カブトガニβ−１，３−グルカン認識タンパク質の認識ドメインを使用した真菌検出法、および当該認識ドメインを含む組換えタンパク質の精製法
【課題】サンプル中の未知のプロテアーゼ活性阻害剤等の影響を受けることなく、高い精度でかつ広いスペクトルで真菌の存在量を定量化することのできる方法を開発することを課題とする。
【解決手段】本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を含む真菌検出用キットおよび真菌検出方法を提供する。
【解決手段】本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を含む真菌検出用キットおよび真菌検出方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を含む真菌検出用キットに関する。
【０００２】
また、本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を試料と接触させる工程を含む、真菌を検出する方法に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
自然免疫は、動植物に共通して見られる免疫系で、脊椎動物を除いた多細胞生物には獲得免疫はなく、自然免疫のみで感染を防御している。自然免疫系で働くタンパク質が、感染微生物を見分ける際に標的とする物質（非自己として認識する物質）は、感染微生物の細胞壁に存在するリポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、あるいはβ−１，３−グルカンと呼ばれる成分である。自然免疫系の異物認識タンパク質は、ＬＰＳやＰＧＮ、β−１，３−グルカンなどが作り出す分子パターンを認識すると考えられている（パターン認識説）。これら細胞壁成分は遺伝子の直接産物のタンパク質ではなく、複雑な酵素反応の連鎖により作られる糖鞘や脂質、あるいはそれらが複雑に結合したのもので、微生物自身の生存に不可欠な成分であり、容易に構造変化させることはできない。したがって、自然免疫系の異物認識がこれらの物質を標的としていることは、大変優れた生体防御戦略といえる。
【０００５】
哺乳動物や節足動物においては、真菌の表層成分であるβ−１，３−グルカンを認識することで一連の生体防御反応が誘導される（非特許文献１）。現在までに、無脊椎動物や昆虫において、多くのβ−１，３−グルカン認識タンパク質が同定されているが（非特許文献２−７）、カブトガニでは、１９８１年には、すでに血球抽出液中にβ−１，３−グルカン感受性プロテアーゼ（ファクターＧ）が報告された（非特許文献８，９）。プロテアーゼ前駆体であるファクターＧは、β−１，３−グルカンを認識することで、自己触媒的にプロテアーゼ活性を発現する（非特許文献１０，１１）。ファクターＧは、構造的には、αサブユニット（７２ｋＤａ）とβサブユニット（３７ｋＤａ）から構成され、非共有結合で二量体を形成している。αサブユニットは６５４アミノ酸残基で、１つのβ−１，３−グルカナーゼＩＡ１様ドメインと３つのキシラナーゼＡ様ドメイン（Ａｌ，２，３）、さらに２つのキシラナーゼＺ様ドメイン（Ｎ末端側よりＺ１とＺ２）の合計６つのドメインから構成されている（非特許文献１２）。一方、βサブユニットは、プロテアーゼドメインのみを含む。
【０００６】
精製されたファクターＧは、β−１，３−グルカン存在下で自己活性化するが、リボ多糖、スルファチド、コレステロールサルフェート、ヘパリン、コンドロイチンサルフェートＡ、Ｂなどでは活性化しない（非特許文献１３）。ファクターＧを最も効率的に活性化するものは、直鎖状のβ−１，３−グルカンであるカードランとパラミロンであり、１ナノグラムのカードランでファクターＧを活性化することができる。ファクターＧのキシラナーゼＺ様ドメインが、β−１，３−グルカン認識に重要であることが判明している（非特許文献１４）。カブトガニ血球細胞の抽出液は、すでにエンドトキシン（ＬＰＳ）やβ−１，３−グルカンの検出に応用されている。その原理は、カブトガニの血球抽出液中のファクターＣがリボ多糖を、ファクターＧがβ−１，３−グルカンを認識して引き起こされるプロテアーゼ活性化の連鎖反応（カスケード反応）を利用し、最終的に活性化される凝固酵素のプロテアーゼ活性を発色ペプチド基質により定量できることに基づいている。カブトガニの血球抽出液によるβ−１，３−グルカン検出の際には、リポ多糖によるファクターＣの活性化を抑えることにより、ファクターＧによるカスケード反応を使用している。したがって、測定資料中にプロテアーゼ活性を阻害する物質や色素の混入が判定に支障をきたすため、検査資料の前処理が検出感度や判定に大きな悪影響をおよぼす。
【０００７】
また、真菌に対する抗体を用いる方法や、特定の真菌に特異的な遺伝子中の配列に基づくＰＣＲにより真菌を検出することも知られている。しかしながら、このような方法では特定の種類の真菌を検出することは可能であるが、真菌類全般に高いスペクトルで検出することは不可能である。
【０００８】
このような状況から、サンプル中の未知のプロテアーゼ活性阻害剤等の影響を受けることなく、高い精度でかつ広いスペクトルで真菌の存在量を定量化することのできる方法が希求されていた。
【非特許文献１】S. Barmicki-Garcia, Annu. Rev. Microbial. 22 (1968) 87-108.
【非特許文献２】K. Soderhall et al, Insect Biochem. 18 (1988) 323-330.
【非特許文献３】M. Ochiai et al, J. Biol. Chem. 263 (1988) 12056-12062.
【非特許文献４】B. Duvic et al, J. Biol. Chem. 265 (1990) 9327-9332.
【非特許文献５】B. Duvic et al, J. Crustacean Biol. 13 (1993) 403-408
【非特許文献６】C. Ma et al, J. Biol. Chem. 275 (2000) 7505-7514.
【非特許文献７】R. Zhang et al, J. Biol. Chem. 278 (2003) 42072-42079.
【非特許文献８】T. Morita et al, FEBS Lett. 129 (1981) 318-321.
【非特許文献９】A. Kakinuma et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101 (1981) 434-439.
【非特許文献１０】S. Iwanaga et al, Thromb. Haemostasis 70 (1993) 48-55.
【非特許文献１１】N. Seki et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 1370-1374.
【非特許文献１２】S. Kawabata et al, New directions in invertebrate immunology, SOS publications, New Jersey, 1996, pp. 255-283.
【非特許文献１３】T. Muta et al, J. Biol. Chem. 270 (1995) 892-897.
【非特許文献１４】Y. Takaki et al, J. Biol. Chem. 277 (2002) 14281-14287.
【非特許文献１５】G. R. Gray, Methods in Enzymol. 50 (1978) 155-160.
【非特許文献１６】C. M. G. A. Fontes et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49 (1998) 552-559.
【非特許文献１７】J. L. Henshaw et al, J. Biol. Chem. 279 (2004) 21552-21559.
【非特許文献１８】V. M. R. Pires et al, J. Biol. Chem. 279 (2004) 21560-21568.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、カブトガニの血球細胞に存在して、カビなどの真菌の細胞壁成分であるβ−１，３−グルカンを特異的に認識するファクターＧの構造機能解析を進めてきた。本発明では、ファクターＧ αサブユニットのβ−１，３−グルカン認識ドメインを有する組換えタンパク質を利用することで、真菌検出用キットおよび真菌を検出する方法を開発することを課題とする。これにより、これまでの特異的な抗体やＰＣＲを利用した特定の真菌に対する検出ではなく、真菌に特徴的な細胞壁成分であるβ−１，３−グルカンをターゲットにすることで、未知の微生物が混在する検査資料の中から真菌のみを迅速かつ簡便に検出することが可能になる。
【００１０】
また、本発明では、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究に努めた結果、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を使用して真菌を検出するに至り、本発明を想到した。
【００１２】
具体的には、本発明者らは、図１に示すようなファクターＧ αサブユニットのＺ２ドメインを１、２または４含む組換えタンパク質（Ｚ２、２Ｒ−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２およびＥＧＦＰ−Ｚ２）を生成し、表面プラズモン共鳴センサーを用いることにより、当該タンパク質がβ−１，３−グルカンに結合することを発見した。
【００１３】
また、本発明者らは、Ｚ２ドメインとＥＧＦＰドメインを融合した組換えタンパク質を用いることにより、当該タンパク質が真菌のみに結合し、グラム陽性菌および陰性菌には結合しないことを蛍光顕微鏡下で観察した。
【００１４】
さらに、本発明者らは、蛍光標識された微生物（大腸菌、黄色ブドウ球菌、出芽酵母）を用いることにより、Ｚ２、２Ｒ−Ｚ２および４Ｒ−Ｚ２が出芽酵母は凝集するが、一方、大腸菌および黄色ブドウ球菌は凝集しないことを発見した。
【００１５】
またさらに、本発明者らは、Ｚ２およびＥＧＦＰ−Ｚ２タンパク質が、酵母菌体およびカードランにより精製されることを見いだした。
本発明はこのように、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質が、β−１，３−グルカンに結合可能であり、その結果、真菌に結合可能であるという知見により想到されたものである。本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
【００１６】
本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を含む、真菌検出用キットを提供する。
【００１７】
本発明の好ましい態様において、前記ドメインは、以下の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたいずれかのアミノ酸配列を有する：
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）（ｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２；または、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００１８】
さらに好ましい態様において、前記ドメインは、配列番号２の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されており、そして以下のアミノ酸残基において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列を有する：
（１）１番目のグリシン
（２）２番目のアルギニン
（３）３番目のアルギニン
（４）４番目のアスパラギン
（５）１５番目のセリン
（６）１６番目のチロシン
（７）１８番目のグルタミン酸
（８）２５番目のロイシン
（９）３７番目のリジン
（１０）５４番目のセリン
（１１）５７番目のバリン
（１２）８６番目のイソロイシン
（１３）９２番目のロイシン
（１４）１０１番目のイソロイシン
（１５）１０６番目のロイシン
（１６）１１７番目のリジン
（１７）１２６番目のアルギニン、および
（１８）１３０番目のバリン。
【００１９】
より好ましい態様において、前記ドメインは配列番号３のアミノ酸配列を有する。
さらにより好ましい態様において、前記ドメインは１ないし４つ含まれる。また、前記タンパク質が結合するβ−１，３−グルカンはトリオース以上の多糖である。さらに、前記タンパク質は検出用ドメインをさらに含む。
【００２０】
また、本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法であって、前記タンパク質をβ−１，３−グルカンを含む担体と接触させる工程を含む前記方法を提供する。
【００２１】
好ましい態様において、担体に含まれるβ−１，３−グルカンはトリオース以上の多糖である。
さらに好ましい態様において、担体はカードランおよび／またはラミナリンを含む担体である。
【００２２】
さらに本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法であって、前記タンパク質を真菌と接触させる工程を含む前記方法を提供する。
【００２３】
好ましい態様において、真菌は酵母である。
（１）真菌検出用キットおよび真菌検出法
本発明は、真菌検出用キットおよび真菌検出方法を提供する。本発明の真菌検出用キットは、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を含む。同様に、本発明の真菌検出方法は、該タンパク質を試料と接触させる工程を含む。
【００２４】
カブトガニのファクターＧは、背景技術の項に記載したように、１９８１年にはすでに報告されている（非特許文献８，９）。これまでにファクターＧのαサブユニットのアミノ酸配列は公知になっており、例えばＮＣＢＩのような公のデータベースより入手することが可能である。ファクターＧのαサブユニットのアクッセション番号はＢＡＡ０４０４４であり、当該配列からシグナルペプチドを除いた配列は、本明細書の配列番号４によっても開示される。
【００２５】
これまでに、ファクターＧのαサブユニットのドメイン構造も公知となっており（非特許文献１２）、Ｎ末端側から、１つのβ−１，３−グルカナーゼＩＡ１様ドメイン（Ｇｌｎ Ａ１）、３つのキシラナーゼＡ様ドメイン（Ｘｌｎ Ａ：Ｎ末端側よりＡ１、Ａ２およびＡ３）、並びに２つのキシラナーゼＺ様ドメイン（Ｘｌｎ Ｚ：Ｎ末端側よりＺ１およびＺ２）を有する。これらのドメインのうち、Ｘｌｎ Ｚ１およびＺ２がβ−１，３−グルカンを認識する部位であることが判明している。例えば、野生型Ｘｌｎ Ｚ１ドメインのアミノ酸配列は配列番号４の３８７−５１６のアミノ酸配列からなり（配列番号１）、野生型Ｘｌｎ Ｚ２ドメインのアミノ酸配列は５２５−６５４のアミノ酸配列からなる（配列番号２）。
【００２６】
しかしながら、本発明において使用可能なＸｌｎ Ｚ１およびＺ２ドメインは、これらの配列と同一のものではなく、少なくともＺ１およびＺ２ドメインに存在するそれぞれ１つのシステイン残基が他のアミノ酸に置換されている。これは、システイン残基が置換されていないＺ１またはＺ２ドメインを１ないし複数含む組換えタンパク質を作成すると、タンパク質の分子間でのジスルフィド結合の形成、または分子内でのジスルフィド結合の形成によりβ−１，３−グルカンに対する結合活性が著しく低下するという、本発明で初めて見いだされた知見に基づく。したがって、本発明においては、Ｚ１またはＺ２ドメイン中のシステイン残基は他のアミノ酸残基に置換されている。好ましい態様においては、システイン残基は、タンパク質全体の立体構造に影響の少ないアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミンに、より好ましくはアラニンに置換されている。このようなアミノ酸残基の置換は、当該タンパク質をコードする塩基配列に、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（２００１）等に記載の、部位特異的突然変異誘発法を使用して、容易に導入することが可能である。
【００２７】
β−１，３−グルカンとは、Ｄ−グルコースがβ−１，３−グリコシド結合により結合した多糖のことである。本発明における組換えタンパク質がβ−１，３−グルカンとの結合可能か否かは、当該技術分野で周知のいずれの技術を使用して決定してよい。このような方法としては、例えばビアコアを用いた表面プラズモン共鳴センサーにより結合解離定数を求めることを含む。表面プラズモン共鳴の具体的な方法は、ビアコア社の取り扱い説明書により実行することが可能であり、例えば本明細書の実施例３のような方法により行われる。また他に、β−１，３−グルカンとタンパク質が結合可能かどうかを決定する方法としては、例えば、カードラン等のβ−１，３−グルカンを混ぜて吸着したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で検出する方法等が公知である。しかしながら、これに限定される訳ではない。β−１，３−グルカンとタンパク質が結合可能とは、例えば結合定数が、１０４以上、好ましくは１０５以上、より好ましくは１０６以上あることをいう。また、β−１，３−グルカンとタンパク質が結合可能性を解離定数で表すことも可能であり、結合可能とは、１０−４以下、好ましくは１０−５以下、より好ましくは１０−６以下であることをいう。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、本発明で使用されるカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインは、以下の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたいずれかのアミノ酸配列を有する：
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）（ｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２；または、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００２９】
ここで、配列番号１は、カブトガニの野生型ファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインのアミノ酸配列を示す。また、配列番号２は、カブトガニの野生型ファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ２ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
しかしながら、本発明で使用可能なカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインまたはＺ２ドメインに由来するドメインは、配列番号１および配列番号２において、システイン残基が他のアミノ酸に置換された配列に限定される訳ではない。即ち、β−１，３−グルカンに結合可能であれば、上記アミノ酸配列に対し、１つまたは数個の欠失、置換、および／または付加を有するドメイン、または８０％以上の同一性を有するドメインもまた、本発明においては使用可能である。
【００３１】
本発明においては、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインまたはＺ２ドメインに由来するドメインのアミノ酸の１つまたは数個の置換は、好ましくは保存的置換により行われる。ここで保存的置換とは、あるアミノ酸残基が生物学的に類似した特性を持つアミノ酸残基に置換されることをいう。保存的置換の例は、１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａ）を別の脂肪族残基に置換すること、１つの極性残基を別の極性残基に置換すること（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎ間で置換すること）、または１つの芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒ）を別の芳香族残基に置換することを含む。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。
【００３２】
「数個」とは、限定される訳ではないが、例えば２０個、好ましくは１８個、さらに好ましくは１５個、より好ましくは１０個、さらにより好ましくは５個をいう。
また本発明の別の好ましい態様において、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインまたはＺ２ドメインに由来するドメインは、β−１，３−グルカンに結合可能であり、それぞれ配列番号１または２に８０％以上の同一性を有し、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。 アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＳおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００３３】
当業者に用いられる配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００３４】
上記のように、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよびＺ２ドメインの配列は公知であり、配列番号１および２にそれぞれ示される。この２つのドメインは非常に同一性が高く、それぞれ全長１３０アミノ酸のうちアミノ酸残基が異なるのは１８個にすぎない。この１８個のアミノ酸とは、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ２ドメインの配列番号２の配列に基づくと、以下のアミノ酸であり、または右に対応するＺ１ドメインにおけるアミノ酸を記載する：
【００３５】
【表１】
【００３６】
カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよびＺ２ドメインは、これらのアミノ酸が異なっていても同様にβ−１，３−グルカンに結合することが可能である。したがって、少なくともこれらのアミノ酸残基はβ−１，３−グルカンへの結合に重要でないと考えられる。
【００３７】
よって、本発明の好ましい態様において、β−１，３−グルカンに結合に結合可能であり、配列番号２の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されており、そして以下のアミノ酸残基において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列が本発明の真菌検出用キットに使用可能である：
（１）１番目のグリシン
（２）２番目のアルギニン
（３）３番目のアルギニン
（４）４番目のアスパラギン
（５）１５番目のセリン
（６）１６番目のチロシン
（７）１８番目のグルタミン酸
（８）２５番目のロイシン
（９）３７番目のリジン
（１０）５４番目のセリン
（１１）５７番目のバリン
（１２）８６番目のイソロイシン
（１３）９２番目のロイシン
（１４）１０１番目のイソロイシン
（１５）１０６番目のロイシン
（１６）１１７番目のリジン
（１７）１２６番目のアルギニン、および
（１８）１３０番目のバリン。
【００３８】
さらに本発明の好ましい態様において、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。ここで、配列番号３は、野生型のＺ２ドメインのアミノ酸配列である配列番号２中のシステイン残基をアラニンに置換したものである。
【００３９】
本発明においては、組換えタンパク質において、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインは、１ないし複数含まれる。当該ドメインは、本明細書の実施例が記載するように、少なくとも１つ有していれば十分にβ−１，３−グルカンに結合する活性を有するものである。したがって、当該ドメインの含まれる数はいくつであってもよく、一態様においては１ないし１０個程度、好ましくは１ないし８個、さらに好ましくは１ないし６個、より好ましくは１ないし４個、最も好ましくは１個、２個、３個または４個である。
【００４０】
本発明において、本発明の組換えタンパク質が結合するβ−１，３−グルカンは、トリオース以上の多糖である。これは、実施例３において、Ｚ２およびファクターＧ αサブユニットがラミナリトリオース−ＢＳＡには結合したものの、ラミナリビオース−ＢＳＡとは結合しなかったとの知見に基づく。このことからＺ２ドメインはβ−１，３結合を認識しているのではなく、β−１，３−グルカンの２糖構造が認識の最小単位であることが考えられ、本発明の好ましい態様では、本発明の組換えタンパク質が結合するβ−１，３−グルカンは、トリオース以上の多糖である。
【００４１】
また、本発明の好ましい態様において、本発明の組換えタンパク質は検出用ドメインをさらに含む。ここで、「検出用ドメイン」とは、組換えタンパク質の存在を可視化することができる、または定量化することができるドメインをいう。検出用ドメインとしては、公知のいかなるドメインをも使用可能である。例えば、蛍光ドメイン、酵素活性ドメイン、およびエピトープタグドメイン等が、検出用ドメインとして使用可能である。
【００４２】
蛍光ドメインとは、特定の波長の光を当てることにより特定の波長の蛍光を発するドメインのことである。このような蛍光ドメインとしては、例えばＧＦＰ、ＲＦＰおよびＹＦＰ等の公知の蛍光タンパク質や、これらの改変型（ＥＧＦＰなど）なども同様に使用可能である。
【００４３】
酵素活性ドメインとは、酵素活性により基質が変換され、変換後の基質が例えば発光や発色をすることによりタンパク質の存在を容易に検出することができるドメインをいう。このような活性をもつドメインとしては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ等、公知の酵素活性ドメインを使用可能である。
【００４４】
また、エピトープタグドメインとは、当該技術分野ではタンパク質の免疫学的手法を用いた検出用に種々のエピトープタグ配列が使用されており、このようなタグ配列を有するドメインをいう。このようなエピトープタグ配列、これを認識する抗体により容易に検出可能である。タグドメインとしては、例えば、Ｆｌａｇタグ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、Ｍｙｃタグ（例えば、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＨＡタグ（例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、Ｈｉｓタグ（例えば、ＨＨＨＨＨＨ）などが知られている。しかしながら、これに限定される訳ではない。即ち、これら以外の配列であったとしても、組換えタンパク質と連結して発現可能な配列であり、抗体により認識される配列は本発明でいうエピトープタグに含まれる。このようなエピトープタグに対する抗体、並びに該抗体に蛍光物質や酵素活性物質を結合したコンジュゲート抗体は一般に市販されており、このような抗体をエピトープタグの検出に使用することが可能である。
【００４５】
また組換えタンパク質検出用の修飾としては、放射性同位元素も使用可能である。このような放射性同位元素を有する組換えタンパク質の生成は、例えば３５Ｓを含む培地中で組換えタンパク質をコードするプラスミドを導入された大腸菌を培養することに容易に行うことが可能である。
【００４６】
本発明のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質は、特に限定されず、公知のいずれの方法によっても作成することが可能である。例えば、当該タンパク質をコードするプラスミドを導入した大腸菌等に発現させても、または人工的な方法で合成してもよい。
【００４７】
（２）組換えタンパク質の精製方法
本発明はさらに、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法を提供する。本発明の方法は、当該タンパク質をβ−１，３−グルカンを含む担体と接触させる工程、または当該タンパク質を真菌と接触させる工程を含む。
【００４８】
本精製方法における用語の定義等は、「（１）真菌検出用キットおよび真菌検出法」におけるものと同じである。
（ｉ）組換えタンパク質をβ−１，３−グルカンを含む担体と接触させる工程
組換えタンパク質とβ−１，３−グルカンを含む担体と接触させる工程は、これら２者が接触できる態様であればどのように行ってもよい。例えば、β−１，３−グルカンを含む担体をカラムに充填し行うことも可能であるし、ファルコンチューブ中に試料とβ−１，３−グルカンを含む担体を添加しローテートまたは静置することに行うことも可能である。また、好ましくは、本精製方法は実施例７の記載に基づいて行うことも可能である。
【００４９】
本発明において使用されるβ−１，３−グルカンは、β−１，３−グルカンを含む公知のいずれの糖も用いることが可能である。好ましい態様においては、β−１，３−グルカンは、トリオース以上の多糖である。これは、実施例３に記載するように、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインが、ラミナリビオースには結合せず、ラミナリトリオース以上の多糖に結合するという、本発明で初めて明らかとなった事実に基づく。また、さらに好ましい態様において、本発明において使用されるβ−１，３−グルカンは、ある種のグラム陰性菌により分泌産生されるカードランや、特定の種類のコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）により産生されるラミナリン、並びにキシラン、パラミロン、シゾフィラン、レンチナン、リケナン、ニゲランおよびクレスチン等が使用される。
【００５０】
本発明に使用される担体は化学的に不活性であり、そしてβ−１，３−グルカンに結合活性を有さなければ公知のどのような担体をも用いることが可能である。このような担体としては、例えばセファロース、ＮＴＡ、セルロース、ポリアクリルアミドおよびトヨパール等が使用可能である。
【００５１】
（ｉｉ）組換えタンパク質を真菌と接触させる工程
組換えタンパク質を真菌と接触させる工程は、これら２者が接触できる態様であればどのように行ってもよい。好ましい態様において、実施例６に記載するように試料を真菌を懸濁し、静置することにより行う。
【００５２】
本発明に真菌とは、細胞壁等の細胞外成分にβ−１，３−グルカンを有し、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインに結合できる真菌であればどのようなものであってもよい。好ましい態様において、真菌は酵母であり、より好ましくは出芽酵母および分裂酵母であり、さらに好ましくはＰ．パストリスである。
【発明の効果】
【００５３】
本発明により、従来問題となっていたプロテアーゼ阻害剤の影響を受けることなく真菌の存在を検出することが可能となる。また、本発明によれば、従来のものよりも簡便で且つ広いスペクトルで真菌を検出することが可能となる。
【００５４】
さらに、本発明により、上記真菌の検出に使用可能なカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を容易に精製することが可能となる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。
【００５６】
実施例１
ＰＣＲで増幅したＺ２ドメイン（５２５−６５４残基）、蛍光タンパク質であるＥＧＦＰ（１−２３９残基）のｃＤＮＡを発現用ベクターｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に導入した。Ｚ２ドメインのシステイン残基のアラニン残基へ置換は、プライマー５’−ＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧ−３’ ５’−ＣＣＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＧＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴ−３’を使用して、ＰＣＲにより行なった。２Ｒ−Ｚ２はＺ２ｃＤＮＡが導入されたｐＥＴ−１５ｂへＺ２ｃＤＮＡを再度導入することで作製した。４Ｒ−Ｚ２も上記と同様にして作製した。さらに、ＥＧＦＰとＺ２ドメインの融合させたベクターも作製した（ＥＧＦＰ−Ｚ２）。これらのベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ株に導入し、タンパク質の発現を行なった。すべてのタンパク質に６×Ｈｉｓタグが付加されており、精製はＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて行なった。
【００５７】
野生型のファクターＧのαサブユニットの構造、および作成した組換えタンパク質の構造は図１Ａに示す。
実施例２
ラミナリオリゴ糖とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のカップリング
ラミナリオリゴ糖（グルコースがβ−１，３−結合したオリゴ糖。この実施例で用いたものは、２糖のラミナリビオース、３糖のラミナリトリオース、５糖のラミナリペンタオース）とＢＳＡのカップリングはＧｒａｙ（非特許文献１５）の方法に従った。２０ｎＭのＢＳＡ、２０μｇ／ｍｌのラミナリオリゴ糖、２０μｇ／ｍｌシアノホウ素酸ナトリウムを０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で３７℃、８日間反応させた。反応させたサンプルは蒸留水で限外透析を行ない、その後凍結乾燥した。
【００５８】
図１Ｂには、作成したラミナリオリゴ糖の構造を示す。また、図１Ｃにはラミナリオリゴ糖が実際に作成されたことを示すウエスタンブロットの図である。
実施例３
表面プラズモン共鳴センサー（ＳＰＲ）を用いた各種Ｚ２ドメインとラミナリオリゴ糖−ＢＳＡの結合解離定数の同定
表面プラズモン共鳴センサーによる結合解離定数の同定は、ビアコア（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて決定した。３種類のラミナリオリゴ糖−ＢＳＡに対してアミンカップリングキットを用いてセンサーチップＣＭ５に固層化を行なった。センサーチップを活性化し、２０μｇ／ｍｌのラミナリオリゴ糖／１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を流速１０μ１／ｍｉｎでフローセルに流し、固層化を行なった。流速３０μ１／ｍｉｎ、２５℃で測定し、緩衝液はＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いた。ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した測定試料（ファクターＧ αサブユニット、Ｚ２、２Ｒ−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２、ＥＧＦＰ−Ｚ２）と固定化したラミナリオリゴ糖との相互作用を測定した。チップの再生は２Ｍのグアニジン塩酸塩で行なった。相互作用のセンサーグラムは、複数の濃度で測定し（１００−４００ｎＭ）、シフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて解析を行なった。Ｚ２、２Ｒ−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２、ファクターＧ αサブユニットおよびＥＧＦＰ−Ｚ２の分子量は１６，７００、３１，３００、６０，４００、１１９，０００、４３，８００として計算を行なった。
【００５９】
Ｚ２およびファクターＧ αサブユニットはラミナリトリオース−ＢＳＡには結合したが、ラミナリビオース−ＢＳＡとは結合しなかった。この結果から、Ｚ２ドメインはβ−１，３結合を認識しているのではなく、β−１，３−グルカンの２糖構造が認識の最小単位であることが示唆された。Ｚ２、２Ｒ．−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２のラミナリオリゴ糖に対する親和性には、いくつかの違いが見られ、例えば、ラミナリペンタオースに対する４Ｒ−Ｚ２の結合速度定数はＺ２、２Ｒ−Ｚ２にくらべて４倍から５倍も増加し、一方、解離速度定数は１／４に減少いる（図２）。すなわち、繰り返しドメインが多くなると、β−１，３−グルカンのオリゴ糖に対して、すばやく結合し、いったん結合すると解離しにくいことを示している。
【００６０】
【表２】
【００６１】
実施例４
蛍光ＸｌｎＺ−２タンパク質を用いた蛍光顕微鏡による微生物の検出
大腸菌Ｋ１２株、黄色ブドウ球菌を５ｍｌのＹＰＤ培地中で、酵母Ｘ−３３株を５ｍｌのトリプトソイ培地／１％グルコース中で、それぞれ３７℃、４０時問培養を行なった。菌体を遠心分離で集菌し、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７５／０．１５Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した後、同じリン酸緩衝液で再懸濁を行なった。１００μ１の洗浄した菌体（ＯＤ６００＝１）をＥＧＦＰ−Ｚ２の条件で混合した。混合したサンプルを２５℃、１時間で静置し、リン酸緩衝液と蒸留水で洗浄した。洗浄した菌体サンプルを蛍光顕微鏡により観察した。
【００６２】
ＥＧＦＰ−Ｚ２は真菌である酵母に結合したが、一方、グラム陽性菌、陰性菌には結合しなかった。また、大腸菌、黄色ブドウ球菌、酵母の菌体を１：１：１で混ぜ合わせたサンプルにおいても、ＥＧＦＰ−Ｚ２は真菌にのみ結合した（図４）。
【００６３】
表面プラズモン共鳴センサーＢＩＡｃｏｒｅの結果から、ＥＧＦＰ−Ｚ２のラミナリペンタオース−ＢＳＡに対する親和性は１．３５×１０−８Ｍと高い親和性を示すことが判明した。Ｚ２の最大の利点として、大腸菌での発現系構築が可能であるため、真菌を検出する抗体等に比較してコストが小さいことが挙げられる。Ｚ２ドメインとＲ２−Ｚ２ドメインの酵母に対する抗菌活性を測定した結果、抗菌活性は測定されず、標識した真菌を生かしたまま顕微鏡下で追跡やモニターが可能なことを示している。Ｚ２ドメインは凍結乾燥により長期間保存が可能で、抗体よりも安価に調製が可能であると推測され、さらに真菌を標識した真菌の追跡を可能にする。
【００６４】
実施例５
Ｚ２ドメインによる凝集活性測定
１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７５／０．１５ＭＮａＣｌに溶解した１０μ１のＺ２ドメイン（０．１ｍｇ／ｍｌ）と１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に懸濁した１０μ１のＡｌｅｘａ４８８で蛍光標識された市販の微生物（大腸菌Ｋ−１２株、黄色ブドウ球菌、出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ＯＤ６００＝１）を混合し、２５℃、３０分間静置した。菌体サンプルを顕微鏡スライドにのせ、凝集の程度を蛍光顕微鏡により観察した。
【００６５】
終濃度５０μｇ／ｍｌのＺ２、２Ｒ−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２、ファクターＧ αサブユニット存在下で出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの凝集が確認されたが、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉや黄色ブドウ球菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対しては、凝集活性は見られなかった。なお、コントロールとして用いたＢＳＡでは凝集は確認されなかった。さらに、５００μｇ／ｍｌのラミナリン存在下では、Ｚ２の凝集活性が阻害された。っまり、Ｚ２、および２Ｒ−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのβ−１，３−グルカンと結合し、凝集活性を引き起こす事が明らかとなった。興味深い事に、Ｚ２でもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対して凝集活性を引き起こした。Ｚ２は、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｍｉｘｔｕｓのセルロース分解酵素のβ−グルカン認識ドメイン（非特許文献１６−１８）と４５％の配列類似性を示す。事実、この酵素にはｃｌｅｆｔＡ、Ｂと呼ばれる２つのβ−グルカン認識部位があり、Ｚ２にもβ−１，３−グルカン結合部位が２個存在することが推定されている。
【００６６】
実施例６
Ｚ−２付加タンパク質の酵母菌体による精製
Ｚ２、ＥＧＦＰ−Ｚ２の発現ベクターを組み込んだＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを５ｍｌのＬＢ培地中で培養し、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）存在下、２０℃、２４時間の培養条件で発現誘導を行なった。遠心分離により集菌した菌体を１ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７．５，１００ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で超音波破砕を行なった。超音波破砕後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により上清を回収し、３００μ１の酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ−３３株（Ｔｒｉｓ緩衝液で洗浄済み）と懸濁、４℃で２時間静置した。非結合画分を遠心分離により回収し、その後、酵母菌体を１ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液、Ｔｗｅｅｎ２０を含まないｔｒｉｓ緩衝液で洗浄し、０．０ｌ−１００ｍｇ／ｍｌのラミナリンを含むＴｒｉｓ緩衝液を用いて目的タンパク質の溶出を行なった。それぞれのサンプル１５μ１を１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、酵母に特異的に吸着したＺ２およびその付加タンパク質（ＥＧＦＰ−Ｚ２）が、ラミナリンにより溶出されることが確認された。また、酵母菌体に残るＺ２タンパク質の存在は確認されなかったため（図６．レーンＰＰＴ）、親和性カラムに結合したタンパク質のほとんどが回収できる事が示唆された。酵母の親和性担体としてのキャパシティーは、１ｍｌ酵母に対して、約１ｍｇのＺ２が吸着する。また、Ｚ２ドメインの溶出の際に１００μｇ／ｍｌのラミナリン濃度で効率的に溶出されることが判明した。加えて、様々なｐＨ条件（ｐＨ１−１２）や５ＭＮａＣｌなどの高塩濃度の条件、さらに１ｍｇ／ｍｌのラクトースやマルトース、スクロースなどの２糖ではＺ−２は、ほとんど溶出されなかった。そのため、これらの条件で洗浄が可能なため、高純度のＺ２融合タンパク質を精製可能である。
【００６８】
実施例７
Ｚ２−融合タンパク質のカードランカラムによる精製
Ｚ２、ＥＧＦＰ−Ｚ２の発現ベクターを組み込んだＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを５ｍｌのＬＢ培地中で培養し、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）存在下、２０℃、２０時間の培養条件で発現誘導を行なった。遠心分離により集菌した菌体を１ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７．５，１００ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で超音波破砕を行なった。超音波破砕後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４０℃、５分間）により、目的タンパク質を含む上清を回収し、１ｍｌのカードラン（Ｗａｋｏより購入）を充填したカラムへ添加した。その後、カードランカラムを５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液、さらに、５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を含まないＴｒｉｓ緩衝液で洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌのラミナリンを含むＴｒｉｓ緩衝液を用いて目的タンパク質の溶出を行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、高純度のＺ２（図７Ａのレーン３）およびその融合タンパク質（ＥＧＦＰ−Ｚ２）（図７Ｂのレーン３）が、カードランカラムからラミナリンにより溶出されることが確認された。素通り画分では目的のタンパク質がほとんど確認できなかったが（図７Ａ、Ｂのレーン２）、溶出画分では爽雑物のほとんどない目的タンパク質のバンドが確認できた（図７Ａ、Ｂのレーン３）。
【００６９】
なお、カードランとは、ある種のグラム陰性菌の分泌産物で不溶性のβ−１，３−グルカンである。一方、ラミナリンは、ある種のコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）の成分で、水溶性のβ−１，３−グルカンである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１Ａは、野生型ファクターＧのαサブユニット、および本明細書の実施例１において作成された組換えタンパク質の構造を示す。図１Ｂは、本明細書実施例２で合成されたラミナリオリゴ糖と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合物の構造を示す。図１Ｃは、図１Ｂの糖タンパク質の合成を確認したウエスタンブロットの結果である。
【図２】図２は、ラミナリトリオース−ＢＳＡと各種Ｚ２ドメインの結合解離強度を、表面プラズモン共鳴センサーを用いて測定した図である。
【図３】図３は、ラミナリペンタオース−ＢＳＡと各種Ｚ２ドメインの結合解離強度を、表面プラズモン共鳴センサーを用いて測定した図である。
【図４】図４は、蛍光Ｘｌｎ−Ｚ２タンパク質を用いた微生物検出の蛍光顕微鏡写真である。
【図５】図５は、Ｚ２ドメインを１つ、２つおよび４つ有する組換えタンパク質の真菌凝集活性を示す図である。
【図６】図６は、Ｚ２ドメインを有する組換えタンパク質の酵母菌体による精製を示すウエスタンブロットの結果である。Ａ：図１ＡのＺ２。Ｂ：図１ＡのＥＧＦＰ−Ｚ２。なお、図中の略語はそれぞれ以下の意味である：ＣＬは、組換えタンパク質を発現している大腸菌の超音波破砕物（組換えタンパク質を含む）。ＦＴは、超音波破砕物を酵母菌体と混合して、結合しなかった画分（遠心した上澄み）。Ｗはタンパク質が結合した酵母菌体を洗浄した液。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４はラミナリン溶液による溶出液の１回、２回、３回、４回の分析（１回ごとに溶出液を１ｍｌ用いた）。ＰＰＴは、溶出が終わった菌体破砕物（最終の遠心した沈殿物）。
【図７】図７は、Ｚ２ドメインを有する組換えタンパク質のカードランによる精製を示す結果である。Ａ：図１ＡのＺ２。Ｂ：図１ＡのＥＧＦＰ−Ｚ２。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を含む真菌検出用キットに関する。
【０００２】
また、本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を試料と接触させる工程を含む、真菌を検出する方法に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
自然免疫は、動植物に共通して見られる免疫系で、脊椎動物を除いた多細胞生物には獲得免疫はなく、自然免疫のみで感染を防御している。自然免疫系で働くタンパク質が、感染微生物を見分ける際に標的とする物質（非自己として認識する物質）は、感染微生物の細胞壁に存在するリポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、あるいはβ−１，３−グルカンと呼ばれる成分である。自然免疫系の異物認識タンパク質は、ＬＰＳやＰＧＮ、β−１，３−グルカンなどが作り出す分子パターンを認識すると考えられている（パターン認識説）。これら細胞壁成分は遺伝子の直接産物のタンパク質ではなく、複雑な酵素反応の連鎖により作られる糖鞘や脂質、あるいはそれらが複雑に結合したのもので、微生物自身の生存に不可欠な成分であり、容易に構造変化させることはできない。したがって、自然免疫系の異物認識がこれらの物質を標的としていることは、大変優れた生体防御戦略といえる。
【０００５】
哺乳動物や節足動物においては、真菌の表層成分であるβ−１，３−グルカンを認識することで一連の生体防御反応が誘導される（非特許文献１）。現在までに、無脊椎動物や昆虫において、多くのβ−１，３−グルカン認識タンパク質が同定されているが（非特許文献２−７）、カブトガニでは、１９８１年には、すでに血球抽出液中にβ−１，３−グルカン感受性プロテアーゼ（ファクターＧ）が報告された（非特許文献８，９）。プロテアーゼ前駆体であるファクターＧは、β−１，３−グルカンを認識することで、自己触媒的にプロテアーゼ活性を発現する（非特許文献１０，１１）。ファクターＧは、構造的には、αサブユニット（７２ｋＤａ）とβサブユニット（３７ｋＤａ）から構成され、非共有結合で二量体を形成している。αサブユニットは６５４アミノ酸残基で、１つのβ−１，３−グルカナーゼＩＡ１様ドメインと３つのキシラナーゼＡ様ドメイン（Ａｌ，２，３）、さらに２つのキシラナーゼＺ様ドメイン（Ｎ末端側よりＺ１とＺ２）の合計６つのドメインから構成されている（非特許文献１２）。一方、βサブユニットは、プロテアーゼドメインのみを含む。
【０００６】
精製されたファクターＧは、β−１，３−グルカン存在下で自己活性化するが、リボ多糖、スルファチド、コレステロールサルフェート、ヘパリン、コンドロイチンサルフェートＡ、Ｂなどでは活性化しない（非特許文献１３）。ファクターＧを最も効率的に活性化するものは、直鎖状のβ−１，３−グルカンであるカードランとパラミロンであり、１ナノグラムのカードランでファクターＧを活性化することができる。ファクターＧのキシラナーゼＺ様ドメインが、β−１，３−グルカン認識に重要であることが判明している（非特許文献１４）。カブトガニ血球細胞の抽出液は、すでにエンドトキシン（ＬＰＳ）やβ−１，３−グルカンの検出に応用されている。その原理は、カブトガニの血球抽出液中のファクターＣがリボ多糖を、ファクターＧがβ−１，３−グルカンを認識して引き起こされるプロテアーゼ活性化の連鎖反応（カスケード反応）を利用し、最終的に活性化される凝固酵素のプロテアーゼ活性を発色ペプチド基質により定量できることに基づいている。カブトガニの血球抽出液によるβ−１，３−グルカン検出の際には、リポ多糖によるファクターＣの活性化を抑えることにより、ファクターＧによるカスケード反応を使用している。したがって、測定資料中にプロテアーゼ活性を阻害する物質や色素の混入が判定に支障をきたすため、検査資料の前処理が検出感度や判定に大きな悪影響をおよぼす。
【０００７】
また、真菌に対する抗体を用いる方法や、特定の真菌に特異的な遺伝子中の配列に基づくＰＣＲにより真菌を検出することも知られている。しかしながら、このような方法では特定の種類の真菌を検出することは可能であるが、真菌類全般に高いスペクトルで検出することは不可能である。
【０００８】
このような状況から、サンプル中の未知のプロテアーゼ活性阻害剤等の影響を受けることなく、高い精度でかつ広いスペクトルで真菌の存在量を定量化することのできる方法が希求されていた。
【非特許文献１】S. Barmicki-Garcia, Annu. Rev. Microbial. 22 (1968) 87-108.
【非特許文献２】K. Soderhall et al, Insect Biochem. 18 (1988) 323-330.
【非特許文献３】M. Ochiai et al, J. Biol. Chem. 263 (1988) 12056-12062.
【非特許文献４】B. Duvic et al, J. Biol. Chem. 265 (1990) 9327-9332.
【非特許文献５】B. Duvic et al, J. Crustacean Biol. 13 (1993) 403-408
【非特許文献６】C. Ma et al, J. Biol. Chem. 275 (2000) 7505-7514.
【非特許文献７】R. Zhang et al, J. Biol. Chem. 278 (2003) 42072-42079.
【非特許文献８】T. Morita et al, FEBS Lett. 129 (1981) 318-321.
【非特許文献９】A. Kakinuma et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101 (1981) 434-439.
【非特許文献１０】S. Iwanaga et al, Thromb. Haemostasis 70 (1993) 48-55.
【非特許文献１１】N. Seki et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 1370-1374.
【非特許文献１２】S. Kawabata et al, New directions in invertebrate immunology, SOS publications, New Jersey, 1996, pp. 255-283.
【非特許文献１３】T. Muta et al, J. Biol. Chem. 270 (1995) 892-897.
【非特許文献１４】Y. Takaki et al, J. Biol. Chem. 277 (2002) 14281-14287.
【非特許文献１５】G. R. Gray, Methods in Enzymol. 50 (1978) 155-160.
【非特許文献１６】C. M. G. A. Fontes et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49 (1998) 552-559.
【非特許文献１７】J. L. Henshaw et al, J. Biol. Chem. 279 (2004) 21552-21559.
【非特許文献１８】V. M. R. Pires et al, J. Biol. Chem. 279 (2004) 21560-21568.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、カブトガニの血球細胞に存在して、カビなどの真菌の細胞壁成分であるβ−１，３−グルカンを特異的に認識するファクターＧの構造機能解析を進めてきた。本発明では、ファクターＧ αサブユニットのβ−１，３−グルカン認識ドメインを有する組換えタンパク質を利用することで、真菌検出用キットおよび真菌を検出する方法を開発することを課題とする。これにより、これまでの特異的な抗体やＰＣＲを利用した特定の真菌に対する検出ではなく、真菌に特徴的な細胞壁成分であるβ−１，３−グルカンをターゲットにすることで、未知の微生物が混在する検査資料の中から真菌のみを迅速かつ簡便に検出することが可能になる。
【００１０】
また、本発明では、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究に努めた結果、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を使用して真菌を検出するに至り、本発明を想到した。
【００１２】
具体的には、本発明者らは、図１に示すようなファクターＧ αサブユニットのＺ２ドメインを１、２または４含む組換えタンパク質（Ｚ２、２Ｒ−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２およびＥＧＦＰ−Ｚ２）を生成し、表面プラズモン共鳴センサーを用いることにより、当該タンパク質がβ−１，３−グルカンに結合することを発見した。
【００１３】
また、本発明者らは、Ｚ２ドメインとＥＧＦＰドメインを融合した組換えタンパク質を用いることにより、当該タンパク質が真菌のみに結合し、グラム陽性菌および陰性菌には結合しないことを蛍光顕微鏡下で観察した。
【００１４】
さらに、本発明者らは、蛍光標識された微生物（大腸菌、黄色ブドウ球菌、出芽酵母）を用いることにより、Ｚ２、２Ｒ−Ｚ２および４Ｒ−Ｚ２が出芽酵母は凝集するが、一方、大腸菌および黄色ブドウ球菌は凝集しないことを発見した。
【００１５】
またさらに、本発明者らは、Ｚ２およびＥＧＦＰ−Ｚ２タンパク質が、酵母菌体およびカードランにより精製されることを見いだした。
本発明はこのように、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質が、β−１，３−グルカンに結合可能であり、その結果、真菌に結合可能であるという知見により想到されたものである。本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
【００１６】
本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を含む、真菌検出用キットを提供する。
【００１７】
本発明の好ましい態様において、前記ドメインは、以下の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたいずれかのアミノ酸配列を有する：
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）（ｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２；または、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００１８】
さらに好ましい態様において、前記ドメインは、配列番号２の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されており、そして以下のアミノ酸残基において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列を有する：
（１）１番目のグリシン
（２）２番目のアルギニン
（３）３番目のアルギニン
（４）４番目のアスパラギン
（５）１５番目のセリン
（６）１６番目のチロシン
（７）１８番目のグルタミン酸
（８）２５番目のロイシン
（９）３７番目のリジン
（１０）５４番目のセリン
（１１）５７番目のバリン
（１２）８６番目のイソロイシン
（１３）９２番目のロイシン
（１４）１０１番目のイソロイシン
（１５）１０６番目のロイシン
（１６）１１７番目のリジン
（１７）１２６番目のアルギニン、および
（１８）１３０番目のバリン。
【００１９】
より好ましい態様において、前記ドメインは配列番号３のアミノ酸配列を有する。
さらにより好ましい態様において、前記ドメインは１ないし４つ含まれる。また、前記タンパク質が結合するβ−１，３−グルカンはトリオース以上の多糖である。さらに、前記タンパク質は検出用ドメインをさらに含む。
【００２０】
また、本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法であって、前記タンパク質をβ−１，３−グルカンを含む担体と接触させる工程を含む前記方法を提供する。
【００２１】
好ましい態様において、担体に含まれるβ−１，３−グルカンはトリオース以上の多糖である。
さらに好ましい態様において、担体はカードランおよび／またはラミナリンを含む担体である。
【００２２】
さらに本発明は、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法であって、前記タンパク質を真菌と接触させる工程を含む前記方法を提供する。
【００２３】
好ましい態様において、真菌は酵母である。
（１）真菌検出用キットおよび真菌検出法
本発明は、真菌検出用キットおよび真菌検出方法を提供する。本発明の真菌検出用キットは、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を含む。同様に、本発明の真菌検出方法は、該タンパク質を試料と接触させる工程を含む。
【００２４】
カブトガニのファクターＧは、背景技術の項に記載したように、１９８１年にはすでに報告されている（非特許文献８，９）。これまでにファクターＧのαサブユニットのアミノ酸配列は公知になっており、例えばＮＣＢＩのような公のデータベースより入手することが可能である。ファクターＧのαサブユニットのアクッセション番号はＢＡＡ０４０４４であり、当該配列からシグナルペプチドを除いた配列は、本明細書の配列番号４によっても開示される。
【００２５】
これまでに、ファクターＧのαサブユニットのドメイン構造も公知となっており（非特許文献１２）、Ｎ末端側から、１つのβ−１，３−グルカナーゼＩＡ１様ドメイン（Ｇｌｎ Ａ１）、３つのキシラナーゼＡ様ドメイン（Ｘｌｎ Ａ：Ｎ末端側よりＡ１、Ａ２およびＡ３）、並びに２つのキシラナーゼＺ様ドメイン（Ｘｌｎ Ｚ：Ｎ末端側よりＺ１およびＺ２）を有する。これらのドメインのうち、Ｘｌｎ Ｚ１およびＺ２がβ−１，３−グルカンを認識する部位であることが判明している。例えば、野生型Ｘｌｎ Ｚ１ドメインのアミノ酸配列は配列番号４の３８７−５１６のアミノ酸配列からなり（配列番号１）、野生型Ｘｌｎ Ｚ２ドメインのアミノ酸配列は５２５−６５４のアミノ酸配列からなる（配列番号２）。
【００２６】
しかしながら、本発明において使用可能なＸｌｎ Ｚ１およびＺ２ドメインは、これらの配列と同一のものではなく、少なくともＺ１およびＺ２ドメインに存在するそれぞれ１つのシステイン残基が他のアミノ酸に置換されている。これは、システイン残基が置換されていないＺ１またはＺ２ドメインを１ないし複数含む組換えタンパク質を作成すると、タンパク質の分子間でのジスルフィド結合の形成、または分子内でのジスルフィド結合の形成によりβ−１，３−グルカンに対する結合活性が著しく低下するという、本発明で初めて見いだされた知見に基づく。したがって、本発明においては、Ｚ１またはＺ２ドメイン中のシステイン残基は他のアミノ酸残基に置換されている。好ましい態様においては、システイン残基は、タンパク質全体の立体構造に影響の少ないアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミンに、より好ましくはアラニンに置換されている。このようなアミノ酸残基の置換は、当該タンパク質をコードする塩基配列に、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（２００１）等に記載の、部位特異的突然変異誘発法を使用して、容易に導入することが可能である。
【００２７】
β−１，３−グルカンとは、Ｄ−グルコースがβ−１，３−グリコシド結合により結合した多糖のことである。本発明における組換えタンパク質がβ−１，３−グルカンとの結合可能か否かは、当該技術分野で周知のいずれの技術を使用して決定してよい。このような方法としては、例えばビアコアを用いた表面プラズモン共鳴センサーにより結合解離定数を求めることを含む。表面プラズモン共鳴の具体的な方法は、ビアコア社の取り扱い説明書により実行することが可能であり、例えば本明細書の実施例３のような方法により行われる。また他に、β−１，３−グルカンとタンパク質が結合可能かどうかを決定する方法としては、例えば、カードラン等のβ−１，３−グルカンを混ぜて吸着したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で検出する方法等が公知である。しかしながら、これに限定される訳ではない。β−１，３−グルカンとタンパク質が結合可能とは、例えば結合定数が、１０４以上、好ましくは１０５以上、より好ましくは１０６以上あることをいう。また、β−１，３−グルカンとタンパク質が結合可能性を解離定数で表すことも可能であり、結合可能とは、１０−４以下、好ましくは１０−５以下、より好ましくは１０−６以下であることをいう。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、本発明で使用されるカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインは、以下の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたいずれかのアミノ酸配列を有する：
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）（ｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２；または、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００２９】
ここで、配列番号１は、カブトガニの野生型ファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインのアミノ酸配列を示す。また、配列番号２は、カブトガニの野生型ファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ２ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
しかしながら、本発明で使用可能なカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインまたはＺ２ドメインに由来するドメインは、配列番号１および配列番号２において、システイン残基が他のアミノ酸に置換された配列に限定される訳ではない。即ち、β−１，３−グルカンに結合可能であれば、上記アミノ酸配列に対し、１つまたは数個の欠失、置換、および／または付加を有するドメイン、または８０％以上の同一性を有するドメインもまた、本発明においては使用可能である。
【００３１】
本発明においては、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインまたはＺ２ドメインに由来するドメインのアミノ酸の１つまたは数個の置換は、好ましくは保存的置換により行われる。ここで保存的置換とは、あるアミノ酸残基が生物学的に類似した特性を持つアミノ酸残基に置換されることをいう。保存的置換の例は、１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａ）を別の脂肪族残基に置換すること、１つの極性残基を別の極性残基に置換すること（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎ間で置換すること）、または１つの芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒ）を別の芳香族残基に置換することを含む。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。
【００３２】
「数個」とは、限定される訳ではないが、例えば２０個、好ましくは１８個、さらに好ましくは１５個、より好ましくは１０個、さらにより好ましくは５個をいう。
また本発明の別の好ましい態様において、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインまたはＺ２ドメインに由来するドメインは、β−１，３−グルカンに結合可能であり、それぞれ配列番号１または２に８０％以上の同一性を有し、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。 アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＳおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００３３】
当業者に用いられる配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００３４】
上記のように、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよびＺ２ドメインの配列は公知であり、配列番号１および２にそれぞれ示される。この２つのドメインは非常に同一性が高く、それぞれ全長１３０アミノ酸のうちアミノ酸残基が異なるのは１８個にすぎない。この１８個のアミノ酸とは、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ２ドメインの配列番号２の配列に基づくと、以下のアミノ酸であり、または右に対応するＺ１ドメインにおけるアミノ酸を記載する：
【００３５】
【表１】
【００３６】
カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよびＺ２ドメインは、これらのアミノ酸が異なっていても同様にβ−１，３−グルカンに結合することが可能である。したがって、少なくともこれらのアミノ酸残基はβ−１，３−グルカンへの結合に重要でないと考えられる。
【００３７】
よって、本発明の好ましい態様において、β−１，３−グルカンに結合に結合可能であり、配列番号２の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されており、そして以下のアミノ酸残基において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列が本発明の真菌検出用キットに使用可能である：
（１）１番目のグリシン
（２）２番目のアルギニン
（３）３番目のアルギニン
（４）４番目のアスパラギン
（５）１５番目のセリン
（６）１６番目のチロシン
（７）１８番目のグルタミン酸
（８）２５番目のロイシン
（９）３７番目のリジン
（１０）５４番目のセリン
（１１）５７番目のバリン
（１２）８６番目のイソロイシン
（１３）９２番目のロイシン
（１４）１０１番目のイソロイシン
（１５）１０６番目のロイシン
（１６）１１７番目のリジン
（１７）１２６番目のアルギニン、および
（１８）１３０番目のバリン。
【００３８】
さらに本発明の好ましい態様において、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。ここで、配列番号３は、野生型のＺ２ドメインのアミノ酸配列である配列番号２中のシステイン残基をアラニンに置換したものである。
【００３９】
本発明においては、組換えタンパク質において、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインは、１ないし複数含まれる。当該ドメインは、本明細書の実施例が記載するように、少なくとも１つ有していれば十分にβ−１，３−グルカンに結合する活性を有するものである。したがって、当該ドメインの含まれる数はいくつであってもよく、一態様においては１ないし１０個程度、好ましくは１ないし８個、さらに好ましくは１ないし６個、より好ましくは１ないし４個、最も好ましくは１個、２個、３個または４個である。
【００４０】
本発明において、本発明の組換えタンパク質が結合するβ−１，３−グルカンは、トリオース以上の多糖である。これは、実施例３において、Ｚ２およびファクターＧ αサブユニットがラミナリトリオース−ＢＳＡには結合したものの、ラミナリビオース−ＢＳＡとは結合しなかったとの知見に基づく。このことからＺ２ドメインはβ−１，３結合を認識しているのではなく、β−１，３−グルカンの２糖構造が認識の最小単位であることが考えられ、本発明の好ましい態様では、本発明の組換えタンパク質が結合するβ−１，３−グルカンは、トリオース以上の多糖である。
【００４１】
また、本発明の好ましい態様において、本発明の組換えタンパク質は検出用ドメインをさらに含む。ここで、「検出用ドメイン」とは、組換えタンパク質の存在を可視化することができる、または定量化することができるドメインをいう。検出用ドメインとしては、公知のいかなるドメインをも使用可能である。例えば、蛍光ドメイン、酵素活性ドメイン、およびエピトープタグドメイン等が、検出用ドメインとして使用可能である。
【００４２】
蛍光ドメインとは、特定の波長の光を当てることにより特定の波長の蛍光を発するドメインのことである。このような蛍光ドメインとしては、例えばＧＦＰ、ＲＦＰおよびＹＦＰ等の公知の蛍光タンパク質や、これらの改変型（ＥＧＦＰなど）なども同様に使用可能である。
【００４３】
酵素活性ドメインとは、酵素活性により基質が変換され、変換後の基質が例えば発光や発色をすることによりタンパク質の存在を容易に検出することができるドメインをいう。このような活性をもつドメインとしては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ等、公知の酵素活性ドメインを使用可能である。
【００４４】
また、エピトープタグドメインとは、当該技術分野ではタンパク質の免疫学的手法を用いた検出用に種々のエピトープタグ配列が使用されており、このようなタグ配列を有するドメインをいう。このようなエピトープタグ配列、これを認識する抗体により容易に検出可能である。タグドメインとしては、例えば、Ｆｌａｇタグ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、Ｍｙｃタグ（例えば、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＨＡタグ（例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、Ｈｉｓタグ（例えば、ＨＨＨＨＨＨ）などが知られている。しかしながら、これに限定される訳ではない。即ち、これら以外の配列であったとしても、組換えタンパク質と連結して発現可能な配列であり、抗体により認識される配列は本発明でいうエピトープタグに含まれる。このようなエピトープタグに対する抗体、並びに該抗体に蛍光物質や酵素活性物質を結合したコンジュゲート抗体は一般に市販されており、このような抗体をエピトープタグの検出に使用することが可能である。
【００４５】
また組換えタンパク質検出用の修飾としては、放射性同位元素も使用可能である。このような放射性同位元素を有する組換えタンパク質の生成は、例えば３５Ｓを含む培地中で組換えタンパク質をコードするプラスミドを導入された大腸菌を培養することに容易に行うことが可能である。
【００４６】
本発明のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質は、特に限定されず、公知のいずれの方法によっても作成することが可能である。例えば、当該タンパク質をコードするプラスミドを導入した大腸菌等に発現させても、または人工的な方法で合成してもよい。
【００４７】
（２）組換えタンパク質の精製方法
本発明はさらに、システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法を提供する。本発明の方法は、当該タンパク質をβ−１，３−グルカンを含む担体と接触させる工程、または当該タンパク質を真菌と接触させる工程を含む。
【００４８】
本精製方法における用語の定義等は、「（１）真菌検出用キットおよび真菌検出法」におけるものと同じである。
（ｉ）組換えタンパク質をβ−１，３−グルカンを含む担体と接触させる工程
組換えタンパク質とβ−１，３−グルカンを含む担体と接触させる工程は、これら２者が接触できる態様であればどのように行ってもよい。例えば、β−１，３−グルカンを含む担体をカラムに充填し行うことも可能であるし、ファルコンチューブ中に試料とβ−１，３−グルカンを含む担体を添加しローテートまたは静置することに行うことも可能である。また、好ましくは、本精製方法は実施例７の記載に基づいて行うことも可能である。
【００４９】
本発明において使用されるβ−１，３−グルカンは、β−１，３−グルカンを含む公知のいずれの糖も用いることが可能である。好ましい態様においては、β−１，３−グルカンは、トリオース以上の多糖である。これは、実施例３に記載するように、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインが、ラミナリビオースには結合せず、ラミナリトリオース以上の多糖に結合するという、本発明で初めて明らかとなった事実に基づく。また、さらに好ましい態様において、本発明において使用されるβ−１，３−グルカンは、ある種のグラム陰性菌により分泌産生されるカードランや、特定の種類のコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）により産生されるラミナリン、並びにキシラン、パラミロン、シゾフィラン、レンチナン、リケナン、ニゲランおよびクレスチン等が使用される。
【００５０】
本発明に使用される担体は化学的に不活性であり、そしてβ−１，３−グルカンに結合活性を有さなければ公知のどのような担体をも用いることが可能である。このような担体としては、例えばセファロース、ＮＴＡ、セルロース、ポリアクリルアミドおよびトヨパール等が使用可能である。
【００５１】
（ｉｉ）組換えタンパク質を真菌と接触させる工程
組換えタンパク質を真菌と接触させる工程は、これら２者が接触できる態様であればどのように行ってもよい。好ましい態様において、実施例６に記載するように試料を真菌を懸濁し、静置することにより行う。
【００５２】
本発明に真菌とは、細胞壁等の細胞外成分にβ−１，３−グルカンを有し、カブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインに結合できる真菌であればどのようなものであってもよい。好ましい態様において、真菌は酵母であり、より好ましくは出芽酵母および分裂酵母であり、さらに好ましくはＰ．パストリスである。
【発明の効果】
【００５３】
本発明により、従来問題となっていたプロテアーゼ阻害剤の影響を受けることなく真菌の存在を検出することが可能となる。また、本発明によれば、従来のものよりも簡便で且つ広いスペクトルで真菌を検出することが可能となる。
【００５４】
さらに、本発明により、上記真菌の検出に使用可能なカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を容易に精製することが可能となる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。
【００５６】
実施例１
ＰＣＲで増幅したＺ２ドメイン（５２５−６５４残基）、蛍光タンパク質であるＥＧＦＰ（１−２３９残基）のｃＤＮＡを発現用ベクターｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に導入した。Ｚ２ドメインのシステイン残基のアラニン残基へ置換は、プライマー５’−ＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧ−３’ ５’−ＣＣＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＧＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴ−３’を使用して、ＰＣＲにより行なった。２Ｒ−Ｚ２はＺ２ｃＤＮＡが導入されたｐＥＴ−１５ｂへＺ２ｃＤＮＡを再度導入することで作製した。４Ｒ−Ｚ２も上記と同様にして作製した。さらに、ＥＧＦＰとＺ２ドメインの融合させたベクターも作製した（ＥＧＦＰ−Ｚ２）。これらのベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ株に導入し、タンパク質の発現を行なった。すべてのタンパク質に６×Ｈｉｓタグが付加されており、精製はＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて行なった。
【００５７】
野生型のファクターＧのαサブユニットの構造、および作成した組換えタンパク質の構造は図１Ａに示す。
実施例２
ラミナリオリゴ糖とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のカップリング
ラミナリオリゴ糖（グルコースがβ−１，３−結合したオリゴ糖。この実施例で用いたものは、２糖のラミナリビオース、３糖のラミナリトリオース、５糖のラミナリペンタオース）とＢＳＡのカップリングはＧｒａｙ（非特許文献１５）の方法に従った。２０ｎＭのＢＳＡ、２０μｇ／ｍｌのラミナリオリゴ糖、２０μｇ／ｍｌシアノホウ素酸ナトリウムを０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で３７℃、８日間反応させた。反応させたサンプルは蒸留水で限外透析を行ない、その後凍結乾燥した。
【００５８】
図１Ｂには、作成したラミナリオリゴ糖の構造を示す。また、図１Ｃにはラミナリオリゴ糖が実際に作成されたことを示すウエスタンブロットの図である。
実施例３
表面プラズモン共鳴センサー（ＳＰＲ）を用いた各種Ｚ２ドメインとラミナリオリゴ糖−ＢＳＡの結合解離定数の同定
表面プラズモン共鳴センサーによる結合解離定数の同定は、ビアコア（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて決定した。３種類のラミナリオリゴ糖−ＢＳＡに対してアミンカップリングキットを用いてセンサーチップＣＭ５に固層化を行なった。センサーチップを活性化し、２０μｇ／ｍｌのラミナリオリゴ糖／１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を流速１０μ１／ｍｉｎでフローセルに流し、固層化を行なった。流速３０μ１／ｍｉｎ、２５℃で測定し、緩衝液はＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いた。ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した測定試料（ファクターＧ αサブユニット、Ｚ２、２Ｒ−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２、ＥＧＦＰ−Ｚ２）と固定化したラミナリオリゴ糖との相互作用を測定した。チップの再生は２Ｍのグアニジン塩酸塩で行なった。相互作用のセンサーグラムは、複数の濃度で測定し（１００−４００ｎＭ）、シフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて解析を行なった。Ｚ２、２Ｒ−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２、ファクターＧ αサブユニットおよびＥＧＦＰ−Ｚ２の分子量は１６，７００、３１，３００、６０，４００、１１９，０００、４３，８００として計算を行なった。
【００５９】
Ｚ２およびファクターＧ αサブユニットはラミナリトリオース−ＢＳＡには結合したが、ラミナリビオース−ＢＳＡとは結合しなかった。この結果から、Ｚ２ドメインはβ−１，３結合を認識しているのではなく、β−１，３−グルカンの２糖構造が認識の最小単位であることが示唆された。Ｚ２、２Ｒ．−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２のラミナリオリゴ糖に対する親和性には、いくつかの違いが見られ、例えば、ラミナリペンタオースに対する４Ｒ−Ｚ２の結合速度定数はＺ２、２Ｒ−Ｚ２にくらべて４倍から５倍も増加し、一方、解離速度定数は１／４に減少いる（図２）。すなわち、繰り返しドメインが多くなると、β−１，３−グルカンのオリゴ糖に対して、すばやく結合し、いったん結合すると解離しにくいことを示している。
【００６０】
【表２】
【００６１】
実施例４
蛍光ＸｌｎＺ−２タンパク質を用いた蛍光顕微鏡による微生物の検出
大腸菌Ｋ１２株、黄色ブドウ球菌を５ｍｌのＹＰＤ培地中で、酵母Ｘ−３３株を５ｍｌのトリプトソイ培地／１％グルコース中で、それぞれ３７℃、４０時問培養を行なった。菌体を遠心分離で集菌し、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７５／０．１５Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した後、同じリン酸緩衝液で再懸濁を行なった。１００μ１の洗浄した菌体（ＯＤ６００＝１）をＥＧＦＰ−Ｚ２の条件で混合した。混合したサンプルを２５℃、１時間で静置し、リン酸緩衝液と蒸留水で洗浄した。洗浄した菌体サンプルを蛍光顕微鏡により観察した。
【００６２】
ＥＧＦＰ−Ｚ２は真菌である酵母に結合したが、一方、グラム陽性菌、陰性菌には結合しなかった。また、大腸菌、黄色ブドウ球菌、酵母の菌体を１：１：１で混ぜ合わせたサンプルにおいても、ＥＧＦＰ−Ｚ２は真菌にのみ結合した（図４）。
【００６３】
表面プラズモン共鳴センサーＢＩＡｃｏｒｅの結果から、ＥＧＦＰ−Ｚ２のラミナリペンタオース−ＢＳＡに対する親和性は１．３５×１０−８Ｍと高い親和性を示すことが判明した。Ｚ２の最大の利点として、大腸菌での発現系構築が可能であるため、真菌を検出する抗体等に比較してコストが小さいことが挙げられる。Ｚ２ドメインとＲ２−Ｚ２ドメインの酵母に対する抗菌活性を測定した結果、抗菌活性は測定されず、標識した真菌を生かしたまま顕微鏡下で追跡やモニターが可能なことを示している。Ｚ２ドメインは凍結乾燥により長期間保存が可能で、抗体よりも安価に調製が可能であると推測され、さらに真菌を標識した真菌の追跡を可能にする。
【００６４】
実施例５
Ｚ２ドメインによる凝集活性測定
１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７５／０．１５ＭＮａＣｌに溶解した１０μ１のＺ２ドメイン（０．１ｍｇ／ｍｌ）と１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に懸濁した１０μ１のＡｌｅｘａ４８８で蛍光標識された市販の微生物（大腸菌Ｋ−１２株、黄色ブドウ球菌、出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ＯＤ６００＝１）を混合し、２５℃、３０分間静置した。菌体サンプルを顕微鏡スライドにのせ、凝集の程度を蛍光顕微鏡により観察した。
【００６５】
終濃度５０μｇ／ｍｌのＺ２、２Ｒ−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２、ファクターＧ αサブユニット存在下で出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの凝集が確認されたが、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉや黄色ブドウ球菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対しては、凝集活性は見られなかった。なお、コントロールとして用いたＢＳＡでは凝集は確認されなかった。さらに、５００μｇ／ｍｌのラミナリン存在下では、Ｚ２の凝集活性が阻害された。っまり、Ｚ２、および２Ｒ−Ｚ２、４Ｒ−Ｚ２はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのβ−１，３−グルカンと結合し、凝集活性を引き起こす事が明らかとなった。興味深い事に、Ｚ２でもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対して凝集活性を引き起こした。Ｚ２は、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｍｉｘｔｕｓのセルロース分解酵素のβ−グルカン認識ドメイン（非特許文献１６−１８）と４５％の配列類似性を示す。事実、この酵素にはｃｌｅｆｔＡ、Ｂと呼ばれる２つのβ−グルカン認識部位があり、Ｚ２にもβ−１，３−グルカン結合部位が２個存在することが推定されている。
【００６６】
実施例６
Ｚ−２付加タンパク質の酵母菌体による精製
Ｚ２、ＥＧＦＰ−Ｚ２の発現ベクターを組み込んだＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを５ｍｌのＬＢ培地中で培養し、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）存在下、２０℃、２４時間の培養条件で発現誘導を行なった。遠心分離により集菌した菌体を１ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７．５，１００ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で超音波破砕を行なった。超音波破砕後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により上清を回収し、３００μ１の酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ−３３株（Ｔｒｉｓ緩衝液で洗浄済み）と懸濁、４℃で２時間静置した。非結合画分を遠心分離により回収し、その後、酵母菌体を１ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液、Ｔｗｅｅｎ２０を含まないｔｒｉｓ緩衝液で洗浄し、０．０ｌ−１００ｍｇ／ｍｌのラミナリンを含むＴｒｉｓ緩衝液を用いて目的タンパク質の溶出を行なった。それぞれのサンプル１５μ１を１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、酵母に特異的に吸着したＺ２およびその付加タンパク質（ＥＧＦＰ−Ｚ２）が、ラミナリンにより溶出されることが確認された。また、酵母菌体に残るＺ２タンパク質の存在は確認されなかったため（図６．レーンＰＰＴ）、親和性カラムに結合したタンパク質のほとんどが回収できる事が示唆された。酵母の親和性担体としてのキャパシティーは、１ｍｌ酵母に対して、約１ｍｇのＺ２が吸着する。また、Ｚ２ドメインの溶出の際に１００μｇ／ｍｌのラミナリン濃度で効率的に溶出されることが判明した。加えて、様々なｐＨ条件（ｐＨ１−１２）や５ＭＮａＣｌなどの高塩濃度の条件、さらに１ｍｇ／ｍｌのラクトースやマルトース、スクロースなどの２糖ではＺ−２は、ほとんど溶出されなかった。そのため、これらの条件で洗浄が可能なため、高純度のＺ２融合タンパク質を精製可能である。
【００６８】
実施例７
Ｚ２−融合タンパク質のカードランカラムによる精製
Ｚ２、ＥＧＦＰ−Ｚ２の発現ベクターを組み込んだＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを５ｍｌのＬＢ培地中で培養し、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）存在下、２０℃、２０時間の培養条件で発現誘導を行なった。遠心分離により集菌した菌体を１ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７．５，１００ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で超音波破砕を行なった。超音波破砕後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４０℃、５分間）により、目的タンパク質を含む上清を回収し、１ｍｌのカードラン（Ｗａｋｏより購入）を充填したカラムへ添加した。その後、カードランカラムを５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液、さらに、５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を含まないＴｒｉｓ緩衝液で洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌのラミナリンを含むＴｒｉｓ緩衝液を用いて目的タンパク質の溶出を行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、高純度のＺ２（図７Ａのレーン３）およびその融合タンパク質（ＥＧＦＰ−Ｚ２）（図７Ｂのレーン３）が、カードランカラムからラミナリンにより溶出されることが確認された。素通り画分では目的のタンパク質がほとんど確認できなかったが（図７Ａ、Ｂのレーン２）、溶出画分では爽雑物のほとんどない目的タンパク質のバンドが確認できた（図７Ａ、Ｂのレーン３）。
【００６９】
なお、カードランとは、ある種のグラム陰性菌の分泌産物で不溶性のβ−１，３−グルカンである。一方、ラミナリンは、ある種のコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）の成分で、水溶性のβ−１，３−グルカンである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１Ａは、野生型ファクターＧのαサブユニット、および本明細書の実施例１において作成された組換えタンパク質の構造を示す。図１Ｂは、本明細書実施例２で合成されたラミナリオリゴ糖と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合物の構造を示す。図１Ｃは、図１Ｂの糖タンパク質の合成を確認したウエスタンブロットの結果である。
【図２】図２は、ラミナリトリオース−ＢＳＡと各種Ｚ２ドメインの結合解離強度を、表面プラズモン共鳴センサーを用いて測定した図である。
【図３】図３は、ラミナリペンタオース−ＢＳＡと各種Ｚ２ドメインの結合解離強度を、表面プラズモン共鳴センサーを用いて測定した図である。
【図４】図４は、蛍光Ｘｌｎ−Ｚ２タンパク質を用いた微生物検出の蛍光顕微鏡写真である。
【図５】図５は、Ｚ２ドメインを１つ、２つおよび４つ有する組換えタンパク質の真菌凝集活性を示す図である。
【図６】図６は、Ｚ２ドメインを有する組換えタンパク質の酵母菌体による精製を示すウエスタンブロットの結果である。Ａ：図１ＡのＺ２。Ｂ：図１ＡのＥＧＦＰ−Ｚ２。なお、図中の略語はそれぞれ以下の意味である：ＣＬは、組換えタンパク質を発現している大腸菌の超音波破砕物（組換えタンパク質を含む）。ＦＴは、超音波破砕物を酵母菌体と混合して、結合しなかった画分（遠心した上澄み）。Ｗはタンパク質が結合した酵母菌体を洗浄した液。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４はラミナリン溶液による溶出液の１回、２回、３回、４回の分析（１回ごとに溶出液を１ｍｌ用いた）。ＰＰＴは、溶出が終わった菌体破砕物（最終の遠心した沈殿物）。
【図７】図７は、Ｚ２ドメインを有する組換えタンパク質のカードランによる精製を示す結果である。Ａ：図１ＡのＺ２。Ｂ：図１ＡのＥＧＦＰ−Ｚ２。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を含む、真菌検出用キット。
【請求項２】
前記ドメインが、以下の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたいずれかのアミノ酸配列である、請求項１の真菌検出用キット：
（ｉ）配列番号１（野生型のＺ１ドメインのアミノ酸配列）；
（ｉｉ）（ｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２（野生型のＺ２ドメインのアミノ酸配列）；または、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項３】
前記ドメインが、配列番号２の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されており、そして以下のアミノ酸残基において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列である、請求項１または２の真菌検出用キット：
（１）１番目のグリシン
（２）２番目のアルギニン
（３）３番目のアルギニン
（４）４番目のアスパラギン
（５）１５番目のセリン
（６）１６番目のチロシン
（７）１８番目のグルタミン酸
（８）２５番目のロイシン
（９）３７番目のリジン
（１０）５４番目のセリン
（１１）５７番目のバリン
（１２）８６番目のイソロイシン
（１３）９２番目のロイシン
（１４）１０１番目のイソロイシン
（１５）１０６番目のロイシン
（１６）１１７番目のリジン
（１７）１２６番目のアルギニン、および
（１８）１３０番目のバリン。
【請求項４】
前記ドメインが配列番号３（実施例レベルの配列番号２においてｃｙｓ→ａｌａ置換のアミノ酸配列）である、請求項１または２の真菌検出用キット。
【請求項５】
前記ドメインを１ないし４つ含む、請求項１−４のいずれか１項の真菌検出用キット。
【請求項６】
前記タンパク質が結合するβ−１，３−グルカンがトリオース以上の多糖である、請求項１−５のいずれか１項の真菌検出用キット。
【請求項７】
前記タンパク質が、検出用ドメインをさらに含む、請求項１−６のいずれか１項の真菌検出用キット。
【請求項８】
システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を試料と接触させる工程を含む、真菌を検出する方法。
【請求項９】
前記ドメインが、以下の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたいずれかのアミノ酸配列である、請求項８の方法：
（ｉ）配列番号１（野生型のＺ１ドメインのアミノ酸配列）；
（ｉｉ）（ｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２（野生型のＺ２ドメインのアミノ酸配列）；または、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項１０】
前記ドメインが、配列番号２の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されており、そして以下のアミノ酸残基において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列である、請求項８または９の方法：
（１）１番目のグリシン
（２）２番目のアルギニン
（３）３番目のアルギニン
（４）４番目のアスパラギン
（５）１５番目のセリン
（６）１６番目のチロシン
（７）１８番目のグルタミン酸
（８）２５番目のロイシン
（９）３７番目のリジン
（１０）５４番目のセリン
（１１）５７番目のバリン
（１２）８６番目のイソロイシン
（１３）９２番目のロイシン
（１４）１０１番目のイソロイシン
（１５）１０６番目のロイシン
（１６）１１７番目のリジン
（１７）１２６番目のアルギニン、および
（１８）１３０番目のバリン。
【請求項１１】
前記ドメインが配列番号３（実施例レベルの配列番号２においてｃｙｓ→ａｌａ置換のアミノ酸配列）である、請求項８または９のいずれか１項の方法。
【請求項１２】
前記ドメインを１ないし４つ含む、請求項８−１１のいずれか１項の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が結合するβ−１，３−グルカンがトリオース以上の多糖である、請求項８−１２のいずれか１項の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が、検出用ドメインをさらに含む、請求項８−１３のいずれか１項の方法。
【請求項１５】
システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法であって、前記タンパク質をβ−１，３−グルカンを含む担体と接触させる工程を含む前記方法。
【請求項１６】
担体に含まれるβ−１，３−グルカンがトリオース以上の多糖である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
担体が、カードランおよび／またはラミナリンを含む担体である、請求項１５または１６の方法。
【請求項１８】
システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法であって、前記タンパク質を真菌と接触させる工程を含む前記方法。
【請求項１９】
真菌が酵母である、請求項１８の方法。
【請求項１】
システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を含む、真菌検出用キット。
【請求項２】
前記ドメインが、以下の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたいずれかのアミノ酸配列である、請求項１の真菌検出用キット：
（ｉ）配列番号１（野生型のＺ１ドメインのアミノ酸配列）；
（ｉｉ）（ｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２（野生型のＺ２ドメインのアミノ酸配列）；または、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項３】
前記ドメインが、配列番号２の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されており、そして以下のアミノ酸残基において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列である、請求項１または２の真菌検出用キット：
（１）１番目のグリシン
（２）２番目のアルギニン
（３）３番目のアルギニン
（４）４番目のアスパラギン
（５）１５番目のセリン
（６）１６番目のチロシン
（７）１８番目のグルタミン酸
（８）２５番目のロイシン
（９）３７番目のリジン
（１０）５４番目のセリン
（１１）５７番目のバリン
（１２）８６番目のイソロイシン
（１３）９２番目のロイシン
（１４）１０１番目のイソロイシン
（１５）１０６番目のロイシン
（１６）１１７番目のリジン
（１７）１２６番目のアルギニン、および
（１８）１３０番目のバリン。
【請求項４】
前記ドメインが配列番号３（実施例レベルの配列番号２においてｃｙｓ→ａｌａ置換のアミノ酸配列）である、請求項１または２の真菌検出用キット。
【請求項５】
前記ドメインを１ないし４つ含む、請求項１−４のいずれか１項の真菌検出用キット。
【請求項６】
前記タンパク質が結合するβ−１，３−グルカンがトリオース以上の多糖である、請求項１−５のいずれか１項の真菌検出用キット。
【請求項７】
前記タンパク質が、検出用ドメインをさらに含む、請求項１−６のいずれか１項の真菌検出用キット。
【請求項８】
システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を試料と接触させる工程を含む、真菌を検出する方法。
【請求項９】
前記ドメインが、以下の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されたいずれかのアミノ酸配列である、請求項８の方法：
（ｉ）配列番号１（野生型のＺ１ドメインのアミノ酸配列）；
（ｉｉ）（ｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２（野生型のＺ２ドメインのアミノ酸配列）；または、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の配列のシステイン以外のアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項１０】
前記ドメインが、配列番号２の配列においてシステイン残基が他のアミノ酸に置換されており、そして以下のアミノ酸残基において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列である、請求項８または９の方法：
（１）１番目のグリシン
（２）２番目のアルギニン
（３）３番目のアルギニン
（４）４番目のアスパラギン
（５）１５番目のセリン
（６）１６番目のチロシン
（７）１８番目のグルタミン酸
（８）２５番目のロイシン
（９）３７番目のリジン
（１０）５４番目のセリン
（１１）５７番目のバリン
（１２）８６番目のイソロイシン
（１３）９２番目のロイシン
（１４）１０１番目のイソロイシン
（１５）１０６番目のロイシン
（１６）１１７番目のリジン
（１７）１２６番目のアルギニン、および
（１８）１３０番目のバリン。
【請求項１１】
前記ドメインが配列番号３（実施例レベルの配列番号２においてｃｙｓ→ａｌａ置換のアミノ酸配列）である、請求項８または９のいずれか１項の方法。
【請求項１２】
前記ドメインを１ないし４つ含む、請求項８−１１のいずれか１項の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が結合するβ−１，３−グルカンがトリオース以上の多糖である、請求項８−１２のいずれか１項の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が、検出用ドメインをさらに含む、請求項８−１３のいずれか１項の方法。
【請求項１５】
システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法であって、前記タンパク質をβ−１，３−グルカンを含む担体と接触させる工程を含む前記方法。
【請求項１６】
担体に含まれるβ−１，３−グルカンがトリオース以上の多糖である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
担体が、カードランおよび／またはラミナリンを含む担体である、請求項１５または１６の方法。
【請求項１８】
システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターＧ αサブユニット Ｘｌｎ Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ−１，３−グルカンに結合可能な組換えタンパク質を精製する方法であって、前記タンパク質を真菌と接触させる工程を含む前記方法。
【請求項１９】
真菌が酵母である、請求項１８の方法。
【図２】
【図３】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−４７５８８（Ｐ２００９−４７５８８Ａ）
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１４７７８（Ｐ２００７−２１４７７８）
【出願日】平成１９年８月２１日（２００７．８．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年７月１０日 日本糖質学会発行の「第２７回日本糖質学会年会要旨集」に発表
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２１日（２００７．８．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年７月１０日 日本糖質学会発行の「第２７回日本糖質学会年会要旨集」に発表
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
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