エビ類検出用プライマーセット
【課題】食物アレルギーの原因となるエビ類を、カニ類等と峻別し、直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及びそのためのプライマーセットの提供。
【解決手段】EBI-SP1-F1、EBI-SP2-F1、EBI-SP2-R1、及びEBI-SP1-R1に示される特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット。ＰＣＲ増幅を、マルチプレックスＰＣＲ法を用いて行う、ＰＣＲ法によるエビ類の検出方法。
【解決手段】EBI-SP1-F1、EBI-SP2-F1、EBI-SP2-R1、及びEBI-SP1-R1に示される特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット。ＰＣＲ増幅を、マルチプレックスＰＣＲ法を用いて行う、ＰＣＲ法によるエビ類の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食物アレルギーの原因となるエビ類を直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法などの遺伝子増幅法によるエビ類の検出方法及びそのための検出用プライマーセット、特に、飲食品製造原料として多用されるエビ類とカニ類を区別可能なＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及びそのための検出用プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本においてアレルギーを持つ人は非常に多いと言われている。アレルギーは抗原及び症状の違い等により様々な種類が存在するが、花粉症、喘息、アトピー性皮膚炎及びアレルギー性鼻炎はアレルギー症状の中でも特に症例数が多い疾患である。中でも食物アレルギーはその発症件数の多さや症状の重篤度から大きな社会問題となっている。食物アレルギーを引き起こす原因食品としては、小麦、卵、乳・乳製品、そば及び落花生の主要５品目の他に果物や肉類及び魚介類など様々な食品が挙げられる。その割合は高い方から、鶏卵、乳製品、小麦、甲殻類、果物類、ソバ、魚類、大豆、木の実類、肉類、野菜類および軟体類である。その中でもアレルギーを引き起こすとされる魚介類は、アワビ、イカ、エビ、カニ、サケ、サバが挙げられるが、特に甲殻類は鶏卵、乳製品、小麦に次いで発症件数が多い食品である。
【０００３】
我が国におけるアレルギー表示制度の動向は、平成１４年４月から食品衛生法によって加工食品中の特定原材料５品目のアレルギー表示が義務付けられ、特定原材料に準ずるものとしては２０品目が表示推奨の対象となった。特定原材料としては、卵、乳・乳製品、小麦、そば、落花生が、特定原材料に準ずるものとしては、エビ、カニ、アワビ、イクラ、オレンジ、キウイフルーツ、牛肉、クルミ、サケ、サバ、大豆、鶏肉、豚肉、マツタケ、モモ、ヤマイモ、リンゴ、ゼラチン、バナナが挙げられている。平成１６年７月に開かれた「第１８回食品の表示に関する共同会議」（厚生労働省；薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会食品表示調査会と農林水産省；農林物資規格調会小委員会の共催）ではアレルギー物質を含む食品に関する表示についての議論が行われ、実態調査により「エビ」についてアレルギー原因食品としての重要性が確認され、その後、甲殻類（エビ・カニ）における臨床的エビデンスの蓄積、アレルギー物質の検査方法開発などの技術的検討から平成２０年度６月から、エビ及びカニは表示推奨の対象から表示義務化の対象とされることとなった。
【０００４】
これまで、甲殻類の検出法としては、エビやカニの主要アレルゲンであるトロポミオシンをＥＬＩＳＡ法により検出する方法が知られている（J Allergy Clin Immunol. 100, 229-34 ,1997)。また、エビコラーゲン又はそのポリペプチド断片からなるエビアレルゲンに対する抗エビアレルゲン抗体を取得し、試料中のエビアレルゲンの混入を検出する方法も開示されている（特開２００８−２５５０５４号公報）。ＥＬＩＳＡ法は定量性に優れているが、患者の血清が必要な上、検出標的としているトロポミオシンが甲殻類の種間でも類似性が高く、エビとカニに共通して存在し、エビだけを特異的に検出することはできない。そのため、エビのみにアレルギーを持つ患者のニーズに対応することは困難である。
【０００５】
一方、近年ＤＮＡ解析技術の発展に伴って、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応；Polymerase Chain Reaction）など遺伝子増幅法に基づいたミトコンドリアＤＮＡ (ｍｔＤＮＡ)をターゲットとする検出技術が検討されている。ＰＣＲ法は、鋳型ＤＮＡ、耐熱性のＤＮＡ（Ｔａｑ ポリメラーゼなど）、目的ＤＮＡの両末端部分の配列をもつオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ合成反応のプライマー）及び基質ヌクレオチドを混合し、反応系に供すことで目的のＤＮＡ断片のみを選択的に増幅させる方法のことである。このＰＣＲ法を用いて、食品中のエビやカニ等の検出を行う方法が開示され、そのＰＣＲ増幅のためのプライマーは数多く開示されている。
【０００６】
例えば、ハウス食品(株)のホームページには「食品中に含まれるアレルギー物質の検査法開発」(2009.2.5)について、食品衛生法が定めるアレルギー物質のうち、エビ、カニ、キウイ、モモ、リンゴのＰＣＲ検出技術の開発について報告されている。また、日本食品衛生学会学術講演会講演要旨集(２００８)には、「ＰＣＲを用いた食品中のエビ及びカニの識別検出法」について掲載されている。更に、“J FOOD prot vol68 P1866(2005)”には、“Detection of crustacean DNA and species identification using a PCR-restriction fragment length polymorphism method”と題して、エビを０．１％含んでいても検出可能な、PCR−restriction fragmentについて報告されている。
【０００７】
また一方、特開２００６−２８０２８１号公報には、サバ、サケ、アワビ、イカや、カニ、エビの検出に好適なＰＣＲプライマーセットが開示されている。かかるＰＣＲプライマーセットにおいて、カニ、エビの検出に好適なＰＣＲプライマーセットは、何れも、カニ、エビに共通するＰＣＲプライマーセットであって、エビ又はカニを区別して検出することはできない。特開２００８−１２８号公報には、カニ及びその他の甲殻類とを区別してエビを高感度で検出するためのエビ検出用プライマーセットが開示されている。
【０００８】
このプライマーセットは、エビの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列において、エビに共通する塩基と、エビに共通し、かつカニ及びその他の甲殻類と区別できる塩基とを含む領域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を有する核酸分子にアニーリングし得るオリゴヌクレオチドから構成される、エビ検出用プライマーセットからなる。このプライマーセットとして、エビとカニの判別用のプライマーと、エビ・カニとその他の甲殻類を判別するプライマーの３種のプライマーを用いることにより、エビ類を特定する方法が開示されている。すなわち、具体的には、エビ２３種、カニ、シャコ、オキアミ、アミの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を基に、試料が加工品であっても検出できるように、１００〜２００ｂｐのプライマーを３種設計されているが、エビとカニを直接区別できるプライマーは開示されておらず、設計されたエビとカニを区別するプライマーは、一部のカニでは区別ができないので、該プライマーと一緒に、エビ、カニを区別できるプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチドを用いて、シャコ、オキアミ、アミなどの他の甲殻類を除く方法が開示されている。また、えびの検出についても、すべてのえび類を検出できるプライマーセットにはなっていない。
【０００９】
一方、特開２００９−２０７４８６号公報には、カニをエビ及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類と区別するカニ検出用プライマーセットが開示されている。該開示のプライマーセットは、カニの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列から設計したプライマーとなり得るオリゴヌクレオチドの３’末端から２番目の塩基に標的配列に対してミスマッチ塩基を導入したオリゴヌクレオチドから構成されるカニ検出用プライマーセットからなる。かかる開示のものは、カニをエビと区別して検出するものであるが、カニの検出方法であるので、エビ類を直接検出することはできない。
【００１０】
上記のように、エビ類、カニ類を、プライマーを用いたＰＣＲ法により検出する方法が開示されているが、今までに、エビ類全体を区別でき、かつ、カニ類を区別して直接的にエビ類を検出し、他の甲殻類とも判別できるＰＣＲプライマーセットは開示されていない。エビは、食物アレルギー表示義務対象であり、エビに対してアレルギー反応を起こすエビアレルギー患者に対する適切な対応のためには、飲食物等において原料や素材として用いられるエビ類を特異的かつ確実に検出できるエビ類の検出方法の開発が望まれるところである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００６−２８０２８１号公報
【特許文献２】特開２００８−１２８号公報
【特許文献３】特開２００８−２５５０５４号公報
【特許文献４】特開２００９−２０７４８６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】J Allergy Clin Immunol. 100, 229-34 ,1997
【非特許文献２】ハウス食品（株）のホームページ「食品中に含まれるアレルギー物質の検査法開発」
【非特許文献３】日本食品衛生学会学術講演会講演要旨集(２００８)
【非特許文献４】J FOOD prot vol68 P1866(2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、食物アレルギーの原因となるエビ類を直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法による検出方法及びそのためのプライマーセットを提供すること、特に、飲食品製造原料として多用されるエビ類とカニ類を峻別可能なＰＣＲ法による検出方法及びそのためのプライマーセットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、食物アレルギーの原因となるエビ類をカニ類と区別し、直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法による検出方法及びそのためのプライマーセットの開発について鋭意検討する中で、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）内においても保存性の高い配列をもつ領域の一つである１６Ｓ ｒＲＮＡをターゲットとし、該領域が特異プライマー設計によく用いられていることや多くの生物にわたって保存された箇所が存在することを考慮して、エビのミトコンドリアＤＮＡ１６Ｓ ｒＲＮＡ領域をエビ類１２種類につき解析した結果、クルマエビ科［クルマエビ、ブラックタイガー］と、タラバエビ科［アキアミ（アミエビ:オキエビ）、サクラエビ、アカエビ、ホッコクアカエビ（アマエビ）、ホッカイエビ、イセエビ、オーストラリアンロブスター、ウチワエビ、ボタンエビ、バナメイエビ］で保存されている特異配列を見い出し、カニ類には反応しない、クルマエビ科とタラバエビ科を区別できるＰＣＲプライマーを設計することに成功し、該ＰＣＲプライマーセットによる、カニ類と区別し、エビ類を全体を特異的かつ効果的に検出できる本発明のエビ類の検出方法の発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、EBI-SP1-F1：5’-TTT AAG TGA AAA GGC TTA AAT-3’（配列表の配列番号１）、EBI-SP2-F1：5’-TTA GAA CAT AAG ACG AGA AG-3’（配列番号２）、EBI-SP2-R1：5’-GTG GCT CTT GTT TTT GAA AGA-3’（配列番号３）、及びEBI-SP1-R1：5’-CTG TTA TCC CTA AAG TAA CTT-3’（配列番号４）に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成される、ＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット、該プライマーセットを用いたＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及び、プライマーセットを具備したＰＣＲ法によるエビ類検出用キットからなる。本発明において、ＰＣＲ法によるエビ類の検出には、マルチプレックスＰＣＲにより行うことができる。
【００１６】
すなわち、具体的には本発明は、（１）配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成される、ＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットや、（２）プライマーセットが、カニ類と区別してエビ類を判別するプライマーセットであることを特徴とする上記（１）記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットや、（３）ＰＣＲ法が、マルチプレックスＰＣＲであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットや、（４）試料より抽出したＤＮＡを鋳型として、上記（１）記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の有無を指標として判別することを特徴とするＰＣＲ法によるエビ類の検出方法からなる。
【００１７】
また、本発明は、（５）ＰＣＲ増幅を、マルチプレックスＰＣＲ法を用いて行うことを特徴とする上記（４）記載のＰＣＲ法によるエビ類の検出方法や、（６）エビ類の検出が、飲食品中に含まれるエビ類由来の飲食品素材の検出であることを特徴とする上記（４）又は（５）記載のＰＣＲ法によるエビ類の検出方法や、（７）配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを具備することを特徴とするＰＣＲ法によるエビ類検出用キットや、（８）ＰＣＲ法によるエビ類検出用キットが、マルチプレックスＰＣＲ法による検出用キットであることを特徴とする上記（７）記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用キットからなる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットは、市場に流通するエビ類をはじめとして、各種のエビ類全体に対する検出を可能とし、しかも、カニ類に対しては、反応しないことから、食物アレルギーの原因となるエビ類をカニ類と区別し、直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及びそのためのＰＣＲプライマーセットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のエビ類の検出方法において対象となる、市場に流通しているエビ類の写真である。
【図２】本発明の実施例におけるＤＮＡの精製度の確認と定量の実験において、１６ＳＡＲ−Ｌ／１６ＳＢＲ−Ｈプライマーセットにおける１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅領域について示す図である。
【図３】本発明の実施例において、１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＢＲ−Ｈのプライマーセットを用いて１２種のエビ類をＰＣＲ増幅させ、電気泳動に供した結果を示した図である。
【図４】本発明の実施例において４種のエビ類（ボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビ、アカエビ）に関して設計し直した、ＥＢＩ−１６Ｓ−Ｆ１及びＥＢＩ−１６Ｓ−Ｒ１の増幅領域及びプライマー配列を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、ＥＢＩ−１６Ｓ−Ｆ１及びＥＢＩ−１６Ｓ−Ｒ１のプライマーセットを用いてボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビ及びアカエビをＰＣＲ増幅させ、電気泳動に供した結果を示す写真である。
【図６】本発明の実施例において、ＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ／ＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓプライマーペアーを用いたクルマエビ、ブラックタイガー、アキアミ、サクラエビ、及びバナメイエビのＰＣＲ増幅結果を示す写真である。
【図７−１】本発明の実施例において、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較図を示す図である。
【図７−２】本発明の実施例において、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較図を示す図の続きである。
【図７−３】本発明の実施例において、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較図を示す図の続きである。
【図７−４】本発明の実施例において、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較図を示す図の続きである。
【図８】本発明の実施例における１２種のエビ類と魚類との塩基配列比較試験において、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域におけるカツオとのエビ類の塩基配列比較について示す図である。
【図９】本発明の実施例における実用性の検証の試験において、ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のミックスプライマーセットを用いて市場で流通するエビ類の加工品及び他の魚介類を用いて実用性の検証を行った結果の電気泳動図（プライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−１）を示す図である。
【図１０】本発明の実施例における実用性の検証の試験において、ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のミックスプライマーセットを用いて市場で流通するエビ類の加工品及び他の魚介類を用いて実用性の検証を行った結果の電気泳動図（プライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−２）を示す図である。
【図１１】本発明の実施例における実用性の検証の試験において、ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のミックスプライマーセットを用いて市場で流通するエビ類の加工品及び他の魚介類を用いて実用性の検証を行った結果の電気泳動図（プライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−３）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、食物アレルギーの原因となるエビ類を直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット、該プライマーセットを用いたＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及び、プライマーセットを具備したＰＣＲ法によるエビ類検出用キットからなる。該ＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットは、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成される。
【００２１】
本発明で、検出の対象となるエビ類としては、現在、市場に流通しているエビ類１２種類：クルマエビ科［クルマエビ、ブラックタイガー］と、タラバエビ科［アキアミ（アミエビ:オキエビ）、サクラエビ、アカエビ、ホッコクアカエビ（アマエビ）、ホッカイエビ、イセエビ、オーストラリアンロブスター、ウチワエビ、ボタンエビ、バナメイエビ］（図１）を挙げることができるが（表１：１２種のエビ類の名称、産地および製品名）、その他のエビ類も包含される。なお、カブトエビ、ホウネンエビ、カイエビ、ヨコエビ、シャコ、オキアミ、カブトガニは、名前に「エビ」とついていたり、姿形がエビと類似しているが、エビ類には含まれない。これらはカニ類とも異なるため、その他甲殻類とされている。本発明のエビ類の検出方法では、従来の方法（特開２００８−１２８号公報）では検出されないアキエビ（アミエビ）も検出することができる。このアキエビが飲食品中に混入されると、エビアレルギーの原因となることから、その検出が要望されている所である。また、本発明のＰＣＲエビ類検出用プライマーセットは、エビ等の甲殻類は陽性で、カニは陰性になることから、カニを区別してエビ類を特異的に検出することができるＰＣＲプライマーセットとして、特に、メリットがある。
【００２２】
【表１】
【００２３】
本発明のエビ類検出に用いられるＰＣＲプライマーセットとしては、本発明において
エビのミトコンドリアＤＮＡ１６Ｓ ｒＲＮＡ領域から設計された次の４つのオリゴヌクレオチドから構成されるＰＣＲプライマーセットが用いられる：EBI-SP1-F1：5’-TTT AAG TGA AAA GGC TTA AAT-3’（配列番号１）、EBI-SP2-F1：5’-TTA GAA CAT AAG ACG AGA AG-3’（配列番号２）、EBI-SP2-R1：5’-GTG GCT CTT GTT TTT GAA AGA-3’（配列番号３）、及びEBI-SP1-R1：5’-CTG TTA TCC CTA AAG TAA CTT-3’（配列番号４）。該ＰＣＲプライマーセットにおけるプライマーは、プライマーとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるＤＮＡ自動合成装置を利用して合成することが可能である。
【００２４】
本発明におけるエビ類の検出は、上記のプライマーセットを用い、ＰＣＲ法により、試料より抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅産物の有無を検出することにより行なうことができる。試料としては、エビを含む可能性のある飲食品やその原料、或いは食品素材が対象となる。本発明の方法により得られた検出結果は、食品のアレルギー表示に利用できるほか、飲食品の製造原料、素材の確認や、製造ラインにおけるコンタミネーションの有無の確認に利用できる。
【００２５】
試料からのＤＮＡの抽出は、核酸抽出法として当業者に公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、フェノール／クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法、などにより行うことができる。試薬メーカーより販売されている各種ＤＮＡ抽出キットを用いても良い。試料の種類によっては、メンブランフィルターによる濾過やホモジナイズ他の精製方法を用いることができる。
【００２６】
本発明のＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲを行うには、プライマーセットとして該本発明のプライマーセットを用いる以外は特に制限はなく、他の試薬、条件（温度条件、サイクルの回数等）は、当業者であれば適切に選択及び設定することができる。該ＰＣＲとしては、マルチプレックスＰＣＲ（Ｍ−ＰＣＲ）を用いることができる。マルチプレックスＰＣＲは、同時に複数個（十数個）の遺伝子を分析することが可能であり、本発明のＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲを行うのに、特に有利に適用することができる。マルチプレックスＰＣＲのキット自体は、市販のものを利用することができ（マキシムバイオ社Ｍ−ＰＣＲ）、その使用条件等は当業者が適宜定めることができる。
【００２７】
本発明のＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行うと、試料にエビ類が含まれる場合は、該ＰＣＲプライマーで増幅されたエビに特異的な増幅産物が得られる。また、本発明のＰＣＲプライマーセットは、カニ類は陰性になることから、カニ等を区別してエビ類を特異的に検出することができる。本発明のＰＣＲプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅を行なうことによって、エビに特異的な増幅産物が得られることから、従来法のように、ＰＣＲ増幅を行って得られた増幅産物が「エビ」か「カニ」かどうかを確認するために制限酵素処理や、シークエンス解析を行って、その確認を行なう必要はない。
【００２８】
ＰＣＲにより得られる増幅産物中に、目的の増幅断片が含まれるかどうかは、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡハイブリダイゼーション等の公知の方法を用いて確認することができる。目的の増幅断片のサイズは、検出しようとするエビの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域において両プライマーに挟まれる領域の塩基数となる。本発明のＰＣＲプライマーセットEBI-SP1-F1（配列番号１）／EBI-SP1-R1（配列番号４）及びEBI-SP2-F1（配列番号２）
／EBI-SP2-R1（配列番号３）を用いてＰＣＲを行なった場合には、エビ類或いはエビの加
工品の場合は、増幅断片のサイズは約２００ｂｐの増幅断片を得る。
【００２９】
以下に実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
［Ｉ．ＰＣＲプライマーセットの構築］
（１．１２種類のエビ類のＤＮＡデータベース（ＮＣＢＩ）における塩基配列登録状況の検索）
本発明のＰＣＲプライマーセットの構築にあたり、特に市場に流通するエビ類を１２種選定した。１２種のエビ類の名称を表２［ＤＮＡデータベース（ＮＣＢＩ）における１２種のエビ類の塩基配列登録状況］に示す。 選定した１２種のエビ類のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔ ＤＮＡ）において保存性の高い配列を探し出すために、どの領域をターゲットとするのかを決定する必要があり、そこで、ＤＮＡデータベース（ＮＣＢＩ）において１２種のエビ類のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列登録状況を調べた。表２に示したとおり、アキアミ、サクラエビ、ウチワエビ、ボタンエビは未だ塩基配列が登録されていないことが分かり、解析する必要があった。一方、イセエビは全塩基配列が登録済みであり、他のエビ類は１６Ｓ ｒＲＮＡ及びＣ０Ｉ領域が登録されているものが多いことが分かった。しかしながら、これらの登録されている配列の多くは部分配列であり、それらの箇所も一致していないため、１２種のエビ類間において保存性の高い配列を探し出すためには、改めてターゲット領域を定める必要性があった。
【００３１】
【表２】
【００３２】
（２．保存性の高い配列探索のためのターゲット領域の決定）
エビ特異プライマーを設計するためには、１２種のエビ類間において保存性の高い配列を探し出す必要がある。そこで、表２の結果を踏まえて、本研究ではミトコンドリアＤＮＡ内においても保存性の高い配列をもつ領域の一つである１６Ｓ ｒＲＮＡをターゲットとした。これは、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域が特異プライマー設計によく用いられていることや多くの生物にわたって保存された箇所が存在するため、それらの配列を用いてユニバーサルプライマーが設計されているためである。
【００３３】
（３．試料および実験方法）
（３−１．試料）
試料には、特に市場に流通する１２種のエビ類を用いた。試料に用いた１２種のエビ類の名称、学名及び産地を前記表１に示す。
【００３４】
（３−２．DNeasy(R) Blood & Tissue Kitを用いた全ＤＮＡの抽出）
全ＤＮＡ抽出にはDNeasy(R) Blood & Tissue Kit (QIAGEN)を用い、操作は付属の説明書に従った。なおバッファーにはすべてキットに含まれているものを使用した。抽出は、各エビにつきそれぞれ５検体ずつ行った。サクラエビの場合は１個体が小さく１匹からＤＮＡを抽出することは困難であったため、無作為に１０匹を選び出し、それらを乳鉢と乳棒を用いてすりつぶしたものを1検体とした。その他のエビは１個体につき１検体とした。
【００３５】
まず、各エビからそれぞれ２５ｍｇを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに採取し、Buffer ATL １８０μＬとproteinase K solution (QIAGEN) ４０μＬを加えボルテックスミキサーでボルテックスし５５℃で３時間インキュベートした。その後室温下で２０，０００×ｇで１５分遠心分離を行い、上清を別の１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。上清を移したエッペンドルフチューブにRNase A(１００ｍｇ／ｍＬ)４μＬを加えボルテックス後室温に２分間放置した。その後、Buffer AL２００μＬを加えボルテックスした後、７０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後ボルテックスを行い、１００％エタノールを２００μＬ加え再度ボルテックスを行い、溶解液を得た。次に、２ｍＬ collecting tube に設置したDNeasy Mini Spin columnに溶解液全量を移し替え、室温、１３，０００×ｇで１分遠心分離を行い、溶出液を捨てた。
【００３６】
新たに用意した２ｍＬcollecting tubeにDNeasy Mini Spin columnを移し、Buffer AW1を５００μＬ加え、室温、１３、０００×ｇで１分間遠心分離を行い溶出液を捨てた。再び新たに用意した２ｍＬ collecting tubeにDNeasy Mini Spin columnを移し、Buffer ＡＷ２を５００μL加え、室温、１８、０００×ｇで３分間遠心分離を行い、溶出液を捨てた。その後新たに用意した１．５ｍＬエッペンドルフチューブにDNeasy Mini Spin columnを移し替え、AE Buffer ２００μＬを加え、室温で１分間放置した。放置後室温、２０，０００×ｇで１分遠心分離を行い、ＤＮＡを抽出した。これをＤＮＡ抽出液とし、ＰＣＲ増幅の鋳型ＤＮＡとして用いるまで−２０℃で冷凍保存した。
【００３７】
（３−３．ＤＮＡの精製度の確認と定量）
抽出精製したＤＮＡ試料原液を一定量取り、２００−３２０ｎｍの範囲で紫外線吸収スペクトルを測定した。この際、２３０、２６０及び２８０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．２３０、２６０及び２８０）を記録した。次いで２６０ｎｍの吸光度の値１を５０ｎｇ／μＬとしてＤＮＡ濃度を算出した。また、Ｏ．Ｄ．２６０／２８０を計算し、この比が１．２−２．５であることを確認した。
【００３８】
（３−４．ＰＣＲ増幅）
エビ類ミトコンドリアＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ 領域のＰＣＲ増幅には、ユニバーサルプライマーである１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＢＲ−Ｈのプライマーセットを用いた。このプライマーによる１６Ｓ ｒＲＮＡ内の増幅領域およびプライマー配列を図２（１６ＳＡＲ−Ｌ／１６ＳＢＲ−Ｈプライマーセットにおける１６Ｓ ｒＲＮＡ 増幅）及び表３（１６ＳＡＲ−Ｌ／１６ＳＢＲ−Ｈプライマーセットの配列）に示した。
【００３９】
【表３】
【００４０】
１検体あたりのＰＣＲ反応液は０．２ｍＬＰＣＲチューブ中に精製した５ｎｇ／μＬ鋳型ＤＮＡ２．５μＬ、１０×緩衝液（TaKaRa）２．５μＬ、２．５ｍＭ each ｄＮＴＰ mix２．０μＬ、２０μＭ各プライマー０．７５μＬ、ExTaq ＤＮＡ ポリメラーゼ（TaKaRa）０．２μＬ、及び滅菌水１６．３μＬを加え、全体で２５μＬとなるようにした。ＰＣＲの温度条件は、９８℃で１０秒、５３℃で３０秒、７２℃で６０秒のサイクルを３０回行った。ＰＣＲ終了後、得られた反応液１０μＬをSYBR SafeTM（１０μＬ／１００ｍＬ）入り１．５％アガロースゲル電気泳動に供した。通電は１００Ｖで３０分とし、増幅断片の検出はトランスイルミネーターで目的とするバンドを観察した。
【００４１】
なお、ＰＣＲ反応では、鋳型ＤＮＡがごく僅かでも存在していれば目的塩基配列領域が増幅され得る。したがって、実際の操作ならびに日ごろの実験環境の保全にあたり、ＤＮＡ（特にＰＣＲ増幅産物）の混入に充分注意を払う必要がある。また、ＤＮＡは人間の皮膚表面から分泌されているＤＮＡ分解酵素により分解されるため、本酵素の混入を防止させなければならない。これらの点を考慮し、意図せざるＤＮＡの混入防止するため、使用するチューブ、チップに関しては、滅菌済みフィルター付きチップを使い捨てで使用することとした。
【００４２】
（３−５．Exo-SAP ＩＴを用いたＰＣＲ産物の精製）
ＰＣＲ増幅産物の塩基配列決定においては、今回得られたＰＣＲ増幅の精製、プラスミド化は行わず、得られたＰＣＲ産物をそのままシークエンス反応に供すダイレクトシーケンス法を採用した。しかしながら、ＰＣＲ反応液中にはＰＣＲ反応の際、余剰の未反応プライマー及びｄＮＴＰが存在する。これらの除去を行わないとシーケンス反応におけるコンタミネーションの原因になってしまう。そこで、ＰＣＲ反応液中の過剰なプライマー及びｄＮＴＰを除去することを目的として、ＰＣＲ反応液のExo-SAP ＩＴ (Amersham Biosciences) 処理を行った。ＰＣＲ反応液に対して５：２２となるようにExo-SAP ＩＴを添し、斎藤および服部の方法（「タンパク質核酸酵素」41,522-530,1996）に従い３７℃で６０分間インキュベートした。この操作によって、エキソヌクレアーゼ（ExoＩ）による過剰なプライマーの分解及びシュリンプアルカリフォスファターゼ（ＳＡＰ）による余分なｄＮＴＰの脱リン化を行った。その反応後８５℃で１５分間加熱することにより、酵素を失活させた。反応後は、ラベリング反応に使用するまで４℃で冷蔵保存した。
【００４３】
（３−６．シーケンス反応）
Exo-SAP ＩＴ処理後のＰＣＲ反応液をラベリング反応に供した。ラベリング反応にはBigDye TerminatorTM v1.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems)を用い、ＤＮＡシーケンサーとして１キャピラリーのABI PRISM(R)310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)及び１６キャピラリーのABI PRISM(R)3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を使い塩基配列の決定を行った。
【００４４】
シーケンス反応は０．２ｍＬ ＰＣＲチューブ中でExo-SAP ＩＴ処理を行ったＰＣＲ反応液を３．５μＬ、２０μＭプライマーを１．０μＬ、上記のキットに含まれるBigDye TerminatorTM v1.1 Ready reaction mixを１．０μＬ加え、全量が１０μＬになるように滅菌水を加えた。その後サーマルサイクラーによりインキュベートしシーケンス反応を行った。温度条件は、９６℃で１分間加熱した後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分のサイクルを１サイクルとし、２５サイクル行った。次にシーケンス反応後のＰＣＲ産物１０μＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中に移し、１２ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０）２．５μＬ、９９．５％エタノール３０μＬを加え室温に１５分間放置した後、室温若しくは４℃、２０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を除去した。
【００４５】
続いて、７０％エタノールを３０μＬ加え室温若しくは４℃、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、再び上清を除去し、得られた沈殿を真空中で乾燥させてエタノール沈殿処理を完了した。乾燥後、Hi-Di Formamide (Applied Biosystems)１５μＬを加え溶解させ、ボルテックス後９５℃で３分間熱変性を行い、最後に１分間氷冷しこれをシーケンスサンプルとした。このサンプルをABI PRISM(R)310 Genetic Analyzer又はABI PRISM(R)3100 Genetic Analyzerに供し塩基配列を決定した。データの解析には、解析ソフトSeqEd Version 1.0.3 (Perkin Elmer社)を用いた。
【００４６】
（４．結果）
（４−１．１２種のエビ類のＰＣＲ増幅）
１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＢＲ−Ｈのプライマーセットを用いて１２種のエビ類をＰＣＲ増幅させ、電気泳動に供した結果を図３に示した（写真中、１：クルマエビ；２：ブラックタイガー；３：アキアミ；４：サクラエビ；５：ウチワエビ；６：イセエビ;７：オーストラリアンロブスター；８：バナメイエビ；９：ボタンエビ；１０：ホッコクアカエビ；１１：ホッカイエビ；１２：アカエビを示す。ＰＣＲ増幅の結果、１２種すべてにおいて５００−６００ｂｐの間にバンドが確認された。そのため、ＰＣＲ産物をそのままシーケンス反応に供すダイレクトシーケンス法を採用し配列の決定を試みた。その結果、アキアミ、サクラエビ、クルマエビ、ブラックタイガー、ウチワエビ、バナメイエビ、イセエビ及びオーストラリアンロブスターの１０種のエビ類に関しては配列の決定を行うことが可能であった。
【００４７】
しかし、ボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビおよびアカエビに関してはフォワード側は解析が可能な結果が得られていたものの、リバース側は解析が可能な結果を得られていなかったため、配列決定を行うことができなかった。これは、４種のエビ類の塩基配列において、１６ＳＢＲ−Ｈのプライマー配列が保存されていなかったためと考えられる。本実施例で用いた１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＢＲ−Ｈのプライマーセットは広く動物ＤＮＡを検知することを目的として設計されているため、標的遺伝子には動物界に広く分布し、高度に保存されている遺伝子を選定している。しかし、上記４種のエビ類においては、フォワードプライマーである１６ＳＡＲ−Ｌは保存されているものの、リバースプライマーである１６ＳＢＲ−Ｈの塩基配列が最低でも２ヵ所存在しており、ＰＣＲ増幅によって、見かけ上、一本と思われたバンドが複数個存在していたために、ダイレクトシーケンス法では解析できなかったと思われる。或いは、ラベリング反応条件が上記４種のエビ類では必ずしもベストと言えなかったことも原因の一つとして挙げられる。
【００４８】
そこで、これら４種のエビ類に関しては改めてプライマーを設計し直すこととした。新たにプライマーを設計するために、すでにＤＮＡデータベース（ＮＣＢＩ）上にミトコンドリアＤＮＡの全塩基配列が解析済みであったエビ類の塩基配列を比較し、保存性の高い配列を探し出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域より外側の位置にＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ(配列番号５)及びＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓ(配列番号６)を設計した。ＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ及びＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓの増幅領域及びプライマー配列を図４（ＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ／ＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓプライマーセットの位置）に示す。
【００４９】
新たに設計したプライマーＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ及びＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓを用いて１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＢＲ−Ｈと同様にＰＣＲ増幅させた。また、ＰＣＲ増幅させる際のアニーリング温度は５１℃とした。ＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ及びＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓのプライマーセットを用いてボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビ及びアカエビをＰＣＲ増幅させ、電気泳動に供した結果を図５に示す（図中、１：ボタンエビ；２：ホッコクアカエビ；３：ホッカイエビ；４：アカエビ、を示す）。その結果、ボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビおよびアカエビにおいて単一のバンドが確認された。その後、得られたＰＣＲ産物をダイレクトシーケンス法によってシーケンス反応に供した結果、塩基配列の決定を行った。
【００５０】
更に、このプライマーセットの実用性を検証するため、クルマエビ、ブラックタイガー、アキアミ、サクラエビ及びバナメイエビについても同様にそれぞれ３検体ずつＰＣＲ増幅させ、電気泳動に供した結果を図６に示す（図中、１〜３：クルマエビ１〜３；４〜６：ブラックタイガー１〜３；７〜９：アキアミ１〜３；１０〜１２サクラエビ１〜３；１３〜１５：バナメイエビ、を示す。
【００５１】
その結果、ボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビ及びアカエビは単一のバンドが確認され、目的のＤＮＡ断片を得ることができた。また、１〜３番のクルマエビ、４〜６番のブラックタイガー及び１０〜１２番のサクラエビについても全ての検体で単一のバンドを確認することができた。また、アキアミについては７番の１検体のみバンドが確認され、バナメイエビについては１３、１４番の２検体においてスメアなバンドが確認された。そのため、ＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ及びＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓのプライマーセットはバナメイエビのようにスメアなバンドが得られた例があったものの、数種のエビ類において単一のバンドが得られたことから、エビ類の１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域を増幅させるプライマーセットとして適していると考えられる。またこの配列は、カニ類やシャコ等にも存在するため、甲殻類全般を検出することが可能であると考えられる。
【００５２】
（４−２．１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較）
１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較図を図７に示す。図中、一段目から、クルマエビ、ブラックタイガー、アキアミ、サクラエビ、ウチワエビ、イセエビ、オーストラリアンロブスター、バナメイエビ、ボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビおよびアカエビの配列を表す。また、当該領域を増幅させるために用いた１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＡＲ−Ｌの配列は四角で囲み示した。図７より、当該領域の塩基数は、クルマエビが６１３ｂｐ、ブラックタイガーが６１２ｂｐ、アキアミが５６９ｂｐ、サクラエビが５６９ｂｐ、ウチワエビが５５８ｂｐ、イセエビが５６６ｂｐ、オーストラリアンロブスターが５６４ｂｐ、バナメイエビが５６５ｂｐ、ボタンエビが５５１ｂｐ、ホッコクアカエビが５５２ｂｐ、ホッカイエビが５５３ｂｐ及びアカエビが５５６ｂｐであった。また、１２種のエビ類の塩基配列を比較したところ、１２種のエビ類はクルマエビおよびブラックタイガーのグループとその他の１０種のエビ類の２つに大きく分けられることが分かった。そのため、１２種のエビ類間において保存性の高い配列を見つけ出すことは困難であったことから、各グループからそれぞれプライマーを設計することとした。
【００５３】
［II．エビ特異プライマーセットの設計と実用性の検証］
（１．エビ類特異プライマーセットの設計）
１２種のエビ類の塩基配列が大きく２つのグループに分けられたことから、エビ検出用プライマーとして、クルマエビとブラックタイガーを検出するためのＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１、その他１０種のエビ類のグループを検出するためのＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１及びＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１の異なる２つのプライマーセットを設計した。これらのプライマーの増幅領域を図７（１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較）において四角く囲み、配列を表４（エビ特異プライマーセットの配列）に示した。それぞれのプライマーセットによる増幅産物は、ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１が１９４ｂｐ、ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１及びＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１が２３７ｂｐとした。これは、ミトコンドリアＤＮＡが高温・高圧下で断片化する恐れがあることを踏まえて、様々な加工食品に対応させるために、２００ｂｐ程度の増幅バンドが得られるようにプライマーを設計したためである。
【００５４】
【表４】
【００５５】
（２．１２種のエビ類と魚類との塩基配列比較）
設計したプライマーセットＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１がエビ類のみに特異的であるかどうかを確認するため、他の魚介類の中からカツオの配列との比較を行った結果を図８（１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域におけるカツオとのエビ類の塩基配列比較）に示す。図８には順にカツオ、クルマエビ、ブラックタイガー、サクラエビ及びボタンエビの塩基配列を示した。その結果、ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１の配列とカツオの配列を比較すると、相同性は非常に低いことが確認された。また、同様にＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１についてもエビ類に欠損部分が見受けられる個所であったことから相同性は低いことが分かった。一方、ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１はカツオの配列との相同性が高いことが分かったが、５塩基の差があることから、このプライマーではカツオは検出されないと判断した。また、ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１については、９塩基の差があったことから同様に問題はないと考えられた。そこで、設計したプライマーを用いて実際に様々な食品でスクリーニングを行い、実用性の検証を行うこととした。
【実施例２】
【００５６】
［市販生鮮品および加工製品における実用性の検証］
（１．試料）
試料には本実施例で対象とした１２種のエビ類の他、他の魚介類として、タコ、ゴマサバ、サーモン、サンマ、ヤリイカ、メカジキ、アンコウ、サワラ、アユ、メバチマグロ、キングサーモン、ニジマス、マダイ、シロサバフグ、さば味噌煮（大西洋サバ）、シログチ冷凍すり身、マサバ（燻製）、アサヒガニ、エガニおよびシャンハイガニを用い、エビ類の加工品として、カップヌードル中のフリーズドライされたピンクエビを用いた。
【００５７】
（２．方法）
まず、それぞれのサンプルから、実施例１，「Ｉ、３−２」と同様の方法でＤＮＡ抽出を行った。その後、それらの鋳型ＤＮＡを設計したエビ特異プライマーセットによりＰＣＲ増幅させた。今回はプライマーが２セットであるため、各プライマーを等量ずつミックスさせるマルチプレックス法を用いることとした。マルチプレックスＰＣＲには、「Multiplex PCR Assay Kit(TaKaRa)」を用いた。すなわち、１検体あたりのＰＣＲ反応液は、０．２ｍＬ ＰＣＲチューブ中に精製した鋳型ＤＮＡを２．５μＬ、Muliplex ＰＣＲ Mix1を０．２５μＬ、Muliplex PCR Mix2を１２．５μＬ、各プライマーを０．５μＬ、合計で２５μＬになるように滅菌水を加えた。ＰＣＲは、９４℃で６０秒、その後９４℃で３０秒、５０℃で９０秒、７２℃で９０秒を３０サイクル行い、その後７２℃で１０分行い、最後に４℃で保存した。
【００５８】
ＰＣＲ反応後、各サンプル１０μＬをSYBR SafeTM入り２％アガロースゲル電気泳動に供した。通電は１００Ｖで３０分とし、増幅断片の検出はトランスイルミネーターで目的とするバンドを観察し、エビ類及びエビの加工品にのみ特異的であるかどうかの検証を行った。
また、各サンプルのＤＮＡ精製度を確認するため、動物ＤＮＡ検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅させた。動物ＤＮＡ検出用プライマーセットの配列および増幅バンド長を表５（動物ＤＮＡ検出用プライマーの配列）に示す。
【００５９】
【表５】
【００６０】
１検体あたりのＰＣＲ反応液は０．２ｍＬ ＰＣＲチューブ中に精製した５ｎｇ／μＬ鋳型ＤＮＡ２．５μＬ、１０×緩衝液（TaKaRa）２．５μＬ、２．５ｍＭ each dNTP mix ２．０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ Ｍｇ３．０μＬ、２５μＭ各プライマー０．２μＬ、xTaq(TaKaRa) ０．１２５μＬ、合計で２５μＬとなるように滅菌水を加えた。ＰＣＲは、９５℃で１０秒、その後９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル行い、その後７２℃で７分行い、最後に４℃で保存した。ＰＣＲ反応後、各サンプル１０μＬをSYBR SafeTM入り２％アガロースゲル電気泳動に供した。通電は１００Ｖで３０分とし、増幅断片の検出はトランスイルミネーターで目的とするバンドを観察した。
【００６１】
（３．結果）
ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のミックスプライマーセットを用いて市場で流通するエビ類の加工品及び他の魚介類を用いて実用性の検証を行った結果を表６（エビ特異プライマーセットの市販生鮮品及び加工製品における実用性の検証）に示し、電気泳動図を図９（ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のプライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−１）、図１０（ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のプライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−２）、及び、図１１（ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のプライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−３）に示す。
【００６２】
【表６】
【００６３】
その結果、エビ類及びエビの加工品のみ２００ｂｐ付近に単一のバンドを確認することができ、エビ以外の魚介類からは増幅が認められないかまたは異なるサイズの位置にバンドが確認された。すなわち、ゴマサバでは約３００ｂｐ付近に、サーモンでは約７００ｂｐ付近に、キングサーモンおよびニジマスでは約７００ｂｐ付近に、シロサバフグでは約１００ｂｐ付近に、サバ味噌煮およびシログチ冷凍すり身では約３００ｂｐ付近に増幅が認められたが、いずれもエビ類とは異なる位置での増幅であった。また、カニ類であるアサヒガニ、エガニ、シャンハイガニでは増幅が認められなかった。よって、これらの検証結果から、今回設計したプライマーセットはマルチプレックスＰＣＲ法を用いることで、エビ類を特異的に検出することが可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットは、市場に流通するエビ類をはじめとして、各種のエビ類全体に対する検出を可能とし、しかも、カニ類に対しては、反応しないことから、食物アレルギーの原因となるエビ類をカニ類と区別し、直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及びそのためのＰＣＲプライマーセットを提供する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食物アレルギーの原因となるエビ類を直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法などの遺伝子増幅法によるエビ類の検出方法及びそのための検出用プライマーセット、特に、飲食品製造原料として多用されるエビ類とカニ類を区別可能なＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及びそのための検出用プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本においてアレルギーを持つ人は非常に多いと言われている。アレルギーは抗原及び症状の違い等により様々な種類が存在するが、花粉症、喘息、アトピー性皮膚炎及びアレルギー性鼻炎はアレルギー症状の中でも特に症例数が多い疾患である。中でも食物アレルギーはその発症件数の多さや症状の重篤度から大きな社会問題となっている。食物アレルギーを引き起こす原因食品としては、小麦、卵、乳・乳製品、そば及び落花生の主要５品目の他に果物や肉類及び魚介類など様々な食品が挙げられる。その割合は高い方から、鶏卵、乳製品、小麦、甲殻類、果物類、ソバ、魚類、大豆、木の実類、肉類、野菜類および軟体類である。その中でもアレルギーを引き起こすとされる魚介類は、アワビ、イカ、エビ、カニ、サケ、サバが挙げられるが、特に甲殻類は鶏卵、乳製品、小麦に次いで発症件数が多い食品である。
【０００３】
我が国におけるアレルギー表示制度の動向は、平成１４年４月から食品衛生法によって加工食品中の特定原材料５品目のアレルギー表示が義務付けられ、特定原材料に準ずるものとしては２０品目が表示推奨の対象となった。特定原材料としては、卵、乳・乳製品、小麦、そば、落花生が、特定原材料に準ずるものとしては、エビ、カニ、アワビ、イクラ、オレンジ、キウイフルーツ、牛肉、クルミ、サケ、サバ、大豆、鶏肉、豚肉、マツタケ、モモ、ヤマイモ、リンゴ、ゼラチン、バナナが挙げられている。平成１６年７月に開かれた「第１８回食品の表示に関する共同会議」（厚生労働省；薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会食品表示調査会と農林水産省；農林物資規格調会小委員会の共催）ではアレルギー物質を含む食品に関する表示についての議論が行われ、実態調査により「エビ」についてアレルギー原因食品としての重要性が確認され、その後、甲殻類（エビ・カニ）における臨床的エビデンスの蓄積、アレルギー物質の検査方法開発などの技術的検討から平成２０年度６月から、エビ及びカニは表示推奨の対象から表示義務化の対象とされることとなった。
【０００４】
これまで、甲殻類の検出法としては、エビやカニの主要アレルゲンであるトロポミオシンをＥＬＩＳＡ法により検出する方法が知られている（J Allergy Clin Immunol. 100, 229-34 ,1997)。また、エビコラーゲン又はそのポリペプチド断片からなるエビアレルゲンに対する抗エビアレルゲン抗体を取得し、試料中のエビアレルゲンの混入を検出する方法も開示されている（特開２００８−２５５０５４号公報）。ＥＬＩＳＡ法は定量性に優れているが、患者の血清が必要な上、検出標的としているトロポミオシンが甲殻類の種間でも類似性が高く、エビとカニに共通して存在し、エビだけを特異的に検出することはできない。そのため、エビのみにアレルギーを持つ患者のニーズに対応することは困難である。
【０００５】
一方、近年ＤＮＡ解析技術の発展に伴って、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応；Polymerase Chain Reaction）など遺伝子増幅法に基づいたミトコンドリアＤＮＡ (ｍｔＤＮＡ)をターゲットとする検出技術が検討されている。ＰＣＲ法は、鋳型ＤＮＡ、耐熱性のＤＮＡ（Ｔａｑ ポリメラーゼなど）、目的ＤＮＡの両末端部分の配列をもつオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ合成反応のプライマー）及び基質ヌクレオチドを混合し、反応系に供すことで目的のＤＮＡ断片のみを選択的に増幅させる方法のことである。このＰＣＲ法を用いて、食品中のエビやカニ等の検出を行う方法が開示され、そのＰＣＲ増幅のためのプライマーは数多く開示されている。
【０００６】
例えば、ハウス食品(株)のホームページには「食品中に含まれるアレルギー物質の検査法開発」(2009.2.5)について、食品衛生法が定めるアレルギー物質のうち、エビ、カニ、キウイ、モモ、リンゴのＰＣＲ検出技術の開発について報告されている。また、日本食品衛生学会学術講演会講演要旨集(２００８)には、「ＰＣＲを用いた食品中のエビ及びカニの識別検出法」について掲載されている。更に、“J FOOD prot vol68 P1866(2005)”には、“Detection of crustacean DNA and species identification using a PCR-restriction fragment length polymorphism method”と題して、エビを０．１％含んでいても検出可能な、PCR−restriction fragmentについて報告されている。
【０００７】
また一方、特開２００６−２８０２８１号公報には、サバ、サケ、アワビ、イカや、カニ、エビの検出に好適なＰＣＲプライマーセットが開示されている。かかるＰＣＲプライマーセットにおいて、カニ、エビの検出に好適なＰＣＲプライマーセットは、何れも、カニ、エビに共通するＰＣＲプライマーセットであって、エビ又はカニを区別して検出することはできない。特開２００８−１２８号公報には、カニ及びその他の甲殻類とを区別してエビを高感度で検出するためのエビ検出用プライマーセットが開示されている。
【０００８】
このプライマーセットは、エビの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列において、エビに共通する塩基と、エビに共通し、かつカニ及びその他の甲殻類と区別できる塩基とを含む領域の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を有する核酸分子にアニーリングし得るオリゴヌクレオチドから構成される、エビ検出用プライマーセットからなる。このプライマーセットとして、エビとカニの判別用のプライマーと、エビ・カニとその他の甲殻類を判別するプライマーの３種のプライマーを用いることにより、エビ類を特定する方法が開示されている。すなわち、具体的には、エビ２３種、カニ、シャコ、オキアミ、アミの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を基に、試料が加工品であっても検出できるように、１００〜２００ｂｐのプライマーを３種設計されているが、エビとカニを直接区別できるプライマーは開示されておらず、設計されたエビとカニを区別するプライマーは、一部のカニでは区別ができないので、該プライマーと一緒に、エビ、カニを区別できるプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチドを用いて、シャコ、オキアミ、アミなどの他の甲殻類を除く方法が開示されている。また、えびの検出についても、すべてのえび類を検出できるプライマーセットにはなっていない。
【０００９】
一方、特開２００９−２０７４８６号公報には、カニをエビ及びアミ、オキアミ等のその他の甲殻類と区別するカニ検出用プライマーセットが開示されている。該開示のプライマーセットは、カニの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列から設計したプライマーとなり得るオリゴヌクレオチドの３’末端から２番目の塩基に標的配列に対してミスマッチ塩基を導入したオリゴヌクレオチドから構成されるカニ検出用プライマーセットからなる。かかる開示のものは、カニをエビと区別して検出するものであるが、カニの検出方法であるので、エビ類を直接検出することはできない。
【００１０】
上記のように、エビ類、カニ類を、プライマーを用いたＰＣＲ法により検出する方法が開示されているが、今までに、エビ類全体を区別でき、かつ、カニ類を区別して直接的にエビ類を検出し、他の甲殻類とも判別できるＰＣＲプライマーセットは開示されていない。エビは、食物アレルギー表示義務対象であり、エビに対してアレルギー反応を起こすエビアレルギー患者に対する適切な対応のためには、飲食物等において原料や素材として用いられるエビ類を特異的かつ確実に検出できるエビ類の検出方法の開発が望まれるところである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００６−２８０２８１号公報
【特許文献２】特開２００８−１２８号公報
【特許文献３】特開２００８−２５５０５４号公報
【特許文献４】特開２００９−２０７４８６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】J Allergy Clin Immunol. 100, 229-34 ,1997
【非特許文献２】ハウス食品（株）のホームページ「食品中に含まれるアレルギー物質の検査法開発」
【非特許文献３】日本食品衛生学会学術講演会講演要旨集(２００８)
【非特許文献４】J FOOD prot vol68 P1866(2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、食物アレルギーの原因となるエビ類を直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法による検出方法及びそのためのプライマーセットを提供すること、特に、飲食品製造原料として多用されるエビ類とカニ類を峻別可能なＰＣＲ法による検出方法及びそのためのプライマーセットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、食物アレルギーの原因となるエビ類をカニ類と区別し、直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法による検出方法及びそのためのプライマーセットの開発について鋭意検討する中で、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）内においても保存性の高い配列をもつ領域の一つである１６Ｓ ｒＲＮＡをターゲットとし、該領域が特異プライマー設計によく用いられていることや多くの生物にわたって保存された箇所が存在することを考慮して、エビのミトコンドリアＤＮＡ１６Ｓ ｒＲＮＡ領域をエビ類１２種類につき解析した結果、クルマエビ科［クルマエビ、ブラックタイガー］と、タラバエビ科［アキアミ（アミエビ:オキエビ）、サクラエビ、アカエビ、ホッコクアカエビ（アマエビ）、ホッカイエビ、イセエビ、オーストラリアンロブスター、ウチワエビ、ボタンエビ、バナメイエビ］で保存されている特異配列を見い出し、カニ類には反応しない、クルマエビ科とタラバエビ科を区別できるＰＣＲプライマーを設計することに成功し、該ＰＣＲプライマーセットによる、カニ類と区別し、エビ類を全体を特異的かつ効果的に検出できる本発明のエビ類の検出方法の発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、EBI-SP1-F1：5’-TTT AAG TGA AAA GGC TTA AAT-3’（配列表の配列番号１）、EBI-SP2-F1：5’-TTA GAA CAT AAG ACG AGA AG-3’（配列番号２）、EBI-SP2-R1：5’-GTG GCT CTT GTT TTT GAA AGA-3’（配列番号３）、及びEBI-SP1-R1：5’-CTG TTA TCC CTA AAG TAA CTT-3’（配列番号４）に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成される、ＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット、該プライマーセットを用いたＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及び、プライマーセットを具備したＰＣＲ法によるエビ類検出用キットからなる。本発明において、ＰＣＲ法によるエビ類の検出には、マルチプレックスＰＣＲにより行うことができる。
【００１６】
すなわち、具体的には本発明は、（１）配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成される、ＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットや、（２）プライマーセットが、カニ類と区別してエビ類を判別するプライマーセットであることを特徴とする上記（１）記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットや、（３）ＰＣＲ法が、マルチプレックスＰＣＲであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットや、（４）試料より抽出したＤＮＡを鋳型として、上記（１）記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の有無を指標として判別することを特徴とするＰＣＲ法によるエビ類の検出方法からなる。
【００１７】
また、本発明は、（５）ＰＣＲ増幅を、マルチプレックスＰＣＲ法を用いて行うことを特徴とする上記（４）記載のＰＣＲ法によるエビ類の検出方法や、（６）エビ類の検出が、飲食品中に含まれるエビ類由来の飲食品素材の検出であることを特徴とする上記（４）又は（５）記載のＰＣＲ法によるエビ類の検出方法や、（７）配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを具備することを特徴とするＰＣＲ法によるエビ類検出用キットや、（８）ＰＣＲ法によるエビ類検出用キットが、マルチプレックスＰＣＲ法による検出用キットであることを特徴とする上記（７）記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用キットからなる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットは、市場に流通するエビ類をはじめとして、各種のエビ類全体に対する検出を可能とし、しかも、カニ類に対しては、反応しないことから、食物アレルギーの原因となるエビ類をカニ類と区別し、直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及びそのためのＰＣＲプライマーセットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のエビ類の検出方法において対象となる、市場に流通しているエビ類の写真である。
【図２】本発明の実施例におけるＤＮＡの精製度の確認と定量の実験において、１６ＳＡＲ−Ｌ／１６ＳＢＲ−Ｈプライマーセットにおける１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅領域について示す図である。
【図３】本発明の実施例において、１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＢＲ−Ｈのプライマーセットを用いて１２種のエビ類をＰＣＲ増幅させ、電気泳動に供した結果を示した図である。
【図４】本発明の実施例において４種のエビ類（ボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビ、アカエビ）に関して設計し直した、ＥＢＩ−１６Ｓ−Ｆ１及びＥＢＩ−１６Ｓ−Ｒ１の増幅領域及びプライマー配列を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、ＥＢＩ−１６Ｓ−Ｆ１及びＥＢＩ−１６Ｓ−Ｒ１のプライマーセットを用いてボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビ及びアカエビをＰＣＲ増幅させ、電気泳動に供した結果を示す写真である。
【図６】本発明の実施例において、ＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ／ＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓプライマーペアーを用いたクルマエビ、ブラックタイガー、アキアミ、サクラエビ、及びバナメイエビのＰＣＲ増幅結果を示す写真である。
【図７−１】本発明の実施例において、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較図を示す図である。
【図７−２】本発明の実施例において、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較図を示す図の続きである。
【図７−３】本発明の実施例において、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較図を示す図の続きである。
【図７−４】本発明の実施例において、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較図を示す図の続きである。
【図８】本発明の実施例における１２種のエビ類と魚類との塩基配列比較試験において、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域におけるカツオとのエビ類の塩基配列比較について示す図である。
【図９】本発明の実施例における実用性の検証の試験において、ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のミックスプライマーセットを用いて市場で流通するエビ類の加工品及び他の魚介類を用いて実用性の検証を行った結果の電気泳動図（プライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−１）を示す図である。
【図１０】本発明の実施例における実用性の検証の試験において、ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のミックスプライマーセットを用いて市場で流通するエビ類の加工品及び他の魚介類を用いて実用性の検証を行った結果の電気泳動図（プライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−２）を示す図である。
【図１１】本発明の実施例における実用性の検証の試験において、ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のミックスプライマーセットを用いて市場で流通するエビ類の加工品及び他の魚介類を用いて実用性の検証を行った結果の電気泳動図（プライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−３）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、食物アレルギーの原因となるエビ類を直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット、該プライマーセットを用いたＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及び、プライマーセットを具備したＰＣＲ法によるエビ類検出用キットからなる。該ＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットは、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成される。
【００２１】
本発明で、検出の対象となるエビ類としては、現在、市場に流通しているエビ類１２種類：クルマエビ科［クルマエビ、ブラックタイガー］と、タラバエビ科［アキアミ（アミエビ:オキエビ）、サクラエビ、アカエビ、ホッコクアカエビ（アマエビ）、ホッカイエビ、イセエビ、オーストラリアンロブスター、ウチワエビ、ボタンエビ、バナメイエビ］（図１）を挙げることができるが（表１：１２種のエビ類の名称、産地および製品名）、その他のエビ類も包含される。なお、カブトエビ、ホウネンエビ、カイエビ、ヨコエビ、シャコ、オキアミ、カブトガニは、名前に「エビ」とついていたり、姿形がエビと類似しているが、エビ類には含まれない。これらはカニ類とも異なるため、その他甲殻類とされている。本発明のエビ類の検出方法では、従来の方法（特開２００８−１２８号公報）では検出されないアキエビ（アミエビ）も検出することができる。このアキエビが飲食品中に混入されると、エビアレルギーの原因となることから、その検出が要望されている所である。また、本発明のＰＣＲエビ類検出用プライマーセットは、エビ等の甲殻類は陽性で、カニは陰性になることから、カニを区別してエビ類を特異的に検出することができるＰＣＲプライマーセットとして、特に、メリットがある。
【００２２】
【表１】
【００２３】
本発明のエビ類検出に用いられるＰＣＲプライマーセットとしては、本発明において
エビのミトコンドリアＤＮＡ１６Ｓ ｒＲＮＡ領域から設計された次の４つのオリゴヌクレオチドから構成されるＰＣＲプライマーセットが用いられる：EBI-SP1-F1：5’-TTT AAG TGA AAA GGC TTA AAT-3’（配列番号１）、EBI-SP2-F1：5’-TTA GAA CAT AAG ACG AGA AG-3’（配列番号２）、EBI-SP2-R1：5’-GTG GCT CTT GTT TTT GAA AGA-3’（配列番号３）、及びEBI-SP1-R1：5’-CTG TTA TCC CTA AAG TAA CTT-3’（配列番号４）。該ＰＣＲプライマーセットにおけるプライマーは、プライマーとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるＤＮＡ自動合成装置を利用して合成することが可能である。
【００２４】
本発明におけるエビ類の検出は、上記のプライマーセットを用い、ＰＣＲ法により、試料より抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅産物の有無を検出することにより行なうことができる。試料としては、エビを含む可能性のある飲食品やその原料、或いは食品素材が対象となる。本発明の方法により得られた検出結果は、食品のアレルギー表示に利用できるほか、飲食品の製造原料、素材の確認や、製造ラインにおけるコンタミネーションの有無の確認に利用できる。
【００２５】
試料からのＤＮＡの抽出は、核酸抽出法として当業者に公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、フェノール／クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法、などにより行うことができる。試薬メーカーより販売されている各種ＤＮＡ抽出キットを用いても良い。試料の種類によっては、メンブランフィルターによる濾過やホモジナイズ他の精製方法を用いることができる。
【００２６】
本発明のＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲを行うには、プライマーセットとして該本発明のプライマーセットを用いる以外は特に制限はなく、他の試薬、条件（温度条件、サイクルの回数等）は、当業者であれば適切に選択及び設定することができる。該ＰＣＲとしては、マルチプレックスＰＣＲ（Ｍ−ＰＣＲ）を用いることができる。マルチプレックスＰＣＲは、同時に複数個（十数個）の遺伝子を分析することが可能であり、本発明のＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲを行うのに、特に有利に適用することができる。マルチプレックスＰＣＲのキット自体は、市販のものを利用することができ（マキシムバイオ社Ｍ−ＰＣＲ）、その使用条件等は当業者が適宜定めることができる。
【００２７】
本発明のＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行うと、試料にエビ類が含まれる場合は、該ＰＣＲプライマーで増幅されたエビに特異的な増幅産物が得られる。また、本発明のＰＣＲプライマーセットは、カニ類は陰性になることから、カニ等を区別してエビ類を特異的に検出することができる。本発明のＰＣＲプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅を行なうことによって、エビに特異的な増幅産物が得られることから、従来法のように、ＰＣＲ増幅を行って得られた増幅産物が「エビ」か「カニ」かどうかを確認するために制限酵素処理や、シークエンス解析を行って、その確認を行なう必要はない。
【００２８】
ＰＣＲにより得られる増幅産物中に、目的の増幅断片が含まれるかどうかは、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡハイブリダイゼーション等の公知の方法を用いて確認することができる。目的の増幅断片のサイズは、検出しようとするエビの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域において両プライマーに挟まれる領域の塩基数となる。本発明のＰＣＲプライマーセットEBI-SP1-F1（配列番号１）／EBI-SP1-R1（配列番号４）及びEBI-SP2-F1（配列番号２）
／EBI-SP2-R1（配列番号３）を用いてＰＣＲを行なった場合には、エビ類或いはエビの加
工品の場合は、増幅断片のサイズは約２００ｂｐの増幅断片を得る。
【００２９】
以下に実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
［Ｉ．ＰＣＲプライマーセットの構築］
（１．１２種類のエビ類のＤＮＡデータベース（ＮＣＢＩ）における塩基配列登録状況の検索）
本発明のＰＣＲプライマーセットの構築にあたり、特に市場に流通するエビ類を１２種選定した。１２種のエビ類の名称を表２［ＤＮＡデータベース（ＮＣＢＩ）における１２種のエビ類の塩基配列登録状況］に示す。 選定した１２種のエビ類のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔ ＤＮＡ）において保存性の高い配列を探し出すために、どの領域をターゲットとするのかを決定する必要があり、そこで、ＤＮＡデータベース（ＮＣＢＩ）において１２種のエビ類のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列登録状況を調べた。表２に示したとおり、アキアミ、サクラエビ、ウチワエビ、ボタンエビは未だ塩基配列が登録されていないことが分かり、解析する必要があった。一方、イセエビは全塩基配列が登録済みであり、他のエビ類は１６Ｓ ｒＲＮＡ及びＣ０Ｉ領域が登録されているものが多いことが分かった。しかしながら、これらの登録されている配列の多くは部分配列であり、それらの箇所も一致していないため、１２種のエビ類間において保存性の高い配列を探し出すためには、改めてターゲット領域を定める必要性があった。
【００３１】
【表２】
【００３２】
（２．保存性の高い配列探索のためのターゲット領域の決定）
エビ特異プライマーを設計するためには、１２種のエビ類間において保存性の高い配列を探し出す必要がある。そこで、表２の結果を踏まえて、本研究ではミトコンドリアＤＮＡ内においても保存性の高い配列をもつ領域の一つである１６Ｓ ｒＲＮＡをターゲットとした。これは、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域が特異プライマー設計によく用いられていることや多くの生物にわたって保存された箇所が存在するため、それらの配列を用いてユニバーサルプライマーが設計されているためである。
【００３３】
（３．試料および実験方法）
（３−１．試料）
試料には、特に市場に流通する１２種のエビ類を用いた。試料に用いた１２種のエビ類の名称、学名及び産地を前記表１に示す。
【００３４】
（３−２．DNeasy(R) Blood & Tissue Kitを用いた全ＤＮＡの抽出）
全ＤＮＡ抽出にはDNeasy(R) Blood & Tissue Kit (QIAGEN)を用い、操作は付属の説明書に従った。なおバッファーにはすべてキットに含まれているものを使用した。抽出は、各エビにつきそれぞれ５検体ずつ行った。サクラエビの場合は１個体が小さく１匹からＤＮＡを抽出することは困難であったため、無作為に１０匹を選び出し、それらを乳鉢と乳棒を用いてすりつぶしたものを1検体とした。その他のエビは１個体につき１検体とした。
【００３５】
まず、各エビからそれぞれ２５ｍｇを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに採取し、Buffer ATL １８０μＬとproteinase K solution (QIAGEN) ４０μＬを加えボルテックスミキサーでボルテックスし５５℃で３時間インキュベートした。その後室温下で２０，０００×ｇで１５分遠心分離を行い、上清を別の１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。上清を移したエッペンドルフチューブにRNase A(１００ｍｇ／ｍＬ)４μＬを加えボルテックス後室温に２分間放置した。その後、Buffer AL２００μＬを加えボルテックスした後、７０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後ボルテックスを行い、１００％エタノールを２００μＬ加え再度ボルテックスを行い、溶解液を得た。次に、２ｍＬ collecting tube に設置したDNeasy Mini Spin columnに溶解液全量を移し替え、室温、１３，０００×ｇで１分遠心分離を行い、溶出液を捨てた。
【００３６】
新たに用意した２ｍＬcollecting tubeにDNeasy Mini Spin columnを移し、Buffer AW1を５００μＬ加え、室温、１３、０００×ｇで１分間遠心分離を行い溶出液を捨てた。再び新たに用意した２ｍＬ collecting tubeにDNeasy Mini Spin columnを移し、Buffer ＡＷ２を５００μL加え、室温、１８、０００×ｇで３分間遠心分離を行い、溶出液を捨てた。その後新たに用意した１．５ｍＬエッペンドルフチューブにDNeasy Mini Spin columnを移し替え、AE Buffer ２００μＬを加え、室温で１分間放置した。放置後室温、２０，０００×ｇで１分遠心分離を行い、ＤＮＡを抽出した。これをＤＮＡ抽出液とし、ＰＣＲ増幅の鋳型ＤＮＡとして用いるまで−２０℃で冷凍保存した。
【００３７】
（３−３．ＤＮＡの精製度の確認と定量）
抽出精製したＤＮＡ試料原液を一定量取り、２００−３２０ｎｍの範囲で紫外線吸収スペクトルを測定した。この際、２３０、２６０及び２８０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．２３０、２６０及び２８０）を記録した。次いで２６０ｎｍの吸光度の値１を５０ｎｇ／μＬとしてＤＮＡ濃度を算出した。また、Ｏ．Ｄ．２６０／２８０を計算し、この比が１．２−２．５であることを確認した。
【００３８】
（３−４．ＰＣＲ増幅）
エビ類ミトコンドリアＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ 領域のＰＣＲ増幅には、ユニバーサルプライマーである１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＢＲ−Ｈのプライマーセットを用いた。このプライマーによる１６Ｓ ｒＲＮＡ内の増幅領域およびプライマー配列を図２（１６ＳＡＲ−Ｌ／１６ＳＢＲ−Ｈプライマーセットにおける１６Ｓ ｒＲＮＡ 増幅）及び表３（１６ＳＡＲ−Ｌ／１６ＳＢＲ−Ｈプライマーセットの配列）に示した。
【００３９】
【表３】
【００４０】
１検体あたりのＰＣＲ反応液は０．２ｍＬＰＣＲチューブ中に精製した５ｎｇ／μＬ鋳型ＤＮＡ２．５μＬ、１０×緩衝液（TaKaRa）２．５μＬ、２．５ｍＭ each ｄＮＴＰ mix２．０μＬ、２０μＭ各プライマー０．７５μＬ、ExTaq ＤＮＡ ポリメラーゼ（TaKaRa）０．２μＬ、及び滅菌水１６．３μＬを加え、全体で２５μＬとなるようにした。ＰＣＲの温度条件は、９８℃で１０秒、５３℃で３０秒、７２℃で６０秒のサイクルを３０回行った。ＰＣＲ終了後、得られた反応液１０μＬをSYBR SafeTM（１０μＬ／１００ｍＬ）入り１．５％アガロースゲル電気泳動に供した。通電は１００Ｖで３０分とし、増幅断片の検出はトランスイルミネーターで目的とするバンドを観察した。
【００４１】
なお、ＰＣＲ反応では、鋳型ＤＮＡがごく僅かでも存在していれば目的塩基配列領域が増幅され得る。したがって、実際の操作ならびに日ごろの実験環境の保全にあたり、ＤＮＡ（特にＰＣＲ増幅産物）の混入に充分注意を払う必要がある。また、ＤＮＡは人間の皮膚表面から分泌されているＤＮＡ分解酵素により分解されるため、本酵素の混入を防止させなければならない。これらの点を考慮し、意図せざるＤＮＡの混入防止するため、使用するチューブ、チップに関しては、滅菌済みフィルター付きチップを使い捨てで使用することとした。
【００４２】
（３−５．Exo-SAP ＩＴを用いたＰＣＲ産物の精製）
ＰＣＲ増幅産物の塩基配列決定においては、今回得られたＰＣＲ増幅の精製、プラスミド化は行わず、得られたＰＣＲ産物をそのままシークエンス反応に供すダイレクトシーケンス法を採用した。しかしながら、ＰＣＲ反応液中にはＰＣＲ反応の際、余剰の未反応プライマー及びｄＮＴＰが存在する。これらの除去を行わないとシーケンス反応におけるコンタミネーションの原因になってしまう。そこで、ＰＣＲ反応液中の過剰なプライマー及びｄＮＴＰを除去することを目的として、ＰＣＲ反応液のExo-SAP ＩＴ (Amersham Biosciences) 処理を行った。ＰＣＲ反応液に対して５：２２となるようにExo-SAP ＩＴを添し、斎藤および服部の方法（「タンパク質核酸酵素」41,522-530,1996）に従い３７℃で６０分間インキュベートした。この操作によって、エキソヌクレアーゼ（ExoＩ）による過剰なプライマーの分解及びシュリンプアルカリフォスファターゼ（ＳＡＰ）による余分なｄＮＴＰの脱リン化を行った。その反応後８５℃で１５分間加熱することにより、酵素を失活させた。反応後は、ラベリング反応に使用するまで４℃で冷蔵保存した。
【００４３】
（３−６．シーケンス反応）
Exo-SAP ＩＴ処理後のＰＣＲ反応液をラベリング反応に供した。ラベリング反応にはBigDye TerminatorTM v1.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems)を用い、ＤＮＡシーケンサーとして１キャピラリーのABI PRISM(R)310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)及び１６キャピラリーのABI PRISM(R)3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を使い塩基配列の決定を行った。
【００４４】
シーケンス反応は０．２ｍＬ ＰＣＲチューブ中でExo-SAP ＩＴ処理を行ったＰＣＲ反応液を３．５μＬ、２０μＭプライマーを１．０μＬ、上記のキットに含まれるBigDye TerminatorTM v1.1 Ready reaction mixを１．０μＬ加え、全量が１０μＬになるように滅菌水を加えた。その後サーマルサイクラーによりインキュベートしシーケンス反応を行った。温度条件は、９６℃で１分間加熱した後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分のサイクルを１サイクルとし、２５サイクル行った。次にシーケンス反応後のＰＣＲ産物１０μＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中に移し、１２ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０）２．５μＬ、９９．５％エタノール３０μＬを加え室温に１５分間放置した後、室温若しくは４℃、２０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を除去した。
【００４５】
続いて、７０％エタノールを３０μＬ加え室温若しくは４℃、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、再び上清を除去し、得られた沈殿を真空中で乾燥させてエタノール沈殿処理を完了した。乾燥後、Hi-Di Formamide (Applied Biosystems)１５μＬを加え溶解させ、ボルテックス後９５℃で３分間熱変性を行い、最後に１分間氷冷しこれをシーケンスサンプルとした。このサンプルをABI PRISM(R)310 Genetic Analyzer又はABI PRISM(R)3100 Genetic Analyzerに供し塩基配列を決定した。データの解析には、解析ソフトSeqEd Version 1.0.3 (Perkin Elmer社)を用いた。
【００４６】
（４．結果）
（４−１．１２種のエビ類のＰＣＲ増幅）
１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＢＲ−Ｈのプライマーセットを用いて１２種のエビ類をＰＣＲ増幅させ、電気泳動に供した結果を図３に示した（写真中、１：クルマエビ；２：ブラックタイガー；３：アキアミ；４：サクラエビ；５：ウチワエビ；６：イセエビ;７：オーストラリアンロブスター；８：バナメイエビ；９：ボタンエビ；１０：ホッコクアカエビ；１１：ホッカイエビ；１２：アカエビを示す。ＰＣＲ増幅の結果、１２種すべてにおいて５００−６００ｂｐの間にバンドが確認された。そのため、ＰＣＲ産物をそのままシーケンス反応に供すダイレクトシーケンス法を採用し配列の決定を試みた。その結果、アキアミ、サクラエビ、クルマエビ、ブラックタイガー、ウチワエビ、バナメイエビ、イセエビ及びオーストラリアンロブスターの１０種のエビ類に関しては配列の決定を行うことが可能であった。
【００４７】
しかし、ボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビおよびアカエビに関してはフォワード側は解析が可能な結果が得られていたものの、リバース側は解析が可能な結果を得られていなかったため、配列決定を行うことができなかった。これは、４種のエビ類の塩基配列において、１６ＳＢＲ−Ｈのプライマー配列が保存されていなかったためと考えられる。本実施例で用いた１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＢＲ−Ｈのプライマーセットは広く動物ＤＮＡを検知することを目的として設計されているため、標的遺伝子には動物界に広く分布し、高度に保存されている遺伝子を選定している。しかし、上記４種のエビ類においては、フォワードプライマーである１６ＳＡＲ−Ｌは保存されているものの、リバースプライマーである１６ＳＢＲ−Ｈの塩基配列が最低でも２ヵ所存在しており、ＰＣＲ増幅によって、見かけ上、一本と思われたバンドが複数個存在していたために、ダイレクトシーケンス法では解析できなかったと思われる。或いは、ラベリング反応条件が上記４種のエビ類では必ずしもベストと言えなかったことも原因の一つとして挙げられる。
【００４８】
そこで、これら４種のエビ類に関しては改めてプライマーを設計し直すこととした。新たにプライマーを設計するために、すでにＤＮＡデータベース（ＮＣＢＩ）上にミトコンドリアＤＮＡの全塩基配列が解析済みであったエビ類の塩基配列を比較し、保存性の高い配列を探し出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域より外側の位置にＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ(配列番号５)及びＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓ(配列番号６)を設計した。ＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ及びＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓの増幅領域及びプライマー配列を図４（ＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ／ＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓプライマーセットの位置）に示す。
【００４９】
新たに設計したプライマーＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ及びＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓを用いて１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＢＲ−Ｈと同様にＰＣＲ増幅させた。また、ＰＣＲ増幅させる際のアニーリング温度は５１℃とした。ＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ及びＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓのプライマーセットを用いてボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビ及びアカエビをＰＣＲ増幅させ、電気泳動に供した結果を図５に示す（図中、１：ボタンエビ；２：ホッコクアカエビ；３：ホッカイエビ；４：アカエビ、を示す）。その結果、ボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビおよびアカエビにおいて単一のバンドが確認された。その後、得られたＰＣＲ産物をダイレクトシーケンス法によってシーケンス反応に供した結果、塩基配列の決定を行った。
【００５０】
更に、このプライマーセットの実用性を検証するため、クルマエビ、ブラックタイガー、アキアミ、サクラエビ及びバナメイエビについても同様にそれぞれ３検体ずつＰＣＲ増幅させ、電気泳動に供した結果を図６に示す（図中、１〜３：クルマエビ１〜３；４〜６：ブラックタイガー１〜３；７〜９：アキアミ１〜３；１０〜１２サクラエビ１〜３；１３〜１５：バナメイエビ、を示す。
【００５１】
その結果、ボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビ及びアカエビは単一のバンドが確認され、目的のＤＮＡ断片を得ることができた。また、１〜３番のクルマエビ、４〜６番のブラックタイガー及び１０〜１２番のサクラエビについても全ての検体で単一のバンドを確認することができた。また、アキアミについては７番の１検体のみバンドが確認され、バナメイエビについては１３、１４番の２検体においてスメアなバンドが確認された。そのため、ＥＢＩ−Ｆ１−１６Ｓ及びＥＢＩ−Ｒ１−１６Ｓのプライマーセットはバナメイエビのようにスメアなバンドが得られた例があったものの、数種のエビ類において単一のバンドが得られたことから、エビ類の１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域を増幅させるプライマーセットとして適していると考えられる。またこの配列は、カニ類やシャコ等にも存在するため、甲殻類全般を検出することが可能であると考えられる。
【００５２】
（４−２．１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較）
１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較図を図７に示す。図中、一段目から、クルマエビ、ブラックタイガー、アキアミ、サクラエビ、ウチワエビ、イセエビ、オーストラリアンロブスター、バナメイエビ、ボタンエビ、ホッコクアカエビ、ホッカイエビおよびアカエビの配列を表す。また、当該領域を増幅させるために用いた１６ＳＡＲ−Ｌ及び１６ＳＡＲ−Ｌの配列は四角で囲み示した。図７より、当該領域の塩基数は、クルマエビが６１３ｂｐ、ブラックタイガーが６１２ｂｐ、アキアミが５６９ｂｐ、サクラエビが５６９ｂｐ、ウチワエビが５５８ｂｐ、イセエビが５６６ｂｐ、オーストラリアンロブスターが５６４ｂｐ、バナメイエビが５６５ｂｐ、ボタンエビが５５１ｂｐ、ホッコクアカエビが５５２ｂｐ、ホッカイエビが５５３ｂｐ及びアカエビが５５６ｂｐであった。また、１２種のエビ類の塩基配列を比較したところ、１２種のエビ類はクルマエビおよびブラックタイガーのグループとその他の１０種のエビ類の２つに大きく分けられることが分かった。そのため、１２種のエビ類間において保存性の高い配列を見つけ出すことは困難であったことから、各グループからそれぞれプライマーを設計することとした。
【００５３】
［II．エビ特異プライマーセットの設計と実用性の検証］
（１．エビ類特異プライマーセットの設計）
１２種のエビ類の塩基配列が大きく２つのグループに分けられたことから、エビ検出用プライマーとして、クルマエビとブラックタイガーを検出するためのＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１、その他１０種のエビ類のグループを検出するためのＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１及びＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１の異なる２つのプライマーセットを設計した。これらのプライマーの増幅領域を図７（１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域における１２種のエビ類の塩基配列比較）において四角く囲み、配列を表４（エビ特異プライマーセットの配列）に示した。それぞれのプライマーセットによる増幅産物は、ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１が１９４ｂｐ、ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１及びＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１が２３７ｂｐとした。これは、ミトコンドリアＤＮＡが高温・高圧下で断片化する恐れがあることを踏まえて、様々な加工食品に対応させるために、２００ｂｐ程度の増幅バンドが得られるようにプライマーを設計したためである。
【００５４】
【表４】
【００５５】
（２．１２種のエビ類と魚類との塩基配列比較）
設計したプライマーセットＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１がエビ類のみに特異的であるかどうかを確認するため、他の魚介類の中からカツオの配列との比較を行った結果を図８（１６Ｓ ｒＲＮＡ部分領域におけるカツオとのエビ類の塩基配列比較）に示す。図８には順にカツオ、クルマエビ、ブラックタイガー、サクラエビ及びボタンエビの塩基配列を示した。その結果、ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１の配列とカツオの配列を比較すると、相同性は非常に低いことが確認された。また、同様にＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１についてもエビ類に欠損部分が見受けられる個所であったことから相同性は低いことが分かった。一方、ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１はカツオの配列との相同性が高いことが分かったが、５塩基の差があることから、このプライマーではカツオは検出されないと判断した。また、ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１については、９塩基の差があったことから同様に問題はないと考えられた。そこで、設計したプライマーを用いて実際に様々な食品でスクリーニングを行い、実用性の検証を行うこととした。
【実施例２】
【００５６】
［市販生鮮品および加工製品における実用性の検証］
（１．試料）
試料には本実施例で対象とした１２種のエビ類の他、他の魚介類として、タコ、ゴマサバ、サーモン、サンマ、ヤリイカ、メカジキ、アンコウ、サワラ、アユ、メバチマグロ、キングサーモン、ニジマス、マダイ、シロサバフグ、さば味噌煮（大西洋サバ）、シログチ冷凍すり身、マサバ（燻製）、アサヒガニ、エガニおよびシャンハイガニを用い、エビ類の加工品として、カップヌードル中のフリーズドライされたピンクエビを用いた。
【００５７】
（２．方法）
まず、それぞれのサンプルから、実施例１，「Ｉ、３−２」と同様の方法でＤＮＡ抽出を行った。その後、それらの鋳型ＤＮＡを設計したエビ特異プライマーセットによりＰＣＲ増幅させた。今回はプライマーが２セットであるため、各プライマーを等量ずつミックスさせるマルチプレックス法を用いることとした。マルチプレックスＰＣＲには、「Multiplex PCR Assay Kit(TaKaRa)」を用いた。すなわち、１検体あたりのＰＣＲ反応液は、０．２ｍＬ ＰＣＲチューブ中に精製した鋳型ＤＮＡを２．５μＬ、Muliplex ＰＣＲ Mix1を０．２５μＬ、Muliplex PCR Mix2を１２．５μＬ、各プライマーを０．５μＬ、合計で２５μＬになるように滅菌水を加えた。ＰＣＲは、９４℃で６０秒、その後９４℃で３０秒、５０℃で９０秒、７２℃で９０秒を３０サイクル行い、その後７２℃で１０分行い、最後に４℃で保存した。
【００５８】
ＰＣＲ反応後、各サンプル１０μＬをSYBR SafeTM入り２％アガロースゲル電気泳動に供した。通電は１００Ｖで３０分とし、増幅断片の検出はトランスイルミネーターで目的とするバンドを観察し、エビ類及びエビの加工品にのみ特異的であるかどうかの検証を行った。
また、各サンプルのＤＮＡ精製度を確認するため、動物ＤＮＡ検出用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅させた。動物ＤＮＡ検出用プライマーセットの配列および増幅バンド長を表５（動物ＤＮＡ検出用プライマーの配列）に示す。
【００５９】
【表５】
【００６０】
１検体あたりのＰＣＲ反応液は０．２ｍＬ ＰＣＲチューブ中に精製した５ｎｇ／μＬ鋳型ＤＮＡ２．５μＬ、１０×緩衝液（TaKaRa）２．５μＬ、２．５ｍＭ each dNTP mix ２．０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ Ｍｇ３．０μＬ、２５μＭ各プライマー０．２μＬ、xTaq(TaKaRa) ０．１２５μＬ、合計で２５μＬとなるように滅菌水を加えた。ＰＣＲは、９５℃で１０秒、その後９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル行い、その後７２℃で７分行い、最後に４℃で保存した。ＰＣＲ反応後、各サンプル１０μＬをSYBR SafeTM入り２％アガロースゲル電気泳動に供した。通電は１００Ｖで３０分とし、増幅断片の検出はトランスイルミネーターで目的とするバンドを観察した。
【００６１】
（３．結果）
ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１及びＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のミックスプライマーセットを用いて市場で流通するエビ類の加工品及び他の魚介類を用いて実用性の検証を行った結果を表６（エビ特異プライマーセットの市販生鮮品及び加工製品における実用性の検証）に示し、電気泳動図を図９（ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のプライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−１）、図１０（ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のプライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−２）、及び、図１１（ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ１−Ｒ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｆ１／ＥＢＩ−ＳＰ２−Ｒ１のプライマーミックスを用いたエビ類の加工品及び他の魚介類の検出−３）に示す。
【００６２】
【表６】
【００６３】
その結果、エビ類及びエビの加工品のみ２００ｂｐ付近に単一のバンドを確認することができ、エビ以外の魚介類からは増幅が認められないかまたは異なるサイズの位置にバンドが確認された。すなわち、ゴマサバでは約３００ｂｐ付近に、サーモンでは約７００ｂｐ付近に、キングサーモンおよびニジマスでは約７００ｂｐ付近に、シロサバフグでは約１００ｂｐ付近に、サバ味噌煮およびシログチ冷凍すり身では約３００ｂｐ付近に増幅が認められたが、いずれもエビ類とは異なる位置での増幅であった。また、カニ類であるアサヒガニ、エガニ、シャンハイガニでは増幅が認められなかった。よって、これらの検証結果から、今回設計したプライマーセットはマルチプレックスＰＣＲ法を用いることで、エビ類を特異的に検出することが可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセットは、市場に流通するエビ類をはじめとして、各種のエビ類全体に対する検出を可能とし、しかも、カニ類に対しては、反応しないことから、食物アレルギーの原因となるエビ類をカニ類と区別し、直接的に、確実かつ特異的に検出することが可能なＰＣＲ法によるエビ類の検出方法及びそのためのＰＣＲプライマーセットを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成される、ＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット。
【請求項２】
プライマーセットが、カニ類と区別してエビ類を判別するプライマーセットであることを特徴とする請求項１記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット。
【請求項３】
ＰＣＲ法が、マルチプレックスＰＣＲであることを特徴とする請求項１又は２記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット。
【請求項４】
試料より抽出したＤＮＡを鋳型として、請求項１記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の有無を指標として判別することを特徴とするＰＣＲ法によるエビ類の検出方法。
【請求項５】
ＰＣＲ増幅を、マルチプレックスＰＣＲ法を用いて行うことを特徴とする請求項４記載のＰＣＲ法によるエビ類の検出方法。
【請求項６】
エビ類の検出が、飲食品中に含まれるエビ類由来の飲食品素材の検出であることを特徴とする請求項４又は５記載のＰＣＲ法によるエビ類の検出方法。
【請求項７】
配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを具備することを特徴とするＰＣＲ法によるエビ類検出用キット。
【請求項８】
ＰＣＲ法によるエビ類検出用キットが、マルチプレックスＰＣＲ法による検出用キットであることを特徴とする請求項７記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用キット。
【請求項１】
配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成される、ＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット。
【請求項２】
プライマーセットが、カニ類と区別してエビ類を判別するプライマーセットであることを特徴とする請求項１記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット。
【請求項３】
ＰＣＲ法が、マルチプレックスＰＣＲであることを特徴とする請求項１又は２記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用プライマーセット。
【請求項４】
試料より抽出したＤＮＡを鋳型として、請求項１記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の有無を指標として判別することを特徴とするＰＣＲ法によるエビ類の検出方法。
【請求項５】
ＰＣＲ増幅を、マルチプレックスＰＣＲ法を用いて行うことを特徴とする請求項４記載のＰＣＲ法によるエビ類の検出方法。
【請求項６】
エビ類の検出が、飲食品中に含まれるエビ類由来の飲食品素材の検出であることを特徴とする請求項４又は５記載のＰＣＲ法によるエビ類の検出方法。
【請求項７】
配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを具備することを特徴とするＰＣＲ法によるエビ類検出用キット。
【請求項８】
ＰＣＲ法によるエビ類検出用キットが、マルチプレックスＰＣＲ法による検出用キットであることを特徴とする請求項７記載のＰＣＲ法によるエビ類検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−９２１４１（Ｐ２０１１−９２１４１Ａ）
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５１３４８（Ｐ２００９−２５１３４８）
【出願日】平成２１年１０月３０日（２００９．１０．３０）
【出願人】（５０４１９６３００）国立大学法人東京海洋大学 (83)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月３０日（２００９．１０．３０）
【出願人】（５０４１９６３００）国立大学法人東京海洋大学 (83)
【Ｆターム（参考）】
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