カルモジュリンを標的とした腫瘍の判定方法
【課題】本発明の課題は、早期診断が可能な胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌等に対する新規腫瘍マーカーを提供すること。
【解決手段】ヒトから採取した生体試料中のカルモジュリン（Calmodulin）の発現量を測定する。カルモジュリンの発現を検出した場合、対象者は癌である可能性が高いと判定される。カルモジュリンの発現量の測定には、抗カルモジュリンモノクローナル抗体や、カルモジュリンのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物が好適に用いられる。また、ヒト腫瘍細胞株を被検物質の存在下に培養し、細胞培養上清中のカルモジュリンの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することにより、腫瘍の抑制剤・治療剤をスクリーニングすることができる。
【解決手段】ヒトから採取した生体試料中のカルモジュリン（Calmodulin）の発現量を測定する。カルモジュリンの発現を検出した場合、対象者は癌である可能性が高いと判定される。カルモジュリンの発現量の測定には、抗カルモジュリンモノクローナル抗体や、カルモジュリンのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物が好適に用いられる。また、ヒト腫瘍細胞株を被検物質の存在下に培養し、細胞培養上清中のカルモジュリンの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することにより、腫瘍の抑制剤・治療剤をスクリーニングすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルモジュリン（Calmodulin）を標的とした、胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌等の腫瘍の判定方法及びそのためのキット、並びに、腫瘍の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における診断・判定として血中腫瘍マーカーの計測が挙げられる。腫瘍マーカーは腫瘍または腫瘍と反応した正常細胞が作る物質の中で、血中や尿中などに放出され腫瘍の体外診断を可能としているものである。
【０００３】
上記腫瘍マーカーに関しては、乳癌患者と正常人の胸部組織に差異的に発現する遺伝子を使用した悪性腫瘍、特に乳癌を予想、診断 、予後判定、予防および処置するための新規な組成物、方法および使用（例えば、特許文献１参照）や、肝炎ウイルスの感染に起因し慢性肝炎または肝硬変を発症した患者に対し、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を評価することによって肝臓癌の発癌リスクを評価する方法（例えば、特許文献２参照）や、その遺伝子産物がＣＬＬ細胞および前立腺癌細胞の新生物性または腫瘍形成性増殖を抑制するｍｉＲ１５およびｍｉＲ１６のコピー数、変異状態または遺伝子発現を検出することによる慢性リンパ性白血病または前立腺癌の診断方法（例えば、特許文献３参照）や、無症候性期または初期段階の患者における発癌過程の存在を検出するのに適当な迅速な癌の診断方法や、癌患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素ＩＩの活性化化合物、すなわち腫瘍マーカー 、該癌の診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者の癌を検出することを特徴とする癌の処置方法、ならびに該癌の診断方法を行うためのキット（例えば、特許文献４参照）等が知られている。
【０００４】
胃癌は、日本と東南アジアでは消化管で最も多くみられる悪性腫瘍であり、癌死亡率では、胃癌が世界で第２位を占めている。胃癌の予後は、診断技術や胃癌の治療法の発達により改善しているが、進行癌の治癒的切除の後に起こる再発の主原因は腹膜播種である。胃漿膜にまで浸潤した胃癌の予後は、５年生存率が３５％と低い。また、進行胃癌術後の腹膜播種再発においてはいまだに有効な治療法がなく、５年生存率は５％以下と報告されている。胃癌細胞のこのような悪性の特性のうちで、腹膜への転移は特に複雑な現象であり、多くのステップと多くの遺伝子が関与している。胃癌の腹膜播種には、接着分子、アポトーシス関連遺伝子および他の遺伝子が深く関与しているという報告があるが、胃癌の転移のメカニズム解明には、さらなる研究が必要であるとされている。
【０００５】
胃癌に関しては、既知のＩ型コラーゲンのＣ端非３重鎖テロペプチド（ＩＣＴＰ）の変動をマーカーにすることを特徴とする、進行胃癌、特にスキルス胃癌の適切な診断マーカー（例えば、特許文献５参照）や、従来のＲＬＧＳ法に比較して少量のＤＮＡサンプルを用い簡便で、迅速、安価に癌患者の予後が良好か否かを診断することのできる技術を確立するものであって、癌部または非癌部組織検体より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、その割合に基づいて胃癌をはじめ、種々の癌疾患の予後が良好か否かを判断する方法（例えば、特許文献６参照）や、転移性結腸直腸癌あるいは原発性および／または転移性の胃癌または食道癌をスクリーニング・診断するための試薬、キットおよび方法や、その患者を処置するためにインビボでイメージングするための化合物や組成物、その治療や予防のための薬物、遺伝子療法薬およびアンチセンス化合物を運搬するための組成物、ワクチンおよび方法（例えば、特許文献７参照）や、細胞の生体エネルギー的指数を作成するため、構造タンパク質およびミトコンドリアの呼吸（それぞれ例えば、ｈｓｐ６０やチトクロームオキシダーゼのサブユニットＩおよびＩＶ）に関して、ミトコンドリアの生体エネルギー的機能のタンパク質（Ｈ＋−ＡＴＰ合成酵素のβ−触媒サブユニットなど）の発現についての研究を使用すること、そしてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素およびピルビン酸キナーゼＭなどの細胞の解糖経路のタンパク質の発現に関連する前記ミトコンドリア生体エネルギー指数（β−ＡＴＰａｓｅ／ｈｓｐ６０比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩ比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩＶ比）を使用することからなる、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法（例えば、特許文献８参照）等が提案されている。
【０００６】
さらに、胃癌腹膜播種又は腹腔内遊離癌細胞の検出のため、特異性の高い新規マーカーを同定する方法としては、被験者から生体試料を採取するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方の存在を被検者の生体試料から検出するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方が存在する場合には、胃癌由来の転移癌細胞が前記試料中に含まれている可能性が高いと判断するステップとを含む方法により、胃癌由来の転移癌細胞を検出し、これらを胃癌由来の転移癌細胞のマーカーとして使用することによって、胃癌患者の腹膜転移の有無を迅速かつ確実に検出することができ、腹腔内癌化学療法を適用すべきかの決定のための有力な材料を提供することができる方法（例えば、特許文献９参照）が開発されている。
【０００７】
また、肺癌は小細胞癌と非小細胞癌の２つの型に大きく分類され、非小細胞癌はさらに腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌の３タイプに分類され、それぞれのタイプによって発生する部位がある程度決まっており、小細胞癌と扁平上皮癌は肺門部に、腺癌と大細胞癌は肺野部にできやすい肺癌といわれている。肺癌に関して、小細胞肺癌 (ＳＣＬＣ)を患う患者を治療し、またはＳＣＬＣ腫瘍の存在を検出するための、比較的短いペプチド、詳細には、α−コノトキシンペプチドＭＩＩおよびＵ００２を使用して小細胞肺癌の存在または位置を決定することにより検出する方法（例えば、特許文献１０参照）や、血清中の肺癌マーカーとして優れる血管透過性因子を測定することにより、特に化学発光検出系酵素免疫測定法を用いて高感度で測定することにより、肺癌の早期診断、さらには治療効果の判定、経過観察を行う方法（例えば、特許文献１１参照）等が知られている。
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−１５９６４０号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０２９号公報
【特許文献３】特表２００６−５０６４６９号公報
【特許文献４】特表２００１−５２４８１５号公報
【特許文献５】特開２００１−３３４６０号公報
【特許文献６】特開２００２−１１２７９９号公報
【特許文献７】特表２００３−５３２３８９号公報
【特許文献８】特表２００５−５２６９８０号公報
【特許文献９】特開２００４−３２１１０２号公報
【特許文献１０】特表平１１−５０６７３７号公報
【特許文献１１】特開平９−３３５３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまでに様々な腫瘍マーカーが開発されているが、擬陽性が多く初期の癌の検出が困難であるなど改善の余地が多く残されている。特に肺癌・胃癌・大腸癌など難治性の癌のマーカーの開発が求められている。現在日本において肺癌は男性の癌死亡率の第１位であり、女性では第２位である。また胃癌は男性の癌死亡率の第２位であり女性では第１位である。このため肺癌ならびに胃癌に対する腫瘍マーカーが新たに開発され早期診断が可能となれば、治療成績の大きな向上が期待できる。本発明の課題は、早期診断が可能な胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌等に対する新規腫瘍マーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、腫瘍マーカー候補物質の探索を目的として、ヒト胃癌由来培養細胞株であるＳＮＵ−１細胞の培養上清に放出されるタンパク質・ペプチドのプロテオーム解析を行い、カルモジュリンが放出されていることを見い出し、カルモジュリンがヒト胃癌由来培養細胞株ばかりでなく、ヒト肺小細胞癌由来培養細胞株、ヒト肺非小細胞癌由来培養細胞株をはじめとして、多くの種類のヒト腫瘍由来培養細胞株において放出されるという知見を得て、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ヒトから採取した生体試料中の細胞外に放出された、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定することを特徴とする腫瘍の判定方法。
（２）腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする上記（１）記載の腫瘍の判定方法。
【００１２】
（３）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腫瘍判定用キット。
（４）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腫瘍判定用キット。
【００１３】
（５）腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする上記（３）又は（４）記載の腫瘍判定用キット。
（６）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドを腫瘍マーカーとして使用する方法。
（７）腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする上記（６）記載の方法。
【００１４】
（８）ヒト腫瘍細胞株を被検物質の存在下に培養し、細胞培養上清中の、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較して、前記ペプチドの発現量が低下しているとき、被検物質を腫瘍抑制剤と評価することを特徴とする腫瘍の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法。
（９）腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする上記（８）記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌等の腫瘍の判定、胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌等の腫瘍の抑制剤・治療剤のスクリーニングを行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の腫瘍の判定方法としては、被検者から採取した血清又は血漿、腫瘍組織等の生体試料、好ましくはその培養上清中の、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチド（カルモジュリン）の発現量を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の腫瘍判定用キットとしては、カルモジュリンに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、カルモジュリンのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、また、上記カルモジュリンの発現量の測定は、血清又は血漿、腫瘍組織、好ましくはその培養上清等を対象サンプルとして、上記本発明の腫瘍の判定用キットを用いる、ＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。そして、上記腫瘍としては、胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌を特に好適に例示することができるが、これらの癌の他、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌、肝臓癌、大腸癌、膵臓癌等を挙げることができ、カルモジュリンの発現を検出した場合、対象者は癌である可能性が高いと判定され、特に発現量が顕著な場合は悪性腫瘍である可能性が高いと判定されることになる。
【００１７】
本発明はまた、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチド（カルモジュリン）を腫瘍マーカーとして使用する方法に関し、腫瘍マーカーとして使用方法としては、腫瘍の判定方法の他、腫瘍再発のリスク評価方法（カルモジュリンの発現を検出した場合、対象者は癌が再発している可能性が高いと判定される）、抗癌剤の有効性の判定方法（抗癌剤を服用している癌患者から採取した血清、癌組織等の生体試料中の、カルモジュリンの発現量を測定し、抗癌剤の服用の結果、カルモジュリンの発現量が減少した場合、当該抗癌剤は癌の治療に有効であると判定される）、腫瘍抑制剤・治療剤のスクリーニング方法などを挙げることができる。例えば、抗癌剤の有効性を判定することにより、各患者個人に適した治療、いわゆるテーラーメイド治療が可能となる。また、カルモジュリンの発現量を測定には、前記本発明の腫瘍判定用キットを有利に用いることができる。
【００１８】
本発明の腫瘍の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法としては、ヒト胃癌由来株化細胞（ＭＫＮ１、ＫＡＴＯIII、ＳＮＵ−１、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６、ＡＺ−５２１、ＭＫＮ４５、ＩＭ９５）や、ヒト肺小細胞癌由来株化細胞（ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＳＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８４１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＦＭ、ＮＣＩ−Ｈ１２８）や、ヒト肺非小細胞癌由来株化細胞（ＮＣＩ−Ｈ６５０、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ１８６９）や、ヒト前立腺癌由来株化細胞（ＰＣ−３）や、ヒト子宮頚管癌由来株化細胞（ＨｅＬａ）や、ヒト乳癌由来株化細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）や、ヒト肝臓癌由来株化細胞（ＨｅｐＧ２）や、ヒト大腸癌由来株化細胞（ＬｏＶｏ）や、ヒト膵臓癌由来株化細胞（Ｐａｎｃ−１）などを、抗癌剤、抗癌候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下に培養し、細胞溶解物中のカルモジュリンの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較して、前記ペプチドの発現量が低下しているとき、被検物質を腫瘍抑制剤と評価する方法であれば特に制限されず、上記カルモジュリンの発現量を測定する方法としては、これら株化培養細胞株の細胞溶解物を二次元電気泳動に供試して所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法の他、カルモジュリンに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を用いるＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、カルモジュリンのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を用いるドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法を挙げることができる。
【００１９】
上記カルモジュリンに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示することができる。これら抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチド又はエピトープを含む断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIESAND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００２０】
また、一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号）を用いることができ、ヒト化抗体をつくるために、ヒト化抗体の調製法（米国特許第5,585,089号、Nature, 321, 522-525, 1986、Protein Engineering, 4, 773-783, 1991）を用いることができ、キメラ抗体をつくるために、キメラ抗体の調製法（米国特許第4,816,567号、Science, 229, 1202-1207, 1985、BioTechniques, 4, 214, 1986、Nature, 312, 643-646, 1984、Nature, 314, 268.270, 1985）を用いることができる。二機能性抗体は、２つの関連した抗体を産生する２つのモノクローナル細胞系同士のハイブリッド、または２つの抗体の断片の化学結合によって産生することができる。
【００２１】
また、上記抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も、上記抗体と同様に用いることができる。例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またＦ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。
【００２２】
これら抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記配列番号１に示されるアミノ酸からなるペプチドを免疫学的測定方法により測定することができる。かかる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２３】
上記カルモジュリンのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセットとしては、これらカルモジュリンのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのうち、上流及び下流の配列の一部とハイブリダイズしうる相補的なプライマーセットであれば、プライマー配列の長さ及びｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのどの部位と相補的であるかなどは特に制限されず、例えば、これらのプライマーは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記ペプチドのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プライマーとして用いることができる。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、これらのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。
【００２４】
上記カルモジュリンのｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとしては、これらペプチドをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）とハイブリダイズしうるアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましく、例えば、これらのプローブは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記ペプチドのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プローブとして用いることができ、また、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることができる他、検出しやすいように５’末端を標識したものを用いることもでき、そのような標識としては、たとえば、ビオチン、蛍光、又は３２Ｐなどを例示することができる。
【００２５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
（細胞培養および培養上清の調製）
ヒト胃癌由来細胞株であるＳＮＵ−１細胞を用い、このＳＮＵ−１細胞を１ｘ１０６個となるよう１０ｃｍシャーレに播種し、一晩インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。培地は１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma社製）を用いた。リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline：ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。質量分析法による分析を行う際には、系内にＦＢＳが存在すると測定誤差が大きくなるため、本研究では無血清培地を使用した。ＲＰＭＩ１６４０培地で１時間インキュベートした後、培地を捨て、ＰＢＳでさらに２回洗浄した。その後、新たにＲＰＭＩ１６４０培地を７ｍｌ加え、４８時間インキュベートした後に培地を回収した。回収した培地を１０００ｘｇで５分間遠心し、細胞等を沈殿させた後、遠心上清を回収した。
【実施例２】
【００２７】
（逆相カラムクロマトグラフィーによる培養上清の分画）
ＳＮＵ−１細胞培養上清を逆相カラムクロマトグラフィーにより分画した。カラムクロマトグラフィーシステムとしてＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＦ２Ｄ（ベックマン社製）を、カラム充填剤としてＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ２５０−４．６（５μｍ：関東化学社製）を用いた。溶出曲線を図１に示す。逆相カラムクロマトグラフィーで得られた１９．５−２０．５分の画分を回収し、減圧下で遠心し濃縮・乾固した。
【実施例３】
【００２８】
（ＭＳ／ＭＳ解析によるタンパク質の同定）
得られた画分をタンパク質酵素消化促進剤であるＲａｐｉＧｅｓｔ ＳＦ（Waters社製）で処理した。次に、トリプシン溶液（８．３ｎｇ／μ ｌ５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム）を１５μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。５００ｍＭ 塩酸３μｌを加えて反応を停止し、Ｚｉｐ Ｔｉｐ（ミリポア社製）を用いて脱塩を行い、ＭＳスペクトルとＭＳ／ＭＳスペクトルを測定用のサンプルを調製した。
【００２９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ型分析機によりＭＳスペクトルを測定した結果、質量数が８０５．４、１７５４．８にピークが検出された。これらのタンパク質断片のペプチドに対しＭＳ／ＭＳスペクトルを測定し、ＮＣＢＩｎｒのデータベースを用いてＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）によるＭＳ／ＭＳイオンサーチ分析を行い、アミノ酸配列を決定した。ＭＡＬＤＩ型質量分析計を用いたトリプシン消化断片の配列決定の結果を表１に示す。その結果、これらの２種のペプチド（配列番号２及び３）はカルモジュリンの一部のペプチド断片であることが分かった。
【００３０】
【表１】
【００３１】
次に、実施例２で得られた画分に、トリプシン溶液（１６．６ｎｇ／μｌ ５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム）を３０μｌ加え、３７℃で１８時間インキュベートした。このうち５μｌを、ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ型分析機であるNanoFrontierシステム（日立ハイテクノロジーズ社製）で分析した。ＬＣ−ＥＳＩ型質量分析計を用いたトリプシン消化断片の配列決定の結果を表２に示す。その結果、これらの３種のペプチド（配列番号４〜６）はカルモジュリンの一部のペプチド断片であることが分かった。
【００３２】
【表２】
【００３３】
さらに、実施例２で得られた画分に、Ｖ８プロテアーゼ（１６．６ｎｇ／μｌ ５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム；ＰＩＥＲＣＥ社製）を３０μｌ加え、３７℃で１８時間インキュベートした。ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ型分析機によりＭＳ／ＭＳスペクトルを測定した。ＬＣ−ＥＳＩ型質量分析計を用いたＶ８プロテアーゼ消化断片の配列決定の結果を表３に示す。その結果、これらの７種のペプチド（配列番号７〜１３）はカルモジュリンの一部のペプチド断片であることが分かった。
【００３４】
【表３】
【００３５】
図２に、にカルモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。太字で示した箇所が２種類のプロテアーゼを用いて検出されたペプチド配列であり、Ｎ末端及びＣ末端を含むほとんどのカルモジュリン配列が検出できている。
【実施例４】
【００３６】
（様々なヒト癌由来株化細胞の培養上清の分析）
他の様々なヒト癌由来株化細胞からのカルモジュリン分泌をＭＳ／ＭＡスペクトル解析により調べた。解析に用いた細胞株は全部で３３種であり、９種の胃癌由来株化細胞（ＭＫＮ１、ＫＡＴＯIII、ＳＮＵ−１、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６、ＡＺ−５２１、ＭＫＮ４５、ＩＭ９５、ＭＫＮ７４）、９種の肺小細胞癌由来株化細胞（ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＳＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８４１、ＮＣＩ−Ｈ１０４８、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＦＭ、ＮＣＩ−Ｈ１２８）、８種の肺非小細胞癌株由来細胞（ＮＣＩ−Ｈ１６５０、ＮＣＩ−Ｈ６５０、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−Ａｄ１、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ１８６９）、２種の前立腺癌由来株化細胞（ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３）、子宮頚管癌由来株化細胞（ＨｅＬａ）、乳癌由来株化細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）、肝臓癌由来株化細胞（ＨｅｐＧ２）、大腸癌由来株化細胞（ＬｏＶｏ）、膵臓癌由来株化細胞（Ｐａｎｃ−１）を用いた。これらの細胞株は、American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ社)、財団法人ヒューマン振興財団、又はＲＩＫＥＮから入手することができる
【００３７】
実施例１に示した方法で各株化細胞を培養し、培養上清を回収した。続いて、実施例２に示した方法で、逆相カラムクロマトグラフィーにより上清を分画した。分離した画分を、実施例３と同様に酵素処理した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ型分析機によりＭＳ／ＭＳスペクトルを測定した。ＭＳ／ＭＳイオンサーチ分析の結果得られたタンパクヒットスコアを表４ならびに表５に示す。ヒットスコアは存在するタンパクが多いほど高いことが知られており、表４に示すように胃癌９株中８株、肺小細胞癌９株中８株、肺非小細胞癌８株中４株がカルモジュリンを放出していることが分かった。また、表５はカルモジュリンが多くの種類の株化癌細胞から放出されていることを示している。
【００３８】
【表４】
【００３９】
【表５】
【００４０】
腫瘍はカルシウムシグナル伝達機構に異常を来していることが知られている。カルモジュリンはカルシウム伝達機構に必須であるタンパク質であり、腫瘍との関連の報告が数多くなされている。本研究において癌由来株化細胞が培養液中にカルモジュリンを放出することが初めて見出された。カルモジュリンはカルシウムが結合した状態では安定性が高いタンパク質であり、血中安定性も高いと考えられる。以上のことから、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、腫瘍細胞がカルモジュリンを分泌しており、血中や尿中に放出されたカルモジュリンは腫瘍マーカーとして有用である可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＳＮＵ−１細胞培養上清を逆相カラムクロマトグラフィーにより分画した溶出曲線を示す図である。
【図２】カルモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。太字で示した箇所が２種類のプロテアーゼを用いてＭＳ／ＭＳ解析により検出されたペプチド配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルモジュリン（Calmodulin）を標的とした、胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌等の腫瘍の判定方法及びそのためのキット、並びに、腫瘍の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における診断・判定として血中腫瘍マーカーの計測が挙げられる。腫瘍マーカーは腫瘍または腫瘍と反応した正常細胞が作る物質の中で、血中や尿中などに放出され腫瘍の体外診断を可能としているものである。
【０００３】
上記腫瘍マーカーに関しては、乳癌患者と正常人の胸部組織に差異的に発現する遺伝子を使用した悪性腫瘍、特に乳癌を予想、診断 、予後判定、予防および処置するための新規な組成物、方法および使用（例えば、特許文献１参照）や、肝炎ウイルスの感染に起因し慢性肝炎または肝硬変を発症した患者に対し、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を評価することによって肝臓癌の発癌リスクを評価する方法（例えば、特許文献２参照）や、その遺伝子産物がＣＬＬ細胞および前立腺癌細胞の新生物性または腫瘍形成性増殖を抑制するｍｉＲ１５およびｍｉＲ１６のコピー数、変異状態または遺伝子発現を検出することによる慢性リンパ性白血病または前立腺癌の診断方法（例えば、特許文献３参照）や、無症候性期または初期段階の患者における発癌過程の存在を検出するのに適当な迅速な癌の診断方法や、癌患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素ＩＩの活性化化合物、すなわち腫瘍マーカー 、該癌の診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者の癌を検出することを特徴とする癌の処置方法、ならびに該癌の診断方法を行うためのキット（例えば、特許文献４参照）等が知られている。
【０００４】
胃癌は、日本と東南アジアでは消化管で最も多くみられる悪性腫瘍であり、癌死亡率では、胃癌が世界で第２位を占めている。胃癌の予後は、診断技術や胃癌の治療法の発達により改善しているが、進行癌の治癒的切除の後に起こる再発の主原因は腹膜播種である。胃漿膜にまで浸潤した胃癌の予後は、５年生存率が３５％と低い。また、進行胃癌術後の腹膜播種再発においてはいまだに有効な治療法がなく、５年生存率は５％以下と報告されている。胃癌細胞のこのような悪性の特性のうちで、腹膜への転移は特に複雑な現象であり、多くのステップと多くの遺伝子が関与している。胃癌の腹膜播種には、接着分子、アポトーシス関連遺伝子および他の遺伝子が深く関与しているという報告があるが、胃癌の転移のメカニズム解明には、さらなる研究が必要であるとされている。
【０００５】
胃癌に関しては、既知のＩ型コラーゲンのＣ端非３重鎖テロペプチド（ＩＣＴＰ）の変動をマーカーにすることを特徴とする、進行胃癌、特にスキルス胃癌の適切な診断マーカー（例えば、特許文献５参照）や、従来のＲＬＧＳ法に比較して少量のＤＮＡサンプルを用い簡便で、迅速、安価に癌患者の予後が良好か否かを診断することのできる技術を確立するものであって、癌部または非癌部組織検体より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、その割合に基づいて胃癌をはじめ、種々の癌疾患の予後が良好か否かを判断する方法（例えば、特許文献６参照）や、転移性結腸直腸癌あるいは原発性および／または転移性の胃癌または食道癌をスクリーニング・診断するための試薬、キットおよび方法や、その患者を処置するためにインビボでイメージングするための化合物や組成物、その治療や予防のための薬物、遺伝子療法薬およびアンチセンス化合物を運搬するための組成物、ワクチンおよび方法（例えば、特許文献７参照）や、細胞の生体エネルギー的指数を作成するため、構造タンパク質およびミトコンドリアの呼吸（それぞれ例えば、ｈｓｐ６０やチトクロームオキシダーゼのサブユニットＩおよびＩＶ）に関して、ミトコンドリアの生体エネルギー的機能のタンパク質（Ｈ＋−ＡＴＰ合成酵素のβ−触媒サブユニットなど）の発現についての研究を使用すること、そしてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素およびピルビン酸キナーゼＭなどの細胞の解糖経路のタンパク質の発現に関連する前記ミトコンドリア生体エネルギー指数（β−ＡＴＰａｓｅ／ｈｓｐ６０比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩ比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩＶ比）を使用することからなる、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法（例えば、特許文献８参照）等が提案されている。
【０００６】
さらに、胃癌腹膜播種又は腹腔内遊離癌細胞の検出のため、特異性の高い新規マーカーを同定する方法としては、被験者から生体試料を採取するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方の存在を被検者の生体試料から検出するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方が存在する場合には、胃癌由来の転移癌細胞が前記試料中に含まれている可能性が高いと判断するステップとを含む方法により、胃癌由来の転移癌細胞を検出し、これらを胃癌由来の転移癌細胞のマーカーとして使用することによって、胃癌患者の腹膜転移の有無を迅速かつ確実に検出することができ、腹腔内癌化学療法を適用すべきかの決定のための有力な材料を提供することができる方法（例えば、特許文献９参照）が開発されている。
【０００７】
また、肺癌は小細胞癌と非小細胞癌の２つの型に大きく分類され、非小細胞癌はさらに腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌の３タイプに分類され、それぞれのタイプによって発生する部位がある程度決まっており、小細胞癌と扁平上皮癌は肺門部に、腺癌と大細胞癌は肺野部にできやすい肺癌といわれている。肺癌に関して、小細胞肺癌 (ＳＣＬＣ)を患う患者を治療し、またはＳＣＬＣ腫瘍の存在を検出するための、比較的短いペプチド、詳細には、α−コノトキシンペプチドＭＩＩおよびＵ００２を使用して小細胞肺癌の存在または位置を決定することにより検出する方法（例えば、特許文献１０参照）や、血清中の肺癌マーカーとして優れる血管透過性因子を測定することにより、特に化学発光検出系酵素免疫測定法を用いて高感度で測定することにより、肺癌の早期診断、さらには治療効果の判定、経過観察を行う方法（例えば、特許文献１１参照）等が知られている。
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−１５９６４０号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０２９号公報
【特許文献３】特表２００６−５０６４６９号公報
【特許文献４】特表２００１−５２４８１５号公報
【特許文献５】特開２００１−３３４６０号公報
【特許文献６】特開２００２−１１２７９９号公報
【特許文献７】特表２００３−５３２３８９号公報
【特許文献８】特表２００５−５２６９８０号公報
【特許文献９】特開２００４−３２１１０２号公報
【特許文献１０】特表平１１−５０６７３７号公報
【特許文献１１】特開平９−３３５３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまでに様々な腫瘍マーカーが開発されているが、擬陽性が多く初期の癌の検出が困難であるなど改善の余地が多く残されている。特に肺癌・胃癌・大腸癌など難治性の癌のマーカーの開発が求められている。現在日本において肺癌は男性の癌死亡率の第１位であり、女性では第２位である。また胃癌は男性の癌死亡率の第２位であり女性では第１位である。このため肺癌ならびに胃癌に対する腫瘍マーカーが新たに開発され早期診断が可能となれば、治療成績の大きな向上が期待できる。本発明の課題は、早期診断が可能な胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌等に対する新規腫瘍マーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、腫瘍マーカー候補物質の探索を目的として、ヒト胃癌由来培養細胞株であるＳＮＵ−１細胞の培養上清に放出されるタンパク質・ペプチドのプロテオーム解析を行い、カルモジュリンが放出されていることを見い出し、カルモジュリンがヒト胃癌由来培養細胞株ばかりでなく、ヒト肺小細胞癌由来培養細胞株、ヒト肺非小細胞癌由来培養細胞株をはじめとして、多くの種類のヒト腫瘍由来培養細胞株において放出されるという知見を得て、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ヒトから採取した生体試料中の細胞外に放出された、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定することを特徴とする腫瘍の判定方法。
（２）腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする上記（１）記載の腫瘍の判定方法。
【００１２】
（３）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腫瘍判定用キット。
（４）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腫瘍判定用キット。
【００１３】
（５）腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする上記（３）又は（４）記載の腫瘍判定用キット。
（６）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドを腫瘍マーカーとして使用する方法。
（７）腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする上記（６）記載の方法。
【００１４】
（８）ヒト腫瘍細胞株を被検物質の存在下に培養し、細胞培養上清中の、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較して、前記ペプチドの発現量が低下しているとき、被検物質を腫瘍抑制剤と評価することを特徴とする腫瘍の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法。
（９）腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする上記（８）記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌等の腫瘍の判定、胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌等の腫瘍の抑制剤・治療剤のスクリーニングを行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の腫瘍の判定方法としては、被検者から採取した血清又は血漿、腫瘍組織等の生体試料、好ましくはその培養上清中の、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチド（カルモジュリン）の発現量を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の腫瘍判定用キットとしては、カルモジュリンに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、カルモジュリンのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、また、上記カルモジュリンの発現量の測定は、血清又は血漿、腫瘍組織、好ましくはその培養上清等を対象サンプルとして、上記本発明の腫瘍の判定用キットを用いる、ＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。そして、上記腫瘍としては、胃癌、肺小細胞癌、肺非小細胞癌を特に好適に例示することができるが、これらの癌の他、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌、肝臓癌、大腸癌、膵臓癌等を挙げることができ、カルモジュリンの発現を検出した場合、対象者は癌である可能性が高いと判定され、特に発現量が顕著な場合は悪性腫瘍である可能性が高いと判定されることになる。
【００１７】
本発明はまた、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチド（カルモジュリン）を腫瘍マーカーとして使用する方法に関し、腫瘍マーカーとして使用方法としては、腫瘍の判定方法の他、腫瘍再発のリスク評価方法（カルモジュリンの発現を検出した場合、対象者は癌が再発している可能性が高いと判定される）、抗癌剤の有効性の判定方法（抗癌剤を服用している癌患者から採取した血清、癌組織等の生体試料中の、カルモジュリンの発現量を測定し、抗癌剤の服用の結果、カルモジュリンの発現量が減少した場合、当該抗癌剤は癌の治療に有効であると判定される）、腫瘍抑制剤・治療剤のスクリーニング方法などを挙げることができる。例えば、抗癌剤の有効性を判定することにより、各患者個人に適した治療、いわゆるテーラーメイド治療が可能となる。また、カルモジュリンの発現量を測定には、前記本発明の腫瘍判定用キットを有利に用いることができる。
【００１８】
本発明の腫瘍の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法としては、ヒト胃癌由来株化細胞（ＭＫＮ１、ＫＡＴＯIII、ＳＮＵ−１、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６、ＡＺ−５２１、ＭＫＮ４５、ＩＭ９５）や、ヒト肺小細胞癌由来株化細胞（ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＳＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８４１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＦＭ、ＮＣＩ−Ｈ１２８）や、ヒト肺非小細胞癌由来株化細胞（ＮＣＩ−Ｈ６５０、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ１８６９）や、ヒト前立腺癌由来株化細胞（ＰＣ−３）や、ヒト子宮頚管癌由来株化細胞（ＨｅＬａ）や、ヒト乳癌由来株化細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）や、ヒト肝臓癌由来株化細胞（ＨｅｐＧ２）や、ヒト大腸癌由来株化細胞（ＬｏＶｏ）や、ヒト膵臓癌由来株化細胞（Ｐａｎｃ−１）などを、抗癌剤、抗癌候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下に培養し、細胞溶解物中のカルモジュリンの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較して、前記ペプチドの発現量が低下しているとき、被検物質を腫瘍抑制剤と評価する方法であれば特に制限されず、上記カルモジュリンの発現量を測定する方法としては、これら株化培養細胞株の細胞溶解物を二次元電気泳動に供試して所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法の他、カルモジュリンに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を用いるＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、カルモジュリンのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を用いるドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法を挙げることができる。
【００１９】
上記カルモジュリンに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示することができる。これら抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチド又はエピトープを含む断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIESAND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００２０】
また、一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号）を用いることができ、ヒト化抗体をつくるために、ヒト化抗体の調製法（米国特許第5,585,089号、Nature, 321, 522-525, 1986、Protein Engineering, 4, 773-783, 1991）を用いることができ、キメラ抗体をつくるために、キメラ抗体の調製法（米国特許第4,816,567号、Science, 229, 1202-1207, 1985、BioTechniques, 4, 214, 1986、Nature, 312, 643-646, 1984、Nature, 314, 268.270, 1985）を用いることができる。二機能性抗体は、２つの関連した抗体を産生する２つのモノクローナル細胞系同士のハイブリッド、または２つの抗体の断片の化学結合によって産生することができる。
【００２１】
また、上記抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も、上記抗体と同様に用いることができる。例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またＦ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。
【００２２】
これら抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記配列番号１に示されるアミノ酸からなるペプチドを免疫学的測定方法により測定することができる。かかる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２３】
上記カルモジュリンのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセットとしては、これらカルモジュリンのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのうち、上流及び下流の配列の一部とハイブリダイズしうる相補的なプライマーセットであれば、プライマー配列の長さ及びｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのどの部位と相補的であるかなどは特に制限されず、例えば、これらのプライマーは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記ペプチドのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プライマーとして用いることができる。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、これらのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。
【００２４】
上記カルモジュリンのｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとしては、これらペプチドをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）とハイブリダイズしうるアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましく、例えば、これらのプローブは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記ペプチドのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プローブとして用いることができ、また、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることができる他、検出しやすいように５’末端を標識したものを用いることもでき、そのような標識としては、たとえば、ビオチン、蛍光、又は３２Ｐなどを例示することができる。
【００２５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
（細胞培養および培養上清の調製）
ヒト胃癌由来細胞株であるＳＮＵ−１細胞を用い、このＳＮＵ−１細胞を１ｘ１０６個となるよう１０ｃｍシャーレに播種し、一晩インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。培地は１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma社製）を用いた。リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline：ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。質量分析法による分析を行う際には、系内にＦＢＳが存在すると測定誤差が大きくなるため、本研究では無血清培地を使用した。ＲＰＭＩ１６４０培地で１時間インキュベートした後、培地を捨て、ＰＢＳでさらに２回洗浄した。その後、新たにＲＰＭＩ１６４０培地を７ｍｌ加え、４８時間インキュベートした後に培地を回収した。回収した培地を１０００ｘｇで５分間遠心し、細胞等を沈殿させた後、遠心上清を回収した。
【実施例２】
【００２７】
（逆相カラムクロマトグラフィーによる培養上清の分画）
ＳＮＵ−１細胞培養上清を逆相カラムクロマトグラフィーにより分画した。カラムクロマトグラフィーシステムとしてＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＦ２Ｄ（ベックマン社製）を、カラム充填剤としてＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ２５０−４．６（５μｍ：関東化学社製）を用いた。溶出曲線を図１に示す。逆相カラムクロマトグラフィーで得られた１９．５−２０．５分の画分を回収し、減圧下で遠心し濃縮・乾固した。
【実施例３】
【００２８】
（ＭＳ／ＭＳ解析によるタンパク質の同定）
得られた画分をタンパク質酵素消化促進剤であるＲａｐｉＧｅｓｔ ＳＦ（Waters社製）で処理した。次に、トリプシン溶液（８．３ｎｇ／μ ｌ５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム）を１５μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。５００ｍＭ 塩酸３μｌを加えて反応を停止し、Ｚｉｐ Ｔｉｐ（ミリポア社製）を用いて脱塩を行い、ＭＳスペクトルとＭＳ／ＭＳスペクトルを測定用のサンプルを調製した。
【００２９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ型分析機によりＭＳスペクトルを測定した結果、質量数が８０５．４、１７５４．８にピークが検出された。これらのタンパク質断片のペプチドに対しＭＳ／ＭＳスペクトルを測定し、ＮＣＢＩｎｒのデータベースを用いてＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）によるＭＳ／ＭＳイオンサーチ分析を行い、アミノ酸配列を決定した。ＭＡＬＤＩ型質量分析計を用いたトリプシン消化断片の配列決定の結果を表１に示す。その結果、これらの２種のペプチド（配列番号２及び３）はカルモジュリンの一部のペプチド断片であることが分かった。
【００３０】
【表１】
【００３１】
次に、実施例２で得られた画分に、トリプシン溶液（１６．６ｎｇ／μｌ ５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム）を３０μｌ加え、３７℃で１８時間インキュベートした。このうち５μｌを、ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ型分析機であるNanoFrontierシステム（日立ハイテクノロジーズ社製）で分析した。ＬＣ−ＥＳＩ型質量分析計を用いたトリプシン消化断片の配列決定の結果を表２に示す。その結果、これらの３種のペプチド（配列番号４〜６）はカルモジュリンの一部のペプチド断片であることが分かった。
【００３２】
【表２】
【００３３】
さらに、実施例２で得られた画分に、Ｖ８プロテアーゼ（１６．６ｎｇ／μｌ ５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム；ＰＩＥＲＣＥ社製）を３０μｌ加え、３７℃で１８時間インキュベートした。ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ型分析機によりＭＳ／ＭＳスペクトルを測定した。ＬＣ−ＥＳＩ型質量分析計を用いたＶ８プロテアーゼ消化断片の配列決定の結果を表３に示す。その結果、これらの７種のペプチド（配列番号７〜１３）はカルモジュリンの一部のペプチド断片であることが分かった。
【００３４】
【表３】
【００３５】
図２に、にカルモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。太字で示した箇所が２種類のプロテアーゼを用いて検出されたペプチド配列であり、Ｎ末端及びＣ末端を含むほとんどのカルモジュリン配列が検出できている。
【実施例４】
【００３６】
（様々なヒト癌由来株化細胞の培養上清の分析）
他の様々なヒト癌由来株化細胞からのカルモジュリン分泌をＭＳ／ＭＡスペクトル解析により調べた。解析に用いた細胞株は全部で３３種であり、９種の胃癌由来株化細胞（ＭＫＮ１、ＫＡＴＯIII、ＳＮＵ−１、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６、ＡＺ−５２１、ＭＫＮ４５、ＩＭ９５、ＭＫＮ７４）、９種の肺小細胞癌由来株化細胞（ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＳＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８４１、ＮＣＩ−Ｈ１０４８、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＦＭ、ＮＣＩ−Ｈ１２８）、８種の肺非小細胞癌株由来細胞（ＮＣＩ−Ｈ１６５０、ＮＣＩ−Ｈ６５０、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−Ａｄ１、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ１８６９）、２種の前立腺癌由来株化細胞（ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３）、子宮頚管癌由来株化細胞（ＨｅＬａ）、乳癌由来株化細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）、肝臓癌由来株化細胞（ＨｅｐＧ２）、大腸癌由来株化細胞（ＬｏＶｏ）、膵臓癌由来株化細胞（Ｐａｎｃ−１）を用いた。これらの細胞株は、American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ社)、財団法人ヒューマン振興財団、又はＲＩＫＥＮから入手することができる
【００３７】
実施例１に示した方法で各株化細胞を培養し、培養上清を回収した。続いて、実施例２に示した方法で、逆相カラムクロマトグラフィーにより上清を分画した。分離した画分を、実施例３と同様に酵素処理した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ型分析機によりＭＳ／ＭＳスペクトルを測定した。ＭＳ／ＭＳイオンサーチ分析の結果得られたタンパクヒットスコアを表４ならびに表５に示す。ヒットスコアは存在するタンパクが多いほど高いことが知られており、表４に示すように胃癌９株中８株、肺小細胞癌９株中８株、肺非小細胞癌８株中４株がカルモジュリンを放出していることが分かった。また、表５はカルモジュリンが多くの種類の株化癌細胞から放出されていることを示している。
【００３８】
【表４】
【００３９】
【表５】
【００４０】
腫瘍はカルシウムシグナル伝達機構に異常を来していることが知られている。カルモジュリンはカルシウム伝達機構に必須であるタンパク質であり、腫瘍との関連の報告が数多くなされている。本研究において癌由来株化細胞が培養液中にカルモジュリンを放出することが初めて見出された。カルモジュリンはカルシウムが結合した状態では安定性が高いタンパク質であり、血中安定性も高いと考えられる。以上のことから、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、腫瘍細胞がカルモジュリンを分泌しており、血中や尿中に放出されたカルモジュリンは腫瘍マーカーとして有用である可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＳＮＵ−１細胞培養上清を逆相カラムクロマトグラフィーにより分画した溶出曲線を示す図である。
【図２】カルモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。太字で示した箇所が２種類のプロテアーゼを用いてＭＳ／ＭＳ解析により検出されたペプチド配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取した生体試料中の細胞外に放出された、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定することを特徴とする腫瘍の判定方法。
【請求項２】
腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする請求項１記載の腫瘍の判定方法。
【請求項３】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腫瘍判定用キット。
【請求項４】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腫瘍判定用キット。
【請求項５】
腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする請求項３又は４記載の腫瘍判定用キット。
【請求項６】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドを腫瘍マーカーとして使用する方法。
【請求項７】
腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
ヒト腫瘍細胞株を被検物質の存在下に培養し、細胞培養上清中の、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較して、前記ペプチドの発現量が低下しているとき、被検物質を腫瘍抑制剤と評価することを特徴とする腫瘍の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする請求項８記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
ヒトから採取した生体試料中の細胞外に放出された、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定することを特徴とする腫瘍の判定方法。
【請求項２】
腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする請求項１記載の腫瘍の判定方法。
【請求項３】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腫瘍判定用キット。
【請求項４】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腫瘍判定用キット。
【請求項５】
腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする請求項３又は４記載の腫瘍判定用キット。
【請求項６】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドを腫瘍マーカーとして使用する方法。
【請求項７】
腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
ヒト腫瘍細胞株を被検物質の存在下に培養し、細胞培養上清中の、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較して、前記ペプチドの発現量が低下しているとき、被検物質を腫瘍抑制剤と評価することを特徴とする腫瘍の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
腫瘍が、胃癌、肺小細胞癌、又は肺非小細胞癌であることを特徴とする請求項８記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２４９５８７（Ｐ２００８−２４９５８７Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９３０３１（Ｐ２００７−９３０３１）
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（５９０００２３８９）静岡県 (173)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（５９０００２３８９）静岡県 (173)
【Ｆターム（参考）】
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