エンサイ由来肝炎抑制組成物
【課題】赤軸系のエンサイ由来の肝障害抑制組成物を提供する。
【解決手段】 本発明の肝障害抑制剤は、植物由来の新しいマクロファージ活性化抑制作用による肝マクロファージの抗炎症効果を発揮することから、赤軸エンサイ由来の脂溶性の高い分画として医薬組成物としての利用が可能である。さらに、従来の肝障害予防、乃至は肝障害治療薬物との合剤的利用も可能であり、経口投与によりその効果を発揮できるすぐれた肝障害抑制組成物であり肝障害抑制剤である。
【解決手段】 本発明の肝障害抑制剤は、植物由来の新しいマクロファージ活性化抑制作用による肝マクロファージの抗炎症効果を発揮することから、赤軸エンサイ由来の脂溶性の高い分画として医薬組成物としての利用が可能である。さらに、従来の肝障害予防、乃至は肝障害治療薬物との合剤的利用も可能であり、経口投与によりその効果を発揮できるすぐれた肝障害抑制組成物であり肝障害抑制剤である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤軸系エンサイより抽出したある分画が、炎症反応に係わるマクロファージの活性抑制を示すことを見出したことによる、エンサイ由来の肝炎抑制組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンサイ（学名Ｉｐｏｍｏｅａ ａｑｕａｔｉｃ Ｆｏｒｓｋ、英語名ｗａｔｅｒ ｓｐｉｎａｃｈ）は別名を空心菜、ヨウサイ、カンコンなどと呼ばれるヒルガオ科サツマイモ属の野菜である。熱帯アジア原産で、中国や東南アジアで広く利用されている。エンサイには茎の色が異なる２系統（青軸、赤軸）が存在する。一般に栽培され流通しているのは、この２系統のうち青軸系（以下、青軸エンサイという）であり、畑で栽培され、茎の色は緑か白色でやわらかく折れやすい。一方、赤軸系のエンサイ（以下、赤軸エンサイという）は野生種であり、茎の色が赤紫色または緑色で、一般に水生で多湿な所で栽培される。
青軸エンサイの生理活性的機能ついて、これまで血糖値上昇抑制作用（非特許文献１）や抗菌作用（非特許文献２）が報告されており、さらにＰｒａｓａｄら（非特許文献３）は、青軸エンサイから抗酸化能を指標にした有効成分の単離に成功している。
【０００３】
しかしながら、赤軸エンサイの生理活性的機能に関してはこれまで全く報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【非特許文献１】Ｍａｌａｌａｖｉｄｈａｎｅ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｌｅａｆｙ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｉｐｏｍｏｅａ ａｑｕａｔｉｃａ ｉｓ ａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｓ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｈｙｐｏｇｌｙｃａｅｍｉｃ ｄｒｕｇ ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ ｉｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｓｕｇａｒ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ Ｒｅｓ．２００１ Ｎｏｖ；１５（７）：６３５−７．
【非特許文献２】Ｅｇａｍｉ ＥＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｄａｎｅｓｅ ｐｌａｎｔ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｏｌｋｌｏｒｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ ５９：３６９−３７３（１９９８）．
【非特許文献３】Ｋ Ｎａｇｅｎｄｒａ Ｐｒａｓａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ−ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｆｒｏｍ ｗａｔｅｒ ｓｐｉｎａｃｈ（Ｉｐｏｍｏｅａ ａｑｕａｔｉｃａ Ｆｏｒｓｋ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ．２００５ Ｍａｒ；８５（９）：１４６１−１４６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、赤軸系のエンサイ由来の肝障害抑制組成物を提供することにある。
よって、本発明者らは、青軸エンサイとは異なる、赤軸エンサイの生理活性機能を見出すべく探索を行った。本発明者らは、先ずこれら２系統のエンサイの四塩化炭素誘導性の肝障害に及ぼす影響を比較検討した。その結果、本発明者らは、赤軸エンサイより抽出したある分画が、肝臓脂質過酸化には影響を与えず、肝障害を抑制することを明らかとした。その要因として炎症反応に係わる肝臓マクロファージの活性を調べたところ、驚くべきことに、赤軸エンサイのエタノール抽出分画またはヘキサン抽出分画に、マクロファージの活性化抑制作用を見出し、この作用は抗炎症作用に関わり、肝障害抑制要因であることを明らかとし、本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち、本発明は、赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出を行った分画からなる、肝障害抑制組成物に関する。
また、赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出または８０％エタノール抽出を行った分画からなる、肝障害抑制組成物に関する。
さらに、赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出を行った分画からなる、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤に関する。
また、赤軸系のエンサイより８０％エタノール抽出を行った分画からなる、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤に関する。
また、赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物を含有する、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤に関する。
さらに、赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンまたは８０％エタノールで抽出操作を行い、ヘキサン分画または８０％エタノール分画を分取した組成物を含有する、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤に関する。
また、赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物を得ることを特徴とする、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤の製造法に関する。さらに、前記のヘキサン分画から、さらに脂溶性の高い分画を分取した組成物を得ることを特徴とする、前記のマクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤の製造法に関する。
また、軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物の、マクロファージ活性化抑制のための使用に関する。さらに、前記のヘキサン分画から、さらに脂溶性の高い分画を分取した組成物の、前記のマクロファージ活性化抑制のための使用に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、赤軸エンサイ由来のマクロファージ活性化抑制効果のある組成物が提供され、該効果により肝臓のマクロファージであるクッパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞）の抗炎症効果による肝障害抑制が達成できる。また、肝障害抑制剤として経口投与可能な剤が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】 肝障害モデルである四塩化炭素障害メカニズムを図示したものである。
【図２】 赤軸エンサイ８０％エタノール抽出分画の肝障害マーカーである血清トランスアミナーゼ活性および肝臓ＴＢＡＲＳ濃度への影響を示した図である。
【図３】 濃度をかえた赤軸エンサイ８０％エタノール抽出分画の血清トランスアミナーゼ活性への影響を示した図である。
【図４】 マクロファージ活性化に与える赤軸エンサイ８０％エタノール抽出分画の効果を示した図である。
【図５】 マクロファージ活性化に与える赤軸エンサイ水抽出分画の影響を示した図である。
【図６】 マクロファージ活性化に与える赤軸エンサイヘキサン抽出分画の効果を示した図である。
【図７】 マクロファージ活性化に与える赤軸エンサイヘキサン抽出分画のさらに細かい画分のマクロファージ活性化にあたえる効果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
先に述べたように、エンサイは抗酸化物質をはじめとした有用成分の含有量が高い野菜として血糖値上昇抑制作用などが知られており、様々な病気および／または症状の治療および／または予防効果が期待されてきている。これまでに青軸エンサイにおいては、このような生理活性機能を示す有効成分としてポリフェノールやカロテノイドが見いだされている。
そこで、先ず始めに青軸エンサイと赤軸エンサイの特に抗酸化物質に注目し、その成分分析を行った。エンサイの抗酸化能の評価については、近年公的機関でも採用されつつある新しい抗酸化能の指標であるＯＲＡＣ（Ｏｘｙｇｅｎ Ｒａｄｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｃａｐａｃｉｔｙ）を用いた。抗酸化能の測定法は複数あるが、ＯＲＡＣは水溶性、脂溶性のどちらの試料でも測定が可能であるので、実際には、親水性−ＯＲＣＡ（以下、Ｈ−ＯＲＣＡという）と疎水性−ＯＲＣＡ（以下、Ｌ−ＯＲＣＡという）に分けて分析を行った。その結果（実験１および表２）、総ポリフェノール含量、総アントシアニン含量、またカロテノイド含量のいずれも赤軸エンサイの方が青軸エンサイよりも高かったにも関わらず、結局総ＯＲＡＣ値は両エンサイの間に有意差がなかった。さらに、赤軸エンサイのＬ−ＯＲＣＡが青軸エンサイに比べ有意に高値を示した。
【０００９】
さらに、抗酸化の効果を明らかとするため、生物学的障害の１つである肝障害に着目し、赤軸エンサイの脂溶性の成分分画の四塩化炭素誘発性肝障害モデルでの評価を行った。四塩化炭素の肝障害については縷々研究が行われ、近年では、肝細胞内の肝薬物代謝酵素の１つであるチトクローム系に係わるＣＹＰ２Ｅ１という酵素により生成される反応性フリーラジカル（・ＣＣｌ３）が、肝細胞のタンパク質、脂質、核酸などと共有結合して非可逆的変化を与え、これが壊死に大きく関与している可能性があるという、脂質過酸化説を基に研究が進められている。しかしながら細胞死へのステップは複雑で，いくつかの因子が相互に関連しながら同時にまた段階的に進行するため、この過程に脂質過酸化あるいは共有結合がどのように関与するのか、まだ具体的には分かっていない（Ｗｅｂｅｒ Ｌ．Ｗ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３３，１０５−１３６（２００３）２９）。
図１に、四塩化炭素肝障害のメカニズムを図式した。
【００１０】
四塩化炭素肝障害モデルにおける障害程度の指標として、血清中トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）活性を測定した。ＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、またはａｓｐａｒａｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＳＴ）とＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、またはａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＬＴ）は生体に広く分布し、アミノ基転移反応を触媒する酵素である。肝臓に対する特異性はＧＰＴの方がＧＯＴより高い。ＧＯＴ、ＧＰＴ活性はＫａｒｍｅｎ単位（ＫＵ）または国際単位（ＩＵ／Ｌ）で表される（１ＩＵ＝１ Ｋａｒｍｅｎ単位×０．４８３）。ＧＯＴ、ＧＰＴは障害された肝細胞から、その変性・壊死の程度に応じて血中へ遊出する。肝・胆道疾患で上昇し、特に急性肝炎で著明であるとされている。
さらに、いくつかのポリフェノール類はその抗酸化力によって脂質過酸化を抑え、四塩化炭素肝障害を抑制すると考えられていので、その脂質過酸化の指標としてはチオバルビツール酸反応物質（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ、ＴＢＡＲＳ）量も測定した。
【００１１】
げっ歯類マウスの四塩化炭素肝障害モデル実験の結果、赤軸エンサイの水抽出分画には、肝障害で上昇した血清トランスアミナーゼ活性を抑制する効果は無く、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画には肝障害で上昇した血清トランスアミナーゼ活性を抑制効果があった。一方、血清トランスアミナーゼ活性の上昇を起こす四塩化炭素濃度において、肝臓中のＴＢＡＲＳ量には、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画は影響を与えなかった（図２および図３）。
よって、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画には、肝臓の脂質過酸化とは別な、つまり抗酸化作用とは異なるメカニズムによって、四塩化炭素肝障害を緩和することが考えられる。そこで炎症反応の点、マクロファージ系細胞であるクパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞）由来のサイトカインなどによる炎症反応の関与の点から分析を行った。
【００１２】
具体的には、マクロファージ様のセルラインＲＡＷ２６４．７細胞を用いてその活性化に与える赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画並びにヘキサン抽出分画の影響を見た。ＲＡＷ２６４．７は、リポ多糖（ＬＰＳ）で処理することにより活性化され、炎症性因子である一酸化窒素（ＮＯ）産生が著しく促進される。そこで、上記エンサイ抽出物をＬＰＳで活性化させたＲＡＷ２６４に添加し、ＮＯ産生量を測定することで検討した。
ＲＡＷ２６４．７細胞において、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画がＬＰＳ誘導性ＮＯ産生量におよぼす影響について調べた。その結果、ＬＰＳのみ投与群は無処理群に対してＮＯ産生量が有意に上昇し、その活性は赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画の濃度、１００μｇ／ｍｌ以上の添加によって有意に低下した（図４）。
同じように赤軸エンサイのヘキサン抽出画分がＮＯ産生量におよぼす影響については、赤軸エンサイのヘキサン画分の濃度、５０μｇ／ｍｌ以上の添加によって有意に低下した（図６）。
これらより、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画並びに赤軸エンサイのヘキサン抽出画分がマクロファージの活性化抑制の効果を有することが明らかとなった。
さらに、赤軸エンサイのヘキサン抽出分画をＨＰＬＣにより細画分したところ、マクロファージの活性化抑制効果は、ＨＰＬＣ分画画分のＦｒ．４１−５４（アセトニトリル濃度：７７−９３％）の部分で顕著であった（図７）。
【００１３】
これらの一連の実験より、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画、並びに赤軸エンサイのヘキサン抽出分画には、従来知られていなかったマクロファージ活性化抑制の効果を呈する物質が含まれている。さらに、本物質は、比較的低極性の性質、つまり脂溶性が高い性質を有した。
【００１４】
本発明に係わる赤軸エンサイは、野生種であるので野生のものを採取してもよいが、野生種から選抜を繰り返し、その性質が保存されたものを栽培し、得たものが好ましい。赤軸エンサイは、茎は赤紫色か緑色で、細かいが繊維質で丈夫である。一般に水生で、多湿なところで栽培できる。
本発明の肝障害抑制組成物は、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画、並びに赤軸エンサイのヘキサン抽出分画からなる組成物であればよいが、抽出する溶媒は、エタノールやヘキサンに限らず、有機溶媒であればよく、好ましくはアルコール類またはヘキサン異性体が挙げられ、さらに好ましくは、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ヘキサン、イソヘキサンまたは３−メチルペンタンである。これらは、例えば水との混合物であってもよい。ヘキサンが最も好ましく、ついで８０％エタノールが好ましい。
【００１５】
なお、肝障害抑制剤は、肝障害抑制組成物として、上記の、例えば、赤軸エンサイのヘキサン抽出分画または赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画の凍結乾燥物に、さらに他の肝障害抑制化合物や混合物を加えてもよい。また、肝障害の程度にも依存するが、本発明の肝障害抑制組成物の含量として、該分画の乾燥重量で１００から５００ｍｇ／ｋｇ体重であればよく、好ましくは頻回の経口投与であればよい。さらに好ましくは、１日１回で３回以上、経口投与することが望ましい。
【００１６】
マクロファージ活性化抑制のためには、ヘキサン抽出分画の肝障害抑制組成物を用いるのが好ましく、上記の肝障害抑制剤の用量と同じ分量で、同じ用法で投与すれば、マクロファージ活性化抑制を介した肝障害抑制効果を奏することができる。
本発明の肝障害抑制剤は、マクロファージ活性化抑制を介して、肝臓のクッパー細胞の炎症反応を抑えることにより肝障害を抑制するものであるので、例えば、薬物代謝能低下を防ぐ作用を有する肝障害改善薬や脂肪蓄積を減少させる作用を有する肝障害治療薬など、本発明の肝障害抑制組成物と異なる作用を有する肝障害改善薬や肝障害治療薬と組み合わせることによる肝障害抑制剤であってもよい。具体的には、本発明の肝障害抑制組成物と組み合わせることが可能なで、肝障害の治療に現在用いられている医療用製剤としては、肝水解物やインターフェロンのような生物学的製剤や、マロチラート、グルタチオン、グリチルリチンに代表される化学療法剤を上げることができ、これら薬剤との組合せで、肝障害用製剤としてもよい。
本発明において肝障害用製剤として経口的に投与する場合は、それに適用される錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤などの固形製剤、あるいは液剤、シロップ剤などの液体製剤等とすればよい。特に顆粒剤及び散剤は、カプセル剤として単位量投与形態とすることができ、液体製剤の場合は使用する際に再溶解させる乾燥生成物（例えば凍結乾燥品）にすることができる。
【００１７】
これら剤形のうち経口用固形剤は、組成物中に製剤上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有することができる。また、経口用液体製剤は、製剤上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有することができる。
本発明の組成物は、実施例中でその製造法を開示しているが、本明細書に開示された方法を修飾した方法を用いてもよく、その組成物のマクロファージ活性化抑制のための使用においては、その対象が培養細胞である場合、または動物個体である場合、その対象に応じて適宜、その活性化抑制の程度により、本発明の組成物量を調整することができる。
【００１８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
（実験１；エンサイの成分分析）
（試料）
栽培種の青軸エンサイはＳｅｒｍ Ｓｒｉ Ｓｅｅｄ社から入手した。また、野生種である赤軸エンサイはＡＶＲＤＣ（アジア蔬菜研究開発センター）から入手し、千葉大学園芸学部で選抜したものを用いた。それらのエンサイは日本大学生物資源科学部にてハウス栽培（最高室温：４０±５℃、最低室温：２０±５℃）された。エンサイは２００８年８から１０月の期間中、２から４週間毎に収穫され、収穫後凍結乾燥された。比較のためのホウレンソウは千葉県内のスーパーマーケットで購入したものを凍結乾燥した。
用いたエンサイおよびホウレンソウはすべて、凍結乾燥物をミキサーで粉砕し粉末状にしたものを用いた。凍結乾燥粉末はデシケーター中に遮光下で冷蔵保存した。
（１．総ポリフェノール含量）
７０％アセトンを用いてエンサイ中よりポリフェノールを抽出し、ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ法を用いてその含量を測定した。
【００２０】
（試薬）７０％アセトン（特級、和光純薬工業（株））、７５ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム溶液（特級、和光純薬工業（株））、ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬；ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬（ＳＩＧＭＡ（株））を蒸留水で２倍に希釈して用いた（測定当日作成）、クロロゲン酸標準液；クロロゲン酸（和光純薬工業（株））０．０１ｇを７０％アセトンに溶解し、５０ｍｌにメスアップして濃度０．２ｍｇ／ｍｌに調製した。この標準液を７０％アセトンで以下の表１に示した液量で希釈した。
【表１】
（測定手順）
試料０．０２ｇを試験管に秤取した（ｎ＝４）。次いで、７０％アセトン１０ｍｌを加え、試験管の上にビー玉を乗せて、６５℃で２０分間加温し、ポリフェノールの抽出操作を行った。この抽出液を遠心管に移し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）した。この上清を目盛り付き試験管に移して７０％アセトンで１０ｍｌに定容し、転倒混和した。
この試料０．２ｍｌまたは、各濃度の標準液０．２ｍｌを試験管に採取し、ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を０．２ｍｌ加え撹拌した。その後７５ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム１ｍｌを加え撹拌し、試験管の上にビー玉を乗せて５０℃で１５分間加温した。加温後氷冷し、吸光度（７６０ｎｍ）を測定した。
各濃度の標準液の吸光度から検量線を作成し、その近似式から試料１００ｇ乾燥重量あたりの総ポリフェノール含量（クロロゲン酸当量）を求めた。
【００２１】
（２．総アントシアニン含量）
アントシアニンは酸性で安定であることから、酸性溶媒を用いた抽出を行った。１％塩酸メタノールや５％ギ酸水溶液などをアントシアニン抽出溶媒に用いることが可能であるが、本実験では抽出時に脱アシル化などによるアントシアニン構造の変化が少ないトリフルオロ酢酸を用いた方法で行った。
（試薬）１％トリフルオロ酢酸水溶液（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））、アントシアニン標準液；塩化シアニジン（一級、和光純薬工業（株））５ｍｇを１％トリフルオロ酢酸水溶液１５．５ｍｌに溶解し、濃度１ｍＭに調製した。この標準液を段階希釈し、０、２５、５０、１００μＭの濃度の溶液を作成した。
（測定手順）
試料０．１ｇをプラスチックチューブに秤取した（ｎ＝４）。次いで１％トリフルオロ酢酸水溶液を５ｍｌ添加し、撹拌した。その後プラスチックチューブをローターに装着し、暗所・室温下で１６時間抽出を行い、遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）操作にて上清を得た。残渣には１％トリフルオロ酢酸水溶液を５ｍｌ添加し、撹拌後、再度遠心分離を行った。その上清を先に得た上清と合わせ、１％トリフルオロ酢酸水溶液で１０ｍｌに定容した。この抽出液が濁っていた場合は、１２０００ｒｐｍ程度で遠心し、清澄な抽出液を得た後、吸光度（５２０ｎｍ）を測定した。
各濃度の標準液の吸光度から検量線を作成し、その近似式から試料１００ｇ乾燥重量あたりの総アントシアニン含量（塩化シアニジン当量）を求めた。
【００２２】
（３．ＯＲＡＣ測定）
（試薬）ヘキサン（特級、和光純薬工業（株））、ジクロロメタン（特級、和光純薬工業（株））、アセトン（特級、和光純薬工業（株））、ＡＷＡ溶液；アセトン：水：酢酸（特級、和光純薬工業（株））＝７０：２９．５：０．５、ＦＬ（フルオレセイン）溶液；フルオレセインナトリウム塩（ＳＩＧＭＡ（株））を蒸留水に溶解し、濃度９４．４ｎＭに調製した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ；７５ｍＭリン酸水素二カリウム（特級、和光純薬工業（株）溶液：７５ｍＭリン酸二水素カリウム（特級、和光純薬工業（株）溶液＝５００：１５、ＡＡＰＨ溶液；ＡＡＰＨ（２，２’−Ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎ ａｍｉｄｉｎｅ）Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＳＩＧＭＡ（株））を使用直前にあらかじめ３７℃に加温したＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、濃度３１．７ｍＭに調製した。トロロックス（特級、和光純薬工業（株））
（測定手順）
（Ｈ（親水性）−ＯＲＡＣまたはＬ（疎水性）−ＯＲＡＣ用抽出液の調製）
試料１ｇにヘキサン：ジクロロメタン＝１：１（ｖ：ｖ）を１０ｍＬ加え、室温で３０秒間攪拌し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行い、上清と沈殿に分けた。この作業を２回行った。上清は、溶媒を窒素気流下で除去した後、アセトン１０ｍＬを加え攪拌、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、上清を回収するという作業を２回行い、アセトンで２５ｍＬに定容してＬ−ＯＲＡＣ用抽出液とした。上清を回収した後の沈殿は、窒素気流下で溶媒を除去した後、ＡＷＡ溶液を１０ｍＬ添加、３０秒間攪拌、超音波洗浄機を用いて氷冷下で５分間の超音波処理、室温で１０分間静置、室温で３０秒間攪拌、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、上清を回収するという作業を２回行い、ＡＷＡ溶液で２５ｍＬに定容して、Ｈ−ＯＲＡＣ用抽出液とした。それぞれの抽出液はＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで適度に希釈を行った。
（測定方法）
測定には９６ｗｅｌｌマイクロプレート、９６ｗｅｌｌマイクロプレート対応蛍光プレートリーダーを用いた。９６ｗｅｌｌマイクロプレートに、上記より得られた抽出液２０μＬ、ＦＬ溶液２００μＬを分注し、振盪攪拌後、蛍光強度（ｆ０ｍｉｎ）を測定した（ｆ０ｍｉｎ：測定開始０ｍｉｎの蛍光強度）。マイクロプレートを３７℃で１０分以上加温した後、ＡＡＰＨ溶液を７５μＬ加え、添加４分後から測定を開始した。測定間隔は２分、測定回数は最低４５回（９０分間）、検出波長はＥｘ．４８５ｎｍ付近、Ｅｍ．５２０ｎｍ付近で行った。また、ブランクにはＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ、標準物質にトロロックスを用いて検量線を作成し試料のＯＲＡＣ値をトロロックス当量として換算した。
（計算方法）
得られた各ウェルでの蛍光強度測定結果により、各試料のＡＵＣを算出した。ＡＵＣの計算は以下の通りである。
ＡＵＣ＝（０．５×ｆ８ｍｉｎ＋ｆ１ｏｍｉｎ＋ｆ１２ｍｉｎ＋ｆ１４ｍｉｎ＋・・・＋ｆｘ−１＋０．５×ｆｘ）／ｆｘｍｉｎ×２
得られたＡＵＣよりｎｅｔＡＵＣを算出した。ｎｅｔＡＵＣの計算方法は以下の通りである。
ｎｅｔＡＵＣｔｒｏｌｏｘ＝ＡＵＣｔｒｏｌｏｘ−ＡＵＣｂｌａｎｋ
ｎｅｔＡＵＣｓａｍｐｌｅ＝ＡＵＣｓａｎｐｌｅ−ＡＵＣｂｌａｎｋ
各トロロックス溶液のｎｅｔＡＵＣをＸ軸に、各トロロックス溶液の濃度（μＭ）をＹ軸にプロットしたグラフより二次回帰式を算出し、この回帰式より以下の数式（数１）からＯＲＡＣ値を算出した。
【数１】
【００２３】
（４．カロテノイド含量）
エンサイのβ−カロテンとキサントフィル含量を、高速液体クロマトグラフを用いて測定した。
（試薬）塩基性炭酸マグネシウム（一級、和光純薬工業（株））、テトラヒドロフラン（特級、和光純薬工業（株））、石油エーテル（特級、和光純薬工業（株））、塩化ナトリウム（特級、和光純薬工業（株））、無水硫酸ナトリウム（特級、和光純薬工業（株））、アセトニトリル（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））、メタノール（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））、ジクロロメタン（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））、ヘキサン（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））。
β−カロテン標準液；β−カロテン標準品（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））１０ｍｇを１００ｍｌのＨＰＬＣ溶離液（濃度組成：後述のグラジエント最終設定値）に溶解し、その標準液を段階希釈し、０．５、１、２、１０μｇ／ｍｌの濃度の溶液を作成した。
キサントフィル標準液；キサントフィル標準品（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））１ｍｇを１０ｍｌのＨＰＬＣ溶離液（濃度組成：後述のグラジエント最終設定値）に溶解し、その標準液を段階希釈し、１、２、５、１０μｇ／ｍｌの濃度の溶液を作成した。
（測定手順）
（試料の調製）
試料１ｇを秤量し乳鉢に取り、０．１ｇの炭酸マグネシウムと３０ｍｌ程度のテトラヒドロフランを加え摩砕し、ガラスフィルターでろ過した。残渣が無色になるまでこの操作を繰り返し（２回程度）、得られたろ液をテトラヒドロフランで１００ｍｌに定容した。そのろ液を分液漏斗に採取し、等量の石油エーテル、少量の塩化ナトリウム水溶液加え、石油エーテル層に転溶させた。下層の水溶液は蒸留水で洗浄し、石油エーテルを加えて着色層を回収した（２回程度）。回収した石油エーテル層に無水硫酸ナトリウムを加え脱水し、ガラスフィルターでろ過した後、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固させた。得られた抽出物に、１００ｍｌのＨＰＬＣ溶離液（濃度組成：後述のグラジエント最終設定値）を加えて溶解させ、メブレンフィルターでろ過した。
（ＨＰＬＣによる分析）
ろ液または標準液２０μｌをＨＰＬＣシステム（カラム：Ｘ Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム・粒子径５μｍ・４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：室温、モニター波長：４７０ｎｍ）に注入した。注入した試料は４種類の有機溶媒による溶離液組成（アセトニトリル：メタノール：ジクロロメタン：ヘキサン＝８５：１０：２．５：２．５）で１０分間溶離させ、その後３０分間で最終濃度（アセトニトリル：メタノール：ジクロロメタン：ヘキサン＝４４：１０：２３：２３）まで変化させる直線グラジエント設定で溶離させた。
（計算方法）
各濃度の標準液のピーク面積から検量線を作成し、その近似式から試料１００ｇ乾燥重量あたりのカロテノイド含量（β−カロテン、キサントフィル）を求めた。
（５．統計処理）
棄却検定後、各群の有意差検定をダンカンの多重比較で行い、５％以下の危険率で群間に有意差が認められると判断した。測定値は平均値±標準誤差で表した。
【００２４】
（結果）
結果を表２に示す。
青軸・赤軸エンサイおよび対照としてホウレンソウ中の総ポリフェノール含量（クロロゲン酸当量）を測定した結果、２系統の両エンサイの総ポリフェノール含量はホウレンソウよりも有意に高く、また赤軸エンサイは青軸エンサイに比べ有意に高い値を示した。
さらに、総アントシアニン含量（塩化シアニジン当量）を測定した結果、赤軸エンサイの総アントシアニン含量は、青軸エンサイまたホウレンソウよりも有意に高く、それらの３倍程度含まれていた。
エンサイの抗酸化能を調べるため、同試料のＯＲＡＣ値を測定した結果、疎水性抽出物のＯＲＡＣ（Ｌ−ＯＲＡＣ）については赤軸エンサイがホウレンソウに比べ有意に高値を示した。青軸エンサイは検出限界以下であったため測定できなかった。また、親水性抽出物のＯＲＡＣ（Ｈ−ＯＲＡＣ）および総ＯＲＡＣについては各試料に有意差は認められなかった。
【表２】
【００２５】
青軸・赤軸エンサイのカロテノイド含量（β−カロテン、キサントフィル）を測定した結果を表３に示す。β−カロテン含量については、赤軸エンサイは青軸エンサイに比べ２倍程度高かった。またキサントフィル含量については、赤軸エンサイは青軸エンサイに比べ３．５倍程度高かった。
【表３】
【００２６】
（実験２；肝障害モデルに対する影響）
（材料および方法）
１）エンサイのエタノール抽出物の調製
野生種の赤軸エンサイまたは栽培種の青軸エンサイは、実験１の試料の記載の通り、これらを収穫し、凍結乾燥後、ミキサーで粉砕しデシケーター中に遮光下で冷蔵保存した。
三角フラスコにエンサイ凍結乾燥サンプル（粉末）とその２０倍量の８０％エタノール（特級、和光純薬工業（株））を加え、振盪しながら８０℃で３時間加温した。次いで遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行い、上清をメンブレンフィルターでろ過した。ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮し、その後凍結乾燥を行い粗抽出物を得た。その粗抽出物を０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）（化学用、和光純薬工業（株））に溶解し、後述の濃度に従って調製した。
２）実験動物
５週齢のＩＣＲ系雄マウス（日本ＳＬＣ（株））を用いた。予備飼育期間中は固形飼料（ＣＥ−２日本クレア（株））を与え、その後平均体重が等しくなるように群分けした（ｎ＝３−６）。固形資料の組成（日本クレアのホームページより）を表４に示す。
【表４】
【００２７】
飼育期間中、マウスは識別用染料で印を付け区別し、１つのプラスチック製マウス用ケージにつき３から６匹ずつ入れ飼育した。ケージにはソフトチップ（日本ＳＬＣ（株））を敷き、２日に一度掃除しチップを交換した。飲料水は水道水を自由摂取させ、２日に一度入れ替えた。１２時間の明暗サイクル、室温２２度±２℃で飼育した。
３）エンサイの経口投与用、８０％エタノールまたはヘキサン抽出物の調製
（試薬）８０％エタノール（特級、和光純薬工業（株））、ｎ−ヘキサン（特級、和光純薬工業（株））、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）（化学用、和光純薬工業（株））；ＣＭＣ０．５ｇに蒸留水１００ｍｌを加え、ガラス棒でダマ状のＣＭＣを砕いた後マグネットスターラーを用いて溶解した。
（８０％エタノール抽出物の調製）
三角フラスコに試料とその２０倍量の８０％エタノールを加え、振盪しながら８０℃で３時間加温した。次いで遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行い、上清をメンブレンフィルターでろ過した。ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮し、その後凍結乾燥を行い粗抽出物を得た（試料が少量の場合は、ろ液を５０ｍｌプラスチックチューブに移し、濃縮遠心機を用いて粗抽出物を得た）。その粗抽出物を０．５％ＣＭＣに溶解し、後述の濃度（χｍｇ／１０ｍｌ／ｋｇ体重）に従って調製した。
（８０％エタノール抽出物のヘキサン画分）
前述の方法で得た８０％エタノール抽出物を、エンサイ試料の２倍量程度の水と等量のヘキサンに溶解し、分液漏斗にて分画した。下層（水層）をいったんビーカーに注ぎ、上層（ヘキサン層）を回収した。その後再び水層と等量のヘキサンを分液漏斗に採取し、上層の緑色がほぼ無色になるまでこの操作を繰り返した（６回程度）。回収した水層とヘキサン層を凍結乾燥機または濃縮遠心機を用いて濃縮乾固し、得られた抽出物を０．５％ＣＭＣに溶解し、後述の濃度（χｍｇ／１０ｍｌ／ｋｇ体重）に従って調製した。
【００２８】
４）四塩化炭素の調整
四塩化炭素の調製・投与に用いる器具（ガラス瓶、ガラスピペット）をオートクレーブ（１２１℃、２０分間）にかけた。ドラフト内で、ゴム手袋を着用して、四塩化炭素（精密分析用、和光純薬工業（株））とオリーブ油（和光純薬工業（株））を後述の割合に従って調整した。
５）肝障害モデルに対する赤軸エンサイの各画分経口投与の影響
ａ）肝障害マーカー、血清トランスアミナーゼおよび肝臓ＴＢＡＲＳ濃度に対する影響マウスを予備飼育後、以下のように群分けした。
Ａ．無処理群 （ｎ＝３）
Ｂ．四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｃ．赤軸エンサイエタノール抽出物：１００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｄ．赤軸エンサイエタノール抽出物：５００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
群分け後、ＡからＤ群には２日間固形飼料を摂取させ、３、４、５日目にＡ、Ｂ群には０．５％ＣＭＣを、ＣからＤ群には上記の８０％エタノール抽出物それぞれ経口投与した。最終投与の２時間後にＢからＤ群には四塩化炭素（四塩化炭素：オリーブ油＝１：１、０．５ｍｌ／ｋｇ ｂ．ｗ．）を、またＡ群には等量のオリーブ油を腹腔内投与し、その２４時間後に解剖を行った。四塩化炭素の投与前後４時間絶食させた。
（解剖）
四塩化炭素投与の２４時間後にマウスを順に麻酔し、解剖を行った。麻酔は、ペントバルビタールナトリウムを濃度が５０ｍｇ／ｍｌになるように蒸留水で調製し、０．２μｍ滅菌シリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理したものを０．１３ｍｌ／１００ｇ体重の割合で腹腔内投与することによって行った。開腹後、心臓から採血し、肝臓を採取した。肝臓はＴＢＡＲＳ測定用のものを切り分けた後アルミホイルで包み、−２０℃フリーザーで保存した。ただし肝臓中ＴＢＡＲＳに関しては、即日測定する必要があるため、解剖終了後すぐにホモジネートし当日または翌日に測定を行った。採取した血液は遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）後、血清を採取し測定まで−２０℃で保存した。
【００２９】
（測定項目及び方法）
（１）血清中トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）活性の測定
解剖時に得られた血清における、ＧＯＴ、ＧＰＴの活性をトランスアミナーゼ ＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業（株））を用いて測定した。血清は、四塩化炭素無処理群は５倍、四塩化炭素投与群は３０倍に希釈したものを測定した。
（２）肝臓中ＴＢＡＲＳの測定
生体内過酸化脂質の測定法として主に用いられているＴＢＡ（チオバルビツール酸）法によりＴＢＡＲＳを測定した。
（試薬）１．１５％ＫＣｌ溶液（和光純薬工業（株））、５％ＢＨＴ／メタノール溶液；ＢＨＴ（和光純薬工業（株））１ｇをメタノール（特級、和光純薬工業（株））２０ｍｌに溶解し５％ＢＨＴ／メタノール溶液とした。２０％酢酸溶液（ｐＨ３．５）；酢酸（一級、和光純薬工業（株））２０ｍｌで１００ｍｌ調製した。３０％水酸化ナトリウム（特級、和光純薬工業（株））で、ｐＨメーターを用いてｐＨ３．５に合わせた。８．１％ＳＤＳ溶液（生化学用、和光純薬工業（株））、０．８％ＴＢＡ溶液（用事調製）；ＴＢＡ（２−チオバルビツール酸；特級、和光純薬工業（株））０．８ｇを蒸留水に溶解し、１００ｍｌに定容した。溶けにくいため湯浴にて溶解した。ｎ−ブタノール：ピリジン（１５：１）溶液；ピリジン（特級、和光純薬工業（株））２０ｍｌをｎ−ブタノール（特級、和光純薬工業（株））３００ｍｌに溶解した。調製はドラフト内で行った。ＴＥＰ標準液；ＴＥＰ（１，１，３，３，−１テトラエトキシプロパン；生化学用、和光純薬工業（株））１１０ｍｇ（約１２３μｌ）を、メタノールで５０ｍｌに定容した。十分に撹拌した後１ｍｌを採取し、さらにメタノールで１００ｍｌに定容し、１００ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度に調製した。これを希釈原液とし、以下の表５に示したようにメタノールで希釈した。
【表５】
【００３０】
（測定手順）
解剖時に切り取った肝臓０．５ｇに、１．１５％ＫＣｌ溶液４．５ｍｌと５％ＢＨＴ溶液１０μｌを加え氷上でホモジナイズした。ホモジナイザーは一回のホモジナイズ毎に蒸留水で洗浄し、キムワイプで軽く拭いてから次のホモジナイズへと移った。ホモジネート液は共栓付き試験管に移した。全ての肝臓を解剖直後にホモジナイズし、氷を入れた発泡スチロール箱に入れて、翌日測定を行う場合は低温室で保存した。
ホモジネート液をよく撹拌し、０．２ｍｌをプラスチックチューブに取り氷上に置いた。同じく各濃度の標準液と、ブランクには蒸留水をそれぞれ０．２ｍｌずつ分注した。次に８．１％ＳＤＳ溶液を０．２ｍｌ、２０％酢酸溶液（ｐＨ３．５）を１．５ｍｌ加えよく撹拌し、さらに蒸留水を０．６ｍｌ加えた。続いて０．８％ＴＢＡ溶液を１．５ｍｌ加え撹拌し、ふたを軽く閉め、９５℃で６０分間加温した。加温後氷水中で急冷し、蒸留水１ｍｌを加えた。ｎ−ブタノール：ピリジン（１５：１）溶液を５ｍｌ加え、手で上下に激しく振った。遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）後、上層の吸光度（５３２ｎｍ）をガラスセルを用いて測定した。セル誤差補正はｎ−ブタノールで行った。
各濃度の標準液の吸光度から検量線を作成し、近似式からホモジネート液０．２ｍｌ中のＴＢＡＲＳ量を算出して、その値から肝臓ｇ組織あたりのＴＢＡＲＳ量を求めた。
（統計処理）
棄却検定後、各群の有意差検定をダンカンの多重比較で行い、５％以下の危険率で群間に有意差が認められると判断した。測定値は平均値±標準誤差で表した。
【００３１】
（結果）
結果を図２に示す。血清トランスアミナーゼ活性については、四塩化炭素のみ投与群は無処理群に対して有意に上昇し、その活性は赤軸エンサイ８０％エタノール抽出物：１００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）投与によって低下する傾向を示した。肝臓ＴＢＡＲＳ値については全ての群間に有意差は見られなかった。
そこで、赤軸エンサイ８０％エタノール抽出物の１００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）近傍の用量をさらに検討した。
【００３２】
ｂ）肝障害マーカー、血清トランスアミナーゼおよび肝臓ＴＢＡＲＳ濃度に対する影響（低用量投与群）
マウスを予備飼育後、以下のように群分けした。
Ａ．無処理群 （ｎ＝４）
Ｂ．四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｃ．赤軸エンサイエタノール抽出物：２５（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｄ．赤軸エンサイエタノール抽出物：５０（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｅ．赤軸エンサイエタノール抽出物：１００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｆ．赤軸エンサイエタノー粗抽出物：２００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
赤軸エンサイの８０％エタノール抽出物の用量以外は上記ａ）の実験と同じ条件で行い、測定等も同様に行った。
（結果）
結果を図３に示す。四塩化炭素のみ投与群は無処理群に対してＧＯＴ活性（ＡＳＴ）が有意に上昇したが、その活性は赤軸エンサイの８０％エタノール粗抽出物：１００および２００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）投与によって有意に低下した。
なお、８０％エタノール抽出物のヘキサン画分並びに水画分につき、以下のような群で同様に実験を行ったが、いずれの投与群でも血清トランスアミナーゼ活性および肝臓ＴＢＡＲＳ濃度に有意な差は見られなかった。（データー示さず）
Ａ．無処理群 （ｎ＝３）
Ｂ．四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｃ．赤軸エンサイ水画分抽出物：５（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｄ．赤軸エンサイ水画分抽出物：１０（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｅ．赤軸エンサイ水画分抽出物：２０（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｆ．赤軸エンサイヘキサン画分抽出物：５（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｇ．赤軸エンサイヘキサン画分抽出物：１０（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｈ．赤軸エンサイヘキサン画分抽出物：２０（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
【００３３】
（実験３；ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞を用いた、赤軸エンサイ抽出物のマクロファージ活性化に与える影響）
ＲＡＷ２６４．７は、リポ多糖（ＬＰＳ）で処理することにより活性化され、炎症性因子である一酸化窒素（ＮＯ）産生が著しく促進される。エンサイ抽出物をＬＰＳで活性化させたＲＡＷ２６４に添加し、ＮＯ産生量を測定することで、マクロファージ活性化に与える影響をみた。
（方法）
１）実験材料
ＲＡＷ２６４．７細胞（理化学研究所、Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋより入手）
ＲＡＷ２６４．７細胞培養用培地は、ダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」（日水製薬（株））に非動化した１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、１％ＰＮ／ＳＭ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ（株））
赤軸エンサイエタノール抽出物、並びに赤軸エンサイ水画分・ヘキサン画分抽出物は、実験２に記載されたものを用いた。
赤軸エンサイヘキサン画分−ＨＰＬＣ画分抽出については、上記赤軸エンサイヘキサン画分抽出物をヘキサンで溶解し、濃度１００ｍｇ／ｍｌに調製した。これを、ＨＰＬＣシステム（カラム：Ｘ Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム・粒子径５μｍ・４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ガードカラム：Ｘ Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム・粒子径５μｍ・４．６ｍｍ×２０ｍｍ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：室温、モニター波長：２８０ｎｍ）に２００μｌ注入した。注入した試料は組成（０．１％ギ酸（和光純薬工業（株））−アセトニトリル溶液：０．１％ギ酸（超純水で溶解）＝３：７）の溶離液で溶離させ始め、その後１時間で最終濃度（０．１％ギ酸−アセトニトリル溶液：１００％）まで変化させる直線グラジエント設定で溶離させた。分画サンプルは、フラクションコレクターを用いて１分間に１ｍｌの容量で６０本のエッペンチューブに採取した。その後濃縮遠心機で濃縮乾固し、分画物を得た。この操作を５回繰り返し、５回分の分画物に２０μｌのＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（生化学用、和光純薬工業（株））を加えよく撹拌して溶解した。
２）細胞処置
ＲＡＷ２６４．７細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように２４ｗｅｌｌプレートに播種し（ｎ＝４）、５％ＣＯ２、３７℃下で６時間培養した。６時間後無血清培地にＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）とエンサイ抽出物を０．１％加え、５００μｌ／ｗｅｌｌで添加した。２４時間培養した後、培養上清を回収し、ＮＯ産生量を測定した。
３）ＮＯ産生測定
（試薬）試薬Ａ：０．２％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩；Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（特級、和光純薬工業（株））０．１ｇを蒸留水５０ｍｌに溶解した。試薬Ｂ：２％スルファニルアミド＋１０％リン酸スルファニルアミド（Ｓｉｇｍａ（株））１ｇとリン酸（特級、和光純薬工業（株））５ｍｌを蒸留水４５ｍｌに溶解した。亜硝酸ナトリウム標準液；亜硝酸ナトリウム（特級、和光純薬工業（株））を蒸留水で溶解し、その標準液を段階希釈し、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００μＭの濃度の溶液を作成した。
（測定手順）
細胞処置で得た培養上清または亜硝酸ナトリウム標準液を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１００μｌずつ入れた（ｎ＝４）。次いで、試薬Ａと試薬Ｂを１：１で混合し、混合液を１００μｌずつ加えた後、吸光度（５５０ｎｍ）を測定した。
４）統計処理
一元配置分散分析後、各群の有意差検定をチューキーの多重比較で行い、５％以下の危険率で群間に有意差が認められると判断した。測定値は平均値±標準誤差で表した。
【００３４】
（結果）
ＬＰＳのみ投与群は無処理群に対してＮＯ産生量が有意に上昇し、その活性は赤軸エンサイエタノール抽出物：１００μｇ／ｍｌ以上の添加によって有意に低下した（図４）。
同条件において、赤軸エンサイの水画分については、ＬＰＳ投与群は無処理群に対してＮＯ産生量が有意に上昇したが、ＬＰＳ投与群と抽出物投与群の間に有意差は見られなかった（図５）。
同条件において赤軸エンサイのヘキサン画分がＮＯ産生量におよぼす影響について調べた結果、ＬＰＳのみ投与群は無処理群に対してＮＯ産生量が有意に上昇し、その活性は赤軸エンサイヘキサン画分：５０μｇ／ｍｌ以上の添加によって有意に低下した（図６）。
さらに、赤軸エンサイＨＰＬＣ分画画分がＮＯ産生量におよぼす影響について調べた。その結果、ＬＰＳのみ投与群は無処理群に対してＮＯ産生量が上昇し、その活性は赤軸エンサイＨＰＬＣ分画画分のＦｒ．４１−５４（アセトニトリル濃度：７７−９３％）の部分、比較的低極性を示すような画分で顕著な低下が見られた（図７）。
【００３５】
これらの実験から、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画やヘキサン抽出分画が、肝障害抑制の生理作用を示し、その作用は、マクロファージ活性化抑制によるものであった。さらにヘキサン分画の比較的低極性の分画がその活性をしめすことから、赤軸エンサイのヘキサン抽出画分の脂溶性の高い分画が、マクロファージ活性化抑制作用を強力に有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の肝障害抑制剤は、植物由来の新しいマクロファージ活性化抑制作用による肝マクロファージの抗炎症効果を発揮することから、赤軸エンサイ由来の脂溶性の高い分画として医薬組成物としての利用が可能である。さらに、従来の肝障害予防、乃至は肝障害治療薬物との合剤的利用も可能であり、経口投与によりその効果を発揮できるすぐれた肝障害抑制組成物であり肝障害抑制剤である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤軸系エンサイより抽出したある分画が、炎症反応に係わるマクロファージの活性抑制を示すことを見出したことによる、エンサイ由来の肝炎抑制組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンサイ（学名Ｉｐｏｍｏｅａ ａｑｕａｔｉｃ Ｆｏｒｓｋ、英語名ｗａｔｅｒ ｓｐｉｎａｃｈ）は別名を空心菜、ヨウサイ、カンコンなどと呼ばれるヒルガオ科サツマイモ属の野菜である。熱帯アジア原産で、中国や東南アジアで広く利用されている。エンサイには茎の色が異なる２系統（青軸、赤軸）が存在する。一般に栽培され流通しているのは、この２系統のうち青軸系（以下、青軸エンサイという）であり、畑で栽培され、茎の色は緑か白色でやわらかく折れやすい。一方、赤軸系のエンサイ（以下、赤軸エンサイという）は野生種であり、茎の色が赤紫色または緑色で、一般に水生で多湿な所で栽培される。
青軸エンサイの生理活性的機能ついて、これまで血糖値上昇抑制作用（非特許文献１）や抗菌作用（非特許文献２）が報告されており、さらにＰｒａｓａｄら（非特許文献３）は、青軸エンサイから抗酸化能を指標にした有効成分の単離に成功している。
【０００３】
しかしながら、赤軸エンサイの生理活性的機能に関してはこれまで全く報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【非特許文献１】Ｍａｌａｌａｖｉｄｈａｎｅ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｌｅａｆｙ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｉｐｏｍｏｅａ ａｑｕａｔｉｃａ ｉｓ ａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｓ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｈｙｐｏｇｌｙｃａｅｍｉｃ ｄｒｕｇ ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ ｉｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｓｕｇａｒ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ Ｒｅｓ．２００１ Ｎｏｖ；１５（７）：６３５−７．
【非特許文献２】Ｅｇａｍｉ ＥＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｄａｎｅｓｅ ｐｌａｎｔ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｏｌｋｌｏｒｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ ５９：３６９−３７３（１９９８）．
【非特許文献３】Ｋ Ｎａｇｅｎｄｒａ Ｐｒａｓａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ−ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｆｒｏｍ ｗａｔｅｒ ｓｐｉｎａｃｈ（Ｉｐｏｍｏｅａ ａｑｕａｔｉｃａ Ｆｏｒｓｋ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ．２００５ Ｍａｒ；８５（９）：１４６１−１４６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、赤軸系のエンサイ由来の肝障害抑制組成物を提供することにある。
よって、本発明者らは、青軸エンサイとは異なる、赤軸エンサイの生理活性機能を見出すべく探索を行った。本発明者らは、先ずこれら２系統のエンサイの四塩化炭素誘導性の肝障害に及ぼす影響を比較検討した。その結果、本発明者らは、赤軸エンサイより抽出したある分画が、肝臓脂質過酸化には影響を与えず、肝障害を抑制することを明らかとした。その要因として炎症反応に係わる肝臓マクロファージの活性を調べたところ、驚くべきことに、赤軸エンサイのエタノール抽出分画またはヘキサン抽出分画に、マクロファージの活性化抑制作用を見出し、この作用は抗炎症作用に関わり、肝障害抑制要因であることを明らかとし、本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち、本発明は、赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出を行った分画からなる、肝障害抑制組成物に関する。
また、赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出または８０％エタノール抽出を行った分画からなる、肝障害抑制組成物に関する。
さらに、赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出を行った分画からなる、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤に関する。
また、赤軸系のエンサイより８０％エタノール抽出を行った分画からなる、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤に関する。
また、赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物を含有する、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤に関する。
さらに、赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンまたは８０％エタノールで抽出操作を行い、ヘキサン分画または８０％エタノール分画を分取した組成物を含有する、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤に関する。
また、赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物を得ることを特徴とする、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤の製造法に関する。さらに、前記のヘキサン分画から、さらに脂溶性の高い分画を分取した組成物を得ることを特徴とする、前記のマクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤の製造法に関する。
また、軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物の、マクロファージ活性化抑制のための使用に関する。さらに、前記のヘキサン分画から、さらに脂溶性の高い分画を分取した組成物の、前記のマクロファージ活性化抑制のための使用に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、赤軸エンサイ由来のマクロファージ活性化抑制効果のある組成物が提供され、該効果により肝臓のマクロファージであるクッパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞）の抗炎症効果による肝障害抑制が達成できる。また、肝障害抑制剤として経口投与可能な剤が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】 肝障害モデルである四塩化炭素障害メカニズムを図示したものである。
【図２】 赤軸エンサイ８０％エタノール抽出分画の肝障害マーカーである血清トランスアミナーゼ活性および肝臓ＴＢＡＲＳ濃度への影響を示した図である。
【図３】 濃度をかえた赤軸エンサイ８０％エタノール抽出分画の血清トランスアミナーゼ活性への影響を示した図である。
【図４】 マクロファージ活性化に与える赤軸エンサイ８０％エタノール抽出分画の効果を示した図である。
【図５】 マクロファージ活性化に与える赤軸エンサイ水抽出分画の影響を示した図である。
【図６】 マクロファージ活性化に与える赤軸エンサイヘキサン抽出分画の効果を示した図である。
【図７】 マクロファージ活性化に与える赤軸エンサイヘキサン抽出分画のさらに細かい画分のマクロファージ活性化にあたえる効果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
先に述べたように、エンサイは抗酸化物質をはじめとした有用成分の含有量が高い野菜として血糖値上昇抑制作用などが知られており、様々な病気および／または症状の治療および／または予防効果が期待されてきている。これまでに青軸エンサイにおいては、このような生理活性機能を示す有効成分としてポリフェノールやカロテノイドが見いだされている。
そこで、先ず始めに青軸エンサイと赤軸エンサイの特に抗酸化物質に注目し、その成分分析を行った。エンサイの抗酸化能の評価については、近年公的機関でも採用されつつある新しい抗酸化能の指標であるＯＲＡＣ（Ｏｘｙｇｅｎ Ｒａｄｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｃａｐａｃｉｔｙ）を用いた。抗酸化能の測定法は複数あるが、ＯＲＡＣは水溶性、脂溶性のどちらの試料でも測定が可能であるので、実際には、親水性−ＯＲＣＡ（以下、Ｈ−ＯＲＣＡという）と疎水性−ＯＲＣＡ（以下、Ｌ−ＯＲＣＡという）に分けて分析を行った。その結果（実験１および表２）、総ポリフェノール含量、総アントシアニン含量、またカロテノイド含量のいずれも赤軸エンサイの方が青軸エンサイよりも高かったにも関わらず、結局総ＯＲＡＣ値は両エンサイの間に有意差がなかった。さらに、赤軸エンサイのＬ−ＯＲＣＡが青軸エンサイに比べ有意に高値を示した。
【０００９】
さらに、抗酸化の効果を明らかとするため、生物学的障害の１つである肝障害に着目し、赤軸エンサイの脂溶性の成分分画の四塩化炭素誘発性肝障害モデルでの評価を行った。四塩化炭素の肝障害については縷々研究が行われ、近年では、肝細胞内の肝薬物代謝酵素の１つであるチトクローム系に係わるＣＹＰ２Ｅ１という酵素により生成される反応性フリーラジカル（・ＣＣｌ３）が、肝細胞のタンパク質、脂質、核酸などと共有結合して非可逆的変化を与え、これが壊死に大きく関与している可能性があるという、脂質過酸化説を基に研究が進められている。しかしながら細胞死へのステップは複雑で，いくつかの因子が相互に関連しながら同時にまた段階的に進行するため、この過程に脂質過酸化あるいは共有結合がどのように関与するのか、まだ具体的には分かっていない（Ｗｅｂｅｒ Ｌ．Ｗ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３３，１０５−１３６（２００３）２９）。
図１に、四塩化炭素肝障害のメカニズムを図式した。
【００１０】
四塩化炭素肝障害モデルにおける障害程度の指標として、血清中トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）活性を測定した。ＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、またはａｓｐａｒａｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＳＴ）とＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、またはａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＬＴ）は生体に広く分布し、アミノ基転移反応を触媒する酵素である。肝臓に対する特異性はＧＰＴの方がＧＯＴより高い。ＧＯＴ、ＧＰＴ活性はＫａｒｍｅｎ単位（ＫＵ）または国際単位（ＩＵ／Ｌ）で表される（１ＩＵ＝１ Ｋａｒｍｅｎ単位×０．４８３）。ＧＯＴ、ＧＰＴは障害された肝細胞から、その変性・壊死の程度に応じて血中へ遊出する。肝・胆道疾患で上昇し、特に急性肝炎で著明であるとされている。
さらに、いくつかのポリフェノール類はその抗酸化力によって脂質過酸化を抑え、四塩化炭素肝障害を抑制すると考えられていので、その脂質過酸化の指標としてはチオバルビツール酸反応物質（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ、ＴＢＡＲＳ）量も測定した。
【００１１】
げっ歯類マウスの四塩化炭素肝障害モデル実験の結果、赤軸エンサイの水抽出分画には、肝障害で上昇した血清トランスアミナーゼ活性を抑制する効果は無く、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画には肝障害で上昇した血清トランスアミナーゼ活性を抑制効果があった。一方、血清トランスアミナーゼ活性の上昇を起こす四塩化炭素濃度において、肝臓中のＴＢＡＲＳ量には、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画は影響を与えなかった（図２および図３）。
よって、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画には、肝臓の脂質過酸化とは別な、つまり抗酸化作用とは異なるメカニズムによって、四塩化炭素肝障害を緩和することが考えられる。そこで炎症反応の点、マクロファージ系細胞であるクパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞）由来のサイトカインなどによる炎症反応の関与の点から分析を行った。
【００１２】
具体的には、マクロファージ様のセルラインＲＡＷ２６４．７細胞を用いてその活性化に与える赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画並びにヘキサン抽出分画の影響を見た。ＲＡＷ２６４．７は、リポ多糖（ＬＰＳ）で処理することにより活性化され、炎症性因子である一酸化窒素（ＮＯ）産生が著しく促進される。そこで、上記エンサイ抽出物をＬＰＳで活性化させたＲＡＷ２６４に添加し、ＮＯ産生量を測定することで検討した。
ＲＡＷ２６４．７細胞において、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画がＬＰＳ誘導性ＮＯ産生量におよぼす影響について調べた。その結果、ＬＰＳのみ投与群は無処理群に対してＮＯ産生量が有意に上昇し、その活性は赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画の濃度、１００μｇ／ｍｌ以上の添加によって有意に低下した（図４）。
同じように赤軸エンサイのヘキサン抽出画分がＮＯ産生量におよぼす影響については、赤軸エンサイのヘキサン画分の濃度、５０μｇ／ｍｌ以上の添加によって有意に低下した（図６）。
これらより、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画並びに赤軸エンサイのヘキサン抽出画分がマクロファージの活性化抑制の効果を有することが明らかとなった。
さらに、赤軸エンサイのヘキサン抽出分画をＨＰＬＣにより細画分したところ、マクロファージの活性化抑制効果は、ＨＰＬＣ分画画分のＦｒ．４１−５４（アセトニトリル濃度：７７−９３％）の部分で顕著であった（図７）。
【００１３】
これらの一連の実験より、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画、並びに赤軸エンサイのヘキサン抽出分画には、従来知られていなかったマクロファージ活性化抑制の効果を呈する物質が含まれている。さらに、本物質は、比較的低極性の性質、つまり脂溶性が高い性質を有した。
【００１４】
本発明に係わる赤軸エンサイは、野生種であるので野生のものを採取してもよいが、野生種から選抜を繰り返し、その性質が保存されたものを栽培し、得たものが好ましい。赤軸エンサイは、茎は赤紫色か緑色で、細かいが繊維質で丈夫である。一般に水生で、多湿なところで栽培できる。
本発明の肝障害抑制組成物は、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画、並びに赤軸エンサイのヘキサン抽出分画からなる組成物であればよいが、抽出する溶媒は、エタノールやヘキサンに限らず、有機溶媒であればよく、好ましくはアルコール類またはヘキサン異性体が挙げられ、さらに好ましくは、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ヘキサン、イソヘキサンまたは３−メチルペンタンである。これらは、例えば水との混合物であってもよい。ヘキサンが最も好ましく、ついで８０％エタノールが好ましい。
【００１５】
なお、肝障害抑制剤は、肝障害抑制組成物として、上記の、例えば、赤軸エンサイのヘキサン抽出分画または赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画の凍結乾燥物に、さらに他の肝障害抑制化合物や混合物を加えてもよい。また、肝障害の程度にも依存するが、本発明の肝障害抑制組成物の含量として、該分画の乾燥重量で１００から５００ｍｇ／ｋｇ体重であればよく、好ましくは頻回の経口投与であればよい。さらに好ましくは、１日１回で３回以上、経口投与することが望ましい。
【００１６】
マクロファージ活性化抑制のためには、ヘキサン抽出分画の肝障害抑制組成物を用いるのが好ましく、上記の肝障害抑制剤の用量と同じ分量で、同じ用法で投与すれば、マクロファージ活性化抑制を介した肝障害抑制効果を奏することができる。
本発明の肝障害抑制剤は、マクロファージ活性化抑制を介して、肝臓のクッパー細胞の炎症反応を抑えることにより肝障害を抑制するものであるので、例えば、薬物代謝能低下を防ぐ作用を有する肝障害改善薬や脂肪蓄積を減少させる作用を有する肝障害治療薬など、本発明の肝障害抑制組成物と異なる作用を有する肝障害改善薬や肝障害治療薬と組み合わせることによる肝障害抑制剤であってもよい。具体的には、本発明の肝障害抑制組成物と組み合わせることが可能なで、肝障害の治療に現在用いられている医療用製剤としては、肝水解物やインターフェロンのような生物学的製剤や、マロチラート、グルタチオン、グリチルリチンに代表される化学療法剤を上げることができ、これら薬剤との組合せで、肝障害用製剤としてもよい。
本発明において肝障害用製剤として経口的に投与する場合は、それに適用される錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤などの固形製剤、あるいは液剤、シロップ剤などの液体製剤等とすればよい。特に顆粒剤及び散剤は、カプセル剤として単位量投与形態とすることができ、液体製剤の場合は使用する際に再溶解させる乾燥生成物（例えば凍結乾燥品）にすることができる。
【００１７】
これら剤形のうち経口用固形剤は、組成物中に製剤上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有することができる。また、経口用液体製剤は、製剤上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有することができる。
本発明の組成物は、実施例中でその製造法を開示しているが、本明細書に開示された方法を修飾した方法を用いてもよく、その組成物のマクロファージ活性化抑制のための使用においては、その対象が培養細胞である場合、または動物個体である場合、その対象に応じて適宜、その活性化抑制の程度により、本発明の組成物量を調整することができる。
【００１８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
（実験１；エンサイの成分分析）
（試料）
栽培種の青軸エンサイはＳｅｒｍ Ｓｒｉ Ｓｅｅｄ社から入手した。また、野生種である赤軸エンサイはＡＶＲＤＣ（アジア蔬菜研究開発センター）から入手し、千葉大学園芸学部で選抜したものを用いた。それらのエンサイは日本大学生物資源科学部にてハウス栽培（最高室温：４０±５℃、最低室温：２０±５℃）された。エンサイは２００８年８から１０月の期間中、２から４週間毎に収穫され、収穫後凍結乾燥された。比較のためのホウレンソウは千葉県内のスーパーマーケットで購入したものを凍結乾燥した。
用いたエンサイおよびホウレンソウはすべて、凍結乾燥物をミキサーで粉砕し粉末状にしたものを用いた。凍結乾燥粉末はデシケーター中に遮光下で冷蔵保存した。
（１．総ポリフェノール含量）
７０％アセトンを用いてエンサイ中よりポリフェノールを抽出し、ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ法を用いてその含量を測定した。
【００２０】
（試薬）７０％アセトン（特級、和光純薬工業（株））、７５ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム溶液（特級、和光純薬工業（株））、ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬；ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬（ＳＩＧＭＡ（株））を蒸留水で２倍に希釈して用いた（測定当日作成）、クロロゲン酸標準液；クロロゲン酸（和光純薬工業（株））０．０１ｇを７０％アセトンに溶解し、５０ｍｌにメスアップして濃度０．２ｍｇ／ｍｌに調製した。この標準液を７０％アセトンで以下の表１に示した液量で希釈した。
【表１】
（測定手順）
試料０．０２ｇを試験管に秤取した（ｎ＝４）。次いで、７０％アセトン１０ｍｌを加え、試験管の上にビー玉を乗せて、６５℃で２０分間加温し、ポリフェノールの抽出操作を行った。この抽出液を遠心管に移し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）した。この上清を目盛り付き試験管に移して７０％アセトンで１０ｍｌに定容し、転倒混和した。
この試料０．２ｍｌまたは、各濃度の標準液０．２ｍｌを試験管に採取し、ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を０．２ｍｌ加え撹拌した。その後７５ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム１ｍｌを加え撹拌し、試験管の上にビー玉を乗せて５０℃で１５分間加温した。加温後氷冷し、吸光度（７６０ｎｍ）を測定した。
各濃度の標準液の吸光度から検量線を作成し、その近似式から試料１００ｇ乾燥重量あたりの総ポリフェノール含量（クロロゲン酸当量）を求めた。
【００２１】
（２．総アントシアニン含量）
アントシアニンは酸性で安定であることから、酸性溶媒を用いた抽出を行った。１％塩酸メタノールや５％ギ酸水溶液などをアントシアニン抽出溶媒に用いることが可能であるが、本実験では抽出時に脱アシル化などによるアントシアニン構造の変化が少ないトリフルオロ酢酸を用いた方法で行った。
（試薬）１％トリフルオロ酢酸水溶液（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））、アントシアニン標準液；塩化シアニジン（一級、和光純薬工業（株））５ｍｇを１％トリフルオロ酢酸水溶液１５．５ｍｌに溶解し、濃度１ｍＭに調製した。この標準液を段階希釈し、０、２５、５０、１００μＭの濃度の溶液を作成した。
（測定手順）
試料０．１ｇをプラスチックチューブに秤取した（ｎ＝４）。次いで１％トリフルオロ酢酸水溶液を５ｍｌ添加し、撹拌した。その後プラスチックチューブをローターに装着し、暗所・室温下で１６時間抽出を行い、遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）操作にて上清を得た。残渣には１％トリフルオロ酢酸水溶液を５ｍｌ添加し、撹拌後、再度遠心分離を行った。その上清を先に得た上清と合わせ、１％トリフルオロ酢酸水溶液で１０ｍｌに定容した。この抽出液が濁っていた場合は、１２０００ｒｐｍ程度で遠心し、清澄な抽出液を得た後、吸光度（５２０ｎｍ）を測定した。
各濃度の標準液の吸光度から検量線を作成し、その近似式から試料１００ｇ乾燥重量あたりの総アントシアニン含量（塩化シアニジン当量）を求めた。
【００２２】
（３．ＯＲＡＣ測定）
（試薬）ヘキサン（特級、和光純薬工業（株））、ジクロロメタン（特級、和光純薬工業（株））、アセトン（特級、和光純薬工業（株））、ＡＷＡ溶液；アセトン：水：酢酸（特級、和光純薬工業（株））＝７０：２９．５：０．５、ＦＬ（フルオレセイン）溶液；フルオレセインナトリウム塩（ＳＩＧＭＡ（株））を蒸留水に溶解し、濃度９４．４ｎＭに調製した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ；７５ｍＭリン酸水素二カリウム（特級、和光純薬工業（株）溶液：７５ｍＭリン酸二水素カリウム（特級、和光純薬工業（株）溶液＝５００：１５、ＡＡＰＨ溶液；ＡＡＰＨ（２，２’−Ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎ ａｍｉｄｉｎｅ）Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＳＩＧＭＡ（株））を使用直前にあらかじめ３７℃に加温したＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、濃度３１．７ｍＭに調製した。トロロックス（特級、和光純薬工業（株））
（測定手順）
（Ｈ（親水性）−ＯＲＡＣまたはＬ（疎水性）−ＯＲＡＣ用抽出液の調製）
試料１ｇにヘキサン：ジクロロメタン＝１：１（ｖ：ｖ）を１０ｍＬ加え、室温で３０秒間攪拌し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行い、上清と沈殿に分けた。この作業を２回行った。上清は、溶媒を窒素気流下で除去した後、アセトン１０ｍＬを加え攪拌、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、上清を回収するという作業を２回行い、アセトンで２５ｍＬに定容してＬ−ＯＲＡＣ用抽出液とした。上清を回収した後の沈殿は、窒素気流下で溶媒を除去した後、ＡＷＡ溶液を１０ｍＬ添加、３０秒間攪拌、超音波洗浄機を用いて氷冷下で５分間の超音波処理、室温で１０分間静置、室温で３０秒間攪拌、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、上清を回収するという作業を２回行い、ＡＷＡ溶液で２５ｍＬに定容して、Ｈ−ＯＲＡＣ用抽出液とした。それぞれの抽出液はＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで適度に希釈を行った。
（測定方法）
測定には９６ｗｅｌｌマイクロプレート、９６ｗｅｌｌマイクロプレート対応蛍光プレートリーダーを用いた。９６ｗｅｌｌマイクロプレートに、上記より得られた抽出液２０μＬ、ＦＬ溶液２００μＬを分注し、振盪攪拌後、蛍光強度（ｆ０ｍｉｎ）を測定した（ｆ０ｍｉｎ：測定開始０ｍｉｎの蛍光強度）。マイクロプレートを３７℃で１０分以上加温した後、ＡＡＰＨ溶液を７５μＬ加え、添加４分後から測定を開始した。測定間隔は２分、測定回数は最低４５回（９０分間）、検出波長はＥｘ．４８５ｎｍ付近、Ｅｍ．５２０ｎｍ付近で行った。また、ブランクにはＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ、標準物質にトロロックスを用いて検量線を作成し試料のＯＲＡＣ値をトロロックス当量として換算した。
（計算方法）
得られた各ウェルでの蛍光強度測定結果により、各試料のＡＵＣを算出した。ＡＵＣの計算は以下の通りである。
ＡＵＣ＝（０．５×ｆ８ｍｉｎ＋ｆ１ｏｍｉｎ＋ｆ１２ｍｉｎ＋ｆ１４ｍｉｎ＋・・・＋ｆｘ−１＋０．５×ｆｘ）／ｆｘｍｉｎ×２
得られたＡＵＣよりｎｅｔＡＵＣを算出した。ｎｅｔＡＵＣの計算方法は以下の通りである。
ｎｅｔＡＵＣｔｒｏｌｏｘ＝ＡＵＣｔｒｏｌｏｘ−ＡＵＣｂｌａｎｋ
ｎｅｔＡＵＣｓａｍｐｌｅ＝ＡＵＣｓａｎｐｌｅ−ＡＵＣｂｌａｎｋ
各トロロックス溶液のｎｅｔＡＵＣをＸ軸に、各トロロックス溶液の濃度（μＭ）をＹ軸にプロットしたグラフより二次回帰式を算出し、この回帰式より以下の数式（数１）からＯＲＡＣ値を算出した。
【数１】
【００２３】
（４．カロテノイド含量）
エンサイのβ−カロテンとキサントフィル含量を、高速液体クロマトグラフを用いて測定した。
（試薬）塩基性炭酸マグネシウム（一級、和光純薬工業（株））、テトラヒドロフラン（特級、和光純薬工業（株））、石油エーテル（特級、和光純薬工業（株））、塩化ナトリウム（特級、和光純薬工業（株））、無水硫酸ナトリウム（特級、和光純薬工業（株））、アセトニトリル（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））、メタノール（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））、ジクロロメタン（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））、ヘキサン（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））。
β−カロテン標準液；β−カロテン標準品（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））１０ｍｇを１００ｍｌのＨＰＬＣ溶離液（濃度組成：後述のグラジエント最終設定値）に溶解し、その標準液を段階希釈し、０．５、１、２、１０μｇ／ｍｌの濃度の溶液を作成した。
キサントフィル標準液；キサントフィル標準品（高速液体クロマトグラフ用、和光純薬工業（株））１ｍｇを１０ｍｌのＨＰＬＣ溶離液（濃度組成：後述のグラジエント最終設定値）に溶解し、その標準液を段階希釈し、１、２、５、１０μｇ／ｍｌの濃度の溶液を作成した。
（測定手順）
（試料の調製）
試料１ｇを秤量し乳鉢に取り、０．１ｇの炭酸マグネシウムと３０ｍｌ程度のテトラヒドロフランを加え摩砕し、ガラスフィルターでろ過した。残渣が無色になるまでこの操作を繰り返し（２回程度）、得られたろ液をテトラヒドロフランで１００ｍｌに定容した。そのろ液を分液漏斗に採取し、等量の石油エーテル、少量の塩化ナトリウム水溶液加え、石油エーテル層に転溶させた。下層の水溶液は蒸留水で洗浄し、石油エーテルを加えて着色層を回収した（２回程度）。回収した石油エーテル層に無水硫酸ナトリウムを加え脱水し、ガラスフィルターでろ過した後、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固させた。得られた抽出物に、１００ｍｌのＨＰＬＣ溶離液（濃度組成：後述のグラジエント最終設定値）を加えて溶解させ、メブレンフィルターでろ過した。
（ＨＰＬＣによる分析）
ろ液または標準液２０μｌをＨＰＬＣシステム（カラム：Ｘ Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム・粒子径５μｍ・４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：室温、モニター波長：４７０ｎｍ）に注入した。注入した試料は４種類の有機溶媒による溶離液組成（アセトニトリル：メタノール：ジクロロメタン：ヘキサン＝８５：１０：２．５：２．５）で１０分間溶離させ、その後３０分間で最終濃度（アセトニトリル：メタノール：ジクロロメタン：ヘキサン＝４４：１０：２３：２３）まで変化させる直線グラジエント設定で溶離させた。
（計算方法）
各濃度の標準液のピーク面積から検量線を作成し、その近似式から試料１００ｇ乾燥重量あたりのカロテノイド含量（β−カロテン、キサントフィル）を求めた。
（５．統計処理）
棄却検定後、各群の有意差検定をダンカンの多重比較で行い、５％以下の危険率で群間に有意差が認められると判断した。測定値は平均値±標準誤差で表した。
【００２４】
（結果）
結果を表２に示す。
青軸・赤軸エンサイおよび対照としてホウレンソウ中の総ポリフェノール含量（クロロゲン酸当量）を測定した結果、２系統の両エンサイの総ポリフェノール含量はホウレンソウよりも有意に高く、また赤軸エンサイは青軸エンサイに比べ有意に高い値を示した。
さらに、総アントシアニン含量（塩化シアニジン当量）を測定した結果、赤軸エンサイの総アントシアニン含量は、青軸エンサイまたホウレンソウよりも有意に高く、それらの３倍程度含まれていた。
エンサイの抗酸化能を調べるため、同試料のＯＲＡＣ値を測定した結果、疎水性抽出物のＯＲＡＣ（Ｌ−ＯＲＡＣ）については赤軸エンサイがホウレンソウに比べ有意に高値を示した。青軸エンサイは検出限界以下であったため測定できなかった。また、親水性抽出物のＯＲＡＣ（Ｈ−ＯＲＡＣ）および総ＯＲＡＣについては各試料に有意差は認められなかった。
【表２】
【００２５】
青軸・赤軸エンサイのカロテノイド含量（β−カロテン、キサントフィル）を測定した結果を表３に示す。β−カロテン含量については、赤軸エンサイは青軸エンサイに比べ２倍程度高かった。またキサントフィル含量については、赤軸エンサイは青軸エンサイに比べ３．５倍程度高かった。
【表３】
【００２６】
（実験２；肝障害モデルに対する影響）
（材料および方法）
１）エンサイのエタノール抽出物の調製
野生種の赤軸エンサイまたは栽培種の青軸エンサイは、実験１の試料の記載の通り、これらを収穫し、凍結乾燥後、ミキサーで粉砕しデシケーター中に遮光下で冷蔵保存した。
三角フラスコにエンサイ凍結乾燥サンプル（粉末）とその２０倍量の８０％エタノール（特級、和光純薬工業（株））を加え、振盪しながら８０℃で３時間加温した。次いで遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行い、上清をメンブレンフィルターでろ過した。ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮し、その後凍結乾燥を行い粗抽出物を得た。その粗抽出物を０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）（化学用、和光純薬工業（株））に溶解し、後述の濃度に従って調製した。
２）実験動物
５週齢のＩＣＲ系雄マウス（日本ＳＬＣ（株））を用いた。予備飼育期間中は固形飼料（ＣＥ−２日本クレア（株））を与え、その後平均体重が等しくなるように群分けした（ｎ＝３−６）。固形資料の組成（日本クレアのホームページより）を表４に示す。
【表４】
【００２７】
飼育期間中、マウスは識別用染料で印を付け区別し、１つのプラスチック製マウス用ケージにつき３から６匹ずつ入れ飼育した。ケージにはソフトチップ（日本ＳＬＣ（株））を敷き、２日に一度掃除しチップを交換した。飲料水は水道水を自由摂取させ、２日に一度入れ替えた。１２時間の明暗サイクル、室温２２度±２℃で飼育した。
３）エンサイの経口投与用、８０％エタノールまたはヘキサン抽出物の調製
（試薬）８０％エタノール（特級、和光純薬工業（株））、ｎ−ヘキサン（特級、和光純薬工業（株））、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）（化学用、和光純薬工業（株））；ＣＭＣ０．５ｇに蒸留水１００ｍｌを加え、ガラス棒でダマ状のＣＭＣを砕いた後マグネットスターラーを用いて溶解した。
（８０％エタノール抽出物の調製）
三角フラスコに試料とその２０倍量の８０％エタノールを加え、振盪しながら８０℃で３時間加温した。次いで遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行い、上清をメンブレンフィルターでろ過した。ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮し、その後凍結乾燥を行い粗抽出物を得た（試料が少量の場合は、ろ液を５０ｍｌプラスチックチューブに移し、濃縮遠心機を用いて粗抽出物を得た）。その粗抽出物を０．５％ＣＭＣに溶解し、後述の濃度（χｍｇ／１０ｍｌ／ｋｇ体重）に従って調製した。
（８０％エタノール抽出物のヘキサン画分）
前述の方法で得た８０％エタノール抽出物を、エンサイ試料の２倍量程度の水と等量のヘキサンに溶解し、分液漏斗にて分画した。下層（水層）をいったんビーカーに注ぎ、上層（ヘキサン層）を回収した。その後再び水層と等量のヘキサンを分液漏斗に採取し、上層の緑色がほぼ無色になるまでこの操作を繰り返した（６回程度）。回収した水層とヘキサン層を凍結乾燥機または濃縮遠心機を用いて濃縮乾固し、得られた抽出物を０．５％ＣＭＣに溶解し、後述の濃度（χｍｇ／１０ｍｌ／ｋｇ体重）に従って調製した。
【００２８】
４）四塩化炭素の調整
四塩化炭素の調製・投与に用いる器具（ガラス瓶、ガラスピペット）をオートクレーブ（１２１℃、２０分間）にかけた。ドラフト内で、ゴム手袋を着用して、四塩化炭素（精密分析用、和光純薬工業（株））とオリーブ油（和光純薬工業（株））を後述の割合に従って調整した。
５）肝障害モデルに対する赤軸エンサイの各画分経口投与の影響
ａ）肝障害マーカー、血清トランスアミナーゼおよび肝臓ＴＢＡＲＳ濃度に対する影響マウスを予備飼育後、以下のように群分けした。
Ａ．無処理群 （ｎ＝３）
Ｂ．四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｃ．赤軸エンサイエタノール抽出物：１００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｄ．赤軸エンサイエタノール抽出物：５００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
群分け後、ＡからＤ群には２日間固形飼料を摂取させ、３、４、５日目にＡ、Ｂ群には０．５％ＣＭＣを、ＣからＤ群には上記の８０％エタノール抽出物それぞれ経口投与した。最終投与の２時間後にＢからＤ群には四塩化炭素（四塩化炭素：オリーブ油＝１：１、０．５ｍｌ／ｋｇ ｂ．ｗ．）を、またＡ群には等量のオリーブ油を腹腔内投与し、その２４時間後に解剖を行った。四塩化炭素の投与前後４時間絶食させた。
（解剖）
四塩化炭素投与の２４時間後にマウスを順に麻酔し、解剖を行った。麻酔は、ペントバルビタールナトリウムを濃度が５０ｍｇ／ｍｌになるように蒸留水で調製し、０．２μｍ滅菌シリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理したものを０．１３ｍｌ／１００ｇ体重の割合で腹腔内投与することによって行った。開腹後、心臓から採血し、肝臓を採取した。肝臓はＴＢＡＲＳ測定用のものを切り分けた後アルミホイルで包み、−２０℃フリーザーで保存した。ただし肝臓中ＴＢＡＲＳに関しては、即日測定する必要があるため、解剖終了後すぐにホモジネートし当日または翌日に測定を行った。採取した血液は遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）後、血清を採取し測定まで−２０℃で保存した。
【００２９】
（測定項目及び方法）
（１）血清中トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）活性の測定
解剖時に得られた血清における、ＧＯＴ、ＧＰＴの活性をトランスアミナーゼ ＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業（株））を用いて測定した。血清は、四塩化炭素無処理群は５倍、四塩化炭素投与群は３０倍に希釈したものを測定した。
（２）肝臓中ＴＢＡＲＳの測定
生体内過酸化脂質の測定法として主に用いられているＴＢＡ（チオバルビツール酸）法によりＴＢＡＲＳを測定した。
（試薬）１．１５％ＫＣｌ溶液（和光純薬工業（株））、５％ＢＨＴ／メタノール溶液；ＢＨＴ（和光純薬工業（株））１ｇをメタノール（特級、和光純薬工業（株））２０ｍｌに溶解し５％ＢＨＴ／メタノール溶液とした。２０％酢酸溶液（ｐＨ３．５）；酢酸（一級、和光純薬工業（株））２０ｍｌで１００ｍｌ調製した。３０％水酸化ナトリウム（特級、和光純薬工業（株））で、ｐＨメーターを用いてｐＨ３．５に合わせた。８．１％ＳＤＳ溶液（生化学用、和光純薬工業（株））、０．８％ＴＢＡ溶液（用事調製）；ＴＢＡ（２−チオバルビツール酸；特級、和光純薬工業（株））０．８ｇを蒸留水に溶解し、１００ｍｌに定容した。溶けにくいため湯浴にて溶解した。ｎ−ブタノール：ピリジン（１５：１）溶液；ピリジン（特級、和光純薬工業（株））２０ｍｌをｎ−ブタノール（特級、和光純薬工業（株））３００ｍｌに溶解した。調製はドラフト内で行った。ＴＥＰ標準液；ＴＥＰ（１，１，３，３，−１テトラエトキシプロパン；生化学用、和光純薬工業（株））１１０ｍｇ（約１２３μｌ）を、メタノールで５０ｍｌに定容した。十分に撹拌した後１ｍｌを採取し、さらにメタノールで１００ｍｌに定容し、１００ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度に調製した。これを希釈原液とし、以下の表５に示したようにメタノールで希釈した。
【表５】
【００３０】
（測定手順）
解剖時に切り取った肝臓０．５ｇに、１．１５％ＫＣｌ溶液４．５ｍｌと５％ＢＨＴ溶液１０μｌを加え氷上でホモジナイズした。ホモジナイザーは一回のホモジナイズ毎に蒸留水で洗浄し、キムワイプで軽く拭いてから次のホモジナイズへと移った。ホモジネート液は共栓付き試験管に移した。全ての肝臓を解剖直後にホモジナイズし、氷を入れた発泡スチロール箱に入れて、翌日測定を行う場合は低温室で保存した。
ホモジネート液をよく撹拌し、０．２ｍｌをプラスチックチューブに取り氷上に置いた。同じく各濃度の標準液と、ブランクには蒸留水をそれぞれ０．２ｍｌずつ分注した。次に８．１％ＳＤＳ溶液を０．２ｍｌ、２０％酢酸溶液（ｐＨ３．５）を１．５ｍｌ加えよく撹拌し、さらに蒸留水を０．６ｍｌ加えた。続いて０．８％ＴＢＡ溶液を１．５ｍｌ加え撹拌し、ふたを軽く閉め、９５℃で６０分間加温した。加温後氷水中で急冷し、蒸留水１ｍｌを加えた。ｎ−ブタノール：ピリジン（１５：１）溶液を５ｍｌ加え、手で上下に激しく振った。遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）後、上層の吸光度（５３２ｎｍ）をガラスセルを用いて測定した。セル誤差補正はｎ−ブタノールで行った。
各濃度の標準液の吸光度から検量線を作成し、近似式からホモジネート液０．２ｍｌ中のＴＢＡＲＳ量を算出して、その値から肝臓ｇ組織あたりのＴＢＡＲＳ量を求めた。
（統計処理）
棄却検定後、各群の有意差検定をダンカンの多重比較で行い、５％以下の危険率で群間に有意差が認められると判断した。測定値は平均値±標準誤差で表した。
【００３１】
（結果）
結果を図２に示す。血清トランスアミナーゼ活性については、四塩化炭素のみ投与群は無処理群に対して有意に上昇し、その活性は赤軸エンサイ８０％エタノール抽出物：１００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）投与によって低下する傾向を示した。肝臓ＴＢＡＲＳ値については全ての群間に有意差は見られなかった。
そこで、赤軸エンサイ８０％エタノール抽出物の１００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）近傍の用量をさらに検討した。
【００３２】
ｂ）肝障害マーカー、血清トランスアミナーゼおよび肝臓ＴＢＡＲＳ濃度に対する影響（低用量投与群）
マウスを予備飼育後、以下のように群分けした。
Ａ．無処理群 （ｎ＝４）
Ｂ．四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｃ．赤軸エンサイエタノール抽出物：２５（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｄ．赤軸エンサイエタノール抽出物：５０（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｅ．赤軸エンサイエタノール抽出物：１００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｆ．赤軸エンサイエタノー粗抽出物：２００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
赤軸エンサイの８０％エタノール抽出物の用量以外は上記ａ）の実験と同じ条件で行い、測定等も同様に行った。
（結果）
結果を図３に示す。四塩化炭素のみ投与群は無処理群に対してＧＯＴ活性（ＡＳＴ）が有意に上昇したが、その活性は赤軸エンサイの８０％エタノール粗抽出物：１００および２００（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）投与によって有意に低下した。
なお、８０％エタノール抽出物のヘキサン画分並びに水画分につき、以下のような群で同様に実験を行ったが、いずれの投与群でも血清トランスアミナーゼ活性および肝臓ＴＢＡＲＳ濃度に有意な差は見られなかった。（データー示さず）
Ａ．無処理群 （ｎ＝３）
Ｂ．四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｃ．赤軸エンサイ水画分抽出物：５（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｄ．赤軸エンサイ水画分抽出物：１０（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｅ．赤軸エンサイ水画分抽出物：２０（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｆ．赤軸エンサイヘキサン画分抽出物：５（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｇ．赤軸エンサイヘキサン画分抽出物：１０（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
Ｈ．赤軸エンサイヘキサン画分抽出物：２０（ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）＋四塩化炭素投与群 （ｎ＝６）
【００３３】
（実験３；ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞を用いた、赤軸エンサイ抽出物のマクロファージ活性化に与える影響）
ＲＡＷ２６４．７は、リポ多糖（ＬＰＳ）で処理することにより活性化され、炎症性因子である一酸化窒素（ＮＯ）産生が著しく促進される。エンサイ抽出物をＬＰＳで活性化させたＲＡＷ２６４に添加し、ＮＯ産生量を測定することで、マクロファージ活性化に与える影響をみた。
（方法）
１）実験材料
ＲＡＷ２６４．７細胞（理化学研究所、Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋより入手）
ＲＡＷ２６４．７細胞培養用培地は、ダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」（日水製薬（株））に非動化した１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、１％ＰＮ／ＳＭ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ（株））
赤軸エンサイエタノール抽出物、並びに赤軸エンサイ水画分・ヘキサン画分抽出物は、実験２に記載されたものを用いた。
赤軸エンサイヘキサン画分−ＨＰＬＣ画分抽出については、上記赤軸エンサイヘキサン画分抽出物をヘキサンで溶解し、濃度１００ｍｇ／ｍｌに調製した。これを、ＨＰＬＣシステム（カラム：Ｘ Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム・粒子径５μｍ・４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ガードカラム：Ｘ Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム・粒子径５μｍ・４．６ｍｍ×２０ｍｍ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：室温、モニター波長：２８０ｎｍ）に２００μｌ注入した。注入した試料は組成（０．１％ギ酸（和光純薬工業（株））−アセトニトリル溶液：０．１％ギ酸（超純水で溶解）＝３：７）の溶離液で溶離させ始め、その後１時間で最終濃度（０．１％ギ酸−アセトニトリル溶液：１００％）まで変化させる直線グラジエント設定で溶離させた。分画サンプルは、フラクションコレクターを用いて１分間に１ｍｌの容量で６０本のエッペンチューブに採取した。その後濃縮遠心機で濃縮乾固し、分画物を得た。この操作を５回繰り返し、５回分の分画物に２０μｌのＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（生化学用、和光純薬工業（株））を加えよく撹拌して溶解した。
２）細胞処置
ＲＡＷ２６４．７細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように２４ｗｅｌｌプレートに播種し（ｎ＝４）、５％ＣＯ２、３７℃下で６時間培養した。６時間後無血清培地にＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）とエンサイ抽出物を０．１％加え、５００μｌ／ｗｅｌｌで添加した。２４時間培養した後、培養上清を回収し、ＮＯ産生量を測定した。
３）ＮＯ産生測定
（試薬）試薬Ａ：０．２％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩；Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（特級、和光純薬工業（株））０．１ｇを蒸留水５０ｍｌに溶解した。試薬Ｂ：２％スルファニルアミド＋１０％リン酸スルファニルアミド（Ｓｉｇｍａ（株））１ｇとリン酸（特級、和光純薬工業（株））５ｍｌを蒸留水４５ｍｌに溶解した。亜硝酸ナトリウム標準液；亜硝酸ナトリウム（特級、和光純薬工業（株））を蒸留水で溶解し、その標準液を段階希釈し、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００μＭの濃度の溶液を作成した。
（測定手順）
細胞処置で得た培養上清または亜硝酸ナトリウム標準液を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１００μｌずつ入れた（ｎ＝４）。次いで、試薬Ａと試薬Ｂを１：１で混合し、混合液を１００μｌずつ加えた後、吸光度（５５０ｎｍ）を測定した。
４）統計処理
一元配置分散分析後、各群の有意差検定をチューキーの多重比較で行い、５％以下の危険率で群間に有意差が認められると判断した。測定値は平均値±標準誤差で表した。
【００３４】
（結果）
ＬＰＳのみ投与群は無処理群に対してＮＯ産生量が有意に上昇し、その活性は赤軸エンサイエタノール抽出物：１００μｇ／ｍｌ以上の添加によって有意に低下した（図４）。
同条件において、赤軸エンサイの水画分については、ＬＰＳ投与群は無処理群に対してＮＯ産生量が有意に上昇したが、ＬＰＳ投与群と抽出物投与群の間に有意差は見られなかった（図５）。
同条件において赤軸エンサイのヘキサン画分がＮＯ産生量におよぼす影響について調べた結果、ＬＰＳのみ投与群は無処理群に対してＮＯ産生量が有意に上昇し、その活性は赤軸エンサイヘキサン画分：５０μｇ／ｍｌ以上の添加によって有意に低下した（図６）。
さらに、赤軸エンサイＨＰＬＣ分画画分がＮＯ産生量におよぼす影響について調べた。その結果、ＬＰＳのみ投与群は無処理群に対してＮＯ産生量が上昇し、その活性は赤軸エンサイＨＰＬＣ分画画分のＦｒ．４１−５４（アセトニトリル濃度：７７−９３％）の部分、比較的低極性を示すような画分で顕著な低下が見られた（図７）。
【００３５】
これらの実験から、赤軸エンサイの８０％エタノール抽出分画やヘキサン抽出分画が、肝障害抑制の生理作用を示し、その作用は、マクロファージ活性化抑制によるものであった。さらにヘキサン分画の比較的低極性の分画がその活性をしめすことから、赤軸エンサイのヘキサン抽出画分の脂溶性の高い分画が、マクロファージ活性化抑制作用を強力に有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の肝障害抑制剤は、植物由来の新しいマクロファージ活性化抑制作用による肝マクロファージの抗炎症効果を発揮することから、赤軸エンサイ由来の脂溶性の高い分画として医薬組成物としての利用が可能である。さらに、従来の肝障害予防、乃至は肝障害治療薬物との合剤的利用も可能であり、経口投与によりその効果を発揮できるすぐれた肝障害抑制組成物であり肝障害抑制剤である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出を行った分画からなる、肝障害抑制組成物。
【請求項２】
赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出または８０％エタノール抽出を行った分画からなる、肝障害抑制組成物。
【請求項３】
赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出を行った分画からなる、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤。
【請求項４】
赤軸系のエンサイより８０％エタノール抽出を行った分画からなる、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤。
【請求項５】
赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物を含有する、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤。
【請求項６】
赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンまたは８０％エタノールで抽出操作を行い、ヘキサン分画または８０％エタノール分画を分取した組成物を含有する、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤。
【請求項７】
赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物を得ることを特徴とする、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤の製造法。
【請求項８】
前記のヘキサン分画から、さらに脂溶性の高い分画を分取した組成物を得ることを特徴とする、請求項７記載のマクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤の製造法。
【請求項９】
赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物の、マクロファージ活性化抑制のための使用。
【請求項１０】
前記のヘキサン分画から、さらに脂溶性の高い分画を分取した組成物の、請求項９記載のマクロファージ活性化抑制のための使用。
【請求項１】
赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出を行った分画からなる、肝障害抑制組成物。
【請求項２】
赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出または８０％エタノール抽出を行った分画からなる、肝障害抑制組成物。
【請求項３】
赤軸系のエンサイよりヘキサン抽出を行った分画からなる、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤。
【請求項４】
赤軸系のエンサイより８０％エタノール抽出を行った分画からなる、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤。
【請求項５】
赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物を含有する、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤。
【請求項６】
赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンまたは８０％エタノールで抽出操作を行い、ヘキサン分画または８０％エタノール分画を分取した組成物を含有する、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤。
【請求項７】
赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物を得ることを特徴とする、マクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤の製造法。
【請求項８】
前記のヘキサン分画から、さらに脂溶性の高い分画を分取した組成物を得ることを特徴とする、請求項７記載のマクロファージ活性化抑制作用を有することを特徴とする肝障害抑制剤の製造法。
【請求項９】
赤軸系のエンサイを凍結乾燥し、粉砕後粉末とし、それをヘキサンで抽出操作を行い、ヘキサン分画を分取した組成物の、マクロファージ活性化抑制のための使用。
【請求項１０】
前記のヘキサン分画から、さらに脂溶性の高い分画を分取した組成物の、請求項９記載のマクロファージ活性化抑制のための使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−１１１７３９（Ｐ２０１２−１１１７３９Ａ）
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７４０６２（Ｐ２０１０−２７４０６２）
【出願日】平成２２年１１月１９日（２０１０．１１．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年５月２１日に社団法人日本栄養・食糧学会により発行された「第６４回日本栄養・食糧学会大会」の講演要旨集の第２４７頁に記載
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１９日（２０１０．１１．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年５月２１日に社団法人日本栄養・食糧学会により発行された「第６４回日本栄養・食糧学会大会」の講演要旨集の第２４７頁に記載
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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