アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤
アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤、並びにそのスクリーニング方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤、並びにアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢者における痴呆症の主なものであるアルツハイマー病の病態の全容と真の発症原因は未だ解明されておらず、その抜本的な予防・治療法も確立されていない。しかしながら、発症メカニズムについては、「アミロイド仮説」が提唱され、アルツハイマー病患者の病理学的所見、及び家族性アルツハイマー病の遺伝学的解析から、広く受け入れられることとなった（非特許文献１）。
【０００３】
これは、アルツハイマー病の発症と進行に、アミロイドと呼ばれる一群のタンパク質の脳（大脳皮質）への異常蓄積が関与するという説である。簡単には、βＡＰＰ（β−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる１回膜貫通型タンパク質の細胞外側がβセクレターゼによって切断を受け（βカット）、引き続きそのＣ末端側断片がγセクレターゼによって切断を受け（γカット）、Ｎ末端側断片（β４０又はβ４２）及びＣ末端側断片（Ｃ６０又はＣ５８（以下、集合的にＡＩＣＤともいう））が産生される。これらの断片のうち、Ｎ末端側断片（β４０又はβ４２）は凝集性が高く、アミロイドを形成し、細胞外に老人斑として蓄積される。このようなアミロイドの産生、凝集及び蓄積が神経細胞障害を引き起こし、神経細胞を細胞死に至らせる。
【非特許文献１】富田泰輔ら、細胞工学、２００１年、第２０巻、第１１号、ｐ．１４８９−１４９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
「アミロイド仮説」に基づいて、アルツハイマー病の予防法（予防薬）・治療法（治療薬）の開発が行われてきたが、それらは、βセクレターゼ及びγセクレターゼの阻害薬、並びに抗アミロイド抗体などである。しかしながら、アルツハイマー病は多因子性疾患であり、アミロイド仮説のみに基づくドラッグデザインでは、アルツハイマー病の予防法（予防薬）・治療法（治療薬）として十分ではないことも指摘されている。
【０００５】
そこで、本発明は、アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤、並びにそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明は、神経細胞においてＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法により、アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤を得ることができる。
【０００７】
上記スクリーニング方法は、
ＡＩＣＤ及びｐ５３が発現し、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はｐ５３と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備えることが好ましい。
【０００８】
このようなスクリーニング方法で得ることのできる、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物は、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤の薬効成分となり得る。
【０００９】
このような薬剤として、ｃ−Ａｂｌ及び／又はｐ１９ＡＲＦを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤が提供される。
【００１０】
ｐ５３は、核内に存在する転写因子であり、細胞周期の制御やＤＮＡの修復を担い、また、細胞分化、細胞老化、血管新生、細胞死（アポトーシス）等を引き起こす。一方、ＡＩＣＤについては、その細胞内での挙動やアルツハイマー病との関わりはよく知られていなかったが、近年、ＡＩＣＤが核内に移行して転写活性化に関与することが報告された（Ｘｉｎｗｅｉ Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，１１５−１２０，（２００１））。
【００１１】
本発明者らは、アルツハイマー病発症の分子生物学的メカニズムの１つとして、ＡＩＣＤが核内に移行してｐ５３との間で何らかの相互作用を引き起こし、その結果、神経細胞が細胞死を受けやすくなり、アルツハイマー病が発症するという仮説を考えた。図１は、アミロイド仮説、並びにアルツハイマー病の発症におけるＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用の関与を説明する模式図である。
【００１２】
そして、本発明者らは、ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用によるｐ５３の安定化がｐ５３の転写因子活性や細胞増殖抑制能、細胞死誘導能等のｐ５３特有の活性を高めて、神経細胞の細胞死を誘導することを見出した。この発見に基づいて、ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する物質はアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物になると考えた。
【００１３】
ｃ−Ａｂｌ及びｐ１９ＡＲＦは、Ｍｄｍ２がｐ５３に結合するのを拮抗的に阻害するタンパク質である（Ｒ．Ｖ．Ｓｉｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，６１４５−６１５７，（１９９９））ので、ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害すると考えられる。
【００１４】
本発明はまた、神経細胞においてＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法によっても、アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤を得ることができる。
【００１５】
上記スクリーニング方法は、
ＡＩＣＤ及びＦｅ６５が発現し、ＡＩＣＤ／Ｆｅ６５複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｆｅ６５抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はＦｅ６５と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／Ｆｅ６５複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｆｅ６５抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備えることが好ましい。
【００１６】
このようなスクリーニング方法で得ることのできる、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物は、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤の薬効成分となり得る。
【００１７】
このような薬剤として、ＡｌｃＩＣＤを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤が提供される。また、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤が提供される。
【００１８】
核受容体タンパク質Ｆｅ６５は、ＡＩＣＤと複合体を形成し、Ｇａｌ４及びヒストンアセチルトランスフェラーゼＴｉｐ６０の融合タンパク質による転写を活性化することが知られている（Ｘｉｎｗｅｉ Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，１１５−１２０，（２００１））。この知見に基づいて、本発明者らは、Ｆｅ６５がＡＩＣＤと相互作用してＡＩＣＤの核内移行を促進する物質であり、ＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する物質は、間接的にＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害し、アルツハイマー病の発症を抑制すると考えた。
【００１９】
ＡｌｃＩＣＤは、ＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する物質である（Ａｒａｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９，２４３４３−２４３５４（２００４））。また、Ｆｅ６５におけるＡＩＣＤの結合部位はＰＴＢ２ドメインであり、ＡＩＣＤにおけるＦｅ６５の結合部位のアミノ酸配列はＮＰＴＹ配列であることが知られている（Ｘｉｎｗｅｉ Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，１１５−１２０，（２００１））。配列表の配列番号１は、Ｆｅ６５におけるＰＴＢ２ドメインのアミノ酸配列を示す配列である。配列表の配列番号２は、ＮＰＴＹ配列を示す配列である。配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドは、ＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害すると考えられる。
【００２０】
本発明はまた、神経細胞においてＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法によっても、アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤を得ることができる。
【００２１】
上記スクリーニング方法は、
ＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０が発現し、ＡＩＣＤ／Ｔｉｐ６０複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｔｉｐ６０抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はＴｉｐ６０と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／Ｔｉｐ６０複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｔｉｐ６０抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備えることが好ましい。
【００２２】
このようなスクリーニング方法で得ることのできる、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物は、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤の薬効成分となり得る。
【００２３】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼＴｉｐ６０は、核内でＡＩＣＤと複合体を形成して神経膠腫細胞の細胞死（アポトーシス）を引き起こすことが知られている（Ａｙａｅ Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２８５３０−２８５３６，（２００２））。この知見に基づいて、本発明者らは、Ｔｉｐ６０がＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を促進する物質であり、ＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０の相互作用を阻害する物質はアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物になると考えた。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤、並びにそのスクリーニング方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、アミロイド仮説、並びにアルツハイマー病の発症におけるＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用の関与を説明する模式図である。
【図２】図２は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。
【図３】図３は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。
【図４】図４は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。
【図６】図６は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。
【図７】図７は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【図８】図８は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。
【図９】図９は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ｐ５３発現細胞でｐ５３を強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数を示すグラフである。
【図１４】図１４は、シスプラチンの量とＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率との関係を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するシスプラチン処理によって得られた産物の免疫ブロットの結果を示す図である。
【図１６】図１６は、Ｃ６０を強制発現させたＵ２０Ｓ細胞の核画分と細胞質画分の免疫ブロットの結果を示す図である。
【図１７】図１７は、Ｃ６０を強制発現させたＵ２ＯＳ細胞を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色したものを共焦点走査顕微鏡で観察した写真に対応する図である。
【図１８】図１８は、Ｃ５８又はＣ６０を強制発現させたＣＯＳ７細胞の免疫ブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。
【００２７】
（ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用）
ｐ５３の転写因子活性、細胞死誘導能（アポトーシス活性）などに関する種々のアッセイをβＡＰＰ及び／又はＡＩＣＤの存在下で行うことによって、βＡＰＰ又はＡＩＣＤとｐ５３との相互作用について検討することができる。
【００２８】
ｐ５３の転写因子活性に対するβＡＰＰの影響：
ｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞にさらにｐ５３遺伝子を導入すると、ｐ５３に反応するプロモーター（ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ）活性が上がることが知られている。そこで、ｐ５３の代わりにβＡＰＰをコードする遺伝子を導入することによってこれらのプロモーター類の活性が上がるか否かを試験する。試験には、転写因子の機能解析の標準的な手法であるルシフェラーゼアッセイ（ルシフェラーゼリポーターアッセイ）を用いる。
【００２９】
具体的には、野性型のｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞にβＡＰＰの発現ベクター、及びｐ５３に反応するプロモーター（ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ）を含有するレポーターベクターを導入する。４８時間後、細胞を回収してそのルシフェラーゼ活性を測定する。このようにして得られたルシフェラーゼ活性測定結果を、各プロモーターについて図２〜４に示す。
【００３０】
図２は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。図３は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。図４は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【００３１】
図２〜４から、βＡＰＰの強制発現によって、ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ由来のプロモーターの活性がいずれも顕著に上昇したことが分かる。βＡＰＰは、内在性のセクレターゼによりＣ６０又はＣ５８を産生していると考えられる。さらに、Ｕ２ＯＳ細胞は野性型ｐ５３を発現している。従って、Ｃ６０又はＣ５８によるｐ５３の活性化が示唆される。
【００３２】
次に、ｐ５３とβＡＰＰを併用することでｐ５３の活性がさらに上がるか否かを試験する。試験には上述の試験と同様にルシフェラーゼアッセイを用いる。
【００３３】
具体的には、野性型のｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞にβＡＰＰの発現ベクター、ｐ５３の発現ベクター、及びｐ５３に反応するプロモーター（ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ）を含有するレポーターベクターを導入する。４８時間後、細胞を回収して、そのルシフェラーゼ活性を測定する。このようにして得られたルシフェラーゼ活性測定結果を、各プロモーターについて図５〜７に示す。
【００３４】
図５は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。図６は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。図７は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【００３５】
図５〜７から、βＡＰＰ及びｐ５３の強制発現によって、ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ由来のプロモーターの活性がいずれも、βＡＰＰを単独で強制発現させた場合に比べて、顕著に上昇したことが分かる。従って、前述の試験の結果と同様に、Ｃ６０又はＣ５８によるｐ５３の活性化が示唆される。
【００３６】
ネガティブコントロ一ルとして、ｐ５３を発現しない細胞を用いて、同様の試験を繰り返す。
【００３７】
野性型ｐ５３を欠くＨ１２９９細胞にβＡＰＰの発現ベクター、及びｐ５３に反応するプロモーター（ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ）を含有するレポーターベクターを導入する。４８時間後、細胞を回収してそのルシフェラーゼ活性を測定する。このようにして得られたルシフェラーゼ活性の測定結果を、各プロモーターについて図８〜１０に示す。
【００３８】
図８は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。図９は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。図１０は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【００３９】
図８〜１０から、βＡＰＰの強制発現によっても、ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ由来のプロモーターの活性が上昇しなかったことが分かる。Ｈ１２９９細胞が野性型ｐ５３を欠くことから、前記Ｕ２ＯＳ細胞で観察されたβＡＰＰによるｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘプロモーターの活性化はβＡＰＰによるｐ５３の活性化に起因することが示唆される。
【００４０】
ｐ５３の細胞増殖抑制能及び細胞死誘導能：
上述の試験で用いるＵ２ＯＳ細胞でｐ５３が本来の細胞増殖抑制能及び細胞死誘導能を呈するか否かを試験する。
【００４１】
野性型のｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞にｐ５３の発現ベクターを導入した後、細胞をＧ４１８存在下で培養する。２週間後、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数を測定する。得られた結果を図１１に示す。図１１は、ｐ５３発現細胞でｐ５３を強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数を示すグラフである。
【００４２】
図１１から、ｐ５３の強制発現によって、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数が顕著に減少したことが分かる。従って、Ｕ２ＯＳ細胞ではｐ５３依存性の細胞増殖抑制又は細胞死が起こっていることが確認される。
【００４３】
ｐ５３の細胞増殖抑制能及び細胞死誘導能に対するβＡＰＰの影響：
次に、βＡＰＰを導入することで内在性ｐ５３の細胞増殖抑制能及び細胞死誘導能に変化があるか否かを試験する。試験には、上述の試験と同様にコロニー形成アッセイを使用する。
【００４４】
野性型のｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞にβＡＰＰの発現ベクターを導入した後、細胞をＧ４１８存在下で培養する。２週間後、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数を測定する。得られた結果を図１２に示す。図１２は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数を示すグラフである。
【００４５】
図１２から、βＡＰＰの強制発現によって、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数が減少したことが分かる。従って、Ｕ２ＯＳ細胞ではβＡＰＰ依存性の細胞増殖抑制又は細胞死が起こっていることが分かる。
【００４６】
ネガティブコントロールとして、野性型ｐ５３を発現しないＨ１２９９細胞で同様の試験を繰り返した。すなわち、野性型ｐ５３を欠くＨ１２９９細胞にβＡＰＰの発現ベクターを導入した後、細胞をＧ４１８存在下で培養する。２週間後、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数を測定する。得られた結果を図１３に示す。図１３は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数をを示すグラフである。
【００４７】
図１３から、βＡＰＰの強制発現によっても、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数が減少しなかったことが分かる。従って、上述の試験で観察されたβＡＰＰ依存性の細胞増殖抑制又は細胞死誘導には野性型ｐ５３の存在が必要であると考えられる。
【００４８】
シスプラチンによる細胞死誘導：
腫瘍細胞は、ＤＮＡ阻害性の薬剤であるシスプラチンで処理すると用量依存的に細胞死を起こすことが認められている。この際、ｐ５３が関与していることも分かっている。このように内在性ｐ５３を誘導することが知られているシスプラチンを用いて、ｐ５３による細胞死誘導とβＡＰＰとの関連を調べる。そのため、まず、シスプラチンによる細胞死の誘導を確認する。
【００４９】
神経芽腫由来の細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を腫瘍細胞として使用する。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をシスプラチンで処理した後、細胞生存率をＭＴＴ法で測定する。得られた結果を図１４に示す。図１４は、シスプラチンの量とＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率との関係を示すグラフである。
【００５０】
図１４から、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞がシスプラチンの用量に依存して減少したことが分かる。シスプラチンによってＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞死が誘導されることが確認される。
【００５１】
次に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するシスプラチン処理によって得られた産物を免疫ブロット及び免疫沈降により分析する。すなわち、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をシスプラチンで処理した後、ｐ５３、ｐ２１、βＡＰＰ及びＡｃｔｉｎの発現量を免疫ブロットで分析する。さらに、βＡＰＰ由来の産物とｐ５３との相互作用を免疫沈降及び免疫ブロットによって解析する。得られた結果を図１５に示す。図１５は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するシスプラチン処理によって得られた産物の免疫ブロットの結果を示す図である。図中、「ＩＰ」は免疫沈降を、「ＩＢ」は免疫ブロットを指す。
【００５２】
図１５の上から２段目の図は、抗ｐ５３抗体を用いた免疫ブロットの結果を示す図である。この図から、シスプラチンによる内在性ｐ５３の誘導が確認される。図１５の上から３段目の図は、抗ｐ２１抗体を用いた免疫ブロットの結果を示す図である。この図から、シスプラチン処理の際に発現したｐ５３がその下流のｐ２１の発現を促進していること、すなわち活性型であることが分かる。図１５の最上段の図は、細胞溶解液（破砕液）を抗βＡＰＰ抗体で免疫沈降させ、沈降物を抗ｐ５３抗体で免疫ブロットした結果を示す図である。この図から、シスプラチン処理群にはｐ５３が存在していることが分かり、βＡＰＰ由来の産物とｐ５３との物理的な結合が確認される。βＡＰＰは膜上に存在し、ｐ５３は核内に存在するため、物理的に両者が結合することは考えられない。従って、これはβＡＰＰの分解産物であるＣ６０又はＣ５８が核内へ移行し、ｐ５３と結合していることを示唆している。シスプラチンによるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞死の誘導は、内在性ｐ５３の安定化に伴う活性化によるものであり、その際にβＡＰＰ由来の産物とｐ５３との相互作用が機能的に関与していることが示唆される。
【００５３】
βＡＰＰ由来の産物Ｃ６０の核への局在化：
Ｃ６０をコードする遺伝子を人工的に作成して、その発現及び核への局在化を確認する。Ｃ６０は非常に不安定であることが知られているので、そのＣ末端側にＦＬＡＧエピトープを付加する。
【００５４】
Ｕ２ＯＳ細胞にＦＬＡＧ標識したＣ６０を強制発現させた後、細胞の核画分及び細胞質画分を調製し、Ｃ６０の分布を免疫ブロットによって調べる。得られた結果を図１６に示す。図１６は、Ｃ６０を強制発現させたＵ２ＯＳ細胞の核画分と細胞質画分の免疫ブロットの結果を示す図である。図中、「Ｃ」は細胞質画分を、「Ｎ」は核画分を指す。また、「ＩＢ」は免疫ブロットを指す。核マトリックスに存在するＬａｍｉｎＢは核マーカーとして用いられている。細胞質に存在するｒａｓは細胞質マーカーとして用いられている。図１６から、Ｃ６０が核に局在することが分かる。
【００５５】
また、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫染色法で、Ｃ６０の分布を生化学的に観察する。得られた顕微鏡での観察結果を図１７に示す。図１７は、Ｃ６０を強制発現させたＵ２ＯＳ細胞を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色したものを共焦点走査顕微鏡で観察した写真に対応する図である。図中、「ＦＬＡＧ−Ｃ６０」はＣ６０の分布を、「ＤＡＰＩ」は核マーカーＤＡＰＩの分布を示す写真に対応する図であり、「Ｍｅｒｇｅ」は上記２種の写真を重ね合わせて合成した写真に対応する図である。図１７から、Ｃ６０の分布がＤＡＰＩの分布と重なることが分かり、Ｃ６０の核への局在化が確認される。
【００５６】
βＡＰＰ由来の産物Ｃ５８又はＣ６０とｐ５３との相互作用：
既に上述の試験の結果によりｐ５３がβＡＰＰと相互作用することが示峻されているが、さらにその相互作用がＣ５８又はＣ６０との結合か否かを試験する。
【００５７】
ＦＬＡＧ標識したＣ５８又はＣ６０をＣＯＳ７細胞に強制発現させた後、ｐ５３との相互作用の有無を免疫沈降により検討する。得られた結果を図１８に示す。図１８は、Ｃ５８又はＣ６０を強制発現させたＣＯＳ７細胞の免疫ブロットの結果を示す図である。図中、「ＩＰ」は免疫沈降を、「ＩＢ」は免疫ブロットを指す。
【００５８】
図１８の最上段の図は、細胞溶解液（破砕液）を抗ｐ５３抗体で免疫沈降させ、沈降物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫ブロットした結果を示す図である。図１８から、Ｃ５８及びＣ６０とｐ５３とが結合していることが分かる。βＡＰＰによるｐ５３の活性化はβＡＰＰ由来の産物Ｃ５８及びＣ６０とｐ５３との物理的結合を介した現象であることが示唆される。
【００５９】
アルツハイマー病はβＡＰＰの分解産物であるβ４２又はβ４０が細胞膜に沈着して、神経細胞の細胞死が起こる結果生じるというのがこれまでの定説であった。しかしながら、前述の結果により、Ｃ末端側に産生するＡＩＣＤが核内に移行し、核内のｐ５３と相互作用してｐ５３の安定化を高め、転写因子活性や細胞増殖抑制能、細胞死誘導能等のｐ５３特有の活性を高め、神経細胞の細胞死を誘導することが分かる。すなわち、アルツハイマー病の発症にＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用が関与していることが示唆される。
【００６０】
上述の知見は、ＡＩＣＤ及びｐ５３の核内での相互作用に干渉するような薬物が新たなアルツハイマー病の予防・治療薬になり得ることを示している。ＡＩＣＤが核内に移行しなければ、ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用は生じない。そこで、１つのアプローチとして、ＡＩＣＤの核内移行を阻害する薬物の発見、開発が考えられる。また、別のアプローチとして、ＡＩＣＤを分解する薬物の発見、開発が考えられる。さらに、ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する薬物の発見、開発が考えられる。なお、βＡＰＰからＡＩＣＤを産生する酵素であるβ、γセクレターゼの阻害薬の開発は既に進められている（富田ら、前掲）。ここでいう候補薬物とは、核酸、タンパク質、その他の高分子化合物、低分子化合物（化学合成又は天然由来）などである。
【００６１】
（アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤）
本発明は、ｃ−Ａｂｌ及び／又はｐ１９ＡＲＦを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤を提供する。また、ＡｌｃＩＣＤを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤を提供する。さらに、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤を提供する。上記ペプチドは、公知の方法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相合成法）によって合成することができる。
【００６２】
これらの薬剤は、有効量の有効成分を薬学的に許容される担体、もしくは希釈剤と混合して、適当な剤形としたものである。投与に適した剤形は、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等である。アルツハイマー病を患う患者又はその前駆症状としての痴呆症状を示す患者に経口的に、又は非経口的に投与される。
【００６３】
（アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物のスクリーニング方法）
本発明はまた、神経細胞においてＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、例えば、Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（例えば、Ｇｙｕｒｉｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ，７５，７９１−８０３（１９９３）；Ｇｏｌｅｍｉｓ，Ｅ．Ａ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）Ｃｈ．２０．０−２０．１，（１９９６））により実施できる。
【００６４】
上記スクリーニング方法は免疫学的手法により実施することが好ましい。すなわち、上記スクリーニング方法は、
ＡＩＣＤ及びｐ５３が発現し、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はｐ５３と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備えることが好ましい。
【００６５】
具体的には、神経細胞内でＡＩＣＤ分子及びｐ５３分子を発現させ、一定時間候補薬物とともに培養した後、細胞を粉砕して細胞溶解液を調製する。一方の分子に対する抗体で免疫沈降させ、沈殿中に含まれる他方の分子を免疫学的手法（免疫ブロット等）で検出、定量することで、候補薬物の両分子の相互作用に及ぼす影響を測定する。ここで、上記培養系に適当なアゴニストと候補薬物とを同時に添加して、上記アッセイを行い、候補薬物を含まない細胞からの免疫沈降物と比較することにより、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物のスクリーニングが可能である。
【００６６】
本発明はまた、神経細胞においてＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。さらに、神経細胞においてＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。これらのスクリーニング方法の好適な実施形態は、ｐ５３の代わりにＦｅ６５又はＴｉｐ６０を用いる他は、前述のスクリーニング方法と同様である。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法で得ることのできる、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物は、アルツハイマー病を患う患者又はその前駆症状としての痴呆症状を示す患者に経口的に、又は非経口的に投与する。得られる薬物は薬学的組成物として調製される。すなわち、有効量の前記薬物を薬学的に許容される担体、もしくは希釈剤と混合して、適当な剤形とする。投与に適した剤形は、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等である。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００６９】
（細胞培養及びトランスフェクション）
ＣＯＳ７及びヒト骨肉種Ｕ２ＯＳ細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）に維持した。Ｈ１２９９ヒト肺大細胞癌細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳとペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０倍地に維持した。細胞は、空気中水飽和５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で培養した。一過的トランスフェクションは、製造者の指示書に従って、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を用いて、各発現プラスミド又は所定の組合せで実施した。Ｕ２ＯＳ細胞とＨ１２９９細胞の一過的トランスフェクションは、製造者の指示書に従って、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）を用いて実施した。
【００７０】
（ルシフェラーゼアッセイ）
Ｕ２ＯＳ細胞を１２ウエルのプレート上で増殖させ（５×１０４細胞／ウエル）、ｐ５３とｐ２１ＷＡＦ１、ＭＤＭ２又はＢａｘプロモーターを含むｐ５３反応性ルシフェラーゼレポーター構築体の発現プラスミドの一定量、及び必要な場合にはβＡＰＰの発現プラスミドの漸増量を用いて、細胞を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション当たりプラスミドＤＮＡの全量をｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で一定量（５１０ｎｇ）に保った。トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクトされた細胞を回収し、氷冷１×ＰＢＳで洗浄した。ルシフェラーゼ活性は、製造者の指示書に従って、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。
【００７１】
（コロニー形成アッセイ）
Ｕ２ＯＳ細胞は、ｐ５３をコードする発現プラスミドの漸増量の存在下、又は存在なしにトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ（最終濃度））を含む培地中に細胞を維持した。２週間の選択の後、プレートをギムザ染色液（Ｇｉｅｍｓａ）で染色した。薬剤耐性コロニー数をスコアした。
【００７２】
（細胞生存アッセイ）
細胞生存率を３−（４、５−ジメチルチアゾリル−２−イル）２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ変法で決定した。すなわち、Ｕ２ＯＳ細胞を９６ウエルマイクロタイタープレート（５×１０３細胞／ウエル）中に１００μｌの完全培地で植菌し、付着するようにした。翌日、培地を変え、細胞をシスプラスチンで２４時間処理した。ＭＴＴアッセイでは、１０μｌのＭＴＴ溶液を各ウエルに添加して、３７℃で３時間インキュベートした。各ウエルの吸光度は、マイクロプレートリーダー（４５０型、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて５７０ｎｍで測定した。
【００７３】
（免疫沈降及び免疫ブロット）
免疫沈降の実験では、ＣＯＳ７細胞を適当なプラスミドで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、氷冷ＥＢＣ細胞溶解緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％（Ｖ／Ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、及び１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）］中に溶解し、全細胞溶解物を抗ｐ５３モノクローナル抗体（ＤＯ−１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）で免疫沈降させた。免疫沈降物を抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いた免疫ブロットにより解析した。タンパク質シグナルは、製造者の指示書に従って、増強化学発光によって可視化した（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）。
【００７４】
（細胞分画）
細胞を細胞質画分及び核画分に分けた。すなわち、まず、トランスフェクトした細胞を氷冷１×ＰＢＳで２回洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、及びプロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を含む細胞溶解緩衝液中で、４℃、３０分間、細胞溶解した。そして、細胞溶解物を１５０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離して、可溶画分を細胞質抽出物として回収した。不溶物質を細胞溶解緩衝液で洗浄し、さらに１×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解して、核画分を回収した。核画分及び細胞質画分を抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＬａｍｉｎＢモノクローナル抗体（Ａｂ−１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）又は抗ｒａｓモノクローナル抗体（ＲＡＳＫ−３、生化学工業社製）を用いる免疫分析に供した。
【００７５】
（免疫染色）
Ｕ２ＯＳ細胞をＦＬＡＧで標識したＣ６０をコードする発現プラスミドで一過的にトランスフェクトした。ガラスカバースリップ上で増殖した細胞を１×ＰＢＳ中、室温で３０分間、３．７％ホルムアルデヒドで固定化し、室温で５分間、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて透過性を上げた。３％ウシ血清アルブミンを含む１×ＰＢＳ中、１時間ブロックした。１×ＰＢＳで洗浄した後、細胞を室温で１時間、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体とともにインキュベートした。一次抗体とともにインキュベーションした後、細胞を洗浄し、ローダミン共役二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とともに、室温で１時間インキュベートした。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞を最終的に１×ＰＢＳで洗浄し、カバースリップを皿から取り除き、スライド上に載せて、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ共焦点レーザ走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）で観察した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
以上に説明したように、本発明により、抗アミロイド抗体、β、γセクレターゼ阻害薬等とは異なる作用メカニズムに基づく、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤の開発が可能になり、アルツハイマー病の予防及び／又は治療における新たな選択肢が提供されることになる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤、並びにアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢者における痴呆症の主なものであるアルツハイマー病の病態の全容と真の発症原因は未だ解明されておらず、その抜本的な予防・治療法も確立されていない。しかしながら、発症メカニズムについては、「アミロイド仮説」が提唱され、アルツハイマー病患者の病理学的所見、及び家族性アルツハイマー病の遺伝学的解析から、広く受け入れられることとなった（非特許文献１）。
【０００３】
これは、アルツハイマー病の発症と進行に、アミロイドと呼ばれる一群のタンパク質の脳（大脳皮質）への異常蓄積が関与するという説である。簡単には、βＡＰＰ（β−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる１回膜貫通型タンパク質の細胞外側がβセクレターゼによって切断を受け（βカット）、引き続きそのＣ末端側断片がγセクレターゼによって切断を受け（γカット）、Ｎ末端側断片（β４０又はβ４２）及びＣ末端側断片（Ｃ６０又はＣ５８（以下、集合的にＡＩＣＤともいう））が産生される。これらの断片のうち、Ｎ末端側断片（β４０又はβ４２）は凝集性が高く、アミロイドを形成し、細胞外に老人斑として蓄積される。このようなアミロイドの産生、凝集及び蓄積が神経細胞障害を引き起こし、神経細胞を細胞死に至らせる。
【非特許文献１】富田泰輔ら、細胞工学、２００１年、第２０巻、第１１号、ｐ．１４８９−１４９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
「アミロイド仮説」に基づいて、アルツハイマー病の予防法（予防薬）・治療法（治療薬）の開発が行われてきたが、それらは、βセクレターゼ及びγセクレターゼの阻害薬、並びに抗アミロイド抗体などである。しかしながら、アルツハイマー病は多因子性疾患であり、アミロイド仮説のみに基づくドラッグデザインでは、アルツハイマー病の予防法（予防薬）・治療法（治療薬）として十分ではないことも指摘されている。
【０００５】
そこで、本発明は、アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤、並びにそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明は、神経細胞においてＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法により、アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤を得ることができる。
【０００７】
上記スクリーニング方法は、
ＡＩＣＤ及びｐ５３が発現し、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はｐ５３と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備えることが好ましい。
【０００８】
このようなスクリーニング方法で得ることのできる、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物は、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤の薬効成分となり得る。
【０００９】
このような薬剤として、ｃ−Ａｂｌ及び／又はｐ１９ＡＲＦを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤が提供される。
【００１０】
ｐ５３は、核内に存在する転写因子であり、細胞周期の制御やＤＮＡの修復を担い、また、細胞分化、細胞老化、血管新生、細胞死（アポトーシス）等を引き起こす。一方、ＡＩＣＤについては、その細胞内での挙動やアルツハイマー病との関わりはよく知られていなかったが、近年、ＡＩＣＤが核内に移行して転写活性化に関与することが報告された（Ｘｉｎｗｅｉ Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，１１５−１２０，（２００１））。
【００１１】
本発明者らは、アルツハイマー病発症の分子生物学的メカニズムの１つとして、ＡＩＣＤが核内に移行してｐ５３との間で何らかの相互作用を引き起こし、その結果、神経細胞が細胞死を受けやすくなり、アルツハイマー病が発症するという仮説を考えた。図１は、アミロイド仮説、並びにアルツハイマー病の発症におけるＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用の関与を説明する模式図である。
【００１２】
そして、本発明者らは、ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用によるｐ５３の安定化がｐ５３の転写因子活性や細胞増殖抑制能、細胞死誘導能等のｐ５３特有の活性を高めて、神経細胞の細胞死を誘導することを見出した。この発見に基づいて、ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する物質はアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物になると考えた。
【００１３】
ｃ−Ａｂｌ及びｐ１９ＡＲＦは、Ｍｄｍ２がｐ５３に結合するのを拮抗的に阻害するタンパク質である（Ｒ．Ｖ．Ｓｉｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，６１４５−６１５７，（１９９９））ので、ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害すると考えられる。
【００１４】
本発明はまた、神経細胞においてＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法によっても、アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤を得ることができる。
【００１５】
上記スクリーニング方法は、
ＡＩＣＤ及びＦｅ６５が発現し、ＡＩＣＤ／Ｆｅ６５複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｆｅ６５抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はＦｅ６５と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／Ｆｅ６５複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｆｅ６５抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備えることが好ましい。
【００１６】
このようなスクリーニング方法で得ることのできる、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物は、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤の薬効成分となり得る。
【００１７】
このような薬剤として、ＡｌｃＩＣＤを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤が提供される。また、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤が提供される。
【００１８】
核受容体タンパク質Ｆｅ６５は、ＡＩＣＤと複合体を形成し、Ｇａｌ４及びヒストンアセチルトランスフェラーゼＴｉｐ６０の融合タンパク質による転写を活性化することが知られている（Ｘｉｎｗｅｉ Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，１１５−１２０，（２００１））。この知見に基づいて、本発明者らは、Ｆｅ６５がＡＩＣＤと相互作用してＡＩＣＤの核内移行を促進する物質であり、ＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する物質は、間接的にＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害し、アルツハイマー病の発症を抑制すると考えた。
【００１９】
ＡｌｃＩＣＤは、ＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する物質である（Ａｒａｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９，２４３４３−２４３５４（２００４））。また、Ｆｅ６５におけるＡＩＣＤの結合部位はＰＴＢ２ドメインであり、ＡＩＣＤにおけるＦｅ６５の結合部位のアミノ酸配列はＮＰＴＹ配列であることが知られている（Ｘｉｎｗｅｉ Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，１１５−１２０，（２００１））。配列表の配列番号１は、Ｆｅ６５におけるＰＴＢ２ドメインのアミノ酸配列を示す配列である。配列表の配列番号２は、ＮＰＴＹ配列を示す配列である。配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドは、ＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害すると考えられる。
【００２０】
本発明はまた、神経細胞においてＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法によっても、アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤を得ることができる。
【００２１】
上記スクリーニング方法は、
ＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０が発現し、ＡＩＣＤ／Ｔｉｐ６０複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｔｉｐ６０抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はＴｉｐ６０と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／Ｔｉｐ６０複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｔｉｐ６０抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備えることが好ましい。
【００２２】
このようなスクリーニング方法で得ることのできる、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物は、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤の薬効成分となり得る。
【００２３】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼＴｉｐ６０は、核内でＡＩＣＤと複合体を形成して神経膠腫細胞の細胞死（アポトーシス）を引き起こすことが知られている（Ａｙａｅ Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２８５３０−２８５３６，（２００２））。この知見に基づいて、本発明者らは、Ｔｉｐ６０がＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を促進する物質であり、ＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０の相互作用を阻害する物質はアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物になると考えた。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、アミロイド仮説とは異なるアルツハイマー病発症メカニズムに基づく、新たなアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤、並びにそのスクリーニング方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、アミロイド仮説、並びにアルツハイマー病の発症におけるＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用の関与を説明する模式図である。
【図２】図２は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。
【図３】図３は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。
【図４】図４は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。
【図６】図６は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。
【図７】図７は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【図８】図８は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。
【図９】図９は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ｐ５３発現細胞でｐ５３を強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数を示すグラフである。
【図１４】図１４は、シスプラチンの量とＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率との関係を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するシスプラチン処理によって得られた産物の免疫ブロットの結果を示す図である。
【図１６】図１６は、Ｃ６０を強制発現させたＵ２０Ｓ細胞の核画分と細胞質画分の免疫ブロットの結果を示す図である。
【図１７】図１７は、Ｃ６０を強制発現させたＵ２ＯＳ細胞を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色したものを共焦点走査顕微鏡で観察した写真に対応する図である。
【図１８】図１８は、Ｃ５８又はＣ６０を強制発現させたＣＯＳ７細胞の免疫ブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。
【００２７】
（ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用）
ｐ５３の転写因子活性、細胞死誘導能（アポトーシス活性）などに関する種々のアッセイをβＡＰＰ及び／又はＡＩＣＤの存在下で行うことによって、βＡＰＰ又はＡＩＣＤとｐ５３との相互作用について検討することができる。
【００２８】
ｐ５３の転写因子活性に対するβＡＰＰの影響：
ｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞にさらにｐ５３遺伝子を導入すると、ｐ５３に反応するプロモーター（ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ）活性が上がることが知られている。そこで、ｐ５３の代わりにβＡＰＰをコードする遺伝子を導入することによってこれらのプロモーター類の活性が上がるか否かを試験する。試験には、転写因子の機能解析の標準的な手法であるルシフェラーゼアッセイ（ルシフェラーゼリポーターアッセイ）を用いる。
【００２９】
具体的には、野性型のｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞にβＡＰＰの発現ベクター、及びｐ５３に反応するプロモーター（ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ）を含有するレポーターベクターを導入する。４８時間後、細胞を回収してそのルシフェラーゼ活性を測定する。このようにして得られたルシフェラーゼ活性測定結果を、各プロモーターについて図２〜４に示す。
【００３０】
図２は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。図３は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。図４は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【００３１】
図２〜４から、βＡＰＰの強制発現によって、ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ由来のプロモーターの活性がいずれも顕著に上昇したことが分かる。βＡＰＰは、内在性のセクレターゼによりＣ６０又はＣ５８を産生していると考えられる。さらに、Ｕ２ＯＳ細胞は野性型ｐ５３を発現している。従って、Ｃ６０又はＣ５８によるｐ５３の活性化が示唆される。
【００３２】
次に、ｐ５３とβＡＰＰを併用することでｐ５３の活性がさらに上がるか否かを試験する。試験には上述の試験と同様にルシフェラーゼアッセイを用いる。
【００３３】
具体的には、野性型のｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞にβＡＰＰの発現ベクター、ｐ５３の発現ベクター、及びｐ５３に反応するプロモーター（ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ）を含有するレポーターベクターを導入する。４８時間後、細胞を回収して、そのルシフェラーゼ活性を測定する。このようにして得られたルシフェラーゼ活性測定結果を、各プロモーターについて図５〜７に示す。
【００３４】
図５は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。図６は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。図７は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰ及びｐ５３を強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【００３５】
図５〜７から、βＡＰＰ及びｐ５３の強制発現によって、ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ由来のプロモーターの活性がいずれも、βＡＰＰを単独で強制発現させた場合に比べて、顕著に上昇したことが分かる。従って、前述の試験の結果と同様に、Ｃ６０又はＣ５８によるｐ５３の活性化が示唆される。
【００３６】
ネガティブコントロ一ルとして、ｐ５３を発現しない細胞を用いて、同様の試験を繰り返す。
【００３７】
野性型ｐ５３を欠くＨ１２９９細胞にβＡＰＰの発現ベクター、及びｐ５３に反応するプロモーター（ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ）を含有するレポーターベクターを導入する。４８時間後、細胞を回収してそのルシフェラーゼ活性を測定する。このようにして得られたルシフェラーゼ活性の測定結果を、各プロモーターについて図８〜１０に示す。
【００３８】
図８は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのｐ２１プロモーターの活性を示すグラフである。図９は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＭＤＭ２プロモーターの活性を示すグラフである。図１０は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときのＢａｘプロモーターの活性を示すグラフである。
【００３９】
図８〜１０から、βＡＰＰの強制発現によっても、ｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘ由来のプロモーターの活性が上昇しなかったことが分かる。Ｈ１２９９細胞が野性型ｐ５３を欠くことから、前記Ｕ２ＯＳ細胞で観察されたβＡＰＰによるｐ２１、ＭＤＭ２、Ｂａｘプロモーターの活性化はβＡＰＰによるｐ５３の活性化に起因することが示唆される。
【００４０】
ｐ５３の細胞増殖抑制能及び細胞死誘導能：
上述の試験で用いるＵ２ＯＳ細胞でｐ５３が本来の細胞増殖抑制能及び細胞死誘導能を呈するか否かを試験する。
【００４１】
野性型のｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞にｐ５３の発現ベクターを導入した後、細胞をＧ４１８存在下で培養する。２週間後、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数を測定する。得られた結果を図１１に示す。図１１は、ｐ５３発現細胞でｐ５３を強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数を示すグラフである。
【００４２】
図１１から、ｐ５３の強制発現によって、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数が顕著に減少したことが分かる。従って、Ｕ２ＯＳ細胞ではｐ５３依存性の細胞増殖抑制又は細胞死が起こっていることが確認される。
【００４３】
ｐ５３の細胞増殖抑制能及び細胞死誘導能に対するβＡＰＰの影響：
次に、βＡＰＰを導入することで内在性ｐ５３の細胞増殖抑制能及び細胞死誘導能に変化があるか否かを試験する。試験には、上述の試験と同様にコロニー形成アッセイを使用する。
【００４４】
野性型のｐ５３を発現しているＵ２ＯＳ細胞にβＡＰＰの発現ベクターを導入した後、細胞をＧ４１８存在下で培養する。２週間後、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数を測定する。得られた結果を図１２に示す。図１２は、ｐ５３発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数を示すグラフである。
【００４５】
図１２から、βＡＰＰの強制発現によって、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数が減少したことが分かる。従って、Ｕ２ＯＳ細胞ではβＡＰＰ依存性の細胞増殖抑制又は細胞死が起こっていることが分かる。
【００４６】
ネガティブコントロールとして、野性型ｐ５３を発現しないＨ１２９９細胞で同様の試験を繰り返した。すなわち、野性型ｐ５３を欠くＨ１２９９細胞にβＡＰＰの発現ベクターを導入した後、細胞をＧ４１８存在下で培養する。２週間後、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数を測定する。得られた結果を図１３に示す。図１３は、ｐ５３非発現細胞でβＡＰＰを強制発現させたときの薬剤耐性コロニー数をを示すグラフである。
【００４７】
図１３から、βＡＰＰの強制発現によっても、Ｇ４１８抵抗性のコロニー数が減少しなかったことが分かる。従って、上述の試験で観察されたβＡＰＰ依存性の細胞増殖抑制又は細胞死誘導には野性型ｐ５３の存在が必要であると考えられる。
【００４８】
シスプラチンによる細胞死誘導：
腫瘍細胞は、ＤＮＡ阻害性の薬剤であるシスプラチンで処理すると用量依存的に細胞死を起こすことが認められている。この際、ｐ５３が関与していることも分かっている。このように内在性ｐ５３を誘導することが知られているシスプラチンを用いて、ｐ５３による細胞死誘導とβＡＰＰとの関連を調べる。そのため、まず、シスプラチンによる細胞死の誘導を確認する。
【００４９】
神経芽腫由来の細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を腫瘍細胞として使用する。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をシスプラチンで処理した後、細胞生存率をＭＴＴ法で測定する。得られた結果を図１４に示す。図１４は、シスプラチンの量とＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率との関係を示すグラフである。
【００５０】
図１４から、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞がシスプラチンの用量に依存して減少したことが分かる。シスプラチンによってＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞死が誘導されることが確認される。
【００５１】
次に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するシスプラチン処理によって得られた産物を免疫ブロット及び免疫沈降により分析する。すなわち、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をシスプラチンで処理した後、ｐ５３、ｐ２１、βＡＰＰ及びＡｃｔｉｎの発現量を免疫ブロットで分析する。さらに、βＡＰＰ由来の産物とｐ５３との相互作用を免疫沈降及び免疫ブロットによって解析する。得られた結果を図１５に示す。図１５は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するシスプラチン処理によって得られた産物の免疫ブロットの結果を示す図である。図中、「ＩＰ」は免疫沈降を、「ＩＢ」は免疫ブロットを指す。
【００５２】
図１５の上から２段目の図は、抗ｐ５３抗体を用いた免疫ブロットの結果を示す図である。この図から、シスプラチンによる内在性ｐ５３の誘導が確認される。図１５の上から３段目の図は、抗ｐ２１抗体を用いた免疫ブロットの結果を示す図である。この図から、シスプラチン処理の際に発現したｐ５３がその下流のｐ２１の発現を促進していること、すなわち活性型であることが分かる。図１５の最上段の図は、細胞溶解液（破砕液）を抗βＡＰＰ抗体で免疫沈降させ、沈降物を抗ｐ５３抗体で免疫ブロットした結果を示す図である。この図から、シスプラチン処理群にはｐ５３が存在していることが分かり、βＡＰＰ由来の産物とｐ５３との物理的な結合が確認される。βＡＰＰは膜上に存在し、ｐ５３は核内に存在するため、物理的に両者が結合することは考えられない。従って、これはβＡＰＰの分解産物であるＣ６０又はＣ５８が核内へ移行し、ｐ５３と結合していることを示唆している。シスプラチンによるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞死の誘導は、内在性ｐ５３の安定化に伴う活性化によるものであり、その際にβＡＰＰ由来の産物とｐ５３との相互作用が機能的に関与していることが示唆される。
【００５３】
βＡＰＰ由来の産物Ｃ６０の核への局在化：
Ｃ６０をコードする遺伝子を人工的に作成して、その発現及び核への局在化を確認する。Ｃ６０は非常に不安定であることが知られているので、そのＣ末端側にＦＬＡＧエピトープを付加する。
【００５４】
Ｕ２ＯＳ細胞にＦＬＡＧ標識したＣ６０を強制発現させた後、細胞の核画分及び細胞質画分を調製し、Ｃ６０の分布を免疫ブロットによって調べる。得られた結果を図１６に示す。図１６は、Ｃ６０を強制発現させたＵ２ＯＳ細胞の核画分と細胞質画分の免疫ブロットの結果を示す図である。図中、「Ｃ」は細胞質画分を、「Ｎ」は核画分を指す。また、「ＩＢ」は免疫ブロットを指す。核マトリックスに存在するＬａｍｉｎＢは核マーカーとして用いられている。細胞質に存在するｒａｓは細胞質マーカーとして用いられている。図１６から、Ｃ６０が核に局在することが分かる。
【００５５】
また、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫染色法で、Ｃ６０の分布を生化学的に観察する。得られた顕微鏡での観察結果を図１７に示す。図１７は、Ｃ６０を強制発現させたＵ２ＯＳ細胞を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色したものを共焦点走査顕微鏡で観察した写真に対応する図である。図中、「ＦＬＡＧ−Ｃ６０」はＣ６０の分布を、「ＤＡＰＩ」は核マーカーＤＡＰＩの分布を示す写真に対応する図であり、「Ｍｅｒｇｅ」は上記２種の写真を重ね合わせて合成した写真に対応する図である。図１７から、Ｃ６０の分布がＤＡＰＩの分布と重なることが分かり、Ｃ６０の核への局在化が確認される。
【００５６】
βＡＰＰ由来の産物Ｃ５８又はＣ６０とｐ５３との相互作用：
既に上述の試験の結果によりｐ５３がβＡＰＰと相互作用することが示峻されているが、さらにその相互作用がＣ５８又はＣ６０との結合か否かを試験する。
【００５７】
ＦＬＡＧ標識したＣ５８又はＣ６０をＣＯＳ７細胞に強制発現させた後、ｐ５３との相互作用の有無を免疫沈降により検討する。得られた結果を図１８に示す。図１８は、Ｃ５８又はＣ６０を強制発現させたＣＯＳ７細胞の免疫ブロットの結果を示す図である。図中、「ＩＰ」は免疫沈降を、「ＩＢ」は免疫ブロットを指す。
【００５８】
図１８の最上段の図は、細胞溶解液（破砕液）を抗ｐ５３抗体で免疫沈降させ、沈降物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫ブロットした結果を示す図である。図１８から、Ｃ５８及びＣ６０とｐ５３とが結合していることが分かる。βＡＰＰによるｐ５３の活性化はβＡＰＰ由来の産物Ｃ５８及びＣ６０とｐ５３との物理的結合を介した現象であることが示唆される。
【００５９】
アルツハイマー病はβＡＰＰの分解産物であるβ４２又はβ４０が細胞膜に沈着して、神経細胞の細胞死が起こる結果生じるというのがこれまでの定説であった。しかしながら、前述の結果により、Ｃ末端側に産生するＡＩＣＤが核内に移行し、核内のｐ５３と相互作用してｐ５３の安定化を高め、転写因子活性や細胞増殖抑制能、細胞死誘導能等のｐ５３特有の活性を高め、神経細胞の細胞死を誘導することが分かる。すなわち、アルツハイマー病の発症にＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用が関与していることが示唆される。
【００６０】
上述の知見は、ＡＩＣＤ及びｐ５３の核内での相互作用に干渉するような薬物が新たなアルツハイマー病の予防・治療薬になり得ることを示している。ＡＩＣＤが核内に移行しなければ、ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用は生じない。そこで、１つのアプローチとして、ＡＩＣＤの核内移行を阻害する薬物の発見、開発が考えられる。また、別のアプローチとして、ＡＩＣＤを分解する薬物の発見、開発が考えられる。さらに、ＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する薬物の発見、開発が考えられる。なお、βＡＰＰからＡＩＣＤを産生する酵素であるβ、γセクレターゼの阻害薬の開発は既に進められている（富田ら、前掲）。ここでいう候補薬物とは、核酸、タンパク質、その他の高分子化合物、低分子化合物（化学合成又は天然由来）などである。
【００６１】
（アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤）
本発明は、ｃ−Ａｂｌ及び／又はｐ１９ＡＲＦを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤を提供する。また、ＡｌｃＩＣＤを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤を提供する。さらに、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤を提供する。上記ペプチドは、公知の方法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相合成法）によって合成することができる。
【００６２】
これらの薬剤は、有効量の有効成分を薬学的に許容される担体、もしくは希釈剤と混合して、適当な剤形としたものである。投与に適した剤形は、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等である。アルツハイマー病を患う患者又はその前駆症状としての痴呆症状を示す患者に経口的に、又は非経口的に投与される。
【００６３】
（アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物のスクリーニング方法）
本発明はまた、神経細胞においてＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、例えば、Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（例えば、Ｇｙｕｒｉｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ，７５，７９１−８０３（１９９３）；Ｇｏｌｅｍｉｓ，Ｅ．Ａ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）Ｃｈ．２０．０−２０．１，（１９９６））により実施できる。
【００６４】
上記スクリーニング方法は免疫学的手法により実施することが好ましい。すなわち、上記スクリーニング方法は、
ＡＩＣＤ及びｐ５３が発現し、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はｐ５３と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備えることが好ましい。
【００６５】
具体的には、神経細胞内でＡＩＣＤ分子及びｐ５３分子を発現させ、一定時間候補薬物とともに培養した後、細胞を粉砕して細胞溶解液を調製する。一方の分子に対する抗体で免疫沈降させ、沈殿中に含まれる他方の分子を免疫学的手法（免疫ブロット等）で検出、定量することで、候補薬物の両分子の相互作用に及ぼす影響を測定する。ここで、上記培養系に適当なアゴニストと候補薬物とを同時に添加して、上記アッセイを行い、候補薬物を含まない細胞からの免疫沈降物と比較することにより、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物のスクリーニングが可能である。
【００６６】
本発明はまた、神経細胞においてＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。さらに、神経細胞においてＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法を提供する。これらのスクリーニング方法の好適な実施形態は、ｐ５３の代わりにＦｅ６５又はＴｉｐ６０を用いる他は、前述のスクリーニング方法と同様である。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法で得ることのできる、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物は、アルツハイマー病を患う患者又はその前駆症状としての痴呆症状を示す患者に経口的に、又は非経口的に投与する。得られる薬物は薬学的組成物として調製される。すなわち、有効量の前記薬物を薬学的に許容される担体、もしくは希釈剤と混合して、適当な剤形とする。投与に適した剤形は、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等である。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００６９】
（細胞培養及びトランスフェクション）
ＣＯＳ７及びヒト骨肉種Ｕ２ＯＳ細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）に維持した。Ｈ１２９９ヒト肺大細胞癌細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳとペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０倍地に維持した。細胞は、空気中水飽和５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で培養した。一過的トランスフェクションは、製造者の指示書に従って、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を用いて、各発現プラスミド又は所定の組合せで実施した。Ｕ２ＯＳ細胞とＨ１２９９細胞の一過的トランスフェクションは、製造者の指示書に従って、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）を用いて実施した。
【００７０】
（ルシフェラーゼアッセイ）
Ｕ２ＯＳ細胞を１２ウエルのプレート上で増殖させ（５×１０４細胞／ウエル）、ｐ５３とｐ２１ＷＡＦ１、ＭＤＭ２又はＢａｘプロモーターを含むｐ５３反応性ルシフェラーゼレポーター構築体の発現プラスミドの一定量、及び必要な場合にはβＡＰＰの発現プラスミドの漸増量を用いて、細胞を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション当たりプラスミドＤＮＡの全量をｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で一定量（５１０ｎｇ）に保った。トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクトされた細胞を回収し、氷冷１×ＰＢＳで洗浄した。ルシフェラーゼ活性は、製造者の指示書に従って、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。
【００７１】
（コロニー形成アッセイ）
Ｕ２ＯＳ細胞は、ｐ５３をコードする発現プラスミドの漸増量の存在下、又は存在なしにトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ（最終濃度））を含む培地中に細胞を維持した。２週間の選択の後、プレートをギムザ染色液（Ｇｉｅｍｓａ）で染色した。薬剤耐性コロニー数をスコアした。
【００７２】
（細胞生存アッセイ）
細胞生存率を３−（４、５−ジメチルチアゾリル−２−イル）２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ変法で決定した。すなわち、Ｕ２ＯＳ細胞を９６ウエルマイクロタイタープレート（５×１０３細胞／ウエル）中に１００μｌの完全培地で植菌し、付着するようにした。翌日、培地を変え、細胞をシスプラスチンで２４時間処理した。ＭＴＴアッセイでは、１０μｌのＭＴＴ溶液を各ウエルに添加して、３７℃で３時間インキュベートした。各ウエルの吸光度は、マイクロプレートリーダー（４５０型、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて５７０ｎｍで測定した。
【００７３】
（免疫沈降及び免疫ブロット）
免疫沈降の実験では、ＣＯＳ７細胞を適当なプラスミドで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、氷冷ＥＢＣ細胞溶解緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％（Ｖ／Ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、及び１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）］中に溶解し、全細胞溶解物を抗ｐ５３モノクローナル抗体（ＤＯ−１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）で免疫沈降させた。免疫沈降物を抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いた免疫ブロットにより解析した。タンパク質シグナルは、製造者の指示書に従って、増強化学発光によって可視化した（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）。
【００７４】
（細胞分画）
細胞を細胞質画分及び核画分に分けた。すなわち、まず、トランスフェクトした細胞を氷冷１×ＰＢＳで２回洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、及びプロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を含む細胞溶解緩衝液中で、４℃、３０分間、細胞溶解した。そして、細胞溶解物を１５０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離して、可溶画分を細胞質抽出物として回収した。不溶物質を細胞溶解緩衝液で洗浄し、さらに１×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解して、核画分を回収した。核画分及び細胞質画分を抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＬａｍｉｎＢモノクローナル抗体（Ａｂ−１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）又は抗ｒａｓモノクローナル抗体（ＲＡＳＫ−３、生化学工業社製）を用いる免疫分析に供した。
【００７５】
（免疫染色）
Ｕ２ＯＳ細胞をＦＬＡＧで標識したＣ６０をコードする発現プラスミドで一過的にトランスフェクトした。ガラスカバースリップ上で増殖した細胞を１×ＰＢＳ中、室温で３０分間、３．７％ホルムアルデヒドで固定化し、室温で５分間、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて透過性を上げた。３％ウシ血清アルブミンを含む１×ＰＢＳ中、１時間ブロックした。１×ＰＢＳで洗浄した後、細胞を室温で１時間、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体とともにインキュベートした。一次抗体とともにインキュベーションした後、細胞を洗浄し、ローダミン共役二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とともに、室温で１時間インキュベートした。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞を最終的に１×ＰＢＳで洗浄し、カバースリップを皿から取り除き、スライド上に載せて、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ共焦点レーザ走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）で観察した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
以上に説明したように、本発明により、抗アミロイド抗体、β、γセクレターゼ阻害薬等とは異なる作用メカニズムに基づく、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物・薬剤の開発が可能になり、アルツハイマー病の予防及び／又は治療における新たな選択肢が提供されることになる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−Ａｂｌ及び／又はｐ１９ＡＲＦを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤。
【請求項２】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法。
【請求項３】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法であって、
ＡＩＣＤ及びｐ５３が発現し、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はｐ５３と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備える方法。
【請求項４】
ＡｌｃＩＣＤを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤。
【請求項５】
配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤。
【請求項６】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法。
【請求項７】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法であって、
ＡＩＣＤ及びＦｅ６５が発現し、ＡＩＣＤ／Ｆｅ６５複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｆｅ６５抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はＦｅ６５と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／Ｆｅ６５複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｆｅ６５抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備える方法。
【請求項８】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法。
【請求項９】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法であって、
ＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０が発現し、ＡＩＣＤ／Ｔｉｐ６０複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｔｉｐ６０抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はＴｉｐ６０と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／Ｔｉｐ６０複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｔｉｐ６０抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備える方法。
【請求項１０】
請求項３、７又は９に記載のスクリーニング方法で得ることのできる、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物。
【請求項１】
ｃ−Ａｂｌ及び／又はｐ１９ＡＲＦを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤。
【請求項２】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法。
【請求項３】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びｐ５３の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法であって、
ＡＩＣＤ及びｐ５３が発現し、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はｐ５３と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／ｐ５３複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗ｐ５３抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備える方法。
【請求項４】
ＡｌｃＩＣＤを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤。
【請求項５】
配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬剤。
【請求項６】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法。
【請求項７】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びＦｅ６５の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法であって、
ＡＩＣＤ及びＦｅ６５が発現し、ＡＩＣＤ／Ｆｅ６５複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｆｅ６５抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はＦｅ６５と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／Ｆｅ６５複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｆｅ６５抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備える方法。
【請求項８】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法。
【請求項９】
神経細胞においてＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０の相互作用を阻害する候補薬物を、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物として選別するスクリーニング方法であって、
ＡＩＣＤ及びＴｉｐ６０が発現し、ＡＩＣＤ／Ｔｉｐ６０複合体が形成されている神経細胞を、候補薬物とともに培養するステップと、
培養後の神経細胞から調製された細胞溶解液と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｔｉｐ６０抗体から選ばれる第１の抗体とを接触させることにより、ＡＩＣＤ又はＴｉｐ６０と前記第１の抗体との複合体である第１の免疫複合体と、ＡＩＣＤ／Ｔｉｐ６０複合体と前記第１の抗体との複合体である第２の免疫複合体とを得るステップと、
前記第１及び第２の免疫複合体と、抗ＡＩＣＤ抗体及び抗Ｔｉｐ６０抗体から選ばれ前記第１の抗体とは異なる第２の抗体とを接触させるステップと、
前記第２の免疫複合体と前記第２の抗体との複合体である第３の免疫複合体の存在を検出するステップと、を備える方法。
【請求項１０】
請求項３、７又は９に記載のスクリーニング方法で得ることのできる、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための薬物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２３２８６
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３６９８（Ｐ２００５−５１３６９８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２９５５
【国際出願日】平成１６年９月６日（２００４．９．６）
【出願人】（０００１６０５２２）久光製薬株式会社 (121)
【出願人】（５９１０１４７１０）千葉県 (49)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２９５５
【国際出願日】平成１６年９月６日（２００４．９．６）
【出願人】（０００１６０５２２）久光製薬株式会社 (121)
【出願人】（５９１０１４７１０）千葉県 (49)
【Ｆターム（参考）】
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