アンモニア脱臭法ならびにアンモニア脱臭能を有する新規なクロレラブルガリスおよびアンモニア脱臭能を有する新規なクロレラブルガリスを含むバイオマスならびに飼料添加物
【課題】大量の曝気やメタノールなどの炭素源の添加などの操作を必要としない、優れた脱臭能力を有するアンモニア脱臭法を提供する。
【解決手段】自然界から単離した受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２を有するクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、優れたアンモニア脱臭能を有する新規なクロレラブルガリスである。この新規なクロレラブルガリスは、培養過程でアンモニアを脱臭するとともに、生育したクロレラブルガリス自身は、新規バイオマスであり、飼料の有効成分と為すことが出来る。
【解決手段】自然界から単離した受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２を有するクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、優れたアンモニア脱臭能を有する新規なクロレラブルガリスである。この新規なクロレラブルガリスは、培養過程でアンモニアを脱臭するとともに、生育したクロレラブルガリス自身は、新規バイオマスであり、飼料の有効成分と為すことが出来る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロレラブルガリスを用いたアンモニア脱臭法ならびにアンモニア脱臭能を有する新規なクロレラブルガリス、およびアンモニア脱臭能を有する新規なクロレラブルガリスを含むバイオマスならびに飼料添加物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現状では、家畜糞尿は一定期間曝気処理されたのち液肥などに使用されるが、依然としてアンモニア等の悪臭が残る。また化学肥料の多用によって、利用されない糞尿が漸増しており、このため環境汚染を引き起こす懸念が高まっている。脱臭技術としては硝化細菌やアンモニア酸化細菌等の脱窒細菌等を用いた方法がある。例えば、非特許文献１，２，３には、硝化細菌を使用したアンモニア脱臭技術が、また特許文献４には、脱窒細菌を用いた窒素除去、脱臭技術が紹介されている。
【０００３】
【非特許文献１】余村吉則，小山田組，野田健史，土屋博嗣，宮澤邦夫，‘アンモニア臭気に対する生物脱臭技術，ＮＫＫ技報，Ｎｏ．１７８，８１〜８６（２００２）
【非特許文献２】Ｓａｔｏｈ Ｈ，Ｙａｍａｋａｗａｂ Ｔ，Ｋｉｎｄａｉｃｈｉ Ｔ，Ｉｔｏ Ｔ，Ｏｋａｂｅ Ｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ−ｔｒｅａｔｉｎｇ ｂｉｏｆｉｌｍｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００６ １３；［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］ＰＭＩＤ：１６４７７６６１［ＰｕｂＭｅｄ−ａｓ ｓｕｐｐｌｉｅｄ ｂｙ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ］
【非特許文献３】Ｍｏｔａ Ｃ，Ｒｉｄｅｎｏｕｒｅ Ｊ，Ｃｈｅｎｇ Ｊ，ｄｅ Ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ ＦＬ ３ｒｄ．Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔｌｙ ａｅｒａｔｅｄ ｒｅａｃｔｏｒｓ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｈｉｇｈ ａｍｍｏｎｉａ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｅｃｏｌ．２００５；５４：３９１−４００
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｅ Ｓ，Ｏｇａｗａ Ｔ，Ｍａｋｉｎｏ Ｈ，Ｈｉｒｏｓａｗａ Ｈ，Ｔｓｕｎｅｄａ Ｓ，Ｈｉｒａｔａ Ａ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｈｏｗｉｎｇ ｈｉｇｈ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｓａｌｉｎｅ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ．Ｌｅｔｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６；４２：２７７−２８３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１〜３に記載されているようなアンモニア酸化細菌を用いたアンモニア脱臭には、アンモニア酸化細菌の生育には酸素が必要であることから、大量の曝気が必要となる。また、非特許文献４に記載されている脱窒細菌によるアンモニアのガス化には、炭素源としてメタノールを添加する必要があり、コスト高になるという問題がある。とくに、硝化・酸化と脱窒素が必要とされる場合には、硝化・酸化や脱窒素を行うそれぞれの細菌が好気性と嫌気性であるので、直列型の処理になり同時処理が出来ない、また、処理槽の分割・曝気処理が必要になるなど、複雑な工程とならざるを得ないという問題もある。またアンモニア酸化細菌や脱窒細菌等微生物を用いた方法は機構がまた判明しない面も多く、制御が困難である。
【０００５】
そこで本発明で解決しようとする点は、これまで提案されているアンモニア酸化細菌や脱窒細菌等微生物を用いた場合に指摘されている種々の問題点を克服せんとするものである。すなわち、藻類の有する高い窒素同化能に着目し、アンモニア脱臭能を有する新しい藻類を見出して優れたアンモニア脱臭技術の確立をめざすことである。またその藻類が可及的に最大の脱臭能を発揮する培養条件について新たな技術提案を行うことである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、土壌中から有機物を活発に分解し、窒素利用に優れた微細藻類（クロレラ）を単離し、水溶液中でのアンモニア除去能を調べたところ、クロレラブルガリスのうち、特に、本出願人が独立行政法人産業技術総合研究所に寄託して平成１８年６月２６日に受領した受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２を有するクロレラブルガリス（以下、「クロレラブルガリスＮＴＭ０６」と称す。）が優れた脱臭能を有していることを見出し本発明に至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、クロレラブルガリスＮＴＭ０６を用いたアンモニア脱臭法である。豚糞消化液などのアンモニアを含む水溶液中にクロレラブルガリスＮＴＭ０６を添加すると、その直後に、アンモニア量が速やかに減少することがわかった。
【０００８】
また、本発明者は、種々の鋭意研究の結果、クロレラブルガリスＮＴＭ０６を、死菌よりも生菌の状態で用いた方がアンモニアの減少比が大きくなることがわかった。すなわち、本発明のアンモニア脱臭法においては、用いるクロレラブルガリスは、アンモニアを含む水溶液中で生存可能なものである方が望ましい。これは、クロレラブルガリスＮＴＭ０６が、細胞表層吸着よりも細胞内への取り込みによってアンモニア脱臭を行っている可能性が高いことを示唆している。さらに、このクロレラブルガリスＮＴＭ０６によるアンモニア脱臭において、水溶液中のアンモニア濃度が高ければ高いほどアンモニアの減少比が高いことがわかった。
【０００９】
また、本発明のアンモニア脱臭法で用いるクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、グルタミン酸を０．１〜１．５％添加した培地で培養したり、培養後２４〜４８時間、４℃にて飢餓状態に置いたりすると、さらに脱臭能が向上することがわかった。したがって、これらの方法で培養されたクロレラブルガリスＮＴＭ０６を用いることにより、本発明のアンモニア脱臭法を、さらに脱臭能力の高い脱臭法とすることができる。
【００１０】
また、本発明のアンモニア脱臭法で用いるアンモニア脱臭能を有するクロレラブルガリスＮＴＭ０６ならびにアンモニア脱臭の過程で生育したクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、バイオマスや、水産、畜産の飼料添加物として有効である。たとえば、植物に関しては、堆肥に混合させたり、動物に関しては、飼料に混合して栄養価を高めたりすることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、クロレラブルガリスＮＴＭ０６を用いることで、優れた脱臭能力を有し、上記従来の方法で問題となっていた、大量の曝気やメタノールなどの炭素源の添加などの操作が不必要で、処理工程を簡略化することが可能なアンモニア脱臭法とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態におけるクロレラブルガリスを用いたアンモニア脱臭法について詳細に説明する。本実施の形態にかかるアンモニア脱臭法に用いるクロレラブルガリスは、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２のクロレラブルガリスＮＴＭ０６である。以下、このクロレラブルガリスＮＴＭ０６の単離方法や形態解析の結果について説明する。
【実施例】
【００１３】
（実施例１）クロレラブルガリスＮＴＭ０６の単離方法
自然界から土壌を採取し、その１ｇに滅菌生理食塩水を１０ｍｌ添加し、十分攪拌した。この懸濁液５０μｌを、酵母培養等に汎用されるＹＰＤ培地にストリークして培養した。このＹＰＤ培地（Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ製）：２０ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（日本製薬製）：１０ｇ，ｇｌｕｃｏｓｅ：２０ｇ，ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ，ｐＨ７．０）は、寒天（ナカライテスク製）を１．５％になるよう添加した後、オートクレーブ滅菌し、滅菌後に約５０℃付近まで冷ました後、１００μｇ／ｍｌになるように抗生物質クロラムフェニコール（和光純薬製）を添加し、シャーレに固化させた（ＹＰＤ平板培地）ものである。
【００１４】
暗所で３０℃、２４時間保温の結果、４日で、緑色のコロニーを形成する微生物を肉眼で観察できるようになった。コロニーの形状は酵母によく似ているが、濃い緑色を呈していた。ＹＰＤ液体培地にて３０℃で３日間振盪培養すると、培地は深い緑色を呈した。この緑色コロニーを再度平板培地に移し、シングルコロニーアイソレーションを繰り返し、単離クロレラ菌とした。単離したクロレラの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、ホモロジーを検索すると、単離クロレラ菌はクロレラブルガリスに最も近縁であった。単離微生物はその生理学的性質からクロレラブルガリスの新種と考えられ、この単離微生物をクロレラブルガリスＮＴＭ０６と命名した。
【００１５】
単離したクロレラの光学顕微鏡写真を図１に、蛍光顕微鏡（励起波長：５４５±１５ｎｍ、放出波長：６１０±３７．５ｎｍ）を図２に示す。単離微生物を光学顕微鏡で観察すると、図１に示すように、細胞形態は球形で大きさは５−９μｍであり、細菌ではないことがわかった。ＵＶ励起下、蛍光顕微鏡で観察すると図２に示すように赤い発色が見られた。葉緑体はＵＶ励起下では赤く発色するので、分離微生物は葉緑体を持つことが考えられた。なお、ＹＰＤ液体培地における生育最適温度およびｐＨは、それぞれ３５〜４０℃、７．０であった。
【００１６】
なお、暗所での保温は、２０〜４０℃、好ましくは３０℃前後の温度で３〜７日程度培養するとよい。この場合の培養では光照射はあっても、なくてもかまわない。
コロニー形成を肉眼確認（約４日）の後、低温（例えば、４℃）で保管し保存菌株とする。この保存菌株は数ヶ月毎、標準的には４か月毎で新しいＹＰＤ寒天平板培地に植え替える。
【００１７】
（実施例２）クロレラブルガリスＮＴＭ０６のアンモニア脱臭能の評価
実施例１で保管した保存菌株から白金耳を用いてコロニーをかきとり、ＹＰＤ液体培地に植え付け、好ましくは３７℃で数日間（例えば、４日間）、震盪培養する。これを前培養菌体とする。前培養菌体を、グルタミン酸を０．１〜１．５％含むＹＰＤ培地に移し、同様の培養条件で震盪培養する。この培養液をさらに低温（例えば、４℃）で一日前後静置することによって得られるクロレラブルガリスＮＴＭ０６をアンモニア脱臭に使用することができる。クロレラブルガリスＮＴＭ０６は自重で沈澱しているので、培地の上澄のみを廃棄することが好ましい。
【００１８】
単離したクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、酢酸資化能が高いので、低級脂肪酸の同化と光合成が共役していることが考えられた。そこで低級脂肪酸等を含むと思われる豚糞消化液を用いて、光照射培養を試みた。
【００１９】
固液分離した豚糞消化液のアンモニア濃度を血中アンモニア比色定量法にて求め、アンモニア濃度が例えば、２００〜３００ｐｐｍになるように希釈し、また、ｐＨが酢酸や乳酸を用いて中性からｐＨ６．０の間となるように調整した。この豚糞消化液に、前述の条件にて培養されたクロレラブルガリスＮＴＭ０６を１ｍｌあたり１０８〜１０１０個、最終濃度が２×１０１０／ｍｌとなるように添加し、緩やかに撹拌し、そのまま静置した。すると、６０分でアンモニア濃度を３５ｐｐｍまで減少させることができた（図３、参照。）。
【００２０】
また、アンモニア濃度が５０ｐｐｍの豚糞消化液に、クロレラブルガリスＮＴＭ０６を最終濃度が２×１０１０／ｍｌとなるように添加すると、３６時間でアンモニア濃度が０になりアンモニア臭を完全に取り除くことができた（図４、参照）。
【００２１】
（実施例３）（グルタミン酸を添加した培地で培養したクロレラブルガリスＮＴＭ０６アンモニア脱臭能の評価）
実施例１で保管した保存菌株から白金耳を用いてコロニーをかきとり、グルタミン酸０．１〜０．５％を含むＹＰＤ培地で培養し、これをアンモニア脱臭に用いた。グルタミン酸を添加したＹＰＤ培地で培養されたものは、ＹＰＤ培地のみで培養されたものよりアンモニア吸収速度が２０〜３０％増加することがわかった。
【００２２】
（実施例４）クロレラブルガリスＮＴＭ０６の培地
実施例１におけるクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、ＹＰＤ培地で最もよく生育した。そこで、グルコース濃度を変えて得られる菌体量を調べた。すると、３０℃培養においてグルコースをまったく含まない培地では１２０時間の培養で１０ｇ湿重量／ｌ弱が得られたが、グルコース濃度３％にすると約５０ｇ／ｌもの菌体を得ることができた。１％では３５ｇ／ｌ程度、４％になると生育は阻害された。このように、ＹＰＤ培地に含まれるグルコース濃度は、簡単な培地で多くのクロレラブルガリスＮＴＭ０６を得るための重要な要素であることがわかった。
【００２３】
以下に示す無機塩のみで、有機物を含まない培地（ＭＢＭ培地）を調製し、片方はアルミ遮光し、もう一方は蛍光灯の光りを当てて３０℃で７日間震盪培養したところ、光りを当てたほうは薄い緑色を呈し、遮光したほうは透明のままであった。このことは二酸化炭素固定能があることを示している。
【００２４】
ＭＢＭ培地
ｘ１ ＭＢＭｍｅｄｉｕｍをオートクレーブ滅菌し、濾過滅菌したｘ１００ Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅとｘ１００ Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅをそれぞれ１００分の１量加えて使用した。組成は以下に示す。
ｘ１ ＭＢＭ ｍｅｄｉｕｍ：
ＫＮＯ３２５ｍｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ７．５ｍｇ，Ｋ２ＨＰＯ４７．５ｍｇ，ＫＨ２ＰＯ４１７．５ｍｇ，ＮａＣｌ２．５ｍｇ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ１ｍｇ，Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅ０．１ｍｌ，Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ０．１ｍｌ，
Ｄ．Ｗ．９９．８ｍｌ，ｐＨ６．０
ｘ１００ Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅ：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１ｇ，Ｄ．Ｗ．５００ｍｌ，Ｈ２ＳＯ４ ｔｗｏ ｄｒｏｐｓ
ｘ１００ Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ：Ｈ３ＢＯ３２８６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２５０ｍｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２２．２ｍｇ，ＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏ７．９ｍｇ，Ｎａ２ＭｏＯ４２．１ｍｇ，Ｄ．Ｗ．１００ｍｌ
【００２５】
単離されたクロレラブルガリスＮＴＭ０６のＭＢＭ培地を用いた暗条件培養において、イーストナイトロジェンベースの添加（１％）では増殖は見られなかったが、グルコースを０．５％になるように添加すると増殖するようになった。暗条件における炭素源の資化性を以下に示す。以下の結果よりクロレラブルガリスＮＴＭ０６はヘテロトロフィックな性質を有する。
グルコース、＋
スクロース、＋
マルトース、＋
ガラクトース、＋
可溶性でんぷん、＋
カルボキシメチルセルロース、＋
イヌリン、＋
酢酸、＋
セロビオース、−
ラクトース、−
キシロース、−
ラフィノース、−
ソルボース、−
メチルアルコール、−
【００２６】
窒素源の利用性を調べるため、グルコースを１．０％になるように添加したＭＢＭ培地を調製した。クロレラブルガリスＮＴＭ０６を培地に植え付け、暗条件培養にて、３０℃、４日間、震盪培養し、増殖の有無を確かめた。以下に窒素源の利用性を示す。
ＫＮＯ３＋
ＮａＮＯ３＋
（ＮＨ４）Ｃｌ＋
（ＮＨ４）２ＳＯ４＋
Ｇｌｙｃｉｎｅ＋
なし ＋
上記のように、窒素源が存在しなくても弱い増殖が認められたので、クロレラブルガリスＮＴＭ０６には窒素固定能が備わっていると考えられる。
【００２７】
クロレラブルガリスＮＴＭ０６はＹＰＤ平板培地を用いて酸素を除去した嫌気条件での生育を確認しているので、発酵または嫌気呼吸を行うこともできる。その場合は光照射が必要であるので、光合成と共役していると予想される。
【００２８】
（実施例５）クロレラブルガリスＮＴＭ０６を含む飼料添加物
アンモニア脱臭工程で得られたクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、簡単な水洗・水切りをして、あるいは、乾燥工程を経て得られたものを、飼料に添加することができる。例えば、培養されたクロレラブルガリスＮＴＭ０６の懸濁液を遠心分離にかけ、水洗を繰り返した後、脱水する。脱水して得られた高濃度のクロレラブルガリスＮＴＭ０６懸濁液を加熱処理して冷却した後、凍結乾燥させて乾燥クロレラブルガリスＮＴＭ０６を得ることも可能である。なお、クロレラブルガリスＮＴＭ０６の消化吸収を助けるため、細胞膜破砕加工を施すことも目的に応じて採用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、クロレラブルガリスＮＴＭ０６を用いることで優れた脱臭能力を有するアンモニア脱臭法として有用である。また、大量の曝気やメタノールなどの炭素源の添加などの操作を必要としないので、操作や制御が容易でコストの低いアンモニア脱臭法として好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】単離したクロレラの光学顕微鏡写真である。
【図２】単離したクロレラの蛍光顕微鏡写真である。
【図３】アンモニア濃度２００ｐｐｍ豚糞消化液のアンモニア濃度の減衰の時間経過を示す図である。
【図４】アンモニア濃度５０ｐｐｍ豚糞消化液界面（検知管を用いた測定）のアンモニア濃度の減衰の時間経過を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロレラブルガリスを用いたアンモニア脱臭法ならびにアンモニア脱臭能を有する新規なクロレラブルガリス、およびアンモニア脱臭能を有する新規なクロレラブルガリスを含むバイオマスならびに飼料添加物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現状では、家畜糞尿は一定期間曝気処理されたのち液肥などに使用されるが、依然としてアンモニア等の悪臭が残る。また化学肥料の多用によって、利用されない糞尿が漸増しており、このため環境汚染を引き起こす懸念が高まっている。脱臭技術としては硝化細菌やアンモニア酸化細菌等の脱窒細菌等を用いた方法がある。例えば、非特許文献１，２，３には、硝化細菌を使用したアンモニア脱臭技術が、また特許文献４には、脱窒細菌を用いた窒素除去、脱臭技術が紹介されている。
【０００３】
【非特許文献１】余村吉則，小山田組，野田健史，土屋博嗣，宮澤邦夫，‘アンモニア臭気に対する生物脱臭技術，ＮＫＫ技報，Ｎｏ．１７８，８１〜８６（２００２）
【非特許文献２】Ｓａｔｏｈ Ｈ，Ｙａｍａｋａｗａｂ Ｔ，Ｋｉｎｄａｉｃｈｉ Ｔ，Ｉｔｏ Ｔ，Ｏｋａｂｅ Ｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ−ｔｒｅａｔｉｎｇ ｂｉｏｆｉｌｍｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００６ １３；［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］ＰＭＩＤ：１６４７７６６１［ＰｕｂＭｅｄ−ａｓ ｓｕｐｐｌｉｅｄ ｂｙ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ］
【非特許文献３】Ｍｏｔａ Ｃ，Ｒｉｄｅｎｏｕｒｅ Ｊ，Ｃｈｅｎｇ Ｊ，ｄｅ Ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ ＦＬ ３ｒｄ．Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔｌｙ ａｅｒａｔｅｄ ｒｅａｃｔｏｒｓ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｈｉｇｈ ａｍｍｏｎｉａ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｅｃｏｌ．２００５；５４：３９１−４００
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｅ Ｓ，Ｏｇａｗａ Ｔ，Ｍａｋｉｎｏ Ｈ，Ｈｉｒｏｓａｗａ Ｈ，Ｔｓｕｎｅｄａ Ｓ，Ｈｉｒａｔａ Ａ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｈｏｗｉｎｇ ｈｉｇｈ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｓａｌｉｎｅ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ．Ｌｅｔｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６；４２：２７７−２８３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１〜３に記載されているようなアンモニア酸化細菌を用いたアンモニア脱臭には、アンモニア酸化細菌の生育には酸素が必要であることから、大量の曝気が必要となる。また、非特許文献４に記載されている脱窒細菌によるアンモニアのガス化には、炭素源としてメタノールを添加する必要があり、コスト高になるという問題がある。とくに、硝化・酸化と脱窒素が必要とされる場合には、硝化・酸化や脱窒素を行うそれぞれの細菌が好気性と嫌気性であるので、直列型の処理になり同時処理が出来ない、また、処理槽の分割・曝気処理が必要になるなど、複雑な工程とならざるを得ないという問題もある。またアンモニア酸化細菌や脱窒細菌等微生物を用いた方法は機構がまた判明しない面も多く、制御が困難である。
【０００５】
そこで本発明で解決しようとする点は、これまで提案されているアンモニア酸化細菌や脱窒細菌等微生物を用いた場合に指摘されている種々の問題点を克服せんとするものである。すなわち、藻類の有する高い窒素同化能に着目し、アンモニア脱臭能を有する新しい藻類を見出して優れたアンモニア脱臭技術の確立をめざすことである。またその藻類が可及的に最大の脱臭能を発揮する培養条件について新たな技術提案を行うことである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、土壌中から有機物を活発に分解し、窒素利用に優れた微細藻類（クロレラ）を単離し、水溶液中でのアンモニア除去能を調べたところ、クロレラブルガリスのうち、特に、本出願人が独立行政法人産業技術総合研究所に寄託して平成１８年６月２６日に受領した受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２を有するクロレラブルガリス（以下、「クロレラブルガリスＮＴＭ０６」と称す。）が優れた脱臭能を有していることを見出し本発明に至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、クロレラブルガリスＮＴＭ０６を用いたアンモニア脱臭法である。豚糞消化液などのアンモニアを含む水溶液中にクロレラブルガリスＮＴＭ０６を添加すると、その直後に、アンモニア量が速やかに減少することがわかった。
【０００８】
また、本発明者は、種々の鋭意研究の結果、クロレラブルガリスＮＴＭ０６を、死菌よりも生菌の状態で用いた方がアンモニアの減少比が大きくなることがわかった。すなわち、本発明のアンモニア脱臭法においては、用いるクロレラブルガリスは、アンモニアを含む水溶液中で生存可能なものである方が望ましい。これは、クロレラブルガリスＮＴＭ０６が、細胞表層吸着よりも細胞内への取り込みによってアンモニア脱臭を行っている可能性が高いことを示唆している。さらに、このクロレラブルガリスＮＴＭ０６によるアンモニア脱臭において、水溶液中のアンモニア濃度が高ければ高いほどアンモニアの減少比が高いことがわかった。
【０００９】
また、本発明のアンモニア脱臭法で用いるクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、グルタミン酸を０．１〜１．５％添加した培地で培養したり、培養後２４〜４８時間、４℃にて飢餓状態に置いたりすると、さらに脱臭能が向上することがわかった。したがって、これらの方法で培養されたクロレラブルガリスＮＴＭ０６を用いることにより、本発明のアンモニア脱臭法を、さらに脱臭能力の高い脱臭法とすることができる。
【００１０】
また、本発明のアンモニア脱臭法で用いるアンモニア脱臭能を有するクロレラブルガリスＮＴＭ０６ならびにアンモニア脱臭の過程で生育したクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、バイオマスや、水産、畜産の飼料添加物として有効である。たとえば、植物に関しては、堆肥に混合させたり、動物に関しては、飼料に混合して栄養価を高めたりすることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、クロレラブルガリスＮＴＭ０６を用いることで、優れた脱臭能力を有し、上記従来の方法で問題となっていた、大量の曝気やメタノールなどの炭素源の添加などの操作が不必要で、処理工程を簡略化することが可能なアンモニア脱臭法とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態におけるクロレラブルガリスを用いたアンモニア脱臭法について詳細に説明する。本実施の形態にかかるアンモニア脱臭法に用いるクロレラブルガリスは、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２のクロレラブルガリスＮＴＭ０６である。以下、このクロレラブルガリスＮＴＭ０６の単離方法や形態解析の結果について説明する。
【実施例】
【００１３】
（実施例１）クロレラブルガリスＮＴＭ０６の単離方法
自然界から土壌を採取し、その１ｇに滅菌生理食塩水を１０ｍｌ添加し、十分攪拌した。この懸濁液５０μｌを、酵母培養等に汎用されるＹＰＤ培地にストリークして培養した。このＹＰＤ培地（Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ製）：２０ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（日本製薬製）：１０ｇ，ｇｌｕｃｏｓｅ：２０ｇ，ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ，ｐＨ７．０）は、寒天（ナカライテスク製）を１．５％になるよう添加した後、オートクレーブ滅菌し、滅菌後に約５０℃付近まで冷ました後、１００μｇ／ｍｌになるように抗生物質クロラムフェニコール（和光純薬製）を添加し、シャーレに固化させた（ＹＰＤ平板培地）ものである。
【００１４】
暗所で３０℃、２４時間保温の結果、４日で、緑色のコロニーを形成する微生物を肉眼で観察できるようになった。コロニーの形状は酵母によく似ているが、濃い緑色を呈していた。ＹＰＤ液体培地にて３０℃で３日間振盪培養すると、培地は深い緑色を呈した。この緑色コロニーを再度平板培地に移し、シングルコロニーアイソレーションを繰り返し、単離クロレラ菌とした。単離したクロレラの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、ホモロジーを検索すると、単離クロレラ菌はクロレラブルガリスに最も近縁であった。単離微生物はその生理学的性質からクロレラブルガリスの新種と考えられ、この単離微生物をクロレラブルガリスＮＴＭ０６と命名した。
【００１５】
単離したクロレラの光学顕微鏡写真を図１に、蛍光顕微鏡（励起波長：５４５±１５ｎｍ、放出波長：６１０±３７．５ｎｍ）を図２に示す。単離微生物を光学顕微鏡で観察すると、図１に示すように、細胞形態は球形で大きさは５−９μｍであり、細菌ではないことがわかった。ＵＶ励起下、蛍光顕微鏡で観察すると図２に示すように赤い発色が見られた。葉緑体はＵＶ励起下では赤く発色するので、分離微生物は葉緑体を持つことが考えられた。なお、ＹＰＤ液体培地における生育最適温度およびｐＨは、それぞれ３５〜４０℃、７．０であった。
【００１６】
なお、暗所での保温は、２０〜４０℃、好ましくは３０℃前後の温度で３〜７日程度培養するとよい。この場合の培養では光照射はあっても、なくてもかまわない。
コロニー形成を肉眼確認（約４日）の後、低温（例えば、４℃）で保管し保存菌株とする。この保存菌株は数ヶ月毎、標準的には４か月毎で新しいＹＰＤ寒天平板培地に植え替える。
【００１７】
（実施例２）クロレラブルガリスＮＴＭ０６のアンモニア脱臭能の評価
実施例１で保管した保存菌株から白金耳を用いてコロニーをかきとり、ＹＰＤ液体培地に植え付け、好ましくは３７℃で数日間（例えば、４日間）、震盪培養する。これを前培養菌体とする。前培養菌体を、グルタミン酸を０．１〜１．５％含むＹＰＤ培地に移し、同様の培養条件で震盪培養する。この培養液をさらに低温（例えば、４℃）で一日前後静置することによって得られるクロレラブルガリスＮＴＭ０６をアンモニア脱臭に使用することができる。クロレラブルガリスＮＴＭ０６は自重で沈澱しているので、培地の上澄のみを廃棄することが好ましい。
【００１８】
単離したクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、酢酸資化能が高いので、低級脂肪酸の同化と光合成が共役していることが考えられた。そこで低級脂肪酸等を含むと思われる豚糞消化液を用いて、光照射培養を試みた。
【００１９】
固液分離した豚糞消化液のアンモニア濃度を血中アンモニア比色定量法にて求め、アンモニア濃度が例えば、２００〜３００ｐｐｍになるように希釈し、また、ｐＨが酢酸や乳酸を用いて中性からｐＨ６．０の間となるように調整した。この豚糞消化液に、前述の条件にて培養されたクロレラブルガリスＮＴＭ０６を１ｍｌあたり１０８〜１０１０個、最終濃度が２×１０１０／ｍｌとなるように添加し、緩やかに撹拌し、そのまま静置した。すると、６０分でアンモニア濃度を３５ｐｐｍまで減少させることができた（図３、参照。）。
【００２０】
また、アンモニア濃度が５０ｐｐｍの豚糞消化液に、クロレラブルガリスＮＴＭ０６を最終濃度が２×１０１０／ｍｌとなるように添加すると、３６時間でアンモニア濃度が０になりアンモニア臭を完全に取り除くことができた（図４、参照）。
【００２１】
（実施例３）（グルタミン酸を添加した培地で培養したクロレラブルガリスＮＴＭ０６アンモニア脱臭能の評価）
実施例１で保管した保存菌株から白金耳を用いてコロニーをかきとり、グルタミン酸０．１〜０．５％を含むＹＰＤ培地で培養し、これをアンモニア脱臭に用いた。グルタミン酸を添加したＹＰＤ培地で培養されたものは、ＹＰＤ培地のみで培養されたものよりアンモニア吸収速度が２０〜３０％増加することがわかった。
【００２２】
（実施例４）クロレラブルガリスＮＴＭ０６の培地
実施例１におけるクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、ＹＰＤ培地で最もよく生育した。そこで、グルコース濃度を変えて得られる菌体量を調べた。すると、３０℃培養においてグルコースをまったく含まない培地では１２０時間の培養で１０ｇ湿重量／ｌ弱が得られたが、グルコース濃度３％にすると約５０ｇ／ｌもの菌体を得ることができた。１％では３５ｇ／ｌ程度、４％になると生育は阻害された。このように、ＹＰＤ培地に含まれるグルコース濃度は、簡単な培地で多くのクロレラブルガリスＮＴＭ０６を得るための重要な要素であることがわかった。
【００２３】
以下に示す無機塩のみで、有機物を含まない培地（ＭＢＭ培地）を調製し、片方はアルミ遮光し、もう一方は蛍光灯の光りを当てて３０℃で７日間震盪培養したところ、光りを当てたほうは薄い緑色を呈し、遮光したほうは透明のままであった。このことは二酸化炭素固定能があることを示している。
【００２４】
ＭＢＭ培地
ｘ１ ＭＢＭｍｅｄｉｕｍをオートクレーブ滅菌し、濾過滅菌したｘ１００ Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅとｘ１００ Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅをそれぞれ１００分の１量加えて使用した。組成は以下に示す。
ｘ１ ＭＢＭ ｍｅｄｉｕｍ：
ＫＮＯ３２５ｍｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ７．５ｍｇ，Ｋ２ＨＰＯ４７．５ｍｇ，ＫＨ２ＰＯ４１７．５ｍｇ，ＮａＣｌ２．５ｍｇ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ１ｍｇ，Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅ０．１ｍｌ，Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ０．１ｍｌ，
Ｄ．Ｗ．９９．８ｍｌ，ｐＨ６．０
ｘ１００ Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅ：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１ｇ，Ｄ．Ｗ．５００ｍｌ，Ｈ２ＳＯ４ ｔｗｏ ｄｒｏｐｓ
ｘ１００ Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ：Ｈ３ＢＯ３２８６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２５０ｍｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２２．２ｍｇ，ＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏ７．９ｍｇ，Ｎａ２ＭｏＯ４２．１ｍｇ，Ｄ．Ｗ．１００ｍｌ
【００２５】
単離されたクロレラブルガリスＮＴＭ０６のＭＢＭ培地を用いた暗条件培養において、イーストナイトロジェンベースの添加（１％）では増殖は見られなかったが、グルコースを０．５％になるように添加すると増殖するようになった。暗条件における炭素源の資化性を以下に示す。以下の結果よりクロレラブルガリスＮＴＭ０６はヘテロトロフィックな性質を有する。
グルコース、＋
スクロース、＋
マルトース、＋
ガラクトース、＋
可溶性でんぷん、＋
カルボキシメチルセルロース、＋
イヌリン、＋
酢酸、＋
セロビオース、−
ラクトース、−
キシロース、−
ラフィノース、−
ソルボース、−
メチルアルコール、−
【００２６】
窒素源の利用性を調べるため、グルコースを１．０％になるように添加したＭＢＭ培地を調製した。クロレラブルガリスＮＴＭ０６を培地に植え付け、暗条件培養にて、３０℃、４日間、震盪培養し、増殖の有無を確かめた。以下に窒素源の利用性を示す。
ＫＮＯ３＋
ＮａＮＯ３＋
（ＮＨ４）Ｃｌ＋
（ＮＨ４）２ＳＯ４＋
Ｇｌｙｃｉｎｅ＋
なし ＋
上記のように、窒素源が存在しなくても弱い増殖が認められたので、クロレラブルガリスＮＴＭ０６には窒素固定能が備わっていると考えられる。
【００２７】
クロレラブルガリスＮＴＭ０６はＹＰＤ平板培地を用いて酸素を除去した嫌気条件での生育を確認しているので、発酵または嫌気呼吸を行うこともできる。その場合は光照射が必要であるので、光合成と共役していると予想される。
【００２８】
（実施例５）クロレラブルガリスＮＴＭ０６を含む飼料添加物
アンモニア脱臭工程で得られたクロレラブルガリスＮＴＭ０６は、簡単な水洗・水切りをして、あるいは、乾燥工程を経て得られたものを、飼料に添加することができる。例えば、培養されたクロレラブルガリスＮＴＭ０６の懸濁液を遠心分離にかけ、水洗を繰り返した後、脱水する。脱水して得られた高濃度のクロレラブルガリスＮＴＭ０６懸濁液を加熱処理して冷却した後、凍結乾燥させて乾燥クロレラブルガリスＮＴＭ０６を得ることも可能である。なお、クロレラブルガリスＮＴＭ０６の消化吸収を助けるため、細胞膜破砕加工を施すことも目的に応じて採用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、クロレラブルガリスＮＴＭ０６を用いることで優れた脱臭能力を有するアンモニア脱臭法として有用である。また、大量の曝気やメタノールなどの炭素源の添加などの操作を必要としないので、操作や制御が容易でコストの低いアンモニア脱臭法として好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】単離したクロレラの光学顕微鏡写真である。
【図２】単離したクロレラの蛍光顕微鏡写真である。
【図３】アンモニア濃度２００ｐｐｍ豚糞消化液のアンモニア濃度の減衰の時間経過を示す図である。
【図４】アンモニア濃度５０ｐｐｍ豚糞消化液界面（検知管を用いた測定）のアンモニア濃度の減衰の時間経過を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２のクロレラブルガリスを用いたアンモニア脱臭法。
【請求項２】
前記クロレラブルガリスは、アンモニアを含む水溶液中で生存可能なものである請求項１記載のアンモニア脱臭法。
【請求項３】
前記クロレラブルガリスは、グルタミン酸を添加した培地で培養されたものである請求項１または２に記載のアンモニア脱臭法。
【請求項４】
アンモニア脱臭能を有する受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２のクロレラブルガリス。
【請求項５】
アンモニア脱臭能を有する受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２のクロレラブルガリスを含むバイオマス。
【請求項６】
請求項５に記載のバイオマスを含む飼料添加物。
【請求項１】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２のクロレラブルガリスを用いたアンモニア脱臭法。
【請求項２】
前記クロレラブルガリスは、アンモニアを含む水溶液中で生存可能なものである請求項１記載のアンモニア脱臭法。
【請求項３】
前記クロレラブルガリスは、グルタミン酸を添加した培地で培養されたものである請求項１または２に記載のアンモニア脱臭法。
【請求項４】
アンモニア脱臭能を有する受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２のクロレラブルガリス。
【請求項５】
アンモニア脱臭能を有する受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９４２のクロレラブルガリスを含むバイオマス。
【請求項６】
請求項５に記載のバイオマスを含む飼料添加物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−１８４１３（Ｐ２００８−１８４１３Ａ）
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２１７５３５（Ｐ２００６−２１７５３５）
【出願日】平成１８年７月１１日（２００６．７．１１）
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１１日（２００６．７．１１）
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【Ｆターム（参考）】
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