エキソヌクレアーゼ活性増強ＤＮＡポリメラーゼ変異体
【課題】ＤＮＡ複製における忠実度の向上したＤＮＡポリメラーゼ、特に、耐熱性を有し、かつＤＮＡ複製における忠実度の向上したＤＮＡポリメラーゼを得る。
【解決手段】ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【解決手段】ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ変異体に関する。詳細には、ＤＮＡポリメラーゼに存する７０６位のアルギニンを電荷を持たないアミノ酸(例えばアラニン)、もしくは、負の電荷を持つアミノ酸（例えばグルタミン酸）に置換することにより得られる、エキソヌクレアーゼ活性を上昇させたＤＮＡポリメラーゼ変異体、それをコードするＤＮＡ、ならびにかかる変異体の用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレート鎖上にハイブリダイズしたプライマー鎖の３’−ＯＨ基と新生鎖として導入する塩基の５’−リン酸基をホスホジエステル結合で連結する活性を有する酵素であり、生体内ではＤＮＡの複製や修復に関与している。従来遺伝子増幅技術として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が開発され、用いられている。ＰＣＲ法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて温度サイクリング反応を行って、標的遺伝子を増幅あるいは検出する方法である。ＰＣＲ法の効率を上げるためにさらなる耐熱性ポリメラーゼが検索され、市販もされている。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼは数千塩基以上にも及ぶテンプレートに対して、精確にテンプレート上の各塩基に対合する塩基を順番に一つずつプライマー鎖に結合して行き、二本鎖ＤＮＡを作成する。その合成速度は、in vivoで毎秒数千塩基にも及ぶとされている。特に、細胞分裂の際には核内のＤＮＡを全て複製する必要があるが、このとき主要な役割を果たすのが複製型ＤＮＡポリメラーゼという種類のＤＮＡポリメラーゼである。膨大な遺伝情報を短い時間で複製する必要があるため、時折テンプレートに対合しない誤った塩基（ミスマッチ塩基）が導入されることがある。そのため複製型ＤＮＡポリメラーゼには上に述べた塩基を導入する二本鎖ＤＮＡ合成（５’→３’ポリメラーゼ機能）の働きのほかに誤って導入されたミスマッチ塩基を取り除く３’→５’エキソヌクレアーゼ機能がある。ミスマッチ塩基はＤＮＡ配列情報を次世代に誤って伝えるため取り除かれなければならず、複製型ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’ポリメラーゼ機能と３’→５’エキソヌクレアーゼ機能のバランスをとりながら、エラーを最小化し、精確なＤＮＡ複製を行う。
【０００４】
ところが、この複製型ＤＮＡポリメラーゼを用いても、複製の忠実度（fidelity）は１００％にならない。今後、より長尺なＤＮＡ合成が求められるようになり、また、並列化も進むことで一つ一つのＤＮＡポリメラーゼの働きの正確さが求められるようになる。本発明は、複製型ＤＮＡポリメラーゼの変異体と、その反応補助因子ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を併用することにより、５’→３’ポリメラーゼ機能と３’→５’エキソヌクレアーゼ機能の平衡を３’→５’エキソヌクレアーゼ側に偏らせて、より忠実度の高いＤＮＡ複製を行うものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決すべき課題は、反応補助因子ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）と協働させることにより３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を増強したＤＮＡポリメラーゼ、特に、耐熱性を有するＤＮＡポリメラーゼを得ることであった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記事情に鑑みて鋭意研究を重ね、ＤＮＡクランプ／ＤＮＡポリメラーゼ複合体の結晶構造解析を行い、その相互作用部位と、それにより安定化される両分子の相対配置、可動範囲を決定することに成功した。その結果、ＤＮＡクランプ／ＤＮＡポリメラーゼ間に主に二箇所の相互作用部位が存在することを見出し、うち一方の相互作用を不活化することで、ＤＮＡクランプとＤＮＡポリメラーゼを協働させた場合において、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が相対的に上昇することを見出した。
【０００７】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を上昇させるため、不活化する方の相互作用部位で主要な役割を果たしているアミノ酸はＤＮＡポリメラーゼでは７０６位のアルギニンである。アルギニンは正の静電荷を持つアミノ酸であるが、このアミノ酸を電荷を持たないアミノ酸（アラニン）、負の静電荷を持つアミノ酸（グルタミン酸）、同じ正の静電荷を持つアミノ酸（リジン）に置換した際、前二者（アラニン、グルタミン酸）において反応補助因子との相互作用強度が大きく変化することを確認し、かつ正の静電荷を持つアミノ酸（リジン）に置換した場合は大きな相互作用強度変化が見出されなかったことから、７０６位のアルギニンの正の静電荷がこの相互作用部位で重要であること見出した。
【０００８】
更にこれまでの研究から、５’→３’ポリメラーゼ機能を果たす場合のＤＮＡポリメラーゼ分子内の基質ＤＮＡの結合角と、３’→５’エキソヌクレアーゼ機能を果たす場合のＤＮＡポリメラーゼ分子内の基質ＤＮＡの結合角は共に明らかにされている。これらをわれわれの解明したＤＮＡクランプ/ＤＮＡポリメラーゼ複合体に重ね合わせて比較すると、５’→３’ポリメラーゼ機能を果たす場合の基質のみが複合体内でＤＮＡクランプと適正な位置関係になる一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ機能を果たす場合の基質は複合体内でＤＮＡクランプと適正な位置関係となりえない。ところが上述の不活化すべき相互作用部位を解消した場合、基質ＤＮＡはＤＮＡクランプと適正な位置関係となりえる。よって我々は７０６位のアルギニンに変異を導入した変異体について３’→５’エキソヌクレアーゼを野生型と比較してみた。その結果、ＤＮＡクランプ・ＤＮＡポリメラーゼ変異体を協働させた場合において、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が相対的に上昇することを見出したのである。図１に、複合体結晶構造解析により明らかとなった、上述の相互作用の不活化による３’→５’エキソヌクレアーゼ活性上昇のメカニズムについて概念図を示した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（２）７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、中性アミノ酸、親水性アミノ酸、または酸性アミノ酸に置換されている、（１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（３）中性アミノ酸がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステインから選択され、親水性アミノ酸がセリン、アスパラギン、グルタミンおよびトレオニンから選択され、酸性アミノ酸がチロシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される、（２）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（４）７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アラニンまたはグルタミン酸に置換されている、（１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（５）７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アスパラギン酸に置換されている、（１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（６）ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されている、（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（７）好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ変異体である、（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
（９）（８）記載のＤＮＡを組み込んだ組換えベクター。
（１０）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＰＣＲ法。
（１１）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＰＣＲ用キット。
（１２）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。
（１３）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＤＮＡシーケンシング用キット。
（１４）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＰＣＲ法。
（１５）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＰＣＲ用キット。
（１６）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。
（１７）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＤＮＡシーケンシング用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ＤＮＡクランプと併用した場合、３’→５’エキソヌクレアーゼが相対的に上昇し、結果的にＤＮＡ複製の忠実度が上昇する。好熱性の生物に由来するＤＮＡポリメラーゼの変異体を用いた場合には、忠実度が高く、かつ耐熱性が優れたＤＮＡ複製系が得られる。さらに、それらをコードするＤＮＡ、ならびにかかるＤＮＡポリメラーゼ、および好ましくはＤＮＡクランプを用いるＰＣＲ法、ＤＮＡシーケンシング法およびそのためのキットが提供される。したがって、より迅速かつ正確なＰＣＲ法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。また本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いると、より長尺なＤＮＡをテンプレートとした系での遺伝子操作を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１．ＤＮＡポリメラーゼ変異体
本発明は、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡクランプの相互作用部位に存するアルギニン、もしくは他のポリメラーゼの相当するアミノ酸を正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換することによって得られるＤＮＡポリメラーゼ変異体を提供するものである。この相互作用部位は複合体の構造を堅固にしていると考えられるが、その反面、３’→５’エキソヌクレアーゼ反応に関しては抑制的に機能しており、そのことによりＤＮＡ複製における忠実度が低減されている。そこで、この相互作用部位に存するＤＮＡポリメラーゼの正電荷アミノ酸に上記の変異を導入し、ＤＮＡクランプと併用することにより、酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および忠実度を向上させることができる。
【００１２】
すなわち、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
【００１３】
ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するとは、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をＤＮＡクランプと協働させた場合に、野生型のＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡクランプと協働させた場合と比較して、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が増強されていることをさす。換言すれば、ＤＮＡクランプ共存下の本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体が、ＤＮＡクランプ共存下の野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較して、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が増強されていることをさす。
【００１４】
ＤＮＡクランプは、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）とも称され、ＤＮＡポリメラーゼの合成持続性を増大させる因子としてが知られている。ＰＣＮＡはＤＮＡを囲む形でトライマーを形成し、ＤＮＡポリメラーゼと結合してその合成持続性を高める。
【００１５】
本発明にかかるピロコッカス・フリオサスの野生型ＤＮＡポリメラーゼの塩基配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される。
【００１６】
本発明において「ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸」は、ホモロジー解析に基づいて特定される。より具体的には、「配列番号２のアミノ酸配列を参照配列としたときの７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸」を意味し、任意のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列Ｚを配列番号２のアミノ酸配列とアラインメントしたときに、配列番号２のアミノ酸配列の１番目の塩基から数えて７０６番目のアミノ酸に対してアラインされる（すなわち、アラインメントにおいて同じ縦列に整列される）、アミノ酸配列Ｚ中のアミノ酸を意味する。なお、ホモロジー解析としては、例えばLimpan-Pearson法のような任意の公知のホモロジー解析法を利用することができる。
【００１７】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体のもととなるＤＮＡポリメラーゼは、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸としてアルギニンまたはリジンを有するものであればよく、その起源はいずれのものであってもよい。好ましくは複製型ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＰＣＲ法の効率および信頼性を向上させること等を考慮すると、反応性および耐熱性がいずれも向上したＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。したがって、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を得るためのＤＮＡポリメラーゼ、およびこれと併用するＤＮＡクランプとしては、例えば好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプが好ましい。このような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにおいて、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定される正電荷アミノ酸（アルギニンまたはリジン）を、正電荷を持たない他のアミノ酸、とりわけ負電荷を持つアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）に置換しＤＮＡクランプと併用することにより、ＤＮＡ複製における忠実度ならびに耐熱性が優れたＤＮＡ複製系を得ることができる。
【００１８】
特に好ましいＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプとしては好熱性細菌（例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）等）、超好熱性細菌（例えば、サーモトガ・マリテマ（Thermotoga maritima）等）、好熱性古細菌（例えば、サーモプラズマ・ボルカニウム（Thermoplasma volcanium）等）または超好熱性古細菌（例えば、アエロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）等）由来のものが挙げられ、超好熱性細菌または超好熱性古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプが最も好ましい。最も好ましいＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプの例としては、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプが挙げられる。
【００１９】
ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定される正電荷アミノ酸を置換するアミノ酸は、正電荷を有しないアミノ酸（正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸）であれば特に制限されない。例えば、中性アミノ酸（アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン）、親水性アミノ酸（セリン、アスパラギン、グルタミン、トレオニン）、または酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン）である。アミノ酸置換は当業者に公知の方法を用いて行うことができるが、好ましくは部位特異的突然変異法を用いて行う。アミノ酸置換については変異導入アミノ酸のコドンを変異後のアミノ酸のコドンに置換することによって行うことができる。
【００２０】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の具体例としては、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸、特に、電荷を有しないアミノ酸（中性アミノ酸、例えばグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、特にアラニン）または負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、特にグルタミン酸）に置換されているＤＮＡポリメラーゼ変異体が挙げられる。
【００２１】
２．ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡ
本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡの塩基配列では、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸をコードする塩基配列が別のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されている。具体的には、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡにおいて、当該野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンをコードする塩基配列が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されている。
【００２２】
塩基配列の置換は、野生型のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡに部位特異的に変異を導入することにより、行うことができる。部位特異的な変異導入は既知のどのような方法を用いてもよく、例えばインビトロジェン社のＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍのような市販のキットを用いて実施することができる。
【００２３】
３．ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクター
本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼ変異体ＤＮＡをプラスミドＤＮＡやファージＤＮＡなどのベクターＤＮＡに挿入した組換えベクターを提供する。
【００２４】
前記プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ｐＹＥ５２等）などが、ファージＤＮＡとしてはＭ１３ファージ、λファージ等が挙げられる。
【００２５】
前記ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。この時挿入されるＤＮＡ断片はＰＣＲ法等を利用して作製することが可能である。
【００２６】
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに異なる。また、必要であればエンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー）等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。また、市販の発現ベクターシステム、例えばノバジェン社のｐＥＴベクターシステムやポストゲノム研究所のｐＵＲＥベクターシステムなども利用できる。
【００２７】
このようなＤＮＡポリメラーゼ変異体を発現しうるプラスミドの例としては、本発明により得られたｐＥＴ１５ｂ−ＰｆｕＰｏｌＲ７０６Ａ、ｐＥＴ１５ｂ−ＰｆｕＰｏｌＲ７０６Ｅが挙げられ、これらとＤＮＡクランプを併用して、耐熱性ならびにＤＮＡ複製における忠実度の優れたＤＮＡポリメラーゼ変異体を製造することができる。
【００２８】
４．ＤＮＡポリメラーゼ変異体の合成
次いで、前記ベクターをＤＮＡポリメラーゼが発現しうるように宿主中に導入し、ＤＮＡポリメラーゼ変異体発現系を作製する。ここで宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されず、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など既知の宿主のいずれでも発現ベクターのシステムを適合させることにより利用できる。
【００２９】
例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cervisiae）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces. pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、その他ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ１９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を挙げることができる。
【００３０】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株、Ｂ株等が挙げられ、枯草菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＭＩ １１４、２０７−２１等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の上記宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。また、ｔａｃプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。また、アクチンプロモーターも使用できる。細菌への組換えベクターの導入方法は、特に限定されず、エレクトロポレーション法などが利用できる。
【００３１】
酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス等が用いられる。プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を挙げることができる。酵母へのベクターの導入方法は、特に限定されず、エレクトロポレーション法などが利用できる。
【００３２】
またＴ７プロモーター等を利用して試験管内で蛋白質を合成する無細胞蛋白質合成系も利用できる。無細胞蛋白質合成系としては、例えばＰＵＲＥ ＳＹＳＴＥＭ（ポストゲノム研究所）などが使用できる。細胞系での蛋白質合成は、細胞培養が必要であるため、操作が煩雑でバイオハザードの問題があることに加えて、合成蛋白質による培養細胞系の生育阻害の問題もある。これに対して無細胞蛋白質合成系には、（１）生細胞取扱い時に生じる全ての問題（細胞の培養の煩雑さ等）から開放される、（２）細胞にとって有害となる蛋白質も生産できる、（３）操作が比較的簡単で、短時間で目的蛋白質を得ることができるため、ハイスループット化が可能である、（４）簡単に非天然型アミノ酸の導入ができるので目的蛋白質の標識も容易である、という利点がある。
【００３３】
５．合成ＤＮＡポリメラーゼの精製
合成したＤＮＡポリメラーゼ変異体を精製回収するためには透析、限外ろ過、各種のカラムクロマトグラフィーなど既存の精製システムが利用できる。合成したＤＮＡポリメラーゼ変異体の量が少量（５００ｎｇ程度）の場合、ＤＮＡポリメラーゼ変異体蛋白質にタグ配列を導入し、このタグ配列に対するアフィニティーを利用してＤＮＡポリメラーゼ変異体を回収する方法が望ましい。例えば、無細胞蛋白質合成系であるＰＵＲＥ ＳＹＳＴＥＭでＤＮＡポリメラーゼを合成した場合、タグ配列としてＳｔｒｅｐ−ｔａｇ配列やＦｌａｇ−ｔａｇ配列などを導入すればＤＮＡポリメラーゼ変異体を回収することができる。回収されたＤＮＡポリメラーゼ変異体の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡクランプと協働させて（ＤＮＡクランプの存在下で）測定することにより評価することができる。
【００３４】
６．本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いるＰＣＲ法、ＤＮＡシーケンシング法およびそのためのキット
本発明は、さらなる態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＰＣＲ法、および本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＰＣＲ用キットを提供する。上述のごとく、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体、特に耐熱性に優れたものはＰＣＲ法に用いることにより威力を発揮する。すなわち、耐熱性ならびにＤＮＡ複製における忠実度が優れた本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をＤＮＡクランプと併用すれば、より迅速かつ信頼性に富むＰＣＲ法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ変異体と併用するＤＮＡクランプは、用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のものであることが好ましい。同生物種由来とは、ＤＮＡポリメラーゼ変異体のもととなったＤＮＡポリメラーゼが由来する生物種と同じ生物種に由来することをさす。
【００３５】
例えば、ＤＮＡポリメラーゼ変異体として、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いる場合、ＤＮＡクランプとしてピロコッカス・フリオサス由来のものを併用するのが好ましい。ピロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡクランプとしては、例えば、配列番号１０または１２のアミノ酸配列からなるＤＮＡクランプが挙げられる。配列番号１０または１２のアミノ酸配列において、１または数個（２個または３個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、ＤＮＡクランプとしての活性を有する蛋白質も用いることができる。かかるＰＣＲ法を行うためのキットは、その必須構成成分として本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含み、好ましくはさらに該ＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプを含む。
【００３６】
本発明は、さらなる態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法、および本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＤＮＡシーケンシング用キットを提供する。ＤＮＡ複製における忠実度が優れた本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をＤＮＡクランプと併用すれば、より迅速かつ信頼性に富むＰＣＲ法を行うことができ、結果として迅速かつ信頼性に富むＤＮＡシーケンシングを行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ変異体と併用するＤＮＡクランプは、用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のものであることが好ましい。かかるＤＮＡシーケンシング法を行うためのキットは、その必須構成成分として本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含み、好ましくはさらに該ＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプを含む。
【００３７】
本発明のＰＣＲ用キットおよびＤＮＡシーケンシング用キットには、通常、キットの取扱説明書が添付され、さらに、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、反応液を適正なｐＨに保つための緩衝成分などのＤＮＡポリメラーゼの反応に必要な試薬が含まれていてもよい。
【００３８】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【００３９】
（実施例１）７０６位アミノ酸変異導入ＤＮＡポリメラーゼの調製
（１）ピロコッカス・フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ゲノムＤＮＡの調製
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３８はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨより入手し、文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２１巻、２５９−２６５ページ）の方法に従って培養した。５００ｍｌの培養液から約１．２ｇの菌体を得た。これを緩衝液Ｌ（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）１０ｍｌに懸濁し、１０％ ＳＤＳを１ｍｌ加えた。撹拌の後、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍｌ加えて、５５℃で６０分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてＤＮＡを不溶化した。回収したＤＮＡを１ｍｌのＴＥ液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、０．７５ｍｇのＲＮａｓｅ Ａを加えて３７℃で６０分反応させた。その後反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。０．７５ｍｇのＤＮＡが得られた。
【００４０】
（２）ｐｏｌ遺伝子・ｐｃｎａ遺伝子のクローン化
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムＤＮＡからｐｏｌ遺伝子と予想される領域をＰＣＲで増幅した。ｐｏｌ遺伝子の翻訳開始コドンと予想されるＡＴＧに合わせてＮｃｏＩ認識配列をフォワードプライマー内に組込んだ。リバースプライマーには終止コドンの直後にＳｐｈＩ認識配列を導入した。ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を３０サイクル行うＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅した。１ｓｔ ＰＣＲ産物を鋳型として、同じ条件で２ｎｄ ＰＣＲを行い、その産物をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（プロメガ社）に組み込み、ＤＮＡシークエンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔａｒ社）を用いてその挿入断片領域の塩基配列の確認を行った。その後、ＮｃｏＩ−ＳｐｈＩで切断してｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクターから切り出したｐｏｌ遺伝子をｐＥＴ１５ｂベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に挿入し、プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌを得た。
【００４１】
プラスミドｐＥＴ２１ａ−ｐｃｎａも同様の手順にて取得した。
【００４２】
このプラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌを鋳型として７０６位のアルギニンをアラニンに置換した変異体（Ｒ７０６Ａ）を作製するべく、部位特異的突然変異法により、以下の手順で変異点導入を行った。変異体（Ｒ７０６Ａ）作製用プライマーセット５’−ＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＴＡＣＴＴＧＣＡＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１５）、５’−ＴＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号１６）と、ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を２０サイクル行うＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅し、目的のＲ７０６Ａプラスミド（ｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６Ａ）を得ることができた。
【００４３】
つぎに、７０６位のアルギニンをグルタミン酸に置換させた変異体（Ｒ７０６Ｅ）を作成するべく、部位特異的突然変異法により、以下の手順で変異点導入を行った。プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌを鋳型として変異体（Ｒ７０６Ｅ）作製用プライマーセット５’−ＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１７）、５’−ＴＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号１８）と、ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を２０サイクル行うＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅し、目的のＲ７０６Ｅプラスミド（ｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６Ｅ）を得ることができた。
【００４４】
（３）Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来野生型ポリメラーゼ、および７０６位のアルギニンに変異を導入したポリメラーゼ（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）の大量発現系の構築および精製
以下、無処理（野生型）ポリメラーゼについての大量発現系の構築および精製について記すが、７０６位のアルギニンに変異を導入したポリメラーゼ（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）についても、最初に用いるプラスミドがｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６ＡおよびｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６Ａになるだけで他の手順は全く同じで、同様に大量発現させ、精製することができた。
【００４５】
プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌによってコンピータントセルＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社ＢＬ２１ コドンプラスＲＩＬをトランスフォーム（形質転換）して、１００μｇ・ｍＬ−１のアンピシリンおよび２０μｇ・ｍＬ−１のクロラムフェニコール存在下のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を用いて３７℃にて培養を行った。培養液濁度（６６０ｎｍ吸光度）が０．６に到達した時点で、終濃度１ｍＭになるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、蛋白質の発現を誘導した。さらに６時間培養を行った後、遠心分離器で菌体を回収した。菌体はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離した。上清を８０℃、２０分間加熱処理を行い遠心分離した。上清に終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）になるようポリエチレンイミンを添加し、遠心分離にて核酸成分を除去した。この溶液に８０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離し、沈殿を採取した。
【００４６】
沈殿はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解して、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．１−０．２Ｍでの溶出画分を採取した。つぎにこの画分を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、同じくＮａＣｌ濃度０．１−０．２Ｍでの溶出画分を採取した。この溶液を濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ ２６／６０、ＧＥヘルスケア社）を用いて、流速１ｍｌ／分で分離操作を行い、８０分辺りに溶出されるメインピークを採取した。この溶液について電気泳動を行ったところ、蛋白質の純度としては９９％以上の純度であることを確認することができた。このように、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を容易に得られることがわかった。
【００４７】
天然のピロコッカス・フリオサスのＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。実施例１で得られた野生型のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。実施例１で得られた変異体Ｒ７０６Ａをコードする塩基配列を配列番号５に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。実施例１で得られた変異体Ｒ７０６Ｅをコードする塩基配列を配列番号７に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００４８】
（４）Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来野生型ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）の大量発現系の構築および精製
プラスミドｐＥＴ２１ａ−ｐｃｎａによってコンピータントセルＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社ＢＬ２１ コドンプラスＲＩＬを形質転換して、１００μｇ・ｍＬ−１のアンピシリンおよび２０μｇ・ｍＬ−１のクロラムフェニコール存在下のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を用いて３７℃にて培養を行った。培養液濁度（６６０ｎｍ吸光度）が０．６に到達した時点で、終濃度１ｍＭになるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、蛋白質の発現を誘導した。さらに６時間培養を行った後、遠心分離器で菌体を回収した。菌体はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離した。上清を８０℃、２０分間加熱処理を行い遠心分離した。上清に終濃度０．１０％（ｗ／ｖ）になるようポリエチレンイミンを添加し、遠心分離にて核酸成分を除去した。この溶液に８０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離し、沈殿を採取した。
【００４９】
沈殿はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解して、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．５〜０．６Ｍでの溶出画分を採取した。つぎにこの画分を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．４〜０．５Ｍでの溶出画分を採取した。この溶液について電気泳動を行ったところ、蛋白質の純度としては９９％以上の純度であることを確認した。このように、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を得た。
【００５０】
天然のピロコッカス・フリオサスのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号９に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。実施例１で得られた野生型のＤＮＡクランプをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【００５１】
（実施例２）７０６位のアルギニンに変異導入したＤＮＡポリメラーゼ変異体の反応活性の野生型との比較
野生型ＤＮＡポリメラーゼと変異体のプライマー伸長活性をＤＮＡクランプ存在・非存在下で比較した。Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、これに２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせたものを基質として用いた。反応溶液は２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２００μＭ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ（５μＣｉ ｏｆ ［α３２Ｐ］ｄＴＴＰ｝］）を含み、７０℃、１分間予め熱しておいて、１０ｎＭ ＤＮＡポリメラーゼを添加して反応を開始した。７０℃、２分間反応を行った後、アガロースゲルを用いて泳動し、オートラジオグラフィーにより泳動パターンの解析を行った。
【００５２】
図２に、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長反応の結果（レーン１）と、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび各種変異体（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）の伸長反応の結果を示す（レーン２〜４）。ＤＮＡクランプ添加によるプライマー伸長反応の上昇は野生型、各変異体とも大差なく５’→３’ポリメラーゼ活性には変異による影響は大きくないことがわかった。
【００５３】
野生型ＤＮＡポリメラーゼと変異体の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をＤＮＡクランプ存在・非存在下で比較した。基質としてはＨｐａＩ処理を行ったｐＥＴ２１ａを用いた。反応溶液は２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ （ｐＨ８．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５％ｖ／ｖグリセロール、０．５ｎＭ 基質ｐＥＴ２１ａで、これに１．５ｎＭのＤＮＡポリメラーゼを添加して反応を開始した。６０℃、１時間反応を行った後、反応停止溶液として、９８％脱イオン化ホルムアミド、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロムフェノールブルーを含んだ溶液を添加することにより反応を停止し、反応産物を、アガロースゲルで泳動した。ゲルをＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（インビトロジェン社）染色後、フルオロイメージャー５９５（ＧＥヘルスケア社）を用いて泳動パターンの解析を行った。
【００５４】
図３にＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在・非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび変異体（Ｒ７０６Ｅ）の、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の変化を示す。ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）非存在下では両者とも同等で非常に弱い活性を示すが（レーン２、４）、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在下では、野生型では活性の僅かな増強しか見られないのに対し、変異体（Ｒ７０６Ｅ）では３’→５’エキソヌクレアーゼ活性増強の度合いは変異体の数倍以上と見積もられた。このことからこのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）とＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を協調させてＤＮＡ複製を行うことで通常より３’→５’エキソヌクレアーゼ機能が亢進した状態で、ＤＮＡ複製を継続できるため、従来より信頼性の高いＤＮＡを高速で行うことが可能となる。
【００５５】
（実施例３）本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の耐熱性
実施例２で使用したＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプは、野生型、変異体共に精製の初期段階において、非耐熱性蛋白質を故意に変性させ、その後の精製操作を簡便化することを目的として、８５℃、２０分間の加熱処理を行ったものである。かかる加熱処理において、変異体は野生型に遜色のない耐熱性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、ＤＮＡ複製において高信頼性で、高速に複製反応を行うことができる系が得られるので、本発明は、生化学の研究分野、研究用試薬分野、診断用試薬分野、製薬分野などにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＤＮＡクランプ／ＤＮＡポリメラーゼ複合体の結晶構造解析を行った結果、その相互作用部位と、それにより安定化される両分子の相対配置、可動範囲を決定した。その結果、ＤＮＡクランプ・ＤＮＡポリメラーゼ間に主に二箇所の相互作用部位が存在することを見出した。図１は両相互作用を維持した状態は５’→３’ポリメラーゼ機能を発現しやすい相対配置を呈するのに対し（図上段）、うち一方の相互作用（２ｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｓｉｔｅ）を不活化することで、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が発現しやすい相対配置を惹き起こす。これは、２ｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｓｉｔｅを不活化したＤＮＡ複製系においては忠実度が上昇することを示唆する（図下段）。
【図２】ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長反応の結果（レーン１）と、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび各種変異体（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）の伸長反応の結果を示す（レーン２〜４）。ＤＮＡクランプがない場合（レーン１）に比べてプライマー伸長はＤＮＡクランプの添加により大幅に促進される。うち、野生型における促進効果が一番高く（レーン２）、変異体ではＲ７０６Ａ（レーン３）、Ｒ７０６Ｅ（レーン４）の順に少しずつ効果が低くなるが、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）による促進の程度に比べて殆ど無視できる程度の減少である。
【図３】ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在・非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび変異体（Ｒ７０６Ｅ）の、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の変化を示す。レーン１はポリメラーゼを入れないｎｕｌｌレーンで未反応基質ＤＮＡの長さを表す。図中下方が、よりエキソヌクレアーゼ活性が高いことを示す。ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を入れない場合、野生型（レーン２）、Ｒ７０６Ｅ（レーン４）共に、同程度の低いエキソヌクレアーゼ活性しか示さない一方で、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を添加すると、共に活性は増大し（レーン３、５）、特に変異体Ｒ７０６Ｅでは野生型の二倍程度のエキソヌクレアーゼ活性を呈する（レーン５）。これはＲ７０６Ｅで有意にエキソヌクレアーゼ活性がより増大し、この系でより忠実度の高い複製を行うことが可能であることを示している。
【００５８】
配列表フリーテキスト
配列番号１は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼをコードする塩基配列である。
配列番号２は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼをコードする塩基配列である。
配列番号４は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）をコードする塩基配列である。
配列番号６は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）のアミノ酸配列である。
配列番号７は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）をコードする塩基配列である。
配列番号８は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）のアミノ酸配列である。
配列番号９は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）をコードする塩基配列である。
配列番号１０は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）のアミノ酸配列である。
配列番号１１は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）をコードする塩基配列である。
配列番号１２は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）のアミノ酸配列である。
配列番号１３はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号１４はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号１５はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号１６はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ変異体に関する。詳細には、ＤＮＡポリメラーゼに存する７０６位のアルギニンを電荷を持たないアミノ酸(例えばアラニン)、もしくは、負の電荷を持つアミノ酸（例えばグルタミン酸）に置換することにより得られる、エキソヌクレアーゼ活性を上昇させたＤＮＡポリメラーゼ変異体、それをコードするＤＮＡ、ならびにかかる変異体の用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレート鎖上にハイブリダイズしたプライマー鎖の３’−ＯＨ基と新生鎖として導入する塩基の５’−リン酸基をホスホジエステル結合で連結する活性を有する酵素であり、生体内ではＤＮＡの複製や修復に関与している。従来遺伝子増幅技術として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が開発され、用いられている。ＰＣＲ法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて温度サイクリング反応を行って、標的遺伝子を増幅あるいは検出する方法である。ＰＣＲ法の効率を上げるためにさらなる耐熱性ポリメラーゼが検索され、市販もされている。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼは数千塩基以上にも及ぶテンプレートに対して、精確にテンプレート上の各塩基に対合する塩基を順番に一つずつプライマー鎖に結合して行き、二本鎖ＤＮＡを作成する。その合成速度は、in vivoで毎秒数千塩基にも及ぶとされている。特に、細胞分裂の際には核内のＤＮＡを全て複製する必要があるが、このとき主要な役割を果たすのが複製型ＤＮＡポリメラーゼという種類のＤＮＡポリメラーゼである。膨大な遺伝情報を短い時間で複製する必要があるため、時折テンプレートに対合しない誤った塩基（ミスマッチ塩基）が導入されることがある。そのため複製型ＤＮＡポリメラーゼには上に述べた塩基を導入する二本鎖ＤＮＡ合成（５’→３’ポリメラーゼ機能）の働きのほかに誤って導入されたミスマッチ塩基を取り除く３’→５’エキソヌクレアーゼ機能がある。ミスマッチ塩基はＤＮＡ配列情報を次世代に誤って伝えるため取り除かれなければならず、複製型ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’ポリメラーゼ機能と３’→５’エキソヌクレアーゼ機能のバランスをとりながら、エラーを最小化し、精確なＤＮＡ複製を行う。
【０００４】
ところが、この複製型ＤＮＡポリメラーゼを用いても、複製の忠実度（fidelity）は１００％にならない。今後、より長尺なＤＮＡ合成が求められるようになり、また、並列化も進むことで一つ一つのＤＮＡポリメラーゼの働きの正確さが求められるようになる。本発明は、複製型ＤＮＡポリメラーゼの変異体と、その反応補助因子ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を併用することにより、５’→３’ポリメラーゼ機能と３’→５’エキソヌクレアーゼ機能の平衡を３’→５’エキソヌクレアーゼ側に偏らせて、より忠実度の高いＤＮＡ複製を行うものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決すべき課題は、反応補助因子ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）と協働させることにより３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を増強したＤＮＡポリメラーゼ、特に、耐熱性を有するＤＮＡポリメラーゼを得ることであった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記事情に鑑みて鋭意研究を重ね、ＤＮＡクランプ／ＤＮＡポリメラーゼ複合体の結晶構造解析を行い、その相互作用部位と、それにより安定化される両分子の相対配置、可動範囲を決定することに成功した。その結果、ＤＮＡクランプ／ＤＮＡポリメラーゼ間に主に二箇所の相互作用部位が存在することを見出し、うち一方の相互作用を不活化することで、ＤＮＡクランプとＤＮＡポリメラーゼを協働させた場合において、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が相対的に上昇することを見出した。
【０００７】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を上昇させるため、不活化する方の相互作用部位で主要な役割を果たしているアミノ酸はＤＮＡポリメラーゼでは７０６位のアルギニンである。アルギニンは正の静電荷を持つアミノ酸であるが、このアミノ酸を電荷を持たないアミノ酸（アラニン）、負の静電荷を持つアミノ酸（グルタミン酸）、同じ正の静電荷を持つアミノ酸（リジン）に置換した際、前二者（アラニン、グルタミン酸）において反応補助因子との相互作用強度が大きく変化することを確認し、かつ正の静電荷を持つアミノ酸（リジン）に置換した場合は大きな相互作用強度変化が見出されなかったことから、７０６位のアルギニンの正の静電荷がこの相互作用部位で重要であること見出した。
【０００８】
更にこれまでの研究から、５’→３’ポリメラーゼ機能を果たす場合のＤＮＡポリメラーゼ分子内の基質ＤＮＡの結合角と、３’→５’エキソヌクレアーゼ機能を果たす場合のＤＮＡポリメラーゼ分子内の基質ＤＮＡの結合角は共に明らかにされている。これらをわれわれの解明したＤＮＡクランプ/ＤＮＡポリメラーゼ複合体に重ね合わせて比較すると、５’→３’ポリメラーゼ機能を果たす場合の基質のみが複合体内でＤＮＡクランプと適正な位置関係になる一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ機能を果たす場合の基質は複合体内でＤＮＡクランプと適正な位置関係となりえない。ところが上述の不活化すべき相互作用部位を解消した場合、基質ＤＮＡはＤＮＡクランプと適正な位置関係となりえる。よって我々は７０６位のアルギニンに変異を導入した変異体について３’→５’エキソヌクレアーゼを野生型と比較してみた。その結果、ＤＮＡクランプ・ＤＮＡポリメラーゼ変異体を協働させた場合において、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が相対的に上昇することを見出したのである。図１に、複合体結晶構造解析により明らかとなった、上述の相互作用の不活化による３’→５’エキソヌクレアーゼ活性上昇のメカニズムについて概念図を示した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（２）７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、中性アミノ酸、親水性アミノ酸、または酸性アミノ酸に置換されている、（１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（３）中性アミノ酸がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステインから選択され、親水性アミノ酸がセリン、アスパラギン、グルタミンおよびトレオニンから選択され、酸性アミノ酸がチロシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される、（２）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（４）７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アラニンまたはグルタミン酸に置換されている、（１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（５）７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アスパラギン酸に置換されている、（１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（６）ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されている、（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（７）好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ変異体である、（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
（９）（８）記載のＤＮＡを組み込んだ組換えベクター。
（１０）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＰＣＲ法。
（１１）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＰＣＲ用キット。
（１２）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。
（１３）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＤＮＡシーケンシング用キット。
（１４）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＰＣＲ法。
（１５）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＰＣＲ用キット。
（１６）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。
（１７）（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＤＮＡシーケンシング用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ＤＮＡクランプと併用した場合、３’→５’エキソヌクレアーゼが相対的に上昇し、結果的にＤＮＡ複製の忠実度が上昇する。好熱性の生物に由来するＤＮＡポリメラーゼの変異体を用いた場合には、忠実度が高く、かつ耐熱性が優れたＤＮＡ複製系が得られる。さらに、それらをコードするＤＮＡ、ならびにかかるＤＮＡポリメラーゼ、および好ましくはＤＮＡクランプを用いるＰＣＲ法、ＤＮＡシーケンシング法およびそのためのキットが提供される。したがって、より迅速かつ正確なＰＣＲ法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。また本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いると、より長尺なＤＮＡをテンプレートとした系での遺伝子操作を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１．ＤＮＡポリメラーゼ変異体
本発明は、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡクランプの相互作用部位に存するアルギニン、もしくは他のポリメラーゼの相当するアミノ酸を正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換することによって得られるＤＮＡポリメラーゼ変異体を提供するものである。この相互作用部位は複合体の構造を堅固にしていると考えられるが、その反面、３’→５’エキソヌクレアーゼ反応に関しては抑制的に機能しており、そのことによりＤＮＡ複製における忠実度が低減されている。そこで、この相互作用部位に存するＤＮＡポリメラーゼの正電荷アミノ酸に上記の変異を導入し、ＤＮＡクランプと併用することにより、酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および忠実度を向上させることができる。
【００１２】
すなわち、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
【００１３】
ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するとは、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をＤＮＡクランプと協働させた場合に、野生型のＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡクランプと協働させた場合と比較して、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が増強されていることをさす。換言すれば、ＤＮＡクランプ共存下の本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体が、ＤＮＡクランプ共存下の野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較して、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が増強されていることをさす。
【００１４】
ＤＮＡクランプは、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）とも称され、ＤＮＡポリメラーゼの合成持続性を増大させる因子としてが知られている。ＰＣＮＡはＤＮＡを囲む形でトライマーを形成し、ＤＮＡポリメラーゼと結合してその合成持続性を高める。
【００１５】
本発明にかかるピロコッカス・フリオサスの野生型ＤＮＡポリメラーゼの塩基配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される。
【００１６】
本発明において「ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸」は、ホモロジー解析に基づいて特定される。より具体的には、「配列番号２のアミノ酸配列を参照配列としたときの７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸」を意味し、任意のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列Ｚを配列番号２のアミノ酸配列とアラインメントしたときに、配列番号２のアミノ酸配列の１番目の塩基から数えて７０６番目のアミノ酸に対してアラインされる（すなわち、アラインメントにおいて同じ縦列に整列される）、アミノ酸配列Ｚ中のアミノ酸を意味する。なお、ホモロジー解析としては、例えばLimpan-Pearson法のような任意の公知のホモロジー解析法を利用することができる。
【００１７】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体のもととなるＤＮＡポリメラーゼは、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸としてアルギニンまたはリジンを有するものであればよく、その起源はいずれのものであってもよい。好ましくは複製型ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＰＣＲ法の効率および信頼性を向上させること等を考慮すると、反応性および耐熱性がいずれも向上したＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。したがって、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を得るためのＤＮＡポリメラーゼ、およびこれと併用するＤＮＡクランプとしては、例えば好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプが好ましい。このような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにおいて、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定される正電荷アミノ酸（アルギニンまたはリジン）を、正電荷を持たない他のアミノ酸、とりわけ負電荷を持つアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）に置換しＤＮＡクランプと併用することにより、ＤＮＡ複製における忠実度ならびに耐熱性が優れたＤＮＡ複製系を得ることができる。
【００１８】
特に好ましいＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプとしては好熱性細菌（例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）等）、超好熱性細菌（例えば、サーモトガ・マリテマ（Thermotoga maritima）等）、好熱性古細菌（例えば、サーモプラズマ・ボルカニウム（Thermoplasma volcanium）等）または超好熱性古細菌（例えば、アエロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）等）由来のものが挙げられ、超好熱性細菌または超好熱性古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプが最も好ましい。最も好ましいＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプの例としては、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプが挙げられる。
【００１９】
ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定される正電荷アミノ酸を置換するアミノ酸は、正電荷を有しないアミノ酸（正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸）であれば特に制限されない。例えば、中性アミノ酸（アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン）、親水性アミノ酸（セリン、アスパラギン、グルタミン、トレオニン）、または酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン）である。アミノ酸置換は当業者に公知の方法を用いて行うことができるが、好ましくは部位特異的突然変異法を用いて行う。アミノ酸置換については変異導入アミノ酸のコドンを変異後のアミノ酸のコドンに置換することによって行うことができる。
【００２０】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の具体例としては、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸、特に、電荷を有しないアミノ酸（中性アミノ酸、例えばグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、特にアラニン）または負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、特にグルタミン酸）に置換されているＤＮＡポリメラーゼ変異体が挙げられる。
【００２１】
２．ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡ
本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡの塩基配列では、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸をコードする塩基配列が別のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されている。具体的には、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡにおいて、当該野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンをコードする塩基配列が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されている。
【００２２】
塩基配列の置換は、野生型のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡに部位特異的に変異を導入することにより、行うことができる。部位特異的な変異導入は既知のどのような方法を用いてもよく、例えばインビトロジェン社のＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍのような市販のキットを用いて実施することができる。
【００２３】
３．ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクター
本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼ変異体ＤＮＡをプラスミドＤＮＡやファージＤＮＡなどのベクターＤＮＡに挿入した組換えベクターを提供する。
【００２４】
前記プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ｐＹＥ５２等）などが、ファージＤＮＡとしてはＭ１３ファージ、λファージ等が挙げられる。
【００２５】
前記ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。この時挿入されるＤＮＡ断片はＰＣＲ法等を利用して作製することが可能である。
【００２６】
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに異なる。また、必要であればエンハンサー（例えば、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー）等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。また、市販の発現ベクターシステム、例えばノバジェン社のｐＥＴベクターシステムやポストゲノム研究所のｐＵＲＥベクターシステムなども利用できる。
【００２７】
このようなＤＮＡポリメラーゼ変異体を発現しうるプラスミドの例としては、本発明により得られたｐＥＴ１５ｂ−ＰｆｕＰｏｌＲ７０６Ａ、ｐＥＴ１５ｂ−ＰｆｕＰｏｌＲ７０６Ｅが挙げられ、これらとＤＮＡクランプを併用して、耐熱性ならびにＤＮＡ複製における忠実度の優れたＤＮＡポリメラーゼ変異体を製造することができる。
【００２８】
４．ＤＮＡポリメラーゼ変異体の合成
次いで、前記ベクターをＤＮＡポリメラーゼが発現しうるように宿主中に導入し、ＤＮＡポリメラーゼ変異体発現系を作製する。ここで宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されず、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など既知の宿主のいずれでも発現ベクターのシステムを適合させることにより利用できる。
【００２９】
例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cervisiae）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces. pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、その他ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ１９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を挙げることができる。
【００３０】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株、Ｂ株等が挙げられ、枯草菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＭＩ １１４、２０７−２１等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の上記宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。また、ｔａｃプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。また、アクチンプロモーターも使用できる。細菌への組換えベクターの導入方法は、特に限定されず、エレクトロポレーション法などが利用できる。
【００３１】
酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス等が用いられる。プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を挙げることができる。酵母へのベクターの導入方法は、特に限定されず、エレクトロポレーション法などが利用できる。
【００３２】
またＴ７プロモーター等を利用して試験管内で蛋白質を合成する無細胞蛋白質合成系も利用できる。無細胞蛋白質合成系としては、例えばＰＵＲＥ ＳＹＳＴＥＭ（ポストゲノム研究所）などが使用できる。細胞系での蛋白質合成は、細胞培養が必要であるため、操作が煩雑でバイオハザードの問題があることに加えて、合成蛋白質による培養細胞系の生育阻害の問題もある。これに対して無細胞蛋白質合成系には、（１）生細胞取扱い時に生じる全ての問題（細胞の培養の煩雑さ等）から開放される、（２）細胞にとって有害となる蛋白質も生産できる、（３）操作が比較的簡単で、短時間で目的蛋白質を得ることができるため、ハイスループット化が可能である、（４）簡単に非天然型アミノ酸の導入ができるので目的蛋白質の標識も容易である、という利点がある。
【００３３】
５．合成ＤＮＡポリメラーゼの精製
合成したＤＮＡポリメラーゼ変異体を精製回収するためには透析、限外ろ過、各種のカラムクロマトグラフィーなど既存の精製システムが利用できる。合成したＤＮＡポリメラーゼ変異体の量が少量（５００ｎｇ程度）の場合、ＤＮＡポリメラーゼ変異体蛋白質にタグ配列を導入し、このタグ配列に対するアフィニティーを利用してＤＮＡポリメラーゼ変異体を回収する方法が望ましい。例えば、無細胞蛋白質合成系であるＰＵＲＥ ＳＹＳＴＥＭでＤＮＡポリメラーゼを合成した場合、タグ配列としてＳｔｒｅｐ−ｔａｇ配列やＦｌａｇ−ｔａｇ配列などを導入すればＤＮＡポリメラーゼ変異体を回収することができる。回収されたＤＮＡポリメラーゼ変異体の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡクランプと協働させて（ＤＮＡクランプの存在下で）測定することにより評価することができる。
【００３４】
６．本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いるＰＣＲ法、ＤＮＡシーケンシング法およびそのためのキット
本発明は、さらなる態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＰＣＲ法、および本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＰＣＲ用キットを提供する。上述のごとく、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体、特に耐熱性に優れたものはＰＣＲ法に用いることにより威力を発揮する。すなわち、耐熱性ならびにＤＮＡ複製における忠実度が優れた本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をＤＮＡクランプと併用すれば、より迅速かつ信頼性に富むＰＣＲ法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ変異体と併用するＤＮＡクランプは、用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のものであることが好ましい。同生物種由来とは、ＤＮＡポリメラーゼ変異体のもととなったＤＮＡポリメラーゼが由来する生物種と同じ生物種に由来することをさす。
【００３５】
例えば、ＤＮＡポリメラーゼ変異体として、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いる場合、ＤＮＡクランプとしてピロコッカス・フリオサス由来のものを併用するのが好ましい。ピロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡクランプとしては、例えば、配列番号１０または１２のアミノ酸配列からなるＤＮＡクランプが挙げられる。配列番号１０または１２のアミノ酸配列において、１または数個（２個または３個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、ＤＮＡクランプとしての活性を有する蛋白質も用いることができる。かかるＰＣＲ法を行うためのキットは、その必須構成成分として本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含み、好ましくはさらに該ＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプを含む。
【００３６】
本発明は、さらなる態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法、および本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＤＮＡシーケンシング用キットを提供する。ＤＮＡ複製における忠実度が優れた本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をＤＮＡクランプと併用すれば、より迅速かつ信頼性に富むＰＣＲ法を行うことができ、結果として迅速かつ信頼性に富むＤＮＡシーケンシングを行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ変異体と併用するＤＮＡクランプは、用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のものであることが好ましい。かかるＤＮＡシーケンシング法を行うためのキットは、その必須構成成分として本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含み、好ましくはさらに該ＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプを含む。
【００３７】
本発明のＰＣＲ用キットおよびＤＮＡシーケンシング用キットには、通常、キットの取扱説明書が添付され、さらに、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、反応液を適正なｐＨに保つための緩衝成分などのＤＮＡポリメラーゼの反応に必要な試薬が含まれていてもよい。
【００３８】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【００３９】
（実施例１）７０６位アミノ酸変異導入ＤＮＡポリメラーゼの調製
（１）ピロコッカス・フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ゲノムＤＮＡの調製
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３８はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨより入手し、文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２１巻、２５９−２６５ページ）の方法に従って培養した。５００ｍｌの培養液から約１．２ｇの菌体を得た。これを緩衝液Ｌ（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）１０ｍｌに懸濁し、１０％ ＳＤＳを１ｍｌ加えた。撹拌の後、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍｌ加えて、５５℃で６０分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてＤＮＡを不溶化した。回収したＤＮＡを１ｍｌのＴＥ液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、０．７５ｍｇのＲＮａｓｅ Ａを加えて３７℃で６０分反応させた。その後反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。０．７５ｍｇのＤＮＡが得られた。
【００４０】
（２）ｐｏｌ遺伝子・ｐｃｎａ遺伝子のクローン化
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムＤＮＡからｐｏｌ遺伝子と予想される領域をＰＣＲで増幅した。ｐｏｌ遺伝子の翻訳開始コドンと予想されるＡＴＧに合わせてＮｃｏＩ認識配列をフォワードプライマー内に組込んだ。リバースプライマーには終止コドンの直後にＳｐｈＩ認識配列を導入した。ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を３０サイクル行うＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅した。１ｓｔ ＰＣＲ産物を鋳型として、同じ条件で２ｎｄ ＰＣＲを行い、その産物をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（プロメガ社）に組み込み、ＤＮＡシークエンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔａｒ社）を用いてその挿入断片領域の塩基配列の確認を行った。その後、ＮｃｏＩ−ＳｐｈＩで切断してｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクターから切り出したｐｏｌ遺伝子をｐＥＴ１５ｂベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に挿入し、プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌを得た。
【００４１】
プラスミドｐＥＴ２１ａ−ｐｃｎａも同様の手順にて取得した。
【００４２】
このプラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌを鋳型として７０６位のアルギニンをアラニンに置換した変異体（Ｒ７０６Ａ）を作製するべく、部位特異的突然変異法により、以下の手順で変異点導入を行った。変異体（Ｒ７０６Ａ）作製用プライマーセット５’−ＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＴＡＣＴＴＧＣＡＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１５）、５’−ＴＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号１６）と、ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を２０サイクル行うＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅し、目的のＲ７０６Ａプラスミド（ｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６Ａ）を得ることができた。
【００４３】
つぎに、７０６位のアルギニンをグルタミン酸に置換させた変異体（Ｒ７０６Ｅ）を作成するべく、部位特異的突然変異法により、以下の手順で変異点導入を行った。プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌを鋳型として変異体（Ｒ７０６Ｅ）作製用プライマーセット５’−ＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１７）、５’−ＴＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号１８）と、ＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性９５℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃を２０サイクル行うＰＣＲ条件で目的の遺伝子を増幅し、目的のＲ７０６Ｅプラスミド（ｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６Ｅ）を得ることができた。
【００４４】
（３）Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来野生型ポリメラーゼ、および７０６位のアルギニンに変異を導入したポリメラーゼ（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）の大量発現系の構築および精製
以下、無処理（野生型）ポリメラーゼについての大量発現系の構築および精製について記すが、７０６位のアルギニンに変異を導入したポリメラーゼ（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）についても、最初に用いるプラスミドがｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６ＡおよびｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌＲ７０６Ａになるだけで他の手順は全く同じで、同様に大量発現させ、精製することができた。
【００４５】
プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ｐｏｌによってコンピータントセルＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社ＢＬ２１ コドンプラスＲＩＬをトランスフォーム（形質転換）して、１００μｇ・ｍＬ−１のアンピシリンおよび２０μｇ・ｍＬ−１のクロラムフェニコール存在下のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を用いて３７℃にて培養を行った。培養液濁度（６６０ｎｍ吸光度）が０．６に到達した時点で、終濃度１ｍＭになるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、蛋白質の発現を誘導した。さらに６時間培養を行った後、遠心分離器で菌体を回収した。菌体はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離した。上清を８０℃、２０分間加熱処理を行い遠心分離した。上清に終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）になるようポリエチレンイミンを添加し、遠心分離にて核酸成分を除去した。この溶液に８０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離し、沈殿を採取した。
【００４６】
沈殿はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解して、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．１−０．２Ｍでの溶出画分を採取した。つぎにこの画分を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、同じくＮａＣｌ濃度０．１−０．２Ｍでの溶出画分を採取した。この溶液を濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ ２６／６０、ＧＥヘルスケア社）を用いて、流速１ｍｌ／分で分離操作を行い、８０分辺りに溶出されるメインピークを採取した。この溶液について電気泳動を行ったところ、蛋白質の純度としては９９％以上の純度であることを確認することができた。このように、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を容易に得られることがわかった。
【００４７】
天然のピロコッカス・フリオサスのＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。実施例１で得られた野生型のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。実施例１で得られた変異体Ｒ７０６Ａをコードする塩基配列を配列番号５に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。実施例１で得られた変異体Ｒ７０６Ｅをコードする塩基配列を配列番号７に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００４８】
（４）Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来野生型ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）の大量発現系の構築および精製
プラスミドｐＥＴ２１ａ−ｐｃｎａによってコンピータントセルＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社ＢＬ２１ コドンプラスＲＩＬを形質転換して、１００μｇ・ｍＬ−１のアンピシリンおよび２０μｇ・ｍＬ−１のクロラムフェニコール存在下のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地を用いて３７℃にて培養を行った。培養液濁度（６６０ｎｍ吸光度）が０．６に到達した時点で、終濃度１ｍＭになるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、蛋白質の発現を誘導した。さらに６時間培養を行った後、遠心分離器で菌体を回収した。菌体はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離した。上清を８０℃、２０分間加熱処理を行い遠心分離した。上清に終濃度０．１０％（ｗ／ｖ）になるようポリエチレンイミンを添加し、遠心分離にて核酸成分を除去した。この溶液に８０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離し、沈殿を採取した。
【００４９】
沈殿はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解して、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．５〜０．６Ｍでの溶出画分を採取した。つぎにこの画分を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ Ｑ、５ｍｌ；ＧＥヘルスケア社）を用いて分離操作を行い、ＮａＣｌ濃度０．４〜０．５Ｍでの溶出画分を採取した。この溶液について電気泳動を行ったところ、蛋白質の純度としては９９％以上の純度であることを確認した。このように、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を得た。
【００５０】
天然のピロコッカス・フリオサスのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号９に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。実施例１で得られた野生型のＤＮＡクランプをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に、それによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【００５１】
（実施例２）７０６位のアルギニンに変異導入したＤＮＡポリメラーゼ変異体の反応活性の野生型との比較
野生型ＤＮＡポリメラーゼと変異体のプライマー伸長活性をＤＮＡクランプ存在・非存在下で比較した。Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、これに２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡをハイブリダイズさせたものを基質として用いた。反応溶液は２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２００μＭ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ（５μＣｉ ｏｆ ［α３２Ｐ］ｄＴＴＰ｝］）を含み、７０℃、１分間予め熱しておいて、１０ｎＭ ＤＮＡポリメラーゼを添加して反応を開始した。７０℃、２分間反応を行った後、アガロースゲルを用いて泳動し、オートラジオグラフィーにより泳動パターンの解析を行った。
【００５２】
図２に、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長反応の結果（レーン１）と、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび各種変異体（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）の伸長反応の結果を示す（レーン２〜４）。ＤＮＡクランプ添加によるプライマー伸長反応の上昇は野生型、各変異体とも大差なく５’→３’ポリメラーゼ活性には変異による影響は大きくないことがわかった。
【００５３】
野生型ＤＮＡポリメラーゼと変異体の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をＤＮＡクランプ存在・非存在下で比較した。基質としてはＨｐａＩ処理を行ったｐＥＴ２１ａを用いた。反応溶液は２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ （ｐＨ８．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５％ｖ／ｖグリセロール、０．５ｎＭ 基質ｐＥＴ２１ａで、これに１．５ｎＭのＤＮＡポリメラーゼを添加して反応を開始した。６０℃、１時間反応を行った後、反応停止溶液として、９８％脱イオン化ホルムアミド、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロムフェノールブルーを含んだ溶液を添加することにより反応を停止し、反応産物を、アガロースゲルで泳動した。ゲルをＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（インビトロジェン社）染色後、フルオロイメージャー５９５（ＧＥヘルスケア社）を用いて泳動パターンの解析を行った。
【００５４】
図３にＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在・非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび変異体（Ｒ７０６Ｅ）の、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の変化を示す。ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）非存在下では両者とも同等で非常に弱い活性を示すが（レーン２、４）、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在下では、野生型では活性の僅かな増強しか見られないのに対し、変異体（Ｒ７０６Ｅ）では３’→５’エキソヌクレアーゼ活性増強の度合いは変異体の数倍以上と見積もられた。このことからこのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）とＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を協調させてＤＮＡ複製を行うことで通常より３’→５’エキソヌクレアーゼ機能が亢進した状態で、ＤＮＡ複製を継続できるため、従来より信頼性の高いＤＮＡを高速で行うことが可能となる。
【００５５】
（実施例３）本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の耐熱性
実施例２で使用したＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡクランプは、野生型、変異体共に精製の初期段階において、非耐熱性蛋白質を故意に変性させ、その後の精製操作を簡便化することを目的として、８５℃、２０分間の加熱処理を行ったものである。かかる加熱処理において、変異体は野生型に遜色のない耐熱性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、ＤＮＡ複製において高信頼性で、高速に複製反応を行うことができる系が得られるので、本発明は、生化学の研究分野、研究用試薬分野、診断用試薬分野、製薬分野などにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＤＮＡクランプ／ＤＮＡポリメラーゼ複合体の結晶構造解析を行った結果、その相互作用部位と、それにより安定化される両分子の相対配置、可動範囲を決定した。その結果、ＤＮＡクランプ・ＤＮＡポリメラーゼ間に主に二箇所の相互作用部位が存在することを見出した。図１は両相互作用を維持した状態は５’→３’ポリメラーゼ機能を発現しやすい相対配置を呈するのに対し（図上段）、うち一方の相互作用（２ｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｓｉｔｅ）を不活化することで、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が発現しやすい相対配置を惹き起こす。これは、２ｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｓｉｔｅを不活化したＤＮＡ複製系においては忠実度が上昇することを示唆する（図下段）。
【図２】ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長反応の結果（レーン１）と、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび各種変異体（Ｒ７０６Ａ、Ｒ７０６Ｅ）の伸長反応の結果を示す（レーン２〜４）。ＤＮＡクランプがない場合（レーン１）に比べてプライマー伸長はＤＮＡクランプの添加により大幅に促進される。うち、野生型における促進効果が一番高く（レーン２）、変異体ではＲ７０６Ａ（レーン３）、Ｒ７０６Ｅ（レーン４）の順に少しずつ効果が低くなるが、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）による促進の程度に比べて殆ど無視できる程度の減少である。
【図３】ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）存在・非存在下での野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび変異体（Ｒ７０６Ｅ）の、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の変化を示す。レーン１はポリメラーゼを入れないｎｕｌｌレーンで未反応基質ＤＮＡの長さを表す。図中下方が、よりエキソヌクレアーゼ活性が高いことを示す。ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を入れない場合、野生型（レーン２）、Ｒ７０６Ｅ（レーン４）共に、同程度の低いエキソヌクレアーゼ活性しか示さない一方で、ＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を添加すると、共に活性は増大し（レーン３、５）、特に変異体Ｒ７０６Ｅでは野生型の二倍程度のエキソヌクレアーゼ活性を呈する（レーン５）。これはＲ７０６Ｅで有意にエキソヌクレアーゼ活性がより増大し、この系でより忠実度の高い複製を行うことが可能であることを示している。
【００５８】
配列表フリーテキスト
配列番号１は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼをコードする塩基配列である。
配列番号２は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼをコードする塩基配列である。
配列番号４は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）をコードする塩基配列である。
配列番号６は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）のアミノ酸配列である。
配列番号７は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）をコードする塩基配列である。
配列番号８は実施例１で得られたPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）のアミノ酸配列である。
配列番号９は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）をコードする塩基配列である。
配列番号１０は野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）のアミノ酸配列である。
配列番号１１は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）をコードする塩基配列である。
配列番号１２は実施例１で得られた野生型のPyrococcus furiosusのＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）のアミノ酸配列である。
配列番号１３はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号１４はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ａ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号１５はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
配列番号１６はPyrococcus furiosusのＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｒ７０６Ｅ）をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項２】
７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、中性アミノ酸、親水性アミノ酸、または酸性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項３】
中性アミノ酸がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステインから選択され、親水性アミノ酸がセリン、アスパラギン、グルタミンおよびトレオニンから選択され、酸性アミノ酸がチロシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される、請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項４】
７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アラニンまたはグルタミン酸に置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項５】
７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アスパラギン酸に置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項６】
ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項７】
好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ変異体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡを組み込んだ組換えベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＰＣＲ法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＰＣＲ用キット。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＤＮＡシーケンシング用キット。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＰＣＲ法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＰＣＲ用キット。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＤＮＡシーケンシング用キット。
【請求項１】
ＤＮＡクランプと協働させた場合に増強された３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項２】
７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、中性アミノ酸、親水性アミノ酸、または酸性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項３】
中性アミノ酸がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステインから選択され、親水性アミノ酸がセリン、アスパラギン、グルタミンおよびトレオニンから選択され、酸性アミノ酸がチロシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される、請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項４】
７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アラニンまたはグルタミン酸に置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項５】
７０６位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アスパラギン酸に置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項６】
ピロコッカス・フリオサス由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７０６位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項７】
好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ変異体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡを組み込んだ組換えベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＰＣＲ法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＰＣＲ用キット。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むＤＮＡシーケンシング用キット。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＰＣＲ法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＰＣＲ用キット。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を用いることを特徴とするＤＮＡシーケンシング法。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体と同生物種由来のＤＮＡクランプ（ＰＣＮＡ）を含むＤＮＡシーケンシング用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１０４３０４（Ｐ２０１０−１０４３０４Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８０３９２（Ｐ２００８−２８０３９２）
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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