アラビノガラクタン分解酵素及びその製造方法並びに当該酵素によるガラクトビオースの製造方法
【課 題】 ＩＩ型アラビノガラクタンから、ガラクトビオースを生産する菌株及び同菌株の産生するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素の提供。
【解決手段】 ＩＩ型アラビノガラクタンを唯一の炭素源とした培地を用いて、ガラクトビオースを生産する菌株を土壌からスクリーニングし、新規な資化性菌株を見いだし、該菌株の産生するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素を得た。
【解決手段】 ＩＩ型アラビノガラクタンを唯一の炭素源とした培地を用いて、ガラクトビオースを生産する菌株を土壌からスクリーニングし、新規な資化性菌株を見いだし、該菌株の産生するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素を得た。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アラビノガラクタン、殊にＩＩ型アラビノガラクタンを基質として、これを酵素的に分解し、ガラクトビオースを製造することができる新規菌株及び同菌株が産生するアラビノガラクタン分解酵素、これをコードするＤＮＡを提供することに関するものである。更に、本発明は、当該菌株又は酵素によるＩＩ型アラビノガラクタンを基質としたガラクトビオースの製造方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
アラビノガラクタンは、ガラクトースの連鎖した多糖類として、自然界に存在しているものであるが、大豆等に含まれているＩ型と呼ばれているものとカラ松等に含まれているＩＩ型と呼ばれているものとが存在している。
ＩＩ型アラビノガラクタンは、木質系多糖類と称されているとうり、カラ松属の植物に多く含まれている天然の多糖類で、水溶性であって、高濃度の水溶液が得られること、天然多糖類のなかでは溶液粘度が低いことから、水分保持、テクスチャ改良、被膜形成、氷晶防止、懸濁安定、乳化安定、ニュウトン流体等を目的にして、食品関係、香料関係、工業用途等に広く使用されているものである。
【０００３】
このうち、Ｉ型アラビノガラクタンについては、これを酵素的に分解し、ガラクトビオースを得る方法が、知られているが（特許文献１，２参照）、ＩＩ型アラビノガラクタンの酵素的分解については、これを分解してガラクトビオースを生成する酵素は前例が無く、従って、酵素的分解の事例は知られていない。
【０００４】
このような状況において、本発明の発明者らは、ＩＩ型アラビノガラクタンの酵素的分解について鋭意研究を重ねた結果、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解する性能を有する菌株を分離することに成功し、同菌株からガラクトビオースを生成する酵素を取得することに成功したものである。
【特許文献１】特開平９−１２１８５３号公報
【特許文献２】特開平１０−３１６６９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解しガラクトビオースを生産するフザリウム属に属する生産菌と該生産菌が産生するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素の提供及び当該生産菌又は酵素を使用してＩＩ型アラビノガラクタンを基質とする反応によりガラクトビオースを得るガラクトビオースの製造方法並びに当該酵素のアミノ酸配列の決定とこれをコードするＤＮＡを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者らは、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解しガラクトビオースを生産する菌株の探索を行っている中で、北海道産シュガービートの絞り粕からＩＩ型アラビノガラクタンを分解し、ガラクトビオースを生産する菌株が存在することを見いだした。即ち、ＩＩ型アラビノガラクタンを唯一の炭素源として含有する培地を用いて、スクリーニングを行い、培地中にガラクトビオースの生成を認めることができる菌株を得ることに成功したものである。
ここに得ることができた菌株を、ＩＩ型アラビノガラクタンを唯一の炭素源として含有する大量の培地を用いて培養し、得られた培養液からＩＩ型アラビノガラクタンを分解する分解酵素を採取し精製すること、当該酵素のアミノ酸配列を決定すること及び当該アミノ酸配列をコードするＤＮＡを得ることができたのである。
本発明は、斯かる知見に基づいてなされたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］ 配列番号：３で表される塩基配列を有するＤＮＡ叉は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
［２］ ［１］記載のＤＮＡによってコードされる配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号：２記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素、
［３］ 以下に示す物理化学的性質を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素、
作用
ＩＩ型アラビノガラクタンに作用しガラクトビオースを生成する
基質特異性
Ｉ型アラビノガラクタンには作用せずＩＩ型アラビノガラクタンに作用し、分解物としてガラクトビオースを与える
分子量
５２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（エンドグルコシダーゼにより４８０００となる）
安定ｐＨ範囲
４．１〜９．９
至適ｐＨ
４．０〜６．９
温度安定性
６０℃で一時間まで安定
至適温度
５０℃
金属塩の影響
下記金属イオン１ｍＭ濃度水溶液中、３７℃３０分経過後の残存活性が、水銀８０％、鉄６５％、亜鉛６０％。銀５０％、銅４５％、カドミウム４０％を示し、本酵素の活性はバリウム、カルシウム、コバルト、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、ニッケルまたはＥＤＴＡによる影響は受けない、
［４］ ＩＩ型アラビノガラクタンを基質とし、［２］又は［３］記載のアラビノガラクタン分解酵素を作用させ、ガラクトビオースを製造することを特徴とするガラクトビオースの製造方法、
［５］ アラビノガラクタン分解酵素がフザリウム属由来の酵素である［２］又は［３］のいずれかに記載の酵素、
［６］ フザリウム属由来の酵素である［４］記載の製造方法、
［７］ フザリウム属に属する菌株をＩＩ型アラビノガラクタンを基質として含む培地で培養し、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを製造する酵素を得ることを特徴とする配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する又は［３］記載の物理化学的性質を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素の製造方法、
［８］ フザリウム属に属し、ＩＩ型アラビノガラクタンからガラクトビオースを生産する生産菌、および
［９］ フザリウム オキシスポラム １２Ｓ（寄託番号Ｐ−２０３８０）である［８］記載の生産菌、
［１０］ フザリウム属に属するガラクトビオースを生産する生産菌をＩＩ型アラビノガラクタンを含む培地で培養し、培地からガラクトビオースを採取することを特徴とするガラクトビオースの製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを生産する菌株を得ることができ、これによって、ガラクトビオースを木質系多糖類であるＩＩ型アラビノガラクタンから容易に取得することができ、従前利用されていなかったカラ松等のバイオマス資源からガラクトビオースを取得することができる。得られたガラクトビオースはそれ自体公知の用途、例えば、ビフィズス菌の増殖を助ける等に利用される。又、当該生産菌から、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを生産する酵素を得て酵素製剤を造ることもでき、生化学的研究用途にも利用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において使用される、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを生産する酵素を産生する菌株は、フザリウム属に属するものであればいずれの菌株であってもよいが、特に、実施例において使用しているところのフザリウム オキシスポラム １２Ｓ（Fusarium oxysporum 12S）（寄託番号Ｐ−２０３８０）は、本発明の発明者らがＩＩ型アラビノガラクタンの資化性菌探索により、北海道産シュガービート絞り粕から分離することに成功した新規な菌株である。
【００１０】
スクリーニングにおいて使用した培地は、炭素源として唯一、ＩＩ型アラビノガラクタンのみを含む外は、通常使用されている液体培地である。ここにおいて、使用されるＩＩ型アラビノガラクタンとしては、カラ松の樹皮、幹、根又は枝葉等それ自体又はこれらから抽出したもの、コーヒー豆（収穫時のものであっても焙煎したものであっても良い）それ自体又はこれから抽出したもの（例えば、インスタントコーヒー粉末）、更には市場から入手できるもの（例えば、ラーチウッドアラビノガラクタン（Sigma-Aldrich社製）などが使用できる。本発明では、原料として、市販されている商品を入手して実験に供してもよい。
【００１１】
培地には、炭素源以外の含有物として、特に限定されるものではないが、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄等、リン酸バッファー、酢酸バッファー等及びペプトン又はこれに類する栄養源を適宜選択して添加し使用することができる。培養温度及び培養時間は、１０−１００℃で１２時間−１０日、好ましくは２０−４０℃で２日−６日、液性はｐＨ５．０とし、静置乃至震蕩培養をするのがよい。スクリーニングに際し、具体的に使用した培地は、以下の組成（ｗ％）及び液性のものである。
【００１２】
即ち、
ＮＨ４ＮＯ３ ０．２
Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５
ＫＣｌ ０．０５
ＦｅＳＯ４ ０．００１
Ｐｅｐｔｏｎ ０．１
の水溶液に、ＩＩ型アラビノガラクトンとしてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製のＬａｒｃｈ ｗｏｏｄ ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎを１．０ｗ％の濃度に加えた液性ｐＨ ５．０であるもの。
【００１３】
ここに得たＩＩ型アラビノガラクタン分解能を有する菌株は、下記に示すとおりの菌学的性質を有し、分類学上の位置をフザリウム（Fusarium）属に属する菌株と判定される。更に、その余の性質をフザリウム属の公知種と比べ、本発明の菌株はフザリウム属オキシスポラム（oxysporum）の種に属するものと判定される。しかしながら、フザリウム属に属する菌株がＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを生産することは未だ知られていないことから、本発明により見いだされた菌株は、この点に置いて区別され、新菌株と判定される。したがって、本発明の出願人は本発明で使用する菌株を、フザリウム オキシスポラム １２Ｓ（Fusarium oxysporum 12S）菌株として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３８０としている。当該菌株の諸性質は次に記述するとおりである。本発明における％は、特に断りのない限りｗ／ｗ％である。
ａ 培養的・形態的性質
培地名 ＧＹＰ培地
培地組成 ２％グルコース、０．５％酵母エキス、０．５％ペプトン
胞子形成 有り
胞子形成に要する日数 ３−５日
胞子の色、形状 最初は白色、後にサーモンピンク、菌糸は羊毛状又はフェルト状
ｂ 生理学的性質
１ 最適生育条件
ｐＨ ５．０
温度 ３０℃
２ 生育の範囲
好気的性質 陽性
ｐＨ ３−７
温度 ２０−４０℃
【００１４】
かくて得られたフザリウム オキシスポラム １２Ｓを、例えば、前記した培地で、培養して、培養液から菌体、その他の不溶物を、例えば濾過、遠心分離等で除き、粗酵素液を得る。得られる粗酵素液を、例えば、陰イオン交換カラムクロマトグラフィ、硫安分画、疎水カラムクロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、膜濃縮、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ等の精製手段を用いて精製する。精製方法としては、例えば、粗酵素液を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィ、例えば、ＤＥＡＥ-Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（東ソー社製）に掛けて、その未吸着画分を回収する。得られる未吸着画分に硫酸アンモニウムを最終濃度が５０％飽和になるように少量ずつ加え、２〜６℃好ましくは３〜５℃更に好ましくは４℃で、６から２０時間好ましくは１０〜１５時間更に好ましくは１２時間攪拌又は静置する。その後、例えば、遠心分離行い、上澄を回収し、疎水性カラムクロマトグラフィ、例えば、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー社製）に掛け、タンパク質の吸着を行い、硫安濃度５０％飽和〜０％のリニアーグラジエントにて吸着したタンパク質の溶出を行う。活性画分を回収し、十分量の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で透析する。次いで、陽イオン交換カラムクロマトグラフィ、例えば、ＭｏｎｏＳ（amersham bioscience社製）（ＦＰＬＣシステム使用、ファルマシア社製）に掛ける。吸着したタンパク質の溶出はＮａＣｌの０〜０．５Ｍのリニアーグラジエントにて行い、活性画分を回収し、膜濃縮、例えば、Ｕｒｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（遠心ろ過、日本ミリポア社製）に掛ける。活性画分を採り、これをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（amersham bioscience社製）（ＦＰＬＣシステム使用、ファルマシア社製）に掛けて、精製酵素を得ることができる。
【００１５】
かくて得られたＩＩ型アラビノガラクタンを分解し、ガラクトビオースを生産する酵素は、以下の諸性質を備えている。即ち、
（１）作用
ＩＩ型アラビノガラクタンに作用しガラクトビオースを生成する
（２）基質特異性
Ｉ型アラビノガラクタンには作用せずＩＩ型アラビノガラクタンに作用し、分解物としてガラクトビオースを与える
（３）分子量
５２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（エンドペプチダーゼの作用により４８０００となる）
（４）安定ｐＨ範囲
４．１〜９．９
（５）至適ｐＨ
４．０〜６．９
（６）温度安定性
６０℃で一時間まで安定
（７）至適温度
５０℃
金属塩の影響
下記金属イオン１ｍＭ濃度水溶液中、３７℃３０分経過後の残存活性が、水銀８０％、鉄６５％、亜鉛６０％。銀５０％、銅４５％、カドミウム４０％を示し、本酵素の活性はバリウム、カルシウム、コバルト、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、ニッケルまたはＥＤＴＡによる影響は受けない。
である。
【００１６】
かくて得られるＩＩ型アラビノガラクタンを分解する酵素（タンパク質）によって、ＩＩ型アラビノガラクタンからガラクトビオースを造る方法が確立される。即ち、本発明により得られるＩＩ型アラビノガラクタンを分解する酵素を、ＩＩ型アラビノガラクタンを基質として含む溶液と接触、反応させることにより、ガラクトビオースを容易且つ効率よく造ることができ、従前、ガラクトビオース製造の原料として利用されていないＩＩ型アラビノガラクタンをバイオマス資源として利用する手法が確立される。
【００１７】
本発明においては、下記実施例で詳記するように、上記菌株培養液から、本発明の酵素に係るＲＮＡを取得し、ｃＤＮＡの一本鎖を取得し、ＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：３）を決定することに成功し、更にＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素のアミノ酸配列（配列番号：２）を決定することにも成功した。
本発明は、また、かかるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも提供する。さらに本発明は、上記アミノ酸配列のみならず、上記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素をも提供する。
【００１８】
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイジェーション法、プラーク・ハイブリダイジェーション法、或いはサザンブロット・ハイブリダイジェーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、ＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７−１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイジェーションを行った後、約０．１−２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、約６５℃程度の条件下で、フィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイジェーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University(1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。上記配列番号：３で表される塩基配列とハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列と少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは約８０％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００１９】
又、配列番号：２記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するとは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは約８０％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを意味する。従って、配列番号：２で表されるアミノ酸配列から、１乃至数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１乃至数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列、１乃至数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等は本発明に含まれるものである。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされるものであれば、２０数種の天然に存するアミノ酸は勿論、それ以外の非天然アミノ酸であっても良い。これらによって生ずるペプチドは、単独であっても、混合（菌体から得たものとの混合も含む）された状態であっても、支障なく、ガラクトビオースの製造に利用される。
【実施例】
【００２０】
以下に、実施例を示して、本発明により得られるＩＩ型アラビノガラクタンを分解する酵素の製造、精製、そのアミノ酸配列及びこれをコードするＤＮＡの塩基配列について、具体的に記述するが、これによって、本発明が制限されるものではない。
【００２１】
実施例１
粗酵素液の製造：
２０００ｍＬの三角フラスコ３個を用意し、その各々に、
ＮＨ４ＮＯ３ ０．２
Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５
ＫＣｌ ０．０５
ＦｅＳＯ４ ０．００１
Ｐｅｐｔｏｎ ０．１
（いずれもｗ／ｗ％を示す）
を含む水溶液を加え、ＩＩ型アラビノガラクトンとしてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製のＬａｒｃｈ ｗｏｏｄ ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎを１．０％の濃度に加えた液性ｐＨ ５．０の水溶液を５００ｍＬずつ加え、それぞれにフザリウム オキシスポラム １２Ｓ（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０３８０）を接種して、３０℃で５日間震湯培養した。培養液から、菌体、その他の不溶性物を濾布を用いて除き、約１４００ｍＬの粗酵素液を得た。
【００２２】
酵素の精製：
上に得た粗酵素液を陰イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム（硫安）分画、疎水カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、膜濃縮、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの順に、処理を行って精製した。具体的には、粗酵素液を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡にしたＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（東ソー社製）に供し、未吸着画分を回収した。回収した未吸着画分に硫酸アンモニウムを最終濃度が５０％飽和になるように加え、４℃で１２時間攪拌した。その後、遠心分離し、上澄を回収し、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー社製）に供し、タンパク質の硫安溶液による溶出を硫安濃度５０〜０％飽和のリニアーグラジエントにて行った。
【００２３】
後記した酵素活性の測定手法で確認しながら活性画分を回収し、十分な２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）にて透析した。次いで、得られた活性画分を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化したＭｏｎｏＳ（amersham bioscience社製）（ＦＰＬＣシステム使用 ファルマシア社製）に掛け、タンパク質の食塩水溶液による溶出を食塩濃度０〜０．５Ｍ濃度のリニアーグラジエントにて行い、前記手法で確認しながら活性画分を回収した。得られた活性画分をＵｒｔａｆｒｅｅ−ＭＣ（日本ミリポア社製 膜濾過）に供し、上澄を活性画分として回収し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（amersham bioscience社製）（ＦＰＬＣシステム使用 ファルマシア社製）に供し、精製酵素を得た。これにより、粗酵素液１４００ｍＬに含まれるトータル活性に対し、１．４％の収率で粗酵素液に対する比活性度が８８倍のアラビノガラクタン分解精製酵素を得た。得量２９０μｇ。
【００２４】
酵素活性の測定：
酵素活性の測定は以下の方法により行った。
（イ）ＨＰＬＣによる方法
０．１ｗ％のＬａｒｃｈ Ｗｏｏｄ ａｒａｂｉｎｏｇａｒａｋｕｔａｎ（ＩＩ型）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液溶液（ｐＨ５．０）２００μＬに酵素５μＬを加え、３７℃で６０分インキュベートした。熱（１００℃ ５分）により、酵素を失活させ反応を止めた。分解産物（ガラクトビオース）を、０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中、酢酸ナトリウム０〜０．３Ｍのリニアーグラジエントで、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎの条件で、ＨＰＬＣ（Dionex Dxc-500（Dimex社製））を使い、ガラクトビオースの得量を計測した。カラムはＣａｒｂｏｐａｃ−ＰＡ−１（Dionex社製）を使用して行った。
【００２５】
（ロ）還元糖量を測定する方法
０．１％のＬａｒｃｈ Ｗｏｏｄ ａｒａｂｉｎｏｇａｒａｋｕｔａｎ（ＩＩ型）（Sigma-Aldrich社製）２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液溶液（ｐＨ５．０）２００μＬに酵素５μＬを加え、３７℃で６０分インキュベートした。その後、ソモギー溶液（ナカライテクス社）を２００μＬ入れ、１００℃で１０分間インキュベートし、氷上で５分間冷やした。その後ネルソン液（ナカライテクス社）を２００μＬ入れ、室温で２０分放置し、蒸留水を１．８ｍＬ入れ、吸光度計により、ＯＤ６６０ｎｍに対する吸光度を測定した。
【００２６】
本酵素の活性単位１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの、ガラクトースの還元末端に相当する還元糖量を遊離する酵素量とした。
至適温度：
０．１％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン（２０ｍＭ酢酸緩衝液 ｐＨ５．０）２００μｌに本発明酵素を１５μｌ（０．３ｍＵ）を入れ、２０℃〜７０℃の各温度にて、３０分間反応した。その後、１００℃で５分間熱し、反応をストップさせた。各温度の相対活性を図１に示す。
【００２７】
至適ｐＨ：
０．１％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン水溶液２００μｌに１００ｍＭの各緩衝溶液（ｐＨ２．５−３．５：酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液、ｐＨ４．０−５．０：酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０−７．５リン酸ナトリウム緩衝液又はｐＨ９．５−１０．５炭酸ナトリウム溶液）５０μｌを入れ、本発明酵素１５μｌ（０．３ｍＵ）を入れ、３７℃で３０分間反応させた。反応は１００℃５分間インキュベートすることによって、ストップさせた。相対活性を図１に示す。
【００２８】
温度安定性：
２０ｍＭ酢酸緩衝液に終濃度１０μｇ／ｍｌになるようにウシ血清アルブミンを入れ、その溶液５００μｌに本発明酵素を１００μｌ入れ、各温度（３０℃〜７０℃）にて１時間インキュベートすることによって酵素液を処理した。その後、０．１％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン（２０ｍＭ酢酸緩衝液 ｐＨ５．０）溶液２００μｌに上記処理した酵素液１５μｌ（０．３ｍＵ）を加え、３７℃で３０分間反応させた。各温度の相対活性を図１に示す。
【００２９】
ｐＨ安定性：
１００ｍＭの各緩衝溶液（ｐＨ２．５−３．５：酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液、ｐＨ４．０−５．０：酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０−７．５：リン酸ナトリウム緩衝液又はｐＨ９．５−１０．５炭酸ナトリウム溶液）１００μｌに本発明酵素１００μｌを入れ、３０℃で１６時間インキュベートさせることにより処理した。その後、０．１％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン（１００ｍＭ酢酸緩衝液 ｐＨ５．０）溶液２００μｌに上記処理酵素を１５μｌ（０．３ｍＵ）を加え、３７℃で３０分間反応させた。各ｐＨの相対活性を図１に示す。
【００３０】
金属塩の影響：
０．１％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄ アラビノガラクタン溶液（２０ｍＭ 酢酸緩衝液 ｐＨ５．０）２００μｌに、下記金属イオン又はＥＤＴＡの終濃度が１ｍＭ濃度水溶液になるように添加し、本発明酵素を１５μｌ（０．３ｍＵ）加え、３７℃３０分間酵素反応を行った。各金属イオンまたはＥＤＴＡの相対活性（％）を表１に示す。相対活性とは、金属イオンを添加する前の酵素活性に対する３０分間の酵素反応後の酵素活性との比を％表示したものである。
【００３１】
【表１】
【００３２】
分子量の測定：
前記したところにより得た本発明の精製酵素（タンパク質）の分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。具体的には、Ｌａｅｍｍｌｉ法（U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.）に従い、１０％のアクリルアミドゲルを作製し、本発明のタンパク質およびタンパク質分子量マーカーであるbenchmark protein ladder (invitrogen社製)を同時に電気泳動した。タンパク質分子量マーカーの移動距離との比例計算から本発明のタンパク質の分子量は約５２０００であることがわかった。なお、本酵素は、エンドグリコシダーゼＨ（ロシュ社製）の作用により、分子量が５２０００から４８０００に変化した。
【００３３】
Ｎ末端アミノ酸配列：
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により本発明のタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写し、ペプチドシーケンサーＰＳＱ−１（島津製作所）によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。具体的には上記方法と同様にしてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行った後、本発明のタンパク質をセミドライ式ブロッティング装置ＡＥ−６６７５（ＡＴＴＯ社）を用い、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。ペプチドシーケンサーＰＳＱ−１（島津製作所）にて、Ｎ末端アミノ酸配列を解読してその配列を配列表の配列番号：１に示した。操作方法は、それぞれの装置のマニュアルに従って行った。
アミノ酸配列：AlaTrpProAsnGlyProPheLysThrGluGlyArgTrpIleValAsnSerAsnGly（配列表：配列番号：１）
【００３４】
実施例２
本発明の酵素（タンパク質）をコードする遺伝子配列の決定
Ａ トータルＲＮＡの抽出：
フザリウム オキシスポラム（Fusarium oxysporum）１２Ｓ株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３８０）からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を使用し、トータルＲＮＡを抽出した。具体的にはＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ １２Ｓ株を前記したｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン培地１０ｍｌで５日間３０℃で振とう培養し、その菌体からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を用い、トータルＲＮＡを抽出した。操作方法は使用説明書にしたがって行った。
【００３５】
Ｂ（１） トータルＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成：
上記にて得られたトータルＲＮＡとＯｌｉｇｏ−ｄｔプライマー（Ｔ２０ＡＰ、配列番号：６）を混合し、逆転写により一本鎖ｃＤＮＡを得た。具体的にはトータルＲＮＡ５μｇにＯｌｉｇｏ（ｄｔ）プライマーを０．２５μｇ（５０ｐｍｏｌ）を入れ、ＤＥＰＣ水（日本ジーン社）にて１２μｌにｆｉｌｌ ｕｐして、反応液を調製した。反応液を７０℃で１０分間インキュベートし、その後、氷上で１０分間インキュベートした。その後、５×緩衝液（逆転写用）（TAKARA Bio）３．５μｌ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ） １μｌ、ｒｅｖｅｒａｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ ＲＮａｓｅＨ ｆｒｅｅ（TAKARA Bio） １μｌ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μｌを入れ、４２℃で１時間反応させた。その後、７０℃で１５分インキュベートし、反応をストップさせ、氷上で１０分間冷却した。その後、反応液にＲＮａｓｅＨ （TAKARA Bio）を１μｌ入れ、３７℃で３０分間反応させた。これにより一本鎖ｃＤＮＡを含む液を得た。
【００３６】
Ｔ２０ＡＰ
５‘−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN−３’（配列表：配列番号：６）
(V:A, G ｏｒ C)
【００３７】
Ｂ（２） ３’末端ＤＮＡのクローニング：
上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを利用して、上記したＮ末端アミノ酸配列より設計した２種のプライマー（ａｇ−ｆ１（配列番号：９）、ａｇ−ｆ２（配列番号：１０））および、Ｔ２０ＡＰ配列より設計した２種のプライマー（ＡＰ−１（配列番号：４）、ＡＰ−２（配列番号：５））を用いて、ＰＣＲを行った。一回目のＰＣＲはａｇ−ｆ１とＡＰ−１のプライマーセットを用いて、上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に行った。２回目のＰＣＲはａｇ−ｆ２とＡＰ−２のプライマーセットを用いて、一回目のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を鋳型に行った。２回のＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片をＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（invitrogen社製）にクローニングした。
具体的には一回目のＰＣＲは、上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを１μｌとり、１０×Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（TOYOBO）１０μｌに２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ を１０μｌ、蒸留水７８μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（TOYOBO）１μｌを加えて混合し、計１００μｌの反応液を調整した。その反応液にプライマーａｇ−ｆ１とＡＰ−１を２０ｐｍｏｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは９５℃２分間の熱変性の後、熱変性９４℃ １分間、アニーリング ５５℃ １分間、伸長反応 ７２℃ ２分間のサイクルを３０回行った。２回目のＰＣＲは一回目のＰＣＲ後の反応液を蒸留水で５００倍に薄めたもの１μｌに１０×Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（TOYOBO）１０μｌに２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ を１０μｌ、蒸留水７８μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（TOYOBO）１μｌを加えて混合し、計１００μｌの反応液を調整した。その反応液にプライマーａｇ−ｆ２とＡＰ−２を２０ｐｍｏｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は一回目と同様である。得られたＤＮＡ断片約１．４ＫｂｐをＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（invitrogen社製）にクローニングした。
ＡＰ１
5´−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3´（配列表：配列番号：４）
ＡＰ２
5´−ACTCACTATAGGGCGAGCGGC-3´（配列表：配列番号：５）
ａｇ−ｆ１
5´−TGGCCIAAYGGICCITTYAARACNGA-3´
(I:inosine, Y: C or T, R: A or G, N: A or T or G or C) （配列表：配列番号：９）
ａｇ−ｆ２
5´−TTYAARACIGARGGIMGITGGATHGT-3´
(M: A or C, H: A or T or C) （配列表：配列番号：１０）
【００３８】
Ｃ ３´側遺伝子の塩基配列：
上記方法によりクローニングした本発明タンパク質をコードする３´側遺伝子の塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ−ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（Beckman Coulter）を用い、ＤＮＡシーケンサーＣＥＱ ２０００ＸＬ（Beckman Coulter）により解読した。操作手順はすべてマニュアルに従った。決定された３´側遺伝子配列中には、本発明のタンパク質の推定ＴＡＧ終始コドンを含んでいた。
決定された塩基配列は本発明タンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列の７８番目から１２６３番目の塩基配列である。
【００３９】
Ｄ ５´側遺伝子のクローニング：
５´側の塩基配列は上記で得られた３´側塩基配列より設計された２種のプライマー（５／ａｇ１（配列番号：７）、５／ａｇ２（配列番号：８））およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ １２Ｓ株のゲノムライブラリー作製に用いたカセットに相補する２種のプライマー（Ｃ１、Ｃ２）により行った。
Ｃ１、Ｃ２として、下記するＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（TAKARA Bio社製）を用いた。
５／ａｇ１
5´−CTTCAACACCTTCTGAAGAATAATTGTACC-3´（配列表：配列番号：７）
５／ａｇ２
5´−AGATCAACGTCTTTACCATTGTTGGCGTAG―3´（配列表：配列番号：８）
【００４０】
Ｅ ゲノムライブラリーの作製：
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ １２Ｓ株のゲノムを抽出した。抽出したゲノムを制限酵素Ｓａｌ Ｉ（TAKARA Bio社製）で処理し、様々な断片をＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（TAKARA Bio社製）を用いて、カセットライゲーションを行い、ゲノムライブラリーを作製した。
具体的には、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ １２Ｓ株をｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン含有培地１０ｍｌで３０℃で５日間培養し、菌体を回収した後、ＤＮＡ抽出キットであるＩＳＯＰＬＡＮＴＩＩ（日本ジーン）を用いてゲノムを抽出した。作業はマニュアルにしたがって行った。その後、得られたゲノム溶液５μｌに制限酵素Ｓａｌ Ｉを５０Ｕ、１０×Ｓａｌ Ｉ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、滅菌蒸留水５０μｌを入れ、３７℃で３時間反応させ、ゲノムを制限酵素処理した。その後、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（TAKARA Bio）を用いて、制限酵素処理したゲノムをＳａｌ Ｉカセットにライゲーションし、ゲノムライブラリーを得た。作業はマニュアルにしたがって行った。
【００４１】
Ｆ ５´側遺伝子のクローニング：
３´側塩基配列から設計された２種のプライマー（５／ａｇ１、５／ａｇ２）および上記にて作製したゲノムライブラリーのＳａｌ Ｉカセットに相補する２種のプライマー（Ｃ１、Ｃ２）（TAKARA Bio社製） により行った。一回目のＰＣＲはゲノム溶液を鋳型に５／ａｇ１とＣ１のプライマーセットを用いて行い、２回目のＰＣＲは一回目のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を鋳型に５／ａｇ２とＣ２をプライマーセットを用いて行った。得られたＤＮＡ断片をＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（invitorogen社製）にクローニングした。
具体的には一回目のＰＣＲは、上記で得られたゲノムを１μｌとり、１０×Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（TOYOBO社製）１０μｌに２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ を１０μｌ、蒸留水７８μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（TOYOBO社製）１μｌを加えて混合し、計１００μｌの反応液を調整した。その反応液にプライマー５／ａｇ１とＣ１を２０ｐｍｏｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは９５℃２分間の熱変性の後、熱変性９４℃ １分間、アニーリング ５５℃ １分間、伸長反応 ７２℃ ２分間のサイクルを３０回行った。二回目のＰＣＲは、上記一回目のＰＣＲで得られたＤＮＡ溶液を５００倍に薄めたものを１μｌとり、１０×Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（TOYOBO）１０μｌに２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ を１０μｌ、蒸留水７８μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（TOYOBO）１μｌを加えて混合し、計１００μｌの反応液を調整した。その反応液にプライマー５／ａｇ２とＣ２を２０ｐｍｏｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは９５℃２分間の熱変性の後、熱変性９４℃ １分間、アニーリング ５５℃ １分間、伸長反応 ７２℃ ２分間のサイクルを３０回行った。得られたＤＮＡ断片０．４ＫｂｐをＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（invitorogen）にクローニングした。
【００４２】
Ｇ ５´側塩基配列の決定：
上記方法によりクローニングした本発明タンパク質の５´側遺伝子の塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ−ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（Beckman Coulter）を用い、ＤＮＡシーケンサーＣＥＱ ２０００ＸＬ（Beckman Coulter）により解読した。操作手順はすべてマニュアルに従った。決定された５´側遺伝子配列の中には推定されるＡＴＧスタートコドンが存在した。
決定された塩基配列は全ｃＤＮＡ配列の１番目から７７番目の塩基配列である。
【００４３】
Ｈ 本発明のタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡのクローニング：
本発明タンパク質をコードする全長ｃＤＮＡのクローニングは３´末端ＤＮＡ配列から設計したプライマーｇａｌ１−ｓｔｏｐ（配列番号：１２）および５´末端ＤＮＡ配列から設計したプライマーｇａｌ１−ｓｔａｒｔ（配列番号：１１）を用い、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって行った。具体的には上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを１μｌとり、１０×Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（TOYOBO）１０μｌに２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ を１０μｌ、蒸留水７８μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（TOYOBO）１μｌを加えて混合し、計１００μｌの反応液を調整した。その反応液にプライマーｇａｌ１−ｓｔｏｐとｇａｌ１−ｓｔａｒｔをそれぞれ２０ｐｍｏｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは９５℃２分間の熱変性の後、熱変性９４℃ １分間、アニーリング ５５℃ １分間、伸長反応 ７２℃ ２分間のサイクルを３０回行った。得られたＤＮＡ断片１２６３ｂｐをＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（invitorogen）にクローニングした。
ｇａｌ１−ｓｔｏｐ：５´−ＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＧＣＣＣＧ−３´（配列番号：１２）
ｇａｌ１−ｓｔａｒｔ：５´−ＡＴＧＡＡＧＣＴＡＴＴＣＧＴＣＡＧＣＣＣ−３´（配列番号：１１）
【００４４】
Ｉ 全ｃＤＮＡ塩基配列の決定：
上記方法によりクローニングした本発明タンパク質の全ｃＤＮＡ塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ−ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（Beckman Coulter）を用い、ＤＮＡシーケンサーＣＥＱ ２０００ＸＬ（Beckman Coulter）により解読した。操作手順はすべてマニュアルに従った。
解読された本発明のタンパク質をコードする全ｃＤＮＡは１２６３ｂｐであった。
配列表：配列番号：３に示した。
【００４５】
ATGAAGCTATTCGTCAGCCCTCTCCTGGCACTCAGCTGCCTCATCGGCAATGCTGTAGCAGCATGGCCCAA
TGGACCTTTCAAAACCGAAGGTCGTTGGATCGTCAACTCCAATGGTGACAAGATCAGCCTCGCTGGAGCCA
ACTGGCCCGGCCACGGCGAAGTCATGGTCCCCGAAGGTCTGCAGTACCAATCCATCAAGGATGTTCTCTCC
GATATTAAGAGCATTGGCATGAACGCTATTCGCCTCACCTTCGCCACTGAGCTTGTTGACCAGATCTACGC
CAACAATGGTAAAGACGTTGATCTCAAGACTGCCTTCGAGGAAGGCCTTGGAAAGGAGAATGGTACAATTA
TTCTTCAGAAGGTGTTGAAGAACAACCCTTCTTTCACCGCTCAGACAACACGTCTTGAGGTCTACGACGCC
ATTGCTGCTGAGTGTCTCCGTCAACAGATCTACATCGACCTTGACAACCACATTTCTGAGGCTAAGTGGTG
CTGCGGCGGTACAGATGGCAACACTTGGTGGGGAGATACCCAGTTTAATGTCGACAACTGGGTTCGAGGTG
GCAAATACATGGCAGCTCACAGCAAGAAATGGCCCGCCAAGATCACCCAGTCTCTGCGCAACGAGCCCCGC
GAACCTACAAACAACAATGCTCTCCGTGACAAGTCATACAACTGGAGTGATCTCTACAAGTACATGCGCCA
AGGTGCTGATGCAGTCCATGAGGCCGATCCCGAGGCAATCATCGTCATCTCCGGCATGAACTACGACACCT
ACGTCACTCCTCTCTATTCCGGTGAGAAGCTTCAGCCAGGAGGCGAAGTCTTTAACAGAGATGACTTTGTC
GGCTATGGCAAGGATAAGCTAGTTCTTGAGATTCACAACTACGAGAACAAGGGAACAAGCTGCTCTTCTCT
TCGCTACAATCTCTACAACAAGGGATTCCAGGCCATGAACGAGAGCGATCCCAATGTCGCTGAGGTCTTCC
CCGTCATGCTGACTGAGTTTGGTCAAGCTATGAATGGTGCCGATTACGACACTGCCAACACTTACGTGAGC
TGCTTGTCGGAGTATCTGCCTGAAATTAAGGCTAGTTGGTTCATTTGGGTTATTGTTGGTCGCTACTATAC
TCGTCAGGGCATCCAGGAGTTTGATGATTCTTGGGGTATGAAGAAGGCTGATTGGTCGGGATGGAAGAACG
ATGACTACATTGCGAAATACCTCAAGCCTCAGATTGCGGGCACTTTGAAGAAGTAG
【００４６】
Ｊ 全アミノ酸配列：
上記で得られた塩基配列から全アミノ酸配列を配列表の配列番号：２のように決定した。
MetLysLeuPheValSerProLeuLeuAlaLeuSerCysLeuIleGlyAsnAlaValAlaAlaTrpProAsnG
lyProPheLysThrGluGlyArgTrpIleValAsnSerAsnGlyAspLysIleSerLeuAlaGlyAlaAsn
TrpProGlyHisGlyGluValMetValProGluGlyLeuGlnTyrGlnSerIleLysAspValLeuSerAsp
IleLysSerIleGlyMetAsnAlaIleArgLeuThrPheAlaThrGluLeuValAspGlnIleTyrAlaAsn
AsnGlyLysAspValAspLeuLysThrAlaPheGluGluGlyLeuGlyLysGluAsnGlyThrIleIleLeuG
lnLysValLeuLysAsnAsnProSerPheThrAlaGlnThrThrArgLeuGluValTyrAspAlaIleAla
AlaGluCysLeuArgGlnGlnIleTyrIleAspLeuAspAsnHisIleSerGluAlaLysTrpCysCysGly
GlyThrAspGlyAsnThrTrpTrpGlyAspThrGlnPheAsnValAspAsnTrpValArgGlyGlyLys
TyrMetAlaAlaHisSerLysLysTrpProAlaLysIleThrGlnSerLeuArgAsnGluProArgGluPro
ThrAsnAsnAsnAlaLeuArgAspLysSerTyrAsnTrpSerAspLeuTyrLysTyrMetArgGlnGly
AlaAspAlaValHisGluAlaAspProGluAlaIleIleValIleSerGlyMetAsnTyrAspThrTyrValThr
ProLeuTyrSerGlyGluLysLeuGlnProGlyGlyGluValPheAsnArgAspAspPheValGlyTyr
GlyLysAspLysLeuValLeuGluIleHisAsnTyrGluAsnLysGlyThrSerCysSerSerLeuArgTyrA
snLeuTyrAsnLysGlyPheGlnAlaMetAsnGluSerAspProAsnValAlaGluValPheProVal
MetLeuThrGluPheGlyGlnAlaMetAsnGlyAlaAspTyrAspThrAlaAsnThrTyrValSerCys
LeuSerGluTyrLeuProGluIleLysAlaSerTrpPheIleTrpValIleValGlyArgTyrTyrThrArgGln
GlyIleGlnGluPheAspAspSerTrpGlyMetLysLysAlaAspTrpSerGlyTrpLysAsnAspAspTyrI
leAlaLysTyrLeuLysProGlnIleAlaGlyThrLeuLysLys
【００４７】
実施例３
ガラクトビオースの製造：
２０％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄ アラビノガラクタン（２０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０）４．５ｍｌに本発明酵素０．５ｍｌ（６ｍＵに相当）を入れ、３７℃で３日間反応させた。反応液を１００℃で５分間処理することによって、酵素を失活させた。その後、反応液からガラクトビオースを精製した。具体的には、反応液に１５ｍｌのエタノールを加え、未反応の多糖を沈殿させたあと、遠心分離にて、沈殿物を取り除いた。上澄を回収し、エバポレーターにより、２ｍｌにまで、濃縮した。その後、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーであるＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２ ｃｏｌｕｍｎ（２．５ｘ４８ｃｍ、Bio-rad）に流した。本ゲルろ過カラムの展開溶媒は２０ｍＭのＮａＣｌ水溶液を用いた。カラムクロマトの溶出画分を２ｍｌずつ分取し、各フラクションをＨＰＬＣ（Dionex Dxc-500、使用カラムCarbopac-PA-1）にて分析した。展開溶媒は０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液に０〜０．３Ｍ酢酸ナトリウムのリニアーグラジエントをかけるようにして行った（流速１．０ｍｌ／分）。ガラクトビオースのピークを認めたフラクションを回収し、その溶液を両イオン交換樹脂であるＡＧ ５０１−Ｘ８（Ｄ）（Bio-rad社製）で処理した。具体的には樹脂を液に入れ、濾過して除いている。その結果、精製ガラクトビオース約５ｍｇを得た。得られたガラクトビオースをＫＲＡＴＯＳ質量分析装置（島津製作所）分析した結果、分子量は３６４．４であった。操作はマニュアルに従っておこなった。また、精製したガラクトビオースを酸加水分解したのち、ＨＰＬＣ（上記と同じ条件）にて分析した結果、保持時間５．１６分にガラクトースの単一ピークを認めた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、従前利用することができなかった木質系のアラビノガラクタン、即ち、ＩＩ型アラビノガラクタンからガラクトビオースを造ることができ、多く存在するバイオマス資源を利用することができる。更に、新規な性能を備えた酵素（ペプチド）が提供され、新たな酵素製剤の提供も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明により提供される酵素（ペプチド）の至適温度、指摘ｐＨ、温度安定性、ｐＨ安定性を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アラビノガラクタン、殊にＩＩ型アラビノガラクタンを基質として、これを酵素的に分解し、ガラクトビオースを製造することができる新規菌株及び同菌株が産生するアラビノガラクタン分解酵素、これをコードするＤＮＡを提供することに関するものである。更に、本発明は、当該菌株又は酵素によるＩＩ型アラビノガラクタンを基質としたガラクトビオースの製造方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
アラビノガラクタンは、ガラクトースの連鎖した多糖類として、自然界に存在しているものであるが、大豆等に含まれているＩ型と呼ばれているものとカラ松等に含まれているＩＩ型と呼ばれているものとが存在している。
ＩＩ型アラビノガラクタンは、木質系多糖類と称されているとうり、カラ松属の植物に多く含まれている天然の多糖類で、水溶性であって、高濃度の水溶液が得られること、天然多糖類のなかでは溶液粘度が低いことから、水分保持、テクスチャ改良、被膜形成、氷晶防止、懸濁安定、乳化安定、ニュウトン流体等を目的にして、食品関係、香料関係、工業用途等に広く使用されているものである。
【０００３】
このうち、Ｉ型アラビノガラクタンについては、これを酵素的に分解し、ガラクトビオースを得る方法が、知られているが（特許文献１，２参照）、ＩＩ型アラビノガラクタンの酵素的分解については、これを分解してガラクトビオースを生成する酵素は前例が無く、従って、酵素的分解の事例は知られていない。
【０００４】
このような状況において、本発明の発明者らは、ＩＩ型アラビノガラクタンの酵素的分解について鋭意研究を重ねた結果、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解する性能を有する菌株を分離することに成功し、同菌株からガラクトビオースを生成する酵素を取得することに成功したものである。
【特許文献１】特開平９−１２１８５３号公報
【特許文献２】特開平１０−３１６６９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解しガラクトビオースを生産するフザリウム属に属する生産菌と該生産菌が産生するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素の提供及び当該生産菌又は酵素を使用してＩＩ型アラビノガラクタンを基質とする反応によりガラクトビオースを得るガラクトビオースの製造方法並びに当該酵素のアミノ酸配列の決定とこれをコードするＤＮＡを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者らは、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解しガラクトビオースを生産する菌株の探索を行っている中で、北海道産シュガービートの絞り粕からＩＩ型アラビノガラクタンを分解し、ガラクトビオースを生産する菌株が存在することを見いだした。即ち、ＩＩ型アラビノガラクタンを唯一の炭素源として含有する培地を用いて、スクリーニングを行い、培地中にガラクトビオースの生成を認めることができる菌株を得ることに成功したものである。
ここに得ることができた菌株を、ＩＩ型アラビノガラクタンを唯一の炭素源として含有する大量の培地を用いて培養し、得られた培養液からＩＩ型アラビノガラクタンを分解する分解酵素を採取し精製すること、当該酵素のアミノ酸配列を決定すること及び当該アミノ酸配列をコードするＤＮＡを得ることができたのである。
本発明は、斯かる知見に基づいてなされたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］ 配列番号：３で表される塩基配列を有するＤＮＡ叉は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
［２］ ［１］記載のＤＮＡによってコードされる配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号：２記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素、
［３］ 以下に示す物理化学的性質を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素、
作用
ＩＩ型アラビノガラクタンに作用しガラクトビオースを生成する
基質特異性
Ｉ型アラビノガラクタンには作用せずＩＩ型アラビノガラクタンに作用し、分解物としてガラクトビオースを与える
分子量
５２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（エンドグルコシダーゼにより４８０００となる）
安定ｐＨ範囲
４．１〜９．９
至適ｐＨ
４．０〜６．９
温度安定性
６０℃で一時間まで安定
至適温度
５０℃
金属塩の影響
下記金属イオン１ｍＭ濃度水溶液中、３７℃３０分経過後の残存活性が、水銀８０％、鉄６５％、亜鉛６０％。銀５０％、銅４５％、カドミウム４０％を示し、本酵素の活性はバリウム、カルシウム、コバルト、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、ニッケルまたはＥＤＴＡによる影響は受けない、
［４］ ＩＩ型アラビノガラクタンを基質とし、［２］又は［３］記載のアラビノガラクタン分解酵素を作用させ、ガラクトビオースを製造することを特徴とするガラクトビオースの製造方法、
［５］ アラビノガラクタン分解酵素がフザリウム属由来の酵素である［２］又は［３］のいずれかに記載の酵素、
［６］ フザリウム属由来の酵素である［４］記載の製造方法、
［７］ フザリウム属に属する菌株をＩＩ型アラビノガラクタンを基質として含む培地で培養し、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを製造する酵素を得ることを特徴とする配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する又は［３］記載の物理化学的性質を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素の製造方法、
［８］ フザリウム属に属し、ＩＩ型アラビノガラクタンからガラクトビオースを生産する生産菌、および
［９］ フザリウム オキシスポラム １２Ｓ（寄託番号Ｐ−２０３８０）である［８］記載の生産菌、
［１０］ フザリウム属に属するガラクトビオースを生産する生産菌をＩＩ型アラビノガラクタンを含む培地で培養し、培地からガラクトビオースを採取することを特徴とするガラクトビオースの製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを生産する菌株を得ることができ、これによって、ガラクトビオースを木質系多糖類であるＩＩ型アラビノガラクタンから容易に取得することができ、従前利用されていなかったカラ松等のバイオマス資源からガラクトビオースを取得することができる。得られたガラクトビオースはそれ自体公知の用途、例えば、ビフィズス菌の増殖を助ける等に利用される。又、当該生産菌から、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを生産する酵素を得て酵素製剤を造ることもでき、生化学的研究用途にも利用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において使用される、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを生産する酵素を産生する菌株は、フザリウム属に属するものであればいずれの菌株であってもよいが、特に、実施例において使用しているところのフザリウム オキシスポラム １２Ｓ（Fusarium oxysporum 12S）（寄託番号Ｐ−２０３８０）は、本発明の発明者らがＩＩ型アラビノガラクタンの資化性菌探索により、北海道産シュガービート絞り粕から分離することに成功した新規な菌株である。
【００１０】
スクリーニングにおいて使用した培地は、炭素源として唯一、ＩＩ型アラビノガラクタンのみを含む外は、通常使用されている液体培地である。ここにおいて、使用されるＩＩ型アラビノガラクタンとしては、カラ松の樹皮、幹、根又は枝葉等それ自体又はこれらから抽出したもの、コーヒー豆（収穫時のものであっても焙煎したものであっても良い）それ自体又はこれから抽出したもの（例えば、インスタントコーヒー粉末）、更には市場から入手できるもの（例えば、ラーチウッドアラビノガラクタン（Sigma-Aldrich社製）などが使用できる。本発明では、原料として、市販されている商品を入手して実験に供してもよい。
【００１１】
培地には、炭素源以外の含有物として、特に限定されるものではないが、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄等、リン酸バッファー、酢酸バッファー等及びペプトン又はこれに類する栄養源を適宜選択して添加し使用することができる。培養温度及び培養時間は、１０−１００℃で１２時間−１０日、好ましくは２０−４０℃で２日−６日、液性はｐＨ５．０とし、静置乃至震蕩培養をするのがよい。スクリーニングに際し、具体的に使用した培地は、以下の組成（ｗ％）及び液性のものである。
【００１２】
即ち、
ＮＨ４ＮＯ３ ０．２
Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５
ＫＣｌ ０．０５
ＦｅＳＯ４ ０．００１
Ｐｅｐｔｏｎ ０．１
の水溶液に、ＩＩ型アラビノガラクトンとしてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製のＬａｒｃｈ ｗｏｏｄ ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎを１．０ｗ％の濃度に加えた液性ｐＨ ５．０であるもの。
【００１３】
ここに得たＩＩ型アラビノガラクタン分解能を有する菌株は、下記に示すとおりの菌学的性質を有し、分類学上の位置をフザリウム（Fusarium）属に属する菌株と判定される。更に、その余の性質をフザリウム属の公知種と比べ、本発明の菌株はフザリウム属オキシスポラム（oxysporum）の種に属するものと判定される。しかしながら、フザリウム属に属する菌株がＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを生産することは未だ知られていないことから、本発明により見いだされた菌株は、この点に置いて区別され、新菌株と判定される。したがって、本発明の出願人は本発明で使用する菌株を、フザリウム オキシスポラム １２Ｓ（Fusarium oxysporum 12S）菌株として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３８０としている。当該菌株の諸性質は次に記述するとおりである。本発明における％は、特に断りのない限りｗ／ｗ％である。
ａ 培養的・形態的性質
培地名 ＧＹＰ培地
培地組成 ２％グルコース、０．５％酵母エキス、０．５％ペプトン
胞子形成 有り
胞子形成に要する日数 ３−５日
胞子の色、形状 最初は白色、後にサーモンピンク、菌糸は羊毛状又はフェルト状
ｂ 生理学的性質
１ 最適生育条件
ｐＨ ５．０
温度 ３０℃
２ 生育の範囲
好気的性質 陽性
ｐＨ ３−７
温度 ２０−４０℃
【００１４】
かくて得られたフザリウム オキシスポラム １２Ｓを、例えば、前記した培地で、培養して、培養液から菌体、その他の不溶物を、例えば濾過、遠心分離等で除き、粗酵素液を得る。得られる粗酵素液を、例えば、陰イオン交換カラムクロマトグラフィ、硫安分画、疎水カラムクロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、膜濃縮、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ等の精製手段を用いて精製する。精製方法としては、例えば、粗酵素液を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィ、例えば、ＤＥＡＥ-Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（東ソー社製）に掛けて、その未吸着画分を回収する。得られる未吸着画分に硫酸アンモニウムを最終濃度が５０％飽和になるように少量ずつ加え、２〜６℃好ましくは３〜５℃更に好ましくは４℃で、６から２０時間好ましくは１０〜１５時間更に好ましくは１２時間攪拌又は静置する。その後、例えば、遠心分離行い、上澄を回収し、疎水性カラムクロマトグラフィ、例えば、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー社製）に掛け、タンパク質の吸着を行い、硫安濃度５０％飽和〜０％のリニアーグラジエントにて吸着したタンパク質の溶出を行う。活性画分を回収し、十分量の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で透析する。次いで、陽イオン交換カラムクロマトグラフィ、例えば、ＭｏｎｏＳ（amersham bioscience社製）（ＦＰＬＣシステム使用、ファルマシア社製）に掛ける。吸着したタンパク質の溶出はＮａＣｌの０〜０．５Ｍのリニアーグラジエントにて行い、活性画分を回収し、膜濃縮、例えば、Ｕｒｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（遠心ろ過、日本ミリポア社製）に掛ける。活性画分を採り、これをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（amersham bioscience社製）（ＦＰＬＣシステム使用、ファルマシア社製）に掛けて、精製酵素を得ることができる。
【００１５】
かくて得られたＩＩ型アラビノガラクタンを分解し、ガラクトビオースを生産する酵素は、以下の諸性質を備えている。即ち、
（１）作用
ＩＩ型アラビノガラクタンに作用しガラクトビオースを生成する
（２）基質特異性
Ｉ型アラビノガラクタンには作用せずＩＩ型アラビノガラクタンに作用し、分解物としてガラクトビオースを与える
（３）分子量
５２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（エンドペプチダーゼの作用により４８０００となる）
（４）安定ｐＨ範囲
４．１〜９．９
（５）至適ｐＨ
４．０〜６．９
（６）温度安定性
６０℃で一時間まで安定
（７）至適温度
５０℃
金属塩の影響
下記金属イオン１ｍＭ濃度水溶液中、３７℃３０分経過後の残存活性が、水銀８０％、鉄６５％、亜鉛６０％。銀５０％、銅４５％、カドミウム４０％を示し、本酵素の活性はバリウム、カルシウム、コバルト、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、ニッケルまたはＥＤＴＡによる影響は受けない。
である。
【００１６】
かくて得られるＩＩ型アラビノガラクタンを分解する酵素（タンパク質）によって、ＩＩ型アラビノガラクタンからガラクトビオースを造る方法が確立される。即ち、本発明により得られるＩＩ型アラビノガラクタンを分解する酵素を、ＩＩ型アラビノガラクタンを基質として含む溶液と接触、反応させることにより、ガラクトビオースを容易且つ効率よく造ることができ、従前、ガラクトビオース製造の原料として利用されていないＩＩ型アラビノガラクタンをバイオマス資源として利用する手法が確立される。
【００１７】
本発明においては、下記実施例で詳記するように、上記菌株培養液から、本発明の酵素に係るＲＮＡを取得し、ｃＤＮＡの一本鎖を取得し、ＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：３）を決定することに成功し、更にＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素のアミノ酸配列（配列番号：２）を決定することにも成功した。
本発明は、また、かかるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも提供する。さらに本発明は、上記アミノ酸配列のみならず、上記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素をも提供する。
【００１８】
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイジェーション法、プラーク・ハイブリダイジェーション法、或いはサザンブロット・ハイブリダイジェーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、ＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７−１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイジェーションを行った後、約０．１−２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、約６５℃程度の条件下で、フィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイジェーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University(1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。上記配列番号：３で表される塩基配列とハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列と少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは約８０％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００１９】
又、配列番号：２記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するとは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは約８０％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことを意味する。従って、配列番号：２で表されるアミノ酸配列から、１乃至数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１乃至数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列、１乃至数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等は本発明に含まれるものである。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされるものであれば、２０数種の天然に存するアミノ酸は勿論、それ以外の非天然アミノ酸であっても良い。これらによって生ずるペプチドは、単独であっても、混合（菌体から得たものとの混合も含む）された状態であっても、支障なく、ガラクトビオースの製造に利用される。
【実施例】
【００２０】
以下に、実施例を示して、本発明により得られるＩＩ型アラビノガラクタンを分解する酵素の製造、精製、そのアミノ酸配列及びこれをコードするＤＮＡの塩基配列について、具体的に記述するが、これによって、本発明が制限されるものではない。
【００２１】
実施例１
粗酵素液の製造：
２０００ｍＬの三角フラスコ３個を用意し、その各々に、
ＮＨ４ＮＯ３ ０．２
Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５
ＫＣｌ ０．０５
ＦｅＳＯ４ ０．００１
Ｐｅｐｔｏｎ ０．１
（いずれもｗ／ｗ％を示す）
を含む水溶液を加え、ＩＩ型アラビノガラクトンとしてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製のＬａｒｃｈ ｗｏｏｄ ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎを１．０％の濃度に加えた液性ｐＨ ５．０の水溶液を５００ｍＬずつ加え、それぞれにフザリウム オキシスポラム １２Ｓ（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０３８０）を接種して、３０℃で５日間震湯培養した。培養液から、菌体、その他の不溶性物を濾布を用いて除き、約１４００ｍＬの粗酵素液を得た。
【００２２】
酵素の精製：
上に得た粗酵素液を陰イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム（硫安）分画、疎水カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、膜濃縮、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの順に、処理を行って精製した。具体的には、粗酵素液を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡にしたＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（東ソー社製）に供し、未吸着画分を回収した。回収した未吸着画分に硫酸アンモニウムを最終濃度が５０％飽和になるように加え、４℃で１２時間攪拌した。その後、遠心分離し、上澄を回収し、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー社製）に供し、タンパク質の硫安溶液による溶出を硫安濃度５０〜０％飽和のリニアーグラジエントにて行った。
【００２３】
後記した酵素活性の測定手法で確認しながら活性画分を回収し、十分な２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）にて透析した。次いで、得られた活性画分を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化したＭｏｎｏＳ（amersham bioscience社製）（ＦＰＬＣシステム使用 ファルマシア社製）に掛け、タンパク質の食塩水溶液による溶出を食塩濃度０〜０．５Ｍ濃度のリニアーグラジエントにて行い、前記手法で確認しながら活性画分を回収した。得られた活性画分をＵｒｔａｆｒｅｅ−ＭＣ（日本ミリポア社製 膜濾過）に供し、上澄を活性画分として回収し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（amersham bioscience社製）（ＦＰＬＣシステム使用 ファルマシア社製）に供し、精製酵素を得た。これにより、粗酵素液１４００ｍＬに含まれるトータル活性に対し、１．４％の収率で粗酵素液に対する比活性度が８８倍のアラビノガラクタン分解精製酵素を得た。得量２９０μｇ。
【００２４】
酵素活性の測定：
酵素活性の測定は以下の方法により行った。
（イ）ＨＰＬＣによる方法
０．１ｗ％のＬａｒｃｈ Ｗｏｏｄ ａｒａｂｉｎｏｇａｒａｋｕｔａｎ（ＩＩ型）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液溶液（ｐＨ５．０）２００μＬに酵素５μＬを加え、３７℃で６０分インキュベートした。熱（１００℃ ５分）により、酵素を失活させ反応を止めた。分解産物（ガラクトビオース）を、０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中、酢酸ナトリウム０〜０．３Ｍのリニアーグラジエントで、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎの条件で、ＨＰＬＣ（Dionex Dxc-500（Dimex社製））を使い、ガラクトビオースの得量を計測した。カラムはＣａｒｂｏｐａｃ−ＰＡ−１（Dionex社製）を使用して行った。
【００２５】
（ロ）還元糖量を測定する方法
０．１％のＬａｒｃｈ Ｗｏｏｄ ａｒａｂｉｎｏｇａｒａｋｕｔａｎ（ＩＩ型）（Sigma-Aldrich社製）２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液溶液（ｐＨ５．０）２００μＬに酵素５μＬを加え、３７℃で６０分インキュベートした。その後、ソモギー溶液（ナカライテクス社）を２００μＬ入れ、１００℃で１０分間インキュベートし、氷上で５分間冷やした。その後ネルソン液（ナカライテクス社）を２００μＬ入れ、室温で２０分放置し、蒸留水を１．８ｍＬ入れ、吸光度計により、ＯＤ６６０ｎｍに対する吸光度を測定した。
【００２６】
本酵素の活性単位１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの、ガラクトースの還元末端に相当する還元糖量を遊離する酵素量とした。
至適温度：
０．１％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン（２０ｍＭ酢酸緩衝液 ｐＨ５．０）２００μｌに本発明酵素を１５μｌ（０．３ｍＵ）を入れ、２０℃〜７０℃の各温度にて、３０分間反応した。その後、１００℃で５分間熱し、反応をストップさせた。各温度の相対活性を図１に示す。
【００２７】
至適ｐＨ：
０．１％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン水溶液２００μｌに１００ｍＭの各緩衝溶液（ｐＨ２．５−３．５：酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液、ｐＨ４．０−５．０：酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０−７．５リン酸ナトリウム緩衝液又はｐＨ９．５−１０．５炭酸ナトリウム溶液）５０μｌを入れ、本発明酵素１５μｌ（０．３ｍＵ）を入れ、３７℃で３０分間反応させた。反応は１００℃５分間インキュベートすることによって、ストップさせた。相対活性を図１に示す。
【００２８】
温度安定性：
２０ｍＭ酢酸緩衝液に終濃度１０μｇ／ｍｌになるようにウシ血清アルブミンを入れ、その溶液５００μｌに本発明酵素を１００μｌ入れ、各温度（３０℃〜７０℃）にて１時間インキュベートすることによって酵素液を処理した。その後、０．１％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン（２０ｍＭ酢酸緩衝液 ｐＨ５．０）溶液２００μｌに上記処理した酵素液１５μｌ（０．３ｍＵ）を加え、３７℃で３０分間反応させた。各温度の相対活性を図１に示す。
【００２９】
ｐＨ安定性：
１００ｍＭの各緩衝溶液（ｐＨ２．５−３．５：酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液、ｐＨ４．０−５．０：酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０−７．５：リン酸ナトリウム緩衝液又はｐＨ９．５−１０．５炭酸ナトリウム溶液）１００μｌに本発明酵素１００μｌを入れ、３０℃で１６時間インキュベートさせることにより処理した。その後、０．１％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン（１００ｍＭ酢酸緩衝液 ｐＨ５．０）溶液２００μｌに上記処理酵素を１５μｌ（０．３ｍＵ）を加え、３７℃で３０分間反応させた。各ｐＨの相対活性を図１に示す。
【００３０】
金属塩の影響：
０．１％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄ アラビノガラクタン溶液（２０ｍＭ 酢酸緩衝液 ｐＨ５．０）２００μｌに、下記金属イオン又はＥＤＴＡの終濃度が１ｍＭ濃度水溶液になるように添加し、本発明酵素を１５μｌ（０．３ｍＵ）加え、３７℃３０分間酵素反応を行った。各金属イオンまたはＥＤＴＡの相対活性（％）を表１に示す。相対活性とは、金属イオンを添加する前の酵素活性に対する３０分間の酵素反応後の酵素活性との比を％表示したものである。
【００３１】
【表１】
【００３２】
分子量の測定：
前記したところにより得た本発明の精製酵素（タンパク質）の分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。具体的には、Ｌａｅｍｍｌｉ法（U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.）に従い、１０％のアクリルアミドゲルを作製し、本発明のタンパク質およびタンパク質分子量マーカーであるbenchmark protein ladder (invitrogen社製)を同時に電気泳動した。タンパク質分子量マーカーの移動距離との比例計算から本発明のタンパク質の分子量は約５２０００であることがわかった。なお、本酵素は、エンドグリコシダーゼＨ（ロシュ社製）の作用により、分子量が５２０００から４８０００に変化した。
【００３３】
Ｎ末端アミノ酸配列：
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により本発明のタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写し、ペプチドシーケンサーＰＳＱ−１（島津製作所）によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。具体的には上記方法と同様にしてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行った後、本発明のタンパク質をセミドライ式ブロッティング装置ＡＥ−６６７５（ＡＴＴＯ社）を用い、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。ペプチドシーケンサーＰＳＱ−１（島津製作所）にて、Ｎ末端アミノ酸配列を解読してその配列を配列表の配列番号：１に示した。操作方法は、それぞれの装置のマニュアルに従って行った。
アミノ酸配列：AlaTrpProAsnGlyProPheLysThrGluGlyArgTrpIleValAsnSerAsnGly（配列表：配列番号：１）
【００３４】
実施例２
本発明の酵素（タンパク質）をコードする遺伝子配列の決定
Ａ トータルＲＮＡの抽出：
フザリウム オキシスポラム（Fusarium oxysporum）１２Ｓ株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３８０）からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を使用し、トータルＲＮＡを抽出した。具体的にはＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ １２Ｓ株を前記したｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン培地１０ｍｌで５日間３０℃で振とう培養し、その菌体からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を用い、トータルＲＮＡを抽出した。操作方法は使用説明書にしたがって行った。
【００３５】
Ｂ（１） トータルＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成：
上記にて得られたトータルＲＮＡとＯｌｉｇｏ−ｄｔプライマー（Ｔ２０ＡＰ、配列番号：６）を混合し、逆転写により一本鎖ｃＤＮＡを得た。具体的にはトータルＲＮＡ５μｇにＯｌｉｇｏ（ｄｔ）プライマーを０．２５μｇ（５０ｐｍｏｌ）を入れ、ＤＥＰＣ水（日本ジーン社）にて１２μｌにｆｉｌｌ ｕｐして、反応液を調製した。反応液を７０℃で１０分間インキュベートし、その後、氷上で１０分間インキュベートした。その後、５×緩衝液（逆転写用）（TAKARA Bio）３．５μｌ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ） １μｌ、ｒｅｖｅｒａｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ ＲＮａｓｅＨ ｆｒｅｅ（TAKARA Bio） １μｌ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μｌを入れ、４２℃で１時間反応させた。その後、７０℃で１５分インキュベートし、反応をストップさせ、氷上で１０分間冷却した。その後、反応液にＲＮａｓｅＨ （TAKARA Bio）を１μｌ入れ、３７℃で３０分間反応させた。これにより一本鎖ｃＤＮＡを含む液を得た。
【００３６】
Ｔ２０ＡＰ
５‘−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN−３’（配列表：配列番号：６）
(V:A, G ｏｒ C)
【００３７】
Ｂ（２） ３’末端ＤＮＡのクローニング：
上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを利用して、上記したＮ末端アミノ酸配列より設計した２種のプライマー（ａｇ−ｆ１（配列番号：９）、ａｇ−ｆ２（配列番号：１０））および、Ｔ２０ＡＰ配列より設計した２種のプライマー（ＡＰ−１（配列番号：４）、ＡＰ−２（配列番号：５））を用いて、ＰＣＲを行った。一回目のＰＣＲはａｇ−ｆ１とＡＰ−１のプライマーセットを用いて、上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に行った。２回目のＰＣＲはａｇ−ｆ２とＡＰ−２のプライマーセットを用いて、一回目のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を鋳型に行った。２回のＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片をＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（invitrogen社製）にクローニングした。
具体的には一回目のＰＣＲは、上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを１μｌとり、１０×Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（TOYOBO）１０μｌに２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ を１０μｌ、蒸留水７８μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（TOYOBO）１μｌを加えて混合し、計１００μｌの反応液を調整した。その反応液にプライマーａｇ−ｆ１とＡＰ−１を２０ｐｍｏｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは９５℃２分間の熱変性の後、熱変性９４℃ １分間、アニーリング ５５℃ １分間、伸長反応 ７２℃ ２分間のサイクルを３０回行った。２回目のＰＣＲは一回目のＰＣＲ後の反応液を蒸留水で５００倍に薄めたもの１μｌに１０×Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（TOYOBO）１０μｌに２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ を１０μｌ、蒸留水７８μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（TOYOBO）１μｌを加えて混合し、計１００μｌの反応液を調整した。その反応液にプライマーａｇ−ｆ２とＡＰ−２を２０ｐｍｏｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は一回目と同様である。得られたＤＮＡ断片約１．４ＫｂｐをＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（invitrogen社製）にクローニングした。
ＡＰ１
5´−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3´（配列表：配列番号：４）
ＡＰ２
5´−ACTCACTATAGGGCGAGCGGC-3´（配列表：配列番号：５）
ａｇ−ｆ１
5´−TGGCCIAAYGGICCITTYAARACNGA-3´
(I:inosine, Y: C or T, R: A or G, N: A or T or G or C) （配列表：配列番号：９）
ａｇ−ｆ２
5´−TTYAARACIGARGGIMGITGGATHGT-3´
(M: A or C, H: A or T or C) （配列表：配列番号：１０）
【００３８】
Ｃ ３´側遺伝子の塩基配列：
上記方法によりクローニングした本発明タンパク質をコードする３´側遺伝子の塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ−ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（Beckman Coulter）を用い、ＤＮＡシーケンサーＣＥＱ ２０００ＸＬ（Beckman Coulter）により解読した。操作手順はすべてマニュアルに従った。決定された３´側遺伝子配列中には、本発明のタンパク質の推定ＴＡＧ終始コドンを含んでいた。
決定された塩基配列は本発明タンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列の７８番目から１２６３番目の塩基配列である。
【００３９】
Ｄ ５´側遺伝子のクローニング：
５´側の塩基配列は上記で得られた３´側塩基配列より設計された２種のプライマー（５／ａｇ１（配列番号：７）、５／ａｇ２（配列番号：８））およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ １２Ｓ株のゲノムライブラリー作製に用いたカセットに相補する２種のプライマー（Ｃ１、Ｃ２）により行った。
Ｃ１、Ｃ２として、下記するＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（TAKARA Bio社製）を用いた。
５／ａｇ１
5´−CTTCAACACCTTCTGAAGAATAATTGTACC-3´（配列表：配列番号：７）
５／ａｇ２
5´−AGATCAACGTCTTTACCATTGTTGGCGTAG―3´（配列表：配列番号：８）
【００４０】
Ｅ ゲノムライブラリーの作製：
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ １２Ｓ株のゲノムを抽出した。抽出したゲノムを制限酵素Ｓａｌ Ｉ（TAKARA Bio社製）で処理し、様々な断片をＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（TAKARA Bio社製）を用いて、カセットライゲーションを行い、ゲノムライブラリーを作製した。
具体的には、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ １２Ｓ株をｌａｒｃｈ ｗｏｏｄアラビノガラクタン含有培地１０ｍｌで３０℃で５日間培養し、菌体を回収した後、ＤＮＡ抽出キットであるＩＳＯＰＬＡＮＴＩＩ（日本ジーン）を用いてゲノムを抽出した。作業はマニュアルにしたがって行った。その後、得られたゲノム溶液５μｌに制限酵素Ｓａｌ Ｉを５０Ｕ、１０×Ｓａｌ Ｉ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、滅菌蒸留水５０μｌを入れ、３７℃で３時間反応させ、ゲノムを制限酵素処理した。その後、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（TAKARA Bio）を用いて、制限酵素処理したゲノムをＳａｌ Ｉカセットにライゲーションし、ゲノムライブラリーを得た。作業はマニュアルにしたがって行った。
【００４１】
Ｆ ５´側遺伝子のクローニング：
３´側塩基配列から設計された２種のプライマー（５／ａｇ１、５／ａｇ２）および上記にて作製したゲノムライブラリーのＳａｌ Ｉカセットに相補する２種のプライマー（Ｃ１、Ｃ２）（TAKARA Bio社製） により行った。一回目のＰＣＲはゲノム溶液を鋳型に５／ａｇ１とＣ１のプライマーセットを用いて行い、２回目のＰＣＲは一回目のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を鋳型に５／ａｇ２とＣ２をプライマーセットを用いて行った。得られたＤＮＡ断片をＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（invitorogen社製）にクローニングした。
具体的には一回目のＰＣＲは、上記で得られたゲノムを１μｌとり、１０×Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（TOYOBO社製）１０μｌに２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ を１０μｌ、蒸留水７８μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（TOYOBO社製）１μｌを加えて混合し、計１００μｌの反応液を調整した。その反応液にプライマー５／ａｇ１とＣ１を２０ｐｍｏｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは９５℃２分間の熱変性の後、熱変性９４℃ １分間、アニーリング ５５℃ １分間、伸長反応 ７２℃ ２分間のサイクルを３０回行った。二回目のＰＣＲは、上記一回目のＰＣＲで得られたＤＮＡ溶液を５００倍に薄めたものを１μｌとり、１０×Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（TOYOBO）１０μｌに２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ を１０μｌ、蒸留水７８μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（TOYOBO）１μｌを加えて混合し、計１００μｌの反応液を調整した。その反応液にプライマー５／ａｇ２とＣ２を２０ｐｍｏｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは９５℃２分間の熱変性の後、熱変性９４℃ １分間、アニーリング ５５℃ １分間、伸長反応 ７２℃ ２分間のサイクルを３０回行った。得られたＤＮＡ断片０．４ＫｂｐをＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（invitorogen）にクローニングした。
【００４２】
Ｇ ５´側塩基配列の決定：
上記方法によりクローニングした本発明タンパク質の５´側遺伝子の塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ−ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（Beckman Coulter）を用い、ＤＮＡシーケンサーＣＥＱ ２０００ＸＬ（Beckman Coulter）により解読した。操作手順はすべてマニュアルに従った。決定された５´側遺伝子配列の中には推定されるＡＴＧスタートコドンが存在した。
決定された塩基配列は全ｃＤＮＡ配列の１番目から７７番目の塩基配列である。
【００４３】
Ｈ 本発明のタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡのクローニング：
本発明タンパク質をコードする全長ｃＤＮＡのクローニングは３´末端ＤＮＡ配列から設計したプライマーｇａｌ１−ｓｔｏｐ（配列番号：１２）および５´末端ＤＮＡ配列から設計したプライマーｇａｌ１−ｓｔａｒｔ（配列番号：１１）を用い、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって行った。具体的には上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを１μｌとり、１０×Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（TOYOBO）１０μｌに２ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘ を１０μｌ、蒸留水７８μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（TOYOBO）１μｌを加えて混合し、計１００μｌの反応液を調整した。その反応液にプライマーｇａｌ１−ｓｔｏｐとｇａｌ１−ｓｔａｒｔをそれぞれ２０ｐｍｏｌ加え、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは９５℃２分間の熱変性の後、熱変性９４℃ １分間、アニーリング ５５℃ １分間、伸長反応 ７２℃ ２分間のサイクルを３０回行った。得られたＤＮＡ断片１２６３ｂｐをＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（invitorogen）にクローニングした。
ｇａｌ１−ｓｔｏｐ：５´−ＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＧＣＣＣＧ−３´（配列番号：１２）
ｇａｌ１−ｓｔａｒｔ：５´−ＡＴＧＡＡＧＣＴＡＴＴＣＧＴＣＡＧＣＣＣ−３´（配列番号：１１）
【００４４】
Ｉ 全ｃＤＮＡ塩基配列の決定：
上記方法によりクローニングした本発明タンパク質の全ｃＤＮＡ塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ−ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（Beckman Coulter）を用い、ＤＮＡシーケンサーＣＥＱ ２０００ＸＬ（Beckman Coulter）により解読した。操作手順はすべてマニュアルに従った。
解読された本発明のタンパク質をコードする全ｃＤＮＡは１２６３ｂｐであった。
配列表：配列番号：３に示した。
【００４５】
ATGAAGCTATTCGTCAGCCCTCTCCTGGCACTCAGCTGCCTCATCGGCAATGCTGTAGCAGCATGGCCCAA
TGGACCTTTCAAAACCGAAGGTCGTTGGATCGTCAACTCCAATGGTGACAAGATCAGCCTCGCTGGAGCCA
ACTGGCCCGGCCACGGCGAAGTCATGGTCCCCGAAGGTCTGCAGTACCAATCCATCAAGGATGTTCTCTCC
GATATTAAGAGCATTGGCATGAACGCTATTCGCCTCACCTTCGCCACTGAGCTTGTTGACCAGATCTACGC
CAACAATGGTAAAGACGTTGATCTCAAGACTGCCTTCGAGGAAGGCCTTGGAAAGGAGAATGGTACAATTA
TTCTTCAGAAGGTGTTGAAGAACAACCCTTCTTTCACCGCTCAGACAACACGTCTTGAGGTCTACGACGCC
ATTGCTGCTGAGTGTCTCCGTCAACAGATCTACATCGACCTTGACAACCACATTTCTGAGGCTAAGTGGTG
CTGCGGCGGTACAGATGGCAACACTTGGTGGGGAGATACCCAGTTTAATGTCGACAACTGGGTTCGAGGTG
GCAAATACATGGCAGCTCACAGCAAGAAATGGCCCGCCAAGATCACCCAGTCTCTGCGCAACGAGCCCCGC
GAACCTACAAACAACAATGCTCTCCGTGACAAGTCATACAACTGGAGTGATCTCTACAAGTACATGCGCCA
AGGTGCTGATGCAGTCCATGAGGCCGATCCCGAGGCAATCATCGTCATCTCCGGCATGAACTACGACACCT
ACGTCACTCCTCTCTATTCCGGTGAGAAGCTTCAGCCAGGAGGCGAAGTCTTTAACAGAGATGACTTTGTC
GGCTATGGCAAGGATAAGCTAGTTCTTGAGATTCACAACTACGAGAACAAGGGAACAAGCTGCTCTTCTCT
TCGCTACAATCTCTACAACAAGGGATTCCAGGCCATGAACGAGAGCGATCCCAATGTCGCTGAGGTCTTCC
CCGTCATGCTGACTGAGTTTGGTCAAGCTATGAATGGTGCCGATTACGACACTGCCAACACTTACGTGAGC
TGCTTGTCGGAGTATCTGCCTGAAATTAAGGCTAGTTGGTTCATTTGGGTTATTGTTGGTCGCTACTATAC
TCGTCAGGGCATCCAGGAGTTTGATGATTCTTGGGGTATGAAGAAGGCTGATTGGTCGGGATGGAAGAACG
ATGACTACATTGCGAAATACCTCAAGCCTCAGATTGCGGGCACTTTGAAGAAGTAG
【００４６】
Ｊ 全アミノ酸配列：
上記で得られた塩基配列から全アミノ酸配列を配列表の配列番号：２のように決定した。
MetLysLeuPheValSerProLeuLeuAlaLeuSerCysLeuIleGlyAsnAlaValAlaAlaTrpProAsnG
lyProPheLysThrGluGlyArgTrpIleValAsnSerAsnGlyAspLysIleSerLeuAlaGlyAlaAsn
TrpProGlyHisGlyGluValMetValProGluGlyLeuGlnTyrGlnSerIleLysAspValLeuSerAsp
IleLysSerIleGlyMetAsnAlaIleArgLeuThrPheAlaThrGluLeuValAspGlnIleTyrAlaAsn
AsnGlyLysAspValAspLeuLysThrAlaPheGluGluGlyLeuGlyLysGluAsnGlyThrIleIleLeuG
lnLysValLeuLysAsnAsnProSerPheThrAlaGlnThrThrArgLeuGluValTyrAspAlaIleAla
AlaGluCysLeuArgGlnGlnIleTyrIleAspLeuAspAsnHisIleSerGluAlaLysTrpCysCysGly
GlyThrAspGlyAsnThrTrpTrpGlyAspThrGlnPheAsnValAspAsnTrpValArgGlyGlyLys
TyrMetAlaAlaHisSerLysLysTrpProAlaLysIleThrGlnSerLeuArgAsnGluProArgGluPro
ThrAsnAsnAsnAlaLeuArgAspLysSerTyrAsnTrpSerAspLeuTyrLysTyrMetArgGlnGly
AlaAspAlaValHisGluAlaAspProGluAlaIleIleValIleSerGlyMetAsnTyrAspThrTyrValThr
ProLeuTyrSerGlyGluLysLeuGlnProGlyGlyGluValPheAsnArgAspAspPheValGlyTyr
GlyLysAspLysLeuValLeuGluIleHisAsnTyrGluAsnLysGlyThrSerCysSerSerLeuArgTyrA
snLeuTyrAsnLysGlyPheGlnAlaMetAsnGluSerAspProAsnValAlaGluValPheProVal
MetLeuThrGluPheGlyGlnAlaMetAsnGlyAlaAspTyrAspThrAlaAsnThrTyrValSerCys
LeuSerGluTyrLeuProGluIleLysAlaSerTrpPheIleTrpValIleValGlyArgTyrTyrThrArgGln
GlyIleGlnGluPheAspAspSerTrpGlyMetLysLysAlaAspTrpSerGlyTrpLysAsnAspAspTyrI
leAlaLysTyrLeuLysProGlnIleAlaGlyThrLeuLysLys
【００４７】
実施例３
ガラクトビオースの製造：
２０％ｌａｒｃｈ ｗｏｏｄ アラビノガラクタン（２０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０）４．５ｍｌに本発明酵素０．５ｍｌ（６ｍＵに相当）を入れ、３７℃で３日間反応させた。反応液を１００℃で５分間処理することによって、酵素を失活させた。その後、反応液からガラクトビオースを精製した。具体的には、反応液に１５ｍｌのエタノールを加え、未反応の多糖を沈殿させたあと、遠心分離にて、沈殿物を取り除いた。上澄を回収し、エバポレーターにより、２ｍｌにまで、濃縮した。その後、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーであるＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２ ｃｏｌｕｍｎ（２．５ｘ４８ｃｍ、Bio-rad）に流した。本ゲルろ過カラムの展開溶媒は２０ｍＭのＮａＣｌ水溶液を用いた。カラムクロマトの溶出画分を２ｍｌずつ分取し、各フラクションをＨＰＬＣ（Dionex Dxc-500、使用カラムCarbopac-PA-1）にて分析した。展開溶媒は０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液に０〜０．３Ｍ酢酸ナトリウムのリニアーグラジエントをかけるようにして行った（流速１．０ｍｌ／分）。ガラクトビオースのピークを認めたフラクションを回収し、その溶液を両イオン交換樹脂であるＡＧ ５０１−Ｘ８（Ｄ）（Bio-rad社製）で処理した。具体的には樹脂を液に入れ、濾過して除いている。その結果、精製ガラクトビオース約５ｍｇを得た。得られたガラクトビオースをＫＲＡＴＯＳ質量分析装置（島津製作所）分析した結果、分子量は３６４．４であった。操作はマニュアルに従っておこなった。また、精製したガラクトビオースを酸加水分解したのち、ＨＰＬＣ（上記と同じ条件）にて分析した結果、保持時間５．１６分にガラクトースの単一ピークを認めた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、従前利用することができなかった木質系のアラビノガラクタン、即ち、ＩＩ型アラビノガラクタンからガラクトビオースを造ることができ、多く存在するバイオマス資源を利用することができる。更に、新規な性能を備えた酵素（ペプチド）が提供され、新たな酵素製剤の提供も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明により提供される酵素（ペプチド）の至適温度、指摘ｐＨ、温度安定性、ｐＨ安定性を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３で表される塩基配列を有するＤＮＡ叉は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡによってコードされる配列番号：２記載のアミノ酸配列又は配列番号：２記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素。
【請求項３】
以下に示す物理化学的性質を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素。
作用
ＩＩ型アラビノガラクタンに作用しガラクトビオースを生成する。
基質特異性
Ｉ型アラビノガラクタンには作用せずＩＩ型アラビノガラクタンに作用し、分解物としてガラクトビオースを与える。
分子量
５２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（エンドグルコシダーゼにより４８０００となる。）
安定ｐＨ範囲
４．１〜９．９
至適ｐＨ
４．０〜６．９
温度安定性
６０℃で一時間まで安定
至適温度
５０℃
金属塩の影響
下記金属イオン１ｍＭ濃度水溶液中、３７℃３０分経過後の残存活性が、水銀８０％、鉄６５％、亜鉛６０％。銀５０％、銅４５％、カドミウム４０％を示し、本酵素の活性はバリウム、カルシウム、コバルト、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、ニッケルまたはＥＤＴＡによる影響は受けない。
【請求項４】
ＩＩ型アラビノガラクタンを基質とし、請求項２又は３記載のアラビノガラクタン分解酵素を作用させ、ガラクトビオースを製造することを特徴とするガラクトビオースの製造方法。
【請求項５】
フザリウム属由来の酵素である請求項２又は３のいずれかに記載の酵素。
【請求項６】
アラビノガラクタン分解酵素がフザリウム属由来の酵素である請求項４記載の製造方法。
【請求項７】
フザリウム属に属する菌株をＩＩ型アラビノガラクタンを基質として含む培地で培養し、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを生産する酵素を得ることを特徴とする配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する又は請求項３記載の物理化学的性質を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素の製造方法。
【請求項８】
フザリウム属に属し、ガラクトビオースを生産する生産菌。
【請求項９】
フザリウム オキシスポラム １２Ｓ（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３８０）である請求項８記載の生産菌。
【請求項１０】
フザリウム属に属するガラクトビオースを生産する生産菌をＩＩ型アラビノガラクタンを含む培地で培養し、培地からガラクトビオースを採取することを特徴とするガラクトビオースの製造方法。
【請求項１】
配列番号：３で表される塩基配列を有するＤＮＡ叉は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡによってコードされる配列番号：２記載のアミノ酸配列又は配列番号：２記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素。
【請求項３】
以下に示す物理化学的性質を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素。
作用
ＩＩ型アラビノガラクタンに作用しガラクトビオースを生成する。
基質特異性
Ｉ型アラビノガラクタンには作用せずＩＩ型アラビノガラクタンに作用し、分解物としてガラクトビオースを与える。
分子量
５２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（エンドグルコシダーゼにより４８０００となる。）
安定ｐＨ範囲
４．１〜９．９
至適ｐＨ
４．０〜６．９
温度安定性
６０℃で一時間まで安定
至適温度
５０℃
金属塩の影響
下記金属イオン１ｍＭ濃度水溶液中、３７℃３０分経過後の残存活性が、水銀８０％、鉄６５％、亜鉛６０％。銀５０％、銅４５％、カドミウム４０％を示し、本酵素の活性はバリウム、カルシウム、コバルト、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、ニッケルまたはＥＤＴＡによる影響は受けない。
【請求項４】
ＩＩ型アラビノガラクタンを基質とし、請求項２又は３記載のアラビノガラクタン分解酵素を作用させ、ガラクトビオースを製造することを特徴とするガラクトビオースの製造方法。
【請求項５】
フザリウム属由来の酵素である請求項２又は３のいずれかに記載の酵素。
【請求項６】
アラビノガラクタン分解酵素がフザリウム属由来の酵素である請求項４記載の製造方法。
【請求項７】
フザリウム属に属する菌株をＩＩ型アラビノガラクタンを基質として含む培地で培養し、ＩＩ型アラビノガラクタンを分解してガラクトビオースを生産する酵素を得ることを特徴とする配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する又は請求項３記載の物理化学的性質を有するＩＩ型アラビノガラクタン分解酵素の製造方法。
【請求項８】
フザリウム属に属し、ガラクトビオースを生産する生産菌。
【請求項９】
フザリウム オキシスポラム １２Ｓ（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３８０）である請求項８記載の生産菌。
【請求項１０】
フザリウム属に属するガラクトビオースを生産する生産菌をＩＩ型アラビノガラクタンを含む培地で培養し、培地からガラクトビオースを採取することを特徴とするガラクトビオースの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−２１１９３８（Ｐ２００６−２１１９３８Ａ）
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２７０１５（Ｐ２００５−２７０１５）
【出願日】平成１７年２月２日（２００５．２．２）
【出願人】（５９１０１８５３４）奥本製粉株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２日（２００５．２．２）
【出願人】（５９１０１８５３４）奥本製粉株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
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