エタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物及びこれを利用したエタノール及びブタノール製造方法
本発明はエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物及びこれを利用したエタノール及びブタノール製造方法に関し、より具体的には、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子及びアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、エタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物及び前記遺伝子組換え微生物を利用して、エタノール及びブタノールを製造する方法に関する。微生物の代謝経路の操作によって取得された本発明に係わる遺伝子組換え微生物は他の副産物なしにブタノールとエタノールだけを高効率で生成できて、産業溶剤及び輸送燃料生成微生物として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物及びこれを利用したエタノール及びブタノール製造方法に関し、より具体的には、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子及びアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、エタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物及び前記遺伝子組換え微生物を利用して、エタノール及びブタノールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エタノールとブタノールは現在、産業用溶媒として巨大な市場を形成しており、将来自動車などの輸送燃料として使用できる可能性が現実化してきており、持続的な需要増加が予想されている。
【０００３】
エタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）は従来から澱粉や糖類を発酵させる方法で製造され、現在、酒類の多くはこの方法で製造している。しかし、現在、酒類製造を除いては石油から得たエチレン（エテン）を原料とする合成法でエチレンを硫酸に吸収させて、エタノールの硫酸エステルを作った後、これをさらに加水分解してジエチルエーテルと共に得る方法（硫酸加水法）と、気相でエチレンを、固体燐酸触媒を用いて接触的に水蒸気と反応させることによって、直接エタノールを合成する方法（直接水和法）で製造している。このような方法は、根本的に石油を原料でしているという点と、硫酸加水法の場合、大量の硫酸を濃縮して循環させるため、大掛かりな設備を必要とする点が問題になっている。
【０００４】
一方、ブタノール（Ｃ４Ｈ９ＯＨ）の全世界生の産量は約百十万トン／年と推定される。現在市販されるブタノールは全て化学的合成により生産されたものである。ブタノールの化学合成法もエタノール同様に石油を原料としており、これから得られたプロピレンから合成されるオキソ法（oxo process）が使われる。このような石油を原料として、高温高圧を使う方法は、エタノールのように、コストとエネルギー面で非効率的である（Tsuchida et al., Ind. Eng.Chem. Res., 45:8634, 2006）。即ち、石油化学を利用したエタノールとブタノールの生産は製造時に多量の有害性廃棄物、廃溶液及び廃ガス（一酸化炭素含む）を排出する問題を有し、特に化石原料を基礎物質として使うという限界がある。
【０００５】
上述したように、今まで生産されていたブタノールの場合、化学合成法によって殆ど生産されており、オイル価格上昇と環境問題などで世界各国ではバイオエタノール及びブタノールの研究に対する関心が急激に高まっているものの、未だにバイオエタノール及びバイオブタノールだけを効率的に生産した例はなかった。
【０００６】
ブタノール及びエタノールの場合、今まで発酵によって生産した例は殆どクロストリジウムを利用して生産されたもので、ベクターにａｄｃ（アセト酢酸脱炭酸酵素）、ｃｔｆＡ（ＣｏＡ伝達酵素Ａ）及びｃｔｆＢ（ＣｏＡ伝達酵素Ｂ）の三つの遺伝子を入れてａｄｃのプロモーターを使って人為的オペロンを作製して、プラスミドを調整する。このプラスミド（ｐＦＮＫ６）をクロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４菌株に導入させて、野生型に比べて、アセトン、ブタノール及びエタノールの生産性を各々９５％、３７％及び９０％増加させた例がある（Mermelstein et al., Biotechnol. Bioeng., 42:1053, 1993）。また、ａａｄ（アルコール／アルデヒド脱水素酵素）をクローニングした後、過発現させて野生型と比較した結果、アセトンの生成量に比べて、ブタノール及びエタノールの生成量が高く示された例（Nair et al., J. Bacteriol., 176:871, 1994）がある。この他に遺伝子の機能を不活性化させる方法でｂｕｋ（酪酸燐酸化酵素）とｐｔａ（燐酸化酢酸伝達酵素）を不活性化させた例があるが、ｂｕｋ遺伝子を不活性化した菌株（ＰＪＣ４ＢＫ）をｐＨ５．０以上で発酵した結果、ブタノール生産量が１６．７ｇ／Ｌまでかなり増加すると報告された（Harris et al., Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000）。しかし、ｐｔａ不活性化の場合は野生型と比較した時、溶媒生産において有意な差を見せることができないと報告された（Harris et al., Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000）。また、無作為突然変異で誘発された突然変異株Clostridium beijerinckii BA101菌株を利用して、炭素原としてマルトデキストリン（maltodextrins）を使った発酵の結果、１８．６ｇ／Ｌのブタノールが生産されることを報告した例もある（Ezeji et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 63:653, 2004）。しかし、前記のこのような結果は全てブタノール及びエタノールが副産物であるアセトンと共に生成される例で、アセトンの特性のためにアセトンを除去しないまま燃料として使用できないという大きい短所がある。
【０００７】
アセトン生成なしに、エタノールとブタノールを生成した例として、ａｄｃ（アセト酢酸脱炭酸酵素の遺伝子）、ｃｔｆＡ（ＣｏＡ伝達酵素Ａの遺伝子）、ｃｔｆＢ（ＣｏＡ伝達酵素Ｂの遺伝子）及びａａｄ（アルコール／アルデヒド脱水素酵素の遺伝子）活性に共に欠陥があるクロストリジウム・アセトブチリカム突然変異株にａａｄ（アルコール／アルデヒド脱水素酵素）を導入した遺伝子組換え変移微生物を利用した例があるが、ブタノールとエタノールの最終濃度が各々８４ｍＭと８ｍＭ（Nair et al., J. Bacteriol., 176:5843, 1994）で生産性が低い短所がある。また、クロストリジウム・アセトブチリカムの遺伝子を含有する遺伝子組換えベクターを大腸菌に導入して、ブタノールを生成した例（Shota et al., Metab. Eng., In Press, 2007）があるが最大ブタノール生成濃度が５５２ｍｇ／Ｌで非常に低く、産業的利用が不可能である。
【０００８】
従って、当業界ではアセトンのような副産物の生成なしに燃料として利用可能なブタノールまたはエタノール／ブタノール混合物を高効率で生産できる微生物開発が切に求められている。
【０００９】
そこで、本発明者らはエタノール及びブタノール合成経路（図１）を基に高い収率でエタノールとブタノールを他の副産物なしに製造できる微生物を開発するために努力した結果、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４由来の酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換するＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｃｔｆＡＢ）と、アセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換するアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ１）をクローニングし、有機溶剤を生産できない宿主微生物に導入させて、遺伝子組換え微生物を作製し、前記遺伝子組換え微生物がエタノールとブタノールは高濃度で生産する一方、副産物であるアセトンは殆ど生産しないを確認して本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、他の副産物の生産なしにブタノールまたはエタノール／ブタノールを高効率で生産する遺伝子組換え微生物及びその製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記遺伝子組換え微生物を利用したエタノール及びブタノールの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を解決するために、本発明はアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換する酵素をコードする遺伝子及び／またはアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）を、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子を導入することを含むエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物の製造方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換する酵素をコードする遺伝子及び／またはアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）を、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子が導入または増幅されていることを特徴とするエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物を提供する。
【００１４】
本発明はまた、前記遺伝子組換え微生物を培養する段階及び前記培養液からエタノール及び／またはブタノールを回収する段階を含むエタノール及び／またはブタノールの製造方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の特徴及び具現例は次の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】エタノール及びブタノール生産能力がない退化（degeneration）されたクロストリジウム・アセトブチリカム菌株の代謝回路（Ａ）と前記退化した菌株にｃｔｆＡＢとａｄｈＥ１を導入して、製造された遺伝子組換え菌株のエタノールとブタノール合成代謝経路（Ｂ）を示す模式図である。
【図２】ｃｔｆＡＢとａｄｈＥ１を含む遺伝子組換えベクターｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢの遺伝子地図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明ではエタノール及びブタノール合成経路（図１）を基にアセトンなど他の副産物の生成なしに高い収率でエタノール／ブタノールを製造できる微生物を開発するため、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４由来の酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換するＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｃｔｆＡＢ）と、アセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換するアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ１）をクローニングし、前記遺伝子をアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っており、アセトンのような有機溶剤を生成できない宿主微生物に導入させて、遺伝子組換え微生物を作製した。
【００１８】
従って、本発明はアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換する酵素をコードする遺伝子及び／またはアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）を、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子を導入することを特徴とするエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物の製造方法及び前記方法によって製造された、アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換する酵素をコードする遺伝子及び／アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）を、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子が導入または増幅されていることを特徴とするエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物に関する。
【００１９】
本発明で「増幅」とは、該当遺伝子の一部塩基を変異、置換または欠失させたり、一部塩基を挿入させたり、または同じ酵素をコードする他の微生物由来の遺伝子を導入させて、対応する酵素の活性を増加させることを含む概念である。
本発明において、前記アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路は、[アセチルＣｏＡ-->アセトアセチルＣｏＡ-->３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ-->クロトニルＣｏＡ-->ブチリルＣｏＡ（acetyl CoA --> acetoacetyl CoA --> 3-hydroxybutyryl CoA --> crotonyl CoA --> butyryl CoA）]であることを特徴とする。
【００２０】
本発明において、前記宿主微生物は、好ましくはアセトン生合成経路が遮断されて、アセトン生成量が全体有機溶剤生産量の１０％未満であることを特徴とする。前記アセトン生合成経路はａｄｃ（アセト酢酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子）を欠失してもよいが、これに限定されるのではない。また、前記宿主微生物は、好ましくはクロストリジウム属由来であることを特徴とするが、アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路を持っている限りこれに限定されるのではない。
【００２１】
本発明において、酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換する酵素は、好ましくはＣｏＡトランスフェラーゼであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、好ましくはｃｔｆＡＢであることを特徴とする。また、アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）を、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素は、好ましくはアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼであることを特徴とし、前記アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はａｄｈＥ１であることを特徴とする。本発明では前記ｃｔｆＡＢ及びａｄｈＥ１として、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４由来であるものだけを例示したが、他の微生物由来の遺伝子であっても、導入された宿主細胞から発現して、同じ活性を示す限り制限なしに使用できる。
【００２２】
本発明の実施例ではmegaplasmid（アセト酢酸脱炭酸酵素、ＣｏＡトランスフェラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼを含んだ１２７遺伝子が存在する）が欠失しているクロストリジウム・アセトブチリカム変移株Ｍ５を宿主微生物として利用した。前記クロストリジウム・アセトブチリカム変移株Ｍ５はアセトン生合成経路が遮断されている微生物である（図１）。本発明ではアセトン生合成経路が遮断されているクロストリジウム属宿主微生物としてクロストリジウム・アセトブチリカムＭ５のみを例示したが、それ以外にもクロストリジウム・アセトブチリカム１ＮＹＧ、４ＮＹＧ、５ＮＹＧ及びＤＧ１（Stim-Herndon, K.P. et al., Biotechnol./Food Microbiol., 2:11, 1996）とC. acetobutylicum ATCC824 Type IV、Ｍ３、Ｍ５、２−ＢＢ Ｒ、２−ＢＢ Ｄ、Ｒｉｆ Ｂ１２、Ｒｉｆ Ｄ１０、Ｒｉｆ Ｆ７、及びC. butyricum ATCC860（Clark、S.W. et al., Appl. Environ. Microbiol., 55:970, 1989）を使用してもよい。前記宿主微生物に前記ｃｔｆＡＢ及びａｄｈＥ１を含有する遺伝子組換えベクター（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）を導入して、遺伝子組換え微生物Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）を製造した後、これを培養した結果、アセトンは殆ど生成されないままブタノール／エタノールが高濃度で生成されることを確認した。
【００２３】
従って、本発明は他の観点において、本発明に係わる遺伝子組換え微生物を培養する段階、及び前記培養液からエタノール及び／またはブタノールを回収する段階を含むエタノール及び／またはブタノールの製造方法に関する。
【００２４】
本発明において、遺伝子組換え微生物の培養とエタノール及びブタノールの回収過程は、従来、発酵工業で通常知らされた培養方法及びエタノール／ブタノールの分離精製方法を使って実施できる。それと共に、前記ブタノール及びエタノールの回収は培養完了後に実施することが一般的であるが、生産性アップのためガスストリッピング（gas-stripping）方法（Thaddeus et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 27:207, 2005）等を利用して、培養途中エタノール及びブタノールを回収してもよい。即ち、培養中に生成されたエタノール及びブタノールを回収すると共に、続けて培養することも本発明の範囲に属する。
【００２５】
一方、本発明ではブタノール生合成経路が遮断された場合だけを例示したが、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４菌株で酪酸（butyrate）生合成経路を遮断して、ブタノール生成量を増加させたと報告され（Harris et al., Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000）、図１の代謝経路でアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からアセテート（actate）への生合成経路及び／またはブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）からブチレート（butyrate）への生合成経路を遮断する場合、エタノールとブタノールの生成を増加させられることが推定できる。他の方法としてアセテート（actate）を利用できる遺伝子（ａｃｓ、ａｔｏＤＡ）等を導入する場合にもエタノールとブタノールの生成を増加できるはずである。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を介して、本発明をより一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明を例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないということは当業界において通常の知識を有するものには自明であろう。特に、下記実施例では本発明に係わる遺伝子を発現させるために有機溶剤を生産できない宿主菌株として、特定クロストリジウム・アセトブチリカム変移株M５のみを例示したが、他のクロストリジウム属や他の属の微生物を使っても、アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路を持っていて、アセトンなどの有機溶剤生合成経路が遮断されている宿主菌株に同一遺伝子を導入し、これを利用して、エタノール及びブタノールを製造できることも当業界で通常の知識を有するものには自明であろう。
【００２７】
［実施例１］アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ１）及びＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｔｆＡＢ）含有遺伝子組換えベクターの製造
配列番号３、配列番号４及び配列番号５の塩基配列を持つクロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４のａｄｈＥ１、ｃｔｆＡ及びｃｔｆＢ遺伝子をプロモーターと転写終了配列を含んで、クローニングした。先ず、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号１と配列番号２のプライマーを使ったＰＣＲ（表１）を行った後、取得されたａｄｈＥ１、ｃｔｆＡ及びｃｔｆＢ遺伝子を制限酵素ＳａｌＩで切断して、同一制限酵素で切断されたクロストリジウム／大腸菌シャトルベクターｐＩＭＰ１（Mermelstein, L.D. et al., Bio/Technol., 10:190, 1992）に挿入して、遺伝子組換えベクターｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢを作製した（図２）。これによって、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４由来のアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼとＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子をコードする遺伝子（ａｄｈＥ１、ｃｔｆＡＢ）がクローニングされた。
【００２８】
【表１】
【００２９】
前記クローニングされたクロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４由来のａｄｈＥ１及びｃｔｆＡＢ遺伝子の塩基配列を分析して、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼとＣｏＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列を推定した。その結果、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４のａｄｈＥ１及びｃｔｆＡＢ遺伝子配列（配列番号３、配列番号４、配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６、配列番号７、配列番号８）を確認した。
【００３０】
［実施例２］遺伝子組換え微生物の製造
実施例１で作製された遺伝子組換えベクターｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢを、エレクトロポレーション法を利用してクロストリジウム・アセトブチリカムＭ５菌株に導入して、Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）菌株を作製した。
【００３１】
先ず、バシラスサブチリスファージ（Bacillus subtilis Phage）Φ３Ｔ Ｉメチルトランスフェラーゼ（methyltransferase）発現ベクター、ｐＡＮ１（Mermelstein et al., Appl. Environ. Microbiol., 59:1077, 1993）を含有する大腸菌ＴＯＰ１０に実施例１で作製された遺伝子組換えベクターを導入して、前記ベクターをクロストリジウムへの形質転換に適合するようにメチレーションを誘導した。このようにメチレーションされたベクターを大腸菌から分離及び精製して、このベクターをmegaplasmid（アセト酢酸脱炭酸酵素の遺伝子、ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子、アルコール／アルデハイドデヒドロゲナーゼの遺伝子を含む１７６遺伝子が存在）が欠失しているクロストリジウム・アセトブチリカム変移株Ｍ５（Cornillot et al., J. Bacteriol., 179:5442, 1997）に導入して、遺伝子組換え微生物を製造した。また、クローニング用ベクターとして使ったｐＩＭＰ１をクロストリジウム・アセトブチリカムＭ５菌株に導入してＭ５（ｐＩＭＰ１）菌株を製造した。
【００３２】
形質転換のためのＭ５コンピテント細胞（competent cell）は次のように準備した。先ず、１０ｍＬＣＧＭ（表２）にＭ５菌株を接種した後、ＯＤ ０．６になるまで培養した。これを利用して、２Ｘ ＹＴＧ培地（バクトトリプトンン１６ｇ、イーストイクストラクト１０ｇ、ＮａＣｌ ４ｇ、グルコース５ｇ、１Ｌ当り）６０ｍＬに１０％接種して、４〜５時間培養した。形質転換バッファー（ＥＰＢ、２７０ｍＭスクロース１５ｍＬ、６８６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４１１０μＬ、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、２．４ｍＬの同一バッファーで微生物細胞を懸濁させた。このように作られたＭ５コンピテント細胞（competent cell）６００μＬと遺伝子組換えプラスミドＤＮＡ２５μＬを混ぜて、４ｍｍ電極を有するキュベットに充填後、２．５ｋＶ、２５ｕＦの条件で電気衝撃を与えた。直ちに、１ｍＬの２ｘＹＴＧ培地で懸濁し、３時間３７℃で培養した後、４０μｇ／μＬのエリスロマイシンが含まれた２ｘＹＴＧ固体培地に塗抹して、形質転換体を選抜した。
【００３３】
【表２】
【００３４】
［実施例３］遺伝子組換え微生物Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）を利用したエタノール／ブタノール生産
実施例２で製造された遺伝子組換え微生物Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）を培養して、その性能を評価した。ＣＧＭ培地１０ｍＬを含有した３０ｍＬ試験管を滅菌後８０℃以上で取り出して、窒素ガスを満たした後、嫌氣チャンバーで室温まで冷やした後、エリスロマイシン（erythromycin）４０μｇ／μＬを添加して、前記遺伝子組換え微生物を接種して、３７℃で吸光度（６００ｎｍ）が１.０になるまで嫌氣条件で前培養を行った。前記成分で構成された培地１００ｍＬを含有した２５０ｍＬフラスコを滅菌後、前記前培養液６ｍＬを接種して、吸光度（６００ｎｍ）が１．０になるまで３７℃、嫌氣条件で２次培養した。その後、前記成分で構成された培地２．０Ｌを含有した５．０Ｌ発酵機（LiFlus GX, Biotron Inc., Kyunggi-Do, Korea）を滅菌後、８０℃以上から窒素を０．５ｖｖｍで１０時間供給しながら、室温まで温度を下げてからエリスロマイシン（erythromycin）４０μｇ／ｍＬを添加して前記２次培養液１００ｍＬを接種して、３７℃、２００ｒｐｍで６０時間培養した。ｐＨは５ＮのＮａＯＨのautomatic feedingによって、５．５に維持され、培養中には窒素を０．２ｖｖｍ（air volume/working volume/minute）で供給した。
【００３５】
前記培地中のグルコース（glucose）をglucose analyzer（model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA）で測定し、時間毎に前記培地を採取して、これから生成されるアセトン、エタノール、及びブタノール濃度を、packed column（Supelco CarbopackTM B AW/6.6% PEG 20M, 2m×2mm ID, Bellefonte, PA, USA）が装着されたガスクロマトグラフィー（gas chromatography: Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA）で測定した。
【００３６】
その結果、表３に示したように、対照菌Ｍ５（ｐＩＭＰ１）ではエタノール及びブタノールが生成されなかったが、遺伝子組換え菌株Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）の場合、高濃度のエタノール及びブタノールが生成され、アセトンは殆ど生成されない（０．５ｇ／Ｌ以下）ことを確認することができた。さらに、エタノールとブタノールの最終生産濃度だけでなく生産性も向上したのを確認することができた。
【００３７】
一方、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４菌株の場合、アセトン生成量が全体有機溶剤の約２８％と知られているが（Harris et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 27:322, 2001）、本発明に係わる遺伝子組換え菌株の場合、約５％未満とその生成量が僅かであることを確認することができた。
【００３８】
【表３】
【産業上利用の可能性】
【００３９】
以上、詳細に説明したが、本発明は特定遺伝子の導入または増幅を介して、エタノール及びブタノールの高生産能力を持つ遺伝子組換え変移微生物を提供する効果がある。本発明に係わる遺伝子組換え変異微生物は、代謝経路の操作によって、アセトンなどの副産物の生産が殆どないだけでなく、エタノールとブタノールの時間当り生産性を向上させられてエタノール／ブタノールの産業的生産に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物及びこれを利用したエタノール及びブタノール製造方法に関し、より具体的には、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子及びアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、エタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物及び前記遺伝子組換え微生物を利用して、エタノール及びブタノールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エタノールとブタノールは現在、産業用溶媒として巨大な市場を形成しており、将来自動車などの輸送燃料として使用できる可能性が現実化してきており、持続的な需要増加が予想されている。
【０００３】
エタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）は従来から澱粉や糖類を発酵させる方法で製造され、現在、酒類の多くはこの方法で製造している。しかし、現在、酒類製造を除いては石油から得たエチレン（エテン）を原料とする合成法でエチレンを硫酸に吸収させて、エタノールの硫酸エステルを作った後、これをさらに加水分解してジエチルエーテルと共に得る方法（硫酸加水法）と、気相でエチレンを、固体燐酸触媒を用いて接触的に水蒸気と反応させることによって、直接エタノールを合成する方法（直接水和法）で製造している。このような方法は、根本的に石油を原料でしているという点と、硫酸加水法の場合、大量の硫酸を濃縮して循環させるため、大掛かりな設備を必要とする点が問題になっている。
【０００４】
一方、ブタノール（Ｃ４Ｈ９ＯＨ）の全世界生の産量は約百十万トン／年と推定される。現在市販されるブタノールは全て化学的合成により生産されたものである。ブタノールの化学合成法もエタノール同様に石油を原料としており、これから得られたプロピレンから合成されるオキソ法（oxo process）が使われる。このような石油を原料として、高温高圧を使う方法は、エタノールのように、コストとエネルギー面で非効率的である（Tsuchida et al., Ind. Eng.Chem. Res., 45:8634, 2006）。即ち、石油化学を利用したエタノールとブタノールの生産は製造時に多量の有害性廃棄物、廃溶液及び廃ガス（一酸化炭素含む）を排出する問題を有し、特に化石原料を基礎物質として使うという限界がある。
【０００５】
上述したように、今まで生産されていたブタノールの場合、化学合成法によって殆ど生産されており、オイル価格上昇と環境問題などで世界各国ではバイオエタノール及びブタノールの研究に対する関心が急激に高まっているものの、未だにバイオエタノール及びバイオブタノールだけを効率的に生産した例はなかった。
【０００６】
ブタノール及びエタノールの場合、今まで発酵によって生産した例は殆どクロストリジウムを利用して生産されたもので、ベクターにａｄｃ（アセト酢酸脱炭酸酵素）、ｃｔｆＡ（ＣｏＡ伝達酵素Ａ）及びｃｔｆＢ（ＣｏＡ伝達酵素Ｂ）の三つの遺伝子を入れてａｄｃのプロモーターを使って人為的オペロンを作製して、プラスミドを調整する。このプラスミド（ｐＦＮＫ６）をクロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４菌株に導入させて、野生型に比べて、アセトン、ブタノール及びエタノールの生産性を各々９５％、３７％及び９０％増加させた例がある（Mermelstein et al., Biotechnol. Bioeng., 42:1053, 1993）。また、ａａｄ（アルコール／アルデヒド脱水素酵素）をクローニングした後、過発現させて野生型と比較した結果、アセトンの生成量に比べて、ブタノール及びエタノールの生成量が高く示された例（Nair et al., J. Bacteriol., 176:871, 1994）がある。この他に遺伝子の機能を不活性化させる方法でｂｕｋ（酪酸燐酸化酵素）とｐｔａ（燐酸化酢酸伝達酵素）を不活性化させた例があるが、ｂｕｋ遺伝子を不活性化した菌株（ＰＪＣ４ＢＫ）をｐＨ５．０以上で発酵した結果、ブタノール生産量が１６．７ｇ／Ｌまでかなり増加すると報告された（Harris et al., Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000）。しかし、ｐｔａ不活性化の場合は野生型と比較した時、溶媒生産において有意な差を見せることができないと報告された（Harris et al., Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000）。また、無作為突然変異で誘発された突然変異株Clostridium beijerinckii BA101菌株を利用して、炭素原としてマルトデキストリン（maltodextrins）を使った発酵の結果、１８．６ｇ／Ｌのブタノールが生産されることを報告した例もある（Ezeji et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 63:653, 2004）。しかし、前記のこのような結果は全てブタノール及びエタノールが副産物であるアセトンと共に生成される例で、アセトンの特性のためにアセトンを除去しないまま燃料として使用できないという大きい短所がある。
【０００７】
アセトン生成なしに、エタノールとブタノールを生成した例として、ａｄｃ（アセト酢酸脱炭酸酵素の遺伝子）、ｃｔｆＡ（ＣｏＡ伝達酵素Ａの遺伝子）、ｃｔｆＢ（ＣｏＡ伝達酵素Ｂの遺伝子）及びａａｄ（アルコール／アルデヒド脱水素酵素の遺伝子）活性に共に欠陥があるクロストリジウム・アセトブチリカム突然変異株にａａｄ（アルコール／アルデヒド脱水素酵素）を導入した遺伝子組換え変移微生物を利用した例があるが、ブタノールとエタノールの最終濃度が各々８４ｍＭと８ｍＭ（Nair et al., J. Bacteriol., 176:5843, 1994）で生産性が低い短所がある。また、クロストリジウム・アセトブチリカムの遺伝子を含有する遺伝子組換えベクターを大腸菌に導入して、ブタノールを生成した例（Shota et al., Metab. Eng., In Press, 2007）があるが最大ブタノール生成濃度が５５２ｍｇ／Ｌで非常に低く、産業的利用が不可能である。
【０００８】
従って、当業界ではアセトンのような副産物の生成なしに燃料として利用可能なブタノールまたはエタノール／ブタノール混合物を高効率で生産できる微生物開発が切に求められている。
【０００９】
そこで、本発明者らはエタノール及びブタノール合成経路（図１）を基に高い収率でエタノールとブタノールを他の副産物なしに製造できる微生物を開発するために努力した結果、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４由来の酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換するＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｃｔｆＡＢ）と、アセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換するアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ１）をクローニングし、有機溶剤を生産できない宿主微生物に導入させて、遺伝子組換え微生物を作製し、前記遺伝子組換え微生物がエタノールとブタノールは高濃度で生産する一方、副産物であるアセトンは殆ど生産しないを確認して本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、他の副産物の生産なしにブタノールまたはエタノール／ブタノールを高効率で生産する遺伝子組換え微生物及びその製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記遺伝子組換え微生物を利用したエタノール及びブタノールの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を解決するために、本発明はアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換する酵素をコードする遺伝子及び／またはアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）を、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子を導入することを含むエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物の製造方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換する酵素をコードする遺伝子及び／またはアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）を、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子が導入または増幅されていることを特徴とするエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物を提供する。
【００１４】
本発明はまた、前記遺伝子組換え微生物を培養する段階及び前記培養液からエタノール及び／またはブタノールを回収する段階を含むエタノール及び／またはブタノールの製造方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の特徴及び具現例は次の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】エタノール及びブタノール生産能力がない退化（degeneration）されたクロストリジウム・アセトブチリカム菌株の代謝回路（Ａ）と前記退化した菌株にｃｔｆＡＢとａｄｈＥ１を導入して、製造された遺伝子組換え菌株のエタノールとブタノール合成代謝経路（Ｂ）を示す模式図である。
【図２】ｃｔｆＡＢとａｄｈＥ１を含む遺伝子組換えベクターｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢの遺伝子地図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明ではエタノール及びブタノール合成経路（図１）を基にアセトンなど他の副産物の生成なしに高い収率でエタノール／ブタノールを製造できる微生物を開発するため、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４由来の酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換するＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｃｔｆＡＢ）と、アセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換するアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ１）をクローニングし、前記遺伝子をアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っており、アセトンのような有機溶剤を生成できない宿主微生物に導入させて、遺伝子組換え微生物を作製した。
【００１８】
従って、本発明はアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換する酵素をコードする遺伝子及び／またはアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）を、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子を導入することを特徴とするエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物の製造方法及び前記方法によって製造された、アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換する酵素をコードする遺伝子及び／アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）を、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子が導入または増幅されていることを特徴とするエタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物に関する。
【００１９】
本発明で「増幅」とは、該当遺伝子の一部塩基を変異、置換または欠失させたり、一部塩基を挿入させたり、または同じ酵素をコードする他の微生物由来の遺伝子を導入させて、対応する酵素の活性を増加させることを含む概念である。
本発明において、前記アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路は、[アセチルＣｏＡ-->アセトアセチルＣｏＡ-->３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ-->クロトニルＣｏＡ-->ブチリルＣｏＡ（acetyl CoA --> acetoacetyl CoA --> 3-hydroxybutyryl CoA --> crotonyl CoA --> butyryl CoA）]であることを特徴とする。
【００２０】
本発明において、前記宿主微生物は、好ましくはアセトン生合成経路が遮断されて、アセトン生成量が全体有機溶剤生産量の１０％未満であることを特徴とする。前記アセトン生合成経路はａｄｃ（アセト酢酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子）を欠失してもよいが、これに限定されるのではない。また、前記宿主微生物は、好ましくはクロストリジウム属由来であることを特徴とするが、アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路を持っている限りこれに限定されるのではない。
【００２１】
本発明において、酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）に転換する酵素は、好ましくはＣｏＡトランスフェラーゼであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、好ましくはｃｔｆＡＢであることを特徴とする。また、アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）及びブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）を、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素は、好ましくはアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼであることを特徴とし、前記アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はａｄｈＥ１であることを特徴とする。本発明では前記ｃｔｆＡＢ及びａｄｈＥ１として、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４由来であるものだけを例示したが、他の微生物由来の遺伝子であっても、導入された宿主細胞から発現して、同じ活性を示す限り制限なしに使用できる。
【００２２】
本発明の実施例ではmegaplasmid（アセト酢酸脱炭酸酵素、ＣｏＡトランスフェラーゼ、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼを含んだ１２７遺伝子が存在する）が欠失しているクロストリジウム・アセトブチリカム変移株Ｍ５を宿主微生物として利用した。前記クロストリジウム・アセトブチリカム変移株Ｍ５はアセトン生合成経路が遮断されている微生物である（図１）。本発明ではアセトン生合成経路が遮断されているクロストリジウム属宿主微生物としてクロストリジウム・アセトブチリカムＭ５のみを例示したが、それ以外にもクロストリジウム・アセトブチリカム１ＮＹＧ、４ＮＹＧ、５ＮＹＧ及びＤＧ１（Stim-Herndon, K.P. et al., Biotechnol./Food Microbiol., 2:11, 1996）とC. acetobutylicum ATCC824 Type IV、Ｍ３、Ｍ５、２−ＢＢ Ｒ、２−ＢＢ Ｄ、Ｒｉｆ Ｂ１２、Ｒｉｆ Ｄ１０、Ｒｉｆ Ｆ７、及びC. butyricum ATCC860（Clark、S.W. et al., Appl. Environ. Microbiol., 55:970, 1989）を使用してもよい。前記宿主微生物に前記ｃｔｆＡＢ及びａｄｈＥ１を含有する遺伝子組換えベクター（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）を導入して、遺伝子組換え微生物Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）を製造した後、これを培養した結果、アセトンは殆ど生成されないままブタノール／エタノールが高濃度で生成されることを確認した。
【００２３】
従って、本発明は他の観点において、本発明に係わる遺伝子組換え微生物を培養する段階、及び前記培養液からエタノール及び／またはブタノールを回収する段階を含むエタノール及び／またはブタノールの製造方法に関する。
【００２４】
本発明において、遺伝子組換え微生物の培養とエタノール及びブタノールの回収過程は、従来、発酵工業で通常知らされた培養方法及びエタノール／ブタノールの分離精製方法を使って実施できる。それと共に、前記ブタノール及びエタノールの回収は培養完了後に実施することが一般的であるが、生産性アップのためガスストリッピング（gas-stripping）方法（Thaddeus et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 27:207, 2005）等を利用して、培養途中エタノール及びブタノールを回収してもよい。即ち、培養中に生成されたエタノール及びブタノールを回収すると共に、続けて培養することも本発明の範囲に属する。
【００２５】
一方、本発明ではブタノール生合成経路が遮断された場合だけを例示したが、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４菌株で酪酸（butyrate）生合成経路を遮断して、ブタノール生成量を増加させたと報告され（Harris et al., Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000）、図１の代謝経路でアセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からアセテート（actate）への生合成経路及び／またはブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）からブチレート（butyrate）への生合成経路を遮断する場合、エタノールとブタノールの生成を増加させられることが推定できる。他の方法としてアセテート（actate）を利用できる遺伝子（ａｃｓ、ａｔｏＤＡ）等を導入する場合にもエタノールとブタノールの生成を増加できるはずである。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を介して、本発明をより一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明を例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないということは当業界において通常の知識を有するものには自明であろう。特に、下記実施例では本発明に係わる遺伝子を発現させるために有機溶剤を生産できない宿主菌株として、特定クロストリジウム・アセトブチリカム変移株M５のみを例示したが、他のクロストリジウム属や他の属の微生物を使っても、アセチルＣｏＡ（acetyl CoA）からブチリルＣｏＡ（butyryl CoA）への生合成経路を持っていて、アセトンなどの有機溶剤生合成経路が遮断されている宿主菌株に同一遺伝子を導入し、これを利用して、エタノール及びブタノールを製造できることも当業界で通常の知識を有するものには自明であろう。
【００２７】
［実施例１］アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ１）及びＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｔｆＡＢ）含有遺伝子組換えベクターの製造
配列番号３、配列番号４及び配列番号５の塩基配列を持つクロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４のａｄｈＥ１、ｃｔｆＡ及びｃｔｆＢ遺伝子をプロモーターと転写終了配列を含んで、クローニングした。先ず、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号１と配列番号２のプライマーを使ったＰＣＲ（表１）を行った後、取得されたａｄｈＥ１、ｃｔｆＡ及びｃｔｆＢ遺伝子を制限酵素ＳａｌＩで切断して、同一制限酵素で切断されたクロストリジウム／大腸菌シャトルベクターｐＩＭＰ１（Mermelstein, L.D. et al., Bio/Technol., 10:190, 1992）に挿入して、遺伝子組換えベクターｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢを作製した（図２）。これによって、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４由来のアルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼとＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子をコードする遺伝子（ａｄｈＥ１、ｃｔｆＡＢ）がクローニングされた。
【００２８】
【表１】
【００２９】
前記クローニングされたクロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４由来のａｄｈＥ１及びｃｔｆＡＢ遺伝子の塩基配列を分析して、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼとＣｏＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列を推定した。その結果、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４のａｄｈＥ１及びｃｔｆＡＢ遺伝子配列（配列番号３、配列番号４、配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６、配列番号７、配列番号８）を確認した。
【００３０】
［実施例２］遺伝子組換え微生物の製造
実施例１で作製された遺伝子組換えベクターｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢを、エレクトロポレーション法を利用してクロストリジウム・アセトブチリカムＭ５菌株に導入して、Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）菌株を作製した。
【００３１】
先ず、バシラスサブチリスファージ（Bacillus subtilis Phage）Φ３Ｔ Ｉメチルトランスフェラーゼ（methyltransferase）発現ベクター、ｐＡＮ１（Mermelstein et al., Appl. Environ. Microbiol., 59:1077, 1993）を含有する大腸菌ＴＯＰ１０に実施例１で作製された遺伝子組換えベクターを導入して、前記ベクターをクロストリジウムへの形質転換に適合するようにメチレーションを誘導した。このようにメチレーションされたベクターを大腸菌から分離及び精製して、このベクターをmegaplasmid（アセト酢酸脱炭酸酵素の遺伝子、ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子、アルコール／アルデハイドデヒドロゲナーゼの遺伝子を含む１７６遺伝子が存在）が欠失しているクロストリジウム・アセトブチリカム変移株Ｍ５（Cornillot et al., J. Bacteriol., 179:5442, 1997）に導入して、遺伝子組換え微生物を製造した。また、クローニング用ベクターとして使ったｐＩＭＰ１をクロストリジウム・アセトブチリカムＭ５菌株に導入してＭ５（ｐＩＭＰ１）菌株を製造した。
【００３２】
形質転換のためのＭ５コンピテント細胞（competent cell）は次のように準備した。先ず、１０ｍＬＣＧＭ（表２）にＭ５菌株を接種した後、ＯＤ ０．６になるまで培養した。これを利用して、２Ｘ ＹＴＧ培地（バクトトリプトンン１６ｇ、イーストイクストラクト１０ｇ、ＮａＣｌ ４ｇ、グルコース５ｇ、１Ｌ当り）６０ｍＬに１０％接種して、４〜５時間培養した。形質転換バッファー（ＥＰＢ、２７０ｍＭスクロース１５ｍＬ、６８６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４１１０μＬ、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、２．４ｍＬの同一バッファーで微生物細胞を懸濁させた。このように作られたＭ５コンピテント細胞（competent cell）６００μＬと遺伝子組換えプラスミドＤＮＡ２５μＬを混ぜて、４ｍｍ電極を有するキュベットに充填後、２．５ｋＶ、２５ｕＦの条件で電気衝撃を与えた。直ちに、１ｍＬの２ｘＹＴＧ培地で懸濁し、３時間３７℃で培養した後、４０μｇ／μＬのエリスロマイシンが含まれた２ｘＹＴＧ固体培地に塗抹して、形質転換体を選抜した。
【００３３】
【表２】
【００３４】
［実施例３］遺伝子組換え微生物Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）を利用したエタノール／ブタノール生産
実施例２で製造された遺伝子組換え微生物Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）を培養して、その性能を評価した。ＣＧＭ培地１０ｍＬを含有した３０ｍＬ試験管を滅菌後８０℃以上で取り出して、窒素ガスを満たした後、嫌氣チャンバーで室温まで冷やした後、エリスロマイシン（erythromycin）４０μｇ／μＬを添加して、前記遺伝子組換え微生物を接種して、３７℃で吸光度（６００ｎｍ）が１.０になるまで嫌氣条件で前培養を行った。前記成分で構成された培地１００ｍＬを含有した２５０ｍＬフラスコを滅菌後、前記前培養液６ｍＬを接種して、吸光度（６００ｎｍ）が１．０になるまで３７℃、嫌氣条件で２次培養した。その後、前記成分で構成された培地２．０Ｌを含有した５．０Ｌ発酵機（LiFlus GX, Biotron Inc., Kyunggi-Do, Korea）を滅菌後、８０℃以上から窒素を０．５ｖｖｍで１０時間供給しながら、室温まで温度を下げてからエリスロマイシン（erythromycin）４０μｇ／ｍＬを添加して前記２次培養液１００ｍＬを接種して、３７℃、２００ｒｐｍで６０時間培養した。ｐＨは５ＮのＮａＯＨのautomatic feedingによって、５．５に維持され、培養中には窒素を０．２ｖｖｍ（air volume/working volume/minute）で供給した。
【００３５】
前記培地中のグルコース（glucose）をglucose analyzer（model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA）で測定し、時間毎に前記培地を採取して、これから生成されるアセトン、エタノール、及びブタノール濃度を、packed column（Supelco CarbopackTM B AW/6.6% PEG 20M, 2m×2mm ID, Bellefonte, PA, USA）が装着されたガスクロマトグラフィー（gas chromatography: Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA）で測定した。
【００３６】
その結果、表３に示したように、対照菌Ｍ５（ｐＩＭＰ１）ではエタノール及びブタノールが生成されなかったが、遺伝子組換え菌株Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）の場合、高濃度のエタノール及びブタノールが生成され、アセトンは殆ど生成されない（０．５ｇ／Ｌ以下）ことを確認することができた。さらに、エタノールとブタノールの最終生産濃度だけでなく生産性も向上したのを確認することができた。
【００３７】
一方、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４菌株の場合、アセトン生成量が全体有機溶剤の約２８％と知られているが（Harris et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 27:322, 2001）、本発明に係わる遺伝子組換え菌株の場合、約５％未満とその生成量が僅かであることを確認することができた。
【００３８】
【表３】
【産業上利用の可能性】
【００３９】
以上、詳細に説明したが、本発明は特定遺伝子の導入または増幅を介して、エタノール及びブタノールの高生産能力を持つ遺伝子組換え変移微生物を提供する効果がある。本発明に係わる遺伝子組換え変異微生物は、代謝経路の操作によって、アセトンなどの副産物の生産が殆どないだけでなく、エタノールとブタノールの時間当り生産性を向上させられてエタノール／ブタノールの産業的生産に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に、酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡに転換する酵素をコードする遺伝子及び／またはアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子を導入することを含む、エタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物の製造方法。
【請求項２】
前記アセチルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの生合成経路は、[アセチルＣｏＡ-->アセトアセチルＣｏＡ-->３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ-->クロトニルＣｏＡ-->ブチリルＣｏＡ]である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主微生物は、アセトン生合成経路が遮断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アセトン生合成経路が遮断されている宿主微生物は、アセト酢酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（ａｄｃ）が欠失している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主微生物はクロストリジウム属由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡに転換する酵素は、ＣｏＡトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ｃｔｆＡＢである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素は、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ａｄｈＥ１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アセチルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に、酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡに転換する酵素をコードする遺伝子及び／またはアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子が導入または増幅されているエタノール及びブタノール生成能が増加した組換え微生物。
【請求項１１】
前記アセチルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの生合成経路は、[アセチルＣｏＡ-->アセトアセチルＣｏＡ-->３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ-->クロトニルＣｏＡ-->ブチリルＣｏＡ]である、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記宿主微生物は、アセトン生合成経路が遮断されている、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
前記アセトン生合成経路が遮断されている宿主微生物は、アセト酢酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（ａｄｃ）が欠失している、請求項１２に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記宿主微生物は、クロストリジウム属由来である、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡに転換する酵素は、ＣｏＡトランスフェラーゼである、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ｃｔｆＡＢである、請求項１５に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
アセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素は、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
前記アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ａｄｈＥ１である、請求項１７に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
アセトン生成量が全体有機溶剤生産量の１０％未満である、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
増加したエタノール及びブタノール生成能を有するクロストリジウム・アセトブチリカム変移株Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）。
【請求項２１】
請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の組換え微生物を培養する段階及び前記培養液からエタノール及び／またはブタノールを回収する段階を含むエタノール及び／またはブタノールの製造方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の組換え微生物を培養する段階及び前記培養液からエタノール及び／またはブタノールを回収する段階を含むエタノール及び／またはブタノールの製造方法。
【請求項１】
アセチルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に、酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡに転換する酵素をコードする遺伝子及び／またはアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子を導入することを含む、エタノール及びブタノール生成能が増加した遺伝子組換え微生物の製造方法。
【請求項２】
前記アセチルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの生合成経路は、[アセチルＣｏＡ-->アセトアセチルＣｏＡ-->３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ-->クロトニルＣｏＡ-->ブチリルＣｏＡ]である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主微生物は、アセトン生合成経路が遮断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アセトン生合成経路が遮断されている宿主微生物は、アセト酢酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（ａｄｃ）が欠失している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主微生物はクロストリジウム属由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡに転換する酵素は、ＣｏＡトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ｃｔｆＡＢである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素は、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ａｄｈＥ１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アセチルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を持っている宿主微生物に、酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡに転換する酵素をコードする遺伝子及び／またはアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素をコードする遺伝子が導入または増幅されているエタノール及びブタノール生成能が増加した組換え微生物。
【請求項１１】
前記アセチルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの生合成経路は、[アセチルＣｏＡ-->アセトアセチルＣｏＡ-->３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ-->クロトニルＣｏＡ-->ブチリルＣｏＡ]である、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記宿主微生物は、アセトン生合成経路が遮断されている、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
前記アセトン生合成経路が遮断されている宿主微生物は、アセト酢酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（ａｄｃ）が欠失している、請求項１２に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記宿主微生物は、クロストリジウム属由来である、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
酢酸及びブチル酸を、それぞれアセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡに転換する酵素は、ＣｏＡトランスフェラーゼである、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ｃｔｆＡＢである、請求項１５に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
アセチルＣｏＡ及びブチリルＣｏＡを、それぞれエタノール及びブタノールに転換する酵素は、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
前記アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ａｄｈＥ１である、請求項１７に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
アセトン生成量が全体有機溶剤生産量の１０％未満である、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
増加したエタノール及びブタノール生成能を有するクロストリジウム・アセトブチリカム変移株Ｍ５（ｐＩＭＰ１：：ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）。
【請求項２１】
請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の組換え微生物を培養する段階及び前記培養液からエタノール及び／またはブタノールを回収する段階を含むエタノール及び／またはブタノールの製造方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の組換え微生物を培養する段階及び前記培養液からエタノール及び／またはブタノールを回収する段階を含むエタノール及び／またはブタノールの製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５０７５０４（Ｐ２０１１−５０７５０４Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３９３０９（Ｐ２０１０−５３９３０９）
【出願日】平成２０年１２月２２日（２００８．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００７５７７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８２１４８
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０２３１８４７８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ (27)
【出願人】（５１０１７１５０８）バイオフューエルケム カンパニー (1)
【出願人】（５１０１７１５１９）ジーエス カルテクス コーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２２日（２００８．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００７５７７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８２１４８
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０２３１８４７８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ (27)
【出願人】（５１０１７１５０８）バイオフューエルケム カンパニー (1)
【出願人】（５１０１７１５１９）ジーエス カルテクス コーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
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