ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ．）の抽出物、並びにその調製方法及び使用
【課題】多くのメタボリックシンドローム患者が存在するため、当該症候群の治療に対処すること。
【解決手段】ウコギ属植物抽出物を調製する工程の提供。当該抽出物の提供。当該抽出物を含んでなる組成物の提供。被験者の、少なくとも１つのメタボリックシンドロームの症状を予防若しくは治療する方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法の提供。被験者のアディポネクチンに関連する疾患の予防若しくは治療方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法の提供。被験者のＰＰＡＲγに関連する疾患の予防若しくは治療方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法の提供。被験者の酸化ストレスを減少させる方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法の提供。メタボリックシンドロームの少なくとも１つの症状の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明の当該抽出物の使用の提供。アディポネクチンに関連する疾患の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明の当該抽出物の使用の提供。ＰＰＡＲγに関連する疾患の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明の当該抽出物の使用の提供。酸化ストレスを減少させるための薬剤の製造への、本発明の当該抽出物の使用の提供。
【解決手段】ウコギ属植物抽出物を調製する工程の提供。当該抽出物の提供。当該抽出物を含んでなる組成物の提供。被験者の、少なくとも１つのメタボリックシンドロームの症状を予防若しくは治療する方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法の提供。被験者のアディポネクチンに関連する疾患の予防若しくは治療方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法の提供。被験者のＰＰＡＲγに関連する疾患の予防若しくは治療方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法の提供。被験者の酸化ストレスを減少させる方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法の提供。メタボリックシンドロームの少なくとも１つの症状の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明の当該抽出物の使用の提供。アディポネクチンに関連する疾患の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明の当該抽出物の使用の提供。ＰＰＡＲγに関連する疾患の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明の当該抽出物の使用の提供。酸化ストレスを減少させるための薬剤の製造への、本発明の当該抽出物の使用の提供。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハーブ抽出物及びその調製方法に関する。本発明はまた、メタボリックシンドロームの治療又は予防のための、上記抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドローム（「エックス症候群」、「インスリン耐性症候群」、「Ｒｅａｖｅｎの症候群」及び「死の四重奏」とも呼ばれる）とは、心血管疾患に係る一群の危険因子を表す。メタボリックシンドロームの幾つかの定義のうち、代表的なものとして、全米コレステロール教育プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ（ＮＣＥＰ））、世界保健機構（ＷＨＯ）、国際糖尿病連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ（ＩＤＦ））及び米国内分泌学会議（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）により提唱されている。一般に、メタボリックシンドロームは、以下の特徴のうちの少なくとも２つ若しくはそれ以上を有するものとして定義することができる：中心性肥満（腹部）、高血圧（例えば≧１４０／９０ｍｍＨｇ）、高いトリグリセリド値、及び高い絶食時血糖値、並びに低い高比重リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロール値。メタボリックシンドロームに罹患する個人は、２型糖尿病並びに心血管疾患の危険性が高い。
【０００３】
一般に、個々のメタボリックシンドロームの障害は、別々の薬剤によって別々に治療される。高血圧の治療には、利尿剤及びＡＣＥ阻害剤が使用されうる。コレステロール剤は、ＬＤＬコレステロール及びトリグリセリド濃度が高いときにはそれを低下させる場合に、またＨＤＬ濃度が低い場合にはそれを上昇させる場合に、使用できる。インスリン耐性を緩和する薬剤（例えばメトホルミン及びチアゾリジンジオン）を利用してもよい。
【０００４】
Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（Ｒｕｐｅｒ．Ｅｔ Ｍａｘｉｍ．）Ｍａｘｉｍ（当初Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）と命名されていた）は、漢方薬において、それ単独若しくは他のハーブとの組み合わせにより、疾患の治療に広く用いられている。特許文献１：特開２００３−２７７２８２号及び特許文献２：特開２００６−２３４６０３号は、Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ Ｈａｒｍｓから医薬化合物を抽出する方法を開示している。特許文献３：特開２００７−２７７１２８号は、肥満、糖尿病及び高脂血症の治療用の漢方薬の、有効成分の１つとしての、Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓの粉末の利用に関して開示している。特許文献４：特開２００６−３４８０５４号は、Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｄｉｅｂｏｌｄｉａｎｕｓの水、アルコール、エーテル及びアセトン抽出物が、リパーゼの阻害効果を有し、また当該抽出物が肥満及び高脂血症の予防若しくは治療に効果的であることを示唆している。しかしながら、特開２００６−３４８０５４号の明細書では、上記水抽出物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、リパーゼ活性を１７０μｇ／０．５ｍｌのＩＣ５０値で阻害することが証明されているのみである。Ｈｉｋｉｎｏ Ｈ．ら（非特許文献１：Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，１９８６，４９（２）：２９３−７）及びＭｅｄｏｎ Ｐ．Ｊ．ら（非特許文献２：Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｙａｏ Ｌｉ Ｘｕｅ Ｂａｏ．，１９８１，２（４）：２８１−５）は、Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ抽出物の投与が、マウスの血漿グルコース濃度を効果的に減弱させたことを開示している。特許文献５：中国特許第１０１３５６９６８号には、メタボリックシンドロームの改善効果を有するＰｏｌｙｇｏｎｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ Ｔｈｕｎｂ．ｅｘ Ｍｕｒｒａｙ ｖａｒ．ｈｙｐｏｌｅｕｃｕｍ（Ｏｈｗｉ）の抽出物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２７７２８２号明細書
【特許文献２】特開２００６−２３４６０３号明細書
【特許文献３】特開２００７−２７７１２８号明細書
【特許文献４】特開２００６−３４８０５４号明細書
【特許文献５】中国特許第１０１３５６９６８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，１９８６，４９（２）：２９３−７）
【非特許文献２】Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｙａｏ Ｌｉ Ｘｕｅ Ｂａｏ．，１９８１，２（４）：２８１−５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ますます多くのメタボリックシンドローム患者が存在する。本発明は、当該症候群の治療に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的の１つは、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を調製する工程を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を含んでなる組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、被験者の、少なくとも１つのメタボリックシンドロームの症状を予防若しくは治療する方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、被験者のアディポネクチンに関連する疾患の予防若しくは治療方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、被験者のペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）γ（ＰＰＡＲγ）に関連する疾患の予防若しくは治療方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、被験者の酸化ストレスを減少させる方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法を提供することである。
【００１５】
本発明の更なる目的は、メタボリックシンドロームの少なくとも１つの症状の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物の使用を提供することである。
【００１６】
本発明の更なる目的は、アディポネクチンに関連する疾患の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物の使用を提供することである。
【００１７】
本発明の更なる目的は、ＰＰＡＲγに関連する疾患の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物の使用を提供することである。
【００１８】
本発明の更なる目的は、酸化ストレスを減少させるための薬剤の製造への、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物の使用を提供することである。
【００１９】
本発明を、以下のセクションにおいて詳述する。本発明の他の特徴、目的及び効果は、本発明の詳細な説明及び請求項中に見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉの抽出物が、ＰＰＡＲγ活性を活性化するのみならず、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＰＰＡＲγの産生をも増加させることを示す。「Ｔｒｏｇ」はトログリタゾンを表し、「ＥＡ１６」はＥ．ｇｉｒａｌｄｉｉの５０％ ＥｔＯＨ−ＥｔＯＡｃ抽出物を表す
【図２】４週齢のＳＤラットにおける、経口グルコース負荷試験の結果を示す。値を、平均±ＳＤ（ｎ＝７〜８）として示す。＊ ｐ＜０．０５、群Ｃとの比較。＃ ｐ＜０．０５、群Ｆとの比較。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本願明細書において、特に明記されない限り、本発明で用いられる科学用語及び技術用語は、当業者が通常理解している意味において用いられる。かかる用語の意味及び範囲は明確であるべきだが、潜在的に曖昧な意味を有する場合には、本願明細書における定義が、いかなる辞書的若しくは外部的な定義に優先して用いられる。
【００２２】
文脈から特定されない限り、単数形の用語はその複数形を含み、また複数形の用語はその単数形を含む。
【００２３】
以下の用語は、本発明の開示において用いられる場合には、特に明記しない限り、以下の意味を有するものとして理解される。
【００２４】
本明細書で用いられる「予防すること」又は「予防」の用語は、感受性を有する被験者における症状の発症を遅延させること、又は疾患の発症を減少させることを意味する。
【００２５】
本明細書で用いられる「治療すること」又は「治療」の用語は、感受性を有する被験者の症状を減少させること、及び／又は、改善すること、を意味する。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「被験者」とは、動物（特に哺乳動物）を意味する。好ましい実施形態では、「被験者」は「ヒト」を意味する。
【００２７】
本明細書で用いられる「治療上有効量」という用語は、単独で、又は、同じ疾患を治療するための他の治療／薬剤との組み合わせにより用いられる有効成分の、治療的有効性を示す量のことを意味する。
【００２８】
「担体」又は「薬学的に許容できる担体」という用語は、当業者に周知の、医薬組成物の製造に用いられる希釈剤、賦形剤、アクセプタ又は類縁体を意味する。
【００２９】
用語「ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）」とは、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、好ましくはエゾウコギ（Ｅ．ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ）（Ｒｕｐｅｒ．ｅｔ Ｍａｘｉｍ．）Ｍａｘｉｍ．、紅毛五加（Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ）又はＥ．ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕの、根、葉、茎及び／又は植物体全体のことを指す。本発明では、上記の植物のサンプルは未処理であってもよく、又は例えば乾燥、スライス、グラインドなどの処理がなされていてもよい。
【００３０】
＜調製工程＞：
被験者への投与に用いるウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を調製する工程は、以下のステップを含んでなる：
ａ）Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．をアルコール溶液で抽出するステップと、
ｂ）ステップａ）から得られる抽出物から固体分を除去し、それによりウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を得るステップ。
【００３１】
本発明の方法では、Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．の、アルコール溶液に対する重量比率は約１／５〜約１／５０、好ましくは約１／１０〜約１／３０、最も好ましくは約１／２０の量である。
【００３２】
本発明の方法において、用語「アルコール溶液」とは、無水アルコール又はアルコールと水とを混合することにより調製される溶液のことを指す。本発明では、アルコールは、１〜６の炭素原子数、好ましくは１〜４の炭素原子数、より好ましくは１〜３の炭素原子数の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル部分を有する。例えば、上記アルコールはメタノール、エタノール、イソプロパノール、又はそれらの混合物である。好ましくは、上記アルコールはメタノール又はエタノールである。
【００３３】
本発明の工程において用いられる上記アルコール溶液中のアルコールの濃度は、約３０〜１００％（ｖ／ｖ）である。好ましい実施形態では、上記アルコール溶液は、約３０〜１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約４０〜９０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約５０〜７０％（ｖ／ｖ）のメタノール溶液である。他の好ましい実施形態では、上記アルコール溶液は、約３０〜１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約４０〜９０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約５０〜７０％（ｖ／ｖ）のエタノール溶液である。
【００３４】
本発明の方法において、ステップａ）の抽出は、いかなる従来公知の方法（例えば煮沸抽出（ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ）、浸漬、超音波処理、撹拌、激しい撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）又はそれらの組み合わせ）によっても実施できる。上記抽出の時間は、約１〜約４８時間、好ましくは約１２〜３６時間、最も好ましくは約２４時間である。抽出温度は約２０〜４５℃、好ましくは約２５〜３５℃である。
【００３５】
本発明の方法において、ステップｂ）では、固体分は、いかなる従来公知の方法（例えば濾過膜（ｃｈｅｅｓｅｃｌｏｔｈ）を用いた濾過、遠心分離又はそれらの組み合わせ）によっても除去できる。
【００３６】
本発明の方法は更に、いかなる従来公知の方法を用いて、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を、例えば凍結乾燥又は蒸発（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，９９：２９４−３００，２００５及びＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，９３２：９１−９５，２００１）により濃縮して、濃縮されたウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を得るステップｃ）を含んでなってもよい。
【００３７】
本発明の方法において、ステップｃ）からの濃縮ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を更に、中極性〜高極性の溶媒で抽出／分画して、第２のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を得ることもできる。本発明において、上記の中極性〜高極性の溶媒は、公知のいかなるもの（例えばエーテル、アルコール、エステル又はその混合物）であってもよい。上記溶媒の例としては、限定されないが、イソブチルアルコール、ｎブタノール、ｎ−酢酸ブチル、クロロホルム、酢酸エチル及びそれらの混合物が挙げられる。濃縮ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物 対 溶媒の比率（ｖ／ｖ）は、約１：１〜１：４である。
【００３８】
本発明の方法の好ましい実施形態では、上記溶媒は酢酸エチルであり、その抽出は液体−液体抽出により実施される（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ．，３８（１）：９７−１０３，２００４、及びＪ．Ｈｅｒｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，７：１０７−１２８，２００７）。一般に、濃縮ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を、酢酸エチルと接触させ、次に０．５％の炭酸水素ナトリウムを、約１：１の比率（ｖ／ｖ）でエステル層に添加し、脂肪酸を除去する（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（３）：５３２−５３４，１９９８）。
【００３９】
＜組成物＞：
本発明は、治療上有効量の、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を含んでなる組成物の提供に関する。本発明の組成物は、食品成分又は医薬組成物として用いることができる。
【００４０】
本発明の組成物は、あらゆる適切な投与経路（例えば経口投与）によって被験者に投与してもよい。適切な製剤としては、錠剤、ロゼンジ、ハードカプセル若しくはソフトカプセル、水性若しくは油性懸濁液、エマルジョン、分散可能な粉末若しくは顆粒、シロップ又はエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、それを滅菌してもよく、又はいかなる薬理学的に許容できる担体（例えば安定化剤、湿潤剤など）と混合してもよい。
【００４１】
本発明の組成物は、周知技術である従来の医薬賦形剤を使用して、従来公知の手順に従い調製してもよい。すなわち、経口的な使用を目的とする組成物は、例えば１つ以上の着色剤、甘味料、調味料及び／又は保存料を含有してもよい。
【００４２】
本発明の組成物は、メタボリックシンドロームの治療用の１つ以上の他の服用中の薬剤（例えば脂質を低下させる薬剤、抗糖尿病薬及び抗酸化剤）（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｈｅｍａｔｏｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００８，６（４）：２３７−５２）との組み合わせで用いることができる。
【００４３】
＜用途＞：
本発明の組成物は、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のメタボリックシンドロームの症状の予防若しくは治療のために用いることができる。メタボリックシンドロームの主な症状としては、肥満、中心性肥満症（腹部肥満）、異脂肪血症、耐糖能異常、心血管疾患、インスリン耐性及び２型糖尿病（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００３，７３：２３９５−２４１１）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明の組成物は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性の阻害に用いることができる。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、脂肪酸合成に関与する鍵となる酵素の１つである。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ反応の生成物（マロニル−ＣｏＡ）は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の基質であり、かつ、カルニチンパルミトイルＣｏＡ転移酵素（ＣＰＴ）の阻害剤でもある。従って、ＡＣＣの阻害は、トリグリセリドの合成を減少させるのみならず、脂肪酸の合成をも低下させる（Ｋｕｓｕｎｏｋｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，２９：９１−１００，２００６、Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇｈら、ＰＮＡＳ，１００：１０２０７−１０２１２，２００３、Ａｒｂｅｅｎｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３３（６）：８４３−８５１．，１９９２、Ｒｏｓｅ−Ｋａｈｎ及びＢａｒ−Ｔａｎａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４２：２５９−２６４，１９９０、並びにＨａｒｗｏｏｄ，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，９（２）：２６７−２８１，２００５）。
【００４５】
本発明の組成物は、アディポネクチンに関連する疾患の予防若しくは治療に用いることができる。アディポネクチンに関連する疾患としては、限定されないが、肥満、インスリン耐性、高血糖及びアテローム性動脈硬化症が挙げられる（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｍｅｔａｂ．Ｓｙｎｄｒ．，２００７，２（４）：２８８−９４、及びＪ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，２００５，９０：４７９２−４７９６）。
【００４６】
本発明の組成物は、ＰＰＡＲγの活性化に用いることができる。ＰＰＡＲγの活性化により、前脂肪細胞の分化及び脂肪の代謝を誘導でき、また細胞のインスリン感受性を改善できる（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．，１９９９，２０：６４９−６８８）。
【００４７】
本発明の組成物は、酸化防止剤などのような、活性酸素種（ＲＯＳ）のスカベンジャーとして用いることができる。ＲＯＳの過剰生成は有害であり、細胞及び組織に対する毒性をもたらし、またそれは糖尿病、アテローム性動脈硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｐａｔｈｙ）、ネフロパシ、神経障害及び網膜症の進行において顕著な役割を果たす（Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２９：６２−７０，２００９、及びＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｙ，１：３−３２，２００２）。食品用の酸化防止剤（酸化ストレスに対して保護効果がある）が、肝障害（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．，４４：５７５−５８６，２００４）、網膜傷害（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．，２２：３８−４５，２００６）及びアテローム性動脈硬化症（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，９９：２９４−３００，２００５）に対抗する作用を発揮させるための治療剤として提案されている。
【００４８】
当業者にとり、治療のための適切な投与経路及び投与量の選択は困難ではない。本発明では、好適な投与経路は経口投与である。投与量は、障害の性質及び状況、患者の年齢及び健康状態、投与経路及びあらゆる過去に行われた治療などに依存する。当業者であれば、投与量が、個人の年齢、サイズ、健康症状及び他の関連する要因に応じて変化しうることは自明である。
【００４９】
以下の実施例は、当業者が本発明を実施する際の参考として提供されるものである。当技術分野の当業者であれば、本願明細書に記載される実施態様に対する修飾及び変更を、本発明の技術思想又は範囲から逸脱することなく実施できるため、それらの実施例は、本発明を過度に限定するものとして解釈すべきでない。
【実施例】
【００５０】
＜実施例１＞：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｓｐ．）の抽出物の調製：
【００５１】
ｉ）アルコール抽出：
各ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）（エゾウコギ（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（Ｒｕｐｅｒ．ｅｔ Ｍａｘｉｍ．）Ｍａｘｉｍ．）、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ及びＥ．ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓを含む）の茎を、機械も用いて粉砕（ｇｒｉｎｄ）し、次に溶媒（例えば５０％又は７０％のメタノール又はエタノール）で、約１／２０の重量／体積比で、２４時間にわたり、４枚の層のチーズクロスで濾過して抽出し、次に減圧濃縮した。
【００５２】
ｉｉ）酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）抽出：
上記で調製した濃縮ＭｅＯＨ抽出物及びＥｔＯＨ抽出物を、等量の酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を５％の重炭酸ナトリウムで処理して脂肪酸を除去し、次に濃縮し、ＭｅＯＨ又はＥｔＯＨ−ＥｔＯＡｃ抽出物を得た。
【００５３】
＜実施例２＞：アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）に対する、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物の抑制効果：
ＡＣＣを、ラット肝臓から単離、精製し、実施例１から得られた抽出物によるＡＣＣ活性の阻害を、Ｔａｎａｂｅら（１９８１．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７１（Ｐｔ Ｃ）：５−１６）に記載の方法に従いアッセイした。表１に示すように、すべての抽出物が、ＡＣＣ活性に対する阻害効果を示した。
【００５４】
表１：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の抽出物の、ＡＣＣ活性に対する阻害効果：
【表１】
【００５５】
＜実施例３＞：３Ｔ３−Ｌ１の前駆脂肪細胞の分化に対する、ウコギ属植物（Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ）抽出物の効果：
Ｗａｋｉその他（２００７．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．５：３５７−３７０）の方法に従い、３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１１０μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ（４，５００ｍｇ／Ｌのグルコース入り）で、３７℃で、５％のＣＯ２インキュベータで培養した。３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化を、培地への１０μｇ／ｍＬインスリン（０日目）の添加により開始させた。インスリン含有培地での７日間（２日目及び４日目で培地交換した）の培養の後、細胞を更に、２日間、インスリンを含有しない培地でインキュベートした。また、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉの抽出物を、０日目の培地及び交換した際の培地にも添加した。試験に供した細胞中のトリグリセリド（ＴＧ）及びアディポネクチンの量、並びに細胞のＰＰＡＲγの結合活性を、市販のアッセイキット（それぞれＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍｏｕｓｅ Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ａｕｄｉｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のＴｒｉｇｌｙｃｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ、及びＢＤ（商標）Ｔｒａｎｓｆａｃｔｏｒ Ｆａｍｉｌｙ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｋｉｔｓ−ＰＰＡＲαβγ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）又はＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＰＰＡＲγ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製））を用いてアッセイし、ＰＰＡＲγの発現を、ウエスタンブロットにより測定した。表２に示すように、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉの抽出物は、用量依存的に３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の分化を刺激しうるのみならず、分泌型のアディポネクチン及び細胞内のアディポネクチンの産生をも刺激しうる。図１は、周知のＰＰＡＲγアゴニスト（トログリタゾン）と異なり、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉの抽出物が、ＰＰＡＲγ活性を活性化しうるのみならず、３Ｔ３−Ｌ１細胞中でのＰＰＡＲγの産生をも増加させうることを示す。
【００５６】
表２：３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の分化に対する、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物の効果：
【表２】
【００５７】
＜実施例４＞：高フルクトース餌料によりメタボリックシンドロームを誘導させた、オス スピローグ−ドーリー（ＳＤ）ラットに対する、７０％ エタノール中のＥ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物の効果：
動物実験を実施し、メタボリックシンドロームの予防及び治療に対する、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物の効果を評価した。２００ｇのオスのＳＤラット（ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ社から購入）を、一定の１２時間／１２時間の光／暗サイクルで、２３±２℃の温度に制御された部屋におけるマイクロアイソレータのケージ１つにつき２匹を飼育した。動物に、水及び食餌を自由に摂取させた。
【００５８】
ラットを４つの群（各群ｎ＝８）に分けた。通常のコントロール（Ｃ）群には、定期的に動物飼育用の餌料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ １３６２Ｎ、Ａｌｔｒｏｍｉｎ社製、Ｉｍ Ｓｅｅｌｅｎｋａｍｐ、ドイツ）を供給した。その他の３つの群には、メタボリックシンドロームを誘発させるために、高フルクトース（４０％）餌料を供給し、一方、Ｌ及びＨ群には、７０％のエタノール中のＥ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物を、９４及び１８８ｍｇ／ｋｇで毎日注入し、また高フルクトースコントロール（Ｆ）群には、同じ量の蒸留水を注入した。
【００５９】
体重及び摂食量を計量した。体重を、９：００〜１１：００（ＡＭ）に測定した。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴｓ）を、４週目及び８週目に実施した。ラットを、試験前１６時間にわたり、一晩絶食させた。試験開始時（０時間目）にラットを秤量し、０．５ｍＬの血液サンプルを尾部静脈から採取し、次にラットに、１０％のＤ−グルコース（１．５ｇ／ｋｇ体重）を経口的に点滴した。更に、注入の３０、６０、９０及び１２０分後に、血液サンプル（０．５ｍＬ）を採取した。４週目に実施したＯＧＴＴの結果を、図２に示す。図２より、６０、９０及び１２０分において、群Ｆの血糖値が、群Ｃのそれらより高く（ｐ＜０．０５）、また、９０及び１２０分においては、群Ｌ及びＨの血糖値が、群Ｆ（ｐ＜０．０５）のそれより顕著に低いことが明らかとなった。８週目の結果は、４週目の結果と類似している。
【００６０】
１０週後にラットを安楽死させ、精巣上体の脂肪パッド、肝臓及び腎臓を摘出し、秤量した。表３は、１０週にわたる食餌治療の後、群Ｌ及びＨの精巣上体の脂肪パッドの相対重量が、全て、群Ｆのそれより顕著に低かったことを示す。器官重量の異常は、実験終了後に実施した検死において観察されなかった。肝臓のトリグリセリド値も測定し、その結果、Ｈ群における値が、１０週にわたる食餌療法の後、Ｆ群のそれらより顕著に低いことが明らかとなった（１２．５±１．４ｍｇ／ｇ肝臓に対して、１０．７±１．７ｍｇ／ｇ肝臓、ｐ＜０．０５）。
【００６１】
以上の結果から、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物が、ｉｎ ｖｉｖｏで糖耐性を改善し、精巣上体の脂肪重量の減少に対して、劇的な効果を示すことが明らかとなった。
【００６２】
表３：１０週にわたる食餌療法の後の、ＳＤラットの組織の相対重量
【表３】
数値を、平均±ＳＤ（ｎ＝７〜８）として示す。
＊ｐ＜０．０５、群Ｃとの比較。
＃ｐ＜０．０５、群Ｆとの比較。
【００６３】
＜実施例５＞：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の抽出物の、ＨｅｐＧ２細胞における、高グルコース誘導されたトリグリセリドのレベル減少に対する効果：
ＨｅｐＧ２細胞を、ＤＭＥＭ−ＬＧ（５．５ｍＭのグルコースを含む）中に播き（２．５×１０５細胞／ウェル）、３７℃の温度、９５％の湿度で、２４時間にわたり、５％のＣＯ２雰囲気のチャンバ内でインキュベートした。ウェル中の培地を、新鮮なＤＭＥＭ−ＬＧ、ＤＭＥＭ−ＨＧ（５０ｍＭのグルコースを含む）又はＤＭＥＭ−ＨＧ−抽出物（５０ｍＭのグルコース及び異なるウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｓｐ．）の抽出物を含む）と交換し、細胞を更に１２０時間インキュベートした。細胞を、Ｄ−ＰＢＳで二回洗浄し、溶解バッファ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１％のトリトンＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＮａＶＯ４及び１ｍＭのＰＭＳＦ）で処理した。トリグリセリド（ＴＧ）及びタンパク質の濃度を、市販のキット（それぞれ、トリグリセリドＧＰＯ−ＰＡＰキット（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製、ダルムシュタット、ドイツ）及びＢｉｏＲａｄ プロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ社製、ヘラクレス、ＣＡ、米国））で測定した。表４に示すように、Ｅ．ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓ及びＥ．ｇｉｒａｌｄｉｉの７０％ エタノール抽出物は、高グルコース条件でインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞におけるＴＧの蓄積を減少させ、またその阻害の程度は、酢酸エチル抽出によって更に強化された。
【００６４】
表４：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の抽出物による、ＨｅｐＧ２細胞における、高グルコース誘導されたトリグリセリド蓄積の阻害：
【表４】
＊阻害％＝（ＴＧ 抽出液−ＴＧ 高グルコース）／（ＴＧ 低グルコース−ＴＧ 高グルコース）×１００
【００６５】
＜実施例６＞：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の抽出物の抗酸化活性：
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの全抗酸化活性を、活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）法を用いて測定した（Ｏｕら、２００１，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４９：４６１９−４６２６、及びＨｕａｎｇら、２００２，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，５０：４４３７−４４４４）。２０μＬのブランク（７５ｍＭのリン酸バッファ）測定後、０〜２００μＭのｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＷＩ、米国）又はウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の異なる抽出物を含有する試験サンプルを、９６ウェルの黒いプレート中にそれぞれ添加し、９６ｎＭのフルオレセイン２ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１５０μＬ、ウェルに添加した。プレートを、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００蛍光マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）に置き、混合した。３２０ｍＭのＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライド、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を３０μＬ添加し、プレートを元の位置に戻し、４９０ｎｍで励起し、５３０ｎｍでの放出を測定した。ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の全てのエタノール抽出物は、相対的な抗酸化活性を示した（表５）。ウコギ属植物（Ｅ．ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓ）抽出物の場合を除き、エタノール抽出による抗酸化活性は、それぞれの酢酸エチル抽出による場合と比較し、高かった。
【００６６】
表５：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の抽出物の抗酸化活性。
【表５】
＊ＴＥ：ｔｒｏｌｏｘ同等物。
結果を、３つの実験の平均＋ＳＤとして示す。
【００６７】
Ｐｕｈｌら（１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２３３：４２５−４１）に記載の方法に従い、５０％のＥｔＯＨ−ＥｔＯＡｃによるＥ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物の酸化防止剤活性を更にアッセイした。一晩絶食させた後、ヒトＬＤＬ（ｄ＝１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍＬ）を、同意を得たる脂質値の健常なヒト被験者の血漿サンプルから、超遠心分離によって、経時的に分離した（Ｍｉｙａｚａｋｉら、１９９４．Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：５２６４−９）。ＬＤＬを、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ及び１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含有するＰＢＳで透析した。透析されたＬＤＬサンプル（１００μｇのタンパク質／ｍＬ）１５０μＬを、様々な濃度の各々の抽出物でプレインキュベートし、次に５μＭのＣｕＳＯ４（最終濃度）を添加した。形成された共役ジエンの量を、２３２ｎｍでモニターした。Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉの５０％ ＥｔＯＨ−ＥｔＯＡｃ抽出物（２０ｇ／ｍＬ）の存在下で、ラグ時間が５８分（ブランク）から２６８分まで延長されることが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハーブ抽出物及びその調製方法に関する。本発明はまた、メタボリックシンドロームの治療又は予防のための、上記抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドローム（「エックス症候群」、「インスリン耐性症候群」、「Ｒｅａｖｅｎの症候群」及び「死の四重奏」とも呼ばれる）とは、心血管疾患に係る一群の危険因子を表す。メタボリックシンドロームの幾つかの定義のうち、代表的なものとして、全米コレステロール教育プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ（ＮＣＥＰ））、世界保健機構（ＷＨＯ）、国際糖尿病連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ（ＩＤＦ））及び米国内分泌学会議（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）により提唱されている。一般に、メタボリックシンドロームは、以下の特徴のうちの少なくとも２つ若しくはそれ以上を有するものとして定義することができる：中心性肥満（腹部）、高血圧（例えば≧１４０／９０ｍｍＨｇ）、高いトリグリセリド値、及び高い絶食時血糖値、並びに低い高比重リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロール値。メタボリックシンドロームに罹患する個人は、２型糖尿病並びに心血管疾患の危険性が高い。
【０００３】
一般に、個々のメタボリックシンドロームの障害は、別々の薬剤によって別々に治療される。高血圧の治療には、利尿剤及びＡＣＥ阻害剤が使用されうる。コレステロール剤は、ＬＤＬコレステロール及びトリグリセリド濃度が高いときにはそれを低下させる場合に、またＨＤＬ濃度が低い場合にはそれを上昇させる場合に、使用できる。インスリン耐性を緩和する薬剤（例えばメトホルミン及びチアゾリジンジオン）を利用してもよい。
【０００４】
Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（Ｒｕｐｅｒ．Ｅｔ Ｍａｘｉｍ．）Ｍａｘｉｍ（当初Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）と命名されていた）は、漢方薬において、それ単独若しくは他のハーブとの組み合わせにより、疾患の治療に広く用いられている。特許文献１：特開２００３−２７７２８２号及び特許文献２：特開２００６−２３４６０３号は、Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ Ｈａｒｍｓから医薬化合物を抽出する方法を開示している。特許文献３：特開２００７−２７７１２８号は、肥満、糖尿病及び高脂血症の治療用の漢方薬の、有効成分の１つとしての、Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓの粉末の利用に関して開示している。特許文献４：特開２００６−３４８０５４号は、Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｄｉｅｂｏｌｄｉａｎｕｓの水、アルコール、エーテル及びアセトン抽出物が、リパーゼの阻害効果を有し、また当該抽出物が肥満及び高脂血症の予防若しくは治療に効果的であることを示唆している。しかしながら、特開２００６−３４８０５４号の明細書では、上記水抽出物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、リパーゼ活性を１７０μｇ／０．５ｍｌのＩＣ５０値で阻害することが証明されているのみである。Ｈｉｋｉｎｏ Ｈ．ら（非特許文献１：Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，１９８６，４９（２）：２９３−７）及びＭｅｄｏｎ Ｐ．Ｊ．ら（非特許文献２：Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｙａｏ Ｌｉ Ｘｕｅ Ｂａｏ．，１９８１，２（４）：２８１−５）は、Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ抽出物の投与が、マウスの血漿グルコース濃度を効果的に減弱させたことを開示している。特許文献５：中国特許第１０１３５６９６８号には、メタボリックシンドロームの改善効果を有するＰｏｌｙｇｏｎｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ Ｔｈｕｎｂ．ｅｘ Ｍｕｒｒａｙ ｖａｒ．ｈｙｐｏｌｅｕｃｕｍ（Ｏｈｗｉ）の抽出物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２７７２８２号明細書
【特許文献２】特開２００６−２３４６０３号明細書
【特許文献３】特開２００７−２７７１２８号明細書
【特許文献４】特開２００６−３４８０５４号明細書
【特許文献５】中国特許第１０１３５６９６８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，１９８６，４９（２）：２９３−７）
【非特許文献２】Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｙａｏ Ｌｉ Ｘｕｅ Ｂａｏ．，１９８１，２（４）：２８１−５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ますます多くのメタボリックシンドローム患者が存在する。本発明は、当該症候群の治療に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的の１つは、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を調製する工程を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を含んでなる組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、被験者の、少なくとも１つのメタボリックシンドロームの症状を予防若しくは治療する方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、被験者のアディポネクチンに関連する疾患の予防若しくは治療方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、被験者のペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）γ（ＰＰＡＲγ）に関連する疾患の予防若しくは治療方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、被験者の酸化ストレスを減少させる方法であって、それを必要とする被験者に本発明の組成物を投与することを含んでなる方法を提供することである。
【００１５】
本発明の更なる目的は、メタボリックシンドロームの少なくとも１つの症状の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物の使用を提供することである。
【００１６】
本発明の更なる目的は、アディポネクチンに関連する疾患の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物の使用を提供することである。
【００１７】
本発明の更なる目的は、ＰＰＡＲγに関連する疾患の予防若しくは治療用薬剤の製造への、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物の使用を提供することである。
【００１８】
本発明の更なる目的は、酸化ストレスを減少させるための薬剤の製造への、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物の使用を提供することである。
【００１９】
本発明を、以下のセクションにおいて詳述する。本発明の他の特徴、目的及び効果は、本発明の詳細な説明及び請求項中に見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉの抽出物が、ＰＰＡＲγ活性を活性化するのみならず、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＰＰＡＲγの産生をも増加させることを示す。「Ｔｒｏｇ」はトログリタゾンを表し、「ＥＡ１６」はＥ．ｇｉｒａｌｄｉｉの５０％ ＥｔＯＨ−ＥｔＯＡｃ抽出物を表す
【図２】４週齢のＳＤラットにおける、経口グルコース負荷試験の結果を示す。値を、平均±ＳＤ（ｎ＝７〜８）として示す。＊ ｐ＜０．０５、群Ｃとの比較。＃ ｐ＜０．０５、群Ｆとの比較。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本願明細書において、特に明記されない限り、本発明で用いられる科学用語及び技術用語は、当業者が通常理解している意味において用いられる。かかる用語の意味及び範囲は明確であるべきだが、潜在的に曖昧な意味を有する場合には、本願明細書における定義が、いかなる辞書的若しくは外部的な定義に優先して用いられる。
【００２２】
文脈から特定されない限り、単数形の用語はその複数形を含み、また複数形の用語はその単数形を含む。
【００２３】
以下の用語は、本発明の開示において用いられる場合には、特に明記しない限り、以下の意味を有するものとして理解される。
【００２４】
本明細書で用いられる「予防すること」又は「予防」の用語は、感受性を有する被験者における症状の発症を遅延させること、又は疾患の発症を減少させることを意味する。
【００２５】
本明細書で用いられる「治療すること」又は「治療」の用語は、感受性を有する被験者の症状を減少させること、及び／又は、改善すること、を意味する。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「被験者」とは、動物（特に哺乳動物）を意味する。好ましい実施形態では、「被験者」は「ヒト」を意味する。
【００２７】
本明細書で用いられる「治療上有効量」という用語は、単独で、又は、同じ疾患を治療するための他の治療／薬剤との組み合わせにより用いられる有効成分の、治療的有効性を示す量のことを意味する。
【００２８】
「担体」又は「薬学的に許容できる担体」という用語は、当業者に周知の、医薬組成物の製造に用いられる希釈剤、賦形剤、アクセプタ又は類縁体を意味する。
【００２９】
用語「ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）」とは、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、好ましくはエゾウコギ（Ｅ．ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ）（Ｒｕｐｅｒ．ｅｔ Ｍａｘｉｍ．）Ｍａｘｉｍ．、紅毛五加（Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ）又はＥ．ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕの、根、葉、茎及び／又は植物体全体のことを指す。本発明では、上記の植物のサンプルは未処理であってもよく、又は例えば乾燥、スライス、グラインドなどの処理がなされていてもよい。
【００３０】
＜調製工程＞：
被験者への投与に用いるウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を調製する工程は、以下のステップを含んでなる：
ａ）Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．をアルコール溶液で抽出するステップと、
ｂ）ステップａ）から得られる抽出物から固体分を除去し、それによりウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を得るステップ。
【００３１】
本発明の方法では、Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．の、アルコール溶液に対する重量比率は約１／５〜約１／５０、好ましくは約１／１０〜約１／３０、最も好ましくは約１／２０の量である。
【００３２】
本発明の方法において、用語「アルコール溶液」とは、無水アルコール又はアルコールと水とを混合することにより調製される溶液のことを指す。本発明では、アルコールは、１〜６の炭素原子数、好ましくは１〜４の炭素原子数、より好ましくは１〜３の炭素原子数の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル部分を有する。例えば、上記アルコールはメタノール、エタノール、イソプロパノール、又はそれらの混合物である。好ましくは、上記アルコールはメタノール又はエタノールである。
【００３３】
本発明の工程において用いられる上記アルコール溶液中のアルコールの濃度は、約３０〜１００％（ｖ／ｖ）である。好ましい実施形態では、上記アルコール溶液は、約３０〜１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約４０〜９０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約５０〜７０％（ｖ／ｖ）のメタノール溶液である。他の好ましい実施形態では、上記アルコール溶液は、約３０〜１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約４０〜９０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約５０〜７０％（ｖ／ｖ）のエタノール溶液である。
【００３４】
本発明の方法において、ステップａ）の抽出は、いかなる従来公知の方法（例えば煮沸抽出（ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ）、浸漬、超音波処理、撹拌、激しい撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）又はそれらの組み合わせ）によっても実施できる。上記抽出の時間は、約１〜約４８時間、好ましくは約１２〜３６時間、最も好ましくは約２４時間である。抽出温度は約２０〜４５℃、好ましくは約２５〜３５℃である。
【００３５】
本発明の方法において、ステップｂ）では、固体分は、いかなる従来公知の方法（例えば濾過膜（ｃｈｅｅｓｅｃｌｏｔｈ）を用いた濾過、遠心分離又はそれらの組み合わせ）によっても除去できる。
【００３６】
本発明の方法は更に、いかなる従来公知の方法を用いて、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を、例えば凍結乾燥又は蒸発（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，９９：２９４−３００，２００５及びＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，９３２：９１−９５，２００１）により濃縮して、濃縮されたウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を得るステップｃ）を含んでなってもよい。
【００３７】
本発明の方法において、ステップｃ）からの濃縮ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を更に、中極性〜高極性の溶媒で抽出／分画して、第２のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を得ることもできる。本発明において、上記の中極性〜高極性の溶媒は、公知のいかなるもの（例えばエーテル、アルコール、エステル又はその混合物）であってもよい。上記溶媒の例としては、限定されないが、イソブチルアルコール、ｎブタノール、ｎ−酢酸ブチル、クロロホルム、酢酸エチル及びそれらの混合物が挙げられる。濃縮ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物 対 溶媒の比率（ｖ／ｖ）は、約１：１〜１：４である。
【００３８】
本発明の方法の好ましい実施形態では、上記溶媒は酢酸エチルであり、その抽出は液体−液体抽出により実施される（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ．，３８（１）：９７−１０３，２００４、及びＪ．Ｈｅｒｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，７：１０７−１２８，２００７）。一般に、濃縮ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を、酢酸エチルと接触させ、次に０．５％の炭酸水素ナトリウムを、約１：１の比率（ｖ／ｖ）でエステル層に添加し、脂肪酸を除去する（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（３）：５３２−５３４，１９９８）。
【００３９】
＜組成物＞：
本発明は、治療上有効量の、本発明のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）抽出物を含んでなる組成物の提供に関する。本発明の組成物は、食品成分又は医薬組成物として用いることができる。
【００４０】
本発明の組成物は、あらゆる適切な投与経路（例えば経口投与）によって被験者に投与してもよい。適切な製剤としては、錠剤、ロゼンジ、ハードカプセル若しくはソフトカプセル、水性若しくは油性懸濁液、エマルジョン、分散可能な粉末若しくは顆粒、シロップ又はエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、それを滅菌してもよく、又はいかなる薬理学的に許容できる担体（例えば安定化剤、湿潤剤など）と混合してもよい。
【００４１】
本発明の組成物は、周知技術である従来の医薬賦形剤を使用して、従来公知の手順に従い調製してもよい。すなわち、経口的な使用を目的とする組成物は、例えば１つ以上の着色剤、甘味料、調味料及び／又は保存料を含有してもよい。
【００４２】
本発明の組成物は、メタボリックシンドロームの治療用の１つ以上の他の服用中の薬剤（例えば脂質を低下させる薬剤、抗糖尿病薬及び抗酸化剤）（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｈｅｍａｔｏｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００８，６（４）：２３７−５２）との組み合わせで用いることができる。
【００４３】
＜用途＞：
本発明の組成物は、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のメタボリックシンドロームの症状の予防若しくは治療のために用いることができる。メタボリックシンドロームの主な症状としては、肥満、中心性肥満症（腹部肥満）、異脂肪血症、耐糖能異常、心血管疾患、インスリン耐性及び２型糖尿病（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００３，７３：２３９５−２４１１）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明の組成物は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性の阻害に用いることができる。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、脂肪酸合成に関与する鍵となる酵素の１つである。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ反応の生成物（マロニル−ＣｏＡ）は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の基質であり、かつ、カルニチンパルミトイルＣｏＡ転移酵素（ＣＰＴ）の阻害剤でもある。従って、ＡＣＣの阻害は、トリグリセリドの合成を減少させるのみならず、脂肪酸の合成をも低下させる（Ｋｕｓｕｎｏｋｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，２９：９１−１００，２００６、Ａｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇｈら、ＰＮＡＳ，１００：１０２０７−１０２１２，２００３、Ａｒｂｅｅｎｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３３（６）：８４３−８５１．，１９９２、Ｒｏｓｅ−Ｋａｈｎ及びＢａｒ−Ｔａｎａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４２：２５９−２６４，１９９０、並びにＨａｒｗｏｏｄ，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，９（２）：２６７−２８１，２００５）。
【００４５】
本発明の組成物は、アディポネクチンに関連する疾患の予防若しくは治療に用いることができる。アディポネクチンに関連する疾患としては、限定されないが、肥満、インスリン耐性、高血糖及びアテローム性動脈硬化症が挙げられる（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｍｅｔａｂ．Ｓｙｎｄｒ．，２００７，２（４）：２８８−９４、及びＪ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，２００５，９０：４７９２−４７９６）。
【００４６】
本発明の組成物は、ＰＰＡＲγの活性化に用いることができる。ＰＰＡＲγの活性化により、前脂肪細胞の分化及び脂肪の代謝を誘導でき、また細胞のインスリン感受性を改善できる（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．，１９９９，２０：６４９−６８８）。
【００４７】
本発明の組成物は、酸化防止剤などのような、活性酸素種（ＲＯＳ）のスカベンジャーとして用いることができる。ＲＯＳの過剰生成は有害であり、細胞及び組織に対する毒性をもたらし、またそれは糖尿病、アテローム性動脈硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｐａｔｈｙ）、ネフロパシ、神経障害及び網膜症の進行において顕著な役割を果たす（Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２９：６２−７０，２００９、及びＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｙ，１：３−３２，２００２）。食品用の酸化防止剤（酸化ストレスに対して保護効果がある）が、肝障害（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．，４４：５７５−５８６，２００４）、網膜傷害（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．，２２：３８−４５，２００６）及びアテローム性動脈硬化症（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，９９：２９４−３００，２００５）に対抗する作用を発揮させるための治療剤として提案されている。
【００４８】
当業者にとり、治療のための適切な投与経路及び投与量の選択は困難ではない。本発明では、好適な投与経路は経口投与である。投与量は、障害の性質及び状況、患者の年齢及び健康状態、投与経路及びあらゆる過去に行われた治療などに依存する。当業者であれば、投与量が、個人の年齢、サイズ、健康症状及び他の関連する要因に応じて変化しうることは自明である。
【００４９】
以下の実施例は、当業者が本発明を実施する際の参考として提供されるものである。当技術分野の当業者であれば、本願明細書に記載される実施態様に対する修飾及び変更を、本発明の技術思想又は範囲から逸脱することなく実施できるため、それらの実施例は、本発明を過度に限定するものとして解釈すべきでない。
【実施例】
【００５０】
＜実施例１＞：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｓｐ．）の抽出物の調製：
【００５１】
ｉ）アルコール抽出：
各ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）（エゾウコギ（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（Ｒｕｐｅｒ．ｅｔ Ｍａｘｉｍ．）Ｍａｘｉｍ．）、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ及びＥ．ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓを含む）の茎を、機械も用いて粉砕（ｇｒｉｎｄ）し、次に溶媒（例えば５０％又は７０％のメタノール又はエタノール）で、約１／２０の重量／体積比で、２４時間にわたり、４枚の層のチーズクロスで濾過して抽出し、次に減圧濃縮した。
【００５２】
ｉｉ）酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）抽出：
上記で調製した濃縮ＭｅＯＨ抽出物及びＥｔＯＨ抽出物を、等量の酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を５％の重炭酸ナトリウムで処理して脂肪酸を除去し、次に濃縮し、ＭｅＯＨ又はＥｔＯＨ−ＥｔＯＡｃ抽出物を得た。
【００５３】
＜実施例２＞：アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）に対する、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物の抑制効果：
ＡＣＣを、ラット肝臓から単離、精製し、実施例１から得られた抽出物によるＡＣＣ活性の阻害を、Ｔａｎａｂｅら（１９８１．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７１（Ｐｔ Ｃ）：５−１６）に記載の方法に従いアッセイした。表１に示すように、すべての抽出物が、ＡＣＣ活性に対する阻害効果を示した。
【００５４】
表１：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の抽出物の、ＡＣＣ活性に対する阻害効果：
【表１】
【００５５】
＜実施例３＞：３Ｔ３−Ｌ１の前駆脂肪細胞の分化に対する、ウコギ属植物（Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ）抽出物の効果：
Ｗａｋｉその他（２００７．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．５：３５７−３７０）の方法に従い、３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１１０μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ（４，５００ｍｇ／Ｌのグルコース入り）で、３７℃で、５％のＣＯ２インキュベータで培養した。３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化を、培地への１０μｇ／ｍＬインスリン（０日目）の添加により開始させた。インスリン含有培地での７日間（２日目及び４日目で培地交換した）の培養の後、細胞を更に、２日間、インスリンを含有しない培地でインキュベートした。また、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉの抽出物を、０日目の培地及び交換した際の培地にも添加した。試験に供した細胞中のトリグリセリド（ＴＧ）及びアディポネクチンの量、並びに細胞のＰＰＡＲγの結合活性を、市販のアッセイキット（それぞれＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍｏｕｓｅ Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ａｕｄｉｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のＴｒｉｇｌｙｃｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ、及びＢＤ（商標）Ｔｒａｎｓｆａｃｔｏｒ Ｆａｍｉｌｙ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｋｉｔｓ−ＰＰＡＲαβγ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）又はＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＰＰＡＲγ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製））を用いてアッセイし、ＰＰＡＲγの発現を、ウエスタンブロットにより測定した。表２に示すように、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉの抽出物は、用量依存的に３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の分化を刺激しうるのみならず、分泌型のアディポネクチン及び細胞内のアディポネクチンの産生をも刺激しうる。図１は、周知のＰＰＡＲγアゴニスト（トログリタゾン）と異なり、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉの抽出物が、ＰＰＡＲγ活性を活性化しうるのみならず、３Ｔ３−Ｌ１細胞中でのＰＰＡＲγの産生をも増加させうることを示す。
【００５６】
表２：３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の分化に対する、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物の効果：
【表２】
【００５７】
＜実施例４＞：高フルクトース餌料によりメタボリックシンドロームを誘導させた、オス スピローグ−ドーリー（ＳＤ）ラットに対する、７０％ エタノール中のＥ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物の効果：
動物実験を実施し、メタボリックシンドロームの予防及び治療に対する、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物の効果を評価した。２００ｇのオスのＳＤラット（ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ社から購入）を、一定の１２時間／１２時間の光／暗サイクルで、２３±２℃の温度に制御された部屋におけるマイクロアイソレータのケージ１つにつき２匹を飼育した。動物に、水及び食餌を自由に摂取させた。
【００５８】
ラットを４つの群（各群ｎ＝８）に分けた。通常のコントロール（Ｃ）群には、定期的に動物飼育用の餌料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ １３６２Ｎ、Ａｌｔｒｏｍｉｎ社製、Ｉｍ Ｓｅｅｌｅｎｋａｍｐ、ドイツ）を供給した。その他の３つの群には、メタボリックシンドロームを誘発させるために、高フルクトース（４０％）餌料を供給し、一方、Ｌ及びＨ群には、７０％のエタノール中のＥ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物を、９４及び１８８ｍｇ／ｋｇで毎日注入し、また高フルクトースコントロール（Ｆ）群には、同じ量の蒸留水を注入した。
【００５９】
体重及び摂食量を計量した。体重を、９：００〜１１：００（ＡＭ）に測定した。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴｓ）を、４週目及び８週目に実施した。ラットを、試験前１６時間にわたり、一晩絶食させた。試験開始時（０時間目）にラットを秤量し、０．５ｍＬの血液サンプルを尾部静脈から採取し、次にラットに、１０％のＤ−グルコース（１．５ｇ／ｋｇ体重）を経口的に点滴した。更に、注入の３０、６０、９０及び１２０分後に、血液サンプル（０．５ｍＬ）を採取した。４週目に実施したＯＧＴＴの結果を、図２に示す。図２より、６０、９０及び１２０分において、群Ｆの血糖値が、群Ｃのそれらより高く（ｐ＜０．０５）、また、９０及び１２０分においては、群Ｌ及びＨの血糖値が、群Ｆ（ｐ＜０．０５）のそれより顕著に低いことが明らかとなった。８週目の結果は、４週目の結果と類似している。
【００６０】
１０週後にラットを安楽死させ、精巣上体の脂肪パッド、肝臓及び腎臓を摘出し、秤量した。表３は、１０週にわたる食餌治療の後、群Ｌ及びＨの精巣上体の脂肪パッドの相対重量が、全て、群Ｆのそれより顕著に低かったことを示す。器官重量の異常は、実験終了後に実施した検死において観察されなかった。肝臓のトリグリセリド値も測定し、その結果、Ｈ群における値が、１０週にわたる食餌療法の後、Ｆ群のそれらより顕著に低いことが明らかとなった（１２．５±１．４ｍｇ／ｇ肝臓に対して、１０．７±１．７ｍｇ／ｇ肝臓、ｐ＜０．０５）。
【００６１】
以上の結果から、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物が、ｉｎ ｖｉｖｏで糖耐性を改善し、精巣上体の脂肪重量の減少に対して、劇的な効果を示すことが明らかとなった。
【００６２】
表３：１０週にわたる食餌療法の後の、ＳＤラットの組織の相対重量
【表３】
数値を、平均±ＳＤ（ｎ＝７〜８）として示す。
＊ｐ＜０．０５、群Ｃとの比較。
＃ｐ＜０．０５、群Ｆとの比較。
【００６３】
＜実施例５＞：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の抽出物の、ＨｅｐＧ２細胞における、高グルコース誘導されたトリグリセリドのレベル減少に対する効果：
ＨｅｐＧ２細胞を、ＤＭＥＭ−ＬＧ（５．５ｍＭのグルコースを含む）中に播き（２．５×１０５細胞／ウェル）、３７℃の温度、９５％の湿度で、２４時間にわたり、５％のＣＯ２雰囲気のチャンバ内でインキュベートした。ウェル中の培地を、新鮮なＤＭＥＭ−ＬＧ、ＤＭＥＭ−ＨＧ（５０ｍＭのグルコースを含む）又はＤＭＥＭ−ＨＧ−抽出物（５０ｍＭのグルコース及び異なるウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｓｐ．）の抽出物を含む）と交換し、細胞を更に１２０時間インキュベートした。細胞を、Ｄ−ＰＢＳで二回洗浄し、溶解バッファ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１％のトリトンＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＮａＶＯ４及び１ｍＭのＰＭＳＦ）で処理した。トリグリセリド（ＴＧ）及びタンパク質の濃度を、市販のキット（それぞれ、トリグリセリドＧＰＯ−ＰＡＰキット（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製、ダルムシュタット、ドイツ）及びＢｉｏＲａｄ プロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ社製、ヘラクレス、ＣＡ、米国））で測定した。表４に示すように、Ｅ．ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓ及びＥ．ｇｉｒａｌｄｉｉの７０％ エタノール抽出物は、高グルコース条件でインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞におけるＴＧの蓄積を減少させ、またその阻害の程度は、酢酸エチル抽出によって更に強化された。
【００６４】
表４：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の抽出物による、ＨｅｐＧ２細胞における、高グルコース誘導されたトリグリセリド蓄積の阻害：
【表４】
＊阻害％＝（ＴＧ 抽出液−ＴＧ 高グルコース）／（ＴＧ 低グルコース−ＴＧ 高グルコース）×１００
【００６５】
＜実施例６＞：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の抽出物の抗酸化活性：
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの全抗酸化活性を、活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）法を用いて測定した（Ｏｕら、２００１，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４９：４６１９−４６２６、及びＨｕａｎｇら、２００２，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，５０：４４３７−４４４４）。２０μＬのブランク（７５ｍＭのリン酸バッファ）測定後、０〜２００μＭのｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＷＩ、米国）又はウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の異なる抽出物を含有する試験サンプルを、９６ウェルの黒いプレート中にそれぞれ添加し、９６ｎＭのフルオレセイン２ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１５０μＬ、ウェルに添加した。プレートを、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００蛍光マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）に置き、混合した。３２０ｍＭのＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライド、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を３０μＬ添加し、プレートを元の位置に戻し、４９０ｎｍで励起し、５３０ｎｍでの放出を測定した。ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の全てのエタノール抽出物は、相対的な抗酸化活性を示した（表５）。ウコギ属植物（Ｅ．ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓ）抽出物の場合を除き、エタノール抽出による抗酸化活性は、それぞれの酢酸エチル抽出による場合と比較し、高かった。
【００６６】
表５：ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の抽出物の抗酸化活性。
【表５】
＊ＴＥ：ｔｒｏｌｏｘ同等物。
結果を、３つの実験の平均＋ＳＤとして示す。
【００６７】
Ｐｕｈｌら（１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２３３：４２５−４１）に記載の方法に従い、５０％のＥｔＯＨ−ＥｔＯＡｃによるＥ．ｇｉｒａｌｄｉｉ抽出物の酸化防止剤活性を更にアッセイした。一晩絶食させた後、ヒトＬＤＬ（ｄ＝１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍＬ）を、同意を得たる脂質値の健常なヒト被験者の血漿サンプルから、超遠心分離によって、経時的に分離した（Ｍｉｙａｚａｋｉら、１９９４．Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：５２６４−９）。ＬＤＬを、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ及び１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含有するＰＢＳで透析した。透析されたＬＤＬサンプル（１００μｇのタンパク質／ｍＬ）１５０μＬを、様々な濃度の各々の抽出物でプレインキュベートし、次に５μＭのＣｕＳＯ４（最終濃度）を添加した。形成された共役ジエンの量を、２３２ｎｍでモニターした。Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉの５０％ ＥｔＯＨ−ＥｔＯＡｃ抽出物（２０ｇ／ｍＬ）の存在下で、ラグ時間が５８分（ブランク）から２６８分まで延長されることが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を調製する工程であって、
ａ）ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）をアルコール溶液で抽出するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた抽出物から、固体成分を除去して、それによりウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を得るステップと、を含んでなる工程。
【請求項２】
ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）が、Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（Ｒｕｐｅｒ． ｅｔ Ｍａｘｉｍ．）Ｍａｘｉｍ．、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ又はＥ．ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓである、請求項１記載の工程。
【請求項３】
前記アルコール溶液に対するウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の重量比率が、約１／５〜約１／５０である、請求項１記載の工程。
【請求項４】
前記アルコール溶液が、エタノール、メタノール又はイソプロパノール溶液である、請求項１記載の工程。
【請求項５】
前記アルコールの濃度が、約３０〜１００％（ｖ／ｖ）である、請求項１記載の工程。
【請求項６】
前記ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を濃縮するステップｃ）を更に含んでなる、請求項１から５のいずれか１項記載の工程。
【請求項７】
前記濃縮されたウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を、中極性〜高極性の溶媒で抽出／分画して、第２のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を得るステップｄ）を更に含んでなる、請求項６記載の工程。
【請求項８】
前記中極性〜高極性の溶媒が、イソブチルアルコール、ｎブタノール、ｎ−酢酸ブチル、クロロホルム、酢酸エチル又はその混合物から選択される、請求項７記載の工程。
【請求項９】
前記中極性〜高極性の溶媒が、酢酸エチルである、請求項８記載の工程。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項記載の工程により調製される、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物。
【請求項１１】
治療上有効量の請求項１０記載のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物と、任意に、薬理学的に許容できる担体、希釈剤若しくは賦形剤を含んでなる組成物。
【請求項１２】
食品成分又は医薬組成物である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも１つのメタボリックシンドロームの症状を予防若しくは治療するための薬剤の製造への、請求項１０記載のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物の使用。
【請求項１４】
前記症状が、中心性肥満症（腹部肥満）、脂質異常症、心血管疾患、耐糖能異常又はインスリン耐性である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの活性を阻害するための薬剤の製造への、請求項１０記載のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物の使用。
【請求項１６】
アディポネクチンに関連する疾患を予防若しくは治療するための薬剤の製造への、請求項１０記載のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物の使用。
【請求項１７】
ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体γを活性化するための薬剤の製造への、請求項１０記載のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物の使用。
【請求項１】
ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を調製する工程であって、
ａ）ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）をアルコール溶液で抽出するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた抽出物から、固体成分を除去して、それによりウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を得るステップと、を含んでなる工程。
【請求項２】
ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）が、Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（Ｒｕｐｅｒ． ｅｔ Ｍａｘｉｍ．）Ｍａｘｉｍ．、Ｅ．ｇｉｒａｌｄｉｉ又はＥ．ｔｒｉｆｏｌｉａｔｕｓである、請求項１記載の工程。
【請求項３】
前記アルコール溶液に対するウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の重量比率が、約１／５〜約１／５０である、請求項１記載の工程。
【請求項４】
前記アルコール溶液が、エタノール、メタノール又はイソプロパノール溶液である、請求項１記載の工程。
【請求項５】
前記アルコールの濃度が、約３０〜１００％（ｖ／ｖ）である、請求項１記載の工程。
【請求項６】
前記ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を濃縮するステップｃ）を更に含んでなる、請求項１から５のいずれか１項記載の工程。
【請求項７】
前記濃縮されたウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を、中極性〜高極性の溶媒で抽出／分画して、第２のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物を得るステップｄ）を更に含んでなる、請求項６記載の工程。
【請求項８】
前記中極性〜高極性の溶媒が、イソブチルアルコール、ｎブタノール、ｎ−酢酸ブチル、クロロホルム、酢酸エチル又はその混合物から選択される、請求項７記載の工程。
【請求項９】
前記中極性〜高極性の溶媒が、酢酸エチルである、請求項８記載の工程。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項記載の工程により調製される、ウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物。
【請求項１１】
治療上有効量の請求項１０記載のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物と、任意に、薬理学的に許容できる担体、希釈剤若しくは賦形剤を含んでなる組成物。
【請求項１２】
食品成分又は医薬組成物である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも１つのメタボリックシンドロームの症状を予防若しくは治療するための薬剤の製造への、請求項１０記載のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物の使用。
【請求項１４】
前記症状が、中心性肥満症（腹部肥満）、脂質異常症、心血管疾患、耐糖能異常又はインスリン耐性である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの活性を阻害するための薬剤の製造への、請求項１０記載のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物の使用。
【請求項１６】
アディポネクチンに関連する疾患を予防若しくは治療するための薬剤の製造への、請求項１０記載のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物の使用。
【請求項１７】
ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体γを活性化するための薬剤の製造への、請求項１０記載のウコギ属植物（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）抽出物の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２０９５４（Ｐ２０１１−２０９５４Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−１６７２２８（Ｐ２００９−１６７２２８）
【出願日】平成２１年７月１５日（２００９．７．１５）
【出願人】（５０６０６２７７９）フード インダストリー リサーチ アンド ディベロップメント インスティテュート (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６７２２８（Ｐ２００９−１６７２２８）
【出願日】平成２１年７月１５日（２００９．７．１５）
【出願人】（５０６０６２７７９）フード インダストリー リサーチ アンド ディベロップメント インスティテュート (3)
【Ｆターム（参考）】
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