インキュベータ及び培養方法
【課題】 炭酸ガスを必要とするインキュベータを小型化する。
【解決手段】 インキュベータ１は、培養ディッシュ３を収容する培養容器２の内部に反応槽１０を設けて、これにイオン交換水と炭酸水素ナトリウムを入れて透明ヒータ１３で加熱する構造で、炭酸水素ナトリウムの分解による炭酸ガスと水分が培養容器２内に供給される。炭酸水素ナトリウムを炭酸ガスの発生源としているので、炭酸ガス供給用のボンベは不要であるし、反応槽１０から発生する炭酸ガスの圧力は低いから、装置構成を単純かつ小型化できる。炭酸ガスだけでなく水分も培養容器２の内部で発生するので、加湿のための構成も必要としない。従って、この点からも装置構成を単純かつ小型化できる。
【解決手段】 インキュベータ１は、培養ディッシュ３を収容する培養容器２の内部に反応槽１０を設けて、これにイオン交換水と炭酸水素ナトリウムを入れて透明ヒータ１３で加熱する構造で、炭酸水素ナトリウムの分解による炭酸ガスと水分が培養容器２内に供給される。炭酸水素ナトリウムを炭酸ガスの発生源としているので、炭酸ガス供給用のボンベは不要であるし、反応槽１０から発生する炭酸ガスの圧力は低いから、装置構成を単純かつ小型化できる。炭酸ガスだけでなく水分も培養容器２の内部で発生するので、加湿のための構成も必要としない。従って、この点からも装置構成を単純かつ小型化できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡観察用培養装置の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、組織、細菌、微生物等の生体系試料を培養ディッシュ内で長時間生存状態とするために、培養ディッシュを収容する培養容器内に炭酸ガスを供給することが行われる。例えば特開２００３−２９１６４号公報（特許文献１）には、ＣＯ2ガスボンベから供給される炭酸ガスをガス混合室に導入し、他のガス成分と混合して培養容器内に供給する顕微鏡観察用培養装置が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−２９１６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１に記載のインキュベータ（顕微鏡観察用培養装置）は、炭酸ガスの供給源としてＣＯ2ガスボンベを用いており、しかも高圧のガスを取り扱うので、必然的に装置構成が複雑化し大型になっていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
請求項１記載のインキュベータは、培養ディッシュを収容する培養容器と、該培養容器と連通しており、炭酸水素ナトリウムが含まれる水溶液を貯留する反応槽と、該反応槽の水溶液を加熱するヒータとを備えたことを特徴とする。
【０００５】
反応槽の水溶液をヒータで例えば３７℃以上に加熱すると、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）がＣＯ2及びＨ2Ｏを失って炭酸ナトリウム（Ｎａ2ＣＯ3）に変化する反応が起こる。つまり、炭酸ガスと水が発生する。
【０００６】
なお、この反応は炭酸ナトリウムなどのアルカリ塩を添加することによって抑制できる。つまり、ヒータによる温度制御とアルカリの添加量とで炭酸ガスの発生量をコントロールできる。
【０００７】
反応槽は培養容器と連通しているので、この炭酸ガスが培養容器に供給される。また、水分も培養容器に供給されて加湿する。
炭酸水素ナトリウムを炭酸ガスの発生源としているので、ＣＯ2ガスボンベは不要であるし、反応槽から発生する炭酸ガスの圧力はガスボンベに比べれば格段に低圧であるから、装置構成を単純かつ小型化できる。
【０００８】
培養容器と反応槽とは、請求項２記載のように、培養容器と反応槽とを一体化することもできるし、請求項３記載のように、培養容器と反応槽とを別体として、これらを管路で接続する構成にもできる。
【０００９】
請求項２記載の構成を採用して培養容器と反応槽とを一体化する場合、請求項３記載のように、反応槽を培養容器内に設けることができる。また、反応槽に培養容器を連接した構造にもできる。いずれの場合も、装置をさらに小型化できる。
【００１０】
請求項４記載のように、反応槽と培養容器とを管路によって接続する構成であると、反応槽と培養容器との距離、相対的な位置関係を自由に選択できる利点がある。
反応槽と培養容器とを管路で接続した場合、請求項５記載の構成にすることもできる。すなわち、請求項４記載のインキュベータにおいて、前記培養容器内に副反応槽を設け、前記反応槽の水溶液を前記副反応槽に送り込む送出ポンプと、前記副反応槽から又は該副反応槽から溢れた水溶液を前記反応槽に送り返す回収ポンプとを備えた構成である。
【００１１】
この場合、上述の炭酸水素ナトリウムがＣＯ2及びＨ2Ｏを失う反応が副反応槽で発生するが、炭酸水素ナトリウムが含まれる水溶液を反応槽と培養容器内の副反応槽との間で循環させるので、炭酸ガスの発生量が不足するおそれはない。
【００１２】
また、請求項６記載のように、請求項４記載のインキュベータにおいて、前記管路を前記反応槽で発生した炭酸ガスが含まれる気体を前記培養容器に送るための送気管路にすることもできる。この場合、反応槽から培養容器に至る送気管路の管路長や管径などにもよるが、通常は送気のためのブロワ又はポンプを設けなくて済む。
【００１３】
請求項１〜６のいずれか記載のインキュベータにおいて、請求項７記載のように、前記反応槽の水溶液を攪拌する攪拌手段と、前記反応槽の水溶液の温度を測定する温度センサと、該温度センサの測定値に基づいて前記ヒータを制御する温度コントローラとを備えれば、反応槽内の水溶液の温度を精度良く制御できるので、炭酸ガスの発生量を精度良く制御できる。
【００１４】
請求項８記載の培養方法は、請求項１〜７のいずれか記載のインキュベータを用い、炭酸水素ナトリウムと、アルカリ塩とを含んだ前記水溶液を前記反応槽に投入して、前記ヒータによって前記反応槽の水溶液を加熱し、発生した炭酸ガスを前記培養容器に供給することを特徴とする。
【００１５】
炭酸水素ナトリウムのみの水溶液でも炭酸ガスを発生させるには十分であるが、投入直後の炭酸ガス発生量が多くなりすぎる（培養容器の炭酸ガス濃度が高くなりすぎる）ことがある。
【００１６】
しかし、上述したように炭酸ナトリウムなどのアルカリ塩を添加することによって、この反応を抑制できるから、炭酸水素ナトリウムとアルカリ塩とを含んだ水溶液を用いるのが好ましい。
【００１７】
特に、請求項９記載のように、前記アルカリ塩としては炭酸ナトリウムが適している。
炭酸ナトリウムをバッファーとする水溶液（緩衝溶液）は、請求項１０記載のように、炭酸水素ナトリウム濃度が５〜１０ｗｔ％、炭酸ナトリウム濃度が１．８〜２．５ｗｔ％の範囲が好ましい。
【００１８】
そして、反応槽内の液温を４０〜６０℃の範囲で制御することで、炭酸ガス濃度を細胞培養に最適な炭酸ガス濃度（一般に５〜１０％）に制御できる。
但し、アルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）をバッファーとして用いる場合には炭酸ガス濃度５％前後で平衡状態になる傾向にあるので、より高濃度にする場合は、請求項１１に記載のようにクエン酸を添加するとよい。こうすれば、炭酸ガス濃度を１０％前後で平衡させることができる。
【００１９】
なお、上記の炭酸水素ナトリウムが含まれる水溶液の調製に当たって水道水を使用すると、残留塩素の影響により、炭酸ガスの平衡濃度が変化するので、純水（イオン交換水）を使用するのが望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
次に、本発明の実施例等により発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は下記の実施例等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲でさまざまに実施できることは言うまでもない。
［実施例１］
図１及び図２に示すように、本実施例のインキュベータ１は、培養容器２と培養ディッシュ３とを備えている。
【００２１】
培養容器２は箱状で、その底部５に設けられた円形の装着穴６にＯリング７を介して培養ディッシュ３がはめ付けられる。
培養容器２の底部５には培養ディッシュ３を取り囲むように、円筒状の仕切壁８が立設されており、この仕切壁８と培養容器２の周壁９との間に反応槽１０が形成されている。また、周壁９を貫通して温度センサ１２が取り付けられている。
【００２２】
そして、培養容器２の上部の開口は透明ヒータ１３によって閉じられ、その上には培養容器２の周壁９に沿った矩形リング状の押さえ１４が載せられる。
図示は省略するが、温度センサ１２及び透明ヒータ１３はコントローラに接続されており、コントローラで目標温度を設定すれば、培養容器２の内部温度が目標温度になるように、コントローラが温度センサ１２の測定値に基づいて透明ヒータ１３を制御する。また、温度センサ１２の測定値はコントローラの表示パネルに数値表示される。
【００２３】
培養ディッシュ３は、例えば石英ガラス等の透明な容器であり、周知の培地が充填され、その培地に培養対象の細胞などが接種される。なお、この培養ディッシュ３は倒立顕微鏡による底側からの内部観察が可能である。
【００２４】
このインキュベータ１を用いて培養、観察操作を行うには、まず反応槽１０に水（イオン交換水）と炭酸水素ナトリウムを入れる。この際に、炭酸ガスの発生量をコントロールするためにアルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）を添加する。
【００２５】
培養試料の種類などにより要求される炭酸ガス濃度が異なり、それに応じた炭酸ガスの発生量にするための炭酸水素ナトリウムの濃度や炭酸水素ナトリウムと炭酸ナトリウムの配合比は一律には決まらないので、予備実験などで好適な条件を求めておくとよい。
【００２６】
通常は、炭酸水素ナトリウムの濃度は５〜１０ｗｔ％、炭酸ナトリウムの濃度は１．８〜２．５ｗｔ％の範囲が好ましい。また、反応槽１０内の液温は４０〜６０℃の範囲で制御するのが好ましい。
【００２７】
次に、このインキュベータ１を倒立顕微鏡のステージにセットする。
続いて、透明ヒータ１３による加温を開始し、温度センサ１２によって測定された内部温度が目標温度（炭酸水素ナトリウムを分解させる必要上３７℃以上、かつ培養試料が生存可能な温度）にて安定させる。加温により炭酸水素ナトリウムが分解するので、培養容器２の内部に炭酸ガスと水分が放出される。
【００２８】
内部温度が目標温度にて安定したところで、培養試料を接種した培養ディッシュ３をセットし、顕微鏡による観察を開始する。
以上のように、インキュベータ１は、培養ディッシュ３を収容する培養容器２の内部に反応槽１０を設けて、これに水と炭酸水素ナトリウムを入れて透明ヒータ１３で加熱する構造であるから、炭酸水素ナトリウムの分解による炭酸ガスと水分が培養容器２内に供給される。
【００２９】
炭酸水素ナトリウムを炭酸ガスの発生源としているので、炭酸ガス供給用のボンベは不要であるし、反応槽１０から発生する炭酸ガスの圧力は低いから、装置構成を単純かつ小型化できる。
【００３０】
また、炭酸ガスだけでなく水分も培養容器２の内部で発生するので、加湿のための構成も必要としない。従って、この点からも装置構成を単純かつ小型化できる。
炭酸ガスの発生量は、炭酸水素ナトリウムの投入量、透明ヒータ１３による温度制御及び炭酸ナトリウムなどのアルカリ塩の添加量により、コントロールできる。
［実施例２］
図３に示すように、本実施例のインキュベータ２１は、反応槽２３の側面部に培養容器２２を連接して、培養容器２２と反応槽２３とを一体化した構造をしている。
【００３１】
反応槽２３の容積は１ｌを充分に上回り、図示のように１ｌの水溶液を投入しても上部に空間が残され、この空間によって培養容器２２と連通する。
反応槽２３には温度センサ２４及びヒータ２５が装着されている。温度センサ２４及びヒータ２５がコントローラに接続され、コントローラによる温度制御及び温度表示が行われるのは、実施例１と同様である。
【００３２】
また、反応槽２３の下にはマグネチックスターラ２６が配されるので、反応槽２３内に入れられた攪拌子２７をマグネチックスターラ２６にて回転させて、水溶液を攪拌できる。
【００３３】
培養容器２２は透明な蓋２８を備えており、この蓋２７を開けることで培養ディッシュ３を出し入れできる。蓋２８が透明であるから、この蓋２８を透かして培養ディッシュ３を観察できる。また、底２９も透明であるから、底２９側からも培養ディッシュ３を観察できる。なお、培養ディッシュ３は実施例１と同じものである。
【００３４】
このインキュベータ２１を用いて培養、観察操作を行うには、まず反応槽２３に炭酸水素ナトリウム、アルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）及び水（イオン交換水）を投入して水溶液とする。又は、予め調製した同水溶液を投入する。水溶液成分の濃度、配合比は実施例１で述べた通りである。
【００３５】
次に、培養ディッシュ３を顕微鏡のステージ上に位置させるべく、インキュベータ２１と顕微鏡を配置する。
続いて、ヒータ２５による加温を開始し、温度センサ２４によって測定された水溶液の温度が目標温度（例えば４３℃）にて安定したところで、培養試料を接種した培養ディッシュ３をセットし、顕微鏡による観察を開始する。加温により炭酸水素ナトリウムが分解するので、反応槽２３の水溶液から炭酸ガスと水分が放出され、これらは培養容器２２に流入する。
【００３６】
マグネチックスターラ２６による水溶液の攪拌は、培養ディッシュ３のセット前から行い、水溶液の炭酸水素ナトリウム及びアルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）が完全に溶解してから培養ディッシュ３をセットするのが望ましい。
【００３７】
１ｌの水溶液を反応槽２３に投入する場合、水溶液の炭酸水素ナトリウム濃度を５〜１０ｗｔ％、炭酸ナトリウム濃度を１．８〜２．５ｗｔ％の範囲として、反応槽２３内の液温を４０〜６０℃の範囲で制御することで、培養容器２２中の炭酸ガス濃度を５％前後に維持して約１週間の観察が可能である。
【００３８】
以上のように、このインキュベータ２１は、培養ディッシュ３を収容する培養容器２２と連通している反応槽２３に水と炭酸水素ナトリウムを入れてヒータ２５で加熱することで、炭酸水素ナトリウムの分解による炭酸ガスと水分を培養容器２２内に供給する構成であるから、実施例１と同様の効果が得られる。
【００３９】
また、本実施例のインキュベータ２１は、培養容器２２と反応槽２３とを一体化した点では実施例１と同様であるが、反応槽２３の側面部に培養容器２２を連接した構造であるので、実施例１に比べて反応槽２３を大型にできる。従って、実施例１よりも多量の炭酸ガスを発生させて培養容器２２に供給できる。
［実施例３］
図４に示すように、本実施例のインキュベータ３１は、培養容器３２と反応槽３３が分離されている。
【００４０】
反応槽３３には、実施例２と同様の温度センサ２４、ヒータ２５及びマグネチックスターラ２６が装備されている。実施例１と同様に温度センサ２４及びヒータ２５がコントローラに接続され、コントローラによる温度制御及び温度表示が行われ、実施例２と同様に攪拌子２７をマグネチックスターラ２６にて回転させて、反応槽３３内の水溶液を攪拌できる。
【００４１】
培養容器３２の内部には副反応槽３４が設けられており、副反応槽３４と培養ディッシュ３（実施例１と同じ）の収容部３６とは、仕切壁３５によって仕切られている。なお、副反応槽３４には溢流槽３７が付属しており、副反応槽３４から溢流槽３７に溢流させることで、副反応槽３４の液量が一定に保たれる。
【００４２】
また、培養容器３２は実施例１と同様の透明ヒータ３８によって閉鎖されるが、透明ヒータ３８を取り外せば培養ディッシュ３を出し入れできる。さらに、培養容器３２には実施例１と同様の温度センサ３９も備わっている。
【００４３】
実施例１と同様に、温度センサ３９及び透明ヒータ３８はコントローラに接続されており、コントローラが温度センサ３９の測定値に基づいて透明ヒータ３８を制御して、培養容器３２の内部温度を目標温度にする。
【００４４】
反応槽３３と培養容器３２とは、反応槽３３から副反応槽３４に至る給液配管４０ａ及び溢流槽３７から反応槽３３に至る回収配管４０ｂとによって接続され、給液配管４０ａには送出ポンプＰ１ａが、回収配管４０ｂには回収ポンプＰ１ｂが介装されている。これにより、送出ポンプＰ１ａを稼働させれば反応槽３３の水溶液を副反応槽３４に送り込むことができ、回収ポンプＰ１ｂを稼働させれば溢流槽３７から反応槽３３へ水溶液を回収できる。
【００４５】
このインキュベータ３１を用いて培養、観察操作を行うには、まず反応槽３３に炭酸水素ナトリウム、アルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）及び水（イオン交換水）を投入して水溶液とする。又は、予め調製した同水溶液を投入する。水溶液成分の濃度、配合比は実施例１、２で述べた通りである。
【００４６】
また、培養ディッシュ３を顕微鏡のステージ上に位置させるべく、培養容器３２と顕微鏡を配置しておく。
続いて、マグネチックスターラ２６による水溶液の攪拌を行いながら、送出ポンプＰ１ａ及び回収ポンプＰ１ｂを稼働させて、水溶液を反応槽３３と副反応槽３４の間で水溶液を循環させる。
【００４７】
また、これと並行的にヒータ２５による加温と透明ヒータによる加温を行う。
温度センサ２４によって測定された反応槽３３内の水溶液の温度及び温度センサ３９によって測定された培養容器３２の内部温度が、それぞれ目標温度（例えば４３℃）にて安定したところで、培養試料を接種した培養ディッシュ３をセットし、顕微鏡による観察を開始する。
【００４８】
ヒータ２５によって水溶液が加温されているので、副反応槽３４内の炭酸水素ナトリウムが分解して炭酸ガスと水分が放出され、培養容器３２内に供給される。
以上のように、このインキュベータ３１は、培養ディッシュ３を収容する培養容器３２内の副反応槽３４に炭酸水素ナトリウムの水溶液を循環させて、炭酸水素ナトリウムの分解による炭酸ガスと水分を培養容器３２内に供給する構成であるから、実施例１と同様の効果が得られる。
【００４９】
なお、本実施例のインキュベータ３１は、培養容器３２と反応槽３３とを分離した構成であるので、実施例１、２と比べて装置構成はやや大型化するが、実施例１に比べて反応槽３３を大型にでき、実施例１よりも多量の炭酸ガスを発生させて培養容器３２に供給できる。また、培養容器３２と反応槽３３とが別体であるから、反応槽３３を例えば顕微鏡（ステージ）とから離れた場所に設置できる等、反応槽３３の設置場所については制約が少なく自由度が高い。
［実施例４］
図５に示すように、本実施例のインキュベータ４１も、実施例３と同様に培養容器４２と反応槽４３が分離されている。但し、反応槽４３から培養容器４２に送出されるのは液ではなく気体である点が実施例３とは異なる。
【００５０】
反応槽４３には、実施例２、３と同様の温度センサ２４、ヒータ２５が備わっている。温度センサ２４及びヒータ２５は温度コントローラＴＣ２に接続されており、実施例２、３と同様に温度コントローラＴＣ２による温度制御が行われる。
【００５１】
また、反応槽４３には、実施例２、３と同様のマグネチックスターラ２６が装備されており、実施例２、３と同様に攪拌子２７をマグネチックスターラ２６にて回転させて、反応槽４３内の水溶液を攪拌できる。
【００５２】
さらに、反応槽４３にはフロートスイッチ４４が備わっていて、液面が上下の設定範囲から外れた場合には、これを検出できる。
反応槽４３の上部（液面の上限よりも高い位置）には送出配管４５に一端が突き出されており、送出配管４５の他端は培養容器４２に接続されている。
【００５３】
また、培養容器４２と反応槽４３とは、回収配管５５によっても接続されている。この回収配管５５には回収ポンプＰ２が介装されており、培養容器４２から吸引した気体を反応槽４３の液中に吐出する。回収ポンプＰ２を稼働させれば、培養容器４２が相対的に低圧、反応槽４３が相対的に高圧になるので、反応槽４３内で発生した炭酸ガスを培養容器４２に供給できる。
【００５４】
培養容器４２は透明な底と蓋を備えた箱状であり、蓋を開ければ培養ディッシュ３を出し入れできる。
培養容器４２には実施例１と同様の温度センサ４６が備わっており、その検出出力は温度コントローラＴＣ１に入力される。温度コントローラＴＣ１は恒温用のヒータ４７の制御用である。
【００５５】
恒温用のヒータ４７は、循環用ポンプＰ１のデリバリ配管４８に装着されていて、このデリバリ配管４８内を流れる気体を加温する。循環用ポンプＰ１のサクション配管４９とデリバリ配管４８は共に培養容器４２に接続されており、ヒータ４７及び循環用ポンプＰ１を稼働させることで、培養容器４２に加温気体を循環させてこれを加温できる。
【００５６】
上述の送出配管４５、回収配管５５、デリバリ配管４８及びサクション配管４９の筐体５０から出ている部分は、結露防止用のエアジャケットホース５１に収容されており、エアジャケットホース５１に温風を送り込むためのヒータ５２及びブロワＦ１が筐体５０内に配されている。
【００５７】
エアジャケットホース５１の吐出端には温度センサ５３が配されており、この温度センサ５３の検出出力が入力される温度コントローラＴＣ３にてヒータ５２を制御することで、エアジャケットホース５１に送り込まれる温風の温度を制御できる。
【００５８】
また、筐体５０にはエアフィルタ付のファンＦ２が取り付けられており、ファンＦ２を稼働されば外気を取り入れできる。
このインキュベータ４１を用いて培養、観察操作を行うには、まず反応槽４３に炭酸水素ナトリウム、アルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）及び水（イオン交換水）を投入して水溶液とする。又は、予め調製した同水溶液を投入する。水溶液成分の濃度、配合比は実施例１、２で述べた通りである。
【００５９】
その一方で、培養ディッシュ３を顕微鏡のステージ上に位置させるべく、培養容器４２と顕微鏡を配置しておく。
次に、ヒータ５２及びブロワＦ１を稼働させてエアジャケットホース５１に温風を送り込む。
【００６０】
その後、ヒータ４７及び循環用ポンプＰ１を稼働させて培養容器４２を加温
する。
また、マグネチックスターラ２６による水溶液の攪拌を行いながら、ヒータ２５により水溶液を加温し、回収ポンプＰ２を稼働させて、反応槽４３内で発生した炭酸ガスを培養容器４２に供給する。
【００６１】
温度センサ２４によって測定された反応槽４３内の水溶液の温度及び温度センサ４６によって測定された培養容器４２の内部温度が、それぞれ目標温度（例えば４３℃）にて安定したところで、培養試料を接種した培養ディッシュ３をセットし、顕微鏡による観察を開始する。
【００６２】
ヒータ２５によって水溶液が加温されているので、反応槽４３内の炭酸水素ナトリウムが分解して炭酸ガスと水分が放出され、これらが培養容器４２内に供給される。
以上のように、このインキュベータ４１は、反応槽４３内の炭酸水素ナトリウムの分解による炭酸ガスと水分を培養容器４２内に供給する構成であるから、実施例１と同様の効果が得られる。
【００６３】
なお、本実施例のインキュベータ４１は、培養容器３２と反応槽４３とを分離した構成であるので、実施例１、２と比べて装置構成はやや大型化するが、実施例１に比べて反応槽４３を大型にでき、実施例１よりも多量の炭酸ガスを発生させて培養容器４２に供給できる。また、培養容器３２と反応槽３３とが別体であるから、反応槽４３を例えば顕微鏡（ステージ）とから離れた場所に設置できる等、反応槽４３の設置場所については実施例３と同様に制約が少なく自由度が高い。
［実施例５］
図６に示すように、この実施例５は、実施例４のインキュベータ４１において、回収配管５５を滅菌フィルタ６１、６２にて外気に通じさせて、空気の取り込みと排出を行うようにした。回収配管５５を外気に通じさせてあるので、系内に空気を取り込むことができ、培養容器２の内部が酸素不足になるのを予防できる。
【００６４】
また 恒温用のヒータ４７、循環用ポンプＰ１、デリバリ配管４８及びサクション配管４９を廃して、培養容器４２の蓋を透明ヒータ６３にした。透明ヒータ６３を制御するための温度センサ４６及び温度コントローラＴＣ１は必要であるが、ヒータ４７、循環用ポンプＰ１、デリバリ配管４８及びサクション配管４９がなくなるので、構成がコンパクトになる。
【００６５】
その他の構成は実施例４と同じであるから説明を省略するが、実施例４と同様の効果が得られることは言うまでもない。
［バッファー効果の確認実験］
実施例４のインキュベータ４１を使用して、炭酸ナトリウムによるバッファー効果を確認するための実験を行った。
【００６６】
実験１（バッファーあり）
イオン交換水２０００ｇ、炭酸水素ナトリウム１５０ｇ、炭酸ナトリウム５０ｇの水溶液（緩衝溶液）を調製し、反応槽４３に投入し、反応槽４３内の液温を４５℃に保つ。
【００６７】
培養ディッシュ３には、ＳＩＧＭＡ製、Ｄ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ），ｌｉｑｕｉｄ，（Ｄ５７９６）培地を充填したが、細胞なし（ブランクテスト）である。培地温度は３７℃、培地のｐＨ値は添加したフェノールレッドの色を指標にして制御した。
【００６８】
培養容器４２内の炭酸ガス濃度を、校正した炭酸ガス濃度計を用いて測定し、記録した。その炭酸ガス濃度のプロットを図７（ａ）に示す。なお、横軸は経過時間で、１目盛り１００分、縦軸は炭酸ガス濃度で幅（レンジ）は２０％である。
【００６９】
このチャートに示すとおり、上記調製した緩衝溶液を反応槽４３に投入した直後に炭酸ガス濃度が約６％に達し、以後は５％前後で安定した状態（平衡濃度と考えられる）を保った。
【００７０】
また、途中で培養容器４２を何回か開放したが、その都度自然に平衡濃度に復帰した。これは緩衝溶液が、炭酸ガス濃度の変化の影響を受けない効果を発揮したためと考えられる。
【００７１】
実験２（バッファーなし）
イオン交換水２０００ｇ、炭酸水素ナトリウム１５０ｇの水溶液を調製し、反応槽４３に投入し、反応槽４３内の液温を４５℃に保つ。その他の条件は実験１と同じである。
【００７２】
この実験における炭酸ガス濃度のプロットを図７（ｂ）に示す。
このチャートに示すとおり、上記調製した緩衝溶液を反応槽４３に投入した直後にプロットペンが振り切れた。測定レンジを変更してみたところ、このときの炭酸ガス濃度は３０％を超えていた。このままでは培地のｐＨ値が低くなり過ぎるので何回か反応槽を開放した。
【００７３】
その炭酸ガス濃度が２０％を超えた状態が約２４時間継続した後、数日を経過して炭酸ガス濃度が５％前後で安定した（平衡状態になったと考えられる）。
考察
実験１、２の比較から明らかなように、炭酸水素ナトリウムのみの水溶液（バッファー無し）では平衡状態になるまでに非常に長い時間を必要とする。
【００７４】
一方、アルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）をバッファーとして使用すると、投入後短時間で平衡状態になる。
なお、緩衝溶液にクエン酸を添加すれば、炭酸ガス濃度が１０％前後で平衡状態にできる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】実施例１のインキュベータの平面図及びＡ−Ａ断面図。
【図２】実施例１のインキュベータの斜視図。
【図３】実施例２のインキュベータの構造説明図。
【図４】実施例３のインキュベータの構造説明図。
【図５】実施例４のインキュベータのプロセスフロー図。
【図６】実施例５のインキュベータのプロセスフロー図。
【図７】バッファー効果の確認実験における培養容器内の炭酸ガス濃度のチャート。
【符号の説明】
【００７６】
１・・・インキュベータ、
２・・・培養容器、
３・・・培養ディッシュ、
８・・・仕切壁、
１０・・・反応槽、
２１・・・インキュベータ、
２２・・・培養容器、
２３・・・反応槽、
３１・・・インキュベータ、
３２・・・培養容器、
３３・・・反応槽、
３４・・・副反応槽、
３６・・・収容部、
３７・・・溢流槽、
４０ａ・・・給液配管、
４０ｂ・・・回収配管、
Ｐ１ａ・・・送出ポンプ、
Ｐ１ｂ・・・回収ポンプ、
４１・・・インキュベータ、
４２・・・培養容器、
４３・・・反応槽、
４５・・・送出配管、
５５・・・回収配管、
Ｐ１・・・循環用ポンプ、
Ｐ２・・・回収ポンプ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡観察用培養装置の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、組織、細菌、微生物等の生体系試料を培養ディッシュ内で長時間生存状態とするために、培養ディッシュを収容する培養容器内に炭酸ガスを供給することが行われる。例えば特開２００３−２９１６４号公報（特許文献１）には、ＣＯ2ガスボンベから供給される炭酸ガスをガス混合室に導入し、他のガス成分と混合して培養容器内に供給する顕微鏡観察用培養装置が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−２９１６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１に記載のインキュベータ（顕微鏡観察用培養装置）は、炭酸ガスの供給源としてＣＯ2ガスボンベを用いており、しかも高圧のガスを取り扱うので、必然的に装置構成が複雑化し大型になっていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
請求項１記載のインキュベータは、培養ディッシュを収容する培養容器と、該培養容器と連通しており、炭酸水素ナトリウムが含まれる水溶液を貯留する反応槽と、該反応槽の水溶液を加熱するヒータとを備えたことを特徴とする。
【０００５】
反応槽の水溶液をヒータで例えば３７℃以上に加熱すると、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）がＣＯ2及びＨ2Ｏを失って炭酸ナトリウム（Ｎａ2ＣＯ3）に変化する反応が起こる。つまり、炭酸ガスと水が発生する。
【０００６】
なお、この反応は炭酸ナトリウムなどのアルカリ塩を添加することによって抑制できる。つまり、ヒータによる温度制御とアルカリの添加量とで炭酸ガスの発生量をコントロールできる。
【０００７】
反応槽は培養容器と連通しているので、この炭酸ガスが培養容器に供給される。また、水分も培養容器に供給されて加湿する。
炭酸水素ナトリウムを炭酸ガスの発生源としているので、ＣＯ2ガスボンベは不要であるし、反応槽から発生する炭酸ガスの圧力はガスボンベに比べれば格段に低圧であるから、装置構成を単純かつ小型化できる。
【０００８】
培養容器と反応槽とは、請求項２記載のように、培養容器と反応槽とを一体化することもできるし、請求項３記載のように、培養容器と反応槽とを別体として、これらを管路で接続する構成にもできる。
【０００９】
請求項２記載の構成を採用して培養容器と反応槽とを一体化する場合、請求項３記載のように、反応槽を培養容器内に設けることができる。また、反応槽に培養容器を連接した構造にもできる。いずれの場合も、装置をさらに小型化できる。
【００１０】
請求項４記載のように、反応槽と培養容器とを管路によって接続する構成であると、反応槽と培養容器との距離、相対的な位置関係を自由に選択できる利点がある。
反応槽と培養容器とを管路で接続した場合、請求項５記載の構成にすることもできる。すなわち、請求項４記載のインキュベータにおいて、前記培養容器内に副反応槽を設け、前記反応槽の水溶液を前記副反応槽に送り込む送出ポンプと、前記副反応槽から又は該副反応槽から溢れた水溶液を前記反応槽に送り返す回収ポンプとを備えた構成である。
【００１１】
この場合、上述の炭酸水素ナトリウムがＣＯ2及びＨ2Ｏを失う反応が副反応槽で発生するが、炭酸水素ナトリウムが含まれる水溶液を反応槽と培養容器内の副反応槽との間で循環させるので、炭酸ガスの発生量が不足するおそれはない。
【００１２】
また、請求項６記載のように、請求項４記載のインキュベータにおいて、前記管路を前記反応槽で発生した炭酸ガスが含まれる気体を前記培養容器に送るための送気管路にすることもできる。この場合、反応槽から培養容器に至る送気管路の管路長や管径などにもよるが、通常は送気のためのブロワ又はポンプを設けなくて済む。
【００１３】
請求項１〜６のいずれか記載のインキュベータにおいて、請求項７記載のように、前記反応槽の水溶液を攪拌する攪拌手段と、前記反応槽の水溶液の温度を測定する温度センサと、該温度センサの測定値に基づいて前記ヒータを制御する温度コントローラとを備えれば、反応槽内の水溶液の温度を精度良く制御できるので、炭酸ガスの発生量を精度良く制御できる。
【００１４】
請求項８記載の培養方法は、請求項１〜７のいずれか記載のインキュベータを用い、炭酸水素ナトリウムと、アルカリ塩とを含んだ前記水溶液を前記反応槽に投入して、前記ヒータによって前記反応槽の水溶液を加熱し、発生した炭酸ガスを前記培養容器に供給することを特徴とする。
【００１５】
炭酸水素ナトリウムのみの水溶液でも炭酸ガスを発生させるには十分であるが、投入直後の炭酸ガス発生量が多くなりすぎる（培養容器の炭酸ガス濃度が高くなりすぎる）ことがある。
【００１６】
しかし、上述したように炭酸ナトリウムなどのアルカリ塩を添加することによって、この反応を抑制できるから、炭酸水素ナトリウムとアルカリ塩とを含んだ水溶液を用いるのが好ましい。
【００１７】
特に、請求項９記載のように、前記アルカリ塩としては炭酸ナトリウムが適している。
炭酸ナトリウムをバッファーとする水溶液（緩衝溶液）は、請求項１０記載のように、炭酸水素ナトリウム濃度が５〜１０ｗｔ％、炭酸ナトリウム濃度が１．８〜２．５ｗｔ％の範囲が好ましい。
【００１８】
そして、反応槽内の液温を４０〜６０℃の範囲で制御することで、炭酸ガス濃度を細胞培養に最適な炭酸ガス濃度（一般に５〜１０％）に制御できる。
但し、アルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）をバッファーとして用いる場合には炭酸ガス濃度５％前後で平衡状態になる傾向にあるので、より高濃度にする場合は、請求項１１に記載のようにクエン酸を添加するとよい。こうすれば、炭酸ガス濃度を１０％前後で平衡させることができる。
【００１９】
なお、上記の炭酸水素ナトリウムが含まれる水溶液の調製に当たって水道水を使用すると、残留塩素の影響により、炭酸ガスの平衡濃度が変化するので、純水（イオン交換水）を使用するのが望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
次に、本発明の実施例等により発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は下記の実施例等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲でさまざまに実施できることは言うまでもない。
［実施例１］
図１及び図２に示すように、本実施例のインキュベータ１は、培養容器２と培養ディッシュ３とを備えている。
【００２１】
培養容器２は箱状で、その底部５に設けられた円形の装着穴６にＯリング７を介して培養ディッシュ３がはめ付けられる。
培養容器２の底部５には培養ディッシュ３を取り囲むように、円筒状の仕切壁８が立設されており、この仕切壁８と培養容器２の周壁９との間に反応槽１０が形成されている。また、周壁９を貫通して温度センサ１２が取り付けられている。
【００２２】
そして、培養容器２の上部の開口は透明ヒータ１３によって閉じられ、その上には培養容器２の周壁９に沿った矩形リング状の押さえ１４が載せられる。
図示は省略するが、温度センサ１２及び透明ヒータ１３はコントローラに接続されており、コントローラで目標温度を設定すれば、培養容器２の内部温度が目標温度になるように、コントローラが温度センサ１２の測定値に基づいて透明ヒータ１３を制御する。また、温度センサ１２の測定値はコントローラの表示パネルに数値表示される。
【００２３】
培養ディッシュ３は、例えば石英ガラス等の透明な容器であり、周知の培地が充填され、その培地に培養対象の細胞などが接種される。なお、この培養ディッシュ３は倒立顕微鏡による底側からの内部観察が可能である。
【００２４】
このインキュベータ１を用いて培養、観察操作を行うには、まず反応槽１０に水（イオン交換水）と炭酸水素ナトリウムを入れる。この際に、炭酸ガスの発生量をコントロールするためにアルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）を添加する。
【００２５】
培養試料の種類などにより要求される炭酸ガス濃度が異なり、それに応じた炭酸ガスの発生量にするための炭酸水素ナトリウムの濃度や炭酸水素ナトリウムと炭酸ナトリウムの配合比は一律には決まらないので、予備実験などで好適な条件を求めておくとよい。
【００２６】
通常は、炭酸水素ナトリウムの濃度は５〜１０ｗｔ％、炭酸ナトリウムの濃度は１．８〜２．５ｗｔ％の範囲が好ましい。また、反応槽１０内の液温は４０〜６０℃の範囲で制御するのが好ましい。
【００２７】
次に、このインキュベータ１を倒立顕微鏡のステージにセットする。
続いて、透明ヒータ１３による加温を開始し、温度センサ１２によって測定された内部温度が目標温度（炭酸水素ナトリウムを分解させる必要上３７℃以上、かつ培養試料が生存可能な温度）にて安定させる。加温により炭酸水素ナトリウムが分解するので、培養容器２の内部に炭酸ガスと水分が放出される。
【００２８】
内部温度が目標温度にて安定したところで、培養試料を接種した培養ディッシュ３をセットし、顕微鏡による観察を開始する。
以上のように、インキュベータ１は、培養ディッシュ３を収容する培養容器２の内部に反応槽１０を設けて、これに水と炭酸水素ナトリウムを入れて透明ヒータ１３で加熱する構造であるから、炭酸水素ナトリウムの分解による炭酸ガスと水分が培養容器２内に供給される。
【００２９】
炭酸水素ナトリウムを炭酸ガスの発生源としているので、炭酸ガス供給用のボンベは不要であるし、反応槽１０から発生する炭酸ガスの圧力は低いから、装置構成を単純かつ小型化できる。
【００３０】
また、炭酸ガスだけでなく水分も培養容器２の内部で発生するので、加湿のための構成も必要としない。従って、この点からも装置構成を単純かつ小型化できる。
炭酸ガスの発生量は、炭酸水素ナトリウムの投入量、透明ヒータ１３による温度制御及び炭酸ナトリウムなどのアルカリ塩の添加量により、コントロールできる。
［実施例２］
図３に示すように、本実施例のインキュベータ２１は、反応槽２３の側面部に培養容器２２を連接して、培養容器２２と反応槽２３とを一体化した構造をしている。
【００３１】
反応槽２３の容積は１ｌを充分に上回り、図示のように１ｌの水溶液を投入しても上部に空間が残され、この空間によって培養容器２２と連通する。
反応槽２３には温度センサ２４及びヒータ２５が装着されている。温度センサ２４及びヒータ２５がコントローラに接続され、コントローラによる温度制御及び温度表示が行われるのは、実施例１と同様である。
【００３２】
また、反応槽２３の下にはマグネチックスターラ２６が配されるので、反応槽２３内に入れられた攪拌子２７をマグネチックスターラ２６にて回転させて、水溶液を攪拌できる。
【００３３】
培養容器２２は透明な蓋２８を備えており、この蓋２７を開けることで培養ディッシュ３を出し入れできる。蓋２８が透明であるから、この蓋２８を透かして培養ディッシュ３を観察できる。また、底２９も透明であるから、底２９側からも培養ディッシュ３を観察できる。なお、培養ディッシュ３は実施例１と同じものである。
【００３４】
このインキュベータ２１を用いて培養、観察操作を行うには、まず反応槽２３に炭酸水素ナトリウム、アルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）及び水（イオン交換水）を投入して水溶液とする。又は、予め調製した同水溶液を投入する。水溶液成分の濃度、配合比は実施例１で述べた通りである。
【００３５】
次に、培養ディッシュ３を顕微鏡のステージ上に位置させるべく、インキュベータ２１と顕微鏡を配置する。
続いて、ヒータ２５による加温を開始し、温度センサ２４によって測定された水溶液の温度が目標温度（例えば４３℃）にて安定したところで、培養試料を接種した培養ディッシュ３をセットし、顕微鏡による観察を開始する。加温により炭酸水素ナトリウムが分解するので、反応槽２３の水溶液から炭酸ガスと水分が放出され、これらは培養容器２２に流入する。
【００３６】
マグネチックスターラ２６による水溶液の攪拌は、培養ディッシュ３のセット前から行い、水溶液の炭酸水素ナトリウム及びアルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）が完全に溶解してから培養ディッシュ３をセットするのが望ましい。
【００３７】
１ｌの水溶液を反応槽２３に投入する場合、水溶液の炭酸水素ナトリウム濃度を５〜１０ｗｔ％、炭酸ナトリウム濃度を１．８〜２．５ｗｔ％の範囲として、反応槽２３内の液温を４０〜６０℃の範囲で制御することで、培養容器２２中の炭酸ガス濃度を５％前後に維持して約１週間の観察が可能である。
【００３８】
以上のように、このインキュベータ２１は、培養ディッシュ３を収容する培養容器２２と連通している反応槽２３に水と炭酸水素ナトリウムを入れてヒータ２５で加熱することで、炭酸水素ナトリウムの分解による炭酸ガスと水分を培養容器２２内に供給する構成であるから、実施例１と同様の効果が得られる。
【００３９】
また、本実施例のインキュベータ２１は、培養容器２２と反応槽２３とを一体化した点では実施例１と同様であるが、反応槽２３の側面部に培養容器２２を連接した構造であるので、実施例１に比べて反応槽２３を大型にできる。従って、実施例１よりも多量の炭酸ガスを発生させて培養容器２２に供給できる。
［実施例３］
図４に示すように、本実施例のインキュベータ３１は、培養容器３２と反応槽３３が分離されている。
【００４０】
反応槽３３には、実施例２と同様の温度センサ２４、ヒータ２５及びマグネチックスターラ２６が装備されている。実施例１と同様に温度センサ２４及びヒータ２５がコントローラに接続され、コントローラによる温度制御及び温度表示が行われ、実施例２と同様に攪拌子２７をマグネチックスターラ２６にて回転させて、反応槽３３内の水溶液を攪拌できる。
【００４１】
培養容器３２の内部には副反応槽３４が設けられており、副反応槽３４と培養ディッシュ３（実施例１と同じ）の収容部３６とは、仕切壁３５によって仕切られている。なお、副反応槽３４には溢流槽３７が付属しており、副反応槽３４から溢流槽３７に溢流させることで、副反応槽３４の液量が一定に保たれる。
【００４２】
また、培養容器３２は実施例１と同様の透明ヒータ３８によって閉鎖されるが、透明ヒータ３８を取り外せば培養ディッシュ３を出し入れできる。さらに、培養容器３２には実施例１と同様の温度センサ３９も備わっている。
【００４３】
実施例１と同様に、温度センサ３９及び透明ヒータ３８はコントローラに接続されており、コントローラが温度センサ３９の測定値に基づいて透明ヒータ３８を制御して、培養容器３２の内部温度を目標温度にする。
【００４４】
反応槽３３と培養容器３２とは、反応槽３３から副反応槽３４に至る給液配管４０ａ及び溢流槽３７から反応槽３３に至る回収配管４０ｂとによって接続され、給液配管４０ａには送出ポンプＰ１ａが、回収配管４０ｂには回収ポンプＰ１ｂが介装されている。これにより、送出ポンプＰ１ａを稼働させれば反応槽３３の水溶液を副反応槽３４に送り込むことができ、回収ポンプＰ１ｂを稼働させれば溢流槽３７から反応槽３３へ水溶液を回収できる。
【００４５】
このインキュベータ３１を用いて培養、観察操作を行うには、まず反応槽３３に炭酸水素ナトリウム、アルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）及び水（イオン交換水）を投入して水溶液とする。又は、予め調製した同水溶液を投入する。水溶液成分の濃度、配合比は実施例１、２で述べた通りである。
【００４６】
また、培養ディッシュ３を顕微鏡のステージ上に位置させるべく、培養容器３２と顕微鏡を配置しておく。
続いて、マグネチックスターラ２６による水溶液の攪拌を行いながら、送出ポンプＰ１ａ及び回収ポンプＰ１ｂを稼働させて、水溶液を反応槽３３と副反応槽３４の間で水溶液を循環させる。
【００４７】
また、これと並行的にヒータ２５による加温と透明ヒータによる加温を行う。
温度センサ２４によって測定された反応槽３３内の水溶液の温度及び温度センサ３９によって測定された培養容器３２の内部温度が、それぞれ目標温度（例えば４３℃）にて安定したところで、培養試料を接種した培養ディッシュ３をセットし、顕微鏡による観察を開始する。
【００４８】
ヒータ２５によって水溶液が加温されているので、副反応槽３４内の炭酸水素ナトリウムが分解して炭酸ガスと水分が放出され、培養容器３２内に供給される。
以上のように、このインキュベータ３１は、培養ディッシュ３を収容する培養容器３２内の副反応槽３４に炭酸水素ナトリウムの水溶液を循環させて、炭酸水素ナトリウムの分解による炭酸ガスと水分を培養容器３２内に供給する構成であるから、実施例１と同様の効果が得られる。
【００４９】
なお、本実施例のインキュベータ３１は、培養容器３２と反応槽３３とを分離した構成であるので、実施例１、２と比べて装置構成はやや大型化するが、実施例１に比べて反応槽３３を大型にでき、実施例１よりも多量の炭酸ガスを発生させて培養容器３２に供給できる。また、培養容器３２と反応槽３３とが別体であるから、反応槽３３を例えば顕微鏡（ステージ）とから離れた場所に設置できる等、反応槽３３の設置場所については制約が少なく自由度が高い。
［実施例４］
図５に示すように、本実施例のインキュベータ４１も、実施例３と同様に培養容器４２と反応槽４３が分離されている。但し、反応槽４３から培養容器４２に送出されるのは液ではなく気体である点が実施例３とは異なる。
【００５０】
反応槽４３には、実施例２、３と同様の温度センサ２４、ヒータ２５が備わっている。温度センサ２４及びヒータ２５は温度コントローラＴＣ２に接続されており、実施例２、３と同様に温度コントローラＴＣ２による温度制御が行われる。
【００５１】
また、反応槽４３には、実施例２、３と同様のマグネチックスターラ２６が装備されており、実施例２、３と同様に攪拌子２７をマグネチックスターラ２６にて回転させて、反応槽４３内の水溶液を攪拌できる。
【００５２】
さらに、反応槽４３にはフロートスイッチ４４が備わっていて、液面が上下の設定範囲から外れた場合には、これを検出できる。
反応槽４３の上部（液面の上限よりも高い位置）には送出配管４５に一端が突き出されており、送出配管４５の他端は培養容器４２に接続されている。
【００５３】
また、培養容器４２と反応槽４３とは、回収配管５５によっても接続されている。この回収配管５５には回収ポンプＰ２が介装されており、培養容器４２から吸引した気体を反応槽４３の液中に吐出する。回収ポンプＰ２を稼働させれば、培養容器４２が相対的に低圧、反応槽４３が相対的に高圧になるので、反応槽４３内で発生した炭酸ガスを培養容器４２に供給できる。
【００５４】
培養容器４２は透明な底と蓋を備えた箱状であり、蓋を開ければ培養ディッシュ３を出し入れできる。
培養容器４２には実施例１と同様の温度センサ４６が備わっており、その検出出力は温度コントローラＴＣ１に入力される。温度コントローラＴＣ１は恒温用のヒータ４７の制御用である。
【００５５】
恒温用のヒータ４７は、循環用ポンプＰ１のデリバリ配管４８に装着されていて、このデリバリ配管４８内を流れる気体を加温する。循環用ポンプＰ１のサクション配管４９とデリバリ配管４８は共に培養容器４２に接続されており、ヒータ４７及び循環用ポンプＰ１を稼働させることで、培養容器４２に加温気体を循環させてこれを加温できる。
【００５６】
上述の送出配管４５、回収配管５５、デリバリ配管４８及びサクション配管４９の筐体５０から出ている部分は、結露防止用のエアジャケットホース５１に収容されており、エアジャケットホース５１に温風を送り込むためのヒータ５２及びブロワＦ１が筐体５０内に配されている。
【００５７】
エアジャケットホース５１の吐出端には温度センサ５３が配されており、この温度センサ５３の検出出力が入力される温度コントローラＴＣ３にてヒータ５２を制御することで、エアジャケットホース５１に送り込まれる温風の温度を制御できる。
【００５８】
また、筐体５０にはエアフィルタ付のファンＦ２が取り付けられており、ファンＦ２を稼働されば外気を取り入れできる。
このインキュベータ４１を用いて培養、観察操作を行うには、まず反応槽４３に炭酸水素ナトリウム、アルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）及び水（イオン交換水）を投入して水溶液とする。又は、予め調製した同水溶液を投入する。水溶液成分の濃度、配合比は実施例１、２で述べた通りである。
【００５９】
その一方で、培養ディッシュ３を顕微鏡のステージ上に位置させるべく、培養容器４２と顕微鏡を配置しておく。
次に、ヒータ５２及びブロワＦ１を稼働させてエアジャケットホース５１に温風を送り込む。
【００６０】
その後、ヒータ４７及び循環用ポンプＰ１を稼働させて培養容器４２を加温
する。
また、マグネチックスターラ２６による水溶液の攪拌を行いながら、ヒータ２５により水溶液を加温し、回収ポンプＰ２を稼働させて、反応槽４３内で発生した炭酸ガスを培養容器４２に供給する。
【００６１】
温度センサ２４によって測定された反応槽４３内の水溶液の温度及び温度センサ４６によって測定された培養容器４２の内部温度が、それぞれ目標温度（例えば４３℃）にて安定したところで、培養試料を接種した培養ディッシュ３をセットし、顕微鏡による観察を開始する。
【００６２】
ヒータ２５によって水溶液が加温されているので、反応槽４３内の炭酸水素ナトリウムが分解して炭酸ガスと水分が放出され、これらが培養容器４２内に供給される。
以上のように、このインキュベータ４１は、反応槽４３内の炭酸水素ナトリウムの分解による炭酸ガスと水分を培養容器４２内に供給する構成であるから、実施例１と同様の効果が得られる。
【００６３】
なお、本実施例のインキュベータ４１は、培養容器３２と反応槽４３とを分離した構成であるので、実施例１、２と比べて装置構成はやや大型化するが、実施例１に比べて反応槽４３を大型にでき、実施例１よりも多量の炭酸ガスを発生させて培養容器４２に供給できる。また、培養容器３２と反応槽３３とが別体であるから、反応槽４３を例えば顕微鏡（ステージ）とから離れた場所に設置できる等、反応槽４３の設置場所については実施例３と同様に制約が少なく自由度が高い。
［実施例５］
図６に示すように、この実施例５は、実施例４のインキュベータ４１において、回収配管５５を滅菌フィルタ６１、６２にて外気に通じさせて、空気の取り込みと排出を行うようにした。回収配管５５を外気に通じさせてあるので、系内に空気を取り込むことができ、培養容器２の内部が酸素不足になるのを予防できる。
【００６４】
また 恒温用のヒータ４７、循環用ポンプＰ１、デリバリ配管４８及びサクション配管４９を廃して、培養容器４２の蓋を透明ヒータ６３にした。透明ヒータ６３を制御するための温度センサ４６及び温度コントローラＴＣ１は必要であるが、ヒータ４７、循環用ポンプＰ１、デリバリ配管４８及びサクション配管４９がなくなるので、構成がコンパクトになる。
【００６５】
その他の構成は実施例４と同じであるから説明を省略するが、実施例４と同様の効果が得られることは言うまでもない。
［バッファー効果の確認実験］
実施例４のインキュベータ４１を使用して、炭酸ナトリウムによるバッファー効果を確認するための実験を行った。
【００６６】
実験１（バッファーあり）
イオン交換水２０００ｇ、炭酸水素ナトリウム１５０ｇ、炭酸ナトリウム５０ｇの水溶液（緩衝溶液）を調製し、反応槽４３に投入し、反応槽４３内の液温を４５℃に保つ。
【００６７】
培養ディッシュ３には、ＳＩＧＭＡ製、Ｄ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ），ｌｉｑｕｉｄ，（Ｄ５７９６）培地を充填したが、細胞なし（ブランクテスト）である。培地温度は３７℃、培地のｐＨ値は添加したフェノールレッドの色を指標にして制御した。
【００６８】
培養容器４２内の炭酸ガス濃度を、校正した炭酸ガス濃度計を用いて測定し、記録した。その炭酸ガス濃度のプロットを図７（ａ）に示す。なお、横軸は経過時間で、１目盛り１００分、縦軸は炭酸ガス濃度で幅（レンジ）は２０％である。
【００６９】
このチャートに示すとおり、上記調製した緩衝溶液を反応槽４３に投入した直後に炭酸ガス濃度が約６％に達し、以後は５％前後で安定した状態（平衡濃度と考えられる）を保った。
【００７０】
また、途中で培養容器４２を何回か開放したが、その都度自然に平衡濃度に復帰した。これは緩衝溶液が、炭酸ガス濃度の変化の影響を受けない効果を発揮したためと考えられる。
【００７１】
実験２（バッファーなし）
イオン交換水２０００ｇ、炭酸水素ナトリウム１５０ｇの水溶液を調製し、反応槽４３に投入し、反応槽４３内の液温を４５℃に保つ。その他の条件は実験１と同じである。
【００７２】
この実験における炭酸ガス濃度のプロットを図７（ｂ）に示す。
このチャートに示すとおり、上記調製した緩衝溶液を反応槽４３に投入した直後にプロットペンが振り切れた。測定レンジを変更してみたところ、このときの炭酸ガス濃度は３０％を超えていた。このままでは培地のｐＨ値が低くなり過ぎるので何回か反応槽を開放した。
【００７３】
その炭酸ガス濃度が２０％を超えた状態が約２４時間継続した後、数日を経過して炭酸ガス濃度が５％前後で安定した（平衡状態になったと考えられる）。
考察
実験１、２の比較から明らかなように、炭酸水素ナトリウムのみの水溶液（バッファー無し）では平衡状態になるまでに非常に長い時間を必要とする。
【００７４】
一方、アルカリ塩（例えば炭酸ナトリウム）をバッファーとして使用すると、投入後短時間で平衡状態になる。
なお、緩衝溶液にクエン酸を添加すれば、炭酸ガス濃度が１０％前後で平衡状態にできる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】実施例１のインキュベータの平面図及びＡ−Ａ断面図。
【図２】実施例１のインキュベータの斜視図。
【図３】実施例２のインキュベータの構造説明図。
【図４】実施例３のインキュベータの構造説明図。
【図５】実施例４のインキュベータのプロセスフロー図。
【図６】実施例５のインキュベータのプロセスフロー図。
【図７】バッファー効果の確認実験における培養容器内の炭酸ガス濃度のチャート。
【符号の説明】
【００７６】
１・・・インキュベータ、
２・・・培養容器、
３・・・培養ディッシュ、
８・・・仕切壁、
１０・・・反応槽、
２１・・・インキュベータ、
２２・・・培養容器、
２３・・・反応槽、
３１・・・インキュベータ、
３２・・・培養容器、
３３・・・反応槽、
３４・・・副反応槽、
３６・・・収容部、
３７・・・溢流槽、
４０ａ・・・給液配管、
４０ｂ・・・回収配管、
Ｐ１ａ・・・送出ポンプ、
Ｐ１ｂ・・・回収ポンプ、
４１・・・インキュベータ、
４２・・・培養容器、
４３・・・反応槽、
４５・・・送出配管、
５５・・・回収配管、
Ｐ１・・・循環用ポンプ、
Ｐ２・・・回収ポンプ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養ディッシュを収容する培養容器と、
該培養容器と連通しており、炭酸水素ナトリウムが含まれる水溶液を貯留する反応槽と、
該反応槽の水溶液を加熱するヒータと
を備えたことを特徴とするインキュベータ。
【請求項２】
請求項１記載のインキュベータにおいて、
前記培養容器と前記反応槽とが一体化されている
ことを特徴とするインキュベータ。
【請求項３】
請求項２記載のインキュベータにおいて、
前記反応槽は前記培養容器内に設けられている
ことを特徴とするインキュベータ。
【請求項４】
請求項１記載のインキュベータにおいて、
前記反応槽と前記培養容器とが管路によって接続されている
ことを特徴とするインキュベータ。
【請求項５】
請求項４記載のインキュベータにおいて、
前記培養容器内に副反応槽を設け、
前記反応槽の水溶液を前記副反応槽に送り込む送出ポンプと、
前記副反応槽から又は該副反応槽から溢れた水溶液を前記反応槽に送り返す回収ポンプと
を備えたことを特徴とするインキュベータ。
【請求項６】
請求項４記載のインキュベータにおいて、
前記管路は前記反応槽で発生した炭酸ガスが含まれる気体を前記培養容器に送るための送気管路である
ことを特徴とするインキュベータ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載のインキュベータにおいて、
前記反応槽の水溶液を攪拌する攪拌手段と、
前記反応槽の水溶液の温度を測定する温度センサと、
該温度センサの測定値に基づいて前記ヒータを制御する温度コントローラと
を備えたことを特徴とするインキュベータ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載のインキュベータを用い、
炭酸水素ナトリウムと、アルカリ塩とを含んだ前記水溶液を前記反応槽に投入して、前記ヒータによって前記反応槽の水溶液を加熱し、発生した炭酸ガスを前記培養容器に供給することを特徴とする培養方法。
【請求項９】
請求項８記載の培養方法において、
前記アルカリ塩が炭酸ナトリウムであることを特徴とする培養方法。
【請求項１０】
請求項９記載の培養方法において、
炭酸水素ナトリウム濃度が５〜１０ｗｔ％、炭酸ナトリウム濃度が１．８〜２．５ｗｔ％の前記水溶液を前記反応槽に投入して、前記反応槽内の液温を４０〜６０℃の範囲とすることを特徴とする培養方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の培養方法において、
前記水溶液にはクエン酸が添加されていることを特徴とする培養方法。
【請求項１】
培養ディッシュを収容する培養容器と、
該培養容器と連通しており、炭酸水素ナトリウムが含まれる水溶液を貯留する反応槽と、
該反応槽の水溶液を加熱するヒータと
を備えたことを特徴とするインキュベータ。
【請求項２】
請求項１記載のインキュベータにおいて、
前記培養容器と前記反応槽とが一体化されている
ことを特徴とするインキュベータ。
【請求項３】
請求項２記載のインキュベータにおいて、
前記反応槽は前記培養容器内に設けられている
ことを特徴とするインキュベータ。
【請求項４】
請求項１記載のインキュベータにおいて、
前記反応槽と前記培養容器とが管路によって接続されている
ことを特徴とするインキュベータ。
【請求項５】
請求項４記載のインキュベータにおいて、
前記培養容器内に副反応槽を設け、
前記反応槽の水溶液を前記副反応槽に送り込む送出ポンプと、
前記副反応槽から又は該副反応槽から溢れた水溶液を前記反応槽に送り返す回収ポンプと
を備えたことを特徴とするインキュベータ。
【請求項６】
請求項４記載のインキュベータにおいて、
前記管路は前記反応槽で発生した炭酸ガスが含まれる気体を前記培養容器に送るための送気管路である
ことを特徴とするインキュベータ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載のインキュベータにおいて、
前記反応槽の水溶液を攪拌する攪拌手段と、
前記反応槽の水溶液の温度を測定する温度センサと、
該温度センサの測定値に基づいて前記ヒータを制御する温度コントローラと
を備えたことを特徴とするインキュベータ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載のインキュベータを用い、
炭酸水素ナトリウムと、アルカリ塩とを含んだ前記水溶液を前記反応槽に投入して、前記ヒータによって前記反応槽の水溶液を加熱し、発生した炭酸ガスを前記培養容器に供給することを特徴とする培養方法。
【請求項９】
請求項８記載の培養方法において、
前記アルカリ塩が炭酸ナトリウムであることを特徴とする培養方法。
【請求項１０】
請求項９記載の培養方法において、
炭酸水素ナトリウム濃度が５〜１０ｗｔ％、炭酸ナトリウム濃度が１．８〜２．５ｗｔ％の前記水溶液を前記反応槽に投入して、前記反応槽内の液温を４０〜６０℃の範囲とすることを特徴とする培養方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の培養方法において、
前記水溶液にはクエン酸が添加されていることを特徴とする培養方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図７】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図７】
【公開番号】特開２００６−２６２８９４（Ｐ２００６−２６２８９４Ａ）
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２７１４（Ｐ２００６−１２７１４）
【出願日】平成１８年１月２０日（２００６．１．２０）
【出願人】（５０５０７２９９３）
【出願人】（５０５０７３００４）アルテア技研株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２０日（２００６．１．２０）
【出願人】（５０５０７２９９３）
【出願人】（５０５０７３００４）アルテア技研株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
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