イヌ腎細胞の浮遊培養物においてウイルスを複製する方法
ウイルスが感染することができ、無血清培地等の動物由来成分を含まない培地において浮遊状態で増殖するように適合させた動物細胞が記載されている。これらの細胞を用いた細胞培養物におけるウイルス複製の方法、またこの方法によって得られるウイルスまたはその抗原部分を含有するワクチンがさらに記載されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスが感染することができ、無血清培地等の動物由来成分を含まない培地において浮遊状態で増殖するように適合させた動物細胞に関し、またこれらの細胞を用いた細胞培養物におけるウイルス複製の方法に関する。本発明はさらに、記載されている方法によって得られるウイルスおよびこの種類のウイルスまたはその構成要素を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび動物の治療のためのインフルエンザワクチン等、多くのワクチンは、発育鶏卵において複製された１種または複数のウイルス株からなる。これらのウイルスは、感染した鶏卵の尿膜腔液から単離され、これらウイルスの抗原は、無傷のウイルス粒子として、界面活性剤および／または溶媒によって分解されたウイルス粒子として、化学的もしくは物理的に不活化されたウイルスとして、またはサブユニットワクチンにおける単離され同定されたウイルスタンパク質としてワクチンに用いられる。ウイルスは多くの場合、当業者に知られた方法によって不活化される。実験的ワクチンにおいて検査がなされた弱毒化生ウイルスの複製もまた、発育鶏卵で行われる。
【０００３】
ワクチン生産のための発育鶏卵の利用は、時間、労働および経費集約的である。獣医によって監視された健康的なニワトリの群れから得た卵は、感染前に通例１２日間インキュベートされなければならない。感染前に卵は生きている胚に関して選別されなければならないが、これはこのような卵だけがウイルス複製に適しているからである。感染後、卵は通例２から３日間再度インキュベートされる。その時点ではまだ生きていた胚は、低温環境に付されることによって死滅し、続いてアスピレーションによってそれぞれの卵から尿膜腔液が得られる。煩雑な精製方法によって望ましくないワクチン副作用をもたらす鶏卵由来の物質がウイルスから分離され、ウイルスが濃縮される。卵は無菌（病原体フリー）ではないため、存在する可能性のある発熱物質およびあらゆる病原体を除去および／または不活化することが追加的に必要である。
【０００４】
他のワクチンのウイルス、例えば狂犬病ウイルス、おたふく風邪、はしか、風疹、ポリオウイルス、Ｆｒｕｈｓｏｍｍｅｒ−Ｍｅｎｉｎｇｏ Ｅｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ＦＳＭＥ）ウイルス等のダニ媒介性脳炎ウイルス等は、細胞培養物において複製することができる。検査された細胞バンクに由来する細胞培養物は病原体を含まず、また鶏卵とは対照的に（理論的には）ほぼ無制限の量を利用できる確定されたウイルス複製システムであるため、細胞培養物は、インフルエンザウイルスの場合であっても、ある特定の環境下における経済的なウイルス複製を可能にする。さらに、卵におけるインフルエンザウイルスの単離および複製は、その大部分が臨床分離株とは異なる特定の表現型の選別をもたらす。継代依存的な選別が起こらない細胞培養物におけるウイルスの単離および複製は、これと対照的である（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２（１９９１）、１８５−１８９；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４（１９９３）２０４７−２０５１）。したがって、有効なワクチンのために、細胞培養物におけるウイルス複製が好ましい。
【０００５】
インフルエンザウイルスは細胞培養物において複製できることが知られている。インフルエンザウイルスのインビトロ複製に適した細胞として、ニワトリ胚細胞やハムスター細胞（ＢＨＫ２１−ＦおよびＨＫＣＣ）の他に、ＭＤＢＫおよびＭＤＣＫ細胞が報告されている（Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｅ．Ｄ．、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、８９−１１０頁、Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ−ニューヨークおよびロンドン、１９８７年）。プロテアーゼは赤血球凝集素の前駆タンパク質［ＨＡ０］を細胞外で開裂させて活性型赤血球凝集素［ＨＡ１およびＨＡ２］にするため、感染成功のための必要条件は、感染培地にプロテアーゼ、好ましくはトリプシンまたは同様のセリンプロテアーゼを添加することである。開裂した赤血球凝集素だけがインフルエンザウイルスの細胞上への吸着をもたらし、続いてウイルスを細胞内に同化させ（Ｔｏｂｉｔａ，Ｋ．ら、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２（１９７５）９−１４；Ｌａｚａｒｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．とＣｈｏｐｐｉｎ，Ｐ．Ｗ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８（１９７５）４４０−４５４；Ｋｌｅｎｋ，Ｈ．−Ｄ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８（１９７５）４２６−４３９）、その結果細胞培養物においてさらにウイルス複製サイクルをもたらす。
【０００６】
その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国再発行特許第３３，１６４号（米国特許第４，５００，５１３号より）は、付着増殖型ＣＬＤＫ細胞（すなわち「ａＣＬＤＫ細胞」）の細胞培養物におけるインフルエンザウイルスの複製を説明している。これらの細胞の付着増殖における制約的な要件は増殖可能な細胞の収量に制限を課し、その結果ワクチン製剤のために回収可能なウイルスの収量にも制限を課す。
【０００７】
さらに、付着（すなわち基質依存的）細胞におけるウイルス増殖は、細胞が浮遊状態で増殖できる場合には必要のないステップを要する。細胞増殖の後、栄養培地が除去されて新しい栄養培地が細胞に添加され、それと同時またはその直後に細胞のインフルエンザウイルス感染が行われる。感染から所定の時間を経た後、最適なウイルス複製を得るためにプロテアーゼ（例えばトリプシン）が添加される。ウイルスは回収、精製、加工されて不活化または弱毒化ワクチンが得られる。
【０００８】
しかし、ワクチン生産のための必要条件としての経済的なインフルエンザウイルスの複製は、米国再発行特許第３３，１６４号明細書に記載されている手順を用いて達成することはできない。その理由として、培地の交換とそれに続く感染とその後行われるトリプシンの添加は、各細胞培養容器の開放を何回も必要とし、したがって非常に労働集約的なためである。さらに、望ましくない微生物やウイルスによる細胞培養物のコンタミネーションの危険は、培養容器の操作毎に増加する。このシステムにおけるさらに別の不都合は、血清（ウシ胎仔血清、ウシ胎児血清（ｆｂｓ）、ウシ新生児血清またはウシ血清を含むが、これらに限定されない）が細胞増殖に必要なことである。血清は、ウイルス収量の障害となるトリプシンインヒビターを含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国再発行特許第３３，１６４号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５００，５１３号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｏｘｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２（１９９１）１８５−１８９
【非特許文献２】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４（１９９３）２０４７−２０５１
【非特許文献３】Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｅ．Ｄ．、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、８９−１１０頁、Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ−ニューヨークおよびロンドン、１９８７年
【非特許文献４】Ｔｏｂｉｔａ，Ｋ．ら、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２（１９７５）９−１４
【非特許文献５】Ｌａｚａｒｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．とＣｈｏｐｐｉｎ，Ｐ．Ｗ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８（１９７５）４４０−４５４
【非特許文献６】Ｋｌｅｎｋ，Ｈ．−Ｄ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８（１９７５）４２６−４３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
より費用対効果の高い代替法は、細胞が培養容器またはマイクロキャリアの表面上に付着して増殖する必要のないシステムにおける細胞増殖である。その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，６５６，７２０号は、浮遊状態で増殖するＭＤＣＫ細胞をインフルエンザウイルスに感染させる、このような一方法の例を提供する。しかし、効率を上げて総費用を下げるためのウイルス増殖の代替手段を提供する追加的な細胞系と手順が必要とされる。
【００１２】
したがって、動物由来成分を含まない培地（例えば、無血清培地または動物性タンパク質を含まない培地）で培養され、動物の副産物（例えばウシ血清）の使用に伴うリスクを低減し、このような動物副産物の経費を削減することができる、追加的な細胞系の必要がある。さらに、基質依存的な増殖の必需品（例えば、Ｔ−フラスコ、ローラーボトルまたはマイクロキャリア）を省き、その代わりに浮遊培養を行う一般的な必要もある。浮遊培養は、コスト節減、より高い細胞密度、より多いウイルス収量等、基質依存的な増殖に優る多くの利点がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ａ）ｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液にウイルスを接種し、これによりｓＣＬＤＫ細胞を感染させるステップ、ｂ）感染ｓＣＬＤＫ細胞においてウイルスを繁殖させるステップおよびｃ）ｓＣＬＤＫ細胞の浮遊培養物からウイルスを回収するステップを含む、ｓＣＬＤＫ細胞の培養物においてウイルスを複製する方法を対象とする。ウイルスは、ヒトインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、馬インフルエンザウイルス、豚インフルエンザウイルス、犬インフルエンザウイルスまたは猫インフルエンザウイルス等の、インフルエンザウイルスであってよい。限定されないが、インフルエンザウイルスは、Ｈ１型インフルエンザウイルス、Ｈ２型インフルエンザウイルス、Ｈ３型インフルエンザウイルス、Ｈ５型インフルエンザウイルスまたはＨ７型インフルエンザウイルスであってよい。限定されないが、インフルエンザウイルスは、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルス、Ｈ３Ｎ８型インフルエンザウイルス、Ｈ１Ｎ１型インフルエンザウイルス、Ｈ３Ｎ２型インフルエンザウイルス、Ｈ２Ｎ３型インフルエンザウイルス、Ｈ７Ｎ８型インフルエンザウイルスまたはＨ３Ｎ１型インフルエンザウイルスであってよい。本発明の一実施形態において、接種直前に、接種と同時に、または接種直後に、赤血球凝集素の前駆タンパク質を開裂させるためのプロテアーゼがｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液に添加される。プロテアーゼはトリプシンであってよい。
【００１４】
本発明はまた、ａ）血清代替物を含む培地に基質依存的なＣＬＤＫ細胞のサンプルを接種するステップ、ｂ）培地において浮遊状態で細胞を増殖させるステップ、ｃ）ＣＬＤＫ細胞を新しいバッチの培地において浮遊状態で連続継代するステップおよびｄ）培地中の血清代替物の量をゼロまで減少させることによって、浮遊状態のＣＬＤＫ細胞から血清代替物を断つステップを含む、基質依存的なＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で増殖するように適合させる方法も対象とする。この方法はまた、「適合方法」とも言う。培地は無血清であってよい。培地はまた、動物由来成分を全く含まなくてもよい。
【００１５】
適合方法の一実施形態において、細胞は、ステップ（ｃ）において、７日間の増殖係数が少なくとも約３から２０、好ましくは約５より大きく、さらに好ましくは約７より大きく、最も好ましくは約１０より大きくなるまで連続継代される。ステップ（ｃ）の３から１５連続継代の間の平均増殖係数がこのような値を達成した後、続く３から６継代にわたって浮遊状態のＣＬＤＫ細胞は血清代替物を断つことができる。非限定的な例として、浮遊状態で少なくとも５−１０継代の平均増殖係数が約５より大きくなるまでＣＬＤＫ細胞は浮遊状態で連続継代され、この時点で細胞は続く６継代以内にわたって血清代替物を断たれる。好ましくは、浮遊状態で少なくとも１０継代の平均増殖係数が約８より大きくなるまでＣＬＤＫ細胞は浮遊状態で連続継代され、この時点で細胞は続く６継代以内にわたって血清代替物を断たれる。あるいは、浮遊状態で少なくとも５継代の平均増殖係数が約１２より大きくなるまでＣＬＤＫ細胞は浮遊状態で連続継代され、この時点で細胞は続く６継代以内にわたって血清代替物を断たれる。
【００１６】
ＣＬＤＫ細胞は、適合方法において血清代替物を首尾よく断つことができ、ただし、最初の血清断ち継代の直前の継代における７日間の増殖係数は少なくとも５である。好ましくは、血清断ち継代の直前の最後の継代における７日間の増殖係数は、少なくとも７、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも約１３である。
【００１７】
本発明はまた、ａ）培地にｓＣＬＤＫ細胞を接種するステップ、ｂ）ｓＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で約４から１０日の期間増殖させるステップ、ｃ）（ｂ）の培養物のサンプルを細胞を含まない新しい培地に移すステップおよびｄ）連続増殖の期間において（ｂ）と（ｃ）を繰り返すステップを含む、ｓＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で連続的に増殖させる方法も対象とする。培地は無血清であってよい。培地は動物性タンパク質を含まなくてもよい。サンプルは、前もってプロテアーゼを全く添加することなく細胞を含まない新しい培地に移すことができる。（ｃ）に従ってサンプルを移した後の細胞密度は、少なくとも３×１０５細胞／ｍＬであってよく、好ましくは少なくとも５×１０５細胞／ｍＬであってもよい。ｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日の期間にわたる増殖係数が３より大きくてよく、４−１０日の期間にわたって好ましくは増殖係数約５より大きくてよく、最も好ましくは約１０より大きくてよい。
【００１８】
本発明はまた、適合方法によって得られる、浮遊状態で増殖できるｓＣＬＤＫ細胞も対象とする。上述の通り、適合方法は、ａ）血清代替物を含む培地において基質依存的なＣＬＤＫ細胞のサンプルを接種するステップ、ｂ）培地において浮遊状態で細胞を増殖させるステップ、ｃ）ＣＬＤＫ細胞を新しいバッチの培地において浮遊状態で連続継代するステップおよびｄ）培地中の血清代替物の量をゼロまで減少させることによって、浮遊状態のＣＬＤＫ細胞から血清代替物を断つステップを含む、基質依存的なＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で増殖するように適合させる方法である。培地は無血清であってよい。血清代替物は動物性タンパク質を含まなくてもよい。本発明はまた、ウイルス複製のための、本方法によって得られるこのようなｓＣＬＤＫ細胞の使用も対象とする。本発明はまた、ワクチン製造における、本方法によって得られるこのようなｓＣＬＤＫ細胞において複製されたこのようなウイルスの使用も対象とする。
【００１９】
本発明はまた、細胞培養培地およびｓＣＬＤＫ細胞を含む組成物も対象とする。
【００２０】
本発明はまた、ａ）培地にｓＣＬＤＫ細胞を接種するステップ、ｂ）培地において浮遊状態でｓＣＬＤＫ細胞を増殖させ、これによってｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液を作製するステップ、ｃ）ｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液をウイルスと共にインキュベートし、これによって感染ｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液を作製するステップ、ｄ）ウイルスを感染ｓＣＬＤＫ細胞内で繁殖させるステップ、ｅ）ウイルスを回収または単離するステップおよびｆ）回収または単離されたウイルスを１種または複数の薬学的に許容される担体と混合し、これによってワクチンを作製するステップを含む、ワクチンの製造方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、細胞培養物における簡便で経済的なウイルス複製を可能にする、細胞および方法の提供に関する。したがって、本発明は、ウイルスが感染することができ、無血清または動物性タンパク質を含まない培地において浮遊状態で増殖するように適合させた動物細胞に関する。この種類の細胞を用いることによって、簡便で経済的な仕方で細胞培養物におけるウイルス複製が可能となることが判明した。細胞が浮遊状態で増殖するように適合されているため、製造バッチはより多数の細胞を、続いてより高力価のウイルスを生産する。ウイルスの収量が高くなれば、全製造コストが抑えられる。さらなる利点として、培地の消費が顕著に減少し、これによって全培地コストを抑えられることが挙げられる。同様に重要なことに、本発明の利点として、ウシ血清またはウシ胎児血清等の動物由来成分のいずれも含まない培地における細胞の増殖（およびそれに続くウイルス複製）があり、これによりＴＳＥ（感染性海綿状脳症）を限定することなく含む様々な病原体リスクの削減が挙げられる。
【００２２】
さらに、本発明に係る細胞の使用によって、一方では血清除去のための感染前の培地交換を省略することができ、他方ではプロテアーゼの添加（必要であれば）を感染と同時に行うことができる。総合的には、培養容器をウイルス感染のために１回だけ開放することが必要であり、それによって細胞培養物のコンタミネーションの危険が大幅に低減される。培地交換、感染およびそれに続くプロテアーゼ添加に関連する労力の使用は、さらに減少する。
【００２３】
本発明において使用されている細胞は、基質依存的カッターラボラトリー・イヌ腎（Ｃｕｔｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｏｇ Ｋｉｄｎｅｙ；ＣＬＤＫ）細胞に由来する。本明細書において、「基質依存的ＣＬＤＫ細胞」および類似の用語は、「付着型ＣＬＤＫ細胞」、「ａＣＬＤＫ細胞」または類似の用語と同義的に用いられている。ａＣＬＤＫ細胞は、浮遊型ＣＬＤＫ細胞とは異なる。前者が付着して増殖するのに対し、後者は使い捨てまたは非使い捨てバイオリアクタまたはバイオコンテナを限定することなく含む、シェーカーフラスコまたは他の大規模製造容器等において浮遊状態で増殖する。ａＣＬＤＫ細胞は、ローラーボトルの表面または培地に添加されたマイクロキャリアもしくはビーズ等、その上で増殖するための表面を必要とする。ａＣＬＤＫ細胞は浮遊状態では増殖しない。振動台上に置かれたシェーカーフラスコ内の培地に接種された場合、ａＣＬＤＫ細胞はある程度の生存率を維持することはできるが、増殖はしない。むしろａＣＬＤＫ細胞は細胞塊を形成する傾向がある。
【００２４】
浮遊型ＣＬＤＫ細胞はまた、「ｓＣＬＤＫ」細胞または「ｓＣＬＤＫ−ＳＦ」細胞とも言い、これら細胞が無血清培地で増殖することを示している。ｓＣＬＤＫ細胞は、本明細書に記載されているように、無血清培地において浮遊状態で継代することによってａＣＬＤＫ細胞から得られる。これらの特性およびウイルス複製のための宿主細胞として機能するその能力のために、ｓＣＬＤＫ細胞は、簡便で費用対効果の高い方法の細胞培養物における経済的なウイルス複製に適している。ａＣＬＤＫ細胞とは対照的に、ｓＣＬＤＫ細胞は振動台上に置かれたシェーカーフラスコまたは他の浮遊増殖手段で増殖する。ｓＣＬＤＫ細胞はこのような浮遊増殖条件で生存率を維持するだけではなく、ａＣＬＤＫ細胞のように凝集または細胞塊を形成することなく細胞数を増やすことができる。
【００２５】
さらに後述する通り、ｓＣＬＤＫ細胞はａＣＬＤＫ細胞に優る多くの利点を有する。第一に、ａＣＬＤＫ細胞とは異なり、ｓＣＬＤＫ細胞は浮遊状態で増殖する。ａＣＬＤＫ細胞とは異なり、ｓＣＬＤＫ細胞は、浮遊状態での増殖のために新しい培地に４−１０日の期間で移された場合少なくとも３の増殖係数（３）を有する。本発明の一実施形態において、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日の期間で３より大きく、好ましくは５より大きい係数で浮遊状態で増殖する。より好ましくは、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日の期間で約６より大きく、最も好ましくは約１０より大きい係数で浮遊状態で増殖する。
【００２６】
ａＣＬＤＫ細胞とは異なり、ｓＣＬＤＫ細胞はまた、浮遊状態で連続的に増殖することができる。ｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日毎に新しい培地に移された場合、３より大きく、好ましくは５より大きい係数で浮遊状態で連続的に増殖することができる。より好ましくは、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日の期間毎に新しい培地に移された場合、約６より大きく、最も好ましくは約１０より大きい係数で浮遊状態で連続的に増殖することができる。
【００２７】
ｓＣＬＤＫ細胞がａＣＬＤＫ細胞に優る別の利点は、前者は血清または他の動物由来の培地サプリメントなしで増殖できることである。ａＣＬＤＫ細胞とは異なり、血清または他の動物由来の培地サプリメントを含まない新しい培地に４−１０日の期間で移された場合、ｓＣＬＤＫ細胞は平均して少なくとも３倍になる。本発明の一実施形態において、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、血清または他の動物由来の培地サプリメントを含まない培地で、４−１０日の期間で３より大きく、好ましくは５より大きい係数で増殖する。より好ましくは、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、血清または他の動物由来の培地サプリメントを含まない新しい培地に移された場合、４−１０日の期間で約６より大きく、最も好ましくは約１０より大きい係数で増殖する。
【００２８】
ａＣＬＤＫ細胞とは異なり、ｓＣＬＤＫ細胞はまた、血清または他の動物由来成分を含まない培地で連続的に増殖することもできる。ｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日毎に新しい培地に移された場合、３より大きく、好ましくは５より大きい係数で、血清または他の動物由来成分を含まない培地で連続的に増殖することができる。より好ましくは、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日毎に新しい培地に移された場合、約６より大きく、最も好ましくは約１０より大きい係数で、血清または他の動物由来成分を含まない培地で連続的に増殖することができる。
【００２９】
したがって、ｓＣＬＤＫ細胞の利点は、血清または他の動物由来成分を含まない培地において浮遊状態で連続的に増殖するその能力である。ｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日毎に新しい培地に移された場合、３より大きく、好ましくは５より大きい係数で、血清または他の動物由来成分を含まない培地において浮遊状態で連続的に増殖することができる。より好ましくは、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日の期間毎に新しい培地に移した場合、約６より大きく、最も好ましくは約１０より大きい係数で、血清または他の動物由来成分を含まない培地において浮遊状態で連続的に増殖することができる。
【００３０】
本明細書において、「増殖係数」または類似の用語は、それによって最初の細胞集団がある期間において増殖した乗数値を意味する。したがって、２または３の増殖係数は、細胞が新しい培地に移された（すなわち、接種または植え継がれた）出発時点の細胞密度と比べて細胞密度がそれぞれ２倍または３倍になったことを示す。１０または２０の増殖係数は、細胞密度が、細胞が新しい培地に移された出発時点の細胞密度に対してそれぞれ係数１０または２０を掛けたことを示す。１以下の増殖係数は、細胞密度が増加しなかったこと、または細胞集団が減少したことを示す。
【００３１】
したがって、本発明はまた、本発明に係る細胞が使用されている細胞培養物におけるウイルス複製の方法にも関する。特に、次のステップ：ｉ）上述の本発明に係る細胞の無血清培地における浮遊状態の増殖、ｉｉ）細胞のウイルスによる感染、ｉｉｉ）感染細胞の培養およびｉｖ）複製されたウイルスの単離、を含む方法に関する。インフルエンザウイルスの場合のように力価が上昇し得る場合、感染の直前に、同時に、または直後にプロテアーゼが添加されてもよい。本発明の非限定的な一実施形態において、ｓＣＬＤＫ細胞は無血清培地で増殖してインフルエンザウイルスを複製する。当業者であれば、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞内で複製できる他のウイルスを知っており、これはインフルエンザウイルスの複製に限定されない。
【００３２】
本発明はまた、ａ）ｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液にウイルスを接種し、これによってｓＣＬＤＫ細胞を感染させるステップ、ｂ）感染ｓＣＬＤＫ細胞内でウイルスを繁殖させるステップおよびｃ）ｓＣＬＤＫ細胞の浮遊培養物からウイルスを回収するステップを含む、ｓＣＬＤＫ細胞培養物においてウイルスを複製する方法も対象とする。ウイルスは、遠心分離、濾過または他の機械的もしくは生化学的な感染細胞懸濁液の分離手段によって、回収することができる。したがって、回収されたウイルスは、ｓＣＬＤＫ細胞またはｓＣＬＤＫ細胞破片を含有したウイルスを含むことができる。回収されたウイルスはまた、ｓＣＬＤＫ細胞またはｓＣＬＤＫ細胞破片を含有しないウイルスを含むこともできる。
【００３３】
本発明に係る細胞は、好ましくは当業者に知られている動物由来成分を含まない培地（例えば、無血清培地、動物性タンパク質を含まない培地）で培養することができる。このような培地の非限定的な例として、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）培地、ｕｌｔｒａ ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、レネックサ、カンザス州）が挙げられる。本発明に従って用いることができる他の無血清培地は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）５２０培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、レネックサ、カンザス州）およびＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）を含む。本発明に従って用いることができる他の動物性タンパク質を含まない培地は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３０２培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、レネックサ、カンザス州）、ＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ ＭＰＳ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）およびＲｅｎｃｙｔｅ ＢＨＫ培地（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ、ジリン、デンマーク）を含む。本発明に従って用いることができる他の大豆または酵母ベースの動物性タンパク質を含まない培地は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている次の全文献、米国特許第７，１６０，６９９号または米国特許出願公開第２００３／０２０３４４８号、第２００４／００７７０８６号、第２００４／００８７０２０号、第２００４／０１７１１５２号、第２００５／００８９９６８号、第２００６／００９４１０４号、第２００６／０２８６６６８号、に記載されているものを含む。本発明に係る方法の過程で用いることができる適切な培養容器は、当業者に知られたあらゆる容器である。
【００３４】
血清代替物が動物由来成分を含まない培地に添加されてもよい。このような代替物は、それ自身動物由来成分を全く含まないが、細胞で、好ましくは動物由来成分を含まない培地で培養した細胞で発現した組換え動物性タンパク質を含むことができる。血清代替物は、組換え成長因子、トランスフェリン代替物もしくは組換えトランスフェリン代替物、合成ホルモンおよび／または他の組換えタンパク質を含むことができる。組換えタンパク質成分は病原体を含まないまたはウイルスを含まない細胞において制御された環境で製造されるため、血清代替物は外来性ウイルスを全く含まない。したがって、血清代替物はウイルスまたはＴＳＥ（感染性海綿状脳症）リスクがない。血清代替物は、好ましくは付着型ＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で増殖するように適合させる（すなわち、ａＣＬＤＫ細胞をｓＣＬＤＫ細胞に転換させる）ために用いられる。しかしこのような代替物はまた、本発明に係るウイルス増殖のためのｓＣＬＤＫ細胞の浮遊培養のためにも用いることができる。血清代替物の非限定的な例として、ＬＩＰＵＭＩＮ（商標）血清代替物（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、パシング、オーストリア）が挙げられる。
【００３５】
インフルエンザウイルスの場合の感染前細胞増殖の温度は、好ましくは３７℃である。細胞増殖のための培養は、例えば攪拌容器発酵槽等の灌流システムにおいて、例えば遠心分離、濾過、スピンフィルター等の当業者に知られた細胞保持システムを用いて、バッチ操作または当業者によく知られた他の技法を用いて行うことができる。
【００３６】
この場合、細胞は好ましくは２から１８日間、特に好ましくは３から１１日間増殖される。培地交換は、この過程で１日当たり０から約１から３容量に増加させて行われる。細胞は、この仕方で非常に高い細胞密度、好ましくは約２×１０７細胞／ｍｌになるまで増殖させる。灌流システムの培養における灌流量は、細胞計数および培地中のグルコース、グルタミンまたは乳酸塩の含有量の両方によって、ならびに当業者に知られた他のパラメーターによって調節することができる。インフルエンザウイルス感染の場合、発酵槽容量の約８５％から９９％、好ましくは９３から９７％が細胞と共にさらに別の発酵槽に移される。最初の発酵槽に残った細胞は次に培地と混合され、灌流システムでさらに複製することができる。この仕方で、ウイルス複製のための連続的な細胞培養が可能となる。
【００３７】
本発明に係る方法の好ましい一実施形態において、用いられている培養培地のｐＨは培養中に調節されてもよく、それはｐＨ６．６からｐＨ７．８の範囲、好ましくはｐＨ６．８からｐＨ７．３の範囲である。
【００３８】
さらにｐＯ２値は、有利には方法のこのステップで調節され、好ましくは２５％−９５％、特に３５％−６０％（空気飽和に基づく）である。本発明に従って、浮遊培養されている細胞の感染は、好ましくはバッチ法における細胞が灌流システムにおいて約８から２５×１０５細胞／ｍｌまたは約５から２０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度を達成したときに行われる。
【００３９】
さらに好ましい一実施形態において、インフルエンザウイルスの場合、細胞の感染は約０．０００１から１０、好ましくは０．００２から０．５のｍ．ｏ．ｉ．（感染効率）で行われる。赤血球凝集素の前駆タンパク質［ＨＡ０］の開裂とそれに続く細胞上のウイルス吸着をもたらすプロテアーゼの添加は、細胞にインフルエンザウイルスを感染させる直前に、同時にまたは直後に、本発明に従って行うことができる。添加が感染と同時に行われる場合、プロテアーゼは、感染される細胞培養物に直接添加されてもよいし、例えば濃縮物としてウイルス接種と共に添加されてもよい。プロテアーゼは、好ましくはセリンプロテアーゼ、特に好ましくはトリプシンである。
【００４０】
好ましい一実施形態において、トリプシンは感染される細胞培養物に、培養培地において１から２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５から５０μｇ／ｍｌ、特に好ましくは５−３０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加される。バッチ法の場合またはトリプシン溶液の連続的添加もしくは断続的添加による灌流システムの場合、本発明に係る感染細胞のさらなる培養の間にトリプシンを新たに添加することによってトリプシン再活性化を行うことができる。後者の場合、トリプシン濃度は好ましくは１μｇ／ｍｌから８０μｇ／ｍｌの範囲である。
【００４１】
感染の後、感染細胞培養物は、特に最大細胞変性効果または最大量のウイルス抗原が検出できるまでさらに培養されてウイルスを複製する。好ましくは、細胞の培養は、２から１０日間、特に３から７日間行われる。培養は次に好ましくは灌流システムまたはバッチ法において行うことができる。
【００４２】
さらに好ましい一実施形態において、細胞は、５−１５％ＣＯ２、最も好ましくは約１０％ＣＯ２にセットされたインキュベーター内で３０℃から３７℃の温度で培養することができる。
【００４３】
インフルエンザウイルスの場合のように、感染後の細胞培養は次に好ましくは調節されたｐＨおよびｐＯ２で行われる。この場合のｐＨは、好ましくは６．６から７．８、特に好ましくは６．８から７．２の範囲であり、ｐＯ２は２５％から１５０％、好ましくは３０％から７５％、特に好ましくは３５％から６０％（空気飽和に基づく）の範囲である。
【００４４】
方法における細胞培養またはウイルス複製の間、抗原収量を最適化するために、細胞培養培地を新たに調製した培地、培地濃縮物またはアミノ酸、ビタミン、脂質画分、リン酸塩等の同定された構成要素に置換することも可能である。
【００４５】
インフルエンザウイルスの場合のように、細胞は感染後、培地または培地濃縮物を数日間にわたってさらに添加することによって徐々に希釈されてもよいし、約１−３から０発酵槽容量／日に減らしながら培地または培地濃縮物でさらに灌流する間インキュベートされてもよい。次にこの場合、灌流量は細胞計数、グルコース、グルタミン、乳酸塩もしくは乳酸脱水素酵素の培地中の含有量または当業者に知られた他のパラメーターによって調節することができる。
【００４６】
灌流システムと流加培養法の組み合わせがさらに可能である。この方法の好ましい一実施形態において、複製したウイルス（例えばインフルエンザウイルス）の回収と単離は、感染後２から１０日以内、好ましくは３から７日以内に行われる。例えばこの回収を行うために、例えば遠心分離、分離器またはフィルター等、当業者に知られた方法によって、細胞または細胞残渣が培養培地から分離される。このようなステップの後に、培養培地中に存在しているウイルスの濃縮が、例えば勾配遠心分離、濾過、沈殿等、当業者に知られた方法によって行われる。
【００４７】
本発明はさらに、本発明に係る方法によって得られるインフルエンザウイルスに関する。インフルエンザウイルスは公知の方法によって回収、製剤され、ヒトまたは動物に投与するためのワクチンを得ることができる。得られたインフルエンザウイルスを含むワクチンの免疫原性または有効性は、当業者に知られた方法、例えば負荷試験において付与された保護によってまたは中和抗体の抗体価として決定することができる。生産されたウイルスすなわち抗原の量の決定は、例えば当業者に知られた方法に従った赤血球凝集素量の決定によって行うことができる。例えば、開裂した赤血球凝集素は様々な種の赤血球、例えばニワトリ赤血球に結合することが知られている。これにより生産されたウイルスまたは形成された抗原の簡便で迅速な定量化が可能となる。
【００４８】
したがって、本発明はまた、本発明に係る方法から得られるウイルスを含むワクチンに関する。この種類のワクチンは、場合によって通例ワクチン用である添加物、特に免疫応答を高める物質、すなわち例えば様々な金属の水酸化物、カルボマー、細菌細胞壁の構成要素、オイルまたはサポニン等のアジュバント、および通例の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。
【００４９】
ウイルスは、無傷のウイルス粒子として、特に弱毒化生ウイルスとしてワクチン中に存在することができる。このため、ウイルス濃縮物は所望の力価に調整されて、凍結乾燥されるかまたは液体の形状で安定化させる。
【００５０】
さらに別の一実施形態において、本発明に係るワクチンは、分解された、不活化されたまたは無傷だが不活化されたウイルスを含むことができる。このため、化学的および／または物理的方法（例えば、界面活性剤またはホルムアルデヒド）によってウイルスの感染力が失われる。続いてワクチンは所望の抗原量に調整され、可能であればアジュバントとの混合の後、または可能であればワクチン製剤の後、例えばリポソーム、ミクロスフィアまたは他の「徐放」製剤において調合される。
【００５１】
さらに別の好ましい一実施形態において、本発明に係るワクチンは、最終的にサブユニットワクチンとして存在することができる。すなわち、ワクチンは、同定され、単離されたウイルス構成要素、好ましくはインフルエンザまたはその他のウイルスの単離タンパク質を含むことができる。これらの構成要素を、当業者に知られた方法によってウイルスから単離することができる。
【００５２】
さらに、本発明に係る方法によって得られるインフルエンザまたはその他のウイルスを、診断目的に用いることができる。したがって、本発明はまた、適切であれば通例本分野の添加物および適切な検出剤と組み合わせた、本発明に係るインフルエンザもしくはその他のウイルスまたはこのようなウイルスの構成要素を含む診断用組成物に関する。
【００５３】
次の実施例は単に例示的なものであり、決して本開示の残り部分を限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
実施例１Ａ：血清または血清代替物を含まない浮遊増殖へのＣＬＤＫ細胞の適合
カッターラボラトリー・イヌ腎（Ｃｕｔｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｏｇ Ｋｉｄｎｅｙ；ＣＬＤＫ）細胞は足場依存性であり、したがって増殖するための基質またはその表面を必要とする。適切な基質は、Ｔ−フラスコもしくはローラーボトル等の容器の内部表面、または培養容器に添加することができるビーズもしくはマイクロキャリアの表面上を含む。通常これらの細胞は基質上に単層を形成し、静置培養およびローラーボトルで増殖できる。これらの細胞は増殖に血清を必要とし、また形態学的には上皮細胞的である。
【００５５】
２本のアンプルのカッターラボラトリーズａＣＬＤＫ細胞を解凍し、続いて各チューブに１ｍＬの解凍された材料が入るよう、２本の４ｍＬクライオチューブに移した。１ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を各クライオチューブに添加した。本明細書における「サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地」は、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ溶液２０ｍＬ／培地１Ｌ）およびゲンタマイシン（培地１リットル当たり０．５ｍＬの１００ｇ／ｍＬ溶液）を補充したＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、レネックサ、カンザス州）の混合物を言う。２本のクライオチューブを３−５分間静置した後、全材料を２本の１５ｍＬ遠心分離チューブに移した。約８ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を各１５ｍｌ遠心分離チューブに加えた。次にこれら２本のチューブを３−５分間静置した後、１０分間、約１，０００ｒｐｍ（５００×ｇ）で遠心分離した。培地上清を捨て、ペレット化した細胞を全容量２０ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地に再懸濁した。再懸濁された細胞を０．２μベントキャップを取り付けた１２５ｍＬシェーカーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、コーニング、ニューヨーク州）に移し、そこへ追加のサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を３０ｍＬ加えて、全容量５０ｍＬを得た。これらの細胞は、下の表１の継代数１に対応し、これを１０％ＣＯ２供給下３７℃ウォータージャケットインキュベーター内のロータリーシェーカープレート上に１週間置いた。
【００５６】
浮遊状態におけるいくらかの増殖を求めるため、細胞を１週間基準で２回以上（表１の継代２および３）、血清または血清代替物なしでシェーカーフラスコに植え継いだ。しかし表１に示す通り、これらの条件のａＣＬＤＫ細胞で記録された最も大きい増殖係数は、７日の期間当たり３未満であった。続く１３継代は、培養培地に１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８界面活性剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、カリフォルニア州）も含んでいた。これらの期間、細胞は高い生存率を維持していたが、表１に示す通り増殖係数は７日の期間当たり（平均）２未満であり続けた。次の１４継代は、培地に１％Ｌｉｐｕｍｉｎ（商標）ＡＤＣＦ（動物由来成分を含まない）血清代替物（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、パシング、オーストリア）も含んでいた。これらの継代の間、平均増殖係数は（表１に示す通り）、１２より大きく、細胞の生存率は＞９５％であった。次の継代では、細胞を０．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８界面活性剤と０．５％Ｌｉｐｕｍｉｎ（商標）ＡＤＣＦ血清代替物で血清断ちさせた。その次の継代では、細胞を０．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８界面活性剤と０．２５％Ｌｉｐｕｍｉｎ（商標）ＡＤＣＦ血清代替物で血清断ちさせた。続く６継代は、細胞からＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８界面活性剤とＬｉｐｕｍｉｎ（商標）ＡＤＣＦ血清代替物を完全に断った。これら最後の６継代の間、細胞は平均１７より大きい増殖係数を有し（表１に示す通り）、高い生存率を保持し続けた。
【００５７】
表１は、本実施例に記載されている継代の履歴を示す。示されているように、サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地は、表示量のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８界面活性剤またはＬｉｐｕｍｉｎ（商標）ＡＤＣＦ血清代替物と共に全容量５０ｍＬを継代毎に用いた。各継代は、１週間、１０％ＣＯ２供給下３７℃のウォータージャケットインキュベーター内のロータリーシェーカープレートに置かれた、１２５ｍＬシェーカーフラスコ中で行った。「細胞植え継ぎ密度」は、継代当初（すなわち、週の最初）の培地５０ｍＬにおける細胞濃度を言い、細胞／ｍＬで提示される。１週間後、材料のサンプルから細胞を計数し、「細胞計数／ｍＬ」を決定した。「７日間の増殖係数」は、「細胞計数／ｍＬ」値を「細胞植え継ぎ密度」値で割ることによって決定した。
【００５８】
【表１】
【００５９】
３８回目の継代の細胞から、１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州）を含む少量の細胞ストック（１５−２０本のクライオバイアル）をアンプルに入れて凍結し、液体窒素（ＬＮ）中で保存した。名称をｓＣＬＤＫ−ＳＦに変えたが、「ｓ」は浮遊（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、「−ＳＦ」はこの方法において無血清（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）であることを意味する。この細胞系の凍結に血清は利用しなかった。
【００６０】
３８回目の継代後のバイアルを凍結してから約５ヶ月後、凍結バイアルの内２本を解凍し、シェーカーフラスコ内に置いた。これらの細胞を１２５ｍＬシェーカーフラスコ内で１週間増殖した（継代数３９）。次いでこれらの細胞を、それぞれが０．２μベントキャップを取り付けた１１個の１Ｌ Ｎａｌｇｅｎｅシェーカーフラスコを用いて４４００ｍＬにスケールアップ（２以上の継代にわたって）した。継代数４１の４日目（９６時間）に、対数期（活発に増殖している）の細胞を回収し、１０％ＤＭＳＯを添加し、自動アンプル充填および、封止装置を用いてＨＥＰＡ濾過空気下でガラス製アンプルに充填し、封をした。マスター細胞ストックバンクは、適切な封止であるか検査し、ラベルを貼り、液体窒素中で凍結した。数個の凍結サンプルを解凍し、生じ得るコンタミネーション（カビおよび細菌によるコンタミネーション）に関して選別した。選別によって、それぞれ２８℃および３７℃のトリプトン大豆ブロスおよびトリプトースリン酸ブロスにおいて２１日後に、カビまたは細菌の増殖がないことが明らかになった。
【００６１】
実施例１Ｂ：血清または血清代替物を含まない浮遊増殖へのａＣＬＤＫ細胞の適合
次に上述のＣＬＤＫ適合手順をより少ない継代で繰り返し、完了した。次表は、培養培地およびこの次の手順で観察された増殖についてまとめている。
【００６２】
【表２】
【００６３】
実施例１Ｃ：液体窒素保存からｓＣＬＤＫ−ＳＦ ＭＣＳ細胞の回収と最適な成長増殖の手段
１Ｌのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を無菌法を用いて調製した。その後、実施例１Ａにおける継代４１の凍結アンプルから得られた細胞２−３ｍＬを液体窒素から回収し、解凍した。解凍したアンプルに７０％アルコールをスプレーし、乾かした。滅菌アンプルスナッパーを用いて全バイアルを割り開けた。その後、滅菌ピペットを用いて一アンプルの細胞を小容量の蓋つき滅菌チューブ（４．５ｍＬ滅菌クライオバイアルまたは同等品）に移した。このステップを第二、第三のアンプルに対して繰り返した。
【００６４】
滅菌ピペットを用いて、１．０ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を各チューブに添加した。細胞−培地混合物を含むこれらのチューブを約３−５分間置いた後、滅菌ピペットを用いて細胞−培地混合物を１本の小容量滅菌チューブから１５ｍＬ遠心分離チューブ（Ｆａｌｃｏｎまたは同等品）に移した。このステップを細胞−培地混合物を含む第二、第三の小容量チューブに対して繰り返した。約８．０ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を各チューブに添加した。それぞれ１０ｍＬの細胞−培地混合物を含む全１５ｍＬ遠心分離チューブを５−１０分間置いた後、チューブを約５００×ｇで１０分間遠心分離した。次に、ペレットを維持したまま培地を遠心分離チューブから注ぎ出した。滅菌ピペットを用いて約５ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を各遠心分離チューブに添加した。続いてペレットを遠心分離チューブ内で再懸濁した。全チューブの再懸濁した細胞−培地混合物を、０．２μｌベントキャップを取り付けた１２５ｍＬシェーカーフラスコ１本に移した。次に約４０ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を１２５ｍＬシェーカーフラスコに添加し、続いてフラスコを１０％ＣＯ２にセットした３７℃インキュベーター内のロータリーシェーカー（１００−１１０ＲＰＭ）上に置いた。細胞を４から７日間インキュベートした。７日間で、生存率が実質的に損なわれることなく最大の細胞増殖係数を得た。自動哺乳類細胞カウンターを用いて細胞および生存率の計数を行った。
【００６５】
実施例１Ｄ：ｓＣＬＤＫ−ＳＦ ＭＣＳ細胞を成長増殖のために植え継ぐ手順
次の手順は、ｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞の連続増殖のために最適化された。この方法は実施例１Ｃのように細胞を回収した後に始まり、７日毎に繰り返して連続的な細胞増殖を維持することができる。細胞は、サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地において増殖する。
【００６６】
サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地中の生きたｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞を含むシェーカーフラスコをインキュベーターから回収した後、滅菌ピペットを用いて細胞サンプルをシェーカーフラスコからサンプルバイアルに移す。自動または手動の計数手段を用いて細胞および生存率の計数を行う。計数が行われた後、新しいシェーカーフラスコに細胞密度５．０×１０５細胞／ｍＬの５０ｍＬ（すなわち２．５×１０７細胞／１２５ｍＬシェーカーフラスコ）で植え継ぐのに必要な細胞の全容量を算出する。
【００６７】
算出された容量の細胞を、滅菌ピペットで新しい１２５ｍＬシェーカーフラスコに移す。おおよその容量のサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を全容量５０ｍＬになるように添加した後、シェーカーフラスコをロータリーシェーカー（１００−１１０ＲＰＭ）上に置く。１０％ＣＯ２インキュベーター内３７℃で７日間の期間、細胞をそのまま維持する。この方法を４−１０日毎に１回繰り返して細胞を恒常的に維持することができる。次のデータは、連続的な細胞増殖のための連続継代を表している。継代１−１６は１週間毎に行われ、継代１７−３４は４日毎に行われた。
【００６８】
【表３】
【００６９】
実施例２：ｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞に対する比較のためのａＣＬＤＫ細胞の別の無血清培地における浮遊状態の増殖
ａＣＬＤＫ細胞を液体窒素保存から取り出し、１０％ＦＢＳ含有イーグル（Ｅａｇｌｅ）最小必須培地（ＥＭＥＭ）を用いて７５ｃｍ２フラスコで約４８時間増殖させた。次に細胞を５％ウシ胎児血清とＥＭＥＭ培地を含む８５０ｃｍ２ローラーボトルに移した。次いでこのローラーはトリプシン処理された。細胞を回収し、５．０×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で２本の異なる１２５ｍｌシェーカーフラスコに植え継いだ。これら２本のフラスコの内、１本のフラスコはサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を含み、もう１本のフラスコはＥＭＥＭ培地を含んだ。ｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞を含む第三のフラスコ（利用可能な連続ストック）をサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地において細胞密度５．０×１０５細胞／ｍＬで植え継いだ。続いて３本の懸濁フラスコを３７℃のウォータージャケットインキュベーター内のロータリーシェーカーに置き、細胞および生存率の計数のために１日毎に標本抽出した（下の結果を参照）。
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
【表６】
【００７３】
本実験から、ａＣＬＤＫ細胞はＥＭＥＭ培地において浮遊培養では増殖しないことが結論できる。このデータはまた、サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地におけるａＣＬＤＫが、生産のための生存能力のある代替物であると考慮するのに十分な速度で増殖しないことも示す。生産に有用であると考慮されるためには通常、少なくとも５の増殖係数が必要である。それどころか、これらの細胞は単に細胞密度と生存率を維持するだけであった。最後に、本実験は、サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地におけるｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞が、無血清浮遊状態において平均分割比１０超で非常に良好に増殖し、高い（＞９９％）生存率を維持することを示す。
【００７４】
実施例３：基質依存的ＣＬＤＫ細胞を別の血清含有培地での浮遊増殖に適合させる試み
ａＣＬＤＫ細胞のクライオバイアル２本を液体窒素タンクから取り出して解凍した。１本のバイアルの材料は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をさらに補充したサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地１０ｍＬに再懸濁した。もう１本のバイアルの材料は、補充添加ハンク（Ｈａｎｋ）最小必須培地（ＭＥＭＨ）１０ｍＬに再懸濁した。サプリメント添加ＭＥＭＨ培地は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国再発行特許第３３，１６４号（米国特許第４，５００，５１３号より）に記載されている。本実施例に用いられているこの培地は、次のものを含んでいる。
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％
非必須アミノ酸、１０ｍｌ／培地１Ｌ
Ｌ−グルタミン、１０ｍＬ／培地１Ｌ
硫酸ネオマイシン、（１００ｍｇ／ｍＬストック溶液を０．３ｍＬ）／培地１Ｌ
ポリミキシンＢ、３０，０００ユニット／培地１Ｌ
ナイスタチン、２５，０００ユニット／培地１Ｌ
５０％ブドウ糖、２．６ｍｌ／培地１Ｌ
ＭＥＭビタミン、３０ｍＬ／培地１Ｌ
【００７５】
両方のバイアルを遠心分離し、上清を廃棄した。次に細胞ペレットを別々にそれぞれの培地１０ｍＬに再懸濁し、続いて別々の２５ｍＬ組織培養フラスコに移してそれぞれの培地で全容量２５ｍＬにした（どちらの培地も５％ＦＢＳを含んでいた）。両方のフラスコを３５℃インキュベーター内に置いた。
【００７６】
翌日、両方の組織フラスコを顕微鏡下で観察したところ、９０−１００％コンフルエントであることが分かった。両方のフラスコをトリプシン処理し、細胞を約４９０ｃｍ２ローラーボトルに移して培地全容量１５０ｍＬ／ローラーボトルに置いた。両方のローラーを３５℃インキュベーター内のローラーカート（０．３ｒｐｍ）上に置いた。３日後、両方のローラーボトルの細胞を顕微鏡観察したところ、３０％コンフルエントであることが分かった。さらに３日後、細胞および生存率計数を行った。ＭＥＭＨにおける細胞は、生存率９９．５％の１．０２×１０７細胞／ｍＬを含んでいることが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における細胞は、生存率９９．８３％の１．０９×１０７細胞／ｍＬを含んでいることが分かった。両方のローラーボトルはトリプシン処理され、細胞を３．１６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で新しい４９０ｃｍ２ローラーボトルに移し、培地全容量１５０ｍＬ／ローラーボトルで置いた。両方のローラーボトルを３５℃インキュベーター内に置いた。
【００７７】
インキュベーターに入れてから４日後、細胞および生存率の計数を行った。Ｈａｎｋｓ ＭＥＭにおける材料は、細胞生存率９９．５％の１．１２×１０７細胞／ｍＬを含むことが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料は、細胞生存率８９．６９％の１．２７×１０７細胞／ｍＬを含むことが分かった。両方のローラーボトルをトリプシン処理し、細胞を３．１６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で新しい４９０ｃｍ２ローラーボトルに移し、培地全容量１５０ｍＬ／ローラーボトルに置いた。両方のローラーボトルを３５℃インキュベーター内に置いた。
【００７８】
インキュベーターに入れてから５日後、細胞および生存率の計数を再度行った。Ｈａｎｋ’ｓ ＭＥＭにおける材料は、細胞生存率９９．９％の１．０３×１０７細胞／ｍＬを含んでいることが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料は、細胞生存率９１．９１％の１．７２×１０７細胞／ｍＬを含んでいることが分かった。両方のローラーボトルをトリプシン処理し、細胞を３．１６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で新しい４９０ｃｍ２ローラーボトルに移して培地全容量１５０ｍＬ／ローラーボトルに置いた。両方のローラーを３５℃インキュベーター内に戻し置いた。
【００７９】
インキュベーターに入れてから４日後、細胞および生存率の計数を再度行った。Ｈａｎｋｓ ＭＥＭにおける材料は、細胞生存率９９．２％の５．９５×１０６細胞／ｍＬを含むことが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料は、細胞生存率８５．８４％の９．４１×１０６細胞／ｍＬ含むことが分かった。両方のローラーボトルをトリプシン処理し、細胞を３．１６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で新しい１２５ｍＬシェーカーフラスコに移し、培地全容量５０ｍＬ／シェーカーフラスコで置いた。両方のシェーカーフラスコは、３５℃インキュベーター内の１００−１１０ｒｐｍのロータリーシェーカー上に置いた。
【００８０】
インキュベーターに入れてから４日後、細胞および生存率の計数を再度行った。Ｈａｎｋｓ ＭＥＭにおける材料は、細胞生存率９４．０％の２．１５×１０５細胞／ｍＬを含むことが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料は、細胞生存率９９．６％の１．３８×１０６細胞／ｍＬを含むことが分かった。両方のシェーカーフラスコを３５℃インキュベーター内の１００−１１０ｒｐｍのロータリーシェーカー上に戻し置いた。
【００８１】
インキュベーターに入れてから３日後、細胞および生存率の計数を再度行った。Ｈａｎｋｓ ＭＥＭにおける材料は、細胞生存率９５．０％の２．００×１０５細胞／ｍＬ（増殖係数０．６３に相当する）を含むことが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料は、細胞生存率９９．８％の３．０３×１０６細胞／ｍＬ（増殖係数９．５８に相当する）を含むことが分かった。次に、５％ＦＢＳ培地含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地におけるＣＬＤＫ細胞を３．１６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で新しい１２５ｍＬシェーカーフラスコに植え継ぎ、３５℃インキュベーター内のロータリーシェーカー上に置いて細胞が増殖し続けるか否かを判断し、培地全容量５０ｍＬ／シェーカーフラスコで置いた。
【００８２】
インキュベーターに入れてから７日後、細胞および生存率の計数を再度行った。５％ＦＢＳ培地含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地におけるＣＬＤＫ細胞は、１．５×１０５細胞／ｍＬ未満を含むことが分かった。値が非常に小さかったため、生存率の計数は核カウンターを用いて行うことができなかった。細胞は目に見えて非常に塊状であり、細胞培養物は廃棄した。
【００８３】
上述の継代プロトコールを下表にまとめている。継代２から５は、通例基質依存細胞の培養のためのローラーボトルで行った。２重線より下の継代６および７は、シェーカーフラスコで行って細胞の浮遊増殖への適合を試みた。しかし表から明らかなように、シェーカーフラスコに１回だけ継代した後により長くインキュベートしたにも関わらず、細胞密度は急激に下がった。確かに、ハンクＭＥＭ培地における材料のためにシェーカーフラスコに１回だけ移した後、またサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料のためにシェーカーフラスコに２回だけ移した後、細胞は実験を継続するのに十分には増殖しなかった。このデータは、これらの基質依存的ＣＬＤＫ細胞が浮遊状態では増殖しないことを示す。
【００８４】
【表７】
【００８５】
実施例４：ｓＣＬＤＫ細胞のインフルエンザウイルスによる感染
ｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞系を犬インフルエンザ（ＣＩＶ、Ａ／イヌ／マイアミ／０５）、低温適応温度感受性Ｈ３Ｎ８型インフルエンザ（Ａ／ウマ／２／ケンタッキー／１／９１、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，１７７，０８２号に記載）および第三のＨ３Ｎ８型インフルエンザウイルス（ＫＹ０２、ウマ／ケンタッキー／０２）に感染させた。ＨＡに対する選別の際、検査した３種類の回収されたウイルスの全てが陽性ＨＡ結果を返し、ＣＩＶおよびＫＹ０２は有意な力価の量を示した。検査した低温適応温度感受性Ｈ３Ｎ８型インフルエンザウイルスに対しては、力価データを収集しなかった。
【００８６】
植え継ぎ前に、最も典型的には５−７日間、ｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞をサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地において増殖させた。細胞をシェーカーフラスコから回収し、シェーカーフラスコ当たり（各ウイルスにつき１フラスコ）５０．０ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地に所望の密度（１．０×１０６細胞／ｍＬ）で植え継ぎ、１０％ＣＯ２のロータリーシェーカーで３７℃インキュベートした。植え継ぎ１時間後、シェーカーを適切なウイルスと感染効率（ＭＯＩ）で感染させた。下表参照。１リットル当たり１ｍＬ（５０ｍＬ当たり５０マイクロリットル）のトリプシンを添加する。ＣＩＶおよびＫＹＯ２を３７℃で、Ｆｌｕ−Ａｖｅｒｔを３４℃でインキュベートする。感染した（単数または複数の）シェーカーフラスコを毎日観察し、感染率をモニターして記録した。毎日サンプルを採取し、−７０℃で凍結した後にＨＡ力価に対して選別した。９０−１００％の細胞が感染したことを確認した後、細胞を回収して−７０℃で凍結した。凍結サンプルを毎日採取し、ＨＡ検査を行った。
【００８７】
【表８】
【００８８】
上述の詳細な説明は、本発明の当業者にその本質およびその実際の適用を伝えることだけを目的とし、これにより当業者は本発明のその数多くの形態を特定の用途の要求に最も適切となることができるよう適合および適用することができる。したがって本発明は上述の実施形態には限定されず、様々に修正することができる。
【００８９】
本明細書において記述されているあらゆる刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスが感染することができ、無血清培地等の動物由来成分を含まない培地において浮遊状態で増殖するように適合させた動物細胞に関し、またこれらの細胞を用いた細胞培養物におけるウイルス複製の方法に関する。本発明はさらに、記載されている方法によって得られるウイルスおよびこの種類のウイルスまたはその構成要素を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび動物の治療のためのインフルエンザワクチン等、多くのワクチンは、発育鶏卵において複製された１種または複数のウイルス株からなる。これらのウイルスは、感染した鶏卵の尿膜腔液から単離され、これらウイルスの抗原は、無傷のウイルス粒子として、界面活性剤および／または溶媒によって分解されたウイルス粒子として、化学的もしくは物理的に不活化されたウイルスとして、またはサブユニットワクチンにおける単離され同定されたウイルスタンパク質としてワクチンに用いられる。ウイルスは多くの場合、当業者に知られた方法によって不活化される。実験的ワクチンにおいて検査がなされた弱毒化生ウイルスの複製もまた、発育鶏卵で行われる。
【０００３】
ワクチン生産のための発育鶏卵の利用は、時間、労働および経費集約的である。獣医によって監視された健康的なニワトリの群れから得た卵は、感染前に通例１２日間インキュベートされなければならない。感染前に卵は生きている胚に関して選別されなければならないが、これはこのような卵だけがウイルス複製に適しているからである。感染後、卵は通例２から３日間再度インキュベートされる。その時点ではまだ生きていた胚は、低温環境に付されることによって死滅し、続いてアスピレーションによってそれぞれの卵から尿膜腔液が得られる。煩雑な精製方法によって望ましくないワクチン副作用をもたらす鶏卵由来の物質がウイルスから分離され、ウイルスが濃縮される。卵は無菌（病原体フリー）ではないため、存在する可能性のある発熱物質およびあらゆる病原体を除去および／または不活化することが追加的に必要である。
【０００４】
他のワクチンのウイルス、例えば狂犬病ウイルス、おたふく風邪、はしか、風疹、ポリオウイルス、Ｆｒｕｈｓｏｍｍｅｒ−Ｍｅｎｉｎｇｏ Ｅｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ＦＳＭＥ）ウイルス等のダニ媒介性脳炎ウイルス等は、細胞培養物において複製することができる。検査された細胞バンクに由来する細胞培養物は病原体を含まず、また鶏卵とは対照的に（理論的には）ほぼ無制限の量を利用できる確定されたウイルス複製システムであるため、細胞培養物は、インフルエンザウイルスの場合であっても、ある特定の環境下における経済的なウイルス複製を可能にする。さらに、卵におけるインフルエンザウイルスの単離および複製は、その大部分が臨床分離株とは異なる特定の表現型の選別をもたらす。継代依存的な選別が起こらない細胞培養物におけるウイルスの単離および複製は、これと対照的である（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２（１９９１）、１８５−１８９；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４（１９９３）２０４７−２０５１）。したがって、有効なワクチンのために、細胞培養物におけるウイルス複製が好ましい。
【０００５】
インフルエンザウイルスは細胞培養物において複製できることが知られている。インフルエンザウイルスのインビトロ複製に適した細胞として、ニワトリ胚細胞やハムスター細胞（ＢＨＫ２１−ＦおよびＨＫＣＣ）の他に、ＭＤＢＫおよびＭＤＣＫ細胞が報告されている（Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｅ．Ｄ．、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、８９−１１０頁、Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ−ニューヨークおよびロンドン、１９８７年）。プロテアーゼは赤血球凝集素の前駆タンパク質［ＨＡ０］を細胞外で開裂させて活性型赤血球凝集素［ＨＡ１およびＨＡ２］にするため、感染成功のための必要条件は、感染培地にプロテアーゼ、好ましくはトリプシンまたは同様のセリンプロテアーゼを添加することである。開裂した赤血球凝集素だけがインフルエンザウイルスの細胞上への吸着をもたらし、続いてウイルスを細胞内に同化させ（Ｔｏｂｉｔａ，Ｋ．ら、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２（１９７５）９−１４；Ｌａｚａｒｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．とＣｈｏｐｐｉｎ，Ｐ．Ｗ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８（１９７５）４４０−４５４；Ｋｌｅｎｋ，Ｈ．−Ｄ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８（１９７５）４２６−４３９）、その結果細胞培養物においてさらにウイルス複製サイクルをもたらす。
【０００６】
その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国再発行特許第３３，１６４号（米国特許第４，５００，５１３号より）は、付着増殖型ＣＬＤＫ細胞（すなわち「ａＣＬＤＫ細胞」）の細胞培養物におけるインフルエンザウイルスの複製を説明している。これらの細胞の付着増殖における制約的な要件は増殖可能な細胞の収量に制限を課し、その結果ワクチン製剤のために回収可能なウイルスの収量にも制限を課す。
【０００７】
さらに、付着（すなわち基質依存的）細胞におけるウイルス増殖は、細胞が浮遊状態で増殖できる場合には必要のないステップを要する。細胞増殖の後、栄養培地が除去されて新しい栄養培地が細胞に添加され、それと同時またはその直後に細胞のインフルエンザウイルス感染が行われる。感染から所定の時間を経た後、最適なウイルス複製を得るためにプロテアーゼ（例えばトリプシン）が添加される。ウイルスは回収、精製、加工されて不活化または弱毒化ワクチンが得られる。
【０００８】
しかし、ワクチン生産のための必要条件としての経済的なインフルエンザウイルスの複製は、米国再発行特許第３３，１６４号明細書に記載されている手順を用いて達成することはできない。その理由として、培地の交換とそれに続く感染とその後行われるトリプシンの添加は、各細胞培養容器の開放を何回も必要とし、したがって非常に労働集約的なためである。さらに、望ましくない微生物やウイルスによる細胞培養物のコンタミネーションの危険は、培養容器の操作毎に増加する。このシステムにおけるさらに別の不都合は、血清（ウシ胎仔血清、ウシ胎児血清（ｆｂｓ）、ウシ新生児血清またはウシ血清を含むが、これらに限定されない）が細胞増殖に必要なことである。血清は、ウイルス収量の障害となるトリプシンインヒビターを含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国再発行特許第３３，１６４号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５００，５１３号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｏｘｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２（１９９１）１８５−１８９
【非特許文献２】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４（１９９３）２０４７−２０５１
【非特許文献３】Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｅ．Ｄ．、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、８９−１１０頁、Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ−ニューヨークおよびロンドン、１９８７年
【非特許文献４】Ｔｏｂｉｔａ，Ｋ．ら、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２（１９７５）９−１４
【非特許文献５】Ｌａｚａｒｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．とＣｈｏｐｐｉｎ，Ｐ．Ｗ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８（１９７５）４４０−４５４
【非特許文献６】Ｋｌｅｎｋ，Ｈ．−Ｄ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６８（１９７５）４２６−４３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
より費用対効果の高い代替法は、細胞が培養容器またはマイクロキャリアの表面上に付着して増殖する必要のないシステムにおける細胞増殖である。その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，６５６，７２０号は、浮遊状態で増殖するＭＤＣＫ細胞をインフルエンザウイルスに感染させる、このような一方法の例を提供する。しかし、効率を上げて総費用を下げるためのウイルス増殖の代替手段を提供する追加的な細胞系と手順が必要とされる。
【００１２】
したがって、動物由来成分を含まない培地（例えば、無血清培地または動物性タンパク質を含まない培地）で培養され、動物の副産物（例えばウシ血清）の使用に伴うリスクを低減し、このような動物副産物の経費を削減することができる、追加的な細胞系の必要がある。さらに、基質依存的な増殖の必需品（例えば、Ｔ−フラスコ、ローラーボトルまたはマイクロキャリア）を省き、その代わりに浮遊培養を行う一般的な必要もある。浮遊培養は、コスト節減、より高い細胞密度、より多いウイルス収量等、基質依存的な増殖に優る多くの利点がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ａ）ｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液にウイルスを接種し、これによりｓＣＬＤＫ細胞を感染させるステップ、ｂ）感染ｓＣＬＤＫ細胞においてウイルスを繁殖させるステップおよびｃ）ｓＣＬＤＫ細胞の浮遊培養物からウイルスを回収するステップを含む、ｓＣＬＤＫ細胞の培養物においてウイルスを複製する方法を対象とする。ウイルスは、ヒトインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、馬インフルエンザウイルス、豚インフルエンザウイルス、犬インフルエンザウイルスまたは猫インフルエンザウイルス等の、インフルエンザウイルスであってよい。限定されないが、インフルエンザウイルスは、Ｈ１型インフルエンザウイルス、Ｈ２型インフルエンザウイルス、Ｈ３型インフルエンザウイルス、Ｈ５型インフルエンザウイルスまたはＨ７型インフルエンザウイルスであってよい。限定されないが、インフルエンザウイルスは、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルス、Ｈ３Ｎ８型インフルエンザウイルス、Ｈ１Ｎ１型インフルエンザウイルス、Ｈ３Ｎ２型インフルエンザウイルス、Ｈ２Ｎ３型インフルエンザウイルス、Ｈ７Ｎ８型インフルエンザウイルスまたはＨ３Ｎ１型インフルエンザウイルスであってよい。本発明の一実施形態において、接種直前に、接種と同時に、または接種直後に、赤血球凝集素の前駆タンパク質を開裂させるためのプロテアーゼがｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液に添加される。プロテアーゼはトリプシンであってよい。
【００１４】
本発明はまた、ａ）血清代替物を含む培地に基質依存的なＣＬＤＫ細胞のサンプルを接種するステップ、ｂ）培地において浮遊状態で細胞を増殖させるステップ、ｃ）ＣＬＤＫ細胞を新しいバッチの培地において浮遊状態で連続継代するステップおよびｄ）培地中の血清代替物の量をゼロまで減少させることによって、浮遊状態のＣＬＤＫ細胞から血清代替物を断つステップを含む、基質依存的なＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で増殖するように適合させる方法も対象とする。この方法はまた、「適合方法」とも言う。培地は無血清であってよい。培地はまた、動物由来成分を全く含まなくてもよい。
【００１５】
適合方法の一実施形態において、細胞は、ステップ（ｃ）において、７日間の増殖係数が少なくとも約３から２０、好ましくは約５より大きく、さらに好ましくは約７より大きく、最も好ましくは約１０より大きくなるまで連続継代される。ステップ（ｃ）の３から１５連続継代の間の平均増殖係数がこのような値を達成した後、続く３から６継代にわたって浮遊状態のＣＬＤＫ細胞は血清代替物を断つことができる。非限定的な例として、浮遊状態で少なくとも５−１０継代の平均増殖係数が約５より大きくなるまでＣＬＤＫ細胞は浮遊状態で連続継代され、この時点で細胞は続く６継代以内にわたって血清代替物を断たれる。好ましくは、浮遊状態で少なくとも１０継代の平均増殖係数が約８より大きくなるまでＣＬＤＫ細胞は浮遊状態で連続継代され、この時点で細胞は続く６継代以内にわたって血清代替物を断たれる。あるいは、浮遊状態で少なくとも５継代の平均増殖係数が約１２より大きくなるまでＣＬＤＫ細胞は浮遊状態で連続継代され、この時点で細胞は続く６継代以内にわたって血清代替物を断たれる。
【００１６】
ＣＬＤＫ細胞は、適合方法において血清代替物を首尾よく断つことができ、ただし、最初の血清断ち継代の直前の継代における７日間の増殖係数は少なくとも５である。好ましくは、血清断ち継代の直前の最後の継代における７日間の増殖係数は、少なくとも７、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも約１３である。
【００１７】
本発明はまた、ａ）培地にｓＣＬＤＫ細胞を接種するステップ、ｂ）ｓＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で約４から１０日の期間増殖させるステップ、ｃ）（ｂ）の培養物のサンプルを細胞を含まない新しい培地に移すステップおよびｄ）連続増殖の期間において（ｂ）と（ｃ）を繰り返すステップを含む、ｓＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で連続的に増殖させる方法も対象とする。培地は無血清であってよい。培地は動物性タンパク質を含まなくてもよい。サンプルは、前もってプロテアーゼを全く添加することなく細胞を含まない新しい培地に移すことができる。（ｃ）に従ってサンプルを移した後の細胞密度は、少なくとも３×１０５細胞／ｍＬであってよく、好ましくは少なくとも５×１０５細胞／ｍＬであってもよい。ｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日の期間にわたる増殖係数が３より大きくてよく、４−１０日の期間にわたって好ましくは増殖係数約５より大きくてよく、最も好ましくは約１０より大きくてよい。
【００１８】
本発明はまた、適合方法によって得られる、浮遊状態で増殖できるｓＣＬＤＫ細胞も対象とする。上述の通り、適合方法は、ａ）血清代替物を含む培地において基質依存的なＣＬＤＫ細胞のサンプルを接種するステップ、ｂ）培地において浮遊状態で細胞を増殖させるステップ、ｃ）ＣＬＤＫ細胞を新しいバッチの培地において浮遊状態で連続継代するステップおよびｄ）培地中の血清代替物の量をゼロまで減少させることによって、浮遊状態のＣＬＤＫ細胞から血清代替物を断つステップを含む、基質依存的なＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で増殖するように適合させる方法である。培地は無血清であってよい。血清代替物は動物性タンパク質を含まなくてもよい。本発明はまた、ウイルス複製のための、本方法によって得られるこのようなｓＣＬＤＫ細胞の使用も対象とする。本発明はまた、ワクチン製造における、本方法によって得られるこのようなｓＣＬＤＫ細胞において複製されたこのようなウイルスの使用も対象とする。
【００１９】
本発明はまた、細胞培養培地およびｓＣＬＤＫ細胞を含む組成物も対象とする。
【００２０】
本発明はまた、ａ）培地にｓＣＬＤＫ細胞を接種するステップ、ｂ）培地において浮遊状態でｓＣＬＤＫ細胞を増殖させ、これによってｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液を作製するステップ、ｃ）ｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液をウイルスと共にインキュベートし、これによって感染ｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液を作製するステップ、ｄ）ウイルスを感染ｓＣＬＤＫ細胞内で繁殖させるステップ、ｅ）ウイルスを回収または単離するステップおよびｆ）回収または単離されたウイルスを１種または複数の薬学的に許容される担体と混合し、これによってワクチンを作製するステップを含む、ワクチンの製造方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、細胞培養物における簡便で経済的なウイルス複製を可能にする、細胞および方法の提供に関する。したがって、本発明は、ウイルスが感染することができ、無血清または動物性タンパク質を含まない培地において浮遊状態で増殖するように適合させた動物細胞に関する。この種類の細胞を用いることによって、簡便で経済的な仕方で細胞培養物におけるウイルス複製が可能となることが判明した。細胞が浮遊状態で増殖するように適合されているため、製造バッチはより多数の細胞を、続いてより高力価のウイルスを生産する。ウイルスの収量が高くなれば、全製造コストが抑えられる。さらなる利点として、培地の消費が顕著に減少し、これによって全培地コストを抑えられることが挙げられる。同様に重要なことに、本発明の利点として、ウシ血清またはウシ胎児血清等の動物由来成分のいずれも含まない培地における細胞の増殖（およびそれに続くウイルス複製）があり、これによりＴＳＥ（感染性海綿状脳症）を限定することなく含む様々な病原体リスクの削減が挙げられる。
【００２２】
さらに、本発明に係る細胞の使用によって、一方では血清除去のための感染前の培地交換を省略することができ、他方ではプロテアーゼの添加（必要であれば）を感染と同時に行うことができる。総合的には、培養容器をウイルス感染のために１回だけ開放することが必要であり、それによって細胞培養物のコンタミネーションの危険が大幅に低減される。培地交換、感染およびそれに続くプロテアーゼ添加に関連する労力の使用は、さらに減少する。
【００２３】
本発明において使用されている細胞は、基質依存的カッターラボラトリー・イヌ腎（Ｃｕｔｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｏｇ Ｋｉｄｎｅｙ；ＣＬＤＫ）細胞に由来する。本明細書において、「基質依存的ＣＬＤＫ細胞」および類似の用語は、「付着型ＣＬＤＫ細胞」、「ａＣＬＤＫ細胞」または類似の用語と同義的に用いられている。ａＣＬＤＫ細胞は、浮遊型ＣＬＤＫ細胞とは異なる。前者が付着して増殖するのに対し、後者は使い捨てまたは非使い捨てバイオリアクタまたはバイオコンテナを限定することなく含む、シェーカーフラスコまたは他の大規模製造容器等において浮遊状態で増殖する。ａＣＬＤＫ細胞は、ローラーボトルの表面または培地に添加されたマイクロキャリアもしくはビーズ等、その上で増殖するための表面を必要とする。ａＣＬＤＫ細胞は浮遊状態では増殖しない。振動台上に置かれたシェーカーフラスコ内の培地に接種された場合、ａＣＬＤＫ細胞はある程度の生存率を維持することはできるが、増殖はしない。むしろａＣＬＤＫ細胞は細胞塊を形成する傾向がある。
【００２４】
浮遊型ＣＬＤＫ細胞はまた、「ｓＣＬＤＫ」細胞または「ｓＣＬＤＫ−ＳＦ」細胞とも言い、これら細胞が無血清培地で増殖することを示している。ｓＣＬＤＫ細胞は、本明細書に記載されているように、無血清培地において浮遊状態で継代することによってａＣＬＤＫ細胞から得られる。これらの特性およびウイルス複製のための宿主細胞として機能するその能力のために、ｓＣＬＤＫ細胞は、簡便で費用対効果の高い方法の細胞培養物における経済的なウイルス複製に適している。ａＣＬＤＫ細胞とは対照的に、ｓＣＬＤＫ細胞は振動台上に置かれたシェーカーフラスコまたは他の浮遊増殖手段で増殖する。ｓＣＬＤＫ細胞はこのような浮遊増殖条件で生存率を維持するだけではなく、ａＣＬＤＫ細胞のように凝集または細胞塊を形成することなく細胞数を増やすことができる。
【００２５】
さらに後述する通り、ｓＣＬＤＫ細胞はａＣＬＤＫ細胞に優る多くの利点を有する。第一に、ａＣＬＤＫ細胞とは異なり、ｓＣＬＤＫ細胞は浮遊状態で増殖する。ａＣＬＤＫ細胞とは異なり、ｓＣＬＤＫ細胞は、浮遊状態での増殖のために新しい培地に４−１０日の期間で移された場合少なくとも３の増殖係数（３）を有する。本発明の一実施形態において、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日の期間で３より大きく、好ましくは５より大きい係数で浮遊状態で増殖する。より好ましくは、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日の期間で約６より大きく、最も好ましくは約１０より大きい係数で浮遊状態で増殖する。
【００２６】
ａＣＬＤＫ細胞とは異なり、ｓＣＬＤＫ細胞はまた、浮遊状態で連続的に増殖することができる。ｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日毎に新しい培地に移された場合、３より大きく、好ましくは５より大きい係数で浮遊状態で連続的に増殖することができる。より好ましくは、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日の期間毎に新しい培地に移された場合、約６より大きく、最も好ましくは約１０より大きい係数で浮遊状態で連続的に増殖することができる。
【００２７】
ｓＣＬＤＫ細胞がａＣＬＤＫ細胞に優る別の利点は、前者は血清または他の動物由来の培地サプリメントなしで増殖できることである。ａＣＬＤＫ細胞とは異なり、血清または他の動物由来の培地サプリメントを含まない新しい培地に４−１０日の期間で移された場合、ｓＣＬＤＫ細胞は平均して少なくとも３倍になる。本発明の一実施形態において、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、血清または他の動物由来の培地サプリメントを含まない培地で、４−１０日の期間で３より大きく、好ましくは５より大きい係数で増殖する。より好ましくは、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、血清または他の動物由来の培地サプリメントを含まない新しい培地に移された場合、４−１０日の期間で約６より大きく、最も好ましくは約１０より大きい係数で増殖する。
【００２８】
ａＣＬＤＫ細胞とは異なり、ｓＣＬＤＫ細胞はまた、血清または他の動物由来成分を含まない培地で連続的に増殖することもできる。ｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日毎に新しい培地に移された場合、３より大きく、好ましくは５より大きい係数で、血清または他の動物由来成分を含まない培地で連続的に増殖することができる。より好ましくは、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日毎に新しい培地に移された場合、約６より大きく、最も好ましくは約１０より大きい係数で、血清または他の動物由来成分を含まない培地で連続的に増殖することができる。
【００２９】
したがって、ｓＣＬＤＫ細胞の利点は、血清または他の動物由来成分を含まない培地において浮遊状態で連続的に増殖するその能力である。ｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日毎に新しい培地に移された場合、３より大きく、好ましくは５より大きい係数で、血清または他の動物由来成分を含まない培地において浮遊状態で連続的に増殖することができる。より好ましくは、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞は、４−１０日の期間毎に新しい培地に移した場合、約６より大きく、最も好ましくは約１０より大きい係数で、血清または他の動物由来成分を含まない培地において浮遊状態で連続的に増殖することができる。
【００３０】
本明細書において、「増殖係数」または類似の用語は、それによって最初の細胞集団がある期間において増殖した乗数値を意味する。したがって、２または３の増殖係数は、細胞が新しい培地に移された（すなわち、接種または植え継がれた）出発時点の細胞密度と比べて細胞密度がそれぞれ２倍または３倍になったことを示す。１０または２０の増殖係数は、細胞密度が、細胞が新しい培地に移された出発時点の細胞密度に対してそれぞれ係数１０または２０を掛けたことを示す。１以下の増殖係数は、細胞密度が増加しなかったこと、または細胞集団が減少したことを示す。
【００３１】
したがって、本発明はまた、本発明に係る細胞が使用されている細胞培養物におけるウイルス複製の方法にも関する。特に、次のステップ：ｉ）上述の本発明に係る細胞の無血清培地における浮遊状態の増殖、ｉｉ）細胞のウイルスによる感染、ｉｉｉ）感染細胞の培養およびｉｖ）複製されたウイルスの単離、を含む方法に関する。インフルエンザウイルスの場合のように力価が上昇し得る場合、感染の直前に、同時に、または直後にプロテアーゼが添加されてもよい。本発明の非限定的な一実施形態において、ｓＣＬＤＫ細胞は無血清培地で増殖してインフルエンザウイルスを複製する。当業者であれば、本明細書に記載されているｓＣＬＤＫ細胞内で複製できる他のウイルスを知っており、これはインフルエンザウイルスの複製に限定されない。
【００３２】
本発明はまた、ａ）ｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液にウイルスを接種し、これによってｓＣＬＤＫ細胞を感染させるステップ、ｂ）感染ｓＣＬＤＫ細胞内でウイルスを繁殖させるステップおよびｃ）ｓＣＬＤＫ細胞の浮遊培養物からウイルスを回収するステップを含む、ｓＣＬＤＫ細胞培養物においてウイルスを複製する方法も対象とする。ウイルスは、遠心分離、濾過または他の機械的もしくは生化学的な感染細胞懸濁液の分離手段によって、回収することができる。したがって、回収されたウイルスは、ｓＣＬＤＫ細胞またはｓＣＬＤＫ細胞破片を含有したウイルスを含むことができる。回収されたウイルスはまた、ｓＣＬＤＫ細胞またはｓＣＬＤＫ細胞破片を含有しないウイルスを含むこともできる。
【００３３】
本発明に係る細胞は、好ましくは当業者に知られている動物由来成分を含まない培地（例えば、無血清培地、動物性タンパク質を含まない培地）で培養することができる。このような培地の非限定的な例として、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）培地、ｕｌｔｒａ ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、レネックサ、カンザス州）が挙げられる。本発明に従って用いることができる他の無血清培地は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）５２０培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、レネックサ、カンザス州）およびＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）を含む。本発明に従って用いることができる他の動物性タンパク質を含まない培地は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３０２培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、レネックサ、カンザス州）、ＨｙＱ ＰＦ ＣＨＯ ＭＰＳ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）およびＲｅｎｃｙｔｅ ＢＨＫ培地（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ、ジリン、デンマーク）を含む。本発明に従って用いることができる他の大豆または酵母ベースの動物性タンパク質を含まない培地は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている次の全文献、米国特許第７，１６０，６９９号または米国特許出願公開第２００３／０２０３４４８号、第２００４／００７７０８６号、第２００４／００８７０２０号、第２００４／０１７１１５２号、第２００５／００８９９６８号、第２００６／００９４１０４号、第２００６／０２８６６６８号、に記載されているものを含む。本発明に係る方法の過程で用いることができる適切な培養容器は、当業者に知られたあらゆる容器である。
【００３４】
血清代替物が動物由来成分を含まない培地に添加されてもよい。このような代替物は、それ自身動物由来成分を全く含まないが、細胞で、好ましくは動物由来成分を含まない培地で培養した細胞で発現した組換え動物性タンパク質を含むことができる。血清代替物は、組換え成長因子、トランスフェリン代替物もしくは組換えトランスフェリン代替物、合成ホルモンおよび／または他の組換えタンパク質を含むことができる。組換えタンパク質成分は病原体を含まないまたはウイルスを含まない細胞において制御された環境で製造されるため、血清代替物は外来性ウイルスを全く含まない。したがって、血清代替物はウイルスまたはＴＳＥ（感染性海綿状脳症）リスクがない。血清代替物は、好ましくは付着型ＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で増殖するように適合させる（すなわち、ａＣＬＤＫ細胞をｓＣＬＤＫ細胞に転換させる）ために用いられる。しかしこのような代替物はまた、本発明に係るウイルス増殖のためのｓＣＬＤＫ細胞の浮遊培養のためにも用いることができる。血清代替物の非限定的な例として、ＬＩＰＵＭＩＮ（商標）血清代替物（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、パシング、オーストリア）が挙げられる。
【００３５】
インフルエンザウイルスの場合の感染前細胞増殖の温度は、好ましくは３７℃である。細胞増殖のための培養は、例えば攪拌容器発酵槽等の灌流システムにおいて、例えば遠心分離、濾過、スピンフィルター等の当業者に知られた細胞保持システムを用いて、バッチ操作または当業者によく知られた他の技法を用いて行うことができる。
【００３６】
この場合、細胞は好ましくは２から１８日間、特に好ましくは３から１１日間増殖される。培地交換は、この過程で１日当たり０から約１から３容量に増加させて行われる。細胞は、この仕方で非常に高い細胞密度、好ましくは約２×１０７細胞／ｍｌになるまで増殖させる。灌流システムの培養における灌流量は、細胞計数および培地中のグルコース、グルタミンまたは乳酸塩の含有量の両方によって、ならびに当業者に知られた他のパラメーターによって調節することができる。インフルエンザウイルス感染の場合、発酵槽容量の約８５％から９９％、好ましくは９３から９７％が細胞と共にさらに別の発酵槽に移される。最初の発酵槽に残った細胞は次に培地と混合され、灌流システムでさらに複製することができる。この仕方で、ウイルス複製のための連続的な細胞培養が可能となる。
【００３７】
本発明に係る方法の好ましい一実施形態において、用いられている培養培地のｐＨは培養中に調節されてもよく、それはｐＨ６．６からｐＨ７．８の範囲、好ましくはｐＨ６．８からｐＨ７．３の範囲である。
【００３８】
さらにｐＯ２値は、有利には方法のこのステップで調節され、好ましくは２５％−９５％、特に３５％−６０％（空気飽和に基づく）である。本発明に従って、浮遊培養されている細胞の感染は、好ましくはバッチ法における細胞が灌流システムにおいて約８から２５×１０５細胞／ｍｌまたは約５から２０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度を達成したときに行われる。
【００３９】
さらに好ましい一実施形態において、インフルエンザウイルスの場合、細胞の感染は約０．０００１から１０、好ましくは０．００２から０．５のｍ．ｏ．ｉ．（感染効率）で行われる。赤血球凝集素の前駆タンパク質［ＨＡ０］の開裂とそれに続く細胞上のウイルス吸着をもたらすプロテアーゼの添加は、細胞にインフルエンザウイルスを感染させる直前に、同時にまたは直後に、本発明に従って行うことができる。添加が感染と同時に行われる場合、プロテアーゼは、感染される細胞培養物に直接添加されてもよいし、例えば濃縮物としてウイルス接種と共に添加されてもよい。プロテアーゼは、好ましくはセリンプロテアーゼ、特に好ましくはトリプシンである。
【００４０】
好ましい一実施形態において、トリプシンは感染される細胞培養物に、培養培地において１から２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５から５０μｇ／ｍｌ、特に好ましくは５−３０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加される。バッチ法の場合またはトリプシン溶液の連続的添加もしくは断続的添加による灌流システムの場合、本発明に係る感染細胞のさらなる培養の間にトリプシンを新たに添加することによってトリプシン再活性化を行うことができる。後者の場合、トリプシン濃度は好ましくは１μｇ／ｍｌから８０μｇ／ｍｌの範囲である。
【００４１】
感染の後、感染細胞培養物は、特に最大細胞変性効果または最大量のウイルス抗原が検出できるまでさらに培養されてウイルスを複製する。好ましくは、細胞の培養は、２から１０日間、特に３から７日間行われる。培養は次に好ましくは灌流システムまたはバッチ法において行うことができる。
【００４２】
さらに好ましい一実施形態において、細胞は、５−１５％ＣＯ２、最も好ましくは約１０％ＣＯ２にセットされたインキュベーター内で３０℃から３７℃の温度で培養することができる。
【００４３】
インフルエンザウイルスの場合のように、感染後の細胞培養は次に好ましくは調節されたｐＨおよびｐＯ２で行われる。この場合のｐＨは、好ましくは６．６から７．８、特に好ましくは６．８から７．２の範囲であり、ｐＯ２は２５％から１５０％、好ましくは３０％から７５％、特に好ましくは３５％から６０％（空気飽和に基づく）の範囲である。
【００４４】
方法における細胞培養またはウイルス複製の間、抗原収量を最適化するために、細胞培養培地を新たに調製した培地、培地濃縮物またはアミノ酸、ビタミン、脂質画分、リン酸塩等の同定された構成要素に置換することも可能である。
【００４５】
インフルエンザウイルスの場合のように、細胞は感染後、培地または培地濃縮物を数日間にわたってさらに添加することによって徐々に希釈されてもよいし、約１−３から０発酵槽容量／日に減らしながら培地または培地濃縮物でさらに灌流する間インキュベートされてもよい。次にこの場合、灌流量は細胞計数、グルコース、グルタミン、乳酸塩もしくは乳酸脱水素酵素の培地中の含有量または当業者に知られた他のパラメーターによって調節することができる。
【００４６】
灌流システムと流加培養法の組み合わせがさらに可能である。この方法の好ましい一実施形態において、複製したウイルス（例えばインフルエンザウイルス）の回収と単離は、感染後２から１０日以内、好ましくは３から７日以内に行われる。例えばこの回収を行うために、例えば遠心分離、分離器またはフィルター等、当業者に知られた方法によって、細胞または細胞残渣が培養培地から分離される。このようなステップの後に、培養培地中に存在しているウイルスの濃縮が、例えば勾配遠心分離、濾過、沈殿等、当業者に知られた方法によって行われる。
【００４７】
本発明はさらに、本発明に係る方法によって得られるインフルエンザウイルスに関する。インフルエンザウイルスは公知の方法によって回収、製剤され、ヒトまたは動物に投与するためのワクチンを得ることができる。得られたインフルエンザウイルスを含むワクチンの免疫原性または有効性は、当業者に知られた方法、例えば負荷試験において付与された保護によってまたは中和抗体の抗体価として決定することができる。生産されたウイルスすなわち抗原の量の決定は、例えば当業者に知られた方法に従った赤血球凝集素量の決定によって行うことができる。例えば、開裂した赤血球凝集素は様々な種の赤血球、例えばニワトリ赤血球に結合することが知られている。これにより生産されたウイルスまたは形成された抗原の簡便で迅速な定量化が可能となる。
【００４８】
したがって、本発明はまた、本発明に係る方法から得られるウイルスを含むワクチンに関する。この種類のワクチンは、場合によって通例ワクチン用である添加物、特に免疫応答を高める物質、すなわち例えば様々な金属の水酸化物、カルボマー、細菌細胞壁の構成要素、オイルまたはサポニン等のアジュバント、および通例の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。
【００４９】
ウイルスは、無傷のウイルス粒子として、特に弱毒化生ウイルスとしてワクチン中に存在することができる。このため、ウイルス濃縮物は所望の力価に調整されて、凍結乾燥されるかまたは液体の形状で安定化させる。
【００５０】
さらに別の一実施形態において、本発明に係るワクチンは、分解された、不活化されたまたは無傷だが不活化されたウイルスを含むことができる。このため、化学的および／または物理的方法（例えば、界面活性剤またはホルムアルデヒド）によってウイルスの感染力が失われる。続いてワクチンは所望の抗原量に調整され、可能であればアジュバントとの混合の後、または可能であればワクチン製剤の後、例えばリポソーム、ミクロスフィアまたは他の「徐放」製剤において調合される。
【００５１】
さらに別の好ましい一実施形態において、本発明に係るワクチンは、最終的にサブユニットワクチンとして存在することができる。すなわち、ワクチンは、同定され、単離されたウイルス構成要素、好ましくはインフルエンザまたはその他のウイルスの単離タンパク質を含むことができる。これらの構成要素を、当業者に知られた方法によってウイルスから単離することができる。
【００５２】
さらに、本発明に係る方法によって得られるインフルエンザまたはその他のウイルスを、診断目的に用いることができる。したがって、本発明はまた、適切であれば通例本分野の添加物および適切な検出剤と組み合わせた、本発明に係るインフルエンザもしくはその他のウイルスまたはこのようなウイルスの構成要素を含む診断用組成物に関する。
【００５３】
次の実施例は単に例示的なものであり、決して本開示の残り部分を限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
実施例１Ａ：血清または血清代替物を含まない浮遊増殖へのＣＬＤＫ細胞の適合
カッターラボラトリー・イヌ腎（Ｃｕｔｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｏｇ Ｋｉｄｎｅｙ；ＣＬＤＫ）細胞は足場依存性であり、したがって増殖するための基質またはその表面を必要とする。適切な基質は、Ｔ−フラスコもしくはローラーボトル等の容器の内部表面、または培養容器に添加することができるビーズもしくはマイクロキャリアの表面上を含む。通常これらの細胞は基質上に単層を形成し、静置培養およびローラーボトルで増殖できる。これらの細胞は増殖に血清を必要とし、また形態学的には上皮細胞的である。
【００５５】
２本のアンプルのカッターラボラトリーズａＣＬＤＫ細胞を解凍し、続いて各チューブに１ｍＬの解凍された材料が入るよう、２本の４ｍＬクライオチューブに移した。１ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を各クライオチューブに添加した。本明細書における「サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地」は、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ溶液２０ｍＬ／培地１Ｌ）およびゲンタマイシン（培地１リットル当たり０．５ｍＬの１００ｇ／ｍＬ溶液）を補充したＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、レネックサ、カンザス州）の混合物を言う。２本のクライオチューブを３−５分間静置した後、全材料を２本の１５ｍＬ遠心分離チューブに移した。約８ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を各１５ｍｌ遠心分離チューブに加えた。次にこれら２本のチューブを３−５分間静置した後、１０分間、約１，０００ｒｐｍ（５００×ｇ）で遠心分離した。培地上清を捨て、ペレット化した細胞を全容量２０ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地に再懸濁した。再懸濁された細胞を０．２μベントキャップを取り付けた１２５ｍＬシェーカーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、コーニング、ニューヨーク州）に移し、そこへ追加のサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を３０ｍＬ加えて、全容量５０ｍＬを得た。これらの細胞は、下の表１の継代数１に対応し、これを１０％ＣＯ２供給下３７℃ウォータージャケットインキュベーター内のロータリーシェーカープレート上に１週間置いた。
【００５６】
浮遊状態におけるいくらかの増殖を求めるため、細胞を１週間基準で２回以上（表１の継代２および３）、血清または血清代替物なしでシェーカーフラスコに植え継いだ。しかし表１に示す通り、これらの条件のａＣＬＤＫ細胞で記録された最も大きい増殖係数は、７日の期間当たり３未満であった。続く１３継代は、培養培地に１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８界面活性剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、カリフォルニア州）も含んでいた。これらの期間、細胞は高い生存率を維持していたが、表１に示す通り増殖係数は７日の期間当たり（平均）２未満であり続けた。次の１４継代は、培地に１％Ｌｉｐｕｍｉｎ（商標）ＡＤＣＦ（動物由来成分を含まない）血清代替物（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、パシング、オーストリア）も含んでいた。これらの継代の間、平均増殖係数は（表１に示す通り）、１２より大きく、細胞の生存率は＞９５％であった。次の継代では、細胞を０．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８界面活性剤と０．５％Ｌｉｐｕｍｉｎ（商標）ＡＤＣＦ血清代替物で血清断ちさせた。その次の継代では、細胞を０．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８界面活性剤と０．２５％Ｌｉｐｕｍｉｎ（商標）ＡＤＣＦ血清代替物で血清断ちさせた。続く６継代は、細胞からＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８界面活性剤とＬｉｐｕｍｉｎ（商標）ＡＤＣＦ血清代替物を完全に断った。これら最後の６継代の間、細胞は平均１７より大きい増殖係数を有し（表１に示す通り）、高い生存率を保持し続けた。
【００５７】
表１は、本実施例に記載されている継代の履歴を示す。示されているように、サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地は、表示量のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８界面活性剤またはＬｉｐｕｍｉｎ（商標）ＡＤＣＦ血清代替物と共に全容量５０ｍＬを継代毎に用いた。各継代は、１週間、１０％ＣＯ２供給下３７℃のウォータージャケットインキュベーター内のロータリーシェーカープレートに置かれた、１２５ｍＬシェーカーフラスコ中で行った。「細胞植え継ぎ密度」は、継代当初（すなわち、週の最初）の培地５０ｍＬにおける細胞濃度を言い、細胞／ｍＬで提示される。１週間後、材料のサンプルから細胞を計数し、「細胞計数／ｍＬ」を決定した。「７日間の増殖係数」は、「細胞計数／ｍＬ」値を「細胞植え継ぎ密度」値で割ることによって決定した。
【００５８】
【表１】
【００５９】
３８回目の継代の細胞から、１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州）を含む少量の細胞ストック（１５−２０本のクライオバイアル）をアンプルに入れて凍結し、液体窒素（ＬＮ）中で保存した。名称をｓＣＬＤＫ−ＳＦに変えたが、「ｓ」は浮遊（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、「−ＳＦ」はこの方法において無血清（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）であることを意味する。この細胞系の凍結に血清は利用しなかった。
【００６０】
３８回目の継代後のバイアルを凍結してから約５ヶ月後、凍結バイアルの内２本を解凍し、シェーカーフラスコ内に置いた。これらの細胞を１２５ｍＬシェーカーフラスコ内で１週間増殖した（継代数３９）。次いでこれらの細胞を、それぞれが０．２μベントキャップを取り付けた１１個の１Ｌ Ｎａｌｇｅｎｅシェーカーフラスコを用いて４４００ｍＬにスケールアップ（２以上の継代にわたって）した。継代数４１の４日目（９６時間）に、対数期（活発に増殖している）の細胞を回収し、１０％ＤＭＳＯを添加し、自動アンプル充填および、封止装置を用いてＨＥＰＡ濾過空気下でガラス製アンプルに充填し、封をした。マスター細胞ストックバンクは、適切な封止であるか検査し、ラベルを貼り、液体窒素中で凍結した。数個の凍結サンプルを解凍し、生じ得るコンタミネーション（カビおよび細菌によるコンタミネーション）に関して選別した。選別によって、それぞれ２８℃および３７℃のトリプトン大豆ブロスおよびトリプトースリン酸ブロスにおいて２１日後に、カビまたは細菌の増殖がないことが明らかになった。
【００６１】
実施例１Ｂ：血清または血清代替物を含まない浮遊増殖へのａＣＬＤＫ細胞の適合
次に上述のＣＬＤＫ適合手順をより少ない継代で繰り返し、完了した。次表は、培養培地およびこの次の手順で観察された増殖についてまとめている。
【００６２】
【表２】
【００６３】
実施例１Ｃ：液体窒素保存からｓＣＬＤＫ−ＳＦ ＭＣＳ細胞の回収と最適な成長増殖の手段
１Ｌのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を無菌法を用いて調製した。その後、実施例１Ａにおける継代４１の凍結アンプルから得られた細胞２−３ｍＬを液体窒素から回収し、解凍した。解凍したアンプルに７０％アルコールをスプレーし、乾かした。滅菌アンプルスナッパーを用いて全バイアルを割り開けた。その後、滅菌ピペットを用いて一アンプルの細胞を小容量の蓋つき滅菌チューブ（４．５ｍＬ滅菌クライオバイアルまたは同等品）に移した。このステップを第二、第三のアンプルに対して繰り返した。
【００６４】
滅菌ピペットを用いて、１．０ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を各チューブに添加した。細胞−培地混合物を含むこれらのチューブを約３−５分間置いた後、滅菌ピペットを用いて細胞−培地混合物を１本の小容量滅菌チューブから１５ｍＬ遠心分離チューブ（Ｆａｌｃｏｎまたは同等品）に移した。このステップを細胞−培地混合物を含む第二、第三の小容量チューブに対して繰り返した。約８．０ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を各チューブに添加した。それぞれ１０ｍＬの細胞−培地混合物を含む全１５ｍＬ遠心分離チューブを５−１０分間置いた後、チューブを約５００×ｇで１０分間遠心分離した。次に、ペレットを維持したまま培地を遠心分離チューブから注ぎ出した。滅菌ピペットを用いて約５ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を各遠心分離チューブに添加した。続いてペレットを遠心分離チューブ内で再懸濁した。全チューブの再懸濁した細胞−培地混合物を、０．２μｌベントキャップを取り付けた１２５ｍＬシェーカーフラスコ１本に移した。次に約４０ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を１２５ｍＬシェーカーフラスコに添加し、続いてフラスコを１０％ＣＯ２にセットした３７℃インキュベーター内のロータリーシェーカー（１００−１１０ＲＰＭ）上に置いた。細胞を４から７日間インキュベートした。７日間で、生存率が実質的に損なわれることなく最大の細胞増殖係数を得た。自動哺乳類細胞カウンターを用いて細胞および生存率の計数を行った。
【００６５】
実施例１Ｄ：ｓＣＬＤＫ−ＳＦ ＭＣＳ細胞を成長増殖のために植え継ぐ手順
次の手順は、ｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞の連続増殖のために最適化された。この方法は実施例１Ｃのように細胞を回収した後に始まり、７日毎に繰り返して連続的な細胞増殖を維持することができる。細胞は、サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地において増殖する。
【００６６】
サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地中の生きたｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞を含むシェーカーフラスコをインキュベーターから回収した後、滅菌ピペットを用いて細胞サンプルをシェーカーフラスコからサンプルバイアルに移す。自動または手動の計数手段を用いて細胞および生存率の計数を行う。計数が行われた後、新しいシェーカーフラスコに細胞密度５．０×１０５細胞／ｍＬの５０ｍＬ（すなわち２．５×１０７細胞／１２５ｍＬシェーカーフラスコ）で植え継ぐのに必要な細胞の全容量を算出する。
【００６７】
算出された容量の細胞を、滅菌ピペットで新しい１２５ｍＬシェーカーフラスコに移す。おおよその容量のサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を全容量５０ｍＬになるように添加した後、シェーカーフラスコをロータリーシェーカー（１００−１１０ＲＰＭ）上に置く。１０％ＣＯ２インキュベーター内３７℃で７日間の期間、細胞をそのまま維持する。この方法を４−１０日毎に１回繰り返して細胞を恒常的に維持することができる。次のデータは、連続的な細胞増殖のための連続継代を表している。継代１−１６は１週間毎に行われ、継代１７−３４は４日毎に行われた。
【００６８】
【表３】
【００６９】
実施例２：ｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞に対する比較のためのａＣＬＤＫ細胞の別の無血清培地における浮遊状態の増殖
ａＣＬＤＫ細胞を液体窒素保存から取り出し、１０％ＦＢＳ含有イーグル（Ｅａｇｌｅ）最小必須培地（ＥＭＥＭ）を用いて７５ｃｍ２フラスコで約４８時間増殖させた。次に細胞を５％ウシ胎児血清とＥＭＥＭ培地を含む８５０ｃｍ２ローラーボトルに移した。次いでこのローラーはトリプシン処理された。細胞を回収し、５．０×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で２本の異なる１２５ｍｌシェーカーフラスコに植え継いだ。これら２本のフラスコの内、１本のフラスコはサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地を含み、もう１本のフラスコはＥＭＥＭ培地を含んだ。ｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞を含む第三のフラスコ（利用可能な連続ストック）をサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地において細胞密度５．０×１０５細胞／ｍＬで植え継いだ。続いて３本の懸濁フラスコを３７℃のウォータージャケットインキュベーター内のロータリーシェーカーに置き、細胞および生存率の計数のために１日毎に標本抽出した（下の結果を参照）。
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
【表６】
【００７３】
本実験から、ａＣＬＤＫ細胞はＥＭＥＭ培地において浮遊培養では増殖しないことが結論できる。このデータはまた、サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地におけるａＣＬＤＫが、生産のための生存能力のある代替物であると考慮するのに十分な速度で増殖しないことも示す。生産に有用であると考慮されるためには通常、少なくとも５の増殖係数が必要である。それどころか、これらの細胞は単に細胞密度と生存率を維持するだけであった。最後に、本実験は、サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地におけるｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞が、無血清浮遊状態において平均分割比１０超で非常に良好に増殖し、高い（＞９９％）生存率を維持することを示す。
【００７４】
実施例３：基質依存的ＣＬＤＫ細胞を別の血清含有培地での浮遊増殖に適合させる試み
ａＣＬＤＫ細胞のクライオバイアル２本を液体窒素タンクから取り出して解凍した。１本のバイアルの材料は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をさらに補充したサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地１０ｍＬに再懸濁した。もう１本のバイアルの材料は、補充添加ハンク（Ｈａｎｋ）最小必須培地（ＭＥＭＨ）１０ｍＬに再懸濁した。サプリメント添加ＭＥＭＨ培地は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国再発行特許第３３，１６４号（米国特許第４，５００，５１３号より）に記載されている。本実施例に用いられているこの培地は、次のものを含んでいる。
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％
非必須アミノ酸、１０ｍｌ／培地１Ｌ
Ｌ−グルタミン、１０ｍＬ／培地１Ｌ
硫酸ネオマイシン、（１００ｍｇ／ｍＬストック溶液を０．３ｍＬ）／培地１Ｌ
ポリミキシンＢ、３０，０００ユニット／培地１Ｌ
ナイスタチン、２５，０００ユニット／培地１Ｌ
５０％ブドウ糖、２．６ｍｌ／培地１Ｌ
ＭＥＭビタミン、３０ｍＬ／培地１Ｌ
【００７５】
両方のバイアルを遠心分離し、上清を廃棄した。次に細胞ペレットを別々にそれぞれの培地１０ｍＬに再懸濁し、続いて別々の２５ｍＬ組織培養フラスコに移してそれぞれの培地で全容量２５ｍＬにした（どちらの培地も５％ＦＢＳを含んでいた）。両方のフラスコを３５℃インキュベーター内に置いた。
【００７６】
翌日、両方の組織フラスコを顕微鏡下で観察したところ、９０−１００％コンフルエントであることが分かった。両方のフラスコをトリプシン処理し、細胞を約４９０ｃｍ２ローラーボトルに移して培地全容量１５０ｍＬ／ローラーボトルに置いた。両方のローラーを３５℃インキュベーター内のローラーカート（０．３ｒｐｍ）上に置いた。３日後、両方のローラーボトルの細胞を顕微鏡観察したところ、３０％コンフルエントであることが分かった。さらに３日後、細胞および生存率計数を行った。ＭＥＭＨにおける細胞は、生存率９９．５％の１．０２×１０７細胞／ｍＬを含んでいることが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における細胞は、生存率９９．８３％の１．０９×１０７細胞／ｍＬを含んでいることが分かった。両方のローラーボトルはトリプシン処理され、細胞を３．１６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で新しい４９０ｃｍ２ローラーボトルに移し、培地全容量１５０ｍＬ／ローラーボトルで置いた。両方のローラーボトルを３５℃インキュベーター内に置いた。
【００７７】
インキュベーターに入れてから４日後、細胞および生存率の計数を行った。Ｈａｎｋｓ ＭＥＭにおける材料は、細胞生存率９９．５％の１．１２×１０７細胞／ｍＬを含むことが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料は、細胞生存率８９．６９％の１．２７×１０７細胞／ｍＬを含むことが分かった。両方のローラーボトルをトリプシン処理し、細胞を３．１６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で新しい４９０ｃｍ２ローラーボトルに移し、培地全容量１５０ｍＬ／ローラーボトルに置いた。両方のローラーボトルを３５℃インキュベーター内に置いた。
【００７８】
インキュベーターに入れてから５日後、細胞および生存率の計数を再度行った。Ｈａｎｋ’ｓ ＭＥＭにおける材料は、細胞生存率９９．９％の１．０３×１０７細胞／ｍＬを含んでいることが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料は、細胞生存率９１．９１％の１．７２×１０７細胞／ｍＬを含んでいることが分かった。両方のローラーボトルをトリプシン処理し、細胞を３．１６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で新しい４９０ｃｍ２ローラーボトルに移して培地全容量１５０ｍＬ／ローラーボトルに置いた。両方のローラーを３５℃インキュベーター内に戻し置いた。
【００７９】
インキュベーターに入れてから４日後、細胞および生存率の計数を再度行った。Ｈａｎｋｓ ＭＥＭにおける材料は、細胞生存率９９．２％の５．９５×１０６細胞／ｍＬを含むことが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料は、細胞生存率８５．８４％の９．４１×１０６細胞／ｍＬ含むことが分かった。両方のローラーボトルをトリプシン処理し、細胞を３．１６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で新しい１２５ｍＬシェーカーフラスコに移し、培地全容量５０ｍＬ／シェーカーフラスコで置いた。両方のシェーカーフラスコは、３５℃インキュベーター内の１００−１１０ｒｐｍのロータリーシェーカー上に置いた。
【００８０】
インキュベーターに入れてから４日後、細胞および生存率の計数を再度行った。Ｈａｎｋｓ ＭＥＭにおける材料は、細胞生存率９４．０％の２．１５×１０５細胞／ｍＬを含むことが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料は、細胞生存率９９．６％の１．３８×１０６細胞／ｍＬを含むことが分かった。両方のシェーカーフラスコを３５℃インキュベーター内の１００−１１０ｒｐｍのロータリーシェーカー上に戻し置いた。
【００８１】
インキュベーターに入れてから３日後、細胞および生存率の計数を再度行った。Ｈａｎｋｓ ＭＥＭにおける材料は、細胞生存率９５．０％の２．００×１０５細胞／ｍＬ（増殖係数０．６３に相当する）を含むことが分かった。５％ＦＢＳ含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料は、細胞生存率９９．８％の３．０３×１０６細胞／ｍＬ（増殖係数９．５８に相当する）を含むことが分かった。次に、５％ＦＢＳ培地含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地におけるＣＬＤＫ細胞を３．１６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で新しい１２５ｍＬシェーカーフラスコに植え継ぎ、３５℃インキュベーター内のロータリーシェーカー上に置いて細胞が増殖し続けるか否かを判断し、培地全容量５０ｍＬ／シェーカーフラスコで置いた。
【００８２】
インキュベーターに入れてから７日後、細胞および生存率の計数を再度行った。５％ＦＢＳ培地含有サプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地におけるＣＬＤＫ細胞は、１．５×１０５細胞／ｍＬ未満を含むことが分かった。値が非常に小さかったため、生存率の計数は核カウンターを用いて行うことができなかった。細胞は目に見えて非常に塊状であり、細胞培養物は廃棄した。
【００８３】
上述の継代プロトコールを下表にまとめている。継代２から５は、通例基質依存細胞の培養のためのローラーボトルで行った。２重線より下の継代６および７は、シェーカーフラスコで行って細胞の浮遊増殖への適合を試みた。しかし表から明らかなように、シェーカーフラスコに１回だけ継代した後により長くインキュベートしたにも関わらず、細胞密度は急激に下がった。確かに、ハンクＭＥＭ培地における材料のためにシェーカーフラスコに１回だけ移した後、またサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地における材料のためにシェーカーフラスコに２回だけ移した後、細胞は実験を継続するのに十分には増殖しなかった。このデータは、これらの基質依存的ＣＬＤＫ細胞が浮遊状態では増殖しないことを示す。
【００８４】
【表７】
【００８５】
実施例４：ｓＣＬＤＫ細胞のインフルエンザウイルスによる感染
ｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞系を犬インフルエンザ（ＣＩＶ、Ａ／イヌ／マイアミ／０５）、低温適応温度感受性Ｈ３Ｎ８型インフルエンザ（Ａ／ウマ／２／ケンタッキー／１／９１、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，１７７，０８２号に記載）および第三のＨ３Ｎ８型インフルエンザウイルス（ＫＹ０２、ウマ／ケンタッキー／０２）に感染させた。ＨＡに対する選別の際、検査した３種類の回収されたウイルスの全てが陽性ＨＡ結果を返し、ＣＩＶおよびＫＹ０２は有意な力価の量を示した。検査した低温適応温度感受性Ｈ３Ｎ８型インフルエンザウイルスに対しては、力価データを収集しなかった。
【００８６】
植え継ぎ前に、最も典型的には５−７日間、ｓＣＬＤＫ−ＳＦ細胞をサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地において増殖させた。細胞をシェーカーフラスコから回収し、シェーカーフラスコ当たり（各ウイルスにつき１フラスコ）５０．０ｍＬのサプリメント添加ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＭＤＣＫ無血清培地に所望の密度（１．０×１０６細胞／ｍＬ）で植え継ぎ、１０％ＣＯ２のロータリーシェーカーで３７℃インキュベートした。植え継ぎ１時間後、シェーカーを適切なウイルスと感染効率（ＭＯＩ）で感染させた。下表参照。１リットル当たり１ｍＬ（５０ｍＬ当たり５０マイクロリットル）のトリプシンを添加する。ＣＩＶおよびＫＹＯ２を３７℃で、Ｆｌｕ−Ａｖｅｒｔを３４℃でインキュベートする。感染した（単数または複数の）シェーカーフラスコを毎日観察し、感染率をモニターして記録した。毎日サンプルを採取し、−７０℃で凍結した後にＨＡ力価に対して選別した。９０−１００％の細胞が感染したことを確認した後、細胞を回収して−７０℃で凍結した。凍結サンプルを毎日採取し、ＨＡ検査を行った。
【００８７】
【表８】
【００８８】
上述の詳細な説明は、本発明の当業者にその本質およびその実際の適用を伝えることだけを目的とし、これにより当業者は本発明のその数多くの形態を特定の用途の要求に最も適切となることができるよう適合および適用することができる。したがって本発明は上述の実施形態には限定されず、様々に修正することができる。
【００８９】
本明細書において記述されているあらゆる刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液にウイルスを接種し、これによりｓＣＬＤＫ細胞を感染させるステップ、
ｂ）前記感染ｓＣＬＤＫ細胞において前記ウイルスを繁殖させるステップおよび
ｃ）ｓＣＬＤＫ細胞の前記浮遊培養物から前記ウイルスを回収するステップ
を含む、ｓＣＬＤＫ細胞の培養物においてウイルスを複製する方法。
【請求項２】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インフルエンザウイルスが、ヒトインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、馬インフルエンザウイルス、豚インフルエンザウイルス、犬インフルエンザウイルスおよび猫インフルエンザウイルスからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記インフルエンザウイルスがＨ３型インフルエンザウイルス、Ｈ５型インフルエンザウイルスまたはＨ７型インフルエンザウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記インフルエンザウイルスがＨ５Ｎ１型インフルエンザウイルス、Ｈ３Ｎ８型インフルエンザウイルスおよびＨ３Ｎ１型インフルエンザウイルスからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
接種直前に、接種と同時に、または接種直後に、赤血球凝集素の前駆タンパク質を開裂させるためのプロテアーゼがｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｓＣＬＤＫ細胞の培養物が無血清培地で増殖されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｓＣＬＤＫ細胞の培養物が、動物成分由来の材料を全く含まない培地で増殖されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）１種または複数の血清代替物を含む培地に基質依存的なＣＬＤＫ細胞のサンプルを接種するステップ、
ｂ）前記培地において浮遊状態で前記細胞を増殖させるステップ、
ｃ）前記ＣＬＤＫ細胞を新しいバッチの前記培地において浮遊状態で連続継代するステップおよび
ｄ）前記培地中の前記血清代替物の量をゼロまで減少させることによって、浮遊状態の前記ＣＬＤＫ細胞から前記１種または複数の血清代替物を断つステップ
を含む、基質依存的なＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で増殖するように適合させる方法。
【請求項１１】
前記培地が無血清である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が動物由来成分を含まない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）培地にｓＣＬＤＫ細胞を接種するステップ、
ｂ）前記ｓＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で約４から１０日の期間増殖させるステップ、
ｃ）（ｂ）の培養物のサンプルを細胞を含まない新しい培地に移すステップおよび
ｄ）連続増殖の期間において（ｂ）と（ｃ）を繰り返すステップ
を含む、ｓＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で連続的に増殖させる方法。
【請求項１４】
前記培地が無血清である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が動物由来成分を含まない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、前もってプロテアーゼを全く添加することなく前記細胞を含まない新しい培地に移される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
（ｃ）に従ってサンプルを移した後の細胞密度が、少なくとも３×１０５細胞／ｍＬである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｓＣＬＤＫ細胞が４−１０日間で約３より大きい増殖係数を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１０の方法によって得られる、浮遊状態で増殖することができるｓＣＬＤＫ細胞。
【請求項２０】
ウイルス複製のための、請求項１０に記載の方法によって得られるｓＣＬＤＫ細胞の使用。
【請求項２１】
ワクチンの製造における、請求項１０に記載の方法によって得られるｓＣＬＤＫ細胞において複製されたウイルスの使用。
【請求項２２】
細胞培養培地およびｓＣＬＤＫ細胞を含む組成物。
【請求項１】
ａ）ｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液にウイルスを接種し、これによりｓＣＬＤＫ細胞を感染させるステップ、
ｂ）前記感染ｓＣＬＤＫ細胞において前記ウイルスを繁殖させるステップおよび
ｃ）ｓＣＬＤＫ細胞の前記浮遊培養物から前記ウイルスを回収するステップ
を含む、ｓＣＬＤＫ細胞の培養物においてウイルスを複製する方法。
【請求項２】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インフルエンザウイルスが、ヒトインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、馬インフルエンザウイルス、豚インフルエンザウイルス、犬インフルエンザウイルスおよび猫インフルエンザウイルスからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記インフルエンザウイルスがＨ３型インフルエンザウイルス、Ｈ５型インフルエンザウイルスまたはＨ７型インフルエンザウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記インフルエンザウイルスがＨ５Ｎ１型インフルエンザウイルス、Ｈ３Ｎ８型インフルエンザウイルスおよびＨ３Ｎ１型インフルエンザウイルスからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
接種直前に、接種と同時に、または接種直後に、赤血球凝集素の前駆タンパク質を開裂させるためのプロテアーゼがｓＣＬＤＫ細胞の懸濁液に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｓＣＬＤＫ細胞の培養物が無血清培地で増殖されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｓＣＬＤＫ細胞の培養物が、動物成分由来の材料を全く含まない培地で増殖されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）１種または複数の血清代替物を含む培地に基質依存的なＣＬＤＫ細胞のサンプルを接種するステップ、
ｂ）前記培地において浮遊状態で前記細胞を増殖させるステップ、
ｃ）前記ＣＬＤＫ細胞を新しいバッチの前記培地において浮遊状態で連続継代するステップおよび
ｄ）前記培地中の前記血清代替物の量をゼロまで減少させることによって、浮遊状態の前記ＣＬＤＫ細胞から前記１種または複数の血清代替物を断つステップ
を含む、基質依存的なＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で増殖するように適合させる方法。
【請求項１１】
前記培地が無血清である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が動物由来成分を含まない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）培地にｓＣＬＤＫ細胞を接種するステップ、
ｂ）前記ｓＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で約４から１０日の期間増殖させるステップ、
ｃ）（ｂ）の培養物のサンプルを細胞を含まない新しい培地に移すステップおよび
ｄ）連続増殖の期間において（ｂ）と（ｃ）を繰り返すステップ
を含む、ｓＣＬＤＫ細胞を浮遊状態で連続的に増殖させる方法。
【請求項１４】
前記培地が無血清である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が動物由来成分を含まない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、前もってプロテアーゼを全く添加することなく前記細胞を含まない新しい培地に移される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
（ｃ）に従ってサンプルを移した後の細胞密度が、少なくとも３×１０５細胞／ｍＬである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｓＣＬＤＫ細胞が４−１０日間で約３より大きい増殖係数を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１０の方法によって得られる、浮遊状態で増殖することができるｓＣＬＤＫ細胞。
【請求項２０】
ウイルス複製のための、請求項１０に記載の方法によって得られるｓＣＬＤＫ細胞の使用。
【請求項２１】
ワクチンの製造における、請求項１０に記載の方法によって得られるｓＣＬＤＫ細胞において複製されたウイルスの使用。
【請求項２２】
細胞培養培地およびｓＣＬＤＫ細胞を含む組成物。
【公表番号】特表２０１１−５２４１８２（Ｐ２０１１−５２４１８２Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１４６９７（Ｐ２０１１−５１４６９７）
【出願日】平成２１年６月９日（２００９．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６７２１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５５１６８
【国際公開日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月９日（２００９．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６７２１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５５１６８
【国際公開日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
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