インフルエンザワクチン
【課題】天然のノイラミニダーゼに対応する抗原特性をもち、正確な作法で折り畳まれる組換えインフルエンザノイラミニダーゼを提供すること。
【解決手段】ノイラミニダーゼ発現ベクターベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し（ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョンが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している）；該発現産物ノイラミニダーゼを培養培地から単離することによって得られる組換えノイラミニダーゼならびに該組換えノイラミニダーゼを適用したワクチンおよびその製造方法ならびに精製方法を提供する。
【解決手段】ノイラミニダーゼ発現ベクターベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し（ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョンが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している）；該発現産物ノイラミニダーゼを培養培地から単離することによって得られる組換えノイラミニダーゼならびに該組換えノイラミニダーゼを適用したワクチンおよびその製造方法ならびに精製方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えインフルエンザノイラミニダーゼ、組換えノイラミニダーゼを宿主細胞中で発現しうる発現ベクター、組換えノイラミニダーゼの産生および精製方法、インフルエンザに対するワクチンおよび本発明の組換えノイラミニダーゼの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスによる流行性感冒(インフルエンザ)は、感染者に相当な被害を与え、社会生活および経済生活に大きな影響を及ぼす。インフルエンザは高齢者および慢性疾患の患者において死亡率が高い。１９４０年代における流行の際に、鶏卵中で培養されたウイルス物質に基づく不活性ワクチンがインフルエンザ感染に対して明らかに効果があることがわかり、その結果、危険率の高い集団の死亡率が大きく低下した。
インフルエンザウイルスは、その２つの表面抗原、すなわち血球凝集素ヘマグルチニン(ＨＡ)とノイラミニダーゼ(ＮＡ)において有意な抗原変異(いわゆる「抗原ドリフト」)を起こすため、咽喉管に生存するウイルスのなかでもユニークである。
その上、特にインフルエンザＡ型ウイルスは、「抗原シフト」という現象によって効果のある免疫を回避することができる。ヒトのウイルスにおいてこのような現象が出現するのは、インフルエンザ遺伝子の動物保菌者由来のＮＡ遺伝子に起因するものである。かくして、１９５７年に、それまで流行していたＮＡ１型のウイルスは新しいＮＡ２型のウイルスと置き換えられた。１９７７年以来、ＮＡ１型のウイルスがヒト集団に再び戻って来ている。したがって、本発明ワクチンは好ましくはＮＡ１およびＮＡ２型ウイルスの両方に対応しうるものを目指さねばならない。
ＮＡはグリコシル基の末端シアル酸残基の除去に触媒作用を及ぼし、それによってＨＡの可能な受容体が破壊される(ゴッチャルク，１９５７；バーネットおよびストーン，１９４７)。ウイルスの集合の阻止および細胞間におけるウイルスの充分な拡散においてＮＡが本質的に関与していると考えられる(コールマンおよびワード，１９８５)。
それぞれのＮＡ分子(Ｍｒ＝２４０，０００)は、ジスルフィド架橋に結合し、非共有結合によって共に交互に保持しあう２組のダイマーで築き上げられた４個の同一のポリペプチド鎖からなるキノコ様構造をしている(ブッチャーおよびキルボーン，１９７２；レイバーおよびバレンタイン，１９６９；バルゲーゼら，１９８３；ワードら，１９８３)。ＨＡとは異なって、ＮＡは、非スプライス、ＮＡ末端、親油性配列、いわゆる膜アンカーによって脂質膜につながれている(フィールズら，１９８３；ブロックら，１９８２)。構造全体のうち最も大きな部分が膜の上に突き出ており、そこで伸長した「柄」領域の頂部に位置する末端・箱形状の「頭部」領域を形成する(リグレイら，１９７３)。該頭部の内側に、各モノマーはそれ自身の触媒部位をもち、少なくとも４個のＮＡ結合グリコシル基が含まれる(コールマンら，１９８３；ワードら，１９８２)。Ｏ−グリコシル化の存在は、現在のところまだ説明されていない。
外部に局在しているために、ＨＡおよびＮＡ抗原は、宿主の免疫系にとって最も重要なウイルス標的構造となっている。ＨＡに特異的に結合する抗体はウイルスの感染性を中和すると考えられ、それはおそらく早期段階の感染を遮断することによるものであろう（ハースト，１９４２；キダら，１９８３)。ＮＡ特異的抗体は通常、標的細胞の初期感染を阻止するのではなく(ジャヒエルおよびキルボーン，１９６６；キルボーンら，１９６８；ヨハンセンら，１９８８)、ウイルスの拡散を阻止する。さらに、競合メカニズムにより、より頻繁に発生するＨＡ抗原のために、ＮＡに対する免疫応答が部分的に抑制されるように思われる(ヨハンセンら，１９８７；キルボーン，１９７６)。実際のところ、ＮＡ免疫の効果は、ほとんどが中和性のＨＡ抗体によって覆い隠されている。このために、ワクチン設計者たちの注意は、長い期間にわたってもっぱらＨＡに焦点を向けられている。
しかし、多くの実験的観察結果から、インフルエンザに対する防御免疫の構築において、ＮＡが実際に重要なパートを演じることが可能であることが示されている(シュルマンら，１９６８；ヨハンセンおよびキルボーン，１９９０；ヨハンセンら，１９９３)。ＮＡの免疫原能力に向けた基礎的な研究には、十分な量の非常に純粋な抗原を、正確な三次元コンホメーションで利用できることが必要である。現在のところ、ＮＡはウイルスのエンベロープを界面活性剤で処理すること(ギャラガーら，１９８４；キルボーンら，１９６８)またはプロナーゼを用いることが多いが、タンパク質頭部のタンパク質分解切断(セトら，１９６６；ロットら，１９７４)によって製造され、次いで精製されている。ある程度までは利用可能であるけれども、これらの方法には収率および純度に関して無視できない限界がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、天然のノイラミニダーゼに対応する抗原特性をもち、正確な作法で折り畳まれる組換えインフルエンザノイラミニダーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
このような実質的単離体である組換えノイラミニダーゼを、本発明にしたがって、
ａ)ノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し(ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョンが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している)；次いで
ｂ)培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することによって得ることができる。
培養培地に分泌される本発明の組換えノイラミニダーゼは、たとえば基礎的研究に用いることができ、そこでは、ワクチン中でのＮＡの役割を決定するために、ＮＡの単独のワクチン接種が行われる。しかし実際問題として、ワクチンによる防御の度合(感染に対して効果的に防御される接種集団のパーセンテージ)および防御の持続性(後期流行性株に対する防御)を増強するために、組換えＮＡをＨＡと組み合わせて使用することはまだないであろう。
【０００５】
さらに詳しくは、本発明は、宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、培養培地から発現産物であるノイラミニダーゼを単離することによって得られる組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを提供する。これには実際問題として、たとえば、ｐＡｃ２ＩＶＡｓからの組換え発現モジュールを、野生型バキュロウイルスまたはその誘導体に乗り換えさせる操作が必然的に伴う。次いで宿主細胞をこの組換えバキュロウイルスに感染させる。
組換えインフルエンザノイラミニダーゼの産生に用いる宿主細胞は、昆虫などの下等真核生物由来のもの、たとえば昆虫細胞系ｓｆ９が好ましいが、サッカロミセスまたはピチアなどの酵母細胞も使用しうる。
【０００６】
さらに本発明は、複製起点、膜アンカーをコードする領域を欠損したインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョン、コード領域の５'に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列、シグナル配列の５'に位置するプロモーターおよびコード領域の３'に位置する転写ターミネーターを含む、分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するための２種のベクターに関する。さらに詳しくは、本発明は、複製起点、膜アンカーをコードする領域を欠損したウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域、またはその修飾バージョンを含む、分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを発現するためのベクターを提供する。
【０００７】
昆虫細胞中で発現するには、このようなベクターを野生型バキュロウイルスまたはその誘導体とともに細胞中に入れる。組換えバキュロウイルスは、二重相同的組換えによって得られ、ここではベクターの発現モジュールがウイルスのゲノムに導入される。プラーク精製後、組換えバキュロウイルスのストックが得られ、続いて、それを用いてｓｆ９細胞などを感染させることができる。
【０００８】
シグナル配列は、インフルエンザＮＡ２ウイルス「Ａ／ビクトリア／３／７５」の血球凝集素遺伝子由来のものであるのが好ましい。本発明は、ベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ(ベルギー、ベー−９０００ゲント、カー・エ・レーデガンクストラート３５番、ラボラトリウム・ボーア・モレキュライル・ビーオロジー−プラシスデンコレクチエ(ＬＭＢＰ)に１９９４年１月３日に提出され、寄託番号はＬＭＢＰ２９７６である)を用いて、二重相同的組換え手段によって、たとえばバキュロウイルスなどのウイルスを形質転換するのが好ましい。ここでは、転写制御シグナル、シグナル配列およびコード領域からなるベクターの発現モジュールを、ウイルスのゲノムに組み入れる。
【０００９】
本発明の他の具体例においては、本発明にしたがって第２のベクターを使用する。このベクターは酵母中で使用されることを企図されており、たとえば複製起点、ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび柄部分をそれぞれコードする領域を欠損しているウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域、またはその修飾バージョン、コード領域の５'に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列、シグナル配列の５'に位置するプロモーターおよびコード領域の３'に位置する転写ターミネーターを含む。
【００１０】
プロモーターおよびターミネーター配列は相同的であり、メチロフィック酵母ピチア・パストリス由来であることが好ましく、アルコールオキシダーゼＩ遺伝子配列などが該当する。シグナル配列はたとえば、サッカロミセス・セレビシアエのプレプロ接合因子αの分泌シグナルである。
【００１１】
このベクターｐＰＰ１ＩＶＶＡｆｌｓはベルギー、ベー−９０００ゲント、カー・エ・レーデガンクストラート３５番、ラボラトリウム・ボーア・モレキュライル・ビーオロジー−プラシスデンコレクチエ(ＬＭＢＰ)に１９９５年１月３日に提出され、寄託番号はＬＭＢＰ３２２３である。
【００１２】
本発明の組換えノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルス、特にＮＡ２型のインフルエンザウイルスに対する防御免疫を産生することが可能であることが見いだされている。したがって、本発明はまた、組換えノイラミニダーゼを含むインフルエンザに対するワクチンに関する。
【００１３】
さらにまた本発明は、組換えノイラミニダーゼの製造方法および精製方法に関する。
【００１４】
本明細書および請求の範囲において語句「ＮＡｓ」は、分泌可能な(組換え)ノイラミニダーゼを意味する。「ｐＮＡ」は、プロナーゼで処理された天然のノイラミニダーゼを意味する。「ＮＡ」はノイラミニダーゼを意味する。
【００１５】
次に述べる実施例において本発明をさらに詳しく説明するが、この実施例は説明の手段としてのみ意図されたものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００１６】
実施例１
組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの発現、精製および特性付け
材料および方法
１.分泌されるノイラミニダーゼをコードする遺伝子の構築およびそのバキュロウイルス発現系への組込み
ａ.プラスミド プラスミドｐＶ６／２１は、１コピーのＡ／ビクトリア／３／７５(Ｈ３Ｎ２)インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子を含むｐＢＲ３２２の誘導体である(ヴァン・ロムプイら，１９８２)。ｐＳＶ５１およびｐＳＶ２３ｍとｐＳＶ２４ｍの両方は、それぞれ後期および初期ＳＶ４０置換ベクターであり、他の文献に記載されている(ヒュイルブレックら，１９８８)。ｐＳＲＳ−８は、Ａ／ビクトリア／３／７５(Ｈ３Ｎ２)の血球凝集素(ＨＡ)遺伝子の出発配列を含むｐＰＬａ２３１１に基づくプラスミドである(ヒュイルブレックら，１９８８)。バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ９４１が、ラッコウおよびサマーズによって設計された(１９８９)。
【００１７】
ｂ.ＨＡシグナルペプチド配列のサブクローニング(ｐＩＶ−プレＨＡ) １８３０ｂｐのｐＳＲＳ−８のＢｓｔＮＩフラグメントをクレノウ酵素で満たした。ＰｖｕＩＩリンカー(ＧＣＡＧＣＴＧＣ)を続いて配列した。得られるフラグメントおよびｐＢＲ３２２をＰｖｕＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、それぞれ７３１ｂｐおよび１６９９ｂｐのフラグメントを単離した。これらの２つのフラグメントを連結して、Ｇ-16(ＡＴＧ＝＋１，＋２，＋３)で出発するＨＡ遺伝子の５'非翻訳領域、次いで完全なＨＡシグナルペプチド配列および成熟ＨＡの最初の２，３個のコドンを含むｐＩＶプレＨＡを作成した。
【００１８】
ｃ.分泌されうるＮＡをコードするキメラ配列：ｐＡＴＩＶＮＡｓの構築 ｐＶ６／２１をＰｖｕＩで開環し、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼで処理した。この混合物にＨｉｎｄＩＩＩリンカーを連結し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで切断した。約１５００ｂｐのＮＡフラグメントを選択し、ｐＳＶ２３ｍの非反復ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位でクローニングした(ｐＳＶ２３ｍＩＶＮＡ)。左回りのインサートをもつプラスミドをＦｎｕｄＩＩおよびＳａｌＩで続いて切断し、膜アンカー配列の欠損したＮＡ遺伝子を含む１２９１ｂｐフラグメントを回収した。ｐＩＶプレＨＡをＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩとともにインキュベートし、ＨＡシグナル配列をもつ８６１ｂｐのフラグメントを保存した。ＰｖｕＩＩ／ＰｓｔＩブラント末端の連結によって、最終的に両方のフラグメントを結合し、ｐＡＴ１５３の２２５３ｂｐ−ＳａｌＩ／ＰｓｔＩフラグメントに挿入し、ｐＡＴＩＶＮＡｓを得た。このプラスミドは、成熟ＨＡの最初の２，３個のアミノ酸を含むＨＡのシグナルペプチド、すぐに続いてシグナルペプチド／膜アンカーを欠損したＮＡ配列および「柄」をコードする領域の一部をコードする配列を有している。ＨＡおよびＮＡフラグメントの連結によって、成熟ＨＡの５位に対応する単一のアミノ酸が置換された(ＧｌｙからＡｌａへ)。ミン・ジョウら(１９８８)およびバン・ロムプイら(１９８２)の文献に記載の情報に基づき、ＮＡｓ中の連結部位に隣接する予測されたＤＮＡおよびアミノ酸配列を図２に示す。
【００１９】
ｄ.バキュロウイルストランスファーベクターへのＮＡｓの組込み
ｐＡＴＩＶＮＡｓの１３６８ｂｐ−ＸｂａＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ｐＳＶ５１の５５６２ｂｐ−ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントおよびｐＳＶ２４ｍの６２４ｂｐ−ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメントに連結した。ＮＡｓ遺伝子を含む１６４７ｂｐ−ＢａｍＨＩフラグメントの１コピーおよびＳＶ４０ポリ(Ａ)部位を、ポリヘドリンプロモーターに対する正確な方向を考慮しながらｐＶＬ９４１の非反復制限部位へ続いて挿入し、ｐＡｃ２ＩＶＮＡｓを得た。この構築物はＳｆ９細胞の同時トランスフェクション後の野生型ＡｃＮＰＶのＤＮＡとの相同的組換えを可能にする。組換えウイルスの子孫は、サマーズおよびスミス(１９８７)に記載されている連続的プラーク精製操作によって単離した。
【００２０】
２.昆虫細胞培養−ＮＡｓの産生
ルーチン培養のために、昆虫細胞Ｓｆ９を、１０％ウシ胎児血清および５０μg／mlのゲンタマイシンを含むＴＣ１００培地中で集密的細胞単層として維持した。組換えバキュロウイルスに感染させるために、８５０cm2の回転ビン内に培養物を移し、２５rpmで回転して懸濁液２００ml中で成長させた。次いで、対数増殖期の終わりに、懸濁細胞(２x１０6細胞／ml)を組換えバキュロウイルスに１.０モイ(ｍｏｉ：感染多重度)で感染させた。２時間後、感染細胞を新鮮な血清フリーのＴＣ１００培地に移し、懸濁液をさらに４８時間インキュベートした。下記のとおり、ＮＡｓを培地から精製した。
【００２１】
３.インフルエンザＸ−４７ウイルスの成長
Ａ／ビクトリア／３／７５の天然のＮＡの製造源として、インフルエンザ株Ｘ−４７をプロナーゼで処理した後に用いた。Ｘ−４７ウイルスは、１１日齢の胚の入ったニワトリの卵の卵黄嚢空隙中で培養した。２５.５℃で２日間インキュベートした後、卵を４℃で一夜冷却し、次の処理に用いるため卵黄嚢液を採集した。
【００２２】
４.緩衝液系
通例、次の緩衝液を用いた：緩衝液Ａ：２０mM ジエタノールアミン/ＨＣｌ,ｐＨ８.５；
緩衝液Ｂ：５０mM ＮａＡｃ,ｐＨ５.５；
緩衝液Ｃ：１０mM ＮａＰ,ｐＨ７.４，１５０mMＮａＣｌ；
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｃは、さらに４％ブタノール(他に特別に指示がない限り)および２mM ＣａＣｌ2を含む。
【００２３】
５.ＮＡｓの精製
ａ.硫酸アンモニウム分画
植え付け(上記参照)後、Ｓｆ９懸濁培養物(通例、約１リットル)を採集し、４０００xｇで１５分間遠心分離を行って細胞レムナントを沈降させた。すべての処理は４℃で行った。最初の精製段階においては、溶液に５mM ＮＡＮ3を加える。透明になった粗培地をｐＨ７.５にて硫酸アンモニウム分画に付した。２０％から６０％の(ＮＨ4)2ＳＯ4で沈殿した物質を遠心分離(１００００xｇ，６０分)によって集め、緩衝液Ａ(ブタノールなし)＋２０mM ＮａＣｌに、出発体積の１／１０の量にて溶解した。再溶解した沈殿物を同緩衝液５０体積に対して２４時間透析(ｍｗｃｏ「モレキュラー・ウエイト・カット−オフ」)した。ここでは、緩衝液を３回連続的に交換した。２００００xｇで１５分間遠心分離して不溶成分を除去した。
【００２４】
ｂ.セファロースＱ−アニオン交換クロマトグラフィー
透析した溶液に先ず４％ブタノールを加え、続いて緩衝液Ａ＋２０mM ＮａＣｌを流速２５ml／時間で通して平衡化したセファロースＱ−カラム(２.５cmx１０cm)に流した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、洗浄緩衝液から２５０mMまでのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶離を行った(２５０ml，２５ml/時間)。ＮＡｓを含む各２.５mlのフラクションを酵素活性およびＥＬＩＳＡレベルを測定することによって同定した。ＮＡ活性は単一ピークとしてカラムから溶出した。
【００２５】
ｃ.Ｎ−(ｐ−アミノフェニル)オキサム酸アガロースアフィニティークロマトグラフィー
(非組換え)インフルエンザＮＡおよびバクテリアＮＡ酵素の精製のためのこのアフィニティーマトリックスの使用が文献に記載されている(カトルカサスおよびイリアーノ，１９７１；ブッチャー，１９７７)。アフィニティーマトリックスの正確な分画は、初めに推奨された緩衝液条件を適用した場合にのみ達成された。セファロースＱによる分離後に活性画分を集め、等量の２００mM ＮａＡｃ，ｐＨ５.５を加えた。続いて、該活性画分を、緩衝液Ｂと１００mM ＮａＣｌで平衡化したＮ−(ｐ−アミノフェニル)オキサム酸アガロースカラム(１.５x５cm)に通した。続いて、平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、緩衝液Ｂで脱塩した。次いで、緩衝液Ａで第２の洗浄段階を行った。最後に、１Ｍ ＮａＣｌを加えた緩衝液Ａを用い、流速１０ml／時間でＮＡｓを溶出した(２mlの画分を集めた)。
【００２６】
ｄ.スーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィー
Ｃentriprep(登録商標)濃縮機(アミコン；ｍｗｃｏ：３０ｋｄ)を用いてアフィニティーカラムの溶出物を２.０mlに濃縮した。次いで、濃縮物を体積１.０mlのサンプル画分にて、緩衝液Ｃおよび４％ブタノールで平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム(１.５cmx６０cm)を用いるクロマトグラフィーに付した。流速１０ml／時間にてカラムを平衡化緩衝液で溶離し、１.０mlの画分を集めた。長期貯蔵するために、−２０℃で関連画分を集め、前述のように濃縮し、続いて最終濃度が５０％になるまでグリセロールを加えた。
【００２７】
精製タンパク質の分子量を評価するために、ウマの脾臓から得たアポフェリチン(４４３ｋｄ)、サツマイモから得たβ−アミラーゼ(２００ｋｄ)、酵母から得たアルコール脱水素酵素(１５０ｋｄ)、ウシ血清アルブミン(６７ｋｄ)および炭酸デヒドラーゼ(２９ｋｄ)でゲル濾過カラムを測定した(すべてシグマ・ケミカル・コーポレイションから入手)。
【００２８】
６.ｐＮＡの製造および精製
ａ.プロナーゼ処理
Ｘ−４７に感染した鶏卵の卵黄嚢液をまず低速(１０００xｇ，１０分)で遠心分離して透明化し、次いで１３０００xｇで１６時間遠心分離してウイルスを沈降させた。ウイルス沈降物を１００感染卵等価物当たり１０mlの緩衝液Ｃに再懸濁し、ウイルスをこれ以上精製をすることなく、２mg/mlまでのプロナーゼを加えた。軽く振とうしながら、混合物を２０℃で１６時間インキュベートした。続いて、残りのウイルスコアおよび不溶のプロナーゼ成分を４℃にて超遠心分離(１０００００xｇ，１時間)によって除去した。次いで、放出されたＮＡ頭部を含上清をカラムクロマトグラフィーにて精製した。
【００２９】
ｂ.セファロースＳ−カチオン交換クロマトグラフィー
クロマトグラフィー操作は、４℃にて行った。粗ｐＮＡサンプルを５倍に希釈し、５０mM ＮａＡＣ，ｐＨ５.５、２mM ＣａＣｌ2および１％ブタノールを加えた。次いで、溶液を緩衝液Ｂ＋１％ブタノールおよび５０mM ＮａＣｌで平衡化したセファロースＳカラム(１.５cmx１０cm)に流す。同じ緩衝液から５００mM ＮａＣｌまで直線勾配を用いて結合した物質を溶離した。ピークの酵素活性を示す画分を集め、Ｃentriprep(登録商標)濃縮機(アミコン；ｍｗｃｏ：３０ｋｄ)を用いて２.０mlに濃縮した。
【００３０】
ｄ.スーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィー
ＮＡｓの場合と同様にしてスーパーデックス２００ゲル濾過を行った(ブタノール濃度が１％である以外)。純ｐＮＡを５０％グリセロール中に−２０℃で貯蔵した。
【００３１】
７.ＮＡ酵素アッセイ
ポティアら(１９７９)の方法に基づいて、ＮＡの触媒活性のアッセイを行った。簡単に述べると、１００μlの反応体積にて、基質として１mMの２'−(４−メチルウンベリフェリル)−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の存在下、−２００mM ＮａＡＣ，ｐＨ６.５、２mM ＣａＣｌ2および１％ブタノールを用いて酵素試験を行った。３７℃で３０〜６０分間インキュベートした後、０.５mlの１３３mMグリシン、８３mMのＮａＨＣＯ3、６０mM ＮａＣｌ,pＨ１０.７を加えて反応を停止した。３６５ｎｍの吸光度を測定することによって、遊離の４−メチルウンベリフェロンを測定した。１ユニットは、１分間に１モルの４−メチルウンベリフェロンを放出する酵素量として定義した。
【００３２】
８.免疫学的技術
ａ.ポリクローナル抗ｐＮＡＩｇＧの製造
精製ｐＮＡに対するポリクローナル抗血清をニュージーランド系の３カ月齢のウサギで作製した。一次免疫感作は、それぞれ投与量当たり５０μgのｐＮＡと７５％のフロイントアジュバントを含む５００μlを四肢に筋肉内投与して行った。６週間後、動物は２つの対応する二次免疫注射を後肢に受けた。ＩｇＧ画分を製造するために、タンパク質Ａセファロース(ファルマシアＬＫＢ)に吸着させることによって集めた血清を精製した。
【００３３】
ｂ.ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートにウサギの抗ｐＮＡＩｇＧを塗布した。試験するサンプルを０.１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで希釈した。ウサギのビオチン化抗ｐＮＡＩｇＧ、次いでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体(ベーリンガー)を用いて結合した抗原を検出した。該プレートをｐ−ニトロフェニルホスフェート(シグマ・ケミカル・コーポレイション)とともにインキュベートして酵素反応を促進した。マイクロタイタープレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３４】
９.分析方法
レムリ法(１９７０)に従い、１０％分離ゲル上でＳＤＳ／ＰＡＧＥを行った(他に特記したもの以外は)。他に特記したもの以外は、β−メルカプトエタノールの存在下に全サンプルを変性した。１０％ゲル中で、マーカータンパク質として、ホスホリラーゼｂ(９４ｋｄ)、ウシ血清アルブミン(６７ｋｄ)、卵白アルブミン(４３ｋｄ)、炭酸脱水素酵素(２９ｋｄ)およびトリプシンインヒビター(２０.１ｋｄ、常に可視ではない)(ファルマシア)を用いた。勾配ゲルに次の質量標準を展開した：ミオシン(２２ｋｄ)、β−ガラクトシダーゼ(１１６ｋｄ)、ホスホリラーゼｂ、ウシ血清アルブミンおよび卵白アルブミン(バイオラド）。モリシー(１９８１)に記載の方法の変更法によってゲル上で銀着色を行った。ブラッドフォード(１９７６)の方法により、ニワトリの卵白アルブミンを標準としてタンパク質濃度を定量した。
【００３５】
１０.架橋分析
１０mM Ｈｅｐｅｓ中の１.０Ｍ溶液(ｐＨ７)として、架橋分子ＢＳ3を新たに調製した。濃度０.５mMのＢＳ3を、反応量３０μlにて加え、タンパク質を架橋した。室温にて１時間インキュベートした。続いて、５μlの１.０Ｍトリス(ｐＨ８.０)を加えて反応を停止した。ポリペプチドのパターンをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。
【００３６】
１１.糖質分析
タンパク質サンプル(０.１μg〜１μg)を５００mMトリス／ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、５％ＳＤＳ、５０mMβ−メルカプトエタノール中で煮沸して変性した。最終ＳＤＳ濃度の少なくとも７倍過剰となるように２.５％のＮＡ−オクチルグルコシドを加えた後、ＮＡ−グリカナーゼを加え(約０.５ユニット；製造者によるユニット)、反応混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。消化パターンをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。
【００３７】
結果
１.ｐＮＡの精製
ここに記載した実験においては、合計１８６個の感染卵を処理した。異なる精製段階とその結果を表１にまとめた。卵黄嚢液およびウイルスの沈積物を収穫し、プロナーゼを濃度２mg/mlで加え、混合物を２０℃で１６時間インキュベートした。超遠心分離後、上清におよそ６０％のＮＡ活性が見られた。この条件下では、活性の損失の主たる原因は、ウイルス粒子のＮＡ頭部の除去が不完全なことであることがわかった。プロナーゼ濃度を高くすること、インキュベーション時間を長くすること、またはインキュベーション温度を上げることは、ＮＡが徐々に失活するのが促進されるため、これらによって収量が増加することはなかった(データは示さず)。続いて、粗ｐＮＡ物質を希釈し、ｐＨ５.５にした。次いで、セファロースＳ−カチオン交換を行った。ｐＮＡを最大収量で得るために、すべての溶液に１％ブタノールを加えた。ほとんどのタンパク質は、セファロースＳカラムにしっかりとは固定されず、勾配溶離において、ＮａＣｌが４００mMの時点において、ひとつのピークが記録されただけであった(示さず)。ＳＤＳ／ＰＡＧＥにおいてコンタミネーションバンドが観察されなかったので、この物質は、実質的に純粋なＮＡであった(図３Ａ、レーン３)。さらに、銀着色では、セファロースＳプールとセファデックス２００ゲル濾過工程の間に少しも差異がなかった(図３Ａ、レーン３と４を比較せよ)。最後のカラムでは、画分６０において分子量２１０ｋｄに対応する単一の鈴形状のピークが得られた(示さず)。連続精製工程を図３Ａに示す。
【００３８】
ＳＤＳ／ＰＡＧＥでは、それぞれ約５４ｋｄと約５２ｋｄに対応する２本のバンドとしてｐＮＡを実際に目視することができた。ここで後者は、銀着色の相対的強度から判るように、最も頻繁に現れるものであった。おそらく、この２つは、柄領域の異なる２カ所の部位でプロナーゼによる好適な切断を受けたことから誘導されたものである。化学製剤ＢＳ3との架橋から、ｐＮＡが真正の四量体タンパク質として回収されることが確認された(図３Ｂ)。
【００３９】
２.ＮＡｓの構築および発現
インフルエンザＮＡ２株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のＮＡ遺伝子を、そのＮＡ末端膜アンカーから分離し、代わりにシグナルペプチドスプライシング部位を含むＡ／ビクトリア／３／７５ＨＡ遺伝子の５'配列に結合した。これによって、分泌可能で可溶性産物の合成が可能になった。得られるキメラ遺伝子は、成熟ＨＡの最初の４個の末端アミノ酸のコドンを含むＨＡシグナル配列、すぐに続いて膜通過部分(アンカー)および柄領域の一部(アミノ酸１〜４５)を欠損したＮＡ配列からなる。両方のＤＮＡ配列は、同じ読み取り枠内にあり、余分のアミノ酸は導入されなかった。連結の結果として、成熟ＨＡタンパク質の５位に対応するただひとつのアミノ酸置換が行われた(図２)。ｐＶＬ９４１を移入ベクターとして用いて、このキメラ配列の１個のコピーをＡｃＮＰＶバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターの後に組み込んだ。Ｓｆ９昆虫細胞の植え付け後、可溶性タンパク質が実際に産生されたことを示すＮＡ活性を培地中で迅速に検出した。感染後およそ４８時間で培地中のＮＡｓ活性がプラトーレベルに達したことを図４に見ることができる。さらにインキュベーションを行うと、おそらく細胞溶解が拡大する結果と考えられるが、総タンパク質濃度が劇的に低下しはじめるので、よい結果を生まなかった。親Ｓｆ９単層と広範囲の懸濁培養物間の中間の運搬が最小に制限される場合に、発現が最も盛んであるらしいことが見出された(データ示さず)。種々の精製実験に基づき、ＮＡｓは６〜８mg/lで変化する濃度および適度に低い産生能力で発現されるが、なおしかし、他の分泌される複合体糖タンパク質について報告された収量(ジャービスら，１９９０)と比較可能なレベルであることを決定した。
【００４０】
３.ＮＡｓの精製
ＴＣ１００培地を、可溶性タンパク質内容物の特異的酵素活性がピークに達する感染の４８時間後に収穫した(図４)。ＮＡｓ精製の種々の工程を表１にまとめた。粗培地に対し、２０％〜６０％飽和硫酸アンモニウム沈殿法を行うと、適度に２倍の濃度の増加が得られ、物質の濃縮を行うことができた。大規模な透析および不溶生成物の除去を行った後、４％ブタノールを加えた。ブタノールを添加することが、ＮＡｓの収量の増加に非常に有利な影響があり、特にタンパク質濃度が低い場合に効果的であることが見出された。培地の疎水性の程度を限定することが、不溶性凝集物の形成を避けるのに必要であることも考慮しうることである。続いて、溶液をセファロースＱ−アニオン交換クロマトグラフィーによって分画した(図５)。塩勾配の開始時に適度に対称的なピークでＮＡ活性が溶出した。ＥＬＩＳＡ試験より、残りの画分にはＮＡ関連物質が含まれないことがわかった。この時点で、出発時のタンパク質の量のおよそ９７.５％が除去され、ほぼ２０の要因によって特異的活性が増加した。次いで、Ｎ−(ｐ−アミノフェニル)オキサム酸アガロースカラムに通すために、溶液のｐＨを５.５まで下げた。初期の実験から、ＮＡ置換オキサム酸が、インフルエンザＮＡの強い可逆的インヒビターであることが知られている(エドモンド，１９６６)。インフルエンザウイルスまたはバクテリアのノイラミニダーゼに対する選択的吸収体としてＮ−(ｐ−アミノフェニル)オキサム酸アガロースを使用することは、最初にカトルカサスおよびイリアーノ(１９７１)によって、後にブッチャー(１９７７)によって証明された。最初の操作にしたがって、高ｐＨの緩衝液(１００mM ＮａＨＣＯ3，ｐＨ９.１)でノイラミニダーゼを溶離した。しかし、我々の実験では、これらの条件では、ＮＡｓの溶出は不完全で、遅い結果しか得られなかった。しかし、ｐＨを高め、かつ塩濃度を高めることによって、効果的な放出が達成できた。溶出に先立って、低濃度の塩の存在下、ｐＨ８.５で追加の洗浄工程を行うことによって、多量の非特異的に結合したタンパク質をカラムから除去した。緩衝剤としてＮａＨＣＯ3よりもジエタノールアミンの方を選ぶことによって、沈殿することなく２mM ＣａＣｌ2を吸収することが可能になった。ＮＡ活性の保持力が、Ｃａ++イオンに幾分左右されることが繰り返し報告されている(チョンら，１９６６；ヂモック，１９７１)。このことが本実験に相当するかどうかは詳細に調査しなかった。
【００４１】
痕跡量の残留混濁物を除去するために、溶出液を限外濾過によって濃縮し、スーパーデックス２００ゲル濾過に付す(図６）。Ａ280測定では、それぞれ約２００ｋｄ、約１３０ｋｄおよび約５４ｋｄにおいて溶出した吸光度の異なる３つのピークが生じた。ＥＬＩＳＡ法によって測定された溶出液の免疫反応性パターンは、記録された３つの各ピークのＡ280プロフィールを正確に表現していることがわかったが、これはすべての物質がＮＡｓ特異的であることを示唆している。
【００４２】
ピーク画分のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析では、分子量の僅かな減少および画分数の増加が認められたが、予測した領域である約５５ｋｄに強いバンドが現れた。(図７)。ＢＳ3を用いた架橋分析によって２２０ｋｄピークは四量体のＮＡｓであると同定された。一方、分子サイズが小さい方の２つのピークは、それぞれ二量体および単量体のＮＡｓであることがわかった。ただし、ここで後者の形体は定量的重要性に限定される(図７Ｂ)。球形体をもつと考えられる四量体や単量体ＮＡｓとは異なり、二量体ＮＡｓは、その棒様の構造のために、その現実の分子量よりも僅かに上で溶出すると考えられる。より注目すべき事は、完全に組み立てられた四量体構造のＮＡｓしか触媒活性を示さないことであった。四量体形状は、酵素活性に必須とされる色々な局在的コンホメーション変化を引き出すことが可能である。精製過程の工程表を表２に示す。
【００４３】
４.ＮＡｓの特性
ＮＡｓをβ−メルカプトエタノールの存在下にＳＤＳと煮沸して変性すると、ＮＡｓは完全解離して分子量約５５ｋｄの単量体鎖になった。ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルの銀着色により四量体および二量体ＮＡｓは、均質に精製されることがわかった。単量体ＮＡｓについては、痕跡量の混濁物が目視されるので、僅かに質の低いものであった。還元剤のない条件下で変性を行うと、四量体および二量体ＮＡｓは、約１１０ｋｄの二量体鎖として移動した(示さず)。これらの結果から、ＮＡｓ二量体はジスルフィド架橋により内部で結合しており、さらに非共有結合的相互作用を介して会合することができ、それによって、天然のＮＡの構造に対応する四量体タンパク質が形成されることが示された。
【００４４】
昆虫細胞が、哺乳類および他の高等細胞のＮＡグリコシル化パターンとは幾らか異なるパターンを生み出すことが繰り返し報告されている(ヒシアおよびロビンス，１９８４；バターおよびヒュー，１９８１；バターら，１９８１；クロダら，１９９０)。したがって、組換えＮＡｓと会合したＮＡ結合糖質の量が、天然のｐＮＡと比較して調査された。代表的なタンパク質サンプルをＮＡグリカナーゼ酵素で処理し、続いてＳＤＳ／ＰＡＧＥ法で分析した(図９)。バンドが相対的に置き換わっていることから、ＮＡｓと会合したＮＡ結合糖質の合計量は、天然の分子と比べて僅かに少ないと結論付けることができる(図９Ａと図９Ｂを比較せよ)；この系で発現する他の糖タンパク質に対して行われた結果と一致する知見である(クロダら，１９８６；ドミンゴおよびトロウブリッジ，１９８８；ヴァン・ドルネン・リッテルら，１９９１)。変性、酵素的脱グリコシルＮＡｓ体が、そのオリジナルのオリゴマー構造にかかわらず、同じ電気泳動的挙動で移動することも確立され、このことから、一次ＮＡｓが一様な鎖長のポリペプチドとして合成されたことが確認される(図９Ｂ、レーン３，５および９を比較せよ)。ＮＡグリカナーゼで処理されたポリペプチド鎖の分子量は、４７.５ｋｄと見積もられ、これは予測されるアミノ酸配列から計算された理論的分子量４７，７１７ｄに一致する。十分興味深いことに、グリコシル化二量体および単量体ＮＡｓと一致するバンドはゲル内で、グリコシル化四量体ＮＡｓから誘導されたバンドよりもやや急速に移動するので、ＮＡグリコシル化の度合は、四量体を形成する能力と関係しているように思われた(図９Ｂ、レーン２に対してレーン４および６；図７Ａも参照せよ)。ＮＡ結合糖質、さらに詳しくはＡｓｎ200に結合するオリゴ糖質鎖が、隣接するサブユニットとの相互作用に介入することによって四量体構造の安定化に一部役割を担うことができるということが示唆されている(バルゲーゼら，１９８３；バルゲーゼおよびコールマン，１９９１)。
【００４５】
四量体タンパク質のみがＮＡｓの触媒特性を有した。単離された四量体ＮＡｓは、ほとんど精製ｐＮＡと同一の特異的活性レベルを呈した(表１および表２)。
【００４６】
各単量体は触媒部位を有しているが、低次構造のＮＡｓ体が酵素活性をもたないという知見は、おそらくインフルエンザＮＡの機能性における四次相互作用にとっての重大な役割を反映している。
【００４７】
ＮＡｓの抗原特性を確かめるために、等しい濃度のタンパク質サンプルを作り、続いて２倍希釈し、ポリクローナル抗ｐＮＡＩｇＧに基づくサンドイッチＥＬＩＳＡで試験した(図１０)。四量体ＮＡｓでは、ｐＮＡの参考グラフと同様の滴定曲線が得られたが、これは、両方が同一かまたは非常によく似た抗原特性をもつことを示している。抗原性に小さなシフトが認められるけれども、論証できるような酵素活性がないにもかかわらず、二量体および単量体ＮＡｓの抗原活性は実質的にそのまま残っていた。抗原性におけるこの小さな差異は、抗原活性／Ａ280比が僅かに上回っている四量体ピークのゲル濾過プロフィールから同様に明らかであった(図６)。天然の四量体構造に対して産生された多数の抗体分子は、不完全に組み立てられたＮＡｓに効率的に結合すること、たとえば隣接するサブユニット間の接触領域を認識することが不可能であったということも有り得る。四量体フォーメーションによって誘発される局部的な変化もまた、多数の微細な抗原差異を引き起こす。
【００４８】
論考
本発明の主たる目的は、分泌され、正確に折り畳まれたタンパク質としてのインフルエンザノイラミニダーゼの合成、およびワクチン用剤として使用しうる均質な生成物を得るための精製操作の決定であった。ＮＡ２インフルエンザウイルス株Ａ／ビクトリア／３／７５のＮＡ遺伝子から、シグナル配列(膜アンカー機能)を有する元のＮＡ末端領域が、インフルエンザＨＡ遺伝子の５’配列の一部と置き換えられたキメラ遺伝子を構築した。続いて、ＨＡから誘導された切断可能なシグナルペプチドにより実質的に分泌可能なＮＡ(ＮＡｓ)をコードする、得られる構築物を、強力なポリヘドリンプロモーターの転写調節下にバキュロウイルス発現ベクターに組み込んだ。宿主昆虫細胞Ｓｆ９の感染後、培養培地中にＮＡｓが分泌された。精製結果に基づいて、６〜８mg/lの範囲で発現のレベルを評価した。バキュロウイルスに感染している間に、分泌による宿主細胞のタンパク質切断能力が劇的に減少することが論証された(ジャービスおよびサマーズ，１９８９)。それにもかかわらず、記載された産生系は実験室スケールの予防接種の研究に適用可能であり、相当なスケールアップにも好適である。
【００４９】
ＮＡｓの精製は、第１の硫酸アンモニウム分画段階、それに続く３種のクロマトグラフィー段階を含む実質的に４段階の操作からなった。酵素活性の獲得については、精製タンパク質としておよそ２５％のＮＡｓが回収されることを評価した。ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより、ＮＡｓを予分別して、架橋分析によりそれぞれ四量体、二量体および単量体ＮＡｓ(ここで後者はほんの少量しか存在しない)として同定される分子サイズの異なる３つの集団に分けた。主要な２つの形体、四量体および二量体ＮＡｓは、約等量で得られ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび銀着色で審査したところ均質であった。
【００５０】
ＮＡｓの酵素および免疫特性を評価するために、比較対称タンパク質として天然のＮＡを単離することが必要であった。Ｘ−４７ウイルスのＡ／ビクトリア／３／７５ＮＡの頭部をプロナーゼ処理により切断し、次いでカチオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。架橋後、ｐＮＡが完全な膜結合ＮＡの四量体構造を保持していることを確認した。
【００５１】
ＮＡｓの触媒特性は、四量体タンパク質のみが酵素活性を呈するという非常に変わったものであった。四量体ＮＡｓは、ほどんどｐＮＡに相当する特異的活性を有した。二量体および単量体ＮＡｓが変性タンパク質であるという理由で単純に不活性であったというのは可能性が低いことである。なぜなら、精製操作中これらの形体もまた、基質結合部位に基づくアフィニティークロマトグラフィーによってしっかりと補足されたからである。これは、酵素の触媒部位は機能的に完全にちがいないが、次に続く触媒への移行が明らかにできないことを示唆している。
【００５２】
ＮＡグリカナーゼ処理により、概してＮＡｓの糖質含量がｐＮＡの糖質含量と比べて僅かに低いこと示されたが、これはこの系で発現する他の糖タンパク質においても認められることであった(クロダら，１９８６；ドミンゴおよびトロウブリッジ，１９８８；バン・ドルネン・リッテルら，１９９１)。ハイポグリコシル化は、二量体および単量体ＮＡｓにおいて明らかに、より顕著であった。Ｘ線回折分析による構造の研究から、Ａｓｎ200に結合した糖質鎖が隣接するサブユニットの接触をより接近したものにすることが示されたが、これは、その鎖が、四量体構造を強化するためのさらなる相互作用を提供したことを示唆している(バルゲーゼら，１９８３；バルゲーゼおよびコールマン，１９９１)。
【００５３】
精製ｐＮＡに対して産生されたポリクローナルＩｇＧとの四量体ＮＡｓの反応性は実質的に完全であったが、これは、両方のタンパク質が非常に類似した抗原特性をもつことを示している。二量体および単量体ＮＡｓの場合に抗原性の小さいシフトを認めることは可能であった。これまでに述べてきたことから、四量体構造のインフルエンザＮＡのみに結合するモノクローナル抗体を単離することが可能であると推論することができた。このような抗体は、おそらく隣接するサブユニットから誘導された表面の抗原決定基との相互作用に入るか、あるいは別の考え方として、四量体形成中のコンホメーション再構成後に形成されたエピトープを認識する。さらに、糖質組成における差異もまた抗原特性を変更する。
【００５４】
実施例２
ピチア・パストリスによる組換えノイラミニダーゼの分泌
序論
昆虫細胞に加えて、酵母が組換えインフルエンザノイラミニダーゼ産生用の宿主細胞として使用しうるかどうかを判定するために、ノイラミニダーゼの酵素的「帽子」部位を含む発現ベクターを構築した。
【００５５】
材料および方法
１.ベクターおよび宿主
ピチア・パストリスのプラスミドｐＰＩＣ９（インビトロゲン製）を用いて発現カセットを構築した。このプラスミドは、ピチア・パストリスの誘導可能なアスコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸＩ）遺伝子の複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、プロモーターおよびターミネーター領域、サッカロミセス・セレビシアエのα因子のプレプロ分泌シグナル、ならびにピチア・パストリスのＨＩＳ４マーカーを含む。宿主としては、メチロトロフィックな酵母菌ピチア・パストリス（インビトロゲン）を用いた。
【００５６】
２.発現カセットの構築
部位特異的突然変異誘発法によって、Ａ／ビクトリア／３／７５のノイラミニダーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列にＳｔｕＩ制限部位を導入した。制限部位の位置はＰｒｏ７９とした。この制限部位を用いて、酵素的活性中心を含むノイラミニダーゼ遺伝子の免疫原性「帽子配列」を、ＳｔｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として単離し、ピチア・パストリスのプラスミドｐＰＩＣ９のＳｎａＢＩ制限部位にクローニングすることができた。図１５はｐＰＩＣ９プラスミドの模式図を示す。図１６はプレプロシグナル配列と組換えノイラミニダーゼの融合領域である。プロペプチドは外来性のＫＥＸ２プロテアーゼによって後期ゴルジ体内で切断される。（Ｇｌｕ−Ａｌａ）2ジペプチドはＳＴＥ１３型のジペプチジルアミノペプチドによって除去される。外側のチロシン残基は切断されず、組換えノイラミニダーゼ上でＮ末端に残るが、これは不必要である。
【００５７】
ＳａｌＩ切断法によってＨＩＳ４選択マーカーの位置で得れらるプラスミドを直線化し、続いてポリエチレングリコールの存在下にピチア・パストリスのＧＴＳ１１５（his４）原形質体に形質転換した。形質転換体から単離されたＤＮＡをサザン分析に付した。この分析により、内部（しかし欠失あり）his４座の位置に相同的組換えを介して組み込まれた発現ベクターが示された。大部分の形質転換体は１〜２コピーのプラスミドを有しているが、高度分泌能力をもつ形質転換体は、タンデム構造で宿主ゲノムに全体を組み込まれた複数コピーのプラスミドを持つことがわかった。該コピーの数は形質転換体当たり２５に達していた。
【００５８】
３.ノイラミニダーゼの発現
最小グリセロール緩衝培地（ｐＨ６．０）中で形質転換体を予備成長させ、４８時間後に、０．５％メタノールを含む最小緩衝培地に移した。この結果、アルコールオキシダーゼＩプロモーターが誘導され、ノイラミニダーゼの「帽子」が発現した。公知のノーザン分析法を用いて、細胞中のノイラミニダーゼのｍＲＮＡ量を評価した。この結果、非常に効果的に誘導がなされたことがわかった。
【００５９】
細胞上清のウエスタン分析から、分子量約７０ｋＤａの組換えノイラミニダーゼが分泌されたことがわかった（図１７参照）。
【００６０】
ＰＮＧアーゼＦを用いて分泌産物を脱グリコシル化した。これによって、予測された４３ｋＤａという大きさの「コア」産物が産生された。コピー数に応じて培地中の組換えノイラミニダーゼの収量が１〜１．５mg/リットルの間で変動することがわかった。
【００６１】
実施例３
材料および方法
１．実験動物
免疫感作開始時に８週齢の雌性同系繁殖系Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＳＣＫ Ｍol、ベルギー）を用いた。受動免疫感作実験において、被検マウスは１２週齢であった。１ケージ（４１０cm2）あたり３匹のグループに分け、食餌と水を任意に与えた。
【００６２】
２．ウイルス
インフルエンザ株は、Ａ．ダグラス博士およびＪ．スケール博士から入手した（ＭＣＲ・ラボラトリーズ、ミル・ヒル、ロンドン）。実験用ウイルスＸ−３１およびＸ−４７はＨ３Ｎ２抗原組成物を含み、該組成物は、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を遺伝子的に再編成することにより、それぞれＡ／アイチ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）として誘導される。両方のウイルスのストックを、マウスが死亡する程度に肺を通して何回も注入することによって順応させた。
【００６３】
３．組換え分泌可能ＮＡ（ＮＡｓ）
インフルエンザＮＡ Ａ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）を、実施例１で記載したバキュロウイルス昆虫細胞発現系で産生された精製組換えタンパク質として投与した。ここで記載する免疫感作実験で使用する精製ＮＡｓ票品には、リン酸緩衝塩溶液として四量体と二量体分子の混合物が含まれていた。
【００６４】
４．アジュバント
我々自身の実験室で行った組換えインフルエンザＨＡの免疫感作研究に基づいて、適当なアジュバントを選んだ。Ｒｉｂｉアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、トレハロース−６，６−ジミコレート（ＴＤＭ）、スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０を含む）とサルモネラ・チフィムリウムＭＰＬＡの入ったビンを製造者の指示書（Ｒｉｂｉイムノケム・リサーチ）にしたがって満たした。ムラミル・ジペプチド（ＭＤＰ）はシグマ・ケミカル・コーポレイションから購入した。
【００６５】
５．免疫感作プロトコル
１μｇのＮＡｓを２００μlの用量で３回、３週間間隔で皮下注射にてマウスに投与した。最初の免疫感作では、通常マウスに用いるＲｉｂｉ用量の半分量中（２５μｇのＭＰＬＡ、２５μｇのＴＤＭ、２μlのスクアレンおよび０．１％のＴｗｅｅｎ８０に相当）に、ＮＡｓを乳剤化した。２５μｇのＭＰＬＡと２５μｇのＭＤＰをＮＡｓに加えてブースター注射を行った。対照動物にはアジュバントのＰＢＳ溶液を投与した。
【００６６】
６．受動免疫感作
３回目の免疫感作後３週間目に、心臓穿刺によってドナーマウスから採血し、同様に処理されたマウスの血清標品を集めた。被検マウスに４００μlの免疫または対照血清を１回投与の腹腔内注射を行った。
【００６７】
７．インフルエンザチャレンジ
ブースター注射後３週間目または受動免疫感作後１日目、軽度にエーテル麻酔したマウスに、２０ＬＤ50の即位的ウイルスを鼻孔内接種した。次いで、接種後１０日間の直腸の温度と体重を測定することによって、感染の進行の程度を追跡した。
【００６８】
８．血清学的方法
ワクチン接種開始前１日（免疫前血清）および各免疫感作後２週間目の血液サンプルを尾部動脈から採血した。ＥＬＩＳＡ法により、ＮＡ特異的抗体について個々の血清サンプルを試験した。マイクロタイタープレート（Nunc Maxisorp）に精製ＮＡｓを塗布し（５０ng/ウエル）、血清を５倍に希釈した。アルカリホスファターゼ（シグマ・ケミカル・コーポレイション）と複合したウサギの抗（マウスＩｇＧ）抗体を加え、次いでｐ−ニトロフェノール基質溶液（シグマ・ケミカル・コーポレイション）をプレートに加えてインキュベートすることによって特異的抗体の結合を定量した。マイクロタイタープレートリーダーにて４０５nmにおけるＯＤ値を測定した。対照ウエル（免疫前血清で処理）よりも０．５高い吸光度が得られるｌｏｇ5血清希釈の逆数としてＮＡ抗体の力価を表した。
【００６９】
結果
１．実験設計
上記免疫感作プロトコルに従い、１グループ１２匹のマウスのグループ３つに、ＮＡｓのワクチン接種を行った。同数の対照マウスを平行してＰＢＳで処理した。続いて、ワクチン接種マウスと対照マウスからなる対のグループをマウス順応Ｘ−４７またはＸ−３１にチャレンジさせた。一方、該対グループを受動免疫感作実験の血清ドナーとした。
【００７０】
２．血清応答
各ケージから１匹ずつ取り出した、１２匹のワクチン接種動物と１２匹の対照動物からランダムに選択した血清で行うＥＬＩＳＡによってＮＡｓに対する抗体応答を追跡した。マウスにおいてＮＡｓ免疫感作を行うと、血清中のＮＡｓ抗体が著しく増加した。最初のブースター注射は、およそｌｏｇ5量の３倍のＮＡｓ抗体を増加したが、第２のブースター注射ではＮＡｓ抗体の力価がさらにまた約５倍の増加を示した。対照マウスにおいては、アジュバントの１回投与では、ＮＡｓと反応する特異的抗体の有意な産生はなされなかった。
【００７１】
３．ＮＡｓによるホモ変異防御
ワクチン接種後３週間目のワクチン接種マウスと対照マウスに対し、２０ ＬＤ50量のホモＮＡ変異ウイルスＸ−４７を投与することにより、免疫を検定した（図１２）。体温の低下および体重の減少が測定されたことからわかるように、すべての対照マウスは重篤な罹患状態に陥った。感染後４日目に、最初の死亡マウスが現れ、すべての対照マウスはウイルス接種後９日以内にすべて死亡した。
反対に、ＮＡｓワクチン接種マウスにおける臨床パラメーターは、一時的かつ小さく低下しただけであった。すべてのワクチンマウスは感染から助かった。
第３の免疫感作を行わない場合、同レベルの防御免疫が達成されうるのかどうかという点についても調べた（ＮＡｓおよび／またはアジュバントの用量を増加することによって補償されるという可能性があると考えられる）。これらの試験は実質的に同一の実験計画に沿って行った。この作法で免疫感作したマウスは一般に良好な耐性を呈したが、少数の個体は重篤な罹患状態に陥った。また、生存率が８０％以下になることは殆ど無かったが、ワクチン接種マウスにおいて死亡するものも時折あらわれた。しかし、３回の免疫感作によって達成された防御免疫のレベルは、全般にわたって優れたものであることがわかった。
【００７２】
４．ＮＡｓによるヘテロ変異防御
７年抗原ドリフトによってＡ／ビクトリア／３／７５から誘導されたＮＡｓから分離されるＮＡを含むヘテロ−ＮＡ−変異ウイルスＸ−３１の２０ ＬＤ50量を、ワクチン接種マウスおよび対照マウスの別のグループに感染させて免疫性を試験した（図１３）。Ｘ−４７免疫感作実験においても観察されたように、臨床結果は劇的なものであった。対照動物は感染後５日目で既に死亡するものがあらわれ始めた。死亡率は８日目に最大値に到達し、その後生存したのは１匹だけであった。ＮＡｓで免疫感作したマウスは、通常は致命的なヘテロ変異ウイルスに感染したにもかかわらず、１００％の生存率を示した。ホモ変異免疫実験の場合と同様に、ワクチン接種マウスは体温を適度に正常レベルで維持することができた。体重の損失は、ホモ変異の場合と比べて幾らかは顕著であったが、すべてのマウスが６日目以降回復を始めた。
【００７３】
５．防御免疫はＮＡｓ免疫血清の受動伝達によって獲得することができる
受動免疫感作による動物防御が、誘発される防御免疫に対して主に応答可能である体液性防御メカニズムであるかどうかを決定するために、該動物防御を試験した。この目的のために、標準的操作にしたがってドナーマウスを免疫感作した。該ドナー動物から採血して、１個体あたり平均約４００μlの血清を得た。対照血清と免疫血清をそれぞれ集めた後、４００μlの血清を被検マウスに腹腔内注射にて１回で投与した。適合させたＸ−４７ウイルスの２０ ＬＤ50量にチャレンジさせる前に、抗体分子がマウス内で満遍なく拡散しうるように２４時間の間隔をあける。対照血清を接種された動物は、すぐに急性の低体温症になり、体重が激しく減少し、最終的に死亡に至ったが、ＮＡｓ免疫血清を投与されたマウスは、能動的に免疫感作された動物と実質的に同程度に防御された（図１４）。
したがって、ＮＡ抗体を予め循環させておくことにより完全な防御が得られるという結論を下すことができる。
【００７４】
論考
インフルエンザに対する免疫は、長い間ほとんどＨＡ抗体の機能についてのみ研究されていたが、免疫に寄与するＮＡの重要性は実質的に無視されてきた。この状況は、ＨＡを結合しうる抗体のみがウイルスを直接中和する能力をもつという観察結果に一部由来するものであった（ハースト，１９４２；デイブンポートら，１９６４；キダら，１９８３）が、ＮＡに対する抗体が、広範囲の濃度において一次感染を防御しうることはわかっていなかった（ジャヒエルおよびキルボーン，１９６６；キルボーンら，１９６８；ヨハンソン，１９８９）。この寛容はおそらく、インフルエンザウイルスのライフサイクルの後期部分で、新たに形成されたウイルスが感染細胞の表面で凝集するのを妨げるように働くＮＡｓを反映している（コールマンおよびウォード，１９８５；ブラウンおよびレイバー，１９６８）。ＨＡとは逆に、ＮＡはインフルエンザウイルスのエンベロープの成分のうちで少ないほうの成分であり、ＮＡ抗体の非中和効果に寄与しうるという事実がさらに発見された（シュルマンら，１９６８）。この存在モル比率の相違が、同様に個々の抗原に対する相対的抗体応答に影響を及ぼす。全インフルエンザウイルスと連続的に対決するために、ＮＡと比べてＨＡが相対的に過剰に提供されることが繰り返されると、おそらくＮａ特異的Ｔ細胞の援助が覚醒される結果として、ＮＡ抗体の産生を抑制することができた（キルボーン，１９７６；ヨハンソンら，１９８７；キルボーンら，１９８７；ヨハンソンら，１９８７）。
【００７５】
したがって、防御ＮＡ免疫を研究するために、ＨＡ抗体を中和することに対する妨害が排除され、ＨＡ抗原およびＮＡ抗原の競合を介したＮＡ免疫応答の阻害が回避されるというシステムを発展させることが必要である。古典的アプローチは、天然のＮＡ成分の単離に基づいて行われる（シュルマンら，１９６８；ヨハンソンおよびキルボーン，１９９０；ギャラガーら，１９８４）かまたは別の場合では限定されたシリーズのインフルエンザ株と血清学的に異なるＨＡおよびＮＡ抗原との組み合わせ投与に基づいて行われる（ロットら，１９７４；キルボーン，１９７６）かのいずれかであった。しかし、本明細書に記載した結果は、精製、組換えＮＡタンパク質を用いる防御免疫感作を直接に説明するものである。Ａ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのＮＡ遺伝子は、膜アンカーをコードする領域がインフルエンザ血球凝集素遺伝子のシグナル配列と置換されることによって分泌可能なタンパク質（ＮＡｓ）をコードする遺伝子に形質転換された（実施例１を参照）。
【００７６】
ＮＡ抗体がウイルス粒子の放出および拡散を阻害することによりウイルス成長の収率を効果的に抑制することができるというインビトロ技術がすでに確立されている（ジャヒエルおよびキルボーン，１９６８；キルボーンら，１９６８）。
【００７７】
肺におけるウイルス力価の低下および肺機能障害の進行の抑制を測定することにより、ＮＡで免疫感作された動物から、同様の結論が引き出された（１１，１２，１３）。肺でのウイルス複製におけるＮＡ免疫の効果に大きな注意が向けられていたけれども、純粋なＮＡタンパク質による免疫感作が、臨床疾患の症候を予防しうるか、または潜在的に致命的なインフルエンザに感染した後の生存チャンスを改良しうるかどうかは疑わしかった。この疑問に対する満足のいく答えはまだ得られていなかった。しかし、本明細書で示す結果は、通常致命的なインフルエンザ感染に対する完全防御が、純粋な組換えＮＡｓで免疫感作することによって達成されうることをを明確に説明しており、ここでは、既往の抗ＨＡ免疫メカニズムまたは保存された内部ウイルスタンパク質の抗原に対する細胞性記憶免疫効果は排除される。
【００７８】
本明細書で説明した実験においては、３週間の間隔をおいて、１μｇのＮＡｓを３回投与してマウスの免疫感作を行った。ワクチン接種した動物は全部インフルエンザウイルスの致命的感染から生還することができた（ここでウイルスはホモまたはヘテロ変異ＮＡを発現した）。感染ウイルスの投与量が多くても、非常に驚くべきことに、体温および体重の変化によって示されるように、免疫感作した動物は臨床疾患の症候を示さないままであった。ＮＡｓとともに投与されるアジュバントがすべて低い反応原特性を有することに注意することが重要であり、そのために、ここで述べた免疫感作操作がヒトのワクチン接種に直接適用しうるのである。さらに、本発明ワクチンは、他の哺乳動物および鳥類に適用可能である。
【００７９】
無垢の被検マウスにＮＡｓで免疫感作したマウスの血清を受動伝達しても、同レベルの防御が得られたが、このことはＮＡｓ免疫感作の防御効果が、ＮＡ抗体の循環に基づいて説明できることを示している。
【００８０】
ここに記載したヘテロ変異防御に関し、ワクチンＡ／ビクトリア／３／７５のＮＡ抗原と変異感染ウイルスＸ−３１に存在するＡ／アイチ／２／６８のＮＡの間の構造的関係を考慮することが重要である。残念なことに、Ａ／アイチ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）のＮＡに関しては、適用できる配列データはないが、アイチ株と同年に単離されたＡ／ＮＴ／６０／６８（Ｈ３Ｎ２）（ベントレーおよびブロウニー，１９８２）のＮＡ配列と比較することはできる。両方のＮＡ変異体の頭部領域を綿密に調査すると、２８位にアミノ酸の置換が発見される（その点で、主要部は分子の表面にある）。
【００８１】
本発明ワクチンは、さらになお移転したドリフト変異体に対する防御をも提供しうる可能性がある。さらに、ＮＡの遺伝子修飾によって遺伝子の変化をその抗原構造にアレンジしうることが考えられる。このことから、たとえば異なるバージョンのＮＡの「カクテル」を製造することが可能になり、したがって、異なるインフルエンザ株に対する広範な防御が獲得できる。
【００８２】
【表１】
この表は、代表的な精製実験を示す（詳細は本文参照）。スーパーデックス２００ゲル濾過後の液量は、２行程のクロマトグラフィーによる精製物を合わせたものである。
【００８３】
【表２】
この表は、代表的な精製実験を示す（詳細は本文参照）。スーパーデックス２００ゲル濾過後の特定の液量は、２行程のクロマトグラフィーからのＮＡｓ画分を合わせたものである。
【００８４】
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【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】分泌可能なＮＡ遺伝子の構築およびバキュロウイルス運搬ベクターへのその組込みのための方策を示す。関連する制限部位のみを示す。一本線は細菌プラスミド配列を示すが、濃い部分はＨＡ特異的（ベタ塗り）またはＮＡ特異的（点付き）配列を示す。ＨＡシグナル配列をシングルハッチングで示す。ＮＡシグナル配列／膜アンカー配列をダブルハッチングで示す。
【図２】正のｃＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列およびＨＡシグナルペプチドとそのＮＡ膜アンカーを除去されたＮＡの間の連結部位のフランキング領域のアミノ酸配列を示す。図２Ａは非切断ＨＡ、詳しくはＡｌａ16とＧｌｎ17間のシグナルペプチダーゼ制限部位（垂直破線）を含む非切断ＨＡを示す。ＮＡｓの分泌に用いるＮＡ末端セグメントを矢印で示す。図２ＢはＮＡの「柄」領域を示す。ＮＡｓの構築に必要とされる先端切断配列を矢印で示す。図２ＣはＡおよびＢからＮＡｓ配列がどのように構築されるかを示す。ここに詳細に示されるのは、ＨＡ特異的配列およびＮＡ特異的配列間の融合領域である。ＮＡｓはおそらく成熟ＨＡの４個のＮＡ末端アミノ酸で開始し、突然変異コドン（点線の下線）がそれに続く。
【図３】精製ｐＮＡのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す。図３Ａは精製段階の異なるｐＮＡから得られるタンパク質サンプルの分析結果である。レーン１はマーカータンパク質を示す；レーン２は粗ｐＮＡを示す（１μg；ｐＮＡバンドは検出可能レベル以下である）；レーン３はセファロースＳによる精製物を示す（１μg）；レーン４はスーパーデックス２００による精製物を示す（１μg）。図３Ｂに示すのは、ＢＳ3法により架橋した１μgのｐＮＡの５．０％〜７．５％の勾配ゲルである。レーン１はマーカータンパク質を示す；レーン２は架橋後のｐＮＡを示す。余分のバンドが約１０５ｋｄ（二量体）、約１６０ｋｄ（三量体）および約２１０ｋｄ（四量体）に現れている。
【図４】Ｓｆ９細胞に組換えバキュロウイルスを植え付けた後の、酵素活性レベル（○）および総タンパク質濃度（◇）から誘導される、培養培地中に検出される特異的活性（□）の時間経過にともなう変化を示す。
【図５】セファロースＱによるアニオン交換クロマトグラフィーを示す。（２０〜６０）％の（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿を溶解し、透析した後、溶液（９７．５mgタンパク質、１１７,０００Ｕ）をセファロースＱカラムに通した。出発緩衝液にＮａＣｌを添加して濃度２５０mMへ向かうＮａＣｌの直線勾配（点線）による溶離を行う前に、非結合物質を洗い流した。溶出液のタンパク質濃度をＡ280（−）を測定して追跡した。２．５mlの画分を集め、酵素活性（○）およびＥＬＩＳＡにおいて抗原性活性（△）を試験した。
【図６】スーパーデックス２００によるＮＡｓのゲル濾過を示す。Ｎ−（ｐ−アミノフェニル）オキサム酸アガロース分離後の溶離液（２．６３mgのタンパク質、４９，１００Ｕ）を２．０mlまで濃縮し、続いてサンプル量１．０mlの画分にて流速１０ml／時間のスーパーデックス２００カラムのクロマトグラフィーに付した。Ａ280を継続的に追跡した（−）。個々の画分（１．０ml）を酵素活性（○）および抗原性活性（△）を試験した。矢印は較正タンパク質の溶出液量を示す（本文参照）：４４３ｋｄ（１）、２００ｋｄ（２）、１５０ｋｄ（３）、６７ｋｄ（４）および２９ｋｄ（５）。
【図７】精製ＮＡｓのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す。各レーンはスーパーデックス２００ゲル濾過の特定の画分番号に対応する。図７Ａは１０μlのサンプルを変性（β−メルカプトエタノール添加）した後のＳＤＳ／ＰＡＧＥパターンを示す。レーンＡおよびＢはマーカータンパク質を示す。図７Ｂでは、タンパク質サンプルをＢＳ3で架橋し、続いてＳＤＳが存在するけれども非還元的な条件下で、５．０％〜７．５％の勾配ゲルの電気泳動によって分離した。画分５７〜６８は、１０μlのサンプル液量；画分７０〜７７は２５μlのサンプル液量である。四量体のＮＡｓは約２２０ｋｄ（四量体）および約１１０ｋｄ（二量体）でバンドを形成する。二量体および単量体ＮＡｓは、それぞれ約１１０ｋｄおよび約５５ｋｄのバンドとして現れる。
【図８】精製段階の異なるＮＡｓからのタンパク質サンプルのＳＤＳ／ＰＡＧＥの結果を示す。レーン１はマーカータンパク質；レーン２は粗培地（５μg）；レーン３は（２０〜６０）％（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿（５μg）；レーン４はセファロースＱ精製物（２．５μg）；レーン５はＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサム酸アガロース分離後の精製物（１μg）；レーン６はスーパーデックス２００ゲル濾過後の四量体および二量体ＮＡｓ画分（１μg）を示す。
【図９】ＮＡ−グルカナーゼ切断およびＳＤＳ／ＰＡＧＥから評価される、ｐＮＡとＮＡｓに結合した糖質含量の比較分析を示す。酵素ＮＡ−グルカナーゼは３５ｋｄのバンドとして現れる。図９Ａでは、レーン１はマーカータンパク質；レーン２は非切断ｐＮＡ（１μg）；レーン３はＮＡ−グルカナーゼ処理したｐＮＡ（１μg）を示す。図９Ｂでは、レーン１および８はマーカータンパク質；レーン２は非切断四量体ＮＡｓ；レーン３はＮＡ−グルカナーゼ処理した四量体ＮＡｓ；レーン４は非切断二量体ＮＡｓ；レーン５はＮＡ−グルカナーゼ処理した二量体ＮＡｓ；レーン６は非切断単量体ＮＡｓ；レーン７はＮＡ−グルカナーゼ処理した単量体ＮＡｓを示す。
【図１０】ＮＡｓとｐＮＡ間の抗原的な近同一性を説明する。ｐＮＡとＮＡｓのサンプルを等しいタンパク質濃度とし、続いてＥＬＩＳＡにおいて２倍に希釈した。図は特異的抗原に対して測定されたＳ字型の抗原性カーブを示す。ｐＮＡは○；四量体ＮＡｓは◇；二量体ＮＡｓは□；および単量体ＮＡｓは△で示される。
【図１１】ＮＡｓに対する抗体応答を説明する。各免疫感作後１４日目に（矢印で表示）、マウスから血液サンプルを採血し、ＮＡｓ抗体の存在をＥＬＩＳＡにて測定した(実験詳細については本文参照)。ベタ塗りバーおよびハッチングバーは、それぞれワクチン接種および対照動物の平均血清力価(±Ｓ．Ｄ)を表す。
【図１２】ホモ変異体防御を示す。ワクチン接種マウス［Ａでは点線；ＢおよびＣでは黒三角］および対照マウス［Ａでは−；ＢおよびＣでは黒丸］を２０ ＬＤ50のホモ変異，マウス順応Ｘ−４７ウイルスにチャレンジさせた。生存率（Ａ）を記録し、直腸温度（Ｂ）および体重（Ｃ）を測定することによって感染の進行を追跡した（実験詳細については本文参照）。データ点は平均値±Ｓ．Ｄで得る。
【図１３】ヘテロ変異体防御を示す。ワクチン接種マウス［Ａでは点線；ＢおよびＣでは黒三角］および対照マウス［Ａでは−；ＢおよびＣでは黒丸］を２０ ＬＤ50のヘテロ変異，マウス順応Ｘ−３１ウイルスにチャレンジさせた。生存率（Ａ）を記録し、直腸温度（Ｂ）および体重（Ｃ）を測定することによって感染の進行を追跡した（実験詳細については本文参照）。データ点は平均値±Ｓ.Ｄで得る。
【図１４】受動免疫感作による防御を示す。ＮＡｓ免疫血清［Ａでは点線；ＢおよびＣでは黒三角］および対照血清［Ａでは−；ＢおよびＣでは黒丸］の腹腔内注射によってマウスのグループを受動的に免疫感作した。２４時間後に、マウスは２０ ＬＤ50のマウス順応Ｘ−４７ウイルスへのチャレンジを受けた（実験詳細は本文を参照）。生存率、直腸温度および体重をそれぞれＡ、ＢおよびＣに示す。データ点は平均値±Ｓ.Ｄで得る。
【図１５】ＡＯＸＩプロモーターおよびターミネーター配列に加えて、ピチア・パストリスのＨＩＳ４マーカーおよびサッカロミセス・セレビシアエのα因子遺伝子のプレプロ分泌シグナルを含むプラスミドｐＰＩＣ９の模式図を示す。多重クローニング部位は分泌シグナルの後に位置する。
【図１６】プレプロ分泌シグナルとノイラミニダーゼの組換え「帽子」部分の間の融合領域である。「ＫＥＸ２」は、後期ゴルジ体において外来性ＫＥＸ−２プロテアーゼによってプロペプチドが切断される位置を示す。（Ｇｌｕ−Ａｌａ）2ジペプチドはＳＴＥ１３型のジペプチジルアミノペプチダーゼによって除去される。チロシン残基はノイラミニダーゼ由来ではないが、除去されない。次のプロリンはＸ−４７ノイラミニダーゼの７９位に一致する。
【図１７】個々の形質転換体の５個の培地サンプルについての１２．５％ポリアクリルアミドゲルのウエスタンブロットである。レーン１は非形質転換体のピチア・パストリス株の培地サンプルを含む。ＴＣＡで沈殿した培養培地１ml中のタンパク質マテリアルをレーン毎に展開した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えインフルエンザノイラミニダーゼ、組換えノイラミニダーゼを宿主細胞中で発現しうる発現ベクター、組換えノイラミニダーゼの産生および精製方法、インフルエンザに対するワクチンおよび本発明の組換えノイラミニダーゼの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスによる流行性感冒(インフルエンザ)は、感染者に相当な被害を与え、社会生活および経済生活に大きな影響を及ぼす。インフルエンザは高齢者および慢性疾患の患者において死亡率が高い。１９４０年代における流行の際に、鶏卵中で培養されたウイルス物質に基づく不活性ワクチンがインフルエンザ感染に対して明らかに効果があることがわかり、その結果、危険率の高い集団の死亡率が大きく低下した。
インフルエンザウイルスは、その２つの表面抗原、すなわち血球凝集素ヘマグルチニン(ＨＡ)とノイラミニダーゼ(ＮＡ)において有意な抗原変異(いわゆる「抗原ドリフト」)を起こすため、咽喉管に生存するウイルスのなかでもユニークである。
その上、特にインフルエンザＡ型ウイルスは、「抗原シフト」という現象によって効果のある免疫を回避することができる。ヒトのウイルスにおいてこのような現象が出現するのは、インフルエンザ遺伝子の動物保菌者由来のＮＡ遺伝子に起因するものである。かくして、１９５７年に、それまで流行していたＮＡ１型のウイルスは新しいＮＡ２型のウイルスと置き換えられた。１９７７年以来、ＮＡ１型のウイルスがヒト集団に再び戻って来ている。したがって、本発明ワクチンは好ましくはＮＡ１およびＮＡ２型ウイルスの両方に対応しうるものを目指さねばならない。
ＮＡはグリコシル基の末端シアル酸残基の除去に触媒作用を及ぼし、それによってＨＡの可能な受容体が破壊される(ゴッチャルク，１９５７；バーネットおよびストーン，１９４７)。ウイルスの集合の阻止および細胞間におけるウイルスの充分な拡散においてＮＡが本質的に関与していると考えられる(コールマンおよびワード，１９８５)。
それぞれのＮＡ分子(Ｍｒ＝２４０，０００)は、ジスルフィド架橋に結合し、非共有結合によって共に交互に保持しあう２組のダイマーで築き上げられた４個の同一のポリペプチド鎖からなるキノコ様構造をしている(ブッチャーおよびキルボーン，１９７２；レイバーおよびバレンタイン，１９６９；バルゲーゼら，１９８３；ワードら，１９８３)。ＨＡとは異なって、ＮＡは、非スプライス、ＮＡ末端、親油性配列、いわゆる膜アンカーによって脂質膜につながれている(フィールズら，１９８３；ブロックら，１９８２)。構造全体のうち最も大きな部分が膜の上に突き出ており、そこで伸長した「柄」領域の頂部に位置する末端・箱形状の「頭部」領域を形成する(リグレイら，１９７３)。該頭部の内側に、各モノマーはそれ自身の触媒部位をもち、少なくとも４個のＮＡ結合グリコシル基が含まれる(コールマンら，１９８３；ワードら，１９８２)。Ｏ−グリコシル化の存在は、現在のところまだ説明されていない。
外部に局在しているために、ＨＡおよびＮＡ抗原は、宿主の免疫系にとって最も重要なウイルス標的構造となっている。ＨＡに特異的に結合する抗体はウイルスの感染性を中和すると考えられ、それはおそらく早期段階の感染を遮断することによるものであろう（ハースト，１９４２；キダら，１９８３)。ＮＡ特異的抗体は通常、標的細胞の初期感染を阻止するのではなく(ジャヒエルおよびキルボーン，１９６６；キルボーンら，１９６８；ヨハンセンら，１９８８)、ウイルスの拡散を阻止する。さらに、競合メカニズムにより、より頻繁に発生するＨＡ抗原のために、ＮＡに対する免疫応答が部分的に抑制されるように思われる(ヨハンセンら，１９８７；キルボーン，１９７６)。実際のところ、ＮＡ免疫の効果は、ほとんどが中和性のＨＡ抗体によって覆い隠されている。このために、ワクチン設計者たちの注意は、長い期間にわたってもっぱらＨＡに焦点を向けられている。
しかし、多くの実験的観察結果から、インフルエンザに対する防御免疫の構築において、ＮＡが実際に重要なパートを演じることが可能であることが示されている(シュルマンら，１９６８；ヨハンセンおよびキルボーン，１９９０；ヨハンセンら，１９９３)。ＮＡの免疫原能力に向けた基礎的な研究には、十分な量の非常に純粋な抗原を、正確な三次元コンホメーションで利用できることが必要である。現在のところ、ＮＡはウイルスのエンベロープを界面活性剤で処理すること(ギャラガーら，１９８４；キルボーンら，１９６８)またはプロナーゼを用いることが多いが、タンパク質頭部のタンパク質分解切断(セトら，１９６６；ロットら，１９７４)によって製造され、次いで精製されている。ある程度までは利用可能であるけれども、これらの方法には収率および純度に関して無視できない限界がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、天然のノイラミニダーゼに対応する抗原特性をもち、正確な作法で折り畳まれる組換えインフルエンザノイラミニダーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
このような実質的単離体である組換えノイラミニダーゼを、本発明にしたがって、
ａ)ノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し(ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョンが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している)；次いで
ｂ)培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することによって得ることができる。
培養培地に分泌される本発明の組換えノイラミニダーゼは、たとえば基礎的研究に用いることができ、そこでは、ワクチン中でのＮＡの役割を決定するために、ＮＡの単独のワクチン接種が行われる。しかし実際問題として、ワクチンによる防御の度合(感染に対して効果的に防御される接種集団のパーセンテージ)および防御の持続性(後期流行性株に対する防御)を増強するために、組換えＮＡをＨＡと組み合わせて使用することはまだないであろう。
【０００５】
さらに詳しくは、本発明は、宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、培養培地から発現産物であるノイラミニダーゼを単離することによって得られる組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを提供する。これには実際問題として、たとえば、ｐＡｃ２ＩＶＡｓからの組換え発現モジュールを、野生型バキュロウイルスまたはその誘導体に乗り換えさせる操作が必然的に伴う。次いで宿主細胞をこの組換えバキュロウイルスに感染させる。
組換えインフルエンザノイラミニダーゼの産生に用いる宿主細胞は、昆虫などの下等真核生物由来のもの、たとえば昆虫細胞系ｓｆ９が好ましいが、サッカロミセスまたはピチアなどの酵母細胞も使用しうる。
【０００６】
さらに本発明は、複製起点、膜アンカーをコードする領域を欠損したインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョン、コード領域の５'に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列、シグナル配列の５'に位置するプロモーターおよびコード領域の３'に位置する転写ターミネーターを含む、分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するための２種のベクターに関する。さらに詳しくは、本発明は、複製起点、膜アンカーをコードする領域を欠損したウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域、またはその修飾バージョンを含む、分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを発現するためのベクターを提供する。
【０００７】
昆虫細胞中で発現するには、このようなベクターを野生型バキュロウイルスまたはその誘導体とともに細胞中に入れる。組換えバキュロウイルスは、二重相同的組換えによって得られ、ここではベクターの発現モジュールがウイルスのゲノムに導入される。プラーク精製後、組換えバキュロウイルスのストックが得られ、続いて、それを用いてｓｆ９細胞などを感染させることができる。
【０００８】
シグナル配列は、インフルエンザＮＡ２ウイルス「Ａ／ビクトリア／３／７５」の血球凝集素遺伝子由来のものであるのが好ましい。本発明は、ベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ(ベルギー、ベー−９０００ゲント、カー・エ・レーデガンクストラート３５番、ラボラトリウム・ボーア・モレキュライル・ビーオロジー−プラシスデンコレクチエ(ＬＭＢＰ)に１９９４年１月３日に提出され、寄託番号はＬＭＢＰ２９７６である)を用いて、二重相同的組換え手段によって、たとえばバキュロウイルスなどのウイルスを形質転換するのが好ましい。ここでは、転写制御シグナル、シグナル配列およびコード領域からなるベクターの発現モジュールを、ウイルスのゲノムに組み入れる。
【０００９】
本発明の他の具体例においては、本発明にしたがって第２のベクターを使用する。このベクターは酵母中で使用されることを企図されており、たとえば複製起点、ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび柄部分をそれぞれコードする領域を欠損しているウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域、またはその修飾バージョン、コード領域の５'に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列、シグナル配列の５'に位置するプロモーターおよびコード領域の３'に位置する転写ターミネーターを含む。
【００１０】
プロモーターおよびターミネーター配列は相同的であり、メチロフィック酵母ピチア・パストリス由来であることが好ましく、アルコールオキシダーゼＩ遺伝子配列などが該当する。シグナル配列はたとえば、サッカロミセス・セレビシアエのプレプロ接合因子αの分泌シグナルである。
【００１１】
このベクターｐＰＰ１ＩＶＶＡｆｌｓはベルギー、ベー−９０００ゲント、カー・エ・レーデガンクストラート３５番、ラボラトリウム・ボーア・モレキュライル・ビーオロジー−プラシスデンコレクチエ(ＬＭＢＰ)に１９９５年１月３日に提出され、寄託番号はＬＭＢＰ３２２３である。
【００１２】
本発明の組換えノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルス、特にＮＡ２型のインフルエンザウイルスに対する防御免疫を産生することが可能であることが見いだされている。したがって、本発明はまた、組換えノイラミニダーゼを含むインフルエンザに対するワクチンに関する。
【００１３】
さらにまた本発明は、組換えノイラミニダーゼの製造方法および精製方法に関する。
【００１４】
本明細書および請求の範囲において語句「ＮＡｓ」は、分泌可能な(組換え)ノイラミニダーゼを意味する。「ｐＮＡ」は、プロナーゼで処理された天然のノイラミニダーゼを意味する。「ＮＡ」はノイラミニダーゼを意味する。
【００１５】
次に述べる実施例において本発明をさらに詳しく説明するが、この実施例は説明の手段としてのみ意図されたものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００１６】
実施例１
組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの発現、精製および特性付け
材料および方法
１.分泌されるノイラミニダーゼをコードする遺伝子の構築およびそのバキュロウイルス発現系への組込み
ａ.プラスミド プラスミドｐＶ６／２１は、１コピーのＡ／ビクトリア／３／７５(Ｈ３Ｎ２)インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子を含むｐＢＲ３２２の誘導体である(ヴァン・ロムプイら，１９８２)。ｐＳＶ５１およびｐＳＶ２３ｍとｐＳＶ２４ｍの両方は、それぞれ後期および初期ＳＶ４０置換ベクターであり、他の文献に記載されている(ヒュイルブレックら，１９８８)。ｐＳＲＳ−８は、Ａ／ビクトリア／３／７５(Ｈ３Ｎ２)の血球凝集素(ＨＡ)遺伝子の出発配列を含むｐＰＬａ２３１１に基づくプラスミドである(ヒュイルブレックら，１９８８)。バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ９４１が、ラッコウおよびサマーズによって設計された(１９８９)。
【００１７】
ｂ.ＨＡシグナルペプチド配列のサブクローニング(ｐＩＶ−プレＨＡ) １８３０ｂｐのｐＳＲＳ−８のＢｓｔＮＩフラグメントをクレノウ酵素で満たした。ＰｖｕＩＩリンカー(ＧＣＡＧＣＴＧＣ)を続いて配列した。得られるフラグメントおよびｐＢＲ３２２をＰｖｕＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、それぞれ７３１ｂｐおよび１６９９ｂｐのフラグメントを単離した。これらの２つのフラグメントを連結して、Ｇ-16(ＡＴＧ＝＋１，＋２，＋３)で出発するＨＡ遺伝子の５'非翻訳領域、次いで完全なＨＡシグナルペプチド配列および成熟ＨＡの最初の２，３個のコドンを含むｐＩＶプレＨＡを作成した。
【００１８】
ｃ.分泌されうるＮＡをコードするキメラ配列：ｐＡＴＩＶＮＡｓの構築 ｐＶ６／２１をＰｖｕＩで開環し、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼで処理した。この混合物にＨｉｎｄＩＩＩリンカーを連結し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで切断した。約１５００ｂｐのＮＡフラグメントを選択し、ｐＳＶ２３ｍの非反復ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位でクローニングした(ｐＳＶ２３ｍＩＶＮＡ)。左回りのインサートをもつプラスミドをＦｎｕｄＩＩおよびＳａｌＩで続いて切断し、膜アンカー配列の欠損したＮＡ遺伝子を含む１２９１ｂｐフラグメントを回収した。ｐＩＶプレＨＡをＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩとともにインキュベートし、ＨＡシグナル配列をもつ８６１ｂｐのフラグメントを保存した。ＰｖｕＩＩ／ＰｓｔＩブラント末端の連結によって、最終的に両方のフラグメントを結合し、ｐＡＴ１５３の２２５３ｂｐ−ＳａｌＩ／ＰｓｔＩフラグメントに挿入し、ｐＡＴＩＶＮＡｓを得た。このプラスミドは、成熟ＨＡの最初の２，３個のアミノ酸を含むＨＡのシグナルペプチド、すぐに続いてシグナルペプチド／膜アンカーを欠損したＮＡ配列および「柄」をコードする領域の一部をコードする配列を有している。ＨＡおよびＮＡフラグメントの連結によって、成熟ＨＡの５位に対応する単一のアミノ酸が置換された(ＧｌｙからＡｌａへ)。ミン・ジョウら(１９８８)およびバン・ロムプイら(１９８２)の文献に記載の情報に基づき、ＮＡｓ中の連結部位に隣接する予測されたＤＮＡおよびアミノ酸配列を図２に示す。
【００１９】
ｄ.バキュロウイルストランスファーベクターへのＮＡｓの組込み
ｐＡＴＩＶＮＡｓの１３６８ｂｐ−ＸｂａＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ｐＳＶ５１の５５６２ｂｐ−ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントおよびｐＳＶ２４ｍの６２４ｂｐ−ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメントに連結した。ＮＡｓ遺伝子を含む１６４７ｂｐ−ＢａｍＨＩフラグメントの１コピーおよびＳＶ４０ポリ(Ａ)部位を、ポリヘドリンプロモーターに対する正確な方向を考慮しながらｐＶＬ９４１の非反復制限部位へ続いて挿入し、ｐＡｃ２ＩＶＮＡｓを得た。この構築物はＳｆ９細胞の同時トランスフェクション後の野生型ＡｃＮＰＶのＤＮＡとの相同的組換えを可能にする。組換えウイルスの子孫は、サマーズおよびスミス(１９８７)に記載されている連続的プラーク精製操作によって単離した。
【００２０】
２.昆虫細胞培養−ＮＡｓの産生
ルーチン培養のために、昆虫細胞Ｓｆ９を、１０％ウシ胎児血清および５０μg／mlのゲンタマイシンを含むＴＣ１００培地中で集密的細胞単層として維持した。組換えバキュロウイルスに感染させるために、８５０cm2の回転ビン内に培養物を移し、２５rpmで回転して懸濁液２００ml中で成長させた。次いで、対数増殖期の終わりに、懸濁細胞(２x１０6細胞／ml)を組換えバキュロウイルスに１.０モイ(ｍｏｉ：感染多重度)で感染させた。２時間後、感染細胞を新鮮な血清フリーのＴＣ１００培地に移し、懸濁液をさらに４８時間インキュベートした。下記のとおり、ＮＡｓを培地から精製した。
【００２１】
３.インフルエンザＸ−４７ウイルスの成長
Ａ／ビクトリア／３／７５の天然のＮＡの製造源として、インフルエンザ株Ｘ−４７をプロナーゼで処理した後に用いた。Ｘ−４７ウイルスは、１１日齢の胚の入ったニワトリの卵の卵黄嚢空隙中で培養した。２５.５℃で２日間インキュベートした後、卵を４℃で一夜冷却し、次の処理に用いるため卵黄嚢液を採集した。
【００２２】
４.緩衝液系
通例、次の緩衝液を用いた：緩衝液Ａ：２０mM ジエタノールアミン/ＨＣｌ,ｐＨ８.５；
緩衝液Ｂ：５０mM ＮａＡｃ,ｐＨ５.５；
緩衝液Ｃ：１０mM ＮａＰ,ｐＨ７.４，１５０mMＮａＣｌ；
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｃは、さらに４％ブタノール(他に特別に指示がない限り)および２mM ＣａＣｌ2を含む。
【００２３】
５.ＮＡｓの精製
ａ.硫酸アンモニウム分画
植え付け(上記参照)後、Ｓｆ９懸濁培養物(通例、約１リットル)を採集し、４０００xｇで１５分間遠心分離を行って細胞レムナントを沈降させた。すべての処理は４℃で行った。最初の精製段階においては、溶液に５mM ＮＡＮ3を加える。透明になった粗培地をｐＨ７.５にて硫酸アンモニウム分画に付した。２０％から６０％の(ＮＨ4)2ＳＯ4で沈殿した物質を遠心分離(１００００xｇ，６０分)によって集め、緩衝液Ａ(ブタノールなし)＋２０mM ＮａＣｌに、出発体積の１／１０の量にて溶解した。再溶解した沈殿物を同緩衝液５０体積に対して２４時間透析(ｍｗｃｏ「モレキュラー・ウエイト・カット−オフ」)した。ここでは、緩衝液を３回連続的に交換した。２００００xｇで１５分間遠心分離して不溶成分を除去した。
【００２４】
ｂ.セファロースＱ−アニオン交換クロマトグラフィー
透析した溶液に先ず４％ブタノールを加え、続いて緩衝液Ａ＋２０mM ＮａＣｌを流速２５ml／時間で通して平衡化したセファロースＱ−カラム(２.５cmx１０cm)に流した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、洗浄緩衝液から２５０mMまでのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶離を行った(２５０ml，２５ml/時間)。ＮＡｓを含む各２.５mlのフラクションを酵素活性およびＥＬＩＳＡレベルを測定することによって同定した。ＮＡ活性は単一ピークとしてカラムから溶出した。
【００２５】
ｃ.Ｎ−(ｐ−アミノフェニル)オキサム酸アガロースアフィニティークロマトグラフィー
(非組換え)インフルエンザＮＡおよびバクテリアＮＡ酵素の精製のためのこのアフィニティーマトリックスの使用が文献に記載されている(カトルカサスおよびイリアーノ，１９７１；ブッチャー，１９７７)。アフィニティーマトリックスの正確な分画は、初めに推奨された緩衝液条件を適用した場合にのみ達成された。セファロースＱによる分離後に活性画分を集め、等量の２００mM ＮａＡｃ，ｐＨ５.５を加えた。続いて、該活性画分を、緩衝液Ｂと１００mM ＮａＣｌで平衡化したＮ−(ｐ−アミノフェニル)オキサム酸アガロースカラム(１.５x５cm)に通した。続いて、平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、緩衝液Ｂで脱塩した。次いで、緩衝液Ａで第２の洗浄段階を行った。最後に、１Ｍ ＮａＣｌを加えた緩衝液Ａを用い、流速１０ml／時間でＮＡｓを溶出した(２mlの画分を集めた)。
【００２６】
ｄ.スーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィー
Ｃentriprep(登録商標)濃縮機(アミコン；ｍｗｃｏ：３０ｋｄ)を用いてアフィニティーカラムの溶出物を２.０mlに濃縮した。次いで、濃縮物を体積１.０mlのサンプル画分にて、緩衝液Ｃおよび４％ブタノールで平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム(１.５cmx６０cm)を用いるクロマトグラフィーに付した。流速１０ml／時間にてカラムを平衡化緩衝液で溶離し、１.０mlの画分を集めた。長期貯蔵するために、−２０℃で関連画分を集め、前述のように濃縮し、続いて最終濃度が５０％になるまでグリセロールを加えた。
【００２７】
精製タンパク質の分子量を評価するために、ウマの脾臓から得たアポフェリチン(４４３ｋｄ)、サツマイモから得たβ−アミラーゼ(２００ｋｄ)、酵母から得たアルコール脱水素酵素(１５０ｋｄ)、ウシ血清アルブミン(６７ｋｄ)および炭酸デヒドラーゼ(２９ｋｄ)でゲル濾過カラムを測定した(すべてシグマ・ケミカル・コーポレイションから入手)。
【００２８】
６.ｐＮＡの製造および精製
ａ.プロナーゼ処理
Ｘ−４７に感染した鶏卵の卵黄嚢液をまず低速(１０００xｇ，１０分)で遠心分離して透明化し、次いで１３０００xｇで１６時間遠心分離してウイルスを沈降させた。ウイルス沈降物を１００感染卵等価物当たり１０mlの緩衝液Ｃに再懸濁し、ウイルスをこれ以上精製をすることなく、２mg/mlまでのプロナーゼを加えた。軽く振とうしながら、混合物を２０℃で１６時間インキュベートした。続いて、残りのウイルスコアおよび不溶のプロナーゼ成分を４℃にて超遠心分離(１０００００xｇ，１時間)によって除去した。次いで、放出されたＮＡ頭部を含上清をカラムクロマトグラフィーにて精製した。
【００２９】
ｂ.セファロースＳ−カチオン交換クロマトグラフィー
クロマトグラフィー操作は、４℃にて行った。粗ｐＮＡサンプルを５倍に希釈し、５０mM ＮａＡＣ，ｐＨ５.５、２mM ＣａＣｌ2および１％ブタノールを加えた。次いで、溶液を緩衝液Ｂ＋１％ブタノールおよび５０mM ＮａＣｌで平衡化したセファロースＳカラム(１.５cmx１０cm)に流す。同じ緩衝液から５００mM ＮａＣｌまで直線勾配を用いて結合した物質を溶離した。ピークの酵素活性を示す画分を集め、Ｃentriprep(登録商標)濃縮機(アミコン；ｍｗｃｏ：３０ｋｄ)を用いて２.０mlに濃縮した。
【００３０】
ｄ.スーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィー
ＮＡｓの場合と同様にしてスーパーデックス２００ゲル濾過を行った(ブタノール濃度が１％である以外)。純ｐＮＡを５０％グリセロール中に−２０℃で貯蔵した。
【００３１】
７.ＮＡ酵素アッセイ
ポティアら(１９７９)の方法に基づいて、ＮＡの触媒活性のアッセイを行った。簡単に述べると、１００μlの反応体積にて、基質として１mMの２'−(４−メチルウンベリフェリル)−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の存在下、−２００mM ＮａＡＣ，ｐＨ６.５、２mM ＣａＣｌ2および１％ブタノールを用いて酵素試験を行った。３７℃で３０〜６０分間インキュベートした後、０.５mlの１３３mMグリシン、８３mMのＮａＨＣＯ3、６０mM ＮａＣｌ,pＨ１０.７を加えて反応を停止した。３６５ｎｍの吸光度を測定することによって、遊離の４−メチルウンベリフェロンを測定した。１ユニットは、１分間に１モルの４−メチルウンベリフェロンを放出する酵素量として定義した。
【００３２】
８.免疫学的技術
ａ.ポリクローナル抗ｐＮＡＩｇＧの製造
精製ｐＮＡに対するポリクローナル抗血清をニュージーランド系の３カ月齢のウサギで作製した。一次免疫感作は、それぞれ投与量当たり５０μgのｐＮＡと７５％のフロイントアジュバントを含む５００μlを四肢に筋肉内投与して行った。６週間後、動物は２つの対応する二次免疫注射を後肢に受けた。ＩｇＧ画分を製造するために、タンパク質Ａセファロース(ファルマシアＬＫＢ)に吸着させることによって集めた血清を精製した。
【００３３】
ｂ.ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートにウサギの抗ｐＮＡＩｇＧを塗布した。試験するサンプルを０.１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで希釈した。ウサギのビオチン化抗ｐＮＡＩｇＧ、次いでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体(ベーリンガー)を用いて結合した抗原を検出した。該プレートをｐ−ニトロフェニルホスフェート(シグマ・ケミカル・コーポレイション)とともにインキュベートして酵素反応を促進した。マイクロタイタープレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３４】
９.分析方法
レムリ法(１９７０)に従い、１０％分離ゲル上でＳＤＳ／ＰＡＧＥを行った(他に特記したもの以外は)。他に特記したもの以外は、β−メルカプトエタノールの存在下に全サンプルを変性した。１０％ゲル中で、マーカータンパク質として、ホスホリラーゼｂ(９４ｋｄ)、ウシ血清アルブミン(６７ｋｄ)、卵白アルブミン(４３ｋｄ)、炭酸脱水素酵素(２９ｋｄ)およびトリプシンインヒビター(２０.１ｋｄ、常に可視ではない)(ファルマシア)を用いた。勾配ゲルに次の質量標準を展開した：ミオシン(２２ｋｄ)、β−ガラクトシダーゼ(１１６ｋｄ)、ホスホリラーゼｂ、ウシ血清アルブミンおよび卵白アルブミン(バイオラド）。モリシー(１９８１)に記載の方法の変更法によってゲル上で銀着色を行った。ブラッドフォード(１９７６)の方法により、ニワトリの卵白アルブミンを標準としてタンパク質濃度を定量した。
【００３５】
１０.架橋分析
１０mM Ｈｅｐｅｓ中の１.０Ｍ溶液(ｐＨ７)として、架橋分子ＢＳ3を新たに調製した。濃度０.５mMのＢＳ3を、反応量３０μlにて加え、タンパク質を架橋した。室温にて１時間インキュベートした。続いて、５μlの１.０Ｍトリス(ｐＨ８.０)を加えて反応を停止した。ポリペプチドのパターンをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。
【００３６】
１１.糖質分析
タンパク質サンプル(０.１μg〜１μg)を５００mMトリス／ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、５％ＳＤＳ、５０mMβ−メルカプトエタノール中で煮沸して変性した。最終ＳＤＳ濃度の少なくとも７倍過剰となるように２.５％のＮＡ−オクチルグルコシドを加えた後、ＮＡ−グリカナーゼを加え(約０.５ユニット；製造者によるユニット)、反応混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。消化パターンをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。
【００３７】
結果
１.ｐＮＡの精製
ここに記載した実験においては、合計１８６個の感染卵を処理した。異なる精製段階とその結果を表１にまとめた。卵黄嚢液およびウイルスの沈積物を収穫し、プロナーゼを濃度２mg/mlで加え、混合物を２０℃で１６時間インキュベートした。超遠心分離後、上清におよそ６０％のＮＡ活性が見られた。この条件下では、活性の損失の主たる原因は、ウイルス粒子のＮＡ頭部の除去が不完全なことであることがわかった。プロナーゼ濃度を高くすること、インキュベーション時間を長くすること、またはインキュベーション温度を上げることは、ＮＡが徐々に失活するのが促進されるため、これらによって収量が増加することはなかった(データは示さず)。続いて、粗ｐＮＡ物質を希釈し、ｐＨ５.５にした。次いで、セファロースＳ−カチオン交換を行った。ｐＮＡを最大収量で得るために、すべての溶液に１％ブタノールを加えた。ほとんどのタンパク質は、セファロースＳカラムにしっかりとは固定されず、勾配溶離において、ＮａＣｌが４００mMの時点において、ひとつのピークが記録されただけであった(示さず)。ＳＤＳ／ＰＡＧＥにおいてコンタミネーションバンドが観察されなかったので、この物質は、実質的に純粋なＮＡであった(図３Ａ、レーン３)。さらに、銀着色では、セファロースＳプールとセファデックス２００ゲル濾過工程の間に少しも差異がなかった(図３Ａ、レーン３と４を比較せよ)。最後のカラムでは、画分６０において分子量２１０ｋｄに対応する単一の鈴形状のピークが得られた(示さず)。連続精製工程を図３Ａに示す。
【００３８】
ＳＤＳ／ＰＡＧＥでは、それぞれ約５４ｋｄと約５２ｋｄに対応する２本のバンドとしてｐＮＡを実際に目視することができた。ここで後者は、銀着色の相対的強度から判るように、最も頻繁に現れるものであった。おそらく、この２つは、柄領域の異なる２カ所の部位でプロナーゼによる好適な切断を受けたことから誘導されたものである。化学製剤ＢＳ3との架橋から、ｐＮＡが真正の四量体タンパク質として回収されることが確認された(図３Ｂ)。
【００３９】
２.ＮＡｓの構築および発現
インフルエンザＮＡ２株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のＮＡ遺伝子を、そのＮＡ末端膜アンカーから分離し、代わりにシグナルペプチドスプライシング部位を含むＡ／ビクトリア／３／７５ＨＡ遺伝子の５'配列に結合した。これによって、分泌可能で可溶性産物の合成が可能になった。得られるキメラ遺伝子は、成熟ＨＡの最初の４個の末端アミノ酸のコドンを含むＨＡシグナル配列、すぐに続いて膜通過部分(アンカー)および柄領域の一部(アミノ酸１〜４５)を欠損したＮＡ配列からなる。両方のＤＮＡ配列は、同じ読み取り枠内にあり、余分のアミノ酸は導入されなかった。連結の結果として、成熟ＨＡタンパク質の５位に対応するただひとつのアミノ酸置換が行われた(図２)。ｐＶＬ９４１を移入ベクターとして用いて、このキメラ配列の１個のコピーをＡｃＮＰＶバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターの後に組み込んだ。Ｓｆ９昆虫細胞の植え付け後、可溶性タンパク質が実際に産生されたことを示すＮＡ活性を培地中で迅速に検出した。感染後およそ４８時間で培地中のＮＡｓ活性がプラトーレベルに達したことを図４に見ることができる。さらにインキュベーションを行うと、おそらく細胞溶解が拡大する結果と考えられるが、総タンパク質濃度が劇的に低下しはじめるので、よい結果を生まなかった。親Ｓｆ９単層と広範囲の懸濁培養物間の中間の運搬が最小に制限される場合に、発現が最も盛んであるらしいことが見出された(データ示さず)。種々の精製実験に基づき、ＮＡｓは６〜８mg/lで変化する濃度および適度に低い産生能力で発現されるが、なおしかし、他の分泌される複合体糖タンパク質について報告された収量(ジャービスら，１９９０)と比較可能なレベルであることを決定した。
【００４０】
３.ＮＡｓの精製
ＴＣ１００培地を、可溶性タンパク質内容物の特異的酵素活性がピークに達する感染の４８時間後に収穫した(図４)。ＮＡｓ精製の種々の工程を表１にまとめた。粗培地に対し、２０％〜６０％飽和硫酸アンモニウム沈殿法を行うと、適度に２倍の濃度の増加が得られ、物質の濃縮を行うことができた。大規模な透析および不溶生成物の除去を行った後、４％ブタノールを加えた。ブタノールを添加することが、ＮＡｓの収量の増加に非常に有利な影響があり、特にタンパク質濃度が低い場合に効果的であることが見出された。培地の疎水性の程度を限定することが、不溶性凝集物の形成を避けるのに必要であることも考慮しうることである。続いて、溶液をセファロースＱ−アニオン交換クロマトグラフィーによって分画した(図５)。塩勾配の開始時に適度に対称的なピークでＮＡ活性が溶出した。ＥＬＩＳＡ試験より、残りの画分にはＮＡ関連物質が含まれないことがわかった。この時点で、出発時のタンパク質の量のおよそ９７.５％が除去され、ほぼ２０の要因によって特異的活性が増加した。次いで、Ｎ−(ｐ−アミノフェニル)オキサム酸アガロースカラムに通すために、溶液のｐＨを５.５まで下げた。初期の実験から、ＮＡ置換オキサム酸が、インフルエンザＮＡの強い可逆的インヒビターであることが知られている(エドモンド，１９６６)。インフルエンザウイルスまたはバクテリアのノイラミニダーゼに対する選択的吸収体としてＮ−(ｐ−アミノフェニル)オキサム酸アガロースを使用することは、最初にカトルカサスおよびイリアーノ(１９７１)によって、後にブッチャー(１９７７)によって証明された。最初の操作にしたがって、高ｐＨの緩衝液(１００mM ＮａＨＣＯ3，ｐＨ９.１)でノイラミニダーゼを溶離した。しかし、我々の実験では、これらの条件では、ＮＡｓの溶出は不完全で、遅い結果しか得られなかった。しかし、ｐＨを高め、かつ塩濃度を高めることによって、効果的な放出が達成できた。溶出に先立って、低濃度の塩の存在下、ｐＨ８.５で追加の洗浄工程を行うことによって、多量の非特異的に結合したタンパク質をカラムから除去した。緩衝剤としてＮａＨＣＯ3よりもジエタノールアミンの方を選ぶことによって、沈殿することなく２mM ＣａＣｌ2を吸収することが可能になった。ＮＡ活性の保持力が、Ｃａ++イオンに幾分左右されることが繰り返し報告されている(チョンら，１９６６；ヂモック，１９７１)。このことが本実験に相当するかどうかは詳細に調査しなかった。
【００４１】
痕跡量の残留混濁物を除去するために、溶出液を限外濾過によって濃縮し、スーパーデックス２００ゲル濾過に付す(図６）。Ａ280測定では、それぞれ約２００ｋｄ、約１３０ｋｄおよび約５４ｋｄにおいて溶出した吸光度の異なる３つのピークが生じた。ＥＬＩＳＡ法によって測定された溶出液の免疫反応性パターンは、記録された３つの各ピークのＡ280プロフィールを正確に表現していることがわかったが、これはすべての物質がＮＡｓ特異的であることを示唆している。
【００４２】
ピーク画分のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析では、分子量の僅かな減少および画分数の増加が認められたが、予測した領域である約５５ｋｄに強いバンドが現れた。(図７)。ＢＳ3を用いた架橋分析によって２２０ｋｄピークは四量体のＮＡｓであると同定された。一方、分子サイズが小さい方の２つのピークは、それぞれ二量体および単量体のＮＡｓであることがわかった。ただし、ここで後者の形体は定量的重要性に限定される(図７Ｂ)。球形体をもつと考えられる四量体や単量体ＮＡｓとは異なり、二量体ＮＡｓは、その棒様の構造のために、その現実の分子量よりも僅かに上で溶出すると考えられる。より注目すべき事は、完全に組み立てられた四量体構造のＮＡｓしか触媒活性を示さないことであった。四量体形状は、酵素活性に必須とされる色々な局在的コンホメーション変化を引き出すことが可能である。精製過程の工程表を表２に示す。
【００４３】
４.ＮＡｓの特性
ＮＡｓをβ−メルカプトエタノールの存在下にＳＤＳと煮沸して変性すると、ＮＡｓは完全解離して分子量約５５ｋｄの単量体鎖になった。ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルの銀着色により四量体および二量体ＮＡｓは、均質に精製されることがわかった。単量体ＮＡｓについては、痕跡量の混濁物が目視されるので、僅かに質の低いものであった。還元剤のない条件下で変性を行うと、四量体および二量体ＮＡｓは、約１１０ｋｄの二量体鎖として移動した(示さず)。これらの結果から、ＮＡｓ二量体はジスルフィド架橋により内部で結合しており、さらに非共有結合的相互作用を介して会合することができ、それによって、天然のＮＡの構造に対応する四量体タンパク質が形成されることが示された。
【００４４】
昆虫細胞が、哺乳類および他の高等細胞のＮＡグリコシル化パターンとは幾らか異なるパターンを生み出すことが繰り返し報告されている(ヒシアおよびロビンス，１９８４；バターおよびヒュー，１９８１；バターら，１９８１；クロダら，１９９０)。したがって、組換えＮＡｓと会合したＮＡ結合糖質の量が、天然のｐＮＡと比較して調査された。代表的なタンパク質サンプルをＮＡグリカナーゼ酵素で処理し、続いてＳＤＳ／ＰＡＧＥ法で分析した(図９)。バンドが相対的に置き換わっていることから、ＮＡｓと会合したＮＡ結合糖質の合計量は、天然の分子と比べて僅かに少ないと結論付けることができる(図９Ａと図９Ｂを比較せよ)；この系で発現する他の糖タンパク質に対して行われた結果と一致する知見である(クロダら，１９８６；ドミンゴおよびトロウブリッジ，１９８８；ヴァン・ドルネン・リッテルら，１９９１)。変性、酵素的脱グリコシルＮＡｓ体が、そのオリジナルのオリゴマー構造にかかわらず、同じ電気泳動的挙動で移動することも確立され、このことから、一次ＮＡｓが一様な鎖長のポリペプチドとして合成されたことが確認される(図９Ｂ、レーン３，５および９を比較せよ)。ＮＡグリカナーゼで処理されたポリペプチド鎖の分子量は、４７.５ｋｄと見積もられ、これは予測されるアミノ酸配列から計算された理論的分子量４７，７１７ｄに一致する。十分興味深いことに、グリコシル化二量体および単量体ＮＡｓと一致するバンドはゲル内で、グリコシル化四量体ＮＡｓから誘導されたバンドよりもやや急速に移動するので、ＮＡグリコシル化の度合は、四量体を形成する能力と関係しているように思われた(図９Ｂ、レーン２に対してレーン４および６；図７Ａも参照せよ)。ＮＡ結合糖質、さらに詳しくはＡｓｎ200に結合するオリゴ糖質鎖が、隣接するサブユニットとの相互作用に介入することによって四量体構造の安定化に一部役割を担うことができるということが示唆されている(バルゲーゼら，１９８３；バルゲーゼおよびコールマン，１９９１)。
【００４５】
四量体タンパク質のみがＮＡｓの触媒特性を有した。単離された四量体ＮＡｓは、ほとんど精製ｐＮＡと同一の特異的活性レベルを呈した(表１および表２)。
【００４６】
各単量体は触媒部位を有しているが、低次構造のＮＡｓ体が酵素活性をもたないという知見は、おそらくインフルエンザＮＡの機能性における四次相互作用にとっての重大な役割を反映している。
【００４７】
ＮＡｓの抗原特性を確かめるために、等しい濃度のタンパク質サンプルを作り、続いて２倍希釈し、ポリクローナル抗ｐＮＡＩｇＧに基づくサンドイッチＥＬＩＳＡで試験した(図１０)。四量体ＮＡｓでは、ｐＮＡの参考グラフと同様の滴定曲線が得られたが、これは、両方が同一かまたは非常によく似た抗原特性をもつことを示している。抗原性に小さなシフトが認められるけれども、論証できるような酵素活性がないにもかかわらず、二量体および単量体ＮＡｓの抗原活性は実質的にそのまま残っていた。抗原性におけるこの小さな差異は、抗原活性／Ａ280比が僅かに上回っている四量体ピークのゲル濾過プロフィールから同様に明らかであった(図６)。天然の四量体構造に対して産生された多数の抗体分子は、不完全に組み立てられたＮＡｓに効率的に結合すること、たとえば隣接するサブユニット間の接触領域を認識することが不可能であったということも有り得る。四量体フォーメーションによって誘発される局部的な変化もまた、多数の微細な抗原差異を引き起こす。
【００４８】
論考
本発明の主たる目的は、分泌され、正確に折り畳まれたタンパク質としてのインフルエンザノイラミニダーゼの合成、およびワクチン用剤として使用しうる均質な生成物を得るための精製操作の決定であった。ＮＡ２インフルエンザウイルス株Ａ／ビクトリア／３／７５のＮＡ遺伝子から、シグナル配列(膜アンカー機能)を有する元のＮＡ末端領域が、インフルエンザＨＡ遺伝子の５’配列の一部と置き換えられたキメラ遺伝子を構築した。続いて、ＨＡから誘導された切断可能なシグナルペプチドにより実質的に分泌可能なＮＡ(ＮＡｓ)をコードする、得られる構築物を、強力なポリヘドリンプロモーターの転写調節下にバキュロウイルス発現ベクターに組み込んだ。宿主昆虫細胞Ｓｆ９の感染後、培養培地中にＮＡｓが分泌された。精製結果に基づいて、６〜８mg/lの範囲で発現のレベルを評価した。バキュロウイルスに感染している間に、分泌による宿主細胞のタンパク質切断能力が劇的に減少することが論証された(ジャービスおよびサマーズ，１９８９)。それにもかかわらず、記載された産生系は実験室スケールの予防接種の研究に適用可能であり、相当なスケールアップにも好適である。
【００４９】
ＮＡｓの精製は、第１の硫酸アンモニウム分画段階、それに続く３種のクロマトグラフィー段階を含む実質的に４段階の操作からなった。酵素活性の獲得については、精製タンパク質としておよそ２５％のＮＡｓが回収されることを評価した。ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより、ＮＡｓを予分別して、架橋分析によりそれぞれ四量体、二量体および単量体ＮＡｓ(ここで後者はほんの少量しか存在しない)として同定される分子サイズの異なる３つの集団に分けた。主要な２つの形体、四量体および二量体ＮＡｓは、約等量で得られ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび銀着色で審査したところ均質であった。
【００５０】
ＮＡｓの酵素および免疫特性を評価するために、比較対称タンパク質として天然のＮＡを単離することが必要であった。Ｘ−４７ウイルスのＡ／ビクトリア／３／７５ＮＡの頭部をプロナーゼ処理により切断し、次いでカチオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。架橋後、ｐＮＡが完全な膜結合ＮＡの四量体構造を保持していることを確認した。
【００５１】
ＮＡｓの触媒特性は、四量体タンパク質のみが酵素活性を呈するという非常に変わったものであった。四量体ＮＡｓは、ほどんどｐＮＡに相当する特異的活性を有した。二量体および単量体ＮＡｓが変性タンパク質であるという理由で単純に不活性であったというのは可能性が低いことである。なぜなら、精製操作中これらの形体もまた、基質結合部位に基づくアフィニティークロマトグラフィーによってしっかりと補足されたからである。これは、酵素の触媒部位は機能的に完全にちがいないが、次に続く触媒への移行が明らかにできないことを示唆している。
【００５２】
ＮＡグリカナーゼ処理により、概してＮＡｓの糖質含量がｐＮＡの糖質含量と比べて僅かに低いこと示されたが、これはこの系で発現する他の糖タンパク質においても認められることであった(クロダら，１９８６；ドミンゴおよびトロウブリッジ，１９８８；バン・ドルネン・リッテルら，１９９１)。ハイポグリコシル化は、二量体および単量体ＮＡｓにおいて明らかに、より顕著であった。Ｘ線回折分析による構造の研究から、Ａｓｎ200に結合した糖質鎖が隣接するサブユニットの接触をより接近したものにすることが示されたが、これは、その鎖が、四量体構造を強化するためのさらなる相互作用を提供したことを示唆している(バルゲーゼら，１９８３；バルゲーゼおよびコールマン，１９９１)。
【００５３】
精製ｐＮＡに対して産生されたポリクローナルＩｇＧとの四量体ＮＡｓの反応性は実質的に完全であったが、これは、両方のタンパク質が非常に類似した抗原特性をもつことを示している。二量体および単量体ＮＡｓの場合に抗原性の小さいシフトを認めることは可能であった。これまでに述べてきたことから、四量体構造のインフルエンザＮＡのみに結合するモノクローナル抗体を単離することが可能であると推論することができた。このような抗体は、おそらく隣接するサブユニットから誘導された表面の抗原決定基との相互作用に入るか、あるいは別の考え方として、四量体形成中のコンホメーション再構成後に形成されたエピトープを認識する。さらに、糖質組成における差異もまた抗原特性を変更する。
【００５４】
実施例２
ピチア・パストリスによる組換えノイラミニダーゼの分泌
序論
昆虫細胞に加えて、酵母が組換えインフルエンザノイラミニダーゼ産生用の宿主細胞として使用しうるかどうかを判定するために、ノイラミニダーゼの酵素的「帽子」部位を含む発現ベクターを構築した。
【００５５】
材料および方法
１.ベクターおよび宿主
ピチア・パストリスのプラスミドｐＰＩＣ９（インビトロゲン製）を用いて発現カセットを構築した。このプラスミドは、ピチア・パストリスの誘導可能なアスコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸＩ）遺伝子の複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、プロモーターおよびターミネーター領域、サッカロミセス・セレビシアエのα因子のプレプロ分泌シグナル、ならびにピチア・パストリスのＨＩＳ４マーカーを含む。宿主としては、メチロトロフィックな酵母菌ピチア・パストリス（インビトロゲン）を用いた。
【００５６】
２.発現カセットの構築
部位特異的突然変異誘発法によって、Ａ／ビクトリア／３／７５のノイラミニダーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列にＳｔｕＩ制限部位を導入した。制限部位の位置はＰｒｏ７９とした。この制限部位を用いて、酵素的活性中心を含むノイラミニダーゼ遺伝子の免疫原性「帽子配列」を、ＳｔｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として単離し、ピチア・パストリスのプラスミドｐＰＩＣ９のＳｎａＢＩ制限部位にクローニングすることができた。図１５はｐＰＩＣ９プラスミドの模式図を示す。図１６はプレプロシグナル配列と組換えノイラミニダーゼの融合領域である。プロペプチドは外来性のＫＥＸ２プロテアーゼによって後期ゴルジ体内で切断される。（Ｇｌｕ−Ａｌａ）2ジペプチドはＳＴＥ１３型のジペプチジルアミノペプチドによって除去される。外側のチロシン残基は切断されず、組換えノイラミニダーゼ上でＮ末端に残るが、これは不必要である。
【００５７】
ＳａｌＩ切断法によってＨＩＳ４選択マーカーの位置で得れらるプラスミドを直線化し、続いてポリエチレングリコールの存在下にピチア・パストリスのＧＴＳ１１５（his４）原形質体に形質転換した。形質転換体から単離されたＤＮＡをサザン分析に付した。この分析により、内部（しかし欠失あり）his４座の位置に相同的組換えを介して組み込まれた発現ベクターが示された。大部分の形質転換体は１〜２コピーのプラスミドを有しているが、高度分泌能力をもつ形質転換体は、タンデム構造で宿主ゲノムに全体を組み込まれた複数コピーのプラスミドを持つことがわかった。該コピーの数は形質転換体当たり２５に達していた。
【００５８】
３.ノイラミニダーゼの発現
最小グリセロール緩衝培地（ｐＨ６．０）中で形質転換体を予備成長させ、４８時間後に、０．５％メタノールを含む最小緩衝培地に移した。この結果、アルコールオキシダーゼＩプロモーターが誘導され、ノイラミニダーゼの「帽子」が発現した。公知のノーザン分析法を用いて、細胞中のノイラミニダーゼのｍＲＮＡ量を評価した。この結果、非常に効果的に誘導がなされたことがわかった。
【００５９】
細胞上清のウエスタン分析から、分子量約７０ｋＤａの組換えノイラミニダーゼが分泌されたことがわかった（図１７参照）。
【００６０】
ＰＮＧアーゼＦを用いて分泌産物を脱グリコシル化した。これによって、予測された４３ｋＤａという大きさの「コア」産物が産生された。コピー数に応じて培地中の組換えノイラミニダーゼの収量が１〜１．５mg/リットルの間で変動することがわかった。
【００６１】
実施例３
材料および方法
１．実験動物
免疫感作開始時に８週齢の雌性同系繁殖系Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＳＣＫ Ｍol、ベルギー）を用いた。受動免疫感作実験において、被検マウスは１２週齢であった。１ケージ（４１０cm2）あたり３匹のグループに分け、食餌と水を任意に与えた。
【００６２】
２．ウイルス
インフルエンザ株は、Ａ．ダグラス博士およびＪ．スケール博士から入手した（ＭＣＲ・ラボラトリーズ、ミル・ヒル、ロンドン）。実験用ウイルスＸ−３１およびＸ−４７はＨ３Ｎ２抗原組成物を含み、該組成物は、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を遺伝子的に再編成することにより、それぞれＡ／アイチ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）として誘導される。両方のウイルスのストックを、マウスが死亡する程度に肺を通して何回も注入することによって順応させた。
【００６３】
３．組換え分泌可能ＮＡ（ＮＡｓ）
インフルエンザＮＡ Ａ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）を、実施例１で記載したバキュロウイルス昆虫細胞発現系で産生された精製組換えタンパク質として投与した。ここで記載する免疫感作実験で使用する精製ＮＡｓ票品には、リン酸緩衝塩溶液として四量体と二量体分子の混合物が含まれていた。
【００６４】
４．アジュバント
我々自身の実験室で行った組換えインフルエンザＨＡの免疫感作研究に基づいて、適当なアジュバントを選んだ。Ｒｉｂｉアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、トレハロース−６，６−ジミコレート（ＴＤＭ）、スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０を含む）とサルモネラ・チフィムリウムＭＰＬＡの入ったビンを製造者の指示書（Ｒｉｂｉイムノケム・リサーチ）にしたがって満たした。ムラミル・ジペプチド（ＭＤＰ）はシグマ・ケミカル・コーポレイションから購入した。
【００６５】
５．免疫感作プロトコル
１μｇのＮＡｓを２００μlの用量で３回、３週間間隔で皮下注射にてマウスに投与した。最初の免疫感作では、通常マウスに用いるＲｉｂｉ用量の半分量中（２５μｇのＭＰＬＡ、２５μｇのＴＤＭ、２μlのスクアレンおよび０．１％のＴｗｅｅｎ８０に相当）に、ＮＡｓを乳剤化した。２５μｇのＭＰＬＡと２５μｇのＭＤＰをＮＡｓに加えてブースター注射を行った。対照動物にはアジュバントのＰＢＳ溶液を投与した。
【００６６】
６．受動免疫感作
３回目の免疫感作後３週間目に、心臓穿刺によってドナーマウスから採血し、同様に処理されたマウスの血清標品を集めた。被検マウスに４００μlの免疫または対照血清を１回投与の腹腔内注射を行った。
【００６７】
７．インフルエンザチャレンジ
ブースター注射後３週間目または受動免疫感作後１日目、軽度にエーテル麻酔したマウスに、２０ＬＤ50の即位的ウイルスを鼻孔内接種した。次いで、接種後１０日間の直腸の温度と体重を測定することによって、感染の進行の程度を追跡した。
【００６８】
８．血清学的方法
ワクチン接種開始前１日（免疫前血清）および各免疫感作後２週間目の血液サンプルを尾部動脈から採血した。ＥＬＩＳＡ法により、ＮＡ特異的抗体について個々の血清サンプルを試験した。マイクロタイタープレート（Nunc Maxisorp）に精製ＮＡｓを塗布し（５０ng/ウエル）、血清を５倍に希釈した。アルカリホスファターゼ（シグマ・ケミカル・コーポレイション）と複合したウサギの抗（マウスＩｇＧ）抗体を加え、次いでｐ−ニトロフェノール基質溶液（シグマ・ケミカル・コーポレイション）をプレートに加えてインキュベートすることによって特異的抗体の結合を定量した。マイクロタイタープレートリーダーにて４０５nmにおけるＯＤ値を測定した。対照ウエル（免疫前血清で処理）よりも０．５高い吸光度が得られるｌｏｇ5血清希釈の逆数としてＮＡ抗体の力価を表した。
【００６９】
結果
１．実験設計
上記免疫感作プロトコルに従い、１グループ１２匹のマウスのグループ３つに、ＮＡｓのワクチン接種を行った。同数の対照マウスを平行してＰＢＳで処理した。続いて、ワクチン接種マウスと対照マウスからなる対のグループをマウス順応Ｘ−４７またはＸ−３１にチャレンジさせた。一方、該対グループを受動免疫感作実験の血清ドナーとした。
【００７０】
２．血清応答
各ケージから１匹ずつ取り出した、１２匹のワクチン接種動物と１２匹の対照動物からランダムに選択した血清で行うＥＬＩＳＡによってＮＡｓに対する抗体応答を追跡した。マウスにおいてＮＡｓ免疫感作を行うと、血清中のＮＡｓ抗体が著しく増加した。最初のブースター注射は、およそｌｏｇ5量の３倍のＮＡｓ抗体を増加したが、第２のブースター注射ではＮＡｓ抗体の力価がさらにまた約５倍の増加を示した。対照マウスにおいては、アジュバントの１回投与では、ＮＡｓと反応する特異的抗体の有意な産生はなされなかった。
【００７１】
３．ＮＡｓによるホモ変異防御
ワクチン接種後３週間目のワクチン接種マウスと対照マウスに対し、２０ ＬＤ50量のホモＮＡ変異ウイルスＸ−４７を投与することにより、免疫を検定した（図１２）。体温の低下および体重の減少が測定されたことからわかるように、すべての対照マウスは重篤な罹患状態に陥った。感染後４日目に、最初の死亡マウスが現れ、すべての対照マウスはウイルス接種後９日以内にすべて死亡した。
反対に、ＮＡｓワクチン接種マウスにおける臨床パラメーターは、一時的かつ小さく低下しただけであった。すべてのワクチンマウスは感染から助かった。
第３の免疫感作を行わない場合、同レベルの防御免疫が達成されうるのかどうかという点についても調べた（ＮＡｓおよび／またはアジュバントの用量を増加することによって補償されるという可能性があると考えられる）。これらの試験は実質的に同一の実験計画に沿って行った。この作法で免疫感作したマウスは一般に良好な耐性を呈したが、少数の個体は重篤な罹患状態に陥った。また、生存率が８０％以下になることは殆ど無かったが、ワクチン接種マウスにおいて死亡するものも時折あらわれた。しかし、３回の免疫感作によって達成された防御免疫のレベルは、全般にわたって優れたものであることがわかった。
【００７２】
４．ＮＡｓによるヘテロ変異防御
７年抗原ドリフトによってＡ／ビクトリア／３／７５から誘導されたＮＡｓから分離されるＮＡを含むヘテロ−ＮＡ−変異ウイルスＸ−３１の２０ ＬＤ50量を、ワクチン接種マウスおよび対照マウスの別のグループに感染させて免疫性を試験した（図１３）。Ｘ−４７免疫感作実験においても観察されたように、臨床結果は劇的なものであった。対照動物は感染後５日目で既に死亡するものがあらわれ始めた。死亡率は８日目に最大値に到達し、その後生存したのは１匹だけであった。ＮＡｓで免疫感作したマウスは、通常は致命的なヘテロ変異ウイルスに感染したにもかかわらず、１００％の生存率を示した。ホモ変異免疫実験の場合と同様に、ワクチン接種マウスは体温を適度に正常レベルで維持することができた。体重の損失は、ホモ変異の場合と比べて幾らかは顕著であったが、すべてのマウスが６日目以降回復を始めた。
【００７３】
５．防御免疫はＮＡｓ免疫血清の受動伝達によって獲得することができる
受動免疫感作による動物防御が、誘発される防御免疫に対して主に応答可能である体液性防御メカニズムであるかどうかを決定するために、該動物防御を試験した。この目的のために、標準的操作にしたがってドナーマウスを免疫感作した。該ドナー動物から採血して、１個体あたり平均約４００μlの血清を得た。対照血清と免疫血清をそれぞれ集めた後、４００μlの血清を被検マウスに腹腔内注射にて１回で投与した。適合させたＸ−４７ウイルスの２０ ＬＤ50量にチャレンジさせる前に、抗体分子がマウス内で満遍なく拡散しうるように２４時間の間隔をあける。対照血清を接種された動物は、すぐに急性の低体温症になり、体重が激しく減少し、最終的に死亡に至ったが、ＮＡｓ免疫血清を投与されたマウスは、能動的に免疫感作された動物と実質的に同程度に防御された（図１４）。
したがって、ＮＡ抗体を予め循環させておくことにより完全な防御が得られるという結論を下すことができる。
【００７４】
論考
インフルエンザに対する免疫は、長い間ほとんどＨＡ抗体の機能についてのみ研究されていたが、免疫に寄与するＮＡの重要性は実質的に無視されてきた。この状況は、ＨＡを結合しうる抗体のみがウイルスを直接中和する能力をもつという観察結果に一部由来するものであった（ハースト，１９４２；デイブンポートら，１９６４；キダら，１９８３）が、ＮＡに対する抗体が、広範囲の濃度において一次感染を防御しうることはわかっていなかった（ジャヒエルおよびキルボーン，１９６６；キルボーンら，１９６８；ヨハンソン，１９８９）。この寛容はおそらく、インフルエンザウイルスのライフサイクルの後期部分で、新たに形成されたウイルスが感染細胞の表面で凝集するのを妨げるように働くＮＡｓを反映している（コールマンおよびウォード，１９８５；ブラウンおよびレイバー，１９６８）。ＨＡとは逆に、ＮＡはインフルエンザウイルスのエンベロープの成分のうちで少ないほうの成分であり、ＮＡ抗体の非中和効果に寄与しうるという事実がさらに発見された（シュルマンら，１９６８）。この存在モル比率の相違が、同様に個々の抗原に対する相対的抗体応答に影響を及ぼす。全インフルエンザウイルスと連続的に対決するために、ＮＡと比べてＨＡが相対的に過剰に提供されることが繰り返されると、おそらくＮａ特異的Ｔ細胞の援助が覚醒される結果として、ＮＡ抗体の産生を抑制することができた（キルボーン，１９７６；ヨハンソンら，１９８７；キルボーンら，１９８７；ヨハンソンら，１９８７）。
【００７５】
したがって、防御ＮＡ免疫を研究するために、ＨＡ抗体を中和することに対する妨害が排除され、ＨＡ抗原およびＮＡ抗原の競合を介したＮＡ免疫応答の阻害が回避されるというシステムを発展させることが必要である。古典的アプローチは、天然のＮＡ成分の単離に基づいて行われる（シュルマンら，１９６８；ヨハンソンおよびキルボーン，１９９０；ギャラガーら，１９８４）かまたは別の場合では限定されたシリーズのインフルエンザ株と血清学的に異なるＨＡおよびＮＡ抗原との組み合わせ投与に基づいて行われる（ロットら，１９７４；キルボーン，１９７６）かのいずれかであった。しかし、本明細書に記載した結果は、精製、組換えＮＡタンパク質を用いる防御免疫感作を直接に説明するものである。Ａ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのＮＡ遺伝子は、膜アンカーをコードする領域がインフルエンザ血球凝集素遺伝子のシグナル配列と置換されることによって分泌可能なタンパク質（ＮＡｓ）をコードする遺伝子に形質転換された（実施例１を参照）。
【００７６】
ＮＡ抗体がウイルス粒子の放出および拡散を阻害することによりウイルス成長の収率を効果的に抑制することができるというインビトロ技術がすでに確立されている（ジャヒエルおよびキルボーン，１９６８；キルボーンら，１９６８）。
【００７７】
肺におけるウイルス力価の低下および肺機能障害の進行の抑制を測定することにより、ＮＡで免疫感作された動物から、同様の結論が引き出された（１１，１２，１３）。肺でのウイルス複製におけるＮＡ免疫の効果に大きな注意が向けられていたけれども、純粋なＮＡタンパク質による免疫感作が、臨床疾患の症候を予防しうるか、または潜在的に致命的なインフルエンザに感染した後の生存チャンスを改良しうるかどうかは疑わしかった。この疑問に対する満足のいく答えはまだ得られていなかった。しかし、本明細書で示す結果は、通常致命的なインフルエンザ感染に対する完全防御が、純粋な組換えＮＡｓで免疫感作することによって達成されうることをを明確に説明しており、ここでは、既往の抗ＨＡ免疫メカニズムまたは保存された内部ウイルスタンパク質の抗原に対する細胞性記憶免疫効果は排除される。
【００７８】
本明細書で説明した実験においては、３週間の間隔をおいて、１μｇのＮＡｓを３回投与してマウスの免疫感作を行った。ワクチン接種した動物は全部インフルエンザウイルスの致命的感染から生還することができた（ここでウイルスはホモまたはヘテロ変異ＮＡを発現した）。感染ウイルスの投与量が多くても、非常に驚くべきことに、体温および体重の変化によって示されるように、免疫感作した動物は臨床疾患の症候を示さないままであった。ＮＡｓとともに投与されるアジュバントがすべて低い反応原特性を有することに注意することが重要であり、そのために、ここで述べた免疫感作操作がヒトのワクチン接種に直接適用しうるのである。さらに、本発明ワクチンは、他の哺乳動物および鳥類に適用可能である。
【００７９】
無垢の被検マウスにＮＡｓで免疫感作したマウスの血清を受動伝達しても、同レベルの防御が得られたが、このことはＮＡｓ免疫感作の防御効果が、ＮＡ抗体の循環に基づいて説明できることを示している。
【００８０】
ここに記載したヘテロ変異防御に関し、ワクチンＡ／ビクトリア／３／７５のＮＡ抗原と変異感染ウイルスＸ−３１に存在するＡ／アイチ／２／６８のＮＡの間の構造的関係を考慮することが重要である。残念なことに、Ａ／アイチ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）のＮＡに関しては、適用できる配列データはないが、アイチ株と同年に単離されたＡ／ＮＴ／６０／６８（Ｈ３Ｎ２）（ベントレーおよびブロウニー，１９８２）のＮＡ配列と比較することはできる。両方のＮＡ変異体の頭部領域を綿密に調査すると、２８位にアミノ酸の置換が発見される（その点で、主要部は分子の表面にある）。
【００８１】
本発明ワクチンは、さらになお移転したドリフト変異体に対する防御をも提供しうる可能性がある。さらに、ＮＡの遺伝子修飾によって遺伝子の変化をその抗原構造にアレンジしうることが考えられる。このことから、たとえば異なるバージョンのＮＡの「カクテル」を製造することが可能になり、したがって、異なるインフルエンザ株に対する広範な防御が獲得できる。
【００８２】
【表１】
この表は、代表的な精製実験を示す（詳細は本文参照）。スーパーデックス２００ゲル濾過後の液量は、２行程のクロマトグラフィーによる精製物を合わせたものである。
【００８３】
【表２】
この表は、代表的な精製実験を示す（詳細は本文参照）。スーパーデックス２００ゲル濾過後の特定の液量は、２行程のクロマトグラフィーからのＮＡｓ画分を合わせたものである。
【００８４】
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【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】分泌可能なＮＡ遺伝子の構築およびバキュロウイルス運搬ベクターへのその組込みのための方策を示す。関連する制限部位のみを示す。一本線は細菌プラスミド配列を示すが、濃い部分はＨＡ特異的（ベタ塗り）またはＮＡ特異的（点付き）配列を示す。ＨＡシグナル配列をシングルハッチングで示す。ＮＡシグナル配列／膜アンカー配列をダブルハッチングで示す。
【図２】正のｃＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列およびＨＡシグナルペプチドとそのＮＡ膜アンカーを除去されたＮＡの間の連結部位のフランキング領域のアミノ酸配列を示す。図２Ａは非切断ＨＡ、詳しくはＡｌａ16とＧｌｎ17間のシグナルペプチダーゼ制限部位（垂直破線）を含む非切断ＨＡを示す。ＮＡｓの分泌に用いるＮＡ末端セグメントを矢印で示す。図２ＢはＮＡの「柄」領域を示す。ＮＡｓの構築に必要とされる先端切断配列を矢印で示す。図２ＣはＡおよびＢからＮＡｓ配列がどのように構築されるかを示す。ここに詳細に示されるのは、ＨＡ特異的配列およびＮＡ特異的配列間の融合領域である。ＮＡｓはおそらく成熟ＨＡの４個のＮＡ末端アミノ酸で開始し、突然変異コドン（点線の下線）がそれに続く。
【図３】精製ｐＮＡのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す。図３Ａは精製段階の異なるｐＮＡから得られるタンパク質サンプルの分析結果である。レーン１はマーカータンパク質を示す；レーン２は粗ｐＮＡを示す（１μg；ｐＮＡバンドは検出可能レベル以下である）；レーン３はセファロースＳによる精製物を示す（１μg）；レーン４はスーパーデックス２００による精製物を示す（１μg）。図３Ｂに示すのは、ＢＳ3法により架橋した１μgのｐＮＡの５．０％〜７．５％の勾配ゲルである。レーン１はマーカータンパク質を示す；レーン２は架橋後のｐＮＡを示す。余分のバンドが約１０５ｋｄ（二量体）、約１６０ｋｄ（三量体）および約２１０ｋｄ（四量体）に現れている。
【図４】Ｓｆ９細胞に組換えバキュロウイルスを植え付けた後の、酵素活性レベル（○）および総タンパク質濃度（◇）から誘導される、培養培地中に検出される特異的活性（□）の時間経過にともなう変化を示す。
【図５】セファロースＱによるアニオン交換クロマトグラフィーを示す。（２０〜６０）％の（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿を溶解し、透析した後、溶液（９７．５mgタンパク質、１１７,０００Ｕ）をセファロースＱカラムに通した。出発緩衝液にＮａＣｌを添加して濃度２５０mMへ向かうＮａＣｌの直線勾配（点線）による溶離を行う前に、非結合物質を洗い流した。溶出液のタンパク質濃度をＡ280（−）を測定して追跡した。２．５mlの画分を集め、酵素活性（○）およびＥＬＩＳＡにおいて抗原性活性（△）を試験した。
【図６】スーパーデックス２００によるＮＡｓのゲル濾過を示す。Ｎ−（ｐ−アミノフェニル）オキサム酸アガロース分離後の溶離液（２．６３mgのタンパク質、４９，１００Ｕ）を２．０mlまで濃縮し、続いてサンプル量１．０mlの画分にて流速１０ml／時間のスーパーデックス２００カラムのクロマトグラフィーに付した。Ａ280を継続的に追跡した（−）。個々の画分（１．０ml）を酵素活性（○）および抗原性活性（△）を試験した。矢印は較正タンパク質の溶出液量を示す（本文参照）：４４３ｋｄ（１）、２００ｋｄ（２）、１５０ｋｄ（３）、６７ｋｄ（４）および２９ｋｄ（５）。
【図７】精製ＮＡｓのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す。各レーンはスーパーデックス２００ゲル濾過の特定の画分番号に対応する。図７Ａは１０μlのサンプルを変性（β−メルカプトエタノール添加）した後のＳＤＳ／ＰＡＧＥパターンを示す。レーンＡおよびＢはマーカータンパク質を示す。図７Ｂでは、タンパク質サンプルをＢＳ3で架橋し、続いてＳＤＳが存在するけれども非還元的な条件下で、５．０％〜７．５％の勾配ゲルの電気泳動によって分離した。画分５７〜６８は、１０μlのサンプル液量；画分７０〜７７は２５μlのサンプル液量である。四量体のＮＡｓは約２２０ｋｄ（四量体）および約１１０ｋｄ（二量体）でバンドを形成する。二量体および単量体ＮＡｓは、それぞれ約１１０ｋｄおよび約５５ｋｄのバンドとして現れる。
【図８】精製段階の異なるＮＡｓからのタンパク質サンプルのＳＤＳ／ＰＡＧＥの結果を示す。レーン１はマーカータンパク質；レーン２は粗培地（５μg）；レーン３は（２０〜６０）％（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿（５μg）；レーン４はセファロースＱ精製物（２．５μg）；レーン５はＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサム酸アガロース分離後の精製物（１μg）；レーン６はスーパーデックス２００ゲル濾過後の四量体および二量体ＮＡｓ画分（１μg）を示す。
【図９】ＮＡ−グルカナーゼ切断およびＳＤＳ／ＰＡＧＥから評価される、ｐＮＡとＮＡｓに結合した糖質含量の比較分析を示す。酵素ＮＡ−グルカナーゼは３５ｋｄのバンドとして現れる。図９Ａでは、レーン１はマーカータンパク質；レーン２は非切断ｐＮＡ（１μg）；レーン３はＮＡ−グルカナーゼ処理したｐＮＡ（１μg）を示す。図９Ｂでは、レーン１および８はマーカータンパク質；レーン２は非切断四量体ＮＡｓ；レーン３はＮＡ−グルカナーゼ処理した四量体ＮＡｓ；レーン４は非切断二量体ＮＡｓ；レーン５はＮＡ−グルカナーゼ処理した二量体ＮＡｓ；レーン６は非切断単量体ＮＡｓ；レーン７はＮＡ−グルカナーゼ処理した単量体ＮＡｓを示す。
【図１０】ＮＡｓとｐＮＡ間の抗原的な近同一性を説明する。ｐＮＡとＮＡｓのサンプルを等しいタンパク質濃度とし、続いてＥＬＩＳＡにおいて２倍に希釈した。図は特異的抗原に対して測定されたＳ字型の抗原性カーブを示す。ｐＮＡは○；四量体ＮＡｓは◇；二量体ＮＡｓは□；および単量体ＮＡｓは△で示される。
【図１１】ＮＡｓに対する抗体応答を説明する。各免疫感作後１４日目に（矢印で表示）、マウスから血液サンプルを採血し、ＮＡｓ抗体の存在をＥＬＩＳＡにて測定した(実験詳細については本文参照)。ベタ塗りバーおよびハッチングバーは、それぞれワクチン接種および対照動物の平均血清力価(±Ｓ．Ｄ)を表す。
【図１２】ホモ変異体防御を示す。ワクチン接種マウス［Ａでは点線；ＢおよびＣでは黒三角］および対照マウス［Ａでは−；ＢおよびＣでは黒丸］を２０ ＬＤ50のホモ変異，マウス順応Ｘ−４７ウイルスにチャレンジさせた。生存率（Ａ）を記録し、直腸温度（Ｂ）および体重（Ｃ）を測定することによって感染の進行を追跡した（実験詳細については本文参照）。データ点は平均値±Ｓ．Ｄで得る。
【図１３】ヘテロ変異体防御を示す。ワクチン接種マウス［Ａでは点線；ＢおよびＣでは黒三角］および対照マウス［Ａでは−；ＢおよびＣでは黒丸］を２０ ＬＤ50のヘテロ変異，マウス順応Ｘ−３１ウイルスにチャレンジさせた。生存率（Ａ）を記録し、直腸温度（Ｂ）および体重（Ｃ）を測定することによって感染の進行を追跡した（実験詳細については本文参照）。データ点は平均値±Ｓ.Ｄで得る。
【図１４】受動免疫感作による防御を示す。ＮＡｓ免疫血清［Ａでは点線；ＢおよびＣでは黒三角］および対照血清［Ａでは−；ＢおよびＣでは黒丸］の腹腔内注射によってマウスのグループを受動的に免疫感作した。２４時間後に、マウスは２０ ＬＤ50のマウス順応Ｘ−４７ウイルスへのチャレンジを受けた（実験詳細は本文を参照）。生存率、直腸温度および体重をそれぞれＡ、ＢおよびＣに示す。データ点は平均値±Ｓ.Ｄで得る。
【図１５】ＡＯＸＩプロモーターおよびターミネーター配列に加えて、ピチア・パストリスのＨＩＳ４マーカーおよびサッカロミセス・セレビシアエのα因子遺伝子のプレプロ分泌シグナルを含むプラスミドｐＰＩＣ９の模式図を示す。多重クローニング部位は分泌シグナルの後に位置する。
【図１６】プレプロ分泌シグナルとノイラミニダーゼの組換え「帽子」部分の間の融合領域である。「ＫＥＸ２」は、後期ゴルジ体において外来性ＫＥＸ−２プロテアーゼによってプロペプチドが切断される位置を示す。（Ｇｌｕ−Ａｌａ）2ジペプチドはＳＴＥ１３型のジペプチジルアミノペプチダーゼによって除去される。チロシン残基はノイラミニダーゼ由来ではないが、除去されない。次のプロリンはＸ−４７ノイラミニダーゼの７９位に一致する。
【図１７】個々の形質転換体の５個の培地サンプルについての１２．５％ポリアクリルアミドゲルのウエスタンブロットである。レーン１は非形質転換体のピチア・パストリス株の培地サンプルを含む。ＴＣＡで沈殿した培養培地１ml中のタンパク質マテリアルをレーン毎に展開した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し（ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる機能的フラグメントをコードする、少なくとも一部のコード領域、またはそのフラグメントが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している）；次いで
ｂ）培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離する
ことによって得られる実質的単離体である組換えノイラミニダーゼ。
【請求項２】
組換え発現ベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ（ＬＭＢＰ２９７６）を用いてウイルスのゲノムの２重相同的組換えを行なってウイルスを形質転換し、該ウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、次いで培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することによって得られる、実質的単離体である組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ。
【請求項３】
組換え発現ベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓ（ＬＭＢＰ３２２３）をトランスフェクトさせた宿主細胞を適当な培養培地中で培養することによって得られる、組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ。
【請求項４】
さらに、培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することを含む請求項３に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項５】
宿主細胞が下等真核生物由来であることを特徴とする請求項１、２、３または４に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項６】
宿主細胞が昆虫細胞であることを特徴とする請求項１、２または５に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項７】
昆虫細胞がｓｆ９昆虫細胞であることを特徴とする請求項６に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項８】
宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする請求項１、３、４または５に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項９】
インフルエンザワクチン用の請求項１〜８に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項１０】
ＮＡ２型インフルエンザワクチン用の請求項２〜８のいずれかに記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項１１】
ａ）膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる機能的フラグメントをコードする、少なくとも一部のコード領域、またはそのフラグメント；
ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列；
ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および
ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター
を含む、分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するベクター。
【請求項１２】
ａ）膜アンカーをコードする領域を欠損しているウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２のノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域、またはそのフラグメント；
ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列；
ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および
ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター
を含む、分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを発現するベクター。
【請求項１３】
シグナル配列がインフルエンザＮＡ２ウイルス「Ａ／ビクトリア／３／７５」（Ｈ３Ｎ２）の血球凝集素遺伝子由来であることを特徴とする請求項１１または１２に記載のベクター。
【請求項１４】
プロモーターがポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする請求項１１、１２または１３に記載のベクター。
【請求項１５】
転写ターミネーターがＳＶ４０および／またはポリヘドリン遺伝子由来であることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれかに記載のベクター。
【請求項１６】
寄託番号がＬＮＢＰ２９７６であるベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ。
【請求項１７】
ａ）ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび少なくとも一部の柄部分をそれぞれコードする領域を欠損しているインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる領域をコードする機能的フラグメントをコードする領域、またはそのフラグメント；
ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列；
ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および
ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター
を含む、酵母中で分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するベクター。
【請求項１８】
ａ）ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび少なくとも一部の柄部分をそれぞれコードする領域を欠損しているウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザノイラミダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる領域をコードする機能的フラグメントをコードする領域、またはそのフラグメント；
ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列；
ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および
ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター
を含む、酵母中で分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを発現するベクター。
【請求項１９】
シグナル配列がサッカロミセス・セレビシアエのα因子のプレプロシグナル配列であることを特徴とする請求項１７または１８に記載のベクター。
【請求項２０】
プロモーターがピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼＩプロモーターであることを特徴とする請求項１７、１８または１９に記載のベクター。
【請求項２１】
転写ターミネーターがピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼＩ遺伝子由来であることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれかに記載のベクター。
【請求項２２】
寄託番号がＬＭＢＰ３２２３であるベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓ。
【請求項２３】
請求項１に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼを含むワクチン。
【請求項２４】
請求項２〜１０に記載の組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを含むワクチン。
【請求項２５】
ａ）適当なプロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域（該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域および柄部分をコードする領域を欠損している）またはそのフラグメントを含む発現ベクターを構築し；
ｂ）得られた該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項２６】
ａ）適当なプロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域（該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域を欠損している）またはそのフラグメントを含む発現ベクターを構築し；
ｂ）得られた該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項２７】
ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域（該コード領域は、膜アンカーをコードする領域を欠損している）または免疫感作において防御免疫を引き起こしうるそのフラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し；
ｂ）ウイルスのゲノムに該ベクターの発現モジュールを二重相同的組換え手段によって持ち込み；
ｃ）得られた該形質転換ウイルスに宿主細胞を感染させ；
ｄ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｅ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項２８】
ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域（該コード領域は、膜アンカーをコードする領域を欠損している）またはそのフラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し；
ｂ）組換えバキュロウイルスを得るために、野生型バキュロウイルスまたはそれから誘導されたバキュロウイルスのゲノムに該ベクターの発現モジュールを二重相同的組換え手段によって持ち込み；
ｃ）該組換えバキュロウイルスに宿主細胞を感染させ；
ｄ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｅ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項２９】
ａ）二重相同的組換え手段によって、寄託番号ＬＭＢＰ２９７６であるベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓの発現モジュールでバキュロウイルスを形質転換し；
ｂ）該組換えバキュロウイルスに宿主細胞を感染させ；
ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項３０】
ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域（該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域および柄部分をコードする領域を欠損している）またはそのフラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し；
ｂ）得られた該組換えベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項３１】
ａ）寄託番号ＬＭＢＰ３２２３であるベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓでピチア・パストリスを形質転換し；
ｂ）該ベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項１】
ａ）ノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し（ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる機能的フラグメントをコードする、少なくとも一部のコード領域、またはそのフラグメントが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している）；次いで
ｂ）培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離する
ことによって得られる実質的単離体である組換えノイラミニダーゼ。
【請求項２】
組換え発現ベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ（ＬＭＢＰ２９７６）を用いてウイルスのゲノムの２重相同的組換えを行なってウイルスを形質転換し、該ウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、次いで培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することによって得られる、実質的単離体である組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ。
【請求項３】
組換え発現ベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓ（ＬＭＢＰ３２２３）をトランスフェクトさせた宿主細胞を適当な培養培地中で培養することによって得られる、組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ。
【請求項４】
さらに、培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することを含む請求項３に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項５】
宿主細胞が下等真核生物由来であることを特徴とする請求項１、２、３または４に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項６】
宿主細胞が昆虫細胞であることを特徴とする請求項１、２または５に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項７】
昆虫細胞がｓｆ９昆虫細胞であることを特徴とする請求項６に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項８】
宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする請求項１、３、４または５に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項９】
インフルエンザワクチン用の請求項１〜８に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項１０】
ＮＡ２型インフルエンザワクチン用の請求項２〜８のいずれかに記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
【請求項１１】
ａ）膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる機能的フラグメントをコードする、少なくとも一部のコード領域、またはそのフラグメント；
ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列；
ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および
ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター
を含む、分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するベクター。
【請求項１２】
ａ）膜アンカーをコードする領域を欠損しているウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２のノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域、またはそのフラグメント；
ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列；
ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および
ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター
を含む、分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを発現するベクター。
【請求項１３】
シグナル配列がインフルエンザＮＡ２ウイルス「Ａ／ビクトリア／３／７５」（Ｈ３Ｎ２）の血球凝集素遺伝子由来であることを特徴とする請求項１１または１２に記載のベクター。
【請求項１４】
プロモーターがポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする請求項１１、１２または１３に記載のベクター。
【請求項１５】
転写ターミネーターがＳＶ４０および／またはポリヘドリン遺伝子由来であることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれかに記載のベクター。
【請求項１６】
寄託番号がＬＮＢＰ２９７６であるベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ。
【請求項１７】
ａ）ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび少なくとも一部の柄部分をそれぞれコードする領域を欠損しているインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる領域をコードする機能的フラグメントをコードする領域、またはそのフラグメント；
ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列；
ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および
ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター
を含む、酵母中で分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するベクター。
【請求項１８】
ａ）ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび少なくとも一部の柄部分をそれぞれコードする領域を欠損しているウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザノイラミダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる領域をコードする機能的フラグメントをコードする領域、またはそのフラグメント；
ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列；
ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および
ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター
を含む、酵母中で分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを発現するベクター。
【請求項１９】
シグナル配列がサッカロミセス・セレビシアエのα因子のプレプロシグナル配列であることを特徴とする請求項１７または１８に記載のベクター。
【請求項２０】
プロモーターがピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼＩプロモーターであることを特徴とする請求項１７、１８または１９に記載のベクター。
【請求項２１】
転写ターミネーターがピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼＩ遺伝子由来であることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれかに記載のベクター。
【請求項２２】
寄託番号がＬＭＢＰ３２２３であるベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓ。
【請求項２３】
請求項１に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼを含むワクチン。
【請求項２４】
請求項２〜１０に記載の組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを含むワクチン。
【請求項２５】
ａ）適当なプロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域（該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域および柄部分をコードする領域を欠損している）またはそのフラグメントを含む発現ベクターを構築し；
ｂ）得られた該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項２６】
ａ）適当なプロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域（該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域を欠損している）またはそのフラグメントを含む発現ベクターを構築し；
ｂ）得られた該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項２７】
ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域（該コード領域は、膜アンカーをコードする領域を欠損している）または免疫感作において防御免疫を引き起こしうるそのフラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し；
ｂ）ウイルスのゲノムに該ベクターの発現モジュールを二重相同的組換え手段によって持ち込み；
ｃ）得られた該形質転換ウイルスに宿主細胞を感染させ；
ｄ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｅ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項２８】
ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域（該コード領域は、膜アンカーをコードする領域を欠損している）またはそのフラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し；
ｂ）組換えバキュロウイルスを得るために、野生型バキュロウイルスまたはそれから誘導されたバキュロウイルスのゲノムに該ベクターの発現モジュールを二重相同的組換え手段によって持ち込み；
ｃ）該組換えバキュロウイルスに宿主細胞を感染させ；
ｄ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｅ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項２９】
ａ）二重相同的組換え手段によって、寄託番号ＬＭＢＰ２９７６であるベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓの発現モジュールでバキュロウイルスを形質転換し；
ｂ）該組換えバキュロウイルスに宿主細胞を感染させ；
ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項３０】
ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域（該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域および柄部分をコードする領域を欠損している）またはそのフラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し；
ｂ）得られた該組換えベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項３１】
ａ）寄託番号ＬＭＢＰ３２２３であるベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓでピチア・パストリスを形質転換し；
ｂ）該ベクターで宿主細胞を形質転換し；
ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し；次いで
ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する；
工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００６−１９３５２７（Ｐ２００６−１９３５２７Ａ）
【公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７２８５（Ｐ２００６−２７２８５）
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【分割の表示】特願平７−５１８２３０の分割
【原出願日】平成７年１月６日（１９９５．１．６）
【出願人】（５００２８５９３４）フラームス・インテルウニフェルジテール・インスティテュート・フォール・ビオテヒノロジー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【分割の表示】特願平７−５１８２３０の分割
【原出願日】平成７年１月６日（１９９５．１．６）
【出願人】（５００２８５９３４）フラームス・インテルウニフェルジテール・インスティテュート・フォール・ビオテヒノロジー (2)
【Ｆターム（参考）】
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