アレルギー性疾患を処置するための胸腺間質性リンホポエチン受容体に対する抗体
本発明では、ヒトＴＳＬＰ受容体を特異的に認識し、拮抗する抗体、およびＴＳＬＰシグナル伝達により媒介される疾病または障害を処置または緩解するためのこれらの抗体の使用方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
サイトカインおよび免疫細胞は、例えば種々の炎症性障害に至る経路など、特定の生理学的機構または経路を媒介する。ヒト胸腺間質性リンホポエチン(ＴＳＬＰ)は、ヒト上皮細胞から生産されるＩＬ−７様サイトカインである。これはＢ細胞の分化を促進し、また、胸腺細胞と成熟Ｔ細胞の双方を同時刺激することもできる。ＴＳＬＰはヒトＣＤ１１ｃ＋樹状細胞(ＤＣ)上の特異的ヘテロ二量体受容体と結合する。この受容体ヘテロ二量体は、共通γ様受容体鎖(ＴＳＬＰ受容体；ＴＳＬＰＲ)とＩＬ−７Ｒ−α鎖からなる。例えば、Tonozuka et al., Cytogenet. Cell Genet. 93:23-25, 2001; Pandey et al., Nat. Immunol. 1:59-64, 2000; L. S. Park et al., J. Exp. Med. 192:659-670, 2000;およびReche et al., J. Immunol. 167:336-343, 2001参照。この受容体に結合するリガンドは、ＤＣのＴＨ２誘引ケモカイン、ＴＡＲＣ(thymus and activation-regulated chemokine)およびＭＤＣ(macrophage-derived chemokine)分泌を誘導する。さらに、ＴＳＬＰはまた、強いＤＣの活性化、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大、続いてのＴＨ２表現型への分極、プロアレルギー性サイトカインインターロイキン４(ＩＬ−４)、ＩＬ−５、ＩＬ−１３および腫瘍壊死因子−αの産生も誘導する。
【背景技術】
【０００２】
また、ＴＳＬＰシグナル伝達の結果、Ｓｔａｔ５転写因子の活性化がもたらされることも判明している。さらに、急性および慢性アトピー性皮膚炎患者は皮膚病変部においてＴＳＬＰを過剰発現することが報告されており、ＴＳＬＰの発現がin vivoにおいてアレルギー性炎症に関連していることが示唆される。皮膚ケラチノサイトの他、気管支上皮細胞、平滑筋および肺繊維芽細胞でも高レベルのＴＳＬＰ発現が見出されており、このことも同様に呼吸器系アレルギー性適応症におけるＴＳＬＰの役割の可能性が示唆される。さらに、ＩｇＥにより活性化された肥満細胞は、ＴＨ２表現型の維持に関与し得る機構である極めて高レベルのＴＳＬＰを発現する。
【０００３】
西洋諸国人口の約２０％が、例えば、喘息、鼻炎、アトピー性皮膚炎および食物アレルギーを含むアレルギー性疾患などの炎症性障害に罹患している。アトピー性皮膚炎患者の５０％〜８０％は喘息またはアレルギー性鼻炎を有しているか、または発症する。現在までアレルギーにより誘発される喘息、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性鼻炎の治癒法は無い。喘息に対するβ−２アドレノセプターアンタゴニスト、アトピー性皮膚炎に対するＥｌｉｄｅｌ、およびアレルギー性鼻炎に対するＨ１−抗ヒスタミンなどの現行療法は対症療法として用いられている。よって、当技術分野では、これらの炎症性障害、特に、アレルギー性炎症を処置するためのより良い治療法の必要性がますます高まっている。本発明は、この問題、また他の問題に取り組むものである。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本明細書において本発明の態様は、標的タンパク質ヒト胸腺間質性リンホポエチン受容体(ｈＴＳＬＰＲ)に特異的な抗原結合領域を有する単離されたヒトまたはヒト化抗体またはその機能的フラグメントおよびｈＴＳＬＰＲと結合する抗体またはその機能的フラグメントを提供する。関連の態様では、このｈＴＳＬＰＲとの結合は少なくとも細胞表面ｈＴＳＬＰ受容体結合により決定され、炎症性メディエーターの放出を妨げる。
【０００５】
さらに別の態様では、本発明は、抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域を提供する。ある特定の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＴＹＧＭＳ(配列番号７)を有するＨ−ＣＤＲ１領域とその保存的変異体を含む。本明細書に記載されるように、保存的変異体は、特定されているアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸残基を含む。関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)を有するＨ−ＣＤＲ２領域、およびその保存的変異体である。別の関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)を有するＨ−ＣＤＲ３領域、およびその保存的変異体である。
【０００６】
別の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)を有するＬ−ＣＤＲ１領域、およびその保存的変異体である。さらに別の関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)を有するＬ−ＣＤＲ２領域、およびその保存的変異体である。なおさらに別の関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を有するＬ−ＣＤＲ３領域、およびその保存的変異体である。
【０００７】
別の態様では、この単離された抗原結合領域は、可変領域アミノ酸配列である配列番号５と、そのＣＤＲ領域において配列番号５のＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％の配列同一性を有する配列を有する重鎖である。関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、可変領域アミノ酸配列である配列番号６と、そのＣＤＲ領域において配列番号６のＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖である。
【０００８】
別の局面において、本発明は、ｈＴＳＬＰＲに対するモノクローナルアンタゴニスト抗体を提供する。本発明の抗ＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは、配列番号５の重鎖可変領域配列と配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む参照抗体と同じ結合特異性を有する。これらの抗体のいくつかは参照抗体と同じ結合特異性を示す完全ヒト抗体である。これらの抗体のいくつかはＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)もしくはＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)の重鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)配列、またはＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)もしくはＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)の軽鎖ＣＤＲ配列を有する。
【０００９】
抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を有する。本発明の他のいくつかの抗体は、配列番号５と少なくとも８５％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号６と少なくとも８５％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。本発明の他のいくつかの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、配列番号５と同一である重鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号６と同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する。
【００１０】
本発明のいくつかの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はマウス抗体である。他のいくつかはキメラ抗体である。キメラ抗体のいくつかはヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域を有する。本発明の他のいくつかの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はヒト化抗体である。本発明の他のいくつかの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、配列番号５の重鎖可変領域配列と配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む抗体と同じ結合特異性を示す完全ヒト抗体である。また、本発明では、単鎖抗体、例えばＦａｂフラグメントも提供される。抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかはＩｇＧ１イソ型のものである。他のいくつかの抗体はＩｇＧ４イソ型のものである。
【００１１】
別の局面において、本発明は、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする単離された、または組み換えポリヌクレオチド(例えばＤＮＡ)を提供する。例えば、このポリヌクレオチドは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)を含む抗体重鎖をコードすることができる。これらのポリヌクレオチドはまた、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を含む抗体軽鎖をコードすることもできる。本発明のいくつかのポリヌクレオチドは、配列番号５の成熟領域と少なくとも９０％同一である成熟重鎖可変領域配列をコードする。他のいくつかのポリヌクレオチドは、配列番号６の成熟領域と少なくとも９０％同一である成熟軽鎖可変領域配列をコードする。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列または配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列をコードする。
【００１２】
別の局面において、本発明は、(１)本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の重鎖をコードする組み換えＤＮＡセグメントと(２)該抗体の軽鎖をコードする第二の組み換えＤＮＡセグメントを担持する単離された宿主細胞を提供する。これらの宿主細胞のいくつかでは、組み換えＤＮＡセグメントはそれぞれ第一および第二のプロモーターに作動可能なように連結され、かつ、宿主細胞で発現することができる。これらの宿主細胞のいくつかは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を有するモノクローナル抗体を発現する。他のいくつかの宿主細胞は、配列番号５の成熟領域と少なくとも９０％同一である成熟重鎖可変領域配列と、配列番号６の成熟領域と少なくとも９０％同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を発現する。これらの宿主細胞のいくつかは、配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列と配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を発現する。これらの宿主細胞のいくつかは非ヒト哺乳類細胞である。
【００１３】
別の局面において、本発明は、対象、例えばヒト患者において炎症性障害を処置する方法を提供する。これらの方法は、その対象に有効量の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を含む医薬組成物を投与することを伴う。一般に、この抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、配列番号５の重鎖可変領域配列と配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む抗ｈＴＳＬＰＲ抗体と同じ結合特異性を有する。これらの治療法のいくつかでは、完全ヒト抗体が用いられる。いくつかの方法では、この抗ＴＳＬＰＲ抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を担持する。いくつかの方法では、使用される抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列と配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む。これらの方法のいくつかは、アレルギー性炎症性疾患に罹患している対象の処置に向けられる。当該処置に適するアレルギー性炎症性疾患の例は、アトピー性皮膚炎、喘息またはアレルギー性鼻炎を含む。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、抗体またはそのフラグメントである第一の成分と第二のアミノ酸配列を有する第二の成分とからなる免疫複合体を提供する。例えば、免疫複合体は細胞毒素であるか、または免疫複合体は、ｈＴＳＬＰＲとは異なる標的に結合特異性を有する結合タンパク質または抗体である。
【００１５】
別の態様において、本発明は抗体またはその抗体フラグメントを有するキットを提供する。いくつかの態様では、このキットはさらに医薬上許容される担体またはその賦形剤を含む。他の関連の態様では、キット内の抗体は単位用量で存在する。さらに別の関連の態様では、キットは対象への投与における使用説明書を含む。
【００１６】
本発明の性質および利点のさらなる理解は本明細書の残りの部分および特許請求の範囲を読めば明らかとなるであろう。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１はＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞においてｈＴＳＬＰ依存性細胞増殖アッセイを用いた抗ＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体のスクリーニングを示す。
図２Ａ〜２Ｃはマウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体の精製を示す。Ａ：キメラＩｇＧ１抗体；Ｂ：キメラＩｇＧ４抗体；およびＣ：マウスＩｇＧ１抗体。
図３Ａ〜３Ｃは細胞増殖アッセイおよびルシフェラーゼリポーターアッセイによる精製マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)のアンタゴニスト活性を示す。Ａ：Ｂａ／Ｆ３−ｈＴＳＬＰＲ−ｈＩＬ７Ｒα細胞の増殖；Ｂ：ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞の増殖；およびＣ：ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性。
図４はマウス抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体１Ｄ６.Ｃ９クローンの可変領域のヌクレオチド配列を示す。
図５はマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体クローン１Ｄ６.Ｃ９の可変領域アミノ酸配列を示す。相補性決定領域(ＣＤＲ)およびフレームワーク領域(ＦＲ)は下線の残基または斜体の残基で示される。
図６はｈＴＳＬＰＲ、ｈＩＬ７ＲαおよびＳｔａｔ５−Ｌｕｃを過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞における精製マウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のアンタゴニスト活性を含むルシフェラーゼリポーターアッセイの結果を示す。
図７はマウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体によるヒト単球由来ＴＳＬＰ媒介ＴＡＲＣ分泌(section)の阻害を示す。
図８は抗体結合ドメインの同定を示す − ＴＳＬＰＲ抗体は不連続エピトープと結合する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、一部分は本発明者らによるヒトＴＳＬＰＲに対してアンタゴニスト抗体の開発に基づくものである。マウスにおいて生成した抗ｈＴＳＬＰＲ抗体またはin vitroで作製されたキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体が、ＴＳＬＰシグナル伝達により媒介される活性、例えばＴＳＬＰにより媒介される細胞増殖を阻害できることが判明した。よって、これらの抗体は、ＴＳＬＰシグナル伝達活性により媒介される、またはＴＳＬＰシグナル伝達活性に関連するいくつかの疾病または障害、例えば、アトピー性皮膚炎および喘息などのアレルギー性炎症性疾患に対する治療薬または予防薬として有用である。次の節で、本発明の組成物を作製および使用するため、また、本発明の方法を実施するための指針を示す。
【００１９】
Ｉ. 定義
特に断りのない限り、本明細書で用いる技術用語および科学用語は全て、本発明の属する技術分野の通常の技術者に共通に理解されているものと同義である。以下の参照文献は本発明で用いられる用語の多くの一般定義を当業者に示す：Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3PrdP ed., 2002);およびA Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4PthP ed., 2000)。さらに、本発明の実施において読者の助けとなるために以下の定義を示す。
【００２０】
本発明がより容易に理解できるよう、まず、特定の用語を定義する。さらなる定義は詳細な説明を通じて示す。
【００２１】
「免疫応答」とは、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫性炎症もしくは病的炎症の場合には正常なヒト細胞または組織の選択的傷害、破壊またはそれらの身体からの排除をもたらす、例えばリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球およびこれらの細胞または肝臓により産生される可溶性高分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用を指す。
【００２２】
「シグナル伝達経路」とは、細胞のある部分から細胞の別の部分へシグナルを伝達する役割を果たす様々なシグナル伝達分子の間の生化学的な関係を指す。
【００２３】
本明細書において「抗体」とは、完全な抗体および抗原結合フラグメント(すなわち、「抗原結合部分」)またはその単鎖を含む。天然「抗体」は、ジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２つの重(Ｈ)鎖および２つの軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は重鎖可変領域(本明細書ではＶＨと略す)と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域(本明細書ではＶＬと略す)と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。このＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる相補性の高い領域が散在した相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並ぶ３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一の成分(Ｃｌｑ)を含む宿主の組織または因子との結合を媒介し得る。
【００２４】
本明細書において抗体の「抗原結合部分」(または簡単には「抗原部分」)とは、抗原(例えばＴＳＬＰＲ)と特異的に結合する能力を保持する抗体の全長または１以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより遂行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に含まれる結合フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；ヒンジ領域においてジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ)２フラグメント；ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単腕のＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546)；および単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。
【００２５】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬとＶＨは独立した遺伝子によりコードされているが、それらは組み換え法を用い、ＶＬ領域とＶＨ領域が対となって一価分子を形成している１本のタンパク質鎖として作製可能とする合成リンカーにより連結することができる(単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られている；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426;およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883参照)。このような単鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に含むものとする。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の常法を用いて得られ、これらのフラグメントは完全抗体と同様にして有用性に関してスクリーニングされる。
【００２６】
本明細書において「単離された抗体」とは、抗原特異性の異なる他の抗体を実質的に含まない抗体を指す(例えば、ＴＳＬＰＲと特異的に結合する単離された抗体は、ＴＳＬＰＲ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、ＴＳＬＰＲと特異的に結合する単離された抗体は、他種由来のＴＳＬＰＲ分子などの他の抗原に対して交差反応性を持ち得る。さらに、単離された抗体は他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない。
【００２７】
本明細書において「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は単一の結合特異性と特定のエピトープに対する親和性を示す。
【００２８】
本明細書において「ヒト抗体」とは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト起源の配列に由来している可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含む場合、この定常領域も、例えば、ヒト生殖細胞系配列または突然変異型ヒト生殖細胞系配列などのヒト配列に由来する。本発明のヒト抗体はヒト配列によってはコードされていないアミノ酸(例えば、in vitroランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、またはin vivo体細胞突然変異により導入された突然変異)を含み得る。
【００２９】
「ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト配列に由来している可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。一態様では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させ、ヒト重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００３０】
本明細書において「組み換えヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入または染色体導入された動物(例えばマウス)またはそれから作製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞(例えば、トランスフェクトーマ)から単離された抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体などの組み換え手段により作製、発現、産生または単離されたあらゆるヒト抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他のいずれかの手段により作製、発現、産生または単離された抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、そのフレームワーク領域とＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。しかしながら、ある特定の態様では、このような組み換えヒト抗体はin vitro突然変異誘発(またはヒトＩｇ配列が遺伝子導入された動物を用いる場合には、in vivo体細胞突然変異誘発)を受けてもよく、従って、組み換え抗体のＶＨ領域とＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それに関連するが、自然界でin vivoにおけるヒト抗体生殖細胞系レパートリー内には存在しない配列である。
【００３１】
「キメラ抗体」とは、(ａ)抗原結合部位(可変領域)が異なるもしくは変更されたクラスの定常領域、エフェクター機能および／または種、またはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子などと連結されるように、定常領域またはその一部が変更、置換または交換されているか、あるいは(ｂ)可変領域またはその一部が、異なるもしくは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換または交換されている抗体分子である。例えば、以下の実施例に示されるように、マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリン由来の定常領域で置換することにより修飾することができる。ヒト定常領域で置換するため、このキメラ抗体はヒトＴＳＬＰＲの認識においてその特異性を保持することができるとともに、元のマウス抗体に比べてヒトでの抗原性が低減されている。
【００３２】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体の反応性を保持しつつ、ヒトでの免疫原性が低い抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持しつつ、抗体の残りの部分をそれらのヒト対応物(すなわち、定常領域ならびに可変領域のフレームワーク部分)で置換することにより達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991;およびPadlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994参照。ヒト工学技術の他の例は、限定されるものではないが、米国特許第５,７６６,８８６号に開示されているＸｏｍａ技術を含む。
【００３３】
本明細書において「ヒューマネリング(humaneering)」とは、非ヒト抗体を操作されたヒト抗体へと変換する方法を指す(例えば、KaloBios’ HumaneeringＴＭ technology参照)。
本明細書において「イソ型」とは、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス(例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のようなＩｇＧ)を指す。
【００３４】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に用いられる。
本明細書において「ヒトＴＳＬＰＲと特異的に結合する」抗体とは、ヒトＴＳＬＰＲとＫＤ ２００×１０−１２Ｍ以下、１５０×１０−１２Ｍ以下または１００×１０−１２Ｍ以下で結合する抗体を指す。
【００３５】
本明細書において「結合特異性」とは、ただ１つの抗原決定基と反応する個々の抗体結合部位の能力を指す。この抗体の結合部位は分子のＦａｂ部分に位置し、重鎖および軽鎖の超可変領域から構成されている。抗体の結合親和性は、抗体上の単一の抗原決定基と単一の結合部位の間の反応の強さである。それは抗体の抗原決定基と結合部位の間で働く誘引力と反発力の和である。親和性は抗原抗体反応を表す平衡定数である。
【００３６】
２つの物の間の特異的結合は、平衡定数(ＫＡ)が少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１である結合を意味する。抗体(例えば抗ｈＴＳＬＰＲ抗体)と「特異的に(または選択的に)結合する」とは、タンパク質および他の生物工学品(bioligics)のヘテロな集団において同族抗原(例えば、ヒトＴＳＬＰＲポリペプチド)の存在の決定因子となる結合反応を指す。上記の平衡定数(ＫＡ)に加え、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は一般に約１×１０−２ ｓ−１、１×１０−３ ｓ−１、１×１０−４ ｓ−１またはそれ以下の解離定数(Ｋｄ)も有し、ヒトＴＳＬＰＲと、非特異的抗原(例えばＢＳＡ)との結合に関するその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗体に特異的な抗体」は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に用いられる。
【００３７】
「エピトープ」とは、抗体と特異的に結合し得るタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群からなり、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下において前者との結合は消失するが、後者との結合は消失しないことで区別される。
【００３８】
「核酸」は、本明細書では「ポリヌクレオチド」と互換的に用いられ、一本鎖型または二本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。この用語は既知のヌクレオチド類似体または修飾された主鎖残基または結合を含む核酸を包含し、これらは合成され、天然に存在し、および天然に存在せず、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様にして代謝される。このような類似体の例は、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(ＰＮＡ)を含む。
【００３９】
特に断りのない限り、特定の核酸配列はまた暗に、その保存的に修飾された変異体(例えば、縮重コドン置換)および相補配列、ならびに明示されている配列を包含する。具体的には、以下に詳説するように、縮重コドン置換は、１以上の選択した(または全ての)コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することにより達成することができる(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985;およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994)。
【００４０】
「アミノ酸」とは、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸摸倣体を指す。天然アミノ酸は遺伝コードによりコードされているもの、ならびにその後修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合しているα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このような類似体は修飾されたＲ基(例えばノルロイシン)または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸摸倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００４１】
本明細書では「ポリペプチド」および「タンパク質」はアミノ酸残基のポリマーを指して互換的に用いられる。これらの用語は、天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーだけでなく、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学摸倣体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。特に断りのない限り、特定のポリペプチド配列はまた暗にその保存的に修飾された変異体も包含する。
【００４２】
「保存的に修飾された変異体」という用語はアミノ酸配列および核酸配列の双方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列を、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列をコードする核酸を指す。遺伝コードの縮重のために、機能的に同一の多数の核酸が、何らかの所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。よって、コドンによりアラニンが指定されているどの位置でも、そのコドンを、コードされているポリペプチドを変化させずに、記載されている対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸変異体は、保存的に修飾されている変異体の一種である「サイレント変異体」である。ポリペプチドをコードしている本明細書の核酸配列はいずれも、その核酸の可能性のある全サイレント変異体も表す。当業者ならば、核酸の各コドン(元々メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧおよび元々トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く)は、機能的に同一の分子が得られるように修飾することができる。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異体が記載されている各配列に含まれる。
【００４３】
ポリペプチド配列に関して「保存的に修飾された変異体」は、あるアミノ酸の化学的に同等なアミノ酸での置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に同等なアミノ酸を示した保存的置換表が当技術分野ではよく知られている。このような保存的に修飾された変異体はその他のものとして本発明の多型変異体、種間ホモログおよび対立遺伝子があり、これらを排除するものではない。次の８つの群は互いに保存的置換となるアミノ酸を挙げたものである。
１)アラニン(Ａ)、グリシン(Ｇ)；
２)アスパラギン酸(Ｄ)、グルタミン酸(Ｅ)；
３)アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)；
４)アルギニン(Ｒ)、リシン(Ｋ)；
５)イソロイシン(Ｉ)、ロイシン(Ｌ)、メチオニン(Ｍ)、バリン(Ｖ)；
６)フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)；
７)セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)；および
８)システイン(Ｃ)、メチオニン(Ｍ)(例えば、Creighton, Proteins (1984)参照)。
【００４４】
２以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して「同一」または「同一性」％とは、同一である２以上の配列または部分配列を指す。２つの配列が、比較ウィンドウまたは以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて判断された指定領域で最大一致が得られるように比較およびアラインした場合に、または手動アライメントと目視により、示された同じアミノ酸残基またはヌクレオチド％(すなわち、示された領域または示されていない場合には全配列にわたって６０％の同一性、場合により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性)を有している場合に、２つの配列は「実質的に同一」である。場合により同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長(または１０アミノ酸長)の領域、またはより好ましくは１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド長(または２０、５０、２００以上のアミノ酸長)の領域にわたって存在する。
【００４５】
配列比較では一般に、１つの配列が参照配列として作用し、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用することもできるし、あるいは別のパラメーターを指定することもできる。次に、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づき参照配列に対して試験配列の配列同一性％を算出する。
【００４６】
本明細書において「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、通常には約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つに対する参照を含む(なお、配列は２つの配列を最適にアラインした後に同数の連続する位置の参照配列と比較すればよい)。比較のための配列アライメント法は当技術分野でよく知られている。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cのローカルホモロジーアルゴリズムにより、またはNeedleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、またはPearson and Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似性検索法により、またはこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実施により(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)、または手動アライメントと目視により行うことができる(例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)参照)。
【００４７】
配列同一性および配列類似性％を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例として、それぞれAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977;およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２.０アルゴリズムがある。ＢＬＳＴ分析を実施するためのソフトウエアはthe National Center for Biotechnology Informationから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインされる場合に、いくつかの陽性評価された閾値スコアＴに合致するか、または満たす検索配列中の長さＷの短いワードを特定することにより、高スコア配列対(ＨＳＰ)を特定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値(neighborhood word score threshold)と呼ばれる(Altschul et al., 前掲)。これらの最初の隣接ワードのヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるべく検索を開始するための核として働く。これらのワードヒットを、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列の両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関してはパラメーターＭ(一致残基対のリワードスコア、常に＞０)およびＮ(不一致残基のペナルティースコア、常に＜０)を用いて算出する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアがその最大達成値から未知数Ｘだけ遠ざかる場合；累積スコアが、１以上の負のスコアリング残基アライメントの累積のために０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ、およびＸはアライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルトとして、ワード長(Ｗ)１１、期待値(Ｅ)または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、期待値(Ｅ)１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989参照)アライメント(Ｂ)５０、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００４８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も行う(例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993参照)。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率(Ｐ(Ｎ))であり、これは２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、参照配列に対する試験核酸の比較において最小合計確率が約０.２未満、より好ましくは０.０１未満、最も好ましくは０.００１未満である場合、核酸は参照配列に類似するとみなされる。
【００４９】
上記の配列同一性％の他、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというもう１つの指標は、下記のように、第一の核酸によりコードされるポリペプチドが第二の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生成された抗体と免疫学的に交差反応するということである。よって、ポリペプチドは一般に、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に第二のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるというもう１つの指標は、下記のように、２つの分子またはそれらの双方物がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズするということである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらにもう１つの指標は、同じプライマーを用いて配列を増幅することができるということである。
【００５０】
「作動可能なように連結される」とは、２以上のポリヌクレオチド(例えばＤＮＡ)セグメントの間の機能的関係を指す。一般に、これは転写調節配列と転写配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、それが適当な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合に、そのコード配列と作動可能なように連結されている。一般に、転写配列に作動可能なように連結されているプロモーター転写調節配列は転写配列と物理的に連続しており、すなわち、それらはシス作用型である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節配列は、それらが転写を増強するコード配列と物理的に連続しているか、または近接して存在する必要はない。
【００５１】
「ベクター」とはそれが連結されている別のポリヌクレオチドを移入し得るポリヌクレオチド分子を指すものとする。ベクターの一種に「プラスミド」があり、これは付加的ＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。もう１つのベクター種としてウイルスベクターがあり、このウイルスゲノムにさらなるＤＮＡセグメントを連結してもよい。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター)内で自律複製することができる。宿主細胞へ導入する際に他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)を宿主細胞ゲノムに組み込み、それにより宿主ゲノムとともに複製されることもできる。さらに、ある特定のベクターはそれらが作動可能なように連結されている遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクターは本発明において「組み換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と呼ぶ。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはプラスミドの形態である場合が多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用い得るが、プラスミドは最も一般的に用いられるベクターの形態である。しかし、本発明は同等の機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などの他の形態の発現ベクターも含むものとする。
【００５２】
「組み換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)とは、組み換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。このような用語は特定の対象の細胞だけでなく、そのような細胞の後代も指すと理解すべきである。突然変異または環境的影響のいずれかにより、連続する世代にある特定の修飾が起こることがあるので、このような後代は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、これらもやはり本明細書において「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【００５３】
「炎症性疾患または状態」とは、傷害部位または感染部位における局部的炎症を特徴とする全ての状態を指し、自己免疫疾患、ある特定の形態の感染炎症状態、臓器移植または他の移植片に特徴的な望ましくない好中球の活性、および事実上、局部的組織部位における望ましくない好中球の蓄積を特徴とする他の状態を含む。これらの状態には、限定されるものではないが、髄膜炎、脳浮腫、関節炎、腎炎、成人性呼吸窮迫症候群、膵炎、筋炎、神経炎、結合組織疾患、静脈炎、動脈炎、脈管炎、アレルギー、アナフィラキシー、エーリキア症、痛風、臓器移植および／または潰瘍性大腸炎が含まれる。
【００５４】
「対象」としては、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、あらゆる脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が含まれる。示されている場合を除き、「患者」または「対象」は本明細書では互換的に用いられる。
【００５５】
「処置する」とは、症候、合併症または疾病(例えば、アレルギー性炎症性疾患)の生化学的徴候の発生を予防または遅延させるために化合物または薬剤を投与すること、症候を緩和する、または疾病、状態または障害のさらなる進行を停止もしくは抑制することを含む。処置は予防的(疾病の発生を予防もしくは遅延させるため、またはその臨床徴候または無症候の発現を予防するため)または疾病の発現後の症候の治療的な抑制もしくは緩和を含む。
【００５６】
「シグナル伝達経路」または「シグナリング経路」(例えば、ＴＳＬＰシグナル伝達経路)とは、細胞と刺激性化合物または薬剤との相互作用から生じる少なくとも１つの生化学的反応を指すが、より一般的には一連の生化学的反応を指す。よって、刺激性化合物(例えばＴＳＬＰ)と細胞との相互作用はシグナル伝達経路を通じて伝達される「シグナル」を生じ、最終的には細胞応答、例えば免疫応答をもたらす。
【００５７】
ＩＩ. ヒトＴＳＬＰＲに対するアンタゴニスト抗体
１. 概要
本発明は、ヒトＴＳＬＰＲと特異的に結合する抗体を提供する。これらの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はＴＳＬＰにより媒介されるシグナル伝達活性、例えば、以下の実施例に記載されるようなＴＳＬＰにより媒介される細胞増殖に拮抗作用を示し得る。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の一般的な作製方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998; Kohler & Milstein, Nature 256:495-497, 1975; Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983;およびCole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985参照。
【００５８】
好ましくは、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は以下の実施例に記載されるような、ヒトＴＳＬＰＲ(クローン１Ｄ６.Ｃ９)に対して生成されたマウスモノクローナル抗体のようなモノクローナルである。モノクローナル抗体とは、単一のクローンに由来する抗体を指す。モノクローナル抗体を作製するいずれの技術を用いても、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌形質転換を産生することができる。ハイブリドーマを産生する１つの動物系としてマウス系がある。マウスにおけるハイブリドーマの産生は非常によく確立された手法である。以下の実施例で示すように、モノクローナル抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、非ヒト動物(例えばマウス)をｈＴＳＬＰＲポリペプチドまたはそのフラグメント、融合タンパク質もしくは変異体で免疫化することにより作製することができる。次に、この動物から単離されたＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを作製する。モノクローナルマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、ｈＴＳＬＰＲポリペプチドまたは融合タンパク質を用い、これらのハイブリドーマをＥＬＩＳＡアッセイでスクリーニングすることにより得ることができる。免疫プロトコールおよび融合のための免疫化脾細胞の単離技術は当技術分野で公知である。融合遺伝子相手(例えばマウス骨髄腫細胞)および融合手順も当技術分野でよく知られている(例えば、Harlow & Lane,前掲参照)。
【００５９】
以下の実施例に記載される例示的なマウス抗ＴＳＬＰＲ抗体の重鎖可変領域(配列番号５)および軽鎖可変領域(配列番号６)のアミノ酸配列が図５に示されている。また、この図面に示されているように、この抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ配列はＴＹＧＭＳ(ＣＤＲ１；配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(ＣＤＲ２；配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(ＣＤＲ３；配列番号９)である。軽鎖可変領域のＣＤＲ配列はＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(ＣＤＲ１；配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(ＣＤＲ２；配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(ＣＤＲ３；配列番号１２)である。
【００６０】
抗体は主として、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に存在するアミノ酸残基により標的抗原と相互作用する。一般に、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、図５に示されている対応するＣＤＲ配列と同一のそれらの重鎖ＣＤＲ配列または軽鎖ＣＤＲ配列の少なくとも１つを有する。本発明のこれらの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは以下の実施例に開示されている例示的マウス抗ＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)と同じ結合特異性を有する。これらの抗体はｈＴＳＬＰＲとの結合をめぐってマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)と競合し得る。本発明のいくつかの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、それらの重鎖および軽鎖の可変領域にそれぞれ、図５に示されている対応するＣＤＲ配列と同一の全てのＣＤＲ配列を有する。よって、これらの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はそれぞれ配列番号７、配列番号８および配列番号９と同一の３つの重鎖ＣＤＲ配列と、それぞれ配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２と同一の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を有する。
【００６１】
それぞれマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)の対応するＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を有することに加え、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは、それぞれ図５に示されている、対応するマウス抗体の可変領域配列(すなわち、配列番号５および配列番号６)と同一の全重鎖および軽鎖可変領域配列を有する。他のいくつかの態様では、これらの抗体は同一のＣＤＲ配列以外、図５に示されている対応するアミノ酸残基とは異なる可変領域のフレームワーク部分のアミノ酸残基を含む(例えば、下記の数種のヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体)。しかしながらやはり、これらの抗体は一般に、図５に示されている対応する可変領域配列と実質的に同一(例えば７５％、８５％、９０％、９５％または９９％)のそれらの全可変領域配列を有する。
【００６２】
本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は２本の重鎖と２本の軽鎖を含む完全抗体であり得る。それらはまた、完全抗体または単鎖抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、非ヒト動物で産生された抗体(例えば、図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体)を含む。それらはまた、図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の修飾型である修飾抗体も含む。多くの場合、これらの修飾抗体は例示されたマウス抗体と同じ特性を有するか、または特性の改善された組み換え抗体である。例えば、以下の実施例で例示されるマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、定常領域を欠失させ、それを、抗体の半減期(例えば血清半減期)、安定性および親和性の増強をもたらし得る異なる定常領域で置換することにより修飾することができる。修飾抗体は例えば、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列にグラフトされたマウス抗体由来ＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより産生することができる(Jones et al.. 1986, Nature 321, 522-525)。このようなフレームワーク配列は公開ＤＮＡデータベースから得ることができる。
【００６３】
修飾抗体のいくつかは部分的ヒト免疫グロブリン配列(例えば定常領域)と部分的非ヒト免疫グロブリン配列(例えば図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体可変領域配列)を含むキメラ抗体である。他のいくつかの修飾抗体はヒト化抗体である。一般に、ヒト化抗体は非ヒトである供給源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野でよく知られている(例えば、米国特許第５,５８５,０８９号および同第５,６９３,７６２号；Jones et al., Nature 321: 522-25, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-27, 1988;およびVerhoeyen et al., Science 239: 1534-36, 1988)。これらの方法は、非ヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体由来のＣＤＲの少なくとも一部を対応するヒト抗体の領域で置換することにより、本発明のヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を作製するために容易に使用することができる。いくつかの態様では、本発明のヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、対応するヒトフレームワーク領域にグラフトされた、図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体由来の各免疫グロブリン鎖において３つ全てのＣＤＲを有する。
【００６４】
上記の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、結合特異性もしくはエフェクター機能、または結合親和性の許容できないような低下なく、可変領域と定常領域の双方で決定的でないアミノ酸置換、付加または欠失を受けてもよい。通常、このような変更を組み込んだ抗体は、それらが由来する参照配列(例えば、図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体)と実質的な配列同一性を示す。例えば、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかの成熟軽鎖可変領域は、図５に示されている抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の成熟軽鎖可変領域の配列と少なくとも７５％または少なくとも８５％の配列同一性を有する。同様に、抗体の成熟重鎖可変領域は一般に、図５に示されている抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の成熟重鎖可変領域の配列と少なくとも７５％または少なくとも８５％の配列同一性を示す。修飾された抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは、図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)と比べた場合に同等の特異性と高い親和性を有する。通常、修飾された抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(例えばヒト化抗体)の親和性は元のマウス抗体と同等であるか、またはより良い結合親和性を有する。これらの修飾抗体の結合親和性は元のマウス抗体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％である。
【００６５】
２. キメラおよびヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体
本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは、ヒト抗体の領域とともに非ヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体アンタゴニスト由来の領域からなるキメラ(例えばマウス／ヒト)抗体である。例えば、キメラＨ鎖はヒト重鎖定常領域の少なくとも一部と連結されたマウス抗ＴＳＬＰＲ抗体の重鎖可変領域の抗原結合領域(例えば配列番号５で示される配列)を含み得る。このキメラ重鎖は、ヒト軽鎖定常領域の少なくとも一部と連結されたマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の軽鎖可変領域の抗原結合領域(例えば配列番号６で示される配列)を含むキメラＬ鎖と組み合わせることができる。
【００６６】
本発明のキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は以下の実施例の開示ならびに当技術分野で公知の方法に従って作製することができる。例えば、マウス抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体分子の重鎖または軽鎖をコードする遺伝子を制限酵素で消化してマウスＦｃ領域を除去し、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の等価部分で置換することができる。組み換え抗体および特にヒト化抗体の発現に好適な発現ベクターおよび宿主細胞は当技術分野でよく知られている。抗ｈＴＳＬＰＲ免疫グロブリン鎖をコードするキメラ遺伝子を発現するベクターは、標準的な組み換え技術、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001);およびBrent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)を用いて構築することができる。ヒト定常領域配列は、限定されるものではないが、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991に挙げられているものを含む、種々の参照配列から選択することができる。ＤＮＡ組み換えによりキメラ抗体を作製するさらに具体的な教示も当技術分野で教示されている(例えば、Robinson et al., 国際特許公報ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira, et al., 欧州特許出願第１８４,１８７号；Taniguchi, M., 欧州特許出願第１７１,４９６号；Morrison et al., 欧州特許出願第１７３,４９４号；Neuberger et al., 国際出願ＷＯ８６／０１５３３；Cabilly et al.米国特許第４,８１６,５６７号；Cabilly et al.., 欧州特許出願第１２５,０２３号；Better (1988) Science 240:1041-1043; Liu (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood (1985) Nature 314:446-449; Shaw (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)。
【００６７】
非ヒト抗体由来の全可変領域を有するキメラ抗体は、ヒトにおける抗体の抗原性を軽減するためにさらにヒト化することができる。これは一般に、Ｆｖ可変領域(フレームワーク領域または非ＣＤＲ領域)の特定の配列またはアミノ酸残基をヒトＦｖ可変領域由来の等価な配列またはアミノ酸残基で置換することにより達成される。これらのさらに置換された配列またはアミノ酸残基は通常、抗原結合に直接的には関与しない。多くの場合、非ヒト抗体のヒト化は、非ヒト抗体(例えば図５に示されているマウス抗体)のＣＤＲのみをヒト抗体のＣＤＲで置換することにより行う。場合によっては、その後、ヒトフレームワーク領域のいくつかのさらなる残基を非ヒトドナー抗体由来の対応する残基で置換する。抗原との結合を向上させるにはこのような付加的グラフトが必要である場合が多い。これは非ヒト抗体からグラフトされたＣＤＲのみを有するヒト化抗体が非ヒトドナー抗体に比べて、完全な結合活性に満たない場合があるためである。よって、本発明のヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は多くの場合、ＣＤＲの他に、非ヒトドナー抗体(例えば図５に示されているマウス抗体)由来の対応する残基で置換された、ヒトフレームワーク領域のいくつかのアミノ酸を有する。置換のためのフレームワーク残基を選択する基準を含む、ＣＤＲ置換によるヒト化抗体の作製方法は当技術分野でよく知られている。例えば、キメラ抗体の作製に関連する上記の技術の他、ヒト化抗体を作製するさらなる技術が例えば、Winter et al., ＵＫ特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ(1987), 米国特許第５,２２５,５３９号; Jones (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988 Science 239:1534;およびBeidler (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に示されている。また、ＣＤＲ置換は、例えば、ヒト単核食細胞上の免疫グロブリンＧのＦｃ受容体に対するヒト化抗体と題されたＷＯ９４／１０３３２に記載されているようなオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を用いて行うこともできる。
【００６８】
本発明のキメラまたはヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は一価、二価または多価免疫グロブリンであり得る。例えば、一価キメラ抗体は上記のように、ジスルフィド橋を介してキメラＬ鎖と結合されたキメラＨ鎖により形成される二量体(ＨＬ)である。二価キメラ抗体は少なくとも１つのジスルフィド橋を介して結合された２つのＨＬ二量体により形成される四量体(Ｈ２Ｌ２)である。多価キメラ抗体は鎖の凝集に基づく。
【００６９】
３. ヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体
本発明には、キメラまたはヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の他、同等の結合特異性および匹敵するまたはより良好な結合親和性を示す完全ヒト抗体も含まれる。例えば、これらのヒト抗体は、配列番号５の重鎖可変領域配列と配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む参照ヒト抗体と同等かまたはより良好な特徴を持ち得る。キメラまたはヒト化抗体に比べ、本発明のヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はさらにヒト対象に投与された場合に、さらに抗原性の低減を示す。
【００７０】
ヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。例えば、非ヒト抗体と同等の結合特性を維持する、またはより良好な結合特性をもたらしつつ、非ヒト抗体可変領域をヒト可変領域で置換するin vivo法が米国特許出願第１０／７７８,７２６号(公開番号２００５０００８６２５)に開示されている。この方法は、エピトープによりガイドされる、非ヒト参照抗体可変領域の完全ヒト抗体での置換に基づく。得られるヒト抗体は一般に参照非ヒト抗体と構造上無関連であるが、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。簡単に言うと、このエピトープによりガイドされる一連の相補的置換アプローチは、「競合因子(competitor)」と参照抗体の多様なハイブリッドのライブラリー(「試験抗体」)との間に、試験抗体と抗原の結合に応答するリポーター系の存在下で限られた量の抗原との結合をめぐる競合を設定することにより可能となる。競合因子は参照抗体または単鎖Ｆｖフラグメントなどのその誘導体であり得る。競合因子はまた、参照抗体と同じエピトープに結合する抗原の天然リガンドまたは人工リガンドであり得る。競合因子の唯一の要件は、参照抗体と同じエピトープに結合することと、それが抗原結合をめぐって参照抗体と競合することである。これらの試験抗体は一般に非ヒト参照抗体由来の１つの抗原結合Ｖ領域と、ヒト抗体レパートリーライブラリーなどの異なる供給源から無作為に選択された他のＶ領域を有する。参照抗体由来の共通Ｖ領域は、選択が参照抗体に対して最高の抗原結合適合度に偏向するよう、試験抗体を抗原上の同じエピトープ上に同じ配向で配置するガイドとして役立つ。ＴＳＬＰＲ結合ドメインの同定はエピトープマッピングにより確定され、図８に示されている。このＴＳＬＰＲ抗体は不連続のエピトープと結合する。
【００７１】
試験抗体と抗原の間の所望の相互作用を検出するためには多くの種類のリポーター系が使用できる。例えば、相補的リポーターフラグメントを抗原および試験抗体にそれぞれ結合させて、試験抗体が抗原と結合したときにのみフラグメント相補によりリポーターの活性化が生じるようにすればよい。この試験抗体−リポーターフラグメント融合物および抗原−リポーターフラグメント融合物が競合因子と同時に存在する場合、試験抗体が競合因子と競合する能力に依存してリポーターの活性化が起こり、これが抗原に対する試験抗体の親和性に比例する。使用可能な他のリポーター系は、米国特許出願第１０／２０８,７３０号(公開番号２００３０１９８９７１)に開示されているような自己阻害リポーター再活性化系(ＲＡＩＲ)のリアクチベーター、または米国特許出願第１０／０７６,８４５号(公開番号２００３０１５７５７９)に開示されている競合活性化系を含む。
【００７２】
連続的なエピトープによりガイドされる相補的置換系で、競合因子、抗原およびリポーター成分とともに単一の試験抗体を発現する細胞を同定するための選択を行う。これらの細胞では、各試験抗体は限られた量の抗原との結合をめぐって競合因子と１対１の競合をする。このリポーターの活性は試験抗体と結合した抗原の量に比例し、これはさらに抗原に対する試験抗体の親和性および試験抗体の安定性に比例する。試験抗体はまず、試験抗体として発現される場合、参照抗体と比べたそれらの活性に基づき選択される。１回目の選択で得られるものは、各々同じ参照抗体由来非ヒトＶ領域とライブラリー由来ヒトＶ領域からなり、その各々が抗原上の、参照抗体と同じエピトープと結合する「ハイブリッド」抗体セットである。１回目に選択されたハイブリッド抗体の１つ以上(one of more)は、参照抗体に匹敵するか、またはそれより高い抗原親和性を有する。
【００７３】
第二段階のＶ領域置換では、第一段階で選択されたヒトＶ領域を、非ヒト参照抗体Ｖ領域を保持するため、同族ヒトＶ領域の異なるライブラリーによるヒト置換の選択のためのガイドとして使用する。１回目に選択されたハイブリッド抗体はまた、２回目の選択の競合因子として用いてもよい。２回目の選択で得られるものは、参照抗体と構造的には異なるが、同じ抗原との結合をめぐって参照抗体と競合する完全ヒト抗体セットである。選択されたヒト抗体のいくつかは参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。これらの選択されたヒト抗体のうち１以上は、参照抗体に匹敵するか、またはそれより高い親和性で同じエピトープと結合する。
【００７４】
参照抗体として上記されているマウスまたはキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の１つを用いて、この方法は、同じ結合特異性および同じか、またはより良好な結合親和性を有するヒトＴＳＬＰＲと結合するヒト抗体を作製するために容易に使用することができる。さらに、このようなヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はまた、例えばKaloBios, Inc. (Mountain View, CA)など、ヒト抗体を習慣的に生産している会社から商業的に入手することもできる。
【００７５】
４. 他タイプの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体
本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はまた、単鎖抗体、二重特異的抗体および多重特異的抗体も含む。いくつかの態様では、本発明の抗体は単鎖抗体である。単鎖抗体は、安定に折り畳まれたポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の双方に由来する抗原結合領域を含む。単鎖抗体は一般にそれ自体、結合特異性とモノクローナル抗体の親和性を保持しているが、従来の免疫グロブリンよりも大きさが著しく小さい。ある特定の適用では、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ単鎖抗体は完全な抗ｈＴＳＬＰＲ抗体に比べて多くの有利な特性を提供する。これらには例えば、身体からのより迅速なクリアランス、画像診断および治療の両面でより大きな組織浸透、ならびにマウスに基づく抗体に比べて免疫原性の有意な軽減が含まれる。単鎖抗体を用いる他の可能性のある利点としては、ハイスループットスクリーニング法におけるスクリーニング力の向上および非経腸適用の可能性が含まれる。
【００７６】
本発明の単鎖抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は当技術分野で記載されている方法を用いて作製することができる。このような技術の例は、米国特許第４,９４６,７７８号および同第５,２５８,４９８号；Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88, 1991; Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999, 1993;ならびにSkerra et al., Science 240:1038-1040, 1988に記載されているものを含む。
【００７７】
いくつかの態様において、本発明は、複数の結合部位または標的エピトープと結合する二重特異的または多重特異的分子を作製するために誘導体化された、または別の機能的分子と結合された抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を提供する。この機能的分子は、別のペプチドまたはタンパク質(例えば、サイトカイン、細胞傷害性薬剤、免疫刺激剤または阻害剤、上記のようなＦａｂ’フラグメントまたは他の抗体結合フラグメント)を含む。例えば、抗ｈＴＳＬＰＲ抗体またはその抗原結合部分は、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合ミメティックなどの１以上の他の結合分子と機能的に結合させることができる(例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有結合またはその他による)。よって、本発明の二重特異的および多重特異的抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、ヒトＴＳＬＰＲに対する第一の結合特異性と第二の標的エピトープに対する第二の結合特異性を有する少なくとも１つのモノクローナル抗ｈＴＳＬＰＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。第二の標的エピトープはＦｃ受容体、例えば、ヒトＦｃγＲＩまたはヒトＦｃγ受容体であり得る。よって、本発明は、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲまたはＦｃεＲを発現するエフェクター細胞(例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞(ＰＭＮ))とヒトＴＳＬＰＲを発現する標的細胞(例えば、ヒトＣＤ１１ｃ＋樹状細胞)の双方と結合することができる二重特異的分子および多重特異的分子を含む。これらの多重特異的(例えば、二重特異的または多重特異的)分子は、ヒトＴＳＬＰＲ発現細胞をエフェクター細胞に向け、ヒトＴＳＬＰＲ発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用(ＡＤＣＣ)、サイトカイン放出、またはスーパーオキシド陰イオンの生成など、Ｆｃ受容体により媒介されるエフェクター細胞の活性化を誘発する。
【００７８】
本発明の二重特異的および多重特異的抗ｈＴＳＬＰＲ分子は当技術分野で記載されている方法により作製することができる。これらには化学的技術(例えば、Kranz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807, 1981参照)、ポリドーマ技術(例えば、米国特許第４,４７４,８９３号参照)、または組み換えＤＮＡ技術が含まれる。本発明の二重特異的分子および多重特異的分子は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される方法を用い、構成的結合特異性、例えば抗ＦｃＲおよび抗ヒトＴＳＬＰＲ結合特異性をコンジュゲートすることにより作製することができる。例えば、二重特異的分子および多重特異的分子の各結合特異性を個別に作製した後、互いにコンジュゲートすることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合のために様々なカップリング剤または架橋剤を使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)が挙げられる。結合特異性が抗体(例えば、２つのヒト化抗体)である場合、それらはその２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介してコンジュゲートすることができる。このヒンジ領域は、コンジュゲーション前に、例えば１個といった奇数のスルフヒドリル残基を含むように修飾することができる。
【００７９】
これらの二重特異的分子および多重特異的分子とそれらの特異的標的との結合は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)またはウエスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらの各アッセイは一般に、対象とする複合体に特異的な標識試薬(例えば抗体)を用いることにより、特に着目するタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識し、それと特異的に結合する酵素結合抗体または抗体フラグメントを用いて検出することができる。あるいは、これらの複合体は他の様々なイムノアッセイのいずれかを用いて検出することもできる。例えば、抗体を放射性標識し、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)に使用することができる(例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986参照)。放射性同位元素はγカウンターもしくはシンチレーションカウンターを使用するなどの手段により、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。
【００８０】
ＩＩＩ. 抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を作製するためのポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明は、上記の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする実質的に精製されたポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)を提供する。本発明のポリヌクレオチドのいくつかは、配列番号１３で示される重鎖可変領域のヌクレオチド配列および／または配列番号１４で示される軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。本発明の他のいくつかのポリヌクレオチドは、配列番号１３または配列番号１４のヌクレオチド配列と実質的に(例えば少なくとも６５、８０％、９５％または９９％)同一のヌクレオチド配列を含む。適当な発現ベクターから発現させると、これらのポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドは抗原結合能を示し得る。
【００８１】
また、本発明では、図５で示される抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域と通常には重鎖または軽鎖の３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは図５で示される抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。例えば、これらのポリヌクレオチドのいくつかは、配列番号５で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列および／または配列番号６で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする。コードの縮重のため、様々な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドは抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の可変領域配列だけをコードすることができる。それらはまた、この抗体の可変領域と定常領域の双方をコードすることもできる。本発明の核酸のポリヌクレオチド配列のいくつかは、配列番号５で示される１Ｄ６.Ｃ９マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の成熟重鎖可変領域配列と実質的に(例えば、少なくとも８０％、９０％または９９％)同一の成熟重鎖可変領域配列をコードする。他のいくつかのポリヌクレオチド配列は、配列番号６で示される１Ｄ６.Ｃ９マウス抗体の成熟軽鎖可変領域配列と実質的に同一の成熟軽鎖可変領域配列をコードする。これらのポリヌクレオチド配列のいくつかは、このマウス抗体の重鎖および軽鎖双方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。他のいくつかのポリヌクレオチドは、このマウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一の２つのポリペプチドセグメントをコードする。
【００８３】
これらのポリヌクレオチド配列は、de novo固相ＤＮＡ合成によるか、または抗ｈＴＳＬＰＲ抗体またはその結合フラグメントをコードする既存の配列(例えば、以下の実施例に記載されている配列)のＰＣＲ突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接化学合成は、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４,４５８,０６６号の固相支持体法など、当技術分野で公知の方法により行うことができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991;およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載のようにして行うことができる。
【００８４】
また、本発明では、上記の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。抗ＴＳＬＰＲ抗体鎖または結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させるためには種々の発現ベクターが使用可能である。哺乳類宿主細胞で抗体を作製するためには、ウイルス系および非ウイルス系双方の発現ベクターが使用可能である。非ウイルスベクターおよび系は、プラスミド、一般にタンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットを有するエピソームベクター、およびヒト人工染色体(例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997参照)を含む。例えば、哺乳類(例えばヒト)細胞における抗ｈＴＳＬＰＲポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ３.１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ(Invitrogen, San Diego, CA)、ＭＰＳＶベクターおよび他のタンパク質の発現に関して当技術分野で知られている他の多くのベクターを含む。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルスに基づくベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ)に基づくベクターが挙げられる。Brent et al., 前掲; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995;およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992参照。
【００８５】
発現ベクターの選択は、そのベクターを発現させる意図する宿主細胞によって異なる。一般に、これらの発現ベクターは、抗ｈＴＳＬＰＲ抗体鎖またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたプロモーターおよびその他の調節配列(例えばエンハンサー)を含む。いくつかの態様では、誘導性プロモーターは、誘導条件下以外で挿入配列を発現しないようにするために使用される。誘導性プロモーターは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターを含む。形質転換生物の培養物は、その発現産物が宿主細胞により良好に許容されるコード配列の集団に偏らないように非誘導条件下で拡張することができる。抗ｈＴＳＬＰＲ抗体鎖またはフラグメントの効率的な発現には、プロモーターの他、他の調節エレメントも必要であるか、または望ましい。これらのエレメントは一般に、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現効率は使用においてその細胞系に適当なエンハンサーを含めることで増強することができる(例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994;およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987参照)。例えば、哺乳類宿主細胞における発現を高めるためには、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用することができる。
【００８６】
発現ベクターはまた、挿入された抗ｈＴＳＬＰＲ抗体配列によりコードされているポリペプチドと融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も提供する。多くの場合、挿入された抗ｈＴＳＬＰＲ抗体配列は、ベクターに封入する前にシグナル配列と連結させる。抗ｈＴＳＬＰＲ抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するために用いられるベクターは定常領域またはその一部もコードする場合がある。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、それにより完全抗体またはそのフラグメントの生成をもたらす。一般に、このような定常領域はヒトである。
【００８７】
抗ｈＴＳＬＰＲ抗体鎖を担持および発現するための宿主細胞は、原核生物かまたは真核生物であり得る。大腸菌(E. coli)は本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な１つの原核生物宿主である。使用に好適な他の微生物宿主は、枯草菌(Bacillus subtilis)などのバチルス属、およびサルモネラ属、セラチア属および種々のシュードモナス種などの他の腸内細菌を含む。これらの原核生物宿主では、一般に、その宿主細胞に適合する発現制御配列(例えば複製起点)を含む発現ベクターの作製も可能となる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはλファージ由来プロモーター系など、種々の周知のプロモーターがいくつ存在してもよい。これらのプロモーターは一般に、任意のオペレーター配列により発現を制御し、転写および翻訳を誘導および完了するために、リボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物も、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲポリペプチドを発現させるために使用することができる。昆虫細胞をバキュロウイルスベクターと組み合わせて使用することもできる。
【００８８】
いくつかの好ましい態様では、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲポリペプチドを発現および産生するために哺乳類宿主細胞を用いる。例えば、それらは内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株(例えば、実施例に記載されるような１Ｄ６.Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン)かまたは外因性の発現ベクターを担持する哺乳類細胞系統(例えば、下記に例示されているＳＰ２／０骨髄腫細胞)のいずれかであり得る。これらには正常な致死の、またが正常もしくは異常な不死の動物もしくはヒト細胞が含まれる。例えば、ＣＨＯ細胞系統、種々のＣｏｓ細胞系統、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系統、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含み、完全な免疫グロブリンを分泌し得るいくつかの好適な宿主細胞系統が開発されている。ポリペプチドを発現させるための哺乳類組織細胞培養の使用は一般に、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987に論じられている。哺乳類宿主細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサー(例えば、Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986参照)などの発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。これらの発現ベクターは通常、哺乳類遺伝子に由来する、または哺乳類ウイルスに由来するプロモーターを含む。好適なプロモーターは構成的、細胞種特異的、段階特異的、および／または調整可能もしくは調節可能である。有用なプロモーターは、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導ＣＭＶプロモーター(ヒト前初期ＣＭＶプロモーター)、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せを含む。
【００８９】
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は細胞宿主の種類によって異なる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞に用いられる場合が多いが、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用可能である(一般に、Sambrook, et al., 前掲参照)。他の方法として、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道法、ウィロソーム(virosome)、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合(Elliot and O’Hare, Cell 88:223, 1997)、薬剤により促進させるＤＮＡ取り込み、およびex vivo形質導入がある。組み換えタンパク質の長期間高収率生産のためには、多くの場合、安定発現が望まれる。例えば、抗ｈＴＳＬＰＲ抗体鎖または結合フラグメントを安定発現する細胞系統は、ウイルス起源の複製または内因性発現エレメントと選択可能なマーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを用いて産生することができる。ベクターを導入した後、富化培地中で１〜２日間細胞を増殖させ、その後、選択培地に切り替えればよい。選択マーカーの目的は選択のために耐性を付与することであり、その存在により、選択培地中で導入配列を首尾よく発現する細胞の増殖が可能となる。耐性のある、安定にトランスフェクトされた細胞は、その細胞種に適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００９０】
ＩＶ. 抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の特性
上記の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体が宿主細胞内で発現ベクターから、または内因的にハイブリドーマにおいて発現されると、それらは培養培地および宿主細胞から容易に精製することができる。通常、抗体鎖はシグナル配列ともに発現され、従って、培地に放出される。しかしながら、宿主細胞が抗体鎖を自然に分泌しない場合には、弱い洗剤で処理することで抗体鎖を放出させることができる。次に、硫酸アンモニウム沈殿、固定化標的に対するアフィニティークロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む常法により抗体鎖を精製することができる。これらの方法は全てよく知られており、当技術分野で慣例的に実施されている(例えば、Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982; and Harlow & Lane, 前掲)。
【００９１】
例として、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を発現する選択されたハイブリドーマは、モノクローナル抗体精製用の２リットルのスピナーフラスコで増殖させることができる。上清を濾過および濃縮した後、プロテインＡ−セファロースまたはＧタンパク質−セファロース(Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーにより純粋かどうかを確認することができる。バッファー溶液をＰＢＳに交換し、ＯＤ２８０の読み取りにより濃度を測定することができる。これらのモノクローナル抗体はアリコートに分け、−８０℃で保存することができる。
【００９２】
それらの製造方法にかかわらず、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体はｈＴＳＬＰＲまたはその抗原フラグメントと特異的に結合する。特異的結合は、ｈＴＳＬＰＲまたはその抗原フラグメントとの抗体結合に関する解離定数が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１ｎＭである場合に存在する。ｈＴＳＬＰＲに対する抗体の結合能は、目的抗体を直接標識することにより検出することもできるし、あるいは抗体を標識せず、種々のサンドイッチアッセイ形式を用いて結合を間接的に検出してもよい。例えば、Harlow & Lane, 前掲参照。このような結合特異性を有する抗体は、以下の実施例で述べられる１Ｄ６.Ｃ９マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体により示される有利な特性を共通に持つ可能性が高い。
【００９３】
本発明の抗ＴＳＬＰＲモノクローナル抗体は、ＴＳＬＰにより媒介されるシグナル伝達活性に拮抗することができる。これらの活性は、例えば、ＴＡＲＣおよびＭＤＣなどの樹状細胞によるＴＨ２−誘引ケモカインの分泌、樹状細胞の活性化、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大およびＴＨ２表現型への分極、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３ ＴＮＦαなどのアレルギー誘発性サイトカインの産生を含む。抗ｈＴＳＬＰＲ抗体がＴＳＬＰにより媒介される細胞活性を阻害することができるかどうかを判定するためには、いくつかのアッセイを使用することができる。これらには、例えば、Ｂａ／Ｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞を用いた細胞増殖アッセイ、Ｂａ／Ｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞を用いたルシフェラーゼリポーターアッセイ、およびＴＡＲＣ分泌アッセイなど、実施例に記載されているいずれのアッセイも含まれる。ＴＳＬＰシグナル伝達活性を測定するためのさらなるアッセイも当技術分野において記載されている。例えば、Reche et al., J. Immunol., 167:336-43, 2001;およびIsaksen et al., J Immunol. 168:3288-94, 2002参照。
【００９４】
いくつかの態様では、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、図５に示されている可変領域配列を有する参照抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(例えば、以下の実施例に記載されるマウス１Ｄ６.Ｃ９抗体またはそのキメラ抗体)とｈＴＳＬＰＲポリペプチドとの結合を遮断するか、またはそれと競合する。これらは上記の完全ヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体であり得る。それらはまた、参照抗体と同じエピトープと結合する他のマウス、キメラまたはヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体であってもよい。参照抗体の結合を遮断するか、またはそれと競合することができるということは、試験下の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体が参照抗体により定義されるものと同一または類似のエピトープと、または参照抗ｈＴＳＬＰＲ抗体が結合しているエピトープに十分近接したエピトープと結合することを示唆する。このような抗体は特に、参照抗体に関して確認された有利な特性を共通に持っている可能性がある。参照抗体を遮断するか、またはそれと競合する能力は、例えば競合結合アッセイにより測定することができる。競合結合アッセイでは、試験下の抗体を、参照抗体とＴＳＬＰＲポリペプチドなどの共通抗原との特異的結合を阻害する能力に関して調べる。試験抗体は、過剰量の試験抗体が参照抗体の結合を実質的に阻害する場合に、抗原との特異的結合をめぐって参照抗体と競合する。実質的阻害とは、試験抗体が参照抗体の特異的結合を通常、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または９０％低下させることを意味する。
【００９５】
ヒトＴＳＬＰＲとの結合をめぐる、抗ｈＴＳＬＰＲ抗体と参照抗ｈＴＳＬＰＲ抗体との競合を評価するために使用可能な既知の競合結合アッセイがいくつかある。これらには、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、固相直接または間接酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986参照)；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow & Lane, 前掲参照)；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990);および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990)が含まれる。一般に、このようなアッセイは、非標識試験抗ｈＴＳＬＰＲ抗体および標識参照抗体のいずれかを担持する固相表面または細胞に結合された精製抗原の使用を含む。競合的阻害は、試験抗体の存在下で、固相表面または細胞に結合された標識の量を測定することにより評価される。競合アッセイにより同定された抗体(競合抗体)には、参照抗体と同じエピトープと結合する抗体および参照抗体が結合しているエピトープと、立体障害が起こるのに十分近接している隣接エピトープと結合する抗体が含まれる。
【００９６】
選択された抗ＴＳＬＰＲモノクローナル抗体がユニークなエピトープに結合するかどうかを調べるためには、各抗体を市販の試薬(例えば、Pierce, Rockford, ILからの試薬)を用いてビオチン化することができる。非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いた競合試験は、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて行うことができる。ビオチン化ＭＡｂの結合はストレプトアビジン(strep-avidin)−アルカリホスファターゼプローブで検出することができる。精製抗ＴＳＬＰＲ抗体のイソ型を調べるためには、イソ型ＥＬＩＳＡを行うことができる。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを４℃にて一晩、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧでコーティングすればよい。１％ＢＳＡで遮断した後、これらのプレートを周囲温度で１〜２時間、１μｇ／ｍｌ以下のモノクローナル抗ｈＴＳＬＰＲ抗体または精製イソ型対照と反応させる。次に、これらのウェルをヒトＩｇＧｌまたはヒト ＩｇＭ特異的アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートプローブのいずれかと反応させる。その後、精製抗体のイソ型が判定できるようにプレートを現像および分析する。
【００９７】
モノクローナル抗ｈＴＳＬＰＲ抗体とｈＴＳＬＰＲポリペプチドを発現する生存細胞との結合を調べるためには、フローサイトメトリーを使用することができる。簡単に言うと、ｈＴＳＬＰＲを発現する細胞系統(標準的な増殖条件下で増殖させる)を、０.１％ＢＳＡおよび１０％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中、種々の濃度の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベートすることができる。洗浄後、一次抗体染色と同様の条件下、これらの細胞をフルオレセイン標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。これらのサンプルを、単細胞に対してゲートを開く光散乱および側方散乱特性を用いたＦＡＣＳｃａｎ装置により分析することができる。フローサイトメトリーアッセイの加えて、またはその代わりに蛍光顕微鏡を用いる別のアッセイを使用することもできる。細胞を上記のような厳密に染色し、蛍光顕微鏡により調べることができる。この方法により個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の濃度によって感受性が低下する場合がある。
【００９８】
本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はさらに、ウエスタンブロット法により、ｈＴＳＬＰＲポリペプチドまたは抗原フラグメントとの反応性に関して試験することができる。簡単に言うと、精製ｈＴＳＬＰＲポリペプチドもしくは融合タンパク質、またはＴＳＬＰＲ発現細胞由来の細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎児血清でブロッキングし、供試モノクローナル抗体でプロービングする。ヒトＩｇＧ結合は抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)で現像することができる。
【００９９】
Ｖ. 非免疫グロブリンスキャフォールド
得られるポリペプチドが標的タンパク質に特異的な少なくとも１つの結合領域を含む限り、多様な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドを使用することができる。このようなフレームワークまたはスキャフォールドとしては、５つの主要なイディオタイプのヒト免疫グロブリンまたはそのフラグメント(本明細書の他所に開示されているものなど)を含み、好ましくはヒト化局面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。ラクダ科で同定されているものなどの単鎖重鎖抗体は、この点で特に着目されるものである。当業者により新規なフレームワーク、スキャフォールドおよびフラグメントの発見および開発が続いている。
【０１００】
一局面において、本発明は、本発明のＣＤＲがグラフト可能な非免疫グロブリンスキャフォールドを用いた非免疫グロブリンに基づく抗体の作製に関する。既知の、または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドは、それらが配列番号Ｘの標的タンパク質に特異的な結合領域を含んでいる限り使用可能である。このような化合物は本明細書では、「標的特異的結合領域をポリペプチド」として知られる。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドは、限定されるものではないが、アドネクチン(Adnectins)(フィブロネクチン)(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(ankyrin)(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd (Cambridge, MA)およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ(Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(lipocalin)(Anticalin)(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、スモール・モジュラー・イムノファルマシューティカル(small modular immuno-pharmaceuticals)(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(maxybodies)(Avidia, Inc. (Mountain View, CA))、プロテインＡ(Affebody AG, Sweden)およびアフィリン(affilin)(γクリスタリンまたはユビキチン)(Scil Protains GmbH, Halle, Germany)を含む。
【０１０１】
(ｉ)アドネクチン−Compound Therapeutics
アドネクチンスキャフォールドは、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン(例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンの１０番目のモジュール(１０Ｆｎ３ドメイン)に基づくものである。このＩＩＩ型フィブロネクチンドメインは２つのβシートの間に分布する７または８βストランドを有し、それら自体は互いに密集してタンパク質核を形成し、さらに互いにβストランドを接続し、溶媒に曝されるループ(ＣＤＲに類似)を含む。βシートサンドイッチの各端にはこのようなループが少なくとも３つあり、この端部はβストランドの方向と垂直にタンパク質の境界となっている(米国特許第６,８１８,４１８号)。
【０１０２】
これらのフィブロネクチンに基づくスキャフォールドは免疫グロブリンではないが、全体的な折り畳みは、ラクダおよびラマＩｇＧにおける全抗原認ユニットを含む最小機能抗体フラグメントである重鎖可変領域のものに密接に関係している。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、自然界で類似の抗原結合特性および抗体に対する親和性を模倣する。これらのスキャフォールドは、in vivoにおける抗体の親和性成熟の過程に類似する、in vitroにおけるループの無作為化およびシャッフリング戦略に使用可能である。これらのフィブロネクチンに基づく分子は、標準的なクローニングを用いてその分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置換することができるスキャフォールドとして使用可能である。
【０１０３】
(ｉｉ)アンキリン−Molecular Partners
この技術は、種々の標的との結合に使用可能な可変領域を保持するためのスキャフォールドとしてアンキリン誘導化リピートモジュールを有するタンパク質の使用に基づくものである。このアンキリンリピートモジュールは２つの逆平行αヘリックスとβターンからなる３３個のアミノ酸のポリペプチドである。これらの可変領域の結合はリボソームディスプレーを用いてほぼ至適化される。
【０１０４】
(ｉｉｉ)マキシボディ／アビマー−Avidia
アビマーはＬＲＰ−１などのタンパク質を含む天然Ａドメインに由来する。これらのドメインはタンパク質−タンパク質相互作用により用いられ、ヒトでは２５０を超えるタンパク質が構造的にＡドメインに基づいている。アビマーはアミノ酸リンカーを介して結合したいくつかの異なる「Ａドメイン」モノマー(２〜１０)からなる。アビマーは、例えば２００４０１７５７５６；２００５００５３９７３；２００５００４８５１２；および２００６０００８８４４に記載されている方法論を用いて標的抗原と結合できるものを作製することができる。
【０１０５】
(ｖｉ)プロテインＡ−アフィボディ
アフィボディ(登録商標)親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１つのスキャフォールドに基づく３本のヘリックス束からなる、小さな単純なタンパク質である。プロテインＡは黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは５８のアミノ酸からなり、そのうち１３は多数のリガンド変異体を有するアフィボディ(登録商標)ライブラリーを作製するために無作為化されている(例えば、米国特許第５,８３１,０１２号参照)。アフィボディ(登録商標)分子は抗体を模倣し、抗体の分子量が１５０ｋＤａであるのに対して、その分子量は６ｋＤａである。その小さなサイズにもかかわらず、アフィボディ(登録商標)分子の結合部位は抗体のものと同等である。
【０１０６】
(ｖ)アンチカリン−Pieris
アンチカリン(登録商標)は、Pieris ProteoLab AG社が開発した製品である。それらは化学的に感受性があるか、または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に通常含まれる、小型かつ頑丈な広範なタンパク質群であるリポカリン類に由来する。数種の天然リポカリンはヒト組織または体液に見られる。
【０１０７】
このタンパク質構造は、強固なフレームワーク上に超可変ループを有する免疫グロブリンを暗示する。しかしながら、抗体またはそれらの組み換えフラグメントとは対照的に、リポカリン類は１６０〜１８０のアミノ酸残基を有する１本のポリペプチド鎖からなり、１本の免疫グロブリンドメインよりもほんの少し大きい。
【０１０８】
結合ポケットを形成する４つのループのセットは、著しい構造的可塑性を示し、かつ、種々の側鎖を許容する。よって、この結合部位は、高い親和性と特異性を有する異なる形状の、指定された標的分子を認識するために、専有プロセスで再成形することができる。
【０１０９】
リポカリンファミリーの１つのタンパク質であるPieris Brassicaeのビリン(bilin)結合タンパク質(ＢＢＰ)は、この４つのループセットを突然変異誘発することによりアンチカリン類(anticalins)を開発するために用いられている。「アンチカリン類」を記載している特許出願の一例はＰＣＴ ＷＯ１９９９１６８７３である。
【０１１０】
(ｖｉ)アフィリン−Scil Protein
アフィリン(商標)分子は、タンパク質および小分子に対して特異的親和性を持つようにデザインされた小型の非免疫グロブリンタンパク質である。新しいアフィリン(商標)分子は、各々異なるヒト由来スキャフォールドタンパク質に基づく２つのライブラリーから極めて迅速に選択することができる。アフィリン(商標)分子は免疫グロブリンタンパク質に構造的ホモロジーを示さない。Scil Proteinは２つのアフィリン(商標)スキャフォールドを用い、その一方はヒト眼のレンズの構造タンパク質であるγクリスタリンであり、他方は「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。両ヒトスキャフォールドとも極めて小さく、高温安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほぼ耐性がある。この高い安定性は主としてこれらのタンパク質の拡張βシート構造によるものである。γクリスタリン由来タンパク質の例はＷＯ２００１０４１４４に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例はＷＯ２００４１０６３６８に記載されている。
【０１１１】
ＶＩ. 抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の治療適用
抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、ＴＳＬＰシグナル伝達活性を阻害することにより、多くの治療的または予防的適用で使用することができる。これらには、Ｂ細胞の発達、Ｔ細胞の発達、Ｔ細胞受容体遺伝子再構成、またはＳｔａｔ５転写因子の調節に影響を及ぼすものなど、ＴＳＬＰシグナル伝達により媒介される疾病または状態の処置を含む。例えば、抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体は、ＴＨ２細胞により媒介される望ましくない免疫応答を抑制または軽減するために使用することができる。特にそれらはＴＳＬＰシグナル伝達と関連するか、またはそれにより媒介されるアレルギー性炎症性障害に罹患しているヒト患者を処置するのに好適である。本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体による処置に従うアレルギー性炎症性疾患としては、例えば、(１)空気流の閉塞と気管支の過敏感反応性に関連する気道の慢性炎症性疾患である喘息；(２)長期の断続的処置を必要とする慢性、増悪性の炎症性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎；および(３)アトピーに関連する、ＴＨ２リンパ球により媒介される鼻腔粘膜の炎症性障害であるアレルギー性鼻炎が挙げられる。米国およびいくつかの主要な欧州諸国では、喘息、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性鼻炎の診断罹患率は、２０１３年にはそれぞれ現在の４６００万人から５３００万人に、現在の３１７０万人から３７２０万人に、現在の５５９０万人から６４５０万人に増えると予測される。アトピー性皮膚炎患者の約５０〜８０％は喘息またはアレルギー性鼻炎を有しているか、または発症する。
【０１１２】
アレルギーの処置に現在使用可能な薬剤のほとんどは症状の緩和をもたらすことを目的としており、長期の疾病改善をもたらす可能性のある免疫調節分野の努力は比較的少ない。本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、これらのアレルギー性疾患のいずれかに罹患している対象(特にヒト患者)の新規かつ有効な処置を提供し得る。ＴＳＬＰ受容体シグナル伝達経路の活性化からＴＳＬＰを阻害することにより、それらはＴＨ２の反応と、アレルギー性炎症の誘発と維持の双方を担うサイトカインの産生を遮断することができる。このアプローチは、アトピー性皮膚炎、喘息およびアレルギー性鼻炎患者において長期の治療効果および疾病改善利益をもたらす可能性を有する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、上記の抗体または機能的フラグメントまたは保存的変異体の少なくともいずれか１つと医薬上許容される担体または賦形剤とを有する医薬組成物を提供する。
【０１１４】
ある特定の態様では、本発明は、受容体標的ｈＴＳＬＰを有する細胞の存在に関連する障害または状態を処置する方法を提供する。この方法はそれを必要とする対象に有効量の上記医薬組成物のいずれかを投与することを含む。関連の態様では、処置される障害または状態は呼吸器系障害である。
【０１１５】
別の態様では、治療される障害または状態は、気道の過敏感反応性(ＡＨＲ)、粘液の過剰生産、繊維症および血清ＩｇＥレベルの上昇を特徴とする、一般的な肺の持続性炎症性疾患である気管支喘息である。
別の態様では、処置される障害または状態は、小児に最も多い皮膚疾患であり、強いかゆみと慢性的湿疹病巣を特徴とするアトピー性(アレルギー性)皮膚炎である。
【０１１６】
別の態様では、処置される障害または状態は、ＣＯＰＤ、急性肺損傷(ＡＬＩ)、急性／成人呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、呼吸困難、アレルギー性気道炎症、小気道疾患、肺癌、鎌形赤血球症および肺高血圧症患者の急性胸部症候群、ならびに他の薬物療法、特に他の吸入薬物療法の結果としての気道過敏感反応の増悪など、他の炎症性または閉塞性気道疾患および状態から選択される。
【０１１７】
別の態様では、処置される障害または状態は、種類および起源によらず、例えば急性、アラキジン酸性、カタル性、クループ性、慢性、または結核性気管支炎を含む気管支炎である。
【０１１８】
別の態様では、処置される障害または状態は、例えば、アルミニウム症、炭粉症、石綿症、石粉症、ダチョウ塵肺症、鉄症、ケイ肺症、タバコ肺症および綿肺症を含む塵肺症(炎症性、一般に職業的な肺疾患、多くの場合、慢性であれ急性であれ気道閉塞が伴い、塵埃の反復的吸収により発生する)を含む。
【０１１９】
別の態様では、処置される障害または状態は、アトピー性鼻炎(枯草熱)および慢性副鼻腔炎から選択される。
別の態様では、処置される障害または状態は、他の皮膚の炎症性状態、例えば、乾癬または紅斑性狼瘡から選択される。
【０１２０】
別の態様では、処置される障害または状態は、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患である。
別の態様では、処置される障害または状態は、全身性硬化症、肝繊維症、肺繊維症、特発性肺繊維症または繊維肺などの他の繊維性状態から選択される。
【０１２１】
別の態様では、処置される障害または状態は腫瘍再発または転移である。Ｔｈ２サイトカインの阻害は動物モデルで抗ウイルスワクチンを増強することが示されており、ＨＩＶおよび他の感染性疾患の処置に有益であり得る[Ahlers, J. D., et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002]。
【０１２２】
別の態様では、処置される障害または状態は、喘息、慢性気管支炎、ＣＯＰＤ、中耳炎および副鼻腔炎などの、基礎にある慢性状態を増悪させる呼吸器系ウイルス感染症である。処置される呼吸器系ウイルス感染症は、中耳炎、副鼻腔炎または肺炎などの二次的細菌感染に関連し得る。
【０１２３】
別の態様では、処置される障害または状態は、他の疾病または状態、特に炎症性成分を有する疾病または状態、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、および他の疾病(アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、ならびに例えば心臓、腎臓、肝臓、肺または骨髄移植後の急性および慢性異種移植片拒絶など)を含む骨および関節の疾病から選択される。
【０１２４】
別の態様では、処置される障害または状態は、内毒素ショック、糸球体腎炎、脳虚血および心虚血、アルツハイマー病、嚢胞性繊維症、ウイルス感染症およびそれらに関連する増悪、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、多発性硬化症(ＭＳ)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)関連胃炎、および癌、特に卵巣癌の増殖である。
【０１２５】
別の態様では、処置される障害または状態は、ヒトライノウイルス、他のエンテロウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルスまたはアデノウイルスにより引き起こされるヒトにおけるウイルス感染により引き起こされる状態である。
本発明の処置は対症的または予防的なものであり得る。
【０１２６】
炎症性状態、例えば炎症性気道疾患の阻害における本発明の薬剤の有効性は、例えば、Wada et al, J. Exp. Med (1994) 180:1135-40; Sekido et al, Nature (1993) 365:654-57; Modelska et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med (1999) 160:1450-56;およびLaffon et al (1999) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160:1443-49に記載されているように、気道炎症または他の炎症性状態の動物モデル、例えばマウス、ラットまたはウサギモデルにおいて証明することができる。
【０１２７】
さらに別の態様では、本発明は、ｈＴＳＬＰ受容体を有する細胞を同定する方法を提供する。この方法は、細胞を検出可能な標識をさらに有する上記抗体または抗体フラグメントのいずれかと接触させることを含む。この標識は放射性、蛍光、磁性、常磁性、または化学発光性である。この方法はさらに上記の標識細胞の画像化または分離のいずれかを含み得る。
【０１２８】
別の態様では、上記のヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメントはいずれも合成品である。
別の態様では、本発明は、医薬組成物および付加的治療薬を提供する。
【０１２９】
付加的治療薬は、特に、以上に記載したものなどの閉塞性または炎症性気道疾患の処置においては、抗炎症薬、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬または鎮咳薬からなる群から選択することができ、例えば、このような薬剤の治療活性の増強薬またはこのような薬剤の必要用量または起こり得る副作用を軽減する手段としてのものがある。本発明の治療薬は、一定の医薬組成物として他の薬剤物質と混合してもよいし、あるいは他の薬剤物質の前、同時、または後に別に投与してもよい。よって、本発明は、上述の本発明の薬剤と抗炎症薬、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬または鎮咳薬物質の組合せを含み、該本発明の薬剤および該薬剤物質は同じ医薬組成物でも異なる医薬組成物でもよい。
【０１３０】
好適な抗炎症薬は、ステロイド、特に、グルココルチコステロイド(例えば、ブデソニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニドまたはフロ酸モメタゾン)、またはＷＯ０２／８８１６７、ＷＯ０２／１２２６６、ＷＯ０２／１００８７９、ＷＯ０２／００６７９(特に実施例３、１１、１４、１７、１９、２６、３４、３７、３９、５１、６０、６７、７２、７３、９０、９９および１０１のもの)、ＷＯ０３／３５６６８、ＷＯ０３／４８１８１、ＷＯ０３／６２２５９、ＷＯ０３／６４４４５、ＷＯ０３／７２５９２、ＷＯ０４／３９８２７およびＷＯ０４／６６９２０に記載のステロイド；非ステロイド系グルココルチコイド受容体アゴニスト、例えば、ＤＥ１０２６１８７４、ＷＯ００／００５３１、ＷＯ０２／１０１４３、ＷＯ０３／８２２８０、ＷＯ ０３／８２７８７、ＷＯ０３／８６２９４、ＷＯ０３／１０４１９５、ＷＯ０３／１０１９３２、ＷＯ０４／０５２２９、ＷＯ０４／１８４２９、ＷＯ０４／１９９３５およびＷＯ０４／２６２４８に記載されているもの；ＬＴＢ４アンタゴニスト、例えば、ＢＩＩＬ２８４、ＣＰ−１９５５４３、ＤＰＣ１１８７０、ＬＴＢ４エタノールアミド、ＬＹ２９３１１１、ＬＹ２５５２８３、ＣＧＳ０２５０１９Ｃ、ＣＰ−１９５５４３、ＯＮＯ−４０５７、ＳＢ２０９２４７、ＳＣ−５３２２８およびＵＳ５４５１７００に記載されているもの；ＬＴＤ４アンタゴニスト、例えば、モンテルカスト、プランルカスト、ザフィルルカスト、アコレート、ＳＲ２６４０、Ｗｙ−４８,２５２、ＩＣＩ１９８６１５、ＭＫ−５７１、ＬＹ−１７１８８３、Ｒｏ２４−５９１３およびＬ−６４８０５１；ＰＤＥ４阻害剤、例えば、シロミラスト(Ariflo(登録商標)GlaxoSmithKline)、ロフルミラスト(Byk Gulden)、Ｖ−１１２９４Ａ(Napp)、ＢＡＹ１９−８００４(Bayer)、ＳＣＨ−３５１５９１(Schering-Plough)、アロフィリン(Almirall Prodesfarma)、ＰＤ１８９６５９／ＰＤ１６８７８７(Parke-Davis)、ＡＷＤ−１２−２８１(Asta Medica)、ＣＤＣ−８０１(Celgene)、ＳｅｌＣＩＤ(ＴＭ)ＣＣ−１０００４(Celgene)、ＶＭ５５４／ＵＭ５６５(Vernalis)、Ｔ−４４０(Tanabe)、ＫＷ−４４９０(Kyowa Hakko Kogyo)、ならびにＷＯ９２／１９５９４、ＷＯ９３／１９７４９、ＷＯ９３／１９７５０、ＷＯ９３／１９７５１、ＷＯ９８／１８７９６、ＷＯ９９／１６７６６、ＷＯ０１／１３９５３、ＷＯ０３／１０４２０４、ＷＯ０３／１０４２０５、ＷＯ０３／３９５４４、ＷＯ０４／０００８１４、ＷＯ０４／０００８３９、ＷＯ０４／００５２５８、ＷＯ０４／０１８４５０、ＷＯ０４／０１８４５１、ＷＯ０４／０１８４５７、ＷＯ０４／０１８４６５、ＷＯ０４／０１８４３１、ＷＯ０４／０１８４４９、ＷＯ０４／０１８４５０、ＷＯ０４／０１８４５１、ＷＯ０４／０１８４５７、ＷＯ０４／０１８４６５、ＷＯ０４／０１９９４４、ＷＯ０４／０１９９４５、ＷＯ０４／０４５６０７およびＷＯ０４／０３７８０５に開示されているもの；Ａ２Ａアゴニスト、例えば、ＥＰ１０５２２６４、ＥＰ１２４１１７６、ＥＰ４０９５９５Ａ２、ＷＯ９４／１７０９０、ＷＯ９６／０２５４３、ＷＯ９６／０２５５３、ＷＯ９８／２８３１９、ＷＯ９９／２４４４９、ＷＯ９９／２４４５０、ＷＯ９９／２４４５１、ＷＯ９９／３８８７７、ＷＯ９９／４１２６７、ＷＯ９９／６７２６３、ＷＯ９９／６７２６４、ＷＯ９９／６７２６５、ＷＯ９９／６７２６６、ＷＯ００／２３４５７、ＷＯ００／７７０１８、ＷＯ００／７８７７４、ＷＯ０１／２３３９９、ＷＯ０１／２７１３０、ＷＯ０１／２７１３１、ＷＯ０１／６０８３５、ＷＯ０１／９４３６８、ＷＯ０２／００６７６、ＷＯ０２／２２６３０、ＷＯ０２／９６４６２およびＷＯ０３／０８６４０８に記載されているもの；ならびにＡ２Ｂアンタゴニスト、例えば、ＷＯ０２／４２２９８に記載されているものを含む。
【０１３１】
好適な気管支拡張薬は、抗コリン作動薬または抗ムスカリン作用薬、特に、臭化イプラトロピウム、臭化オキシトロピウム、チオトロピウム塩およびＣＨＦ４２２６(Chiesi)、およびグリコピロレート、また、ＥＰ４２４０２１、ＵＳ３７１４３５７、ＵＳ５１７１７４４、ＷＯ０１／０４１１８、ＷＯ０２／００６５２、ＷＯ０２／５１８４１、ＷＯ０２／５３５６４、ＷＯ０３／００８４０、ＷＯ０３／３３４９５、ＷＯ０３／５３９６６、ＷＯ０３／８７０９４、ＷＯ０４／０１８４２２およびＷＯ０４／０５２８５に記載されているもの；ならびにβ−２アドレノセプターアゴニスト、例えば、アルブテロール(サルブタモール)、メタプロテレノール、テルブタリン、サルメテロール、フェノテロール、プロカテロール、特に、フォルモテロール、カルモテロールおよびその医薬上許容される塩、および出典明示により本明細書の一部とされるＷＯ００／７５１１４の式Ｉの化合物(遊離型または塩または溶媒和物型)、好ましくは、その実施例の化合物、特に、化合物(５−[(Ｒ)−２−(５,６−ジエチル−インダン−２−イルアミノ)−１−ヒドロキシ−エチル]−８−ヒドロキシ−１Ｈ−キノリン−２−オン)およびその医薬上許容される塩、ならびにＷＯ０４／１６６０１の式Ｉの化合物(遊離型または塩または溶媒和物型)、また、ＥＰ１４４０９６６、ＪＰ０５０２５０４５、ＷＯ９３／１８００７、ＷＯ９９／６４０３５、ＵＳ２００２／００５５６５１、ＷＯ０１／４２１９３、ＷＯ０１／８３４６２、ＷＯ０２／６６４２２、ＷＯ０２／７０４９０、ＷＯ０２／７６９３３、ＷＯ０３／２４４３９、ＷＯ０３／４２１６０、ＷＯ０３／４２１６４、ＷＯ０３／７２５３９、ＷＯ０３／９１２０４、ＷＯ０３／９９７６４、ＷＯ０４／１６５７８、ＷＯ０４／２２５４７、ＷＯ０４／３２９２１、ＷＯ０４／３３４１２、ＷＯ０４／３７７６８、ＷＯ０４／３７７７３、ＷＯ０４／３７８０７、ＷＯ０４／３９７６２、ＷＯ０４／３９７６６、ＷＯ０４／４５６１８、ＷＯ０４／４６０８３、ＷＯ０４／８０９６４、ＥＰ１４６００６４、ＷＯ０４／０８７１４２、ＷＯ０４／０８９８９２、ＥＰ０１４７７１６７、ＵＳ２００４／０２４２６２２、ＵＳ２００４／０２２９９０４、ＷＯ０４／１０８６７５、ＷＯ０４／１０８６７６、ＷＯ０５／０３３１２１、ＷＯ０５／０４０１０３およびＷＯ０５／０４４７８７の化合物を含む。
【０１３２】
好適な抗炎症性および気管支拡張性の二重の薬剤は、ＵＳ２００４／０１６７１６７、ＷＯ０４／７４２４６およびＷＯ０４／７４８１２に開示されているものなどのβ−２アドレノセプターアゴニスト／ムスカリンアンタゴニストを含む。
【０１３３】
好適な抗ヒスタミン薬物質は、塩酸セチリジン、アセトアミノフェン、フマル酸クレマスチン、プロメタジン、ロラチジン、デスロラチジン、ジフェンヒドラミンおよび塩酸フェキソフェナジン、アクチバスチン、アステミゾール、アゼラスチン、エバスチン、エピナスチン、ミゾラスチンおよびテフェナジン、ならびにＪＰ２００４１０７２９９、ＷＯ０３／０９９８０７およびＷＯ０４／０２６８４１に開示されているものを含む。
【０１３４】
本発明の治療薬と抗コリン作動薬または抗ムスカリン作動薬、ステロイド類、β−２アゴニスト、ＰＤＥ４阻害剤、ドーパミン受容体アゴニスト、ＬＴＤ４アンタゴニストまたはＬＴＢ４アンタゴニストの組合せも使用可能である。本発明の薬剤と抗炎症薬との他の有用な組合せとしては、他のケモカイン受容体アンタゴニスト、例えば、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−３、ＣＣＲ−４、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−６、ＣＣＲ−７、ＣＣＲ−８、ＣＣＲ−９およびＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、特にＣＣＲ−５アンタゴニスト、例えば、Schering-PloughアンタゴニストＳＣ−３５１１２５、ＳＣＨ−５５７００およびＳＣＨ−Ｄ、Takedaアンタゴニスト、例えば、Ｎ−[[４−[[[６,７−ジヒドロ−２−(４−メチルフェニル)−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−８−イル]カルボニル]アミノ]フェニル]−メチル]−テトラヒドロ−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２Ｈ−ピラン−４−アミニウムクロリド(ＴＡＫ−７７０)、ＵＳ６１６６０３７(特に請求項１８および１９)、ＷＯ００６６５５８(特に請求項８)、ＷＯ００６６５５９(特に請求項９)、ＷＯ０４／０１８４２５およびＷＯ０４／０２６８７３に記載のＣＣＲ−５アンタゴニストとの組合せがある。
【０１３５】
付加的治療薬はまた、他のサイトカイン結合分子、特に他のサイトカインの抗体、特に、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８３６に記載されているものなどの抗ＩＬ４抗体、Xolair(登録商標)などの抗ＩｇＥ抗体、ＷＯ０５／００７６９９に記載されているものなどの抗ＩＬ３１抗体、抗ＩＬ３１Ｒ抗体、抗ＩＬ１３抗体、抗エンドリン抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、および抗ＴＳＬＰ抗体または別の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体との組合せからなる群から選択することができる。
【０１３６】
本発明の抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体は、治療的および予防的の双方で対象を処置するために使用可能である。治療適用では、抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体(例えば、ヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体)を含む組成物は、ＴＳＬＰシグナル伝達により引き起こされるか、またはシグナル伝達に関連するアレルギー性疾患に既に罹患している対象に投与される。この組成物は抗体をその状態およびその合併症を治癒する、部分的に阻止する、または進行を検出可能な程度に遅延させるのに十分な量で含む。予防適用では、モノクローナル抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を含む組成物は、アレルギー性炎症性障害のまだ罹患していない患者に投与される。むしろ、それらはアレルギー性炎症性障害を発症するリスクがあるか、または疾病素因を有する対象に向けられる。このような適用は対象に患者としての抵抗性を高めさせるか、またはＴＳＬＰシグナル伝達により媒介されるアレルギー性炎症性障害の進行を遅延させる。
【０１３７】
ＶＩＩ. 医薬組成物
本発明は、医薬上許容される担体とともに製剤された抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体(完全または結合フラグメント)を含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、所与のアレルギー性障害を処置または予防するのに好適な他の治療薬、例えば、上記の既知の抗アレルギー薬をさらに含み得る。医薬担体は組成物を増強または安定化するか、または組成物の調製を助ける。医薬上許容される担体としては、生理学的に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
【０１３８】
本発明の医薬組成物は当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。投与経路および／または投与様式は所望の結果によって異なる。投与は静脈投与、筋肉投与、腹腔内投与または皮下投与であるか、または標的部位に近接して投与することが好ましい。医薬上許容される担体は静脈投与、筋肉投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与または上皮投与(例えば、注射または注入による)に適しているべきである。投与経路に応じて、有効化合物、すなわち抗体、二重特異的および多重特異的分子は、酸の作用および化合物を不活性化し得る他の天然条件から化合物を保護するための材料でコーティングすることができる。
【０１３９】
組成物は無菌かつ流動性であるべきである。適切な流動性は例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散系の場合では必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射組成物の長時間吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含めることにより行うことができる。
【０１４０】
本発明の医薬組成物は周知かつ当技術分野で慣例的に実施されている方法に従って製造することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; and Sustained and Controlled Release Drug Delivery systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。医薬組成物はＧＭＰ条件下で製造するのが好ましい。一般に、本発明の医薬組成物には、治療上有効な用量または効果的な用量の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を用いる。これらの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、当業者に公知の常法により医薬上許容される投与形として製剤される。投与計画は最適目的応答(例えば、治療応答)を提供するように調節される。例えば、１回のボーラス投与を行ってもよいし、経時的に数回の分割投与を行ってよいし、あるいは治療状況の緊急性により指示されるように用量を比例的に減少または増加させてもよい。投与の簡単さと用量の均一性のために、非経口組成物は単位投与形で処方することが特に有利である。本明細書において単位投与形とは、処置される対象にとって単位用量として適した物理的に独立した単位を指し、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算した所定量の有効化合物を必要な医薬担体とともに含む。
【０１４１】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式に対して、患者への毒性なく、所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量が得られるように変更することができる。選択される用量レベルは、使用する本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性を含む様々な薬物動態因子、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排泄速度、処置期間、使用する特定の組成物と併用される他の薬剤、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態および過去の薬歴によって異なる。
【０１４２】
医師または獣医師は、医薬組成物中に用いられる本発明の抗体用量を所望の治療効果を達成するのに必要とされるものよりも低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで徐々に用量を高めることができる。一般に、本明細書に記載のアレルギー性炎症性障害の処置のための、本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、および処置が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの異なる因子によって異なる。処置用量は安全性と有効性を至適化すべく微調整する必要がある。抗体とともに投与する場合、用量は約０.０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０.０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。処置計画例としては、２週間に１回または１か月に１回または３〜６か月に１回の投与が必要である。
【０１４３】
抗体は通常、複数回で投与される。１回の投与の間隔は１週間、１か月または１年であり得る。間隔は患者において抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の血中レベルを測定することにより指示される場合、不定期であってもよい。いくつかの方法では、用量は、血漿抗体濃度１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌとなるように調節される。あるいは、抗体は徐放性処方物として投与することもでき、この場合には必要とされる投与頻度は少なくなる。用量および頻度は患者における抗体の半減期によって異なる。一般に、ヒト化抗体はキメラ抗体および非ヒト抗体の場合よりも長い半減期を示す。用量および投与頻度は、その処置が予防的であるか治療的であるかによって異なり得る。予防適用では、比較的低用量を、長期間にわたって比較的低頻度で投与する。患者によっては、生涯にわたって処置を続ける。治療適用では、疾病の進行が軽減または終結されるまで、好ましくは、患者が疾病の症状の部分的または完全な緩解を示すまで、比較的高用量を比較的短い間隔で投与する必要がある場合がある。その後、この患者には予防計画で投与することができる。
【実施例】
【０１４４】
以下の実施例は本発明をさらに説明するために示されるものであり、その範囲を限定するものではない。本発明の他の変形形態は当業者には容易に明らかとなり、添付の特許請求の範囲に包含される。
【０１４５】
実施例１. マウス抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体の開発
本実施例はマウス抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体の開発について記載する。Ｂｃｌ２ Ｗｅｈｉ２２マウス(＃１７７０)を、R&D System (Minneapolis, MN) (カタログ番号981-TR, ロット番号EDY1312A)から購入したヒトＴＳＬＰＲ(Ｍｅｔ１−Ｌｙｓ２３１)／ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ(Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３３０)融合タンパク質で免疫化した。この免疫化は１８日間で計８回の注射により行った。末梢リンパ節からＢ細胞を単離し、Ｆ０骨髄腫細胞(ATCC, Manassas, VA)と融合させた。抗体の産生をｈＴＳＬＰＲ／Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ｈＴＳＬＰＲを特異的に認識する抗体を産生する計２４のクローンが得られた。ｈＴＳＬＰＲ抗体と細胞表面ＴＳＬＰＲとの結合はＦＡＣＳアッセイ(BD Biosciences, San Jose, CA)で分析した。簡単に言うと、ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞をハイブリドーマ培養上清、その後ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧとともにインキュベートし、ＦＡＣＳ装置で分析した。これらの結果は、２４クローンのうち１４のハイブリドーマクローンが細胞表面受容体と結合できたことを示した。
【０１４６】
次に、ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞におけるｈＴＳＬＰ依存性細胞増殖アッセイを用い、ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体をスクリーニングした。これらの細胞はヒトＴＳＬＰＲとＩＬ７Ｒαの双方を発現し、ヒトＴＳＬＰの刺激に応答することができる(Reche et al., J. Immunol., 167:336-43, 2001)。細胞増殖アッセイは本質的にReche et al.に記載されているように行った。簡単に言うと、ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞を培養上清からの抗体とともに１時間プレインキュベートし、図１に示されている濃度のｈＴＳＬＰで誘導した。細胞増殖はAlamar Blue (TREK Diagnositc Systems, Cleveland, OH)を用いて測定した。このアッセイでは、各親クローンに対して１〜３のサブクローンを用いた。図１に示されている結果は、クローン１Ｄ６由来の３つのサブクローンが強いアンタゴニスト活性を示したことを示唆する。
【０１４７】
サブクローンの１つ１Ｄ６.Ｃ９からモノクローナル抗体(ｍＡｂ)を精製した(図２Ｃ)。簡単に言うと、Miniperm culture (Vivascience, Carlsbad, CA)からの無血清細胞馴化培地をCleanascite (LigoChem, Fairfield, NJ)で処理した。次に、抗体をＧタンパク質Ｇレジン(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)で精製した。精製した抗体を上記のような細胞増殖アッセイで試験した。Ｂａ／Ｆ３−ｈＴＳＬＰＲ−ｈＩＬ７Ｒα細胞またはＢａｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞を、１ｎｇ／ｍｌのｈＴＳＬＰの添加前に１時間、種々の濃度の抗体で処理した。これらの結果は、ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞(図３Ａ)とＢａｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞(図３Ｂ)の双方のＴＳＬＰ依存性の増殖がマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の添加により用量依存的に阻害されたことを示唆する。
【０１４８】
さらに、ＴＳＬＰにより媒介されるシグナル伝達活性に対する抗体の作用を調べるため、ルシフェラーゼリポーターアッセイも用いた。ＴＳＬＰは、Ｂａｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒａ細胞においてＳｔａｔ３およびＳｔａｔ５のリン酸化を誘導する(Reche et al., 前掲)。このアッセイは、ＴＳＬＰシグナル伝達に応答して、Ｂａｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒａ／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞において、Ｓｔａｔ５の制御下のリポーター遺伝子発現を測定するようにデザインした。簡単に言うと、このＳｔａｔ−Ｌｕｃリポーター構築物は、プロモーターおよびエンハンサーを含まないｐＧＬ２基本Ｌｕｃリポーターベクター(Promega, Madison, WI)にＳｔａｔコンセンサス結合部位を挿入することにより作製した。挿入されたＳｔａｔ結合部位は、核Ｓｔａｔ結合配列ＴＴＣＣＣＧＧＡＡ(配列番号１６)(Yan et al., Cell. 84:421-30, 1996;およびSaylors et al., Gene Ther. 6:944-6, 1999)を担持するＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧ配列エレメント(配列番号１５)を８コピー含む。このＳｔａｔ−Ｌｕｃリポーター構築物をＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞に導入した。得られたＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞を、１ｎｇ／ｍｌのｈＴＳＬＰの添加前に１時間、種々の濃度のマウス抗体で処理した。ルシフェラーゼ活性はBright Glo (Promega, Madison, WI)を用いて測定した。このアッセイから得られた結果を図３Ｃに示した。細胞増殖アッセイからの結果と同様に、Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃリポーターアッセイから得られたデータも、マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の用量依存的アンタゴニスト活性(antantagonist activity)を示した。
【０１４９】
ｍＡｂ １Ｄ６.Ｃ９重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)の可変領域をＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。これら重鎖および軽鎖の可変領域の同定に用いたプライマーの配列は次の通りである。ＶＨのプライマーは(１)ＶＨ９：ＧＡＴＧＧＣＡＧＣＷＧＣＹＣＡＡＡＧ(配列番号１)；および(２)Ｈ−定常：ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＹＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＲＲＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ(配列番号２)である。ＶＬのプライマーは(１)ＬＣＶ３：ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＷＣＡＣＡＫＷＣＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＲＴＡ(配列番号３)；およびＬ−定常：ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ(配列番号４)である。
【０１５０】
簡単に言うと、１Ｄ６.Ｃ９クローンから全ＲＮＡを単離した。重鎖または軽鎖可変領域のいずれかのシグナル配列に対するフォワードプライマーと、重鎖ＣＨ１領域または軽鎖κ定常領域に対するリバースプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、配列決定のためｐＣＲ ＩＩまたはｐｃＤＮＡ３.１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＰＯＰ−ＴＡベクターにクローニングした。次に、この抗体クローンの重鎖および軽鎖可変領域配列のポリヌクレオチド配列を決定した(図４)。これらの可変領域に対応するアミノ酸配列(配列番号５および配列番号６)を図５に示す。また、図５に、Kabat et al., 前掲の符番体系に従って推定されたＣＤＲ領域およびフレームワーク領域を示す。
【０１５１】
実施例２. キメラ抗ｈＴＳＬＰＡ抗体の作製
本実施例はキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の作製および特性決定について記載する。これらのキメラ抗体は上記のマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体１Ｄ６.Ｃ９クローン由来の可変領域とヒト免疫グロブリン(immuglobulins)由来の定常領域を含む。
【０１５２】
キメラ抗体を作製するため、ヒトＴＳＬＰＲクローン１Ｄ６.Ｃ９に対するマウス抗体の可変領域を、ＰＣＲ技術と、カセットベクターにクローニングするためにデザインされた実施例１に記載のプライマー配列を用いて作製した。次に、これらのＰＣＲ産物を、表１に示される配列を用いた、ヒト免疫グロブリンリーダー配列、Ｊ−セグメントおよびスプライサー−ドナーシグナルとのインフレーム融合物を含むカセットベクターにそれぞれクローニングした。次に、これらの配列を、例えばＳＰ２／０ベクターなど、ヒト免疫グロブリン定常領域を含む哺乳類発現ベクターに移入した。
【表１】
【０１５３】
この重鎖を発現するクローンの選択はネオマイシン選択に基づき、一方、軽鎖を発現するクローンはｄｈｆｒ選択を用いて選択した。遺伝子増幅はメトトレキサートを用いて誘導した。重鎖の可変領域カセットをそれぞれヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４哺乳類発現ベクターに移入した。
【０１５４】
このサブクローニングの後、ＩｇＧ１キメラ抗体を生産するため、キメラＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖のＤＮＡプラスミドをＳＰ２／０骨髄腫細胞に同時エレクトロポレーションを行った。同様に、ＩｇＧ４キメラ抗体を生産するため、キメラＩｇＧ４重鎖およびκ軽鎖をＳＰ２／０骨髄腫細胞に同時エレクトロポレーションを行った。細胞をゲネチシンで選択した後、ゲネチシンとメトトレキサートを含有する増殖培地で培養および拡張した。抗体を精製するため、細胞を無血清培地に適応させた。トランスフェクトされたＳＰ２／０細胞から分泌されたキメラＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体を精製した(図２Ａおよび図２Ｂ)。精製されたキメラＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体のアンタゴニスト活性を、Ｌｕｃリポーターアッセイにおいてマウス抗体の場合と比較した。デス受容体５(ＤＲ５)に対するＩｇＧ１キメラ抗体を陰性対照として用いた。ｈＴＳＬＰＲ、ｈＩＬ７ＲαおよびＳｔａｔ５−Ｌｕｃを過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞におけるリポーター遺伝子発現により評価されるように、これらの結果は、これらのキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体がマウスＩｇＧ１抗体と同様のアンタゴニスト活性を示したことを示唆する(図６)。
【０１５５】
実施例３. 抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はＴＳＬＰにより媒介されるＴＡＲＣ分泌を阻害する
本実施例は、抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体によるヒト単球からの、ＴＳＬＰにより媒介されるＴＡＲＣ分泌(section)の阻害について記載する。上記のマウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の双方を、ヒト単球による、ＴＨ２誘引胸腺活性化調節ケモカイン(ＴＡＲＣ)のＴＳＬＰにより媒介される分泌に対する作用に関して調べた。ＴＡＲＣ分泌アッセイは、抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を添加すること以外、本質的にSoumelis et al., Nat Immunol. 3:673-80, 2002に記載されているようにして行った。結果を図７に示す。図の上の２つのパネルはそれぞれ、ＴＳＬＰで刺激されたヒト単球およびＣＤ１１＋樹状細胞からのＴＡＲＣ分泌(section)を示す。下の３つのパネルはそれぞれ、ヒト単球からのＴＳＬＰにより媒介されるＴＡＲＣ分泌(section)に対する３つの異なる抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の作用を示す。この図に示されているように、マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体およびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(ＩｇＧ１イソ型およびＩｇＧ４イソ型の双方)は全て、ヒト単球からのＴＡＲＣ分泌を用量依存的に阻害することができる。これによりさらに、ＴＳＬＰシグナル伝達に対する抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の拮抗活性が確認された。
【０１５６】
抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の結合親和性を判定するための結合試験を、「オン」率(ｋａ)および「オフ」率(ｋｄ)を測定するための標準的なBiacoreプラズモン共鳴分析を用いて行った。これらの測定から抗体の結合定数(ＫＤ)が計算される。また、液相の結合速度を調べるためのさらなる分析を行った。さらに、細胞アッセイを用いて抗体のＩＣ５０を求めた。これらの試験の結果を表３にまとめる。
【表２】
【０１５７】
抗体配列
NV115-3B配列
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS (配列番号22)
VK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHTRLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRASGVPDRFSGTGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK (配列番号23)
NV115-3E配列
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS (配列番号24)
VK
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSLAWYQQKPGQPPKLLIHWAVTRVSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK (配列番号25)
NV115-3E配列
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS (配列番号26)
VK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHTRLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLRAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK (配列番号27)
【０１５８】
以上、本発明を、理解を明確にするために例および実施例を示してある程度詳細に記載したが、当業者ならば本発明の教示に照らして、添付の特許請求の精神または範囲から逸脱することなく、それに対して特定の変更および修飾を行うことができることが容易に明らかとなろう。
【０１５９】
本明細書に引用される刊行物、データベース、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および特許出願はその各々が具体的かつ個々に出典明示により本明細書の一部とされることが示されている場合と同様に、出典明示により本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞においてｈＴＳＬＰ依存性細胞増殖を用いた抗ＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体のスクリーニングを示す。
【図２】マウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体の精製を示す。Ａ：キメラＩｇＧ１抗体；Ｂ：キメラＩｇＧ４抗体；およびＣ：マウスＩｇＧ１抗体。
【図３】細胞増殖アッセイおよびルシフェラーゼリポーターアッセイによる精製マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)のアンタゴニスト活性を示す。Ａ：Ｂａ／Ｆ３−ｈＴＳＬＰＲ−ｈＩＬ７Ｒα細胞の増殖；Ｂ：ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞の増殖；およびＣ：ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性。
【図４】マウス抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体１Ｄ６.Ｃ９クローンの可変領域のヌクレオチド配列。
【図５】マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体クローン１Ｄ６.Ｃ９の可変領域アミノ酸配列を示す。相補性決定領域(ＣＤＲ)およびフレームワーク領域(ＦＲ)は下線の残基または斜体の残基で示される。
【図６】ｈＴＳＬＰＲ、ｈＩＬ７ＲαおよびＳｔａｔ５−Ｌｕｃを過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞における精製マウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のアンタゴニスト活性を含むルシフェラーゼリポーターアッセイの結果を示す。
【図７】マウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体によるヒト単球由来ＴＳＬＰ媒介ＴＡＲＣ分泌(section)の阻害を示す。
【図８】抗体結合ドメインの同定を示す−ＴＳＬＰＲ抗体は不連続エピトープと結合する。
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
サイトカインおよび免疫細胞は、例えば種々の炎症性障害に至る経路など、特定の生理学的機構または経路を媒介する。ヒト胸腺間質性リンホポエチン(ＴＳＬＰ)は、ヒト上皮細胞から生産されるＩＬ−７様サイトカインである。これはＢ細胞の分化を促進し、また、胸腺細胞と成熟Ｔ細胞の双方を同時刺激することもできる。ＴＳＬＰはヒトＣＤ１１ｃ＋樹状細胞(ＤＣ)上の特異的ヘテロ二量体受容体と結合する。この受容体ヘテロ二量体は、共通γ様受容体鎖(ＴＳＬＰ受容体；ＴＳＬＰＲ)とＩＬ−７Ｒ−α鎖からなる。例えば、Tonozuka et al., Cytogenet. Cell Genet. 93:23-25, 2001; Pandey et al., Nat. Immunol. 1:59-64, 2000; L. S. Park et al., J. Exp. Med. 192:659-670, 2000;およびReche et al., J. Immunol. 167:336-343, 2001参照。この受容体に結合するリガンドは、ＤＣのＴＨ２誘引ケモカイン、ＴＡＲＣ(thymus and activation-regulated chemokine)およびＭＤＣ(macrophage-derived chemokine)分泌を誘導する。さらに、ＴＳＬＰはまた、強いＤＣの活性化、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大、続いてのＴＨ２表現型への分極、プロアレルギー性サイトカインインターロイキン４(ＩＬ−４)、ＩＬ−５、ＩＬ−１３および腫瘍壊死因子−αの産生も誘導する。
【背景技術】
【０００２】
また、ＴＳＬＰシグナル伝達の結果、Ｓｔａｔ５転写因子の活性化がもたらされることも判明している。さらに、急性および慢性アトピー性皮膚炎患者は皮膚病変部においてＴＳＬＰを過剰発現することが報告されており、ＴＳＬＰの発現がin vivoにおいてアレルギー性炎症に関連していることが示唆される。皮膚ケラチノサイトの他、気管支上皮細胞、平滑筋および肺繊維芽細胞でも高レベルのＴＳＬＰ発現が見出されており、このことも同様に呼吸器系アレルギー性適応症におけるＴＳＬＰの役割の可能性が示唆される。さらに、ＩｇＥにより活性化された肥満細胞は、ＴＨ２表現型の維持に関与し得る機構である極めて高レベルのＴＳＬＰを発現する。
【０００３】
西洋諸国人口の約２０％が、例えば、喘息、鼻炎、アトピー性皮膚炎および食物アレルギーを含むアレルギー性疾患などの炎症性障害に罹患している。アトピー性皮膚炎患者の５０％〜８０％は喘息またはアレルギー性鼻炎を有しているか、または発症する。現在までアレルギーにより誘発される喘息、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性鼻炎の治癒法は無い。喘息に対するβ−２アドレノセプターアンタゴニスト、アトピー性皮膚炎に対するＥｌｉｄｅｌ、およびアレルギー性鼻炎に対するＨ１−抗ヒスタミンなどの現行療法は対症療法として用いられている。よって、当技術分野では、これらの炎症性障害、特に、アレルギー性炎症を処置するためのより良い治療法の必要性がますます高まっている。本発明は、この問題、また他の問題に取り組むものである。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本明細書において本発明の態様は、標的タンパク質ヒト胸腺間質性リンホポエチン受容体(ｈＴＳＬＰＲ)に特異的な抗原結合領域を有する単離されたヒトまたはヒト化抗体またはその機能的フラグメントおよびｈＴＳＬＰＲと結合する抗体またはその機能的フラグメントを提供する。関連の態様では、このｈＴＳＬＰＲとの結合は少なくとも細胞表面ｈＴＳＬＰ受容体結合により決定され、炎症性メディエーターの放出を妨げる。
【０００５】
さらに別の態様では、本発明は、抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域を提供する。ある特定の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＴＹＧＭＳ(配列番号７)を有するＨ−ＣＤＲ１領域とその保存的変異体を含む。本明細書に記載されるように、保存的変異体は、特定されているアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸残基を含む。関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)を有するＨ−ＣＤＲ２領域、およびその保存的変異体である。別の関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)を有するＨ−ＣＤＲ３領域、およびその保存的変異体である。
【０００６】
別の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)を有するＬ−ＣＤＲ１領域、およびその保存的変異体である。さらに別の関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)を有するＬ−ＣＤＲ２領域、およびその保存的変異体である。なおさらに別の関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、アミノ酸配列ＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を有するＬ−ＣＤＲ３領域、およびその保存的変異体である。
【０００７】
別の態様では、この単離された抗原結合領域は、可変領域アミノ酸配列である配列番号５と、そのＣＤＲ領域において配列番号５のＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％の配列同一性を有する配列を有する重鎖である。関連の態様では、この単離された抗原結合領域は、可変領域アミノ酸配列である配列番号６と、そのＣＤＲ領域において配列番号６のＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％の配列同一性を有する配列を有する軽鎖である。
【０００８】
別の局面において、本発明は、ｈＴＳＬＰＲに対するモノクローナルアンタゴニスト抗体を提供する。本発明の抗ＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは、配列番号５の重鎖可変領域配列と配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む参照抗体と同じ結合特異性を有する。これらの抗体のいくつかは参照抗体と同じ結合特異性を示す完全ヒト抗体である。これらの抗体のいくつかはＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)もしくはＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)の重鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)配列、またはＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)もしくはＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)の軽鎖ＣＤＲ配列を有する。
【０００９】
抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を有する。本発明の他のいくつかの抗体は、配列番号５と少なくとも８５％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号６と少なくとも８５％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。本発明の他のいくつかの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、配列番号５と同一である重鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号６と同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する。
【００１０】
本発明のいくつかの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はマウス抗体である。他のいくつかはキメラ抗体である。キメラ抗体のいくつかはヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域を有する。本発明の他のいくつかの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はヒト化抗体である。本発明の他のいくつかの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、配列番号５の重鎖可変領域配列と配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む抗体と同じ結合特異性を示す完全ヒト抗体である。また、本発明では、単鎖抗体、例えばＦａｂフラグメントも提供される。抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかはＩｇＧ１イソ型のものである。他のいくつかの抗体はＩｇＧ４イソ型のものである。
【００１１】
別の局面において、本発明は、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする単離された、または組み換えポリヌクレオチド(例えばＤＮＡ)を提供する。例えば、このポリヌクレオチドは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)を含む抗体重鎖をコードすることができる。これらのポリヌクレオチドはまた、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を含む抗体軽鎖をコードすることもできる。本発明のいくつかのポリヌクレオチドは、配列番号５の成熟領域と少なくとも９０％同一である成熟重鎖可変領域配列をコードする。他のいくつかのポリヌクレオチドは、配列番号６の成熟領域と少なくとも９０％同一である成熟軽鎖可変領域配列をコードする。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列または配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列をコードする。
【００１２】
別の局面において、本発明は、(１)本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の重鎖をコードする組み換えＤＮＡセグメントと(２)該抗体の軽鎖をコードする第二の組み換えＤＮＡセグメントを担持する単離された宿主細胞を提供する。これらの宿主細胞のいくつかでは、組み換えＤＮＡセグメントはそれぞれ第一および第二のプロモーターに作動可能なように連結され、かつ、宿主細胞で発現することができる。これらの宿主細胞のいくつかは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を有するモノクローナル抗体を発現する。他のいくつかの宿主細胞は、配列番号５の成熟領域と少なくとも９０％同一である成熟重鎖可変領域配列と、配列番号６の成熟領域と少なくとも９０％同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を発現する。これらの宿主細胞のいくつかは、配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列と配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を発現する。これらの宿主細胞のいくつかは非ヒト哺乳類細胞である。
【００１３】
別の局面において、本発明は、対象、例えばヒト患者において炎症性障害を処置する方法を提供する。これらの方法は、その対象に有効量の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を含む医薬組成物を投与することを伴う。一般に、この抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、配列番号５の重鎖可変領域配列と配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む抗ｈＴＳＬＰＲ抗体と同じ結合特異性を有する。これらの治療法のいくつかでは、完全ヒト抗体が用いられる。いくつかの方法では、この抗ＴＳＬＰＲ抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を担持する。いくつかの方法では、使用される抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列と配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む。これらの方法のいくつかは、アレルギー性炎症性疾患に罹患している対象の処置に向けられる。当該処置に適するアレルギー性炎症性疾患の例は、アトピー性皮膚炎、喘息またはアレルギー性鼻炎を含む。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、抗体またはそのフラグメントである第一の成分と第二のアミノ酸配列を有する第二の成分とからなる免疫複合体を提供する。例えば、免疫複合体は細胞毒素であるか、または免疫複合体は、ｈＴＳＬＰＲとは異なる標的に結合特異性を有する結合タンパク質または抗体である。
【００１５】
別の態様において、本発明は抗体またはその抗体フラグメントを有するキットを提供する。いくつかの態様では、このキットはさらに医薬上許容される担体またはその賦形剤を含む。他の関連の態様では、キット内の抗体は単位用量で存在する。さらに別の関連の態様では、キットは対象への投与における使用説明書を含む。
【００１６】
本発明の性質および利点のさらなる理解は本明細書の残りの部分および特許請求の範囲を読めば明らかとなるであろう。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１はＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞においてｈＴＳＬＰ依存性細胞増殖アッセイを用いた抗ＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体のスクリーニングを示す。
図２Ａ〜２Ｃはマウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体の精製を示す。Ａ：キメラＩｇＧ１抗体；Ｂ：キメラＩｇＧ４抗体；およびＣ：マウスＩｇＧ１抗体。
図３Ａ〜３Ｃは細胞増殖アッセイおよびルシフェラーゼリポーターアッセイによる精製マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)のアンタゴニスト活性を示す。Ａ：Ｂａ／Ｆ３−ｈＴＳＬＰＲ−ｈＩＬ７Ｒα細胞の増殖；Ｂ：ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞の増殖；およびＣ：ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性。
図４はマウス抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体１Ｄ６.Ｃ９クローンの可変領域のヌクレオチド配列を示す。
図５はマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体クローン１Ｄ６.Ｃ９の可変領域アミノ酸配列を示す。相補性決定領域(ＣＤＲ)およびフレームワーク領域(ＦＲ)は下線の残基または斜体の残基で示される。
図６はｈＴＳＬＰＲ、ｈＩＬ７ＲαおよびＳｔａｔ５−Ｌｕｃを過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞における精製マウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のアンタゴニスト活性を含むルシフェラーゼリポーターアッセイの結果を示す。
図７はマウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体によるヒト単球由来ＴＳＬＰ媒介ＴＡＲＣ分泌(section)の阻害を示す。
図８は抗体結合ドメインの同定を示す − ＴＳＬＰＲ抗体は不連続エピトープと結合する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、一部分は本発明者らによるヒトＴＳＬＰＲに対してアンタゴニスト抗体の開発に基づくものである。マウスにおいて生成した抗ｈＴＳＬＰＲ抗体またはin vitroで作製されたキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体が、ＴＳＬＰシグナル伝達により媒介される活性、例えばＴＳＬＰにより媒介される細胞増殖を阻害できることが判明した。よって、これらの抗体は、ＴＳＬＰシグナル伝達活性により媒介される、またはＴＳＬＰシグナル伝達活性に関連するいくつかの疾病または障害、例えば、アトピー性皮膚炎および喘息などのアレルギー性炎症性疾患に対する治療薬または予防薬として有用である。次の節で、本発明の組成物を作製および使用するため、また、本発明の方法を実施するための指針を示す。
【００１９】
Ｉ. 定義
特に断りのない限り、本明細書で用いる技術用語および科学用語は全て、本発明の属する技術分野の通常の技術者に共通に理解されているものと同義である。以下の参照文献は本発明で用いられる用語の多くの一般定義を当業者に示す：Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3PrdP ed., 2002);およびA Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4PthP ed., 2000)。さらに、本発明の実施において読者の助けとなるために以下の定義を示す。
【００２０】
本発明がより容易に理解できるよう、まず、特定の用語を定義する。さらなる定義は詳細な説明を通じて示す。
【００２１】
「免疫応答」とは、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫性炎症もしくは病的炎症の場合には正常なヒト細胞または組織の選択的傷害、破壊またはそれらの身体からの排除をもたらす、例えばリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球およびこれらの細胞または肝臓により産生される可溶性高分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用を指す。
【００２２】
「シグナル伝達経路」とは、細胞のある部分から細胞の別の部分へシグナルを伝達する役割を果たす様々なシグナル伝達分子の間の生化学的な関係を指す。
【００２３】
本明細書において「抗体」とは、完全な抗体および抗原結合フラグメント(すなわち、「抗原結合部分」)またはその単鎖を含む。天然「抗体」は、ジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２つの重(Ｈ)鎖および２つの軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は重鎖可変領域(本明細書ではＶＨと略す)と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域(本明細書ではＶＬと略す)と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。このＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる相補性の高い領域が散在した相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並ぶ３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一の成分(Ｃｌｑ)を含む宿主の組織または因子との結合を媒介し得る。
【００２４】
本明細書において抗体の「抗原結合部分」(または簡単には「抗原部分」)とは、抗原(例えばＴＳＬＰＲ)と特異的に結合する能力を保持する抗体の全長または１以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより遂行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に含まれる結合フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；ヒンジ領域においてジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ)２フラグメント；ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単腕のＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546)；および単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。
【００２５】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬとＶＨは独立した遺伝子によりコードされているが、それらは組み換え法を用い、ＶＬ領域とＶＨ領域が対となって一価分子を形成している１本のタンパク質鎖として作製可能とする合成リンカーにより連結することができる(単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られている；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426;およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883参照)。このような単鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に含むものとする。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の常法を用いて得られ、これらのフラグメントは完全抗体と同様にして有用性に関してスクリーニングされる。
【００２６】
本明細書において「単離された抗体」とは、抗原特異性の異なる他の抗体を実質的に含まない抗体を指す(例えば、ＴＳＬＰＲと特異的に結合する単離された抗体は、ＴＳＬＰＲ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、ＴＳＬＰＲと特異的に結合する単離された抗体は、他種由来のＴＳＬＰＲ分子などの他の抗原に対して交差反応性を持ち得る。さらに、単離された抗体は他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない。
【００２７】
本明細書において「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は単一の結合特異性と特定のエピトープに対する親和性を示す。
【００２８】
本明細書において「ヒト抗体」とは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト起源の配列に由来している可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含む場合、この定常領域も、例えば、ヒト生殖細胞系配列または突然変異型ヒト生殖細胞系配列などのヒト配列に由来する。本発明のヒト抗体はヒト配列によってはコードされていないアミノ酸(例えば、in vitroランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、またはin vivo体細胞突然変異により導入された突然変異)を含み得る。
【００２９】
「ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト配列に由来している可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。一態様では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させ、ヒト重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００３０】
本明細書において「組み換えヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入または染色体導入された動物(例えばマウス)またはそれから作製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞(例えば、トランスフェクトーマ)から単離された抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体などの組み換え手段により作製、発現、産生または単離されたあらゆるヒト抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他のいずれかの手段により作製、発現、産生または単離された抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、そのフレームワーク領域とＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。しかしながら、ある特定の態様では、このような組み換えヒト抗体はin vitro突然変異誘発(またはヒトＩｇ配列が遺伝子導入された動物を用いる場合には、in vivo体細胞突然変異誘発)を受けてもよく、従って、組み換え抗体のＶＨ領域とＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それに関連するが、自然界でin vivoにおけるヒト抗体生殖細胞系レパートリー内には存在しない配列である。
【００３１】
「キメラ抗体」とは、(ａ)抗原結合部位(可変領域)が異なるもしくは変更されたクラスの定常領域、エフェクター機能および／または種、またはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子などと連結されるように、定常領域またはその一部が変更、置換または交換されているか、あるいは(ｂ)可変領域またはその一部が、異なるもしくは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換または交換されている抗体分子である。例えば、以下の実施例に示されるように、マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリン由来の定常領域で置換することにより修飾することができる。ヒト定常領域で置換するため、このキメラ抗体はヒトＴＳＬＰＲの認識においてその特異性を保持することができるとともに、元のマウス抗体に比べてヒトでの抗原性が低減されている。
【００３２】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体の反応性を保持しつつ、ヒトでの免疫原性が低い抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持しつつ、抗体の残りの部分をそれらのヒト対応物(すなわち、定常領域ならびに可変領域のフレームワーク部分)で置換することにより達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991;およびPadlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994参照。ヒト工学技術の他の例は、限定されるものではないが、米国特許第５,７６６,８８６号に開示されているＸｏｍａ技術を含む。
【００３３】
本明細書において「ヒューマネリング(humaneering)」とは、非ヒト抗体を操作されたヒト抗体へと変換する方法を指す(例えば、KaloBios’ HumaneeringＴＭ technology参照)。
本明細書において「イソ型」とは、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス(例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のようなＩｇＧ)を指す。
【００３４】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に用いられる。
本明細書において「ヒトＴＳＬＰＲと特異的に結合する」抗体とは、ヒトＴＳＬＰＲとＫＤ ２００×１０−１２Ｍ以下、１５０×１０−１２Ｍ以下または１００×１０−１２Ｍ以下で結合する抗体を指す。
【００３５】
本明細書において「結合特異性」とは、ただ１つの抗原決定基と反応する個々の抗体結合部位の能力を指す。この抗体の結合部位は分子のＦａｂ部分に位置し、重鎖および軽鎖の超可変領域から構成されている。抗体の結合親和性は、抗体上の単一の抗原決定基と単一の結合部位の間の反応の強さである。それは抗体の抗原決定基と結合部位の間で働く誘引力と反発力の和である。親和性は抗原抗体反応を表す平衡定数である。
【００３６】
２つの物の間の特異的結合は、平衡定数(ＫＡ)が少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１である結合を意味する。抗体(例えば抗ｈＴＳＬＰＲ抗体)と「特異的に(または選択的に)結合する」とは、タンパク質および他の生物工学品(bioligics)のヘテロな集団において同族抗原(例えば、ヒトＴＳＬＰＲポリペプチド)の存在の決定因子となる結合反応を指す。上記の平衡定数(ＫＡ)に加え、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は一般に約１×１０−２ ｓ−１、１×１０−３ ｓ−１、１×１０−４ ｓ−１またはそれ以下の解離定数(Ｋｄ)も有し、ヒトＴＳＬＰＲと、非特異的抗原(例えばＢＳＡ)との結合に関するその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗体に特異的な抗体」は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に用いられる。
【００３７】
「エピトープ」とは、抗体と特異的に結合し得るタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群からなり、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下において前者との結合は消失するが、後者との結合は消失しないことで区別される。
【００３８】
「核酸」は、本明細書では「ポリヌクレオチド」と互換的に用いられ、一本鎖型または二本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。この用語は既知のヌクレオチド類似体または修飾された主鎖残基または結合を含む核酸を包含し、これらは合成され、天然に存在し、および天然に存在せず、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様にして代謝される。このような類似体の例は、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(ＰＮＡ)を含む。
【００３９】
特に断りのない限り、特定の核酸配列はまた暗に、その保存的に修飾された変異体(例えば、縮重コドン置換)および相補配列、ならびに明示されている配列を包含する。具体的には、以下に詳説するように、縮重コドン置換は、１以上の選択した(または全ての)コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することにより達成することができる(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985;およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994)。
【００４０】
「アミノ酸」とは、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸摸倣体を指す。天然アミノ酸は遺伝コードによりコードされているもの、ならびにその後修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合しているα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このような類似体は修飾されたＲ基(例えばノルロイシン)または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸摸倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００４１】
本明細書では「ポリペプチド」および「タンパク質」はアミノ酸残基のポリマーを指して互換的に用いられる。これらの用語は、天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーだけでなく、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学摸倣体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。特に断りのない限り、特定のポリペプチド配列はまた暗にその保存的に修飾された変異体も包含する。
【００４２】
「保存的に修飾された変異体」という用語はアミノ酸配列および核酸配列の双方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列を、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列をコードする核酸を指す。遺伝コードの縮重のために、機能的に同一の多数の核酸が、何らかの所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。よって、コドンによりアラニンが指定されているどの位置でも、そのコドンを、コードされているポリペプチドを変化させずに、記載されている対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸変異体は、保存的に修飾されている変異体の一種である「サイレント変異体」である。ポリペプチドをコードしている本明細書の核酸配列はいずれも、その核酸の可能性のある全サイレント変異体も表す。当業者ならば、核酸の各コドン(元々メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧおよび元々トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く)は、機能的に同一の分子が得られるように修飾することができる。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異体が記載されている各配列に含まれる。
【００４３】
ポリペプチド配列に関して「保存的に修飾された変異体」は、あるアミノ酸の化学的に同等なアミノ酸での置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に同等なアミノ酸を示した保存的置換表が当技術分野ではよく知られている。このような保存的に修飾された変異体はその他のものとして本発明の多型変異体、種間ホモログおよび対立遺伝子があり、これらを排除するものではない。次の８つの群は互いに保存的置換となるアミノ酸を挙げたものである。
１)アラニン(Ａ)、グリシン(Ｇ)；
２)アスパラギン酸(Ｄ)、グルタミン酸(Ｅ)；
３)アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)；
４)アルギニン(Ｒ)、リシン(Ｋ)；
５)イソロイシン(Ｉ)、ロイシン(Ｌ)、メチオニン(Ｍ)、バリン(Ｖ)；
６)フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)；
７)セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)；および
８)システイン(Ｃ)、メチオニン(Ｍ)(例えば、Creighton, Proteins (1984)参照)。
【００４４】
２以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して「同一」または「同一性」％とは、同一である２以上の配列または部分配列を指す。２つの配列が、比較ウィンドウまたは以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて判断された指定領域で最大一致が得られるように比較およびアラインした場合に、または手動アライメントと目視により、示された同じアミノ酸残基またはヌクレオチド％(すなわち、示された領域または示されていない場合には全配列にわたって６０％の同一性、場合により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性)を有している場合に、２つの配列は「実質的に同一」である。場合により同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長(または１０アミノ酸長)の領域、またはより好ましくは１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド長(または２０、５０、２００以上のアミノ酸長)の領域にわたって存在する。
【００４５】
配列比較では一般に、１つの配列が参照配列として作用し、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用することもできるし、あるいは別のパラメーターを指定することもできる。次に、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づき参照配列に対して試験配列の配列同一性％を算出する。
【００４６】
本明細書において「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、通常には約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つに対する参照を含む(なお、配列は２つの配列を最適にアラインした後に同数の連続する位置の参照配列と比較すればよい)。比較のための配列アライメント法は当技術分野でよく知られている。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cのローカルホモロジーアルゴリズムにより、またはNeedleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、またはPearson and Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似性検索法により、またはこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実施により(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)、または手動アライメントと目視により行うことができる(例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)参照)。
【００４７】
配列同一性および配列類似性％を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例として、それぞれAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977;およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２.０アルゴリズムがある。ＢＬＳＴ分析を実施するためのソフトウエアはthe National Center for Biotechnology Informationから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインされる場合に、いくつかの陽性評価された閾値スコアＴに合致するか、または満たす検索配列中の長さＷの短いワードを特定することにより、高スコア配列対(ＨＳＰ)を特定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値(neighborhood word score threshold)と呼ばれる(Altschul et al., 前掲)。これらの最初の隣接ワードのヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるべく検索を開始するための核として働く。これらのワードヒットを、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列の両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関してはパラメーターＭ(一致残基対のリワードスコア、常に＞０)およびＮ(不一致残基のペナルティースコア、常に＜０)を用いて算出する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアがその最大達成値から未知数Ｘだけ遠ざかる場合；累積スコアが、１以上の負のスコアリング残基アライメントの累積のために０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ、およびＸはアライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルトとして、ワード長(Ｗ)１１、期待値(Ｅ)または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、期待値(Ｅ)１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989参照)アライメント(Ｂ)５０、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００４８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も行う(例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993参照)。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率(Ｐ(Ｎ))であり、これは２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、参照配列に対する試験核酸の比較において最小合計確率が約０.２未満、より好ましくは０.０１未満、最も好ましくは０.００１未満である場合、核酸は参照配列に類似するとみなされる。
【００４９】
上記の配列同一性％の他、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというもう１つの指標は、下記のように、第一の核酸によりコードされるポリペプチドが第二の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生成された抗体と免疫学的に交差反応するということである。よって、ポリペプチドは一般に、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に第二のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるというもう１つの指標は、下記のように、２つの分子またはそれらの双方物がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズするということである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらにもう１つの指標は、同じプライマーを用いて配列を増幅することができるということである。
【００５０】
「作動可能なように連結される」とは、２以上のポリヌクレオチド(例えばＤＮＡ)セグメントの間の機能的関係を指す。一般に、これは転写調節配列と転写配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、それが適当な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合に、そのコード配列と作動可能なように連結されている。一般に、転写配列に作動可能なように連結されているプロモーター転写調節配列は転写配列と物理的に連続しており、すなわち、それらはシス作用型である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節配列は、それらが転写を増強するコード配列と物理的に連続しているか、または近接して存在する必要はない。
【００５１】
「ベクター」とはそれが連結されている別のポリヌクレオチドを移入し得るポリヌクレオチド分子を指すものとする。ベクターの一種に「プラスミド」があり、これは付加的ＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。もう１つのベクター種としてウイルスベクターがあり、このウイルスゲノムにさらなるＤＮＡセグメントを連結してもよい。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター)内で自律複製することができる。宿主細胞へ導入する際に他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)を宿主細胞ゲノムに組み込み、それにより宿主ゲノムとともに複製されることもできる。さらに、ある特定のベクターはそれらが作動可能なように連結されている遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクターは本発明において「組み換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と呼ぶ。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはプラスミドの形態である場合が多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用い得るが、プラスミドは最も一般的に用いられるベクターの形態である。しかし、本発明は同等の機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などの他の形態の発現ベクターも含むものとする。
【００５２】
「組み換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)とは、組み換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。このような用語は特定の対象の細胞だけでなく、そのような細胞の後代も指すと理解すべきである。突然変異または環境的影響のいずれかにより、連続する世代にある特定の修飾が起こることがあるので、このような後代は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、これらもやはり本明細書において「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【００５３】
「炎症性疾患または状態」とは、傷害部位または感染部位における局部的炎症を特徴とする全ての状態を指し、自己免疫疾患、ある特定の形態の感染炎症状態、臓器移植または他の移植片に特徴的な望ましくない好中球の活性、および事実上、局部的組織部位における望ましくない好中球の蓄積を特徴とする他の状態を含む。これらの状態には、限定されるものではないが、髄膜炎、脳浮腫、関節炎、腎炎、成人性呼吸窮迫症候群、膵炎、筋炎、神経炎、結合組織疾患、静脈炎、動脈炎、脈管炎、アレルギー、アナフィラキシー、エーリキア症、痛風、臓器移植および／または潰瘍性大腸炎が含まれる。
【００５４】
「対象」としては、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、あらゆる脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が含まれる。示されている場合を除き、「患者」または「対象」は本明細書では互換的に用いられる。
【００５５】
「処置する」とは、症候、合併症または疾病(例えば、アレルギー性炎症性疾患)の生化学的徴候の発生を予防または遅延させるために化合物または薬剤を投与すること、症候を緩和する、または疾病、状態または障害のさらなる進行を停止もしくは抑制することを含む。処置は予防的(疾病の発生を予防もしくは遅延させるため、またはその臨床徴候または無症候の発現を予防するため)または疾病の発現後の症候の治療的な抑制もしくは緩和を含む。
【００５６】
「シグナル伝達経路」または「シグナリング経路」(例えば、ＴＳＬＰシグナル伝達経路)とは、細胞と刺激性化合物または薬剤との相互作用から生じる少なくとも１つの生化学的反応を指すが、より一般的には一連の生化学的反応を指す。よって、刺激性化合物(例えばＴＳＬＰ)と細胞との相互作用はシグナル伝達経路を通じて伝達される「シグナル」を生じ、最終的には細胞応答、例えば免疫応答をもたらす。
【００５７】
ＩＩ. ヒトＴＳＬＰＲに対するアンタゴニスト抗体
１. 概要
本発明は、ヒトＴＳＬＰＲと特異的に結合する抗体を提供する。これらの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はＴＳＬＰにより媒介されるシグナル伝達活性、例えば、以下の実施例に記載されるようなＴＳＬＰにより媒介される細胞増殖に拮抗作用を示し得る。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の一般的な作製方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998; Kohler & Milstein, Nature 256:495-497, 1975; Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983;およびCole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985参照。
【００５８】
好ましくは、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は以下の実施例に記載されるような、ヒトＴＳＬＰＲ(クローン１Ｄ６.Ｃ９)に対して生成されたマウスモノクローナル抗体のようなモノクローナルである。モノクローナル抗体とは、単一のクローンに由来する抗体を指す。モノクローナル抗体を作製するいずれの技術を用いても、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌形質転換を産生することができる。ハイブリドーマを産生する１つの動物系としてマウス系がある。マウスにおけるハイブリドーマの産生は非常によく確立された手法である。以下の実施例で示すように、モノクローナル抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、非ヒト動物(例えばマウス)をｈＴＳＬＰＲポリペプチドまたはそのフラグメント、融合タンパク質もしくは変異体で免疫化することにより作製することができる。次に、この動物から単離されたＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを作製する。モノクローナルマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、ｈＴＳＬＰＲポリペプチドまたは融合タンパク質を用い、これらのハイブリドーマをＥＬＩＳＡアッセイでスクリーニングすることにより得ることができる。免疫プロトコールおよび融合のための免疫化脾細胞の単離技術は当技術分野で公知である。融合遺伝子相手(例えばマウス骨髄腫細胞)および融合手順も当技術分野でよく知られている(例えば、Harlow & Lane,前掲参照)。
【００５９】
以下の実施例に記載される例示的なマウス抗ＴＳＬＰＲ抗体の重鎖可変領域(配列番号５)および軽鎖可変領域(配列番号６)のアミノ酸配列が図５に示されている。また、この図面に示されているように、この抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ配列はＴＹＧＭＳ(ＣＤＲ１；配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(ＣＤＲ２；配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(ＣＤＲ３；配列番号９)である。軽鎖可変領域のＣＤＲ配列はＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(ＣＤＲ１；配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(ＣＤＲ２；配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(ＣＤＲ３；配列番号１２)である。
【００６０】
抗体は主として、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に存在するアミノ酸残基により標的抗原と相互作用する。一般に、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、図５に示されている対応するＣＤＲ配列と同一のそれらの重鎖ＣＤＲ配列または軽鎖ＣＤＲ配列の少なくとも１つを有する。本発明のこれらの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは以下の実施例に開示されている例示的マウス抗ＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)と同じ結合特異性を有する。これらの抗体はｈＴＳＬＰＲとの結合をめぐってマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)と競合し得る。本発明のいくつかの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、それらの重鎖および軽鎖の可変領域にそれぞれ、図５に示されている対応するＣＤＲ配列と同一の全てのＣＤＲ配列を有する。よって、これらの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はそれぞれ配列番号７、配列番号８および配列番号９と同一の３つの重鎖ＣＤＲ配列と、それぞれ配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２と同一の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を有する。
【００６１】
それぞれマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)の対応するＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を有することに加え、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは、それぞれ図５に示されている、対応するマウス抗体の可変領域配列(すなわち、配列番号５および配列番号６)と同一の全重鎖および軽鎖可変領域配列を有する。他のいくつかの態様では、これらの抗体は同一のＣＤＲ配列以外、図５に示されている対応するアミノ酸残基とは異なる可変領域のフレームワーク部分のアミノ酸残基を含む(例えば、下記の数種のヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体)。しかしながらやはり、これらの抗体は一般に、図５に示されている対応する可変領域配列と実質的に同一(例えば７５％、８５％、９０％、９５％または９９％)のそれらの全可変領域配列を有する。
【００６２】
本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は２本の重鎖と２本の軽鎖を含む完全抗体であり得る。それらはまた、完全抗体または単鎖抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、非ヒト動物で産生された抗体(例えば、図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体)を含む。それらはまた、図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の修飾型である修飾抗体も含む。多くの場合、これらの修飾抗体は例示されたマウス抗体と同じ特性を有するか、または特性の改善された組み換え抗体である。例えば、以下の実施例で例示されるマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、定常領域を欠失させ、それを、抗体の半減期(例えば血清半減期)、安定性および親和性の増強をもたらし得る異なる定常領域で置換することにより修飾することができる。修飾抗体は例えば、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列にグラフトされたマウス抗体由来ＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより産生することができる(Jones et al.. 1986, Nature 321, 522-525)。このようなフレームワーク配列は公開ＤＮＡデータベースから得ることができる。
【００６３】
修飾抗体のいくつかは部分的ヒト免疫グロブリン配列(例えば定常領域)と部分的非ヒト免疫グロブリン配列(例えば図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体可変領域配列)を含むキメラ抗体である。他のいくつかの修飾抗体はヒト化抗体である。一般に、ヒト化抗体は非ヒトである供給源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野でよく知られている(例えば、米国特許第５,５８５,０８９号および同第５,６９３,７６２号；Jones et al., Nature 321: 522-25, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-27, 1988;およびVerhoeyen et al., Science 239: 1534-36, 1988)。これらの方法は、非ヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体由来のＣＤＲの少なくとも一部を対応するヒト抗体の領域で置換することにより、本発明のヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を作製するために容易に使用することができる。いくつかの態様では、本発明のヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、対応するヒトフレームワーク領域にグラフトされた、図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体由来の各免疫グロブリン鎖において３つ全てのＣＤＲを有する。
【００６４】
上記の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、結合特異性もしくはエフェクター機能、または結合親和性の許容できないような低下なく、可変領域と定常領域の双方で決定的でないアミノ酸置換、付加または欠失を受けてもよい。通常、このような変更を組み込んだ抗体は、それらが由来する参照配列(例えば、図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体)と実質的な配列同一性を示す。例えば、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかの成熟軽鎖可変領域は、図５に示されている抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の成熟軽鎖可変領域の配列と少なくとも７５％または少なくとも８５％の配列同一性を有する。同様に、抗体の成熟重鎖可変領域は一般に、図５に示されている抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の成熟重鎖可変領域の配列と少なくとも７５％または少なくとも８５％の配列同一性を示す。修飾された抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは、図５に示されているマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)と比べた場合に同等の特異性と高い親和性を有する。通常、修飾された抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(例えばヒト化抗体)の親和性は元のマウス抗体と同等であるか、またはより良い結合親和性を有する。これらの修飾抗体の結合親和性は元のマウス抗体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％である。
【００６５】
２. キメラおよびヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体
本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のいくつかは、ヒト抗体の領域とともに非ヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体アンタゴニスト由来の領域からなるキメラ(例えばマウス／ヒト)抗体である。例えば、キメラＨ鎖はヒト重鎖定常領域の少なくとも一部と連結されたマウス抗ＴＳＬＰＲ抗体の重鎖可変領域の抗原結合領域(例えば配列番号５で示される配列)を含み得る。このキメラ重鎖は、ヒト軽鎖定常領域の少なくとも一部と連結されたマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の軽鎖可変領域の抗原結合領域(例えば配列番号６で示される配列)を含むキメラＬ鎖と組み合わせることができる。
【００６６】
本発明のキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は以下の実施例の開示ならびに当技術分野で公知の方法に従って作製することができる。例えば、マウス抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体分子の重鎖または軽鎖をコードする遺伝子を制限酵素で消化してマウスＦｃ領域を除去し、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の等価部分で置換することができる。組み換え抗体および特にヒト化抗体の発現に好適な発現ベクターおよび宿主細胞は当技術分野でよく知られている。抗ｈＴＳＬＰＲ免疫グロブリン鎖をコードするキメラ遺伝子を発現するベクターは、標準的な組み換え技術、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001);およびBrent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)を用いて構築することができる。ヒト定常領域配列は、限定されるものではないが、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991に挙げられているものを含む、種々の参照配列から選択することができる。ＤＮＡ組み換えによりキメラ抗体を作製するさらに具体的な教示も当技術分野で教示されている(例えば、Robinson et al., 国際特許公報ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira, et al., 欧州特許出願第１８４,１８７号；Taniguchi, M., 欧州特許出願第１７１,４９６号；Morrison et al., 欧州特許出願第１７３,４９４号；Neuberger et al., 国際出願ＷＯ８６／０１５３３；Cabilly et al.米国特許第４,８１６,５６７号；Cabilly et al.., 欧州特許出願第１２５,０２３号；Better (1988) Science 240:1041-1043; Liu (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood (1985) Nature 314:446-449; Shaw (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)。
【００６７】
非ヒト抗体由来の全可変領域を有するキメラ抗体は、ヒトにおける抗体の抗原性を軽減するためにさらにヒト化することができる。これは一般に、Ｆｖ可変領域(フレームワーク領域または非ＣＤＲ領域)の特定の配列またはアミノ酸残基をヒトＦｖ可変領域由来の等価な配列またはアミノ酸残基で置換することにより達成される。これらのさらに置換された配列またはアミノ酸残基は通常、抗原結合に直接的には関与しない。多くの場合、非ヒト抗体のヒト化は、非ヒト抗体(例えば図５に示されているマウス抗体)のＣＤＲのみをヒト抗体のＣＤＲで置換することにより行う。場合によっては、その後、ヒトフレームワーク領域のいくつかのさらなる残基を非ヒトドナー抗体由来の対応する残基で置換する。抗原との結合を向上させるにはこのような付加的グラフトが必要である場合が多い。これは非ヒト抗体からグラフトされたＣＤＲのみを有するヒト化抗体が非ヒトドナー抗体に比べて、完全な結合活性に満たない場合があるためである。よって、本発明のヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は多くの場合、ＣＤＲの他に、非ヒトドナー抗体(例えば図５に示されているマウス抗体)由来の対応する残基で置換された、ヒトフレームワーク領域のいくつかのアミノ酸を有する。置換のためのフレームワーク残基を選択する基準を含む、ＣＤＲ置換によるヒト化抗体の作製方法は当技術分野でよく知られている。例えば、キメラ抗体の作製に関連する上記の技術の他、ヒト化抗体を作製するさらなる技術が例えば、Winter et al., ＵＫ特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ(1987), 米国特許第５,２２５,５３９号; Jones (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988 Science 239:1534;およびBeidler (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に示されている。また、ＣＤＲ置換は、例えば、ヒト単核食細胞上の免疫グロブリンＧのＦｃ受容体に対するヒト化抗体と題されたＷＯ９４／１０３３２に記載されているようなオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を用いて行うこともできる。
【００６８】
本発明のキメラまたはヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は一価、二価または多価免疫グロブリンであり得る。例えば、一価キメラ抗体は上記のように、ジスルフィド橋を介してキメラＬ鎖と結合されたキメラＨ鎖により形成される二量体(ＨＬ)である。二価キメラ抗体は少なくとも１つのジスルフィド橋を介して結合された２つのＨＬ二量体により形成される四量体(Ｈ２Ｌ２)である。多価キメラ抗体は鎖の凝集に基づく。
【００６９】
３. ヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体
本発明には、キメラまたはヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の他、同等の結合特異性および匹敵するまたはより良好な結合親和性を示す完全ヒト抗体も含まれる。例えば、これらのヒト抗体は、配列番号５の重鎖可変領域配列と配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む参照ヒト抗体と同等かまたはより良好な特徴を持ち得る。キメラまたはヒト化抗体に比べ、本発明のヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はさらにヒト対象に投与された場合に、さらに抗原性の低減を示す。
【００７０】
ヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。例えば、非ヒト抗体と同等の結合特性を維持する、またはより良好な結合特性をもたらしつつ、非ヒト抗体可変領域をヒト可変領域で置換するin vivo法が米国特許出願第１０／７７８,７２６号(公開番号２００５０００８６２５)に開示されている。この方法は、エピトープによりガイドされる、非ヒト参照抗体可変領域の完全ヒト抗体での置換に基づく。得られるヒト抗体は一般に参照非ヒト抗体と構造上無関連であるが、参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。簡単に言うと、このエピトープによりガイドされる一連の相補的置換アプローチは、「競合因子(competitor)」と参照抗体の多様なハイブリッドのライブラリー(「試験抗体」)との間に、試験抗体と抗原の結合に応答するリポーター系の存在下で限られた量の抗原との結合をめぐる競合を設定することにより可能となる。競合因子は参照抗体または単鎖Ｆｖフラグメントなどのその誘導体であり得る。競合因子はまた、参照抗体と同じエピトープに結合する抗原の天然リガンドまたは人工リガンドであり得る。競合因子の唯一の要件は、参照抗体と同じエピトープに結合することと、それが抗原結合をめぐって参照抗体と競合することである。これらの試験抗体は一般に非ヒト参照抗体由来の１つの抗原結合Ｖ領域と、ヒト抗体レパートリーライブラリーなどの異なる供給源から無作為に選択された他のＶ領域を有する。参照抗体由来の共通Ｖ領域は、選択が参照抗体に対して最高の抗原結合適合度に偏向するよう、試験抗体を抗原上の同じエピトープ上に同じ配向で配置するガイドとして役立つ。ＴＳＬＰＲ結合ドメインの同定はエピトープマッピングにより確定され、図８に示されている。このＴＳＬＰＲ抗体は不連続のエピトープと結合する。
【００７１】
試験抗体と抗原の間の所望の相互作用を検出するためには多くの種類のリポーター系が使用できる。例えば、相補的リポーターフラグメントを抗原および試験抗体にそれぞれ結合させて、試験抗体が抗原と結合したときにのみフラグメント相補によりリポーターの活性化が生じるようにすればよい。この試験抗体−リポーターフラグメント融合物および抗原−リポーターフラグメント融合物が競合因子と同時に存在する場合、試験抗体が競合因子と競合する能力に依存してリポーターの活性化が起こり、これが抗原に対する試験抗体の親和性に比例する。使用可能な他のリポーター系は、米国特許出願第１０／２０８,７３０号(公開番号２００３０１９８９７１)に開示されているような自己阻害リポーター再活性化系(ＲＡＩＲ)のリアクチベーター、または米国特許出願第１０／０７６,８４５号(公開番号２００３０１５７５７９)に開示されている競合活性化系を含む。
【００７２】
連続的なエピトープによりガイドされる相補的置換系で、競合因子、抗原およびリポーター成分とともに単一の試験抗体を発現する細胞を同定するための選択を行う。これらの細胞では、各試験抗体は限られた量の抗原との結合をめぐって競合因子と１対１の競合をする。このリポーターの活性は試験抗体と結合した抗原の量に比例し、これはさらに抗原に対する試験抗体の親和性および試験抗体の安定性に比例する。試験抗体はまず、試験抗体として発現される場合、参照抗体と比べたそれらの活性に基づき選択される。１回目の選択で得られるものは、各々同じ参照抗体由来非ヒトＶ領域とライブラリー由来ヒトＶ領域からなり、その各々が抗原上の、参照抗体と同じエピトープと結合する「ハイブリッド」抗体セットである。１回目に選択されたハイブリッド抗体の１つ以上(one of more)は、参照抗体に匹敵するか、またはそれより高い抗原親和性を有する。
【００７３】
第二段階のＶ領域置換では、第一段階で選択されたヒトＶ領域を、非ヒト参照抗体Ｖ領域を保持するため、同族ヒトＶ領域の異なるライブラリーによるヒト置換の選択のためのガイドとして使用する。１回目に選択されたハイブリッド抗体はまた、２回目の選択の競合因子として用いてもよい。２回目の選択で得られるものは、参照抗体と構造的には異なるが、同じ抗原との結合をめぐって参照抗体と競合する完全ヒト抗体セットである。選択されたヒト抗体のいくつかは参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。これらの選択されたヒト抗体のうち１以上は、参照抗体に匹敵するか、またはそれより高い親和性で同じエピトープと結合する。
【００７４】
参照抗体として上記されているマウスまたはキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の１つを用いて、この方法は、同じ結合特異性および同じか、またはより良好な結合親和性を有するヒトＴＳＬＰＲと結合するヒト抗体を作製するために容易に使用することができる。さらに、このようなヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はまた、例えばKaloBios, Inc. (Mountain View, CA)など、ヒト抗体を習慣的に生産している会社から商業的に入手することもできる。
【００７５】
４. 他タイプの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体
本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はまた、単鎖抗体、二重特異的抗体および多重特異的抗体も含む。いくつかの態様では、本発明の抗体は単鎖抗体である。単鎖抗体は、安定に折り畳まれたポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の双方に由来する抗原結合領域を含む。単鎖抗体は一般にそれ自体、結合特異性とモノクローナル抗体の親和性を保持しているが、従来の免疫グロブリンよりも大きさが著しく小さい。ある特定の適用では、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ単鎖抗体は完全な抗ｈＴＳＬＰＲ抗体に比べて多くの有利な特性を提供する。これらには例えば、身体からのより迅速なクリアランス、画像診断および治療の両面でより大きな組織浸透、ならびにマウスに基づく抗体に比べて免疫原性の有意な軽減が含まれる。単鎖抗体を用いる他の可能性のある利点としては、ハイスループットスクリーニング法におけるスクリーニング力の向上および非経腸適用の可能性が含まれる。
【００７６】
本発明の単鎖抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は当技術分野で記載されている方法を用いて作製することができる。このような技術の例は、米国特許第４,９４６,７７８号および同第５,２５８,４９８号；Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88, 1991; Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999, 1993;ならびにSkerra et al., Science 240:1038-1040, 1988に記載されているものを含む。
【００７７】
いくつかの態様において、本発明は、複数の結合部位または標的エピトープと結合する二重特異的または多重特異的分子を作製するために誘導体化された、または別の機能的分子と結合された抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を提供する。この機能的分子は、別のペプチドまたはタンパク質(例えば、サイトカイン、細胞傷害性薬剤、免疫刺激剤または阻害剤、上記のようなＦａｂ’フラグメントまたは他の抗体結合フラグメント)を含む。例えば、抗ｈＴＳＬＰＲ抗体またはその抗原結合部分は、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合ミメティックなどの１以上の他の結合分子と機能的に結合させることができる(例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有結合またはその他による)。よって、本発明の二重特異的および多重特異的抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、ヒトＴＳＬＰＲに対する第一の結合特異性と第二の標的エピトープに対する第二の結合特異性を有する少なくとも１つのモノクローナル抗ｈＴＳＬＰＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。第二の標的エピトープはＦｃ受容体、例えば、ヒトＦｃγＲＩまたはヒトＦｃγ受容体であり得る。よって、本発明は、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲまたはＦｃεＲを発現するエフェクター細胞(例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞(ＰＭＮ))とヒトＴＳＬＰＲを発現する標的細胞(例えば、ヒトＣＤ１１ｃ＋樹状細胞)の双方と結合することができる二重特異的分子および多重特異的分子を含む。これらの多重特異的(例えば、二重特異的または多重特異的)分子は、ヒトＴＳＬＰＲ発現細胞をエフェクター細胞に向け、ヒトＴＳＬＰＲ発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用(ＡＤＣＣ)、サイトカイン放出、またはスーパーオキシド陰イオンの生成など、Ｆｃ受容体により媒介されるエフェクター細胞の活性化を誘発する。
【００７８】
本発明の二重特異的および多重特異的抗ｈＴＳＬＰＲ分子は当技術分野で記載されている方法により作製することができる。これらには化学的技術(例えば、Kranz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807, 1981参照)、ポリドーマ技術(例えば、米国特許第４,４７４,８９３号参照)、または組み換えＤＮＡ技術が含まれる。本発明の二重特異的分子および多重特異的分子は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される方法を用い、構成的結合特異性、例えば抗ＦｃＲおよび抗ヒトＴＳＬＰＲ結合特異性をコンジュゲートすることにより作製することができる。例えば、二重特異的分子および多重特異的分子の各結合特異性を個別に作製した後、互いにコンジュゲートすることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合のために様々なカップリング剤または架橋剤を使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)が挙げられる。結合特異性が抗体(例えば、２つのヒト化抗体)である場合、それらはその２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介してコンジュゲートすることができる。このヒンジ領域は、コンジュゲーション前に、例えば１個といった奇数のスルフヒドリル残基を含むように修飾することができる。
【００７９】
これらの二重特異的分子および多重特異的分子とそれらの特異的標的との結合は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)またはウエスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらの各アッセイは一般に、対象とする複合体に特異的な標識試薬(例えば抗体)を用いることにより、特に着目するタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識し、それと特異的に結合する酵素結合抗体または抗体フラグメントを用いて検出することができる。あるいは、これらの複合体は他の様々なイムノアッセイのいずれかを用いて検出することもできる。例えば、抗体を放射性標識し、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)に使用することができる(例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986参照)。放射性同位元素はγカウンターもしくはシンチレーションカウンターを使用するなどの手段により、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。
【００８０】
ＩＩＩ. 抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を作製するためのポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明は、上記の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする実質的に精製されたポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)を提供する。本発明のポリヌクレオチドのいくつかは、配列番号１３で示される重鎖可変領域のヌクレオチド配列および／または配列番号１４で示される軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む。本発明の他のいくつかのポリヌクレオチドは、配列番号１３または配列番号１４のヌクレオチド配列と実質的に(例えば少なくとも６５、８０％、９５％または９９％)同一のヌクレオチド配列を含む。適当な発現ベクターから発現させると、これらのポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドは抗原結合能を示し得る。
【００８１】
また、本発明では、図５で示される抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域と通常には重鎖または軽鎖の３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは図５で示される抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。例えば、これらのポリヌクレオチドのいくつかは、配列番号５で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列および／または配列番号６で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする。コードの縮重のため、様々な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドは抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の可変領域配列だけをコードすることができる。それらはまた、この抗体の可変領域と定常領域の双方をコードすることもできる。本発明の核酸のポリヌクレオチド配列のいくつかは、配列番号５で示される１Ｄ６.Ｃ９マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の成熟重鎖可変領域配列と実質的に(例えば、少なくとも８０％、９０％または９９％)同一の成熟重鎖可変領域配列をコードする。他のいくつかのポリヌクレオチド配列は、配列番号６で示される１Ｄ６.Ｃ９マウス抗体の成熟軽鎖可変領域配列と実質的に同一の成熟軽鎖可変領域配列をコードする。これらのポリヌクレオチド配列のいくつかは、このマウス抗体の重鎖および軽鎖双方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。他のいくつかのポリヌクレオチドは、このマウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一の２つのポリペプチドセグメントをコードする。
【００８３】
これらのポリヌクレオチド配列は、de novo固相ＤＮＡ合成によるか、または抗ｈＴＳＬＰＲ抗体またはその結合フラグメントをコードする既存の配列(例えば、以下の実施例に記載されている配列)のＰＣＲ突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接化学合成は、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４,４５８,０６６号の固相支持体法など、当技術分野で公知の方法により行うことができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991;およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載のようにして行うことができる。
【００８４】
また、本発明では、上記の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。抗ＴＳＬＰＲ抗体鎖または結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させるためには種々の発現ベクターが使用可能である。哺乳類宿主細胞で抗体を作製するためには、ウイルス系および非ウイルス系双方の発現ベクターが使用可能である。非ウイルスベクターおよび系は、プラスミド、一般にタンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットを有するエピソームベクター、およびヒト人工染色体(例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997参照)を含む。例えば、哺乳類(例えばヒト)細胞における抗ｈＴＳＬＰＲポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ３.１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ(Invitrogen, San Diego, CA)、ＭＰＳＶベクターおよび他のタンパク質の発現に関して当技術分野で知られている他の多くのベクターを含む。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルスに基づくベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ)に基づくベクターが挙げられる。Brent et al., 前掲; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995;およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992参照。
【００８５】
発現ベクターの選択は、そのベクターを発現させる意図する宿主細胞によって異なる。一般に、これらの発現ベクターは、抗ｈＴＳＬＰＲ抗体鎖またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたプロモーターおよびその他の調節配列(例えばエンハンサー)を含む。いくつかの態様では、誘導性プロモーターは、誘導条件下以外で挿入配列を発現しないようにするために使用される。誘導性プロモーターは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターを含む。形質転換生物の培養物は、その発現産物が宿主細胞により良好に許容されるコード配列の集団に偏らないように非誘導条件下で拡張することができる。抗ｈＴＳＬＰＲ抗体鎖またはフラグメントの効率的な発現には、プロモーターの他、他の調節エレメントも必要であるか、または望ましい。これらのエレメントは一般に、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現効率は使用においてその細胞系に適当なエンハンサーを含めることで増強することができる(例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994;およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987参照)。例えば、哺乳類宿主細胞における発現を高めるためには、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用することができる。
【００８６】
発現ベクターはまた、挿入された抗ｈＴＳＬＰＲ抗体配列によりコードされているポリペプチドと融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も提供する。多くの場合、挿入された抗ｈＴＳＬＰＲ抗体配列は、ベクターに封入する前にシグナル配列と連結させる。抗ｈＴＳＬＰＲ抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するために用いられるベクターは定常領域またはその一部もコードする場合がある。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、それにより完全抗体またはそのフラグメントの生成をもたらす。一般に、このような定常領域はヒトである。
【００８７】
抗ｈＴＳＬＰＲ抗体鎖を担持および発現するための宿主細胞は、原核生物かまたは真核生物であり得る。大腸菌(E. coli)は本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な１つの原核生物宿主である。使用に好適な他の微生物宿主は、枯草菌(Bacillus subtilis)などのバチルス属、およびサルモネラ属、セラチア属および種々のシュードモナス種などの他の腸内細菌を含む。これらの原核生物宿主では、一般に、その宿主細胞に適合する発現制御配列(例えば複製起点)を含む発現ベクターの作製も可能となる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはλファージ由来プロモーター系など、種々の周知のプロモーターがいくつ存在してもよい。これらのプロモーターは一般に、任意のオペレーター配列により発現を制御し、転写および翻訳を誘導および完了するために、リボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物も、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲポリペプチドを発現させるために使用することができる。昆虫細胞をバキュロウイルスベクターと組み合わせて使用することもできる。
【００８８】
いくつかの好ましい態様では、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲポリペプチドを発現および産生するために哺乳類宿主細胞を用いる。例えば、それらは内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株(例えば、実施例に記載されるような１Ｄ６.Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン)かまたは外因性の発現ベクターを担持する哺乳類細胞系統(例えば、下記に例示されているＳＰ２／０骨髄腫細胞)のいずれかであり得る。これらには正常な致死の、またが正常もしくは異常な不死の動物もしくはヒト細胞が含まれる。例えば、ＣＨＯ細胞系統、種々のＣｏｓ細胞系統、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系統、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含み、完全な免疫グロブリンを分泌し得るいくつかの好適な宿主細胞系統が開発されている。ポリペプチドを発現させるための哺乳類組織細胞培養の使用は一般に、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987に論じられている。哺乳類宿主細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサー(例えば、Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986参照)などの発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。これらの発現ベクターは通常、哺乳類遺伝子に由来する、または哺乳類ウイルスに由来するプロモーターを含む。好適なプロモーターは構成的、細胞種特異的、段階特異的、および／または調整可能もしくは調節可能である。有用なプロモーターは、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導ＣＭＶプロモーター(ヒト前初期ＣＭＶプロモーター)、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せを含む。
【００８９】
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は細胞宿主の種類によって異なる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞に用いられる場合が多いが、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用可能である(一般に、Sambrook, et al., 前掲参照)。他の方法として、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道法、ウィロソーム(virosome)、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合(Elliot and O’Hare, Cell 88:223, 1997)、薬剤により促進させるＤＮＡ取り込み、およびex vivo形質導入がある。組み換えタンパク質の長期間高収率生産のためには、多くの場合、安定発現が望まれる。例えば、抗ｈＴＳＬＰＲ抗体鎖または結合フラグメントを安定発現する細胞系統は、ウイルス起源の複製または内因性発現エレメントと選択可能なマーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを用いて産生することができる。ベクターを導入した後、富化培地中で１〜２日間細胞を増殖させ、その後、選択培地に切り替えればよい。選択マーカーの目的は選択のために耐性を付与することであり、その存在により、選択培地中で導入配列を首尾よく発現する細胞の増殖が可能となる。耐性のある、安定にトランスフェクトされた細胞は、その細胞種に適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００９０】
ＩＶ. 抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の特性
上記の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体が宿主細胞内で発現ベクターから、または内因的にハイブリドーマにおいて発現されると、それらは培養培地および宿主細胞から容易に精製することができる。通常、抗体鎖はシグナル配列ともに発現され、従って、培地に放出される。しかしながら、宿主細胞が抗体鎖を自然に分泌しない場合には、弱い洗剤で処理することで抗体鎖を放出させることができる。次に、硫酸アンモニウム沈殿、固定化標的に対するアフィニティークロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む常法により抗体鎖を精製することができる。これらの方法は全てよく知られており、当技術分野で慣例的に実施されている(例えば、Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982; and Harlow & Lane, 前掲)。
【００９１】
例として、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を発現する選択されたハイブリドーマは、モノクローナル抗体精製用の２リットルのスピナーフラスコで増殖させることができる。上清を濾過および濃縮した後、プロテインＡ−セファロースまたはＧタンパク質−セファロース(Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーにより純粋かどうかを確認することができる。バッファー溶液をＰＢＳに交換し、ＯＤ２８０の読み取りにより濃度を測定することができる。これらのモノクローナル抗体はアリコートに分け、−８０℃で保存することができる。
【００９２】
それらの製造方法にかかわらず、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体はｈＴＳＬＰＲまたはその抗原フラグメントと特異的に結合する。特異的結合は、ｈＴＳＬＰＲまたはその抗原フラグメントとの抗体結合に関する解離定数が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１ｎＭである場合に存在する。ｈＴＳＬＰＲに対する抗体の結合能は、目的抗体を直接標識することにより検出することもできるし、あるいは抗体を標識せず、種々のサンドイッチアッセイ形式を用いて結合を間接的に検出してもよい。例えば、Harlow & Lane, 前掲参照。このような結合特異性を有する抗体は、以下の実施例で述べられる１Ｄ６.Ｃ９マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体により示される有利な特性を共通に持つ可能性が高い。
【００９３】
本発明の抗ＴＳＬＰＲモノクローナル抗体は、ＴＳＬＰにより媒介されるシグナル伝達活性に拮抗することができる。これらの活性は、例えば、ＴＡＲＣおよびＭＤＣなどの樹状細胞によるＴＨ２−誘引ケモカインの分泌、樹状細胞の活性化、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大およびＴＨ２表現型への分極、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３ ＴＮＦαなどのアレルギー誘発性サイトカインの産生を含む。抗ｈＴＳＬＰＲ抗体がＴＳＬＰにより媒介される細胞活性を阻害することができるかどうかを判定するためには、いくつかのアッセイを使用することができる。これらには、例えば、Ｂａ／Ｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞を用いた細胞増殖アッセイ、Ｂａ／Ｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞を用いたルシフェラーゼリポーターアッセイ、およびＴＡＲＣ分泌アッセイなど、実施例に記載されているいずれのアッセイも含まれる。ＴＳＬＰシグナル伝達活性を測定するためのさらなるアッセイも当技術分野において記載されている。例えば、Reche et al., J. Immunol., 167:336-43, 2001;およびIsaksen et al., J Immunol. 168:3288-94, 2002参照。
【００９４】
いくつかの態様では、本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、図５に示されている可変領域配列を有する参照抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(例えば、以下の実施例に記載されるマウス１Ｄ６.Ｃ９抗体またはそのキメラ抗体)とｈＴＳＬＰＲポリペプチドとの結合を遮断するか、またはそれと競合する。これらは上記の完全ヒト抗ｈＴＳＬＰＲ抗体であり得る。それらはまた、参照抗体と同じエピトープと結合する他のマウス、キメラまたはヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体であってもよい。参照抗体の結合を遮断するか、またはそれと競合することができるということは、試験下の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体が参照抗体により定義されるものと同一または類似のエピトープと、または参照抗ｈＴＳＬＰＲ抗体が結合しているエピトープに十分近接したエピトープと結合することを示唆する。このような抗体は特に、参照抗体に関して確認された有利な特性を共通に持っている可能性がある。参照抗体を遮断するか、またはそれと競合する能力は、例えば競合結合アッセイにより測定することができる。競合結合アッセイでは、試験下の抗体を、参照抗体とＴＳＬＰＲポリペプチドなどの共通抗原との特異的結合を阻害する能力に関して調べる。試験抗体は、過剰量の試験抗体が参照抗体の結合を実質的に阻害する場合に、抗原との特異的結合をめぐって参照抗体と競合する。実質的阻害とは、試験抗体が参照抗体の特異的結合を通常、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または９０％低下させることを意味する。
【００９５】
ヒトＴＳＬＰＲとの結合をめぐる、抗ｈＴＳＬＰＲ抗体と参照抗ｈＴＳＬＰＲ抗体との競合を評価するために使用可能な既知の競合結合アッセイがいくつかある。これらには、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、固相直接または間接酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986参照)；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow & Lane, 前掲参照)；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990);および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990)が含まれる。一般に、このようなアッセイは、非標識試験抗ｈＴＳＬＰＲ抗体および標識参照抗体のいずれかを担持する固相表面または細胞に結合された精製抗原の使用を含む。競合的阻害は、試験抗体の存在下で、固相表面または細胞に結合された標識の量を測定することにより評価される。競合アッセイにより同定された抗体(競合抗体)には、参照抗体と同じエピトープと結合する抗体および参照抗体が結合しているエピトープと、立体障害が起こるのに十分近接している隣接エピトープと結合する抗体が含まれる。
【００９６】
選択された抗ＴＳＬＰＲモノクローナル抗体がユニークなエピトープに結合するかどうかを調べるためには、各抗体を市販の試薬(例えば、Pierce, Rockford, ILからの試薬)を用いてビオチン化することができる。非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いた競合試験は、ＴＳＬＰＲポリペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて行うことができる。ビオチン化ＭＡｂの結合はストレプトアビジン(strep-avidin)−アルカリホスファターゼプローブで検出することができる。精製抗ＴＳＬＰＲ抗体のイソ型を調べるためには、イソ型ＥＬＩＳＡを行うことができる。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを４℃にて一晩、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧでコーティングすればよい。１％ＢＳＡで遮断した後、これらのプレートを周囲温度で１〜２時間、１μｇ／ｍｌ以下のモノクローナル抗ｈＴＳＬＰＲ抗体または精製イソ型対照と反応させる。次に、これらのウェルをヒトＩｇＧｌまたはヒト ＩｇＭ特異的アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートプローブのいずれかと反応させる。その後、精製抗体のイソ型が判定できるようにプレートを現像および分析する。
【００９７】
モノクローナル抗ｈＴＳＬＰＲ抗体とｈＴＳＬＰＲポリペプチドを発現する生存細胞との結合を調べるためには、フローサイトメトリーを使用することができる。簡単に言うと、ｈＴＳＬＰＲを発現する細胞系統(標準的な増殖条件下で増殖させる)を、０.１％ＢＳＡおよび１０％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中、種々の濃度の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベートすることができる。洗浄後、一次抗体染色と同様の条件下、これらの細胞をフルオレセイン標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。これらのサンプルを、単細胞に対してゲートを開く光散乱および側方散乱特性を用いたＦＡＣＳｃａｎ装置により分析することができる。フローサイトメトリーアッセイの加えて、またはその代わりに蛍光顕微鏡を用いる別のアッセイを使用することもできる。細胞を上記のような厳密に染色し、蛍光顕微鏡により調べることができる。この方法により個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の濃度によって感受性が低下する場合がある。
【００９８】
本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はさらに、ウエスタンブロット法により、ｈＴＳＬＰＲポリペプチドまたは抗原フラグメントとの反応性に関して試験することができる。簡単に言うと、精製ｈＴＳＬＰＲポリペプチドもしくは融合タンパク質、またはＴＳＬＰＲ発現細胞由来の細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎児血清でブロッキングし、供試モノクローナル抗体でプロービングする。ヒトＩｇＧ結合は抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)で現像することができる。
【００９９】
Ｖ. 非免疫グロブリンスキャフォールド
得られるポリペプチドが標的タンパク質に特異的な少なくとも１つの結合領域を含む限り、多様な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドを使用することができる。このようなフレームワークまたはスキャフォールドとしては、５つの主要なイディオタイプのヒト免疫グロブリンまたはそのフラグメント(本明細書の他所に開示されているものなど)を含み、好ましくはヒト化局面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。ラクダ科で同定されているものなどの単鎖重鎖抗体は、この点で特に着目されるものである。当業者により新規なフレームワーク、スキャフォールドおよびフラグメントの発見および開発が続いている。
【０１００】
一局面において、本発明は、本発明のＣＤＲがグラフト可能な非免疫グロブリンスキャフォールドを用いた非免疫グロブリンに基づく抗体の作製に関する。既知の、または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドは、それらが配列番号Ｘの標的タンパク質に特異的な結合領域を含んでいる限り使用可能である。このような化合物は本明細書では、「標的特異的結合領域をポリペプチド」として知られる。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドは、限定されるものではないが、アドネクチン(Adnectins)(フィブロネクチン)(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(ankyrin)(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd (Cambridge, MA)およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ(Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(lipocalin)(Anticalin)(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、スモール・モジュラー・イムノファルマシューティカル(small modular immuno-pharmaceuticals)(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(maxybodies)(Avidia, Inc. (Mountain View, CA))、プロテインＡ(Affebody AG, Sweden)およびアフィリン(affilin)(γクリスタリンまたはユビキチン)(Scil Protains GmbH, Halle, Germany)を含む。
【０１０１】
(ｉ)アドネクチン−Compound Therapeutics
アドネクチンスキャフォールドは、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン(例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンの１０番目のモジュール(１０Ｆｎ３ドメイン)に基づくものである。このＩＩＩ型フィブロネクチンドメインは２つのβシートの間に分布する７または８βストランドを有し、それら自体は互いに密集してタンパク質核を形成し、さらに互いにβストランドを接続し、溶媒に曝されるループ(ＣＤＲに類似)を含む。βシートサンドイッチの各端にはこのようなループが少なくとも３つあり、この端部はβストランドの方向と垂直にタンパク質の境界となっている(米国特許第６,８１８,４１８号)。
【０１０２】
これらのフィブロネクチンに基づくスキャフォールドは免疫グロブリンではないが、全体的な折り畳みは、ラクダおよびラマＩｇＧにおける全抗原認ユニットを含む最小機能抗体フラグメントである重鎖可変領域のものに密接に関係している。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、自然界で類似の抗原結合特性および抗体に対する親和性を模倣する。これらのスキャフォールドは、in vivoにおける抗体の親和性成熟の過程に類似する、in vitroにおけるループの無作為化およびシャッフリング戦略に使用可能である。これらのフィブロネクチンに基づく分子は、標準的なクローニングを用いてその分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置換することができるスキャフォールドとして使用可能である。
【０１０３】
(ｉｉ)アンキリン−Molecular Partners
この技術は、種々の標的との結合に使用可能な可変領域を保持するためのスキャフォールドとしてアンキリン誘導化リピートモジュールを有するタンパク質の使用に基づくものである。このアンキリンリピートモジュールは２つの逆平行αヘリックスとβターンからなる３３個のアミノ酸のポリペプチドである。これらの可変領域の結合はリボソームディスプレーを用いてほぼ至適化される。
【０１０４】
(ｉｉｉ)マキシボディ／アビマー−Avidia
アビマーはＬＲＰ−１などのタンパク質を含む天然Ａドメインに由来する。これらのドメインはタンパク質−タンパク質相互作用により用いられ、ヒトでは２５０を超えるタンパク質が構造的にＡドメインに基づいている。アビマーはアミノ酸リンカーを介して結合したいくつかの異なる「Ａドメイン」モノマー(２〜１０)からなる。アビマーは、例えば２００４０１７５７５６；２００５００５３９７３；２００５００４８５１２；および２００６０００８８４４に記載されている方法論を用いて標的抗原と結合できるものを作製することができる。
【０１０５】
(ｖｉ)プロテインＡ−アフィボディ
アフィボディ(登録商標)親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１つのスキャフォールドに基づく３本のヘリックス束からなる、小さな単純なタンパク質である。プロテインＡは黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは５８のアミノ酸からなり、そのうち１３は多数のリガンド変異体を有するアフィボディ(登録商標)ライブラリーを作製するために無作為化されている(例えば、米国特許第５,８３１,０１２号参照)。アフィボディ(登録商標)分子は抗体を模倣し、抗体の分子量が１５０ｋＤａであるのに対して、その分子量は６ｋＤａである。その小さなサイズにもかかわらず、アフィボディ(登録商標)分子の結合部位は抗体のものと同等である。
【０１０６】
(ｖ)アンチカリン−Pieris
アンチカリン(登録商標)は、Pieris ProteoLab AG社が開発した製品である。それらは化学的に感受性があるか、または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に通常含まれる、小型かつ頑丈な広範なタンパク質群であるリポカリン類に由来する。数種の天然リポカリンはヒト組織または体液に見られる。
【０１０７】
このタンパク質構造は、強固なフレームワーク上に超可変ループを有する免疫グロブリンを暗示する。しかしながら、抗体またはそれらの組み換えフラグメントとは対照的に、リポカリン類は１６０〜１８０のアミノ酸残基を有する１本のポリペプチド鎖からなり、１本の免疫グロブリンドメインよりもほんの少し大きい。
【０１０８】
結合ポケットを形成する４つのループのセットは、著しい構造的可塑性を示し、かつ、種々の側鎖を許容する。よって、この結合部位は、高い親和性と特異性を有する異なる形状の、指定された標的分子を認識するために、専有プロセスで再成形することができる。
【０１０９】
リポカリンファミリーの１つのタンパク質であるPieris Brassicaeのビリン(bilin)結合タンパク質(ＢＢＰ)は、この４つのループセットを突然変異誘発することによりアンチカリン類(anticalins)を開発するために用いられている。「アンチカリン類」を記載している特許出願の一例はＰＣＴ ＷＯ１９９９１６８７３である。
【０１１０】
(ｖｉ)アフィリン−Scil Protein
アフィリン(商標)分子は、タンパク質および小分子に対して特異的親和性を持つようにデザインされた小型の非免疫グロブリンタンパク質である。新しいアフィリン(商標)分子は、各々異なるヒト由来スキャフォールドタンパク質に基づく２つのライブラリーから極めて迅速に選択することができる。アフィリン(商標)分子は免疫グロブリンタンパク質に構造的ホモロジーを示さない。Scil Proteinは２つのアフィリン(商標)スキャフォールドを用い、その一方はヒト眼のレンズの構造タンパク質であるγクリスタリンであり、他方は「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。両ヒトスキャフォールドとも極めて小さく、高温安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほぼ耐性がある。この高い安定性は主としてこれらのタンパク質の拡張βシート構造によるものである。γクリスタリン由来タンパク質の例はＷＯ２００１０４１４４に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例はＷＯ２００４１０６３６８に記載されている。
【０１１１】
ＶＩ. 抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の治療適用
抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、ＴＳＬＰシグナル伝達活性を阻害することにより、多くの治療的または予防的適用で使用することができる。これらには、Ｂ細胞の発達、Ｔ細胞の発達、Ｔ細胞受容体遺伝子再構成、またはＳｔａｔ５転写因子の調節に影響を及ぼすものなど、ＴＳＬＰシグナル伝達により媒介される疾病または状態の処置を含む。例えば、抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体は、ＴＨ２細胞により媒介される望ましくない免疫応答を抑制または軽減するために使用することができる。特にそれらはＴＳＬＰシグナル伝達と関連するか、またはそれにより媒介されるアレルギー性炎症性障害に罹患しているヒト患者を処置するのに好適である。本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体による処置に従うアレルギー性炎症性疾患としては、例えば、(１)空気流の閉塞と気管支の過敏感反応性に関連する気道の慢性炎症性疾患である喘息；(２)長期の断続的処置を必要とする慢性、増悪性の炎症性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎；および(３)アトピーに関連する、ＴＨ２リンパ球により媒介される鼻腔粘膜の炎症性障害であるアレルギー性鼻炎が挙げられる。米国およびいくつかの主要な欧州諸国では、喘息、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性鼻炎の診断罹患率は、２０１３年にはそれぞれ現在の４６００万人から５３００万人に、現在の３１７０万人から３７２０万人に、現在の５５９０万人から６４５０万人に増えると予測される。アトピー性皮膚炎患者の約５０〜８０％は喘息またはアレルギー性鼻炎を有しているか、または発症する。
【０１１２】
アレルギーの処置に現在使用可能な薬剤のほとんどは症状の緩和をもたらすことを目的としており、長期の疾病改善をもたらす可能性のある免疫調節分野の努力は比較的少ない。本発明の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、これらのアレルギー性疾患のいずれかに罹患している対象(特にヒト患者)の新規かつ有効な処置を提供し得る。ＴＳＬＰ受容体シグナル伝達経路の活性化からＴＳＬＰを阻害することにより、それらはＴＨ２の反応と、アレルギー性炎症の誘発と維持の双方を担うサイトカインの産生を遮断することができる。このアプローチは、アトピー性皮膚炎、喘息およびアレルギー性鼻炎患者において長期の治療効果および疾病改善利益をもたらす可能性を有する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、上記の抗体または機能的フラグメントまたは保存的変異体の少なくともいずれか１つと医薬上許容される担体または賦形剤とを有する医薬組成物を提供する。
【０１１４】
ある特定の態様では、本発明は、受容体標的ｈＴＳＬＰを有する細胞の存在に関連する障害または状態を処置する方法を提供する。この方法はそれを必要とする対象に有効量の上記医薬組成物のいずれかを投与することを含む。関連の態様では、処置される障害または状態は呼吸器系障害である。
【０１１５】
別の態様では、治療される障害または状態は、気道の過敏感反応性(ＡＨＲ)、粘液の過剰生産、繊維症および血清ＩｇＥレベルの上昇を特徴とする、一般的な肺の持続性炎症性疾患である気管支喘息である。
別の態様では、処置される障害または状態は、小児に最も多い皮膚疾患であり、強いかゆみと慢性的湿疹病巣を特徴とするアトピー性(アレルギー性)皮膚炎である。
【０１１６】
別の態様では、処置される障害または状態は、ＣＯＰＤ、急性肺損傷(ＡＬＩ)、急性／成人呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、呼吸困難、アレルギー性気道炎症、小気道疾患、肺癌、鎌形赤血球症および肺高血圧症患者の急性胸部症候群、ならびに他の薬物療法、特に他の吸入薬物療法の結果としての気道過敏感反応の増悪など、他の炎症性または閉塞性気道疾患および状態から選択される。
【０１１７】
別の態様では、処置される障害または状態は、種類および起源によらず、例えば急性、アラキジン酸性、カタル性、クループ性、慢性、または結核性気管支炎を含む気管支炎である。
【０１１８】
別の態様では、処置される障害または状態は、例えば、アルミニウム症、炭粉症、石綿症、石粉症、ダチョウ塵肺症、鉄症、ケイ肺症、タバコ肺症および綿肺症を含む塵肺症(炎症性、一般に職業的な肺疾患、多くの場合、慢性であれ急性であれ気道閉塞が伴い、塵埃の反復的吸収により発生する)を含む。
【０１１９】
別の態様では、処置される障害または状態は、アトピー性鼻炎(枯草熱)および慢性副鼻腔炎から選択される。
別の態様では、処置される障害または状態は、他の皮膚の炎症性状態、例えば、乾癬または紅斑性狼瘡から選択される。
【０１２０】
別の態様では、処置される障害または状態は、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患である。
別の態様では、処置される障害または状態は、全身性硬化症、肝繊維症、肺繊維症、特発性肺繊維症または繊維肺などの他の繊維性状態から選択される。
【０１２１】
別の態様では、処置される障害または状態は腫瘍再発または転移である。Ｔｈ２サイトカインの阻害は動物モデルで抗ウイルスワクチンを増強することが示されており、ＨＩＶおよび他の感染性疾患の処置に有益であり得る[Ahlers, J. D., et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002]。
【０１２２】
別の態様では、処置される障害または状態は、喘息、慢性気管支炎、ＣＯＰＤ、中耳炎および副鼻腔炎などの、基礎にある慢性状態を増悪させる呼吸器系ウイルス感染症である。処置される呼吸器系ウイルス感染症は、中耳炎、副鼻腔炎または肺炎などの二次的細菌感染に関連し得る。
【０１２３】
別の態様では、処置される障害または状態は、他の疾病または状態、特に炎症性成分を有する疾病または状態、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、および他の疾病(アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、ならびに例えば心臓、腎臓、肝臓、肺または骨髄移植後の急性および慢性異種移植片拒絶など)を含む骨および関節の疾病から選択される。
【０１２４】
別の態様では、処置される障害または状態は、内毒素ショック、糸球体腎炎、脳虚血および心虚血、アルツハイマー病、嚢胞性繊維症、ウイルス感染症およびそれらに関連する増悪、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、多発性硬化症(ＭＳ)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)関連胃炎、および癌、特に卵巣癌の増殖である。
【０１２５】
別の態様では、処置される障害または状態は、ヒトライノウイルス、他のエンテロウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルスまたはアデノウイルスにより引き起こされるヒトにおけるウイルス感染により引き起こされる状態である。
本発明の処置は対症的または予防的なものであり得る。
【０１２６】
炎症性状態、例えば炎症性気道疾患の阻害における本発明の薬剤の有効性は、例えば、Wada et al, J. Exp. Med (1994) 180:1135-40; Sekido et al, Nature (1993) 365:654-57; Modelska et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med (1999) 160:1450-56;およびLaffon et al (1999) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160:1443-49に記載されているように、気道炎症または他の炎症性状態の動物モデル、例えばマウス、ラットまたはウサギモデルにおいて証明することができる。
【０１２７】
さらに別の態様では、本発明は、ｈＴＳＬＰ受容体を有する細胞を同定する方法を提供する。この方法は、細胞を検出可能な標識をさらに有する上記抗体または抗体フラグメントのいずれかと接触させることを含む。この標識は放射性、蛍光、磁性、常磁性、または化学発光性である。この方法はさらに上記の標識細胞の画像化または分離のいずれかを含み得る。
【０１２８】
別の態様では、上記のヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメントはいずれも合成品である。
別の態様では、本発明は、医薬組成物および付加的治療薬を提供する。
【０１２９】
付加的治療薬は、特に、以上に記載したものなどの閉塞性または炎症性気道疾患の処置においては、抗炎症薬、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬または鎮咳薬からなる群から選択することができ、例えば、このような薬剤の治療活性の増強薬またはこのような薬剤の必要用量または起こり得る副作用を軽減する手段としてのものがある。本発明の治療薬は、一定の医薬組成物として他の薬剤物質と混合してもよいし、あるいは他の薬剤物質の前、同時、または後に別に投与してもよい。よって、本発明は、上述の本発明の薬剤と抗炎症薬、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬または鎮咳薬物質の組合せを含み、該本発明の薬剤および該薬剤物質は同じ医薬組成物でも異なる医薬組成物でもよい。
【０１３０】
好適な抗炎症薬は、ステロイド、特に、グルココルチコステロイド(例えば、ブデソニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニドまたはフロ酸モメタゾン)、またはＷＯ０２／８８１６７、ＷＯ０２／１２２６６、ＷＯ０２／１００８７９、ＷＯ０２／００６７９(特に実施例３、１１、１４、１７、１９、２６、３４、３７、３９、５１、６０、６７、７２、７３、９０、９９および１０１のもの)、ＷＯ０３／３５６６８、ＷＯ０３／４８１８１、ＷＯ０３／６２２５９、ＷＯ０３／６４４４５、ＷＯ０３／７２５９２、ＷＯ０４／３９８２７およびＷＯ０４／６６９２０に記載のステロイド；非ステロイド系グルココルチコイド受容体アゴニスト、例えば、ＤＥ１０２６１８７４、ＷＯ００／００５３１、ＷＯ０２／１０１４３、ＷＯ０３／８２２８０、ＷＯ ０３／８２７８７、ＷＯ０３／８６２９４、ＷＯ０３／１０４１９５、ＷＯ０３／１０１９３２、ＷＯ０４／０５２２９、ＷＯ０４／１８４２９、ＷＯ０４／１９９３５およびＷＯ０４／２６２４８に記載されているもの；ＬＴＢ４アンタゴニスト、例えば、ＢＩＩＬ２８４、ＣＰ−１９５５４３、ＤＰＣ１１８７０、ＬＴＢ４エタノールアミド、ＬＹ２９３１１１、ＬＹ２５５２８３、ＣＧＳ０２５０１９Ｃ、ＣＰ−１９５５４３、ＯＮＯ−４０５７、ＳＢ２０９２４７、ＳＣ−５３２２８およびＵＳ５４５１７００に記載されているもの；ＬＴＤ４アンタゴニスト、例えば、モンテルカスト、プランルカスト、ザフィルルカスト、アコレート、ＳＲ２６４０、Ｗｙ−４８,２５２、ＩＣＩ１９８６１５、ＭＫ−５７１、ＬＹ−１７１８８３、Ｒｏ２４−５９１３およびＬ−６４８０５１；ＰＤＥ４阻害剤、例えば、シロミラスト(Ariflo(登録商標)GlaxoSmithKline)、ロフルミラスト(Byk Gulden)、Ｖ−１１２９４Ａ(Napp)、ＢＡＹ１９−８００４(Bayer)、ＳＣＨ−３５１５９１(Schering-Plough)、アロフィリン(Almirall Prodesfarma)、ＰＤ１８９６５９／ＰＤ１６８７８７(Parke-Davis)、ＡＷＤ−１２−２８１(Asta Medica)、ＣＤＣ−８０１(Celgene)、ＳｅｌＣＩＤ(ＴＭ)ＣＣ−１０００４(Celgene)、ＶＭ５５４／ＵＭ５６５(Vernalis)、Ｔ−４４０(Tanabe)、ＫＷ−４４９０(Kyowa Hakko Kogyo)、ならびにＷＯ９２／１９５９４、ＷＯ９３／１９７４９、ＷＯ９３／１９７５０、ＷＯ９３／１９７５１、ＷＯ９８／１８７９６、ＷＯ９９／１６７６６、ＷＯ０１／１３９５３、ＷＯ０３／１０４２０４、ＷＯ０３／１０４２０５、ＷＯ０３／３９５４４、ＷＯ０４／０００８１４、ＷＯ０４／０００８３９、ＷＯ０４／００５２５８、ＷＯ０４／０１８４５０、ＷＯ０４／０１８４５１、ＷＯ０４／０１８４５７、ＷＯ０４／０１８４６５、ＷＯ０４／０１８４３１、ＷＯ０４／０１８４４９、ＷＯ０４／０１８４５０、ＷＯ０４／０１８４５１、ＷＯ０４／０１８４５７、ＷＯ０４／０１８４６５、ＷＯ０４／０１９９４４、ＷＯ０４／０１９９４５、ＷＯ０４／０４５６０７およびＷＯ０４／０３７８０５に開示されているもの；Ａ２Ａアゴニスト、例えば、ＥＰ１０５２２６４、ＥＰ１２４１１７６、ＥＰ４０９５９５Ａ２、ＷＯ９４／１７０９０、ＷＯ９６／０２５４３、ＷＯ９６／０２５５３、ＷＯ９８／２８３１９、ＷＯ９９／２４４４９、ＷＯ９９／２４４５０、ＷＯ９９／２４４５１、ＷＯ９９／３８８７７、ＷＯ９９／４１２６７、ＷＯ９９／６７２６３、ＷＯ９９／６７２６４、ＷＯ９９／６７２６５、ＷＯ９９／６７２６６、ＷＯ００／２３４５７、ＷＯ００／７７０１８、ＷＯ００／７８７７４、ＷＯ０１／２３３９９、ＷＯ０１／２７１３０、ＷＯ０１／２７１３１、ＷＯ０１／６０８３５、ＷＯ０１／９４３６８、ＷＯ０２／００６７６、ＷＯ０２／２２６３０、ＷＯ０２／９６４６２およびＷＯ０３／０８６４０８に記載されているもの；ならびにＡ２Ｂアンタゴニスト、例えば、ＷＯ０２／４２２９８に記載されているものを含む。
【０１３１】
好適な気管支拡張薬は、抗コリン作動薬または抗ムスカリン作用薬、特に、臭化イプラトロピウム、臭化オキシトロピウム、チオトロピウム塩およびＣＨＦ４２２６(Chiesi)、およびグリコピロレート、また、ＥＰ４２４０２１、ＵＳ３７１４３５７、ＵＳ５１７１７４４、ＷＯ０１／０４１１８、ＷＯ０２／００６５２、ＷＯ０２／５１８４１、ＷＯ０２／５３５６４、ＷＯ０３／００８４０、ＷＯ０３／３３４９５、ＷＯ０３／５３９６６、ＷＯ０３／８７０９４、ＷＯ０４／０１８４２２およびＷＯ０４／０５２８５に記載されているもの；ならびにβ−２アドレノセプターアゴニスト、例えば、アルブテロール(サルブタモール)、メタプロテレノール、テルブタリン、サルメテロール、フェノテロール、プロカテロール、特に、フォルモテロール、カルモテロールおよびその医薬上許容される塩、および出典明示により本明細書の一部とされるＷＯ００／７５１１４の式Ｉの化合物(遊離型または塩または溶媒和物型)、好ましくは、その実施例の化合物、特に、化合物(５−[(Ｒ)−２−(５,６−ジエチル−インダン−２−イルアミノ)−１−ヒドロキシ−エチル]−８−ヒドロキシ−１Ｈ−キノリン−２−オン)およびその医薬上許容される塩、ならびにＷＯ０４／１６６０１の式Ｉの化合物(遊離型または塩または溶媒和物型)、また、ＥＰ１４４０９６６、ＪＰ０５０２５０４５、ＷＯ９３／１８００７、ＷＯ９９／６４０３５、ＵＳ２００２／００５５６５１、ＷＯ０１／４２１９３、ＷＯ０１／８３４６２、ＷＯ０２／６６４２２、ＷＯ０２／７０４９０、ＷＯ０２／７６９３３、ＷＯ０３／２４４３９、ＷＯ０３／４２１６０、ＷＯ０３／４２１６４、ＷＯ０３／７２５３９、ＷＯ０３／９１２０４、ＷＯ０３／９９７６４、ＷＯ０４／１６５７８、ＷＯ０４／２２５４７、ＷＯ０４／３２９２１、ＷＯ０４／３３４１２、ＷＯ０４／３７７６８、ＷＯ０４／３７７７３、ＷＯ０４／３７８０７、ＷＯ０４／３９７６２、ＷＯ０４／３９７６６、ＷＯ０４／４５６１８、ＷＯ０４／４６０８３、ＷＯ０４／８０９６４、ＥＰ１４６００６４、ＷＯ０４／０８７１４２、ＷＯ０４／０８９８９２、ＥＰ０１４７７１６７、ＵＳ２００４／０２４２６２２、ＵＳ２００４／０２２９９０４、ＷＯ０４／１０８６７５、ＷＯ０４／１０８６７６、ＷＯ０５／０３３１２１、ＷＯ０５／０４０１０３およびＷＯ０５／０４４７８７の化合物を含む。
【０１３２】
好適な抗炎症性および気管支拡張性の二重の薬剤は、ＵＳ２００４／０１６７１６７、ＷＯ０４／７４２４６およびＷＯ０４／７４８１２に開示されているものなどのβ−２アドレノセプターアゴニスト／ムスカリンアンタゴニストを含む。
【０１３３】
好適な抗ヒスタミン薬物質は、塩酸セチリジン、アセトアミノフェン、フマル酸クレマスチン、プロメタジン、ロラチジン、デスロラチジン、ジフェンヒドラミンおよび塩酸フェキソフェナジン、アクチバスチン、アステミゾール、アゼラスチン、エバスチン、エピナスチン、ミゾラスチンおよびテフェナジン、ならびにＪＰ２００４１０７２９９、ＷＯ０３／０９９８０７およびＷＯ０４／０２６８４１に開示されているものを含む。
【０１３４】
本発明の治療薬と抗コリン作動薬または抗ムスカリン作動薬、ステロイド類、β−２アゴニスト、ＰＤＥ４阻害剤、ドーパミン受容体アゴニスト、ＬＴＤ４アンタゴニストまたはＬＴＢ４アンタゴニストの組合せも使用可能である。本発明の薬剤と抗炎症薬との他の有用な組合せとしては、他のケモカイン受容体アンタゴニスト、例えば、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−３、ＣＣＲ−４、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−６、ＣＣＲ−７、ＣＣＲ−８、ＣＣＲ−９およびＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、特にＣＣＲ−５アンタゴニスト、例えば、Schering-PloughアンタゴニストＳＣ−３５１１２５、ＳＣＨ−５５７００およびＳＣＨ−Ｄ、Takedaアンタゴニスト、例えば、Ｎ−[[４−[[[６,７−ジヒドロ−２−(４−メチルフェニル)−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−８−イル]カルボニル]アミノ]フェニル]−メチル]−テトラヒドロ−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２Ｈ−ピラン−４−アミニウムクロリド(ＴＡＫ−７７０)、ＵＳ６１６６０３７(特に請求項１８および１９)、ＷＯ００６６５５８(特に請求項８)、ＷＯ００６６５５９(特に請求項９)、ＷＯ０４／０１８４２５およびＷＯ０４／０２６８７３に記載のＣＣＲ−５アンタゴニストとの組合せがある。
【０１３５】
付加的治療薬はまた、他のサイトカイン結合分子、特に他のサイトカインの抗体、特に、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８３６に記載されているものなどの抗ＩＬ４抗体、Xolair(登録商標)などの抗ＩｇＥ抗体、ＷＯ０５／００７６９９に記載されているものなどの抗ＩＬ３１抗体、抗ＩＬ３１Ｒ抗体、抗ＩＬ１３抗体、抗エンドリン抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、および抗ＴＳＬＰ抗体または別の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体との組合せからなる群から選択することができる。
【０１３６】
本発明の抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体は、治療的および予防的の双方で対象を処置するために使用可能である。治療適用では、抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体(例えば、ヒト化抗ｈＴＳＬＰＲ抗体)を含む組成物は、ＴＳＬＰシグナル伝達により引き起こされるか、またはシグナル伝達に関連するアレルギー性疾患に既に罹患している対象に投与される。この組成物は抗体をその状態およびその合併症を治癒する、部分的に阻止する、または進行を検出可能な程度に遅延させるのに十分な量で含む。予防適用では、モノクローナル抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を含む組成物は、アレルギー性炎症性障害のまだ罹患していない患者に投与される。むしろ、それらはアレルギー性炎症性障害を発症するリスクがあるか、または疾病素因を有する対象に向けられる。このような適用は対象に患者としての抵抗性を高めさせるか、またはＴＳＬＰシグナル伝達により媒介されるアレルギー性炎症性障害の進行を遅延させる。
【０１３７】
ＶＩＩ. 医薬組成物
本発明は、医薬上許容される担体とともに製剤された抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体(完全または結合フラグメント)を含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、所与のアレルギー性障害を処置または予防するのに好適な他の治療薬、例えば、上記の既知の抗アレルギー薬をさらに含み得る。医薬担体は組成物を増強または安定化するか、または組成物の調製を助ける。医薬上許容される担体としては、生理学的に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
【０１３８】
本発明の医薬組成物は当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。投与経路および／または投与様式は所望の結果によって異なる。投与は静脈投与、筋肉投与、腹腔内投与または皮下投与であるか、または標的部位に近接して投与することが好ましい。医薬上許容される担体は静脈投与、筋肉投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与または上皮投与(例えば、注射または注入による)に適しているべきである。投与経路に応じて、有効化合物、すなわち抗体、二重特異的および多重特異的分子は、酸の作用および化合物を不活性化し得る他の天然条件から化合物を保護するための材料でコーティングすることができる。
【０１３９】
組成物は無菌かつ流動性であるべきである。適切な流動性は例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散系の場合では必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射組成物の長時間吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含めることにより行うことができる。
【０１４０】
本発明の医薬組成物は周知かつ当技術分野で慣例的に実施されている方法に従って製造することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; and Sustained and Controlled Release Drug Delivery systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。医薬組成物はＧＭＰ条件下で製造するのが好ましい。一般に、本発明の医薬組成物には、治療上有効な用量または効果的な用量の抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を用いる。これらの抗ｈＴＳＬＰＲ抗体は、当業者に公知の常法により医薬上許容される投与形として製剤される。投与計画は最適目的応答(例えば、治療応答)を提供するように調節される。例えば、１回のボーラス投与を行ってもよいし、経時的に数回の分割投与を行ってよいし、あるいは治療状況の緊急性により指示されるように用量を比例的に減少または増加させてもよい。投与の簡単さと用量の均一性のために、非経口組成物は単位投与形で処方することが特に有利である。本明細書において単位投与形とは、処置される対象にとって単位用量として適した物理的に独立した単位を指し、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算した所定量の有効化合物を必要な医薬担体とともに含む。
【０１４１】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式に対して、患者への毒性なく、所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量が得られるように変更することができる。選択される用量レベルは、使用する本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性を含む様々な薬物動態因子、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排泄速度、処置期間、使用する特定の組成物と併用される他の薬剤、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態および過去の薬歴によって異なる。
【０１４２】
医師または獣医師は、医薬組成物中に用いられる本発明の抗体用量を所望の治療効果を達成するのに必要とされるものよりも低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで徐々に用量を高めることができる。一般に、本明細書に記載のアレルギー性炎症性障害の処置のための、本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、および処置が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの異なる因子によって異なる。処置用量は安全性と有効性を至適化すべく微調整する必要がある。抗体とともに投与する場合、用量は約０.０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０.０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。処置計画例としては、２週間に１回または１か月に１回または３〜６か月に１回の投与が必要である。
【０１４３】
抗体は通常、複数回で投与される。１回の投与の間隔は１週間、１か月または１年であり得る。間隔は患者において抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の血中レベルを測定することにより指示される場合、不定期であってもよい。いくつかの方法では、用量は、血漿抗体濃度１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌとなるように調節される。あるいは、抗体は徐放性処方物として投与することもでき、この場合には必要とされる投与頻度は少なくなる。用量および頻度は患者における抗体の半減期によって異なる。一般に、ヒト化抗体はキメラ抗体および非ヒト抗体の場合よりも長い半減期を示す。用量および投与頻度は、その処置が予防的であるか治療的であるかによって異なり得る。予防適用では、比較的低用量を、長期間にわたって比較的低頻度で投与する。患者によっては、生涯にわたって処置を続ける。治療適用では、疾病の進行が軽減または終結されるまで、好ましくは、患者が疾病の症状の部分的または完全な緩解を示すまで、比較的高用量を比較的短い間隔で投与する必要がある場合がある。その後、この患者には予防計画で投与することができる。
【実施例】
【０１４４】
以下の実施例は本発明をさらに説明するために示されるものであり、その範囲を限定するものではない。本発明の他の変形形態は当業者には容易に明らかとなり、添付の特許請求の範囲に包含される。
【０１４５】
実施例１. マウス抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体の開発
本実施例はマウス抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体の開発について記載する。Ｂｃｌ２ Ｗｅｈｉ２２マウス(＃１７７０)を、R&D System (Minneapolis, MN) (カタログ番号981-TR, ロット番号EDY1312A)から購入したヒトＴＳＬＰＲ(Ｍｅｔ１−Ｌｙｓ２３１)／ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ(Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３３０)融合タンパク質で免疫化した。この免疫化は１８日間で計８回の注射により行った。末梢リンパ節からＢ細胞を単離し、Ｆ０骨髄腫細胞(ATCC, Manassas, VA)と融合させた。抗体の産生をｈＴＳＬＰＲ／Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ｈＴＳＬＰＲを特異的に認識する抗体を産生する計２４のクローンが得られた。ｈＴＳＬＰＲ抗体と細胞表面ＴＳＬＰＲとの結合はＦＡＣＳアッセイ(BD Biosciences, San Jose, CA)で分析した。簡単に言うと、ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞をハイブリドーマ培養上清、その後ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧとともにインキュベートし、ＦＡＣＳ装置で分析した。これらの結果は、２４クローンのうち１４のハイブリドーマクローンが細胞表面受容体と結合できたことを示した。
【０１４６】
次に、ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞におけるｈＴＳＬＰ依存性細胞増殖アッセイを用い、ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体をスクリーニングした。これらの細胞はヒトＴＳＬＰＲとＩＬ７Ｒαの双方を発現し、ヒトＴＳＬＰの刺激に応答することができる(Reche et al., J. Immunol., 167:336-43, 2001)。細胞増殖アッセイは本質的にReche et al.に記載されているように行った。簡単に言うと、ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞を培養上清からの抗体とともに１時間プレインキュベートし、図１に示されている濃度のｈＴＳＬＰで誘導した。細胞増殖はAlamar Blue (TREK Diagnositc Systems, Cleveland, OH)を用いて測定した。このアッセイでは、各親クローンに対して１〜３のサブクローンを用いた。図１に示されている結果は、クローン１Ｄ６由来の３つのサブクローンが強いアンタゴニスト活性を示したことを示唆する。
【０１４７】
サブクローンの１つ１Ｄ６.Ｃ９からモノクローナル抗体(ｍＡｂ)を精製した(図２Ｃ)。簡単に言うと、Miniperm culture (Vivascience, Carlsbad, CA)からの無血清細胞馴化培地をCleanascite (LigoChem, Fairfield, NJ)で処理した。次に、抗体をＧタンパク質Ｇレジン(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)で精製した。精製した抗体を上記のような細胞増殖アッセイで試験した。Ｂａ／Ｆ３−ｈＴＳＬＰＲ−ｈＩＬ７Ｒα細胞またはＢａｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞を、１ｎｇ／ｍｌのｈＴＳＬＰの添加前に１時間、種々の濃度の抗体で処理した。これらの結果は、ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞(図３Ａ)とＢａｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞(図３Ｂ)の双方のＴＳＬＰ依存性の増殖がマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の添加により用量依存的に阻害されたことを示唆する。
【０１４８】
さらに、ＴＳＬＰにより媒介されるシグナル伝達活性に対する抗体の作用を調べるため、ルシフェラーゼリポーターアッセイも用いた。ＴＳＬＰは、Ｂａｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒａ細胞においてＳｔａｔ３およびＳｔａｔ５のリン酸化を誘導する(Reche et al., 前掲)。このアッセイは、ＴＳＬＰシグナル伝達に応答して、Ｂａｆ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒａ／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞において、Ｓｔａｔ５の制御下のリポーター遺伝子発現を測定するようにデザインした。簡単に言うと、このＳｔａｔ−Ｌｕｃリポーター構築物は、プロモーターおよびエンハンサーを含まないｐＧＬ２基本Ｌｕｃリポーターベクター(Promega, Madison, WI)にＳｔａｔコンセンサス結合部位を挿入することにより作製した。挿入されたＳｔａｔ結合部位は、核Ｓｔａｔ結合配列ＴＴＣＣＣＧＧＡＡ(配列番号１６)(Yan et al., Cell. 84:421-30, 1996;およびSaylors et al., Gene Ther. 6:944-6, 1999)を担持するＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧ配列エレメント(配列番号１５)を８コピー含む。このＳｔａｔ−Ｌｕｃリポーター構築物をＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞に導入した。得られたＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞を、１ｎｇ／ｍｌのｈＴＳＬＰの添加前に１時間、種々の濃度のマウス抗体で処理した。ルシフェラーゼ活性はBright Glo (Promega, Madison, WI)を用いて測定した。このアッセイから得られた結果を図３Ｃに示した。細胞増殖アッセイからの結果と同様に、Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃリポーターアッセイから得られたデータも、マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の用量依存的アンタゴニスト活性(antantagonist activity)を示した。
【０１４９】
ｍＡｂ １Ｄ６.Ｃ９重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)の可変領域をＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。これら重鎖および軽鎖の可変領域の同定に用いたプライマーの配列は次の通りである。ＶＨのプライマーは(１)ＶＨ９：ＧＡＴＧＧＣＡＧＣＷＧＣＹＣＡＡＡＧ(配列番号１)；および(２)Ｈ−定常：ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＹＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＲＲＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ(配列番号２)である。ＶＬのプライマーは(１)ＬＣＶ３：ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＷＣＡＣＡＫＷＣＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＲＴＡ(配列番号３)；およびＬ−定常：ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ(配列番号４)である。
【０１５０】
簡単に言うと、１Ｄ６.Ｃ９クローンから全ＲＮＡを単離した。重鎖または軽鎖可変領域のいずれかのシグナル配列に対するフォワードプライマーと、重鎖ＣＨ１領域または軽鎖κ定常領域に対するリバースプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、配列決定のためｐＣＲ ＩＩまたはｐｃＤＮＡ３.１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＰＯＰ−ＴＡベクターにクローニングした。次に、この抗体クローンの重鎖および軽鎖可変領域配列のポリヌクレオチド配列を決定した(図４)。これらの可変領域に対応するアミノ酸配列(配列番号５および配列番号６)を図５に示す。また、図５に、Kabat et al., 前掲の符番体系に従って推定されたＣＤＲ領域およびフレームワーク領域を示す。
【０１５１】
実施例２. キメラ抗ｈＴＳＬＰＡ抗体の作製
本実施例はキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の作製および特性決定について記載する。これらのキメラ抗体は上記のマウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体１Ｄ６.Ｃ９クローン由来の可変領域とヒト免疫グロブリン(immuglobulins)由来の定常領域を含む。
【０１５２】
キメラ抗体を作製するため、ヒトＴＳＬＰＲクローン１Ｄ６.Ｃ９に対するマウス抗体の可変領域を、ＰＣＲ技術と、カセットベクターにクローニングするためにデザインされた実施例１に記載のプライマー配列を用いて作製した。次に、これらのＰＣＲ産物を、表１に示される配列を用いた、ヒト免疫グロブリンリーダー配列、Ｊ−セグメントおよびスプライサー−ドナーシグナルとのインフレーム融合物を含むカセットベクターにそれぞれクローニングした。次に、これらの配列を、例えばＳＰ２／０ベクターなど、ヒト免疫グロブリン定常領域を含む哺乳類発現ベクターに移入した。
【表１】
【０１５３】
この重鎖を発現するクローンの選択はネオマイシン選択に基づき、一方、軽鎖を発現するクローンはｄｈｆｒ選択を用いて選択した。遺伝子増幅はメトトレキサートを用いて誘導した。重鎖の可変領域カセットをそれぞれヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４哺乳類発現ベクターに移入した。
【０１５４】
このサブクローニングの後、ＩｇＧ１キメラ抗体を生産するため、キメラＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖のＤＮＡプラスミドをＳＰ２／０骨髄腫細胞に同時エレクトロポレーションを行った。同様に、ＩｇＧ４キメラ抗体を生産するため、キメラＩｇＧ４重鎖およびκ軽鎖をＳＰ２／０骨髄腫細胞に同時エレクトロポレーションを行った。細胞をゲネチシンで選択した後、ゲネチシンとメトトレキサートを含有する増殖培地で培養および拡張した。抗体を精製するため、細胞を無血清培地に適応させた。トランスフェクトされたＳＰ２／０細胞から分泌されたキメラＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体を精製した(図２Ａおよび図２Ｂ)。精製されたキメラＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体のアンタゴニスト活性を、Ｌｕｃリポーターアッセイにおいてマウス抗体の場合と比較した。デス受容体５(ＤＲ５)に対するＩｇＧ１キメラ抗体を陰性対照として用いた。ｈＴＳＬＰＲ、ｈＩＬ７ＲαおよびＳｔａｔ５−Ｌｕｃを過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞におけるリポーター遺伝子発現により評価されるように、これらの結果は、これらのキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体がマウスＩｇＧ１抗体と同様のアンタゴニスト活性を示したことを示唆する(図６)。
【０１５５】
実施例３. 抗ｈＴＳＬＰＲ抗体はＴＳＬＰにより媒介されるＴＡＲＣ分泌を阻害する
本実施例は、抗ｈＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体によるヒト単球からの、ＴＳＬＰにより媒介されるＴＡＲＣ分泌(section)の阻害について記載する。上記のマウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の双方を、ヒト単球による、ＴＨ２誘引胸腺活性化調節ケモカイン(ＴＡＲＣ)のＴＳＬＰにより媒介される分泌に対する作用に関して調べた。ＴＡＲＣ分泌アッセイは、抗ｈＴＳＬＰＲ抗体を添加すること以外、本質的にSoumelis et al., Nat Immunol. 3:673-80, 2002に記載されているようにして行った。結果を図７に示す。図の上の２つのパネルはそれぞれ、ＴＳＬＰで刺激されたヒト単球およびＣＤ１１＋樹状細胞からのＴＡＲＣ分泌(section)を示す。下の３つのパネルはそれぞれ、ヒト単球からのＴＳＬＰにより媒介されるＴＡＲＣ分泌(section)に対する３つの異なる抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の作用を示す。この図に示されているように、マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体およびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(ＩｇＧ１イソ型およびＩｇＧ４イソ型の双方)は全て、ヒト単球からのＴＡＲＣ分泌を用量依存的に阻害することができる。これによりさらに、ＴＳＬＰシグナル伝達に対する抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の拮抗活性が確認された。
【０１５６】
抗ｈＴＳＬＰＲ抗体の結合親和性を判定するための結合試験を、「オン」率(ｋａ)および「オフ」率(ｋｄ)を測定するための標準的なBiacoreプラズモン共鳴分析を用いて行った。これらの測定から抗体の結合定数(ＫＤ)が計算される。また、液相の結合速度を調べるためのさらなる分析を行った。さらに、細胞アッセイを用いて抗体のＩＣ５０を求めた。これらの試験の結果を表３にまとめる。
【表２】
【０１５７】
抗体配列
NV115-3B配列
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS (配列番号22)
VK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHTRLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRASGVPDRFSGTGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK (配列番号23)
NV115-3E配列
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS (配列番号24)
VK
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSLAWYQQKPGQPPKLLIHWAVTRVSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK (配列番号25)
NV115-3E配列
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGISWLRQAPGQGLEWMGWVNTNTGNPRYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGFITTVVGAAGRFVYWGQGTLVTVSS (配列番号26)
VK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIHTRLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLRAEDVAVYYCQQYSTYPTFGQGTKLEIK (配列番号27)
【０１５８】
以上、本発明を、理解を明確にするために例および実施例を示してある程度詳細に記載したが、当業者ならば本発明の教示に照らして、添付の特許請求の精神または範囲から逸脱することなく、それに対して特定の変更および修飾を行うことができることが容易に明らかとなろう。
【０１５９】
本明細書に引用される刊行物、データベース、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および特許出願はその各々が具体的かつ個々に出典明示により本明細書の一部とされることが示されている場合と同様に、出典明示により本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα細胞においてｈＴＳＬＰ依存性細胞増殖を用いた抗ＴＳＬＰＲアンタゴニスト抗体のスクリーニングを示す。
【図２】マウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体の精製を示す。Ａ：キメラＩｇＧ１抗体；Ｂ：キメラＩｇＧ４抗体；およびＣ：マウスＩｇＧ１抗体。
【図３】細胞増殖アッセイおよびルシフェラーゼリポーターアッセイによる精製マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体(クローン１Ｄ６.Ｃ９)のアンタゴニスト活性を示す。Ａ：Ｂａ／Ｆ３−ｈＴＳＬＰＲ−ｈＩＬ７Ｒα細胞の増殖；Ｂ：ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞の増殖；およびＣ：ＢａＦ３／ｈＴＳＬＰＲ／ｈＩＬ７Ｒα／Ｓｔａｔ５−Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性。
【図４】マウス抗ｈＴＳＬＰＲモノクローナル抗体１Ｄ６.Ｃ９クローンの可変領域のヌクレオチド配列。
【図５】マウス抗ｈＴＳＬＰＲ抗体クローン１Ｄ６.Ｃ９の可変領域アミノ酸配列を示す。相補性決定領域(ＣＤＲ)およびフレームワーク領域(ＦＲ)は下線の残基または斜体の残基で示される。
【図６】ｈＴＳＬＰＲ、ｈＩＬ７ＲαおよびＳｔａｔ５−Ｌｕｃを過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞における精製マウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体のアンタゴニスト活性を含むルシフェラーゼリポーターアッセイの結果を示す。
【図７】マウスおよびキメラ抗ｈＴＳＬＰＲ抗体によるヒト単球由来ＴＳＬＰ媒介ＴＡＲＣ分泌(section)の阻害を示す。
【図８】抗体結合ドメインの同定を示す−ＴＳＬＰＲ抗体は不連続エピトープと結合する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５の重鎖可変領域配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
配列番号５の重鎖可変領域配列と配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
ＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)もしくはＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)の重鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)配列、またはＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)もしくはＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)の軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号５と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号６と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
マウス抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
キメラ抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項８】
ヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ヒト化抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項１１】
単鎖抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項１２】
Ｆａｂフラグメントである、請求項２に記載の抗体。
【請求項１３】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４イソ型である、請求項２に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項２に記載の抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする単離されたまたは組み換えポリヌクレオチド。
【請求項１５】
抗体がヒト抗体である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記抗体をコードするポリヌクレオチドが重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記抗体が配列番号５の成熟領域と少なくとも８０％同一である成熟重鎖可変領域配列と、配列番号６の成熟領域と少なくとも８０％同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記抗体が配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列と、配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ＤＮＡである、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
(１)請求項２に記載の抗体の重鎖をコードする組み換えＤＮＡセグメントと(２)該抗体の軽鎖をコードする第二の組み換えＤＮＡセグメントを含む、単離された宿主細胞であって、該ＤＮＡセグメントがそれぞれ第一および第二のプロモーターに作動可能なように連結され、かつ、前記宿主細胞で発現することができる、宿主細胞。
【請求項２１】
前記モノクローナル抗体がヒト抗体である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記モノクローナル抗体が重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記抗体が配列番号５の成熟領域と少なくとも８０％同一である成熟重鎖可変領域配列と、配列番号６の成熟領域と少なくとも８０％同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記モノクローナル抗体が配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列と、配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
非ヒト哺乳類細胞系統である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
対象において炎症性障害を処置する方法であって、その対象に請求項２に記載の有効量の抗体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記抗体がヒト抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が(ｉ)配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列と(ｉｉ)配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象がアレルギー性炎症性疾患に罹患している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記アレルギー性炎症性疾患がアトピー性皮膚炎、喘息またはアレルギー性鼻炎である、請求項３１に記載の方法。
【請求項１】
配列番号５の重鎖可変領域配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
配列番号５の重鎖可変領域配列と配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
ＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)もしくはＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)の重鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)配列、またはＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)もしくはＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)の軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号５と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号６と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
マウス抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
キメラ抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項８】
ヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ヒト化抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項１１】
単鎖抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項１２】
Ｆａｂフラグメントである、請求項２に記載の抗体。
【請求項１３】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４イソ型である、請求項２に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項２に記載の抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする単離されたまたは組み換えポリヌクレオチド。
【請求項１５】
抗体がヒト抗体である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記抗体をコードするポリヌクレオチドが重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記抗体が配列番号５の成熟領域と少なくとも８０％同一である成熟重鎖可変領域配列と、配列番号６の成熟領域と少なくとも８０％同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記抗体が配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列と、配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ＤＮＡである、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
(１)請求項２に記載の抗体の重鎖をコードする組み換えＤＮＡセグメントと(２)該抗体の軽鎖をコードする第二の組み換えＤＮＡセグメントを含む、単離された宿主細胞であって、該ＤＮＡセグメントがそれぞれ第一および第二のプロモーターに作動可能なように連結され、かつ、前記宿主細胞で発現することができる、宿主細胞。
【請求項２１】
前記モノクローナル抗体がヒト抗体である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記モノクローナル抗体が重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記抗体が配列番号５の成熟領域と少なくとも８０％同一である成熟重鎖可変領域配列と、配列番号６の成熟領域と少なくとも８０％同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記モノクローナル抗体が配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列と、配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
非ヒト哺乳類細胞系統である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
対象において炎症性障害を処置する方法であって、その対象に請求項２に記載の有効量の抗体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記抗体がヒト抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＴＹＧＭＳ(配列番号７)、ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＲＹＡＤＤＦＫＧ(配列番号８)およびＥＧＦＩＴＴＶＶＧＡＡＧＲＦＶＹ(配列番号９)と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、それぞれＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ(配列番号１０)、ＷＡＳＴＲＨＴ(配列番号１１)およびＱＱＹＳＴＹＰＴ(配列番号１２)を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が(ｉ)配列番号５の成熟領域と同一である成熟重鎖可変領域配列と(ｉｉ)配列番号６の成熟領域と同一である成熟軽鎖可変領域配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象がアレルギー性炎症性疾患に罹患している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記アレルギー性炎症性疾患がアトピー性皮膚炎、喘息またはアレルギー性鼻炎である、請求項３１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５２３４２６（Ｐ２００９−５２３４２６Ａ）
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５０５１４（Ｐ２００８−５５０５１４）
【出願日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６０３７９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１２１４６
【国際公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【出願人】（５０３２６１５２４）アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (158)
【氏名又は名称原語表記】ＩＲＭ，ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６０３７９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１２１４６
【国際公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【出願人】（５０３２６１５２４）アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (158)
【氏名又は名称原語表記】ＩＲＭ，ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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