カルジオリピン調製の方法および工程
本発明は様々な脂肪酸鎖長を有するカルジオリピンおよびカルジオリピン類似体、特に１，１’，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピンを調製する新規な方法を提供する。本方法は、１，２−Ｏ−ｓｎ−ジアシルグリセリンなどの出発化合物および２−保護グリセリンをホスホロアミダイト試薬と反応させて保護されたカルジオリピンを得て、この保護されたカルジオリピンを脱保護してカルジオリピンを調製することを含む。カルジオリピンおよびカルジオリピン類似体は、トリフルオロ酢酸ピリジニウムなどの活性化剤の存在下で調製してよい。本発明の方法を使用してカルジオリピンおよびカルジオリピン類似体を大量に調製する。本発明の方法によって調製されたカルジオリピンはリポソーム中に組み込むことができ、このリポソームは疎水性または親水性の薬剤などの活性薬剤をも含むことができる。かかるリポソームは疾患を治療するためにまたは診断および／もしくは分析アッセイにおいて使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカルジオリピンおよびカルジオリピン類似体の調製のための新規な方法に関する。より詳しくは、本発明は活性化剤を使用するホスホロアミダイト法によってカルジオリピンおよびカルジオリピン類似体を調製する方法に関する。さらに、本発明の方法はカルジオリピンおよびカルジオリピン類似体を大量に調製するために使用される。
【背景技術】
【０００２】
（ジホスファチジルグリセリンとしても知られている）カルジオリピンは、通常心筋および骨格筋のミトコンドリアを含む高代謝活性を伴う組織の細胞膜から精製される複合体アニオン性リン脂質の一群を構成する。カルジオリピンの負の表面電荷は、リポソームを凝集依存性の取り込みに対して安定化させる。しかし、カルジオリピンの脂肪酸鎖の長さおよび性格（すなわち飽和か不飽和か）が、リポソームの凝集に対して与える可能性がある効果は解明されていない。
【０００３】
カルジオリピンを合成するための知られている方法は、主に２つのグループに分けられる：（ａ）ホスホリル化剤を使用して２−保護グリセリンの第一級ヒドロキシル基を、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセリンとカップリングさせること、および（ｂ）２−保護グリセリンの両方の第一級ヒドロキシル基における、ホスファチジン酸との２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（ＴＰＳ）またはピリジンの存在下での縮合（Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１１，７６９−７７０（１９７６）、Ｄｕｒａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１６０７−１６１０（１９９８）、Ｓａｕｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８８，３８４４−３８４７（１９６６）、 Ｍｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．，１１，９９２−９９４（１９８５）、およびＳｔｅｐａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｚｈ．Ｏｒｇ．，Ｋｈｉｍ．，２０，９８５−９８８（１９８４）を参照されたい。）。カルジオリピンは、ジアシルグリセロ燐酸エステルの銀塩と１，３−ジヨードプロパノールベンジルエーテルまたは１，３−ジヨードプロパノールｔ−ブチルエーテルとの間の反応によっても生成されてきた（Ｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１６，１１４−１２４（１９６６）、およびＩｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１１，１１５０−１１５６（１９６３）を参照されたい。）。これらの方法は構造を確認するためのカルジオリピンの分析用量の調製には適当であるが、関与する多くのステップ、中間体の注意深い精製の必要性ならびに高度に感光性の銀塩中間体および不安定なヨウ素中間体の使用のために、製造目的での大量の日常的調製のためには実用的でない。
【０００４】
リン酸トリエステルおよびホスホロアミダイトエステルは、核酸の合成においてリン酸結合を形成させるために幅広く、またリン脂質の合成においてより狭い範囲で使用されてきた（Ｂｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ，１，６５３−６５７（２０００）を参照されたい。）。これに関しては、上記のＢｒｏｗｎｅらは、ホスホロアミダイト法を使用するリン脂質類似体、特にホスホリルコリン類似体の調製を記載している。ホスファチジルイノシトールＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２およびＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、ならびにこれらの誘導体は、様々なホスホロアミダイト試薬を使用して調製されており、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，３５，１２３−１２４（１９９４）を参照されたい。）、ジフルオレニルホスホロアミダイト（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３８，７４０７−７４１０（１９９７））およびジアシルグリセリンを（ベンジルオキシ）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンと反応させることによって生成する試薬（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，６１，６３０５−６３１２（１９９６）およびＰｒｅｓｔｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２９，５０３−５１３（１９９６）を参照されたい。）が含まれる。加えて、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２およびＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のホスホトリエステル類似体が、ホスホロアミダイト試薬２−シアノ−エチルＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを利用して調製されている（例えば、Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，６１，８６４２−８６４７（１９９６）を参照されたい。）。さらに、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，６４，６４８−６５１（１９９９）は、メチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトをホスホリル化剤として利用する２，５−ジベンジル−Ｄ−マンニトールからのホスファチジルグリセリンの合成を記載している。
【０００５】
最近、カルジオリピン、特に様々な長さの脂肪鎖を有するカルジオリピン種などのリン脂質の調製におけるホスホロアミダイトエステルの使用が報告されている（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ，３９，２８５−２９０（２００４）、Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，４５，２０７７−２０７９（２００４）、Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ，３９，５９５−６００（２００４）、Ａｈｍａｄ ｅｔ．ａｌ．の米国特許出願第２００５／０１８１０３７Ａ１号およびＡｒｍａｄ ｅｔ．ａｌ．，の米国特許出願第２００５／０２６６０６８Ａ１号を参照されたい。）。前述の合成スキームの全てにおいて、第１ステップは１，２−Ｏ−ジアシル−ｓｎ−グリセリンの１つまたは複数のホスホロアミダイト試薬との反応を含み、これに２−保護グリセリンとのカップリングが続き、ここで保護されたカルジオリピンが生成する。これらの反応におけるホスホロアミダイト試薬は１Ｈ−テトラゾールによって活性化された。
【０００６】
１Ｈ−テトラゾールはホスフィチル化反応において使用される最も一般的な活性化剤である。しかし、大規模な合成における１Ｈ−テトラゾールの使用は、これの爆発性および強い毒性のために制限される。これは使用、投棄および貯蔵の間に特別な取り扱いが必要である。さらに、１Ｈ−テトラゾールは、極めて高価でもあり、それ故にコスト効率的なカルジオリピンの合成のためには実用的でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
様々な脂肪酸鎖長を有する飽和および不飽和のカルジオリピン種の大量を調製するために使用することができる新規の合成方法に対する必要性が存在する。より幅広い種類のカルジオリピン種の入手可能性を増大し、および現在入手可能なものよりも明確な組成を含む活性薬剤を含有する新規のリポソーム配合物の開発のために利用可能な脂質を多様化する、新規の合成方法に対する必要性も存在する。
【０００８】
本発明はこうした方法を提供する。本発明のこれらのおよび他の利点は、発明のさらなる特徴と同様に、本明細書に提示する本発明の記載から明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明は様々な脂肪酸鎖長を有するカルジオリピンを調製するための方法を提供する。この方法は、（ａ）光学的に純粋な１，２−二置換−ｓｎ−グリセリンを１つまたは複数のホスホロアミダイト試薬と反応させるステップと；（ｂ）（ａ）の生成物を２−Ｏ保護または２−Ｏ置換グリセリンと活性化剤の存在下で反応させるステップとを含む。本発明の方法は、カルジオリピンおよびカルジオリピン類似体を大量に製造するために使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は一般式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ
【００１１】
【化８】
【００１２】
【化９】
を有するカルジオリピンの変形体および類似体を調製する方法を記載する。
【００１３】
式ＩＩＩにおいて、Ｙ１およびＹ２は、同一でありまたは異なり、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−などである。式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩにおいて、Ｒ１およびＲ２は、同一でありまたは異なり、Ｈ、飽和および／または不飽和のアルキル基、好ましくはＣ２からＣ３４の飽和および／または不飽和のアルキル基である。式ＩＩＩにおいて、Ｒ３は（ＣＨ２）ｎであり、ｎ＝０−１５である。式ＩＩＩにおいて、Ｒ４は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ペプチド、ジペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物（グルコース、マンノース、ガラクトース、多糖類など）、複素環、ヌクレオシド、ポリヌクレオチドなどである。式ＩＩＩにおいて、Ｒ５はリンカーであり、このリンカーは必要性および用途に応じて分子中に加えても（加えなくても）よい。しかし、加える場合は、Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、ポリアルキルオキシ［例えば、約１から５００個のアルキルオキシ体を含有する（および少なくとも約１０個のアルキルオキシ体、例えば少なくとも約５０個のアルキルオキシ体または少なくとも約１００個のアルキルオキシ体、例えば少なくとも約２００個のアルキルオキシ体、または少なくとも約３００個のアルキルオキシ体または少なくとも約４００個のアルキルオキシ体を有することができる）ＰＥＧ化されたエーテル、置換ポリアルキルオキシなど］、
【化１０】
ペプチド、ジペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物例（例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、多糖類など）を含むことができる。式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩにおいて、Ｘは無毒のカチオン、好ましくは、水素、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウムイオンなどである。
【００１４】
最も好ましい実施形態によれば、式ＩＩＩ中のＹ１およびＹ２は−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｏ−であり、Ｒ１およびＲ２は同一であり、Ｃ２からＣ２４の飽和および／または不飽和のアルキル基、より好ましくは４から１８個の間の炭素原子（約６から１４個の炭素原子など）である。Ｒ３は最も好ましくはＣＨ２である。Ｘは最も好ましくは水素またはアンモニウムイオンである。リンカー（Ｒ５）が不在の場合は、カルジオリピンの一般的構造が開示される。
【００１５】
本発明は式ＩＶ
【００１６】
【化１１】
のアルコールを、活性化剤の存在下で１つまたは複数のホスホロアミダイト試薬および２−Ｏ−保護グリセリンまたは式Ｖのジオールと反応させることを含む、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのカルジオリピンまたはこれの類似体を調製する方法を提供する。式ＩＶにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｙ１、およびＹ２は、上記で式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに関して示した通りでよい。式Ｖにおいて、Ｒ４およびＲ５は、上記で式ＩＩＩに関して示した通りでよい。本発明の方法によれば、活性化剤は反応を促進させることができるどの適当なピリジニウム塩であってもよい。かかるピリジニウム塩の例には、ピリジニウム塩酸塩、ピリジニウムトリフレート、酢酸ピリジニウム、クロロ酢酸ピリジニウム、ジクロロ酢酸ピリジニウム、トリクロロ酢酸ピリジニウムおよびトリフルオロ酢酸ピリジニウムが含まれる。本発明の方法によれば、カップリングホスホロアミダイトは式ＶＩまたはＶＩＩ
【００１７】
【化１２】
を有することができる。
【００１８】
好ましい手順に従えば、本発明は式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのカルジオリピンまたはこれの類似体を調製する方法を提供する。この方法は、２−Ｏ保護グリセリンまたはジオールを１つまたは複数のホスホトリエステルとピリジニウムトリブロマイドの存在下で反応させるステップを含む。好ましいホスホトリエステルは、式ＩＶのアルコールの一般式ＶＩＩＩのホスホロアミダイトとの活性化剤の存在下での反応によって製造することができる。
【００１９】
【化１３】
【００２０】
式ＶＩ、ＶＩＩまたはＶＩＩＩ中のＲ６はリン酸保護基、好ましくはメチル基、ベンジル基または２−シアノエチルもしくはシリル基である。適当な保護基の他の例には、エチル、シクロヘキシル、ｔ−ブチルを含むアルキルホスフェート；２−シアノエチル、４−シアノ−２−ブテニル、２−（メチルジフェニルシリル）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチルを含む２−置換エチルホスフェート；２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチルを含むハロエチルホスフェート；４−クロロベンジル、フルオレニル−９−メチル、ジフェニルメチルを含むベンジルホスフェートおよびアミデートが含まれる。
【００２１】
本発明の方法によれば、好ましい活性化剤は式ＩＸを有するピリジニウムトリフルオロ酢酸塩である。ピリジニウムトリフルオロ酢酸塩は、安価、安定性、無毒、有機溶媒に高溶解性、より低酸性および１−Ｈ−テトラゾールよりも取り扱いが安全である。しかし、次だけには限定されないが、ピリジニウム塩酸塩、ピリジニウムトリフレート、酢酸ピリジニウム、クロロ酢酸ピリジニウム、ジクロロ酢酸ピリジニウムおよびトリクロロ酢酸ピリジニウムを含む他の任意の他のピリジニウム塩も使用することができることが企図されている。
【００２２】
【化１４】
【００２３】
本発明によるカルジオリピンまたはこれの類似体の合成のための反応の一般的な順序を図１および２に例示する。本発明は、様々な脂肪酸鎖長を有するカルジオリピン１を調製するための、（ａ）光学的に純粋な１，２−二置換−ｓｎ−グリセリンＩＶを一般式ＶＩ（図１）またはＶＩＩ（図２）の１つまたは複数のホスホロアミダイト試薬と反応させるステップと、（ｂ）（ａ）の生成物２を２−Ｏ−保護グリセリンＸ（式Ｘ中のＲ４はヒドロキシル保護基、好ましくはアルキル基など、またはシリル保護基である。）と塩素化された溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルムなど）中でカップリングさせ、続いてｍ−クロロペルオキシ安息香酸（ｍ−ＣＰＢＡ）または過酸化水素またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）を用いる酸化が保護されたカルジオリピン３の生成をもたらすステップとを含む、一般的方法を提供する。その後、保護されたカルジオリピンの脱保護に続くアンモニウム塩への転化がカルジオリピン１（アンモニウム塩）の生成をもたらす。合成方法のこの状況において好ましい活性化剤はトリフルオロ酢酸ピリジニウムである。
【００２４】
光学的に純粋な１，２−二置換−ｓｎ−グリセリンＩＶとの反応のためには、例えばＢｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．の上記文献に記載されているものなどの、任意の適当なホスホロアミダイト試薬または方法でも使用することができる。適当なホスホロアミダイト試薬の例には、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミジッククロリド（例えば、Ｂｒｕｚｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：２４１５−２４１８（１９９５）を参照されたい。）、（ベンジルオキシ）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（例えば、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１３，１８２２−１８２５，（１９９１）を参照されたい。）、ベンジルオキシビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（例えば、Ｄｒｅｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２９，６５１３−６５１６，（１９８８）を参照されたい。）；２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｂｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，６５３−６５７，（２０００）を参照されたい。）、（２−シアノエチル）（Ｎ，Ｎ，−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（例えば、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，６５１１−６５２２，（１９９８）を参照されたい。）ジフルオレニルジイソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８，７４０７−７４１０．（１９９７）を参照されたい。）、メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（例えば、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，６４８−６５１（１９９９）を参照されたい。）、ジメチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４，４９７−５００（１９９３）を参照されたい。）、ジベンジルジイソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４１、８５０９−８５１２（２０００）を参照されたい。）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７，１９４−１９９，（２００２）を参照されたい。）、２−（ジフェニルメチルシリル）エチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２，１８５９−１８６１，（２０００）を参照されたい。）、（Ｎ−トリフルオロアセチルアミノ）ブチルおよび（Ｎ−トリフルオロアセチルアミノ）ペンチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｗｉｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２，６７１２−６７１３，（１９９７）を参照されたい。）が含まれる。
【００２５】
本発明の他の実施形態を図３に示す。この方法では、光学的に純粋な１，２−二置換−ｓｎ−グリセリンＩＶをホスホロアミダイトＶＩＩＩおよびトリフルオロ酢酸ピリジニウムを使用してホスホリル化し、ホスファイトトリエステル４を得ることができ、このトリエステルは任意の適当な２−Ｏ−保護グリセリンＸ、例えばベンジルオキシ１，３−プロパンジオールまたは２−レブリノイル−１，３−プロパンジオールなどとピリジニウムペルブロミドおよびホスホニウム塩法を使用してカップリングさせて（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．の上記文献を参照されたい。）保護されたカルジオリピン３を得ることができる。合成方法のこの状況において好ましいカップリング試薬はジベンジルジイソプロピルホスホロアミダイトであり、好ましい活性化剤はトリフルオロ酢酸ピリジニウムである。
【００２６】
本発明の最も好ましい方法を図４に示す。この図には１，１’ ，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピン（Ｃ１４：０）１１の合成スキームの概要を示す。この合成は光学的に純粋な１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセリン５のＮ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホロアミダイトクロリド６とのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）などの塩基の存在下におけるジクロロメタンなどの適当な溶媒中での反応を含む。得られた中間体７は、ｉｎ ｓｉｔｕでベンジルオキシ１，３−プロパンジオール８とトリフルオロ酢酸ピリジニウムの存在下における塩素化された溶媒（例えばジクロロメタン、クロロホルムなど）中でカップリングさせ、続いてｍ−クロロペルオキシ安息香酸（ｍ−ＣＰＢＡ）または過酸化水素を用いて酸化することにより保護されたカルジオリピン９の生成に至る。次いで保護されている前駆体９のメチル基を、ヨウ化ナトリウムを用いる反応によって除去するとカルジオリピンのナトリウム塩が生成し、次いでこのカルジオリピンのナトリウム塩を希ＨＣｌに続いて希水酸化アンモニウムを用いる処理によってアンモニウム塩１０に転化させる。接触水素化によるベンジル保護基の脱保護はテトラミリストイルカルジオリピン１１（アンモニウム塩）をもたらす。
【００２７】
本発明の中間体および最終生成物は、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレン、メタノールおよびアセトンなどの一般的な有機溶媒の単一物または混合物を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００２８】
本発明において中間体および生成物の結晶化に使用することができる適当な溶媒には、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどの炭化水素；メチレンクロリド、クロロホルム、１，２−ジクロロエタンなどの塩素化された溶媒；アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブチルアルコールなど；ケトン、例えば、アセトン、２−ブタノンなど、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、トルエンなどが含まれる。結晶化用の溶媒は単一溶媒または溶媒の混合物、例えば、ヘキサン−酢酸エチル、クロロホルム−アセトン、クロロホルム−メタノール、ジクロロメタン−メタノールなどを使用することができる。本発明において溶媒の混合物を使用する場合は、１つの溶媒と他の溶媒の比は、９：１から１：９、例えば８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、１：９などである。
【００２９】
本発明は中間体を一般的な溶媒を用いる結晶化によって得る好都合な方法をも提供し、それによって大掛かりなカラムクロマトグラフィー精製の必要性を排除する。最終の粗生成物はカラムクロマトグラフィーによって精製することができる。本発明の１つの目的は、少なくとも８０％の純度を有する、例えば少なくとも９０％純粋なまたは少なくとも９５％純粋なまたは少なくとも９８％純粋なまたは少なくとも９９％純粋なまたは少なくとも１００％純粋なカルジオリピンを調製する方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、カルジオリピンをコスト効率のよい仕方で調製する方法を提供することである。
【００３０】
「アルキル」という用語は、飽和または不飽和で直鎖および分岐鎖の炭化水素部分を包含する。「置換アルキル」という用語は、ヒドロキシ、（低級アルキル基の）アルコキシ、（低級アルキル基の）メルカプト、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、アミド、イミド、イミノ、チオ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、アシル、オキシアシルカルボキシルなどから選択された１つまたは複数の置換基をさらに持っているアルキル基を含む。
【００３１】
本発明の方法は、様々な長さおよび飽和の脂肪酸鎖を含むカルジオリピン種を調製するために使用することができる。リン脂質脂肪酸の一般的構造は、１つの炭化水素鎖および１つのカルボン酸基を含む。一般には、脂肪酸の炭化水素鎖の長さは約４個から約３４個の炭素原子の範囲であるが、炭素鎖はより通常には約１２個から２４個の間の炭素原子である。一部の実施形態においては、炭化水素鎖は、例えば少なくとも約５個の炭素原子または少なくとも約１０個の炭素原子または少なくとも約１５個の炭素原子を含むことが望ましい。通常、脂肪酸の炭化水素の長さは約３０個の炭素原子よりも短く、例えば約２５個の炭素原子より短いまたは約２０個の炭素原子より短くさえある。
【００３２】
最も好ましくは、本発明の方法によって調製されるカルジオリピンは、脂肪酸鎖を含み（すなわち「短鎖」カルジオリピン）、本発明は短鎖カルジオリピンを提供する。短い脂肪酸鎖は約４個から約１４個の間の炭素原子を含み、および約６個から約１２個の間の炭素原子、例えば約８個から約１０個の間の炭素原子を有することができる。あるいは、本発明の方法によって製造されるカルジオリピンは長鎖脂肪酸を含むことができる（すなわち「長鎖」カルジオリピン）。長鎖脂肪酸は、約２２個から約３０個の間の炭素原子、例えば約２４個から約２８個の間の炭素原子を含む。本発明の方法は短鎖または長鎖のカルジオリピン種の製造に排他的に限定されるものではない。実際に、中間的な長さの脂肪酸鎖を含有するカルジオリピンも本発明の方法によって調製することができることが企図されている。
【００３３】
リン脂質の脂肪酸は通常、炭化水素鎖中の二重および／または三重結合（すなわち不飽和）の数によって分類される。飽和脂肪酸は二重または三重結合を含まず、鎖中のそれぞれの炭素は最大数の水素原子に結合している。脂肪酸の不飽和度は、炭化水素鎖中において存在する二重または三重結合の数によって決まる。これに関しては、一価不飽和脂肪酸は１つの二重結合を含有し、多価不飽和脂肪酸は２つ以上の二重結合を含有する（例えば、「オックスフォード生化学・分子生物学辞書（Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，ｒｅｖ．ｅｄ．，Ａ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈ（ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）、および「細胞の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ）」，３ｒｄ ｅｄ．，Ｂ．Ａ．Ａｌｂｅｒｔｓ（ｅｄ．），Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたい。）。本発明の方法によって調製されるカルジオリピンの脂肪酸鎖は、短くても長くても、飽和であることも不飽和であることもできる。
【００３４】
記載した方法は様々な新規のカルジオリピン分子を調製するために使用することができる。例えば、これらの方法は、短い脂肪酸鎖や長い脂肪酸鎖を含有する純粋な形態のカルジオリピン変形体を調製するために使用することができる。好ましい脂肪酸は約Ｃ２からＣ３４、好ましくは約Ｃ４から約Ｃ２４の間にわたり、とりわけテトラ酸（Ｃ４：０）、ペンタン酸（Ｃ５：０）、ヘキサン酸（Ｃ６：０）ヘプタン酸（Ｃ７：０）、オクタン酸（Ｃ８：０）、ノナン酸（Ｃ９：０）、デカン酸（Ｃ１０：０）、ウンデカン酸（Ｃ１１：０）、ドデカン酸（Ｃ１２：０）、トリデカン酸（Ｃ１３：０）、テトラデカン（ミリスチン）酸（Ｃ１４：０）、ペンタデカン酸（Ｃ１５：０）、ヘキサデカン（パルミチン）酸（Ｃ１６：０）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７：０）、オクタデカン（ステアリン）酸（Ｃ１８：０）、ノナデカン酸（Ｃ１９：０）、エイコサン（アラキジン）酸（Ｃ２０：０）、ヘンエイコサン酸（Ｃ２１：０）、ドコサン（ベヘン）酸（Ｃ２２：０）、トリコサン酸（Ｃ２３：０）、テトラコサン酸（Ｃ２４：０）、１０−ウンデセン酸（Ｃ１１：１）、１１−ドデセン酸（Ｃ１２：１）、１２−トリデセン酸（Ｃ１３：１）、ミリストオレイン酸（Ｃ１４：１）、１０−ペンタデセン酸（Ｃ１５：１）、パルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、リノレン酸（Ｃ１８：３）、エイコセン酸（Ｃ２０：１）、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２）、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３）、アラキドン酸（ｃｉｓ−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）、およびｃｉｓ−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸を含む。エーテル類似体についても、アルキル鎖はＣ２からＣ３４、好ましくは約Ｃ４から約Ｃ２４の間にわたる。他の脂肪酸鎖もＲ１および／またはＲ２置換基として使用することができる。例には飽和脂肪酸、例えばエタン（または酢）酸、プロパン（またはプロピオン）酸、ブタン（または酪）酸、ヘキサコサン（またはセロチン）酸、オクタコサン（モンタン）酸、トリアコンタン（またはメリシン）酸、ドトリアコンタン（またはラッセル）酸、テトラトリアコンタン（またはゲダ）酸、ペンタトリアコンタン（またはセロプラスン）酸など；モノエチレン性不飽和脂肪酸、例えばｔｒａｎｓ−２−ブテン（またはクロトン）酸、ｃｉｓ−２−ブテン（またはイソクロトン）酸、２−ヘキセン（またはイソヒドロソルビン）酸、４−デカン（またはオブツシル）酸、９−デカン（またはカプロレイン）酸、４−ドデセン（またはリンデル）酸、５−ドデセン（またはデンチセチン）酸、９−ドデセン酸（またはラウロレイン）酸、４−テトラデセン（またはツズ）酸、５−テトラデセン（またはフィセテリン）酸、６−オクタデセン（またはペトロセレン）酸、ｔｒａｎｓ−９−オクタデセン（エライジン）酸、ｔｒａｎｓ−１１−オクタデセン（またはバクシン）酸、９−エイコセン（またはガドレイン）酸、１１−エイコセン（またはゴンドイン）酸、１１−ドコセン（またはセトレイン）酸、１３−ドコセン（またはエルカ）酸、１５−テトラコセン（またはネルボン）酸、１７−ヘキサコセン（またはキシメン）酸、２１−トリアコンテン（またはルメクエン）酸など；ジエン性不飽和脂肪酸、例えば２，４−ペンタジエン（またはβ−ビニルアクリル）酸、２，４−ヘキサジエン（またはソルビン）酸、２，４−デカジエン（またはスチリンギン）酸、２，４−ドデカジエン酸、９，１２−ヘキサデカジエン酸、ｃｉｓ−９，ｃｉｓ−１２−オクタデカジエン（またはα−リノール）酸、ｔｒａｎｓ−９，ｔｒａｎｓ−１２−オクタデカジエン（またはリノレンエライジン）酸、ｔｒａｎｓ−１０，ｔｒａｎｓ−１２−オクタデカジエン酸、１１，１４−エイコサジエン酸、１３，１６−ドコサジエン酸、１７，２０−ヘキサコサジエン酸など；トリエン性不飽和脂肪酸、例えば６，１０，１４−ヘキサデカトリエン（またはヒラゴン）酸、７，１０，１３−ヘキサデカトリエン酸、ｃｉｓ−６，ｃｉｓ−９−ｃｉｓ−１２−オクタデカトリエン（またはγ−リノール）酸、ｔｒａｎｓ−８，ｔｒａｎｓ−１０−ｔｒａｎｓ−１２−オクタデカトリエン（またはβ−カレンディン）酸、ｃｉｓ−８，ｔｒａｎｓ−１０−ｃｉｓ−１２−オクタデカトリエン酸、ｃｉｓ−９，ｃｉｓ−１２−ｃｉｓ−１５−オクタデカトリエン（またはα−リノレン）酸、ｔｒａｎｓ−９，ｔｒａｎｓ−１２−ｔｒａｎｓ−１５−オクタデカトリエン（またはα−リノールエライジン）酸、ｃｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１１−ｔｒａｎｓ−１３−オクタデカトリエン（またはα−エレオステアリン）酸、ｔｒａｎｓ−９，ｔｒａｎｓ−１１−ｔｒａｎｓ−１３−オクタデカトリエン（またはβ−エレオステアリン）酸、ｃｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１１−ｃｉｓ−１３−オクタデカトリエン（またはプニカ）酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸、８，１１，１４−エイコサトリエン酸など；テトラエン性不飽和脂肪酸、例えば４，８，１１，１４−ヘキサデカテトラエン酸、６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸、４，８，１２，１５−オクタデカテトラエン（モロクチン）酸、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、９，１１，１３，１５−オクタデカテトラエン（またはα−またはβ−パリナリン）酸、９，１２，１５，１８−オクタデカテトラエン酸、４，８，１２，１６−エイコサテトラエン酸、６，１０，１４，１８−エイコサテトラエン酸、４，７，１０，１３−ドコサテトラエン酸、７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸、８，１２，１６，１９−ドコサテトラエン酸など；ペンタ−およびヘキサエン性不飽和脂肪酸、例えば４，８，１２，１５，１８−エイコサペンタエン（またはチムノドン）酸、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、４，８，１２，１５，１９−ドコサペンタエン（またはクルパノドン）酸、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸、４，８，１２，１５，１８，２１−テトラコサヘキサエン（またはニシン）酸など；分岐鎖脂肪酸、例えば３−メチルブタン（またはイソ吉草）酸、８−メチルドデカン酸、１０−メチルウンデカン（またはイソラウリン）酸、１１−メチルドデカン（またはイソウンデシル）酸、１２−メチルトリデカン（またはイソミリスチン）酸、１３−メチルテトラデカン（またはイソペンタデシル）酸、１４−メチルペンタデカン（またはイソパルミチン）酸、１５−メチルヘキサデカン酸、１０−メチルヘプタデカン酸、１６−メチルヘプタデカン（またはイソステアリン）酸、１８−メチルノナデカン（またはイソアラキジン）酸、２０−メチルヘンエイコサン（またはイソベヘン）酸、２２−メチルトリコサン（またはイソリグノセリン）酸、２４−メチルペンタコサン（またはイソセロチン）酸、２６−メチルヘプタコサン（またはｉｓｏｍｏｎａｔｏｎｉｃ）酸、２，４，６−トリメチルオクタコサン（またはｍｙｃｏｃｅｒａｎｉｃまたはｍｙｃｏｓｅｒｏｓｉｃ）酸、２−メチル−ｃｉｓ−２−ブテン（アンゲリカ）酸、２−メチル−ｔｒａｎｓ−２−ブテン（チグリン）酸、４−メチル−３−ペンテン（またはｐｙｒｏｔｅｒｅｂｉｃ）酸などを含む。
【００３５】
本明細書で使用する「ヒドロキシ保護基」という用語は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｗｕｔｓ，「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）によって開示されている一般に使用される保護基を指す。かかる保護基には、メチルエーテル、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニルエーテルを含む置換メチルエーテル；１−エトキシエチルのような置換エチルエーテル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、アリル、プロパルギル；ベンジルおよびｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、トリフェニルメチルを含む置換ベンジルエーテル；トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、ジフェニルメチルシリルを含むシリルエーテル；ホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、ベンゾエート、レブリニレートおよびカーボネートを含むエステルが含まれる。
【００３６】
本明細書で使用する「リン酸保護基」という用語は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｗｕｔｓ，「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）によって記載されている一般に使用される保護基を指す。かかる保護基には、メチル、エチル、シクロヘキシル、ｔ−ブチルを含むアルキルホスフェート；２−シアノエチル、４−シアノ−２−ブテニル、２−（メチルジフェニルシリル）エチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチルを含む２−置換エチルホスフェート；２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチルを含むハロエチルホスフェート；４−クロロベンジル、フルオレニル−９−メチル、ジフェニルメチルを含むベンジルホスフェートおよびアミデートが含まれる。
【００３７】
本明細書で記載しているカルジオリピン分子および本発明の方法によって製造されるカルジオリピンは脂質製剤中で使用することができる。本発明のカルジオリピンを含んでいる複合体、エマルジョンおよび他の製剤も本発明の範囲内である。本発明によるかかる製剤は任意の適当な技法によって調製することができる。リポソーム組成物、複合体、エマルジョンなどは、本発明のカルジオリピンに加えて、他の成分のうち安定剤、吸収促進剤、酸化防止剤、リン脂質、生分解性ポリマーおよび医薬的に活性な薬剤を含むことができる。一部の実施形態では、本発明の組成物、特にリポソーム組成物は、１つまたは複数の標的化剤、例えば炭水化物、タンパク質または抗体（またはその断片）もしくは細胞の受容体を識別するリガンドなどの特定の基質に結合する他のリガンドを含むことが好ましい。かかる剤（炭水化物または抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチドホルモン、細胞受容体に対する抗体などの受容体リガンドおよびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質など）の包含はリポソームが所定の組織または細胞種を標的とすることを促進することができる。
【００３８】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、言うまでもなく、決してその範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００３９】
本実施例は、１，１’ ，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピン１１を調製する方法を実例によって説明する。化合物１１
【００４０】
【化１５】
は、図４に概要を示す合成経路によって合成することができる。１，２−Ｏ−ミリストイル−ｓｎ−グリセリン５（１４８ｇ、２８２．２０ｍｍｏｌ）および乾燥Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５９ｍＬ、３３８．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．７Ｌ）中溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミドクロリド６（５９ｇ、２９９ｍｍｏｌ）を室温で３０分間かけて滴加した。反応混合物を室温で２時間撹拌後、トリフルオロ酢酸ピリジニウム（６５．６ｇ、３３９．２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物にＣＨ２Ｃｌ２（２８０ｍＬ）中の２−ベンジルオキシ−１，３−プロパンジオール８（２５ｇ、１３７．２０ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。次いで反応混合物を５−１０℃（内部温度）まで冷却し、３５％過酸化水素溶液（３５ｍＬ、４２４．８ｍｍｏｌ）を、反応混合物の温度が１０℃未満に保たれるように加えた。２５℃まで温まったら混合物を分液ロートへ移して１０％チオ硫酸ナトリウム溶液（３４０ｍＬ）、水（２×５００ｍＬ）、食塩水（２×５００ｍＬ）で洗浄した。有機相を真空濃縮して残留オイルを得た。粗製オイルをアセトニトリル（３．５Ｌ）中で３０分間磨砕し、次いで冷凍庫（−２０℃）中で２４時間保管した。固体をコールドフィンガーフリット（１０−２０μｍ）付きガラスロート（ドライアイス／アセトンを用いて−３０℃まで冷却）上で真空ろ過した。固体をフリット付きロートから４Ｌフラスコに移した。ヘプタン（２Ｌ）を加えて３０分間磨砕した後、冷凍庫（−２０℃）中で２４時間保管した。固体をコールドフィンガーフリット（１０−２０μｍ）付きガラスロート（ドライアイス／アセトンを用いて−３０℃まで冷却）上で真空ろ過した。固体をヘキサン中に溶解させることによって集めた。溶媒を除去すると２−Ｏ−ベンジル−１，３−ビス（１，２−Ｏ−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリル）グリセリンジメチルエステル９の１７４ｇが無色のオイルとして得られた。Ｒｆ０．２７（ヘキサン−酢酸エチル、容積比１：１）。
【００４１】
２−ブタノン（１．７４Ｌ）中の十分に保護されたカルジオリピン９（１７４ｇ）の撹拌された溶液に、ＮａＩ（４８．０２ｇ）を加えて反応混合物を１．５時間還流させ、および２５℃まで冷却し、次いで−２０℃で２時間冷却した。得られた白色沈殿をろ過し、冷たい（−２０℃）アセトン（４００ｍＬ）で洗浄した。これを酢酸エチル（１．６Ｌ）および０．５ＭのＨＣｌ（７２０ｍＬ）中に溶解し、室温で１時間撹拌することによって二ナトリウム塩を対応するアンモニウム塩に転化させた。有機層を分離し、Ｈ２Ｏで洗浄した。有機層を５ＭのＮＨ４ＯＨ（１２０ｍＬ）の添加によって中和した。撹拌は１５分間続け、次いで冷凍庫に１時間保管した。固体をフリット（１０−２０μｍ）付きガラスロートを通して真空ろ過し、冷たい（−２０℃）アセトン（４００ｍＬ）で洗浄した。固体をヘキサン中に溶解させることによって集めた。溶媒を真空乾燥して２−Ｏ−ベンジル−１，３−ビス（１，２−Ｏ−ジミリストイル−ｓｎ−グリセリロ−３−ホスホリル）グリセリンジアンモニウム塩１０の１５９ｇを白色固体として得た。Ｒｆ０．５３（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ、容積比６５／２５／５）。２−Ｏ−ベンジル−１，３−ビス（１，２−Ｏ−ジミリストイル−ｓｎ−グリセリロ−３−ホスホリル）グリセリン二アンモニウム塩１０（１５９．０ｇ）を酢酸エチル（５００ｍＬ）中に３０℃で１時間溶解させた。溶液を真空下で０．２μｍＰＴＦＥ膜を通してろ過した。ろ液を２Ｌの水素化圧力容器中に移して酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈した。１０％Ｐｄ−Ｃ（６４ｇ）を加えて混合物を水素化装置中５０ｐｓｉで１６時間撹拌した。沈殿した生成物および触媒を、セライト（８６５ｇ）を入れてろ過し、ろ液を廃棄した。セライトケーキをクロロホルム中の５０％メタノール（３×６Ｌ）で洗浄し、洗浄液を濃縮し、高真空乾燥した。粗生成物をシリカゲルカラム（２．５ｋｇ）でまずＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ（１００：１５：１、４Ｌ）で、次いでＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ（６５：１５：１、２３Ｌ）で溶出して精製した。純粋な生成物を含有する画分をプールし、０．２μｍのＰＴＦＥ膜を通してろ過した。溶媒を除去し、高真空乾燥して１，３−ビス（１，２−Ｏ−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリル）グリセリン二アンモニウム塩（テトラミリストイルカルジオリピン）１１の７２ｇ（全収率４１％）を得た。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ６５：２５：５）Ｒｆ＝０．２９；１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３２（ｂｒ ｓ，ＮＨ４）、５．２６（ｍ，２Ｈ，ＲＣＯＯＣＨ）、４．３４−３．９２（ｍ，１３Ｈ，ＲＣＯＯＣＨ２，ＰＯＣＨ２，ＨＯＣＨ）、２．３３（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２ＣＯＯ−）、２．２９（ｔ，Ｊ＝７．５，１Ｈ，ＣＨＯＨ）、１．５８（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−）、１．３０（ｂｒ ｓ，８０Ｈ，ＣＨ２）、０．８８（ｔ，Ｊ＝６．５，１２Ｈ，ＣＨ３）；ＦＴＩＲ（ＡＴＲ）３２３１ｓ、２９１８ｓ、２８５０ｓ、１７３８ｓ、１４６７ｗ、１３７８ｗ、１２０３ｍｓ、１０６７ｓ ｃｍ−１；ＥＳＩ−ＭＳ、ｍ／ｚ（Ｍ−２ＮＨ４）２− ６１９．９、（Ｍ−２ＮＨ４−ＲＣＯＯ）− １０１１．９、（Ｍ−２ＮＨ４＋Ｈ）− １２４０．２。
【００４２】
本明細書で引用した出版物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、あたかもそれぞれの参考文献が個別におよび具体的に参照により組み入れられることが示され、またこれの全体が本明細書に記載されたかのごとく同程度に参照により本明細書によって組み入れられる。
【００４３】
本発明を記載する文脈における（特に添付の特許請求の範囲の文脈における）「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の指示語の使用は、本明細書において別の表示がされるかまたは文脈によって明らかに否定されるかしない限りは単数および複数の両方に及ぶものと解釈すべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別途に断りのない限り非限定的用語（すなわち「含むがこれに限定されない」）と解釈すべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において別途に示さない限りは、その範囲内に入るそれぞれの個々の値に個別に言及する簡略法として働くことを意図するに過ぎず、それぞれの個々の値はあたかも本明細書において個別に記載されたかのように本明細書に組み入れられる。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において別の指示があるかまたは文脈によって明らかに否定されるかしない限り、任意の適当な順序で行うことができる。本明細書で使用する任意および全ての例または例を示す言葉（例えば、「など、例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は単に本発明をより良く例示することが意図されており、別の特許請求がされない限り、本発明の範囲に制限を加えない。本明細書中のどの言葉も特許請求されていないいずれかの要素が本発明の実施に対して不可欠であることを示すものと解釈してはならない。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態は、本発明者らに知られている本発明を実施するための最良の形態を含めて本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態は、先の記載を読めば当業者には明らかとなりうる。本発明者らは、当業者はかかる変形を適切なものとして採用するものと考えており、さらに本発明者らは本発明が本明細書で詳細に記載した方法以外の方法で実施されることをも意図している。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲に記載の主題の全ての変形形態および等価形態を該当する法律によって認められる通りに包含する。さらに、全ての可能な変形形態における上記の要素の任意の組合せは、本明細書において別の指示があるかまたは文脈によって明らかに否定されるかしない限り本発明によって包含される。
【００４５】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】カルジオリピンを合成するための一般的スキームの図である。
【図２】カルジオリピンを合成するための一般的な代替スキームの図である。
【図３】カルジオリピンを合成するための一般的な代替スキームの図である。
【図４】１，１’，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピンを合成するための一般的スキームの図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はカルジオリピンおよびカルジオリピン類似体の調製のための新規な方法に関する。より詳しくは、本発明は活性化剤を使用するホスホロアミダイト法によってカルジオリピンおよびカルジオリピン類似体を調製する方法に関する。さらに、本発明の方法はカルジオリピンおよびカルジオリピン類似体を大量に調製するために使用される。
【背景技術】
【０００２】
（ジホスファチジルグリセリンとしても知られている）カルジオリピンは、通常心筋および骨格筋のミトコンドリアを含む高代謝活性を伴う組織の細胞膜から精製される複合体アニオン性リン脂質の一群を構成する。カルジオリピンの負の表面電荷は、リポソームを凝集依存性の取り込みに対して安定化させる。しかし、カルジオリピンの脂肪酸鎖の長さおよび性格（すなわち飽和か不飽和か）が、リポソームの凝集に対して与える可能性がある効果は解明されていない。
【０００３】
カルジオリピンを合成するための知られている方法は、主に２つのグループに分けられる：（ａ）ホスホリル化剤を使用して２−保護グリセリンの第一級ヒドロキシル基を、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセリンとカップリングさせること、および（ｂ）２−保護グリセリンの両方の第一級ヒドロキシル基における、ホスファチジン酸との２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（ＴＰＳ）またはピリジンの存在下での縮合（Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１１，７６９−７７０（１９７６）、Ｄｕｒａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１６０７−１６１０（１９９８）、Ｓａｕｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８８，３８４４−３８４７（１９６６）、 Ｍｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．，１１，９９２−９９４（１９８５）、およびＳｔｅｐａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｚｈ．Ｏｒｇ．，Ｋｈｉｍ．，２０，９８５−９８８（１９８４）を参照されたい。）。カルジオリピンは、ジアシルグリセロ燐酸エステルの銀塩と１，３−ジヨードプロパノールベンジルエーテルまたは１，３−ジヨードプロパノールｔ−ブチルエーテルとの間の反応によっても生成されてきた（Ｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１６，１１４−１２４（１９６６）、およびＩｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１１，１１５０−１１５６（１９６３）を参照されたい。）。これらの方法は構造を確認するためのカルジオリピンの分析用量の調製には適当であるが、関与する多くのステップ、中間体の注意深い精製の必要性ならびに高度に感光性の銀塩中間体および不安定なヨウ素中間体の使用のために、製造目的での大量の日常的調製のためには実用的でない。
【０００４】
リン酸トリエステルおよびホスホロアミダイトエステルは、核酸の合成においてリン酸結合を形成させるために幅広く、またリン脂質の合成においてより狭い範囲で使用されてきた（Ｂｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ，１，６５３−６５７（２０００）を参照されたい。）。これに関しては、上記のＢｒｏｗｎｅらは、ホスホロアミダイト法を使用するリン脂質類似体、特にホスホリルコリン類似体の調製を記載している。ホスファチジルイノシトールＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２およびＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、ならびにこれらの誘導体は、様々なホスホロアミダイト試薬を使用して調製されており、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，３５，１２３−１２４（１９９４）を参照されたい。）、ジフルオレニルホスホロアミダイト（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３８，７４０７−７４１０（１９９７））およびジアシルグリセリンを（ベンジルオキシ）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンと反応させることによって生成する試薬（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，６１，６３０５−６３１２（１９９６）およびＰｒｅｓｔｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２９，５０３−５１３（１９９６）を参照されたい。）が含まれる。加えて、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２およびＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のホスホトリエステル類似体が、ホスホロアミダイト試薬２−シアノ−エチルＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを利用して調製されている（例えば、Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，６１，８６４２−８６４７（１９９６）を参照されたい。）。さらに、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，６４，６４８−６５１（１９９９）は、メチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトをホスホリル化剤として利用する２，５−ジベンジル−Ｄ−マンニトールからのホスファチジルグリセリンの合成を記載している。
【０００５】
最近、カルジオリピン、特に様々な長さの脂肪鎖を有するカルジオリピン種などのリン脂質の調製におけるホスホロアミダイトエステルの使用が報告されている（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ，３９，２８５−２９０（２００４）、Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，４５，２０７７−２０７９（２００４）、Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ，３９，５９５−６００（２００４）、Ａｈｍａｄ ｅｔ．ａｌ．の米国特許出願第２００５／０１８１０３７Ａ１号およびＡｒｍａｄ ｅｔ．ａｌ．，の米国特許出願第２００５／０２６６０６８Ａ１号を参照されたい。）。前述の合成スキームの全てにおいて、第１ステップは１，２−Ｏ−ジアシル−ｓｎ−グリセリンの１つまたは複数のホスホロアミダイト試薬との反応を含み、これに２−保護グリセリンとのカップリングが続き、ここで保護されたカルジオリピンが生成する。これらの反応におけるホスホロアミダイト試薬は１Ｈ−テトラゾールによって活性化された。
【０００６】
１Ｈ−テトラゾールはホスフィチル化反応において使用される最も一般的な活性化剤である。しかし、大規模な合成における１Ｈ−テトラゾールの使用は、これの爆発性および強い毒性のために制限される。これは使用、投棄および貯蔵の間に特別な取り扱いが必要である。さらに、１Ｈ−テトラゾールは、極めて高価でもあり、それ故にコスト効率的なカルジオリピンの合成のためには実用的でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
様々な脂肪酸鎖長を有する飽和および不飽和のカルジオリピン種の大量を調製するために使用することができる新規の合成方法に対する必要性が存在する。より幅広い種類のカルジオリピン種の入手可能性を増大し、および現在入手可能なものよりも明確な組成を含む活性薬剤を含有する新規のリポソーム配合物の開発のために利用可能な脂質を多様化する、新規の合成方法に対する必要性も存在する。
【０００８】
本発明はこうした方法を提供する。本発明のこれらのおよび他の利点は、発明のさらなる特徴と同様に、本明細書に提示する本発明の記載から明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明は様々な脂肪酸鎖長を有するカルジオリピンを調製するための方法を提供する。この方法は、（ａ）光学的に純粋な１，２−二置換−ｓｎ−グリセリンを１つまたは複数のホスホロアミダイト試薬と反応させるステップと；（ｂ）（ａ）の生成物を２−Ｏ保護または２−Ｏ置換グリセリンと活性化剤の存在下で反応させるステップとを含む。本発明の方法は、カルジオリピンおよびカルジオリピン類似体を大量に製造するために使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は一般式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ
【００１１】
【化８】
【００１２】
【化９】
を有するカルジオリピンの変形体および類似体を調製する方法を記載する。
【００１３】
式ＩＩＩにおいて、Ｙ１およびＹ２は、同一でありまたは異なり、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−などである。式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩにおいて、Ｒ１およびＲ２は、同一でありまたは異なり、Ｈ、飽和および／または不飽和のアルキル基、好ましくはＣ２からＣ３４の飽和および／または不飽和のアルキル基である。式ＩＩＩにおいて、Ｒ３は（ＣＨ２）ｎであり、ｎ＝０−１５である。式ＩＩＩにおいて、Ｒ４は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ペプチド、ジペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物（グルコース、マンノース、ガラクトース、多糖類など）、複素環、ヌクレオシド、ポリヌクレオチドなどである。式ＩＩＩにおいて、Ｒ５はリンカーであり、このリンカーは必要性および用途に応じて分子中に加えても（加えなくても）よい。しかし、加える場合は、Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルコキシ、ポリアルキルオキシ［例えば、約１から５００個のアルキルオキシ体を含有する（および少なくとも約１０個のアルキルオキシ体、例えば少なくとも約５０個のアルキルオキシ体または少なくとも約１００個のアルキルオキシ体、例えば少なくとも約２００個のアルキルオキシ体、または少なくとも約３００個のアルキルオキシ体または少なくとも約４００個のアルキルオキシ体を有することができる）ＰＥＧ化されたエーテル、置換ポリアルキルオキシなど］、
【化１０】
ペプチド、ジペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物例（例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、多糖類など）を含むことができる。式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩにおいて、Ｘは無毒のカチオン、好ましくは、水素、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウムイオンなどである。
【００１４】
最も好ましい実施形態によれば、式ＩＩＩ中のＹ１およびＹ２は−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｏ−であり、Ｒ１およびＲ２は同一であり、Ｃ２からＣ２４の飽和および／または不飽和のアルキル基、より好ましくは４から１８個の間の炭素原子（約６から１４個の炭素原子など）である。Ｒ３は最も好ましくはＣＨ２である。Ｘは最も好ましくは水素またはアンモニウムイオンである。リンカー（Ｒ５）が不在の場合は、カルジオリピンの一般的構造が開示される。
【００１５】
本発明は式ＩＶ
【００１６】
【化１１】
のアルコールを、活性化剤の存在下で１つまたは複数のホスホロアミダイト試薬および２−Ｏ−保護グリセリンまたは式Ｖのジオールと反応させることを含む、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのカルジオリピンまたはこれの類似体を調製する方法を提供する。式ＩＶにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｙ１、およびＹ２は、上記で式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに関して示した通りでよい。式Ｖにおいて、Ｒ４およびＲ５は、上記で式ＩＩＩに関して示した通りでよい。本発明の方法によれば、活性化剤は反応を促進させることができるどの適当なピリジニウム塩であってもよい。かかるピリジニウム塩の例には、ピリジニウム塩酸塩、ピリジニウムトリフレート、酢酸ピリジニウム、クロロ酢酸ピリジニウム、ジクロロ酢酸ピリジニウム、トリクロロ酢酸ピリジニウムおよびトリフルオロ酢酸ピリジニウムが含まれる。本発明の方法によれば、カップリングホスホロアミダイトは式ＶＩまたはＶＩＩ
【００１７】
【化１２】
を有することができる。
【００１８】
好ましい手順に従えば、本発明は式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのカルジオリピンまたはこれの類似体を調製する方法を提供する。この方法は、２−Ｏ保護グリセリンまたはジオールを１つまたは複数のホスホトリエステルとピリジニウムトリブロマイドの存在下で反応させるステップを含む。好ましいホスホトリエステルは、式ＩＶのアルコールの一般式ＶＩＩＩのホスホロアミダイトとの活性化剤の存在下での反応によって製造することができる。
【００１９】
【化１３】
【００２０】
式ＶＩ、ＶＩＩまたはＶＩＩＩ中のＲ６はリン酸保護基、好ましくはメチル基、ベンジル基または２−シアノエチルもしくはシリル基である。適当な保護基の他の例には、エチル、シクロヘキシル、ｔ−ブチルを含むアルキルホスフェート；２−シアノエチル、４−シアノ−２−ブテニル、２−（メチルジフェニルシリル）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチルを含む２−置換エチルホスフェート；２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチルを含むハロエチルホスフェート；４−クロロベンジル、フルオレニル−９−メチル、ジフェニルメチルを含むベンジルホスフェートおよびアミデートが含まれる。
【００２１】
本発明の方法によれば、好ましい活性化剤は式ＩＸを有するピリジニウムトリフルオロ酢酸塩である。ピリジニウムトリフルオロ酢酸塩は、安価、安定性、無毒、有機溶媒に高溶解性、より低酸性および１−Ｈ−テトラゾールよりも取り扱いが安全である。しかし、次だけには限定されないが、ピリジニウム塩酸塩、ピリジニウムトリフレート、酢酸ピリジニウム、クロロ酢酸ピリジニウム、ジクロロ酢酸ピリジニウムおよびトリクロロ酢酸ピリジニウムを含む他の任意の他のピリジニウム塩も使用することができることが企図されている。
【００２２】
【化１４】
【００２３】
本発明によるカルジオリピンまたはこれの類似体の合成のための反応の一般的な順序を図１および２に例示する。本発明は、様々な脂肪酸鎖長を有するカルジオリピン１を調製するための、（ａ）光学的に純粋な１，２−二置換−ｓｎ−グリセリンＩＶを一般式ＶＩ（図１）またはＶＩＩ（図２）の１つまたは複数のホスホロアミダイト試薬と反応させるステップと、（ｂ）（ａ）の生成物２を２−Ｏ−保護グリセリンＸ（式Ｘ中のＲ４はヒドロキシル保護基、好ましくはアルキル基など、またはシリル保護基である。）と塩素化された溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルムなど）中でカップリングさせ、続いてｍ−クロロペルオキシ安息香酸（ｍ−ＣＰＢＡ）または過酸化水素またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）を用いる酸化が保護されたカルジオリピン３の生成をもたらすステップとを含む、一般的方法を提供する。その後、保護されたカルジオリピンの脱保護に続くアンモニウム塩への転化がカルジオリピン１（アンモニウム塩）の生成をもたらす。合成方法のこの状況において好ましい活性化剤はトリフルオロ酢酸ピリジニウムである。
【００２４】
光学的に純粋な１，２−二置換−ｓｎ−グリセリンＩＶとの反応のためには、例えばＢｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．の上記文献に記載されているものなどの、任意の適当なホスホロアミダイト試薬または方法でも使用することができる。適当なホスホロアミダイト試薬の例には、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミジッククロリド（例えば、Ｂｒｕｚｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：２４１５−２４１８（１９９５）を参照されたい。）、（ベンジルオキシ）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（例えば、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１３，１８２２−１８２５，（１９９１）を参照されたい。）、ベンジルオキシビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（例えば、Ｄｒｅｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２９，６５１３−６５１６，（１９８８）を参照されたい。）；２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｂｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，６５３−６５７，（２０００）を参照されたい。）、（２−シアノエチル）（Ｎ，Ｎ，−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（例えば、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，６５１１−６５２２，（１９９８）を参照されたい。）ジフルオレニルジイソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８，７４０７−７４１０．（１９９７）を参照されたい。）、メチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（例えば、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，６４８−６５１（１９９９）を参照されたい。）、ジメチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４，４９７−５００（１９９３）を参照されたい。）、ジベンジルジイソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４１、８５０９−８５１２（２０００）を参照されたい。）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７，１９４−１９９，（２００２）を参照されたい。）、２−（ジフェニルメチルシリル）エチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２，１８５９−１８６１，（２０００）を参照されたい。）、（Ｎ−トリフルオロアセチルアミノ）ブチルおよび（Ｎ−トリフルオロアセチルアミノ）ペンチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホロアミダイト（例えば、Ｗｉｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２，６７１２−６７１３，（１９９７）を参照されたい。）が含まれる。
【００２５】
本発明の他の実施形態を図３に示す。この方法では、光学的に純粋な１，２−二置換−ｓｎ−グリセリンＩＶをホスホロアミダイトＶＩＩＩおよびトリフルオロ酢酸ピリジニウムを使用してホスホリル化し、ホスファイトトリエステル４を得ることができ、このトリエステルは任意の適当な２−Ｏ−保護グリセリンＸ、例えばベンジルオキシ１，３−プロパンジオールまたは２−レブリノイル−１，３−プロパンジオールなどとピリジニウムペルブロミドおよびホスホニウム塩法を使用してカップリングさせて（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．の上記文献を参照されたい。）保護されたカルジオリピン３を得ることができる。合成方法のこの状況において好ましいカップリング試薬はジベンジルジイソプロピルホスホロアミダイトであり、好ましい活性化剤はトリフルオロ酢酸ピリジニウムである。
【００２６】
本発明の最も好ましい方法を図４に示す。この図には１，１’ ，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピン（Ｃ１４：０）１１の合成スキームの概要を示す。この合成は光学的に純粋な１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセリン５のＮ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホロアミダイトクロリド６とのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）などの塩基の存在下におけるジクロロメタンなどの適当な溶媒中での反応を含む。得られた中間体７は、ｉｎ ｓｉｔｕでベンジルオキシ１，３−プロパンジオール８とトリフルオロ酢酸ピリジニウムの存在下における塩素化された溶媒（例えばジクロロメタン、クロロホルムなど）中でカップリングさせ、続いてｍ−クロロペルオキシ安息香酸（ｍ−ＣＰＢＡ）または過酸化水素を用いて酸化することにより保護されたカルジオリピン９の生成に至る。次いで保護されている前駆体９のメチル基を、ヨウ化ナトリウムを用いる反応によって除去するとカルジオリピンのナトリウム塩が生成し、次いでこのカルジオリピンのナトリウム塩を希ＨＣｌに続いて希水酸化アンモニウムを用いる処理によってアンモニウム塩１０に転化させる。接触水素化によるベンジル保護基の脱保護はテトラミリストイルカルジオリピン１１（アンモニウム塩）をもたらす。
【００２７】
本発明の中間体および最終生成物は、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレン、メタノールおよびアセトンなどの一般的な有機溶媒の単一物または混合物を使用してカラムクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００２８】
本発明において中間体および生成物の結晶化に使用することができる適当な溶媒には、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどの炭化水素；メチレンクロリド、クロロホルム、１，２−ジクロロエタンなどの塩素化された溶媒；アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブチルアルコールなど；ケトン、例えば、アセトン、２−ブタノンなど、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、トルエンなどが含まれる。結晶化用の溶媒は単一溶媒または溶媒の混合物、例えば、ヘキサン−酢酸エチル、クロロホルム−アセトン、クロロホルム−メタノール、ジクロロメタン−メタノールなどを使用することができる。本発明において溶媒の混合物を使用する場合は、１つの溶媒と他の溶媒の比は、９：１から１：９、例えば８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、１：９などである。
【００２９】
本発明は中間体を一般的な溶媒を用いる結晶化によって得る好都合な方法をも提供し、それによって大掛かりなカラムクロマトグラフィー精製の必要性を排除する。最終の粗生成物はカラムクロマトグラフィーによって精製することができる。本発明の１つの目的は、少なくとも８０％の純度を有する、例えば少なくとも９０％純粋なまたは少なくとも９５％純粋なまたは少なくとも９８％純粋なまたは少なくとも９９％純粋なまたは少なくとも１００％純粋なカルジオリピンを調製する方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、カルジオリピンをコスト効率のよい仕方で調製する方法を提供することである。
【００３０】
「アルキル」という用語は、飽和または不飽和で直鎖および分岐鎖の炭化水素部分を包含する。「置換アルキル」という用語は、ヒドロキシ、（低級アルキル基の）アルコキシ、（低級アルキル基の）メルカプト、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、アミド、イミド、イミノ、チオ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、アシル、オキシアシルカルボキシルなどから選択された１つまたは複数の置換基をさらに持っているアルキル基を含む。
【００３１】
本発明の方法は、様々な長さおよび飽和の脂肪酸鎖を含むカルジオリピン種を調製するために使用することができる。リン脂質脂肪酸の一般的構造は、１つの炭化水素鎖および１つのカルボン酸基を含む。一般には、脂肪酸の炭化水素鎖の長さは約４個から約３４個の炭素原子の範囲であるが、炭素鎖はより通常には約１２個から２４個の間の炭素原子である。一部の実施形態においては、炭化水素鎖は、例えば少なくとも約５個の炭素原子または少なくとも約１０個の炭素原子または少なくとも約１５個の炭素原子を含むことが望ましい。通常、脂肪酸の炭化水素の長さは約３０個の炭素原子よりも短く、例えば約２５個の炭素原子より短いまたは約２０個の炭素原子より短くさえある。
【００３２】
最も好ましくは、本発明の方法によって調製されるカルジオリピンは、脂肪酸鎖を含み（すなわち「短鎖」カルジオリピン）、本発明は短鎖カルジオリピンを提供する。短い脂肪酸鎖は約４個から約１４個の間の炭素原子を含み、および約６個から約１２個の間の炭素原子、例えば約８個から約１０個の間の炭素原子を有することができる。あるいは、本発明の方法によって製造されるカルジオリピンは長鎖脂肪酸を含むことができる（すなわち「長鎖」カルジオリピン）。長鎖脂肪酸は、約２２個から約３０個の間の炭素原子、例えば約２４個から約２８個の間の炭素原子を含む。本発明の方法は短鎖または長鎖のカルジオリピン種の製造に排他的に限定されるものではない。実際に、中間的な長さの脂肪酸鎖を含有するカルジオリピンも本発明の方法によって調製することができることが企図されている。
【００３３】
リン脂質の脂肪酸は通常、炭化水素鎖中の二重および／または三重結合（すなわち不飽和）の数によって分類される。飽和脂肪酸は二重または三重結合を含まず、鎖中のそれぞれの炭素は最大数の水素原子に結合している。脂肪酸の不飽和度は、炭化水素鎖中において存在する二重または三重結合の数によって決まる。これに関しては、一価不飽和脂肪酸は１つの二重結合を含有し、多価不飽和脂肪酸は２つ以上の二重結合を含有する（例えば、「オックスフォード生化学・分子生物学辞書（Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，ｒｅｖ．ｅｄ．，Ａ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈ（ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）、および「細胞の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ）」，３ｒｄ ｅｄ．，Ｂ．Ａ．Ａｌｂｅｒｔｓ（ｅｄ．），Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたい。）。本発明の方法によって調製されるカルジオリピンの脂肪酸鎖は、短くても長くても、飽和であることも不飽和であることもできる。
【００３４】
記載した方法は様々な新規のカルジオリピン分子を調製するために使用することができる。例えば、これらの方法は、短い脂肪酸鎖や長い脂肪酸鎖を含有する純粋な形態のカルジオリピン変形体を調製するために使用することができる。好ましい脂肪酸は約Ｃ２からＣ３４、好ましくは約Ｃ４から約Ｃ２４の間にわたり、とりわけテトラ酸（Ｃ４：０）、ペンタン酸（Ｃ５：０）、ヘキサン酸（Ｃ６：０）ヘプタン酸（Ｃ７：０）、オクタン酸（Ｃ８：０）、ノナン酸（Ｃ９：０）、デカン酸（Ｃ１０：０）、ウンデカン酸（Ｃ１１：０）、ドデカン酸（Ｃ１２：０）、トリデカン酸（Ｃ１３：０）、テトラデカン（ミリスチン）酸（Ｃ１４：０）、ペンタデカン酸（Ｃ１５：０）、ヘキサデカン（パルミチン）酸（Ｃ１６：０）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７：０）、オクタデカン（ステアリン）酸（Ｃ１８：０）、ノナデカン酸（Ｃ１９：０）、エイコサン（アラキジン）酸（Ｃ２０：０）、ヘンエイコサン酸（Ｃ２１：０）、ドコサン（ベヘン）酸（Ｃ２２：０）、トリコサン酸（Ｃ２３：０）、テトラコサン酸（Ｃ２４：０）、１０−ウンデセン酸（Ｃ１１：１）、１１−ドデセン酸（Ｃ１２：１）、１２−トリデセン酸（Ｃ１３：１）、ミリストオレイン酸（Ｃ１４：１）、１０−ペンタデセン酸（Ｃ１５：１）、パルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、リノレン酸（Ｃ１８：３）、エイコセン酸（Ｃ２０：１）、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２）、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３）、アラキドン酸（ｃｉｓ−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）、およびｃｉｓ−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸を含む。エーテル類似体についても、アルキル鎖はＣ２からＣ３４、好ましくは約Ｃ４から約Ｃ２４の間にわたる。他の脂肪酸鎖もＲ１および／またはＲ２置換基として使用することができる。例には飽和脂肪酸、例えばエタン（または酢）酸、プロパン（またはプロピオン）酸、ブタン（または酪）酸、ヘキサコサン（またはセロチン）酸、オクタコサン（モンタン）酸、トリアコンタン（またはメリシン）酸、ドトリアコンタン（またはラッセル）酸、テトラトリアコンタン（またはゲダ）酸、ペンタトリアコンタン（またはセロプラスン）酸など；モノエチレン性不飽和脂肪酸、例えばｔｒａｎｓ−２−ブテン（またはクロトン）酸、ｃｉｓ−２−ブテン（またはイソクロトン）酸、２−ヘキセン（またはイソヒドロソルビン）酸、４−デカン（またはオブツシル）酸、９−デカン（またはカプロレイン）酸、４−ドデセン（またはリンデル）酸、５−ドデセン（またはデンチセチン）酸、９−ドデセン酸（またはラウロレイン）酸、４−テトラデセン（またはツズ）酸、５−テトラデセン（またはフィセテリン）酸、６−オクタデセン（またはペトロセレン）酸、ｔｒａｎｓ−９−オクタデセン（エライジン）酸、ｔｒａｎｓ−１１−オクタデセン（またはバクシン）酸、９−エイコセン（またはガドレイン）酸、１１−エイコセン（またはゴンドイン）酸、１１−ドコセン（またはセトレイン）酸、１３−ドコセン（またはエルカ）酸、１５−テトラコセン（またはネルボン）酸、１７−ヘキサコセン（またはキシメン）酸、２１−トリアコンテン（またはルメクエン）酸など；ジエン性不飽和脂肪酸、例えば２，４−ペンタジエン（またはβ−ビニルアクリル）酸、２，４−ヘキサジエン（またはソルビン）酸、２，４−デカジエン（またはスチリンギン）酸、２，４−ドデカジエン酸、９，１２−ヘキサデカジエン酸、ｃｉｓ−９，ｃｉｓ−１２−オクタデカジエン（またはα−リノール）酸、ｔｒａｎｓ−９，ｔｒａｎｓ−１２−オクタデカジエン（またはリノレンエライジン）酸、ｔｒａｎｓ−１０，ｔｒａｎｓ−１２−オクタデカジエン酸、１１，１４−エイコサジエン酸、１３，１６−ドコサジエン酸、１７，２０−ヘキサコサジエン酸など；トリエン性不飽和脂肪酸、例えば６，１０，１４−ヘキサデカトリエン（またはヒラゴン）酸、７，１０，１３−ヘキサデカトリエン酸、ｃｉｓ−６，ｃｉｓ−９−ｃｉｓ−１２−オクタデカトリエン（またはγ−リノール）酸、ｔｒａｎｓ−８，ｔｒａｎｓ−１０−ｔｒａｎｓ−１２−オクタデカトリエン（またはβ−カレンディン）酸、ｃｉｓ−８，ｔｒａｎｓ−１０−ｃｉｓ−１２−オクタデカトリエン酸、ｃｉｓ−９，ｃｉｓ−１２−ｃｉｓ−１５−オクタデカトリエン（またはα−リノレン）酸、ｔｒａｎｓ−９，ｔｒａｎｓ−１２−ｔｒａｎｓ−１５−オクタデカトリエン（またはα−リノールエライジン）酸、ｃｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１１−ｔｒａｎｓ−１３−オクタデカトリエン（またはα−エレオステアリン）酸、ｔｒａｎｓ−９，ｔｒａｎｓ−１１−ｔｒａｎｓ−１３−オクタデカトリエン（またはβ−エレオステアリン）酸、ｃｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１１−ｃｉｓ−１３−オクタデカトリエン（またはプニカ）酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸、８，１１，１４−エイコサトリエン酸など；テトラエン性不飽和脂肪酸、例えば４，８，１１，１４−ヘキサデカテトラエン酸、６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸、４，８，１２，１５−オクタデカテトラエン（モロクチン）酸、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、９，１１，１３，１５−オクタデカテトラエン（またはα−またはβ−パリナリン）酸、９，１２，１５，１８−オクタデカテトラエン酸、４，８，１２，１６−エイコサテトラエン酸、６，１０，１４，１８−エイコサテトラエン酸、４，７，１０，１３−ドコサテトラエン酸、７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸、８，１２，１６，１９−ドコサテトラエン酸など；ペンタ−およびヘキサエン性不飽和脂肪酸、例えば４，８，１２，１５，１８−エイコサペンタエン（またはチムノドン）酸、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、４，８，１２，１５，１９−ドコサペンタエン（またはクルパノドン）酸、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸、４，８，１２，１５，１８，２１−テトラコサヘキサエン（またはニシン）酸など；分岐鎖脂肪酸、例えば３−メチルブタン（またはイソ吉草）酸、８−メチルドデカン酸、１０−メチルウンデカン（またはイソラウリン）酸、１１−メチルドデカン（またはイソウンデシル）酸、１２−メチルトリデカン（またはイソミリスチン）酸、１３−メチルテトラデカン（またはイソペンタデシル）酸、１４−メチルペンタデカン（またはイソパルミチン）酸、１５−メチルヘキサデカン酸、１０−メチルヘプタデカン酸、１６−メチルヘプタデカン（またはイソステアリン）酸、１８−メチルノナデカン（またはイソアラキジン）酸、２０−メチルヘンエイコサン（またはイソベヘン）酸、２２−メチルトリコサン（またはイソリグノセリン）酸、２４−メチルペンタコサン（またはイソセロチン）酸、２６−メチルヘプタコサン（またはｉｓｏｍｏｎａｔｏｎｉｃ）酸、２，４，６−トリメチルオクタコサン（またはｍｙｃｏｃｅｒａｎｉｃまたはｍｙｃｏｓｅｒｏｓｉｃ）酸、２−メチル−ｃｉｓ−２−ブテン（アンゲリカ）酸、２−メチル−ｔｒａｎｓ−２−ブテン（チグリン）酸、４−メチル−３−ペンテン（またはｐｙｒｏｔｅｒｅｂｉｃ）酸などを含む。
【００３５】
本明細書で使用する「ヒドロキシ保護基」という用語は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｗｕｔｓ，「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）によって開示されている一般に使用される保護基を指す。かかる保護基には、メチルエーテル、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニルエーテルを含む置換メチルエーテル；１−エトキシエチルのような置換エチルエーテル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、アリル、プロパルギル；ベンジルおよびｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、トリフェニルメチルを含む置換ベンジルエーテル；トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、ジフェニルメチルシリルを含むシリルエーテル；ホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、ベンゾエート、レブリニレートおよびカーボネートを含むエステルが含まれる。
【００３６】
本明細書で使用する「リン酸保護基」という用語は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｗｕｔｓ，「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）によって記載されている一般に使用される保護基を指す。かかる保護基には、メチル、エチル、シクロヘキシル、ｔ−ブチルを含むアルキルホスフェート；２−シアノエチル、４−シアノ−２−ブテニル、２−（メチルジフェニルシリル）エチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチルを含む２−置換エチルホスフェート；２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチルを含むハロエチルホスフェート；４−クロロベンジル、フルオレニル−９−メチル、ジフェニルメチルを含むベンジルホスフェートおよびアミデートが含まれる。
【００３７】
本明細書で記載しているカルジオリピン分子および本発明の方法によって製造されるカルジオリピンは脂質製剤中で使用することができる。本発明のカルジオリピンを含んでいる複合体、エマルジョンおよび他の製剤も本発明の範囲内である。本発明によるかかる製剤は任意の適当な技法によって調製することができる。リポソーム組成物、複合体、エマルジョンなどは、本発明のカルジオリピンに加えて、他の成分のうち安定剤、吸収促進剤、酸化防止剤、リン脂質、生分解性ポリマーおよび医薬的に活性な薬剤を含むことができる。一部の実施形態では、本発明の組成物、特にリポソーム組成物は、１つまたは複数の標的化剤、例えば炭水化物、タンパク質または抗体（またはその断片）もしくは細胞の受容体を識別するリガンドなどの特定の基質に結合する他のリガンドを含むことが好ましい。かかる剤（炭水化物または抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチドホルモン、細胞受容体に対する抗体などの受容体リガンドおよびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質など）の包含はリポソームが所定の組織または細胞種を標的とすることを促進することができる。
【００３８】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、言うまでもなく、決してその範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００３９】
本実施例は、１，１’ ，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピン１１を調製する方法を実例によって説明する。化合物１１
【００４０】
【化１５】
は、図４に概要を示す合成経路によって合成することができる。１，２−Ｏ−ミリストイル−ｓｎ−グリセリン５（１４８ｇ、２８２．２０ｍｍｏｌ）および乾燥Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５９ｍＬ、３３８．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．７Ｌ）中溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミドクロリド６（５９ｇ、２９９ｍｍｏｌ）を室温で３０分間かけて滴加した。反応混合物を室温で２時間撹拌後、トリフルオロ酢酸ピリジニウム（６５．６ｇ、３３９．２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物にＣＨ２Ｃｌ２（２８０ｍＬ）中の２−ベンジルオキシ−１，３−プロパンジオール８（２５ｇ、１３７．２０ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。次いで反応混合物を５−１０℃（内部温度）まで冷却し、３５％過酸化水素溶液（３５ｍＬ、４２４．８ｍｍｏｌ）を、反応混合物の温度が１０℃未満に保たれるように加えた。２５℃まで温まったら混合物を分液ロートへ移して１０％チオ硫酸ナトリウム溶液（３４０ｍＬ）、水（２×５００ｍＬ）、食塩水（２×５００ｍＬ）で洗浄した。有機相を真空濃縮して残留オイルを得た。粗製オイルをアセトニトリル（３．５Ｌ）中で３０分間磨砕し、次いで冷凍庫（−２０℃）中で２４時間保管した。固体をコールドフィンガーフリット（１０−２０μｍ）付きガラスロート（ドライアイス／アセトンを用いて−３０℃まで冷却）上で真空ろ過した。固体をフリット付きロートから４Ｌフラスコに移した。ヘプタン（２Ｌ）を加えて３０分間磨砕した後、冷凍庫（−２０℃）中で２４時間保管した。固体をコールドフィンガーフリット（１０−２０μｍ）付きガラスロート（ドライアイス／アセトンを用いて−３０℃まで冷却）上で真空ろ過した。固体をヘキサン中に溶解させることによって集めた。溶媒を除去すると２−Ｏ−ベンジル−１，３−ビス（１，２−Ｏ−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリル）グリセリンジメチルエステル９の１７４ｇが無色のオイルとして得られた。Ｒｆ０．２７（ヘキサン−酢酸エチル、容積比１：１）。
【００４１】
２−ブタノン（１．７４Ｌ）中の十分に保護されたカルジオリピン９（１７４ｇ）の撹拌された溶液に、ＮａＩ（４８．０２ｇ）を加えて反応混合物を１．５時間還流させ、および２５℃まで冷却し、次いで−２０℃で２時間冷却した。得られた白色沈殿をろ過し、冷たい（−２０℃）アセトン（４００ｍＬ）で洗浄した。これを酢酸エチル（１．６Ｌ）および０．５ＭのＨＣｌ（７２０ｍＬ）中に溶解し、室温で１時間撹拌することによって二ナトリウム塩を対応するアンモニウム塩に転化させた。有機層を分離し、Ｈ２Ｏで洗浄した。有機層を５ＭのＮＨ４ＯＨ（１２０ｍＬ）の添加によって中和した。撹拌は１５分間続け、次いで冷凍庫に１時間保管した。固体をフリット（１０−２０μｍ）付きガラスロートを通して真空ろ過し、冷たい（−２０℃）アセトン（４００ｍＬ）で洗浄した。固体をヘキサン中に溶解させることによって集めた。溶媒を真空乾燥して２−Ｏ−ベンジル−１，３−ビス（１，２−Ｏ−ジミリストイル−ｓｎ−グリセリロ−３−ホスホリル）グリセリンジアンモニウム塩１０の１５９ｇを白色固体として得た。Ｒｆ０．５３（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ、容積比６５／２５／５）。２−Ｏ−ベンジル−１，３−ビス（１，２−Ｏ−ジミリストイル−ｓｎ−グリセリロ−３−ホスホリル）グリセリン二アンモニウム塩１０（１５９．０ｇ）を酢酸エチル（５００ｍＬ）中に３０℃で１時間溶解させた。溶液を真空下で０．２μｍＰＴＦＥ膜を通してろ過した。ろ液を２Ｌの水素化圧力容器中に移して酢酸エチル（５００ｍＬ）で希釈した。１０％Ｐｄ−Ｃ（６４ｇ）を加えて混合物を水素化装置中５０ｐｓｉで１６時間撹拌した。沈殿した生成物および触媒を、セライト（８６５ｇ）を入れてろ過し、ろ液を廃棄した。セライトケーキをクロロホルム中の５０％メタノール（３×６Ｌ）で洗浄し、洗浄液を濃縮し、高真空乾燥した。粗生成物をシリカゲルカラム（２．５ｋｇ）でまずＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ（１００：１５：１、４Ｌ）で、次いでＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ（６５：１５：１、２３Ｌ）で溶出して精製した。純粋な生成物を含有する画分をプールし、０．２μｍのＰＴＦＥ膜を通してろ過した。溶媒を除去し、高真空乾燥して１，３−ビス（１，２−Ｏ−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリル）グリセリン二アンモニウム塩（テトラミリストイルカルジオリピン）１１の７２ｇ（全収率４１％）を得た。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ６５：２５：５）Ｒｆ＝０．２９；１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３２（ｂｒ ｓ，ＮＨ４）、５．２６（ｍ，２Ｈ，ＲＣＯＯＣＨ）、４．３４−３．９２（ｍ，１３Ｈ，ＲＣＯＯＣＨ２，ＰＯＣＨ２，ＨＯＣＨ）、２．３３（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２ＣＯＯ−）、２．２９（ｔ，Ｊ＝７．５，１Ｈ，ＣＨＯＨ）、１．５８（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−）、１．３０（ｂｒ ｓ，８０Ｈ，ＣＨ２）、０．８８（ｔ，Ｊ＝６．５，１２Ｈ，ＣＨ３）；ＦＴＩＲ（ＡＴＲ）３２３１ｓ、２９１８ｓ、２８５０ｓ、１７３８ｓ、１４６７ｗ、１３７８ｗ、１２０３ｍｓ、１０６７ｓ ｃｍ−１；ＥＳＩ−ＭＳ、ｍ／ｚ（Ｍ−２ＮＨ４）２− ６１９．９、（Ｍ−２ＮＨ４−ＲＣＯＯ）− １０１１．９、（Ｍ−２ＮＨ４＋Ｈ）− １２４０．２。
【００４２】
本明細書で引用した出版物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、あたかもそれぞれの参考文献が個別におよび具体的に参照により組み入れられることが示され、またこれの全体が本明細書に記載されたかのごとく同程度に参照により本明細書によって組み入れられる。
【００４３】
本発明を記載する文脈における（特に添付の特許請求の範囲の文脈における）「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の指示語の使用は、本明細書において別の表示がされるかまたは文脈によって明らかに否定されるかしない限りは単数および複数の両方に及ぶものと解釈すべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別途に断りのない限り非限定的用語（すなわち「含むがこれに限定されない」）と解釈すべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において別途に示さない限りは、その範囲内に入るそれぞれの個々の値に個別に言及する簡略法として働くことを意図するに過ぎず、それぞれの個々の値はあたかも本明細書において個別に記載されたかのように本明細書に組み入れられる。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において別の指示があるかまたは文脈によって明らかに否定されるかしない限り、任意の適当な順序で行うことができる。本明細書で使用する任意および全ての例または例を示す言葉（例えば、「など、例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は単に本発明をより良く例示することが意図されており、別の特許請求がされない限り、本発明の範囲に制限を加えない。本明細書中のどの言葉も特許請求されていないいずれかの要素が本発明の実施に対して不可欠であることを示すものと解釈してはならない。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態は、本発明者らに知られている本発明を実施するための最良の形態を含めて本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態は、先の記載を読めば当業者には明らかとなりうる。本発明者らは、当業者はかかる変形を適切なものとして採用するものと考えており、さらに本発明者らは本発明が本明細書で詳細に記載した方法以外の方法で実施されることをも意図している。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲に記載の主題の全ての変形形態および等価形態を該当する法律によって認められる通りに包含する。さらに、全ての可能な変形形態における上記の要素の任意の組合せは、本明細書において別の指示があるかまたは文脈によって明らかに否定されるかしない限り本発明によって包含される。
【００４５】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】カルジオリピンを合成するための一般的スキームの図である。
【図２】カルジオリピンを合成するための一般的な代替スキームの図である。
【図３】カルジオリピンを合成するための一般的な代替スキームの図である。
【図４】１，１’，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピンを合成するための一般的スキームの図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＶ
【化１】
のアルコールを、１つまたは複数のホスホロアミダイト試薬および２−Ｏ−保護グリセリンまたは２−Ｏ−置換グリセリンと、活性化剤の存在下で反応させることを含む、
式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ
【化２】
［式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ中の
Ｙ１およびＹ２は、同一でありまたは異なり、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ１およびＲ２は、同一でありまたは異なり、Ｈ、Ｃ２からＣ３４までの飽和または不飽和のアルキル基であり、
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎであり、ｎ＝０−１５であり、
Ｒ４は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ペプチド、ジペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、複素環、ヌクレオシド、ポリヌクレオチドであり、
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルキルオキシ、ポリアルキルオキシ、ペプチド、ジペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物を含むリンカーであり、
Ｘは無毒のカチオンである。］
のカルジオリピンまたはこれの類似体を調製する方法。
【請求項２】
カップリングホスホロアミダイトの少なくとも１つが、式ＶＩ
【化３】
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カップリングホスホロアミダイトの少なくとも１つが、式ＶＩＩ
【化４】
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２−Ｏ保護グリセリンを１つまたは複数のホスホトリエステルと三臭化ピリジニウムの存在下で反応させることを含む、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのカルジオリピンまたはこれの類似体を調製する方法。
【請求項５】
ホスホトリエステルの１つまたは複数が、式ＩＶのアルコールを一般式ＶＩＩＩのホスホロアミダイトと活性化剤の存在下で反応させることによって製造される、請求項４に記載の方法。
【化５】
【請求項６】
活性化剤が、ピリジニウム塩酸塩、ピリジニウムトリフレート、酢酸ピリジニウム、クロロ酢酸ピリジニウム、ジクロロ酢酸ピリジニウム、トリクロロ酢酸ピリジニウムおよびトリフルオロ酢酸ピリジニウムからなる群から選択される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項７】
好ましい活性化剤が、式ＩＸを有するトリフルオロ酢酸ピリジニウムである、請求項１、５または６のいずれかに記載の方法。
【化６】
【請求項８】
式ＶＩ、ＶＩＩまたはＶＩＩＩ中のＲ６が、メチル、ベンジル、エチル、シクロヘキシル、ｔ−ブチルを含むアルキルホスフェート；２−シアノエチル、４−シアノ−２−ブテニル、２−（メチルジフェニルシリル）エチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチルを含む２−置換エチルホスフェート；２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチルを含むハロエチルホスフェート；４−クロロベンジル、フルオレニル−９−メチル、ジフェニルメチルを含むベンジルホスフェートおよびアミデートを含むリン酸保護基である、請求項２、４または５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
好ましいリン酸保護基が、メチル、ベンジル基またはシアノエチル基である、請求項２、３、５または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１および／またはＲ２の少なくとも１つが、２個から３４個の間の炭素を有する飽和または不飽和のアルキル基である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
カルジオリピンが、４個から１８個の間の炭素を有する短鎖脂肪酸を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
カルジオリピンが、６個から１４個の間の炭素を有する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
カルジオリピンが１４個から３４個の間の炭素を有する長鎖脂肪酸を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
カルジオリピンが、飽和および／または不飽和である、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれかに記載の方法によって調製される、カルジオリピンまたはカルジオリピン類似体。
【請求項１６】
式５の１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセリンを式６のホスホロアミダイト試薬および式８の２−Ｏ−保護グリセリンと活性化剤の存在下で反応させるステップ、これに続く保護基の除去を含む、式１１の１，１’，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピンを調製する方法。
【化７】
【請求項１７】
活性化剤がトリフルオロ酢酸ピリジニウムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
中間体および最終生成物が、結晶化および／またはカラムクロマトグラフィー技法によって精製される、請求項１、４または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
結晶化および／またはカロムクロマトグラフィーが、一般的な有機溶媒の単一物または混合物を使用して行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
一般的な有機溶媒が、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン、２−ブタノン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルおよびトルエンからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
カルジオリピンまたはカルジオリピン類似体を請求項１から２０に記載の方法のいずれかによって調製するステップと、前記カルジオリピンまたはカルジオリピン類似体をリポソーム中に含めるステップとを含む、リポソームを調製する方法。
【請求項２２】
請求項１から２０のいずれかに記載の方法によって調製されたカルジオリピンまたはカルジオリピン類似体および活性薬剤を含むリポソーム組成物。
【請求項２３】
請求項１から２０に記載の方法のいずれかによってカルジオリピンまたはカルジオリピン類似体を調製するステップと、活性薬剤と複合させた前記カルジオリピンまたはカルジオリピン類似体をリポソーム中に含めるステップと、前記リポソームを、それを必要としている対象に投与するステップとを含む、ヒトの疾患または動物の疾患を治療する方法。
【請求項２４】
請求項１から２０に記載の方法のいずれかによってカルジオリピンまたはカルジオリピン類似体を調製するステップと、前記カルジオリピンまたはカルジオリピン類似体および活性薬剤をリポソーム中に含めるステップと、前記リポソームを細胞に送達するステップとを含む、活性薬剤を細胞に送達する方法。
【請求項１】
式ＩＶ
【化１】
のアルコールを、１つまたは複数のホスホロアミダイト試薬および２−Ｏ−保護グリセリンまたは２−Ｏ−置換グリセリンと、活性化剤の存在下で反応させることを含む、
式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ
【化２】
［式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ中の
Ｙ１およびＹ２は、同一でありまたは異なり、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ１およびＲ２は、同一でありまたは異なり、Ｈ、Ｃ２からＣ３４までの飽和または不飽和のアルキル基であり、
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎであり、ｎ＝０−１５であり、
Ｒ４は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ペプチド、ジペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、複素環、ヌクレオシド、ポリヌクレオチドであり、
Ｒ５は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルキルオキシ、ポリアルキルオキシ、ペプチド、ジペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物を含むリンカーであり、
Ｘは無毒のカチオンである。］
のカルジオリピンまたはこれの類似体を調製する方法。
【請求項２】
カップリングホスホロアミダイトの少なくとも１つが、式ＶＩ
【化３】
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カップリングホスホロアミダイトの少なくとも１つが、式ＶＩＩ
【化４】
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２−Ｏ保護グリセリンを１つまたは複数のホスホトリエステルと三臭化ピリジニウムの存在下で反応させることを含む、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのカルジオリピンまたはこれの類似体を調製する方法。
【請求項５】
ホスホトリエステルの１つまたは複数が、式ＩＶのアルコールを一般式ＶＩＩＩのホスホロアミダイトと活性化剤の存在下で反応させることによって製造される、請求項４に記載の方法。
【化５】
【請求項６】
活性化剤が、ピリジニウム塩酸塩、ピリジニウムトリフレート、酢酸ピリジニウム、クロロ酢酸ピリジニウム、ジクロロ酢酸ピリジニウム、トリクロロ酢酸ピリジニウムおよびトリフルオロ酢酸ピリジニウムからなる群から選択される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項７】
好ましい活性化剤が、式ＩＸを有するトリフルオロ酢酸ピリジニウムである、請求項１、５または６のいずれかに記載の方法。
【化６】
【請求項８】
式ＶＩ、ＶＩＩまたはＶＩＩＩ中のＲ６が、メチル、ベンジル、エチル、シクロヘキシル、ｔ−ブチルを含むアルキルホスフェート；２−シアノエチル、４−シアノ−２−ブテニル、２−（メチルジフェニルシリル）エチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチルを含む２−置換エチルホスフェート；２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチルを含むハロエチルホスフェート；４−クロロベンジル、フルオレニル−９−メチル、ジフェニルメチルを含むベンジルホスフェートおよびアミデートを含むリン酸保護基である、請求項２、４または５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
好ましいリン酸保護基が、メチル、ベンジル基またはシアノエチル基である、請求項２、３、５または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１および／またはＲ２の少なくとも１つが、２個から３４個の間の炭素を有する飽和または不飽和のアルキル基である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
カルジオリピンが、４個から１８個の間の炭素を有する短鎖脂肪酸を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
カルジオリピンが、６個から１４個の間の炭素を有する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
カルジオリピンが１４個から３４個の間の炭素を有する長鎖脂肪酸を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
カルジオリピンが、飽和および／または不飽和である、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれかに記載の方法によって調製される、カルジオリピンまたはカルジオリピン類似体。
【請求項１６】
式５の１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセリンを式６のホスホロアミダイト試薬および式８の２−Ｏ−保護グリセリンと活性化剤の存在下で反応させるステップ、これに続く保護基の除去を含む、式１１の１，１’，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピンを調製する方法。
【化７】
【請求項１７】
活性化剤がトリフルオロ酢酸ピリジニウムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
中間体および最終生成物が、結晶化および／またはカラムクロマトグラフィー技法によって精製される、請求項１、４または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
結晶化および／またはカロムクロマトグラフィーが、一般的な有機溶媒の単一物または混合物を使用して行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
一般的な有機溶媒が、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン、２−ブタノン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルおよびトルエンからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
カルジオリピンまたはカルジオリピン類似体を請求項１から２０に記載の方法のいずれかによって調製するステップと、前記カルジオリピンまたはカルジオリピン類似体をリポソーム中に含めるステップとを含む、リポソームを調製する方法。
【請求項２２】
請求項１から２０のいずれかに記載の方法によって調製されたカルジオリピンまたはカルジオリピン類似体および活性薬剤を含むリポソーム組成物。
【請求項２３】
請求項１から２０に記載の方法のいずれかによってカルジオリピンまたはカルジオリピン類似体を調製するステップと、活性薬剤と複合させた前記カルジオリピンまたはカルジオリピン類似体をリポソーム中に含めるステップと、前記リポソームを、それを必要としている対象に投与するステップとを含む、ヒトの疾患または動物の疾患を治療する方法。
【請求項２４】
請求項１から２０に記載の方法のいずれかによってカルジオリピンまたはカルジオリピン類似体を調製するステップと、前記カルジオリピンまたはカルジオリピン類似体および活性薬剤をリポソーム中に含めるステップと、前記リポソームを細胞に送達するステップとを含む、活性薬剤を細胞に送達する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５２７５７６（Ｐ２００９−５２７５７６Ａ）
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５６４７３（Ｐ２００８−５５６４７３）
【出願日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００５０３８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１００８０８
【国際公開日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（５０８２５５３８８）ネオフアーム・インコーポレイテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００５０３８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１００８０８
【国際公開日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（５０８２５５３８８）ネオフアーム・インコーポレイテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
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