イミダゾリノン耐性植物作出のための成熟型ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド
成熟型野性型イミダゾリノン耐性アセトヒドロキシ酸合成酵素の大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド分子と、これらのポリペプチドをコードするアミノ酸配列を開示する。本発明のポリヌクレオチド分子を含む発現カセットと形質転換ベクター並びにポリヌクレオチド分子、発現カセット及び形質転換ベクターにより形質転換される植物と宿主細胞を開示する。植物の除草剤に対する抵抗性を亢進するようにポリヌクレオチド分子を用いる方法と、このような植物の近傍に存在する雑草を抑制する方法も開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物分子生物学の分野に関し、詳細には、コムギのアセトヒドロキシ酸合成酵素の大サブユニット酵素（以下、ＡＨＡＳＬ）をコードし、除草剤耐性植物を作出するのに用いることができる新規のヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ；ＥＣ ４．１．３．１８、アセト乳酸合成酵素又はＡＬＳとしても公知である）は、分岐鎖アミノ酸であるバリン、ロイシン、イソロイシンの生化学的合成を触媒する最初の酵素である（Ｓｉｎｇｈ（１９９９）「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｖａｌｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ ａｎｄ ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，」 ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，Ｓｉｎｇｈ，Ｂ．Ｋ．，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２２７−２４７）。ＡＨＡＳは、スルホニルウレア（ＬａＲｏｓｓａ ａｎｄ Ｆａｌｃｏ（１９８４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：１５８−１６１）、イミダゾリノン（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６：５４５−５４６）、トリアゾロピリミジン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ａｎｄ Ｇｅｒｗｉｃｋ（１９８９）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｂｙ ｔｒｉａｚｏｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ，」 ｉｎ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｓｏｎｎｅｔ，Ｐ．Ｅ．ｅｄｓ．，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．２７７−２８８）及びピリミジルオキシ安息香酸（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４：２３９−２４４．）を含む、構造的に多様な４除草剤系の作用部位である。イミダゾリノン系及びスルホニルウレア系除草剤は、少使用量での効果及び動物における相対的な非毒性により、現代の農業において広範に使用されている。ＡＨＡＳ活性を阻害することにより、これらの除草剤系は多くの雑草種を含む、感受性が高い植物の更なる成長及び生育を阻止する。市販されているイミダゾリノン系除草剤の数例はＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼタピル）、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザキン）及びＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）（イマザピル）である。スルホニルウレア系除草剤の例はクロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメツルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン（ａｍｉｄｏｓｕｌｆｉｕｏｎ）、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル及びハロスルフロンである。
【０００３】
その高い効果及び低毒性のため、イミダゾリノン系除草剤は広範囲の植生の頂部にわたり噴霧することにより、使用に対して好意的に受け入れられている。広範囲の植生の頂部にわたり除草剤を噴霧できることにより、栽培場の造成及び維持に関連するコストが低減し、このような化学物質の使用前の現地準備の必要性が低下する。所望の耐性種の頂部にわたり噴霧することにより、競合種が存在しないため、所望の種の最大生産力を達成する能力も生じる。しかし、このような噴霧手法を用いる能力は、噴霧領域における所望の植生のイミダゾリノン抵抗性種の存在に依存する。
【０００４】
主な農作物の中で、ダイズのような一部のマメ科種は、その除草剤化合物を迅速に代謝する能力により、イミダゾリノン系除草剤に対してもともと抵抗性がある（Ｓｈａｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９８５）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．３３：４６９−４７１）。トウモロコシ（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２８８６）及びイネ（Ｂａｒｒｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｒｏｐ Ｓａｆｅｎｅｒｓ ｆｏｒ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１９５−２２０）のような他の作物は、イミダゾリノン系除草剤に対してある程度感受性がある。イミダゾリノン系除草剤に対する感受性の差異は、特定の除草剤の化学的性質と、各植物における毒性から非毒性形態への化合物の代謝の差異に依存する（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６：５４５−５４６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７：２４−２９）。吸収及び移行のような植物の他の生理学的相違も感受性に重要な役割を果たす（Ｓｈａｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９８５）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．３３：４６９−４７１）。
【０００５】
トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）及びタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）における種子、小胞子、花粉及びカルスの変異誘発を用いて、イミダゾリノン、スルホニルウレアトリア及びトリアゾロピリミジンへの抵抗性を示す作物品種の生産が成功している（Ｓｅｂａｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．２９：１４０３−１４０８；Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８：５２５−５３０；Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：６５−７０；Ｓａｔｈａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１０４４−１０５０；Ｍｏｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ８４：９１−９６）。全ての場合において、単一の部分優性核遺伝子が抵抗性を付与した。コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）Ｌ．ｃｖ．Ｆｉｄｅｌの種子変異誘発後、４種類のイミダゾリノン抵抗性コムギ植物も過去に単離された（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６）。遺伝試験により、単一の部分優性遺伝子が抵抗性を付与することが確認された。対立遺伝子試験に基づき、著者らは同定された４系統における突然変異が同じ遺伝子座に位置すると結論づけた。Ｆｉｄｅｌ品種の抵抗性遺伝子の１つはＦＳ−４と命名された（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６）。
【０００６】
ＡＨＡＳ阻害複合体の３次元構造のコンピュータベースのモデリングでは、提示された阻害因子結合ポケットにおける複数のアミノ酸が、誘発変異がイミダゾリノンに対する選択的抵抗性を付与する可能性がある部位であると予測している（Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：３５９−３６８）。ＡＨＡＳ酵素の提示された結合部位における、これらの合理的に設計された変異の一部によって生産されたコムギ植物は、実際に単一種類の除草剤への特異的抵抗性を示した（Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：３５９−３６８）。
【０００７】
イミダゾリノン系除草剤に対する植物抵抗性は多くの特許においても報告されている。米国特許第４，７６１，３７３号、第５，３３１，１０７号、第５，３０４，７３２号、第６，２１１，４３８号、第６，２１１，４３９号及び第６，２２２，１００号では、植物における除草剤抵抗性を誘発するためにＡＨＡＳ改変遺伝子を用いることを概説し、ある種のイミダゾリノン抵抗性トウモロコシ系を具体的に開示している。米国特許第５，０１３，６５９号では、１つ以上の保存領域における少なくとも１つのアミノ酸の変異により除草剤抵抗性を示す植物を開示している。当該特許に記載されている変異はイミダゾリノンとスルホニルウレアへの交差抵抗性又はスルホニルウレア特異的抵抗性をコードするが、イミダゾリノン特異的抵抗性は記載されていない。更に、米国特許第５，７３１，１８０号及び米国特許第５，７６７，３６１号では、イミダゾリノン特異的抵抗性を生ずる、野性型単子葉植物のＡＨＡＳアミノ酸配列における単一アミノ酸置換を有する単離遺伝子について考察している。
【０００８】
植物では検討される他のあらゆる生命体のように、ＡＨＡＳ酵素は大サブユニット（触媒機能）と小サブユニット（調節機能）の２つのサブユニットからなる（Ｄｕｇｇｌｅｂｙ ａｎｄ Ｐａｎｇ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：１−３６）。大サブユニット（ＡＨＡＳＬと称される）はシロイヌナズナ及びイネのように単一遺伝子に、或いはトウモロコシ、アブラナ及びワタのように複数の遺伝子ファミリーメンバーにコードされ得る。大サブユニットにおける特異的な単一ヌクレオチド置換により、１種類以上の除草剤に対するある程度の非感受性が酵素に付与される（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｄｕｇｇｌｅｂｙ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３３：７６５−７７７）。
【０００９】
例えば、パンコムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌはアセトヒドロキシ酸合成酵素の３つの同祖大サブユニット遺伝子を有する。各遺伝子は各３遺伝子における変異体由来の除草剤応答及び生化学的データに基づく有意な発現を示す（Ａｓｃｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ，Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｓ１０−１７）。これら３遺伝子全てのコード配列はヌクレオチドレベルにおいて広範な相同性を共有する（ＷＯ０３／０１４３５７）。数種類のコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）由来のＡＨＡＳＬ遺伝子の配列決定を介し、大部分のＩＭＩ耐性（イミダゾリノン耐性）系における除草剤耐性の分子基盤が突然変異Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎであることが見出された（ＷＯ０３／０１４３５６；ＷＯ０３／０１４３５７）。この変異はＡＨＡＳＬタンパク質をコードするＤＮＡ配列における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
米国特許第５，７３１，１８０号では、イミダゾリノン特異的抵抗性を生ずる、大サブユニットの６２１位置におけるアミノ酸置換を有するトウモロコシＡＨＡＳＬ変異体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を開示している。Ｈａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１１：２６６−２７１，１９８８）はシロイヌナズナにおけるイミダゾリノン抵抗性の発現を開示した。Ｓａｔｈａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，７６７，３６６号）はシロイヌナズナにおけるイミダゾリノン特異的抵抗性が、正常なＡＨＡＳＬアミノ酸配列における６５３位置での変異に基づくものであると同定した。ＷＯ０３／０１４３５７では、３つの野性型ＡＨＡＳＬ遺伝子（Ａｌｓ１，Ａｌｓ２及びＡｌｓ３；本明細書では以下、それぞれＡＨＡＳＬ１Ｄ，ＡＨＡＳＬ１Ｂ，ＡＨＡＳＬ１Ａとも称する）に対応する、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）由来の部分長ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列並びにＡｌｓ２及びＡｌｓ３におけるイミダゾリノン耐性抵抗性突然変異を開示している。現在まで成熟型コムギＡＨＡＳＬタンパク質に対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列は報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、成熟型野性型除草剤抵抗性コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチド分子は３つのコムギＡＨＡＳＬ遺伝子、ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａに対応する。本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は、例えば、シロイヌナズナＡＨＡＳＬタンパク質におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換に対応する、それぞれのアミノ酸配列における置換を有する除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質を含む。本発明のポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、９及び１１に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列、配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列並びに野性型ＡＨＡＳＬタンパク質又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質、特に前述のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を有するイミダゾリノン抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の断片及び変異体を含む。
【００１２】
本発明は植物、植物細胞や他の非ヒト宿主細胞に本発明のポリヌクレオチド分子を発現させるための発現カセットを提供する。発現カセットは、野性型又はイミダゾリノン抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチド分子に機能的に結合した、対象植物、植物細胞又は他の宿主細胞に発現可能なプロモーターを含む。植物又は植物細胞での発現を所望する場合、発現カセットは発現されたＡＨＡＳＬタンパク質を葉緑体に誘導するため、葉緑体輸送ペプチドをコードする、機能的に結合した葉緑体標的配列を含むこともできる。本発明の発現カセットは植物及び宿主細胞の除草剤耐性を亢進する方法に用途を見出す。本方法は本発明の発現カセットにより植物又は宿主細胞を形質転換することを伴い、ここで発現カセットは対象植物又は宿主細胞に発現可能なプロモーターを含み、当該プロモーターはイミダゾリノン抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドに機能的に結合される。
【００１３】
本発明は本発明の選択可能なマーカー遺伝子を含む形質転換ベクターを提供する。選択可能なマーカー遺伝子は、本発明のポリヌクレオチドに機能的に結合した、宿主細胞における発現を促進するプロモーターを含む。更に、形質転換ベクターは宿主に発現される対象遺伝子を含むことができ、所望であれば、本発明のポリヌクレオチドに機能的に結合した葉緑体標的配列を含むこともできる。このような形質転換ベクターは対象遺伝子により形質転換される宿主細胞を選択する方法に用途を見出す。
【００１４】
更に、本発明は対象遺伝子により形質転換される細胞を選択するため、本発明の形質転換ベクターを用いる方法を提供する。このような方法は形質転換ベクターにより宿主細胞を形質転換することを伴い、非形質転換宿主細胞を死滅させ、或いはその成長を阻害すると思われるイミダゾリノン系除草剤のレベルに細胞を曝露し、除草剤の存在下で成長する能力により形質転換宿主細胞を同定する。本発明の好ましい実施形態において、宿主細胞は植物細胞であり、選択可能なマーカー遺伝子は植物細胞における発現を促進するプロモーターを含む。
【００１５】
本発明は本発明の形質転換植物の近傍における雑草を抑制する方法を提供する。このような形質転換植物は、植物細胞における発現を促進するプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットをそのゲノムに含み、ここで当該プロモーターは本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドに機能的に結合される。本方法は有効量のイミダゾリノン系除草剤を雑草と形質転換植物に適用するステップを含み、ここで形質転換植物は非形質転換植物に比し、イミダゾリノン系除草剤への抵抗性が高まる。
【００１６】
本発明は本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド、発現カセット又は形質転換ベクターにより形質転換される植物、植物組織、植物細胞、種子及び非ヒト宿主細胞も提供する。このように形質転換される植物、植物組織、植物細胞、種子及び非ヒト宿主細胞は、形質転換されない植物、植物組織、植物細胞、種子又は非ヒト宿主細胞のそれぞれを死滅させ、或いはその成長を阻害する除草剤レベルにおいて、少なくとも１つのイミダゾリノン系除草剤に対する耐性又は抵抗性が亢進している。本発明の形質転換される植物、植物組織、植物細胞及び種子はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）と、これらに限定されないが、コムギ、イネ、トウモロコシ、モロコシ、オオムギ、ライムギ、ミレット、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、モロコシ、ミレット、タバコ、トマト及びジャガイモを含む栽培植物であることが好ましい。
【００１７】
本発明は、野性型イミダゾリノン抵抗性コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）ＡＨＡＳＬタンパク質を含む、単離されたポリペプチドを提供する。このように単離されたイミダゾリノン抵抗性ＡＨＡＳＬポリペプチドは各々、シロイヌナズナＡＨＡＳＬタンパク質におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換に対応する、それぞれのアミノ酸配列における置換を有する。本発明の単離ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１、３、５、７、９及び１１に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列並びに野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性、特に前述のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換から生じるイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳ活性を含む前記ポリペプチドの断片及び変異体を含む。
配列リスト
【００１８】
添付の配列リストに一覧にしたヌクレオチド酸及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基に対する標準的な文字省略形及びアミノ酸に対する３文字コードを用いて示される。ヌクレオチド配列は配列の５’末端から開始し、３’末端方向へ前進する（即ち、各ラインにおいて左から右方向）標準的慣用に従う。各核酸の鎖が１つだけ示されるが、表示された鎖を参照して相補鎖が含まれると理解すべきである。アミノ酸配列は配列のアミノ末端から開始し、カルボキシ末端方向へ前進する（即ち、各ラインにおいて左から右方向）標準的慣用に従う。
【００１９】
配列番号１はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ｄタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２０】
配列番号２はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ｄタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号３はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ｂタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２２】
配列番号４はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ｂタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号５はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２４】
配列番号６はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号７はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ｄタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号１に対し、配列番号７はヌクレオチド位置１７３６におけるＣからＡへの置換を含む。
【００２６】
配列番号８はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ｄタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。配列番号２に対し、配列番号８はアミノ酸位置５７９におけるＳｅｒからＡｓｎへの置換を含む。
【００２７】
配列番号９はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ｂタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号３に対し、配列番号９はヌクレオチド位置１７３６におけるＣからＡへの置換を含む。
【００２８】
配列番号１０はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ｂタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。配列番号４に対し、配列番号１０はアミノ酸位置５７９におけるＳｅｒからＡｓｎへの置換を含む。
【００２９】
配列番号１１はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号５に対し、配列番号１１はヌクレオチド位置１７３６におけるＣからＡへの置換を含む。
【００３０】
配列番号１２はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。配列番号６に対し、配列番号１２はアミノ酸位置５７９におけるＳｅｒからＡｓｎへの置換を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、成熟型コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、詳細には野性型除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子に関する。このような成熟型ＡＨＡＳＬタンパク質は、これらのタンパク質の葉緑体への輸送を促進する葉緑体輸送ペプチドを欠く。詳細には、成熟型除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質はイミダゾリノン抵抗性ＡＨＡＳＬ活性を含む。より詳細には、成熟型除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質は、シロイヌナズナＡＨＡＳＬタンパク質におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換に対応する、それぞれのアミノ酸配列における置換を含む。本発明のポリヌクレオチド分子は３つのコムギＡＨＡＳＬ遺伝子、ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａに対応する。本発明のポリヌクレオチド配列は植物及び宿主細胞の除草剤抵抗性を亢進する方法に用途を見出す。ポリヌクレオチドは形質転換される細胞、組織及び生命体、特に植物及び植物細胞を選択する方法に用いられる選択可能なマーカー遺伝子として更なる用途を見出す。
【００３２】
本発明の組成物は、野性型アセトヒドロキシ酸合成酵素をコードする単離ポリヌクレオチド分子と、通常であれば植物を死滅させ、或いはその成長を停止させるレベルにおいて除草剤に対する耐性又は抵抗性を示す植物を作出する方法に関わる除草剤耐性又は除草剤抵抗性アセトヒドロキシ酸合成酵素をコードする単離ポリヌクレオチド分子を含む。同様に、「除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質」又は「除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質」とは、野性型ＡＨＡＳＬタンパク質のＡＨＡＳ活性を阻害することが既知である濃度にてイミダゾリノン系除草剤が存在する際、このようなＡＨＡＳＬタンパク質が野性型ＡＨＡＳＬのＡＨＡＳ活性に比し、高いＡＨＡＳ活性を示すことを意味する。本発明のこのような除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は、除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドにコードされる。
【００３３】
「野性型ＡＨＡＳ活性」とは、野性型ＡＨＡＳＬタンパク質のＡＨＡＳ活性を意味することを意図する。「除草剤耐性ＡＨＡＳ活性」又は「除草剤抵抗性ＡＨＡＳ活性」とは、「除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質」又は「除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質」のＡＨＡＳ活性を意味することを意図する。
【００３４】
詳細には、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列並びにその断片及び変異体を含む、単離された核酸分子を提供する。更に、本明細書に記載する核酸分子にコードされるアミノ酸配列、例えば、配列番号１、３、５、７、９及び１１に示される配列並びにその断片及び変異体を有するポリペプチドが提供される。
【００３５】
本発明は単離され、或いは実質的に精製された核酸又はタンパク質組成物を包含する。「単離」或いは「精製」された核酸分子又はタンパク質又はその生物活性部分は、自然発生環境において見出される核酸分子又はタンパク質に通常は伴い、或いはこれと相互作用する要素を実質的に或いは本質的に含まない。従って、単離或いは精製された核酸分子又はタンパク質は、組換え技術により産生される際に他の細胞物質又は培養基を実質的に含まず、或いは化学合成により産生される際に化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。「単離された」核酸は、その核酸が由来する生命体のゲノムＤＮＡにおける核酸の側面にもともと位置する配列（好ましくはタンパク質コード配列）（即ち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含まないことが好ましい。例えば、種々の実施形態において、単離核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおける核酸の側面にもともと位置するヌクレオチド配列を約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満含有し得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％又は１％（乾燥重量単位）未満の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質又はその生物活性部分が組換えにより産生される際、培養基は約３０％、２０％、１０％、５％又は１％（乾燥重量単位）未満の化学的前駆体又は非対象タンパク質の化学物質を示すことが好ましい。
【００３６】
開示されるヌクレオチド配列の断片及び変異体も本発明に包含される。「断片」とは、ヌクレオチド配列の一部又はアミノ酸配列の一部、従って、これにコードされるタンパク質を意味する。ヌクレオチド配列の断片は、天然の成熟型ＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性、従って、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を保持するタンパク質断片をコードし得る。或いは、一般的に、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、生物活性を保持する断片タンパク質をコードしない。従って、ヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから本発明のタンパク質をコードする全長ヌクレオチドまでの配列に及び得る。
【００３７】
本発明の野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性部分をコードするＡＨＡＳＬヌクレオチド配列の断片は、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３５０、４００、４５０、５００、５２５、５５０又は５７５個の隣接アミノ酸或いは本発明の全長ＡＨＡＳＬタンパク質に存在する総数のアミノ酸をコードする（例えば、各配列番号２、４、６、８、１０及び１２のそれぞれに対して５９６個のアミノ酸）。一般的に、ハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして有用なＡＨＡＳＬタンパク質のヌクレオチド配列の断片は、ＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性部分をコードする必要がない。
【００３８】
従って、ＡＨＡＳＬヌクレオチド配列の断片はＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性部分をコードし得て、或いは以下に考察する方法を用いてハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして用いることができる断片となり得る。ＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性部分は、本発明のＡＨＡＳＬヌクレオチド配列の１配列の一部分を単離し、除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質のコード化部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現）、野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質の当該部分の活性を評価することにより、調製することができる。野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、少なくとも１６、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，６５０、１，７００又は１，７５０個のヌクレオチド或いは本明細書に開示する除草剤耐性全長ＡＨＡＳＬヌクレオチド配列に存在する数までのヌクレオチドを含む（例えば、各配列番号１、３、５、７、９及び１２のそれぞれに対して１７８８個のヌクレオチド）。
【００３９】
「変異体」とは実質的に類似する配列を意味する。ヌクレオチド配列では、保存変異体は、遺伝コードの縮重のため、本発明の１つのＡＨＡＳＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらのような自然発生する対立変異体は、周知の分子生物学的手法、例えば、以下に概略するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法及びハイブリダイゼーション法を用いて同定することができる。変異ヌクレオチド配列は、例えば、部位特異的変異誘発を用いて生成されるが、それでも本発明のＡＨＡＳＬタンパク質をコードするような合成由来のヌクレオチド配列も含む。一般的に、本発明の特定のヌクレオチド配列の変異体は、デフォルトパラメータを用いて本明細書の別の箇所で述べる配列アライメントプログラムにより決定される特定のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約７０％、７５％、一般的には少なくとも約８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。
【００４０】
本発明の特定のヌクレオチド配列（即ち、基準ヌクレオチド配列）の変異体は、変異ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドと基準ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドの配列同一性パーセントの比較によって評価することもできる。従って、例えば、配列番号２のポリペプチドに対する所与の配列同一性パーセントを有するポリペプチドをコードする単離核酸を開示する。任意の２つのポリペプチドの配列同一性パーセントは、デフォルトパラメータを用いて本明細書の別の箇所で述べる配列アライメントプログラムを用いて計算することができる。本発明の任意の所与のヌクレオチド配列対が、これらがコードする２つのポリペプチドに共有される配列同一性パーセントの比較によって評価される場合、この２つのコード化ポリペプチドの配列同一性パーセントは少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、一般的には少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性である。
【００４１】
「変異体」タンパク質とは、天然タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆる切断）又は付加；天然タンパク質での１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失又は付加；或いは天然タンパク質での１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換による天然タンパク質由来のタンパク質を意味する。本発明に包含される変異タンパク質は生物学的に活性であり、即ち天然タンパク質の所望の生物活性、即ち、本明細書で述べる野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有し続ける。このような変異体は、例えば、遺伝的多型又は人工的な操作により生じ得る。本発明の除草剤耐性天然ＡＨＡＳＬタンパク質の生物学的に活性な変異体は、デフォルトパラメータを用いて本明細書の別の箇所で述べる配列アライメントプログラムにより決定される天然タンパク質のアミノ酸配列に対し、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、一般的には少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。本発明のタンパク質の生物学的に活性な変異体は、わずか１〜１５個のアミノ酸残基、わずか１〜１０個のアミノ酸残基、例えば６〜１０個、わずか５個、わずか４個、３個、２個、更には１個のアミノ酸残基だけ当該タンパク質と異なり得る。
【００４２】
本発明のタンパク質はアミノ酸の置換、欠失、切断及び挿入を含む種々の方法にて改変され得る。このような操作の方法は当分野で一般的に既知である。例えば、除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質のアミノ酸配列変異体はＤＮＡにおける突然変異により調製することができる。突然変異誘発及びヌクレオチド配列改変の方法は当分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及び当該文献に引用される参考文献を参照されたい。対象タンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得て、同文献は参照により本明細書に組み込まれる。１つのアミノ酸を類似する特性を有する別のアミノ酸に置換するような保存的置換が好ましいといえる。
【００４３】
本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は、配列番号８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を含むが、これらに限定されない。これらアミノ酸の各々は前述のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換に対応する（それぞれの野性型配列に対する）アミノ酸置換を含む。配列番号８、１０及び１２では、この置換はアミノ酸残基又は位置５７９にて生ずる。本発明の除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質は、配列番号８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列の変異体及び断片を含み、また、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギン及び除草剤耐性ＡＨＡＳ活性も含むタンパク質も包含する。「等価な位置」とは、米国特許第５，７６７，３６６号に開示されたイミダゾリノン抵抗性シロイヌナズナＡＨＡＳＬタンパク質におけるアミノ酸位置又は残基６５３に相当するＡＨＡＳＬタンパク質における位置或いは本発明の配列番号２、４、６、８、１０及び１２におけるアミノ酸位置５７９を意味することを意図する。ＡＨＡＳＬタンパク質のこのような等価な位置におけるセリン残基からアスパラギンへの置換により、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むＡＨＡＳＬタンパク質を生成できることが好ましい。加えて、本発明はこのような除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を包含する。
【００４４】
従って、本発明の遺伝子及びヌクレオチド配列は自然発生配列と変異型の双方を含む。同様に、本発明のタンパク質は自然発生タンパク質とその変種及び改変型の双方を包含する。このような変異体は所望の野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬ活性を有し続ける。明らかに、変異体をコードするＤＮＡ配列において生じる突然変異は、当該配列を読み枠外に置いてはならず、また、ｍＲＮＡ二次構造を生成し得る相補領域を生じないことが好ましい。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照されたい。
【００４５】
加えて、本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は、前述のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換及び／又は除草剤抵抗性をＡＨＡＳＬタンパク質に付与することが既知である、少なくとも１つの他の突然変異を含む除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質を含むが、これに限定されない。ＷＯ０３／０１３２５５、ＷＯ０３／０１４３５６、ＷＯ０３／０１４３５７及び米国仮特許出願第６０／４７３，８２８号を参照されたい。これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。本発明の一実施形態において、本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は１、２、３以上のこのような変異を含むことができる。更に、本発明はこのような除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を包含する。
【００４６】
従って、本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は、前述のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を含むＡＨＡＳＬタンパク質に限定されない。詳細には、本発明は、配列番号２、４及び６に示されるアミノ酸配列を含むＡＨＡＳＬタンパク質の除草剤抵抗性変異体及び断片並びに配列番号１、３及び５に示されるヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の除草剤抵抗性変異体及び断片を更に包含する。このようなＡＨＡＳＬタンパク質の除草剤抵抗性変異体及び断片は、例えば、本明細書で述べる本発明のＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を改変し、ヌクレオチド配列にコードされるＡＨＡＳＬタンパク質に除草剤抵抗性を付与することが既知である１つ以上の変異を含むようにすることにより、生成することができる。このような変異については前述している。本発明は、このような除草剤抵抗性変異体及び断片をコードするポリヌクレオチド分子を更に包含する。
【００４７】
本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入及び置換は、タンパク質の特性に大きな変化をもたらすとは考えられない。しかし、置換、欠失又は挿入の正確な作用を事前に予測することが困難な場合、この作用はルーチンのスクリーニングアッセイにより評価されることを当業者は理解するであろう。即ち、ＡＨＡＳＬ機能はイミダゾリノン系除草剤の存在下及び非存在下でのＡＨＡＳ酵素活性アッセイにより評価することができる。例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１７３−１７９）を参照されたい。同文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
変異ヌクレオチド配列及びタンパク質は、ＤＮＡシャッフリングのような変異誘発及び組換え誘導手法由来の配列及びタンパク質も包含する。このような手法を用いて、１つ以上の異なる除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質配列を操作し、所望の特性を有する新規の除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質を生成することができる。このようにして、実質的な配列同一性を有するとともにインビトロ又はインビボでの相同組換えが可能な配列領域を含む関連配列のポリヌクレオチドの集団から、組換えポリヌクレオチドのライブラリが生成される。例えば、この手法を用いて対象ドメインをコードする配列モチーフを本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ遺伝子と他の既知のＡＨＡＳＬ遺伝子とでシャッフリングし、酵素の場合にはＫmの上昇のような対象特性が向上したタンパク質をコードする新規遺伝子を得ることもできる。このようなＤＮＡシャッフリングの方法は当分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；並びに米国特許第５，６０５，７９３号及び第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【００４９】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、他の生命体、詳細には他の植物、より詳細には他の単子葉植物から対応する配列を単離することができる。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を用いて、本明細書に示す配列に対する配列相同性に基づき、このような配列を同定することができる。本明細書に示すＡＨＡＳＬ配列全体又はその断片に対する配列同一性に基づき単離される配列は本発明に包含される。従って、除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードし、ストリンジェントな条件下で本明細書に開示するＡＨＡＳＬ配列又はその断片とハイブリダイズする単離配列は、本発明に包含される。
【００５０】
ＰＣＲ法では、任意の対象植物から抽出されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来の対応するＤＮＡ配列を増幅するため、ＰＣＲ反応において用いるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲプライマー及びＰＣＲクローニングを設計する方法は当分野で一般的に既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＩｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）も参照されたい。既知のＰＣＲ法には、ペアプライマー、ネストプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的に整合しないプライマーなどを用いた方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
ハイブリダイゼーション法では、既知のヌクレオチド配列の全体又は一部が、選択された生命体からクローニングされたゲノムＤＮＡ断片又はｃＤＮＡ断片の集団（即ち、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリ）に存在する、他の対応するヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズするプローブとして用いられる。ハイブリダイゼーションプローブはゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片又は他のオリゴヌクレオチドでよく、32Ｐのような検出可能基又は他の任意の検出可能なマーカーで標識され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブは、本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製できる。ハイブリダイゼーション用のプローブの調製並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリの構築のための方法は、当分野で一般的に既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。
【００５２】
例えば、本明細書に開示するＡＨＡＳＬポリヌクレオチド全体又はその一部分若しくはそれ以上の部分を、対応するＡＨＡＳＬポリヌクレオチド及びメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることが可能なプローブとして用い得る。種々の条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するため、このようなプローブは、ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドの中で固有であって、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を含む。このようなプローブは、選択された植物由来の対応するＡＨＡＳＬポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅するために用い得る。この手法は所望の植物から更なるコード配列を単離するため、或いは植物におけるコード配列の存在を判定する診断アッセイとして用い得る。ハイブリダイゼーション法は平板培養ＤＮＡライブラリ（プラーク又はコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい）のハイブリダイゼーションスクリーニングを含む。
【００５３】
このような配列のハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で実施し得る。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが他の配列よりも検出可能に大きな程度にその標的配列とハイブリダイズする条件を意味する（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、様々な状況で異なってくる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを調節することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロービング）。或いは、ストリンジェンシー条件は、配列における多少のミスマッチを許容し、低度の類似性が検出されるように調節することができる（異種プロービング）。一般的に、プローブは約１０００ヌクレオチド長未満、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００５４】
通常、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（又は他の塩）、ｐＨ７．０〜８．３であり、温度が短プローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長プローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件はホルムアミドのような脱安定化剤を加えても実行され得る。典型的な低ストリンジェンシー条件は、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝液による３７℃でのハイブリダイゼーションと、１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中、５０〜５５℃での洗浄を含む。典型的な中程度のストリンジェンシー条件は、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーションと、０．５×〜１×ＳＳＣ中、５５〜６０℃での洗浄を含む。典型的な高ストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーションと、０．１×ＳＳＣ中、６０〜６５℃での洗浄を含む。任意に、洗浄緩衝液は約０．１％〜約１％ＳＤＳを含み得る。ハイブリダイゼーションの時間は概して２４時間未満、通常、約４〜約１２時間である。
【００５５】
通常、特異度はハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な要素はイオン強度と最終洗浄液の温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔmは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の等式から概算できる：Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセントであり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセントであり、Ｌは塩基対におけるハイブリッド長である。Ｔmは５０％の相補標的配列が完全に一致したプローブとハイブリダイズする際の温度（明確なイオン強度及びｐＨ下における）である。Ｔmは１％ミスマッチごとに約１℃低下する。従って、Ｔm、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件は所望の同一性の配列とハイブリダイズするように調節できる。例えば、９０％以上の同一性を有する配列を求める場合、Ｔmを１０℃低下させることができる。一般的に、ストリンジェントな条件は、明確なイオン強度及びｐＨにて特定の配列とその相捕体に対する熱融解温度（Ｔm）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、非常にストリンジェントな条件では、熱融解温度（Ｔm）よりも１、２、３又は４℃低い温度でハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を行うことができる。中程度にストリンジェントな条件では、熱融解温度（Ｔm）よりも６、７、８、９又は１０℃低い温度でハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を行うことができる。低ストリンジェンシー条件では、熱融解温度（Ｔm）よりも１１、１２、１３、１４、１５又は２０℃低い温度でハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を行うことができる。等式、ハイブリダイゼーション及び洗浄成分構成並びに所望のＴmを用いて、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が本質的に説明されていることを当業者は理解するであろう。所望のミスマッチ度により４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴmとなる場合、より高い温度を用いることができるようにＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００５６】
２つ以上の核酸又はポリヌクレオチド間の配列関係を説明するために次の用語が用いられる：（ａ）「基準配列」、（ｂ）「比較ウインドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性パーセント」及び（ｅ）「実質的同一性」。
【００５７】
（ａ）本明細書で用いられるように、「基準配列」は配列比較の基準として用いられる明確な配列である。基準配列は、例えば、全長ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列のセグメント又は完全ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列として、特定の配列のサブセット又は全体となり得る。
【００５８】
（ｂ）本明細書で用いられるように、「比較ウインドウ」は、ポリヌクレオチド配列の隣接する特定のセグメントを指し、２配列の最適アライメントに対し、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列は基準配列（これは付加又は欠失を含まない）に比し、付加又は欠失（例えば、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウインドウは少なくとも２０隣接ヌクレオチド長であり、任意で３０、４０、５０、１００以上の長さとすることができる。ポリヌクレオチド配列にギャップを含むことに起因する基準配列への高類似性を避けるため、通常、ギャップペナルティが導入され、マッチ数から減じられることを当業者は理解するであろう。本発明では本明細書で特に述べない場合、本発明のヌクレオチド又はアミノ酸配列の別の配列に対する比較では、比較ウインドウは本発明の全長配列長である。
【００５９】
比較のための配列アライメントの方法は当分野で公知である。従って、任意の２配列の配列同一性パーセントを求めるには、数学的アルゴリズムを用いて実行することができる。このような数学的アルゴリズムの非限定例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１− １７の数学的アルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所アライメントアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３− ４５３の大域アライメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８の局所探索アライメント法；Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４のアルゴリズムであってＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７のように改変されているアルゴリズムである。
【００６０】
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータ処理は、配列同一性を判定するため配列の比較に用いることができる。このような処理系には、ＰＣ／遺伝子プログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ（カリフォルニア州マウンテンビュー、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社から市販）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージにおけるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）並びにＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、バージョン１０（米国カリフォルニア州サンディエゴＳｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，９６８５、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，から市販）が含まれるが、これらに限定されない。これらのプログラムを用いたアライメントはデフォルトパラメータを用いて実行することができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ ８：１５５−６５；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１に十分に説明されている。ＡＬＩＧＮプログラムは前述のＭｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較する場合、ＡＬＩＧＮプログラムではＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いることができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは前述のＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムに基づいている。本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同的なヌクレオチド配列を得るため、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２により、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実行することができる。本発明のタンパク質又はポリペプチドと相同的なアミノ酸配列を得るため、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実行することができる。比較目的のためにギャップアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されているように（ＢＬＡＳＴ ２．０における）Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。或いは、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実行するため、（ＢＬＡＳＴ ２．０における）ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いることができる。前述のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いる際、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列にはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質にはＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。アライメントは手動による検査によっても実施され得る。
【００６１】
特に述べない場合、本明細書で提供される配列同一性／類似性の値は、デフォルトパラメータを用い、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン７．１（米国メリーランド州フレデリック、Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，）を用いて他の配列に対する本発明の全長配列のアライメントに対して得られる値を指す。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン７．１ではＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを用いて多重配列アライメントを生成する。「等価なプログラム」とは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン７．１により生成される、対応するアライメントと比較した際、対象となる任意の２配列に対し、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基マッチと、同一の配列同一性パーセントを有するアライメントを生成する任意の配列比較プログラムを意味する。
【００６２】
（ｃ）本明細書で用いるように、２つの核酸又はポリペプチド配列の場合における「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較ウインドウ上で最大限に対応するようにアライメントされた際に同一である２配列における残基を指す。タンパク質に関して配列同一性パーセントが用いられる場合、同一でない残基位置が保存的アミノ酸置換により異なることが多く、この場合、アミノ酸残基は類似する化学特性（例えば、疎水性、電荷）を有する他のアミノ酸残基に代わって置換され、従って、分子の機能特性を変化させないということが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは置換の保存的性質を補正するため上方に調節され得る。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調節を行う手段は当業者には周知である。通常、この手段は保存的置換を全長ミスマッチではなく部分的ミスマッチとしてスコアリングし、これにより配列同一性パーセントを高くすることを含む。従って、例えば、同一アミノ酸がスコア１を付与され、非保存的置換がスコア０を付与される場合、保存的置換は０と１の間のスコアを付与される。保存的置換のスコアリングは、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（カリフォルニア州マウンテンビュー、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社）において実行されるように計算される。
【００６３】
（ｄ）本明細書で用いるように、「配列同一性パーセント」とは、比較ウインドウ上で最適にアライメントされた２配列を比較することにより求められる値のことであり、２配列の最適アライメントに対し、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は基準配列（これは付加又は欠失を含まない）に比し、付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。両方の配列における同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を求めてマッチした位置の数を算出し、マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で除算し、この計算結果を１００で乗算して配列同一性パーセントを算出することにより、パーセントが計算される。
【００６４】
（ｅ）（ｉ）ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、標準的なパラメータを用い、前述のアライメントプログラムの１つを用いて、ポリヌクレオチドが基準配列に比し、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。コドン縮重、アミノ酸類似性、読み枠の配置などを考慮することによってこれらの値を適切に調節し、２ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の対応する同一性を求めることができるということを当業者は認識するであろう。通常、これらを目的とするアミノ酸配列の実質的同一性とは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００６５】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするかということである。一般的に、ストリンジェントな条件は、明確なイオン強度及びｐＨにて特定の配列に対する熱融解温度（Ｔm）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書で別途認めるように所望のストリンジェンシーに依存し、Ｔmよりも約１℃〜約２０℃低い範囲の温度を包含する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、それでも実質的に同一である。これは、遺伝コードにより許容される最大のコドン縮重を用いて核酸のコピーが生成される場合に生じ得る。２つの核酸配列が実質的に同一であるという１つの指標は、第一の核酸にコードされるポリペプチドが第二の核酸にコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応する場合である。
【００６６】
（ｅ）（ｉｉ）ペプチドの場合の「実質的同一性」という用語は、ペプチドが特定の比較ウインドウ上で基準配列に対し、基準配列に対する少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％又は９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の相同アライメントアルゴリズムを用いて最適アライメントを行うことが好ましい。２つのペプチド配列が実質的に同一であるという指標は、１つのペプチドが第二のペプチドに対する抗体と免疫学的に反応することである。従って、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、１つのペプチドは他方のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似」するペプチドは前述の配列を共有するが、但し、同一でない残基位置が保存的アミノ酸置換により異なり得る。
【００６７】
本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドは対象植物における発現のための発現カセットに提供される。当該カセットは本発明のＡＨＡＳＬ配列に機能的に結合した５’及び３’調節配列を含む。プロモーターに対して「機能的に結合」とは、プロモーターともう１つの配列の機能的結合を意味し、プロモーター配列は第二の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始し、媒介する。一般的に、「機能的に結合」とは、結合される核酸配列が隣接し、必要な場合、２つのタンパク質コード領域を結合して隣接させ、同じ読み枠内にすることである。カセットは生命体に同時形質転換される、少なくとも１つの付加遺伝子を更に含有し得る。或いは、付加遺伝子は複数の発現カセットに提供することができる。
【００６８】
このような発現カセットは、ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドの挿入が調節領域の転写調節下におかれるように複数の制限部位を備える。発現カセットは選択可能なマーカー遺伝子を更に含有し得る。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号１、３、５、７、９及び１１に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む。このようなヌクレオチド配列は開始コドンを含まないと認識される。宿主細胞又は植物における発現を所望する場合、ＡＴＧのような開始コドンを本発明のヌクレオチド配列に機能的に結合することができる。或いは、葉緑体発現を所望する場合、このような開始コドンを含む葉緑体標的配列を本発明のヌクレオチド配列に機能的に結合することができる。
【００７０】
発現カセットは転写の５’−３’方向に、植物において機能的な転写及び翻訳開始領域（即ち、プロモーター）、本発明のＡＨＡＳＬヌクレオチド配列及び転写及び翻訳終止領域（即ち、終止領域）を含む。プロモーターは植物宿主及び／又は本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に対し、天然若しくは類似性又は外来性若しくは異種となり得る。加えて、プロモーターは天然配列或いは合成配列となり得る。プロモーターが植物宿主に対して「外来性」又は「異種」である場合、プロモーターが導入される天然植物にプロモーターが見出されないということを意味する。プロモーターが本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に対して「外来性」又は「異種」である場合、プロモーターが、機能的に結合した本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に対し、天然又は自然発生プロモーターではないということを意味する。本明細書で用いるように、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に機能的に結合したコード配列を含む。
【００７１】
異種プロモーターを用いて配列を発現させることが好ましいこともあるが、天然プロモーター配列を用い得る。このような構築体は本発明の又は植物若しくは植物細胞におけるＡＨＡＳＬタンパク質の発現レベルを変化させ、或いは植物又は植物細胞に除草剤耐性表現型を付与すると思われる。従って、植物又は植物細胞の表現型が改変される。
【００７２】
終止領域は転写開始領域に対して天然であり得て、機能的に結合した対象ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に対して天然であり得て、植物宿主に対して天然であり得て、或いは別のソース（即ち、プロモーター、対象ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド、植物宿主又はその任意の組合せ）由来であり得る。便宜な終止領域はＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドから得ることができ、例えば、オクトピン合成酵素及びノパリン合成酵素終止領域である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；及びＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照されたい。
【００７３】
適切な場合、遺伝子は形質転換植物での発現増大のために最適化し得る。即ち、発現向上のため、植物に好ましいコドンを用いて遺伝子を合成することができる。例えば、宿主に好ましいコドンの使用法の考察について、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。植物に好ましい遺伝子を合成する方法は当分野で得られる。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号及び第５，４３６，３９１号並びにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたい。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
細胞宿主における遺伝子発現を亢進する更なる配列改変が既知である。これには、スプリアスポリアデニリル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列や発現に有害となり得る他の十分に特徴づけられた配列の除去が含まれる。配列のＧ−Ｃ含量は、宿主細胞に発現される既知の遺伝子を参照して計算し、所与の宿主細胞の平均レベルに調節され得る。可能な場合、予測されるｍＲＮＡヘアピン二次構造を避けるため、配列を改変する。
【００７５】
発現カセットは発現カセット構築体に５’リーダー配列を更に含有し得る。このようなリーダー配列は翻訳を亢進するように作用することができる。翻訳リーダーは当分野で公知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎ウイルスの５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６１２６−６１３０）；ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １６５（２）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４：９−２０）及びヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスの外殻タンパク質ｍＲＮＡ（ＡＭＶ ＲＮＡ ４）由来の非翻訳リーダー（Ｊｏｂｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ，ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２３７−２５６）；並びにトウモロコシクロロティックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２−３８５）を含む。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８も参照されたい。翻訳を亢進することが既知である他の方法、例えば、イントロンなども用いることができる。
【００７６】
発現カセットを調製するにあたり、ＤＮＡ配列を適正な配位に、また、必要に応じて適正な読み枠に提供するため、様々なＤＮＡ断片を操作し得る。これを目的として、アダプター又はリンカーを用いてＤＮＡ断片を結合し、或いは便宜な制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供するため、他の操作が伴い得る。これを目的として、インビトロでの変異誘発、プライマーの修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転位及び転換が伴い得る。
【００７７】
本発明の実施にあたり多くのプロモーターを用いることができる。プロモーターは所望の成果に基づいて選択することができる。植物での発現のため、核酸を構成型、組織優先型又は他のプロモーターと結合することができる。
【００７８】
このような構成型プロモーターには、例えば、コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）；イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９− ６３２及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などが含まれる。他の構成型プロモーターには、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号；第５，６０４，１２１号；第５，５６９，５９７号；第５，４６６，７８５号；第５，３９９，６８０号；第５，２６８，４６３号；及び第５，６０８，１４２号が含まれる。
【００７９】
外因性化学調節剤の適用を通じ、化学調節プロモーターを用いて植物における発現を調節することができる。目的に応じ、プロモーターは化学物質の適用が遺伝子発現を誘発する場合には化学物質誘導性プロモーター、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する場合には化学物質抑制プロモーターとし得る。化学物質誘導性プロモーターは当分野で公知であり、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤により活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、出芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物により活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター及びサリチル酸により活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーターを含むが、これらに限定されない。他の対象化学調節プロモーターには、ステロイド反応性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１−１０４２５及びＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４（２）：２４７−２５７におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照されたい）並びにテトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９− ２３７並びに米国特許第５，８１４，６１８号及び第５，７８９，１５６号を参照されたい）が含まれ、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
組織優先プロモーターを用いて特定の植物組織内のＡＨＡＳＬ発現の亢進を目標とすることができる。組織優先プロモーターは、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１− １９６；Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２０）：９５８６−９５９０；及びＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（３）：４９５−５０５を含む。
【００８１】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド分子は発現に対して葉緑体を標的とする。このようにして、対象ポリヌクレオチド分子が葉緑体に直接挿入されない場合、発現カセットは対象遺伝子産物を葉緑体に誘導するように、輸送ペプチドをコードする、機能的に結合した核酸配列を更に含有する。このような輸送ペプチドは当分野で公知である。葉緑体標的配列に関し、「機能的に結合」とは、輸送ペプチドをコードする核酸配列（即ち、葉緑体標的配列）が本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドに結合し、そのため２配列が隣接し、同じ読み枠にあるということである。例えば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１を参照されたい。
【００８２】
葉緑体標的配列は当分野で公知であり、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ルビスコ）の葉緑体小サブユニット（ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｓｉｌｖａ Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：７６９−７８０；Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５）：３３３５−３３４２）；５−（エノールピルビル）シキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）（Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２（６）：７８９−８１０）；トリプトファンシンターゼ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：６０８１−６０８７）；プラストシアニン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３）：２０３５７−２０３６３）；コリスミ酸シンターゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２７４４７−２７４５７）；及び集光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＬＨＢＰ）（Ｌａｍｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４９９６−１４９９９）を含む。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４− １２６；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１も参照されたい。或いは、コムギＡＨＡＳＬ遺伝子に対する葉緑体標的配列を単離し、本発明のＡＨＡＳＬヌクレオチド分子に機能的に結合することができる。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチド分子は植物の葉緑体ゲノムを形質転換するのに用いることができる。葉緑体の形質転換法は当分野で公知である。例えば、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１−６０６を参照されたい。本方法は選択可能なマーカーを含有するＤＮＡのパーティクルガン送達と、相同組換えを通じた色素体ゲノムへのＤＮＡの標的化に依存する。加えて、色素体の形質転換は、核コード化及び色素体標的化ＲＮＡポリメラーゼの組織優先発現による、色素体媒介性沈黙導入遺伝子の転写活性化によって可能となる。このようなシステムはＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５に報告されている。
【００８４】
葉緑体を標的とする対象ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドは、植物核とこの細胞小器官のコドン使用法の差異を考慮に入れるように、葉緑体における発現を最適化され得る。このようにして、対象ポリヌクレオチドは葉緑体優先コドンを用いて合成され得る。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号を参照されたい。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
形質転換プロトコル及びヌクレオチド配列の植物への導入プロトコルは、形質転換の標的となる植物又は植物細胞の種類、即ち、単子葉植物又は双子葉植物に応じて異なり得る。ヌクレオチド配列を植物細胞に、続いて植物ゲノムに導入する好適な方法は、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５６３，０５５号；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，９８１，８４０号）、遺伝子直接導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７−２７２２）及びバリスティック粒子加速（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９４５，０５０号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８７９，９１８号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８８６，２４４号；Ｂｉｄｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）「Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ，」 ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６）；及びＬｅｃ１形質転換（ＷＯ ００／２８０５８）を参照されたい）を含む。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ ａｎｄ ＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；Ｔｏｍｅｓ、米国特許第５，２４０，８５５号；Ｂｕｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，３２２，７８３号及び第５，３２４，６４６号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）「Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ，」 ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４；Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，７３６，３６９号（穀物）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５−４１８及びＫａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ηａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：２５０−２５５及びＣｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ７５：４０７−４１３（イネ）；Ｏｓｊｏｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介トウモロコシ）も参照されたい。当該文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
形質転換された細胞は従来の方法に従って植物に生育され得る。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１−８４を参照されたい。次に、これらの植物は生育され、同じ形質転換株又は異なる株と受粉され、その結果生じるハイブリッドは同定された所望の表現型特性の構成的発現を有する。所望の表現型特性の発現が安定的に維持され、遺伝されるように２世代以上を生育し、次に、所望の表現型特性の発現が達成されたことを確認するため、種子を採取し得る。このようにして、本発明は、本発明のヌクレオチド構築体、例えば、そのゲノムに安定的に組み込まれた本発明の発現カセットを有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも称される）を提供する。
【００８７】
これらのヌクレオチド配列に関し、ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド分子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部分に相補的なアンチセンス構築体を構築できることが認識される。アンチセンスヌクレオチドは対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするように構築される。アンチセンス配列の改変は、配列が対応するｍＲＮＡとハイブリダイズし、その発現に干渉する限り、行い得る。このようにして、対応するアンチセンス化された配列に対し、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％の配列同一性を有するアンチセンス構築体を用い得る。更に、アンチセンスヌクレオチドの一部を用いて標的遺伝子の発現を阻害し得る。一般的に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチドの配列を用い得る。
【００８８】
本発明のヌクレオチド配列は植物における内在遺伝子の発現を抑制するため、センス配位においても用い得る。センス配位におけるヌクレオチド配列を用いて植物における遺伝子発現を抑制する方法は、当分野で公知である。一般的に、本方法は、内在遺伝子の転写物に対応するヌクレオチド配列の少なくとも一部分に機能的に結合した、植物における発現を促進するプロモーターを含むＤＮＡ構築体により植物を形質転換することを含む。通常、このようなヌクレオチド配列は内在遺伝子の転写物の配列に対する実質的な配列同一性を有し、好ましくは約６５％以上の配列同一性、より好ましくは約８５％以上の配列同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有する。米国特許第５，２８３，１８４号及び第５，０３４，３２３号を参照されたい。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドは、ピリミジルオキシ安息香酸系、ピリミジルチオ安息香酸系及びイミダゾリノン系除草剤に対する植物、植物細胞又は他の宿主細胞の耐性を亢進する方法に用いることができる。本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドは、植物、植物細胞及び宿主細胞をイミダゾリノン系除草剤に曝露させることを含む、形質転換された植物、植物細胞や他の宿主細胞を選択する方法に用いることもできる。本発明では、イミダゾリノン系除草剤には、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼタピル）、ＣＡＤＲＥ（登録商標）（イマザピック）、ＲＡＰＴＯＲ（登録商標）（イマザモックス）、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザキン）、ＡＳＳＥＲＴ（登録商標）（イマゼサベンツ）、ＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）（イマザピル）、前述の任意の除草剤の誘導体又は前述の除草剤の２つ以上の混合物、例えば、イマザピル／イマザモックス（ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、イミダゾリノン系除草剤は、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル）−４−］［メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン］酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−）４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−）イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸並びにメチル［６−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−］オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物から選択することができるが、これらに限定されない。５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸と［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−］イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸が好ましい。［２−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸が特に好ましい。本発明ではピリミジルチオ安息香酸系除草剤はＳＴＡＰＬＥ（登録商標）（ピリチオバックナトリウム塩）を含むが、これに限定されない。
【００９０】
本発明の方法は、形質転換植物、形質転換植物細胞及び形質転換宿主細胞を除草剤、詳細にはピリミジルオキシ安息香酸系、ピリミジルチオ安息香酸系又はイミダゾリノン系除草剤、より詳細にはイミダゾリノン系除草剤に曝露させることを含む。除草剤の好ましい量又は濃度は「有効量」又は「有効濃度」である。「有効量」及び「有効濃度」とは、類似する非形質転換植物、植物細胞又は宿主細胞を死滅させ、或いはその生育を阻害するのに十分な量と濃度であるが、前記量では形質転換植物、形質転換植物細胞及び形質転換宿主細胞をそれほどには死滅させず、或いはその生育を阻害しない量と濃度をそれぞれ意味する。「類似する非形質転換植物、植物細胞又は宿主細胞」とは、本発明の形質転換植物、形質転換植物細胞又は形質転換宿主細胞を作製するのに用いられた本発明の特定のポリヌクレオチドを欠く、植物、植物、植物組織、植物細胞又は宿主細胞をそれぞれ意味する。従って、「非形質転換」という用語の使用は、植物、植物細胞又は他の宿主細胞がそのゲノムに組換えＤＮＡを欠損しているということを意味するものではない。
【００９１】
本発明は、単子葉植物及び双子葉植物を含むがこれに限定されない任意の植物種の形質転換に用い得る。対象植物種の例には、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アブラナ種（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ，Ｂ．ｒａｐａ，Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に種子油源として有用なアブラナ種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ，Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ミレット（例えば、パールミレット（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ，Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、カンキツ樹（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、オートムギ、オオムギ、野菜類、鑑賞植物及び球果植物が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
野菜類は、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、グリーンビーンズ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、リママメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｓｐｐ．）並びにキュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）及びマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）のようなＣｕｃｕｍｉｓ属を含む。鑑賞植物は、アザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ．）、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）及びキクを含む。
【００９３】
本発明を実施するにあたり用いられ得る球果植物は、例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールパイン（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ）及びモンテレーマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）のようなマツ；ダグラスファー（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）；アメリカスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；ヨーロッパモミ（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ）及びバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ）のような真性モミ；並びにウェスタンレッドシダー（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）及びアラスカイエローシダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）のようなスギを含む。本発明の植物は、好ましくは栽培植物（例えば、コムギ、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、モロコシ、ミレット、タバコなど）であり、より好ましくは穀物植物（例えば、コムギ、イネ、トウモロコシ、オオムギ、モロコシ、ライムギ、ミレットなど）であり、最も好ましくはコムギ植物である。
【００９４】
本発明は、本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドの１つ以上をそのゲノムに含む、非トランスジェニック植物、特に非トランスジェニックコムギ植物も包含する。このようなコムギ植物は除草剤抵抗性であり、当分野で公知の任意の変異誘発法を介して野性型コムギ植物から作出することができる。例えば、米国特許第６，３３９，１８４号を参照されたい。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。本発明はこのような除草剤抵抗性植物の植物細胞、植物部分、植物組織、種子及び後代を更に包含する。
【００９５】
本発明の宿主細胞は原核細胞及び真核細胞、特に細菌細胞、真菌細胞及び動物細胞を含む。このような真菌細胞は、これに限定されないが酵母菌細胞を含み、このような動物細胞は、これに限定されないが昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む。
【００９６】
本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドは、本発明の植物形質転換のための選択可能なマーカー遺伝子としての使用に用途を見出すが、本発明の発現カセットは形質転換細胞の選択のための別の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。本発明の選択可能なマーカー遺伝子を含む選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換された細胞又は組織の選択に用いられる。マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子並びに除草剤化合物、例えば、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン及び２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）への抵抗性を付与する遺伝子を含む。Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４−６３１８；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３−７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９−２４２２；Ｂａｒｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８０）ｉｎ Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ，ｐｐ．１７７−２２０；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５−５６６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３−６１２；Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３−７２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００−５４０４；Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９−２５５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０−４８３；Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９１７−１９２１；Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２−３９５６；Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：５０７２−５０７６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７−４６５３；Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１−１５９５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４−１１０４；Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３−９１９；Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１−７２４を全体的に参照されたい。このような開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
選択可能なマーカー遺伝子の前述のリストは限定的な意味をもつものではない。本発明の選択可能なマーカー遺伝子を含む、任意の選択可能なマーカー遺伝子を本発明において用いることができる。
【００９８】
本発明の形質転換ベクターは対象遺伝子により形質転換される植物を作出するのに用いることができる。形質転換ベクターは本発明の選択可能なマーカー遺伝子と、導入されて通常形質転換植物に発現される対象遺伝子を含む。
【００９９】
対象遺伝子は所望の成果により異なる。例えば、表現型の種々の変化が対象となり得て、これには植物における脂肪酸組成の改変、植物のアミノ酸含量の変更、植物の昆虫及び／又は病原体防御機構の変更などが含まれる。これらの結果は、植物における異種産物の発現又は内在産物の発現の増大を付与することにより、達成することができる。或いは、植物における１つ以上の内在産物、特に酵素又は補因子の発現を低減することにより、結果を達成することができる。これらの変化により形質転換植物の表現型の変化が生じる。
【０１００】
対象遺伝子は市場及び作物開発に関わる者の関心を反映する。対象となる作物及び市場は変化し、発展途上国が世界市場を開拓していくに従って、新規の作物及び技術も出現するであろう。加えて、収穫量及び雑種強勢のような農業形質及び特性の理解が深まるにつれ、それに応じて形質転換のための遺伝子の選択も変化するであろう。対象遺伝子の一般的範疇には、例えば、ジンクフィンガーのような情報に関与する遺伝子、キナーゼのような伝達に関与する遺伝子及び熱ショックタンパク質のようなハウスキーピングに関与する遺伝子が含まれる。より具体的な導入遺伝子の範疇には、例えば、農学、昆虫抵抗性、病害抵抗性、除草剤抵抗性、繁殖不能性、穀物特性及び商品に対する重要な形質をコードする遺伝子が含まれる。一般的に、対象遺伝子は種々の種子成分、例えば、油性物、デンプン、タンパク質及び可溶性糖類に関与する遺伝子並びに昆虫及び病害抵抗性と、例えば、寒冷、熱及び干ばつのような環境ストレスへの耐性のような農業成績に好影響を及ぼす遺伝子を含む。
【０１０１】
油性物、デンプン及びタンパク質含量のような農学的に重要な形質は、従来の育種法に加えて遺伝学的に改変することができる。改変には、オレイン酸含量、飽和及び不飽和油性物の増加、リシン及び硫黄レベルの上昇、必須アミノ酸の付与、更にデンプンの改変が含まれる。
【０１０２】
昆虫抵抗性遺伝子は、多大な収穫妨害をもたらすルートワーム、カットワーム、アワノメイガなどの害虫への抵抗性をコードし得る。このような遺伝子には、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒性タンパク質遺伝子（米国特許第５，３６６，８９２号；第５，７４７，４５０号；第５，７３６，５１４号；第５，７２３，７５６号；第５，５９３，８８１号；及びＧｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４８：１０９）；レクチン（Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８２５）などが含まれる。
【０１０３】
病害抵抗性形質をコードする遺伝子には、ｆｕｍｏｎｏｓｉｎに対するような解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号）；弱毒性（ａｖｒ）及び病害抵抗性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２；及びＭｉｎｄｒｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：１０８９）などが含まれる。
【０１０４】
外因性産物には、植物の酵素及び産物並びに原核生物や他の真核生物を含む他のソース由来の産物が含まれる。このような産物には酵素、補因子、ホルモンなどが含まれる。タンパク質、特に植物の栄養価を改善するためにアミノ酸分布を向上させた改変タンパク質のレベルを上昇させることができる。これは、増大したアミノ酸含量を有するようなタンパク質の発現によって達成される。
【０１０５】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド分子」、「ヌクレオチド分子」、「ヌクレオチド構築体」などの用語の本明細書における使用は、ＤＮＡを含むヌクレオチド構築体に本発明を限定するものではない。リボヌクレオチド及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合せから構成されるヌクレオチド構築体、特にポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドも本明細書で開示する方法に用いられ得ることを当業者は認識するであろう。従って、本発明のヌクレオチド構築体は、植物を形質転換する本発明の方法において用いることができるあらゆるヌクレオチド構築体を包含し、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びその組合せから構成されるヌクレオチド構築体を含むが、これらに限定されない。このようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは自然発生分子及び合成類似体の両方を含む。本発明のヌクレオチド構築体はあらゆる形態のヌクレオチド構築体も包含し、一本鎖型、二本鎖型、ヘアピン型、ステムル一プ構造などを含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
更に、本発明の方法では、少なくとも１つのタンパク質又は少なくとも１つのＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補的なアンチセンスＲＮＡの発現を形質転換植物において誘導することが可能なヌクレオチド構築体を用い得ることが認識される。通常、このようなヌクレオチド構築体は、５’及び３’転写調節領域に機能的に結合した、タンパク質又はＲＮＡのコード配列から構成される。或いは、本発明の方法では、タンパク質又はＲＮＡの発現を形質転換植物において誘導することが可能でないヌクレオチド構築体を用い得ることも認識される。
【０１０７】
本発明の方法はヌクレオチド構築体を植物に導入することを含む。「導入」とは、ヌクレオチド構築体が植物の細胞の内部にアクセスできるように、構築体を植物に提示することを意味する。本発明の方法はヌクレオチド構築体を植物に導入する特定の方法に依存せず、単にヌクレオチド構築体が植物の少なくとも１つの細胞の内部にアクセスできるということである。ヌクレオチド構築体を植物に導入する方法は当分野で公知であり、安定性形質転換法、一過性形質転換法及びウイルス媒介法を含むが、これらに限定されない。
【０１０８】
「安定性形質転換」とは、植物に導入されるヌクレオチド構築体が植物のゲノムに組み込まれ、その後代に遺伝されることが可能であることを意味する。「一過性形質転換」とは、植物に導入されるヌクレオチド構築体が植物のゲノムに組み込まれないことを意味する。
【０１０９】
本発明のヌクレオチド構築体は、植物をウイルス又はウイルスポリヌクレオチドと接触させることにより、植物に導入され得る。一般的に、このような方法は、本発明のヌクレオチド構築体をウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に組み込むことを含む。本発明のイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬタンパク質は、当初、ウイルスポリタンパク質の一部として合成され、その後、これはインビボ又はインビトロでのタンパク質分解により処理され、所望の組換えタンパク質を産生し得ることが認識される。更に、本発明のプロモーターはウイルスＲＮＡポリメラーゼによる転写に用いられるプロモーターも包含することが認識される。ヌクレオチド構築体を植物に導入し、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子が関与する、コードされたタンパク質をその植物において発現させる方法は、当分野で公知である。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号、第５，８８９，１９０号、第５，８６６，７８５号、第５，５８９，３６７号及び第５，３１６，９３１号を参照されたい。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
本明細書で更に提供されるのは、本発明の少なくとも１つのＡＨＡＳＬポリヌクレオチドにより形質転換される植物の近傍における雑草を抑制する方法である。本方法は有効量の除草剤、特に有効量のイミダゾリノン系除草剤を雑草と形質転換植物又は雑草と形質転換植物が生じる土壌に適用するステップを含み、ここで植物は非形質転換植物に比し、除草剤への抵抗性が増大している。「有効量の除草剤」とは、形質転換植物の近傍における所望の雑草を死滅させ、或いはその生育を遅延させるのに十分な量であって、また、形質転換植物と同じであるが本発明の少なくとも１つの除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドをそのゲノムに欠く非形質転換植物を死滅させるのに十分な量を意味する。加えて、有効量の除草剤では形質転換植物に適用された際、本発明の形質転換植物を死滅させず、好ましくは形質転換植物の生育を有意に遅延させず、或いはこれを有意に損傷しない。通常、除草剤の有効量は、農業生産システムにおいて雑草を死滅させるのに日常的に用いられる量である。このような量は当業者には既知である。
【０１１１】
雑草を抑制するこのような方法では、形質転換植物は好ましくは栽培植物であり、コムギ、イネ、トウモロコシ、モロコシ、オオムギ、ライムギ、ミレット、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、モロコシ、ミレット、タバコ、トマト及びジャガイモを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
除草剤、特にイミダゾリノン系除草剤への抵抗性が亢進した植物を提供することにより、植物の生育を亢進し、栄養素を求める競争を低減するため、植物を雑草から防御するための広範な配合物を用いることができる。除草剤は、本明細書で述べる植物を取り囲む領域における雑草の出芽前、出芽後、植付け前及び植付け時の抑制に単独で用いることができ、或いは他の添加剤を含有するイミダゾリノン系除草剤配合物を用いることができる。除草剤は種子処理剤としても用いることができる。除草剤配合物に見出される添加剤には、他の除草剤、洗浄剤、補助剤、展着剤、固着剤、安定化剤などが含まれる。除草剤配合物は湿潤又は乾燥調製物とすることができ、流動性粉末、乳化可能な濃縮物及び液状濃縮物を含むことができるが、これらに限定されない。除草剤及び除草剤配合物は従来の方法、例えば、噴霧、灌注、散布などに従って適用することができる。
【実施例１】
【０１１３】
ＡＨＡＳＬ大サブユニットは３遺伝子にコードされる
コムギ突然変異誘発プログラムの過程において、除草剤噴霧アッセイにより、何千もの独立して誘導された系統を分析した。耐性の分子基盤を理解するため、コムギにおける活性遺伝子を同定しようと試みた。過去にクローニングしたＡＨＡＳＬヌクレオチド分子に基づいて縮重ＰＣＲプライマーを設計することにより、野性型及びイミダゾリノン抵抗性コムギ植物由来のＡＨＡＳＬ遺伝子のクローニングを行った。クローニングしたＰＣＲ産物は密接に関連した３群に分類され、６倍体のコムギに３個のＡＨＡＳＬ遺伝子があることが示唆される。このことは各２倍体ゲノムが単一ＡＨＡＳＬ遺伝子を有することと一致する。その後のＥＳＴデータの解析により、わずか３つのＡＨＡＳＬの活性コピーがあることが示された。加えて、独立的に分離した抵抗性遺伝子がわずかに３個見出されている（Ｐｏｚｎｉａｋ ａｎｄ Ｈｕｃｌ、印刷中）。コムギＡＨＡＳＬ遺伝子のほぼ全長の配列をＰＡＣＥ−ＰＣＲにより決定した。配列表に示すヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１〜１２）はコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）品種「Ｇｕｎｎｅｒ」由来である。完全な転写配列の解明はコード配列の５’部分の超高ＧＣ含量により阻止された。各３遺伝子はその１７８８ｂｐ長に沿って約９８％同一であり、コード化タンパク質は互いにわずかに１つのアミノ酸だけ異なる（図１）。密接に関連した４倍体種のＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ Ｌ．（デュラムコムギ）は６倍体のコムギにおけるその同族に比し、同一（遺伝子３）又はアミノ酸が１つだけ異なる（遺伝子２）タンパク質をコードする２個の遺伝子を含有する。
【実施例２】
【０１１４】
コムギＡＨＡＳＬ遺伝子は第６染色体の長腕に位置する
３遺伝子の染色体位置を決定するため、異数体系統の「チャイニーズスプリング」の採取物を遺伝子特異的な増幅切断多型（ＣＡＰＳ）マーカーと共に用いた（Ｐｏｚｎｉａｋ ｅｔ ａｌ、提出済）。遺伝子１はＮ６ＤＴ６Ａ及びＤｔ６ＤＳから欠失していることが見出され、一方、遺伝子２はＮ６ＢＴ６Ｄ及びＤｔ６ＢＳ線上に存在せず、遺伝子３はＮ６ＡＴ６Ｂ及びＤｔ６ＡＳ線上に存在しなかった（図２〜３）。これにより、遺伝子１は６Ｄ染色体、遺伝子２は６Ｂ染色体、遺伝子３は６Ａ染色体の長腕に位置することが示される。ここで同祖遺伝子１〜３をそれぞれＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＬＳ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａと改称し、最後の文字はゲノムを示す。
【実施例３】
【０１１５】
耐性レベルは突然変異化ＡＨＡＳＬ遺伝子に影響される
コムギにおいて認められる最も一般的な変異では、シロイヌナズナにおけるＳｅｒ６５３に等価な位置におけるＳｅｒからＡｓｎへの置換が生じる（Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎと命名）。典型的には、温室で生育された植物での差異を検出するのに十分な程度のイマザモックスを噴霧した後、各変異誘発系統由来の２４個体を０〜９の評価スケール（０＝損傷なし；９＝最大損傷）でスコアリングした（図４）。各系統に対し、特定の変異遺伝子を決定した。除草剤噴霧アッセイの評価とこの位置で変異した特定の同祖の間に明らかな相関が見出された。ＡＨＡＳＬ１Ｄにおける変異は、１Ｂ（５．４）及び１Ａ（６．４）に比し、高い耐性を生じた（損傷中央値＝４．０）。
【実施例４】
【０１１６】
６倍体のコムギにおける各ＡＨＡＳＬ遺伝子は様々な量の活性を酵素プールに付与する
除草剤に対する酵素感受性レベルへの各変異の影響を理解するため、複数のバックグラウンド由来の個体を用いて、３遺伝子全てにおけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異体に対してＡＨＡＳアッセイを行った（各データは図６Ａ中）。その結果は、１００μＭイマザピルの存在下、ＡＨＡＳＬ１Ｄが最大レベルの非感受性（３８％）を付与し、一方、ＡＨＡＳＬ１Ａ及び１Ｂが低レベルの活性（それぞれ３３％、２５％）を示したという点において、噴霧アッセイデータと同様である。ＣＤＣ Ｔｅａｌバックグラウンドにおける変異体由来の抽出物の比較では類似した関係が示され、１００μＭイマゼタピルの存在下、ＡＨＡＳ１Ｄは４０％の活性を有し、ＡＨＡＳ１Ｂは３０％の活性を有した。また、１Ａと１Ｄの二重変異体は６３％のＡＨＡＳ活性を保持した（Ｐｏｚｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．、提出済）。総合的に考えて、当該データはＡＨＡＳＬ１Ｄが最大量の活性を酵素プールに付与し、また、抵抗性レベルが概して相加的であることを示す。デュラムコムギ（Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ）において、各同祖はＡＨＡＳプールに同等量を付与するように思われる（図６Ｂ）。
【実施例５】
【０１１７】
除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質
本発明は野性型コムギＡＨＡＳＬ成熟ポリペプチド及び除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬ成熟ポリペプチドのヌクレオチド及びアミノ酸配列を開示する。除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリペプチドを含む植物は前に同定されており、除草剤抵抗性を付与するアミノ酸置換の部位であるＡＨＡＳＬポリペプチドの多くの保存領域が記載されている。例えば、Ｄｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｅｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ」．Ｉｎ：Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．１５９−１８５，ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；及びＤｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｓｈｕｋｌａ，（２０００）Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ １９：８８１−８８９を参照されたい。
【０１１８】
本発明のＡＨＡＳＬ配列（配列番号１、３、５、７、９及び１１）及び当業者に既知であって本明細書に開示される方法を用いて、これらの保存領域における同定された部位での１、２、３又はそれ以上のアミノ酸置換を有する除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリペプチドをコードする更なるポリヌクレオチドを生成することができる。表６はＡＨＡＳＬタンパク質の保存領域、これらの保存領域内の除草剤抵抗性を付与することが既知であるアミノ酸置換及び配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示されるコムギＡＨＡＳＬタンパク質における対応するアミノ酸を示す。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
1Ｄｅｖｉｎｅ及びＥｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ」、「Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、１５９〜１８５頁、ＩＯＳ出版、アムステルダム並びにＤｅｖｉｎｅ及びＳｈｕｋｌａ（２０００）Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ １９：８８１−８８９から出典の保存領域。
【０１２１】
2アミノ酸の番号づけはシロイヌナズナＡＨＡＳＬポリペプチドのアミノ酸配列に対応する。
【０１２２】
3本発明のコムギＡＨＡＳＬタンパク質の各アミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０及び１２）は同じ保存領域を含む。
【０１２３】
4Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２９）：１７３８１−１７３８５。
【０１２４】
5Ｗｒｉｇｈｔ及びＰｅｎｎｅｒ（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：６１２−６２０。
【０１２５】
6Ｂｏｕｔｓａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．５５：５０７−５１６。
【０１２６】
7Ｇｕｔｔｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４３：１４３−１７８。
【０１２７】
8Ｇｕｔｔｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４０：６７０−６７８。
【０１２８】
9Ｋｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０９：１１４７−１１５９。
【０１２９】
10Ｈａｒｔｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）「Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｎｔｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｕｔａｔｅｄ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅｓ」、「Ｍａｎａｇｉｎｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、米国化学会シンポジウム、シリーズ第４２１号、米国ワシントン特別区。
【０１３０】
11Ｓｉｍｐｓｏｎ（１９９８）Ｄｏｗｎ ｔｏ Ｅａｒｔｈ ５３（ｌ）：２６−３５。
【０１３１】
12Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．５１：８４５−８５３。
【０１３２】
13Ｂｒｕｎｉａｒｄ（２００１）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｓｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎ，ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）、１〜７８頁、博士号論文、米国ノースダコタ州ファーゴ、ノースダコタ州立大学。
【０１３３】
14Ｄｅｖｉｎｅ及びＥｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ」、「Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、１５９〜１８５頁、ＩＯＳ出版、アムステルダム。
【０１３４】
15Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５２：３４１−３４５。
【０１３５】
16Ｃｈａｎｇ及びＤｕｇｇｌｅｂｙ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３３：７６５−７７７。
【０１３６】
17本発明は除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａ成熟タンパク質のアミノ酸配列を示す配列番号８、１０及び１２を開示する。これらのアミノ酸配列の各々はアミノ酸位置５７９におけるＡｓｎを含む。本発明は成熟除草剤抵抗性除草剤抵抗性コムギ成熟タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を示す配列番号７、９及び１１を更に開示する。
【０１３７】
本明細書に挙げた刊行物及び特許出願は全て、本発明に関連する当業者のレベルを示すものである。刊行物及び特許出願は全て、各々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別的に望ましいといえるほどに、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
前述の発明を明瞭な理解を目的として例示及び実施例によりある程度詳細に説明したが、添付した特許請求の範囲内においていくつかの変更及び改変を実施し得るということは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】コムギＡＨＡＳＬ遺伝子コード配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列の対比較から得た配列同一性パーセントの表である。６倍体はＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来の配列を指す。４倍体はＴ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ由来の配列を示す。遺伝子１はＡＨＡＳＬ１Ｄに対応する。遺伝子２はＡＨＡＳＬ１Ｂに対応する。遺伝子３はＡＨＡＳＬ１Ａに対応する。
【図２】実施例２で述べるチャイニーズスプリングにおける３つのコムギＡＨＡＳＬ遺伝子の染色体位置の解析結果を示す写真図である。
【図３】実施例２で述べるチャイニーズスプリングにおける３つのコムギＡＨＡＳＬ遺伝子の染色体位置の解析結果を示す写真図である。
【図４】実施例３で述べる変異部位と植物全体の損傷の相関のグラフである。１Ｄ、１Ｂ及び１Ａは、コムギＡＨＡＳＬ遺伝子のそれぞれＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａを示す。
【図５】Ａは、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異から生じる除草剤非感受性酵素活性のグラフであり、Ｂは、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異から生じる除草剤非感受性酵素活性のグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物分子生物学の分野に関し、詳細には、コムギのアセトヒドロキシ酸合成酵素の大サブユニット酵素（以下、ＡＨＡＳＬ）をコードし、除草剤耐性植物を作出するのに用いることができる新規のヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ；ＥＣ ４．１．３．１８、アセト乳酸合成酵素又はＡＬＳとしても公知である）は、分岐鎖アミノ酸であるバリン、ロイシン、イソロイシンの生化学的合成を触媒する最初の酵素である（Ｓｉｎｇｈ（１９９９）「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｖａｌｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ ａｎｄ ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，」 ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，Ｓｉｎｇｈ，Ｂ．Ｋ．，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２２７−２４７）。ＡＨＡＳは、スルホニルウレア（ＬａＲｏｓｓａ ａｎｄ Ｆａｌｃｏ（１９８４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：１５８−１６１）、イミダゾリノン（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６：５４５−５４６）、トリアゾロピリミジン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ａｎｄ Ｇｅｒｗｉｃｋ（１９８９）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｂｙ ｔｒｉａｚｏｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ，」 ｉｎ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｓｏｎｎｅｔ，Ｐ．Ｅ．ｅｄｓ．，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．２７７−２８８）及びピリミジルオキシ安息香酸（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４：２３９−２４４．）を含む、構造的に多様な４除草剤系の作用部位である。イミダゾリノン系及びスルホニルウレア系除草剤は、少使用量での効果及び動物における相対的な非毒性により、現代の農業において広範に使用されている。ＡＨＡＳ活性を阻害することにより、これらの除草剤系は多くの雑草種を含む、感受性が高い植物の更なる成長及び生育を阻止する。市販されているイミダゾリノン系除草剤の数例はＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼタピル）、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザキン）及びＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）（イマザピル）である。スルホニルウレア系除草剤の例はクロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメツルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン（ａｍｉｄｏｓｕｌｆｉｕｏｎ）、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル及びハロスルフロンである。
【０００３】
その高い効果及び低毒性のため、イミダゾリノン系除草剤は広範囲の植生の頂部にわたり噴霧することにより、使用に対して好意的に受け入れられている。広範囲の植生の頂部にわたり除草剤を噴霧できることにより、栽培場の造成及び維持に関連するコストが低減し、このような化学物質の使用前の現地準備の必要性が低下する。所望の耐性種の頂部にわたり噴霧することにより、競合種が存在しないため、所望の種の最大生産力を達成する能力も生じる。しかし、このような噴霧手法を用いる能力は、噴霧領域における所望の植生のイミダゾリノン抵抗性種の存在に依存する。
【０００４】
主な農作物の中で、ダイズのような一部のマメ科種は、その除草剤化合物を迅速に代謝する能力により、イミダゾリノン系除草剤に対してもともと抵抗性がある（Ｓｈａｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９８５）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．３３：４６９−４７１）。トウモロコシ（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２８８６）及びイネ（Ｂａｒｒｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｒｏｐ Ｓａｆｅｎｅｒｓ ｆｏｒ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１９５−２２０）のような他の作物は、イミダゾリノン系除草剤に対してある程度感受性がある。イミダゾリノン系除草剤に対する感受性の差異は、特定の除草剤の化学的性質と、各植物における毒性から非毒性形態への化合物の代謝の差異に依存する（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６：５４５−５４６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７：２４−２９）。吸収及び移行のような植物の他の生理学的相違も感受性に重要な役割を果たす（Ｓｈａｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９８５）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．３３：４６９−４７１）。
【０００５】
トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）及びタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）における種子、小胞子、花粉及びカルスの変異誘発を用いて、イミダゾリノン、スルホニルウレアトリア及びトリアゾロピリミジンへの抵抗性を示す作物品種の生産が成功している（Ｓｅｂａｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．２９：１４０３−１４０８；Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８：５２５−５３０；Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：６５−７０；Ｓａｔｈａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１０４４−１０５０；Ｍｏｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ８４：９１−９６）。全ての場合において、単一の部分優性核遺伝子が抵抗性を付与した。コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）Ｌ．ｃｖ．Ｆｉｄｅｌの種子変異誘発後、４種類のイミダゾリノン抵抗性コムギ植物も過去に単離された（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６）。遺伝試験により、単一の部分優性遺伝子が抵抗性を付与することが確認された。対立遺伝子試験に基づき、著者らは同定された４系統における突然変異が同じ遺伝子座に位置すると結論づけた。Ｆｉｄｅｌ品種の抵抗性遺伝子の１つはＦＳ−４と命名された（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６）。
【０００６】
ＡＨＡＳ阻害複合体の３次元構造のコンピュータベースのモデリングでは、提示された阻害因子結合ポケットにおける複数のアミノ酸が、誘発変異がイミダゾリノンに対する選択的抵抗性を付与する可能性がある部位であると予測している（Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：３５９−３６８）。ＡＨＡＳ酵素の提示された結合部位における、これらの合理的に設計された変異の一部によって生産されたコムギ植物は、実際に単一種類の除草剤への特異的抵抗性を示した（Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：３５９−３６８）。
【０００７】
イミダゾリノン系除草剤に対する植物抵抗性は多くの特許においても報告されている。米国特許第４，７６１，３７３号、第５，３３１，１０７号、第５，３０４，７３２号、第６，２１１，４３８号、第６，２１１，４３９号及び第６，２２２，１００号では、植物における除草剤抵抗性を誘発するためにＡＨＡＳ改変遺伝子を用いることを概説し、ある種のイミダゾリノン抵抗性トウモロコシ系を具体的に開示している。米国特許第５，０１３，６５９号では、１つ以上の保存領域における少なくとも１つのアミノ酸の変異により除草剤抵抗性を示す植物を開示している。当該特許に記載されている変異はイミダゾリノンとスルホニルウレアへの交差抵抗性又はスルホニルウレア特異的抵抗性をコードするが、イミダゾリノン特異的抵抗性は記載されていない。更に、米国特許第５，７３１，１８０号及び米国特許第５，７６７，３６１号では、イミダゾリノン特異的抵抗性を生ずる、野性型単子葉植物のＡＨＡＳアミノ酸配列における単一アミノ酸置換を有する単離遺伝子について考察している。
【０００８】
植物では検討される他のあらゆる生命体のように、ＡＨＡＳ酵素は大サブユニット（触媒機能）と小サブユニット（調節機能）の２つのサブユニットからなる（Ｄｕｇｇｌｅｂｙ ａｎｄ Ｐａｎｇ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：１−３６）。大サブユニット（ＡＨＡＳＬと称される）はシロイヌナズナ及びイネのように単一遺伝子に、或いはトウモロコシ、アブラナ及びワタのように複数の遺伝子ファミリーメンバーにコードされ得る。大サブユニットにおける特異的な単一ヌクレオチド置換により、１種類以上の除草剤に対するある程度の非感受性が酵素に付与される（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｄｕｇｇｌｅｂｙ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３３：７６５−７７７）。
【０００９】
例えば、パンコムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌはアセトヒドロキシ酸合成酵素の３つの同祖大サブユニット遺伝子を有する。各遺伝子は各３遺伝子における変異体由来の除草剤応答及び生化学的データに基づく有意な発現を示す（Ａｓｃｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ，Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｓ１０−１７）。これら３遺伝子全てのコード配列はヌクレオチドレベルにおいて広範な相同性を共有する（ＷＯ０３／０１４３５７）。数種類のコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）由来のＡＨＡＳＬ遺伝子の配列決定を介し、大部分のＩＭＩ耐性（イミダゾリノン耐性）系における除草剤耐性の分子基盤が突然変異Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎであることが見出された（ＷＯ０３／０１４３５６；ＷＯ０３／０１４３５７）。この変異はＡＨＡＳＬタンパク質をコードするＤＮＡ配列における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
米国特許第５，７３１，１８０号では、イミダゾリノン特異的抵抗性を生ずる、大サブユニットの６２１位置におけるアミノ酸置換を有するトウモロコシＡＨＡＳＬ変異体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を開示している。Ｈａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１１：２６６−２７１，１９８８）はシロイヌナズナにおけるイミダゾリノン抵抗性の発現を開示した。Ｓａｔｈａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，７６７，３６６号）はシロイヌナズナにおけるイミダゾリノン特異的抵抗性が、正常なＡＨＡＳＬアミノ酸配列における６５３位置での変異に基づくものであると同定した。ＷＯ０３／０１４３５７では、３つの野性型ＡＨＡＳＬ遺伝子（Ａｌｓ１，Ａｌｓ２及びＡｌｓ３；本明細書では以下、それぞれＡＨＡＳＬ１Ｄ，ＡＨＡＳＬ１Ｂ，ＡＨＡＳＬ１Ａとも称する）に対応する、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）由来の部分長ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列並びにＡｌｓ２及びＡｌｓ３におけるイミダゾリノン耐性抵抗性突然変異を開示している。現在まで成熟型コムギＡＨＡＳＬタンパク質に対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列は報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、成熟型野性型除草剤抵抗性コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチド分子は３つのコムギＡＨＡＳＬ遺伝子、ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａに対応する。本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は、例えば、シロイヌナズナＡＨＡＳＬタンパク質におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換に対応する、それぞれのアミノ酸配列における置換を有する除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質を含む。本発明のポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、９及び１１に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列、配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列並びに野性型ＡＨＡＳＬタンパク質又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質、特に前述のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を有するイミダゾリノン抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の断片及び変異体を含む。
【００１２】
本発明は植物、植物細胞や他の非ヒト宿主細胞に本発明のポリヌクレオチド分子を発現させるための発現カセットを提供する。発現カセットは、野性型又はイミダゾリノン抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチド分子に機能的に結合した、対象植物、植物細胞又は他の宿主細胞に発現可能なプロモーターを含む。植物又は植物細胞での発現を所望する場合、発現カセットは発現されたＡＨＡＳＬタンパク質を葉緑体に誘導するため、葉緑体輸送ペプチドをコードする、機能的に結合した葉緑体標的配列を含むこともできる。本発明の発現カセットは植物及び宿主細胞の除草剤耐性を亢進する方法に用途を見出す。本方法は本発明の発現カセットにより植物又は宿主細胞を形質転換することを伴い、ここで発現カセットは対象植物又は宿主細胞に発現可能なプロモーターを含み、当該プロモーターはイミダゾリノン抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドに機能的に結合される。
【００１３】
本発明は本発明の選択可能なマーカー遺伝子を含む形質転換ベクターを提供する。選択可能なマーカー遺伝子は、本発明のポリヌクレオチドに機能的に結合した、宿主細胞における発現を促進するプロモーターを含む。更に、形質転換ベクターは宿主に発現される対象遺伝子を含むことができ、所望であれば、本発明のポリヌクレオチドに機能的に結合した葉緑体標的配列を含むこともできる。このような形質転換ベクターは対象遺伝子により形質転換される宿主細胞を選択する方法に用途を見出す。
【００１４】
更に、本発明は対象遺伝子により形質転換される細胞を選択するため、本発明の形質転換ベクターを用いる方法を提供する。このような方法は形質転換ベクターにより宿主細胞を形質転換することを伴い、非形質転換宿主細胞を死滅させ、或いはその成長を阻害すると思われるイミダゾリノン系除草剤のレベルに細胞を曝露し、除草剤の存在下で成長する能力により形質転換宿主細胞を同定する。本発明の好ましい実施形態において、宿主細胞は植物細胞であり、選択可能なマーカー遺伝子は植物細胞における発現を促進するプロモーターを含む。
【００１５】
本発明は本発明の形質転換植物の近傍における雑草を抑制する方法を提供する。このような形質転換植物は、植物細胞における発現を促進するプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットをそのゲノムに含み、ここで当該プロモーターは本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドに機能的に結合される。本方法は有効量のイミダゾリノン系除草剤を雑草と形質転換植物に適用するステップを含み、ここで形質転換植物は非形質転換植物に比し、イミダゾリノン系除草剤への抵抗性が高まる。
【００１６】
本発明は本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド、発現カセット又は形質転換ベクターにより形質転換される植物、植物組織、植物細胞、種子及び非ヒト宿主細胞も提供する。このように形質転換される植物、植物組織、植物細胞、種子及び非ヒト宿主細胞は、形質転換されない植物、植物組織、植物細胞、種子又は非ヒト宿主細胞のそれぞれを死滅させ、或いはその成長を阻害する除草剤レベルにおいて、少なくとも１つのイミダゾリノン系除草剤に対する耐性又は抵抗性が亢進している。本発明の形質転換される植物、植物組織、植物細胞及び種子はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）と、これらに限定されないが、コムギ、イネ、トウモロコシ、モロコシ、オオムギ、ライムギ、ミレット、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、モロコシ、ミレット、タバコ、トマト及びジャガイモを含む栽培植物であることが好ましい。
【００１７】
本発明は、野性型イミダゾリノン抵抗性コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）ＡＨＡＳＬタンパク質を含む、単離されたポリペプチドを提供する。このように単離されたイミダゾリノン抵抗性ＡＨＡＳＬポリペプチドは各々、シロイヌナズナＡＨＡＳＬタンパク質におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換に対応する、それぞれのアミノ酸配列における置換を有する。本発明の単離ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１、３、５、７、９及び１１に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列並びに野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性、特に前述のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換から生じるイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳ活性を含む前記ポリペプチドの断片及び変異体を含む。
配列リスト
【００１８】
添付の配列リストに一覧にしたヌクレオチド酸及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基に対する標準的な文字省略形及びアミノ酸に対する３文字コードを用いて示される。ヌクレオチド配列は配列の５’末端から開始し、３’末端方向へ前進する（即ち、各ラインにおいて左から右方向）標準的慣用に従う。各核酸の鎖が１つだけ示されるが、表示された鎖を参照して相補鎖が含まれると理解すべきである。アミノ酸配列は配列のアミノ末端から開始し、カルボキシ末端方向へ前進する（即ち、各ラインにおいて左から右方向）標準的慣用に従う。
【００１９】
配列番号１はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ｄタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２０】
配列番号２はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ｄタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号３はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ｂタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２２】
配列番号４はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ｂタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号５はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２４】
配列番号６はコムギ由来の野性型ＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号７はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ｄタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号１に対し、配列番号７はヌクレオチド位置１７３６におけるＣからＡへの置換を含む。
【００２６】
配列番号８はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ｄタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。配列番号２に対し、配列番号８はアミノ酸位置５７９におけるＳｅｒからＡｓｎへの置換を含む。
【００２７】
配列番号９はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ｂタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号３に対し、配列番号９はヌクレオチド位置１７３６におけるＣからＡへの置換を含む。
【００２８】
配列番号１０はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ｂタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。配列番号４に対し、配列番号１０はアミノ酸位置５７９におけるＳｅｒからＡｓｎへの置換を含む。
【００２９】
配列番号１１はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質の成熟型をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号５に対し、配列番号１１はヌクレオチド位置１７３６におけるＣからＡへの置換を含む。
【００３０】
配列番号１２はコムギ由来の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質の成熟型のアミノ酸配列を示す。配列番号６に対し、配列番号１２はアミノ酸位置５７９におけるＳｅｒからＡｓｎへの置換を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、成熟型コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、詳細には野性型除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子に関する。このような成熟型ＡＨＡＳＬタンパク質は、これらのタンパク質の葉緑体への輸送を促進する葉緑体輸送ペプチドを欠く。詳細には、成熟型除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質はイミダゾリノン抵抗性ＡＨＡＳＬ活性を含む。より詳細には、成熟型除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質は、シロイヌナズナＡＨＡＳＬタンパク質におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換に対応する、それぞれのアミノ酸配列における置換を含む。本発明のポリヌクレオチド分子は３つのコムギＡＨＡＳＬ遺伝子、ＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａに対応する。本発明のポリヌクレオチド配列は植物及び宿主細胞の除草剤抵抗性を亢進する方法に用途を見出す。ポリヌクレオチドは形質転換される細胞、組織及び生命体、特に植物及び植物細胞を選択する方法に用いられる選択可能なマーカー遺伝子として更なる用途を見出す。
【００３２】
本発明の組成物は、野性型アセトヒドロキシ酸合成酵素をコードする単離ポリヌクレオチド分子と、通常であれば植物を死滅させ、或いはその成長を停止させるレベルにおいて除草剤に対する耐性又は抵抗性を示す植物を作出する方法に関わる除草剤耐性又は除草剤抵抗性アセトヒドロキシ酸合成酵素をコードする単離ポリヌクレオチド分子を含む。同様に、「除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質」又は「除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質」とは、野性型ＡＨＡＳＬタンパク質のＡＨＡＳ活性を阻害することが既知である濃度にてイミダゾリノン系除草剤が存在する際、このようなＡＨＡＳＬタンパク質が野性型ＡＨＡＳＬのＡＨＡＳ活性に比し、高いＡＨＡＳ活性を示すことを意味する。本発明のこのような除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は、除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドにコードされる。
【００３３】
「野性型ＡＨＡＳ活性」とは、野性型ＡＨＡＳＬタンパク質のＡＨＡＳ活性を意味することを意図する。「除草剤耐性ＡＨＡＳ活性」又は「除草剤抵抗性ＡＨＡＳ活性」とは、「除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質」又は「除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質」のＡＨＡＳ活性を意味することを意図する。
【００３４】
詳細には、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列並びにその断片及び変異体を含む、単離された核酸分子を提供する。更に、本明細書に記載する核酸分子にコードされるアミノ酸配列、例えば、配列番号１、３、５、７、９及び１１に示される配列並びにその断片及び変異体を有するポリペプチドが提供される。
【００３５】
本発明は単離され、或いは実質的に精製された核酸又はタンパク質組成物を包含する。「単離」或いは「精製」された核酸分子又はタンパク質又はその生物活性部分は、自然発生環境において見出される核酸分子又はタンパク質に通常は伴い、或いはこれと相互作用する要素を実質的に或いは本質的に含まない。従って、単離或いは精製された核酸分子又はタンパク質は、組換え技術により産生される際に他の細胞物質又は培養基を実質的に含まず、或いは化学合成により産生される際に化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。「単離された」核酸は、その核酸が由来する生命体のゲノムＤＮＡにおける核酸の側面にもともと位置する配列（好ましくはタンパク質コード配列）（即ち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含まないことが好ましい。例えば、種々の実施形態において、単離核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおける核酸の側面にもともと位置するヌクレオチド配列を約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満含有し得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％又は１％（乾燥重量単位）未満の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質又はその生物活性部分が組換えにより産生される際、培養基は約３０％、２０％、１０％、５％又は１％（乾燥重量単位）未満の化学的前駆体又は非対象タンパク質の化学物質を示すことが好ましい。
【００３６】
開示されるヌクレオチド配列の断片及び変異体も本発明に包含される。「断片」とは、ヌクレオチド配列の一部又はアミノ酸配列の一部、従って、これにコードされるタンパク質を意味する。ヌクレオチド配列の断片は、天然の成熟型ＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性、従って、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を保持するタンパク質断片をコードし得る。或いは、一般的に、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、生物活性を保持する断片タンパク質をコードしない。従って、ヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから本発明のタンパク質をコードする全長ヌクレオチドまでの配列に及び得る。
【００３７】
本発明の野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性部分をコードするＡＨＡＳＬヌクレオチド配列の断片は、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３５０、４００、４５０、５００、５２５、５５０又は５７５個の隣接アミノ酸或いは本発明の全長ＡＨＡＳＬタンパク質に存在する総数のアミノ酸をコードする（例えば、各配列番号２、４、６、８、１０及び１２のそれぞれに対して５９６個のアミノ酸）。一般的に、ハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして有用なＡＨＡＳＬタンパク質のヌクレオチド配列の断片は、ＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性部分をコードする必要がない。
【００３８】
従って、ＡＨＡＳＬヌクレオチド配列の断片はＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性部分をコードし得て、或いは以下に考察する方法を用いてハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして用いることができる断片となり得る。ＡＨＡＳＬタンパク質の生物活性部分は、本発明のＡＨＡＳＬヌクレオチド配列の１配列の一部分を単離し、除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質のコード化部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現）、野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質の当該部分の活性を評価することにより、調製することができる。野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、少なくとも１６、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，６５０、１，７００又は１，７５０個のヌクレオチド或いは本明細書に開示する除草剤耐性全長ＡＨＡＳＬヌクレオチド配列に存在する数までのヌクレオチドを含む（例えば、各配列番号１、３、５、７、９及び１２のそれぞれに対して１７８８個のヌクレオチド）。
【００３９】
「変異体」とは実質的に類似する配列を意味する。ヌクレオチド配列では、保存変異体は、遺伝コードの縮重のため、本発明の１つのＡＨＡＳＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらのような自然発生する対立変異体は、周知の分子生物学的手法、例えば、以下に概略するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法及びハイブリダイゼーション法を用いて同定することができる。変異ヌクレオチド配列は、例えば、部位特異的変異誘発を用いて生成されるが、それでも本発明のＡＨＡＳＬタンパク質をコードするような合成由来のヌクレオチド配列も含む。一般的に、本発明の特定のヌクレオチド配列の変異体は、デフォルトパラメータを用いて本明細書の別の箇所で述べる配列アライメントプログラムにより決定される特定のヌクレオチド配列に対し、少なくとも約７０％、７５％、一般的には少なくとも約８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。
【００４０】
本発明の特定のヌクレオチド配列（即ち、基準ヌクレオチド配列）の変異体は、変異ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドと基準ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドの配列同一性パーセントの比較によって評価することもできる。従って、例えば、配列番号２のポリペプチドに対する所与の配列同一性パーセントを有するポリペプチドをコードする単離核酸を開示する。任意の２つのポリペプチドの配列同一性パーセントは、デフォルトパラメータを用いて本明細書の別の箇所で述べる配列アライメントプログラムを用いて計算することができる。本発明の任意の所与のヌクレオチド配列対が、これらがコードする２つのポリペプチドに共有される配列同一性パーセントの比較によって評価される場合、この２つのコード化ポリペプチドの配列同一性パーセントは少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、一般的には少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性である。
【００４１】
「変異体」タンパク質とは、天然タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆる切断）又は付加；天然タンパク質での１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失又は付加；或いは天然タンパク質での１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換による天然タンパク質由来のタンパク質を意味する。本発明に包含される変異タンパク質は生物学的に活性であり、即ち天然タンパク質の所望の生物活性、即ち、本明細書で述べる野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有し続ける。このような変異体は、例えば、遺伝的多型又は人工的な操作により生じ得る。本発明の除草剤耐性天然ＡＨＡＳＬタンパク質の生物学的に活性な変異体は、デフォルトパラメータを用いて本明細書の別の箇所で述べる配列アライメントプログラムにより決定される天然タンパク質のアミノ酸配列に対し、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、一般的には少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。本発明のタンパク質の生物学的に活性な変異体は、わずか１〜１５個のアミノ酸残基、わずか１〜１０個のアミノ酸残基、例えば６〜１０個、わずか５個、わずか４個、３個、２個、更には１個のアミノ酸残基だけ当該タンパク質と異なり得る。
【００４２】
本発明のタンパク質はアミノ酸の置換、欠失、切断及び挿入を含む種々の方法にて改変され得る。このような操作の方法は当分野で一般的に既知である。例えば、除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質のアミノ酸配列変異体はＤＮＡにおける突然変異により調製することができる。突然変異誘発及びヌクレオチド配列改変の方法は当分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及び当該文献に引用される参考文献を参照されたい。対象タンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得て、同文献は参照により本明細書に組み込まれる。１つのアミノ酸を類似する特性を有する別のアミノ酸に置換するような保存的置換が好ましいといえる。
【００４３】
本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は、配列番号８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を含むが、これらに限定されない。これらアミノ酸の各々は前述のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換に対応する（それぞれの野性型配列に対する）アミノ酸置換を含む。配列番号８、１０及び１２では、この置換はアミノ酸残基又は位置５７９にて生ずる。本発明の除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質は、配列番号８、１０及び１２に示されるアミノ酸配列の変異体及び断片を含み、また、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギン及び除草剤耐性ＡＨＡＳ活性も含むタンパク質も包含する。「等価な位置」とは、米国特許第５，７６７，３６６号に開示されたイミダゾリノン抵抗性シロイヌナズナＡＨＡＳＬタンパク質におけるアミノ酸位置又は残基６５３に相当するＡＨＡＳＬタンパク質における位置或いは本発明の配列番号２、４、６、８、１０及び１２におけるアミノ酸位置５７９を意味することを意図する。ＡＨＡＳＬタンパク質のこのような等価な位置におけるセリン残基からアスパラギンへの置換により、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むＡＨＡＳＬタンパク質を生成できることが好ましい。加えて、本発明はこのような除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を包含する。
【００４４】
従って、本発明の遺伝子及びヌクレオチド配列は自然発生配列と変異型の双方を含む。同様に、本発明のタンパク質は自然発生タンパク質とその変種及び改変型の双方を包含する。このような変異体は所望の野性型又は除草剤耐性ＡＨＡＳＬ活性を有し続ける。明らかに、変異体をコードするＤＮＡ配列において生じる突然変異は、当該配列を読み枠外に置いてはならず、また、ｍＲＮＡ二次構造を生成し得る相補領域を生じないことが好ましい。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照されたい。
【００４５】
加えて、本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は、前述のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換及び／又は除草剤抵抗性をＡＨＡＳＬタンパク質に付与することが既知である、少なくとも１つの他の突然変異を含む除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質を含むが、これに限定されない。ＷＯ０３／０１３２５５、ＷＯ０３／０１４３５６、ＷＯ０３／０１４３５７及び米国仮特許出願第６０／４７３，８２８号を参照されたい。これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。本発明の一実施形態において、本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は１、２、３以上のこのような変異を含むことができる。更に、本発明はこのような除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を包含する。
【００４６】
従って、本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬタンパク質は、前述のＳ６５３（Ａｔ）Ｎ置換を含むＡＨＡＳＬタンパク質に限定されない。詳細には、本発明は、配列番号２、４及び６に示されるアミノ酸配列を含むＡＨＡＳＬタンパク質の除草剤抵抗性変異体及び断片並びに配列番号１、３及び５に示されるヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の除草剤抵抗性変異体及び断片を更に包含する。このようなＡＨＡＳＬタンパク質の除草剤抵抗性変異体及び断片は、例えば、本明細書で述べる本発明のＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を改変し、ヌクレオチド配列にコードされるＡＨＡＳＬタンパク質に除草剤抵抗性を付与することが既知である１つ以上の変異を含むようにすることにより、生成することができる。このような変異については前述している。本発明は、このような除草剤抵抗性変異体及び断片をコードするポリヌクレオチド分子を更に包含する。
【００４７】
本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入及び置換は、タンパク質の特性に大きな変化をもたらすとは考えられない。しかし、置換、欠失又は挿入の正確な作用を事前に予測することが困難な場合、この作用はルーチンのスクリーニングアッセイにより評価されることを当業者は理解するであろう。即ち、ＡＨＡＳＬ機能はイミダゾリノン系除草剤の存在下及び非存在下でのＡＨＡＳ酵素活性アッセイにより評価することができる。例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１７３−１７９）を参照されたい。同文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
変異ヌクレオチド配列及びタンパク質は、ＤＮＡシャッフリングのような変異誘発及び組換え誘導手法由来の配列及びタンパク質も包含する。このような手法を用いて、１つ以上の異なる除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質配列を操作し、所望の特性を有する新規の除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質を生成することができる。このようにして、実質的な配列同一性を有するとともにインビトロ又はインビボでの相同組換えが可能な配列領域を含む関連配列のポリヌクレオチドの集団から、組換えポリヌクレオチドのライブラリが生成される。例えば、この手法を用いて対象ドメインをコードする配列モチーフを本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ遺伝子と他の既知のＡＨＡＳＬ遺伝子とでシャッフリングし、酵素の場合にはＫmの上昇のような対象特性が向上したタンパク質をコードする新規遺伝子を得ることもできる。このようなＤＮＡシャッフリングの方法は当分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；並びに米国特許第５，６０５，７９３号及び第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【００４９】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、他の生命体、詳細には他の植物、より詳細には他の単子葉植物から対応する配列を単離することができる。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を用いて、本明細書に示す配列に対する配列相同性に基づき、このような配列を同定することができる。本明細書に示すＡＨＡＳＬ配列全体又はその断片に対する配列同一性に基づき単離される配列は本発明に包含される。従って、除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードし、ストリンジェントな条件下で本明細書に開示するＡＨＡＳＬ配列又はその断片とハイブリダイズする単離配列は、本発明に包含される。
【００５０】
ＰＣＲ法では、任意の対象植物から抽出されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来の対応するＤＮＡ配列を増幅するため、ＰＣＲ反応において用いるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲプライマー及びＰＣＲクローニングを設計する方法は当分野で一般的に既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＩｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）も参照されたい。既知のＰＣＲ法には、ペアプライマー、ネストプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的に整合しないプライマーなどを用いた方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
ハイブリダイゼーション法では、既知のヌクレオチド配列の全体又は一部が、選択された生命体からクローニングされたゲノムＤＮＡ断片又はｃＤＮＡ断片の集団（即ち、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリ）に存在する、他の対応するヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズするプローブとして用いられる。ハイブリダイゼーションプローブはゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片又は他のオリゴヌクレオチドでよく、32Ｐのような検出可能基又は他の任意の検出可能なマーカーで標識され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブは、本発明の除草剤耐性ＡＨＡＳＬ配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製できる。ハイブリダイゼーション用のプローブの調製並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリの構築のための方法は、当分野で一般的に既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。
【００５２】
例えば、本明細書に開示するＡＨＡＳＬポリヌクレオチド全体又はその一部分若しくはそれ以上の部分を、対応するＡＨＡＳＬポリヌクレオチド及びメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることが可能なプローブとして用い得る。種々の条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するため、このようなプローブは、ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドの中で固有であって、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を含む。このようなプローブは、選択された植物由来の対応するＡＨＡＳＬポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅するために用い得る。この手法は所望の植物から更なるコード配列を単離するため、或いは植物におけるコード配列の存在を判定する診断アッセイとして用い得る。ハイブリダイゼーション法は平板培養ＤＮＡライブラリ（プラーク又はコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい）のハイブリダイゼーションスクリーニングを含む。
【００５３】
このような配列のハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で実施し得る。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが他の配列よりも検出可能に大きな程度にその標的配列とハイブリダイズする条件を意味する（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、様々な状況で異なってくる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを調節することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロービング）。或いは、ストリンジェンシー条件は、配列における多少のミスマッチを許容し、低度の類似性が検出されるように調節することができる（異種プロービング）。一般的に、プローブは約１０００ヌクレオチド長未満、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００５４】
通常、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（又は他の塩）、ｐＨ７．０〜８．３であり、温度が短プローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長プローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件はホルムアミドのような脱安定化剤を加えても実行され得る。典型的な低ストリンジェンシー条件は、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝液による３７℃でのハイブリダイゼーションと、１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中、５０〜５５℃での洗浄を含む。典型的な中程度のストリンジェンシー条件は、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーションと、０．５×〜１×ＳＳＣ中、５５〜６０℃での洗浄を含む。典型的な高ストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーションと、０．１×ＳＳＣ中、６０〜６５℃での洗浄を含む。任意に、洗浄緩衝液は約０．１％〜約１％ＳＤＳを含み得る。ハイブリダイゼーションの時間は概して２４時間未満、通常、約４〜約１２時間である。
【００５５】
通常、特異度はハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な要素はイオン強度と最終洗浄液の温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔmは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の等式から概算できる：Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセントであり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセントであり、Ｌは塩基対におけるハイブリッド長である。Ｔmは５０％の相補標的配列が完全に一致したプローブとハイブリダイズする際の温度（明確なイオン強度及びｐＨ下における）である。Ｔmは１％ミスマッチごとに約１℃低下する。従って、Ｔm、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件は所望の同一性の配列とハイブリダイズするように調節できる。例えば、９０％以上の同一性を有する配列を求める場合、Ｔmを１０℃低下させることができる。一般的に、ストリンジェントな条件は、明確なイオン強度及びｐＨにて特定の配列とその相捕体に対する熱融解温度（Ｔm）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、非常にストリンジェントな条件では、熱融解温度（Ｔm）よりも１、２、３又は４℃低い温度でハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を行うことができる。中程度にストリンジェントな条件では、熱融解温度（Ｔm）よりも６、７、８、９又は１０℃低い温度でハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を行うことができる。低ストリンジェンシー条件では、熱融解温度（Ｔm）よりも１１、１２、１３、１４、１５又は２０℃低い温度でハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を行うことができる。等式、ハイブリダイゼーション及び洗浄成分構成並びに所望のＴmを用いて、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が本質的に説明されていることを当業者は理解するであろう。所望のミスマッチ度により４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴmとなる場合、より高い温度を用いることができるようにＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００５６】
２つ以上の核酸又はポリヌクレオチド間の配列関係を説明するために次の用語が用いられる：（ａ）「基準配列」、（ｂ）「比較ウインドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性パーセント」及び（ｅ）「実質的同一性」。
【００５７】
（ａ）本明細書で用いられるように、「基準配列」は配列比較の基準として用いられる明確な配列である。基準配列は、例えば、全長ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列のセグメント又は完全ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列として、特定の配列のサブセット又は全体となり得る。
【００５８】
（ｂ）本明細書で用いられるように、「比較ウインドウ」は、ポリヌクレオチド配列の隣接する特定のセグメントを指し、２配列の最適アライメントに対し、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列は基準配列（これは付加又は欠失を含まない）に比し、付加又は欠失（例えば、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウインドウは少なくとも２０隣接ヌクレオチド長であり、任意で３０、４０、５０、１００以上の長さとすることができる。ポリヌクレオチド配列にギャップを含むことに起因する基準配列への高類似性を避けるため、通常、ギャップペナルティが導入され、マッチ数から減じられることを当業者は理解するであろう。本発明では本明細書で特に述べない場合、本発明のヌクレオチド又はアミノ酸配列の別の配列に対する比較では、比較ウインドウは本発明の全長配列長である。
【００５９】
比較のための配列アライメントの方法は当分野で公知である。従って、任意の２配列の配列同一性パーセントを求めるには、数学的アルゴリズムを用いて実行することができる。このような数学的アルゴリズムの非限定例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１− １７の数学的アルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所アライメントアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３− ４５３の大域アライメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８の局所探索アライメント法；Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４のアルゴリズムであってＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７のように改変されているアルゴリズムである。
【００６０】
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータ処理は、配列同一性を判定するため配列の比較に用いることができる。このような処理系には、ＰＣ／遺伝子プログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ（カリフォルニア州マウンテンビュー、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社から市販）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージにおけるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）並びにＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、バージョン１０（米国カリフォルニア州サンディエゴＳｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，９６８５、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，から市販）が含まれるが、これらに限定されない。これらのプログラムを用いたアライメントはデフォルトパラメータを用いて実行することができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ ８：１５５−６５；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１に十分に説明されている。ＡＬＩＧＮプログラムは前述のＭｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較する場合、ＡＬＩＧＮプログラムではＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いることができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは前述のＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムに基づいている。本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同的なヌクレオチド配列を得るため、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２により、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実行することができる。本発明のタンパク質又はポリペプチドと相同的なアミノ酸配列を得るため、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実行することができる。比較目的のためにギャップアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されているように（ＢＬＡＳＴ ２．０における）Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。或いは、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実行するため、（ＢＬＡＳＴ ２．０における）ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いることができる。前述のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いる際、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列にはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質にはＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。アライメントは手動による検査によっても実施され得る。
【００６１】
特に述べない場合、本明細書で提供される配列同一性／類似性の値は、デフォルトパラメータを用い、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン７．１（米国メリーランド州フレデリック、Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，）を用いて他の配列に対する本発明の全長配列のアライメントに対して得られる値を指す。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン７．１ではＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを用いて多重配列アライメントを生成する。「等価なプログラム」とは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン７．１により生成される、対応するアライメントと比較した際、対象となる任意の２配列に対し、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基マッチと、同一の配列同一性パーセントを有するアライメントを生成する任意の配列比較プログラムを意味する。
【００６２】
（ｃ）本明細書で用いるように、２つの核酸又はポリペプチド配列の場合における「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較ウインドウ上で最大限に対応するようにアライメントされた際に同一である２配列における残基を指す。タンパク質に関して配列同一性パーセントが用いられる場合、同一でない残基位置が保存的アミノ酸置換により異なることが多く、この場合、アミノ酸残基は類似する化学特性（例えば、疎水性、電荷）を有する他のアミノ酸残基に代わって置換され、従って、分子の機能特性を変化させないということが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは置換の保存的性質を補正するため上方に調節され得る。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調節を行う手段は当業者には周知である。通常、この手段は保存的置換を全長ミスマッチではなく部分的ミスマッチとしてスコアリングし、これにより配列同一性パーセントを高くすることを含む。従って、例えば、同一アミノ酸がスコア１を付与され、非保存的置換がスコア０を付与される場合、保存的置換は０と１の間のスコアを付与される。保存的置換のスコアリングは、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（カリフォルニア州マウンテンビュー、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社）において実行されるように計算される。
【００６３】
（ｄ）本明細書で用いるように、「配列同一性パーセント」とは、比較ウインドウ上で最適にアライメントされた２配列を比較することにより求められる値のことであり、２配列の最適アライメントに対し、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は基準配列（これは付加又は欠失を含まない）に比し、付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。両方の配列における同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を求めてマッチした位置の数を算出し、マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で除算し、この計算結果を１００で乗算して配列同一性パーセントを算出することにより、パーセントが計算される。
【００６４】
（ｅ）（ｉ）ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、標準的なパラメータを用い、前述のアライメントプログラムの１つを用いて、ポリヌクレオチドが基準配列に比し、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。コドン縮重、アミノ酸類似性、読み枠の配置などを考慮することによってこれらの値を適切に調節し、２ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の対応する同一性を求めることができるということを当業者は認識するであろう。通常、これらを目的とするアミノ酸配列の実質的同一性とは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００６５】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするかということである。一般的に、ストリンジェントな条件は、明確なイオン強度及びｐＨにて特定の配列に対する熱融解温度（Ｔm）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書で別途認めるように所望のストリンジェンシーに依存し、Ｔmよりも約１℃〜約２０℃低い範囲の温度を包含する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、それでも実質的に同一である。これは、遺伝コードにより許容される最大のコドン縮重を用いて核酸のコピーが生成される場合に生じ得る。２つの核酸配列が実質的に同一であるという１つの指標は、第一の核酸にコードされるポリペプチドが第二の核酸にコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応する場合である。
【００６６】
（ｅ）（ｉｉ）ペプチドの場合の「実質的同一性」という用語は、ペプチドが特定の比較ウインドウ上で基準配列に対し、基準配列に対する少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％又は９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の相同アライメントアルゴリズムを用いて最適アライメントを行うことが好ましい。２つのペプチド配列が実質的に同一であるという指標は、１つのペプチドが第二のペプチドに対する抗体と免疫学的に反応することである。従って、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、１つのペプチドは他方のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似」するペプチドは前述の配列を共有するが、但し、同一でない残基位置が保存的アミノ酸置換により異なり得る。
【００６７】
本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドは対象植物における発現のための発現カセットに提供される。当該カセットは本発明のＡＨＡＳＬ配列に機能的に結合した５’及び３’調節配列を含む。プロモーターに対して「機能的に結合」とは、プロモーターともう１つの配列の機能的結合を意味し、プロモーター配列は第二の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始し、媒介する。一般的に、「機能的に結合」とは、結合される核酸配列が隣接し、必要な場合、２つのタンパク質コード領域を結合して隣接させ、同じ読み枠内にすることである。カセットは生命体に同時形質転換される、少なくとも１つの付加遺伝子を更に含有し得る。或いは、付加遺伝子は複数の発現カセットに提供することができる。
【００６８】
このような発現カセットは、ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドの挿入が調節領域の転写調節下におかれるように複数の制限部位を備える。発現カセットは選択可能なマーカー遺伝子を更に含有し得る。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号１、３、５、７、９及び１１に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む。このようなヌクレオチド配列は開始コドンを含まないと認識される。宿主細胞又は植物における発現を所望する場合、ＡＴＧのような開始コドンを本発明のヌクレオチド配列に機能的に結合することができる。或いは、葉緑体発現を所望する場合、このような開始コドンを含む葉緑体標的配列を本発明のヌクレオチド配列に機能的に結合することができる。
【００７０】
発現カセットは転写の５’−３’方向に、植物において機能的な転写及び翻訳開始領域（即ち、プロモーター）、本発明のＡＨＡＳＬヌクレオチド配列及び転写及び翻訳終止領域（即ち、終止領域）を含む。プロモーターは植物宿主及び／又は本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に対し、天然若しくは類似性又は外来性若しくは異種となり得る。加えて、プロモーターは天然配列或いは合成配列となり得る。プロモーターが植物宿主に対して「外来性」又は「異種」である場合、プロモーターが導入される天然植物にプロモーターが見出されないということを意味する。プロモーターが本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に対して「外来性」又は「異種」である場合、プロモーターが、機能的に結合した本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に対し、天然又は自然発生プロモーターではないということを意味する。本明細書で用いるように、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に機能的に結合したコード配列を含む。
【００７１】
異種プロモーターを用いて配列を発現させることが好ましいこともあるが、天然プロモーター配列を用い得る。このような構築体は本発明の又は植物若しくは植物細胞におけるＡＨＡＳＬタンパク質の発現レベルを変化させ、或いは植物又は植物細胞に除草剤耐性表現型を付与すると思われる。従って、植物又は植物細胞の表現型が改変される。
【００７２】
終止領域は転写開始領域に対して天然であり得て、機能的に結合した対象ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド配列に対して天然であり得て、植物宿主に対して天然であり得て、或いは別のソース（即ち、プロモーター、対象ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド、植物宿主又はその任意の組合せ）由来であり得る。便宜な終止領域はＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドから得ることができ、例えば、オクトピン合成酵素及びノパリン合成酵素終止領域である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；及びＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照されたい。
【００７３】
適切な場合、遺伝子は形質転換植物での発現増大のために最適化し得る。即ち、発現向上のため、植物に好ましいコドンを用いて遺伝子を合成することができる。例えば、宿主に好ましいコドンの使用法の考察について、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。植物に好ましい遺伝子を合成する方法は当分野で得られる。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号及び第５，４３６，３９１号並びにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたい。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
細胞宿主における遺伝子発現を亢進する更なる配列改変が既知である。これには、スプリアスポリアデニリル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列や発現に有害となり得る他の十分に特徴づけられた配列の除去が含まれる。配列のＧ−Ｃ含量は、宿主細胞に発現される既知の遺伝子を参照して計算し、所与の宿主細胞の平均レベルに調節され得る。可能な場合、予測されるｍＲＮＡヘアピン二次構造を避けるため、配列を改変する。
【００７５】
発現カセットは発現カセット構築体に５’リーダー配列を更に含有し得る。このようなリーダー配列は翻訳を亢進するように作用することができる。翻訳リーダーは当分野で公知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎ウイルスの５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６１２６−６１３０）；ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １６５（２）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４：９−２０）及びヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスの外殻タンパク質ｍＲＮＡ（ＡＭＶ ＲＮＡ ４）由来の非翻訳リーダー（Ｊｏｂｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ，ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２３７−２５６）；並びにトウモロコシクロロティックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２−３８５）を含む。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８も参照されたい。翻訳を亢進することが既知である他の方法、例えば、イントロンなども用いることができる。
【００７６】
発現カセットを調製するにあたり、ＤＮＡ配列を適正な配位に、また、必要に応じて適正な読み枠に提供するため、様々なＤＮＡ断片を操作し得る。これを目的として、アダプター又はリンカーを用いてＤＮＡ断片を結合し、或いは便宜な制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供するため、他の操作が伴い得る。これを目的として、インビトロでの変異誘発、プライマーの修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転位及び転換が伴い得る。
【００７７】
本発明の実施にあたり多くのプロモーターを用いることができる。プロモーターは所望の成果に基づいて選択することができる。植物での発現のため、核酸を構成型、組織優先型又は他のプロモーターと結合することができる。
【００７８】
このような構成型プロモーターには、例えば、コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）；イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９− ６３２及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などが含まれる。他の構成型プロモーターには、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号；第５，６０４，１２１号；第５，５６９，５９７号；第５，４６６，７８５号；第５，３９９，６８０号；第５，２６８，４６３号；及び第５，６０８，１４２号が含まれる。
【００７９】
外因性化学調節剤の適用を通じ、化学調節プロモーターを用いて植物における発現を調節することができる。目的に応じ、プロモーターは化学物質の適用が遺伝子発現を誘発する場合には化学物質誘導性プロモーター、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する場合には化学物質抑制プロモーターとし得る。化学物質誘導性プロモーターは当分野で公知であり、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤により活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、出芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物により活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター及びサリチル酸により活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーターを含むが、これらに限定されない。他の対象化学調節プロモーターには、ステロイド反応性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１−１０４２５及びＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４（２）：２４７−２５７におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照されたい）並びにテトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９− ２３７並びに米国特許第５，８１４，６１８号及び第５，７８９，１５６号を参照されたい）が含まれ、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
組織優先プロモーターを用いて特定の植物組織内のＡＨＡＳＬ発現の亢進を目標とすることができる。組織優先プロモーターは、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１− １９６；Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２０）：９５８６−９５９０；及びＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（３）：４９５−５０５を含む。
【００８１】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド分子は発現に対して葉緑体を標的とする。このようにして、対象ポリヌクレオチド分子が葉緑体に直接挿入されない場合、発現カセットは対象遺伝子産物を葉緑体に誘導するように、輸送ペプチドをコードする、機能的に結合した核酸配列を更に含有する。このような輸送ペプチドは当分野で公知である。葉緑体標的配列に関し、「機能的に結合」とは、輸送ペプチドをコードする核酸配列（即ち、葉緑体標的配列）が本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドに結合し、そのため２配列が隣接し、同じ読み枠にあるということである。例えば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１を参照されたい。
【００８２】
葉緑体標的配列は当分野で公知であり、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ルビスコ）の葉緑体小サブユニット（ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｓｉｌｖａ Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：７６９−７８０；Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５）：３３３５−３３４２）；５−（エノールピルビル）シキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）（Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２（６）：７８９−８１０）；トリプトファンシンターゼ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：６０８１−６０８７）；プラストシアニン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３）：２０３５７−２０３６３）；コリスミ酸シンターゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２７４４７−２７４５７）；及び集光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＬＨＢＰ）（Ｌａｍｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４９９６−１４９９９）を含む。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４− １２６；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１も参照されたい。或いは、コムギＡＨＡＳＬ遺伝子に対する葉緑体標的配列を単離し、本発明のＡＨＡＳＬヌクレオチド分子に機能的に結合することができる。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチド分子は植物の葉緑体ゲノムを形質転換するのに用いることができる。葉緑体の形質転換法は当分野で公知である。例えば、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１−６０６を参照されたい。本方法は選択可能なマーカーを含有するＤＮＡのパーティクルガン送達と、相同組換えを通じた色素体ゲノムへのＤＮＡの標的化に依存する。加えて、色素体の形質転換は、核コード化及び色素体標的化ＲＮＡポリメラーゼの組織優先発現による、色素体媒介性沈黙導入遺伝子の転写活性化によって可能となる。このようなシステムはＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５に報告されている。
【００８４】
葉緑体を標的とする対象ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドは、植物核とこの細胞小器官のコドン使用法の差異を考慮に入れるように、葉緑体における発現を最適化され得る。このようにして、対象ポリヌクレオチドは葉緑体優先コドンを用いて合成され得る。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号を参照されたい。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
形質転換プロトコル及びヌクレオチド配列の植物への導入プロトコルは、形質転換の標的となる植物又は植物細胞の種類、即ち、単子葉植物又は双子葉植物に応じて異なり得る。ヌクレオチド配列を植物細胞に、続いて植物ゲノムに導入する好適な方法は、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５６３，０５５号；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，９８１，８４０号）、遺伝子直接導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７−２７２２）及びバリスティック粒子加速（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９４５，０５０号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８７９，９１８号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８８６，２４４号；Ｂｉｄｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）「Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ，」 ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６）；及びＬｅｃ１形質転換（ＷＯ ００／２８０５８）を参照されたい）を含む。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ ａｎｄ ＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；Ｔｏｍｅｓ、米国特許第５，２４０，８５５号；Ｂｕｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，３２２，７８３号及び第５，３２４，６４６号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）「Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ，」 ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４；Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，７３６，３６９号（穀物）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５−４１８及びＫａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ηａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：２５０−２５５及びＣｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ７５：４０７−４１３（イネ）；Ｏｓｊｏｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介トウモロコシ）も参照されたい。当該文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
形質転換された細胞は従来の方法に従って植物に生育され得る。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１−８４を参照されたい。次に、これらの植物は生育され、同じ形質転換株又は異なる株と受粉され、その結果生じるハイブリッドは同定された所望の表現型特性の構成的発現を有する。所望の表現型特性の発現が安定的に維持され、遺伝されるように２世代以上を生育し、次に、所望の表現型特性の発現が達成されたことを確認するため、種子を採取し得る。このようにして、本発明は、本発明のヌクレオチド構築体、例えば、そのゲノムに安定的に組み込まれた本発明の発現カセットを有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも称される）を提供する。
【００８７】
これらのヌクレオチド配列に関し、ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド分子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部分に相補的なアンチセンス構築体を構築できることが認識される。アンチセンスヌクレオチドは対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするように構築される。アンチセンス配列の改変は、配列が対応するｍＲＮＡとハイブリダイズし、その発現に干渉する限り、行い得る。このようにして、対応するアンチセンス化された配列に対し、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％の配列同一性を有するアンチセンス構築体を用い得る。更に、アンチセンスヌクレオチドの一部を用いて標的遺伝子の発現を阻害し得る。一般的に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチドの配列を用い得る。
【００８８】
本発明のヌクレオチド配列は植物における内在遺伝子の発現を抑制するため、センス配位においても用い得る。センス配位におけるヌクレオチド配列を用いて植物における遺伝子発現を抑制する方法は、当分野で公知である。一般的に、本方法は、内在遺伝子の転写物に対応するヌクレオチド配列の少なくとも一部分に機能的に結合した、植物における発現を促進するプロモーターを含むＤＮＡ構築体により植物を形質転換することを含む。通常、このようなヌクレオチド配列は内在遺伝子の転写物の配列に対する実質的な配列同一性を有し、好ましくは約６５％以上の配列同一性、より好ましくは約８５％以上の配列同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有する。米国特許第５，２８３，１８４号及び第５，０３４，３２３号を参照されたい。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドは、ピリミジルオキシ安息香酸系、ピリミジルチオ安息香酸系及びイミダゾリノン系除草剤に対する植物、植物細胞又は他の宿主細胞の耐性を亢進する方法に用いることができる。本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドは、植物、植物細胞及び宿主細胞をイミダゾリノン系除草剤に曝露させることを含む、形質転換された植物、植物細胞や他の宿主細胞を選択する方法に用いることもできる。本発明では、イミダゾリノン系除草剤には、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼタピル）、ＣＡＤＲＥ（登録商標）（イマザピック）、ＲＡＰＴＯＲ（登録商標）（イマザモックス）、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザキン）、ＡＳＳＥＲＴ（登録商標）（イマゼサベンツ）、ＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）（イマザピル）、前述の任意の除草剤の誘導体又は前述の除草剤の２つ以上の混合物、例えば、イマザピル／イマザモックス（ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、イミダゾリノン系除草剤は、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル）−４−］［メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン］酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−）４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−）イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸並びにメチル［６−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−］オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物から選択することができるが、これらに限定されない。５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸と［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−］イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸が好ましい。［２−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸が特に好ましい。本発明ではピリミジルチオ安息香酸系除草剤はＳＴＡＰＬＥ（登録商標）（ピリチオバックナトリウム塩）を含むが、これに限定されない。
【００９０】
本発明の方法は、形質転換植物、形質転換植物細胞及び形質転換宿主細胞を除草剤、詳細にはピリミジルオキシ安息香酸系、ピリミジルチオ安息香酸系又はイミダゾリノン系除草剤、より詳細にはイミダゾリノン系除草剤に曝露させることを含む。除草剤の好ましい量又は濃度は「有効量」又は「有効濃度」である。「有効量」及び「有効濃度」とは、類似する非形質転換植物、植物細胞又は宿主細胞を死滅させ、或いはその生育を阻害するのに十分な量と濃度であるが、前記量では形質転換植物、形質転換植物細胞及び形質転換宿主細胞をそれほどには死滅させず、或いはその生育を阻害しない量と濃度をそれぞれ意味する。「類似する非形質転換植物、植物細胞又は宿主細胞」とは、本発明の形質転換植物、形質転換植物細胞又は形質転換宿主細胞を作製するのに用いられた本発明の特定のポリヌクレオチドを欠く、植物、植物、植物組織、植物細胞又は宿主細胞をそれぞれ意味する。従って、「非形質転換」という用語の使用は、植物、植物細胞又は他の宿主細胞がそのゲノムに組換えＤＮＡを欠損しているということを意味するものではない。
【００９１】
本発明は、単子葉植物及び双子葉植物を含むがこれに限定されない任意の植物種の形質転換に用い得る。対象植物種の例には、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アブラナ種（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ，Ｂ．ｒａｐａ，Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に種子油源として有用なアブラナ種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ，Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ミレット（例えば、パールミレット（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ，Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、カンキツ樹（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、オートムギ、オオムギ、野菜類、鑑賞植物及び球果植物が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
野菜類は、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、グリーンビーンズ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、リママメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｓｐｐ．）並びにキュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）及びマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）のようなＣｕｃｕｍｉｓ属を含む。鑑賞植物は、アザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ．）、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）及びキクを含む。
【００９３】
本発明を実施するにあたり用いられ得る球果植物は、例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールパイン（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ）及びモンテレーマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）のようなマツ；ダグラスファー（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）；アメリカスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；ヨーロッパモミ（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ）及びバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ）のような真性モミ；並びにウェスタンレッドシダー（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）及びアラスカイエローシダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）のようなスギを含む。本発明の植物は、好ましくは栽培植物（例えば、コムギ、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、モロコシ、ミレット、タバコなど）であり、より好ましくは穀物植物（例えば、コムギ、イネ、トウモロコシ、オオムギ、モロコシ、ライムギ、ミレットなど）であり、最も好ましくはコムギ植物である。
【００９４】
本発明は、本発明の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドの１つ以上をそのゲノムに含む、非トランスジェニック植物、特に非トランスジェニックコムギ植物も包含する。このようなコムギ植物は除草剤抵抗性であり、当分野で公知の任意の変異誘発法を介して野性型コムギ植物から作出することができる。例えば、米国特許第６，３３９，１８４号を参照されたい。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。本発明はこのような除草剤抵抗性植物の植物細胞、植物部分、植物組織、種子及び後代を更に包含する。
【００９５】
本発明の宿主細胞は原核細胞及び真核細胞、特に細菌細胞、真菌細胞及び動物細胞を含む。このような真菌細胞は、これに限定されないが酵母菌細胞を含み、このような動物細胞は、これに限定されないが昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む。
【００９６】
本発明のＡＨＡＳＬポリヌクレオチドは、本発明の植物形質転換のための選択可能なマーカー遺伝子としての使用に用途を見出すが、本発明の発現カセットは形質転換細胞の選択のための別の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。本発明の選択可能なマーカー遺伝子を含む選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換された細胞又は組織の選択に用いられる。マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子並びに除草剤化合物、例えば、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン及び２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）への抵抗性を付与する遺伝子を含む。Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４−６３１８；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３−７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９−２４２２；Ｂａｒｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８０）ｉｎ Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ，ｐｐ．１７７−２２０；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５−５６６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３−６１２；Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３−７２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００−５４０４；Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９−２５５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０−４８３；Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９１７−１９２１；Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２−３９５６；Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：５０７２−５０７６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７−４６５３；Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１−１５９５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４−１１０４；Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３−９１９；Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１−７２４を全体的に参照されたい。このような開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
選択可能なマーカー遺伝子の前述のリストは限定的な意味をもつものではない。本発明の選択可能なマーカー遺伝子を含む、任意の選択可能なマーカー遺伝子を本発明において用いることができる。
【００９８】
本発明の形質転換ベクターは対象遺伝子により形質転換される植物を作出するのに用いることができる。形質転換ベクターは本発明の選択可能なマーカー遺伝子と、導入されて通常形質転換植物に発現される対象遺伝子を含む。
【００９９】
対象遺伝子は所望の成果により異なる。例えば、表現型の種々の変化が対象となり得て、これには植物における脂肪酸組成の改変、植物のアミノ酸含量の変更、植物の昆虫及び／又は病原体防御機構の変更などが含まれる。これらの結果は、植物における異種産物の発現又は内在産物の発現の増大を付与することにより、達成することができる。或いは、植物における１つ以上の内在産物、特に酵素又は補因子の発現を低減することにより、結果を達成することができる。これらの変化により形質転換植物の表現型の変化が生じる。
【０１００】
対象遺伝子は市場及び作物開発に関わる者の関心を反映する。対象となる作物及び市場は変化し、発展途上国が世界市場を開拓していくに従って、新規の作物及び技術も出現するであろう。加えて、収穫量及び雑種強勢のような農業形質及び特性の理解が深まるにつれ、それに応じて形質転換のための遺伝子の選択も変化するであろう。対象遺伝子の一般的範疇には、例えば、ジンクフィンガーのような情報に関与する遺伝子、キナーゼのような伝達に関与する遺伝子及び熱ショックタンパク質のようなハウスキーピングに関与する遺伝子が含まれる。より具体的な導入遺伝子の範疇には、例えば、農学、昆虫抵抗性、病害抵抗性、除草剤抵抗性、繁殖不能性、穀物特性及び商品に対する重要な形質をコードする遺伝子が含まれる。一般的に、対象遺伝子は種々の種子成分、例えば、油性物、デンプン、タンパク質及び可溶性糖類に関与する遺伝子並びに昆虫及び病害抵抗性と、例えば、寒冷、熱及び干ばつのような環境ストレスへの耐性のような農業成績に好影響を及ぼす遺伝子を含む。
【０１０１】
油性物、デンプン及びタンパク質含量のような農学的に重要な形質は、従来の育種法に加えて遺伝学的に改変することができる。改変には、オレイン酸含量、飽和及び不飽和油性物の増加、リシン及び硫黄レベルの上昇、必須アミノ酸の付与、更にデンプンの改変が含まれる。
【０１０２】
昆虫抵抗性遺伝子は、多大な収穫妨害をもたらすルートワーム、カットワーム、アワノメイガなどの害虫への抵抗性をコードし得る。このような遺伝子には、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒性タンパク質遺伝子（米国特許第５，３６６，８９２号；第５，７４７，４５０号；第５，７３６，５１４号；第５，７２３，７５６号；第５，５９３，８８１号；及びＧｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４８：１０９）；レクチン（Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８２５）などが含まれる。
【０１０３】
病害抵抗性形質をコードする遺伝子には、ｆｕｍｏｎｏｓｉｎに対するような解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号）；弱毒性（ａｖｒ）及び病害抵抗性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２；及びＭｉｎｄｒｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：１０８９）などが含まれる。
【０１０４】
外因性産物には、植物の酵素及び産物並びに原核生物や他の真核生物を含む他のソース由来の産物が含まれる。このような産物には酵素、補因子、ホルモンなどが含まれる。タンパク質、特に植物の栄養価を改善するためにアミノ酸分布を向上させた改変タンパク質のレベルを上昇させることができる。これは、増大したアミノ酸含量を有するようなタンパク質の発現によって達成される。
【０１０５】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド分子」、「ヌクレオチド分子」、「ヌクレオチド構築体」などの用語の本明細書における使用は、ＤＮＡを含むヌクレオチド構築体に本発明を限定するものではない。リボヌクレオチド及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合せから構成されるヌクレオチド構築体、特にポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドも本明細書で開示する方法に用いられ得ることを当業者は認識するであろう。従って、本発明のヌクレオチド構築体は、植物を形質転換する本発明の方法において用いることができるあらゆるヌクレオチド構築体を包含し、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びその組合せから構成されるヌクレオチド構築体を含むが、これらに限定されない。このようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは自然発生分子及び合成類似体の両方を含む。本発明のヌクレオチド構築体はあらゆる形態のヌクレオチド構築体も包含し、一本鎖型、二本鎖型、ヘアピン型、ステムル一プ構造などを含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
更に、本発明の方法では、少なくとも１つのタンパク質又は少なくとも１つのＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの少なくとも一部分に相補的なアンチセンスＲＮＡの発現を形質転換植物において誘導することが可能なヌクレオチド構築体を用い得ることが認識される。通常、このようなヌクレオチド構築体は、５’及び３’転写調節領域に機能的に結合した、タンパク質又はＲＮＡのコード配列から構成される。或いは、本発明の方法では、タンパク質又はＲＮＡの発現を形質転換植物において誘導することが可能でないヌクレオチド構築体を用い得ることも認識される。
【０１０７】
本発明の方法はヌクレオチド構築体を植物に導入することを含む。「導入」とは、ヌクレオチド構築体が植物の細胞の内部にアクセスできるように、構築体を植物に提示することを意味する。本発明の方法はヌクレオチド構築体を植物に導入する特定の方法に依存せず、単にヌクレオチド構築体が植物の少なくとも１つの細胞の内部にアクセスできるということである。ヌクレオチド構築体を植物に導入する方法は当分野で公知であり、安定性形質転換法、一過性形質転換法及びウイルス媒介法を含むが、これらに限定されない。
【０１０８】
「安定性形質転換」とは、植物に導入されるヌクレオチド構築体が植物のゲノムに組み込まれ、その後代に遺伝されることが可能であることを意味する。「一過性形質転換」とは、植物に導入されるヌクレオチド構築体が植物のゲノムに組み込まれないことを意味する。
【０１０９】
本発明のヌクレオチド構築体は、植物をウイルス又はウイルスポリヌクレオチドと接触させることにより、植物に導入され得る。一般的に、このような方法は、本発明のヌクレオチド構築体をウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に組み込むことを含む。本発明のイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬタンパク質は、当初、ウイルスポリタンパク質の一部として合成され、その後、これはインビボ又はインビトロでのタンパク質分解により処理され、所望の組換えタンパク質を産生し得ることが認識される。更に、本発明のプロモーターはウイルスＲＮＡポリメラーゼによる転写に用いられるプロモーターも包含することが認識される。ヌクレオチド構築体を植物に導入し、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子が関与する、コードされたタンパク質をその植物において発現させる方法は、当分野で公知である。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号、第５，８８９，１９０号、第５，８６６，７８５号、第５，５８９，３６７号及び第５，３１６，９３１号を参照されたい。当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
本明細書で更に提供されるのは、本発明の少なくとも１つのＡＨＡＳＬポリヌクレオチドにより形質転換される植物の近傍における雑草を抑制する方法である。本方法は有効量の除草剤、特に有効量のイミダゾリノン系除草剤を雑草と形質転換植物又は雑草と形質転換植物が生じる土壌に適用するステップを含み、ここで植物は非形質転換植物に比し、除草剤への抵抗性が増大している。「有効量の除草剤」とは、形質転換植物の近傍における所望の雑草を死滅させ、或いはその生育を遅延させるのに十分な量であって、また、形質転換植物と同じであるが本発明の少なくとも１つの除草剤耐性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドをそのゲノムに欠く非形質転換植物を死滅させるのに十分な量を意味する。加えて、有効量の除草剤では形質転換植物に適用された際、本発明の形質転換植物を死滅させず、好ましくは形質転換植物の生育を有意に遅延させず、或いはこれを有意に損傷しない。通常、除草剤の有効量は、農業生産システムにおいて雑草を死滅させるのに日常的に用いられる量である。このような量は当業者には既知である。
【０１１１】
雑草を抑制するこのような方法では、形質転換植物は好ましくは栽培植物であり、コムギ、イネ、トウモロコシ、モロコシ、オオムギ、ライムギ、ミレット、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、モロコシ、ミレット、タバコ、トマト及びジャガイモを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
除草剤、特にイミダゾリノン系除草剤への抵抗性が亢進した植物を提供することにより、植物の生育を亢進し、栄養素を求める競争を低減するため、植物を雑草から防御するための広範な配合物を用いることができる。除草剤は、本明細書で述べる植物を取り囲む領域における雑草の出芽前、出芽後、植付け前及び植付け時の抑制に単独で用いることができ、或いは他の添加剤を含有するイミダゾリノン系除草剤配合物を用いることができる。除草剤は種子処理剤としても用いることができる。除草剤配合物に見出される添加剤には、他の除草剤、洗浄剤、補助剤、展着剤、固着剤、安定化剤などが含まれる。除草剤配合物は湿潤又は乾燥調製物とすることができ、流動性粉末、乳化可能な濃縮物及び液状濃縮物を含むことができるが、これらに限定されない。除草剤及び除草剤配合物は従来の方法、例えば、噴霧、灌注、散布などに従って適用することができる。
【実施例１】
【０１１３】
ＡＨＡＳＬ大サブユニットは３遺伝子にコードされる
コムギ突然変異誘発プログラムの過程において、除草剤噴霧アッセイにより、何千もの独立して誘導された系統を分析した。耐性の分子基盤を理解するため、コムギにおける活性遺伝子を同定しようと試みた。過去にクローニングしたＡＨＡＳＬヌクレオチド分子に基づいて縮重ＰＣＲプライマーを設計することにより、野性型及びイミダゾリノン抵抗性コムギ植物由来のＡＨＡＳＬ遺伝子のクローニングを行った。クローニングしたＰＣＲ産物は密接に関連した３群に分類され、６倍体のコムギに３個のＡＨＡＳＬ遺伝子があることが示唆される。このことは各２倍体ゲノムが単一ＡＨＡＳＬ遺伝子を有することと一致する。その後のＥＳＴデータの解析により、わずか３つのＡＨＡＳＬの活性コピーがあることが示された。加えて、独立的に分離した抵抗性遺伝子がわずかに３個見出されている（Ｐｏｚｎｉａｋ ａｎｄ Ｈｕｃｌ、印刷中）。コムギＡＨＡＳＬ遺伝子のほぼ全長の配列をＰＡＣＥ−ＰＣＲにより決定した。配列表に示すヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号１〜１２）はコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）品種「Ｇｕｎｎｅｒ」由来である。完全な転写配列の解明はコード配列の５’部分の超高ＧＣ含量により阻止された。各３遺伝子はその１７８８ｂｐ長に沿って約９８％同一であり、コード化タンパク質は互いにわずかに１つのアミノ酸だけ異なる（図１）。密接に関連した４倍体種のＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ Ｌ．（デュラムコムギ）は６倍体のコムギにおけるその同族に比し、同一（遺伝子３）又はアミノ酸が１つだけ異なる（遺伝子２）タンパク質をコードする２個の遺伝子を含有する。
【実施例２】
【０１１４】
コムギＡＨＡＳＬ遺伝子は第６染色体の長腕に位置する
３遺伝子の染色体位置を決定するため、異数体系統の「チャイニーズスプリング」の採取物を遺伝子特異的な増幅切断多型（ＣＡＰＳ）マーカーと共に用いた（Ｐｏｚｎｉａｋ ｅｔ ａｌ、提出済）。遺伝子１はＮ６ＤＴ６Ａ及びＤｔ６ＤＳから欠失していることが見出され、一方、遺伝子２はＮ６ＢＴ６Ｄ及びＤｔ６ＢＳ線上に存在せず、遺伝子３はＮ６ＡＴ６Ｂ及びＤｔ６ＡＳ線上に存在しなかった（図２〜３）。これにより、遺伝子１は６Ｄ染色体、遺伝子２は６Ｂ染色体、遺伝子３は６Ａ染色体の長腕に位置することが示される。ここで同祖遺伝子１〜３をそれぞれＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＬＳ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａと改称し、最後の文字はゲノムを示す。
【実施例３】
【０１１５】
耐性レベルは突然変異化ＡＨＡＳＬ遺伝子に影響される
コムギにおいて認められる最も一般的な変異では、シロイヌナズナにおけるＳｅｒ６５３に等価な位置におけるＳｅｒからＡｓｎへの置換が生じる（Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎと命名）。典型的には、温室で生育された植物での差異を検出するのに十分な程度のイマザモックスを噴霧した後、各変異誘発系統由来の２４個体を０〜９の評価スケール（０＝損傷なし；９＝最大損傷）でスコアリングした（図４）。各系統に対し、特定の変異遺伝子を決定した。除草剤噴霧アッセイの評価とこの位置で変異した特定の同祖の間に明らかな相関が見出された。ＡＨＡＳＬ１Ｄにおける変異は、１Ｂ（５．４）及び１Ａ（６．４）に比し、高い耐性を生じた（損傷中央値＝４．０）。
【実施例４】
【０１１６】
６倍体のコムギにおける各ＡＨＡＳＬ遺伝子は様々な量の活性を酵素プールに付与する
除草剤に対する酵素感受性レベルへの各変異の影響を理解するため、複数のバックグラウンド由来の個体を用いて、３遺伝子全てにおけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異体に対してＡＨＡＳアッセイを行った（各データは図６Ａ中）。その結果は、１００μＭイマザピルの存在下、ＡＨＡＳＬ１Ｄが最大レベルの非感受性（３８％）を付与し、一方、ＡＨＡＳＬ１Ａ及び１Ｂが低レベルの活性（それぞれ３３％、２５％）を示したという点において、噴霧アッセイデータと同様である。ＣＤＣ Ｔｅａｌバックグラウンドにおける変異体由来の抽出物の比較では類似した関係が示され、１００μＭイマゼタピルの存在下、ＡＨＡＳ１Ｄは４０％の活性を有し、ＡＨＡＳ１Ｂは３０％の活性を有した。また、１Ａと１Ｄの二重変異体は６３％のＡＨＡＳ活性を保持した（Ｐｏｚｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．、提出済）。総合的に考えて、当該データはＡＨＡＳＬ１Ｄが最大量の活性を酵素プールに付与し、また、抵抗性レベルが概して相加的であることを示す。デュラムコムギ（Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ）において、各同祖はＡＨＡＳプールに同等量を付与するように思われる（図６Ｂ）。
【実施例５】
【０１１７】
除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬタンパク質
本発明は野性型コムギＡＨＡＳＬ成熟ポリペプチド及び除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬ成熟ポリペプチドのヌクレオチド及びアミノ酸配列を開示する。除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリペプチドを含む植物は前に同定されており、除草剤抵抗性を付与するアミノ酸置換の部位であるＡＨＡＳＬポリペプチドの多くの保存領域が記載されている。例えば、Ｄｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｅｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ」．Ｉｎ：Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．１５９−１８５，ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；及びＤｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｓｈｕｋｌａ，（２０００）Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ １９：８８１−８８９を参照されたい。
【０１１８】
本発明のＡＨＡＳＬ配列（配列番号１、３、５、７、９及び１１）及び当業者に既知であって本明細書に開示される方法を用いて、これらの保存領域における同定された部位での１、２、３又はそれ以上のアミノ酸置換を有する除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリペプチドをコードする更なるポリヌクレオチドを生成することができる。表６はＡＨＡＳＬタンパク質の保存領域、これらの保存領域内の除草剤抵抗性を付与することが既知であるアミノ酸置換及び配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示されるコムギＡＨＡＳＬタンパク質における対応するアミノ酸を示す。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
1Ｄｅｖｉｎｅ及びＥｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ」、「Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、１５９〜１８５頁、ＩＯＳ出版、アムステルダム並びにＤｅｖｉｎｅ及びＳｈｕｋｌａ（２０００）Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ １９：８８１−８８９から出典の保存領域。
【０１２１】
2アミノ酸の番号づけはシロイヌナズナＡＨＡＳＬポリペプチドのアミノ酸配列に対応する。
【０１２２】
3本発明のコムギＡＨＡＳＬタンパク質の各アミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０及び１２）は同じ保存領域を含む。
【０１２３】
4Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２９）：１７３８１−１７３８５。
【０１２４】
5Ｗｒｉｇｈｔ及びＰｅｎｎｅｒ（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：６１２−６２０。
【０１２５】
6Ｂｏｕｔｓａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．５５：５０７−５１６。
【０１２６】
7Ｇｕｔｔｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４３：１４３−１７８。
【０１２７】
8Ｇｕｔｔｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４０：６７０−６７８。
【０１２８】
9Ｋｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０９：１１４７−１１５９。
【０１２９】
10Ｈａｒｔｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）「Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｎｔｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｕｔａｔｅｄ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅｓ」、「Ｍａｎａｇｉｎｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、米国化学会シンポジウム、シリーズ第４２１号、米国ワシントン特別区。
【０１３０】
11Ｓｉｍｐｓｏｎ（１９９８）Ｄｏｗｎ ｔｏ Ｅａｒｔｈ ５３（ｌ）：２６−３５。
【０１３１】
12Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．５１：８４５−８５３。
【０１３２】
13Ｂｒｕｎｉａｒｄ（２００１）Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｓｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎ，ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）、１〜７８頁、博士号論文、米国ノースダコタ州ファーゴ、ノースダコタ州立大学。
【０１３３】
14Ｄｅｖｉｎｅ及びＥｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ」、「Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、１５９〜１８５頁、ＩＯＳ出版、アムステルダム。
【０１３４】
15Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５２：３４１−３４５。
【０１３５】
16Ｃｈａｎｇ及びＤｕｇｇｌｅｂｙ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３３：７６５−７７７。
【０１３６】
17本発明は除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａ成熟タンパク質のアミノ酸配列を示す配列番号８、１０及び１２を開示する。これらのアミノ酸配列の各々はアミノ酸位置５７９におけるＡｓｎを含む。本発明は成熟除草剤抵抗性除草剤抵抗性コムギ成熟タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を示す配列番号７、９及び１１を更に開示する。
【０１３７】
本明細書に挙げた刊行物及び特許出願は全て、本発明に関連する当業者のレベルを示すものである。刊行物及び特許出願は全て、各々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別的に望ましいといえるほどに、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
前述の発明を明瞭な理解を目的として例示及び実施例によりある程度詳細に説明したが、添付した特許請求の範囲内においていくつかの変更及び改変を実施し得るということは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】コムギＡＨＡＳＬ遺伝子コード配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列の対比較から得た配列同一性パーセントの表である。６倍体はＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来の配列を指す。４倍体はＴ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ由来の配列を示す。遺伝子１はＡＨＡＳＬ１Ｄに対応する。遺伝子２はＡＨＡＳＬ１Ｂに対応する。遺伝子３はＡＨＡＳＬ１Ａに対応する。
【図２】実施例２で述べるチャイニーズスプリングにおける３つのコムギＡＨＡＳＬ遺伝子の染色体位置の解析結果を示す写真図である。
【図３】実施例２で述べるチャイニーズスプリングにおける３つのコムギＡＨＡＳＬ遺伝子の染色体位置の解析結果を示す写真図である。
【図４】実施例３で述べる変異部位と植物全体の損傷の相関のグラフである。１Ｄ、１Ｂ及び１Ａは、コムギＡＨＡＳＬ遺伝子のそれぞれＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａを示す。
【図５】Ａは、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｄ、ＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異から生じる除草剤非感受性酵素活性のグラフであり、Ｂは、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍのＡＨＡＳＬ１Ｂ及びＡＨＡＳＬ１Ａタンパク質におけるＳ６５３（Ａｔ）Ｎ変異から生じる除草剤非感受性酵素活性のグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、３、５、７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む、成熟型除草剤耐性アセトヒドロキシ酸合成酵素の大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｆ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）配列番号８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｖ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
からなる群より選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド分子に機能的に結合し、宿主細胞において発現可能なプロモーターを含む発現カセット。
【請求項４】
前記プロモーターが、植物細胞、細菌細胞、動物細胞及び真菌細胞からなる群より選択される少なくとも１つの宿主細胞において発現可能である、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記プロモーターが構成型プロモーターである、請求項３又は４に記載の発現カセット。
【請求項６】
機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項３から５のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項７】
対象遺伝子と、請求項２に記載のポリヌクレオチド分子に機能的に結合したプロモーターを含む選択可能なマーカー遺伝子とを含む形質転換ベクター。
【請求項８】
前記プロモーターが、植物細胞、細菌細胞、動物細胞及び真菌細胞からなる群より選択される少なくとも１つの宿主細胞において発現可能である、請求項７に記載の形質転換ベクター。
【請求項９】
前記プロモーターが構成型プロモーターである、請求項７又は８に記載の形質転換ベクター。
【請求項１０】
前記選択可能なマーカー遺伝子が、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の形質転換ベクター。
【請求項１１】
植物細胞における発現を促進するプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチド分子を含み、ゲノムに安定的に組み込まれた少なくとも１つの発現カセットを含む形質転換植物であって、前記ポリヌクレオチド分子が、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む、成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｆ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、形質転換植物。
【請求項１２】
前記発現カセットが、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項１１に記載の形質転換植物。
【請求項１３】
前記植物がそのゲノムに少なくとも１つの非トランスジェニックイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬ遺伝子を含む、請求項１１又は１２に記載の形質転換植物。
【請求項１４】
前記植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１５】
前記単子葉植物が、コムギ、ライコムギ、トウモロコシ、イネ、モロコシ、ライムギ、ミレット及びオオムギからなる群より選択される、請求項１４に記載の形質転換植物。
【請求項１６】
前記双子葉植物が、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、タバコ、トマト及びジャガイモからなる群より選択される、請求項１４に記載の形質転換植物。
【請求項１７】
前記植物が非形質転換植物に比し、少なくとも１つの除草剤に対する亢進した抵抗性を有する、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１８】
前記除草剤が、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジルオキシ安息香酸系除草剤及びピリミジルチオ安息香酸系除草剤からなる群より選択される、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１９】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−）イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−）５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１８に記載の形質転換植物。
【請求項２０】
種子が前記発現カセットを含む、請求項１１から１９のいずれか一項に記載の植物の形質転換種子。
【請求項２１】
植物細胞における発現を促進するプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチド分子を含み、ゲノムに安定的に組み込まれた少なくとも１つの発現カセットを含む形質転換植物細胞であって、前記ポリヌクレオチド分子が、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む、成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｆ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、形質転換植物細胞。
【請求項２２】
前記発現カセットが、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項２１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２３】
前記植物細胞がそのゲノムに少なくとも１つの非トランスジェニックイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬ遺伝子を含む、請求項２１又は２２に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２４】
前記植物細胞が単子葉植物又は双子葉植物由来である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２５】
前記単子葉植物が、コムギ、ライコムギ、トウモロコシ、イネ、モロコシ、ライムギ、ミレット及びオオムギからなる群より選択される、請求項２４に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２６】
前記双子葉植物が、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、タバコ、トマト及びジャガイモからなる群より選択される、請求項２４に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２７】
前記植物が非形質転換植物に比し、少なくとも１つの除草剤に対する亢進した抵抗性を有する、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２８】
前記除草剤が、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジルオキシ安息香酸系除草剤及びピリミジルチオ安息香酸系除草剤からなる群より選択される、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２９】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項２８に記載の形質転換植物細胞。
【請求項３０】
植物の除草剤抵抗性を亢進させる方法であって、
植物細胞における発現を促進するプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの発現カセットにより前記植物の少なくとも１つの細胞を形質転換するステップと、
前記細胞から安定的に形質転換される植物を再生するステップと
を含み、前記ポリヌクレオチド分子が、
（ａ）配列番号７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、
前記形質転換植物が非形質転換植物に比し、少なくとも１つの除草剤に対する亢進した抵抗性を有するようにした方法。
【請求項３１】
前記発現カセットが、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記除草剤が、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジルオキシ安息香酸系除草剤及びピリミジルチオ安息香酸系除草剤からなる群より選択される、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
形質転換植物細胞を選択する方法であって、
選択可能なマーカー遺伝子を含む植物形質転換ベクターにより植物細胞を形質転換するステップと、
前記形質転換植物細胞を、非形質転換植物細胞の生育を阻害する濃度にて除草剤に曝露させるステップと、
前記除草剤の存在下で生育できる能力により前記形質転換植物細胞を同定するステップと
を含み、
前記選択可能なマーカー遺伝子が、植物細胞における発現を促進するプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリヌクレオチド分子が、
（ａ）配列番号７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項３５】
前記選択可能なマーカー遺伝子が、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記除草剤が、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジルオキシ安息香酸系除草剤及びピリミジルチオ安息香酸系除草剤からなる群より選択される、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記植物形質転換ベクターが少なくとも１つの対象遺伝子を更に含む、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記形質転換植物細胞を形質転換植物に生育させるステップを更に含む、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
形質転換植物の近傍における雑草を抑制する方法であって、前記方法が有効量の除草剤を雑草と形質転換植物に適用するステップを含み、前記形質転換植物が非形質転換植物に比し、除草剤に対する増大した抵抗性を有し、前記形質転換植物が植物細胞における遺伝子発現を促進するプロモーターに機能的に結合されたポリヌクレオチド分子を含む、少なくとも１つの発現カセットをそのゲノムに含み、前記ポリヌクレオチド分子が、
（ａ）配列番号７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項４１】
前記選択可能なマーカー遺伝子が、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記除草剤が、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジルオキシ安息香酸系除草剤及びピリミジルチオ安息香酸系除草剤からなる群より選択される、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記単子葉植物が、コムギ、ライコムギ、トウモロコシ、イネ、モロコシ、ライムギ及びミレット及びオオムギからなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記双子葉植物が、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、モロコシ、ミレット、タバコ、トマト及びジャガイモからなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
請求項３に記載の発現カセットを含む非ヒト宿主細胞。
【請求項４８】
前記宿主細胞が、植物細胞、細菌細胞、動物細胞及び真菌細胞からなる群より選択される、請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
請求項７に記載の形質転換ベクターを含む非ヒト宿主細胞。
【請求項５０】
前記宿主細胞が、植物細胞、細菌細胞、動物細胞及び真菌細胞からなる群より選択される、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＡＨＡＳ活性を含むポリペプチドに含まれるアミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含むとともに除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むポリペプチドに含まれるアミノ酸配列と、
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むポリペプチドに含まれるアミノ酸配列と
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１】
（ａ）配列番号１、３、５、７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む、成熟型除草剤耐性アセトヒドロキシ酸合成酵素の大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｆ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）配列番号８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｖ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
からなる群より選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド分子に機能的に結合し、宿主細胞において発現可能なプロモーターを含む発現カセット。
【請求項４】
前記プロモーターが、植物細胞、細菌細胞、動物細胞及び真菌細胞からなる群より選択される少なくとも１つの宿主細胞において発現可能である、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記プロモーターが構成型プロモーターである、請求項３又は４に記載の発現カセット。
【請求項６】
機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項３から５のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項７】
対象遺伝子と、請求項２に記載のポリヌクレオチド分子に機能的に結合したプロモーターを含む選択可能なマーカー遺伝子とを含む形質転換ベクター。
【請求項８】
前記プロモーターが、植物細胞、細菌細胞、動物細胞及び真菌細胞からなる群より選択される少なくとも１つの宿主細胞において発現可能である、請求項７に記載の形質転換ベクター。
【請求項９】
前記プロモーターが構成型プロモーターである、請求項７又は８に記載の形質転換ベクター。
【請求項１０】
前記選択可能なマーカー遺伝子が、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の形質転換ベクター。
【請求項１１】
植物細胞における発現を促進するプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチド分子を含み、ゲノムに安定的に組み込まれた少なくとも１つの発現カセットを含む形質転換植物であって、前記ポリヌクレオチド分子が、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む、成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｆ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、形質転換植物。
【請求項１２】
前記発現カセットが、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項１１に記載の形質転換植物。
【請求項１３】
前記植物がそのゲノムに少なくとも１つの非トランスジェニックイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬ遺伝子を含む、請求項１１又は１２に記載の形質転換植物。
【請求項１４】
前記植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１５】
前記単子葉植物が、コムギ、ライコムギ、トウモロコシ、イネ、モロコシ、ライムギ、ミレット及びオオムギからなる群より選択される、請求項１４に記載の形質転換植物。
【請求項１６】
前記双子葉植物が、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、タバコ、トマト及びジャガイモからなる群より選択される、請求項１４に記載の形質転換植物。
【請求項１７】
前記植物が非形質転換植物に比し、少なくとも１つの除草剤に対する亢進した抵抗性を有する、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１８】
前記除草剤が、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジルオキシ安息香酸系除草剤及びピリミジルチオ安息香酸系除草剤からなる群より選択される、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の形質転換植物。
【請求項１９】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−）イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−）５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１８に記載の形質転換植物。
【請求項２０】
種子が前記発現カセットを含む、請求項１１から１９のいずれか一項に記載の植物の形質転換種子。
【請求項２１】
植物細胞における発現を促進するプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチド分子を含み、ゲノムに安定的に組み込まれた少なくとも１つの発現カセットを含む形質転換植物細胞であって、前記ポリヌクレオチド分子が、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｅ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む、成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｆ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、形質転換植物細胞。
【請求項２２】
前記発現カセットが、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項２１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２３】
前記植物細胞がそのゲノムに少なくとも１つの非トランスジェニックイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳＬ遺伝子を含む、請求項２１又は２２に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２４】
前記植物細胞が単子葉植物又は双子葉植物由来である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２５】
前記単子葉植物が、コムギ、ライコムギ、トウモロコシ、イネ、モロコシ、ライムギ、ミレット及びオオムギからなる群より選択される、請求項２４に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２６】
前記双子葉植物が、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、タバコ、トマト及びジャガイモからなる群より選択される、請求項２４に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２７】
前記植物が非形質転換植物に比し、少なくとも１つの除草剤に対する亢進した抵抗性を有する、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２８】
前記除草剤が、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジルオキシ安息香酸系除草剤及びピリミジルチオ安息香酸系除草剤からなる群より選択される、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の形質転換植物細胞。
【請求項２９】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項２８に記載の形質転換植物細胞。
【請求項３０】
植物の除草剤抵抗性を亢進させる方法であって、
植物細胞における発現を促進するプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチド分子を含む少なくとも１つの発現カセットにより前記植物の少なくとも１つの細胞を形質転換するステップと、
前記細胞から安定的に形質転換される植物を再生するステップと
を含み、前記ポリヌクレオチド分子が、
（ａ）配列番号７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、
前記形質転換植物が非形質転換植物に比し、少なくとも１つの除草剤に対する亢進した抵抗性を有するようにした方法。
【請求項３１】
前記発現カセットが、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記除草剤が、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジルオキシ安息香酸系除草剤及びピリミジルチオ安息香酸系除草剤からなる群より選択される、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
形質転換植物細胞を選択する方法であって、
選択可能なマーカー遺伝子を含む植物形質転換ベクターにより植物細胞を形質転換するステップと、
前記形質転換植物細胞を、非形質転換植物細胞の生育を阻害する濃度にて除草剤に曝露させるステップと、
前記除草剤の存在下で生育できる能力により前記形質転換植物細胞を同定するステップと
を含み、
前記選択可能なマーカー遺伝子が、植物細胞における発現を促進するプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリヌクレオチド分子が、
（ａ）配列番号７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項３５】
前記選択可能なマーカー遺伝子が、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記除草剤が、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジルオキシ安息香酸系除草剤及びピリミジルチオ安息香酸系除草剤からなる群より選択される、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記植物形質転換ベクターが少なくとも１つの対象遺伝子を更に含む、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記形質転換植物細胞を形質転換植物に生育させるステップを更に含む、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
形質転換植物の近傍における雑草を抑制する方法であって、前記方法が有効量の除草剤を雑草と形質転換植物に適用するステップを含み、前記形質転換植物が非形質転換植物に比し、除草剤に対する増大した抵抗性を有し、前記形質転換植物が植物細胞における遺伝子発現を促進するプロモーターに機能的に結合されたポリヌクレオチド分子を含む、少なくとも１つの発現カセットをそのゲノムに含み、前記ポリヌクレオチド分子が、
（ａ）配列番号７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含む成熟型除草剤耐性ＡＨＡＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９及び１１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列の相補体に対する、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項４１】
前記選択可能なマーカー遺伝子が、機能的に結合した葉緑体標的配列を更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記除草剤が、イミダゾリノン系除草剤、ピリミジルオキシ安息香酸系除草剤及びピリミジルチオ安息香酸系除草剤からなる群より選択される、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−］５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、メチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルアートとメチル［２−（４−］イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルアートの混合物及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記単子葉植物が、コムギ、ライコムギ、トウモロコシ、イネ、モロコシ、ライムギ及びミレット及びオオムギからなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記双子葉植物が、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、モロコシ、ミレット、タバコ、トマト及びジャガイモからなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
請求項３に記載の発現カセットを含む非ヒト宿主細胞。
【請求項４８】
前記宿主細胞が、植物細胞、細菌細胞、動物細胞及び真菌細胞からなる群より選択される、請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
請求項７に記載の形質転換ベクターを含む非ヒト宿主細胞。
【請求項５０】
前記宿主細胞が、植物細胞、細菌細胞、動物細胞及び真菌細胞からなる群より選択される、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９又は１１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＡＨＡＳ活性を含むポリペプチドに含まれるアミノ酸配列と、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸位置５７９又は等価な位置におけるアスパラギンを含むとともに除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むポリペプチドに含まれるアミノ酸配列と、
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０及び１２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を含むポリペプチドに含まれるアミノ酸配列と
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５２０１８３（Ｐ２００８−５２０１８３Ａ）
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１６６９２（Ｐ２００７−５１６６９２）
【出願日】平成１７年６月１５日（２００５．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２１１７０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００７３７３
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（５０２１８６４９７）ビーエーエスエフ、プラント、サイエンス、ゲゼルシャフト、ミット、ベシュレンクテル、ハフツング (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月１５日（２００５．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２１１７０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００７３７３
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（５０２１８６４９７）ビーエーエスエフ、プラント、サイエンス、ゲゼルシャフト、ミット、ベシュレンクテル、ハフツング (1)
【Ｆターム（参考）】
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