
【００７５】
その結果、アラザイム投与群は、対照群に比べてＭＭＰ−９の発現様相が減少した（図４及び図５）。
【００７６】
ＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）生成の増加時、炎症とともに多くの種類の癌において浸潤度と転移が増加することが知られている。また、これは多くのＭＭＰのうち、主にＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２によってなされる。特に、ＭＭＰ−９の発現を調節する上位信号伝達機序には、ＭＡＰＫを含む成長因子、サイトカイン、腫瘍促進因子などが関与する。ＭＭＰ−９の発現様相の減少は、癌の浸潤と転移が抑制されていることを意味する。
【００７７】
＜実験例５＞アラザイム投与がＮＦ−κＢの発現に及ぼす影響の調査
ＮＦ−κＢの免疫組織化学的観察のために、前記実験例４と同じ過程を遂行して、１次抗体は、ＭＭＰ−９の代りに抗ウサギ１次抗体であるＮＦ−κＢ（１：２００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国）を使用した。
【００７８】
その結果、アラザイム投与群は、対照群に比べてＮＦ−κＢの発現様相が減少した（図６及び図７）。
【００７９】
ＮＦ−κＢは、多様な環境的因子に対する反応で活性化する誘導転写因子である。また、薬物不応性のまた他の影響因子でもある。これは、サイトカイン合成の重要な因子であり、免疫反応や炎症反応に関与する多様な遺伝子の発現を増加させる転写因子で、活性化すると核内に移動して炎症遺伝子の発現を増加させる。ＮＦ−κＢの発現減少は、癌が抑制されていることを意味する。
【００８０】
＜実験例６＞アラザイム投与がＰＣＮＡの発現に及ぼす影響の調査
ＰＣＮＡの免疫組織化学的観察のために、前記実験例４と同じ過程を遂行し、１次抗体は、ＭＭＰ−９の代りに抗マウス１次抗体であるＰＣＮＡ（１：８００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ，米国）を使用した。
【００８１】
その結果、アラザイム投与群は、対照群に比べてＰＣＮＡの発現様相が減少した（図８及び図９）。
【００８２】
ＰＣＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼデルタの補助的なタンパク質で、ＰＣＮＡの発現は、角質細胞の増殖状態、神経膠症、着色された皮膚病変、肺の非小細胞性癌の組織病理学的等級と関連があることが知られているので、ＰＣＮＡの組織免疫蛍光法は、腫瘍組織での成長に関与する部分がどの程度なのかを知る尺度として作用する。ＰＣＮＡの発現の減少は、腫瘍組織の成長が抑制されていることを意味する。
【００８３】
＜実験例７＞アラザイム投与がヒト乳癌細胞のタンパク質発現に及ぼす影響の調査
前記＜実施例３＞と同様にアラザイムを処理したヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において、腫瘍発生と関連あるタンパク質の発現様相を観察するために免疫ブロッティングを実施した。０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）と蛋白質分解酵素抑制剤カクテルタブレット（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔ，Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）を溶解させたＲＩＰＡ緩衝液にアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）を処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を融解させた後、１４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して上澄み液を取得した。取得された細胞質タンパク質試料をブラッドフォード方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ＭＭ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７７年，第７２巻，２４８−２５４頁）にしたがってタンパク質濃度を測定した後、それぞれのタンパク質試料を８０ｇ／ウェルで８〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用して電気泳動を遂行した。電気泳動されたゲル内のタンパク質をＰＶＤＦ膜（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ）に電気移動（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）を遂行した。同じ量のタンパク質がローディングされたものをクマシブルー染色を通じて確認した。３％牛血清アルブミンをリン酸緩衝食塩水に溶解させたブロッキング溶液に１時間ブロッキング後、１次抗体であるｐ−２１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国）、β−アクチン（１：５００ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国）に反応させた。０．５％ツイーン２００が溶解されたＴＢＳ緩衝液で充分に洗浄して、１次抗体に対応する２次抗体である抗ヤギＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国）を１：１，０００〜１：２，０００の割合に希釈して室温で１時間反応させた。また、ＴＢＳ緩衝液で充分に洗浄後、特異的な反応を観察するために化学発光基質（Ｓｕｐｅｒ ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＰＩＥＲＣＥ，米国）と反応させて医学用Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ，日本）に露出させた。ｐ−２１以外の１次抗体では、ｐ−ｐ３８、ＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＢＣｌ２、ＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １）及びカタラーゼを使用し、前記抗体の製造社は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国である。前記の１次抗体に該当する各々の２次抗体を使用して、前記のような方法で遂行した。ｐ−ｐ３８に対応する２次抗体は、抗ウサギＨＲＰ抗体、ＰＣＮＡに対応する２次抗体は、抗ヤギＨＲＰ抗体、ＶＥＧＦに対応する２次抗体は、抗ヤギＨＲＰ抗体、ＢＣｌ２に対応する２次抗体は、抗ウサギＨＲＰ抗体、ＭＭＰ−１に対応する２次抗体は、抗マウスＨＲＰ抗体、カタラーゼに対応する２次抗体は、抗ヤギＨＲＰ抗体にし、前記２次抗体の製造社は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ，米国である。
【００８４】
その結果、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）にアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）の適用は、ｐ２１、ＰＣＮＡ、ＶＥＧＦ及びＢＣｌ２の顕著な抑制効能を示した。また、アラザイムを処理しない対照群に比べて、ｐ−ｐ３８、ＰＫＣ及びＭＭＰ−１の発現が減少したことが観察された。カタラーゼにおいては、アラザイム処理群で発現量が増加したことを観察することができた（図１）。
【００８５】
また、前記の結果を基にして、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）にアラザイム（６０μｇ／ｍｌ）を処理した後、腫瘍細胞の成長、分化、増殖及び転移に係わるタンパク質の発現変化程度を相対的割合で示し（図２）、結果は図１のとおりである。
【００８６】
＜実験例８＞アラザイムの急性毒性実験
本発明のアラザイムに対する急性毒性を調べるために、下記のような実験を遂行した。
【００８７】
ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）系統の９週齢特定病原体不在（ＳＰＦ）メスのラット（オリエント、韓国）に対して、それぞれ４匹ずつ４群に分けて、温度２２±３℃、湿度５５±１０％、照明１２Ｌ／１２Ｄ条件の動物室内で飼育した。ラット入手後、動物室で１週間検疫及び順化過程を経た。全試験期間の間、ポリカーボネート製飼育箱［２４０Ｗ×３９０Ｌ×１７５Ｈ（ｍｍ）］で５匹以下ずつ収容した。個体識別は、油性マジックペンを使用した皮膚標識法と飼育箱別個体識別カード表示法を使用した。実験動物用固形飼料（ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，米国）は滅菌し、水は上水道水を水差しを使用して自由に摂取させた。
【００８８】
前記実施例のアラザイムを０、１２５０、２５００及び５０００ｍｇ／ｋｇの濃度で注射用滅菌注射用水に溶解して、１０ｍｌ／ｋｇの用量に調剤してラットに経口投与用ゾンデを使用して単回経口投与した。一週間の順化期間を経て、４つのグループに分離した後、１０週齢のラットにアラザイムを濃度別に投与した後、一般症状観察を実施した後、アラザイムの実質臓器に対する実質毒性を評価するために２４時間後に剖検を実施した。
【００８９】
メスのラットにアラザイムを経口投与した後、試験物質投与による一般症状を正確に観察して毒性を評価するために、動物の行動、外観、機能に対する観察を実施した。
【００９０】
実験の結果、アラザイム投与後の動物の活動性、歩行、気質、ひきつけなどにいては何らの異常症状が観察されず、被毛状態、眼球周辺、耳、生殖器、四肢状態、尾状態などの動物の外観観察及び呼吸状態、唾液分泌、糞便、嘔吐などの機能観察でも何らの異常症状が観察されなかった。アラザイム投与後２４時間に、剖検を実施した。肉眼剖検所見でも、全臓器でアラザイム投与による何らの異常も観察されなかった。アラザイム致死量（ＬＤ５０）は、５０００ｍｇ／ｋｇ以上の高濃度であると判断される。顕微鏡学的観察において、肝、心臓、肺、すい臓などの実質臓器では、何らの病理学的異常所見が観察されなかった。
【００９１】
下記に本発明の組成物のための製剤例を例示する。
【００９２】
＜製剤例１＞薬学的製剤の製造
＜１−１＞散剤の製造
アラザイム ２ｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合した後、気密包に充填して散剤を製造した。
【００９３】
＜１−２＞錠剤の製造
アラザイム １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【００９４】
＜１−３＞カプセル剤の製造
アラザイム １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００９５】
＜１−４＞丸薬の製造
アラザイム １ｇ
乳糖 １．５ｇ
グリセリン １ｇ
キシリトール ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法によって１丸薬当り４ｇになるように製造した。
【００９６】
＜１−５＞顆粒の製造
アラザイム １５０ｍｇ
大豆抽出物 ５０ｍｇ
ブドウ糖 ２００ｍｇ
澱粉 ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％エチルアルコール１００ｍｇを添加して、摂氏６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、包に充填した。
【００９７】
＜１−６＞注射液剤の製造
アラザイム １０μｇ／ｍｌ
薄い塩酸ＢＰ ｐＨ７．６になるまで
注射用塩化ナトリウムＢＰ 最大１ｍｌ
適当な容積の注射用塩化ナトリウムＢＰの中にアラザイムを溶解させて、生成された溶液のｐＨを薄い塩酸ＢＰを使用してｐＨ７．６に調節して、注射用塩化ナトリウムＢＰを使用して容積を調節して充分に混合した。溶液を透明ガラスの５ｍｌタイプＩアンプル中に充填させて、ガラスを溶解させることで入口を封入して、１２０℃で１５分以上オートクレーブさせて殺菌して注射液剤を製造した。
【００９８】
＜製剤例２＞食品の製造
前記製剤例１の散剤、錠剤、カプセル剤、丸薬及び顆粒を食品に応用しても良く、前記のアラニコラプロテオチリクスの培養液、またはそれから分離したアラザイムを含む食品を下記のように製造した。
【００９９】
＜２−１＞小麦粉食品の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１〜１０．０重量部を小麦粉に添加して、この混合物を使用して通常の方法でパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して、健康増進用食品を製造した。
【０１００】
＜２−２＞スープ及び肉汁（ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１〜１．０重量部をスープ及び肉汁に添加して、通常の方法で健康増進用肉加工製品、麺類のスープ及び肉汁を製造した。
【０１０１】
＜２−３＞グランドビーフの製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム１０重量部をグラウンドビーフに添加して、通常の方法で健康増進用グラウンドビーフを製造した。
【０１０２】
＜２−４＞乳製品の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１〜１．０重量部を牛乳に添加して、前記牛乳を使用して通常の方法で、バター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【０１０３】
＜２−５＞禅食（Ｓｕｎ−Ｓｉｋ）の製造
玄米、麦、もち米、鳩麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【０１０４】
黒豆、黒ごま、えごまも公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【０１０５】
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを真空濃縮機で減圧、濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を粉砕機で粒度６０メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。
【０１０６】
前記で製造した穀物類、種実類及びアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムの乾燥粉末を、次の割合で配合して通常の方法で製造した。
穀物類（玄米３０重量部、鳩麦１５重量部、麦２０重量部）、
種実類（えごま７重量部、黒豆８重量部、黒ごま７重量部）、
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムの乾燥粉末（１重量部）、
霊芝（０．５重量部）、
地黄（０．５重量部）。
【０１０７】
＜製剤例３＞飲料の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを含む飲料を次のように製造した。
【０１０８】
＜３−１＞健康飲料の製造
液状果糖（０．５％）、オリゴ糖（２％）、砂糖（２％）、食塩（０．５％）、水（７５％）のような副材料とアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを均質に配合して瞬間殺菌をした後、これをガラス瓶、ペット瓶など小包装容器に包装して健康飲料を製造した。
【０１０９】
＜３−２＞野菜ジュースの製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．５ｇをトマトまたはにんじんなどの野菜のジュース１，０００ｍｌに加えて、通常の方法で健康増進用野菜ジュースを製造した。
【０１１０】
＜３−３＞果物ジュースの製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１ｇをリンゴまたはブドウなどの果物のジュース１，０００ｍｌに加えて、通常の方法で健康増進用果物ジュースを製造した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラザイム（ａｒａｚｙｍｅ）を有効成分として含む癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記アラザイムが、
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号：２で表わされる塩基配列のコード領域を含むＤＮＡによってコードされるタンパク質、
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において一つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列で構成され、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質、及び
（ｄ）配列番号：２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるＤＮＡによってコードされるタンパク質であり、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質
の中のいずれかひとつであることを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記アラザイムが、アラニコラプロテオチリクス（Ａｒａｎｉｃｏｌａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）培養液から分離したことを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記アラニコラプロテオチリクスが、アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３（受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）であることを特徴とする、請求項３記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記の癌が、肺癌、乳癌、肝癌、胃癌、結腸癌、骨癌、膵臓癌、頭部癌、頚部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門付近癌、ファロピウス管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頚部癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫または中枢神経系腫瘍であることを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記アラザイムが、ＭＭＰ−９（Ｍａｔｒｉｘ ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記アラザイムが、ＮＦ−κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ κＢ）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記アラザイムが、ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項９】
前記アラザイムが、ｐ２１の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記アラザイムが、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１１】
前記アラザイムが、ＢＣｌ２（Ｂ−ｃｅｌｌ ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ ２）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１２】
前記アラザイムが、ｐ−ｐ３８の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１３】
前記アラザイムが、ＰＫＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１４】
前記アラザイムが、ＭＭＰ−１（Ｍａｔｒｉｘ ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
前記アラザイムが、カタラーゼの発現を促進することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１６】
薬学的に有効量のアラザイムを癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法。
【請求項１７】
薬学的に有効量のアラザイムを個体に投与する工程を含む癌の予防方法。
【請求項１８】
癌の予防及び治療剤の製造のためのアラザイムの使用。
【請求項１９】
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを有効成分として含む癌の予防及び改善用健康食品。
【請求項２０】
前記アラニコラプロテオチリクスが、アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３（受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１９記載の癌の予防及び改善用健康食品。
【請求項２１】
前記アラザイムが、
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号：２で表わされる塩基配列のコード領域を含むＤＮＡによってコードされるタンパク質、
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において一つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列で構成され、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質、及び
（ｄ）配列番号：２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるＤＮＡによってコードされるタンパク質であり、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質
の中のいずれかひとつであることを特徴とする、請求項１９記載の癌の予防及び改善用健康食品。
【請求項２２】
前記癌が、肺癌、乳癌、肝癌、胃癌、結腸癌、骨癌、膵臓癌、頭部癌、頚部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門付近癌、ファロピウス管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頚部癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫または中枢神経系腫瘍であることを特徴とする、請求項１９記載の癌の予防及び改善用健康食品。
【請求項１】
アラザイム（ａｒａｚｙｍｅ）を有効成分として含む癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記アラザイムが、
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号：２で表わされる塩基配列のコード領域を含むＤＮＡによってコードされるタンパク質、
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において一つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列で構成され、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質、及び
（ｄ）配列番号：２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるＤＮＡによってコードされるタンパク質であり、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質
の中のいずれかひとつであることを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記アラザイムが、アラニコラプロテオチリクス（Ａｒａｎｉｃｏｌａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）培養液から分離したことを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記アラニコラプロテオチリクスが、アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３（受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）であることを特徴とする、請求項３記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記の癌が、肺癌、乳癌、肝癌、胃癌、結腸癌、骨癌、膵臓癌、頭部癌、頚部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門付近癌、ファロピウス管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頚部癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫または中枢神経系腫瘍であることを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記アラザイムが、ＭＭＰ−９（Ｍａｔｒｉｘ ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記アラザイムが、ＮＦ−κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ κＢ）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記アラザイムが、ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項９】
前記アラザイムが、ｐ２１の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記アラザイムが、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１１】
前記アラザイムが、ＢＣｌ２（Ｂ−ｃｅｌｌ ＣＬＬ／ｌｙｍｐｈｏｍａ ２）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１２】
前記アラザイムが、ｐ−ｐ３８の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１３】
前記アラザイムが、ＰＫＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１４】
前記アラザイムが、ＭＭＰ−１（Ｍａｔｒｉｘ ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
前記アラザイムが、カタラーゼの発現を促進することを特徴とする、請求項１記載の癌の予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項１６】
薬学的に有効量のアラザイムを癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法。
【請求項１７】
薬学的に有効量のアラザイムを個体に投与する工程を含む癌の予防方法。
【請求項１８】
癌の予防及び治療剤の製造のためのアラザイムの使用。
【請求項１９】
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを有効成分として含む癌の予防及び改善用健康食品。
【請求項２０】
前記アラニコラプロテオチリクスが、アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３（受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１９記載の癌の予防及び改善用健康食品。
【請求項２１】
前記アラザイムが、
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号：２で表わされる塩基配列のコード領域を含むＤＮＡによってコードされるタンパク質、
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において一つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列で構成され、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質、及び
（ｄ）配列番号：２で表わされる塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるＤＮＡによってコードされるタンパク質であり、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同一なタンパク質
の中のいずれかひとつであることを特徴とする、請求項１９記載の癌の予防及び改善用健康食品。
【請求項２２】
前記癌が、肺癌、乳癌、肝癌、胃癌、結腸癌、骨癌、膵臓癌、頭部癌、頚部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門付近癌、ファロピウス管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頚部癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫または中枢神経系腫瘍であることを特徴とする、請求項１９記載の癌の予防及び改善用健康食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５１４７５９（Ｐ２０１０−５１４７５９Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４３９５３（Ｐ２００９−５４３９５３）
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００６９３８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８２１８２
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０９１８３６３７）インセクト バイオテック カンパニー， リミティッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００６９３８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８２１８２
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０９１８３６３７）インセクト バイオテック カンパニー， リミティッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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